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CN102906267A - 玉米光合作用组织和非光合作用组织昼夜节律的鉴定及其在改良作物方面的用途 - Google Patents

玉米光合作用组织和非光合作用组织昼夜节律的鉴定及其在改良作物方面的用途 Download PDF

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CN102906267A
CN102906267A CN2011800121142A CN201180012114A CN102906267A CN 102906267 A CN102906267 A CN 102906267A CN 2011800121142 A CN2011800121142 A CN 2011800121142A CN 201180012114 A CN201180012114 A CN 201180012114A CN 102906267 A CN102906267 A CN 102906267A
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CN
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corn
zea mays
plant
polynucleotide
circadian
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Application number
CN2011800121142A
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O.N.丹尼列夫斯卡亚
J.E.黑本
K.R.海斯
C.R.西蒙斯
S.D.德尚
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Pioneer Hi Bred International Inc
EIDP Inc
Original Assignee
Pioneer Hi Bred International Inc
EI Du Pont de Nemours and Co
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Publication date
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Abstract

本发明提供涉及玉米的叶和穗组织中昼夜循环的多核苷酸序列。本发明提供了多核苷酸序列及其编码的与振荡相关的多肽的用途。所述公开的序列负责控制作物中植物生长、源-库关系和产量。

Description

玉米光合作用组织和非光合作用组织昼夜节律的鉴定及其在改良作物方面的用途
技术领域
本发明整体涉及分子生物学领域。
背景技术
昼夜循环是控制植物日节律和季节节律的一个主要环境因素。昼夜明暗转变带动内部昼夜节律钟，昼夜节律钟产生在不变的光照条件下自行维持的(自由运转的)节律。昼夜节律钟的一个简化模型由三个基本组元组成：输入途径，其能感光；核心振荡器，其是产生节律的转录机制；以及输出途径，其控制各种发育和代谢过程，引起对昼夜周期的适当的生理适应(Barak，et a1.，(2000)Trends Plant Sci 5：517-522(Barak等人，2000年，《植物科学趋势》，第5卷，第517-522页)；Harmer，(2009)Annu RevPlant Biol 60：357-377(Harmer，2009年，《植物生物学年评》，第60卷，第357-377页))。内部时钟和外部明/暗循环的适当同步使植物更强壮、存活率更高、竞争优势更明显(Dodd，et al.，(2005)Science 309：630-633(Dodd等人，2005年，《科学》，第309卷，第630-633页))并且长势更佳(Ni，et al.，(2009)Nature 457：327-331(Ni等人，2009年，《自然》，第457卷，第327-331页))。
到目前为止，植物昼夜节律系统的基因结构在拟南芥中阐述得最多(Mas，(2008)Trends Cell Biol 18：273-281(Mas，2008年，《细胞生物学趋势》，第18卷，第273-281页))。输入途径由两套光受体组成，即感受红光/远红光的光敏色素(PHYA-E)和感受UV-A/蓝光的隐花色素(CRY1和CRY2)，它们在日间感知光并向核心振荡器发送信号(Nemhauser，(2008)Curr Opin Plant Biol 11：4-8(Nemhauser，2008年，《植物生物学新见》，第11卷，第4-8页))。核心振荡器基因形成连锁的转录反馈环路(Harmer and McClung，(2009)Science 323：1440-1441(Harmer和McClung，2009年，《科学》，第323卷，第1440-1441页))。晨间环路由MYB样转录因子CCA1(CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED)和LHY(LATEELONGATED HYPOCOTYL)组成，它们参与两个不同环路的调控。在晨间环路中，CCA1/LHY负调控伪应答调控因子TOC1(TIMING OF CABEXPRESSION 1)和TCP样转录因子CHE(CCA1 HIKING EXPEDITION)的转录。TOC1/CHE形成正调控CCA1/LHY转录的复合物(Pruneda-Paz，et al.，(2009)Science 323：1481-1485(Pruneda-Paz等人，2009年，《科学》，第323卷，第1481-1485页))。在日间环路中，CCA1/LHY正调控PRR7和PRR9(PSEUDO-RESPONSE REGULATORS)的转录，二者都负调控CCA1/LHY。在晚间环路中，TOC1/CHE充当GI(GIGANTIA)的负调控因子，后者本身是TOC1的正调控因子。晚间基因ZTL(ZEITLUPE，降解蛋白的F-box蛋白)参与TOC1和PRR3蛋白的降解，提供在蛋白水平上对核心时钟组分的调控(Mas，et al.，(2003)Nature 426：567-570(Mas等人，2003年，《自然》，第426卷，第567-570页))。多个连锁的转录环路使遗传机制既保持稳固又不乏灵活性(Harmer(2009))。
昼夜节律钟产生节律输出，从而调控许多植物发育和生理过程，包括：生长(Nozue，et al.，(2007)Nature 448：358-361(Nozue等人，2007年，《自然》，第448卷，第358-361页)；Nozue and Maloof，(2006)Plant CellEnviron 29：396-408(Nozue和Maloof，2006年，《植物、细胞与环境》，第29卷，第396-408页))、开花时间、一年生植物的块茎形成、多年生植物的生长停止和顶芽形成(Lagercrantz，(2009)J Exp Bot 60：2501-2515(Lagercrantz，2009年，《实验植物学杂志》，第60卷，第2501-2515页))、光合作用(Sun，et al.，(2003)Plant Mol Biol 53：467-478(Sun等人，2003年，《植物分子生物学》，第53卷，第467-478页))、氮吸收(Gutierrez，et al.，(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105：4939-4944(Gutierrez等人，2008年，《美国国家科学院院刊》，第105卷，第4939-4944页))以及激素信号传导和应激反应(Covington and Harmer，(2007)PLoS Biol 5：e222(Covington和Harmer，2007年，《公共科学图书馆·生物学》，第5卷，第e222页)。然而，目前只是初步了解将昼夜节律钟和输出途径关联起来的分子节点(molecular nodes)。迄今为止，理解最清楚的关联点是拟南芥和水稻开花时间的光周期调控。拟南芥时钟基因GI及其水稻同源基因OsGI促进转录因子CO(CONSTANS)和OsCO(Hd1，HEADING1)的表达，这两个转录因子控制拟南芥的下游开花激活因子FT(FLOWERING LOCUS T)及其水稻同源基因Hd3a(HEADING 3a)的转录(Michaels，(2009)Curr Opin PlantBiol 12：75-80(Michaels，2009年，《植物生物学新见》，第12卷，第75-80页)，Tsuji and Komiya，(2008)Rice 1：25-35(Tsuji和Komiya，2008年，《水稻》，第1卷，第25-35页))。光周期敏感性途径确保了在有利的条件下开花。
有几篇论文鉴定了拟南芥核心振荡器与多种植物生理过程之间的分子关联。节律性下胚轴生长是由两个碱性螺旋-环-螺旋转录因子PIF4和PIF5(PHYTOCHROM-INERACTING FACTOR)的正作用促进的，它们的转录水平由CCA1调控(Nozue，et al.，(2007)Nature 448：358-361(Nozue等人，2007年，《自然》，第448卷，第358-361页))。下胚轴生长也由植物激素生长素的游离水平独立调控，生长素由生长素生物合成基因YUCCA8产生，该基因由时钟依赖性Myb样转录因子RVE1(REVEILLE 1)直接控制(Rawat，et al.，(2009)Proc Natl Acad Sci USA 106：16883-16888(Rawat等人，2009年，《美国国家科学院院刊》，第106卷，第16883-16888页))。这是昼夜节律振荡器与调控拟南芥幼苗生长的生长素网络之间的直接关联。PPR9/7/5基因的输出途径与中间代谢(主要是线粒体中的)，特别是三羧酸(TCA)循环的维持相关(Fukushima，et al.，(2009)Proc Natl Acad Sci USA106：7251-7256(福岛等人，2009年，《美国国家科学院院刊》，第106卷，第7251-7256页))。TOC1也与胁迫相关ABA激素有关联，其将昼夜节律钟与植物对干旱的反应联系起来(Legnaioli，et al.，(2009)The EMBOJournal 28：3745-3757(Legnaioli等人，2009年，《欧洲分子生物学学会会刊》，第28卷，第3745-3757页))。
芯片技术的应用揭示了拟南芥中昼夜节律对基因转录的普遍影响。这些研究主要集中在感光组织上，例如拟南芥莲座。在绿色组织中，多达35％的拟南芥基因受昼夜节律调控(Covington，et al.，(2008)Genome Biol9：R130(Covington等人，2008年，《基因组生物学》，第9卷，第R130页)；Harmer，et al.，(2000)Science 290：2110-2113(Harmer等人，2000年，《科学》，第290卷，第2110-2113页)；Ptitsyn，(2008)BMCBioinformatics 9(9)：S18(Ptitsyn，2008年，《BMC生物信息学》，第9卷第9期，第S18页))。虽然动物模型表明几乎每个组织的转录程序都有很大的昼夜节律组分，但尚未对多种植物组织系统地评估昼夜光周期对转录的相对贡献(Ptitsyn，et al.，(2006)PLoS Comput Biol 2：e16(Ptitsyn等人，2006年，《公共科学图书馆计算生物学》，第2卷，第e16页))。在前基因组时代，在玉米叶光合作用和叶伸长速率中观察到昼夜变化，它们在中午达到峰值(Kalt-Torres and Huber，(1987)Plant Physiol 83：294-298(Kalt-Torres和Huber，1987年，《植物生理学》，第83卷，第294-298页)，Kalt-Torres，et al.，(1987)Plant Physiol 83：283-288(Kalt-Torres等人，1987年，《植物生理学》，第83卷，第283-288页)，Usuda，et al.，(1987)Plant Physiol83：289-293(Usuda等人，1987年，《植物生理学》，第83卷，第289-293页))。在非光合作用的籽粒中也发现了胚乳特异性转录因子O2(Opaque 2)的昼夜变化，并且有人提出O2活性由昼夜代谢物流量控制(Ciceri，et al.，(1999)Plant Physiol 121：1321-1328(Ciceri等人，1999年，《植物生理学》，第121卷，第1321-1328页))。GI(gigz1)和CO(conz1)的玉米同源基因被证明有昼夜节律，它们是控制拟南芥开花时间的光周期途径中的昼夜节律钟的直接输出(Miller，et al.，(2008)Planta 227：1377-1388(Miller等人，2008年，《植物》，第227卷，第1377-1388页))，尽管温带玉米是开花不受白天长度调控的日中性植物。
本研究鉴定了两个TOC1同源基因ZmTOCa和ZmTOCb，它们分别定位于5号和4号染色体。两个基因的转录都在6pm达到峰值，这与拟南芥TOC1基因表达相符。TOC1是伪应答调控因子(PRR)家族的成员，该家族由拟南芥和水稻中进化上保守的五个PRR基因组成(Murakami，et al.，(2007)Biosci Biotechnol Biochem 71：1107-1110(Murakami等人，2007年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第71卷，第1107-1110页)；Murakami，etal.，(2003)Plant Cell Physiol 44：1229-1236(村上等人，2003年，《植物细胞生理学》，第44卷，第1229-1236页))。除了两个ZmTOC1同源基因外，本研究还鉴定了ZmPRR73、ZmPRR37和ZmPRR59，它们是基于序列相似性水平根据水稻PRR基因命名的(村上等人，(2003))。还鉴定了两个ZEITLUPE同源基因(Kim，et al.，(2007)Nature 449：356-360(Kim等人，2007年，《自然》，第449卷，第356-360页))ZmZTLa和ZmZTLb，它们定位于2号和4号染色体。GIGANTIA的两个玉米直系同源基因gigz1A和gigz1B此前已有描述(Miller，et al.，(2008)Planta 227：1377-1388(Miller等人，2008年，《植物》，第227卷，第1377-1388页))，在此确认了它们在穗和叶中的振荡。安捷伦(安捷伦科技有限公司生命科学与化学分析事业部，美国特拉华州威明顿市森特威尔路2850号，19808-1610(AgilentTechnologies，Inc.，Life Sciences and Chemical Analysis，2850 Centerville Road，Wilmington，DE 19808-1610，USA))和亿明达(亿明达股份有限公司，美国加利福利亚圣地亚哥市镇中心大道9885号，92121(Illumina，Inc.，9885Towne Centre Drive，San Diego，CA 92121 USA))分析都说明大部分已知的核心组元循环往复。通过RT-PCR分析进一步确认了核心组分ZmCCA、ZmLHY、ZmTOC1a和ZmTOC1b的循环。与叶组织相比，发育期穗中的核心组元的振幅减弱，但仍然强健。这些数据表明大部分植物核心振荡器系统在非光合作用组织例如穗中起作用，但振荡器输出显然与影响下游昼夜表达改变的转录机器远远分离。
核心时钟机构以及源于此的邻近信号机构的组分可以例如改变或扩展源和库例如叶和穗之间关系达到正向影响作物表现这样的方式改进。已证实来自不同种质源的昼夜模式的大规模遗传互补能增强组合的昼夜模式和表观适应性(Ni，(2009))。
附图说明
图1：在玉米中起作用的昼夜核心时钟组元、染色体位置和达到峰值表达水平的时间。
图2：用qRT-PCR验证ZmCCA1、ZmLHY、ZmTOC1a和ZmTOC1b的昼夜表达。
图3：穗中昼夜表达的基因、染色体位置和达峰值表达水平的时间。
图4：ZmCCA1和ZmLHY基因的外显子/内含子结构
图5：依时间富集的基因功能项的昼夜模式
发明内容
目前还没有对玉米的昼夜/生理节律转录模式进行过系统研究。开始本研究工作，是为了用现代全基因组图谱分析技术考察玉米中昼夜循环在调控基因转录中作用的范围。设计了在天然未受干扰条件下的田间实验，并采集了光合作用组织(即叶)和非光合作用组织(即发育期穗)的样品。鉴定了数千个在玉米叶中显著地循环的转录物。然而在非光合作用的穗中只有少至45个的少部分基因明显地进行昼夜循环。其中许多是拟南芥核心振荡器基因的玉米同源基因，表明核心昼夜节律基因是保守在玉米中的，且在光合作用组织和非光合作用组织中昼夜表达。
在分析中鉴定了多个玉米昼夜调控的基因。总共471个序列，包括来自未成熟穗的序列、在叶组织中有高振幅/大幅度循环的序列以及与NUE和碳::氮功能相关的多种序列。这些序列包含ORF、编码的多肽和与其相关的启动子。
以下列表包括本发明的一些实施例：
1.一种分离出的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自：
a.多核苷酸，如用GAP算法在默认参数下确定的，所述多核苷酸与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全长序列具有至少90％的序列同一性；其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有昼夜活动调节剂的功能；
b.多核苷酸，所述多核苷酸选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全长序列具有至少90％的序列同一性；
c.与(a)或(b)的多核苷酸完全互补的多核苷酸；
d.由(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽；和
e.多肽，如用GAP算法在默认参数下确定的，所述多肽与选自SEQ ID NO：185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、467、469和471的多肽的全长序列具有至少90％的序列同一性。
2.一种重组表达盒，所述重组表达盒包含权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有义或反义方向有效连接至启动子。
3.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求2所述的表达盒。
4.一种转基因植物，所述转基因植物包含权利要求2所述的重组表达盒。
5.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
6.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
7.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。
8.一种转基因种子，所述转基因种子来自权利要求4所述的转基因植物。
9.一种调整植物昼夜节律的方法，所述方法包括：
a.向植物细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含有效连接至启动子的权利要求1所述的多核苷酸；和
b.在植物细胞生长条件下培养所述植物；其中所述植物细胞中的昼夜节律被调制。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自选自以下的植物：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。
11.一种调制植物中整株植物或昼夜节律的方法，所述方法包括：
a.向植物细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含有效连接至启动子的权利要求1所述的多核苷酸；
b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；和
c.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的昼夜节律被调制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生和可可。
13.一种来源于对转基因植物组织进行加工的方法的产品，所述转基因植物组织表达编码昼夜起作用的基因的分离多核苷酸，所述方法包括：
a.用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、20、40、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全长序列具有至少90％的序列同一性；所述多核苷酸有效地连接至启动子；和
b.在植物细胞生长条件下培养所述转化的植物细胞；其中所述转化的植物细胞的生长被调制；
c.在形成植物的条件下培养所述植物细胞，以在植物组织中表达所述多核苷酸；和
d.对所述植物组织进行加工以获得产品。
14.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
15.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、甘蔗和稷。
16.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述多核苷酸的过表达导致与未转化的植物相比改善的植物生长。
17.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物与未转化的植物相比，表现出改善的源-库关系。
18.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物与未转化的植物相比，具有提高的产量。
19.一种调控多核苷酸分子，所述分子包含选自以下的序列：(a)SEQID NO：31-183；(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO：31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO：31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90％的同一性。
20.一种嵌合多核苷酸分子，所述分子包含权利要求19所述的核酸片段。
21.根据权利要求20所述的嵌合分子，所述分子包含所述昼夜调控元件和组织特异性表达元件。
22.根据权利要求21所述的嵌合分子，其中所述组织特异性表达元件选自根特异性、维管束鞘细胞特异性、叶特异性和胚特异性表达元件。
23.根据权利要求19所述的调控多核苷酸分子，其中所述调控多核苷酸分子是启动子。
24.一种包含权利要求19所述的调控分子的构建体，所述调控分子有效连接至异源多核苷酸分子，其中所述异源分子赋予所关注的性状。
25.根据权利要求24所述的构建体，其中所述所关注的性状选自耐旱性、耐冻性、耐寒性、抗病性和昆虫抗性。
26.根据权利要求24所述的构建体，其中所述异源分子在源-库代谢中起作用。
27.一种用权利要求19所述的调控分子转化的转基因植物。
28.根据权利要求27所述的转基因植物，其是单子叶植物。
29.根据权利要求27所述的转基因植物，其选自：玉米、大豆、卡诺拉油菜、棉花、向日葵、苜蓿、甜菜、小麦、裸麦、水稻、甘蔗、燕麦、大麦、草坪草、高粱、稷、番茄、木豆、蔬菜、果树和饲草。
30.一种增加植物产量的方法，所述方法包括在权利要求19所述的调控分子的控制下表达所关注的异源多核苷酸。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述异源多核苷酸是昼夜调控的植物基因。
32.一种提高植物非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括在权利要求19所述的调控分子的控制下在植物中表达一种或多种赋予非生物胁迫耐性的多核苷酸。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述非生物胁迫耐性选自耐旱性、耐冻性和耐寒性。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述赋予耐旱性的多核苷酸是在调控元件控制下表达的，其峰值表达发生于中午或傍晚左右。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述赋予耐冻性或耐寒性的多核苷酸是在调控元件控制下表达的，其峰值表达发生于黎明或上午中间左右。
36.一种降低转基因表达的产量抑制的方法，所述方法包括表达有效连接至调控多核苷酸分子的转基因，所述调控多核苷酸分子包含选自以下的序列：(a)SEQ ID NO：31-183；(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO：31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO：31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90％的同一性。
37.一种筛选涉及非生物胁迫耐性的候选基因的方法，所述方法包括(a)鉴定在组成性表达或组织特异性表达下表现产量抑制的一个或多个候选基因和(b)在引导昼夜表达模式的调控分子控制下表达所述候选基因。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述调控分子包含选自以下的序列：(a)SEQ ID NO：31-183；(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO：31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQID NO：31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90％的同一性。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。
下文将参照附图更完整地描述本发明，其中示出了本发明的一些但并非全部实施例。事实上，这些公开内容可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；相反，这些实施例提供的目的是使本发明满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。这类技术在文献中有完整的解释。参见例如Langenheim and Thimann，BOTANY：PLANT BIOLOGY AND ITS RELATIONTO HUMAN AFFAIRS，John Wiley (1982)(Langenheim和Thimann，《植物学：植物生物学及其与人类事务的关系》，约翰威立出版社，1982年)；CELL CULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS，vol.1，Vasil，ed.(1984)(《植物细胞培养与体细胞遗传学》，第1卷，Vasil编辑，1984年)；Stanier，et al.，THE MICROBIAL WORLD，5th ed.，Prentice-Hall(1986)(Stanier等人，《微生物世界》，第5版，普伦蒂斯·霍尔出版社，1986年)；Dhringra and Sinclair，BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS，CRC Press(1985)(Dhringra和Sinclair，《植物病理学基本方法》，CRC出版社，1985年)；Maniatis，et al.，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(1982)(Maniatis等人，《分子克隆实验指南》，1982年)；DNA CLONING，vols.I and II，Glover，ed.(1985)(《DNA克隆》，第I卷和II卷，Glover编辑，1985年)；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS，Gait，ed.(1984)(《寡核苷酸合成》，Gait编辑，1984年)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，Hames and Higgins，eds.(1984)(《核酸杂交》，Hames和Higgins编辑，1984年)和丛书METHODS INENZYMOLOGY，Colowick and Kaplan，eds，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(《酶学方法》，Colowick和Kaplan编辑，学术出版社，加州圣地亚哥)。
单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5’到3’的方向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。
在描述本发明时，将采用下面的术语，并采用下文所示的定义。
所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省密西沙加加拿大基因公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Persing，et al.，eds.，American Society forMicrobiology，Washington，DC(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，《美国微生物学会》，华盛顿，1993年)。扩增的产物称为扩增子。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens)，对其而言GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka，etal.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32(Ishizuka等人，1993年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页))都可以被修改以获得功能相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种隐匿的变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列作出的会改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为“保守修饰的变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白对于其天然底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
另参见Creighton，PROTEINS，W.H.Freeman and Co.(1984)(Creighton，《蛋白质》，W.H.弗里曼公司，1984年)。
如本文所用，“基本上由......组成”意指在如下情况下目标多核苷酸可包括额外的序列：该额外的序列在严格杂交条件下不会选择性地杂交至与该多核苷酸所杂交的cDNA相同的cDNA，且该杂交条件包括在0.1X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠中在65℃下进行的洗涤步骤。
就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)，或可缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，当用例如某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum)(Yamao，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-9(Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页))或纤毛虫大核表达核酸时，可使用这些生物体中存在的通用密码的变体。
当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98(Murray等人，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，该文献以引用方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉米优选密码子可由来自玉米的已知基因序列得出。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的核酸。例如，有效连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
所谓“宿主细胞”意指含有载体并且支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、稷和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。
术语“杂交复合体”包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未发现在其天然环境中与其一起的物质。如本文所定义，“分离的”核酸也称为“异源”核酸。除非另有规定，否则术语“昼夜核酸”意指包含编码昼夜多肽的多核苷酸(“昼夜多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且基本上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建在标准的分子生物学参考书有教导，如Bergerand Kimmel，GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES(Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南》)，选自丛书METHODS INENZYMOLOGY，vol.152，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1987)(《酶学方法》，第152卷，学术出版社，加州圣地亚哥，1987年)；Sambrook，et al.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd ed.，vols.1-3(1989)(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第二版，第1-3卷，1989年)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel，et al.，eds，Current Protocols，a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.(1994 Supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，选自《实验室指南》，格林出版联合公司与约翰威立父子出版公司的合资公司)。
如本文所用，“有效连接”包括指第一序列(如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始或介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
如本文所用，术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的种：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米。
如本文所用，“产量”包括指收获时针对谷粒水分(通常是15％)进行了修正后的每英亩谷类作物的蒲式耳数。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的调整后测试重量被确定为对收获时谷粒水分含量做了修正之后的每蒲式耳的磅重。如本文所用，改善的“源-库”关系包括指与籽粒灌浆中同化物的供给(即源)和需求(即库)间的比例改善相关的特性。
如本文所用，“多核苷酸”包括指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指代指定的序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(如次黄嘌呤核苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅举两个实例)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，“启动子”包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质(例如转录因子)的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌获得的那些启动子，所述细菌如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子被称为“组织偏好的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的实例包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下活跃的启动子。
如本文所用，“调控元件”或“调控多核苷酸”指调整与所述调控元件相关的可转录多核苷酸的表达的核酸片段。这种关联可能以顺式出现。植物启动子也可以用作调整有效连接至所述启动子的特定基因的表达的调控元件。当有效连接至可转录多核苷酸分子时，调控元件影响所述可转录多核苷酸分子的转录模式。“顺式元件”或“顺式作用元件”指影响基因表达的顺式作用的转录调控元件。顺式元件可以具有结合调整转录的转录因子、反式作用蛋白质的功能。本文公开的昼夜启动子可包含一个或多个提供昼夜基因表达模式的顺式元件。
本文公开的植物启动子和调控元件可包括通过启动子工程产生的核苷酸序列，即组合已知启动子和/或调控元件以产生人工的、合成的、嵌合的或杂交的启动子。这些启动子也可以组合来自一个或多个启动子的顺式元件，例如通过向包含昼夜表达调控元件的启动子添加异源组织特异性调控元件。因此，设想了包含至少一个本文公开的启动子的顺式元件，用于调整有效连接的多核苷酸序列的表达的嵌合或杂交启动子的设计、构建和使用。
本文公开的启动子序列(包括SEQ ID NO：31-183及其片段，包括例如其50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000和最多2500个连续核苷酸并与这些片段具有约80％或85％或90％或95％或99％同一性)预期用于调整一个或多个异源基因的表达模式。在此语境下的术语“异源”指所关注的核苷酸的表达由不是所述核苷酸自身启动子的启动子序列或其片段调整。根据本文提供的指导，本领域普通技术人员可以容易地制备本文公开的多个启动子序列的缺失构建体。选择位于公开的调控元件3’或5’端侧翼的约25-50个连续核苷酸用于调整基因表达。也进行了突变分析以增强昼夜调控的特异性。
术语“昼夜多肽”指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“昼夜蛋白质”包括昼夜多肽。除非另有规定，否则术语“昼夜核酸”意指包含编码昼夜多肽的多核苷酸(“昼夜多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“重组的”包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。如本文所用，术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
如本文所用，“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指并入蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸已知类似物。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，最优选100％的序列同一性(即互补性)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括37℃下在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃下杂交，并在0.1X SSC中于60-65℃下洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可由Meinkoth and Wahl，(1984)Anal.Biochem.138：267-84(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的方程Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L估计；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤；利用该公式、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指南可在如下文献中找到：Tijssen，LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY--HYBRIDIZATION WITHNUCLEIC ACID PROBES，part I，chapter 2，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，”Elsevier，New York(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学实验技术-与核酸探针的杂交》，第I部分，第2章，“有关杂交原理和核酸探针分析策略的综述”，爱思唯尔，纽约，1993年)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，chapter 2，Ausubel，et al.，eds，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版社与Wiley-Interscience，纽约，1995年)。除非另有规定，否则在本专利申请中，高严格性定义为在4X SSC、5X Denhardt′s(5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白于500ml水中)、0.1mg/ml煮沸的鲑精DNA和25mM磷酸钠中在65℃下杂交，和在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。
如本文所用，“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。
以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“基本上全同”。
如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
如本文所用，“比较窗口”意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的片段，其中多核苷酸序列可与参考序列进行比较并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的各种方法是本领域公知的。局部同源性算法(BESTFIT)(Smith and Waterman，(1981)Adv.Appl.Math2：482(Smith和Waterman，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页))可以对用于比较的序列进行最佳比对；还可采用同源性对比算法(GAP)(Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页))；相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)(Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页))；这些算法的计算机化实施包括，但不限于：Intelligenetics(加州山景城(Mountain View，California))的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software
Figure BDA00002091896500241
第8版(可得自Genetics Computer Group(
Figure BDA00002091896500242
程序(Accelrys公司(加州圣地亚哥(SanDiego，CA)))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序由如下文献详细说明：Higgins and Sharp，(1988)Gene 73：237-44(Higgins和Sharp，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页)；Higgins and Sharp，(1989)CABIOS 5：151-3(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet，et al.，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang，et a1.，(1992)Computer Applications inthe Biosciences 8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)和Pearson，et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31(Pearson等人，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng andDoolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60(Feng和Doolittle，1987年，《分子进化杂志》，第25卷，第351-360页)，其类似于Higgins and Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)描述的方法，并且据此以引用的方式并入本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，Chapter 19，Ausubel，et al.，eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第19章，Ausubel等人编辑，格林出版社与Wiley-Interscience，纽约，1995年)。
GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。Wisconsin Genetics Software
Figure BDA00002091896500251
第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
GAP给出具有最好的比对的家族中的一个成员。这个家族可能存在许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性打分。Wisconsin Genetics Software
Figure BDA00002091896500261
第10版中所用的打分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。
除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul，et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页))。
如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(Wooten and Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63(Wooten和Federhen，1993年，《计算化学杂志》，第17卷，第149-163页))和XNU(Claverie and States，(1993)Comput.Chem.17：191-201(Claverie和States，1993年，《计算化学杂志》，第17卷，第191-201页))低复杂性过滤程序。
在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers and Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17(Meyers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics(美国加州山景城(Mountain View，California，USA)))中所实现的。
如本文所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指利用所描述的比对程序之一采用标准参数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100％之间的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％且最优选至少95％序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调节这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列基本上相同通常意指55-100％之间的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％。
核苷酸序列基本上相同的另一指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。遗传密码的简并性允许许多氨基酸置换，这种氨基酸置换在编码相同氨基酸的核苷酸序列中导致多样化，因而有可能该DNA序列可编码相同多肽但在严格条件下不彼此杂交。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列是基本上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。
在肽的情形中，术语“基本上相同”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55％的序列同一性，优选60％，优选70％，更优选80％，最优选至少90％或95％的序列同一性。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是基本上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽基本上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位基本上相同，则它们基本上相同。“基本上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
本发明公开了昼夜多核苷酸和多肽。本发明的新型核苷酸和蛋白质具有表明它们调控细胞数量并因而在植物发育中起重要作用的表达模式。该多核苷酸在多种植物组织中表达。该多核苷酸和多肽因而提供了操纵植物发育来改变种子和营养组织发育、时间安排或组成的机会。这可用于产生不育植株、无籽植株或具有改变的胚乳组成的植株。
通过交互BLAST搜索并评估推断的蛋白质关系是否遵循物种形成模式，来鉴定拟南芥和水稻昼夜节律基因的玉米直系同源基因，然后查询叶和穗组织的振荡模式。采用这些标准，在玉米同源基因中鉴定出了数个主要核心组分，包括CCA1/LHY、TOC1、PRR7/3、GI和ZTL(图1)。
本研究鉴定了两个TOC1同源基因ZmTOCa和ZmTOCb，它们分别定位于5号和4号染色体。两个基因的转录都在6pm达到峰值，这与拟南芥TOC1基因表达相符。TOC1是伪应答调控因子(PRR)家族的成员，该家族由拟南芥和水稻中进化上保守的五个PRR基因组成(Murakami，et al.，(2007)Biosci Biotechnol Biochem 71：1107-1110(Murakami等人，2007年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第71卷，第1107-1110页)；Murakami，etal.，(2003)Plant Cell Physiol 44：1229-1236(村上等人，2003年，《植物细胞生理学》，第44卷，第1229-1236页))。除了两个ZmTOC1同源基因外，本研究还鉴定了ZmPRR73、ZmPRR37和ZmPRR59，它们是基于序列相似性水平根据水稻PRR基因命名的(村上等人，(2003))。还鉴定了两个ZEITLUPE同源基因(Kim，et al.，(2007)Nature 449：356-360(Kim等人，2007年，《自然》，第449卷，第356-360页))ZmZTLa和ZmZTLb，它们定位于2号和4号染色体。GIGANTI的两个玉米直系同源基因gigz1A和gigz1B此前已有描述(Miller，et al.，(2008)Planta 227：1377-1388(Miller等人，2008年，《植物》，第227卷，第1377-1388页))，在此确认了它们在穗和叶中的振荡。通过RT-PCR分析进一步确认了核心组分ZmCCA、ZmLHY、ZmTOC1a和ZmTOC1b的循环(图2)。与叶组织相比，发育期穗中的核心组元的振幅减弱，但仍然强健。这些数据表明大部分植物核心振荡器系统在非光合作用组织例如穗中起作用，但振荡器输出显然与影响下游昼夜表达改变的转录机器远远分离。
确定了昼夜调控的转录物遍及玉米叶细胞的大部分功能。本文所确定会受昼夜调控的6674个转录物(出自10,037个安捷伦(Agilent)阵列探针)代表超过22％的检测到的表达的全部转录物，这6674个转录物可以归属于1716个不同的基因本体(GO)项和22个KOG功能类别。
一般而言，各个基因峰在其昼夜循环中只有一个峰。当把这些基因归属于各功能项并绘制这些功能项在一天范围内的相对富集时，大部分功能具有一天中时间特有模式的显著富集。然而，一些功能项也明显趋向于具有双峰模式，其中在10AM有上午中间的峰，在傍晚6PM或晚上10PM有第二个峰。超过18％的功能项被分类为双峰调控的，并根据上午或下午峰的相对富集进一步细分。加上指定为一天中只在一个峰处达峰值的各个功能，所述1738个功能的94.5％归属于这两模式中的一种，只剩下95个归属于“其他”模式。
通常双峰模式的功能项代表更广泛的基因富集功能分类，例如蛋白质激酶活性、信号转导机制或氨基酸转运和代谢。(图5)因此，这些双峰模式往往在整天也具有充分代表性，不只是10AM和6/10PM。然而，基因和功能富集峰通常在上午中间出现并在傍晚/晚上再次出现，这仍然是昼夜模式的主要特征。在本实验中，日出是6:02AM，日落在8:40PM。因此，日出为10AM的功能峰之前4小时，但日落为6PM时间点之后2.45小时和10PM时间点之前1.25小时。附加的时间点可提供更高的分辨率，但在双峰模式中10AM＞6/10PM模式的功能富集指数比6PM＞10AM模式高出70％，这可能与这些时间点相对于日出和日落的不对称分布有关。或者，一些功能类别可能固有地在上午阶段富集，反映潜在的生物趋势。
1643个或94.5％的功能项归属于一个时间峰模式，这表明各功能在一天中有相当确定的演化。可见功能组不是均匀分布于一天的不同阶段，而是表现出特定的模式和偏向。黎明富集的功能类别包括例如：对寒冷的响应、脂类分解代谢和激素信号传导。然后在上午中间，多个激素响应功能被富集。预期中午由光合作用系统I和II、叶绿素合成和参与抗氧化剂生成的单脱水抗坏血酸还原酶(MDAR)主导。傍晚和晚上显示出明显的核糖体和DNA损伤修复(包括解旋酶、端粒酶和核酸内切酶活性)的富集，说明染色体和核糖体修复系统被激活。此外，蔗糖转运和戊糖磷酸支路在傍晚/晚上达峰值，说明了叶绿体碳水化合物代谢的力度变化。深夜峰包括红光::远红光传导，如引言所述，其不仅调控核心时钟，而且调控过氧化氢代谢。在夜间通常与细胞死亡相关的半胱天冬酶(样)活性、光系统II分解代谢、核苷酸转运和代谢以及乙酰辅酶A结合功能都达到峰值。其他不规则但令人关注的峰模式是在6PM和2AM都达到峰值的氨基酸糖基化，以及在10AM和2AM达到峰值的苹果酸酶和钙调蛋白结合。这些只是描述全株植物细胞生理学的非常复杂的情形的几个例子。
值得注意的是，尽管许多基因和功能受昼夜调控，但大部分功能类别只有少数受昼夜调控的成员。在1738个功能类别中，平均覆盖率是28.2％，中位数为20％，众数为约15％。昼夜调控的转录物无法完全代表包含多个基因的功能类别，对于昼夜调控的转录物而言，只有很少功能类别显著地富集。在昼夜调控组中，GO：0004614磷酸葡萄糖变位酶活性在6个转录物中有5个，GO：0009926生长素极性运输在4个转录物中有3个。这些发现说明昼夜调控的转录物参与但不主导这些不同的功能。
在分析中鉴定了多个玉米昼夜调控的基因。总共471个序列，包括来自未成熟穗的序列、在叶组织中有高振幅/大幅度循环的序列以及与NUE和碳::氮功能相关的多种序列。这些序列包含ORF、编码的多肽和与其相关的启动子。
核酸
本发明特别提供包括昼夜多核苷酸在内的RNA、DNA及它们的类似物和/或嵌合体的分离的核酸。
本发明还包括为在不同生物体中表达而经优化的多核苷酸。例如，对于多核苷酸在玉米植物中的表达，可变更该序列以解决特定的密码子偏好性和改变GC含量，如根据Murray等人(出处同上)所述。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
本发明的昼夜核酸包括分离的昼夜多核苷酸，所述多核苷酸包括：
(a)编码昼夜多肽及其经保守修饰的和多态性的变体的多核苷酸；
(b)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
(c)(a)或(b)的多核苷酸的互补序列。
下面的表1列出了本文公开的多核苷酸和多肽的具体成份
表1
 名称   植物物种   多核苷酸/多肽  SEQ ID NO：
 ZmTOC1b   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：1
 ZmMYB.L   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：2
 ZmZTLa   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：3
 ZmZTLb   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：4
 ZmPRR37   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：5
 ZmPRR59   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：6
 ZmCO类似物   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：7
 ZmCCA1基因组   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：8
 ZmCCA1外显子1   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：9
 ZmCCA1外显子2   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：10
 ZmCCA1外显子3   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：11
 ZmCCA1外显子4   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：12
 ZmCCA1外显子5   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：13
 ZmCCA1外显子6   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：14
 ZmCCA1外显子7   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：15
 ZmCCA1外显子8   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：16
 ZmCCA1外显子9   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：17
 ZmCCA1外显子10   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：18
 ZmCCA1外显子11   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：19
 ZmLHY基因组   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：20
 ZmLHY外显子1   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：21
 ZmLHY外显子2   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：22
 ZmLHY外显子3   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：23
 ZmLHY外显子4   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：24
 ZmLHY外显子5   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：25
 ZmLHY外显子6   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：26
 ZmLHY外显子7   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：27
 ZmLHY外显子8   玉米(Zea mays)   多核苷酸  SEQ ID NO：28
 ZmLHY外显子9   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：29
 ZmLHY外显子10   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：30
 昼夜启动子#1   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：31
 昼夜启动子#2   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：32
 昼夜启动子#3   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：33
 昼夜启动子#4   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：34
 ZmCCA1启动子   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：35
 ZmLHY启动子   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：36
 昼夜启动子#7   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：37
 昼夜启动子#8   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：38
 昼夜启动子#9   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：39
 ZmTOCa启动子   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：40
 昼夜穗启动子1   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：41
 昼夜穗启动子2   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：42
 昼夜穗启动子3   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：43
 昼夜穗启动子4   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：44
 昼夜穗启动子5   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：45
 昼夜穗启动子7   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：46
 昼夜穗启动子8   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：47
 昼夜穗启动子9   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：48
 昼夜穗启动子10   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：49
 昼夜穗启动子11   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：50
 昼夜穗启动子12   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：51
 昼夜穗启动子13   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：52
 昼夜穗启动子14   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：53
 昼夜穗启动子15   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：54
 昼夜穗启动子16   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：55
 昼夜NUE启动子1   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：56
 昼夜NUE启动子2   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：57
 昼夜NUE启动子3   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：58
 昼夜NUE启动子4   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：59
 昼夜NUE启动子5   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：60
 昼夜NUE启动子6   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：61
 昼夜NUE启动子7   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：62
 昼夜NUE启动子8   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：63
 昼夜NUE启动子9   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：64
 昼夜NUE启动子10   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：65
 昼夜NUE启动子11   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：66
 昼夜NUE启动子12   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：67
 昼夜NUE启动子13   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：68
 昼夜NUE启动子14   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：69
 昼夜NUE启动子15   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：70
 昼夜NUE启动子16   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：71
 昼夜NUE启动子17   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：72
 昼夜NUE启动子18   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：73
 昼夜NUE启动子19   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：74
 昼夜NUE启动子20   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：75
 昼夜NUE启动子21   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：76
 昼夜NUE启动子22   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：77
 昼夜NUE启动子23   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：78
 昼夜NUE启动子24   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：79
 昼夜NUE启动子25   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：80
 昼夜NUE启动子26   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：81
 昼夜NUE启动子27   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：82
 昼夜NUE启动子28   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：83
 昼夜NUE启动子29   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：84
 昼夜NUE启动子30   玉米(Zea mays)   多核苷酸   SEQ ID NO：85
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核酸的构建
本发明中的分离的核酸可以用以下方法制备：(a)标准重组方法、(b)合成技术，或其组合。在一些实施例中，本发明的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、扩增或以别的方式构建。
所述核酸可便利地包含除本发明的多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点插入核酸中以帮助分离该多核苷酸。另外，可插入可翻译序列以助于分离翻译了的本发明多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了便利的手段来纯化本发明的蛋白质。本发明的核酸(排除所述多核苷酸序列)任选地为用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。可将另外的序列添加至这种克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以助于分离所述多核苷酸，或改善所述多核苷酸向细胞内的引入。通常，本发明核酸的长度减去其本发明多核苷酸的长度为小于20千碱基对，往往小于15kb，常常小于10kb。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域已知的。示例性核酸包括诸如以下的载体：M13、λZAP Express、λZAP II、λgt10、λgt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、λDASH II、λEMBL 3、λEMBL 4、pWE15、SuperCos 1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3’SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和II、pOPRSVI CAT、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox和λMOSElox。任选用于本发明的载体包括但不限于λZAP II和pGEX。有关各种核酸的描述，参见例如Stratagene CloningSystems，目录号1995，1996，1997(加州拉荷亚(La Jolla，CA))和安玛西亚生物科技有限公司(Amersham Life Sciences，Inc)，目录号’97(伊利诺伊州阿灵顿高地(Arlington Heights，IL))。
构建核酸的合成方法
本发明中的分离出的核酸也可以通过直接化学合成制备，例如用磷酸三酯方法(Narang，et al.，(1979)Meth.Enzymol.68：90-9(Narang等人，1979年，《酶学方法》，第68卷，第90-99页))、磷酸二酯方法(Brown，etal.，(1979)Meth.Enzymol.68：109-51(Brown等人，1979年，《酶学方法》，第68卷，第109-151页))、二乙基亚磷酰胺方法(Beaucage et al.，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-62(Beaucage等人，1981年，《四面体通讯》，第22卷第20期，第1859-1862页))、如上的Beaucage等人所述的固相亚磷酰胺三酯方法，用例如如Needham-VanDevanter，et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-68所述的自动合成仪，以及美国专利No.4,458,066的固相支撑方法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过将该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。技术人员将会认识到，虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得较长的序列。
UTR和密码子偏好性
一般而言，已发现翻译效率受RNA的5′非编码区或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125(Kozak，1987年，《核酸研究》，第15卷，第8125页))和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond，et al.，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375(Drummond等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第7375页))。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing，et al.，(1987)Cell 48：691(Muesing等人，1987年，《细胞》，第48卷，第691页))和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao，et al.，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284(Rao等人，1988年，《分子与细胞生物学》，第8卷，第284页))。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。
另外，可修饰本发明多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子使用。可采用改变了的密码子使用，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉米中表达而优化异源序列中的密码子使用。本发明的多核苷酸的编码区中的密码子使用可用可商购获得的软件包(如可得自University of Wisconsin Genetics Computer Group的“Codon Preference”)进行统计分析。参见Devereaux，et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395(Devereaux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387-395页)；或MacVector 4.1(康涅狄格州纽黑文的伊士曼柯达公司(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.))。因而，本发明提供了本发明多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特性。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
序列改组
本发明提供了使用本发明多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在PCT专利公布No.96/19256中有描述。也可参见Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-9(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)和Zhao，et al.，(1998)Nature Biotech 16：258-61(Zhao等人，1998年，《自然生物技术》，第16卷，第258-261页)。一般来讲，序列改组提供出用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，可对该文库进行选择或筛选。从一群包含具有基本上序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区的相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以是能用筛选系统选择或检测的任何性质或属性，可以包括如下性质：所编码的蛋白质、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白质结合元件等等的性质，例如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施例中，选择的特性将为相对于本文所提供的野生型蛋白质而言改变了的Km和/或Kcat。在其它实施例中，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。在另外其它实施例中，与非改组的野生型多核苷酸相比，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸将具有改变了的最佳pH。这类性质的提高可占野生型值的至少110％、120％、130％、140％或高于150％。
重组表达盒
本发明还提供包含本发明的核酸的重组表达盒。可将编码所需的本发明多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本发明的活性蛋白质的多肽的cDNA或基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的宿主细胞。重组表达盒将通常包含有效连接至转录起始调控序列的本发明多核苷酸，所述转录起始调控序列将引导所述多核苷酸在预期的宿主细胞(如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可以包括：(1)在5′和3′调控序列的转录控制下克隆了的植物基因和(2)显性选择性标记物。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
可采用会引导本发明多核苷酸在再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′或2′启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-2(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页)中所述；水稻肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)PlantCell 163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第163-171页))；泛素(Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-89(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，etal.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBOJ.3：2723-30(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学学会会刊》，第3卷，第2723-2730页))和玉米H3组蛋白(Lepetit，et al.，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85(Lepetit等人，1992年，《分子和普通遗传学》，第231卷，第276-285页)和Atanassvoa，et al.，(1992)Plant Journal 2(3)：291-300(Atanassvoa等人，1992年，《植物杂志》，第2卷第3期，第291-300页))；ALS启动子，如PCT专利申请公布No.WO 96/30530所述；GOS2(美国专利No.6,504,083)和其他来自本领域技术人员已知的多种植物基因的转录起始区。对于本发明而言，泛素启动子是用于单子叶植物中表达的优选启动子。
或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下的表达。这种启动子在本文中称为“诱导型”启动子(Rab17、RAD29)。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子是Adh1启动子(其可通过低氧或寒冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可通过热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可通过光诱导)。
在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3′-端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源于多种植物基因，或源于T-DNA。待添加的3′端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或者源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。这些调控元件的例子包括但不限于3’终止和/或聚腺苷区域，例如根瘤农杆菌胭脂氨酸合酶(nos)基因(Bevan，et al.，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85(Bevan等人，1983年，《核酸研究》，第12卷，第369-385页))、马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，et al.，(1986)Nucleic Acids Res.14：5641-50(Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页)和An，et al.，(1989)Plant Cell 1：115-22(An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-122页))和CaMV 19S基因(Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-72(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页))。
可将内含子序列添加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加在胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在动物和植物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上都能增加基因表达最高达1000倍(Buchman and Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405(Buchman和Berg，1988年，《分子细胞生物学》，第8卷，第4395-4405页)；Callis，et al.，(1987)Genes Dev.1：1183-200(Callis等人，1987年，《基因与发育》，第1卷，第1183-1200页))。当设置在接近转录单位的5′端时，这种基因表达的内含子增强通常是最大的。玉米内含子Adh1-S内含子1、Adh1-S内含子2和Adh1-S内含子6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。一般参见THE MAIZE HANDBOOK，Chapter 116，Freelingand Walbot，eds.，Springer，New York(1994)(《玉米手册》，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，施普林格出版，纽约，1994年)。
植物信号序列包括但不限于：编码将蛋白质靶向植物细胞的胞外基质的信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos，et al.，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900(Dratewka-Kos等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第4896-4900页))，例如皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)延伸基因(DeLoose，et al.，(1991)Gene 99：95-100(DeLoose等人，1991年，《基因》，第99卷，第95-100页))；将蛋白质靶向液泡的信号肽，例如甘薯sporamin基因(Matsuka，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834(Matsuka等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第834页))和大麦凝集素基因(Wilkins，et al.，(1990)Plant Cell，2：301-13(Wilkins等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第301-313页))；导致蛋白质被分泌的信号肽，例如PRIb信号肽(Lind，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53(Lind等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第47-53页))或大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：119(Rahmatullah等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第119页)，以引用方式并入本文)或者将蛋白质靶向质体的信号肽，例如油菜烯脂酰ACP还原酶(Verwaert，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202(Verwaert等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第189-202页))可用于本发明中。融合至昼夜多核苷酸的大麦α淀粉酶信号序列是本发明的用于在玉米中表达的优选构建体。
包含来自本发明多核苷酸的序列的载体将通常包含标记基因，该标记基因可在植物细胞上赋予选择性表型。通常，选择性标记基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素这种抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这种基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。
可用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域公知的，包括衍自根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，如Rogers，et al.，(1987)Meth.Enzymol.153：253-77(Rogers等人，1987年，《酶学方法》，第153卷，第253-277页)所描述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本发明的示例性的根瘤农杆菌载体是Schardl，et al.，(1987)Gene 61：1-11(Schardl等人，1987年，《基因》，第61卷，第1-11页)和Berger，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6(Berger等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第8402-8406页)所述的质粒pKYLX6和pKYLX7。本发明中可用的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自加州帕罗奥多(Palo Alto，CA)的CLONTECH Laboratories，Inc.。
蛋白质在宿主细胞中的表达
使用本发明的核酸，可以在重组工程改造的细胞如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或优选植物细胞中表达本发明的蛋白质。这类细胞在非天然条件下(例如，在数量、组成、位置和/或时间方面)产生蛋白质，因为它们已通过人为干预被遗传改变成在非天然条件下产生蛋白质。
可以预期，本领域的技术人员知晓多种可用于表达编码本发明的蛋白质的核酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白质的各种方法。
简单概括而言，编码本发明蛋白质的分离核酸的表达通常可、通过使例如DNA或cDNA有效连接至启动子(组成型或诱导型)、然后整合进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调控编码本发明蛋白质的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建表达载体，该表达载体在最低程度上含有用以指导转录的强启动子(如泛素启动子)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因而，某些是弱组成型启动子，而另一些是强组成型启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列以“高水平”或约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物进行表达。
技术人员将认识到，可对本发明的蛋白质进行修饰而不减低其生物活性。可进行某些修饰以有利于目标分子的克隆、表达或掺入进融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
在原核生物中的表达
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最常由多种大肠杆菌菌株代表；然而，也可以使用其他微生物菌株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核控制序列，包括诸如β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang，et al.，(1977)Nature 198：1056(Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，et al.，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057(Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页))和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake，et al.，(1981)Nature 292：128(Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页))。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标志物也是有用的。这种标志物的例子包括规定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
选择载体以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达本发明的蛋白质的表达系统可用芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)(Palva，et al.，(1983)Gene 22：229-35(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页)；Mosbach，et al.，(1983)Nature 302：543-5(Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页))。得自法玛西亚(Pharmacia)的pGEX-4T-1质粒载体是本发明的优选大肠杆菌表达载体。
在真核生物中的表达
多种真核表达系统如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施例中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本发明的蛋白质。
异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman，et al.，(1982)METHODS IN YEAST GENETICS，Cold Spring Harbor Laboratory(Sherman等人，1982年，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室)是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(pichia)中表达的载体、菌株和方法是本领域已知的并可从商业来源(例如英杰公司(Invitrogen))获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，例如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。
本发明的蛋白质，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
还可将编码本发明的蛋白质的序列连接到多种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞系统通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已开发了多种能够表达完整蛋白质的合适宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen，et al.，(1986)Immunol.Rev.89：49(Queen等人，1986年，《免疫学评论》，第89卷，第49页))和必要的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag多聚A添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本发明的蛋白质的其他动物细胞可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)Catalogue ofCell Lines and Hybridomas(《细胞系和杂交瘤目录》)(第7版，1992)获得。
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇属(Drosophila)细胞系如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65(Schneider，1987年，《胚胎学与实验形态学杂志》，第27卷，第353-365页))。
如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列整合进载体中。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的一个例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，et al.，(1983)J.Virol.45：773-81(Sprague等人，1983年，《病毒学杂志》，第45卷，第773-781页))。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列整合进载体，如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些(Saveria-Campo，“Bovine PapillomaVirus DNA a Eukaryotic Cloning Vector”(牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体)，载于DNA CLONING：A PRACTICAL APPROACH，vol.II，Glover，ed.，IRL Press，Arlington，VA，pp.213-38(1985)(《DNA克隆：一种实用方法》，第II卷，Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-238页，1985年))。
另外，可将设置在适当植物表达载体中的昼夜表达基因用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，将适当的组织(例如，种子或叶)进行大规模蛋白质提取和纯化技术。
植物转化方法
有多种用于将外来基因转入植物中的方法是公知的并可用来将昼夜多核苷1酸插入植物宿主中，这包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如Miki等人，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”(外源DNA引入植物的方法)，载于METHODS IN PLANT MOLECULARBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，Glick and Thompson，eds.，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993)(《植物分子生物学和生物技术方法》，Glick和Thompson编辑，CRC出版社，Boca Raton，第67-88页，1993年)。所选择的方法随宿主植物而变化，包括化学转染方法如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移如农杆菌介导的基因转移(Horsch，et al.，Science 227：1229-31(1985)(Horsch等人，《科学》，第227卷，第1229-1231页，1985年))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber等人，“Vectors for PlantTransformation”(用于植物转化的载体)，载于METHODS IN PLANTMOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY(《植物分子生物学和生物技术方法》)(出处同上)，第89-119页。
可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方式可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页)和美国专利No.6,300,543)、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))、直接基因转移(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学学会会刊》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见例如Sanford等人，美国专利No.4,945,050；WO 91/10725和McCabe，et al.，(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))。还可参见Tomes等人，Direct DNA Transfer into Intact Plant CellsVia Microprojectile Bombardment(通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中)，载于Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Fundamental Methodseds.Gamborg and Phillips，Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1995(《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格出版社柏林海德堡，纽约，1995年)第197-213页；美国专利No.5,736,369(分生组织)；Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年评》，第22卷，第421-477页)；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；Datta，etal.，(1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉米)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉米)；WO 91/10725(玉米)；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉米)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)；和Gordon-Kamm，et al.，(1990)Plant Cell 2：603-618(Gordon-Kamm等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第603-618页)(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren and Hooykaas(1984)Nature(London)311：763-764(Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas，1984年，《自然》，伦敦，第311卷，第763-764页)；Bytebier，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；DeWet，et al.，(1985)In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman，et al.，pp.197-209；Longman，NY(De Wet等人，1985年，《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，第197-209页，朗文，纽约)(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)；和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；美国专利No.5,693,512(超声波降解)；D’Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(D’Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，et al.，(1995)Plant Cell Reports 12：250-255(Li等人，1995年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)；以及Christou and Ford，(1993)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1993年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)NatureBiotech.14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)；农杆菌介导的玉米转化(美国专利No.5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame，et al.，(1994)Plant J.6：941-948(Frame等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第941-948页))；激光方法(Guo，et al.，(1995)Physiologia Plantarum 93：19-24(Guo等人，1995年，《植物生理学》，第93卷，第19-24页))；超声波降解方法(Bao，et al.，(1997)Ultrasound inMedicine & Biology 23：953-959(Bao等人，1997年，《医学与生物学超声》，第23卷，第953-959页)；Finer and Finer，(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10(Finer和Finer，2000年，《应用微生物学快报》，第30卷，第406-410页)；Amoah，et al.，(2001)J Exp Bot 52：1135-42)(Amoah等人，2001年，《实验植物学杂志》，第52卷，第1135-1142页)；聚乙二醇方法(Krens，et al.，(1982)Nature 296：72-77(Krens等人，1982年，《自然》，第296卷，第72-77页))；单子叶和双子叶植物细胞的原生质可以用电穿孔(Fromm，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824-5828(Fromm等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第5824-5828页))和显微注射(Crossway，et al.，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子和普通遗传学》，第202卷，第179-185页))转化，这些文献全部以引用的方式并入本文。
农杆菌介导的转化
最广泛使用的将表达载体引入植物中的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤农杆菌和毛根农杆菌是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1(Kado，1991年，《植物科学评论》，第10卷，第1页)。有关农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述在以下文献中提供：Gruber等人(出处同上)；Miki等人(出处同上)；和Moloney，et al.，(1989)Plant Cell Reports8：238(Moloney等人，1989年，《植物细胞报道》，第8卷，第238页)。
相似地，可将基因插入源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如Benfey andChua，(1989)Science 244：174-81(Benfey和Chua，1989年，《科学》，第244卷，第174-181页)。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型叶特异性表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这样一种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因也必须存在，或者与T-DNA部分一起，或者通过其中vir基因存在于单独载体上的双元系统。这类系统、其中所用的载体、以及转化植物细胞的方法在美国专利No.4,658,082；1986年10月1日提交的美国专利申请No.913,914，它们在公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306和Simpson，et al.，(1986)Plant Mol.Biol.6：403-15(Simpson等人，1986年，《植物分子生物学》，第6卷，第403-415页)(也在‘306专利中引用)中有所描述，所述文献全文均以引用方式并入本文。
一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种的细胞通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染而言是易感的。本发明还可以想到若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。多大数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主范围，涵盖大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。单子叶植物现在可以一定的成功率进行转化。欧洲专利申请No.604662A1公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请No.672 752A1公开了使用未成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉米的方法(NatureBiotechnology 14：745-50(1996)(《自然生物技术》，第14卷，第745-750页，1996年))。
一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植株可通过使该植株产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植株的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因)接种植物组织而转化的根或苗用作植物来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。再生植物组织的此类方法的例子公开于Shahin，Theor.Appl.Genet.69：235-40(1985)(Shahin，《理论与应用遗传学》，第69卷，第235-240页)；美国专利No.4,658,082；Simpson等人(同上)和均于1986年10月1日提交的美国专利申请No.913,913和913,914，如公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306引用，将上述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。
直接基因转移
尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式而言是顽拗的，尽管最近已在稻中获得了一定的成功(Hiei，et al.，(1994)The Plant Journal 6：271-82(Hiei等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第271-282页))。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代。
一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1至4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置(biolistic device)将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300-600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford，et al.，(1987)Part.Sci.Technol.5：27(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27页)；Sanford，(1988)Trends Biotech 6：299(Sanford，1988年，《生物技术趋势》，第6卷，第299页)；Sanford，(1990)Physiol.Plant 79：206(Sanford，1990年，《植物生理学》，第79卷，第206页)和Klein，et al.，(1992)Biotechnology 10：268(Klein等人，1992年，《生物技术》，第10卷，第268页))。
物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang，et al.，(1991)BioTechnology 9：996(Zang等人，1991年，《生物技术》，第9卷，第996页)中所述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes，et al.，(1985)EMBO J.4：2731(Deshayes等人，1985年，《欧洲分子生物学学会会刊》，第4卷，第2731页)和Christou，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3962(Christou等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第3962页)。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中已有报道。参见例如Hain，et al.，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161(Hain等人，1985年，《分子和普通遗传学》，第199卷，第161页)和Draper，etal.，(1982)Plant Cell Physiol.23：451(Draper等人，1982年，《植物细胞生理学》，第23卷，第451页)。
原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn等人(1990)，发表于Abstracts of the VIIth Int’l.Congress on Plant Cell and TissueCulture IAPTC，A2-38，p.53(《第VII届植物细胞与组织培养IAPTC会议摘要》，第A2-38卷，第53页)；D’Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-505(D’Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)和Spencer，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：51-61(Spencer等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第51-61页)。
增加昼夜多核苷酸编码的昼夜多肽的活性和/或水平
提供了增加本发明的昼夜多核苷酸编码的昼夜多肽的活性和/或水平的方法。可通过将昼夜多肽提供给植物，来实现本发明的昼夜多肽的水平和/或活性的增加。该昼夜多肽可通过如下方式来提供：将编码该昼夜多肽的氨基酸序列引入该植物中，将编码昼夜多肽的核苷酸序列引入该植物中，或者修饰编码本发明的昼夜多肽的基因组座位。
如本文别处所论述过的，本领域已知有多种方法用于将多肽提供给植物，包括但不限于将多肽直接引入植物中，将编码具有细胞数目调控活性的多肽的多核苷酸构建体引入植物中(短暂引入或稳定引入)。还认识到，本发明的方法可采用不能够在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因此，可通过变更编码昼夜多肽的基因或其启动子来提高昼夜多肽的水平和/或活性。参见例如Kmiec，美国专利No.5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868。因此，提供了携带昼夜基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变增加昼夜基因的表达或增加编码的昼夜多肽的植物生长和/或器官发育活性。
降低昼夜多肽的活性和/或水平
提供了方法来通过用表达可抑制昼夜多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞，降低或消除本发明的昼夜多肽的活性。该多核苷酸可通过防止昼夜信使RNA的翻译来直接抑制昼夜多肽的表达，或者通过编码能抑制编码昼夜多肽的昼夜基因的转录或翻译的多肽来间接抑制昼夜多肽的表达。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域所熟知的，任何这种方法可用于本发明中来抑制昼夜多肽的表达。
根据本发明，如果昼夜多肽的蛋白质水平为该同一昼夜多肽在未经过遗传修饰或诱变以抑制该昼夜多肽的表达的植物中的蛋白质水平的不到70％，则昼夜多肽的表达被抑制。在本发明的具体实施例中，该昼夜多肽在根据发明的经修饰的植物中的蛋白质水平，为该同一昼夜多肽在不属于突变体的植物或者未经过遗传修饰以抑制该昼夜多肽的表达的植物中的蛋白质水平的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。昼夜多肽的表达水平可例如通过检测植物细胞或植物中表达的昼夜多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量植物细胞或植物中的昼夜多肽的植物生长和/或器官发育活性，或通过测量植物中的生物量来间接测量。进行这种检测的方法在本文的其他地方进行了描述。
在本发明的其他实施例中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除昼夜多肽的活性，所述表达盒包含编码可抑制昼夜多肽活性的多肽的多核苷酸。根据本发明，如果昼夜多肽的植物生长和/或器官发育活性为该同一昼夜多肽在未经过修饰以抑制该昼夜多肽的植物生长和/或器官发育活性的植物中的植物生长和/或器官发育活性的不到70％，则昼夜多肽的植物生长和/或器官发育活性被抑制。在本发明的具体实施例中，该昼夜多肽在根据本发明的经修饰的植物中的植物生长和/或器官发育活性，为该同一昼夜多肽在未经过修饰以抑制该昼夜多肽的表达的植物中的植物生长和/或器官发育活性的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％或不到5％。当昼夜多肽的植物生长和/或器官发育活性不能通过本文其他地方所描述的检测法测定时，则根据本发明该活性被“消除”了。确定昼夜多肽的植物生长和/或器官发育活性的方法在本文其他地方进行了描述。
在其他实施例中，可通过破坏编码昼夜多肽的基因来降低或消除昼夜多肽的活性。本发明涵盖携带昼夜基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变减少昼夜基因的表达或抑制编码的昼夜多肽的植物生长和/或器官发育活性。
因而，有许多方法可用于降低或消除昼夜多肽的活性。此外，有不止一种方法可用于减少单种昼夜多肽的活性。降低或消除昼夜多肽的表达的方法的非限制性例子在下面给出。
1.基于多核苷酸的方法：
在本发明的一些实施例中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达可抑制本发明的昼夜多肽的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本发明的目的，能够表达可抑制至少一种昼夜多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制本发明的至少一种昼夜多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白质或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白质或多肽，而蛋白质或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白质或多肽。
可抑制昼夜多肽的表达的多核苷酸的例子在下面给出。
i.有义抑制/共抑制
在本发明的一些实施例中，昼夜多肽表达的抑制可通过有义抑制或共抑制获得。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码昼夜多肽的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别那些显示出对昼夜多肽表达的最大抑制的植株。
用于共抑制的多核苷酸可对应于编码昼夜多肽的序列的全部或部分、昼夜多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或者编码昼夜多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。在其中该多核苷酸包含昼夜多肽的编码区的全部或部分的一些实施例中，将表达盒设计为消除该多核苷酸的起始密码子，使得不会翻译出蛋白质产物。
共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白质而言具有不可检测的蛋白质水平的植物。参见(例如)Broin，et al.，(2002)Plant Cell 14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)。共抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)美国专利No.5,942,657。使用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Flavell，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496(Flavell等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第3490-3496页)；Jorgensen，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973(Jorgensen等人，1996年，《植物分子生物学》，第31卷，第957-973页)；Johansen and Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938(Johansen和Carrington，2001年，《植物生理学》，第126卷，第930-938页)；Broin，et al.，(2002)Plant Cell 14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；Yu，et al.，(2003)Phytochemistry63：753-763(Yu等人，2003年，《植物化学》，第63卷，第753-763页)和美国专利No.5,034,323、5,283,184和5,942,657，将这些文献和专利以引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置包括poly-dT区来提高。参见美国专利申请公布No.2002/0048814，将其以引用的方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有相当大的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见美国专利No.5,283,184和5,034,323，将它们以引用的方式并入本文。
ii.反义抑制
在本发明的一些实施例中，对昼夜多肽表达的抑制可通过反义抑制获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达与编码该昼夜多肽的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。该反义RNA分子的过量表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用反义抑制表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别那些显示出对昼夜多肽表达的最大抑制的植株。
用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码昼夜多肽的序列的互补序列的全部或部分、昼夜转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、或者编码昼夜多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。此外，反义多核苷酸可与目标序列完全互补(即与目标序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与目标序列的互补序列的同一性低于100％)。反义抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)美国专利No.5,942,657。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献和专利中有描述：Liu，etal.，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和5,942,657，将这些参考文献和专利的每一个以引用的方式并入本文。反义抑制的效率可通过在表达盒中在反义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置处包括poly-dT区来提高。参见美国专利申请公布No.2002/0048814，将其以引用的方式并入本文。
iii.双链RNA干扰
在本发明的一些实施例中，对昼夜多肽表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。
有义和反义分子的表达可通将表达盒子设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。然后对用dsRNA干扰表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别显示出对昼夜多肽表达的最大抑制的植株。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Waterhouse，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964(Waterhouse等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第13959-13964页)，Liu，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)以及WO 99/49029、WO 99/53050、WO 99/61631和WO00/49035，将每个文献和专利以引用方式并入本文。
iv.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰
在本发明的一些实施例中，对昼夜多肽表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《遗传学自然评论》，第4卷，第29-38页)及其中引用的参考文献。
对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于编码要对其表达进行抑制的基因的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。因此，该分子的碱基配对茎区通常确定了RNA干扰的特异性。hpRNA在抑制内源基因表达中很高效，它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。参见例如Chuang andMeyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)以及Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《遗传学自然评论》，第4卷，第29-38页)。使用hpRNA干扰来抑制或消除基因表达的方法在例如以下文献和专利中有描述：Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《遗传学自然评论》，第4卷，第29-38页)；Pandolfini，et al.，BMC Biotechnology 3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页)以及美国专利申请公布No.2003/0175965，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。hpRNA构建体体内消除基因表达的效率的瞬时测定法已由Panstruga，et al.，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-140页)描述(将其以引用方式并入本文)。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环区大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见例如Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)。事实上，Smith等人证实使用ihpRNA介导的干扰，内源基因表达受到100％抑制。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法例如在Smith，et al.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；Wesley，et al.，(2001)Plant J.27：581-590(Wesley等人，2001年，《植物杂志》，第27卷，第581-590页)；Wang and Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150(Wang和Waterhouse，2001年，《植物生物学新见》，第5卷，第146-150页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《遗传学自然评论》，第4卷，第29-38页)；Helliwell and Waterhouse，(2003)Methods30：289-295(Helliwell和Waterhouse，2003年，《方法》，第30卷，第289-295页)和美国专利申请公布No.2003/0180945中有所描述，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。
还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在这个实施例中，该反义和有义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO02/00904，以引用的方式将其并入本文。
v.扩增子介导的干扰
扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能指导其自身的复制。由该扩增子产生的转录物相对于目标序列(即昼夜多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。使用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法例如在以下文献和专利中有描述：Angell and Baulcombe，(1997)EMBO J.16：3675-3684(Angell和Baulcombe，1997年，《欧洲分子生物学学会会刊》，第16卷，第3675-3684页)，Angell and Baulcombe，(1999)Plant J.20：357-362(Angell和Baulcombe，1999年，《植物杂志》，第20卷，第357-362页)以及美国专利No.6,646,805，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。
vi.核酶
在一些实施例中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是昼夜多肽的信使RNA特异性的催化性RNA或具有昼夜多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因而，该多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致昼夜多肽表达的降低。这个方法例如在美国专利No.4,987,071中进行了描述，将该专利以引用的方式并入本文。
vii.小干扰RNA或微RNA
在本发明的一些实施例中，昼夜多肽表达的抑制可通过表达编码微RNA(miRNA)的基因经RNA干扰获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调控剂，miRNA在抑制内源基因表达方面很高效。参见例如Javier，etal.，(2003)Nature 425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》，第425卷，第257-263页)，将该文献以引用的方式并入本文。
对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。该miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与另一内源基因(靶序列)互补的22核苷酸序列。为抑制昼夜表达，所述22个核苷酸的序列选自昼夜转录物序列并包含所述昼夜序列有义方向的22个核苷酸和与所述有义序列互补的相应的反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源基因的表达上很高效，它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。
2.基因表达的基于多肽的抑制
在一个实施例中，所述多核苷酸编码与编码昼夜多肽的基因结合的锌指蛋白，从而导致所述基因的表达降低。在特定实施例中，该锌指蛋白结合至昼夜基因的调控区。在其他实施例中，该锌指蛋白结合至编码昼夜多肽的信使RNA并防止其翻译。选择被锌指蛋白靶向的位点的方法已例如在美国专利No.6,453,242进行了描述，利用锌指蛋白来抑制植物中的基因表达的方法例如在美国专利申请公布No.2003/0037355中进行了描述，将这些专利每一者以引用的方式并入本文。
3.蛋白质活性的基于多肽的抑制
在本发明的一些实施例中，所述多核苷酸编码这样的抗体，该抗体结合至少一种昼夜多肽并降低该昼夜多肽的活性。在另一个实施例中，抗体的结合导致由细胞质量控制机制进行的抗体昼夜复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体表达并结合至植物细胞中的蛋白质来抑制分子途径是本领域所熟知的。参见例如Conrad and Sonnewald，(2003)NatureBiotech.21：35-36(Conrad和Sonnewald，2003年，《自然生物技术》，第21卷，第35-36页)，其以引用方式并入本文。
4.基因破坏
在本发明的一些实施例中，通过破坏编码昼夜多肽的基因，降低或消除昼夜多肽的活性。可通过本领域已知的任何方法来破坏编码昼夜多肽的基因。例如，在一个实施例中，通过转座子标签法破坏所述基因。在另一个实施例中，通过利用随机诱变或定向诱变来对植物进行诱变处理并选择具有降低的细胞数量调控因子活性的植物来破坏所述基因。
i.转座子标签法
在本发明的一个实施例中，使用转座子标签法降低或消除一个或多个昼夜多肽的活性。转座子标签法包括在内源昼夜基因内插入转座子以降低或消除所述昼夜多肽的表达。“昼夜基因”意指编码根据本发明的昼夜多肽的基因。
在该实施例中，通过在编码昼夜多肽的基因的调控区或编码区内插入转座子来降低或消除一种或多种昼夜多肽的表达。处于昼夜基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其他调控序列内的转座子可用于降低或消除所编码昼夜多肽的表达和/或活性。
用于对植物中的特定基因进行转座子标记的方法是本领域所熟知的。参见例如Maes，et al.，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96(Maes等人，1999年，《植物科学趋势》，第4卷，第90-96页)；Dharmapuri and Sonti，(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59(Dharmapuri和Sonti，1999年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第179卷，第53-59页)；Meissner，et al.，(2000)Plant J.22：265-274(Meissner等人，2000年，《植物杂志》，第22卷，第265-274页)；Phogat，et al.，(2000)J.Biosci.25：57-63(Phogat等人，2000年，《生物科学杂志》，第25卷，第57-63页)；Walbot，(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107(Walbot，2000年，《植物生物学新见》，第2卷，第103-107页)；Gai，et al.，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96(Gai等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第94-96页)；Fitzmaurice，et al.，(1999)Genetics 153：1919-1928(Fitzmaurice等人，1999年，《遗传学》，第153卷，第1919-1928页))。此外，在Bensen，et al.，(1995)Plant Cell 7：75-84(Bensen等人，1995年，《植物细胞》，第7卷，第75-84页)；Mena，et al.，(1996)Science 274：1537-1540(Mena等人，1996年，《科学》，第274卷，第1537-1540页)和美国专利No.5,962,764中描述了在选择的基因中选择Mu插入的TUSC方法，以上每个文献和专利以引用的方式并入本文。
ii.活性降低的突变体植物
用于降低或消除植物中的内源基因的表达的另外方法也是本领域已知的，并且可类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变以反向遗传学方式(使用PCR)用于鉴别其中内源基因已缺失的植株。如需这些方法的例子，请参见Ohshima，et al.，(1998)Virology 243：472-481(Ohshima等人，1998年，《病毒学》，第243卷，第472-481页)；Okubara，et al.，(1994)Genetics 137：867-874(Okubara等人，1994年，《遗传学》，第137卷，第867-874页)和Quesada，et al.，(2000)Genetics 154：421-436(Quesada等人，2000年，《遗传学》，第154卷，第421-436页)，以上每个文献以引用的方式并入本文。此外，一种用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes(定向诱导基因组局部突变))也适用于本发明，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见McCallum，et al.，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)，其以引用的方式并入本文。
影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能的突变是本领域所熟知的。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编码的蛋白质的细胞数量调控因子活性方面是特别有效的。植物昼夜多肽的适于以消除细胞数量调控因子活性为目标来进行诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离这种突变体，并且可通过遗传杂交对不同昼夜基因座中的突变进行堆叠。参见例如Gruis，et al.，(2002)Plant Cell 14：2863-2882(Gruis等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第2863-2882页)。
在本发明的另一个实施例中，显性突变体由于基因倒位和重复基因座的重组可用于引发RNA沉默。参见例如Kusaba，et al.，(2003)Plant Cell15：1455-1467(Kusaba等人，2003年，《植物细胞》，第15卷，第1455-1467页)。
本发明涵盖另外的用于降低或消除一种或多种昼夜多肽的活性的方法。用于改变或突变植物中的基因组核苷酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不限于使用RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA:DNA寡核苷酸以及重组工程寡核碱基(recombinogenic oligonucleobase)。这种载体和使用方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972和5,871,984，以上每个专利以引用的方式并入本文。另参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778(Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页)，以上每个文献和专利以引用的方式并入本文。
iii.调节细胞生长和/或器官发育活性
在特定的方法中，通过增加植物中的昼夜多肽的水平或活性来增加植物中组织发育的水平和/或活性。增加植物中的昼夜多肽的水平和/或活性的方法在本文其他地方进行了论述。简而言之，这种方法包括提供本发明的昼夜多肽给植物，从而增加该昼夜多肽的水平和/或活性。在其他实施例中，可通过这样来提供编码昼夜多肽的昼夜核苷酸序列：向植物中引入包含本发明的昼夜核苷酸序列的多核苷酸，表达该昼夜序列，增加该昼夜多肽的活性，并因此增加植物或植物部分中的组织细胞的数目。在其他实施例中，引入植物中的昼夜核苷酸构建体被稳定的整合到植物的基因组中。
在其他方法中，通过增加植物中的昼夜多肽的水平和/或活性来增加植物组织的细胞数目和生物量。这种方法在本文其他地方进行了详细公开。在一这样的方法中，将昼夜核苷酸序列引入植物中，所述昼夜核苷酸序列的表达可降低昼夜多肽的活性并从而增加植物或植物部分中的植物生长和/或器官发育。在其他实施例中，引入植物中的昼夜核苷酸构建体被稳定的整合到植物的基因组中。
如上面所论述的，技术人员会认识到，可将适当的启动子用于调节植物中的植物生长和/或器官发育多核苷酸和多肽的水平/活性。在本文其他地方已经公开了该实施例的示例性启动子。
因此，本发明还提供了当与对照植物组织的植物生长和/或器官发育比较时具有变更的植物生长和/或器官发育的植物。在一个实施例中，本发明的植物具有增加的本发明的昼夜多肽的水平/活性，因而在植物组织中具有增加的植物生长和/或器官发育。在其他实施例中，本发明的植物具有降低或消除的本发明的昼夜多肽的水平，因而在植物组织中具有降低的植物生长和/或器官发育。在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定整合了包含本发明的昼夜核苷酸序列的核酸分子，该序列有效连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
iv.调节根发育
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于：初生根的生长速率、根鲜重、侧根和不定根形成的程度、维管系统、分生组织发育或径向扩张度。
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所述方法包括调节该昼夜多肽在植物中的水平和/或活性。在一种方法中，将本发明的昼夜多肽提供给植物。在另一种方法中，通过这样来提供昼夜核苷酸序列：将包含本发明的昼夜核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该昼夜序列，从而变更根发育。在另外其他的方法中，引入植物中的昼夜核苷酸构建体被稳定的整合到植物的基因组中。
在其他方法中，通过改变昼夜多肽在植物中的水平或活性来调节根发育。当与对照植物比较时昼夜活性的增加可导致至少一种或多种如下对根发育的变更，包括但不限于：较大的根分生组织、根生长增加、增强的径向扩张、增强的维管系统、增加的根分支、更多的不定根和/或鲜根重的增加。
本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。
测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如美国专利申请公布No.2003/0074698和Werner，et al.，(2001)PNAS 18：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第18卷，第10487-10492页)，将这两篇文献以引用的方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施例的示例性启动子包括组成型启动子和根优选的启动子。示例性的根优选的启动子已在本文别处公开。
通过增加昼夜多肽的活性和/或水平来刺激根生长和增加根的重量也在改善植物的抗倒伏性方面得到应用。术语“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。对于具有竖立或半竖立生长习性的植物，该术语还指在不利(环境)条件下保持直立位置的能力。该性状涉及根系的尺寸、深度和形态。此外，通过增加昼夜多肽的水平和/或活性来刺激根生长和增加根重量也在促进外植体的体外繁殖方面得到应用。
此外，由于增加的昼夜活性的水平和/或活性引起的较高的根部生物量对产量具有直接效果以及对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物的产生具有间接的影响。在根培养物中产生的关注化合物的一个实例是紫草素(shikonin)，其产量可通过所述方法有利地增强。
因此，本发明还提供了与对照植物的根发育相比较时具有受调节的根发育的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的昼夜多肽的水平/活性和具有增强了的根生长和/或根生物量。在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定整合了包含本发明的昼夜核苷酸序列的核酸分子，该序列有效连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
v.调节苗和叶发育
还提供了用于调节植物中的苗和叶发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指植物苗和/或叶的发育的任何改变。苗和/或叶发育中的这种改变包括但不限于在苗分生组织发育方面、在叶数目、叶尺寸、叶和茎维管系统、节间长度和叶衰老方面的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶系统和苗系统的不同部分在这些系统发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶系统中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Werner，et al.，(2001)PNAS 98：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第10487-10492页)和美国专利申请公布No.2003/0074698，将这两篇文献各以引用的方式并入本文。
调节植物中苗和/或叶发育的方法包括调节本发明的昼夜多肽的活性和/或水平。在一个实施例中，提供本发明的昼夜序列。在其他实施例中，可如下来提供该昼夜核苷酸序列：将包含本发明的昼夜核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该昼夜序列，从而变更苗和/或叶发育。在其他实施例中，引入植物中的昼夜核苷酸构建体被稳定的整合到植物的基因组中。
在具体的实施例中，通过降低植物中的昼夜多肽的水平和/或活性来调节苗或叶发育。当与对照植物比较时，昼夜活性的降低可导致至少一种或多种如下苗和/或叶发育的改变，包括但不限于：叶数目减少、叶表面降低、维管减少、节间较短以及生长矮小和叶老化延缓。
如上面所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施例的示例性启动子包括组成型启动子、苗优选的启动子、苗分生组织优选的启动子和叶优选的启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。
降低植物中的昼夜活性和/或水平会导致节间较短和生长矮小。因而，本发明的方法可在产生矮秆植物方面有应用。另外，如上面所论述的，植物中的昼夜活性的调节可调节根和苗二者的生长。因而，本发明还提供了用于改变根/苗比的方法。可进一步通过降低植物中的昼夜多肽的水平和/或活性来调节苗或叶发育。
因此，本发明还提供了与对照植物相比较时具有受调节的苗和/或叶发育的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的昼夜多肽的水平/活性，改变了苗和/或叶的发育。这种改变包括但不限于与对照植物相比较，叶数目增加、叶表面增加、维管结构增加、节间更长和植物株高增加以及叶老化改变。在其他实施例中，本发明的植物具有降低了的本发明的昼夜多肽的水平/活性。
vi 调节生殖组织发育
提供了用于调节生殖组织发育的方法。在一个实施例中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”意指与其中昼夜多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物的生殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中昼夜多肽的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物生殖组织发育的时刻的任何改变(即花发育时刻的延迟或提前)。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：生殖器官的尺寸、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间周期，或者维持或发展经过开花过程的能力。微观改变可包括构成生殖器官的细胞的类型或形状的改变。
调节植物中的花发育的方法包括调节植物中的昼夜活性。在一个方法中，提供本发明的昼夜序列。可以通过这样来提供昼夜核苷酸序列：将包含本发明的昼夜核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该昼夜序列，从而变更花的发育。在其他实施例中，引入植物中的昼夜核苷酸构建体被稳定的整合到植物的基因组中。
在具体的方法中，通过降低植物中的昼夜多肽的水平或活性来调节花发育。当与对照植物比较时，昼夜活性的降低可导致至少一种或多种如下的花发育改变，包括但不限于：开花延迟、花数目减少、部分雄性不育和结籽减少。诱导开花延迟或抑制开花可用于增强诸如苜蓿之类的饲料作物的产量。用于测量花发育的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Mouradov，et al.，(2002)The Plant Cell S111-S130(Mouradov等人，2002年，《植物细胞》，第S111-S130页)，将该文献以引用的方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗优选的启动子、花序优选的启动子。
在其他方法中，通过增加本发明的昼夜序列的水平和/或活性来调节花发育。这种方法可包括将昼夜核苷酸序列引入植物从而增加昼夜多肽的活性。在其他方法中，引入植物中的昼夜核苷酸构建体被稳定的整合到植物的基因组中。增加本发明的昼夜序列的表达能调节胁迫期间的花发育。这种方法在本文别处进行了描述。因此，本发明还提供了与对照植物的花发育相比具有受调节的花发育的植物。组合物包括具有增加的本发明的昼夜多肽的水平/活性且具有改变的花发育的植物。组合物还包括具有增加的本发明的昼夜多肽的水平/活性的植物，其中所述植物在胁迫时保持或继续开花过程。
还提供了使用本发明的昼夜序列来增加种子大小和/或重量的方法。该方法包括提高植物或植物部分例如种子中的昼夜序列的活性。种子尺寸和/或重量的增加包括种子尺寸或重量增加和/或一个或多个种子部分(包括例如胚、胚乳、种皮、糊粉或子叶)的尺寸或重量增加。
如上面所论述的，技术人员将认识到用于增加种子尺寸和/或种子重量的适当启动子。该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子优选的启动子、胚优选的启动子和胚乳优选的启动子。
降低植物中的种子尺寸和/或种子重量的方法包括降低该植物中的昼夜活性。在一个实施例中，可如下来提供该昼夜核苷酸序列：将包含本发明的昼夜核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该昼夜序列，从而降低种子重量和/或尺寸。在其他实施例中，引入植物中的昼夜核苷酸构建体被稳定的整合到植物的基因组中。
还认识到，增加种子尺寸和/或重量可以还伴随有籽苗生长速度的增加或早期活力的增加。如本文所用，术语“早期活力”指植物在早期发育期间快速生长的能力并且涉及萌发后的成功建植、具有发育良好的根系和发育良好的光合作用器官。此外，当与对照比较时，种子尺寸和/或重量的增加还可导致植物产量的增加。
因此，本发明还提供了当与对照植物比较时具有增加的种子重量和/或种子尺寸的植物。在其他实施例中，还提供了具有增加的活力和植物产量的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的昼夜多肽的水平/活性和具有增加了的种子重量和/或种子尺寸。在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定整合了包含本发明的昼夜核苷酸序列的核酸分子，该序列有效连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
vii.昼夜启动子多核苷酸的使用方法
当与DNA构建体装配使得昼夜启动子序列有效连接至包含所关注的多核苷酸的核苷酸序列时，包含本发明中所公开的昼夜启动子的多核苷酸以及其变体和片段可用于任何宿主细胞(优选植物细胞)的遗传操纵。这样，本发明的昼夜启动子多核苷酸连同所关注的多核苷酸序列一起在表达盒中提供用于在所关注的宿主细胞中表达。如本发明的“实例”部分所述，本发明的昼夜启动子序列在多种组织中表达，因此该启动子序列可用于调控所关注多核苷酸的时间和/或空间表达。
合成的杂合启动子区是本领域已知的。这种区域包含有效连接至另一多核苷酸的启动子元件的一多核苷酸的上游启动子元件。在本发明的一个实施例中，通过合成的杂合启动子控制异源序列表达，该合成的杂合启动子包含有效连接至来自异源启动子的上游启动子元件的本发明的昼夜启动子序列或其变体或片段。涉及植物防御系统的上游启动子元件已被鉴定并可用于产生合成启动子。参见例如Rushton，et al.，(1998)Curr.Opin.Plant Biol.1：311-315(Rushton等人，1998年，《植物生物学新见》，第1卷，第311-315页)。或者，合成的昼夜启动子序列可包含昼夜启动子序列内存在的上游启动子元件的重复。
已经认识到，本发明的启动子序列可与其天然的昼夜编码序列使用。包含与其天然昼夜基因有效连接的昼夜启动子的DNA构建体可用于转化任何所关注的植物来引起所需的表型变化，例如调节细胞数目、调节根、苗、叶、花和胚的发育、胁迫耐受性和本文其他地方描述的任何其他表型。
本文所公开的启动子核苷酸序列和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
所关注基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。所关注作物和市场在变化，并且随着发展中国家开放了世界市场，也将会出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。所关注基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响籽粒大小、蔗糖载量等的那些。
在某些实施例中，可将本发明的核酸序列与所关注的其他多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。生成的组合可包括所关注多核苷酸中的任何一者或多者的多个拷贝。本发明的多核苷酸可以与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括但不限于动物饲料所需的性状例如高油基因(例如美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利No.5,990,389；5,885,801；5,885,802和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)和WO 98/20122)以及高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，et al.，(1988)Gene 71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)和Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))；提高了的消化性(例如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的美国专利申请No.10/053,410)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国专利申请No.10/005,429))，将上述公开内容以引用的方式并入本文。本发明的多核苷酸也可与抗虫、抗病或抗除草剂所需的性状堆叠(例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白质(美国专利No.5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))；凝集素(Van Damme，et al.，(1994)PlantMol.Biol.24：825(Van Damme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页))；伏马毒素解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒基因和抗病基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinos，etal.，(1994)Cell 78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草胺膦或basta(例如bar基因)和草甘磷抗性(EPSPS基因))以及加工或处理产品所需的性状例如高油(例如美国专利No.6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如美国专利No.5,602,321；β-酮硫解酶、聚羟丁酸合成酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，上述公开内容以引用的方式并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与影响例如雄性不育(例如参见美国专利No.5,583,210)、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或者例如细胞周期调控或基因靶向(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，以上公开内容以引用的方式合并入本文。
在一个实施例中，所关注序列可改善植物生长和/或作物产量。例如，所关注序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农学上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导。这类基因的例子包括但不限于玉米质膜H+ATP酶(MHA2)(Frias，et al.，(1996)Plant Cell 8：1533-44(Frias等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第1533-1544页))；AKT1，即拟南芥中钾摄取组织的组分(Spalding，et al.，(1999)J Gen Physiol113：909-18(Spalding等人，1999年，《普通生理学杂志》，第113卷，第909-918页))；RML基因，其在根尖细胞中激活细胞分裂周期(Cheng，etal.，(1995)Plant Physiol 108：881(Cheng等人，1995年，《植物生理学》，第108卷，第881页))；玉米谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya，et al.，(1994)Plant Mol Biol 26：1935-46(Sukanya等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第1935-1946页))和血红蛋白(Duff，et al.，(1997)J.Biol.Chem27：16749-16752(Duff等人，1997年，《生物化学杂志》，第27卷，第16749-16752页)；Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第115卷，第1259-1266页)；Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol 114：493-500(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第114卷，第493-500页)和本文引用的参考文献)。所关注序列还可用于表达负面影响根发育的基因反义核苷酸序列。
另外，除了利用传统的育种方法外，还可遗传改变诸如油脂、淀粉和蛋白质含量之类的农学上重要的性状。修饰包括增加油酸、饱和或不饱和油的含量、增加赖氨酸或硫的水平、提供必需氨基酸以及修饰淀粉。美国专利No.5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些文献以引用的方式并入本文。另一个例子是美国专利No.5,850,016中所描述的由大豆2S白蛋白编码的富赖氨酸和/或富硫种子蛋白，和Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)所述的源自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，以上公开内容以引用的方式并入本文。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽的基因(BHL)源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，参见于1996年11月1日提交的美国专利申请No.08/740,682和WO 98/20133，将这两篇文献的公开内容以引用的方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白质例如来自向日葵籽(Lilley，et al.，(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilizationin Human Foods and Animal Feedstuffs，ed.Applewhite(American Oil ChemistsSociety，Champaign，Illinois)，pp.497-502(Lilley等人，1989年，《关于人类食物和动物饲料中植物蛋白利用的世界大会论文集》，Applewhite编辑(美国油脂化学家协会，伊利诺伊香槟)，第497-502页)，其以引用方式并入本文)；玉米(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，et al.，(1988)Gene 71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)，这两篇文献均以引用方式并入本文)和水稻(Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页)，其以引用方式并入本文)。其他农学上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可编码对严重影响产量的害虫的抗性，所述害虫例如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等。这类括例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白质基因(美国专利No.5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881和Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))等等。
编码抗病性状的基因包括解毒基因，例如对抗伏马毒素的基因(美国专利No.5,792,931)；无毒(avr)和抗病性(R)基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)和Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))等等。
除草剂抗性性状可包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码针对起到抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方式。可以这类方式使用的基因的例子包括雄性组织优选的基因和具有雄性不育表型的基因如QM，其在美国专利No.5,583,210中进行了描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。
谷粒的质量反映在诸如以下的性状：饱和及不饱和油的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素的含量。在玉米中，修饰的hordothionin蛋白在美国专利No.5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中进行了描述。
还可在基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。转化植物的另一重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，如在美国专利No.5,602,321中描述的。诸如β-酮基硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
viii.额外的顺式作用元件的鉴定
可以用多种标准技术鉴定本文公开的昼夜启动子的额外的顺式作用元件，所述标准技术包括例如核苷酸缺失分析，即从启动子的5′端或内部删除一个或多个核苷酸并分析调控活性；用DNA酶I足迹法进行DNA结合蛋白质分析；甲基化干扰；电泳迁移率变动分析；用连接介导的PCR进行体内基因组足迹分析和其他常规分析，或者通过用常规DNA序列比较方法与其他已知的顺式元件基序进行DNA序列相似性分析，以及通过统计方法例如隐马尔可夫模型(HMM)来鉴定。可以用一个或多个核苷酸的突变分析或通过其他常规方法进一步分析顺式元件。
ix.嵌合启动子
组合一个或多个顺式元件的嵌合启动子是已知的(参见Venter，et al.，(2008)，Trends in Plant Science，12(3)：118-124(Venter等人，2008年，《植物科学趋势》，第12卷，第3期，第118-124页))。包含来自本文公开的启动子的顺式元件及其旁侧序列的嵌合启动子可以被工程化改造为其他启动子，例如组织特异性的启动子。例如，可以通过将包含来自一个启动子的激活因子(昼夜)页式元件的第一个启动子片段融合到包含来自另一个启动子的激活因子(组织特异性)顺式元件的第二个启动子片段来产生嵌合启动子；所得的嵌合启动子可以昼夜和组织特异性的方式增加连接的可转录多核苷酸分子的基因表达。本文公开的调控元件用于工程化改造嵌合启动子，例如通过将这种元件置于最小启动子的上游。
参考如下非限制性实例可更好地理解本发明。本领域技术人员将会理解，可以在不脱离本文所公开的并受权利要求书保护的发明的精神和范围的情况下实施本发明的其他实施例。
实例
实例1.玉米中昼夜节律研究
将玉米植株(B73基因型)种植在田间条件下并在生殖的V14-15阶段采样。根据美国海军天文台的记录(材料和方法)，采样时的光照条件是大约14.75小时日光。从第1天的日出开始，在连续3天内以4小时的时间间隔采集顶叶和未成熟穗的样品。用设计为在约105k个探针中探查全基因表达模式的定制的安捷伦(Agilent)玉米阵列进行RNA图谱分析。用于亿明达(Illumina)数字基因表达(DGE)平台的样品是在1天时间内每4小时从3个植株收集3个重复样。然后将3个样品分为3组进行分析。
将GeneTS方法应用于数据以确定周期性(Wichert，et al.，(2004)Bioinformatics 20：5-20(Wichert等人，2004年，《生物信息学》，第20卷，第5-20页))。此方法首先产生傅立叶频率的周期图。然后用Fisher g统计法评估显著傅立叶频率的显著性。在此给定的实验设计情况下，此方法显示了在检测昼夜节律中比其他常用方法更好的效力(Hughes，et al.，(2007)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 72：381-386(Hughes等人，2007年，《冷泉港定量生物学讨论会会议录》，第72卷，第381-386页)；Hughes，et al.，(2009)PLoS Genet 5：e1000442(Hughes等人，2009年，《PLoS遗传学》，第5卷，第e1000442页))。然后通过转换为q值，针对多重测量比较对来自Fisher G检验的显著性值进行修正，以评估错误发现率(Storey andTibshirani，(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100：9440-9445(Storey和Tibshirani，2003年，《美国国家科学院院刊》，第100卷，第9440-9445页))。昼夜调控的转录物被确定为每天至少有一次显著表达并且在FDR率为10％时也具有显著性的转录物。
叶子的昼夜微阵列分析
基因表达的昼夜节律可以在光合作用叶组织内方便地检测。在具有可检测到的表达的44,187个探针中，10,037个或22.7％被用GeneTS算法鉴定为循环的。循环转录物的这一比例与拟南芥中报道的比例(Hazen，et al.，(2009)Genome Biol 10：R17(Hazen等人，2009年，《基因组生物学》，第10卷，第R17页))一致。显著循环的转录物的中位数周期为24.1小时，如自然条件下所预期的。循环转录物的振幅是强健的，峰/谷比率的中位数为约5倍，许多显示出高于20倍的峰/谷比率。这些循环转录物的峰值表达表现出一个很宽的分布，峰出现在一天的所有阶段。
穗的昼夜微阵列分析
与叶的结果相反，在发育期穗中只有极少的转录物表现出昼夜节律。在38,445个表达的转录物探针中只有149个(1.7％)被明确鉴定为循环着的。尽管循环转录物数量少，但仍存在傍晚富集，大约一半循环的转录物在此阶段出现峰值。在上述149个转录物中，100个(67.1％)也在叶组织中昼夜循环。在叶和穗组织中都循环的转录物中，发育期穗中的节律的振幅严重减弱。在合并多余的探针和更彻底基因的注释后，这个清单减少到了45个推定的穗循环基因(图3)。这些基因中许多似乎是详细描述的拟南芥振荡器CCA1/LHY、TOC1、PRR7/3、GI、ZTL(ZEITLUPE，在水稻中称为Adagio样蛋白质3)的玉米同源基因。玉米穗组织核心振荡器因此似乎是完整的，但显然与其大多数转录输出系统解除了偶联。
然而在穗中循环的一组基因中发现了一些输出基因。强健循环的转录物的清单包括最多13个玉米捕光CAB转录物(叶绿素a-b结合蛋白质)，是更大的玉米CAB基因家族的子集。定位于1号染色体的CONSTANS样(ZmCO样)基因在穗和叶中循环，其表达峰值在傍晚(6PM)。然而其是先前鉴定为位于9号染色体的conz1(Miller，et al.，(2008)Planta 227：1377-1388(Miller等人，2008年，《植物》，第227卷，第1377-1388页))不同的CO同源基因。检测到了MYB样转录因子(ZmMyb.L)的强健循环，在黎明(6AM)达到峰值。此基因是REVEILLE1的同源基因，REVEILLE1是拟南芥中将昼夜节律钟和生长素途径相结合的Myb转录因子(Rawat等人，(2009))。两个穗特异性基因具有有趣的推定功能，锌指蛋白质(ZmZF-5)在10AM达到峰值，渗透胁迫/脱落酸激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶(ZmSAPK9)在6PM达到峰值。在其他循环基因中，有3个编码转运蛋白、2个热休克蛋白质、数个酶和假定蛋白质。
数字基因表达分析
专门为亿明达(Illumina)DGE表达平台(亿明达股份有限公司，美国加利福利亚圣地亚哥市镇中心大道9885号，92121(Illumina，Inc.，9885 TowneCentre Drive，San Diego，CA 92121 USA)采集了独立的样品，并分析了节律性。这代表了为确定节律性昼夜表达模式进行的首次NexGen型深度测序尝试。对来自6个时间点(ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16和ZT20)各自的3个平行样品进行了从两个限制性酶切位点DPNII和NLAIII的锚定点开始的测序。每个倍增的样品在单独的流动细胞通道中运行。评估了输出序列的质量并将输出序列相对于Dana Farber Gene Index Maize 19.0(可在万维网上的www.bio.dfci.harvard.edu/tgi/找到)进行比对。总共4.7×109个碱基对通过了测序过程的全部质量控制和比对指标，其约为每个通道1.3×108bp。对超过1.89×108个标签进行节律性行为的基因表达分析，也就是每份样品约525万标签。3个重复被人工分为连续的3天。然后用与微阵列数据相同的方法评估了数据的周期性。该数据在此处主要用于独立地确认通过统计上更强健的微阵列策略鉴定的那些循环转录物，因此在此处不用作独立发现实验。
结果显示了与安捷伦(Agilent)分析广泛的一致性。在叶组织中，2559个转录物被鉴定为在叶组织中循环。所有用安捷伦(Agilent)鉴定为循环的核心组分也在亿明达(Illumina)下被确定为循环的。两种技术都鉴定为循环的有1378个转录物。由于这些转录物是每个不同的图谱分析平台独立地发现的，这些转录物是玉米光合作用(叶)组织中循环转录物的置信度最高的碱基组。
发育期穗的亿明达(Illumina)图谱分析显示超过安捷伦(Agilent)2倍的循环转录物，其中362个显示出显著的节律性。然而，尽管发育期穗中循环基因的数量增加了，它与叶光合作用组织相比仍然很少。尽管这些不同的技术之间的一致性较低，但在两个平台中仍然从穗鉴定出了循环的48个转录物。在这48个循环的转录物中，23个被安捷伦(Agilent)和亿明达(Illumina)技术鉴定出并且在叶和穗组织中都鉴定出。在剩下的25个中，在4次可能的测试(叶安捷伦(Agilent)、叶亿明达(Illumina)、穗安捷伦(Agilent)和穗亿明达(Illumina))的3次中有24个被鉴定为循环的。这些独立结果确认核心振荡器在穗组织中起作用。
昼夜表达分析
玉米的昼夜转录谱是强健的并且与在独立的生物组织和技术平台中的模型植物拟南芥的昼夜转录谱类似。来自接收光的光合作用叶组织的结果为用安捷伦(Agilent)技术鉴定出高达22.7％(10K/44K探针)的表达的转录物存在昼夜节律。用两个独立的转录组范围分析平台，即安捷伦(Agilent)微阵列和亿明达(Illumina)标签测序，补偿任一技术固有的偏差，显示出1400个昼夜调控的转录物的最小核心高置信度组。
在非光合作用的发育期穗中，昼夜节律对转录程序不会起到显著影响。只有45个基因被鉴定为只在穗中或在穗和叶中循环。其中发现了13个CAB(叶绿素A/B转录物)，它们现在是植物中已确立的昼夜表达模式的标记物(Millar and Kay，(1991)Plant Cell 3：541-550(Millar和Kay，1991年，《植物细胞》，第3卷，第541-550页))。然而，与叶相比，它们在穗中的振幅严重减弱。核心振荡器系统的11个直系同源基因出现在这个跨组织叶-穗组中。因此，核心振荡器似乎在穗中有活性。植物的核心振荡器被描述为连锁的3或4个环路过程(Harmer，(2009)；Ueda，(2006)Mol SystBiol 2：60(Ueda，2006年，《分子系统生物学》，第2卷，第60页))。该结果说明由ZmCCA1/ZmLHY和ZmTOC1a，b组成的中心反馈环路在玉米中是保守的。此环路在叶组织中表现出极端振幅的波，可能作为转录输出的主要驱动器。在穗组织中，这些波的振幅减小，分别减小83％和94％，主要通过峰值转录水平的减小而减小。穗组织波形减小的高度强烈表明持续的昼夜循环但振幅减小。它似乎不是昼夜模式的去同步，后者可能在循环模式中散布偏移，而使峰-谷波形减弱或变模糊。如果ZmCCA1/ZmTOC1环路确实作为中心授时因子，由于其减弱的波形，其对昼夜输出基因发送信号的相对贡献会严重降低。包含例如ZmPRR73/ZmPRR37、gigz1/gigz2和ZmZTLa/ZmZTLb等基因的两个外部环路也显示波振幅的显著减小。
对穗中核心机器与输出途径解偶联的一个解释可归因于低光强度通过包裹穗的壳叶(苞叶)穿透发育期穗。昼夜表达模式的转录增强可能通过感光蛋白质例如光敏色素和隐花色素发生，因此该增强可能在相对缺乏光的穗中相应地减小。如在拟南芥中所示，核心振荡器时钟基因例如CCA1和LHY被光激活并介导输出的CAB基因的激活(Wang等人，(1997))。因此，核心振荡器的低振幅可能不能产生足够的蛋白质来引发输出途径的转录或仅能微弱地引发。有少数输出基因(其启动子可能对较低水平的核心振荡器产物敏感)被激活，但总体转录输出被有效地解除了偶联。
在穗中只有少量循环的基因可以是连接核心振荡器和输出途径的近端翻译节点。其中一个是ZmMyb.L，它在叶和穗中的表达峰在6AM。ZmMYB.L蛋白质显示与拟南芥和玉米的上午阶段基因CCA/LHY的MYB结构域的高度同一性，甚至扩展到包含独特的SHAQKYFF蛋白质基序。ZmMyb.L可能有拟南芥REVEILLE1的直系同源基因功能，REVEILLE1结合昼夜节律钟和生长素途径(Rawat，(2009))。
长成的拟南芥根和苗组织的微阵列分析表明在根非光合作用组织中有简化形式的核心振荡器在循环(James，et al.，(2008)Science 322：1832-1835(James等人，2008年，《科学》，第322卷，第1832-1835页))。根据上述微阵列表达研究，在苗组织中有6518个转录物被鉴定为循环的，与之相比，在根组织中有335个。这些结果与本文公开的发现大体相符；也就是说，在大部分非光合作用组织中，无论是根还是穗，核心振荡器的许多组分运行，但其转录输出大大减弱。
昼夜生理学功能
研究了昼夜基因表达节律以在分子水平更好地理解昼夜调控的生物学的范围，进而可有机会改善作物性能。(图5)这些结果揭示了玉米昼夜机构的许多方面，从核心时钟基因、信号传递到下游效应器基因。玉米叶基因表达的昼夜振荡是普遍的，有数千个基因及其伴随功能在昼夜起伏中循环。在一天的范围内明显演变的生理学作用是有趣的，并具体表明了表达的分阶段控制，但这也可以是对昼夜节律中近端和远端事件作出响应而展现出的生理事件的自然演进。已认识到，采用更细的时间分辨率便能获得更多昼夜调控的转录物，同时能更好地描述一天中功能显现程度的演变。此全基因组昼夜图谱分析调查是首次针对玉米的研究，结合超过1700个功能项的分配，揭示了一天中功能事件连续演变的持久轮廓。已经清楚的是，昼夜节律是复杂的，并深深地交织在细胞的全部生物学过程中。据推测这适于细胞机构一致或协调的表达。
在上午和下午/晚上的双峰功能富集模式的存在是有趣的，几乎肯定地反映植物日常作息中的一种基本活动。更多的基因在10AM和6PM的时间点出现峰值，这本身使得这些基因所属的更多的功能分类也在这些时间出现峰值，从而形成此双峰功能模式。尽管各个昼夜调控的基因只在一天中的一个时间出现峰值，功能分类是双峰的事实意味着在这些功能分类下的不同基因在不同的时间出现峰值。现在还可以考虑与最近描述的被校准到中午的“太阳钟”的可能的关系(Yeang，(2009)Bioessays 31：1211-1218(Yeang，2009年，《生物短评》，第31卷，第1211-1218页))。这些上午和晚上的峰可表示昼夜调控的基因与太阳钟调控的基因之间进行的通信。
昼夜模式在叶中很强，但在发育期穗中较弱。发育期穗也是经历昼夜振荡的曲折的光合作用源器官的主库。即使未成熟的穗自身不具有明显的内部昼夜驱动，可以预期会发生从源器官接收昼夜驱动(例如通过移动信号的波和固定的碳)，以从外部驱动某些基因的昼夜转录作用。但是，这显然没有观察到。就一天中少数穗昼夜调控的基因出现峰值的时间而论，功能富集说明信号转导和转录在上午，光合作用在下午，核心振荡器和转录调控在晚上。
核心时钟机构以及源于此的邻近信号机构的组分可以例如改变或扩展源和库例如叶和穗之间关系达到正向影响作物表现这样的方式改进。已证实来自不同种质源的昼夜模式的大规模遗传互补能增强组合的昼夜模式和表观适应性(Ni，(2009))。
实例2.ZmCCA1和ZmLHY的基因组结构
在推断ZmCCA1和ZmLHY的玉米基因模型的过程中发现该基因分别由约45kb和78kb的基因区域编码(图4)。这种大小的玉米基因极为罕见，其平均基因大小接近4kb(Bruggmann，et al.，(2006)Genome Res 16：1241-1251(Bruggmann等人，2006年，《基因组研究》，第16卷，第1241-1251页))。ZmCCA1和ZmLHY基因的外显子-内含子模型是由从BAC测序获得的其cDNA序列和基因组序列的比对推导出的。ZmCCA1基因由11个外显子组成，这些外显子被10个不同长度的内含子分开。最长的是内含子#2(约9kb)和内含子#6(约15.6kb)，在玉米基因组中很罕见。翻译起始密码子ATG位于外显子#5。这意味着未翻译的5′UTR被分为大小在40-200bp范围内的5个小外显子。ZmLHY基因由10个外显子组成，这些外显子被9个不同长度的内含子分开。(在现有的EST中小外显子可能丢失)。内含子2为约30.0kb，内含子6为约20.1kb，它们可能是玉米基因组中最大的内含子。已知控制基因表达的调控序列通常位于内含子。非常长的内含子可能在ZmCCA1和ZmLHY调控中起作用。ZmCCA1和ZmLHY基因都极长。特别长的基因可能减慢转录，因而是基因表达的一种基因组调控形式。与ZmCCA1类似，翻译起始密码子ATG位于外显子5。5’UTR的复杂外显子结构说明前体mRNA的成熟可能是这些基因另一个水平的调控。
DNA测序
用双链随机Shutgun法(Bodenteich等人，Shotgun cloning or the strategyof choice to generate template for high-throughput dideoxynucleotide sequencing(用以生成高通量双脱氧核苷酸测序模板的Shutgun克隆法或选择策略)，载于：M.D.Adams，C.Fields，J.C.Venter(Eds.)，Automated DNA Sequencingand Analysis，Academic Press，San Diego，1994，pp.42-50(M.D.Adams、C.Fields、J.C.Venter编辑，《自动DNA测序和分析》，学术出版社，圣地亚哥，1994年，第42-50页))对BAC克隆测序。简而言之，在通过双醋酸盐清除裂解物方案(double-acetate cleared lysate protocol)分离BAC克隆后，通过雾化使其断裂并将所得片段末端修复，亚克隆到pBluescript II SK(+)中。在通过电穿孔转化到DH-10B电转感受态大肠杆菌(Escherichia coli)细胞(英杰(Invitrogen))后，用自动Q-Bot菌落挑选仪(Genetix)挑菌落并放在含6％甘油和100μg/ml氨苄青霉素的冷冻培养基中储存于-80℃。然后用Templiphi DNA测序模板扩增试剂盒方法(通用电气医疗集团(GEHealthcare))分离质粒。简言之，Templiphi方法使用噬菌体
Figure BDA00002091896500861
DNA聚合酶，通过等温滚环扩增法扩增环状单链或双链DNA(Reagin，et al.，(2003)J.Biomol.Techniques 14：143-148(Reagin等人，2003年，《生物分子技术》，第14卷，第143-148页))。然后将扩增产物在95℃变性10min并在384孔板中进行末端测序，测序时使用载体引发类型的M13寡核苷酸和ABIBigDye version 3.1 Prism测序试剂盒。在基于乙醇的清除后，将循环测序反应产物重溶并在Perkin-Elmer ABI 3730xl自动测序仪上检测，并用公共域的Phred/Phrap/Consed软件包(在万维网上的www.phrap.org/phredphrapconsed.html)组装各个序列。用Exgap(A.Hua，俄克拉荷马大学(University of Oklahoma)，个人通信)查看和确认重叠群顺序。Exgap是本地图形工具，其使用碱基对读取信息对Phred、Phrap和Consed产生的重叠群排序，并确认基于Phrap的组装的准确性。随后，大部分所关注的重叠群之间的测序缺口通过如下方式关闭：在定制设计的测序引物存在下，对先前用Templiphi扩增试剂盒方法扩增的质粒DNA模板进行测序，并将所得的定制序列插入原来的基于Phrap的组装中。也通过对与公开的BAC DNA序列(即来自美国国家生物技术信息中心核苷酸数据库的ZMMBBc0099K11(GenBank AC211312.1)和ZMMBBc0076L18(GenBankAC213378.3))的重叠区进行测序，来确认剩下的所关注的重叠群之间的缺口序列。
实例3.昼夜调控的启动子
光和温度的昼夜(白天)循环是所有活生物适应的环境因素。植物生理学的几乎所有方面例如生长、发育、光合作用和光合同化物分配、呼吸作用、应激反应、激素反应、氮同化都受昼夜调控。
一天特定时间的启动子提供根据自然昼夜模式以受控方式操纵特定生理或代谢过程的工具。例如，一天中对晨间时钟基因CCA1和LHY的人工下调会导致参与光合作用和碳水化合物代谢的基因的上调，从而提高长势和产量。为实现下调，CCA1和LHY启动子可驱动其自身的RNAi表达盒。
全基因组的昼夜RNA图谱分析为一天中每个阶段的启动子提供具有高诱导性和低背景的候选物。根椐需要，具体的一天的时间的例子是脉动(即每天只短暂转录一次)、宽峰的(例如转录12h开启，12h关闭)或二者之间任何位置。
涉及多种农艺学性状(例如耐冻性、耐寒性、耐旱性、通过改善代谢引起的产量增加)的基因适于用本文公开的昼夜调控元件调节。任选地，这些昼夜元件与组织特异性启动子联合使用以优化所关注的基因的所需表达模式。例如，在一个实施例中，改善耐旱性的基因在表现出中午或傍晚左右的峰表达模式的昼夜调控元件与根特异性启动子元件的共同控制下表达。类似地，改善耐寒性和耐冻性的基因在表现出黎明或晚上的峰表达模式的昼夜调控元件与叶特异性启动子元件的共同控制下表达。此外，涉及碳水化合物代谢和光合作用期间源/库关系的基因在本文公开的昼夜启动子元件与一个或多个组织特异性启动子元件的共同控制下表达。已知多种基因涉及非生物胁迫耐性和氮利用效率(参见例如美国专利申请公布No.US 2010/0223695；US 2010/0313304；US 2010/0269218)。如图5所示，属于多个功能分类的基因表现出不同的昼夜表达模式。例如，GO：0009651对盐胁迫的响应在上午中间出现峰值，而GO：0008643碳水化合物转运在晚上出现峰值。
来自相关途径的与昼夜调控的那些基因共调控的基因也在本发明的范围内。对这些相关途径成员的表达进行操控以通过使用本文公开的一个或多个昼夜调控元件更好地调控。
启动子基序分析方法
文献中已证明少量基序的组合通过相长和相消干涉能产生在任何相移下达到峰值的波形。(例如CBE：Wang，et al.，(1997)Plant Cell 9：491-507(Wang等人，1997年，《植物细胞》，第9卷，第491-507页)和EE：Alabadí，et al.，(2001)Science 293：880-883(Alabadí等人，2001年，《科学》，第293卷，第880-883页)。然而，这些控制元件的数量和其在植物种间的保守性的程度未被充分阐述。所述144个玉米基因的启动子根据授时因子时间(即其峰值表达的时机)分类，其中ZT0＝6am、ZT4＝10am、ZT8＝2pm、ZT12＝6pm、ZT16＝10pm并且ZT20＝2am。对每组启动子分析了远缘物种拟南芥中鉴定的基序的存在。基序是“CBE”、“EE”、“O-G-box”、“Morning Element”、“SORLIP1”、“Refined MorningConsesnus”、“Evening GATA”、“Telo Box”、“Starch Box”和“Protein Box”。这些基序是通过文献检索鉴定的，包括被鉴定为上午、晚上和夜间表达的基序。在TSS的2000bp内以正向和反向扫描启动子，以得到基序的精确匹配。
表2
  元件   序列   SEQ ID
  CBE   AAAAATCT   SEQ ID NO：472
  CBE’   AGATTTTT   SEQ ID NO：473
  EE   AAATATCT   SEQ ID NO：474
  EE’   AGATATTT   SEQ ID NO：475
  O G-Box   GCCACGTG   SEQ ID NO：476
  O B-Box’   CACGTGGC   SEQ ID NO：477
  Morning Element   AACCAC   SEQ ID NO：478
  Morning Element’   GTGGTT   SEQ ID NO：479
  SORLIP1   GCCAC   SEQ ID NO：480
  SORLIP1’   GTGGC   SEQ ID NO：481
  Refined Morning Element   CCACAC   SEQ ID NO：482
  Refined Morning Element’   GTGTGG   SEQ ID NO：483
  Evening GATA   GGATAAG   SEQ ID NO：484
  Evening GATA’   CTTATCC   SEQ ID NO：485
  TeloBox   AAACCCT   SEQ ID NO：486
  TeloBox’   AGGGTTT   SEQ ID NO：487
  StarchBox   AAAGCCC   SEQ ID NO：488
  StarchBox’   GGGCTTT   SEQ ID NO：489
  Protein Box   ATGGGCC   SEQ ID NO：490
  Protein Box’   GGCCCAT   SEQ ID NO：491
从广泛的文献检索中搜集了昼夜节律基序，包括：
CBE：Carréand Kay，(1995)Plant Cell 7 2039-2051(Carré和Kay，1995年，《植物细胞》，第7卷，第2039-2051页)。EE：Harmer and Kay，(2005)Plant Cell 17 1926-1940(Harmer和Kay，2005年，《植物细胞》，第17卷，第1926-1940页)。
G-BOX、TELO、STARCH、PROTEIN和GATA：Michael，et al.，(2008).PLoS Genet.4e14(Michael等人，2008年，《PLoS遗传学》，第4卷，第e14页)。SORLIP和Refined Morning Consensus：Hudson and Quail，(2003)Plant Physiol.1331605-1616(Hudson和Quail，2003年，《植物生理学》，第133卷，第1605-1616页)。Morning Element：Harmer and Kay，(2005)Plant Cell 17 1926-1940(Harmer和Kay，2005年，《植物细胞》，第17卷，第1926-1940页)。
对来自若干基因的EE和CBE基序构建了隐马尔可夫模型(HMM)，所述基因包含显著循环并与其拟南芥直系同源基因在同一适当阶段循环的基序。这些HMM没有显示对任何周围碱基的偏好，因此使用精确核心基序进一步分析。从所在序列中找出基序和反向互补的精确匹配。将所发现的基因数量和基序总数相对于随机概率和相对于该组的剩余部分进行比较以寻找富集。
基序分析结果
“CBE基序”是一个8bp基序，又称为CCA1结合元件，其在本分析规模的组中应随机出现13次；在144个启动子中，准确的CBE基序出现了40次。CBE基序富集于在白天时分发现的基因中，其遵循拟南芥CCA1的玉米直系同源基因的表达模式(包括在本发明中)。
“EE基序”是一个8bp基序，又称为Evening Element，其在本分析规模的组中应随机出现13次；在144个启动子中，准确的EE基序出现了34次。此外，该基序的普遍出现集中于对应晚上和夜间峰值基因的那些启动子，＞40％的该基序位于ZT12组的启动子，＞70％的情形处于6pm-2am之间。在ZT12出现峰表达的那些基因中，23个基因中有12个包含至少1个EE。
“O-G-Box”被鉴定为上午驱动基序，本文的数据表明全部发现的O-G-Box基序中50％位于光照开始后的第一个时间点ZT4。其他上午元件“Morning Element”、“SORLIP1”和“Refined Morning Element”都显示类似的模式，峰富集在光照开始后紧接着的那些时间点(分别是28％、33％和31％)，与这些启动子是光驱动的理论相符。也与此相符的是这样的事实：如果是通过长白天时间培育植物来产生初始数据，则这些启动子的存在是针对两个真正黑暗时间点ZT16和ZT20选择的。
“Evening GATA”、“Telo Box”、“Starch Box”和“Protein Box”基序都被鉴定为晚上和深夜基序。在此，在定义为中午的时间点，当光照最亮时，存在这些基序的低富集。这些元件在全部晚上和夜间时间点的相对宽的分布范围与多个基序组合产生不同峰表达阶段的理论一致。
务必注意，鉴定出的144个启动子中的许多携带不止一个基序，每个启动子中发现的基序的中位数是4，发现的最大基序数是12。其中的12个启动子在每个时间点上都不包含任何基序。在ZT12峰值组(包括高度普遍的EE基序)中，23个基因中有11个不包含典型EE，且如前所述，数个基因不包含任何已知基序，这表明其他因子和基序在起作用，使得观察到高振幅的波形，然而它们也可包含于本文公开的启动子序列内。
启动子表达分析
幼苗制备
按如下方法将GS3种子灭菌并使之准备萌发：用70％乙醇洗涤5分钟，然后用含50％漂白剂和2滴20的溶液洗涤15分钟。然后用无菌水洗涤3次，分别为5、15和5分钟。用30％过氧化氢洗涤种子5分钟，然后用无菌水洗涤3次。然后将种子放在无菌水中浸泡5小时。
用15ml无菌水湿润无菌育苗纸并置于无菌的Q托盘中。以相等的间隔在每个托盘放入16粒种子，用另一张无菌育苗纸覆盖，并用9ml无菌水打湿。用Austraseal胶带密封Q托盘，并置于22℃光照培养室中，培养3天。
除去包裹发育期幼苗的种皮材料，并将萌发的幼苗接种在含4.3％MS基础盐、0.1％肌醇、0.5％MS维生素储液和40％蔗糖的培养基(pH 5.6)上，每个平板接种2株。
叶的制备与轰击
从21/2至3周大的GS3幼苗的最嫩叶(部分露出的)分离1英寸宽的横切片，并接种在含4.3％MS基础盐、0.1％肌醇、0.5％MS维生素储液和40％蔗糖的培养基(pH 5.6)上以便实行轰击。
胚制备
用含与测试启动子有效连接的GUS基因的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚。如下进行转化。
在授粉8-14天后收集玉米GS3穗并在30％
Figure BDA00002091896500922
漂白剂和0.5％Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水冲洗2次。切下未成熟胚并以胚轴侧朝下(盾片侧朝上)的方向放置，每个平板25个胚。将这些胚在轰击前4天在560L培养基中黑暗培养。560L培养基是基于N6的培养基，包含Eriksson维生素、硫胺素、蔗糖、2，4-D和硝酸银。在轰击当天，将胚转移到560Y培养基中4小时，然后布置在2.5cm的靶区域内。560Y培养基是高渗培养基(含高浓度蔗糖的560L培养基)。在轰击后，将胚维持于560Y培养基(一种基于N6的培养基)上1天，然后染色观察GUS表达。
轰击
按如下方法制备DNA/金颗粒混合物用于轰击：用乙醇预先洗涤60mg0.6-1.0微米的金颗粒，用无菌蒸馏H2O冲洗并重悬于总共1mL的无菌H2O中。通过超声处理25μL预先洗涤的0.6μM金颗粒，并加入到20μL100ng/μL的测试质粒中，将DNA沉淀于金颗粒表面。将该混合物再次超声处理并加入2.5μL TFX。将该溶液置于低速设置的漩涡振荡器上10分钟。然后将该溶液在10K RPM下离心1min，并从管中除去液体。加入60μL乙醇，然后将该溶液再次超声处理。然后在轰击前，将10μL该DNA/金混合物置于每个巨载体上并使之干燥。
在27-28英寸汞柱的真空下，对叶和幼苗组织在1100psi、对胚在450psi下用PDS-1000/He枪轰击幼苗。巨载体和阻挡屏之间的距离为6和8cm之间。轰击后将平板在密封容器中在27-28℃培养18-24h。每个构建体的2个平板在黑暗中培养，另2个平板在光照下培养。
通过将幼苗浸入含100mM NaH2PO4-H2O(pH 7.0)、10mM EDTA、0.5mM K4Fe(CN)6-3H2O、0.1％Triton X-100和2mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷酸的GUS分析缓冲液中，分析轰击后的组织中瞬时GUS表达。将该组织在黑暗中37℃温育24h。用70％乙醇更换GUS染色溶液终止分析。在显微镜下观察GUS表达/染色。
BMS转化
在含40ml#237培养基(4.3％MS基础盐、0.1％肌醇、0.5％MS维生素储液、0.002％2，4-D和40％蔗糖，pH 5.6)的250ml锥形瓶中，在黑暗中、28℃下以约150RPM摇动下培养BMS(墨西哥黑甜玉米)细胞3天。此时，加入25ml#237液体培养基并使培养物再继续生长3天，此时可能发生农杆菌转化。在此前1天，将含有包含与测试启动子有效连接的GUS基因的质粒的农杆菌培养物置于含适当的抗生素的10ml培养物中，并使之在28℃生长过夜。
将每个250mL锥形瓶置于层流净化罩中10分钟以允许细胞沉降。移去20ml上清液。将剩余的混合物移到50ml管中并在3200RPM离心5min。除去上清液并用40ml 561Q液体培养基更换。561Q是基于4％N6的培养基，包含Eriksson维生素(1X)、0.005％硫胺素、68.5％蔗糖、0.0015％2，4-D、0.69％L-脯氨酸和36％葡萄糖，pH为5.2。将细胞再次在3200RPM离心5min。将细胞重悬在561Q中达到15ml的终体积，并分成125ml锥形瓶中的7.5ml等分试样。
然后将农杆菌培养物在3200RPM离心5分钟，倒去上清液，将沉淀重悬在2ML 561Q+乙酰丁香酮(AS)中。乙酰丁香酮溶液是通过在DMSO中配制100mM溶液制备的。将该溶液按1μL A.S./1mL#561Q加入561Q中。测量OD550的吸光度以确定用于转化的细胞浓度。在OD550为0.75时，将1ml农杆菌溶液加入5ml 561Q+AS中，然后与7.5ml BMS细胞在黑暗中28℃下以150RPM的速度摇动共培养3小时。
在3小时温育后，向该13.5ml的培养物加入更多561Q培养基以使其体积在50ml管中达到约48ml。将12ml培养物涂布于无菌滤纸盘上，然后放在562U培养基的平板上，在28℃黑暗中培养4天。562U是基于4％N6的培养基，包含Eriksson维生素(1X)、0.005％硫胺素、30％蔗糖、0.002％2，4-D、0.69％L-脯氨酸，pH为5.8。然后将滤纸移到563N平板上，在28℃黑暗中再培养2天。563N是基于4％N6的培养基，包含Eriksson维生素(1X)、0.005％硫胺素、30％蔗糖、0.0015％2，4-D、0.69％L-脯氨酸和0.5％MES缓冲液，pH为5.8。
为每个测试构建体建立4个平板。将每个构建体的两个BMS平板从黑暗取出并对GUS染色，而其他两个则在对GUS染色前置于光照下5小时。将BMS细胞从滤纸上刮下放入新管中并通过将细胞浸入包含100mMNaH2PO4-H2O(pH 7.0)、10mM EDTA、0.5mM K4Fe(CN)6-3H2O、0.1％TritonX-100和2mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷酸的GUS分析缓冲液进行瞬时GUS表达分析。将该组织在黑暗中37℃温育24h。用70％乙醇更换GUS染色溶液终止分析。在显微镜下观察GUS表达/染色。
代表性启动子表达结果
Zm-SARK PRO(PCO646468)
采用ZM-SARK PRO构建体时，在萌发幼苗的轰击中检测到了表达，但未在叶或胚轰击或BMS转化中检测到。
Zm-CCA PRO(PCO651594)
采用ZM-CCA PRO构建体时，在测试的每种组织类型中都检测到了表达。
ZM-LHY PRO：ADH1 INTRON(PCO639678)
采用ZM-LHY PRO构建体时，在胚的轰击中检测到了表达，但未在叶或幼苗轰击或BMS转化中检测到。
ZM-LHY PRO(ALT1)(PCO639678)
采用ZM-LHY PRO(ALT1)构建体时，在全部轰击实验中检测到了表达，但未在BMS转化中检测到。
ZM-NIGHT2 PRO(PCO643174)
采用ZM-NIGHT2 PRO构建体时，在胚和叶的轰击中检测到了表达，但未在胚轰击或BMS转化中检测到。
ZM-NIGHT1 PRO(PCO503721)
采用ZM-NIGHT1 PRO构建体时，在测试的组织中没有发现可检测的表达。也有可能是在所用的测试条件下没能捕捉到昼夜表达模式。
ZM-LICH2 PRO(PCO642613)
采用ZM-LICH2 PRO构建体时，在测试的每种组织中都检测到了表达。
实例4.转基因植物的转化和再生
用质粒轰击来自温室供体植株的未成熟玉米胚，所述质粒含有可有效连接至干旱诱导型启动子RAB17启动子(Vilardell，et al.，(1990)Plant MolBiol 14：423-432(Vilardell等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第423-432页))的转化序列和赋予针对除草剂双丙氨膦的抗性的选择性标记基因PAT。或者，该选择性标记基因在单独的质粒上提供。如下进行转化。培养基配方见下文。
靶标组织的制备：
将穗去壳并在30％
Figure BDA00002091896500951
漂白剂加0.5％Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。
DNA的制备：
制备质粒载体，该质粒载体包含可有效连接至泛素启动子的转化序列。使用如下的CaCl2沉淀程序将该质粒DNA加上含有PAT选择性标记的质粒DNA沉淀于1.1μm(平均直径)的钨小球上：
100μl制备的钨粒子水溶液
10μl Tris EDTA缓冲液中的(1μg)DNA(1μg总DNA)
100μl 2.5M CaCl2
10μl 0.1M亚精胺
将每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时保持在复式管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml 100％乙醇洗涤，离心30秒。再次除去液体，将105μl 100％乙醇加到最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μl点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。
粒子枪处理：
将样品板在粒子枪#HE34-1或#HE34-2中以水平#4进行轰击。所有样品接受650PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。
后续处理：
在轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2星期进行分培。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4个星期)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的盘插入孔(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1星期，随后在温室中再生长1-2个星期，然后转移到典型的600个盆(1.6加仑)并生长至成熟。针对增加的耐旱性对植株进行检测和评分。测量改善的耐旱性的测定法是本领域的常规工作，包括例如当与干旱条件下的对照玉米植株比较时在相同环境条件下的核仁-抽穗能力产量增加。作为另一种选择，可针对分生组织发育的调节(即穗上小穗形成的降低)监测转化植株。参见例如Bruce，et al.，(2002)Journal of Experimental Botany 53：1-13(Bruce等人，2002年，《实验植物学杂志》，第53卷，第1-13页)。
轰击法和培养基：
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0mlEriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和288g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；2.0g/l(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l 2，4-D(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；3.0g/l(在用去离子水定容后加入)和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素储液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼去离子水定容)(Murashige and Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473(Murashige和Skoog，1962年，《植物生理学》，第15卷，第473页))、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l 0.1mM脱落酸(调至pH 5.6后用精炼去离子水定容)；3.0g/l
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(在用去离子水定容后加入)和1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素母液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH 5.6后用精炼去离子水定容)和6g/l bactoTM琼脂(在用精炼去离子水定容后加入)，无菌并冷却至60℃。
实例5.农杆菌介导的转化
对于用本发明的转化序列的反义序列对玉米进行农杆菌介导的转化，优选的是采用Zhao的方法(美国专利No.5,981,840和PCT专利公布No.WO98/32326，所述专利的内容据此以引用的方式并入本文)。简单而言，从玉米分离出未成熟胚并使胚与农杆菌的悬浮液接触，其中该细菌能够将转化序列转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，优选将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中用于开始接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地，在感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上培养。在这个共培养期之后，设想到任选的“静息”步骤。在该静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：静息步骤)。优选将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不加选择剂，用于消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息期。接着，将经接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生为植株(步骤5：再生步骤)，并优选将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。针对分生组织发育的调节对植株进行监测并评分。例如，对苗和花分生组织的尺寸和外观的改变和/或叶、花和/或果实的产量增加进行监测。
实例6.玉米昼夜基因的过表达影响植物尺寸和生长
通过用表达该转基因的转基因植物检测昼夜基因的功能。用转基因特异性引物RT-PCR确认转基因表达。
营养生长和生物量积累：
与非转基因近亲相比，转基因植物(T1代)应该表现出植株高度的增加。通过比较转基因植物与未转化对照组的茎直径值，测量转基因植物的茎。植株高度和茎粗细的增加会导致转基因植物较大的植株高度和生物量。
已经发现昼夜基因主要通过加快生长速率而不是延长生长周期而影响植物生长。增强的生长(即增加的植物尺寸和生物量积累)似乎主要是由于加快的生长速率而不是由于延长的生长周期，因为根据吐丝和开花日期，转基因植物的开花没有延迟。因此，昼夜基因的过表达会加快植物的生长速率。加快的生长速率似乎与增加的昼夜速率相关。
转基因植物中增加的营养生长、生物量积累和加快的生长速率可以用对杂交和近交背景的后生世代(T3)的大量田间实验进一步检测。转基因植物预期显示以下一种或多种特性：植株高度增加、茎直径增加、秸秆干重增加、叶面积增加、植物总干重增加。
生殖生长和谷粒产量：
昼夜基因的过表达可能与增强生殖组织生长相关。T1转基因植物预期会表现出以下一种或多种特性：穗长度增加、每个穗的籽粒总重量增加、每个穗的籽粒数量和籽粒尺寸增加。籽粒和穗特性的正变化与谷粒产量增加相关。
转基因植物增加了的生殖生长和谷粒产量已被对后生世代(T3)的大量田间实验所确认。在近交和杂交背景中都观察到了增强。与作为对照的非转基因近亲相比，转基因植物预期显示以下一项或多项的显著增加：主穗干重量、次穗干重量、穗丝干重量和壳干重量。
也评估了转基因植物的胁迫耐性参数，这些参数包括：减少的ASI、减少的秃尖和减少的败育籽粒数量。当在高植物密度胁迫条件下培育植物时，减少程度可能更大。这些参数的减少量度通常与生物胁迫耐性有关。
实例7.昼夜序列的变体
A.不改变所编码的氨基酸序列的昼夜序列的变体核苷酸序列
用昼夜核苷酸序列产生变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列所具有的开放阅读框核苷酸序列与相应的SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列相比具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性。这些功能变体是用标准密码子表产生的。虽然变体的核苷酸序列被改变，但开放阅读框所编码的氨基酸序列没有改变。
B.昼夜多肽的变体氨基酸序列
产生了昼夜多肽的变体氨基酸序列。在这个实例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。通过考虑蛋白质比对(与其他直系同源基因或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择出这样的氨基酸，其被认为不处在高选择压力下(不高度保守)，且相当容易地被具有相似的化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸置换。利用蛋白质比对，可对适当的氨基酸进行改变。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。使用这个方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。
C.昼夜多肽的额外的变体氨基酸序列
在该实例中，产生出相对于参比蛋白质序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。这后一尝试要求从比对鉴别保守区和可变区，然后明智地应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。
主要地，基于各个昼夜蛋白质之间或其他多肽之间的保守区作出哪些氨基酸序列要进行改变的决定。基于序列比对，多肽的很可能被改变的各个区域以小写字母表示，而保守区以大写字母表示。应认识到，可在以下保守区域中作出保守置换而又不改变功能。另外，技术人员会理解，本发明的序列的功能变体可在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸变更。
然后产生出与原始蛋白质序列相差在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性范围内的人工蛋白质序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表3中提供。
表3.置换表
  氨基酸   强相似的和最佳的置换   改变顺序排列   注释
  I   LV   1   50∶50置换
  L   I，V   2   50∶50置换
  V   I，L   3   50∶50置换
  A   G   4
  G   A   5
  D   E   6
  E   D   7
  W   Y   8
  Y   W   9
  S   T   10
  T   S   11
  K   R   12
  R   K   13
  N   Q   14
  Q   N   15
  F   Y   16
  M   L   17   第一个甲硫氨酸不能改变
  H   Na   无好的置换物
  C   Na   无好的置换物
  P   Na   无好的置换物
首先，鉴定出蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。
H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interim number substitution)，以便不造成改变的逆转。名单的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50∶50置换。
将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与以下SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的多肽的变体：1、3、5和40-71。
实例8.使用本文公开的调控元件和多肽改变植物的性状。
本文公开的各种调控元件(包括昼夜启动子和昼夜多肽)可用于多种作物的性状开发。这包括工程化改造耐冻或耐霜性、耐冷或耐寒性、耐旱或耐热性、盐胁迫耐性、降低的光呼吸、气孔开度调控、使产量增加的光合作用效率、碳水化合物代谢和转运、增加的氮利用、选择性代谢物生物合成、改善的营养物吸收、源/库调节、抗病性、昆虫抗性和抗虫性。本文公开的一个或多个调控元件与其他调控元件(包括多种胁迫可诱导的或组织特异性基序)组合以优化转基因表达。
本说明书中的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的普通技能水平。所有出版物和专利申请均以引用的方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用的方式并入本文一样。
藉着各个具体的和优选的实施例和技术描述了本发明。但是，应理解，在保持在本发明的精神和范围的前提下可以作出许多变化和修改。
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Claims (38)

1.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自：
a.多核苷酸，如用GAP算法在默认参数下确定的，所述多核苷酸与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全长序列具有至少90％的序列同一性；其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有昼夜活动调节剂的功能；
b.多核苷酸，所述多核苷酸选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470；
c.与(a)或(b)的多核苷酸完全互补的多核苷酸；
d.由(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽；和
e.多肽，如用GAP算法在默认参数下确定的，所述多肽与选自SEQ ID NO：185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、467、469和471的多肽的全长序列具有至少90％的序列同一性。
2.一种重组表达盒，所述重组表达盒包含权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有义或反义取向有效连接至启动子。
3.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求2所述的表达盒。
4.一种转基因植物，所述转基因植物包含权利要求2所述的重组表达盒。
5.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
6.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
7.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。
8.一种转基因种子，所述转基因种子来自权利要求4所述的转基因植物。
9.一种调制植物昼夜节律的方法，所述方法包括：
a.向植物细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含有效连接至启动子的权利要求1所述的多核苷酸；和
b.在植物细胞生长条件下培养所述植物；其中所述植物细胞中的所述昼夜节律被调制。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自选自以下的植物：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。
11.一种调制植物中整株植物或昼夜节律的方法，所述方法包括：
a.向植物细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含有效连接至启动子的权利要求1所述的多核苷酸；
b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；和
c.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的昼夜节律被调制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生和可可。
13.一种来源于对转基因植物组织进行加工的方法的产品，所述转基因植物组织表达编码昼夜起作用的基因的分离多核苷酸，所述方法包括：
a.用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、20、40、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全长序列具有至少90％的序列同一性；所述多核苷酸有效地连接至启动子；和
b.在植物细胞生长条件下培养所述转化的植物细胞；其中所述转化的植物细胞的生长被调制；
c.在形成植物的条件下培养所述植物细胞，以在植物组织中表达所述多核苷酸；和
d.对所述植物组织进行加工以获得产品。
14.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
15.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、甘蔗和稷。
16.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述多核苷酸的过表达导致与未转化的植物相比改善了的植物生长。
17.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物与未转化的植物相比，表现出改善的源-库关系。
18.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物与未转化的植物相比，具有提高的产量。
19.一种调控多核苷酸分子，所述分子包含选自以下的序列：(a)SEQ IDNO：31-183；(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO：31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO：31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90％的同一性。
20.一种嵌合多核苷酸分子，所述分子包含权利要求19所述的核酸片段。
21.根据权利要求20所述的嵌合分子，所述分子包含所述昼夜调控元件和组织特异性表达元件。
22.根据权利要求21所述的嵌合分子，其中所述组织特异性表达元件选自根特异性、维管束鞘细胞特异性、叶特异性和胚特异性表达元件。
23.根据权利要求19所述的调控多核苷酸分子，其中所述调控多核苷酸分子是启动子。
24.一种包含权利要求19所述的调控分子的构建体，所述调控分子有效连接至异源多核苷酸分子，其中所述异源分子赋予所关注的性状。
25.根据权利要求24所述的构建体，其中所述所关注的性状选自耐旱性、耐冻性、耐寒性、抗病性和昆虫抗性。
26.根据权利要求24所述的构建体，其中所述异源分子在源-库代谢中起作用。
27.一种用权利要求19所述的调控分子转化的转基因植物。
28.根据权利要求27所述的转基因植物，其是单子叶植物。
29.根据权利要求27所述的转基因植物，其选自：玉米、大豆、卡诺拉油菜、棉花、向日葵、苜蓿、甜菜、小麦、裸麦、水稻、甘蔗、燕麦、大麦、草坪草、高粱、稷、番茄、木豆、蔬菜、果树和饲草。
30.一种增加植物产量的方法，所述方法包括在权利要求19所述的调控分子的控制下表达所关注的异源多核苷酸。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述异源多核苷酸是昼夜调控的植物基因。
32.一种提高植物非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括在权利要求19所述的调控分子的控制下在植物中表达一种或多种赋予非生物胁迫耐性的多核苷酸。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述非生物胁迫耐性选自耐旱性、耐冻性和耐寒性。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述赋予耐旱性的多核苷酸是在调控元件控制下表达的，其峰值表达发生于中午或傍晚左右。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述赋予耐冻性或耐寒性的多核苷酸是在调控元件控制下表达的，其峰值表达发生于黎明或上午中间左右。
36.一种降低转基因表达的产量抑制的方法，所述方法包括表达有效连接至调控多核苷酸分子的转基因，所述调控多核苷酸分子包含选自以下的序列：(a)SEQ ID NO：31-183；(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO：31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO：31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90％的同一性。
37.一种筛选涉及非生物胁迫耐性的候选基因的方法，所述方法包括(a)鉴定在组成性表达或组织特异性表达下表现产量抑制的一个或多个候选基因和(b)在引导昼夜表达模式的调控分子控制下表达所述候选基因。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述调控分子包含选自以下的序列：(a)SEQ ID NO：31-183；(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQID NO：31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO：31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90％的同一性。
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