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TWI716405B - 抗ox40抗體及其使用方法 - Google Patents

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TWI716405B
TWI716405B TW105114161A TW105114161A TWI716405B TW I716405 B TWI716405 B TW I716405B TW 105114161 A TW105114161 A TW 105114161A TW 105114161 A TW105114161 A TW 105114161A TW I716405 B TWI716405 B TW I716405B
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艾卡特莉娜 布瑞歐尼斯
沃克 賽伯特
蓋德 瑞特
大衛 薛爾
丹尼爾 賀希賽默曼
塔哈 默格豪伯
唐浩
大衛 沙維斯基
傑若米 偉特
尼可拉斯 威爾森
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美商艾吉納斯公司
盧德威格癌症研究協會
紀念斯隆凱特琳癌症中心
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Abstract

本揭露提供了特異性結合人類OX40受體(OX40)的抗體以及包括此類抗體的組成物。在一個具體方面，該等抗體特異性結合人類OX40並且調節OX40活性，例如，增強、啟動、或誘導OX40活性，或降低、滅活、或抑制OX40活性。本揭露還提供了藉由給予抗體來治療障礙、如癌症之方法，該抗體特異性結合人類OX40並且調節OX40活性，例如，增強、啟動、或誘導OX40活性。還提供了藉由給予抗體來治療自身免疫性或炎性疾病或障礙之方法，該抗體特異性結合人類OX40並且調節OX40活性，例如，降低、滅活、或抑制OX40活性。

Description

抗OX40抗體及其使用方法 [序列表]
本申請包括序列表，該序列表已以ASCII格式電子提交且藉由引用以其全文結合在此(2016年5月5日創建的所述ASCII副本被命名為3617_003TW04_SL.txt且大小為120,927位組)。
本揭露涉及特異性結合人類OX40受體(“OX40”)的抗體、包括此類抗體的組成物、以及生產和使用特異性結合OX40的抗體之方法。
先天性和獲得性免疫應答在控制人類腫瘤生長中的貢獻是充分表徵的(維塞利(Vesely)MD等人，(2011)免疫學年鑒(Annu Rev Immunol)29：235-271)。其結果係，已出現了基於抗體的策略，其出於癌症治療目的旨在增強T細胞應答，如用激發型抗體靶向T細胞表現的刺激性受體、或用功能性拮抗劑靶向抑制性受 體(梅爾曼(Mellman)I等人，(2011)自然(Nature)480：480-489)。抗體介導的激動劑和拮抗劑方法已顯示出臨床前活性，並且最近顯示出臨床活性。調整T細胞、自然殺傷T(NKT)細胞、以及NK細胞功能的重要刺激性受體係OX40受體(又稱為OX40、CD134、TNFRSF4、TXGP1L、ACT35、以及ACT-4)(Sugamura K等人，(2004)自然免疫學評論(Nat Rev Immunol)4：420-431)。OX40係腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)的一成員，並且經由OX40傳訊可以調整重要的免疫功能。
展示載入有同源肽的MHC類別I或II分子的專職抗原呈遞細胞(APC)進行T細胞受體(TCR)刺激後，可以藉由抗原特異性T細胞上調OX40(Sugamura K等人，(2004)自然免疫學評論4：420-431)。當成熟後，APC(如樹突細胞(DC))上調刺激性B7家族成員(例如，CD80和CD86)，連同輔助共刺激分子(包括OX40配位基(OX40L))，這有助於塑造T細胞免疫應答的動力學和大小，連同有效的記憶細胞分化。明顯的是，其他細胞類型也可以表現組成性和/或誘導性水平的OX40L，如B細胞、血管內皮細胞、肥大細胞，並且在一些情況下是活化的T細胞(索魯什(Soroosh)P等人，(2006)免疫學雜誌(J Immunol)176：5975-5987)。據信OX40：OX40L共結合驅動受體三聚體的更高有序聚簇和後續信號轉導(康帕安(Compaan)DM等人，(2006)結 構(Structure)14：1321-1330)。
已經在鼠科動物和人類腫瘤組織中觀察到腫瘤微環境中藉由T細胞的OX40表現(布雅德(Bulliard)Y等人，(2014)免疫細胞生物學(Immunol Cell Biol)92：475-480以及皮康思(Piconese)S等人，(2014)肝臟病學(Hepatology)60：1494-1507)。相對於常規T細胞群體，調節性T細胞(Treg)的瘤內群體高度表現OX40，這一特徵歸因於它們的增殖狀態(維特(Waight)JD等人，(2015)免疫學雜誌(J Immunol)194：878-882以及布雅德(Bulliard)Y等人，(2014)免疫細胞生物學(Immunol Cell Biol)92：475-480)。早期研究證明，OX40激發型抗體能夠引起小鼠模型中的腫瘤排斥(溫伯格(Weinberg)AD等人，(2000)免疫學雜誌164：2160-2169以及皮康思S等人，(2008)實驗醫學雜誌(J Exp Med)205：825-839)。還已經顯示，使人類OX40傳訊激發的小鼠抗體增強癌症病人的免疫功能(柯蒂(Curti)BD等人，(2013)癌症研究(Cancer Res)73：7189-7198)。
OX40與OX40L相互作用還與炎症性以及自身免疫性疾病和障礙中的免疫應答有關，該等疾病包括氣喘/特應性、腦脊髓炎、類風濕關節炎、結腸炎/炎性腸病、移植物抗宿主疾病(例如，移植排斥)、非肥胖性糖尿病小鼠中的糖尿病、以及動脈硬化的小鼠模型(克羅夫特(Croft)M等人，(2009)免疫學綜述(Immunol Rev) 229(1)：173-191，以及其中引用的參考文獻)。與疾病和障礙相關的症狀減少已經報導於OX40-和OX40L-缺陷小鼠中、接受載入有細胞抑制藥的抗OX40脂質體的小鼠中、以及其中OX40與OX40L相互作用受抗OX40L封閉性抗體或融合到人類免疫球蛋白的Fc片段上的重組OX40阻斷的小鼠中(克羅夫特M等人；布特EPJ等人，(2005)關節炎研究與治療(Arthritis Res Ther)7：R604-615；溫伯格AD等人，(1999)免疫學雜誌162：1818-1826)。還顯示出，用封閉性抗OX40L抗體進行治療能抑制獼猴氣喘模型中的Th2炎症(克羅夫特M等人；Seshasayee D等人，(2007)臨床研究雜誌(J Clin Invest)117：3868-3878)。另外地，OX40L的多態性已與狼瘡相關聯(克羅夫特M等人)。
鑒於人類OX40在調節免疫應答中的作用，在此提供了特異性結合OX40的抗體以及該等抗體用以調節OX40活性之用途。
在一個方面，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：包含在SEQ ID NO：16中的VH CDR1的重鏈可變區(VH)CDR1、包含在SEQ ID NO：16中的VH CDR2的VH CDR2、包含在SEQ ID NO：16中的VH CDR3的 VH CDR3、包含在SEQ ID NO：15中的VL CDR1的輕鏈可變區(VL)CDR1、包含在SEQ ID NO：15中的VL CDR2的VL CDR2、以及包含在SEQ ID NO：15中的VL CDR3的VL CDR3，其中根據CDR的卡巴特(Kabat)定義、喬西亞(Chothia)定義、卡巴特定義和喬西亞定義的組合、IMGT編號系統、AbM定義、或接觸定義(contact definition)來限定各個CDR。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：(a)包括重鏈互補決定區1(CDR1)的重鏈可變區，該重鏈CDR1包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；重鏈CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；以及重鏈CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；以及(b)包括輕鏈CDR1的輕鏈可變區，該輕鏈CDR1包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；輕鏈CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及輕鏈CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：(a)包括重鏈CDR1的重鏈可變區，該重鏈CDR1包括GFTFSGSA(SEQ ID NO：47)的胺基酸序列；重鏈CDR2，其包括IRSKANSYAT(SEQ ID NO：48)的胺基酸序列；以及重鏈CDR3，其包括TSGIYDSSGYDY(SEQ ID NO：49)的胺基酸序列；以及(b)包括輕鏈CDR1的 輕鏈可變區，該輕鏈CDR1包括QSLLHSNGYNY(SEQ ID NO：44)的胺基酸序列；輕鏈CDR2，其包括LGS(SEQ ID NO：45)的胺基酸序列；以及輕鏈CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：46)的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該抗體包括具有人類或人類衍生的框架區的重鏈可變區。
在一個實施方式中，該抗體包括重鏈可變框架區，該重鏈可變框架區衍生自由人類基因編碼的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列包括IGHV3-73*01(SEQ ID NO：19)。
在一個實施方式中，該抗體包括具有人類或人類衍生的框架區的輕鏈可變序列。
在一個實施方式中，該抗體包括輕鏈可變框架區，該輕鏈可變框架區衍生自由人類基因編碼的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列包括IGKV2-28*01(SEQ ID NO：18)。
在一個實施方式中，該抗體包括重鏈可變區序列，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該抗體包括重鏈序列，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：21、23、51、以及52。在一個實施方式中，該抗體包括重鏈序列，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：60-63。
在一個實施方式中，該抗體包括輕鏈可變區 序列，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該抗體包括輕鏈序列，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；以及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該抗體包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：21的胺基酸序列；以及輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。在一個實施方式中，該抗體包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：60的胺基酸序列；以及輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該抗體包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：23的胺基酸序列；以及輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。在一個實施方式中，該抗體包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：61的胺基酸序列；以及輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該抗體包括：重鏈，其 包括SEQ ID NO：51或52的胺基酸序列；以及輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。在一個實施方式中，該抗體包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：62或63的胺基酸序列；以及輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該抗體包括重鏈和/或輕鏈恒定區。在一個實施方式中，該重鏈恒定區選自由以下各項組成之群組：人類免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2。在一個實施方式中，該IgG1係非岩藻糖基化的IgG1。在一個實施方式中，IgG1的胺基酸序列包括N297A突變。在一個實施方式中，IgG1的胺基酸序列包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。在一個實施方式中，IgG1的胺基酸序列包括N297Q突變。在一個實施方式中，IgG4的胺基酸序列包括S228P突變。在一個實施方式中，IgG2的胺基酸序列包括C127S突變。在一個實施方式中，該重鏈恒定區包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：32-37、53-54、以及64-71。在一個實施方式中，該輕鏈恒定區選自由以下各項組成之群組：人類免疫球蛋白IgGκ和IgGλ。
在一個實施方式中，該抗體係人抗體。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體與以下抗體結合人類OX40的相同表位，該抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列； VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體與以下抗體結合人類OX40的相同表位，該抗體包括：VH CDR1，其包括GFTFSGSA(SEQ ID NO：47)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括IRSKANSYAT(SEQ ID NO：48)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括TSGIYDSSGYDY(SEQ ID NO：49)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括QSLLHSNGYNY(SEQ ID NO：44)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGS(SEQ ID NO：45)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：46)的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體與以下抗體結合人類OX40的相同表位，該抗體包括：重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；以及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該抗體係激動性的。在一個實施方式中，該抗體啟動、增強或誘導人類OX40的活性。在一個實施方式中，該抗體誘導CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，CD4+ T細胞增殖係抗體濃度的 基本上遞增性的函數。在一個實施方式中，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線。在一個實施方式中，該抗體藉由抗-CD3-刺激的T細胞誘導IL-2、TNFα、IFNγ、IL-4、IL-10、IL-13、或其組合的產生。在一個實施方式中，該抗體藉由抗-CD3-刺激的外周血單核細胞(PBMC)誘導TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、或其組合的產生。在一個實施方式中，該抗體藉由抗-CD3-刺激的PBMC誘導TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13的產生，其中TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13的產生係抗體濃度的基本上遞增性的函數。在一個實施方式中，該抗體藉由抗-CD3-刺激的PBMC誘導TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13的產生，其中TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13的產生顯示S形劑量響應曲線。在一個實施方式中，該抗體藉由SEA-刺激的T細胞誘導IL-2的產生並且藉由SEA-刺激的T細胞抑制IL-10的產生。在一個實施方式中，該抗體藉由SEA-刺激的外周血單核細胞(PBMC)誘導IL-2的產生並且藉由SEA-刺激的PBMC抑制IL-2的產生。在一個實施方式中，該抗體藉由SEA-刺激的PBMC誘導IL-2的產生，其中IL-2的產生係抗體濃度的基本上遞增性的函數。在一個實施方式中，該抗體藉由SEA-刺激的PBMC誘導IL-2的產生，其中IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線。
在一個實施方式中，該抗體藉由調節性T細胞緩解效應T細胞的抑制。
在一個實施方式中，該抗體藉由效應T細胞和調節性T細胞的共培養誘導IL-2的產生並且藉由效應T細胞和調節性T細胞的共培養抑制IL-10的產生。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(kit)(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體( 例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：( a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中在4μg/ml的抗體的存在下比在0.032μg/ml的抗體的存在下的IL-2產量更大。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、 0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50 μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ 、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基 酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其 中當抗OX40抗體濃度在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，特異性結合OX40的抗體包括：VH CDR1，其包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；VH CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；VL CDR1，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧 基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256 μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組 (細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司(Meso Scale Discovery)))所測量，其中在4μg/ml的抗體的存在下比在0.032μg/ml的抗體的存在下IL-2的產量更大。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少75%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少75%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以 及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少75%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少75%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20 μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少75%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少75%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中在4μg/ml的抗體的存在下比在0.032μg/ml的抗體的存在下IL-2的產量更大。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA 下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少80%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少80%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織 培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少80%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少80%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少80%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少80%一致性的VH 結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中在4μg/ml的抗體的存在下比在0.032μg/ml的抗體的存在下IL-2的產量更大。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少85%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少85%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml 和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少85%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少85%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不 存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少85%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少85%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中在4μg/ml的抗體的存在下比在0.032μg/ml的抗體的存在下IL-2的產量更大。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)) 測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少90%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少90%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少90%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少90%一致性的VH結構域，其中該抗 體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少90%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少90%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中在4μg/ml的抗體的存在下比在0.032μg/ml的抗體的存在下IL-2的產量更大。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少95%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少95%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的 產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少95%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少95%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞) 持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少95%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少95%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中在4μg/ml的抗體的存在下比在0.032μg/ml的抗體的存在下IL-2的產量更大。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少98%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少98%一致性的VH 結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少98%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少98%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養 套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少98%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少98%一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中在4μg/ml的抗體的存在下比在0.032μg/ml的抗體的存在下IL-2的產量更大。可以在例如包括以下步驟的測定中評估IL-2的產生：(a)在不存在或存在不同濃度的該 抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例 如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中 評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少75%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少75%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3 μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少75%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少75%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50 μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少80%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少80%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介 素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少80%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少80%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V- Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少85%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少85%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如 電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少85%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少85%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、 IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少90%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少90%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及 5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少90%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少90%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合 的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少95%一致性的VL結構域和與 SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少95%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在一個實施方式中，抗體包括與 SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少95%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少95%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、 GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少98%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少98%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V- Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少98%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少98%一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類 TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度 在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞 (例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少75%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少75%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少75%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少75%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度 在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少75%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少75%一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞 (例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少80%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少80%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少80%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少80%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度 在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少80%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少80%一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞 (例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少85%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少85%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少85%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少85%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度 在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少85%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少85%一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞 (例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少90%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少90%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少90%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少90%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度 在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少90%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少90%一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞 (例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少95%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少95%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少95%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少95%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度 在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少95%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少95%一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞 (例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少98%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少98%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少98%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少98%一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度 在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少98%一致性的VL結構域和與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少98%一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞 (例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一個實施方式中，抗體包括人類免疫球蛋白IgG1重鏈恒定區，其中IgG1重鏈恒定區的胺基酸序列包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、以及其組合。在一個實施方式中，抗體包括IgG1重鏈恒定區，其中IgG1重鏈恒定區的胺基酸序列包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗體係一種抗體，其中相對於該抗體與SEQ ID NO：55的人類OX40序列之間的結合，該抗體與變體OX40之間的結合大幅變弱，並且其中該變體OX40包括SEQ ID NO：55的序列，除了選自下組的胺基酸突變以外，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A、以及其組合。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗體係一種抗體，其中相對於該抗體與SEQ ID NO：55的人類OX40序列之間的結合，該抗體與變體OX40之間的結合大幅變弱，並且其中該變體OX40包括SEQ ID NO：55的序列，除了以下胺基酸突變以外：W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、以及P115A。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗體係一種抗體，與結合SEQ ID NO：55的人類OX40序列相比，該抗體展示出與SEQ ID NO：55相同的蛋白質(除了存在選自下組的胺基酸突變，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A、以及其組合)降低的結合或不結合。
在一個實施方式中，抗體特異性結合人類OX40。特異性結合人類OX40的分離的抗體，其中與結合SEQ ID NO：55的人類OX40序列相比，該抗體展示出與SEQ ID NO：55相同的蛋白質(除了存在胺基酸突變W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、以及P115A)降低的結合或不結合。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗體係特異性結合人類OX40序列的表位的抗體，該表位包括SEQ ID NO：55的選自下組的殘基，該組由以下各項組成：60、62、80、88、93、99、115、以及其組合。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗體係特異性結合人類OX40序列的表位的抗體，該表位包括SEQ ID NO：55的殘基58、60、62、80、88、93、99、以及115。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗體係特異性結合SEQ ID NO：55的選自下組的至少一個殘基的抗體，該組由以下各項組成：60、62、80、88、93、99、115、以及其組合。
在一個實施方式中，抗體包括重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列，在此提供的抗體並且選自由以下各項組成之群組：Fab、Fab’、F(ab’)2、以及scFv片段。
在一個實施方式中，抗體包括人類免疫球蛋白IgG1重鏈恒定區，並且其中IgG1重鏈恒定區的胺基酸序列包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、以及其組合。在一個實施方式中，抗體包括IgG1重鏈恒定區，其中IgG1重鏈恒定區的胺基酸序列包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗體包括：(a)特異性結合人類OX40的第一抗原結合域；以及(b)不會特異性結合由人類免疫細胞表現的抗原的第二抗原結合域。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：(a)包括VH互補決定區(CDR)1的第一重鏈可變域(VH)，該VH CDR1包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH-CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；以及VH-CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；以及(b)包括VL-CDR1的第一輕鏈可變域(VL)，該VL-CDR1包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL-CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL- CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域與以下抗體一樣地特異性結合人類OX40的相同表位，該抗體包括：VH，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列，以及VL，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在一個實施方式中，與結合SEQ ID NO：55的人類OX40序列相比，特異性結合人類OX40的抗原結合域展示出與SEQ ID NO：55相同的蛋白質(除了存在選自下組的胺基酸突變，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A、以及其組合)降低的結合或不結合。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括VH和VL，其中VH包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括VH和VL，其中VL包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
在一個實施方式中，第二抗原結合域特異性結合非人類抗原。在一個實施方式中，第二抗原結合域特異性結合病毒抗原。在一個實施方式中，病毒抗原係HIV抗原。在一個實施方式中，第二抗原結合域特異性結合雞白蛋白或雞卵溶菌酶。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗體包括：(a)包括VH互補決定區(CDR)1的第一重鏈可變域(VH)，該VH CDR1包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH-CDR2，其包括 RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；以及VH-CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；以及(b)包括VL-CDR1的第一輕鏈可變域(VL)，該VL-CDR1包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL-CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL-CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域與以下抗體一樣地特異性結合人類OX40的相同表位，該抗體包括：VH，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列，以及VL，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在一個實施方式中，與結合SEQ ID NO：55的人類OX40序列相比，特異性結合人類OX40的抗原結合域展示出與SEQ ID NO：55相同的蛋白質(除了存在選自下組的胺基酸突變，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A、以及其組合)降低的結合或不結合。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括VH和VL，其中VH包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括VH和VL，其中VL包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
在一個實施方式中，第二重鏈係Fc片段。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：VH，其包括與SEQ ID NO：16的胺基酸 序列至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%一致的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：VH，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：VH，其包括衍生自人類IGHV3-73種系序列的胺基酸序列。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：VL，其包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%一致的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：VL-CDR3，其包括SEQ ID NO：3的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：VL，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：輕鏈，其包括SEQ ID NO：50的胺基酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：VL，其包括衍生自人類IGKV2-28種系序列的胺基酸序列。
在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括分別在SEQ ID NO：16和15中列出的VH和VL序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：21的胺基 酸序列。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：60的胺基酸序列。
在一個實施方式中，第一抗原結合域和第二抗原結合域包括選自下組的相同的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、以及其組合。在一個實施方式中，第一抗原結合域和第二抗原結合域包括選自下組的相同的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域和第二重鏈或其片段包括選自下組的相同的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、以及其組合。在一個實施方式中，特異性結合人類OX40的抗原結合域和第二重鏈或其片段包括選自下組的相同的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。
在一個實施方式中，抗體與人類OX40拮抗。在一個實施方式中，抗體滅活、降低或抑制人類OX40的活性。在一個實施方式中，抗體抑制或減少人類OX40與人類OX40配位基的結合。在一個實施方式中，抗體抑制或減少人類OX40傳訊。在一個實施方式中，抗體抑制或減少由人類OX40配位基誘導的人類OX40傳訊。
在一個實施方式中，抗體包括可檢測標籤。
在一個實施方式中，本發明涉及本發明的抗體用作藥物。
在一個實施方式中，本發明涉及本發明的抗體用作診斷劑。
在一個實施方式中，本發明涉及本發明的抗體用於體外檢測樣品中的OX40之用途。在一個實施方式中，OX40係人類OX40。
在一個實施方式中，本發明涉及本發明的抗體用於體外啟動、增強或誘導人類OX40活性的用途。在一個實施方式中，抗體體外誘導CD4+ T細胞增殖。
在一個方面，在此提供了編碼特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的分離的核酸分子。在一個實施方式中，核酸分子編碼在此提供的抗OX40抗體的重鏈可變區或重鏈。在一個實施方式中，核酸分子編碼在此提供的抗OX40抗體的輕鏈可變區或輕鏈。在一個實施方式中，核酸分子編碼在此提供的抗OX40抗體的重鏈可變區或重鏈以及該抗體的輕鏈可變區或輕鏈。在一個實施方式中，核酸分子編碼重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一個實施方式中，核酸分子編碼輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。還在此提供了由此類核酸分子編碼的分離的抗體。
在一個方面，在此提供了包含此類核酸分子的載體。
在一個方面，在此提供了包含此類核酸分子或此類載體的宿主細胞。在一個實施方式中，宿主細胞選自由以下各項組成之群組：組織培養中的大腸桿菌、假單 孢菌屬、芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬、酵母菌、CHO、YB/20、NS0、PER-C6、HEK-293T、NIH-3T3、海拉(HeLa)、BHK、Hep G2、SP2/0、R1.1、B-W、L-M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10細胞、植物細胞、昆蟲細胞及人類細胞。
在一個方面，在此提供了產生特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的方法，該方法包括培養此類宿主細胞，從而核酸分子得以表現並且抗體得以產生。
在一個實施方式中，本發明涉及本發明的抗體、本發明的核酸分子、本發明的載體、和/或本發明的宿主細胞用作藥物。
在一個實施方式中，本發明涉及本發明的抗體、本發明的核酸分子、本發明的載體、和/或本發明的宿主細胞用作診斷劑。
在一個實施方式中，本發明涉及本發明的抗體、本發明的核酸分子、本發明的載體、和/或本發明的宿主細胞用於體外檢測樣品中的OX40之用途。在一個實施方式中，OX40係人類OX40。
在一個實施方式中，本發明涉及本發明的抗體用於體外啟動、增強或誘導人類OX40活性的用途。在一個實施方式中，抗體體外誘導CD4+ T細胞增殖。
在一個方面，在此提供了醫藥組成物，該醫藥組成物包括在此提供的特異性結合OX40的抗體、編碼 特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的核酸分子、包含此種核酸分子的載體、或包含此種核酸分子或載體的宿主細胞。
在一個方面，在此提供了醫藥組成物，該醫藥組成物包括在此提供的特異性結合OX40的抗體、編碼特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的核酸分子、包含此種核酸分子的載體、或包含此種核酸分子或載體的宿主細胞，用作藥物。
在一個方面，在此提供了醫藥組成物，該醫藥組成物包括在此提供的特異性結合OX40的抗體、編碼特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的核酸分子、包含此種核酸分子的載體、或包含此種核酸分子或載體的宿主細胞，用作診斷劑。
在一個方面，在此提供了用於調節受試者的免疫應答的方法，該方法包括向該受試者給予有效量的在此提供的抗體、核酸、載體、宿主細胞、或醫藥組成物。在一個實施方式中，該方法用於增強或誘導受試者的免疫應答。在一個實施方式中，調節免疫應答包括增強或誘導受試者的免疫應答。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在調節免疫應答之方法中使用。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在增強或誘 導免疫應答之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在調節受試者的免疫應答之方法中使用。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在增強或誘導受試者的免疫應答之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在調節受試者的免疫應答之方法中使用，該方法包括向該受試者給予有效量的本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、或醫藥組成物。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在增強或誘導受試者的免疫應答之方法中使用，該方法包括向該受試者給予有效量的本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、或醫藥組成物。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，在此提供了用於增強受試者的T細胞擴增以及T細胞效應物功能之方法，該方法包括向該受試者給予有效量的在此提供的抗體、核酸、載體、宿主細胞、或醫藥組成物。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核 酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在增強T細胞擴增以及T細胞效應物功能之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在增強受試者的T細胞擴增以及T細胞效應物功能之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在增強受試者的T細胞擴增以及T細胞效應物功能的方法中使用，該方法包括向該受試者給予有效量的本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，在此提供了用於治療受試者癌症的方法，該方法包括向該受試者給予有效量的在此提供的抗體、核酸、載體、宿主細胞、或醫藥組成物。在一些實施方式中，癌症選自由以下各項組成之群組：黑色素瘤、腎癌、以及前列腺癌。在一些實施方式中，癌症選自由以下各項組成之群組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、結腸癌、以及肺癌。在一些實施方式中，肺癌係非小細胞肺癌(NSCLC)。在一個實例中，該方法進一步包括向受試者給予檢查點靶向劑。在一個實例中，檢查點靶向劑選自由以下各項組成之群組：拮抗劑抗PD-1抗體、拮抗劑抗PD-L1抗體、拮抗劑抗PD-L2抗體、拮抗劑抗CTLA-4抗 體、拮抗劑抗TIM-3抗體、拮抗劑抗LAG-3抗體、拮抗劑抗CEACAM1抗體、激動劑抗GITR抗體、激動劑抗CD137抗體、以及激動劑抗OX40抗體。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療癌症之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療受試者癌症之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療受試者癌症之方法中使用，該方法包括向該受試者給予有效量的本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)檢查點靶向劑用作藥物。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)檢查點靶向劑，用於在治療癌症之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及醫藥組成物、套組 或多部分套組，其包括(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)檢查點靶向劑。
如在此描述的抗體可以與IDO抑制劑組合使用以治療癌症。在一個實施方式中，該方法進一步包括向受試者給予吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)的抑制劑。如在此描述的用於治療癌症的IDO抑制劑以醫藥組成物的固體劑型(如片劑、丸劑或膠囊劑)存在，其中醫藥組成物包括IDO抑制劑以及藥學上可接受的賦形劑。因此，如在此描述的抗體和如在此描述的IDO抑制劑可以作為分開的劑型分別、順序或同時給予。在一個實施方式中，胃腸外給予抗體，而口服給予IDO抑制劑。在具體實施方式中，抑制劑選自由以下各項組成之群組：依帕卡朵絲坦(epacadostat)(因塞特公司(Incyte Corporation))、F001287(福克斯生物科學公司(Flexus Biosciences))、印朵目德(indoximod)(紐琳基因公司(NewLink Genetics))、以及NLG919(紐琳基因公司)。依帕卡朵絲坦(epacadostat)已描述於PCT公開案號WO 2010/005958中，出於所有的目的將其藉由引用以其全文結合在此。在一個實施方式中，抑制劑係依帕卡朵絲坦(epacadostat)。在另一個實施方式中，抑制劑係F001287。在另一個實施方式中，抑制劑係印朵目德(indoximod)。在另一個實施方式中，抑制劑係NLG919。
在一個方面，本發明涉及(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)IDO抑制劑，用作藥物。
在一個方面，本發明涉及(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)IDO抑制劑，用於在治療癌症之方法中使用。在一個方面，本發明涉及組成物、套組或多部分套組，其包括(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)IDO抑制劑。
在此描述的抗體可以與疫苗組合使用。在一個具體實施方式中，疫苗包括熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)，其中HSPPC包括與一種或多種抗原肽(例如，腫瘤相關抗原肽)複合的熱休克蛋白(例如，gp96蛋白、hsp70蛋白、或hsc70蛋白)。在一個實施方式中，熱休克蛋白係gp96蛋白並且與腫瘤相關抗原肽複合。在一個實施方式中，熱休克蛋白係hsp70或hsc70蛋白並且與腫瘤相關抗原肽複合。在一個實施方式中，熱休克蛋白係gp96蛋白並且與腫瘤相關抗原肽複合，其中HSPPC衍生自獲得自受試者的腫瘤。在一個實施方式中，熱休克蛋白係hsp70或hsc70蛋白並且與腫瘤相關抗原肽複合，其中HSPPC衍生自獲得自受試者的腫瘤。
在一個方面，本發明涉及(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)疫苗，用作藥物。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)疫苗，用於在治療癌症之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，本發明涉及組成物、套組或多部分套組，其包括(a)本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物以及(b)疫苗。在一個實施方式中，抗體係激動性的。
在一些實施方式中，本揭露提供了如在此描述的抗體在製造用於治療癌症的藥物中之用途。在某些實施方式中，本揭露提供了如在此描述的抗體用於在治療癌症中使用。在某些實施方式中，本揭露提供了如在此描述的醫藥組成物在製造用於治療癌症的藥物中之用途。在某些實施方式中，本揭露提供了如在此描述的醫藥組成物用於在治療癌症中使用。
在一個方面，在此提供了用於治療受試者自身免疫或炎性疾病或障礙之方法，該方法包括向該受試者給予有效量的在此提供的抗體、核酸、載體、宿主細胞、或醫藥組成物。在一些實施方式中，該疾病或障礙選自由以下各項組成之群組：移植排斥、血管炎、氣喘、類風濕關節炎、皮膚炎、炎性腸病、葡萄膜炎、以及狼瘡。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療自身免疫或炎性疾病或障礙之方法中使用。在一個實施方式 中，抗體係拮抗性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療受試者自身免疫或炎性疾病或障礙之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係拮抗性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療受試者自身免疫或炎性疾病或障礙之方法中使用，該方法包括向該受試者給予有效量的本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物。在一個實施方式中，抗體係拮抗性的。
在一個方面，在此提供了用於治療受試者的傳染性疾病之方法，該方法包括向該受試者給予有效量的在此提供的抗體、核酸、載體、宿主細胞、或醫藥組成物。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療傳染性疾病之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。在一個實施方式中，抗體係拮抗性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療受試者的傳染性疾病之方法中使用。在一個實施方式中，抗體係激動性的。在一個實施方式中，抗體係拮抗性的。
在一個方面，本發明涉及本發明的抗體、核 酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物用於在治療受試者的傳染性疾病之方法中使用，該方法包括向該受試者給予有效量的本發明的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物。在一個實施方式中，抗體係激動性的。在一個實施方式中，抗體係拮抗性的。
在此處提供的方法的一個實施方式中，受試者係人。
在一個方面，在此提供了用於檢測樣品中的OX40之方法，該方法包括將所述樣品與在此提供的抗體接觸。
在一個方面，在此提供了用於體外檢測樣品中的OX40之方法，該方法包括將所述樣品與在此提供的抗體接觸。在一個實施方式中，OX40係人類OX40。
在一個方面，在此提供了用於體外檢測樣品中的OX40之方法，該方法包括將所述樣品與在此提供的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物接觸。在一個實施方式中，OX40係人類OX40。
在一個方面，在此提供了在此提供的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物，較佳的是在此提供的抗體用於體外檢測樣品中的OX40之用途。
在一個方面，在此提供了在此提供的抗體、核酸、載體、宿主細胞、和/或醫藥組成物、較佳的是在此提供的抗體用於在檢測受試者中的OX40中使用。在一個實施方式中，受試者係人。
在一個方面，在此提供了套組，該套組包括：在此提供的特異性結合OX40的抗體、編碼特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的核酸分子、包含此種核酸分子的載體、包含此種核酸分子或載體的宿主細胞、或包含此種抗體、核酸分子、載體、或宿主細胞的醫藥組成物，以及a)檢測試劑、b)OX40抗原、c)標識，該標識反映批准用於人類給藥使用或銷售、或d)其組合。
圖1A、1B、1C、1D、以及1E：圖1A係一對長條圖，示出了抗OX40抗體pab1949和同種型(isotype)對照與活化的人類CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的結合。圖1B係一對長條圖，示出了pab1949-1和同種型對照與未刺激和刺激的(使用抗CD3抗體)CD4+ T細胞的結合。圖1C係顯示劑量滴定的pab1949-1或同種型對照與活化的人類CD4+ T細胞的結合的圖。圖1D係一組長條圖，測量了pab1949-1和同種型對照與人類未刺激的血源性免疫細胞群體的結合。圖1E係pab1949和同種型對照與活化的食蟹猴(cynomolgus monkey)(食蟹猴(Macaca fascicularis))CD4+ T細胞結合的長條圖。
圖2A、2B、以及2C係次優CD3刺激測定以評估抗OX40抗體pab1949(圖2A和2C)和pab2044(圖2B)的刺激對富集的CD4+ T細胞增殖作用的結果的 圖。抗體pab1949係人IgG1抗體。抗體pab2044與pab1949具有相同的重鏈可變區和相同的輕鏈，但包括人類IgG4恒定區。針對每種測試的抗體示出了細胞增殖(CFSE；x軸)：圖2A中IgG1同種型對照、pab1949、以及抗CD28抗體作為陽性對照；以及圖2B中IgG4同種型對照、pab2044、以及抗CD28抗體。圖2C係顯示在次優抗CD3刺激下抗OX40抗體pab1949(0.002、0.02、0.2、2、以及20μg/ml)的滴定以及該抗體對富集的CD4+ T細胞增殖的作用的線形圖。
圖3A、3B、3C、3D、3E、以及3F係來自由抗OX40抗體pab1949或pab1949-1與不同次優濃度的抗CD3抗體和IL-2相組合誘導的IFNγ和TNFα細胞介素產生的代表性分析結果。在圖3A-3C中，對來自四個不同供體的PBMC進行測試：供體KM、供體TM、供體GS、以及供體SB。圖3A和3B係顯示來自供體SB(圖3A)和供體GS(圖3B)的CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的細胞內細胞介素染色(IFNγ和TNFα)的標繪圖。對於抗OX40抗體pab1949或同種型對照標繪IFNγ+ TNFα+多功能CD4+ T細胞以及CD8+ T細胞或TNFα+單功能CD4+ T細胞以及CD8+ T細胞的百分比(圖3C)。圖3C中顯示的百分比代表在三種不同抗CD3抗體濃度下產生的最高應答。誤差條代表標準差(n=2)。圖3D、3E、以及3F係一組圖，顯示在類似的次優抗CD3刺激測定中，在衍生自供體GS的PBMC的細胞中由抗OX40抗體 pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的TNFα+CD4+ T細胞(圖3D)、IFNγ+ TNFα+多功能CD8+ T細胞(圖3E)、以及IFNγ+ CD8+ T細胞(圖3F)的百分比。
圖4A、4B、以及4C係顯示使用衍生自供體1、2、4、5、7、8、9、以及10的PBMC的細胞的次優抗CD3刺激測定結果的一組圖。針對pab1949-1或IgG1同種型對照抗體的抗體濃度範圍對IFNγ+、TNFα+、或IFNγ+ TNFα+多功能CD4+或CD8+ T細胞的百分比進行繪圖。
圖5A係一組橫條圖，顯示在次優抗CD3刺激測定中使用來自供體SB和供體GS的PBMC，抗OX40抗體pab1949或同種型對照對一系列細胞介素(IL-2、TNFα、IL-10、IL-4、以及IL-13)分泌的作用。使用不同次優濃度的抗CD3抗體(殖株SP34)、IL2(20U/ml)、以及5μg/ml的抗OX40抗體或IgG1同種型對照活化來自健康供體的PBMC，並且在刺激後4天(SB#1A)或3天(SB#1B、SB#2、以及GS)測量細胞介素。圖5A中的條形代表由在5μg/ml的抗OX40抗體濃度下測試的所有抗CD3濃度誘導的最高細胞介素分泌。誤差條代表標準差(n=2)。圖5B、5C、以及5D係一組圖，顯示在次優濃度的抗CD3抗體存在下，在衍生自供體GS的PBMC的細胞中由不同濃度的pab1949-1或IgG1同種型對照抗體誘導的細胞介素(TNFα、IL-10、或IL-13)的分泌量。
圖6A、6B、以及6C係一組圖，顯示在次優抗CD3刺激測定中，在衍生自供體1-10的PBMC的細胞中由pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的GM-CSF的分泌量。ECL係指電化學發光。
圖7A、7B、以及7C類似於圖6A、6B、以及6C，顯示了由pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的IL-2的分泌量。ECL係指電化學發光。
圖8A、8B、以及8C類似於圖6A、6B、以及6C，顯示了由pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的TNFβ的分泌量。
圖9A和9B係橫條圖，顯示在以1：3的比例共培養的調節性T細胞(Treg)和效應T細胞(Teff)(Treg：Teff)中，由可溶或交聯的(使用抗FcF(ab’)2)pab1949-1或IgG1同種型對照抗體誘導的IL-2(圖9A)和IL-10(圖9B)生產。
圖10A、10B、10C、10D、10E、10F、以及10G係描繪在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激時，抗OX40抗體對初代人類PBMC的功能活性的圖。在不存在或存在固定濃度(10μg/ml)或不同濃度的抗OX40抗體或同種型對照的情況下用SEA刺激人類PBMC並且評估IL-2或IL-10細胞介素分泌。所測試的抗OX40抗體包括pab1949、pab1949-1、pab2193-1、pab1949-1-N297A、以及參考抗體pab1784和pab2045。在10μg/ml的抗OX40抗體濃度下，對於所測試的抗體對IL-2(圖10A)和IL- 10(圖10B)的倍數變化進行繪圖。圖10C、10D、以及10E係顯示在pab1949、pab1949-1、或參考抗體pab1784以及pab2045的不同濃度下，IL-2產生的倍數變化的劑量響應曲線。藉由學生t檢驗相比於由星號指示的同種型對照試樣來確定統計顯著性。誤差條代表來自3次重複的標準差。圖10A中的*代表p<0.001。圖10B中的*代表p<0.01。圖10F係圖，顯示由pab1949-1、pab2193-1、IgG1同種型對照抗體、或IgG2同種型對照抗體劑量滴定誘導的IL-2產生。圖10G係圖，顯示響應於pab1949-1、pab1949-1-N297A、或IgG1同種型對照抗體劑量滴定的IL-2產生。
圖11A和11B係來自測定的結果，在該測定中使用OX40 NF-κB-螢光素酶報告子(reporter)細胞系對可溶(可溶條件，圖11A)或交聯(複合條件，圖11B)的pab1949-1或IgG1同種型對照抗體進行測試。針對所測試的不同抗體濃度對相對光單位(RLU)進行繪圖。
圖12A和12B係來自報告子測定的結果，在該報告子測定中測試當抗OX40抗體結合至表現OX40的靶細胞時抗OX40抗體用於活化表現FcγRIIIA(圖12A)或FcγRIIAH131變體(圖12B)的報告子細胞的能力。在圖12A中，針對不同濃度的pab1949-1和pab2044-1對Δ RLU值進行繪圖。Δ RLU代表抗OX40抗體的RLU減去同種型對照的RLU。在圖12B中，針對濃度遞增的 pab1949-1、pab1949-1-S267E/L328F、pab2193-1、IgG1同種型對照抗體或IgG2同種型對照抗體對RLU值進行繪圖。
圖13A係橫條圖，顯示來自藉由抗CD3/抗CD28珠粒活化的健康供體的nTregs、CD4+ T細胞或CD8+ T細胞上的人類OX40的Δ MFI(如藉由流動式細胞測量術所測量的)。Δ MFI代表抗OX40抗體的MFI減去同種型對照的MFI。所使用的抗OX40抗體係PE-綴合的小鼠抗人類OX40抗體(生物傳奇公司(Biolegend)：ACT35；目錄：350004；批號：B181090)。圖13B係顯示來自兩個健康供體的活化的nTreg和效應T細胞上的人類OX40的Δ MFI的橫條圖。將細胞用商業抗OX40抗體(BER-ACT35殖株)或同種型對照抗體進行染色並且使用流動式細胞測量術進行分析。圖13C係使用Fcγ受體IIIA(FcγRIIIA)報告子細胞系檢驗抗OX40抗體pab1949的圖。在37℃下，在pab1949或同種型對照存在下，將過量表現FcγRIIIA(158 V/V多態性)的Jurkat NFAT-螢光素酶報告子細胞與活化的初代nTreg和效應T細胞共培養持續20小時。在20小時之後，記錄相對光單位(RLU)，其代表FcγRIIIA結合。Δ RLU代表抗OX40抗體的RLU減去同種型對照的RLU。誤差條代表標準差(n=2)。所示出的資料代表使用來自三個供體的細胞的實驗。圖13D類似於圖13C，顯示了來自使用修飾的實驗方案測試pab1949-1的研究的結果。
圖14A係一組長條圖，示出了藉由流動式細胞測量術測量的OX40的表面表現。從健康人類供體(a-c，n=3)的血液或從非小細胞肺癌患者(NSCLC)(d-f，n=3)的腫瘤組織中收集試樣。將細胞群體定義如下：Tconv(CD3+、CD4+、CD8a-、CD25低、以及FOXP3-)或Treg(CD3+、CD4+、CD8a-、CD25高、以及FOXP3+)。圖14B係一對來自類似於圖14A中所描繪的研究的長條圖，測量了來自子宮內膜癌樣品的CD8+或CD4+ T細胞、或Treg細胞中的表面OX40表現。圖14C係顯示不同腫瘤類型中Treg細胞和Teff細胞上OX40表現的橫條圖。圖14D係匯總在與腫瘤相關的CD4+ Teff細胞和Treg細胞中OX40表現的表格。“-”代表陰性/沒有表現，“+”代表弱表現，“++”代表中度表現，並且“+++”代表高度表現。
圖15A和15B係一組圖，顯示在衍生自食蟹猴PBMC的細胞中由pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的GM-CSF的分泌量。注意，Cyno(食蟹猴)2和Cyno 9係指來自獨立實驗中所測試的相同食蟹猴的PBMC。從不同食蟹猴供體中收集所有其他PBMC樣品。
圖16A和16B類似於圖15A和15B，顯示了由pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的IL-17的分泌量。
圖17A和17B類似於圖15A和15B，顯示了 由pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的TNFβ的分泌量。
圖18A和18B類似於圖15A和15B，顯示了由pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的IL-5的分泌量。
圖19A和19B類似於圖15A和15B，顯示了由pab1949-1或IgG1同種型對照抗體劑量滴定誘導的IL-10的分泌量。
圖20A和20B係一組圖，顯示來自檢驗在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激時，抗OX40抗體pab1949-1對初代食蟹猴PBMC的功能活性的測定的結果。針對pab1949-1或IgG1同種型對照抗體的劑量滴定，對由來自兩個食蟹猴供體的PBMC分泌的IL-2量進行繪圖。
圖21係匯總單株抗OX40抗體pab1949-1和pab1928與表現人類OX40丙胺酸突變體的1624-5細胞的結合的表格。
在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且調節OX40活性的抗體(例如，單株抗體)。例如，在一個方面，在此提供了特異性結合OX40並且增強、誘導、或增加一種或多種OX40活性的抗體。例如，在另一個方面，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且滅活、降低或抑制一種或多種OX40活性 的抗體。在具體實施方式中，抗體係分離的。
還提供了編碼此類抗體的分離的核酸(多核苷酸)，如互補DNA(cDNA)。進一步提供了載體(例如，表現載體)及細胞(例如，宿主細胞)，其包括編碼此類抗體的核酸(多核苷酸)。還提供了製造此類抗體之方法。在其他方面，在此提供了用於誘導、增加或增強OX40活性並且治療某些病症(如癌症)之方法及用途。進一步提供了用於滅活、減少、或抑制OX40(例如，人類OX40)活性並且治療某些病症(如炎性或自身免疫性疾病及障礙)的方法及用途。還提供了相關組成物(例如，醫藥組成物)、套組及檢測方法。
5.1 術語
如在此所使用的，術語“約”和“大約”，當用於修飾數值或數值範圍時，顯示5%至10%高於及5%至10%低於該值或範圍的偏差維持在所述值或範圍旨在意指的範圍內。
如在此所使用的，如果在指定域範圍內(例如，在給定實驗中，或使用多次實驗的平均值)B隨著A增加而大幅增加，那麼在A值的指定域範圍內，B係A的“基本上遞增性的函數”。該定義允許相對於與任何A的較低值對應的B值，與A的給定值對應的B值低1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、或20%。
如在此所使用的，術語“抗體”係本領域用語 並且在此可以互換地使用，並意指具有特異性結合抗原的抗原結合部位的分子。
抗體可以包括，例如單株抗體、重組產生的抗體、人源抗體、人源化抗體、表面更新的抗體(resurfaced antibodies)、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、四聚體抗體，其包括兩個重鏈及兩個輕鏈分子、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體、雜綴合(heteroconjugate)抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fvs(scFv)、駝峰化(camelized)抗體、親合體(affybody)、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫化物連接的Fvs(sdFv)、抗獨特型(抗Id)抗體(包括例如抗抗Id抗體)、雙特異性抗體、以及多特異性抗體。在某些實施方式中，在此描述的抗體係指多株抗體群。抗體可以係任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何種類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、或IgA2)或任何亞類(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些實施方式中，在此描述的抗體係IgG抗體、或其種類(例如，人類IgG1、IgG2、或IgG4)或亞類。在一個具體實施方式中，抗體係人源化單株抗體。在另一個具體實施方式中，抗體係人類單株抗體，例如其係免疫球蛋白。在某些實施方式中，在此描述的抗體係IgG1、IgG2、或IgG4抗體。
如在此所使用的，術語“抗原結合域”、“抗原 結合區”、“抗原結合部位”及類似術語係指抗體分子的部分，該部分包括賦予抗體分子針對抗原的特異性的胺基酸殘基(例如，互補決定區(CDR))。抗原結合區可以衍生自任何動物物種，如齧齒類動物(例如，小鼠、大鼠或倉鼠)以及人類。
如在此所使用的，術語“可變區”或“可變域”可互換使用並且在本領域中是常見的。可變區典型地是指抗體的部分，一般而言，輕鏈或重鏈的部分，典型地，成熟重鏈中胺基末端的約110至120個胺基酸或110至125個胺基酸以及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其在抗體之間序列上廣泛地不同並且針對其特定抗原用於特定抗體的結合及特異性。序列的可變性集中於那些被稱為互補決定區(CDR)的區，而可變域中更高度保守的區被稱為框架區(FR)。不希望受任何具體機制或理論束縛的情況下，據信輕鏈和重鏈的CDR主要負責抗體與抗原的相互作用及特異性。在某些實施方式中，可變區係人類可變區。在某些實施方式中，可變區包括齧齒類動物或鼠科動物CDR以及人類框架區(FR)。在具體實施方式中，可變區係靈長類動物(例如，非人類靈長動物)可變區。在某些實施方式中，可變區包括齧齒類動物或鼠科動物CDR以及靈長類動物(例如，非人類靈長動物)框架區(FR)。
術語“VL”及“VL結構域”可互換使用，係指抗體的輕鏈可變區。
術語“VH”及“VH結構域”可互換使用，係指抗體的重鏈可變區。
術語“卡巴特編號”及類似術語係本領域公認的並且是指抗體的重鏈和輕鏈可變區或其抗原結合部分中編號胺基酸殘基的系統。在某些方面中，可以根據卡巴特編號系統確定抗體的CDR(參見，例如，卡巴特(Kabat)EA &吳(Wu)TT(1971)紐約科學學術年報(Ann NY Acad Sci)190：382-391以及卡巴特(Kabat)EA等人，(1991)免疫學重要的蛋白質的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美國衛生和公共服務部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版號91-3242)。使用卡巴特編號系統，抗體重鏈分子中的CDR典型地存在於胺基酸位置31至35，其視情況可以包括一個或兩個額外的胺基酸在35之後(在卡巴特編號方案中被稱為35A及35B)(CDR1)、胺基酸位置50至65(CDR2)及胺基酸位置95至102(CDR3)。使用卡巴特編號系統，抗體輕鏈分子中的CDR典型地存在於胺基酸位置24至34(CDR1)、胺基酸位置50至56(CDR2)及胺基酸位置89至97(CDR3)。在一個具體實施方式中，已根據卡巴特編號方案確定在此描述的抗體的CDR。
如在此所使用的，術語“恒定區”或“恒定域”係可互換的並且在本領域中具有共同意義。恒定區係抗體部分，例如，輕鏈和/或重鏈的羧基末端部分，其不直接參 與抗體與抗原的結合但可展現出各種效應物功能，如與Fc受體的相互作用。免疫球蛋白分子的恒定區相對於免疫球蛋白可變域一般具有更為保守的胺基酸序列。
如在此所使用的，當關於抗體使用時，術語“重鏈”，基於恒定域的胺基酸序列可意指任何不同類型，例如，α、δ、ε、γ及μ，其分別產生抗體的IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類型，包含IgG的亞類，例如，IgG1、IgG2、IgG3、以及IgG4。
如在此所使用的，當關於抗體使用時，術語“輕鏈”，基於恒定域的胺基酸序列可意指任何不同類型，例如，kappa(κ)或lambda(λ)。輕鏈胺基酸序列係本領域熟知的。在具體實施方式中，輕鏈係人類輕鏈。
“結合親和力”總體上是指分子(例如，抗體)的單個結合部位與其結合配偶體(partner)(例如，抗原)之間非共價相互作用的總和的強度。除非另外指明，如在此所使用的，“結合親和力”係指內部結合親和力，其反映出結合對(例如，抗體與抗原)的成員之間1：1相互作用。分子X針對其配偶體Y的親和力通常可以由解離常數(KD)來表示。可以本領域中已知的多種方式測量和/或表示親和力，包括但不限於，平衡解離常數(KD)以及平衡締合常數(KA)。從k關/k開的商計算KD，而從k開/k關的商計算KA。K開係指例如抗體對抗原的結合速率常數，而k關係指例如抗體對抗原的解離。可以藉由熟習該項技術者已知的技術，如BIAcore®或KinExA來確定k開及k關。
如在此所使用的，“保守性胺基酸取代”係其中的胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基所替代的取代。具有側鏈的胺基酸殘基的家族已在本領域中定義。該等家族包括具有以下的胺基酸：鹼性側鏈(例如賴胺酸、精胺酸、組胺酸)，酸性側鏈(例如天冬胺酸、穀胺酸)，不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)，非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)，β-支鏈的側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)以及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。在某些實施方式中，在一個或多個CDR中或抗體的一個或多個框架區中的一個或多個胺基酸殘基可以被具有類似側鏈的胺基酸殘基取代。
如在此所使用的，“表位”係本領域中的術語並且係指抗體可特異性結合的抗原的局部區。表位可以是，例如，多肽的連續胺基酸(線性或連續表位)或者表位可以是，例如，來自一種或多種多肽的兩個或多個非連續區聚集在一起(構象、非線性、間斷或非連續表位)。在某些實施方式中，抗體所結合的表位可以由例如NMR光譜術、X射線衍射結晶學研究、ELISA分析、偶合質譜法(例如，液相層析質譜法)的氫/氘交換、基於陣列的寡肽掃描分析、和/或誘變基因作圖(例如，定點誘變基因作圖)確定。對於X光結晶學，可使用任一種本領域中已知的方法完成結晶(例如，吉爾格(Giegé)R等人， (1994)晶體學報D輯：生物晶體學(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)50(Pt 4)：339-350；麥克弗森(McPherson)A(1990)歐洲生物化學雜誌(Eur J Biochem)189：1-23；錢(Chayen)NE(1997)結構(Structure)5：1269-1274；麥克弗森A(1976)生物化學雜誌(J Biol Chem)251：6300-6303)。抗體：抗原晶體可使用為人熟知的X射線衍射技術進行研究並且可使用電腦軟體(如X-PLOR(耶魯大學(Yale University)，1992，由分子模擬公司(Molecular Simulations,Inc.)精細化；參見，例如，酶學方法(Meth Enzymol)(1985)第114和115卷，編輯威科夫(Wyckoff)HW等人；U.S.2004/0014194)、以及BUSTER(布裡科奈(Bricogne)G(1993)晶體學報D輯：生物晶體學49(Pt1)：37-60；布裡科奈G(1997)酶學方法276A：361-423，編輯卡特(Carter)CW；羅維西(Roversi)P等人，(2000)晶體學報D輯：生物晶體學56(Pt 10)：1316-1323)。誘變基因作圖研究可使用熟習該項技術者已知的任何方法來完成。參見，例如，錢貝(Champe)M等人，(1995)生物化學雜誌270：1388-1394以及坎甯安(Cunningham)BC和威爾斯(Wells)JA(1989)科學244：1081-1085關於誘變技術的描述，包括丙胺酸分區誘變技術。在一個具體實施方式中，使用丙胺酸掃描誘變研究確定抗體的表位。
如在此所使用的，術語“免疫特異性結合”、“免疫特異性識別”、“特異性結合”以及“特異性識別”在抗 體背景下是類似術語，並且是指結合抗原(例如，表位或免疫複合物)的分子，而此種結合係熟習該項技術者所理解的。例如，特異性結合抗原的分子通常以較低親和性可結合到其他肽或多肽上，其藉由例如免疫測定、BIAcore®、KinExA 3000儀器(SapidyneInstruments，博伊西(Boise)，愛達荷州(ID))或其他本領域中已知的分析來確定。在一個具體實施方式中，免疫特異性結合一種抗原的分子以至少2對數、2.5對數、3對數、4對數或高於當分子非特異性結合另一種抗原時的KA的KA結合到該抗原。在具有抗OX40抗原結合域和不特異性結合由人類免疫細胞表現的抗原的第二抗原結合域的抗體背景下，術語“免疫特異性結合”、“免疫特異性識別”、“特異性結合”以及“特異性識別”係指標對多於一種抗原具有突出特異性的抗體(即，與第二抗原結合域相關的OX40和抗原)。
在另一個具體實施方式中，免疫特異性結合抗原的分子在類似結合條件下不與其他蛋白交叉反應。在另一個具體實施方式中，免疫特異性結合抗原的分子不與其他非OX40蛋白交叉反應。在一個具體實施方式中，在此提供了以比與另一種不相關抗原較高的親和性結合OX40的抗體。在某些實施方式中，在此提供了以20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%親和性或比與另一種不相關抗原更高的親和性結合OX40(例如，人類OX40) 的抗體，如藉由例如放射免疫測定、表面等離振子共振(plasmon resonance)或動力學排除測定法所測量的。在一個具體實施方式中，在此描述的抗OX40抗體與不相關非OX40蛋白的結合程度小於該抗體與OX40蛋白結合的10%、15%或20%，如藉由例如放射免疫測定所測量的。
在一個具體實施方式中，在此提供了以比與另一種OX40較高的親和性結合人類OX40的抗體。在某些實施方式中，在此提供了以5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%親和性或比與另一種OX40該高的親和性結合人類OX40的抗體，如藉由例如放射免疫測定、表面等離振子共振或動力學排除測定法所測量的。在一個具體實施方式中，在此描述的結合人類OX40的抗體將以小於該抗體與人類OX40蛋白結合的10%、15%或20%結合另一種OX40蛋白質，如藉由例如放射免疫測定、表面等離振子共振或動力學排除測定法所測量的。
如在此所使用的，術語“OX40受體”或“OX40”或“OX40多肽”係指OX40包括但不限於，天然OX40、OX40的亞型或OX40的種間OX40同系物。Ox40又稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員4(TNFRSF4)、ACT35、CD134、IMD16、以及TXGP1L。GenBankTM登錄號BC105070和BC105072提供了人類OX40核酸序列。Refseq號NP_003318.1提供了人類OX40的胺基酸序列。人類OX40的不成熟胺基酸序列提供為SEQ ID NO：17。 人類OX40的成熟胺基酸序列提供為SEQ ID NO：55。人類OX40由Entrez Gene指定為GeneID：7293。RefSeq號XM_005545122.1和XP_005545179.1分別提供了預測的食蟹猴OX40核酸序列和胺基酸序列。還已經報導了人類OX40的可溶亞型(泰勒(Taylor)L等人，(2001)免疫學方法雜誌255：67-72)。如在此所使用的，術語“人類OX40”係指包括SEQ ID NO：55的多肽序列的OX40。
如在此所使用的，術語“OX40配位基”和“OX40L”係指腫瘤壞死因子配位基超家族成員4(TNFSF4)。OX40L另外被稱為CD252、GP34、TXGP1、以及CD134L。GenBankTM登錄號D90224.1和AK297932.1提供了示例性的人類OX40L核酸序列。RefSeq號NP_003317.1和Swiss-Prot登錄號P23510-1提供了針對亞型1的示例性人類OX40L胺基酸序列。RefSeq號NP_001284491.1和Swiss-Prot登錄號P23510-2提供了針對亞型2的示例性人類OX40L胺基酸序列。人類OX40L由Entrez Gene指定為GeneID：7292。在一個具體實施方式中，OX40L係SEQ ID NO：42的人類OX40L亞型1或SEQ ID NO：43的亞型2。
如在此所使用的，術語“宿主細胞”可以是任何類型的細胞(例如，原代細胞、培養物中的細胞或來自細胞系的細胞)。在具體實施方式中，術語“宿主細胞”係指用核酸分子轉染的細胞以及此種細胞的子代或潛在子代。此種細胞的子代可以不與用核酸分子轉染的親本細胞 相同，因為例如可能在後代中或核酸分子整合進宿主細胞基因組中時發生的突變或環境影響。
如在此所使用的，在給予受試者治療的背景下，術語“有效量”係指達到所希望的預防或治療效果的治療的量。有效量的實例提供於以下章節5.5.1.3中。
如在此所使用的，術語“受試者”與“患者”可互換地使用。受試者可以是動物。在一些實施方式中，受試者係哺乳動物，諸如非靈長類(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類(例如，猴或人類)，最較佳的是人類。在一些實施方式中，受試者係食蟹猴。在某些實施方式中，此類術語係指非人類動物(例如，非人類動物，諸如豬、馬、牛、貓或狗)。在一些實施方式中，此類術語係指寵物或家畜。在具體實施方式中，此類術語係指人類。
如在此所使用的，如果相對於測試抗體與第二抗原之間的結合，測試抗體與第一抗原之間的結合降低了至少30%、40%、50%、60%、70%或80%，那麼相對於測試抗體與第二抗原之間的結合，測試抗體與第一抗原之間的結合“大幅變弱”，如例如在流動式細胞測量術分析中所測量的。
兩個序列(例如，胺基酸序列或核酸序列)之間“百分比一致性”的確定也可以使用數學演算法來完成。用於比較兩個序列的數學演算法的一個具體、非限制性的實例係卡爾林(Karlin)S和阿爾丘爾(Altschul)SF (1990)美國科學院院報87：2264-2268的演算法，該演算法在卡爾林S和阿爾丘爾SF(1993)美國科學院院報90：5873-5877中被修改。此種演算法被結合到阿爾丘爾SF等人，(1990)分子生物學雜誌215：403的NBLAST和XBLAST程式中。BLAST核苷酸檢索可由NBLAST核苷酸程式參數設定為例如分數=100，字長=12，來進行以獲得與在此描述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可由XBLAST程式參數設定為例如分數50，字長=3，來進行以獲得與在此描述的蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目標的有缺口的比對，可以利用如在阿爾丘爾SF等人，(1997)核酸研究25：33893402中所述的有缺口的BLAST。可替代地，可以將PSI BLAST用於進行檢測分子之間的距離關係的反覆運算檢索(Id.)。當運用BLAST、有缺口的BLAST以及PSI Blast程式時，可以使用對應程式的(例如，XBLAST及NBLAST的)默認參數(參見，例如，在萬維網(ncbi.nlm.nih.gov)上的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))。用於序列比較的數學演算法的另一個具體、非限制性的實例係梅耶斯(Myers)和米勒(Miller)的演算法(1988，CABIOS4：11 17)。此種演算法被結合到ALIGN程式(第2.0版)中，該程式係GCG序列排比套裝軟體的一部分。當運用ALIGN程式用於比較胺基酸序列，可使用PAM120權重殘基表、12的空位長度罰分以 及4的空位罰分。
可使用類似於上述那些技術的技術，在容許或不容許缺口的情況下確定兩個序列之間的百分比一致性。在計算百分比一致性中，典型地僅計數確切的匹配。
如在此所使用的，術語“不結合由人類免疫細胞表現的抗原的抗原結合域”意指該抗原結合域不結合由任何造血起源的人類細胞表現的抗原，該人類細胞在免疫應答中發揮作用。免疫細胞包括淋巴細胞(如B細胞和T細胞)；自然殺傷細胞；以及骨髓細胞(如單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、嗜鹼性粒細胞、以及粒細胞)。例如，此種結合域不會結合OX40或TNF受體超家族的由人類細胞表現的任何其他成員。然而，該抗原結合域可以結合例如但不限於以下各項的抗原：在其他生物而並非人類中表現的抗原(即非人類抗原)；不是由野生型人類細胞表現的抗原；或病毒抗原(包括但不限於，來自不感染人類細胞的病毒的抗原、或不存在於不受感染的人類免疫細胞中的病毒抗原)。
5.2 抗體
在一個具體方面，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體(例如，單株抗體(如嵌合、人源化、或人抗體))。
在某些實施方式中，在此描述的抗體結合人類CD4+ T細胞和人類CD8+ T細胞。在某些實施方式 中，在此描述的抗體結合人類CD4+細胞和食蟹猴CD4+ T細胞。
在一個具體實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包括：(a)包括胺基酸序列RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)、由其組成、或基本上由其組成的VL CDR1，(b)包括胺基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO：2)、由其組成、或基本上由其組成的VL CDR2，以及(c)包括胺基酸序列MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)、由其組成、或基本上由其組成的VL CDR3，如表1中所示。
在一些實施方式中，抗體包括在此描述的VL框架區。在具體實施方式中，抗體包括表3中所列抗體的VL框架區(FR)。
在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包括：(a)包括胺基酸序列GSAMH(SEQ ID NO：4)、由其組成、或基本上由其組成的VH CDR1，(b)包括胺基酸序列RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)、由其組成、或基本上由其組成的VH CDR2，以及(c)包括胺基酸序列GIYDSSGYDY(SEQ ID NO： 6)、由其組成、或基本上由其組成的VH CDR3，如表2中所示。
在一些實施方式中，抗體包括在此描述的VH框架。在具體實施方式中，抗體包括表4中所列抗體的VH框架區。
Figure 105114161-A0202-12-0105-2
 1表1中的VL CDR係根據卡巴特(Kabat)確定的。
Figure 105114161-A0202-12-0105-4
 2表2中的VH CDR係根據卡巴特(Kabat)確定的。
Figure 105114161-A0202-12-0105-5
 3表3中描述的VL框架區係針對CDR基於卡巴特編號系統的邊界而確定的。換言之，VL CDR係藉由卡巴特(Kabat)確定的，並且框架區係圍繞呈FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、以及FR4形式的可變區中的CDR的胺基酸殘基。
Figure 105114161-A0202-12-0106-3
 4表4中描述的VH框架區係針對CDR基於卡巴特編號系統的邊界而確定的。換言之，VH CDR係藉由卡巴特(Kabat)確定的，並且框架區係圍繞呈FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、以及FR4狀態的可變區中的CDR的胺基酸殘基。
在具體實施方式中，抗體包括表3中所列的四個VL框架區(FR)以及表4中所列的四個VH框架區(FR)。
在某些實施方式中，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括pab1949或pab2044的輕鏈可變區(VL)CDR和重鏈可變區(VH)CDR的抗體，例如，如在表1和2中所列出的(即SEQ ID NO：1-6)。在某些實施方式中，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括pab1949或pab2044的輕鏈可變區(VL)CDR和重鏈可變區(VH)CDR的抗體，例如，如在表1和2中所列出的(即SEQ ID NO：1-6)，並且VL框架區和VH框架區在表3和4中列出。
在一個具體實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包括：如在表1中所列出的VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3和在表3中所列出的 VL框架區。
在某些實施方式中，抗體包括輕鏈可變框架區，該輕鏈可變框架區衍生自由人類基因編碼的胺基酸序列，其中該胺基酸序列係IGKV2-28*01的胺基酸序列(SEQ ID NO：18)。
在一個具體實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包括：如在表2中所列出的VH CDR1、VH CDR2、以及VH CDR3和在表4中所列出的VH框架區。
在某些實施方式中，抗體包括重鏈可變框架區，該重鏈可變框架區衍生自由人類基因編碼的胺基酸序列，其中該胺基酸序列係IGHV3-73*01的胺基酸序列(SEQ ID NO：19)。
在一個具體實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：VL結構域，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在一個具體實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括由SEQ ID NO：15的胺基酸序列組成、或基本上由其組成的VL結構域。
在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：VH結構域，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括由SEQ ID NO：16的胺基酸序列組成、或基本上由其組成的VH結構域。
在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括VH結構域和VL結構域，其中VH結構域和VL結構域分別包括SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括VH結構域和VL結構域，其中VH結構域和VL結構域分別由SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：15的胺基酸序列組成、或基本上由其組成。
在某些方面中，在此描述的抗體可單獨地依其VL結構域或單獨地依其VH結構域、或單獨地依其3個VL CDR或單獨地依其3個VH CDR進行描述。參見，例如，雷德(Rader)C等人，(1998)美國科學院院報95：8910-8915，將其藉由引用以其全文結合在此，其描述了小鼠抗αvβ3抗體的人源化，藉由分別從人類輕鏈或重鏈文庫(heavy chain library)中鑒別互補輕鏈或重鏈，從而得到具有與原始抗體親和性一樣高或高於其的親和性的人源化抗體變體。還參見克拉克森(Clackson)T等人，(1991)自然352：624-628，將其藉由引用以其全文結合在此，其描述了藉由使用特定VL結構域(或VH結構域)並篩選用於互補可變域的文庫而產生結合特定抗原的抗體的方法。篩選產生針對特定VH結構域的14個新配偶體以及針對特定VL結構域的13個新配偶體，該等配偶體 係強結合劑，如藉由ELISA所確定的。還參見金姆(Kim)SJ和洪(Hong)HJ，(2007)微生物學雜誌(JMicrobiol)45：572-577，將其藉由引用以其全文結合在此，其描述了藉由使用特定VH結構域並篩選用於互補VL結構域的文庫(例如，人類VL文庫)而產生結合特定抗原的抗體的方法；所選擇的VL結構域進而可用於引導選擇額外的互補(例如，人類)VH結構域。
在某些方面中，抗體的CDR可根據喬西亞編號方案(Chothia numbering scheme)(其係指免疫球蛋白結構環的位置)來確定(參見，例如，喬西亞C和萊斯克(Lesk)Am，(1987)，分子生物學雜誌196：901-917；Al-Lazikani B等人，(1997)分子生物學雜誌273：927-948；喬西亞C等人，(1992)分子生物學雜誌227：799-817；拉蒙塔諾(Tramontano)A等人，(1990)分子生物學雜誌215(1)：175-82；以及美國專利案號7,709,226)。典型地，當使用卡巴特編號規定(Kabat numbering convention)時，Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34處，Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56處，並且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，並且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。當使用卡巴特編號規定進行編號時，Chothia CDR-H1環的末端根據環的長度在H32及H34之間變化(這係 因為卡巴特編號方案將插入置於H35A及H35B處；如果35A和35B均不存在，則環在32處終止；或僅35A存在，則環在33處終止；若35A和35B兩者都存在，則環在34處終止)。
在某些方面中，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括pab1949或pab2044的VL的Chothia VL CDR的抗體。在某些方面中，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括pab1949或pab2044的VH的Chothia VH CDR的抗體。在某些方面中，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括pab1949或pab2044的VL的Chothia VL CDR並且包括pab1949或pab2044的VH的Chothia VH CDR的抗體。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括一個或多個CDR，其中Chothia和Kabat CDR具有相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括Kabat CDR和Chothia CDR組合的抗體。
在某些方面中，抗體的CDR可根據如描述於勒弗朗(Lefranc)M-P，(1999)免疫學家(The Immunologist)7：132-136以及勒弗朗M-P等人，(1999)核酸研究(Nucleic Acids Res)27：209-212中的IMGT編號系統來確定。根據IMGT編號方案，VH-CDR1在位置26至35處，VH-CDR2在位置51至57處，VH-CDR3在位置93至102處，VL-CDR1在位置27至32處，VL- CDR2在位置50至52處，並且VL-CDR3在位置89至97處。在一個具體實施方式中，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括pab1949或pab2044的CDR的抗體，如藉由IMGT編號系統(例如，如描述於上述勒弗朗M-P(1999)以及上述勒弗朗M-P等人，(1999)中)所確定的。
在某些方面中，抗體的CDR可根據麥克卡倫(MacCallum)RM等人，(1996)分子生物學雜誌262：732-745來確定。還參見，例如，馬丁(Martin)A.在《抗體工程》(Antibody Engineering)中的“抗體可變域的蛋白質序列及結構分析(“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”)”，康特曼(Kontermann)和迪貝爾(Dübel)，編輯，第31章，第422-439頁，柏林斯普林格出版社(Springer-Verlag)，柏林(Berlin)(2001)。在一個具體實施方式中，在此提供了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括pab1949或pab2044的CDR的抗體，如藉由麥克卡倫RM等人中的方法所確定的。
在某些方面中，抗體的CDR可根據AbM編號方案來確定，該編號方案係指AbM高變區，該等高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的平衡(compromise)，並且被Oxford Molecular’s AbM抗體建模軟體(牛津大學分子小組公司(Oxford Molecular Group,Inc.))使用。在一個具體實施方式中，在此提供 了特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括pab1949或pab2044的CDR的抗體，如藉由AbM編號方案所確定的。
在一個具體實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，沿在此描述的抗體的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)區的一個或多個CDR的位置可以變化一、二、三、四、五或六個胺基酸位置。例如，在一個實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，相對於在此描述的抗體(例如，pab1949或pab2044)的CDR位置，定義在此描述的抗體的CDR的位置可以藉由將CDR的N端和/或C端邊界移位一、二、三、四、五或六個胺基酸而變化。在另一個實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，沿在此描述的抗體的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)區的一個或多個CDR的長度可以變化(例如，變短或變長)一、二、三、四、五或更多個胺基酸。
在一個實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，在此描述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、和/或VH CDR3可以比在此描述的一個或多個CDR(例如，SEQ ID NO：1-6)短一、二、三、四、五或更多個胺基酸。在另一個實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，在此描述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、和/或VH CDR3可以比在此描述的一個或多個CDR(例如，SEQ ID NO：1-6)長一、二、三、四、五或更多個胺基酸。在另一個實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，在此描述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、和/或VH CDR3的胺基端可以相比於在此描述的一個或多個CDR(例如，SEQ ID NO：1-6)延長一、二、三、四、五或更多個胺基酸。在另一個實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，在此描述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、和/或VH CDR3的羧基末端可以相比於在此描述的一個或多個CDR(例如，SEQ ID NO：1-6)延長一、二、三、四、五或更多個胺基酸。在另一個實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，在此描述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、和/或VH CDR3的胺基端可以相比於在此描述的一個或多個CDR(例如，SEQ ID NO：1-6)縮短一、二、三、四、五或更多個胺基酸。在一個實施方式中，只要能維持免疫特異性結合至OX40(例如，人類OX40)(例如，基本上維持，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)，在此描述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、和/或VH CDR3的羧基末端可以相比於在此描述的一個或多個CDR(例如，SEQ ID NO：1-6)縮短一、二、三、四、五或更多個胺基酸。本領域中已知的任何方法都可以用於確認免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)是否得以維持，例如，在此提供的“實例”部分(第6章節)中所述的結合分析及條件。
在具體方面，在此提供了包括抗體輕鏈和重鏈(例如，分別的輕鏈和重鏈)的抗體。關於輕鏈，在一個具體實施方式中，在此描述的抗體輕鏈係κ輕鏈。在另一個具體實施方式中，在此描述的抗體輕鏈係λ輕鏈。在 又另一個具體實施方式中，在此描述的抗體輕鏈係人類κ輕鏈或人類λ輕鏈。在一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40多肽(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈，其中VL結構域的胺基酸序列包括在SEQ ID NO：15中列出的序列，並且其中輕鏈的恒定區包括人類κ輕鏈恒定區的胺基酸序列。在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈，其中VL結構域的胺基酸序列包括在SEQ ID NO：15中列出的序列，並且其中輕鏈的恒定區包括人類λ輕鏈恒定區的胺基酸序列。在一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈，其中VL結構域的胺基酸序列包括在SEQ ID NO：15中列出的序列，並且其中輕鏈的恒定區包括人類κ或λ輕鏈恒定區的胺基酸序列。人類恒定區序列的非限制性實例已經在本領域中有描述，例如，參見美國專利案號5,693,780以及上述卡巴特EA等人，(1991)。
在一個具體實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈，該輕鏈包括在SEQ ID NO：20中列出的胺基酸序列。
關於重鏈，在一個具體實施方式中，在此描述的抗體重鏈可以是α、δ、ε、γ或μ重鏈。在另一個具體實施方式中，所述抗體重鏈可以包括人類α、δ、ε、γ或μ重鏈。在一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，其中 VH結構域的胺基酸序列可以包括在SEQ ID NO：16中列出的序列，並且其中重鏈的恒定區包括人類γ重鏈恒定區的胺基酸序列。在一個具體實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，其中VH結構域的胺基酸序列包括在SEQ ID NO：16中列出的序列，並且其中重鏈的恒定區包括在此描述或本領域已知的人類重鏈的胺基酸。人類恒定區序列的非限制性實例已經在本領域中有描述，例如，參見美國專利案號5,693,780以及上述卡巴特EA等人，(1991)。
在一個具體實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：21中列出的胺基酸序列。在一個具體實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：60中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：23中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：61中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：51中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：62中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：52中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：63中列出的胺基酸序列。
在一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括包含任何在此描述的胺基酸序列的VL結構域和VH結構域，並且其中恒定區包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、或IgY免疫球蛋白分子、或人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、或IgY免疫球蛋白分子恒定區的胺基酸序列。在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括包含任何在此描述的胺基酸序列的VL結構域和VH結構域，並且其中恒定區包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、或IgY免疫球蛋白分子、任何種類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)或任何亞類(例如，IgG2a以及IgG2b)免疫球蛋白分子恒定區的胺基酸序列。在一個具體實施方式中，恒定區包括人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、或IgY免疫球蛋白分子、任何種類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)或任何亞類(例如，IgG2a以及IgG2b)免疫球蛋白分子恒定區的胺基酸序列。
在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫 特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括包含任何在此描述的胺基酸序列的VL結構域和VH結構域，並且其中恒定區包括人類IgG1(例如，同種異型G1m3、G1m17,1或G1m17,1,2)、人類IgG2、或人類IgG4恒定區的胺基酸序列。在一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括包含任何在此描述的胺基酸序列的VL結構域和VH結構域，並且其中恒定區包括人類IgG1(同種異型G1m3)恒定區的胺基酸序列。人類恒定區的非限制性實例在本領域中有描述，例如，參見上述卡巴特(Kabat)EA等人，(1991)。
在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：輕鏈，該輕鏈包括在SEQ ID NO：20中列出的胺基酸序列，以及重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：21中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：輕鏈，該輕鏈包括在SEQ ID NO：20中列出的胺基酸序列，以及重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：60中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：輕鏈，該輕鏈包括在SEQ ID NO：20中列出的胺基酸序列，以及重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：23中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：輕鏈，該輕鏈包括在SEQ ID NO：20中列出的胺基酸序列，以及 重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：61中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：輕鏈，該輕鏈包括在SEQ ID NO：20中列出的胺基酸序列，以及重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：51或52中列出的胺基酸序列。在另一個實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：輕鏈，該輕鏈包括在SEQ ID NO：20中列出的胺基酸序列，以及重鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO：62或63中列出的胺基酸序列。
在某些實施方式中，將一、二或更多個突變(例如，胺基酸取代)導入在此描述的抗體的Fc區(例如，CH2結構域(人類IgG1的殘基231至340)和/或CH3結構域(人類IgG1的殘基341-447)和/或鉸鏈區，其具有根據卡巴特編號系統的編號(例如，卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index))，以改變抗體的一種或多種功能特性(如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性)。
在某些實施方式中，將一、二或更多個突變(例如，胺基酸取代)導入Fc區(CH1結構域)的絞鏈區中，這樣使得絞鏈區中的半胱胺酸殘基數目發生變化(例如，增加或減少)，如在例如美國專利案號5,677,425中所描述的。可以將CH1結構域的絞鏈區中的半胱胺酸殘基數目改變，以例如協助輕鏈和重鏈的組裝、或以改變(例如，增加或減少)該抗體的穩定性。
在一些實施方式中，將一、二或更多個突變(例如，胺基酸取代)導入在此描述的抗體的Fc區(例如，CH2結構域(人類IgG1的殘基231至340)和/或CH3結構域(人類IgG1的殘基341-447)和/或鉸鏈區，其具有根據卡巴特編號系統的編號(例如，卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index))，以增加或減少抗體對效應細胞表面上Fc受體(例如，活化的Fc受體)的親和性。降低或增加抗體對Fc受體的親和性的抗體的Fc區中的突變以及用於將此類突變導入到Fc受體或其片段中的技術是熟習該項技術者已知的。抗體的Fc受體中發生可以改變抗體對Fc受體的親和性的突變的實例描述於例如，史密斯(Smith)P等人，(2012)美國科學院院報109：6181-6186、美國專利案號6,737,056、以及國際公開案號WO 02/060919；WO 98/23289；以及WO 97/34631中，將其藉由引用結合在此。
在一個具體實施方式中，將一、二或更多個胺基酸突變(即取代、插入或缺失)導入到IgG恒定域或其FcRn-結合片段(較佳的是，Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)中，以改變(例如，減少或增加)體內抗體的半衰期。關於將改變(例如，減少或增加)體內抗體半衰期的突變的實例，參見，例如，國際公開案號WO 02/060919；WO 98/23289；以及WO 97/34631；以及美國專利案號5,869,046、6,121,022、6,277,375以及6,165,745。在一些實施方式中，將一、二或更多個胺基酸 突變(即取代、插入或缺失)導入到IgG恒定域或其FcRn-結合片段(較佳的是，Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)中，以減少體內抗體的半衰期。在其他實施方式中，將一、二或更多個胺基酸突變(即取代、插入或缺失)導入到IgG恒定域或其FcRn-結合片段(較佳的是，Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)中，以增加體內抗體的半衰期。在一個具體實施方式中，抗體可以在第二恒定(CH2)結構域(人類IgG1的殘基231至340)和/或第三恒定(CH3)結構域(人類IgG1的殘基341-447)中具有一個或多個胺基酸突變(例如，取代)，其具有根據卡巴特(Kabat)中EU指數(EU index)的編號(上述卡巴特EA等人，(1991))。在一個具體實施方式中，在此描述的抗體的IgG1的恒定區包括在位置252甲硫胺酸(M)取代為酪胺酸(Y)、在位置254絲胺酸(S)取代為蘇胺酸(T)、以及在位置256蘇胺酸(T)取代為穀胺酸(E)，根據卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index)進行編號。參見美國專利案號7,658,921，將其藉由引用結合在此。此種類型的突變體IgG(稱為“YTE突變體”)相較於相同抗體的野生型形式已顯示展現增加四倍的半衰期(參見達爾阿誇(Dall’Acqua)WF等人，(2006)生物化學雜誌281：23514-24)。在某些實施方式中，抗體包括IgG恒定域，該恒定域包括在位置251至257、285至290、308至314、385至389及428至436處胺基酸殘基的一、二、三或更多個胺基酸取代，根據卡巴特(Kabat)中的EU指 數(EU index)進行編號。
在另外的實施方式中，將一、二或更多個胺基酸取代導入到IgG恒定域Fc區中，以改變抗體的一種或多種效應物功能。例如，可以將一個或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320以及322(根據卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index)進行編號)的胺基酸用不同胺基酸進行替代，這樣使得該抗體具有針對效應物配位基的改變的親和性，但是保留親本抗體的抗原結合能力。親和性被改變的效應物配位基可以是例如Fc受體或補體的C1組分。這個途徑進一步詳細地描述於美國專利案號5,624,821和5,648,260中。在一些實施方式中，恒定區結構域的缺失或失活(經由點突變或其他方式)可降低循環抗體的Fc受體結合，從而提高腫瘤定位。關於使恒定域缺失或失活並且從而提高腫瘤定位的突變的描述，參見，例如，美國專利案號5,585,097以及8,591,886。在某些實施方式中，可以將一個或多個胺基酸取代導入到在此描述的抗體的Fc區中，以去除Fc區上可降低Fc受體結合的潛在糖基化位點(參見，例如，希爾茲(Shields)RL等人，(2001)生物化學雜誌276：6591-604)。在不同的實施方式中，在此描述的抗體的恒定區中可發生以下突變中的一個或多個：N297A取代；N297Q取代；L235A取代以及L237A取代；L234A取代以及L235A取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；D265A取代；A327Q取代；或 P329A取代，根據卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index)進行編號。在某些實施方式中，在此描述的抗體的恒定區中可發生選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。
在一個具體實施方式中，在此描述的抗體包括帶有N297Q或N297A胺基酸取代的IgG1的恒定域。在一個實施方式中，在此描述的抗體包括帶有選自下組的突變的IgG1的恒定域，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。
在某些實施方式中，可以將在此描述的抗體的恒定區中的一個或多個選自胺基酸殘基329、331以及322的胺基酸(根據卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index)進行編號)用不同胺基酸進行替代，這樣使得該抗體具有改變的C1q結合和/或減少的或廢除的補體依賴性細胞毒性(CDC)。這個途徑進一步詳細地描述於美國專利案號6,194,551中(伊杜索奇(Idusogie)等人)。在一些實施方式中，可以將在此描述的抗體的CH2結構域的N端區中的胺基酸位置231至238內的一個或多個胺基酸殘基進行改變，以由此改變該抗體固定補體的能力。這個途徑進一步描述於國際公開案號WO 94/29351中。在某些實施方式中，藉由使在以下位置處的一個或多個胺基酸發生突變(例如，引入胺基酸取代)，對在此描述的抗體的Fc區進行修飾以提高該抗體對抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)進行介導的能力，和/或以提高該抗體針對一種 Fcγ受體的親和性：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438、或439，根據卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index)進行編號。這個途徑進一步描述於國際公開案號WO 00/42072中。
在某些實施方式中，在此描述的抗體包括帶有在位置267、328、或其組合處的突變(例如，取代)(根據卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index)進行編號)的IgG1的恒定域。在某些實施方式中，在此描述的抗體包括帶有選自下組的突變(例如，取代)的IgG1的恒定域，該組由以下各項組成：S267E、L328F、以及其組合。在某些實施方式中，在此描述的抗體包括帶有S267E/L328F突變(例如，取代)的IgG1的恒定域。在某些實施方式中，在此描述包括帶有S267E/L328F突變(例如，取代)的IgG1的恒定域的抗體針對FcγRIIA、FcγRIIB、或FcγRIIA以及FcγRIIB具有增加的結合親和力。
在某些實施方式中，在此描述的抗體包括IgG4抗體的恒定域，並且在重鏈胺基酸殘基228處的絲胺 酸(根據卡巴特(Kabat)中的EU指數(EU index)進行編號)取代為脯胺酸。
在某些實施方式中，在此描述的抗體包括IgG2抗體的恒定域，並且在重鏈胺基酸殘基127處的半胱胺酸(根據卡巴特(Kabat)進行編號)取代為絲胺酸。
已經報導，具有低岩藻糖含量的抗體針對Fc受體(例如，FcγRIIIA)具有增加的親和性。因此，在某些實施方式中，在此描述的抗體具有低岩藻糖含量或無岩藻糖含量。可以使用熟習該項技術者已知的技術來生產此類抗體。例如，可以在岩藻糖化缺陷型或缺少岩藻糖基化作用能力的細胞中表現抗體。在一個具體實例中，可以將具有敲除α1,6-岩藻糖基轉移酶的兩個等位基因的細胞系用以產生具有低岩藻糖含量的抗體。Potelligent®系統(龍沙公司)係此種系統的實例，可以將其用於產生具有低岩藻糖含量的抗體。可替代地，具有低岩藻糖含量或無岩藻糖含量的抗體可由例如下述生產：(i)在避免或降低岩藻糖基化作用的條件下培養細胞；(ii)翻譯後移去岩藻糖(例如，用岩藻糖苷酶)；(iii)翻譯後加入所希望的醣(例如，在重組表現非糖基化的糖蛋白之後)；或(iv)純化糖蛋白，以選擇未經岩藻糖基化的抗體。對於用於生產具有無岩藻糖含量或低岩藻糖含量的抗體的方法，參見，例如，朗莫爾(Longmore)GD和沙克特(Schachter)H(1982)碳水化合物研究(Carbohydr Res)100：365-92以及今井西穀(Imai-Nishiya)H等人， (2007)BMC生物技術(BMC Biotechnol.)7：84。
工程化的糖型可用於多種目的，包括但不限於，增強或降低效應物功能。用於在此描述的抗體中生成工程化的糖型的方法包括但不限於，揭露於例如烏馬納(Umaña)P等人，(1999)自然生物技術(Nat Biotechnol)17：176-180；大衛斯(Davies)J等人，(2001)生物技術與生物工程(Biotechnol Bioeng)74：288-294；希爾茲(Shields)RL等人，(2002)生物化學雜誌277：26733-26740；新川(Shinkawa)T等人，(2003)生物化學雜誌278：3466-3473；丹羽(Niwa)R等人，(2004)臨床癌症研究(Clin Cancer Res)1：6248-6255；普雷斯塔(Presta)LG等人，(2002)生物化學學會會刊(Biochem Soc Trans)30：487-490；坎達(Kanda)Y等人，(2007)糖生物學(Glycobiology)17：104-118；美國專利案號6,602,684；6,946,292；以及7,214,775；美國專利公開案號US 2007/0248600；2007/0178551；2008/0060092；以及2006/0253928；國際公開案號WO 00/61739；WO 01/292246；WO 02/311140；以及WO 02/30954；PotillegentTM技術(Biowa公司，普林斯頓(Princeton)，新澤西州(N.J.))；以及GlycoMAb®糖基化工程技術(Glycart生物技術AG，蘇黎世，瑞士)中的那些方法。還參見，例如，費拉拉(Ferrara)C等人，(2006)生物技術與生物工程93：851-861；國際公開案號WO 07/039818；WO 12/130831；WO 99/054342；WO 03/011878；以及WO 04/065540。
在某些實施方式中，用於工程化在此描述的抗體的Fc結構域的技術係Xencor(Monrovia，CA)的Xmab®技術。參見，例如，美國專利案號8,367,805；8,039,592；8,124,731；8,188,231；美國專利公開案號2006/0235208；國際公開案號WO 05/077981；WO 11/097527；以及理查茲(Richards)JO等人，(2008)分子癌症治療學(Mol Cancer Ther)7：2517-2527。
在某些實施方式中，在此描述的抗體的恒定區中在與人類IgG1重鏈中位置L234、L235、以及D265對應的位置處的胺基酸殘基(根據編號的EU指數(EU index)進行編號)分別不是L、L、以及D。這個途徑詳細地描述於國際公開案號WO 14/108483中。在一個具體實施方式中，與人類IgG1重鏈中位置L234、L235、以及D265對應的胺基酸分別是F、E、以及A；或A、A、以及A。
在某些實施方式中，可以將任何在此描述的恒定區突變或修飾引入到在此描述的具有兩個重鏈恒定區的抗體的一個或兩個重鏈恒定區中。
在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈和重鏈，其中(i)該輕鏈包括VL結構域，該結構域包括在SEQ ID NO：1-3中列出的VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3胺基酸序列(例如，列於表1中的那些)；(ii) 該重鏈包括VH結構域，該結構域包括在SEQ ID NO：4-6中列出的VH CDR1、VH CDR2、以及VH CDR3胺基酸序列(例如，列於表2中的那些)；(iii)該輕鏈進一步包括輕鏈恒定域，該輕鏈恒定域包括人類κ輕鏈恒定域的胺基酸序列；以及(iv)該重鏈進一步包括重鏈恒定域，該重鏈恒定域包括人類IgG1(視情況IgG1(同種異型Glm3))重鏈恒定域的胺基酸序列。
在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈和重鏈，其中(i)該輕鏈包括VL結構域，該結構域包括在SEQ ID NO：15中列出的胺基酸；(ii)該重鏈包括VH結構域，該結構域包括在SEQ ID NO：16中列出的胺基酸序列；(iii)該輕鏈進一步包括恒定域，該恒定域包括人類κ輕鏈恒定域的胺基酸序列；以及(iv)該重鏈進一步包括恒定域，該恒定域包括人類IgG1(視情況IgG1(同種異型G1m3))重鏈恒定域的胺基酸序列。
在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈和重鏈，其中(i)該輕鏈包括VL結構域，該結構域包括在SEQ ID NO：1-3中列出的VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3胺基酸序列(例如，列於表1中的那些)；(ii)該重鏈包括VH結構域，該結構域包括在SEQ ID NO：4-6中列出的VH CDR1、VH CDR2、以及VH CDR3胺基酸序列(例如，列於表2中的那些)；(iii)該輕鏈進一步包 括輕鏈恒定域，該輕鏈恒定域包括人類κ輕鏈恒定域的胺基酸序列；以及(iv)該重鏈進一步包括重鏈恒定域，該重鏈恒定域包括人類IgG4重鏈恒定域的胺基酸序列。
在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈和重鏈，其中(i)該輕鏈包括VL結構域，該結構域包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列；(ii)該重鏈包括VH結構域，該結構域包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；(iii)該輕鏈進一步包括恒定域，該恒定域包括人類κ輕鏈恒定域的胺基酸序列；以及(iv)該重鏈進一步包括恒定域，該恒定域包括人類IgG4重鏈恒定域的胺基酸序列。
在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈和重鏈，其中(i)該輕鏈包括VL結構域，該結構域包括在SEQ ID NO：1-3中列出的VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3胺基酸序列(例如，列於表1中的那些)；(ii)該重鏈包括VH結構域，該結構域包括在SEQ ID NO：4-6中列出的VH CDR1、VH CDR2、以及VH CDR3胺基酸序列(例如，列於表2中的那些)；(iii)該輕鏈進一步包括輕鏈恒定域，該輕鏈恒定域包括人類κ輕鏈恒定域的胺基酸序列；以及(iv)該重鏈進一步包括重鏈恒定域，該重鏈恒定域包括人類IgG2重鏈恒定域的胺基酸序列。
在另一個具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括輕鏈和 重鏈，其中(i)該輕鏈包括VL結構域，該結構域包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列；(ii)該重鏈包括VH結構域，該結構域包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；(iii)該輕鏈進一步包括恒定域，該恒定域包括人類κ輕鏈恒定域的胺基酸序列；以及(iv)該重鏈進一步包括恒定域，該恒定域包括人類IgG2重鏈恒定域的胺基酸序列。在某些實施方式中，輕鏈包括SEQ ID NO：50的胺基酸序列並且重鏈包括SEQ ID NO：51的胺基酸序列。在某些實施方式中，輕鏈包括SEQ ID NO：50的胺基酸序列並且重鏈包括SEQ ID NO：62的胺基酸序列。在某些實施方式中，輕鏈包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列並且重鏈包括SEQ ID NO：51的胺基酸序列。在某些實施方式中，輕鏈包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列並且重鏈包括SEQ ID NO：62的胺基酸序列。
在另一個具體實施方式中，在此提供的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(a)包括SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈，其在胺基酸位置297處具有N取代為A或Q的胺基酸取代；以及(b)包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列的輕鏈。在另一個具體實施方式中，在此提供的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(a)包括SEQ ID NO：60的胺基酸序列的重鏈，其在胺基酸位置297處具有N取代為A或Q的胺基酸取代；以及(b)包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列的輕鏈。
在另一個具體實施方式中，在此提供的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(a)包括SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈，其具有選自下組的胺基酸取代，該組由以下各項組成：在胺基酸位置267處S取代為E、在胺基酸位置328處L取代為F、以及在胺基酸位置267處S取代為E和在胺基酸位置328處L取代為F二者；以及(b)包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列的輕鏈。在另一個具體實施方式中，在此提供的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(a)包括SEQ ID NO：60的胺基酸序列的重鏈，其具有選自下組的胺基酸取代，該組由以下各項組成：在胺基酸位置267處S取代為E、在胺基酸位置328處L取代為F、以及在胺基酸位置267處S取代為E和在胺基酸位置328處L取代為F二者；以及(b)包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列的輕鏈。
在具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體展示出抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)活性。在具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體引發自然殺傷細胞介導的細胞消耗。在具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體用於治療被自然殺傷細胞浸潤的的腫瘤。在具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體展示出抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP) 活性。在具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體引發巨噬細胞介導的細胞消耗。在具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體用於治療被巨噬細胞浸潤的的腫瘤。在具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體選擇性地耗盡瘤內的調節性T細胞。
在具體實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括框架區(例如，VL結構域和/或VH結構域的框架區)，該框架區係人類框架區或衍生自人類框架區。人類框架區的非限制性實例在本領域中有描述，例如，參見上述卡巴特(Kabat)EA等人，(1991)。在某些實施方式中，在此描述的抗體包括框架區(例如，VL結構域和/或VH結構域的框架區)，該框架區係靈長類(例如，非人類靈長類)框架區或衍生自靈長類(例如，非人類靈長類)框架區。
例如，將來自抗原特異性非人抗體(典型地為齧齒類動物來源(例如，小鼠或大鼠))的CDR移植到同源人類或非人類靈長動物受體框架中。在一個實施方式中，非人類靈長動物受體框架來自舊世界猿(Old World ape)。在一個具體實施方式中，舊世界猿(Old World ape)受體框架來自黑猩猩(Pan troglodytes)、倭黑猩猩(Pan paniscus)或大猩猩(Gorilla gorilla)。在一個具體實施方式中，非人類靈長動物受體框架來自黑猩 猩(Pan troglodytes)。在一個具體實施方式中，非人類靈長動物受體框架係舊世界猴受體框架。在一個具體實施方式中，舊世界猴受體框架來自獼猴屬。在某一個實施方式中，非人類靈長動物受體框架衍生自食蟹猴(Macaca cynomolgus)。非人類靈長動物框架序列描述於美國專利申請公開案號US 2005/0208625中。
在某些實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括一個、兩個或更多個VL框架區(FR)，該框架區具有針對上述表3所列抗體在此描述的胺基酸序列。在一些實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括一個、兩個或更多個VH框架區(FR)，該框架區具有針對上述表4所列抗體在此描述的胺基酸序列。在具體實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：一個、兩個或更多個VL框架區，該框架區具有針對上述表3所列抗體在此描述的胺基酸序列，以及一個、兩個或更多個VH框架區，該框架區具有針對上述表4所列抗體在此描述的胺基酸序列。
在一些實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：VL結構域的一個、二個、三個或四個框架區，該結構域具有pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：7-10)的胺基酸序列，其帶有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個胺基酸突變(例如，胺基酸取代(如保守性胺基酸取代))和/或VH結構 域的框架區，該結構域具有pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：11-14)的胺基酸序列。在某些實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：VH結構域的一個、二個、三個或四個框架區，該結構域具有pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：11-14)的胺基酸序列，其帶有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個胺基酸突變(例如，胺基酸取代(如保守性胺基酸取代))和/或VL結構域的框架區，該結構域具有pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：7-10)的胺基酸序列。
在某些實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與上述表3中在此描述的VL框架區具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL框架區(FR)。在某些實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與上述表4中在此描述的VH框架區具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH框架區(FR)。在一些實施方式中，在此描述的特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：與上述表4中在此描述的VH框架區具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH框架區(FR)，以及與上述表3中在此描述的VL框架區具有至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL框架區(FR)。
兩個序列(例如，胺基酸序列或核酸序列)之間百分比一致性的確定也可以使用數學演算法來完成。用於比較兩個序列的數學演算法的一個具體、非限制性的實例係卡爾林(Karlin)S和阿爾丘爾(Altschul)SF(1990)美國科學院院報87：2264-2268的演算法，該演算法在卡爾林S和阿爾丘爾SF(1993)美國科學院院報90：5873-5877中被修改。此種演算法被結合到阿爾丘爾SF等人，(1990)分子生物學雜誌215：403的NBLAST和XBLAST程式中。BLAST核苷酸檢索可由NBLAST核苷酸程式參數設定為例如分數=100，字長=12，來進行以獲得與在此描述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可由XBLAST程式參數設定為例如分數50，字長=3，來進行以獲得與在此描述的蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目標的有缺口的比對，可以利用如在阿爾丘爾SF等人，(1997)核酸研究25：3389 3402中所述的有缺口的BLAST。可替代地，可以將PSI BLAST用於進行檢測分子之間的距離關係的反覆運算檢索(Id.)。當運用BLAST、有缺口的BLAST以及PSI Blast程式時，可以使用對應程式的(例如，XBLAST及NBLAST的)默認參數(參見，例如，在萬維網(ncbi.nlm.nih.gov)上的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI))。用於序列比較的數學演算法的另一個具體、非限制性的實例係梅耶斯(Myers)和米勒(Miller)的演算法(1988，CABIOS 4：11 17)。此種演算法被結合到ALIGN程式(第2.0版)中，該程式係GCG序列排比套裝軟體的一部分。當運用ALIGN程式用於比較胺基酸序列，可使用PAM120權重殘基表、12的空位長度罰分以及4的空位罰分。
可使用類似於上述那些技術的技術，在容許或不容許缺口的情況下確定兩個序列之間的百分比一致性。在計算百分比一致性中，典型地僅計數確切的匹配。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體包括與pab1949或pab2044的VL CDR相同的VL CDR。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體包括與pab1949或pab2044的VH CDR相同的VH CDR。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體包括與pab1949或pab2044的VL CDR和VH CDR相同的VL CDR和VH CDR。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8 μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至 少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中當抗OX40抗體在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例 如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構 域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗 OX40抗體在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中當抗OX40抗體在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性 結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗 體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中當抗OX40抗體在例如0.032μg/ml和20μg/ml、0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中 評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6ug/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如 在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1 μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化 學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構 域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生係在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如， 人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體當與板結合時，與板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)相組合地，當在例如37℃以及5% CO2下刺激持續例如4天后誘導例如PBMC或T細胞中一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.7μg/ml和50μg/ml、1.6μg/ml和50μg/ml、3.1μg/ml和50μg/ml、或6.3μg/ml和50μg/ml之間時，一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13) 的產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在板結合的抗CD3抗體(例如，0.8μg/ml)和不同濃度(例如，0、0.3、1、3、6、12、25、和50μg/ml；或0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的板結合的本發明抗體的存在下、在例如37℃以及5% CO2下培養該等PBMC持續例如4天；以及(b)收集上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)或非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司))測量一種或多種細胞介素(例如，TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10、或IL-13)的產生。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20 μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或 pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20 μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性 結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中當該抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，該抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在某些實施方式中，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：(i)與pab1949或pab2044(例如，SEQ ID NO：15)的VL結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VL結構域；以及(ii)與pab1949或pab2044(例如， SEQ ID NO：16)的VH結構域的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%序列一致性的VH結構域，其中該抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.2μg/ml和20μg/ml、或2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在另一個方面，在此提供了與在此描述的抗體(例如，pab1949或pab2044)結合OX40的相同或重疊表位(例如，人類OX40的表位)的抗體。在某些實施方式中，抗體的表位可以由例如NMR光譜術、X射線衍射結晶學研究、ELISA分析、偶合質譜法(例如，液相層析質譜法)的氫/氘交換、基於陣列的寡肽掃描分析、和/或誘變基因作圖(例如，定點誘變基因作圖)確定。對於X光結晶學，可使用任一種本領域中已知的方法完成結晶 (例如，吉爾格(Giegé)R等人，(1994)晶體學報D輯：生物晶體學(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)50(Pt 4)：339-350；麥克弗森(McPherson)A(1990)歐洲生物化學雜誌(Eur J Biochem)189：1-23；錢(Chayen)NE(1997)結構(Structure)5：1269-1274；麥克弗森A(1976)生物化學雜誌(J Biol Chem)251：6300-6303)。抗體：抗原晶體可使用為人熟知的X射線衍射技術進行研究並且可使用電腦軟體(如X-PLOR(耶魯大學(Yale University)，1992，由分子模擬公司(Molecular Simulations,Inc.)精細化；參見，例如，酶學方法(Meth Enzymol)(1985)第114和115卷，編輯威科夫(Wyckoff)HW等人；美國專利申請號2004/0014194)、以及BUSTER(布裡科奈(Bricogne)G(1993)晶體學報D輯：生物晶體學49(Pt 1)：37-60；布裡科奈G(1997)酶學方法276A：361-423，編輯卡特(Carter)CW；羅維西(Roversi)P等人，(2000)晶體學報D輯：生物晶體學56(Pt 10)：1316-1323)。誘變基因作圖研究可使用熟習該項技術者已知的任何方法來完成。參見，例如，上述錢貝(Champe)M等人，(1995)及上述坎甯安(Cunningham)BC和威爾斯(Wells)JA(1989)關於誘變技術的描述，包括丙胺酸分區誘變技術。在一個具體實施方式中，使用丙胺酸掃描誘變研究確定抗體的表位。此外，識別並且結合OX40(例如，人類OX40)的相同或重疊表位的抗體可使用常規技術(如免 疫測定)進行鑒定，例如，藉由顯示一種抗體阻斷另一種抗體結合靶抗原的能力(即競爭性結合分析)。還可以使用競爭結合鑒定法以確定兩種抗體是否對表位具有類似結合特異性。可以在分析中確定競爭性結合，其中在測試下的免疫球蛋白抑制參考抗體特異性結合共同抗原(如OX40)。已知許多類型的競爭性結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶聯免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見斯塔里(Stahli)C等人，(1983)酶學方法(Methods Enzymol)9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見柯克蘭(Kirkland)TN等人，(1986)免疫學雜誌137：3614-9)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見哈洛E和拉內D，(1988)抗體：實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社)；使用I-125標籤的固相直接標記RIA(參見莫雷爾(Morel)GA等人，(1988)分子免疫學(Mol Immunol)25(1)：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(張(Cheung)RC等人，(1990)病毒學(Virology)176：546-52)；以及直接標記RIA(莫爾登豪爾(Moldenhauer)G等人，(1990)斯堪的納維亞免疫學雜誌(Scand J Immunol)32：77-82)。典型地，此種分析涉及使用結合至帶有未標記的測試免疫球蛋白以及標記的參考免疫球蛋白中的任一種的固體表面或細胞的純化抗原(例如，OX40(如人類OX40))。可以在測試免疫球蛋白的存在下，藉由確定結合至固體表面或細胞的標籤量 而測量競爭性抑制。通常，測試免疫球蛋白以過量存在。通常，當競爭抗體過量存在時，它將會抑制參考抗體特異性結合共同抗原至少50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%或更多。可使用標記抗原或標記抗體以許多不同形式配置競爭結合鑒定法。在此種分析的常用版本中，將抗原固定在96孔板上。然後，使用放射性或酶標籤測量未標記抗體阻斷標記抗體結合抗原的能力。關於進一步的細節，參見，例如，瓦格納(Wagener)C等人，(1983)免疫學雜誌130：2308-2315；瓦格納C等人，(1984)免疫學方法雜誌68：269-274；黑木(Kuroki)M等人，(1990)癌症研究50：4872-4879；黑木M等人，(1992)免疫學研究(Immunol Invest)21：523-538；黑木M等人，(1992)融合瘤(Hybridoma)11：391-407以及抗體：實驗室手冊，編輯上述哈洛E和拉內D編輯，第386-389頁。
在一個實施方式中，使用表面等離振子共振(BIAcore®)，例如藉由‘串聯方式(in tandem approach)’(如艾迪赫(Abdiche)YN等人，(2009)分析生物化學(Analytical Biochem)386：172-180所述)進行競爭分析，由此將OX40抗原固定在晶片表面上(例如，CM5感測器晶片)，並且然後使抗OX40抗體在晶片上跑過。為了確定一種抗體是否與在此描述的抗OX40抗體競爭，首先使抗OX40抗體在晶片表面跑過以達到飽和，並且然後添加潛在的競爭抗體。相對於非競爭對照， 然後可以確定並且量化競爭抗體的結合。
在某些方面中，可將競爭結合分析用於確定抗體係否例如以劑量依賴性方式被另一種抗體競爭性阻斷，例如，當兩種抗體在競爭結合分析(如競爭ELISA分析)中識別相同或空間重疊表位時，抗體與參考抗體結合基本上相同的表位或重疊表位，可使用標記抗原或標記抗體以許多不同形式配置該分析。在一個具體實施方式中，在競爭結合分析中抗體可與在此描述的抗體(例如，抗體pab1949或pab2044)、或其嵌合或Fab抗體、或包括在此描述的抗體(例如，pab1949或pab2044)的VH CDR及VL CDR的抗體進行測試。
在另一個方面，在此提供了與在此描述的抗體(例如，pab1949或pab2044)競爭(例如，以劑量依賴性方式)結合OX40(例如，人類OX40)的抗體，如使用熟習該項技術者已知或在此描述的分析(例如，ELISA競爭性分析或表面等離振子共振)所確定的。在另一個方面，在此提供了競爭性抑制(例如，以劑量依賴性方式)在此描述的抗體(例如，pab1949或pab2044)結合OX40(例如，人類OX40)的抗體，如使用熟習該項技術者已知或在此描述的分析(例如，ELISA競爭性分析、或懸浮陣列或表面等離振子共振分析)所確定的。在具體實施方式中，此類競爭性阻斷抗體活化、誘導或增強一種或多種OX40活性。在具體方面，在此提供了與包括在此描述的胺基酸序列的抗體(例如，抗體pab1949或pab2044的 VL和/或VH胺基酸序列)競爭(例如，以劑量依賴性方式)特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體，如使用熟習該項技術者已知或在此描述的分析(例如，ELISA競爭性分析、或懸浮陣列或表面等離振子共振分析)所確定的。
在某些實施方式中，在此提供了與在此描述的抗體競爭結合OX40(例如，人類OX40)的程度跟在此描述的抗體自體競爭結合OX40(例如，人類OX40)的程度相同的抗體。在一些實施方式中，在此提供了與在此描述的抗體競爭結合OX40(例如，人類OX40)的第一抗體，其中該第一抗體在分析中競爭結合，該分析包括以下步驟：(a)用以未標記形式的第一抗體在容器中培養OX40轉染細胞；以及(b)添加以標記形式的在此描述的抗體至容器中並且在容器中培養細胞；以及(c)檢測結合細胞的以標記形式的在此描述的抗體。在某些實施方式中，在此提供了與在此描述的抗體競爭結合OX40(例如，人類OX40)的第一抗體，其中競爭呈現為第一抗體與OX40的結合降低超過了80%(例如，85%、90%、95%或98%、或在80%至85%、80%至90%、85%至90%、或85%至95%之間)。
在具體方面，在此提供了與包括具有在SEQ ID NO：15中列出的胺基酸序列的VL結構域和具有在SEQ ID NO：16中列出的胺基酸序列的VH結構域的抗體競爭(例如，以劑量依賴性方式)特異性結合OX40(例 如，人類OX40)的抗體。
在具體方面，在此提供了與包括(i)包括具有列於表1中VL CDR的胺基酸序列的VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3的VL結構域；以及(ii)包括具有列於表2中CDR的胺基酸序列的VH CDR1、VH CDR2、以及VH CDR3的VH結構域的抗體競爭(例如，以劑量依賴性方式)特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體。
在一個具體實施方式中，在此描述的抗體係被包括具有在SEQ ID NO：15中列出的胺基酸序列的VL結構域和具有在SEQ LD NO：16中列出的胺基酸序列的VH結構域的抗體競爭性阻斷(例如，以劑量依賴性方式)特異性結合OX40(例如，人類OX40)的一種抗體。
在另一個具體實施方式中，在此描述的抗體係被包括(i)包括具有列於表1中CDR的胺基酸序列的VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3的VL結構域；以及(ii)包括具有列於表2中CDR的胺基酸序列的VH CDR1、VH CDR2、以及VH CDR3的VH結構域的抗體競爭性阻斷(例如，以劑量依賴性方式)的一種抗體。
在具體方面，在此提供了與pab1949或pab2044的抗體免疫特異性結合相同表位的抗體，以特異性結合OX40(例如，人類OX40)。熟習該項技術者已知或在此描述的分析(例如，X光結晶學、偶合質譜法(例如，液相層析質譜法)的氫/氘交換、丙胺酸掃描、ELISA 分析等)可用於確定兩種抗體是否結合至相同表位。
在一個具體實施方式中，在此描述的抗體免疫特異性結合被pab1949或pab2044結合的相同表位或與該表位重疊的表位。
在另一個具體實施方式中，在此描述的抗體與包括(i)包括具有列於表1中CDR的胺基酸序列的VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3的VL結構域；以及(ii)包括具有列於表2中CDR的胺基酸序列的VH CDR1、VH CDR2、以及VH CDR3的VH結構域的抗體免疫特異性結合相同表位。
在一個具體方面，相對於該抗體與SEQ ID NO：55的人類OX40序列之間的結合，在此描述的抗體與變體OX40之間的結合大幅變弱，並且其中該變體OX40包括SEQ ID NO：55的序列，除了一個選自下組的胺基酸突變(例如，取代)，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A、以及其組合。在一些實施方式中，變體OX40包括SEQ ID NO：55的序列，除了任何一個選自下組的突變，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、以及P115A。在一些實施方式中，變體OX40包括SEQ ID NO：55的序列，除了任何二、三、四、五、六或七個選自下組的突變，該組由以下各項組成：W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、以及P115A。在一些實施方式中，變體OX40包括SEQ ID NO：55的序列，除了胺基 酸突變W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、以及P115A。
在一個具體方面，在此描述的抗體特異性結合人類OX40序列的表位，該表位包括SEQ ID NO：55的選自下組的殘基、基本上由其組成、或由其組成，該組由以下各項組成：60、62、80、88、93、99、115、以及其組合。在一些實施方式中，該表位包括選自下組的任何一個殘基、基本上由其組成、或由其組成，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：55的60、62、80、88、93、99、以及115。在一些實施方式中，該表位包括選自下組的任何二、三、四、五、六或七個殘基、基本上由其組成、或由其組成，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：55的58、60、62、80、88、93、99、以及115。在一些實施方式中，該表位包括SEQ ID NO：55的殘基58、60、62、80、88、93、99、以及115、基本上由其組成、或由其組成。
在一個具體實施方式中，在此描述的抗體特異性結合SEQ ID NO：55的表位，該表位包括選自下組的殘基、基本上由其組成、或由其組成，該組由以下各項組成：60、62、80、88、93、99、115、以及其組合。在一些實施方式中，該表位包括選自下組的任何一個殘基、基本上由其組成、或由其組成，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：55的60、62、80、88、93、99、以及115。在一些實施方式中，該表位包括選自下組的任何二、三、四、五、六或七個殘基、基本上由其組成、或由其組成，該組 由以下各項組成：SEQ ID NO：55的58、60、62、80、88、93、99、以及115。在一些實施方式中，該表位包括SEQ ID NO：55的殘基58、60、62、80、88、93、99、以及115、基本上由其組成、或由其組成。
在一個具體方面，在此描述的抗體特異性結合SEQ ID NO：55的選自下組的至少一個殘基，該組由以下各項組成：60、62、80、88、93、99、115、以及其組合。在一些實施方式中，在此描述的抗體特異性結合選自下組的任何一個殘基、或任何二、三、四、五、六或七個殘基，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：55的60、62、80、88、93、99、以及115。在一些實施方式中，在此描述的抗體特異性結合選自下組的任何二、三、四、五、六或七個殘基，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：55的58、60、62、80、88、93、99、以及115。在一些實施方式中，在此描述的抗體特異性結合SEQ ID NO：55的殘基58、60、62、80、88、93、99、以及115。
在一個具體方面，與結合SEQ ID NO：55的人類OX40序列相比，在此描述的抗體展示出與SEQ ID NO：55相同的蛋白質(除了存在一個選自下組的胺基酸突變(例如，取代)，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A、以及其組合)降低的結合或不結合。在一些實施方式中，該蛋白與SEQ ID NO：55相同，除了存在包括選自下組的任何一個突變、或任何二、三、四、五、六或七個突變的胺基酸突 變，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、以及P115A。在一些實施方式中，該蛋白與SEQ ID NO：55相同，除了存在包括選自下組的任何二、三、四、五、六或七個突變的胺基酸突變，該組由以下各項組成：W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、以及P115A。在一些實施方式中，該蛋白與SEQ ID NO：55相同，除了存在包括突變W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、以及P115A的胺基酸取代。
在某些實施方式中，在此描述的抗體的表位被用作免疫原以生產抗體。對於用於生產抗體的方法，參見，例如，以下章節5.3。
在具體方面，在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體起到激動劑的作用。
在某些實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的OX40(例如，人類OX40)活性，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將OX40(例如，人類OX40)活性增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述和/或熟習該項技術者已知的方法所測定的。在某些實施方式中，相對於在 不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的OX40(例如，人類OX40)活性，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將OX40(例如，人類OX40)活性增加了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由在此描述和/或熟習該項技術者已知的方法所測定的。OX40(例如，人類OX40)活性的非限制性實例可以包括OX40(例如，人類OX40)傳訊、細胞增殖、細胞存活、以及細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)。在某些實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體誘導、增強、或增加OX40(例如，人類OX40)活性。在具體實施方式中，如以下實例中所述測定OX40活性的增加。
在某些方面中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體誘導、增強、或增加表現OX40並且響應於OX40傳訊的細胞的細胞增殖(例如，響應於OX40刺激和OX40傳訊而增殖的細胞(如T細胞))。細胞增殖測定如本領域中所述(例如，3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、BrdU摻入法或CFSE法，如在實例2中所述)，並且可以由熟習該項技術者容易地實施。在具體實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙 酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有增加的細胞增殖。
在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的OX40(例如，人類OX40)活性刺激，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將細胞增殖(例如，T細胞(如CD4和CD8效應T細胞))增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、BrdU摻入法或CFSE法，如以下實例2中所述)所測定的。在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的OX40(例如，人類OX40)活性，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將細胞增殖(例如，T細胞(如 CD4和CD8效應T細胞))增加了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、BrdU摻入法或CFSE法，如以下實例2中所述)所測定的。在具體實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如0.2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在具體實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中CD4+ T細胞增殖係在例如2μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如 37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在具體實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在具體實施方式中，免疫特異性結合OX40 (例如，人類OX40)的在此描述的抗體增加CD4+ T細胞增殖，其中當抗OX40抗體濃度在例如2μg/ml和20μg/ml之間時，CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及(c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。在具體實施方式中，當抗體以20μg/ml的濃度相比於以2μg/ml的濃度存在時，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體導致CD4+ T細胞增殖的更大增加，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在例如37℃下用例如10μM羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)對例如富集的CD4+ T細胞進行標記持續例如7分鐘；(b)在充分洗滌之後，用例如3μg/ml的例如板結合的抗CD3抗體和不同濃度(例如，0.002、0.02、0.2、2、和20μg/ml)的例如在此描述的其板結合的抗體、在例如37℃以及5% CO2的情況下刺激該等細胞(例如，在孔中105個細胞)；以及 (c)在例如第4天，用例如抗CD4抗體進行細胞染色並且借助流動式細胞測量術藉由例如測量CFSE低CD4+細胞的百分比來檢查CD4+ T細胞增殖。
在一些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原刺激的T細胞，用促T細胞分裂原(例如，抗CD3抗體或佛波酯)刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的細胞增殖，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、BrdU摻入法或CFSE法，如以下實例2中所述)所測定的。在一些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有增加了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的細胞增殖，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、BrdU摻入法或CFSE法，如以下實例2中所述)所測定的。在一個具體實施方式中，如以下實例2中所述對細胞增殖進行測定。在具體實施方式中，5μg/ml在此描述的OX40抗體將用3μg/ml抗CD3抗體處理的人類CD4T細胞的增殖增加了至少20%。在具體實施方式中，5μg/ml在此描述的OX40抗體將用3μg/ml抗CD3抗體處理的人類CD4 T細胞的增殖增加了至少30%。在具體實施方式中，5μg/ml在此描述的OX40抗體將用3μg/ml抗CD3抗體處理的人類CD4 T細胞的增殖增加了至少40%。在具體實施方式中，5μg/ml在此描述的OX40抗體將用3μg/ml抗CD3抗體處理的人類CD4T細胞的增殖增加了至少50%。
在某些方面中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體增加細胞(例如，T細胞(如CD4和CD8效應T細胞))的存活。在一個具體實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的 存在下，具有增加的存活。細胞存活測定如本領域中所述(例如，台盼藍排除測定法)並且可以由熟習該項技術者容易地實施。
在具體實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將細胞存活(例如，T細胞(如CD4和CD8效應T細胞))增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，台盼藍排除測定法)，在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下所測定的。在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的OX40(例如，人類OX40)活性，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將細胞存活(例如，T細胞(如CD4和CD8效應T細胞))增加了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，台盼藍排除測定法)所測定的。
在一些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素 (PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細胞分裂原(例如，抗CD3抗體或佛波酯)刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的細胞存活，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，台盼藍排除測定法)所測定的。在一些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有增加了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的細胞存活，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，台盼藍排除測定法)所測定的。
在某些實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體防止效應T細胞 (例如，CD4+和CD8+效應T細胞)遭受啟動誘導的細胞死亡。
在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下、在有或無OX40(例如，人類OX40)刺激存在下的細胞介素產生，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)誘導、增強、或增加了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由在此描述(參見以下實例，如實例2)或熟習該項技術者已知的方法所測定的。在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下、在有或無OX40(例如，人類OX40)刺激存在下的細胞介素產生，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)誘導或增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述(參見以下實例，如實例2)或熟習該項技術者已知的方法所測定的。
在某些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有增加了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，ELISA測定或如以下實例中所述)所測定的。在一些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有增加 了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，ELISA測定或如以下實例中所述)所測定的。
在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的IL-2產生，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將響應於葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激的IL-2產生增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述(參見以下實例，如實例2)或熟習該項技術者已知的方法所測定的。
在某些實施方式中，相對於僅用SEA刺激的T細胞，用葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激進行刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+ T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50 倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的IL-2產生，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，ELISA測定或如以下實例中所述)所測定的。
在具體實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。在某些實施方式中，由抗體與SEA相結合誘導的IL-2產生係在例如0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數。在另一個實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中IL-2的產生係在例如0.032μg/ml和20μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度 下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在某些實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中IL-2的產生係在例如0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間的抗體濃度的基本上遞增性的函數，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在具體實施方式中，當抗體以20μg/ml的濃度相比於以0.032μg/ml的濃度存在時，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體響應於葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)導致更多的IL-2產生。在一個具體實施方式中，當抗體以20μg/ml的濃度相比於 以0.16μg/ml的濃度存在時，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體響應於葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)導致更多的IL-2產生。
在具體實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)相組合地，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后誘導例如PBMC中IL-2的產生，如藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))所測量，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml之間時，IL-2的產生顯示S形劑量響應曲線。在某些實施方式中，當抗OX40抗體濃度在例如0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，由抗體與SEA相組合誘導的IL-2產生顯示S形劑量響應曲線。在另一個實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.032μg/ml和20μg/ml之間時，IL-2產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如， 20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在某些實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體，與葡萄球菌腸毒素A(SEA)相組合地，誘導例如PBMC中IL-2的產生，其中當抗OX40抗體濃度在例如0.16μg/ml和20μg/ml、0.8μg/ml和20μg/ml、4μg/ml和20μg/ml、0.032μg/ml和4μg/ml、0.16μg/ml和4μg/ml、或0.8μg/ml和4μg/ml之間時，IL-2產生顯示S形劑量響應曲線，如在例如包括以下步驟的測定中評估：(a)在不存在或存在不同濃度的該抗體(例如，20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、和0.000256μg/ml)和例如100ng/ml的SEA下、在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下培養該等PBMC(例如，在孔中105個細胞)持續例如5天；以及(b)收集澄清上清液並且藉由例如電化學發光(例如，人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司))測量IL-2的滴度。在具體實施方式中，當抗體以20μg/ml的濃度相比於以0.032μg/ml的濃度存在時，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體響應於 葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)導致更多的IL-2產生。在一個具體實施方式中，當抗體以20μg/ml的濃度相比於以0.16μg/ml的濃度存在時，當在例如37℃、5% CO2、以及97%濕度下刺激持續例如5天后，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體響應於葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如，100ng/ml)導致更多的IL-2產生。
在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的IL-10產生，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體將響應於葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激的IL-10產生降低了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%，如藉由在此描述(參見以下實例，如實例2)或熟習該項技術者已知的方法所測定的。
在某些實施方式中，相對於僅用SEA刺激的T細胞，用葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激進行刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+ T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的存在下，具有降低了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%的IL-10產生，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，ELISA測定或如以下實例中所述)所測定的。
在具體實施方式中，當結合至活化的調節性T 細胞時、免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體結合至選自由CD16、CD32A及CD64所組成的組的活化Fcγ受體的程度大於(例如，1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍)當結合至活化的效應T細胞時、抗體結合至選自由CD16、CD32A及CD64所組成的組的活化Fcγ受體的程度，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，Fcγ受體IIIA(CD16)報告測定或如以下實例中所述)所測定的。在具體實施方式中，活化Fcγ受體在選自下組的細胞上表現，該組由以下各項組成：髓源性效應細胞以及淋巴細胞源性效應細胞。在一個具體實施方式中，活化Fcγ受體係CD16。
在具體實施方式中，當結合至活化的調節性T細胞時、免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體引起選自由CD16、CD32A及CD64所組成的組的活化Fcγ受體的活化更強於當結合至活化的效應T細胞時、抗體引起選自由CD16、CD32A及CD64所組成的組的活化Fcγ受體的活化。在具體實施方式中，當免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體結合至活化的調節性T細胞時、活化Fcγ受體的活化更強於當免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體結合至活化的效應T細胞時、活化Fcγ受體的活 化至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，Fcγ受體IIIA(CD16)報告測定或如以下實例中所述)所測定的。在具體實施方式中，活化Fcγ受體在選自下組的細胞上表現，該組由以下各項組成：髓源性效應細胞以及淋巴細胞源性效應細胞。在一個具體實施方式中，活化Fcγ受體係CD16。
在一個具體方面，在此提供了免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的拮抗劑抗體。
OX40傳訊的活化取決於受體聚簇，以形成更高有序的受體複合物，該受體複合物有效募集頂上銜接蛋白以驅動細胞內信號轉導。不拘於理論，抗OX40激動劑抗體可經由雙價抗體臂(即，兩個各自結合OX40抗原的抗體臂)和/或經由共接合到輔助骨髓或淋巴樣細胞上的Fc-Fc受體(FcR)來介導受體聚簇。因此，一種用於開發抗OX40拮抗劑抗體的途徑係選擇與OX40配位基(OX40L)競爭結合OX40的抗體，減弱或消除抗體的Fc區與Fc受體的結合，和/或採用單價抗體形式。單價抗體形式可以包括結構上單價的抗體，例如但不限於，僅包括一個抗原結合域(例如，僅一個Fab臂)的抗OX40抗體、或僅包括一個結合OX40(例如，人類OX40)的與重鏈配對或與重鏈的片段配對(例如，Fc片段)的抗原結 合域的抗體。單價抗體形式還可以包括功能上單價的抗體，例如，僅包括一個結合OX40(例如，人類OX40)的與不結合由人類免疫細胞表現的抗原的第二抗原結合域配對的抗原結合域的抗體(即，該抗體包括兩個抗原結合域，但只有一個抗原結合域結合OX40)。
以上討論的IgG恒定域Fc區的突變的實例可降低Fc受體結合或可去除潛在糖基化位點。在某些實施方式中，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的重鏈恒定區包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、C127S、S228P、以及其組合。在某些實施方式中，突變係N297A、N297Q、D265A、或其組合。在某些實施方式中，突變係C127S。在某些實施方式中，突變係S228P。在一個實施方式中，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的重鏈恒定區包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。在某些實施方式中，重鏈恒定區選自由以下各項組成之群組：免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2。在某些實施方式中，免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。包含突變(例如，取代)的人類免疫球蛋白在此也被稱為人類免疫球蛋白。在一個具體方面，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括免疫球蛋白IgG1重鏈恒定區，其中IgG1重鏈恒定區的胺基酸序列包括選自下組的突變，該組由以下各項組成： N297A、N297Q、D265A、或其組合。在一個方面，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括免疫球蛋白IgG1重鏈恒定區，其中IgG1重鏈恒定區的胺基酸序列包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。在一個具體方面，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括免疫球蛋白IgG2重鏈恒定區，其中IgG2重鏈恒定區的胺基酸序列包括C127S突變。在一個具體方面，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括免疫球蛋白IgG4重鏈恒定區，其中IgG4重鏈恒定區的胺基酸序列包括S228P突變。在某些實施方式中，抗體係拮抗性的。
在一個具體方面，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體選自由以下各項組成之群組：Fab、Fab’、F(ab’)2、以及scFv片段，其中Fab、Fab’、F(ab’)2、或scFv片段包括如在此描述的抗OX40抗原結合域或抗體的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列。可以藉由熟習該項技術者已知的任何技術(包括但不限於，以下章節5.3中所討論的那些)生產Fab、Fab’、F(ab’)2、或scFv片段。在某些實施方式中，Fab、Fab’、F(ab’)2、或scFv片段進一步包括延長抗體在體內半衰期的部分。該部分也被稱為“半衰期延長部分”。可以使用任何熟習該項技術者已知用於延長Fab、Fab’、F(ab’)2、或scFv片段在體內半衰期的部分。例如，半衰 期延長部分可以包括Fc區、聚合物、白蛋白、或白蛋白結合蛋白或化合物。聚合物可以包括天然或合成的、視情況取代的直鏈或支鏈聚伸烷基、聚伸烯基、聚氧化烯基、聚糖、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、甲氧基聚乙二醇、乳糖、直鏈澱粉、右旋糖酐、糖原、或其衍生物。取代基可以包括一個或多個羥基、甲基、或甲氧基。在某些實施方式中，可以藉由添加一個或多個用於附接半衰期延長部分的C端胺基酸來修飾Fab、Fab’、F(ab’)2、或scFv片段。在某些實施方式中，半衰期延長部分係聚乙二醇或人血清清蛋白。在某些實施方式中，Fab、Fab’、F(ab’)2、或scFv片段融合到Fc區上。在某些實施方式中，抗體係拮抗性的。
在一個具體方面，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括一個重鏈和一個輕鏈(即該抗體不包括任何其他重鏈或輕鏈，並且包括單個重鏈-輕鏈對、基本上由其組成、或由其組成)，其中重鏈和輕鏈分別包括如在此描述的抗OX40抗原結合域或抗體的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列。在某些實施方式中，重鏈包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、C127S、S228P、以及其組合。在某些實施方式中，突變係N297A、N297Q、D265A、或其組合。在某些實施方式中，突變係C127S。在某些實施方式中，突變係S228P。在某些實施方式中，重鏈包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組 合。在某些實施方式中，重鏈選自由以下各項組成之群組：免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2。在某些實施方式中，免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。在某些實施方式中，重鏈係IgG1重鏈，其包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、或其組合。在某些實施方式中，重鏈係IgG2重鏈，其包括C127S突變。在某些實施方式中，重鏈係IgG4重鏈，其包括S228P突變。在某些實施方式中，重鏈係IgG1重鏈，其包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。在某些實施方式中，抗體係拮抗性的。
在一個具體方面，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：第一抗原結合域，其結合OX40，如在此描述的；以及第二抗原結合域，其不會特異性結合由人類免疫細胞表現的抗原(即第二抗原結合域不會結合OX40或任何其他由人類免疫細胞表現的抗原)，如在此描述的。在某些實施方式中，第一和第二抗原結合域包括互補CH3結構域。例如，互補CH3結構域允許異二聚體化優先發生在第一抗原結合域的重鏈和第二抗原結合域的重鏈之間，而不是各自抗原結合域的同二聚體化。可以使用熟習該項技術者已知的任何技術(包括但不限於，如在裡奇韋(Ridgway)JBB等人，(1996)蛋白質工程(Protein Eng)9(7)：617-621以及麥錢特(Merchant)M等人中描述的突出入洞(knob-into- hole)技術)來生產互補CH3結構域。例如，突出物入洞(knob-into-hole)技術將第一CH3結構域中的小胺基酸用較大胺基酸(即“突出”)替代並且將第二CH3結構域中的大胺基酸用較小胺基酸(即“洞”)替代。然後可以基於突出物和洞的相互作用，使包括CH3結構域的多肽二聚化。在某些實施方式中，抗原結合域中的一個包括第一IgG1 CH3結構域，其包括選自下組的取代，該組由以下各項組成：T366Y以及T366W，並且另一個抗原結合域包括第二IgG1 CH3結構域，其包括選自下組的取代，該組由以下各項組成：Y407T、T366S、L368A、以及Y407V。在某些實施方式中，第二抗原結合域所結合的抗原不是由人類免疫細胞天然表現的。在某些實施方式中，免疫細胞選自由以下各項組成之群組：T細胞(CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)、B細胞、自然殺傷細胞、樹突細胞、巨噬細胞、以及嗜酸性粒細胞。在某些實施方式中，特異性結合OX40的抗原結合域包括第一VH和第一VL，並且第二抗原結合域包括第二VH和第二VL。在某些實施方式中，特異性結合OX40的抗原結合域包括第一重鏈和第一輕鏈，並且第二抗原結合域包括第二重鏈和第二輕鏈。在某些實施方式中，抗體用於給予至樣本或受試者，其中第二抗原結合域係非反應性的(即第二抗原結合域所結合的抗原不存在於樣本或受試者中)。在某些實施方式中，第二抗原結合域不會特異性結合表現OX40的細胞上的抗原(例如，第二抗原結合域不會結合由表現 OX40的細胞天然表現的抗原)。在某些實施方式中，抗體在樣本或受試者中起到單價抗體(即抗OX40單價抗體)的作用，其中抗體的第一抗原結合域結合OX40，而第二抗原結合域在樣本或受試者中是非反應性的(例如，由於在樣本或受試者中不存在第二抗原結合域所結合的抗原)。在某些實施方式中，第二抗原結合域特異性結合非人類抗原(即在其他生物而非人類中表現的抗原)。在某些實施方式中，第二抗原結合域特異性結合病毒抗原。在某些實施方式中，病毒抗原來自不感染人類的病毒(即非人類病毒)。在某些實施方式中，病毒抗原不存在於人類免疫細胞中(例如，人類免疫細胞不受與病毒抗原相關的病毒感染)。在某些實施方式中，病毒抗原係HIV抗原。在某些實施方式中，第二抗原結合域特異性結合雞白蛋白或雞卵溶菌酶。在某些實施方式中，第二抗原結合域特異性結合不是由(即不存在於)野生型細胞(例如，野生型人類細胞)表現的抗原。在某些實施方式中，第二抗原結合域特異性結合不是由(即不存在於)正常細胞(例如，野生型細胞(例如，野生型人類細胞))表現的腫瘤相關抗原。在某些實施方式中，腫瘤相關抗原不是由(即不存在於)人類細胞表現的。在某些實施方式中，第二抗原結合域的重鏈恒定區包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、C127S、S228P、以及其組合。在某些實施方式中，突變係N297A、N297Q、D265A、或其組合。在某些實施方式中，突變係C127S。 在某些實施方式中，突變係S228P。在某些實施方式中，第二抗原結合域的重鏈恒定區包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。在某些實施方式中，第一和第二抗原結合域的重鏈恒定區選自由以下各項組成之群組：免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2。在某些實施方式中，免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。在某些實施方式中，第一和第二抗原結合域的重鏈恒定區係同種型的。在某些實施方式中，第一抗原結合域包括第一IgG1重鏈恒定區並且第二抗原結合域包括第二IgG1重鏈恒定區，其中第一和第二重鏈恒定區包括選自下組的相同的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、或其組合。在某些實施方式中，第一抗原結合域包括第一IgG1重鏈恒定區並且第二抗原結合域包括第二IgG1重鏈恒定區，其中第一和第二重鏈恒定區包括選自下組的相同的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、或其組合。在某些實施方式中，第一抗原結合域包括第一IgG2重鏈恒定區並且第二抗原結合域包括第二IgG2重鏈恒定區，其中第一和第二重鏈恒定區包括C127S突變。在某些實施方式中，第一抗原結合域包括第一IgG4重鏈恒定區並且第二抗原結合域包括第二IgG4重鏈恒定區，其中第一和第二重鏈恒定區包括S228P突變。在某些實施方式中，抗體係拮抗性的。
在一個具體方面，如在此描述的免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體包括：特異性結合 OX40的第一抗原結合域，其包括第一重鏈和第一輕鏈；以及第二重鏈或其片段。在某些實施方式中，第一和第二重鏈、或第二重鏈的片段包括互補CH3結構域。例如，互補CH3結構域允許異二聚體化優先發生在重鏈之間，而不是各自重鏈的同二聚體化。在某些實施方式中，重鏈中的一個包括第一IgG1 CH3結構域，其包括選自下組的取代，該組由以下各項組成：T366Y以及T366W，並且另一個重鏈包括第二IgG1 CH3結構域，其包括選自下組的取代，該組由以下各項組成：Y407T、T366S、L368A、Y407V。在一些實施方式中，第二重鏈的片段係Fc片段。在某些實施方式中，第二重鏈或其片段來自特異性結合非人類抗原(即在其他生物而非人類中表現的抗原)的抗原結合域。在某些實施方式中，第二重鏈或其片段來自特異性結合病毒抗原的抗原結合域。在某些實施方式中，病毒抗原不存在於人類免疫細胞中(例如，人類免疫細胞不受與病毒抗原相關的病毒感染)。在某些實施方式中，病毒抗原係HIV抗原。在某些實施方式中，第二重鏈或其片段來自特異性結合雞白蛋白或雞卵溶菌酶的抗原結合域。在某些實施方式中，第二重鏈或其片段來自特異性結合不是由(即不存在於)野生型細胞(例如，野生型人類細胞)表現的抗原的抗原結合域。在某些實施方式中，第二重鏈或其片段來自特異性結合不是由(即不存在於)正常細胞(例如，野生型細胞(例如，野生型人類細胞))表現的腫瘤相關抗原的抗原結合域。在某些實施方式中， 腫瘤相關抗原不是由(即不存在於)人類細胞表現的。在某些實施方式中，第二重鏈或其片段包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、C127S、S228P、以及其組合。在某些實施方式中，突變係N297A、N297Q、D265A、或其組合。在某些實施方式中，突變係C127S。在某些實施方式中，突變係S228P。在某些實施方式中，第二重鏈或其片段包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、以及其組合。在某些實施方式中，第一和第二重鏈恒定區選自由以下各項組成之群組：免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2。在某些實施方式中，免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。在某些實施方式中，第一和第二重鏈恒定區係同種型的。在某些實施方式中，第一和第二重鏈恒定區係IgG1恒定區，並且包括選自下組的相同的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A、或其組合。在某些實施方式中，第一和第二重鏈恒定區係IgG1恒定區，並且包括選自下組的相同的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A、或其組合。在某些實施方式中，第一和第二重鏈恒定區係IgG2重鏈恒定區，並且包括C127S突變。在某些實施方式中，第一和第二重鏈恒定區係IgG4重鏈恒定區，並且包括S228P突變。在某些實施方式中，抗體係拮抗性的。
在上述針對包括特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域以及第二抗原結合域或第二重鏈 或其片段的抗體的方面中，抗原結合域可以包括在此描述的抗OX40序列中或任一種。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：(a)包括VH互補決定區(CDR)1的第一重鏈可變域(VH)，該VH CDR1包括GSAMH(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列；VH CDR2，其包括RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列；以及VH-CDR3，其包括GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列；以及(b)包括VL-CDR1的第一輕鏈可變域(VL)，其包括RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列；VL-CDR2，其包括LGSNRAS(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列；以及VL-CDR3，其包括MQALQTPLT(SEQ ID NO：3)的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域與以下抗體特異性結合OX40(例如，人類OX40)的相同表位，該抗體包括：VH，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列，以及VL，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在某些實施方式中，與結合SEQ ID NO：55的人類OX40序列相比，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域展示出與SEQ ID NO：55相同的蛋白質(除了存在選自下組的胺基酸突變，該組由以下各項組成：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A、以及其組合)降低的結合或不結合。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括VH和VL，其中VH包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括VH和VL，其中VL包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在某些實施方式中，結合OX40的抗原結合域包括：VH，其包括與SEQ ID NO：16的胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%一致的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：VH，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在某些實施方式中，結合OX40的抗原結合域包括：VH，其包括衍生自人類IGHV3-73種系序列(例如，IGHV3-73*01(例如，具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列))的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：VL，其包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%一致的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：VL-CDR3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：3。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：VL，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：輕鏈，其包括SEQ ID NO：50的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類 OX40)的抗原結合域包括：VL，其包括衍生自人類IGKV2-28種系序列(例如，IGKV2-28*01(例如，具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列))的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括分別在SEQ ID NO：16和15中列出的VH和VL序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：21的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括：重鏈，其包括SEQ ID NO：60的胺基酸序列。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：N297A、N297Q、D265A突變、或其組合。在某些實施方式中，特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗原結合域包括選自下組的突變，該組由以下各項組成：D265A、P329A以及其組合。
在某些實施方式中，在此描述的拮抗性抗體與OX40(例如，人類OX40)拮抗。在某些實施方式中，抗體滅活、降低或抑制OX40(例如，人類OX40)的活性。在某些實施方式中，抗體抑制或減少OX40(例如，人類OX40)與OX40配位基(例如，人類OX40配位基)的結合。在某些實施方式中，抗體抑制或減少OX40(例如，人類OX40)傳訊。在某些實施方式中，抗體抑制或減少由OX40配位基(例如，人類OX40配位基)誘 導的OX40(例如，人類OX40)活性(例如，OX40傳訊)。在某些實施方式中，在此描述的拮抗性抗體抑制或減少T細胞增殖。在某些實施方式中，在此描述的拮抗性抗體抑制或減少T細胞增殖。在某些實施方式中，在此描述的拮抗性抗體抑制或減少細胞介素的產生(例如，藉由刺激的T細胞抑制或減少IL-2、TNFα、IFNγ、IL-4、IL-10、IL-13、或其組合的產生)。在某些實施方式中，在此描述的拮抗性抗體藉由SEA刺激的T細胞抑制或減少IL-2的產生。在某些實施方式中，在此描述的拮抗性抗體阻斷OX40與OX40L的相互作用(例如，阻斷OX40L與OX40彼此的結合(例如，阻斷人類OX40配位基與人類OX40的結合))。
在某些實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的OX40(例如，人類OX40)活性，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體將OX40(例如，人類OX40)活性降低了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述和/或熟習該項技術者已知的方法所測定的。在某些實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的OX40(例如，人類 OX40)活性，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體將OX40(例如，人類OX40)活性降低了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由在此描述和/或熟習該項技術者已知的方法所測定的。OX40(例如，人類OX40)活性的非限制性實例可以包括OX40(例如，人類OX40)傳訊、細胞增殖、細胞存活、以及細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)。在某些實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體抑制、減少、或滅活OX40(例如，人類OX40)活性。在具體實施方式中，如以下實例中所述測定OX40活性。
在某些方面中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體抑制、減少、或滅活表現OX40並且響應於OX40傳訊的細胞的細胞增殖(例如，響應於OX40刺激和OX40傳訊而增殖的細胞(如T細胞))。細胞增殖測定如本領域中所述(例如，3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、BrdU摻入法或CFSE法，如在以下實例中所述)，並且可以由熟習該項技術者容易地實施。在具體實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細 胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體的存在下，具有降低的細胞增殖。
在某些方面中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體降低細胞(例如，T細胞(如CD4和CD8效應T細胞))的存活。在一個具體實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體的存在下，具有降低的存活。細胞存活測定如本領域中所述(例如，台盼藍排除測定法)並且可以由熟習該項技術者容易地實施。
在具體實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體將細胞存活(例如，T細胞(如CD4和CD8效應T細胞))降低了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、 70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，台盼藍排除測定法)，在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下所測定的。在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下的OX40(例如，人類OX40)活性，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體將細胞存活(例如，T細胞(如CD4和CD8效應T細胞))降低了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，台盼藍排除測定法)所測定的。
在一些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細胞分裂原(例如，抗CD3抗體或佛波酯)刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體的存在下，具有降低了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍 的細胞存活，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，台盼藍排除測定法)所測定的。在一些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體的存在下，具有降低了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的細胞存活，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，台盼藍排除測定法)所測定的。
在某些實施方式中，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體無法防止效應T細胞(例如，CD4+和CD8+效應T細胞)遭受啟動誘導的細胞死亡。
在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下、在有或無OX40(例如，人類OX40)刺激存在下的細胞介素產生，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體將細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)抑制、減少、或滅活了至少約5%、10%、15%、 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由在此描述(參見以下實例)或熟習該項技術者已知的方法所測定的。在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40的抗體)的情況下、在有或無OX40(例如，人類OX40)刺激存在下的細胞介素產生，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體將細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)抑制或減少了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述(參見以下實例，如實例2)或熟習該項技術者已知的方法所測定的。
在某些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性 抗體的存在下，具有降低了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，ELISA測定或如以下實例中所述)所測定的。在一些實施方式中，相對於僅用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞，用促T細胞分裂原或T細胞受體複合物刺激劑(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體))刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+效應T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體的存在下，具有降低了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13)，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，ELISA測定或如以下實例中所述)所測定的。
在具體實施方式中，相對於在不存在任何抗體或存在不相關抗體(例如，不會免疫特異性結合OX40 的抗體)的情況下的IL-2產生，免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體將響應於葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激的IL-2產生降低了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由在此描述(參見以下實例，如實例2)或熟習該項技術者已知的方法所測定的。
在某些實施方式中，相對於僅用SEA刺激的T細胞，用葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激進行刺激的T細胞(例如，CD4+或CD8+ T細胞)在免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的拮抗性抗體的存在下，具有降低了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的IL-2產生，如藉由在此描述或熟習該項技術者已知的方法(例如，ELISA測定或如以下實例中所述)所測定的。
可以將抗OX40抗體融合或綴合(例如，共價地或非共價地連接)到可檢測標籤或物質上。可檢測標籤或物質的實例包括酶標籤(如，葡萄糖氧化酶)；放射性同位素(如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(121In)及鍀(99Tc))；發光標籤(如魯米諾)；以及螢光標籤(如螢光素及羅丹明及生物素)。可 以將此類標記抗體用於檢測OX40(例如，人類OX40)蛋白。參見，例如，以下章節5.5.2。
5.3 抗體產生
免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體可藉由本領域已知的任何合成抗體的方法產生，例如，藉由化學合成或藉由重組表現技術。在此描述的方法採用，除非另有指明，分子生物學、微生物學、遺傳分析、重組DNA、有機化學、生物化學、PCR、寡核苷酸合成及修飾、核酸雜交及技術領域中相關領域的常規技術。該等技術描述於，例如，在此引用的參考文獻中並且在文獻中已有充分解釋。參見例如，馬尼亞蒂斯(Maniatis)T等人，(1982)分子殖株：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；薩姆布魯克(Sambrook)J等人，(1989)，分子殖株：實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社；薩姆布魯克J等人，(2001)，分子殖株：實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY；奧蘇貝爾FM等人，當代分子生物學實驗手冊，約翰&威利父子公司(1987以及每年更新)；當代免疫學實驗手冊(Current Protocols in Immunology)，約翰&威利父子公司(1987以及每年更新)蓋特(Gait)(編輯)(1984)寡核苷酸合成：實用方法(Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach)，IRL出版社；埃克斯 坦(Eckstein)(編輯)(1991)寡核苷酸及類似物：實用方法(Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach)，IRL出版社；比倫(Birren)B等人，(編輯)(1999)基因組分析：實驗室手冊(Genome Analysis：A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社。
在一個具體實施方式中，在此描述的抗體係藉由任何涉及創造的手段(例如，經由DNA序列的合成、基因工程)而製備、表現、創造或分離的抗體(例如，重組抗體)。在某些實施方式中，此類抗體包括並非天然存在於動物或哺乳動物(例如，人類)體內的抗體種系譜中的序列(例如，DNA序列或胺基酸序列)。
在某一方面中，在此提供了製造免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的方法，該方法包括培養在此描述的細胞或宿主細胞。在某一方面中，在此提供了製造免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的方法，該方法包括使用在此描述的細胞或宿主細胞(例如，細胞或宿主細胞，其包括編碼在此描述的的抗體的多核苷酸)表現(例如，重組表現)該抗體。在一個具體實施方式中，細胞係分離的細胞。在一個具體實施方式中，已經將外源多核苷酸引入至細胞中。在一個具體實施方式中，該方法進一步包括純化從細胞或宿主細胞中獲得的抗體的步驟。
用於產生多株抗體的方法在本領域係已知的(參見，例如精編分子生物學實驗指南(Short Protocols in Molecular Biology)，(2002)第5次編輯，奧蘇貝爾FM等人，編輯，約翰&威利父子公司，紐約中的第11章)。
可使用本領域中已知的各種技術來製備單株抗體，包括使用融合瘤、重組體及噬菌體展示技術或其組合。例如，可使用融合瘤技術產生單株抗體，包括本領域中已知以及所教導的技術，例如，在哈洛(Harlow)E和拉內(Lane)D，抗體：實驗室手冊(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社，第2版，1988)；哈姆林(Hammerling)GJ等人，在單株抗體及T細胞融合瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)563 681(愛思唯爾(Elsevier)，N.Y.，1981)中。如在此所使用的，術語“單株抗體”不限於由融合瘤技術產生的抗體。例如，可由外源表現在此描述的抗體的宿主細胞重組產生單株抗體。
在具體實施方式中，如在此所使用的“單株抗體”係由單個細胞(例如，生產重組抗體的融合瘤或宿主細胞)所產生的抗體，其中藉由例如ELISA或本領域已知或在此提供的實施方式中的其他抗原-結合或競爭性結合分析，來確定抗體免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)。在具體實施方式中，單株抗體可以是嵌合抗體或人源化抗體。在某些實施方式中，單株抗體係單價抗體或多價(例如，雙價)抗體。在某些實施方式中，單株抗體可以是Fab片段或F(ab’)2片段。可例如，藉由如科勒 (Kohler)G和米爾斯坦(Milstein)C(1975)自然(Nature)256：495中所描述的融合瘤方法製造或可例如使用例如如在此描述的技術從噬菌體文庫分離在此描述的單株抗體。其他用於製備殖株細胞系以及由其表現的單株抗體的方法係本領域中所熟知的(參見，例如，上述精編分子生物學實驗指南，(2002)第5次編輯，奧蘇貝爾FM等人中的第11章)。
使用融合瘤技術用於產生以及篩選特異性抗體的方法在本領域中是常規的並且是眾所周知的。例如，在融合瘤方法中，小鼠或其他適當的宿主動物(如綿羊、山羊、兔、大鼠、倉鼠或獼猴)經過免疫以引發產生或能夠產生將特異性結合用於免疫的蛋白質(例如，OX40(例如，人類OX40))的抗體的淋巴細胞。可替代地，體外可使淋巴細胞免疫。然後，使用適當的熔劑(如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞(戈丁(Goding)JW(編輯)，單株抗體：原理與實踐(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103頁(學術出版社(Academic Press)，1986))。此外，可使用RIMMS(多位點重複免疫)技術免疫動物(基爾派翠克(Kilpatrick)KE等人，(1997)融合瘤(Hybridoma)16：381-9，藉由引用以其全文結合)。
在一些實施方式中，可以用抗原(例如，OX40(例如，人類OX40))免疫小鼠(或其他動物，(如大鼠、猴、驢、豬、綿羊、倉鼠或狗))，並且一旦 檢測到免疫應答，例如，在小鼠血清中檢測到特異性針對抗原的抗體，收集小鼠脾臟並且分離脾細胞。然後，藉由熟知的技術將脾細胞融合至任何適當的骨髓瘤細胞，例如來自細胞系SP20(可以獲得自美國種質保存中心(ATCC®)(馬納薩斯(Manassas)，VA))的細胞，以形成融合瘤。藉由有限的稀釋選擇並選殖融合瘤。在某些實施方式中，收集經免疫小鼠的淋巴結並且與NS0骨髓瘤細胞融合。
因而，將所製備的融合瘤細胞接種並生長在適當的培養基中，其較佳的是包含一或多種能夠抑制未融合的親代骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如，若親代骨髓瘤細胞缺少酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，融合瘤的培養基典型地將包括次黃嘌呤、胺喋呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止HGPRT缺陷型細胞的生長。
具體實施方式採用有效融合、支持藉由所選的生產抗體的細胞穩定高-水平產生抗體，並且對培養基(如HAT培養基)敏感的骨髓瘤細胞。在該等之中，骨髓瘤細胞系係鼠科骨髓瘤株系，如NS0細胞系或衍生自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤的細胞系，其可以獲得自美國加利福尼亞州(CA)聖地牙哥(San Diego)索爾克研究所細胞分佈中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，以及SP-2或X63-Ag8.653細胞，其可以獲得自美國馬里蘭州(MD)羅克維爾市(Rockville)美國種 質保存中心。還描述了人類骨髓瘤及小鼠-人類雜合骨髓瘤細胞系用於產生人類單株抗體(科茲波爾(Kozbor)D(1984)免疫學雜誌133：3001-5；布羅迪(Brodeur)等人，單株抗體生產技術及應用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)，第51-63頁(馬塞爾德克爾公司(Marcel Dekker,Inc.)，紐約，1987))。
為了產生針對OX40(例如，人類OX40)的單株抗體，對融合瘤細胞生長於其中的培養基進行分析。藉由本領域中已知的方法確定由融合瘤細胞所產生的單株抗體的結合特異性，例如，免疫沈澱法或藉由體外結合鑒定法，如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。
在鑒定出產生具有所希望特異性、親和性和/或活性的抗體的融合瘤細胞之後，可藉由有限稀釋流程將殖株進行亞選殖並且藉由標準方法(上述戈丁JW(編輯)，單株抗體：原理與實踐)使其生長。為此目的，適當的培養基包括，例如，D-MEM或RPMI 1640培養基。此外，融合瘤細胞可作為動物中的腹水瘤在體內生長。
藉由常規免疫球蛋白純化程式(例如，蛋白質A-交聯瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析法)適當地將由亞殖株所分泌的單株抗體從培養基、腹水液或血清中分離。
可以藉由熟習該項技術者已知的任何技術產 生在此描述的抗體。例如，可使用酶(如木瓜酵素(以產生Fab片段))或胃蛋白酶(以產生F(ab’)2片段)藉由免疫球蛋白分子的蛋白酶剪切產生在此描述的Fab及F(ab’)2片段。Fab片段對應於四聚體抗體分子的兩個相同臂中的一個並且包含與重鏈的VH及CH1結構域配對的完整輕鏈。F(ab’)2片段包含四聚體抗體分子的兩個藉由鉸鏈區的二硫鍵連接的抗原結合臂。
另外，還可以使用各種本領域已知的噬菌體展示方法來產生在此描述的抗體。在噬菌體展示方法中，蛋白被展示於噬菌體顆粒的表面上，該等噬菌體顆粒攜帶編碼它們的多核苷酸序列。具體地說，將編碼VH和VL結構域的DNA序列從動物cDNA文庫(例如，人類或鼠類的受影響組織cDNA文庫)中進行擴增。藉由PCR將編碼該等VH和VL結構域的DNA與scFv連接物重組在一起，並且選殖至噬粒載體中。將該載體以電穿孔轉至大腸桿菌中，並且用輔助噬菌體對該大腸桿菌進行感染。在該等方法中所使用的噬菌體典型地是包括fd和M13的絲狀噬菌體，並且該等VH和VL結構域通常與噬菌體基因III或基因VIII重組融合。表現與特定抗原結合的抗體的噬菌體可以用抗原(例如，使用標記抗原或被結合或捕獲至固體表面或珠的抗原)來進行選擇或鑒定。可以被用來製備在此描述的抗體的噬菌體展示方法的實例包括在以下項中所揭露的那些：布林克曼(Brinkman)等人，(1995)免疫學方法雜誌(J Immunol Methods)182：41-50；艾姆 斯(Ames)RS等人，(1995)免疫學方法雜誌184：177-186；凱特爾伯勒(Kettleborough)CA等人，(1994)歐洲免疫學雜誌(Eur J Immunol)24：952-958；佩西克(Persic)L等人，(1997)基因(Gene)187：9-18；伯頓(Burton)DR和巴巴斯(Barbas)CF(1994)，免疫學進展(Advan Immunol)57：191-280；PCT申請號PCT/GB 91/001134；國際公開案號WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、以及WO 97/13844；以及美國專利案號5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743、以及5,969,108。
如在以上參考文獻中所說明的，在噬菌體選擇之後，可以對來自該噬菌體的該等抗體編碼區進行分離，並且用來產生抗體(包括人類抗體)，並且在任何所希望的宿主(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母以及細菌(例如，如以下描述的))中進行表現。還可以採用用以重組產生抗體(如Fab、Fab’及F(ab’)2片段)的技術，使用本領域已知的方法，如以下項中所揭露的那些：PCT公開案號WO 92/22324；馬利納克斯(Mullinax)RL等人，(1992)生物技術(BioTechniques)12(6)：864-9；沙懷(Sawai)H等人，(1995)美國生殖免疫學雜誌(Am J Reprod Immunol)34：26-34；以及貝特爾(Better) M等人，(1988)科學(Science)240：1041-1043。
在一個方面，為了產生抗體，包括VH或VL核苷酸序列、限制位點以及保護限制位點的旁側序列的PCR引物可用於擴增來自模版(例如，scFv殖株)的VH或VL序列。利用熟習該項技術者已知的選殖技術，可以將經PCR擴增的VH結構域選殖進表現VH恒定區的載體中，並且可以將經PCR擴增的VL結構域選殖進表現VL恒定區(例如人類κ或λ恒定區)的載體中。還可以將VH和VL結構域選殖進表現必需恒定區的一種載體。然後使用熟習該項技術者已知的技術，將重鏈轉化載體和輕鏈轉化載體共轉染到細胞系中，以產生表現抗體(例如，IgG)的穩定或暫態細胞系。
嵌合抗體係其中抗體的不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗體可包含融合至人抗體恒定區的小鼠或大鼠單株抗體的可變區。用於生產嵌合抗體的方法在本領域中是已知的。參見，例如，莫里森(Morrison)SL(1985)科學229：1202-7；維(Oi)VT和莫里森SL(1986)生物技術4：214-221；吉利斯(Gillies)SD等人，(1989)免疫學方法雜誌125：191-202；以及美國專利案號5,807,715、4,816,567、4,816,397、以及6,331,415。
人源化抗體能夠結合預定的抗原並且包括框架區，其具有實質上人類免疫球蛋白的胺基酸序列，而CDR具有實質上非人類免疫球蛋白(例如，鼠科免疫球蛋 白)的胺基酸序列。在具體實施方式中，人源化抗體還包含免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分，該免疫球蛋白通常是人類免疫球蛋白。抗體還可以包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。人源化抗體可以選自任何類型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE及任何同型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。可以使用本領域中已知的各種技術來產生人源化抗體，包括但不限於，CDR-移植(歐洲專利號EP 239400；國際公開案號WO 91/09967；以及美國專利案號5,225,539、5,530,101、以及5,585,089)，貼面(veneering)或重鋪(resurfacing)(歐洲專利號EP 592106以及EP 519596；帕德蘭(Padlan)EA(1991)分子免疫學(Mol Immunol)28(4/5)：489-498；斯登尼克(Studnicka)GM等人，(1994)蛋白質工程(Prot Engineering)7(6)：805-814；以及羅格斯克(Roguska)MA等人，(1994)美國科學院院報91：969-973)，鏈改組(chain shuffling)(美國專利案號5,565,332)，以及以下項中所揭露的技術：例如，美國專利案號6,407,213、美國專利案號5,766,886、國際公開案號WO 93/17105；譚(Tan)P等人，(2002)免疫學雜誌169：1119-25；卡爾達斯(Caldas)C等人，(2000)蛋白質工程13(5)：353-60；摩裡亞(Morea)V等人，(2000)方法(Methods)20(3)：267-79；巴卡(Baca)M等人，(1997)生物化學雜誌(J Biol Chem)272(16)：10678-84；羅格斯克(Roguska)MA等人，(1996)蛋白 質工程9(10)：895 904；科托(Couto)JR等人，(1995)癌症研究55(增刊23)：5973s-5977s；科托(Couto)JR等人，(1995)癌症研究55(8)：1717-22；桑德胡(Sandhu)JS(1994)基因150(2)：409-10以及佩德森(Pedersen)JT等人，(1994)分子生物學雜誌(J Mol Biol)235(3)：959-73。還參見美國申請公開案號US 2005/0042664 A1(2005年2月24日)，該申請藉由引用以其全部內容結合在此。
可以藉由本領域熟知的方法產生單域抗體(例如，缺少輕鏈的抗體)。參見裡希曼(Riechmann)L和謬德曼斯(Muyldermans)S(1999)免疫學雜誌231：25-38；納托爾(Nuttall)SD等人，(2000)當代藥學生物技術(Curr Pharm Biotechnol)1(3)：253-263；謬德曼斯S，(2001)生物技術雜誌(J Biotechnol)74(4)：277-302；美國專利案號6,005,079；以及國際公開案號WO 94/04678、WO 94/25591以及WO 01/44301。
另外，免疫特異性結合OX40抗原的抗體可以進而被用於產生“模擬”抗原的抗獨特型抗體，這係使用熟習該項技術者所熟知的技術。(參見，例如，格林斯潘(Greenspan)NS和博納(Bona)CA(1989)FASEB雜誌7(5)：437-444；以及尼辛諾夫(Nissinoff)A(1991)免疫學雜誌147(8)：2429-2438)。
在具體實施方式中，與在此描述的抗OX40抗體一樣地結合OX40(例如，人類OX40)的相同表位的在 此描述的抗體係人抗體。在具體實施方式中，競爭性阻斷(例如，以劑量依賴性方式)在此描述的抗體中的任一種(例如，pab1949或pab2044)與OX40(例如，人類OX40)結合的在此描述的抗體係人抗體。可以使用本領域已知的任何方法產生人抗體。例如，可使用不能表現功能性內源免疫球蛋白，但可以表現人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠。具體地說，人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物可隨機或藉由同源重組導入小鼠胚胎幹細胞中。可替代地，除了人類重鏈及輕鏈基因之外，人類可變區、恒定區及多變區還可被導入小鼠胚胎幹細胞中。小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因可分別或在藉由同源重組導入人類免疫球蛋白基因座的同時變得無功能。具體地說，JH區的純合性缺失阻止內源性抗體產生。將經修飾的胚胎幹細胞擴展並且顯微注射進胚泡中，以產生嵌合小鼠。然後，飼養嵌合小鼠，以產生表現人抗體的純合子代。用所選抗原以正常的方式使轉基因小鼠免疫(例如全部或部分抗原(例如，OX40))。可以使用常規融合瘤技術從經免疫的轉基因小鼠中獲得針對抗原的單株抗體。轉基因小鼠所攜帶的人類免疫球蛋白轉基因在B細胞分化期間重排，並且隨後經歷類別轉換及體細胞突變。因此，使用此種技術，可能產生治療有用的IgG、IgA、IgM及IgE抗體。對於用於產生人抗體的此項技術的綜述，參見倫貝格(Lonberg)N和胡薩爾(Huszar)D(1995)免疫學國際評論(Int Rev Immunol)13：65-93。對於用於產生人抗體 及人類單株抗體的此項技術及用於生產此類抗體的程式的詳細討論，參見例如，國際公開案號WO 98/24893、WO 96/34096以及WO 96/33735；以及美國專利案號5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318以及5,939,598。能夠產生人抗體的小鼠的實例包括XenomouseTM(安根尼克斯(Abgenix)公司；美國專利案號6,075,181以及6,150,184)、HuAb-MouseTM(梅達雷克斯公司(Mederex,Inc.)/Gen Pharm；美國專利案號5,545,806以及5,569,825)、Trans Chromo MouseTM(Kirin)以及KM MouseTM(梅達雷克斯公司(Medarex)/Kirin)。
特異性結合OX40(例如，人類OX40)的人抗體可以藉由多種本領域已知的方法製造，包括上述噬菌體展示方法，使用衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體文庫。還參見美國專利案號4,444,887、4,716,111、以及5,885,793；以及國際公開案號WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、以及WO 91/10741。
在一些實施方式中，可使用小鼠-人類融合瘤產生人抗體。例如，用EB病毒(EBV)轉化的人類外周血淋巴細胞可與小鼠骨髓瘤細胞融，以產生分泌人類單株抗體的小鼠-人類融合瘤，並且可以篩選該等小鼠-人類融合瘤，以確定分泌免疫特異性結合靶抗原(例如，OX40(例如，人類OX40))的人類單株抗體的融合瘤。此類 方法係已知的並且在本領域中有描述，參見，例如，新本(Shinmoto)H等人，(2004)細胞工程學(Cytotechnology)46：19-23；那加那瓦(Naganawa)Y等人，(2005)人類抗體(Human Antibodies)14：27-31。
5.3.1 多核苷酸
在某些方面中，在此提供了多核苷酸，其包括編碼免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)抗原的在此描述的抗體或其片段(例如，可變輕鏈區和/或可變重鏈區)的核苷酸序列，以及載體，例如包括此類多核苷酸的載體，用於在宿主細胞(例如，大腸桿菌以及哺乳動物細胞)中重組表現。在此提供了多核苷酸，其包括編碼任一種在此提供的抗體的核苷酸序列，連同載體，其包括此類多核苷酸序列，例如在宿主細胞(例如，哺乳動物細胞)中有效表現它們的表現載體。
如在此所使用的，“分離的”多核苷酸或核酸分子係從存在於核酸分子的天然來源(例如，在小鼠或人類)的其他核酸分子中分離出來的。另外，“分離的”核酸分子(如cDNA分子)可基本上不含其他細胞材料或當藉由重組技術產生時，不含培養基，或當化學合成時基本上不含化學先質或其他化學製劑。例如，語言“基本上不含”包括具有少於約15%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%(特別是少於約10%)的其他材料(例如，細胞材料、培養基、其他核酸分子、化學先質和/或其他化學製劑)的 多核苷酸或核酸分子的製劑。在一個具體實施方式中，將編碼在此描述的抗體的一個或多個核酸分子分離或純化。
在特定方面中，在此提供了多核苷酸，其包括編碼免疫特異性結合OX40多肽(例如，人類OX40)且包括如在此描述的胺基酸序列的抗體的核苷酸序列，連同抗體，其與結合OX40多肽(例如，以劑量依賴性方式)的此類抗體競爭、或與此類抗體結合相同的表位。
在某些方面中，在此提供了多核苷酸，其包括編碼在此描述的抗體輕鏈或重鏈的核苷酸序列。多核苷酸可以包括編碼輕鏈(包括在此描述的抗體的VL FR以及CDR(參見例如表1和3))的核苷酸序列。多核苷酸可以包括編碼重鏈(包括在此描述的抗體的VH FR以及CDR(參見例如表2和4))的核苷酸序列。在具體實施方式中，在此描述的多核苷酸編碼VL結構域，其包括在SEQ ID NO：15中列出的胺基酸序列。在具體實施方式中，在此描述的多核苷酸編碼VH結構域，其包括在SEQ ID NO：16中列出的胺基酸序列。
在具體實施方式中，在此提供了多核苷酸，其包括編碼包括三個VL鏈CDR(例如，包含在此描述的任一種抗體的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如，參見表1))的抗OX40抗體的核苷酸序列。在具體實施方式中，在此提供了多核苷酸，其包括三個VH鏈CDR(例如，包含在此描述的任一種抗體的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(例如，參見表2))。在具體實施方 式中，在此提供了多核苷酸，其包括編碼抗OX40抗體的核苷酸序列，該抗體包括三個VH鏈CDR(例如，包含在此描述的任一種抗體的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如，參見表1))以及三個VH鏈CDR(例如，包含在此描述的任一種抗體的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(例如，參見表2))。
在具體實施方式中，在此提供了多核苷酸，其包括編碼抗OX40抗體或其片段的核苷酸序列，該抗體或其片段包括VL結構域，例如包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，包括在此描述的胺基酸序列(例如參見表1和3，例如在表中按名稱鑒定的具體抗體的VL CDR及VLFR)。在具體實施方式中，在此提供了多核苷酸，其包括編碼抗OX40抗體或其片段的核苷酸序列，該抗體或其片段包括VH結構域，例如包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，包括在此描述的胺基酸序列(例如參見表2和4，例如在表中按名稱鑒定的具體抗體的VH CDR及VH FR)。
在某些實施方式中，在此描述的多核苷酸包括編碼在此提供的抗體的核苷酸序列，該抗體包括輕鏈可變區，其包括在此描述的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：15)，其中該抗體免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)。在某一個實施方式中，在此描述的多核苷酸包括編碼在此提供的抗體pab1949或pab2044或其片段的核苷酸序列，該抗體或其片段包括輕鏈可變區，該輕鏈可變 區包括在此描述的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：15)。
在某些實施方式中，在此描述的多核苷酸包括編碼在此提供的抗體的核苷酸序列，該抗體包括重鏈可變區，該重鏈可變區包括在此描述的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：16)，其中該抗體免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)。在某一個實施方式中，在此描述的多核苷酸包括編碼在此提供的抗體pab1949或pab2044或其片段的核苷酸序列，該抗體或其片段包括重鏈可變區，該重鏈可變區包括在此描述的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：16)。
在某些方面中，多核苷酸包括編碼在此描述的抗體或其片段的核苷酸序列，該抗體或其片段包括VL結構域，該VL結構域包括一個或多個具有在此描述的胺基酸序列(例如，參見表3)的VL FR，其中該抗體免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)。在某些方面中，多核苷酸包括編碼在此描述的抗體或其片段的核苷酸序列，該抗體或其片段包括VH結構域，該VH結構域包括一個或多個具有在此描述的胺基酸序列(例如，參見表4)的VH FR，其中該抗體免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)。
在具體實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼在此描述的抗體或其片段的核苷酸序列，該抗體或其片段包括：係人類框架區的框架區(例如，VL結構域 和VH結構域的框架區)，其中該抗體免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)。在某些實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼描述於上述章節5.2中的抗體或其片段(例如，CDR或可變域)的核苷酸序列。
在具體方面，在此提供了多核苷酸，其包括編碼包括輕鏈和重鏈(例如，分別的輕鏈和重鏈)的抗體的核苷酸序列。關於輕鏈，在一個具體實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼κ輕鏈的核苷酸序列。在另一個具體實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼λ輕鏈的核苷酸序列。在又另一個具體實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼包括人類κ輕鏈或人類λ輕鏈的在此描述的抗體的核苷酸序列。在一個具體實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的核苷酸序列，其中該抗體包括輕鏈，並且其中VL結構域的胺基酸序列可包括在SEQ ID NO：15中列出的胺基酸序列，並且其中輕鏈的恒定區包括人類κ輕鏈恒定區的胺基酸序列。在另一個具體實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼抗體的核苷酸序列，該抗體免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)並且包括輕鏈，其中VL結構域的胺基酸序列可包括在SEQ ID NO：15中列出的胺基酸序列，並且其中輕鏈的恒定區包括人類λ輕鏈恒定區的胺基酸序列。例如，人恒定區序列可以是描述於美國專利案號5,693,780中的那些。
在一個具體實施方式中，在此提供的多核苷 酸包括編碼在此描述的、免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的核苷酸序列，其中該抗體包括重鏈，其中VH結構域的胺基酸序列可包括在SEQ ID NO：16中列出的胺基酸序列，並且其中重鏈的恒定區包括人類γ重鏈恒定區的胺基酸序列。
在某一個實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼在此描述的、免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體(例如，pa91949或pab2044，如針對VH結構域，SEQ ID NO：16，或針對VL結構域，SEQ ID NO：15)的VH結構域和/或VL結構域的一個或多個核苷酸序列。
在又另一個具體實施方式中，在此提供的多核苷酸包括編碼在此描述的、免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的抗體的核苷酸序列，其中該抗體包括包含任何在此描述的胺基酸序列的VL結構域和VH結構域，並且其中恒定區包括人類IgG1(例如，同種異型1、17或3)、人類IgG2或人類IgG4恒定區的胺基酸序列。
在一個具體實施方式中，在此提供了多核苷酸，其包括編碼抗OX40抗體或其結構域(如在此所指定，參見例如表1-4，例如抗體pab1949或pab2044)的核苷酸序列。
在此還提供了編碼例如藉由密碼子/RNA優化、用異源信號序列取代以及消除mRNA不穩定性元件而優化的抗OX40抗體或其片段的多核苷酸。藉由引入密碼 子改變和/或消除mRNA中抑制區而產生編碼抗OX40抗體或其片段(例如，輕鏈、重鏈、VH結構域、或VL結構域)以重組表現優化的核酸的方法因而可以藉由採用描述於例如美國專利案號5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；以及6,794,498中的優化方法進行。例如，RNA中潛在的剪接位點和不穩定性元件(例如，A/T或A/U豐富的元件)可無需改變由核酸序列編碼的胺基酸而發生突變，以增加RNA重組表現的穩定性。該等改變利用遺傳密碼的簡並，例如對於相同的胺基酸使用替代密碼子。在一些實施方式中，可以令人希望的是改變一個或多個密碼子以編碼保守突變，例如與原胺基酸具有類似化學結構及特性和/或功能的類似胺基酸。
在某些實施方式中，編碼在此描述的抗OX40抗體或其片段(例如，VL結構域或VH結構域)的優化多核苷酸序列可與編碼在此描述的抗OX40抗體或其片段(例如，VL結構域或VH結構域)的未優化多核苷酸序列的反義(例如互補)多核苷酸雜交。在具體實施方式中，編碼在此描述的抗OX40抗體或片段的優化核苷酸序列在高嚴格度條件下與編碼在此描述的抗OX40抗體或其片段的未優化多核苷酸序列的反義多核苷酸雜交。在一個具體實施方式中，編碼在此描述的抗OX40抗體或其片段的優化核苷酸序列在高嚴格度、中等、或較低嚴格度雜交條件下與編碼在此描述的抗OX40抗體或其片段的未優化核苷酸序列的反義多核苷酸雜交。關於雜交條件的資訊已 描述於，參見例如美國專利申請公開案號US 2005/0048549(例如，第72-73段)中，將其藉由引用結合在此。
可藉由本領域中已知的任何方法獲得多核苷酸，並且確定多核苷酸的核苷酸序列。可以使用本領域熟知的方法確定編碼在此描述的抗體(例如，描述於表1-4中的抗體)以及該等抗體的修飾形式的核苷酸序列，即以此方式組裝已知編碼特定胺基酸的核苷酸密碼子，以產生編碼抗體的核酸。編碼抗體的此類多核苷酸可以組裝自化學合成的寡核苷酸組合(例如，如描述於庫特梅爾(Kutmeier)G等人，(1994)，生物技術(BioTechniques)17：242-246中)，簡言之，其涉及包含編碼抗體、將那些寡核苷酸的退火與連接、然後藉由PCR擴增所連接的寡核苷酸的序列部分的重疊寡核苷酸合成。
可替代地，可以使用本領域熟知的方法(例如，PCR及其他分子選殖方法)從適當來源(例如，融合瘤)的核酸中產生編碼在此描述的抗體或其片段的多核苷酸。例如，使用可與已知序列的3’及5’端雜交的合成引物的PCR擴增可使用獲得自生產感興趣的抗體的融合瘤細胞的基因組DNA進行。可使用此類PCR擴增方法以獲得包括編碼抗體輕鏈和/或重鏈的序列的核酸。可使用此類PCR擴增方法以獲得包括編碼抗體可變輕鏈區和/或可變重鏈區的序列的核酸。可以將擴增的核酸選殖進載體 中，以在宿主細胞中表現以及進一步選殖，例如，以產生嵌合及人源化抗體。
如果包含編碼特定抗體或其片段的核酸的殖株無法獲得，但已知抗體分子或其片段的序列，則編碼免疫球蛋白或其片段的核酸可以化學合成或獲得自適當來源(例如，抗體cDNA文庫或產生自下述的cDNA文庫，或從下述分離的核酸(較佳的是poly A+ RNA)：表現抗體的任何組織或細胞，如經選擇表現在此描述的抗體的融合瘤細胞)，藉由PCR擴增，使用可與序列的3’及5’端雜交的合成引物，或藉由選殖，使用特異性針對特定基因序列的寡核苷酸探針，以從cDNA文庫中鑒定例如編碼抗體的cDNA殖株。然後，可以使用本領域熟知的任何方法，將藉由PCR產生的擴增核酸選殖進可複製的殖株載體中。
使用常規程式(例如，藉由使用能夠特異性結合編碼抗OX40抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)可以容易地分離和測序編碼在此描述的抗OX40抗體的DNA。融合瘤細胞可充當此類DNA的來源。一旦發生分離，可以將DNA置於表現載體中，然後將載體轉染至不另外產生免疫球蛋白蛋白質的宿主細胞(如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如來自CHO GS SystemTM(龍沙公司(Lonza))的CHO細胞)或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中獲得合成抗OX40抗體。
為了產生抗體，包括VH或VL核苷酸序列、 限制位點以及保護限制位點的旁側序列的PCR引物可用於擴增scFv殖株中的VH或VL序列。利用熟習該項技術者已知的選殖技術，可以將經PCR擴增的VH結構域選殖進表現重鏈恒定區(例如人類γ4恒定區)的載體中，並且可以將經PCR擴增的VL結構域選殖進表現輕鏈恒定區(例如人類κ或λ恒定區)的載體中。在某些實施方式中，用於表現VH或VL結構域的載體包括EF-1α啟動子、分泌訊號、可變域的選殖位點、恒定域以及選擇標記如新黴素。還可以將VH和VL結構域選殖進表現必需恒定區的一種載體。然後使用熟習該項技術者已知的技術，將重鏈轉化載體和輕鏈轉化載體共轉染到細胞系中，以產生表現全長抗體(例如，IgG)的穩定或暫態細胞系。
還可以例如，藉由以鼠序列取代人類重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列，或藉由將非免疫球蛋白多肽全部或部分的編碼序列共價結合至免疫球蛋白編碼序列來修飾DNA。
還提供了在高嚴格度、中等、或較低嚴格度雜交條件下與編碼在此描述的抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。在具體實施方式中，在此描述的多核苷酸在高嚴格度、中等、或較低嚴格度雜交條件下雜交至編碼在此提供的VH結構域(例如，SEQ ID NO：16)和/或VL結構域(例如，SEQ ID NO：15)的多核苷酸。
雜交條件已描述於本領域中並且是熟習該項技術者已知的。例如，在嚴格條件下的雜交可涉及以下： 與在約45℃下在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中的濾膜結合的DNA雜交，接著在0.2xSSC/0.1% SDS中在約50℃-65℃下進行一次或多次洗滌；在高嚴格條件下的雜交可涉及以下：與在約45℃下在6xSSC中的濾膜結合的核酸雜交，接著在0.1xSSC/0.2% SDS中在約68℃下進行一次或多次洗滌。在其他嚴格雜交條件下的雜交係熟習該項技術者已知的並且已被描述於，參見例如，奧蘇貝爾(Ausubel)FM等人編輯，(1989)當代分子生物學實驗手冊(Current Protocols in Molecular Biology)，第I卷，格林出版協會公司(Green Publishing Associates,Inc.)以及約翰&威利父子公司(John Wiley & Sons,Inc.)，紐約(New York)，第6.3.1-6.3.6和2.10.3頁中。
5.3.2 細胞及載體
在某些方面中，在此提供了表現(例如，重組地)特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的細胞(例如，宿主細胞)以及相關多核苷酸和表現載體。在此提供了載體(例如，表現載體)，該載體包括多核苷酸，該多核苷酸包括編碼抗OX40抗體或片段的核苷酸序列，以在宿主細胞中、較佳的是在哺乳動物細胞中重組表現。在此還提供了宿主細胞，其包括此類載體以重組地表現在此描述的抗OX40抗體(例如，人類或人源化抗體)。在一個具體方面，在此提供了用於產生在此描 述的抗體的方法，該方法包括在宿主細胞中表現此類抗體。
特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體或其片段(例如，在此描述的抗體重鏈或輕鏈或單鏈抗體)的重組表現涉及構建表現載體，其包含編碼該抗體或片段的多核苷酸。一旦已經獲得編碼在此描述的抗體或其片段(例如，重鏈或輕鏈可變域)的多核苷酸，可使用本領域熟知的技術藉由重組DNA技術產生用於生產抗體分子的載體。因此，在此描述了藉由表現包含抗體或抗體片段(例如，輕鏈或重鏈)編碼核苷酸序列的多核苷酸用於製備蛋白質的方法。可以使用熟習該項技術者熟知的方法來構建含有抗體或抗體片段(例如，輕鏈或重鏈)編碼序列以及適當的轉錄和翻譯控制信號的表現載體。該等方法包括，例如，體外重組DNA技術、合成技術及體內遺傳重組。還提供了可複製載體，其包括編碼在此描述的抗體分子、抗體重鏈或輕鏈、抗體或其片段重鏈或輕鏈可變域或重鏈或輕鏈CDR的核苷酸序列，可操作地連接至啟動子。此類載體可以例如包括編碼抗體分子恒定區的核苷酸序列(參見例如，國際公開案號WO 86/05807以及WO 89/01036；以及美國專利案號5,122,464)，並且可以將抗體的可變域選殖進此類載體中，以表現整個重鏈、整個輕鏈或整個重鏈及輕鏈二者。
可以藉由常規技術將表現載體轉移到細胞(例如，宿主細胞)中，並且然後可以藉由常規技術培養 所得細胞，以產生在此描述的抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)或其片段。因此，在此提供了宿主細胞，其包含編碼在此描述的抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)或其片段的(例如，其重鏈或輕鏈、或其片段)的多核苷酸，可操作地連接至啟動子，以在宿主細胞中表現此類序列。在某些實施方式中，為了表現雙鏈抗體，可以將單獨編碼重鏈和輕鏈兩者的載體在宿主細胞中共表現，以表現整個免疫球蛋白分子，詳細說明如下。在某些實施方式中，宿主細胞包含載體，該載體包括編碼在此描述的抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)重鏈及輕鏈兩者、或其片段的多核苷酸。在具體實施方式中，宿主細胞包含兩種不同的載體，第一載體包括編碼在此描述的抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)重鏈或重鏈可變區、或其片段的多核苷酸，以及第二載體包括編碼在此描述的抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)輕鏈或輕鏈可變區、或其片段的多核苷酸。在其他實施方式中，第一宿主細胞包括第一載體，該第一載體包括編碼在此描述的抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)重鏈或重鏈可變區、或其片段的多核苷酸，並且第二宿主細胞包括第二載體，該第二載體包括編碼在此描述的抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)輕鏈或輕鏈可變區的多核苷酸。在具體實施方式中，由第一細胞表現的重鏈/重鏈可變區 聯合第二細胞的輕鏈/輕鏈可變區，以形成在此描述的抗OX40抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)。在某些實施方式中，在此提供了宿主細胞群體，其包括此類第一宿主細胞和此類第二宿主細胞。
在一個具體實施方式中，在此提供了載體群體，其包含第一載體和第二載體，該第一載體包括編碼在此描述的抗OX40抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)輕鏈/輕鏈可變區的多核苷酸，並且該第二載體包括編碼在此描述的抗OX40抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)重鏈/重鏈可變區的多核苷酸。
可利用多種宿主-表現載體系統來表現在此描述的抗體分子(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)(參見例如，美國專利案號5,807,715)。這類宿主表現系統代表可藉以產生並隨後純化感興趣的編碼序列的媒介物，而且還代表在用適當核苷酸編碼序列轉化或轉染時可以原位表現在此描述的抗體分子的細胞。該等系統包括但不限於微生物，如用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表現載體轉化的細菌(例如大腸桿菌和枯草桿菌)；用含有抗體編碼序列的重組酵母表現載體轉化的酵母(例如酵母(Saccharomyces)、畢赤酵母(Pichia))；用含有抗體編碼序列的重組病毒表現載體(例如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用重組病毒表現載體(例如花椰菜花葉病 毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或用含有抗體編碼序列的重組質粒表現載體(例如Ti質粒)轉化的植物細胞系統(例如，綠藻如萊茵衣藻)；或具有含有源自哺乳動物細胞的基因組(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子)的啟動子的重組表現構建體的哺乳動物細胞系統(例如COS(例如，COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、海拉、以及NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20以及BMT10細胞)。在一個具體實施方式中，用於表現在此描述的抗體(例如，包括抗體pab1949或pab2044中任一個的CDR的抗體)的細胞係CHO細胞，例如來自CHO GS SystemTM(龍沙公司)的CHO細胞。在一個具體實施方式中，用於表現在此描述的抗體的細胞係人類細胞，例如，人類細胞系。在一個具體實施方式中，哺乳動物表現載體係pOptiVECTM或pcDNA3.3。在一個具體實施方式中，將細菌細胞(如大腸桿菌)或真核細胞(例如，哺乳動物細胞)用於表現重組抗體分子，特別是用於表現整個重組抗體分子。例如，哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)聯合載體(如來自人巨細胞病毒的主要中期早期基因啟動子元件)係針對抗體的有效表現系統(福爾京(Foecking)MK和霍夫施泰特爾(Hofstetter)H(1986)基因(Gene)45：101-105；以及科克特 (Cockett)MI等人，(1990)生物技術(Biotechnology)8：662-667)。在某些實施方式中，在此描述的抗體係由CHO細胞或NS0細胞產生的。在一個具體實施方式中，編碼免疫特異性結合OX40(例如，人類OX40)的在此描述的抗體的核苷酸序列的表現受組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性啟動子調控。
在細菌系統中，取決於所表現的抗體分子的預定用途，可以有利地選擇許多表現載體。例如，當要產生大量這種抗體，用於生成抗體分子的醫藥組成物時，可能希望指導容易純化的融合蛋白產物的高水平表現的載體。這類載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278(魯塞爾(Ruether)U和米勒-希爾(Mueller-Hill)B，(1983)EMBO J 2：1791-1794)，其中抗體編碼序列可以單獨地與lac Z編碼區同框連接至載體中，這樣使得產生一種融合蛋白；pIN載體(井上(Inouye)S和井上M(1985)核酸研究(Nuc Acids Res)13：3101-3109；凡赫克(Van Heeke)G和舒斯特(Schuster)SM(1989)生物化學雜誌(J Biol Chem)24：5503-5509)；等。例如，pGEX載體也可以用於表現作為與麩胺基硫5-轉移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般來說，這類融合蛋白係可溶的並且能夠藉由吸附且結合至基質麩胺基硫-瓊脂糖珠粒，隨後在游離麩胺基硫存在下洗脫來容易地從溶解的細胞中純化。該等pGEX載體被設計成包括凝血酶或因數Xa蛋白酶裂解位點，這樣使得可以從GST部分釋放 選殖的靶基因產物。
在一種昆蟲系統中，例如，可以將加洲苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)用作表現外源基因的一種載體。病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中生長。可以將抗體編碼序列單獨地選殖至病毒的非必需區域(例如，多角體蛋白基因)中且置於一種AcNPV啟動子(例如，多角體蛋白啟動子)的控制下。
在哺乳動物宿主細胞中，可以利用許多基於病毒的表現系統。在使用腺病毒作為表現載體的情況中，可以將感興趣的抗體編碼序列連接到腺病毒轉錄/翻譯調控複合物上，例如晚期啟動子以及三聯前導序列。然後，可以藉由體外或體內重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組中。在病毒基因組非必需區域(例如，區域E1或E3)進行插入會得到能存活並且能夠在被感染的宿主中表現抗體分子的重組病毒(例如參見洛根(Logan)J和申克(Shenk)T(1984)美國科學院院報(PNAS)81：3655-3659)。特定起始信號也被要求用於插入的抗體編碼序列的有效翻譯。該等信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。另外，起始密碼子必須與所需編碼序列的閱讀框同期以便確保整個插入物的翻譯。該等外源翻譯控制信號和起始密碼子可以具有多種來源，天然的和合成的。可以藉由包括適當的轉錄增強子元件、轉錄終止子等來增強表現的效率(參見例如，比特(Bitter)G等人，(1987)酶學方 法(Methods Enzymol)153：516-544)。
此外，可以選擇一種宿主細胞株，該宿主細胞株調節插入的序列的表現，或以所希望的特定方式修飾和加工基因產物。蛋白質產物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如裂解)對於蛋白質的功能來說可能是重要的。不同宿主細胞對於蛋白和基因產物的翻譯後加工和修飾具有特徵和特定機制。可以選擇適當的細胞系或宿主系統以確保對所表現的異種蛋白進行正確的修飾和加工。為此，可以使用處理細胞機器以適當處理基因產物的初級轉錄物、糖基化及磷酸化的真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、VERO、BHK、海拉、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不會內源性產生任何免疫球蛋白鏈的鼠科骨髓瘤細胞系)、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10以及HsS78BsT細胞。在某些實施方式中，在此描述的抗OX40抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)在哺乳動物細胞(如CHO細胞)中產生。
在一個具體實施方式中，在此描述的抗體具有低岩藻糖含量或無岩藻糖含量。可以使用熟習該項技術者已知的技術來生產此類抗體。例如，可以在岩藻糖化缺陷型或缺少岩藻糖化能力的細胞中表現抗體。在一個具體 實例中，可以將具有敲除α1,6-岩藻糖基轉移酶的兩個等位基因的細胞系用以產生具有低岩藻糖含量的抗體。Potelligent®系統(龍沙公司)係此種系統的實例，可以將其用於產生具有低岩藻糖含量的抗體。
為了長期、高產率生產重組蛋白，可以產生穩定表現細胞。例如，可工程化穩定表現在此描述的抗OX40抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)的細胞系。在具體實施方式中，在此提供的細胞穩定表現與形成在此描述的抗體(例如，包括pab1949或pab2044的CDR的抗體)有關的輕鏈/輕鏈可變域及重鏈/重鏈可變域。
在某些方面中，並非使用含有病毒複製起點的表現載體，可以用由適當表現控制元件(例如，啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制的DNA及選擇標記轉化宿主細胞。在引入外源DNA/多核苷酸之後，可允許工程化細胞在富集培養基中生長1至2天，並且然後轉換到選擇性培養基中。重組質粒中的選擇標記賦予對選擇的抗性，並且允許細胞穩定地將質粒整合到其染色體中並生長以形成病灶，進而其可以進行選殖並擴展成細胞系。此方法可有利地用於工程化表現在此描述的抗OX40抗體或其片段的細胞系。這類工程化的細胞系特別適用於篩選和評估與該抗體分子直接或間接相互作用的組成物。
可使用許多選擇系統，包括但不限於，單純 皰疹病毒的胸苷激酶(威戈勒(Wigler)M等人，(1977)細胞(Cell)11(1)：223-232)、次黃嘌呤轉磷酸核糖基酶(斯吉巴爾斯科(Szybalska)EH和斯吉巴爾斯基(Szybalski)W(1962)美國科學院院報(PNAS)48(12)：2026-2034)以及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(羅伊(Lowy)I等人，(1980)細胞22(3)：817-823)基因可分別用在tk-、hgprt-或aprt-細胞中。另外，可以將抗代謝藥抗性作為選擇以下基因的依據：dhfr，其賦予針對甲胺喋呤的抗性(威戈勒(Wigler)M等人，(1980)美國科學院院報(PNAS)77(6)：3567-3570；奧海爾(O’Hare)K等人，(1981)美國科學院院報78：1527-1531)；gpt，其賦予針對黴酚酸的抗性(穆麗幹(Mulligan)RC和伯格爾(Berg)P(1981)美國科學院院報78(4)：2072-2076)；neo，其賦予針對胺基糖甙G-418的抗性(吳(Wu)GY和吳(Wu)CH(1991)生物療法(Biotherapy)3：87-95；托爾斯托西弗(Tolstoshev)P(1993)藥理學與毒物學年鑒(Ann Rev Pharmacol Toxicol)32：573-596；穆麗幹RC(1993)科學(Science)260：926-932；以及摩根(Morgan)RA和安德森(Anderson)WF(1993)生物化學年評(Ann Rev Biochem)62：191-217；納貝爾(Nabel)GJ和費爾格納(Felgner)PL(1993)生物技術趨勢(Trends Biotechnol)11(5)：211-215)；以及hygro，其賦予針對潮黴素的抗性(聖德爾(Santerre)RF等人，(1984)基因(Gene)30(1-3)：147-156)。可以將 本領域公知的重組DNA技術的方法常規地應用於選擇所希望的重組殖株，並且此類方法描述於，例如，奧蘇貝爾(Ausubel)FM等人(編輯)，當代分子生物學實驗手冊(Current Protocols in Molecular Biology)，約翰&威利父子公司(John Wiley & Sons)，NY(1993)；克裡格勒爾(Kriegler)M，基因轉移和表現：實驗室手冊(Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual)，斯托克頓出版社(Stockton Press)，NY(1990)；以及在第12和13章中，Dracopoli NC等人(編輯)，當代人類遺傳學實驗手冊(Current Protocols in Human Genetics)，約翰&威利父子公司，NY(1994)；Colbère-GarapinF等人，(1981)分子生物學雜誌(J Mol Biol)150：1-14中，將其藉由引用以其全文結合在此。
抗體分子的表現水平可以藉由載體擴增來增加(關於綜述，參見貝賓頓(Bebbington)CR和漢切爾(Hentschel)CCG，使用基於基因擴增的載體來在DNA殖株中在哺乳動物細胞中表現選殖的基因(The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)，第3卷(學術出版社(Academic Press)，紐約，1987))。當表現抗體的載體系統中的標記可擴增時，存在於宿主細胞培養物中的抑制劑的水平增加將使標記物基因的拷貝數目增加。由於所擴增的區域與抗體基因相關聯，因此該抗體的產生也將增加(克勞斯(Crouse)GF等人，(1983)， 分子細胞生物學雜誌(Mol Cell Biol)3：257-66)。
宿主細胞可被在此描述的兩個或更多個表現載體(第一載體編碼重鏈衍生的多肽並且第二載體編碼輕鏈衍生的多肽)進行共轉染。這兩種載體可包含相同的選擇標記，這使得重鏈和輕鏈多肽能相等表現。宿主細胞可以被不同量的兩種或更多種表現載體進行共轉染。例如，宿主細胞可以被下列任一比例的第一表現載體和第二表現載體進行轉染：1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：12、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45或1：50。
可替代地，可使用單個載體，該載體編碼並且能夠表現重鏈和輕鏈多肽兩者。在此類情況中，輕鏈應置於重鏈之前，以避免過量的毒性游離重鏈(普勞德富特(Proudfoot)NJ(1986)自然(Nature)322：562-565；以及科勒(Köhler)G(1980)美國科學院院報(PNAS)77：2197-2199)。重鏈和輕鏈編碼序列可包括cDNA或基因組DNA。表現載體可以是單順反子或多順反子。多順反子核酸構建體可編碼2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個，或者在2至5、5至10或10至20個範圍內的基因/核苷酸序列。例如，雙順反子核酸構建體可以按以下順序包括啟動子、第一基因(例如，在此描述的抗體重鏈)及第二基因及(例如，在此描述的抗體輕鏈)。在此種表現載體中，兩種基因的轉錄可以由啟動子來驅動，而來自第一基因的mRNA的翻譯可以由帽依賴性掃描機制來 驅動，並且來自第二基因的mRNA的翻譯可以由帽獨立性機制(例如，藉由IRES)來驅動。
一旦在此描述的抗體分子已經藉由重組表現產生，就可以藉由本領域中已知用於純化免疫球蛋白分子的任何方法來純化該抗體分子，例如，藉由層析法(例如，離子交換、親和法(特別是藉由特異性抗原對蛋白質A的親和性)和尺寸分級柱層析法)、離心、差別溶解度、或者藉由用於純化蛋白質的任何其他標準技術。另外，在此描述的抗體可融合到在此描述或其他本領域已知的異源多肽序列中以促進純化。
在具體實施方式中，將在此描述的抗體分離或純化。通常，分離的抗體係基本上不含其他具有與分離的抗體不同抗原特異性的抗體。例如，在一個具體實施方式中，在此描述的抗體的製劑基本上不含細胞材料和/或化學先質。語言“基本上不含細胞材料”包括抗體的製劑，其中抗體係從細胞的細胞成分中分離出來的，抗體從細胞中分離或重組產生。因此，基本上不含細胞材料的抗體包括具有少於約30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%(按乾重計)的異源蛋白質(在此也稱為“污染蛋白質”)和/或抗體變體(例如，抗體的不同翻譯後修飾形式)的抗體製劑。當重組地產生抗體或片段時，它也通常基本上不含培養基，即培養基表示蛋白製劑的少於約20%、10%、2%、1%、0.5%或0.1%的體積。當藉由化學合成產生抗體或片段時，它通常基本上不含化學先質或其 他化學製劑，即，從參與合成蛋白質的化學先質或其他化學製劑中分離出來。因此，此類抗體或片段的製劑具有少於約30%、20%、10%或5%(按乾重計)的、除感興趣的抗體或片段之外的化學先質或成分。在一個具體實施方式中，將在此描述的抗體分離或純化。
5.4 醫藥組成物
在此提供了組成物，其包括在此描述的具有所希望純度的抗體在生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(雷明頓藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(1990)馬克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯頓，賓夕法尼亞州)中。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度下是對接受者無毒性的。
在此描述的醫藥組成物可用於增強、誘導或啟動OX40活性並且治療病症(如癌症或傳染性疾病)。可以根據在此描述的方法治療的癌症的實例包括但不限於：B細胞淋巴瘤(例如，B細胞慢性淋巴細胞白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤、皮膚B細胞淋巴瘤、彌漫性大型B細胞淋巴瘤)、基底細胞癌、膀胱癌、胚細胞瘤、腦轉移瘤、乳癌、柏基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、癌(例如，腺癌(例如，胃與食管交界處的腺癌))、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌(結腸癌和直腸癌)、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏肉瘤、濾泡性淋巴瘤、胃癌、胃與 食管交界處的癌、胃腸道癌、神經膠母細胞瘤(例如，多形性神經膠母細胞瘤(例如，新診斷出的或復發的))、神經膠質瘤、頭頸癌(例如，頭頸部鱗狀細胞癌)、肝轉移、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤、腎臟癌(例如，腎細胞癌及威爾姆斯瘤(Wilms’ tumor))、喉癌、白血病(例如，慢性髓細胞性白血病、多毛細胞白血病)、肝癌(liver cancer)(例如，肝癌(hepatic carcinoma)及肝腫瘤)、肺癌(例如，非小細胞肺癌及小細胞肺癌)、淋巴母細胞淋巴瘤、淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、轉移性腦腫瘤、轉移性癌症、骨髓瘤(例如，多發性骨髓瘤)、成神經細胞瘤、眼黑色素瘤、口咽癌症、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌(例如，胰管腺癌)、前列腺癌(例如，激素抵抗性(例如，去勢難治性)、轉移性、轉移性激素難治性(例如，去勢難治性、非雄激素依賴性))、腎細胞癌(例如，轉移性)、唾液腺癌、肉瘤(例如，橫紋肌肉瘤)、皮膚癌(例如，黑色素瘤(例如，轉移性黑色素瘤))、軟組織肉瘤、實性瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、甲狀腺癌、移行細胞癌(尿路上皮細胞癌症)、葡萄膜黑色素瘤(例如，轉移性)、疣狀癌、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)。在一個實施方式中，可以根據在此描述的方法治療的癌症的實例包括但不限於：晚期、復發性、或轉移性實性瘤、淋巴瘤(例如，彌散性大B細胞淋巴瘤或柏基特淋巴瘤)、乳癌、前列腺癌、頭頸癌、結腸 直腸癌、結腸癌、黑色素瘤(例如，轉移性黑色素瘤)、子宮內膜癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌或肺腺癌)、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胃癌、子宮癌、嗜鉻細胞瘤、轉移性皮膚鱗狀細胞癌(例如，在移植患者中)、Merkel氏細胞癌、皮膚T淋巴細胞瘤、神經內分泌腫瘤、骨源腫瘤(例如，骨肉瘤)、血管外皮細胞瘤、與遺傳綜合症有關的腫瘤(NF1或VHL)、脊索瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、生殖細胞瘤、小腸腫瘤、闌尾癌、以及病毒相關的腫瘤(例如，卡波西氏肉瘤)。在一個實施方式中，在此描述的醫藥組成物用作藥物或診斷劑。在一個實施方式中，包括在此描述的激動性抗體的醫藥組成物用於在治療癌症的方法中使用。
包括在此描述的拮抗性抗體的在此描述的醫藥組成物可用於減少、抑制、或滅活OX40活性並且治療病症(如炎性或自身免疫性疾病或障礙或傳染性疾病)。在一個實施方式中，包括在此描述的拮抗性抗體的醫藥組成物用於在治療炎性或自身免疫性疾病或障礙或傳染性疾病的方法中使用。
包括在此描述的拮抗性抗體的在此描述的醫藥組成物可用於減少、滅活、或抑制OX40活性並且治療選自下組的病症，該組由以下各項組成：感染(病毒性、細菌性、真菌性以及寄生蟲)、與感染有關的內毒素休克、關節炎、類風濕關節炎、氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、盆腔炎、阿茲海默症、炎性腸病、克羅恩 病、潰瘍性結腸炎、Peyronie氏病、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癬、血管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆病、關節炎、腦膜腦炎、葡萄膜炎、自身免疫性眼色素層炎、中樞和外周神經系統的免疫介導的炎性疾病(如多發性硬化症、狼瘡(如系統性紅斑性狼瘡))以及格-巴綜合症、皮膚炎、異位性皮膚炎、自身免疫性肝炎、纖維性肺泡炎、格雷氏病、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、美尼爾氏病)(Meniere's disease)、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、類肉瘤病、硬皮病、華格納氏肉芽病、胰臟炎、創傷(手術)、移植物抗宿主疾病、移植排斥、心臟病(即心血管疾病)(包括缺血性疾病(如心肌梗塞連同動脈硬化))、血管內血凝固、骨吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、齒根骨膜炎、胃酸過少(hypochlorhydia)、視神經脊髓炎、乳糜瀉、結締組織病(例如，狼瘡)、感染後炎性疾病(例如，格巴二氏症候群)、以及伴腫瘤症候群。
該等用於體內給藥的組成物可以是無菌的。這可以藉由經由例如無菌過濾膜進行過濾容易地實現。
5.5 用途及方法 5.5.1 治療性用途及方法
在一個方面，在此呈現了用於調節受試者的一種或多種免疫功能或應答之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予在此描述的抗OX40抗體或其組成物。 在一個具體方面，在此呈現了用於啟動、增強或誘導受試者的一種或多種免疫功能或應答之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。在一個具體實施方式中，在此呈現了用於預防和/或治療其中期望啟動或增強一種或多種免疫功能或應答的疾病之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予在此描述的抗OX40抗體或其組成物。在某一個實施方式中，在此呈現了用於治療傳染性疾病之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。在某一個實施方式中，在此呈現了用於治療癌症之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。癌症可以選自由以下各項組成之群組：黑色素瘤、腎癌、以及前列腺癌。癌症可以選自由以下各項組成之群組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、結腸癌、以及肺癌。在某一個實施方式中，在此呈現了用於治療黑色素瘤之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。在某一個實施方式中，在此呈現了用於治療腎癌之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。在某一個實施方式中，在此呈現了用於治療前列腺癌之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。在某些實施方式中，在此呈現了用於治療結腸癌之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。在某些實施方式中，在此呈現了用於治療肺癌之方法，該方法包括向對其有需要 的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。在某些實施方式中，在此呈現了用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40抗體或其組成物。在一個實例中，該方法進一步包括向受試者給予檢查點靶向劑。在一個實例中，檢查點靶向劑選自由以下各項組成之群組：拮抗劑抗PD-1抗體、拮抗劑抗PD-L1抗體、拮抗劑抗PD-L2抗體、拮抗劑抗CTLA-4抗體、拮抗劑抗TIM-3抗體、拮抗劑抗LAG-3抗體、拮抗劑抗CEACAM1抗體、激動劑抗GITR抗體、激動劑抗CD137抗體、以及激動劑抗OX40抗體。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係拮抗劑抗PD-1抗體。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係拮抗劑抗PD-L1抗體。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係激動劑抗GITR抗體。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係激動劑抗CD137抗體。
在某些實施方式中，將抗PD-1抗體用於此處所揭露的方法中。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗(Nivolumab)，又稱為BMS-936558或MDX1106，由Bristol-Myers Squibb所開發。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係潘布陸利珠單抗(Pembrolizumab)，又稱為拉立珠單抗(Lambrolizumab)或MK-3475，由默克公司(Merck & Co)所開發。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係皮立珠單抗(Pidilizumab)，又稱為CT-011，由CureTech所開發。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係MEDI0680，又稱為AMP-514，由醫學免疫公司 (Medimmune)所開發。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係由諾華製藥公司(Novartis Pharmaceuticals)所開發的PDR001。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係由再生元製藥(Regeneron Pharmaceuticals)所開發的REGN2810。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係由輝瑞公司(Pfizer)所開發的PF-06801591。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係由貝基公司(BeiGene)所開發的BGB-A317。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係由安阿泰生物公司(AnaptysBio)和特瑟若公司(Tesaro)所開發的TSR-042。在某些實施方式中，抗PD-1抗體係由恒瑞公司(Hengrui)所開發的SHR-1210。
可用於此處所揭露的治療方法的抗PD-1抗體的其他非限制性實例揭露於以下專利和專利申請，出於所有的目的將藉由引用將它們該等文件藉由引用以全文結合在此：美國專利案號6,808,710；美國專利案號7,332,582；美國專利案號7,488,802；美國專利案號8,008,449；美國專利案號8,114,845；美國專利案號8,168,757；美國專利案號8,354,509；美國專利案號8,686,119；美國專利案號8,735,553；美國專利案號8,747,847；美國專利案號8,779,105；美國專利案號8,927,697；美國專利案號8,993,731；美國專利案號9,102,727；美國專利案號9,205,148；美國公開案號US 2013/0202623 A1；美國公開案號US 2013/0291136 A1；美國公開案號US 2014/0044738 A1；美國公開案號US 2014/0356363 A1；美國公開案號US 2016/0075783 A1；以及PCT公開案號WO 2013/033091 A1；PCT公開案號WO 2015/036394 A1；PCT公開案號WO 2014/179664 A2；PCT公開案號WO 2014/209804 A1；PCT公開案號WO 2014/206107 A1；PCT公開案號WO 2015/058573 A1；PCT公開案號WO 2015/085847 A1；PCT公開案號WO 2015/200119 A1；PCT公開案號WO 2016/015685 A1；以及PCT公開案號WO 2016/020856 A1。
在某些實施方式中，將抗PD-L1抗體用於此處所揭露的方法中。在某些實施方式中，抗PD-L1抗體係由遺傳技術公司(Genentech)所開發的atezolizumab。在某些實施方式中，抗PD-L1抗體係由阿斯利康製藥有限公司(AstraZeneca)、塞爾基因公司(Celgene)以及醫學免疫公司所開發的durvalumab。在某些實施方式中，抗PD-L1抗體係avelumab，又稱為MSB0010718C，由默克雪蘭諾公司(Merck Serono)以及輝瑞公司所開發。在某些實施方式中，抗PD-L1抗體係由百時美施貴寶(Bristol-Myers Squibb)公司所開發的MDX-1105。在某些實施方式中，抗PD-L1抗體係由阿帕裡免疫公司(Amplimmune)和GSK公司所開發的AMP-224。
可用於此處所揭露的治療方法的抗PD-L1抗體的非限制性實例揭露於以下專利和專利申請，出於所有的目的藉由引用將它們該等文件藉由引用以全文結合在此：美國專利案號7,943,743；美國專利案號8,168,179； 美國專利案號8,217,149；美國專利案號8,552,154；美國專利案號8,779,108；美國專利案號8,981,063；美國專利案號9,175,082；美國公開案號US 2010/0203056 A1；美國公開案號US 2003/0232323 A1；美國公開案號US 2013/0323249 A1；美國公開案號US 2014/0341917 A1；美國公開案號US 2014/0044738 A1；美國公開案號US 2015/0203580 A1；美國公開案號US 2015/0225483 A1；美國公開案號US 2015/0346208 A1；美國公開案號US 2015/0355184 A1；以及PCT公開案號WO 2014/100079 A1；PCT公開案號WO 2014/022758 A1；PCT公開案號WO 2014/055897 A2；PCT公開案號WO 2015/061668 A1；PCT公開案號WO 2015/109124 A1；PCT公開案號WO 2015/195163 A1；PCT公開案號WO 2016/000619 A1；以及PCT公開案號WO 2016/030350 A1。
在某一個實施方式中，在此呈現了用於治療選自下組的癌症之方法，該組由以下各項組成：B細胞淋巴瘤(例如，B細胞慢性淋巴細胞白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤、皮膚B細胞淋巴瘤、彌漫性大型B細胞淋巴瘤)、基底細胞癌、膀胱癌、胚細胞瘤、腦轉移瘤、乳癌、柏基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、癌(例如，腺癌(例如，胃與食管交界處的腺癌))、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌(結腸癌和直腸癌)、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏肉瘤、濾泡性淋巴瘤、胃癌、胃與食管交界處的癌、胃腸道癌、神經膠母細胞瘤(例如，多形性神經膠 母細胞瘤(例如，新診斷出的或復發的))、神經膠質瘤、頭頸癌(例如，頭頸部鱗狀細胞癌)、肝轉移、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤、腎臟癌(例如，腎細胞癌及威爾姆斯瘤(Wilms’ tumor))、喉癌、白血病(例如，慢性髓細胞性白血病、多毛細胞白血病)、肝癌(liver cancer)(例如，肝癌(hepatic carcinoma)及肝腫瘤)、肺癌(例如，非小細胞肺癌及小細胞肺癌)、淋巴母細胞淋巴瘤、淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、轉移性腦腫瘤、轉移性癌症、骨髓瘤(例如，多發性骨髓瘤)、成神經細胞瘤、眼黑色素瘤、口咽癌症、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌(例如，胰管腺癌)、前列腺癌(例如，激素抵抗性(例如，去勢難治性)、轉移性、轉移性激素難治性(例如，去勢難治性、非雄激素依賴性))、腎細胞癌(例如，轉移性)、唾液腺癌、肉瘤(例如，橫紋肌肉瘤)、皮膚癌(例如，黑色素瘤(例如，轉移性黑色素瘤))、軟組織肉瘤、實性瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、甲狀腺癌、移行細胞癌(尿路上皮細胞癌症)、葡萄膜黑色素瘤(例如，轉移性)、疣狀癌、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)。在某一個實施方式中，在此呈現了用於治療選自下組的癌症的方法，該組由以下各項組成：晚期、復發性、或轉移性實性瘤、淋巴瘤(例如，彌散性大B細胞淋巴瘤或柏基特淋巴瘤)、乳癌、前列腺癌、頭頸癌、結腸直腸癌、結腸癌、黑色素瘤(例如，轉移性黑色素瘤)、子宮內膜癌、腎細胞癌、 腎透明細胞癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌或肺腺癌)、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胃癌、子宮癌、嗜鉻細胞瘤、轉移性皮膚鱗狀細胞癌(例如，在移植患者中)、Merkel氏細胞癌、皮膚T淋巴細胞瘤、神經內分泌腫瘤、骨源腫瘤(例如，骨肉瘤)、血管外皮細胞瘤、與遺傳綜合症有關的腫瘤(NF1或VHL)、脊索瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、生殖細胞瘤、小腸腫瘤、闌尾癌、以及病毒相關的腫瘤(例如，卡波西氏肉瘤)。
在另一個實施方式中，將抗OX40抗體給予診斷為患有癌症的患者，以增加患者的一種或多種免疫細胞群體(例如，T細胞效應細胞(如CD4+及CD8+ T細胞)的增殖和/或效應物功能。
在一個具體實施方式中，相對於未給予在此描述的抗OX40抗體的受試者的免疫功能，在此描述的抗OX40抗體將受試者的一種或多種免疫功能或應答啟動或增強或誘導了至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%或在10%至25%、25%至50%、50%至75%、或75%至95%之間的範圍內，使用本領域中熟知的測定(例如，ELISPOT、ELISA)和細胞增殖測定。在一個具體實施方式中，免疫功能係細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13產生)。在另一個實施 方式中，免疫功能係T細胞增殖/擴增，可以藉由例如流動式細胞測量術進行測定，以檢測表現T細胞標記(例如，CD3、CD4或CD8)的細胞數量。在另一個實施方式中，免疫功能係抗體生成，可以藉由例如ELISA進行測定。在一些實施方式中，免疫功能係效應物功能，可以藉由例如細胞毒性分析或其他本領域中熟知的分析進行測定。在另一個實施方式中，免疫功能係Th1應答。在另一個實施方式中，免疫功能係Th2應答。在另一個實施方式中，免疫功能係記憶應答。
在具體實施方式中，可以藉由抗OX40抗體增強或誘導的免疫功能的非限制性實例係：效應淋巴細胞的增殖/擴增(例如，效應T淋巴細胞數量的增加)、以及抑制效應淋巴細胞(例如，效應T淋巴細胞)的細胞凋亡。在具體實施方式中，藉由在此描述的抗OX40抗體增強或誘導的免疫功能係：CD4+ T細胞(例如，Th1及Th2輔助T細胞)、CD8+ T細胞(例如，細胞毒T淋巴細胞、α/β T細胞、以及γ/δ T細胞)、B細胞(例如，漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、腫瘤-駐留T細胞、CD122+ T細胞、自然殺傷(NK)細胞)、巨噬細胞、單核細胞、樹狀細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞或多形核化的白細胞的增殖/數目的擴增或活化。在一個實施方式中，在此描述的抗OX40抗體啟動或增強淋巴細胞先質的增殖/擴增或數量。在一些實施方式中，相對於陰性對照(例如，未用在此描述的抗OX40抗體處 理、培養或接觸的對應細胞的數量)，在此描述的抗OX40抗體將CD4+ T細胞(例如，Th1及Th2輔助T細胞)、CD8+ T細胞(例如，細胞毒T淋巴細胞、α/β T細胞、以及γ/δ T細胞)、B細胞(例如，漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、腫瘤-駐留T細胞(tumor-resident T cell)、CD122+ T細胞、自然殺傷(NK)細胞)、巨噬細胞、單核細胞、樹狀細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞或多形核化的白細胞的數量增加大約至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%、或在10%至25%、25%至50%、50%至75%、或75%至95%之間的範圍內。
在一些實施方式中，將在此描述的抗OX40抗體與靶向一種或多種免疫調節酶(如IDO(吲哚胺-2,3-雙加氧酶)以及TDO(色胺酸2,3-雙加氧酶)的化合物組合向受試者給予。在具體實施方式中，此類化合物選自由以下各項組成之群組：依帕卡朵絲坦(epacadostat)(因塞特公司(Incyte Corp))、F001287(福克斯生物科學公司(Flexus Biosciences))、印朵目德(indoximod)(紐琳基因公司(NewLink Genetics))、以及NLG919(紐琳基因公司)。在一個實施方式中，化合物係依帕卡朵絲坦(epacadostat)。在另一個實施方式中，化合物係F001287。在另一個實施方式中，化合物係印朵目德 (indoximod)。在另一個實施方式中，化合物係NLG919。
在一些實施方式中，將在此描述的抗OX40抗體與疫苗組合向受試者給予。
在一些實施方式中，將在此描述的抗OX40抗體與抗CD137抗體、利妥昔單抗、環磷醯胺、化療或放射治療組合向受試者給予。
在一些實施方式中，將在此描述的抗OX40抗體與基於熱休克蛋白的腫瘤疫苗或基於熱休克蛋白的病原體疫苗組合向受試者給予。在一個具體實施方式中，將抗OX40抗體與基於熱休克蛋白的腫瘤疫苗組合向受試者給予。熱休克蛋白(HSP)係普遍存在於所有物種中的高度保守蛋白質家族。作為熱休克或其他形式應激(包括曝露於毒素、氧化應激或葡萄糖剝奪)的結果，它們的表現可經有力地誘導成更高水平。根據分子量分類為五個家族：HSP-110、-90、-70、-60和-28。HSP經由抗原遞呈細胞(APC)(如巨噬細胞和樹突細胞(DC))的交叉呈遞途徑遞送免疫原性肽，從而導致T細胞活化。HSP起到形成能夠誘導腫瘤特異性免疫的複合物的腫瘤相關抗原肽的蛋白伴侶載體的作用。一但從死腫瘤細胞中釋放，HSP-抗原複合物被抗原呈遞細胞(APC)吸收，其中抗原被加工成結合MHC類別I和類別II分子的肽，從而導致抗腫瘤CD8+及CD4+ T細胞的活化。由衍生自腫瘤製劑的HSP複合物引發的免疫性特異性針對由每個受試者癌症表現的 獨特抗原肽抗體庫。
熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)係蛋白肽複合物，其由與抗原肽非共價複合的熱休克蛋白組成。HSPPC引發先天性和獲得性免疫應答兩者。在一個具體實施方式中，一種或多種抗原肽顯示出針對正在治療的癌症的抗原性。經由膜受體(主要是CD91)或藉由結合Toll-樣受體，HSPPC可有效地被APC抓住。HSPPC內化導致具有趨化介素和細胞介素產生的APC的功能成熟，從而引起自然殺傷細胞(NK)、單核細胞和Th1及Th-2介導的免疫應答的活化。在一些實施方式中，用於此處所揭露的方法中的HSPPC包括一種或多種熱休克蛋白，其來自與抗原肽複合的應激蛋白的hsp60、hsp70或hsp90家族。在一些實施方式中，HSPPC包括hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、鈣網蛋白或其兩種或更多種的組合。
在一個具體實施方式中，將抗OX40抗體與熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)(例如，熱休克蛋白肽複合物-96(HSPPC-96))組合向受試者給予以治療癌症。HSPPC-96包括與抗原肽複合的96kDa熱休克蛋白(Hsp)，gp96。HSPPC-96從受試者的腫瘤中製造的癌症免疫療法並且包含癌症的抗原“指紋”。在一些實施方式中，該指紋包含僅存在於特定受試者的特異性癌症細胞中的獨特抗原，並且注射疫苗旨在刺激受試者的免疫系統，以識別並且攻擊任何具有特異性癌症指紋的細胞。
在一些實施方式中，HSPPC(例如，HSPPC-96)從受試者的腫瘤組織中產生。在一個具體實施方式中，從正在治療的癌症類型的腫瘤或其轉移中產生HSPPC(例如，HSPPC-96)。在另一個具體實施方式中，HSPPC(例如，HSPPC-96)對於正在治療的受試者是自體的。在一些實施方式中，腫瘤組織係非壞死腫瘤組織。在一些實施方式中，使用至少1克(例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10克)的非壞死腫瘤組織以產生疫苗方案。在一些實施方式中，在手術切除後，在用於疫苗製備之前將非壞死腫瘤組織冷凍。在一些實施方式中，藉由純化技術將HSPPC(例如，HSPPC-96)從腫瘤組織中分離、過濾並製備成可注射疫苗。在一些實施方式中，給予受試者6-12個劑量的HSPPC(例如，HSPPC-96)。在此類實施方式中，HSPPC(例如，HSPPC-96)劑量可以按最初每週4個劑量，然後雙周2-8個另外的劑量給予。
可根據在此描述的方法使用的HSPPC的其他實例揭露於以下專利和專利申請，出於所有的目的藉由引用將它們該等文件藉由引用以全文結合在此：美國專利案號6,391,306、6,383,492、6,403,095、6,410,026、6,436,404、6,447,780、6,447,781以及6,610,659。
在一些實施方式中，本發明涉及本發明的抗體或醫藥組成物用作藥物。在一些方面，本發明涉及本發明的抗體或醫藥組成物用於在治療癌症的方法中使用。在 一些方面，本發明涉及本發明的抗體或醫藥組成物用於在治療受試者癌症的方法中使用，該方法包括向該受試者給予有效量的本發明的抗體或醫藥組成物。在一些方面，本發明涉及(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)檢查點靶向劑，用作藥物。在一些方面，本發明涉及(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)檢查點靶向劑，用於在用於治療癌症的方法中使用。在一些方面，本發明涉及組成物、套組或多部分套組，其包括(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)檢查點靶向劑。在一個方面，本發明涉及(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)IDO抑制劑，用作藥物。在一些方面，本發明涉及(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)IDO抑制劑，用於在治療癌症的方法中使用。在一些方面，本發明涉及組成物、套組或多部分套組，其包括(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)IDO抑制劑。在一些方面，本發明涉及(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)疫苗，用作藥物。在一些方面，本發明涉及(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)疫苗，用於在治療癌症之方法中使用。在一些方面，本發明涉及組成物、套組或多部分套組，其包括(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)疫苗。在抗體或醫藥組成物用於在治療癌症之方法中使用的一個較佳的實施方式中，抗體係激動性的。
在一個方面，如在此呈現的用於調節受試者的一種或多種免疫功能或應答之方法係用於滅活、減少或 抑制受試者的一種或多種免疫功能或應答的方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予抗OX40拮抗性抗體或其組成物。在一個具體實施方式中，在此呈現了用於預防和/或治療其中期望滅活、降低或抑制一種或多種免疫功能或應答的疾病的方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予在此描述的抗OX40拮抗性抗體或其組成物。在某一個實施方式中，在此呈現了用於治療自身免疫或炎性疾病或障礙的方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予有效量的抗OX40拮抗性抗體或其組成物。在某些實施方式中，受試者係人。在某些實施方式中，疾病或障礙選自由以下各項組成之群組：感染(病毒性、細菌性、真菌性以及寄生蟲)、與感染有關的內毒素休克、關節炎、類風濕關節炎、氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、盆腔炎、阿茲海默症、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、Peyronie氏病、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癬、血管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆病、關節炎、腦膜腦炎、葡萄膜炎、自身免疫性眼色素層炎、中樞和外周神經系統的免疫介導的炎性疾病(如多發性硬化症、狼瘡(如系統性紅斑性狼瘡))以及格-巴綜合症、皮膚炎、異位性皮膚炎、自身免疫性肝炎、纖維性肺泡炎、格雷氏病、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、美尼爾氏病、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、類肉瘤病、硬皮病、華格納氏肉芽病、胰臟炎、創傷(手術)、移植物抗宿主疾病、移植排斥、心臟病(即心血管疾病)(包 括缺血性疾病(如心肌梗塞連同動脈硬化))、血管內血凝固、骨吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、齒根骨膜炎、胃酸過少(hypochlorhydia)、視神經脊髓炎、乳糜瀉、結締組織病(例如，狼瘡)、感染後炎性疾病(例如，格巴二氏症候群)、以及伴腫瘤症候群。在某些實施方式中，該疾病或障礙選自由以下各項組成之群組：移植排斥、血管炎、氣喘、類風濕關節炎、皮膚炎、炎性腸病、葡萄膜炎、以及狼瘡。在某些實施方式中，此處的方法中的任一項(例如，用於治療傳染性疾病的方法、或用於治療自身免疫或炎性疾病或障礙的方法)包括向受試者給予如在此描述的抗體以及檢查點靶向劑。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係抗體(例如，抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM-3抗體、抗LAG-3抗體、抗CEACAM1抗體、抗GITR抗體、抗CD137抗體、或抗OX40抗體)。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係拮抗劑或激動劑抗體。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係抗PD-1抗體。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係抗GITR抗體。在某些實施方式中，檢查點靶向劑係抗CD137抗體。
在另一個實施方式中，將抗OX40拮抗性抗體給予診斷為患有自身免疫或炎性疾病或障礙的患者，以降低患者的一種或多種免疫細胞群體(例如，T細胞效應細胞(如CD4+及CD8+ T細胞)的增殖和/或效應物功能。
在一個具體實施方式中，相對於未給予在此 描述的抗OX40拮抗性抗體的受試者的免疫功能，在此描述的抗OX40拮抗性抗體將受試者的一種或多種免疫功能或應答滅活或降低或抑制至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%或在10%至25%、25%至50%、50%至75%、或75%至95%之間的範圍內，使用本領域中熟知的測定(例如，ELISPOT、ELISA)和細胞增殖測定。在一個具體實施方式中，免疫功能係細胞介素產生(例如，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、和/或IL-13產生)。在另一個實施方式中，免疫功能係T細胞增殖/擴增，可以藉由例如流動式細胞測量術進行測定，以檢測表現T細胞標記(例如，CD3、CD4或CD8)的細胞數量。在另一個實施方式中，免疫功能係抗體生成，可以藉由例如ELISA進行測定。在一些實施方式中，免疫功能係效應物功能，可以藉由例如細胞毒性分析或其他本領域中熟知的分析進行測定。在另一個實施方式中，免疫功能係Th1應答。在另一個實施方式中，免疫功能係Th2應答。在另一個實施方式中，免疫功能係記憶應答。
在具體實施方式中，可以藉由抗OX40拮抗性抗體降低或抑制的免疫功能的非限制性實例係：效應淋巴細胞的增殖/擴增(例如，效應T淋巴細胞數量的減少)、以及刺激效應淋巴細胞(例如，效應T淋巴細胞) 的細胞凋亡。在具體實施方式中，藉由在此描述的抗OX40拮抗性抗體降低或抑制的免疫功能係：CD4+ T細胞(例如，Th1及Th2輔助T細胞)、CD8+ T細胞(例如，細胞毒T淋巴細胞、α/β T細胞、以及γ/δ T細胞)、B細胞(例如，漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、腫瘤-駐留T細胞(tumor-resident T cell)、CD122+ T細胞、自然殺傷(NK)細胞)、巨噬細胞、單核細胞、樹狀細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞或多形核化(polymorphonucleated)的白細胞的增殖/數目的擴增或活化。在一個實施方式中，在此描述的抗OX40拮抗性抗體滅活或降低或抑制淋巴細胞先質的增殖/擴增或數量。在一些實施方式中，相對於陰性對照(例如，未用在此描述的抗OX40拮抗性抗體處理、培養或接觸的對應細胞的數量)，在此描述的抗OX40拮抗性抗體將CD4+ T細胞(例如，Th1及Th2輔助T細胞)、CD8+ T細胞(例如，細胞毒T淋巴細胞、α/β T細胞、以及γ/δ T細胞)、B細胞(例如，漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、腫瘤-駐留T細胞、CD122+ T細胞、自然殺傷(NK)細胞)、巨噬細胞、單核細胞、樹狀細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞或多形核化的白細胞的數量減少大約至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%、或在10%至25%、25% 至50%、50%至75%、或75%至95%之間的範圍內。
在一些方面，本發明涉及本發明的抗體或醫藥組成物用於在治療自身免疫或炎性疾病或障礙的方法中使用。在一個方面，本發明涉及本發明的抗體或醫藥組成物用於在治療傳染性疾病的方法中使用。在抗體或醫藥組成物用於在治療自身免疫或炎性疾病或障礙、或傳染性疾病的方法中使用的一個較佳的實施方式中，抗體係拮抗性的。
5.5.1.1 給藥途徑及劑量
在此描述的抗體或組成物可以藉由多種途徑遞送至受試者，如胃腸外、皮下、靜脈內、皮內、經皮、鼻內、瘤內、以及給藥至腫瘤引流淋巴結。在一個實施方式中，抗體或組成物藉由靜脈內或瘤內途徑進行給藥。
將有效治療和/或預防病症的抗體或組成物的量將取決於疾病的性質並且可以藉由標準臨床技術確定。
組成物中所採用的精確劑量也將取決於給藥途徑、以及疾病的嚴重程度，並且應根據從業者的判斷及各個受試者的情況而決定。例如，有效劑量還可以依給藥方式、目標部位、患者的生理狀態(包括年齡、體重及健康)、患者是否為人類或動物、給予的其他藥物或治療是否為預防性或治療性的而異。通常，患者係人類，但也可治療包括轉基因哺乳動物的非人哺乳動物。可以將治療劑量優化滴定以優化安全性及療效。
在某些實施方式中，採用體外測定以幫助鑒別最佳劑量範圍。可以從衍生自體外或動物模型測試系統的劑量響應曲線外推有效劑量。
通常，由於對外來多肽的免疫應答，人抗體比來自其他物種的抗體在人體內具有更長的半衰期。因此，通常可能的是較低劑量的人抗體及較低頻率的給藥。
5.5.2 檢測及診斷用途
在此描述的抗OX40抗體(參見例如章節5.2)可用於分析生物試樣中的OX40蛋白水平，使用熟習該項技術者已知的典型免疫組織學方法，包括免疫測定，如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫沈澱反應或西方墨點法。合適的抗體測定標籤係本領域中已知的並且包括酶標籤(如，葡萄糖氧化酶)；放射性同位素(如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(121In)及鍀(99Tc))；發光標籤(如魯米諾)；以及螢光標籤(如螢光素及羅丹明及生物素)。此類標籤可用於標記在此描述的抗體。可替代地，可以對識別在此描述的抗OX40抗體的第二抗體進行標記並且與抗OX40抗體組合使用以檢測OX40蛋白水平。
測定OX40蛋白表現水平旨在包括在第一生物試樣中直接(例如，藉由確定或估計絕對蛋白水平)或相對(例如，藉由與第二生物試樣中疾病相關的蛋白水平比較)定性或定量測量或估計OX40蛋白的水平。可測量或 估計並且將第一生物試樣中的OX40多肽表現水平與標準OX40蛋白水平進行比較，標準取自從不患有疾病的個體中獲得的第二生物試樣或由不患有疾病的個體的種群的平均水平確定。正如本領域將理解的，一旦已知“標準”OX40多肽水平，其可重複用作為比較的標準品。
如在此所使用的，術語“生物試樣”係指獲得自受試者、細胞系、組織或其他可能表現OX40的細胞來源的任何生物試樣。用於從動物(例如，人類)中獲得活體組織切片及體液的方法係本領域中所熟知的。生物試樣包括外周血單核細胞。
在此描述的抗OX40抗體可用於預後、診斷、監測及篩查應用，包括熟練技術人員所熟知並且標準並且基於本說明書的體外和體內應用。用於體外評估和評價免疫系統狀態和/或免疫應答的預後、診斷、監測及篩查測定和套組可用於預測、診斷及監測來評估患者樣品，包括已知患有或懷疑患有免疫系統-功能異常或關於預期或所希望的免疫系統應答、抗原應答或疫苗應答者的那些樣品。免疫系統狀態和/或免疫應答的評估和評價還可用於測定患者對於藥物臨床試驗或對於給予特定化學治療劑或抗體(包括其組合)相對於不同藥劑或抗體的適合性。此種類型的預後及診斷及監測評估已處於實踐中，利用對抗乳癌中HER2蛋白的抗體(HercepTestTM，達科公司(Dako))，其中該測定使用Herceptin®也用於評價抗體療法的患者。體內應用包括定向細胞治療以及免疫系統調 節及免疫應答放射性成像。
在一個實施方式中，抗OX40抗體可用於活檢樣品的免疫組織化學中。
在另一個實施方式中，抗OX40抗體可用於檢測OX40的水平或在其膜表面上包含OX40的細胞水平，然後可以將該等水平與某些疾病症狀相關聯。在此描述的抗OX40抗體可以攜帶可檢測或功能性標籤。當使用螢光標籤時，本領域中已知目前可獲得的顯微鏡檢查法和螢光啟動細胞分選器分析(FACS)或兩種方法程式的組合可用於鑒別以及量化特異性結合成員。在此描述的抗OX40抗體可以攜帶螢光標籤。示例性的螢光標籤包括，例如，反應性及偶聯探針(例如，胺基香豆素(Aminocoumarin)、螢光素(Fluorescein)及德克薩斯紅(Texas red)、亞曆克薩螢光染料(Alexa Fluor dye)、Cy染料及DyLight染料)。抗OX40抗體可以攜帶放射性標記物，如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac以及186Re。當使用放射性標記物時，本領域中已知目前可獲得的計數程式可用於鑒別以及量化抗OX40抗體特異性結合OX40(例如，人類OX40)。在標籤係酶的情況下，檢測可以藉由本領域中已知目前所採用的比色、分光光度、螢光分光光度、電流滴定或氣體定量技術中的任一種來完成。這可以藉由將樣品或對照樣品與抗OX40抗體在考慮到抗體與OX40之間的複合物的形成 的條件下進行接觸來實現。對該抗體和OX40之間形成的任何複合物進行檢測並在該樣品和該對照中進行比較。鑒於在此描述的抗體針對OX40的特異性結合，其抗體可用於特異性檢測細胞表面的OX40表現。在此描述的抗體還可以經由免疫親和純化用於純化OX40。
此處還包括了測定系統，其可以測試套組的形式進行製備，用於定量分析例如OX40或OX40/OX40L複合物的存在程度。系統或測試套組可包括標記組分(例如，標記抗體)以及一種或多種另外的免疫化學試劑。參見例如以下章節5.6對套組的詳細描述。
在一些方面，在此提供了用於體外檢測樣品中的OX40的方法，該方法包括將所述樣品與抗體接觸。在一些方面，在此提供了在此提供的抗體用於體外檢測樣品中的OX40之用途。在一個方面，在此提供了在此提供的抗體或醫藥組成物用於在檢測受試者中的OX40中使用。在一個方面，在此提供了在此提供的抗體或醫藥組成物用作診斷劑。在一個較佳的實施方式中，抗體包括可檢測標籤。在一個較佳的實施方式中，OX40係人類OX40。在一個較佳的實施方式中，受試者係人。
5.6 套組
在此提供了套組，其包括一種或多種在此描述的抗體或其綴合物。在一個具體實施方式中，在此提供了藥物包或套組，其包括填充有在此描述的醫藥組成物的 一種或多種成分(如在此提供的一種或多種抗體)的一個或多個容器。在一些實施方式中，套組包含在此描述的醫藥組成物以及任何預防劑或治療劑(如在此描述的那些)。在某些實施方式中，套組可包含促T細胞分裂原(例如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇乙酯(PMA))、或TCR複合物刺激抗體(如抗CD3抗體以及抗CD28抗體)。視情況與此類容器相關聯的可以是處於管理藥物或生物製品生產、使用或銷售的政府機構所規足的形式的標識，該標識反映生產、使用或銷售機構批准用於人施用。
在此還提供了可用於上述方法中之套組。在一個實施方式中，套組在一個或多個容器中包括在此描述的抗體，較佳的是純化抗體。在一個具體實施方式中，在此描述的套組包含基本上分離的OX40抗原(例如，人類OX40)，該抗原可以用作對照物。在另一個具體實施方式中，在此描述的套組進一步包括不與OX40抗原反應的對照抗體。在另一個具體實施方式中，在此描述的套組包含一個或多個用於檢測抗體與OX40抗原結合的元件(例如，抗體可綴合至可檢測底物(如螢光化合物、酶底物、放射性化合物或發光化合物)，或識別第一抗體的第二抗體可綴合至可檢測底物)。在具體實施方式中，在此提供的套組可包括重組產生或化學合成的OX40抗原。套組中所提供的OX40抗原還可以附接到固體支援體上。在一個更具體的實施方式中，上述套組的檢測裝置包括OX40抗 原所附接的固體支持體。此種套組還可包括未附接的、報告子標記的抗人類抗體或抗小鼠/大鼠抗體。在該實施方式中，可以藉由所述報告子標記的抗體的結合來檢測抗體與OX40抗原的結合。另外，提供了套組或多部分套組，其包括(a)本發明的抗體或醫藥組成物以及(b)檢查點靶向劑、IDO抑制劑和/或疫苗。
以說明的方式而不是以限制的方式提供以下實例。
6.實例
以說明的方式而不是以限制的方式提供此章節(即章節6)中的實例。
6.1 實例1：產生對抗人類OX40的新穎抗體
此實例描述了結合人類OX40的抗體的產生及表徵。具體地說，此實例描述了特異性結合人類OX40以及對T細胞呈現共刺激性影響的人類抗體的產生。
6.1.1 文庫產生
在此描述了Retrocyte DisplayTM文庫的產生。對於文庫插入片段的產生，藉由苯酚/氯仿從源自於兩個臍帶血樣的FACS分選的CD19陽性人類B淋巴細胞中萃取總RNA。使用來自富酶泰斯公司(Fermentas)(目錄號K1621和K1622)的RevertAid第一鏈cDNA合成套 組，將每個臍帶血樣(1μg)的總RNA用於第一鏈cDNA合成。藉由PCR從cDNA中擴增抗體可變區，並選殖進逆轉錄病毒表現載體(pCMA)中。隨後將該等構建體用於轉導前B細胞，以使用Retrocyte DisplayTM技術在表面上表現抗體。逆轉錄病毒表現載體包含5’和3’ LTR、包括膜錨著點部分(IGHG1)的免疫球蛋白恒定區(IGHG1或IGKC)以及CD4表面標誌基因。
使用Vκ家族特異性正向引物和反向引物的混合物，藉由半巢式PCR擴增輕鏈可變區(VL)。正向引物引入HindIII選殖位點，並且反向引物引入Eco47III選殖位點。
使用VH家族特異性正向引物和反向引物的混合物，藉由PCR擴增重鏈可變區(VH)。正向引物引入HindIII選殖位點，並且反向引物引入Eco47III選殖位點。
將擴增的VH和Vκ區域在37℃下消化過夜。消化之後，獲得大小為400-450bp的條帶並進行凝膠純化(馬歇雷-納高公司(Macherey&Nagel)，NucleoSpin凝膠和PCR淨化(Gel and PCR clean-up))。
對於選殖重鏈可變區，將構建體3181(pCMA-InsX Cg(iso3)loxP2-I-tr_huCD4-loxP)用HindIII/Eco47III在37℃下消化持續4小時，並且將大小為8362bp的條帶凝膠純化。對於選殖κ輕鏈可變區，將構建體3204(pCMA-InsX Ck-I-CD4)用HindIII/Eco47III 在37℃下消化持續4小時，並且將大小為7465bp的條帶凝膠純化。
使用載體與插入片段1：3的比率，將消化並且純化的抗體可變區在框內連接至合適的表現載體中。將每個VH和Vκ家族分別連接至逆轉錄病毒表現載體中並且藉由沈澱將其濃縮10倍。還將沈澱的VH和Vκ連接反應分別轉化至大腸桿菌DH10B細胞中用於文庫產生。每個VH和Vκ家族的各自連接、沈澱和轉化允許文庫反映功能胚系基因的自然分佈，由此確保相比於具有數目較少功能胚系基因的家族，具有大量功能胚系基因的VH或Vκ家族在最終文庫中具有高度代表性。在轉化之後，收穫大腸桿菌細胞並且將其合併至最終文庫中。藉由診斷性限制酶切消化以及分析測序數據來控制每個文庫的質量。從序列分析的資料中計算文庫多樣性。
6.1.2 回收來自預選的前B細胞殖株的重鏈及輕鏈
將如以上所描述產生的文庫材料用於鑒別對OX40具有高結合親和力的抗體。將B細胞殖株裂解，並且使用本領域標準的PCR方法，從穩定地整合到基因組DNA中的插入的逆轉錄病毒載體中擴增重鏈及輕鏈可變區。隨後將擴增的重鏈及輕鏈可變區選殖進包含人類重鏈及輕鏈恒定區的哺乳動物表現載體中。隨後將DNA質粒製劑用於轉染CHO細胞，並且使用懸浮陣列技術測試所表現的抗體。在Microsynth(巴爾加赫(Balgach)，瑞 士)上對抗體重鏈及輕鏈進行測序。
6.1.3 抗OX40抗體的生物物理表徵
選擇指定為pab1949的抗體，並且在如下所述的多個測定中對其進行表徵。抗OX40抗體pab1949包括重鏈和輕鏈，該重鏈包括SEQ ID NO：60的胺基酸序列並且該輕鏈包括SEQ ID NO：50的胺基酸序列的。抗體pab1949係在輕鏈恒定域中包含T109S取代(即，相對於野生型輕鏈恒定域，在位置109處蘇胺酸取代為絲胺酸)的人類IgG1抗體(根據卡巴特(Kabat)進行編號)，這有助於將框內可變區選殖進恒定區中。該突變係不影響抗體結合或功能的保守修飾。還產生了在位置109處包含蘇胺酸的野生型對應物(命名為pab1949-1)(根據卡巴特(Kabat)進行編號)。抗體pab1949-1係包括SEQ ID NO：60的重鏈和SEQ ID NO：20的輕鏈的人類IgG1抗體。
6.1.3.1 藉由生物膜層干涉法的親和性測定
藉由生物膜層干涉法(BLI)確定pab1949-1的親和性。簡言之，使用1xPBS稀釋重組體人類OX40抗原(OX40-Fc，R&D)以獲得1,000μl的0.2μM並且將其添加至96孔板。將pab1949-1在1xPBS中稀釋至濃度50nM。使用1xPBS從50nM溶液中製備pab1949-1的六點連續稀釋物，以獲得在50nM至0.78nM範圍內的抗體 稀釋物，並且將對應抗體連續稀釋物添加至96孔板的每個孔。根據製造商的說明，使用Octet®的16通道模式，在25℃下將傳感物用人類OX40抗原塗覆持續5min，閾值為1.0nm。對於阻斷，將0.5mg/ml的非特異性IgG1抗體培養10分鐘。將包含pab1949-1的連續抗體稀釋物的板置於Octet®儀器上。根據製造商的說明進行測定。分別記錄pab1949-1與OX40抗原的結合和解離3分鐘和10分鐘。使用Octet®資料分析軟體對資料進行分析，並且結果示於表5中。
Figure 105114161-A0202-12-0277-6
6.1.3.2 結合至活化的人類或食蟹猴T細胞的抗體
藉由流動式細胞測量術針對抗OX40抗體pab1949和pab1949-1與人類或食蟹猴OX40的結合特性進行分析。
使用基於磁性的分離(Miltenyi Biotec)，將經由菲柯爾(ficoll)梯度從健康供體血沈棕黃層(血液研究部門(Research Blood Components)，LLC)中分離的人類PBMC富集用於未改變的CD4+和CD8+ T細胞。然後，在推薦的培養條件下，將T淋巴細胞的富集群體用具有500U rIL-2(R&D系統公司)的CD3-CD28膨脹珠粒(Miltenyi Biotec)進行活化3天，並且之後為50U rIL-2。所推薦的培養條件定義如下：在37℃和5% CO2下，將細胞培養在RPMI-1640培養基中，補充有10%胎牛血清、10mM HEPES以及1X Pen/Strep-穀胺醯胺。在活化之後，在4℃下，將細胞與包含CD3(BV711，OKT3)、CD4(BV605，OKT4)、CD8a(BV650，RPA-T8)的綴合抗體以及在FACS緩衝劑(具有2%FBS的PBS)中稀釋的預先綴合的抗OX40抗體或同種型對照(均為Afluor488，10μg/ml)的表面抗體混合物培養持續30分鐘。留出另外的樣品用於單染補償控制(CD45-BV650、CD45-Afluor488、CD45-BV605、以及CD45-BV711)。然後，將細胞用FACS緩衝劑洗滌兩次並且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行分析。使用FACS DIVA與WEHI Weasel軟體的組合分析流動式細胞測量術圖。抗OX40抗體pab1949結合至活化的人類CD4+ T細胞和CD8+ T細胞(圖1A)。
針對結合活化的T細胞，對一系列濃度的pab1949-1進行測試，以表徵劑量應答關係。簡言之，將人類外周血單核細胞(PBMC)解凍並用PBS進行洗滌。用磁珠(Miltenyi Biotec)進行T細胞的陰性分離，並且將純化的T細胞重懸於RPMI+10% FBS中並在37℃和5% CO2下用抗-CD3/抗-CD28珠粒刺激持續72小時。將細胞洗滌並用Fc封閉液(Trustain，生物傳奇公司(Biolegend))在室溫下封閉15分鐘。將細胞再次洗 滌，並在4℃下在黑暗中用pab1949-1的連續稀釋(10至0.00003μg/ml)進行染色45分鐘。將細胞洗滌，並且然後用包括抗CD3異硫氰酸螢光素(FITC)(殖株SP34)和抗CD4亮紫(Brilliant Violet)(BV)510(殖株OKT4)的譜系標誌物抗體與第二抗體一起進行染色，以檢測pab1949-1(抗κIgG PE)。將細胞洗滌，用1.6%多聚甲醛進行固定，並且使用Becton Dickinson Fortessa流式細胞儀進行採集。pab1949-1限制僅結合至刺激的T細胞，而不結合未刺激的T細胞(圖1B)。pab1949-1與活化的人類CD4+ T細胞的結合係劑量依賴性的(圖1C)。
然後，針對pab1949-1的結合，對多個靜止期免疫細胞亞型進行測試。將人類PBMC解凍並用PBS進行洗滌。為了給死細胞染色，添加紅外線(IR)生存染料(viability dye)並且在室溫下避光培養15分鐘。將細胞洗滌，並且用胺染料紅外線(生命技術公司(Life Technologies))在室溫下染色15分鐘。將細胞洗滌並在室溫下進行Fc封閉(Trustain FcX，生物傳奇公司(Biolegend))10分鐘。在洗滌之後，在4℃下，將細胞用1μg/ml的pab1949-1或IgG1同種型對照避光培養30分鐘。將細胞洗滌，並且用二級試劑(抗-Fc F(ab’)PE，傑克遜免疫研究實驗室(Jackson Immune Research Laboratories))進行染色、隨後進行譜系標誌物抗體染色，該染色包括抗-CD3藻紅蛋白菁7(PECy7，殖株SP34.2)、抗-CD8 BV510(殖株SK1)、抗-CD4多甲藻 素-葉綠素-蛋白複合物(PerCP)Cy5(殖株Ly200)、以及抗-CD14 FITC(殖株TUK4)。將細胞洗滌，用1.6%多聚甲醛進行固定，並且使用Becton Dickinson Fortessa流式細胞儀進行採集。如圖1D所示，抗OX40抗體pab1949-1沒有顯示出與CD14+細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD20+ B細胞、或CD3-CD20-細胞可檢出的結合。
為了測試物種交叉反應性，使用活化的食蟹猴(Macaca fascicularis)PBMC進行細胞結合測定。簡言之，在37℃下，在5% CO2增濕的房室中，將能生存的食蟹猴PBMC(Worldwide Primates Inc.)與刀豆凝集素-a(西格瑪-奧德里奇(Sigma Aldrich)，5μg/ml)和重組體IL-2(Miltenyi，20U/ml)在補充有10%熱滅活的FBS的RPMI培養基中進行活化持續3天。在活化之後，將細胞與人Fc受體阻斷劑(生物傳奇公司(Biolegend))在室溫下培養持續15分鐘，以減少非特異性結合。將抗OX40抗體pab1949或人類IgG1同種型對照(10μg/ml)添加至樣品中並在4℃下培養持續30分鐘。在用FACS緩衝劑洗滌一次之後，將包含APC-綴合的抗-人類κ抗體連同特異性針對CD4(BV605，OKT4)和CD8a(PE，RPA-T8)的抗體(均為2.5μg/ml)的抗體混合物稀釋於FACS緩衝劑(PBS，2mM EDTA，0.5% BSA以及pH 7.2)中，將其添加至各個樣品中並在4℃下培養持續30分鐘。在染色之前，留出另外的樣品用於單 染補償控制(犬活性(cyno-reactive)：CD4-BV605、CD4-PE、以及CD4-APC)。將樣品在FACS緩衝劑中洗滌兩次並且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行分析。如圖1E所示，pab1949結合至活化的食蟹猴CD4+ T細胞。
6.1.3.3 OX40抗體選擇性測定
使用懸浮陣列技術作為多重測定，相對於TNFR超家族的其他成員來評價pab1949-1對於OX40的選擇性。使用標準NHS-酯化學，將多個TNFR家族成員化學連接至Luminex®微球上。將pab1949-1的純化材料在測定緩衝液(羅氏(Roche)11112589001)中稀釋至10ng/ml、100ng/ml以及1000ng/ml。簡言之，將每份25μl的稀釋物在黑暗中(20℃，650rpm)與在5μl測定緩衝液中的1500 Luminex®微球在96半孔濾板(密理博(Millipore)，MABVN1250)中培養1小時。將Luminex®微球(路明克斯公司(Luminex Corp)，LC10001-01、LC10005-01、LC10010-01、LC10014-01、LC10015-01、LC10018-01、LC10022-01、LC10026-01、LC10052-01、LC10053-01以及LC10055-01)與重組體人類LTBR-Fc(Acros Biosystems，LTR-H5251)、抗-人類IgG(F(ab)2-特異性，JIR，105-006-097)、重組體人類OX40-Fc(R&D系統公司(R&D systems)，3388-OX)、重組體人類GITR-Fc(R&D，689-GR)、重組體 人類DR6-Fc(SinoBiological，10175-H02H)、重組體人類DR3-Fc(R&D，943-D3)、重組體人類GITR-His(SinoBiological，13643-H08H)、重組體人類TWEAK R-Fc(SinoBiological，10431-H01H)、重組體人類OX40-His(SinoBiological，10481-H08H)、重組體人類4-1BB-His(SinoBiological，10041-H08H)或重組體人類BAFFR-Fc(R&D，1162-BR)經由與COOH珠粒表面偶聯的胺進行偶聯。使用按1：3稀釋系列(0.08-540ng/ml)的一式兩份的25μl的人類IgG1標準品(西格瑪公司(Sigma)，I5154)來生成標準曲線。使用60μl標記有R-PE的山羊抗人類IgGF(ab)2(2.5μg/ml；JIR 109-116-098，AbDSerotec Rapid RPE抗體綴合套組，LNK022RPE)以及再一小時的培養時間(20℃，650rpm)進行檢測。使用Luminex® 200系統(密理博(Millipore))對板進行分析。在48μl樣本體積中，每孔計數總數為100個珠粒。將PE MFI值用於確定與上述重組蛋白的特異性或非特異性結合。
抗體pab1949-1顯示出與人類OX40的特異性結合，並且在檢測濃度下沒有觀察到與其他TNFR家族成員的顯著結合(資料未顯示)。
6.2 實例2：抗OX40抗體的功能表征
此實例證明了，藉由上述方法產生的抗OX40抗體pab1949和pab1949-1起到OX40的激動劑的作用的 能力。對抗體pab1949和pab1949-1進行檢測以確定它們共刺激初代人類CD4+或CD8+ T細胞的能力。此外，將作為人類IgG1抗體的pab1949和pab1949-1分別轉化為人類IgG4抗體pab2044和pab2044-1。抗體pab2044與pab1949具有相同的重鏈可變區和相同的輕鏈，但包括人類IgG4恒定區。抗體pab2044包括SEQ ID NO：61的重鏈序列和SEQ ID NO：50的輕鏈序列。類似於pab1949，pab2044在輕鏈恒定區中包含T109S單個胺基酸取代、不影響抗體結合或功能的保守修飾，以促進選殖。野生型對應物，pab2044-1，在位置109處包含蘇胺酸(根據卡巴特(Kabat)進行編號)，並且包括SEQ ID NO：61的重鏈序列和SEQ ID NO：20的輕鏈序列。類似地，同樣將pab1949和pab1949-1分別轉化為人類IgG2抗體pab2193和pab2193-1。抗體pab2193包括SEQ ID NO：62的重鏈序列和SEQ ID NO：50的輕鏈序列。抗體pab2193-1包括SEQ ID NO：62的重鏈序列和SEQ ID NO：20的輕鏈序列。在一些測定中，對pab1949、pab1949-1、pab2044、pab2044-1、pab2193、或pab2193-1的功能活性進行了檢驗。
在一些測定中，將本發明的抗OX40抗體的激動活性與參考抗體pab1784和pab2045的激動活性進行比較。抗體pab1784係基於美國專利案號7,960,515(藉由引用結合在此)中提供的抗體11D4的可變區而產生的。pab1784的重鏈包括11D4(SEQ ID NO：26)的重鏈可變 區的胺基酸序列和SEQ ID NO：65的人類IgG1恒定區。pab1784的輕鏈包括11D4(SEQ ID NO：24)的輕鏈可變區的胺基酸序列和SEQ ID NO：25的恒定區。
抗體pab2045係基於國際公開案號WO 13/038191(藉由引用結合在此)中提供的抗體20E5的可變區而產生的。pab2045的重鏈包括20E5(SEQ ID NO：30)的重鏈可變區的胺基酸序列和SEQ ID NO：65的人類IgG1恒定區。pab2045的輕鏈包括20E5(SEQ ID NO：28)的輕鏈可變區的胺基酸序列和SEQ ID NO：41的恒定區。
6.2.1 抗OX40抗體對抗CD3刺激的CD4+ T細胞增殖的作用
為了檢驗pab1949對T細胞增殖的作用，使用基於磁性的分離(Stemcell Technologies)，針對未改變的CD4+ T細胞將經由菲柯爾(ficoll)梯度從健康供體血沈棕黃層(血液研究部門(Research Blood Components)，LLC)中分離的人類PBMC富集。藉由監測分裂的細胞中羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)染料的稀釋來確定細胞增殖(柯(Quah)BJ等人，(2007)自然方案(Nat Protoc)，2(9)：2049-56)。在37℃下，將富集的CD4+ T細胞用10μM CellTraceTM CFSE(生命技術公司(Life Technologies))標記7分鐘。在充分洗滌之後，將細胞懸浮於補充有10%熱滅活的 FBS的RPMI1640培養基中，按1 x 106個細胞/ml。將總數為100μl(1 x 105個細胞)接種到用抗CD3抗體(3μg/ml，BD生物科技公司(BD Biosciences))與5μg/ml的pab1949、5μg/ml的IgG1同種型對照、或2μg/ml的抗CD28抗體(BD生物科技公司(BD Biosciences))預包衣的平底96孔板的每個孔中，並且在37℃和5% CO2下進行培養。在第5天，在4℃下，將細胞用0.5μl/孔的標記有PerCP-Cy5.5的抗CD4抗體的在FACS緩衝劑(2% FBS在PBS中)中染色30分鐘，並且藉由LSRFortessa(BD生物科技公司(BD Biosciences))上的流動式細胞測量術來確定CFSE低CD4+細胞的百分比。使用FlowJo對流動式細胞測量術資料進行分析。
使用與如以上所描述的其中將標記有CFSE的CD4+ T細胞接種到用抗CD3抗體(3μg/ml，BD生物科技公司(BD Biosciences))與5μg/ml的pab2044、5μg/ml的IgG4同種型對照(pab2031)、或2μg/ml的抗CD28抗體(BD生物科技公司(BD Biosciences))預包衣的96孔板中類似的測定，對pab2044的活性進行評估。在第5天，藉由流動式細胞測量術來檢驗CFSE低CD4+細胞的百分比。
圖2A和2B係來自由用抗OX40抗體共同刺激誘導的CD4+ T細胞增殖的代表性流動式細胞測量術分析的長條圖，顯示了細胞數目(Y軸)和由標記有CFSE的CD4+ T細胞發射的螢光水平(X軸)。藉由增加的細 胞百分比伴隨由CFSE發射的螢光水平下降，顯示出增強的CD4+ T細胞增殖。該長條圖中指示了CFSE低CD4+細胞的百分比。當添加至用次優濃度的抗CD3抗體活化的細胞中時，pab1949(圖2A)和pab2044(圖2B)，當與板結合時，均誘導CD4+ T細胞增殖。
然後，對pab1949在誘導T細胞增殖中的劑量響應進行測量。使用基於磁性的分離(Stemcell Technologies)，針對未改變的CD4+ T細胞將經由菲柯爾(ficoll)梯度從健康供體血沈棕黃層(血液研究部門(Research Blood Components)，LLC)中分離的PBMC富集。然後，在37℃下，將CD4+ T細胞的富集群體用10μM CellTraceTM CFSE(生命技術公司(Life Technologies))標記持續7min。在充分洗滌之後，將細胞懸浮於補充有10%熱滅活的FBS的RPMI1640培養基中，按1 x 106/ml。將100μl(1 x 105)的細胞接種到用抗CD3抗體(3μg/ml，BD生物科技公司(BD Biosciences))與不同濃度的pab1949或IgG1同種型對照預包衣的平底96孔板的每個孔中，並且在37℃和5% CO2下進行培養。在第4天，在4℃下，將細胞用0.5μl/孔的標記有APC的抗CD4抗體在FACS緩衝劑(2% FBS在PBS中)中染色30分鐘，並且藉由LSRFortessa(BD生物科技公司(BD Biosciences))上的流動式細胞測量術來確定CFSE低CD4+細胞的百分比。
如圖2C所示，抗OX40抗體pab1949能夠在 藥理學上相關的抗體濃度下維持高水平的T細胞增殖。CD4+ T細胞增殖係在0.2μg/ml與20μg/ml之間的pab1949濃度的基本上遞增性的函數(圖2C)。
6.2.2 抗OX40抗體對抗CD3刺激的人類PBMC細胞介素產生的作用
作為抗OX40抗體pab1949和pab1949-1的激動活性的進一步證據，對在次優抗CD3刺激下的細胞介素產生進行測量。
對於細胞內細胞介素染色實驗，將經由菲柯爾(ficoll)梯度從健康供體血沈棕黃層(血液研究部門(Research Blood Components)，LLC)中分離的人類PBMC貯藏於液氮中，並在實驗當天解凍。將細胞重懸於細胞培養基(IL-2的RPMI+10% FBS+20U/mL)中並且將其添加至96孔培養平板中，該培養平板包含不同次優濃度的與板結合的抗CD3抗體，以及5μg/ml的抗OX40抗體pab1949或同種型對照IgG1抗體。在37℃和5% CO2下，將樣品培養3天。在活化之後，為了限制細胞內的蛋白質轉運，根據製造商的說明，將細胞用佈雷菲德菌素A(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行處理，並且在37℃和5% CO2下，將樣品培養6小時。在培養之後，針對死細胞，將細胞用生存胺染料(viability amine dye)(生命技術公司(Life Technologies))染色。在用FACS緩衝劑(PBS，2% FBS，pH 7.2)洗滌之 後，將稀釋於冷FACS緩衝劑中的包含特異性針對CD3(APC Cy7，SP34.2)、CD4(PercP Cy5.5，L200)、以及CD8a(PE Cy7，SK1)的抗體的抗體混合物添加至各個樣品中並在4℃下培養持續10分鐘。將細胞固定，並且根據製造商的說明，將其用Cytofix-Cytoperm(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行透性化用於細胞內染色。將PBMC用特異性針對IFNγ(Alexa647，B27)和TNFα(PE，Mab11)的抗體進行染色，並且在室溫下培養10分鐘。在染色之前，使用單染補償控制，將結合小鼠IgG抗體κ輕鏈的珠粒用用於給細胞染色的抗體進行染色。使用1xPerm-洗滌緩衝液(BD生物科技公司(BD Biosciences))洗滌樣品並且使用FACS Canto流式細胞儀(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行分析。使用Flojo軟體分析流動式細胞測量術圖。
對來自四個不同供體的PBMC進行測試：供體KM、供體TM、供體GS、以及供體SB。對於所有供體，pab1949證明了對人類T細胞的共刺激活性，包括IFNγ+ TNFα+多功能CD4+ T細胞以及CD8+ T細胞以及TNFα+單功能CD4+ T細胞以及CD8+ T細胞(圖3A、3B、以及3C)。在來自供體GS的PBMC中，pab1949也能夠增加IFNγ+單功能T細胞的百分比(圖3B)。
然後，在與上述使用衍生自供體GS的PBMC的細胞的測定類似的次優抗CD3刺激測定中，對抗OX40抗體pab1949-1的劑量滴定進行測試。簡言之，在37℃ 和5% CO2下，將PBMC和與板結合的抗CD3抗體(0.8μg/ml)以及與板結合的pab1949-1或IgG1同種型對照抗體(0、0.3、1、3、6、12、25、或50μg/ml)培養4天。在活化之後，為了限制細胞內的蛋白質轉運，根據製造商的說明，將細胞用佈雷菲德菌素A(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行處理，並且在37℃和5% CO2下，將樣品培養6小時。在培養之後，將細胞用FITC生存胺染料(viability amine dye)(生命技術公司(Life Technologies))染色以區別活細胞和死細胞。在用冷緩衝劑(1xPBS+2% FBS，pH 7.2)洗滌之後，將包含抗CD3(APC Cy7，SP34.2)、抗CD4(PercP Cy5.5，L200)、以及抗CD8a(PE Cy7，SK1)的抗體混合物添加至各個樣品中並在4℃下培養持續10分鐘。將細胞固定，並且根據製造商的說明，將其用Cytofix-Cytoperm(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行透性化用於細胞內染色。將PBMC用抗IFNγ(Alexa647，B27)和抗TNFα(PE，Mab11)抗體進行染色，並且在室溫下培養10分鐘。使用1xPerm-洗滌緩衝液(BD生物科技公司(BD Biosciences))洗滌樣品並且使用FACScanto流式細胞儀(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行採集。使用Flojo軟體分析流動式細胞測量術圖。如圖3D-3F所示，抗OX40抗體pab1949-1證明了共刺激活性並且以劑量依賴性方式增加了TNFα+ CD4+ T細胞、IFNγ+ TNFα+多功能CD8+ T細胞、以及IFNγ+ CD8+ T細胞的 百分比。
使用衍生自上述次優抗CD3刺激測定中額外供體的PBMC的細胞進一步測試pab1949-1劑量範圍的共刺激活性。在0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml下測試抗OX40抗體pab1949-1和IgG1同種型對照抗體。抗OX40抗體pab1949-1始終增加來自多個供體的PBMC中的IFNγ+和/或TNFα+ T細胞的百分比(圖4A-4C)。
值得注意的是，對於來自很多供體的PBMC，由抗OX40抗體pab1949-1誘導的IFNγ+和/或TNFα+ T細胞百分比係抗體濃度在所測試的大範圍抗體濃度內的基本上遞增、性的函數(圖3D-3F和4A-4C)。
為了進一步檢驗抗OX40抗體pab1949的激動活性，對所分泌的細胞介素的數量進行了測量。將經由菲柯爾(ficoll)梯度從健康供體血沈棕黃層(血液研究部門(Research Blood Components)，LLC)中分離的人類PBMC貯藏於液氮中，並在實驗當天解凍。將細胞重懸於細胞培養基(IL-2的RPMI+10% FBS+20U/mL)中並且將其添加至96孔培養平板中，該培養平板包含不同次優濃度的與板結合的抗CD3抗體，以及5μg/ml的抗OX40抗體pab1949或同種型對照IgG1抗體。在37℃和5% CO2下培養樣品，並且在4天(SB#1A)或3天(SB#1B、SB#2、以及GS)後收集細胞培養物上清液。根據製造商的說明，使用V-PLEX Proinflammatory Panel1 (人類)套組(細觀發現公司)對樣品進行測試，用於生產IL-2、TNFα、IL-10、IL-4、以及IL-13。
如圖5A中所描繪，抗OX40抗體pab1949共刺激來自兩個不同供體(供體SB和供體GS)的人類PBMC中的細胞介素產生。在兩個分別的試驗中對來自供體SB的PBMC的細胞介素產生進行了測試：SB#1A和SB#1B顯示來自第一個實驗的結果，其中分別在刺激4天和3天之後測量細胞介素；以及SB#2顯示來自第二個實驗的結果，其中在刺激3天之後測量細胞介素。
然後，使用衍生自與上述測定類似的次優抗CD3刺激測定中的供體GS的PBMC的細胞，對由pab1949-1的劑量滴定誘導的細胞介素分泌進行檢驗。簡言之，在37℃和5% CO2下，將PBMC和與板結合的抗CD3抗體(0.8μg/ml)以及與板結合的pab1949-1或IgG1同種型對照抗體(0、0.3、1、3、6、12、25、或50μg/ml)培養4天。在活化之後，收集細胞培養物上清液，使用人類TH1/TH2 10-Plex組織培養套組(細觀發現公司)用於檢測細胞介素。
如圖5B-5D所示，抗OX40抗體pab1949-1以劑量依賴性方式刺激TNFα、IL-10、以及IL-13產生。
使用衍生自另外供體的PBMC的細胞來進一步證實pab1949-1在誘導細胞介素分泌中的共刺激活性。簡言之，在37℃和5% CO2下，將PBMC和與板結合的抗CD3抗體(0.8ug/ml)以及與板結合的pab1949-1或 IgG1同種型對照抗體(0、0.7、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)培養4天。在活化之後，使用非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司)測量分泌至上清液中的細胞介素量。
對於所測試的所有供體，pab1949-1劑量依賴性地增加了GM-CSF(圖6A-6C)、IL-2(圖7A-7C)、以及TNFβ(圖8A-8C)的分泌。
對於來自很多供體的PBMC，由抗OX40抗體pab1949-1誘導的細胞介素(GM-CSF、IL-2、TNFα、TNFβ、IL-10、以及IL-13)分泌係抗體濃度在大範圍抗體濃度內的基本上遞增性的函數(圖5B-5D、6A-6C、7A-7C、和8A-8C)。
6.2.3 抗OX40抗體在效應T細胞：調節性T細胞共培養測定中的作用
然後，檢驗抗OX40抗體pab1949-1在效應T細胞(Teff)：調節性T細胞(Treg)共培養測定中的活性。簡言之，將經由菲柯爾(ficoll)梯度從健康供體血沈棕黃層(血液研究部門(Research Blood Components)，LLC)中分離的人類PBMC貯藏於液氮中，並在實驗當天解凍。藉由磁珠分離(分別為CD4+CD25+CD127dim/-調節性T細胞分離套組II和Pant T細胞套組，Miltenyi Biotec)來分離調節性T細胞和效應T細胞。然後，藉由用抗-CD3/抗-CD28/抗-CD2珠粒 (Miltenyi Biotec)按1：2(T細胞：珠粒)的比例在細胞培養基(RPMI+10% FBS)中培養使調節性T細胞活化2天。在活化之後，在抗-CD3/抗-CD28/抗-CD2珠粒、可溶或交聯的(使用抗-Fc F(ab’)2，傑克遜免疫研究(Jackson ImmunoResearch))pab1949-1或IgG1同種型對照(10μg/ml)的存在下，將調節性T細胞和效應T細胞按1：3(Treg：Teff)的比例添加至96孔培養平板中。在37℃和5% CO2下，將樣品培養4天。在活化之後，收集上清液，並且使用AlphaLISA®(鉑金埃爾默公司(Perkin Elmer))測量IL-10或IL-2。
在該體外Teff：Treg共培養測定中，抗OX40抗體pab1949-1藉由Treg細胞緩解了Teff細胞群體的抑制，如藉由與同種型處理的細胞相比來自pab1949-1處理的細胞中增強的IL-2產生(圖9A)和降低的IL-10產生(圖9B)所證明。
6.2.4 在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激時，抗OX40抗體對人類PBMC的作用
在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之後，進一步評估了抗OX40抗體pab1949和pab1949-1對初代人類PBMC的功能活性。將在補充有青黴素、鏈黴素以及10%FBS(Hyclone)的RPMI1640中的深冷保存的PBMC(105個細胞/孔)添加至96孔NUNCLON delta平面板(NUNCTM)上。在37℃、5% CO2以及97%濕度下，在 不存在或存在固定濃度(10μg/ml在圖10A和10B中)或不同濃度(20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、以及0.00128μg/ml在圖10C和10D中；50、10、2、0.4、0.08、0.016、以及0.0032μg/ml在圖10E中)的抗OX40抗體或同種型對照以及100ng/ml的SEA(Toxin Technologies)的情況下，培養細胞5天。收集澄清上清液並且在-80℃下儲存直至分析。對於IL-2和IL-10，使用電化學發光(細觀發現公司)生成細胞介素的效價。
抗OX40抗體pab1949在該初代人類PBMC測定中顯示出激動活性，包括IL-2產生(圖10A)和抑制IL-10產生(圖10B)。藉由在10μg/ml下的pab1949增強IL-2產生優於利用參考抗OX40抗體pab1784和pab2045所觀察到的(圖10A)。圖10C、10D、以及10E係來自三個獨立試驗的顯示在用不同濃度的pab1949、pab1949-1、或參考抗體pab1784以及pab2045共同刺激之後，IL-2倍數變化的劑量響應曲線。抗體pab1949和pab1949-1展現出與參考抗體不同的劑量響應關係並且能夠在藥理學上相關的抗體濃度下誘導高水平的IL-2產生。由pab1949或pab1949-1誘導的IL-2產生係抗體濃度在大範圍抗體濃度內的基本上遞增性的函數(例如，在0.032與20μg/ml之間，如圖10C和10D所示，或在0.0032與50μg/ml之間，如圖10E所示)。
然後，在上述初代人類PBMC測定中比較IgG1抗體pab1949-1和IgG2抗體pab2193-1的功能活性。 簡言之，將深冷保存的人類PBMC(血液研究部門(Research Blood Components))按105個細胞/孔置於在96孔NUNCLON delta平面板中補充有NormocinTM(英傑公司(Invivogen)，#ant-nr)和10%熱滅活的FBS(Gibco，英傑公司(Invitrogen Corporation))的RPMI1640培養基中。在37℃、5% CO2以及97%濕度下，將細胞與增加濃度(50、10、2、0.4、0.08、0.016、以及0.0032μg/ml)的pab1949-1、pab2193-1、IgG1同種型對照抗體、或IgG2同種型對照抗體、以及100ng/ml SEA超抗原(拓新科技公司(Toxin Technologies))培養5天。收集澄清上清液並且在-80℃下儲存直至分析。藉由ELISA測量IL-2的濃度。
如圖10F所示，IgG1抗體pab1949-1和IgG2抗體pab2193-1均誘導人類PBMC中的IL-2產生。類似於pab1949-1，pab2193-1也展現出劑量響應關係，其中IL-2產生係抗體濃度的基本上遞增性的函數。
另外，藉由將IgG1抗體pab1949-1與未糖基化的變體pab1949-1-N297A進行比較，檢驗FcγR相互作用在抗OX40抗體pab1949-1的功能活性中的作用。pab1949-1-N297A與pab1949-1共用重鏈可變區和輕鏈序列，但在重鏈恒定區中包括N297A取代(根據EU編號系統進行編號)。
將經由菲柯爾(ficoll)梯度從健康供體血沈棕黃層(血液研究部門(Research Blood Components)， LLC)中分離的人類PBMC貯藏於液氮中，並在實驗當天解凍。將細胞重懸於細胞培養基(RPMI+10%熱滅活的FBS)中並且在37℃以及5% CO2下，用100ng/ml SEA(Toxin Technologies)以及pab1949-1、pab1949-1-N297A、或IgG1同種型對照抗體(0-50μg/ml)的劑量滴定進行培養持續5天。收集上清液，並且然後使用AlphaLISA®(鉑金埃爾默公司(Perkin Elmer))測試IL-2。
如圖10G所示，在SEA刺激時，pab1949-1和pab1949-1-N297A均以劑量依賴性方式誘導人類PBMC中的IL-2產生。存在於天冬醯胺297(N297)處的單個n-聯糖基化位點的關鍵糖基化在pab1949-1-N297A變異體抗體上缺失，由此導致其Fc片段與FcγR結合的缺失。相比於野生型對應物，該變異體抗體展現出降低的激動活性。
6.2.5 激動性抗OX40抗體對OX40 NF-κB-螢光素酶報告子細胞系的作用
使用人類OX40 NF-κB-螢光素酶報告子細胞系測量抗OX40抗體pab1949-1介導T細胞中信號轉導的能力。將使用Jurkat細胞系生成的報告子細胞重懸於測定培養基(RPMI+10% FBS+青黴素/鏈黴素/穀胺酸酯+1μg/ml嘌黴素)中，並且用不同濃度的可溶性pab1949-1(0-6μg/ml)或IgG1同種型對照抗體在存在(複合條 件)或不存在(可溶條件)抗Fc試劑的情況下進行培養。在37℃和5% CO2下，將板培養2小時。在培養之後，在室溫下將板平衡，並且然後添加等體積的室溫Nano-Glo試劑(普洛麥格公司(Promega))。使用EnVision多標記讀取器2100讀取發光。
僅交聯的pab1949-1誘導OX40 NF-κB-螢光素酶報告子細胞系的活化顯著(圖11B)。可溶性pab1949-1誘導報告子細胞系的活化最低，並且IgG1同種型對照抗體沒有誘導可檢測水平的螢光素酶表現(圖11A和11B)。
6.2.6 激動性抗OX40抗體對Fcγ受體IIIA報告子細胞系的作用
在本實例中，使用表現Fcγ受體IIIA的報告子細胞系與表現人類OX40的靶細胞對IgG1抗體pab1949-1和IgG4抗體pab2044-1經由活化Fcγ受體共接合OX40和傳訊的能力進行評價。將過量表現FcγRIIIA(158 V/V多態性)的Jurkat NFAT-螢光素酶報告子細胞(普洛麥格公司(Promega))用作效應細胞。抗體/抗原複合物，其中抗原位於靶細胞的表面，與效應細胞上的FcγRIIIA的結合向啟動子/報告子構建體發信號並且導致螢光素酶基因表現。
將OX40-過量表現細胞(PHA-活化的Hut102細胞)與FcγRIIIA報告子細胞在可溶性pab1949-1、 pab2044-1、IgG1同種型對照、或IgG2同種型對照(0-10μg/ml)的劑量滴定存在下共培養。根據製造商的說明，對報告子細胞的活化進行評估，並且記錄相對光單位(RLU)。ΔRLU計算如下：抗OX40抗體的RLU減去同種型對照的RLU。如圖12A所示，當結合至OX40-表現細胞時，僅IgG1抗體pab1949-1活化FcγRIIIA報告子細胞。
6.2.7 激動性抗OX40抗體對Fcγ受體IIA報告子細胞系的作用
然後，使用表現FcγRIIA(普洛麥格公司(Promega))的報告子細胞系與靶細胞(表現人類OX40的Jurkat細胞)對IgG1抗體pab1949-1和pab1949-1-S267E/L328F連同IgG2抗體pab2193-1經由FcγRIIA共接合OX40和傳訊的能力進行評價。pab1949-1-S267E/L328F與pab1949-1共用重鏈和輕鏈序列，但在重鏈恒定區中包括S267E和L328F取代(根據EU編號系統進行編號)。
將表現具有高親和性131 H/H多態性的FcγRIIA和驅動熒火蟲螢光素酶表現的NFAT應答元件的Jurkat細胞用作效應細胞。簡言之，將25μl的靶細胞(6 x 106個細胞/ml)與25μl的連續稀釋的抗體在96孔白測定板的二重孔中混合。所測試的抗體係pab1949-1、pab1949-1-S267E/L328F、pab2193-1、IgG1同種型對照抗體以及IgG2同種型對照抗體。然後，將25μl的效應細胞 (6 x 106個細胞/ml)添加至每個孔中，從而得到1：1的效應物：靶比值。在37℃和5% CO2下，將板培養20小時。在該培養之後，將Bio-Glo螢光素酶測定試劑(普洛麥格公司(Promega))在室溫下解凍，並且將75μl添加至每個孔中。在5-10分鐘內，使用EnVision多標記微孔板檢測儀(鉑金埃爾默公司(PerkinElmer))測量發光。將本底發光從各個樣品讀數中減去，並且記錄調節的相對光單位(RLU)。
如圖12B所示，當結合至表現OX40的細胞時，IgG2抗體pab2193-1顯示出最強的FcγRIIAH131活化，隨後是pab1949-1-S267E/L328F以及pab1949-1。
6.2.8 抗OX40抗體與調節性T細胞或效應T細胞的相互作用
在本實例中，對藉由活化的自然調節性T細胞(nTreg)和效應T細胞(Teff)表現人類OX40進行了檢驗。使用基於磁性的分離，針對未改變的CD3+ T細胞(Teff)或CD4+ CD25+ CD45RA+ T細胞(nTregs)將從健康供體中分離出的PBMC富集。將T淋巴細胞用抗-CD3/CD28偶聯的珠粒與500U rIL-2活化4天，並且與50U rIL-2再活化4天。在活化8天之後，收穫T細胞，並且在4℃下，用死細胞/活細胞可固定的Near-IR死細胞染色在PBS中進行染色20分鐘。將包含針對CD4(BV605，OKT4)、CD8a(BV650，RPA-T8)、CD127 (BV421，AO1905)、CD25(APC，M-A251)、以及OX-40(PE，ACT35)的、稀釋於緩衝劑(具有2% FBS的PBS)中的綴合抗體的表面抗體混合物添加至各個樣品中並在4℃下培養持續30分鐘。然後，將細胞用緩衝劑洗滌並固定並且用胞內抗體混合物進行染色，該胞內抗體混合物包含稀釋於緩衝劑中的針對CD3(BV711，OKT3)以及Foxp3(AF488，PCH101)的綴合抗體。對於OX40，使用小鼠抗人類IgG1-PE同種型對照，將來自各個T細胞群體的一個樣品也用螢光負一型(fluorescence minus one)(FMO)對照進行染色。藉由流動式細胞測量術對樣品進行分析。根據製造商的說明，同時運作PE-綴合的Quantibrite珠粒並且用於量化OX40受體密度。
如圖13A所示，人類OX40在活化的nTreg細胞上的表面表現高於其在活化的CD4+或CD8+效應T細胞上的表面表現。
在類似的研究中，將來自兩個供體的活化的nTreg以及Teff用商業抗OX40抗體(BER-ACT35殖株)或同種型對照抗體進行染色並且藉由流動式細胞測量術進行分析。Δ平均螢光強度(Δ MFI)代表抗OX40抗體的MFI減去同種型對照的MFI。結果示於圖13B中。
然後，使用上述表現Fcγ受體IIIA(FcγRIIIA)的報告子細胞系與如上生成的活化的效應T細胞(Teff)或nTreg細胞，對抗OX40抗體pab1949經 由活化Fcγ受體共接合OX40和傳訊的能力進行評價。將抗OX40抗體pab1949或IgG1同種型對照用起始終濃度為10μg/ml的3倍稀釋物進行連續稀釋。在二重孔中，將25μl的各個抗體稀釋物添加至Teff或nTreg細胞中。將過量表現FcγRIIIA(158 V/V多態性)的Jurkat NFAT-螢光素酶報告子細胞按1：1的效應物一靶比值添加。將板培養20小時，並且然後使用Bio-Glo螢光素酶測定試劑(普洛麥格公司(Promega))進行分析。將本底發光(空白外孔)從各個樣品讀數中減去，並且記錄調節的相對光單位(RLU)。Δ RLU示於圖13C中，其代表抗OX40抗體的RLU減去同種型對照的RLU。
使用輕度修飾的實驗方案，重複圖13C中所描繪的研究。簡言之，將來自健康志願者的血沈棕黃層(血液研究部門(Research Blood Components))用於分離初代調節性T細胞和效應T細胞。藉由磁珠分離將兩個T細胞亞群純化(分別為CD4+CD25+CD127dim/-調節性T細胞分離套組II和Pant T細胞套組，Miltenyi Biotec)，並且然後藉由將細胞與抗-CD3/抗-CD28/抗-CD2珠粒(Miltenyi Biotech)以1：4的比例(T細胞：珠粒)在細胞培養基(RPMI+10%FBS)中培養進行活化7天。將活化的Treg細胞或Teff細胞與上述表現FcγRIIIA的Jurkat NFAT-螢光素酶報告子細胞(普洛麥格公司(Promega))在可溶性pab1949-1或IgG1同種型對照抗體(0-10μg/ml)的劑量滴定存在下共培養。根據製造商 的說明，對報告子細胞的活化進行評估，並且Δ RLU示於圖13D中。
與活化的nTreg和活化的CD4+或CD8+效應T細胞之間的差異表面OX40表現一致(圖13A和13B)，抗OX40抗體pab1949(圖13C)和pab1949-1(圖13D)較佳的是標記的活化的nTreg細胞，由此誘導在報告子細胞系中的FcγRIIIA依賴性信號轉導。
為了評價OX40過量表現是否是位於腫瘤微環境之內的調節性T細胞的特徵，比較在分離自健康人類供體血液(圖14A，a-c，n=3)或分離自非小細胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織(圖14A，d-f，n=3)的T細胞上的OX40表現。為了消除抗體與免疫群體的本底結合，在添加細胞表面和胞內抗體之前，將所有細胞用純化的CD16/32抗體培養(10μg/ml，在室溫下20分鐘)。在FcR-封閉之後，將所有樣品用APC-綴合的抗OX40抗體(殖株Ber-ACT35)或同種型對照以及細胞表面抗體譜系混合物(CD3-FITC、CD25-PECy7、CD4-BV650以及CD8a-PE)在冰上培養45分鐘(每個1μg/ml)，用FACS緩衝劑(PBS、EDTA以及0.5% BSA)洗滌三次，隨後固定/透化並且用太平洋藍綴合的FOXP3(在冰上固定/透化以及培養各自45分鐘，1μg/ml)培養。然後，使用LSRFortessa流式細胞儀(BD生物科技公司(BD Biosciences))分析染色的樣品。將圖14A中的細胞群體定義如下：Tconv(CD3+、CD4+、CD8a-、CD25低、 FOXP3-)或Treg(CD3+、CD4+、CD8a-、CD25高、FOXP3+)。
如圖14A所示，OX40表面表現在分離自NSCLC患者腫瘤組織的調節性T細胞上最高，而在來自健康供體的Treg或常規T細胞上有很低或沒有可檢測水平。
對於其他腫瘤類型，進行類似的分析。簡言之，將冷凍、解離的腫瘤樣品(Conversant)或PBMC在AutoMACS水洗溶液(洗滌緩衝液，Miltenyi Biotec)中解凍，並且在細胞表面染色之前，將細胞進行Fc-封閉(Trustain FcX，生物傳奇公司(Biolegend))。將細胞用洗滌緩衝液進行洗滌並且在下4℃用譜系標誌物抗體進行染色45分鐘，該等譜系標誌物抗體包括抗-CD3(殖株SP34)、抗-CD4(殖株OKT4)、抗-CD8(殖株SK1)、抗-CD25(殖株MA-251)、以及抗-OX40(殖株BER-ACT35)。根據製造商的說明，洗滌細胞並且用叉頭框P3(FOXP3)/轉錄因數染色緩衝液組(eBioscience)進行透性化。在透化之後，將細胞用抗-FOXP3 eFluor450(殖株PCH101，eBioscience)進行染色。使用BD生物科技公司(BD Biosciences)Fortessa流式細胞儀採集染色的樣品，並且使用Flojo軟體分析資料。
來自多種腫瘤類型(包括卵巢癌、結腸癌(CRC)、子宮內膜癌、腎細胞癌(RCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)以及乳癌)的樣品證明了在與腫瘤相關的調 節性T細胞中的OX40表現高於在與腫瘤相關的效應T細胞中的表現(圖14B、14C、以及14D)。
6.2.9 抗OX40抗體對抗CD3刺激的食蟹猴PBMC細胞介素產生的作用
然後，使用次優抗CD3刺激測定，對抗OX40抗體pab1949-1對食蟹猴PBMC的激動活性進行檢驗。簡言之，將冷凍的食蟹猴PBMC(全球靈長動物公司(World Wide Primates))貯藏於液氮中，並在實驗當天解凍。將細胞重懸於細胞培養基(IL-2的RPMI+10% FBS+20U/ml)中，並且在37℃和5% CO2下，將其和與板結合的抗CD3抗體(0.8μg/ml)以及與板結合的pab1949-1或IgG1同種型對照抗體(0、0.8、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)培養4天。收集細胞培養物上清液，並且使用非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司)對所分泌的細胞介素進行檢驗。
抗OX40抗體pab1949-1劑量依賴性地增強了GM-CSF(圖15A和15B)、IL-17(圖16A和16B)、TNFβ(圖17A和17B)、IL-5(圖18A和18B)、以及IL-10(圖19A和19B)在多個食蟹猴的PBMC中的產生。
6.2.10 在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激時，抗OX40抗體對食蟹猴PBMC的作用
在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之後，進一步分析了pab1949-1共刺激食蟹猴PBMC的能力。將冷凍的食蟹猴PBMC(全球靈長動物公司(World Wide Primates))貯藏於液氮中，並在實驗當天解凍。將細胞重懸於細胞培養基(RPMI+10%熱滅活的FBS)中並且在37℃以及5% CO2下，用SEA抗原(100ng/ml)連同pab1949-1或IgG1同種型對照抗體(0、0.8、1.6、3.1、6.3、12.5、25、或50μg/ml)的劑量滴定進行培養持續5天。在活化之後，收集細胞培養物上清液，並且使用非人類靈長動物(NHP)V-Plex測定套組(細觀發現公司)對所分泌的鈀胞介素進行檢驗。
如圖20A和20B所示，抗OX40抗體pab1949-1增加了來自兩個供體的食蟹猴PBMC中的IL-2產生。
6.3 實例3：抗OX40抗體的表位作圖
在本實例中，藉由丙胺酸掃描對pab1949和參考抗OX40抗體pab1928的表位進行了分析。抗體pab1928係基於美國專利公開案號US 2013/0280275(藉由引用結合在此)中提供的抗體Hu106-122的可變區而產生的。pab1928的重鏈包括Hu106-122(SEQ ID NO：56)的重鏈可變區的胺基酸序列和SEQ ID NO：65的人類IgG1恒定區。pab1928的輕鏈包括Hu106-122(SEQ ID NO：57)的輕鏈可變區的胺基酸序列和SEQ ID NO：25的 恒定區。因此，重鏈包括SEQ ID NO：72的胺基酸序列並且輕鏈包括SEQ ID NO：59的胺基酸序列。
6.3.1 表位作圖-丙胺酸掃描
藉由丙胺酸掃描，對pab1949-1和參考抗體pab1928的結合特性進行測定。簡言之，將來自安捷倫技術公司(Agilent Technologies)(G590lA)的快速變化HT蛋白質工程系統(QuikChange HT Protein Engineering System)用於生成在胞外域中具有丙胺酸取代的人類OX40突變體。使用標準轉染技術，隨後如以上所描述的轉導，使人類OX40突變體在1624-5細胞的表面表現。
對表現正確折疊的人類OX40突變體的細胞，如藉由在流動式細胞測量術中結合多株抗OX40抗體所證明，進行進一步選擇表現人類OX40突變體、不結合單株抗OX40抗體pab1949-1或pab1928的亞群。藉由製備型、高速FACS(FACSAriaII，BD生物科技公司(BD Biosciences))將展現出特異性抗體結合的細胞從非結合細胞群體中分離。在組織培養中再次擴張抗體反應性或非反應性細胞池，由於逆轉錄病毒轉導細胞的穩定表現表型，重複抗體定向的細胞分選和組織培養擴增的循環，直到獲得明顯可檢測的抗OX40抗體(pab1949-1或pab1928)非反應性細胞群體的點處。使抗OX40抗體非反應性細胞群體經歷最終的單細胞分選步驟。在若干天的細胞擴增之後，使用流動式細胞測量術，針對結合多株抗 OX40抗體以及不結合單株抗體pab1949-1或pab1928，再次測試單細胞分選的細胞。簡言之，將表現個體人類OX40丙胺酸突變體的1624-5細胞與單株抗OX40抗體pab1949-1或pab1928進行培養。對於每種抗體，測試了兩種抗體濃度(pab1949-1：2μg/ml和0.5μg/ml；pab1928：1.1μg/ml和0.4μg/ml)。將與APC綴合的多株抗OX40抗體(AF3388，R&D系統公司(R&D systems))以1：2000進行稀釋。添加FC受體封閉(1：200；BD目錄號553142)，並且在4℃下，將樣品培養20分鐘。在洗滌之後，對於檢測如果有必要(PE-綴合的；BD目錄號109-116-097)，則在4℃下，將細胞用第二抗IgG抗體培養20min。然後，洗滌細胞，並且使用流式細胞儀(BD生物科技公司(BD Biosciences))進行採集。
為了將表型(多株抗OX40抗體+、單株抗OX40抗體-)與基因型聯繫起來，對單細胞分選的人類OX40突變體進行測序。圖21係顯示仍然結合多株抗OX40抗體但不結合單株抗OX40抗體pab1949-1或pab1928的人類OX40丙胺酸突變體的表。所有殘基係根據人類OX40的成熟胺基酸序列(SEQ ID NO：55)進行編號的。基於流動式細胞測量術分析，“+”表示結合，而“-”表示缺少結合。
***
本發明不被在此說明的具體實施方式限於一 定的範圍。確實，從以上說明和附圖，除了所描述的內容以外，本發明的不同修改對於熟習該項技術者而言也都將變得很清楚。這類改變旨在落入所附申請專利範圍的範圍內。
出於所有的目的，本文所引用的全部參考文獻(例如，出版物或專利或專利申請)藉由引用以其全文結合在此，並且這達到如同每個單獨的參考文獻(例如，出版物或專利或專利申請)具體地或單獨地指明出於所有目的藉由引用以其全文而結合的相同的程度。
其他實施方式在以下申請專利範圍的範圍內。
<110> 美商阿格納公司(Agenus Inc.) 盧德威格癌症研究協會(Ludwig Institute for Cancer Research Ltd.) 紀念斯隆凱特琳癌症中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)
<120> 抗OX40抗體及其使用方法
<140> TW 105114161
<141> 2016-05-06
<150> US 62/323,458
<151> 2016-04-15
<150> US 62/262,373
<151> 2015-12-02
<150> US 62/161,198
<151> 2015-05-13
<150> US 62/158,515
<151> 2015-05-07
<160> 72
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 23
Figure 105114161-A0202-12-0321-35
Figure 105114161-A0202-12-0322-36
Figure 105114161-A0202-12-0323-37
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Figure 105114161-A0202-12-0323-38
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Figure 105114161-A0202-12-0324-40
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Figure 105114161-A0202-12-0324-39
Figure 105114161-A0202-12-0325-41
<210> 27
<400> 27 000
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Figure 105114161-A0202-12-0325-42
Figure 105114161-A0202-12-0326-43
<210> 29
<400> 29 000
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Figure 105114161-A0202-12-0326-44
<210> 31
<400> 31 000
<210> 32
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵(MISC_FEATURE)
<222> (97)..(97)
<223> 可以是賴胺酸或精氨酸
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (239)..(239)
<223> 可以是天冬胺酸或谷胺酸
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (241)..(241)
<223> 可以是亮胺酸或甲硫胺酸
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (314)..(314)
<223> 可以是甘胺酸或丙胺酸
<400> 32
Figure 105114161-A0202-12-0327-45
Figure 105114161-A0202-12-0328-46
Figure 105114161-A0202-12-0329-47
<210> 33
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Figure 105114161-A0202-12-0329-48
Figure 105114161-A0202-12-0330-49
<210> 34
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Figure 105114161-A0202-12-0330-50
Figure 105114161-A0202-12-0331-51
Figure 105114161-A0202-12-0332-52
<210> 35
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Figure 105114161-A0202-12-0332-53
Figure 105114161-A0202-12-0333-54
Figure 105114161-A0202-12-0334-55
<210> 36
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
Figure 105114161-A0202-12-0334-56
Figure 105114161-A0202-12-0335-57
<210> 37
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Figure 105114161-A0202-12-0335-58
Figure 105114161-A0202-12-0336-59
Figure 105114161-A0202-12-0337-60
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (46)..(46)
<223> 可以是纈胺酸或丙胺酸
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (84)..(84)
<223> 可以是亮胺酸或纈胺酸
<400> 38
Figure 105114161-A0202-12-0337-61
Figure 105114161-A0202-12-0338-62
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Figure 105114161-A0202-12-0338-63
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Figure 105114161-A0202-12-0339-64
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Figure 105114161-A0202-12-0339-65
Figure 105114161-A0202-12-0340-66
<210> 42
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Figure 105114161-A0202-12-0340-67
Figure 105114161-A0202-12-0341-68
<210> 43
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Figure 105114161-A0202-12-0341-69
Figure 105114161-A0202-12-0342-70
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Figure 105114161-A0202-12-0342-71
<210> 45
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Figure 105114161-A0202-12-0342-72
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
Figure 105114161-A0202-12-0342-73
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
Figure 105114161-A0202-12-0343-74
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
Figure 105114161-A0202-12-0343-75
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
Figure 105114161-A0202-12-0343-76
<210> 50
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
Figure 105114161-A0202-12-0343-77
Figure 105114161-A0202-12-0344-78
<210> 51
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
Figure 105114161-A0202-12-0344-79
Figure 105114161-A0202-12-0345-80
Figure 105114161-A0202-12-0346-81
<210> 52
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
Figure 105114161-A0202-12-0347-82
Figure 105114161-A0202-12-0348-83
Figure 105114161-A0202-12-0349-84
<210> 53
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
Figure 105114161-A0202-12-0349-85
Figure 105114161-A0202-12-0350-86
<210> 54
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
Figure 105114161-A0202-12-0351-87
Figure 105114161-A0202-12-0352-88
<210> 55
<211> 249
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Figure 105114161-A0202-12-0352-89
Figure 105114161-A0202-12-0353-90
<210> 56
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
Figure 105114161-A0202-12-0353-91
Figure 105114161-A0202-12-0354-92
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
Figure 105114161-A0202-12-0354-93
Figure 105114161-A0202-12-0355-94
<210> 58
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
Figure 105114161-A0202-12-0355-95
Figure 105114161-A0202-12-0356-96
Figure 105114161-A0202-12-0357-97
<210> 59
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
Figure 105114161-A0202-12-0357-98
Figure 105114161-A0202-12-0358-99
<210> 60
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
Figure 105114161-A0202-12-0358-100
Figure 105114161-A0202-12-0359-101
Figure 105114161-A0202-12-0360-102
<210> 61
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
Figure 105114161-A0202-12-0361-103
Figure 105114161-A0202-12-0362-104
Figure 105114161-A0202-12-0363-105
<210> 62
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
Figure 105114161-A0202-12-0363-106
Figure 105114161-A0202-12-0364-107
Figure 105114161-A0202-12-0365-108
<210> 63
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
Figure 105114161-A0202-12-0365-109
Figure 105114161-A0202-12-0366-110
Figure 105114161-A0202-12-0367-112
<210> 64
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (97)..(97)
<223> X是K或R
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (239)..(239)
<223> X是D或E
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (241)..(241)
<223> X是L或M
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (314)..(314)
<223> X是G或A
<400> 64
Figure 105114161-A0202-12-0367-113
Figure 105114161-A0202-12-0368-114
Figure 105114161-A0202-12-0369-115
<210> 65
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
Figure 105114161-A0202-12-0369-116
Figure 105114161-A0202-12-0370-117
Figure 105114161-A0202-12-0371-118
<210> 66
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
Figure 105114161-A0202-12-0371-119
Figure 105114161-A0202-12-0372-120
<210> 67
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Figure 105114161-A0202-12-0373-121
Figure 105114161-A0202-12-0374-122
<210> 68
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
Figure 105114161-A0202-12-0374-123
Figure 105114161-A0202-12-0375-124
Figure 105114161-A0202-12-0376-125
<210> 69
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
Figure 105114161-A0202-12-0376-126
Figure 105114161-A0202-12-0377-127
<210> 70
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
Figure 105114161-A0202-12-0378-128
Figure 105114161-A0202-12-0379-129
<210> 71
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 71
Figure 105114161-A0202-12-0379-130
Figure 105114161-A0202-12-0380-131
Figure 105114161-A0202-12-0381-132
<210> 72
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 72
Figure 105114161-A0202-12-0381-133
Figure 105114161-A0202-12-0382-134
Figure 105114161-A0202-12-0383-135

Claims (76)

  1. 一種特異性結合人類OX40的分離之抗體，該抗體包括：(a)重鏈可變區，該重鏈可變區包括：包括SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)；包括SEQ ID NO：5的胺基酸序列的重鏈CDR2；及包括SEQ ID NO：6的胺基酸序列的重鏈CDR3；和(b)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包括：包括SEQ ID NO：1的胺基酸序列的輕鏈CDR1；包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列的輕鏈CDR2；及包括SEQ ID NO：3的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該重鏈可變區包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體包括重鏈，該重鏈包括選自由SEQ ID NO：60至63所組成的群組的胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該輕鏈可變區包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體包括輕鏈，該輕鏈包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，該抗體包括：(a)重鏈可變區，該重鏈可變區包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；和(b)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之抗體，其中該抗體包括：(a)重鏈，該重鏈包括SEQ ID NO：60的胺基酸序列；和(b)輕鏈，該輕鏈包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之抗體，其中該抗體包括：(a)重鏈，該重鏈包括SEQ ID NO：61的胺基酸序列；和(b)輕鏈，該輕鏈包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之抗體，其中該抗體包括：(a)重鏈，該重鏈包括SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63的胺基酸序列；和(b)輕鏈，該輕鏈包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之抗體，該抗體進一 步包括重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之抗體，其中該重鏈恒定區選自由下述組成之群組：人類免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之抗體，其中該IgG1係非岩藻糖基化的IgG1。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之抗體，其中該IgG1的胺基酸序列包括N297A突變或選自由D265A、P329A及彼等之組合所組成的群組的突變。
  14. 如申請專利範圍第11項所述之抗體，其中該IgG1的胺基酸序列包括N297Q突變。
  15. 如申請專利範圍第11項所述之抗體，其中該IgG4的胺基酸序列包括S228P突變。
  16. 如申請專利範圍第11項所述之抗體，其中該IgG2的胺基酸序列包括C127S突變。
  17. 如申請專利範圍第11項所述之抗體，其中該重鏈恒定區包括選自由SEQ ID NO：64至71所組成的群組的胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第10項所述之抗體，其中該輕鏈恒定區選自由下述組成之群組：人類κ輕鏈恒定區和人類λ輕鏈恒定區。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體係人抗體。
  20. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗 體，其中該抗體係激動性的。
  21. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體活化、增強或誘導人類OX40的活性。
  22. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體誘導CD4+ T細胞增殖。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之抗體，其中該CD4+ T細胞增殖係該抗體的濃度的基本上遞增性的函數。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之抗體，其中該CD4+ T細胞增殖顯示S形劑量響應曲線。
  25. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體藉由抗-CD3-刺激的外周血單核細胞(PBMC)誘導TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13或彼等之組合的產生。
  26. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體藉由抗-CD3-刺激的PBMC誘導TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10或IL-13的產生，其中TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10或IL-13的產生係該抗體的濃度的基本上遞增性的函數。
  27. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體藉由抗-CD3-刺激的PBMC誘導TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10或IL-13的產生，其中TNFα、TNFβ、IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-10或IL-13的產生顯示S形劑量響應曲線。
  28. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體藉由SEA-刺激的外周血單核細胞(PBMC)誘導IL-2產生且藉由SEA-刺激的PBMC抑制IL-10產生。
  29. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體藉由SEA-刺激的PBMC誘導IL-2產生，其中IL-2產生係該抗體的濃度的基本上遞增性的函數。
  30. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體藉由SEA-刺激的PBMC誘導IL-2產生，其中IL-2產生顯示S形劑量響應曲線。
  31. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體藉由調節性T細胞緩解T效應細胞的抑制。
  32. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體藉由T效應細胞和調節性T細胞的共培養誘導IL-2產生且藉由T效應細胞和調節性T細胞的共培養抑制IL-10產生。
  33. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，該抗體進一步包括可檢測標籤。
  34. 一種分離之核酸分子，該核酸分子編碼如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體的重鏈可變區或重鏈。
  35. 一種分離之核酸分子，該核酸分子編碼如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體的輕鏈可變區或 輕鏈。
  36. 一種分離之核酸分子，該核酸分子編碼如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體的重鏈可變區或重鏈及如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體的輕鏈可變區或輕鏈。
  37. 如申請專利範圍第34或36項所述之分離之核酸分子，其中該核酸分子編碼重鏈可變區，該重鏈可變區包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列。
  38. 如申請專利範圍第35或36項所述之分離之核酸分子，其中該核酸分子編碼輕鏈可變區，該輕鏈可變區包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
  39. 一種分離之載體，該載體包括如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子。
  40. 一種宿主細胞，該宿主細胞包括如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子、如申請專利範圍第39項所述之載體、或第一載體及第二載體，該第一載體包括如申請專利範圍第34或37項所述之核酸分子且該第二載體包括如申請專利範圍第35或38項所述之核酸分子。
  41. 如申請專利範圍第40項所述之宿主細胞，該宿主細胞選自由下述組成之群組：大腸桿菌、假單孢菌屬、芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬、酵母菌、CHO、YB/20、NS0、PER-C6、HEK-293T、NIH-3T3、海拉(HeLa)、BHK、Hep G2、SP2/0、R1.1、B-W、L-M、COS 1、COS 7、BSC1、 BSC40、BMT10細胞、植物細胞、昆蟲細胞及組織培養中的人類細胞。
  42. 一種產生結合人類OX40的抗體之方法，該方法包括培養如申請專利範圍第40或41項所述之宿主細胞，使得該核酸分子得以表現且該抗體得以產生。
  43. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包括如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體及藥學上可接受的賦形劑。
  44. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包括如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子、如申請專利範圍第39項所述之載體或如申請專利範圍第40或41項所述之宿主細胞及藥學上可接受的賦形劑。
  45. 一種如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子、如申請專利範圍第39項所述之載體、如申請專利範圍第40或41項所述之宿主細胞或如申請專利範圍第43或44項所述之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於調節個體的免疫應答。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之用途，其中調節免疫應答包括增強或誘導該個體的免疫應答。
  47. 一種如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子、如申請專利範圍第39項所述之載體、如申請專利 範圍第40或41項所述之宿主細胞或如申請專利範圍第43或44項所述之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於增強個體的T細胞擴增和T細胞效應物功能。
  48. 一種如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子、如申請專利範圍第39項所述之載體、如申請專利範圍第40或41項所述之宿主細胞或如申請專利範圍第43或44項所述之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於治療個體的癌症。
  49. 如申請專利範圍第48項所述之用途，其中該癌症選自由下述組成之群組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、結腸癌及肺癌。
  50. 如申請專利範圍第48項所述之用途，該藥物進一步包括吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)的抑制劑。
  51. 如申請專利範圍第50項所述之用途，其中該抑制劑選自由下述組成之群組：依帕卡朵絲坦(epacadostat)、F001287、印朵目德(indoximod)及NLG919。
  52. 如申請專利範圍第51項所述之用途，其中該抑制劑係依帕卡朵絲坦。
  53. 如申請專利範圍第51項所述之用途，其中該抑制劑係F001287。
  54. 如申請專利範圍第51項所述之用途，其中該抑制劑係印朵目德。
  55. 如申請專利範圍第51項所述之用途，其中該抑制 劑係NLG919。
  56. 如申請專利範圍第48項所述之用途，該藥物進一步包括疫苗。
  57. 如申請專利範圍第56項所述之用途，其中該疫苗包括熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)，該複合物包括與抗原肽複合的熱休克蛋白。
  58. 如申請專利範圍第57項所述之用途，其中該熱休克蛋白係gp96蛋白且與腫瘤相關抗原肽複合，其中該HSPPC源自於得自該個體的腫瘤。
  59. 如申請專利範圍第57項所述之用途，其中該熱休克蛋白係hsp70或hsc70蛋白且與腫瘤相關抗原肽複合。
  60. 如申請專利範圍第45至59項中任一項所述之用途，其中該個體係人類。
  61. 一種檢測樣品中OX40之方法，該方法包括使所述樣品與如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體接觸。
  62. 一種套組，該套組包括如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子、如申請專利範圍第39項所述之載體、如申請專利範圍第40或41項所述之宿主細胞或如申請專利範圍第43或44項所述之醫藥組成物及a)檢測試劑、b)OX40抗原、c)反映批准用於人類給藥使用或銷售之標識、或d)彼等之組合。
  63. 如申請專利範圍第10、11及18項中任一項所述 之抗體，其中該抗體包括人類免疫球蛋白IgG1重鏈恒定區，且其中該IgG1重鏈恒定區的胺基酸序列包括選自由N297A、N297Q、D265A及彼等之組合所組成的群組的突變或選自由D265A、P329A及彼等之組合所組成的群組的突變。
  64. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中相對於該抗體與SEQ ID NO：55的人類OX40序列之間的結合，該抗體與OX40變體之間的結合實質減弱，且其中該OX40變體包括SEQ ID NO：55的序列，唯存有選自由N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A及彼等之組合所組成的群組的胺基酸突變。
  65. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中相較於與SEQ ID NO：55的人類OX40序列的結合，該抗體顯現與下述蛋白質降低的結合或不結合：該蛋白質與SEQ ID NO：55相同，唯存有選自由N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A及彼等之組合所組成的群組的胺基酸突變。
  66. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體特異性結合人類OX40序列的表位，該表位包括SEQ ID NO：55的選自由位置60、62、80、88、93、99、115及彼等之組合所組成的群組的殘基。
  67. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體特異性結合SEQ ID NO：55的至少一個殘基，該至少一個殘基選自由殘基60、62、80、88、93、 99、115及彼等之組合所組成的群組。
  68. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體特異性結合SEQ ID NO：55的殘基58、60、62、80、88、93、99及115。
  69. 如申請專利範圍第64項所述之抗體，其中該抗體包括人類免疫球蛋白IgG1重鏈恒定區，且其中該IgG1重鏈恒定區的胺基酸序列包括選自由N297A、N297Q、D265A及彼等之組合所組成的群組的突變或選自由D265A、P329A及彼等之組合所組成的群組的突變。
  70. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之抗體，其中該抗體選自由下述組成之群組：Fab、Fab’、F(ab’)2及scFv片段。
  71. 一種如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子、如申請專利範圍第39項所述之載體、如申請專利範圍第40或41項所述之宿主細胞或如申請專利範圍第43或44項所述之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於治療個體的自身免疫性或炎性疾病或病症。
  72. 如申請專利範圍第71項所述之用途，其中該疾病或病症選自由下述組成之群組：移植排斥、血管炎、氣喘、類風濕關節炎、皮膚炎、炎性腸病、葡萄膜炎及狼瘡。
  73. 如申請專利範圍第71至72項中任一項所述之用途，其中該個體係人類。
  74. 一種如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第34至38項中任一項所述之核酸分子、如申請專利範圍第39項所述之載體、如申請專利範圍第40或41項所述之宿主細胞或如申請專利範圍第43或44項所述之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於治療個體的傳染性疾病。
  75. 如申請專利範圍第48項所述之用途，該藥物進一步包括檢查點靶向劑。
  76. 如申請專利範圍第75項所述之用途，其中該檢查點靶向劑選自由下述組成之群組：拮抗劑抗PD-1抗體、拮抗劑抗PD-L1抗體、拮抗劑抗PD-L2抗體、拮抗劑抗CTLA-4抗體、拮抗劑抗TIM-3抗體、拮抗劑抗LAG-3抗體、拮抗劑抗CEACAM1抗體、促效劑抗GITR抗體、促效劑抗CD137抗體及促效劑抗OX40抗體。
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