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MX2011008697A - Moleculas de anticuerpos que tiene especificidad para ox40 humano. - Google Patents

Moleculas de anticuerpos que tiene especificidad para ox40 humano.

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Publication number
MX2011008697A
MX2011008697A MX2011008697A MX2011008697A MX2011008697A MX 2011008697 A MX2011008697 A MX 2011008697A MX 2011008697 A MX2011008697 A MX 2011008697A MX 2011008697 A MX2011008697 A MX 2011008697A MX 2011008697 A MX2011008697 A MX 2011008697A
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MX
Mexico
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seq
antibody
cdr
human
sequence
Prior art date
Application number
MX2011008697A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew George Popplewell
Alastair David Griffiths Lawson
Yi Zhang
Andrew Malcom Nesbitt
Stephen Graham Shaw
Diana Shpektor
Original Assignee
Ucb Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42634416&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2011008697(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ucb Pharma Sa filed Critical Ucb Pharma Sa
Publication of MX2011008697A publication Critical patent/MX2011008697A/es

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Abstract

La invención se refiere a moléculas de anticuerpos que tienen especificidad para determinantes antigénicos de 0X40 humano, usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpos y métodos para producir las moléculas de anticuerpos.

Description

MOLÉCULAS DE ANTICUERPOS QUÉ TIENE ESPECIFICIDAD PARA OX40 HUMANO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos que tienen especificidad para determinantes antigénicos de OX40 y composiciones que comprenden las mismas. La presente invención también se refiere a los usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpos, composiciones y métodos para producir las moléculas de anticuerpos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN OX40 (también conocido como CD134, TNFRSF4 , ACT35 o TXGP1L) es un miembro' de la superfamilia del receptor TN F, que incluye 4-1BB, CD27, CD30 y CD40. El dominio enlazado de ligando extracelular de OX40 está compuesto de 3 dominios ricos en cisteina completos (CRDs, por sus siglas en inglés) y un CRD de cuatro terminal C, parcial (Bodmer et al., 2002, Trends Biochem Sci, 27, 19-26) .
El ligando para OX40 es OX40L y 3 copias , de OX40 enlazadas al ligando trimérico para formar el complejo OX40-OX40L (Compaan y Hymowitz, 2006,- Structure, 14, 1321-1330) . El OX40 es un receptor de enlace a la membrana; sin embargo una isoforma soluble también se ha detectado (Taylor y Schwarz, 2001, J. Immunol . Methods, 255, 67-72). La importancia funcional de la forma soluble se desconoce actualmente. El OX40 no se expresa en células T en reposo, pero se expresa transitoriamente en células T 'activadas después de la ligación del receptor de célula T (TCR, por sus siglas en inglés) . El ligando para OX40, OX40L, es un miembro de la familia TNF y se expresa en células que presentan antigeno activado (APC, por sus siglas en inglés), incluyendo células B, macrófagos, células endoteliales y células dendriticas (DC, por sus siglas en inglés).
El OX40 es un receptor coestimulador principal con participación secuencial de CD28 y OX40 siendo requerido para sobrevivencia y proliferación de célula T óptima. La ligación de OX40 en células T activadas permite la producción de citoquinas potenciadas y proliferación de tanto células T CD4+ como CD8+ (Gramaglia et al., 2000, J. Immunol, 165, 3043-3050, Bansal-Pakala et al., 2004, J. Immunol, 172, 4821-425) y puede contribuir . a tanto respuestas Thl y Th2 en desarrollo (Gramaglia et al., 1998, J. Immuno., 161, 6510-6517, Arestides et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32, 2874-2880) . La coestímulación OX40 prolonga la sobrevivencia de célula T más allá de la fase efectora inicial de la respuesta inmunitaria e incrementa el número de células T de memoria a través de la inhibición de muerte de célula T efectora.
Cuando la activación inmunitaria es excesiva o no controlada, puede ocurrir alergia patológica, asma, inflamación, enfermedad autoinmunitaria y otras enfermedades relacionadas. Debido a que OX40 funciona para potenciar respuestas ' inmunitarias , puede exacerbar enfermedades auntoinmunitarias e inflamatorias.
El papel de interacciones OX40/OX40L en modelos de enfermedad se ha demostrado en ratones agónicos OX40. En encefalomielitis alérgica experimental (EAE, por sus siglas en inglés) , un modelo de esclerosis múltiple, signos, clínicos menos severos de la enfermedad e infiltrado inflamatorio reducido dentro del SNT se señaló en ratones agénicos OX40 (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11). También los ratones agénicos OX40 cebados y enfrentados con ovalbúmina muestran inflamación de pulmón disminuida (80 -90% de reducción en eosinofilia) , producción de mucosidad reducida, e hiper-reactividad de las vías respiratorias significativamente atenuadas (Jember et al., 2001, J. Exp. Med., 193, 387-392). Los anticuerpos monoclonales para ligando OX40 de murino han mostrado efecto benéficos en el modelo de artritis inducido por colágeno de artritis reumatoide (Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immuriol., 30, 2815-2823), EAE (Nohara et al., 2001, J. Immunol . , 166, 2108-2115) , ratones diabéticos no obesos (NOD, por sus siglas en inglés) (Pakala et al., 2004, Eur. J. Inamunol . , 34, 3039-3046), colitis en ratones, restaurados de célula T (Malmstrom et al., 2001, J. Immunol., 166, 6972-6981, Totsuka et al., 2003, Am. J. Physiol.' Gastrointest . Liver Physiol., 284, G595-G603) y modelos de inflamación de pulmón (Salek-Ardakani et al., 2003, J. Exp. Med., 198, 315-324, Hoshinó et al., 2003, Eur. J. Immunol, 33, 861-869). Un anticuerpo para OX40L humano se ha perfilado en un modelo de inflamación de pulmón en monos rhesus y resultado en niveles reducidos de IL-5, IL-13 y células T de memoria efectoras en fluido de lavado bronquiolar después de la prueba inmunogénica de alérgeno (Seshasayee et -al., 2007, J. Clin. Invest, 117, 3868-3878) .
Un incremento en la expresión de OX40 se ha señalado en varias enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias. Esto incluye un incremento en expresión OX40 en células T aislada del fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Brugnoni D et al., 1998, Br. J. Rheum. , 37, 584-585; Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823; Giacomelli R et al., 2001, Clin. Exp. Rheumatol., 19, 317-320). Similarmente un incremento en la expresión OX40 se ha señalado en tejido gastrointestinal de pacientes c n colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn (Souza et al., 1999, Gut, 45, 856-863; Stube.r et 'al., -2000, Eur. J. Clin. Invest., 30, 594-599) y en lesiones activas de pacientes con esclerosis múltiple (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11) . El OX40L también puede detectarse en el músculo liso de las vías respiratorias (ASM, por sus siglas en inglés) humano y las células ASM en pacientes con asma muestran respuestas inflamatorias mayores para ligación OX40L que los donadores saludables, indicando un papel para la trayectoria OX40/OX40L en asma (Burgess et al., 2004, J. Allergy Clin Immunol . , 113, 683-689; Burgess et al., 200.5, J. Allergy Clin Immunol., 115, 302-308) . También se ha reportado que las células T CD4 + aisladas de la sangre periférica de pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés) expresan niveles elevados de OX40 que se asocia con la actividad de la enfermedad (Patschan et al., 2006, Clin. Exp. Immunol., 145, 235-242).
Dando el papel de'OX40 en alergia, asma y enfermedades asociadas con autoinmunidad e inflamación, un enfoque para terapia en estas enfermedades es bloquear la señalización OX40-OX40L a través del uso de anticuerpos anti-OX40L o anticuerpos anti-OX40 antagónicos.
Se han descrito anticuerpos anti-OX40L, ver por ejemplo WO2006/029879. Numerosos anticuerpos anti-OX40 agonísticos se han descrito pero muy pocos anticuerpos anti-OX40 antagónicos se conocen. Un anticuerpo OX40 anti-ratón policlonal de conejo se produjo por Stuber et al., 1996, J. Exp. Med, 183, 979-989 que bloquea la interacción entre OX40 y OX40L. Los anticuerpos monoclonales de ratón, 131 y 315 que enlazan OX40 humano se generaron por Imura et al., 1996, J. Exp. Med, 2185-2195.
Los anticuerpos antagónicos completamente humanos se han descrito en 02007 /O 62245 , la afinidad superior de estos anticuerpos tiene una afinidad para superficie celular expresada OX40 (células T activadas) de llnM.
Los anticuerpos antagónicos humanizados se han. descrito en WO2008/106116 y el anticuerpo con la mejor afinidad para OX40 tiene una afinidad de 0.94nM.
Otros anticuerpos anti-OX40 se han descrito, incluyendo L106 de murino (Patente de E.U.A. número 6,277,962) y ACT35 de murino, comercialmente disponibles de eBioscience.
En consecuencia todavía existe una necesidad en la técnica para un anticuerpo anti-OX40 mejorado adecuado para tratar pacientes.
Hemos ahora identificado un anticuerpo anti-OX40 antagónico de afinidad alta adecuado para el uso en el tratamiento o profilaxis de trastornos patológicos ! mediados por OX40 o asociados con un nivel incrementado de OX40.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1(a) a Figura 1 (n) muestra ciertas secuencias de aminoácidos o ADN con relación a un anticuerpo de acuerdo con la descripción Figura 2 muestra una representación esquemática de un anticuerpo del formato A26 Fab' -PEG Figura 3 muestra la afinidad basada en célula del anticuerpo A26 Fab' -PEG para superficie celular OX40 Figura 4 muestra el porcentaje de inhibición de OX40L enlazado a células T activadas por el anticuerpo A26, Fab' -PEG Figura 5 muestra el porcentaje de inhibición de la proliferación de célula T por el anticuerpo A26 Fab' -PEG en el MLR humano Figura 6 muestra la inhibición A26 Fab' -PEG de la proliferación de PBMC expuesto a Toxoide tetánico Figura 7 muestra el porcentaje de inhibición de A26 Fab' -PEG de producción IL-13 de PBMCs expuestos a extracto alergénico Dermatophagoides pteronyssinus Figura 8 muestra el porcentaje de inhibición de A26 Fab' -PEG de producción de citoquina de PBMCs expuestos a extracto alergénico Dermatophagoides pteronyssinus Figura 9 muestra A26 Fab' -PEG que inhibe la proliferación de célula T CD4+ y CD8+ en un modelo Hu-SCID.
Figura 10 muestra inhibición de registro de , artritis (como área bajo la curva) por A26 Fab'-PEG en un modelo in vivo Figura 11 muestra registros histológicos totales en un modelo in vivo para artritis DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El anticuerpo de rata original del cual los anticuerpos humanizados se derivan se refiere en la presente como CA044_00026.
El CA044_00026 humanizado generalmente en la forma de un fragmento Fab u otros fragmentos, se refiere como A26.
El anticuerpo PEGilado "A'26" en el formato mostrado en la Figura 2, se refiere en la presente como A26Fab'-PEG.
Los residuos en dominios variables de anticuerpo se enumeran convencionalmente de acuerdo con un sistema inventado por Kabat et al. Este sistema se establece en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteínas of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EUA (de aquí en adelante "Kabat et al. (supra)"). Este sistema de numeración se usa en la especificación actual excepto donde se indique de otra manera .
Las designaciones del residuo Kabat no siempre corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácido. La secuencia de aminoácidos lineal actual puede contener pocos o aminoácidos adicionales que en la numeración Kabat estricta corresponden a un acortamiento de, o inserción en, un componente estructural, si la estructura o región que determina la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) , de la estructura dé dominio variable básica. La numeración Kabat correcta de residuos puede determinarse por un anticuerpo dado por alineación de residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar".
Las CDRs del dominio variable de cadena pesada se localizan en 31-35 residuos (CDR-H1), 50-65 residuos (CDR-H2) y 95-102 residuos (CDR-H3) de acuerdo con el sistema de numeración Kabat. Sin embargo, de acuerdo con Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196,. 901-917 (1987)), el equivalente de rizo para CDR-HÍ se extiende desde el residuo 26 hasta el residuo 32. De esta manera a menos que se indique de otra manera ^CDR-HI' como se emplea en la presente se pretende para referir a 26 hasta 35 residuos, como se describe por una combinación del sistema de numeración Kabat y definición del rizo topológico de Chothia.
Las CDRs del dominio variable de cadena ligera se localizan en 24-34 residuos (CDR-L1), 50-56 residuos (CDR-L2) y 89-97 residuos (CDR-L3) de acuerdo con el sistema de numeración Kabat.
Como se usa en la presente, el término 'anticuerpo antagónico' describe un anticuerpo que es capaz de inhibir y/o neutralizar la actividad de señalización biológica de OX40, por ejemplo al bloquear el enlace o sustancialmente reducir el enlace de OX40 para el ligando OX40 y de esta manera inhibir la activación de 0X40.
Los anticuerpos para uso en la presente invención pueden obtenerse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. El polipéptido/proteina OX40 incluyendo proteínas de fusión, por ejemplo células o proteínas de fusiones OX40-Fc ( recombinantemente o naturalmente) que expresan el polipéptido (tales como células T activadas) pueden usarse para producir anticuerpos que reconocen específicamente a OX40. El polipéptido 0X40 puede ser el polipéptido 'maduro' o un fragmento biológicamente, activo o derivado del mismo. Adecuadamente el polipéptido OX40 es el polipéptido humano maduro o el dominio extracelular o fragmento del mismo. El dominio extracelular típicamente comprende 29-214 aminoácidos de la proteína OX40 (SWISS PROT entrada P43489) . Los polipéptidos OX40 pueden prepararse por procesos bien conocidos en la técnica de células hospederas preparadas por ingeniería genéticamente que comprenden sistemas de expresión o que pueden recuperarse de fuentes biológicas naturales. En la solicitud actual, el término "polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Estos se usan de forma intercambiable a menos que se especifique de otra manera. El polipéptido OX40 puede en algunos casos ser parte de una proteína grande tal como una proteína de fusión por ejemplo fusionada a una etiqueta de afinidad. Los anticuerpos generados contra el polipéptido OX40 pueden obtenerse, donde la inmunización de un animal sea necesaria, al administrar los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos de rutina y bien conocidos, ver por ejemplo Handbook of Experimental Immunology, D. . Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, oveja, vaca, camellos o cerdos pueden inmunizarse. Sin embargo, los ratones, conejos, cerdos y ratas son generalmente más adecuados.
Los anticuerpos para uso en la presente invención incluyen anticuerpos completos y fragmentos funcionalmente activos o derivados de los mismos y pueden ser, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales , humanizados, completamente humanos o quiméricos.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica tal como la técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica trioraa, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).
Los anticuerpos para uso en la invención también pueden generarse usando métodos de anticuerpos de linfocito sencillo al clonar y expresar cADNs de región variable de inmunoglobulina generada de linfocitos sencillos seleccionados para la producción de anticuerpos específicos por, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 93 ( 15 ) : 7843-78481 ; WO92/02551; WO2004/051268 y Solicitud de Patente International número O2004/106377.
El cribado para anticuerpos puede realizarse usando ensayos para medir el enlace a OX40 humano y/o ensayos para medir la capacidad de bloquear el enlace de OX40 a su ligando, OX40L. Un ejemplo de un ensayo de enlace es un ELISA, en particular, usando una proteína de fusión de OX40 humano y Fe humano, que se inmoviliza en placas, y empleando un anticuerpo secundario conjugado para detectar el anticuerpo anti-OX40 enlazado a la proteína de fusión. Un ejemplo de un ensayo de bloqueo es un ensayo basado en citometría de flujo que mide el bloque de la proteína de fusión de ligando OX40 enlazada a OX40 en células CD4 humanas. Un anticuerpo secundario fluorescentemente etiquetado se usa para detectar la cantidad de proteína de fusión de ligando OX40 enlazada a la célula. Este ensayo se observa para una reducción en señal ya que el anticuerpo en el sobrenadante bloquea el enlace de la proteína de fusión de ligando a OX40. Un ejemplo adicional de un ensayo de bloqueo es un ensayo donde el bloque de coestimulación de células T humanas nativas mediada por proteína de fusión de ligando OX40 recubierta para una placa se mide al medir la incorporación de timidina tritiada.
Los anticuerpos humanizados (que incluyen anticuerpos injertados con CDR) son moléculas de anticuerpos que tiene una o más regiones que determinan la complementariedad (CDRs) de una especie no humana y una región de estructura de una molécula de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo US 5,585,089; WO91/09967). Se apreciará que esto sólo puede ser necesario para transferir los residuos que determinan la especificidad de las CDRs en vez de la CDR completa (ver por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) . Los anticuerpos humanizados pueden opcionalmente comprender además uno o más residuos de estructura derivadós de la especie no humana de la cual las CDRs se derivaron.
Los anticuerpos quiméricos están compuestos de elementos derivados de dos especies diferentes de manera que los elementos mantienen las características de la especie de la cual se derivan. Generalmente un anticuerpo quimérico comprenderá una región variable de una especie, por ejemplo un ratón, rata, conejo o similares y región constante de otra especie tal como un humano.
Los anticuerpos para uso en la presente invención también pueden generarse usando varios métodos de despliegue de fago conocidos en la técnica e incluyen aquellos descritos por Brínkman et al. (en J. Immunol . Methods, 1995, , 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) y WO 90/02809; O 91/10737; O 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108.
Los anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los cuales la regiones variables y las regiones constantes (donde se presenten) de tanto las cadenas pesadas y ligeras todas son de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencia de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente, humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo por los métodos de despliegue de fago descritos arriba y anticuerpos producidos por ratones en los cuales la variable de inmunoglobulina de murino y opcionalmente los genes de región constante se han reemplazado por sus contrapartes humanas por ejemplo, como se describe en términos generales en EP0546073 Bl, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5, 625, 126, US 5,633, 425, US 5,661,016, US5,770,429, EP 0438474 y EP0463151.
En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo antagónico gue tiene especificidad para OX40 humano, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene la secuencia dada en la' Figura 1 (c) SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, una CDR que tiene la secuencia dada en la Figura 1(c) SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 20 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la Figura 1(c) SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.
En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que comprende una cadena pesada, en donde al menos dos de CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 del dominio variable de la cadena pesada se seleccionan de lo siguiente: la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-Hl, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la' secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3. Por ejemplo, el .anticuerpo puede comprender una cadena pesada en donde CDR-H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 y CDR-H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2. Alternativamente, el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en donde CDR-H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 y CDR-H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3, o el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en donde CDR-H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 y CDR-H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3. Para evitar dudas, se entiende que se incluyen todas las permutaciones.
En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-Hl, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.
En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 20 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.
En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que comprende una' cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una CDR que tiene la secuencia dada en la Figura 1 (c) SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 21 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la Figura 1 (c) SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la Figura 1 (c) SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que comprende una cadena ligera, en donde al menos dos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 del dominio variable de la cadena ligera se seleccionan de lo siguiente: la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3. Por ejemplo,- el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde CDR-L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 y CDR-L2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5. Alternativamente, el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde CDR-L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 y CDR-L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6, o el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde CDR-L2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 y CDR-L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6. Para evitar dudas, se entiende que se incluyen todas las permutaciones .
En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para 0X40 humano, que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 21 para CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
Las moléculas de anticuerpos de la presente invención adecuadamente comprenden una cadena ligera complementaria o una cadena pesada complementaria, respectivamente.
Por lo tanto en una modalidad, un anticuerpo dé acuerdo con la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable, de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 20 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3 y una cadena ligera en donde el dominio¦ variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 21 para CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
Se apreciará que una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos pueden hacerse a las CDRs proporcionadas por la ' presente invención sin, alterar significativamente la capacidad del anticuerpo para enlazar a OX40 y para neutralizar la actividad OX40. El efecto de cualquiera de las sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos puede probarse fácilmente por alguien experimentado en la técnica, por ejemplo al usar los métodos descritos en la presente, en particular en los Ejemplos, para determinar el enlace OX40 e inhibición de la interacción OX40/OX40L. En consecuencia, la presente invención proporciona un anticuerpo que tiene especificidad para OX40 humano que comprende una o más CDRs seleccionadas de CDRH-1 (SEQ ID NO: 1), CDRH-2 (SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 20), CDRH-3 (SEQ ID NO: 3), CDRL-1 (SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 21), CDRL-2 (SEQ ID NO: 5) y CDRL-3 (SEQ ID NO: 6) en las cuales uno o más aminoácidos en una o más de las CDRs se han sustituido con otro aminoácido, .adecuadamente un aminoácido similar como se define en la presente a continuación i En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo que tiene especificidad para OX40 humano que comprende CDRH-1 (SEQ ID NO: 1), CDRH-2 (SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 20), CDRH-3 (SEQ ID NO: 3), CDRL-1 (SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 21), CDRL-2 (SEQ ID NO: 5) y CDRL-3 (SEQ ID NO: 6) como se muestra en la Figura 1 (c) , por ejemplo en las cuales uno o más aminoácidos en una o más de las CDRs se han sustituido con otro aminoácido, tal como un aminoácido similar como se define en la presente a continuación.
En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende tres CDRs en donde la secuencia de CDRH-1 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1, CDRH-2 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 y/o CDRH-3 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en. donde el dominio variable de la cadena pesada comprende tres CDRs en donde la secuencia de CDRH-1 tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1, CDRH-2 tiene ; al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 y/o CDRH-3 tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:.3.
"Identidad", como se usa en la presente, indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similitud", como se usa en la presente, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, leucina puede sustituirse por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que pueden a menudo sustituirse por otro incluyen pero no se limitan a: - fenilalanina, tirosina y triptofano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas); - lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas); - aspartato y glutamato - (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas) ; - asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amida) ; y - cisteina y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre) . Los grados de idéntidad y similitud pueden calcularse fácilmente (Compütational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1983; Biocomputing . Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.,. Humana Press, New Jersey, 1994 ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, New York,' 1991, el software BLAST™ disponible de NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet . 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,) .
En otra modalidad,' un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDRs en donde la secuencia de CDRL-1 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4, CDRL-2 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 y/o CDRL-3 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDRs en donde la secuencia de CDRL-1 tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4, CDRL-2 tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 y/o CDRL-3 tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de idéntidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6.
En una modalidad el anticuerpo proporcionado en la presente es un anticuerpo monoclonai.
En una modalidad el anticuerpo proporcionado por la presente es un anticuerpo quimérico.
En una modalidad el anticuerpo proporcionado por la presente invención es una molécula de anticuerpo injertado CDR que comprende una o más de las CDRs proporcionadas en las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, '5, 6, 20 y/o 21 (Figura 1 (c) ) o variantes de la misma. Como se usa en la presente, el término 'molécula de anticuerpo injertado CDR' se refiere a una molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDRs (incluyendo, si se desea, una o más CDRs modificadas) de un anticuerpo donador (por ejemplo un anticuerpo monoclonai de murino) injertado en una estructura de región variable de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo aceptor (por ejemplo un anticuerpo · humano) . Para una revisión, ver Vaughan et al, Naüure Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una modalidad en vez de que el CDR completo se transfiera, sólo uno o más de los residuos que determinan la especificidad de cualquiera de una de las CDRs descritas en la presente arriba se transfieren a la estructura de anticuerpo humano (ver por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una modalidad sólo los residuos que determinan la especificidad de una o más de las CDRs descritas en la presente arriba se transfieren a la estructura de anticuerpo humano. En otra modalidad sólo los residuos que determinan la especificidad de cada una de las CDRs descritas en la 'presente arriba se transfieren a la estructura de anticuerpo humano.
Cuando las CDRs o residuos que determinan la especificidad son injertados, cualquier secuencia de estructura de región variable aceptora apropiada se puede utilizar teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donador del cual las CDRs se derivan, incluyendo regiones de estructura de ratón, primate y humano. Adecuadamente, el anticuerpo injertado CDR de acuerdo con la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones de estructura aceptoras humanas asi como una o más de las CDRs o residuos que determinan la especificidad descrita arriba. De esta manera, proporcionada en una modalidad es un anticuerpo injertado CDR neutralizante en donde el dominio variable comprende regiones de estructura aceptoras humanas y CDRs donadoras no humanas.
Los ejemplos de estructuras humanas que pueden usarse en la presente invención son KOL, NE M, REI , EU, TUR, TEI , LAY y POM (Kabat et al., supra) . Por ejemplo, KOL y EWM pueden usarse para la cadena pesada, REI puede usarse para la cadena ligera y EU, LAY y POM pueden usarse para tanto la cadena pesada como la cadena ligera. Alternativamente, pueden usarse secuencias de linea germinal humanas; estas están disponibles en: http : //vbase . mrc-cpe .cam.ac.uk En un anticuerpo injertado en CDR de la presente invención, las cadenas ligeras y pesadas aceptoras no necesariamente necesitán derivarse del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas que tienen regiones de estructura derivadas de diferentes cadenas.
La región de estructura adecuada para la cadena pesada del anticuerpo injertado en CDR de la presente invención se deriva de la secuencia 1-3 3-07 VH3 del sub-grupo humano junto con JH4. En consecuencia, se proporciona un anticuerpo injertado en CDR neutralizante que comprende al menos un CDR donador no humano en donde la región de estructura de cadena pesada se deriva de la secuencia 1-3 3-07 VH3 del subgrupo humano junto con JH . ' La secuencia de JH4 humano es como sigue: ( YFDY) WGQGTLVTVSS (Seq ID No: 22). La porción YFDY es parte de CDR-H3 y no es parte de la estructura 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).
La región de estructura adecuada para la cadena ligera del anticuerpo injertado en CDR de la presente invención se deriva de la secuencia' 2-1 1-02 VK1 del sub-grupo de linea germinal humano junto con JK4. En consecuencia, se proporciona un anticuerpo injertado en CDR neutralizante que comprende al menos un CDR donador no humano en donde la región de estructura de cadena ligera se deriva de la secuencia 2-1 1-02 del subgrupo humano junto con JK4. La secuencia JK1 es como sigue: (WT) FGQGTKVEIK (Seq ID No: 23). La porción WT es parte de CDR-L3 y no es parte de la estructura 4 (Hieter, PA.,. et al., 1982, J. Biol . Chem., 257, 1516-1522) .
También, en un anticuerpo injertado en CDR de la presente invención, las regiones de estructura necesarias no tienen exactamente la misma secuencia como aquellas del anticuerpo aceptor. · Por ejemplo, los residuos no usuales pueden cambiarse a residuos que se presentan más frecuentemente para tal tipo o clase de cadena aceptora. Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones de estructura aceptoras pueden cambiarse de manera que corresponden al residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donador (ver Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Tales cambios deben mantenerse al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donador. Un protocolo para seleccionar residuos en las regiones de estructura aceptoras que pueden necesitar cambiarse se establece en la WO 91/09967.
Adecuadamente, en una molécula de anticuerpo injertado CDR de la presente invención, si la cadena pesada aceptora tiene la secuencia 1-3 3-07 VH3 humana junto con JH4, entonces las regiones de estructura de la cadena pesada aceptoras comprenden, además de una o más CDRs donadoras, un residuo donador en al menos una de las posiciones 37, 73, 78 o 94 (de acuerdo con abat et al., (supra), ). En consecuencia, se proporciona un anticuerpo injertado en CDR, en donde al menos los residuos en las posiciones 37, 73, 78 y 94 del dominio variable . de la cadena pesada son residuos donadores .
Adecuadamente, en 'una molécula de anticuerpo injertado CDR de acuerdo con la presente invención, si la cadena ligera aceptora tiene la secuencia 2-1 1-02 VK1 del sub-grupo humano junto con JK4 , entonces las regiones aceptoras de estructura de la cadena ligera comprenden, además de una o más CDRs donadoras, un residuo donador en al menos una de las posiciones 64 o 71. En consecuencia, se proporciona un anticuerpo injertado en CDR, en donde al menos los residuos en las posiciones 64 y 71 del dominio variable de la cadena ligera son residuos donadores. ; Los residuos donadores son residuos del anticuerpo donador, esto es el anticuerpo del cual las CDRs se derivaron originalmente.
En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la Figura 1 (b) SEQ ID NO: 9.
Se apreciará que una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos pueden hacerse a los dominios de anticuerpo variable, proporcionados por la presente invención, sin alterar significativamente la capacidad del anticuerpo para enlazar a OX40 y para neutralizar la actividad OX40. El efecto de cualquiera de las sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos puede probarse fácilmente por alguien experimentado en la técnica, por ejemplo al usar los métodos descritos en la presente, en particular los Ejemplos, para determinar el enlace OX40 y bloqueo del ligando.
En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 9. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de . la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 9.
En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la Figura 1 (a) SEQ ID NO: 7.
En otra modalidad,' un ¦ anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 7. En' una modalidad el anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 7.
En una modalidad un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ. ID NO: 7.
En otra modalidad de la . invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 9 y el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 7. Adecuadamente, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 7.
Las moléculas de anticuerpos de la presente invención pueden comprender una molécula .de anticuerpo completo que tiene cadenas ligeras y pesadas de longitud completa o un fragmento del mismo y puede ser, pero no se limitan a Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio sencillo (por ejemplo VH o VL o VHH) , scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos enlazados al epitopc de cualquiera de los de arriba (ver por ejemplo Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 ( 9) : 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3) , 209- 217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Otros fragmentos de anticuerpo para uso en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en las solicitudes de patente Internacional WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171. ' Los anticuerpos multivalentes . pueden comprender especificidades múltiples o pueden ser monoespecificos (ver por ejemplo WO 92/22853 y WO05/113605) .
En una modalidad el anticuerpo de acuerdo con la descripción actual se proporciona como una proteina de fusión de anticuerpo enlazado a OX40 que comprende una porción de inmunoglobulina , por ejemplo un fragmento Fab o Fab' , y uno o dos anticuerpos de dominio sencillo (dAb) > ligados directamente o indirectamente a estos, por ejemplo, como se describe en WO2009/040562.
En una modalidad la .proteina de fusión comprende dos anticuerpos de dominio, por ejemplo como un emparejamiento pesado variable (VH, por sus siglas en inglés) y ligero variable (VL, por sus siglas en inglés), opcionalmente ligado por un enlace de disulfuro.
En una modalidad el elemento Fab o Fab' de la i proteina de fusión tiene la misma o similar especificidad a los anticuerpos o anticuerpo de dominio sencillo. En una modalidad el Fab o Fab' tiene una especificidad diferente a los anticuerpos o anticuerpo de dominio sencillo, es decir la proteina de fusión es . multivalente . En una modalidad una proteina de fusión multivalente de acuerdo con la, presente invención tiene un sitio enlazado a la albúmina, por ejemplo un par VH/VL en ella proporciona un sitio enlazado a la albúmina .
Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si se presentan, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que pueden requerirse. Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humano. En particular, pueden usarse dominios de región constante IgG humano, especialmente de los isotipos IgGl e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo se pretende para usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras de anticuerpo. Alternativamente, los isotipos IgG2 e IgG4 pueden usarse cuando la molécula, de anticuerpo se , pretende para propósitos terapéuticos y no se requieren funciones efectoras de anticuerpo, por ejemplo para bloquear simplemente la actividad OX40. Se apreciará que también pueden usarse las variantes de secuencia de estos dominios de región constante. Por ejemplo pueden usarse moléculas IgG4 en las cuales la serina en la posición 241 se ha cambiado a prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. También se entenderá por alguien experimentado en la técnica que los anticuerpos pueden experimentar una variedad de modificaciones post-traslacional . El tipo y extensión de estas modificaciones a menudo dependen de la linea celular hospedera usada para expresar el anticuerpo asi como las condiciones de cultivo. Tales modificaciones pueden incluir variaciones en glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperazina, isomeri zación de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico de terminal carboxi (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chrcmatography 705:129-134, 1995) . En consecuencia, la lisina de terminal C de la cadena pesada de anticuerpo dada en la Figura 1 (f), SEQ ID NO: 15 puede estar ausente.
En una modalidad la ¦ cadena pesada de anticuerpo comprende un dominio CK1 y la cadena ligera de anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.
En una modalidad el anticuerpo proporcionado por la presente invención es un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano en el cual la región constante de cadena pesada comprende una región de bisagra modificada. En consecuencia, la presente invención proporciona un anticuerpo en el cual la cadena pesada comprende o consiste de la secuencia dada en la Figura 1 (f), SEQ ID NO: 15.
Se apreciará que una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos pueden hacerse al anticuerpo variable y/o dominios .constantes proporcionados por la presente invención sin alterar significativamente la capacidad del anticuerpo para enlazar a OX40 y para neutralizar la actividad OX40. El efecto de cualquiera de las sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos puede probarse fácilmente por alguien experimentado en la técnica, por ejemplo al usar los métodos descritos en la presente, en particular en los Ejemplos, para determinar el enlace OX40 y bloqueo de la interacción OX40/OX40L. 1 En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15. Adecuadamente, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15. 3.5 En una modalidad una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la Figura 1 (d) , SEQ ID NO: 11.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 11. Por ejemplo, el anticuerpo comprende una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 11.
En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo en el cual la cadena pesada comprende o consiste de la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15 y la cadena ligera comprende o consiste de la secuencia dada en la SEQ ID NO: 11.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15 y la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 11. Generalmente, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 11- Las moléculas biológicas, tales como anticuerpos o fragmentos, contienen grupos funcionales ácidos y/o básicos, por ello da a la molécula una carga positiva o negativa pura. La cantidad de carga "observada" general dependerá de la secuencia de aminoácido absoluta de la entidad, el ambiente local de los grupos cargados en la estructura en 3D y las condiciones ambientales de la molécula. El punto isoeléctrico (pl, por sus siglas en inglés) es el ,pH en el cual una molécula particular o superficie accesible de solvente del mismo no porta carga eléctrica pura. En una modalidad el anticuerpo o fragmento de acuerdo con la descripción actual tiene un punto isoeléctrico (pl) de al menos 7. En una modalidad el anticuerpo o fragmento tiene un punto isoeléctrico de al menos 8, tal como 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 , o 9.
El anticuerpo OX40 y fragmentos de la invención se han preparado por ingeniería para tener un punto isoeléctrico apropiado. Esto puede llevar a anticuerpos y/o fragmentos con propiedades más robustas, en particular perfiles de solubilidad y/o estabilidad adecuados y/o características de purificaciones mejoradas.
De esta manera en un aspecto la invención proporciona un anticuerpo OX40 humanizado preparado por ingeniería para tener un punto isoeléctrico diferente a aquel del anticuerpo originalmente identificado CA044_00026. El anticuerpo puede, por ejemplo prepararse por ingeniería al reemplazar un residuo de aminoácido tal como reemplazando un residuo de aminoácido ácido con uno o más residuos de aminoácido básicos. Alternativamente, los residuos de aminoácido básicos pueden introducirse o los residuos de aminoácido ácidos pueden removerse. Alternativamente, si la molécula tiene los residuos ácidos de valor pl no aceptables altos puede introducirse para disminuir el pl, como se requiera. El pl objetivo del anticuerpo preparado por ingeniería o fragmento deseable puede, por ejemplo ser 8 o arriba, tal 8.5 o 9. Es importante que cuando se manipula el cuidado pl debe tomarse para retener la actividad deseable del anticuerpo o fragmento. De esta manera en una modalidad el anticuerpo o fragmento preparado por ingeniería tiene la misma o sustancialmente la misma . actividad como el anticuerpo o fragmento "no modificado".
Los programas tales como ** ExPASY http: //www. expasy. ch/tools/pi tool .html, y http : //www . iut-arles . up . univ-mrs . fr/w3bb/d abim/compo-p . html, pueden usarse para predecir el punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento.
También proporcionado por la presente invención es un epitopo o región especifica de OX40 humano que se enlaza por un anticuerpo proporcionado por la presente invención, en particular un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada gH2 (SEQ ID NO: 9) y/o la secuencia de cadena ligera gL8 (SEQ ID NO: 7) .
Este epitopo o región especifica del polipéptido OX40 humano puede identificarse por cualquier método de mapeo de epitopo adecuado conocido en la técnica, en combinación con cualquiera de uno de los anticuerpos proporcionados la presente invención. Los ejemplos de tales métodos incluyen cribado de péptidos de varias longitudes derivadas ÓX40 para enlazar al anticuerpo de la. presente invención con el fragmento más pequeño .que puede específicamente enlazar al anticuerpo que contiene la secuencia del epitopo reconocido por el anticuerpo. Los péptidos OX40 pueden producirse sintéticamente o por digestión proteolitica del polipéptido OX40. Los péptidos que enlazan el anticuerpo pueden identificarse por, por ejemplo, análisis espectrométrico de masa. En otro ejemplo, espectrometría RMN o cristalografía de rayos X pueden usarse para identificar el enlace de epítopo por un anticuerpo de la presente invención. Una vez identificado, el fragmento epitópico que enlaza un anticuerpo de la presente invención puede usarse, si se requiere, como un inmunógeno para obtener anticuerpos antagónicos adicionales que enlazan el mismo epítopo.
Los anticuerpos que bloquean cruzado el enlace de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención en particular, un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada gH2 (SEQ ID NO: 9) y la secuencia de cadena ligera gL8 (SEQ ID NO: 7) puede ser similarmente útil en actividad OX40 antagónica. En consecuencia, la presente invención también proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que bloquea cruzado el enlace de cualquiera de uno de los anticuerpos descritos arriba para OX40 humano y/o se bloquea cruzado de enlace OX40 por cualquiera de unos de aquellos anticuerpos. En una modalidad, tal anticuerpo enlaza al mismo epítopo como un anticuerpo descrito en la presente arriba. En otra modalidad el anticuerpo neutrali ante de bloque cruzado enlaza a un epítopo que se limita y/o traslapa con el enlace dé epítopo por un anticuerpo descrito en la presente arriba. En otra modalidad el anticuerpo neutralizante de bloqueo cruzado de 4 O este aspecto de la invención no enlaza al mismo epitopo como un anticuerpo de la presente invención o un epitopo que se limita y/o traslapa con el epitopo.
Los anticuerpos de bloqueo cruzado pueden identificarse usando cualquier método adecuado en la técnica, por ejemplo al usar ensayos ELISA o BIAcore de competencia donde el enlace del anticuerpo de bloqueo cruzado a OX40 humano previene el enlace de un anticuerpo de la presente invención o vice versa.
En una modalidad se proporciona un anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que bloquea cruzado el enlace de un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia gH2 (SEQ ID NO: 9) y cuya cadena ligera comprende la secuencia gL8 (SEQ ID NO: 7) para OX40 humano. En una modalidad los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención inhiben el enlace de un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada gH2 (SEQ ID NO: 9) y la secuencia de cadena ligera gL8 (SEQ ID NO: 7) por mayor que 80%, por ejemplo por mayor que 85%, tal como por mayor que 90%, en ' particular por mayor que 95%.
Alternativamente o además, los anticuerpos antagónicos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden bloquearse cruzado de enlace para OX40 humano por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada gH2 (SEQ ID NO: 9) y la secuencia de cadena ligera gL8 (SEQ ID NO: 7) . También se proporciona por lo tanto una molécula de anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano que se bloquea cruzado del OX'40 humano enlazado por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada gH2 (SEQ ID NO: 9) y la secuencia de cadena ligera gL8 (SEQ ID NO: 7) . En una modalidad los anticuerpos antagónicos proporcionados por este aspecto de la invención se inhiben del OX40 humano enlazado por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada gH2 (SEQ ID NO: 9) y la secuencia de cadena ligera gL8 (SEQ ID NO: 7) por mayor que 80%, por ejemplo por mayor que 85%, tal como por mayor que 90%, en particular por mayor que 95% .
En una modalidad ' los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención son completamente humanos. En una modalidad los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención son humanizados. En una modalidad los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención tienen una afinidad para OX40 humano de ????? o mejor. En una modalidad los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la . presente invención tienen una afinidad para OX40 humano de 50p o mej or .
En una modalidad l anticuerpo de bloqueo cruzado tiene un punto isoeléctrico de al menos 7, por ejemplo al menos 8, tal como 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 o 9.0.
Las moléculas de anticuerpos de la presente invención adecuadamente tienen una afinidad de enlace alta, en particular picomolar. La afinidad puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo BIAcore, como se describe en los Ejemplos en la presente, usando OX40 recombinante o natural aislado o una proteina/polipéptido de fusión de adecuado. En un ejemplo la afinidad se mide usando dominio .extracelular de OX40 humano recombinante como se describe en los Ejemplos en la presente. En un ejemplo el dominio extracelular de OX40 humano recombinante usado es un dimero, por ejemplo un dimero de fusión Fe. Adecuadamente las moléculas de anticuerpos de la presente invención tienen una' afinidad de enlace para OX40 humano aislado de alrededor de 200pM o mejor. En una modalidad la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de alrededor de 100 pM o mejor. En una modalidad la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de alrededor de 50pM o mejor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de alrededor de 40pM o mejor. En una modalidad la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de alrededor de 30p o mejor. En una modalidad la molécula de anticuerpo de la presente invención es completamente humano o humanizado y tiene una afinidad de enlace de alrededor de lOOpM o mejor.
Las moléculas de anticuerpos de la presente invención adecuadamente tienen una afinidad de enlace alta para OX40 humano expresado en la superficie de las células T activadas, por ejemplo afinidad nanomolar o picomolar. La afinidad puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo el método como se describe en los Ejemplos en la presente usando células T humanas CD4+ OX40+ activadas. En particular las moléculas de anticuerpos de la presente invención tienen una afinidad de enlace para superficie , celular que expresa OX40 humano de alrededor de 2n o mejor. En un ejemplo las moléculas de anticuerpos de la presente invención tienen una afinidad de enlace para superficie celular que expresa QX40 humano de alrededor de 1.5 nM o mejor. En otro ejemplo las moléculas de anticuerpos de la presente invención tienen una afinidad de enlace para superficie celular que expresa OX40 humano de alrededor de 1.2 nM o mejor. En una modalidad se próporciona una molécula de anticuerpo completamente humano o humanizado que tiene una afinidad de enlace de alrededor de 2nM o mejor para superficie celular humana que expresa OX40.
Se apreciará que la afinidad de anticuerpos proporcionados por la presente invención puede alterarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. La presente invención por lo tanto también se r,efiere a variantes de las moléculas de anticuerpos de la presente invención, que tienen una afinidad mejorada para OX40. Tales variantes pueden obtenerse per un número de protocolos de maduración de afinidad incluyendo madurar las CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254 , 392-403, 1995), mezclado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol . , 250 , 359-368, 1996), intercalado - de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), despliegue de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998).' Vaughan et al. (supra) discute estos métodos de maduración de afinidad.
En una modalidad las moléculas de anticuerpos de la presente invención bloquean la interacción entre OX40 y OX40L. Numerosos ensayos adecuados para determinar la capacidad de un anticuerpo para bloquear esta interacción se describen en los ejemplos en - la presente. En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especi icidad para OX40 humano que es capaz de inhibir el enlace de OX40L humano (probado en una concentración final de 2µg/ml) para células T CD4+OX40+ humanas activadas al 50% en una concentración de , menos de 5nM. En una modalidad el OX40L humano usado en el ensayo es OX40 humano natural. En una modalidad el OX40 humano usado en el ensayo es OX40 humano recombinante . En una modalidad el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo humanizado o completamente humano.
Si se desea un anticuerpo para uso en la presente invención puede conjugarse a una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una molécula efectora sencilla o dos o más de tales moléculas asi ligadas como para formar una porción sencilla que pueda enlazarse a los anticuerpos de la presente invención. Donde se desee para obtener un fragmento de anticuerpo ligado a una molécula efectora, esto puede prepararse por procedimientos de ADN recombinantes o químicos estándares en los cuales el fragmento de anticuerpo se liga ya sea directamente o por medio de un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar tales moléculas efectoras a anticuerpos son bien conocidas en la técnica (ver, Mellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson eü al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunql. Rev., 62:119-58 y Dubo chik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics , 83, 67-123.) . Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en la WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO03031581. Alternativamente, donde la molécula efectora es una proteina- o polipéptido ¦ la ligadura puede alcanzarse usando procedimientos de ADN recombinantes, por ejemplo como se describe en la WO 86/01533 y EP0392745.
El término molécula efectora como se usa en la presente incluye, por ejemplo, agentes antineoplásticos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, polímeros que se presentan naturalmente o sintéticos, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos por ejemplo ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos , particularmente radioyodo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos reporteros tales como compuestos o compuestos fluorescentes que pueden detectarse por RMN o espectroscopia ESR.
Los ejemplos de moléculas éfectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos incluyendo cualquiér agente que es perjudicial para (por ejemplo extermina) las células. Los ejemplos incluyen c.ombrestatinas, dolastatinas , epotilonas, estauroesporina, mai tansinoides , espongistatinas , rizoxina, halicondrinas , roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina , dihidroxi antracin diona, mitoxantrona , . mitramicina , actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , procaina, tetracaina, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.
Las moléculas efecioras también incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por . ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina , 6-tioguanina , citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo mecloretamina , tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida , busulfan, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por . ejemplo dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC) , caliqueamicinas o duocarmicina) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo vincristina y · vinblastina ) .
Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados tales como 1]1In y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252 , Iridio192 y Tungsteno188/Renio188 ; o fármacos tales como pero no limitados a, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.
Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero no se limitan a, enzimas proteolítica,. hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas . Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero' no se limitan a, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina, o difteria toxina, una proteína tal como insulina, factor de necrosis de tumor, oc-interferón, ß-interferón, factor de crecimiento del nervio, factor de crecimiento derivado de plaqueta o activados de plasminógeno de tejido, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo angioestatina o endoestatina , o, un modificador de respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), factor que estimula la colonia de macrófago de granulocito (GM-CSF) , factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSF) , factor del crecimiento del nervio (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.
Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles por ejemplo en diagnostico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas,, grupos proestéticos, materiales . fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radioactivos, metales gue emiten positrón (para uso en tomografia de emisión de positrón) , e iones de metal paramagnético no radioactivo. Ver generalmente Pptente de E.U.A. No. 4,741,900 para iones de metal que pueden conjugarse con anticuerpos para uso como diagnósticos. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de raíz dé rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa , o acetilcolinesterasa ; los grupos proestéticos adeucados incluyen estreptavidina , avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona , fluoresceína , isotiocianato de fluoresceína , rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina , cloruro de dansilo y ficoeritrina ; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales de bioluminiscencia adecuados incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; y los núclidos radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, niIn y 99Tc.
En otro ejemplo la molécula efectora puede incrementar la vida media del anticuerpo in vivo, y o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar el suministro de un anticuerpo a través de una barrera epitelial ; para el sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas enlazadas a albúmina o compuestos enlazados a albúmina tales como aquellos descritos en la WO05/117984.
Donde la molécula efectora es un polímero puede, en general, ser un polímero que se presenta naturalmente o sintético, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo un homo o hetero-polisacárido.
Los sustituyentes opcionales específicos que pueden presentarse en los polímeros sintéticos mencionados arriba incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.
Los ejemplos sintéticos de polímeros sintéticos incluyen poli (etilenglicol) , poli (propilenglicol ) poli ( vinilalcohol ) de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido o derivados de los mismos, especialmente poli ( etilenglicol ) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli (etilenglicol ) o derivados de los mismos.
Los polímeros que se presentan naturalmente específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de los mismos.
"Derivados" como se usa en la presente se pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos tio'l tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede ligarse directamente o través de un : segmento de ligadura para el polímero. Se apreciará que el résiduo de tal grupo en algunos casos formará parte del producto como el grupo de ligadura entre .el fragmento de anticuerpo y el polímero .
El tamaño del polímero puede variarse como se desee, pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio desde 500Da hasta SOOOODa, por ejemplo desde 5000 hasta 40000Da tal como desde 20000 hasta 40000Da. El tamaño de polímero puede en particular seleccionarse en la base del uso pretendido del producto por ejemplo capacidad para localizar a ciertos tejidos tales como tumores o extender la vida media circulante (para revisión ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). De esta manera, por ejemplo, donde el producto se pretende para dejar el tejido de circulación y penetrado, por ejemplo para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso para usar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 5000Da.- Para aplicaciones donde el producto permanece en la . circulación, puede ser ventajoso para usar un polímero de peso molecular superior, por ejemplo que tiene un peso molecular en el intervalo desdé 20000Da hasta 40000Da.
Los polímeros adecuados incluyen un : polímero polialquiieno, tal como un poli (enilenglicol ) o, especialmente, un metoxipoli (etilenglicol ) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo desde alrededor de ISOOODa hasta alrededor de 40000Da.
En un ejemplo los anticuerpos para uso en la presente invención se enlazan a porciones de poli (etilenglicol ) (PEG). En un ejemplo particular el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas PEG pueden enlazarse a través de cualquier grupo funcional aminoácido de terminal o cadena lateral de aminoácido disponible ubicado en el fragmento del anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Tales aminoácidos pueden ocurrir naturalmente en el fragmento de anticuerpo o pueden prepararse por ingeniería en el fragmento usando métodos de ADN recombinantes (ver por ejemplo US 5,219,996; US 5,667,425; W098/25971) , En un ejemplo la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en donde la modificación es la adición al extremo de terminal C de su. cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir el enlace de una molécula efectora. Adecuadamente, los aminoácidos adicionales forman una región de bisagra modificada qué contiene uno o más residuos de cisteína a los cuales la molécula efectora puede enlazarse. Los sitios múltiples pueden usarse para enlazar dos o más moléculas PEG.
Adecuadamente las 'moléculas PEG se ligan covaléntemente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína ubicado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero enlazada al fragmento de anticuerpo modificado puede ligarse covalentemente al' átomo de azufre de un residuo de cisteína ubicado en el fragmento. La ligadura covalente generalmente será un enlace de disulfuro o, en particular, un enlace de azufre-carbono. Donde un grupo tiol se usa como el punto de enlace a moléculas efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo derivados selectivos tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína pueden usarse. Un polímero activado puede usarse como el material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados por polímero como se describe arriba. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contiene un grupo reactivo tiol tal como un éster o ácido a-halocarboxílico, por ejemplo yodoacetamida , una imida, por ejemplo maleimida, un vinil sulfona o un disulfuro. Tales materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EUA) o pueden prepararse de materiales de partida comercialmente disponibles usando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas PEG particulares incluyen 20K metoxi-PEG-amina (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater) .
En una modalidad, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado o diFab que es PEGilado, esto es tiene PEG (poli (etilenglicol ) ) covalentemente enlazado a esto, por ejemplo de acuerdo con el método descrito en la EP 0948544 o EP1090037 [ver también "Poly (ethyleneglycol ) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed) , Pienum Press, New York, "Poly (ethyleneglycol ) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconj ugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. En un ejemplo PEG se enlaza a una cisteina en la región de bisagra.. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado PEG tiene un grupo maleimida covalentemente ligado a un grupo tiol sencillo en una región de bisagra modificada. Un residuo de lisina puede ligarse covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina en el residuo de lisina puede enlazarse un polímero metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000Da. El peso molecular total del PEG enlazado al fragmento . Fab puede por lo tanto ser aproximadamente 40,000Da.
En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que es un fragmentos Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 9 y una cadena- ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 7 y que tiene en el extremo terminal C de su cadena pesada una región de bisagra modificada que contiene al menos un residuo de cisteina al cual una molécula efectora se enlaza. Adecuadamente la molécula efectora es PEG y se enlaza usando los métodos descritos en (W098/25971 y WO2004072116 o en WO2007/003898 ) . Adecuadamente la molécula efectora se enlaza en tal manera que un grupo lisil-maleimida se enlaza al residuo de cisteina en el extremo terminal C de la cadena pesada, y cada grupo amino del residuo lisilo se ha ligado covalen'temente a un residuo metoxipoli (etilenglicol ) que tiene un peso molecular de alrededor de 20,000 Da. El peso molecular total del PEG enlazado ai anticuerpo es por lo tanto aproximadamente 40,000Da. Las moléculas PEG particulares incluyen' lisina modificada con ¦ 2-[3-(N-maleimido) propionamido] etil amida de ?,?'-bis (metoxipoli (etilen glicol) PM 20,000), también, conocido como PEG2MAL40K (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater) .
Las fuentes alternativas de ligaduras PEG incluyen NOF que suministran GL2-400MA2 (en donde m en la estructura de abajo es 5) y GL2-400 A (donde rr. es 2) y n es aproximadamente 450: m es 2 o 5 Es decir cada PEG es alrededor de 20,OOODa.
Las moléculas efectoras PEG alternativas adicionales del siguiente tipo: están disponibles de Dr Reddy, NOF y Jenkem.
En una modalidad se' proporciona un anticuerpo que es PEGilado (por ejemplo con un PEG descrito en la presente), enlazado a través de un residuo de aminoácido de cisteina en o alrededor de 226 aminoácidos en la cadena, por ejemplo 226 aminoácidos de la cadena pesada (por numeración secuencial).
En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo antagónico que tiene especificidad para OX40 humano, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende o consiste de la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende o consiste de la secuencia dada en la SEQ ID NO: 11 y que tiene una molécula efectora enlazada a la cisteina en la posición 226 de la cadena pesada (numeración lineal de la SEQ ID NO: 15) . Adecuadamente la molécula efectora es PEG y se enlaza usando los métodos descritos en (W098/25971 y WO2004072116 o WO2007 /003898 ) y un grupo lisil-maleimida se enlaza al residuo de cisteina en la posición 226 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 15), y cada grupo amino del residuo lisilo se ha ligado covalentemente a un residuo metoxipoli (etilenglicol ) que tiene un peso molecular de alrededor de 20,000Da. El peso molecular total del PEG enlazado al anticuerpo es por lo tanto aproximadamente 40,000Da. Las moléculas PEG particulares incluyen lisina modificada con 2- [3- (N-maleimido) propionamido] etil amida de N, N' -bis (metoxipoli (etilen glicol) PM 20,000), : también conocido como PEG2MAL40K (.obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater) . Adecuadamente, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab' modificado ' PEGilado como se muestra en la Figura 2. Esta molécula PEGilada se refiere en la presente como A26Fab'-PEG.
En otro ejemplo las moléculas efectoras pueden enlazarse a fragmentos de anticuerpo usando los métodos descritos en solicitudes WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171.
La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica las cadenas pesadas y/o ligeras de una molécula de anticuerpo de la presente invención. Adecuadamente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido por procesamiento químico, cADN, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos. Las secuencias de ADN que codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse por métodos bien conocidos para aquellos experimentados en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN codificadas para parte o toda de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo pueden sintetizarse como se desea de las secuencias de ADN determinadas o sobre la base de las secuencias de aminoácido correspondiente.
El ADN codificado para las secuencias de estructura aceptora está ampliamente disponible para : aquellos experimentados en la técnica y pueden sintetizarse fácilmente sobre la base de sus secuencias de aminoácido conocidas.
Las técnicas estándares de biología molecular pueden usarse para preparar secuencias de ADN codificadas para la molécula de anticuerpo de la .presente invención. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótido . Las técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio y reacción de cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) pueden usarse como sea apropiado.
Los ejemplos de secuencias adecuadas se proporcionan en la Figura 1 (h) SEQ ID NO: 8; Figura 1 (i) SEQ IQ NO: 10; Figura 1 (j) SEQ ID NO: 13; Figura 1 (k) SEQ ID NO: 14; Figura 1 (1) SEQ ID NO: 17 y Figura.1 (m) SEQ ID NO: 18. Los nucleótidos 1-63 en la SEQ ID NO 18 y 1-63 en la SEQ ID NO: 14 codifican la secuencia . OmpA del péptido de señal que se desdobla para dar una molécula de anticuerpo antagónico de la presente invención (el péptido de señal corresponde a 1-21 residuos de aminoácido en la Figura 1 (g) SEQ ID NO: 16 y 1-21 en la Figura 1 (e) SEQ ID NO: 12 respectivamente) . La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención que comprende la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 18. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena ligéra de' un anticuerpo de la presente . invención que comprende la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 1 .
La presente invención también se refiere a un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. En consecuencia, se proporciona un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADÑ que codifican un anticuerpo de la presente invención. Adecuadamente, el vector de clonación o expresión comprende dos secuencias de ADN, que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente. Adecuadamente, un vector de acuerdo con la presente invención comprende las secuencias dadas en la SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 18. Los nucleótidos 1-63 en la SEQ ID NO 18 y 1-63 en la SEQ ID NO 14 codifican la secuencia de péptido de señal de OmpA (1-21 residuos en la SEQ ID NO: 16 y 1-21 en la SEQ ID NO: 12 respectivamente) que se desdobla más adecuadamente para dar una molécula de anticuerpo neutralizante de la presente invención. En un ejemplo el vector comprende una secuencia intergénica entre las cadenas pesada y ligera, tal como IGS2 (ver WO03/048208) . En consecuencia en una modalidad el vector de la presente invención comprende la secuencia dada en la Figura 1 (n) (SEQ ID NO: 19) .
Los métodos generales por los cuales los vectores pueden construirse, métodos de transfección y método de cultivo son bien conocidos para aquellos experimentados en la técnica. En este sentido, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F . M . Ausubel (ed) , Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.
También se proporciona una célula hospedera que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Cualquier sistema de célula hospedera/vector adecuado puede usarse para expresión de las secuencias de ADN qµe codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Bacteriano, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos pueden ser usados o eucarióticos, por ejemplo mamíferos, también pueden usarse sistemas de expresión de célula hospedera. Las células hospederas mamíferas. adecuadas incluyen células CHO, mieloma o hibridoma.
La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo dé acuerdo con la presente invención que comprende cultivar uña célula hospedera que contiene un vector de la presente invención bajo condiciones adecuadas para llevar a expresión de proteína de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula del anticuerpo.
La molécula de anticuerpo puede comprender sólo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso sólo una secuencia que codifica, el polipéptido de cadena pesada o cadena ligera necesita usarse para transferir las células hospederas. Para producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la linea celular puede transferirse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera .y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, un vector sencillo puede usarse, el vector que incluye secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.
Los anticuerpos . y fragmentos de acuerdo con la descripción actual se expresan en buenos niveles de células hospederas. De esta manera las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos se optimizan y son propicios a procesamiento comercial.
Ya que los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento' y/o profilaxis de una afección patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o- más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. En consecuencia, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la fabricación de un medicamento. La composición usualmente se suministrará come parte de una composición farmacéutica, estéril que normalmente · incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede adicionalmente comprender un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un proceso para preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende agregar y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
La molécula de anticuerpo puede ser el ingrediente activo único en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede realizarse por otros ingredientes activos incluyendo otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo anticuerpos anti-TNF, anti-IL-?ß, anti-célula T, anti-IFNy o anti-LPS, o ingrediente no de anticuerpo tales como xantinas: Otros ingredientes activos adecuados incluyen anticuerpos capaces de inducir tolerancia, po ejemplo, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.
En una modalidad adicional el anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la descripción se emplea en combinación con un agente farmacéuticamente activo adicional, por ejemplo un corticosteroide (tal como propiónato de fluticasona) y/o un beta-2-agonista (tal como salbutamol, salmeterol o formoterol) o inhibidores de crecimiento celular y proliferación (tal como rapamicina, ciclofosfamida , metotrexato) o alternativo un inhibidor CD28 y/o CD40. En una modalidad el inhibidor, es una molécula pequeña. 1 En otra modalidad el inhibidor es un anticuerpo especifico para el objetivo.
Las composiciones armacéuticas adecuadamente comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. El término "cantidad' terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, aliviar o prevenir una afección o enfermedad objetivo, o para inhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular o en modelo animal, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. - El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración y ruta de administración adecuada. Tal información luego puede usarse para determinar dosis y rutas útiles para administración en humanos.
La cantidad terapéuticamente efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinaciones de fármaco, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a terapia. Esta cantidad puede determinarse por experimentación de rutina y está dentro del juicio del médico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva será desde 0.01 mg/kg hasta 50 mg/kg, por ejemplo 0.1 mg/kg hasta 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convencionalmente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.
Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (por ejemplo simultáneamente, secuencialmente o separadamente) con otros agentes, fármacos u hormonas.
La dosis en la cual la molécula de anticuerpo de la presente invención se administra depende de la naturaleza de la afección a tratarse, la extensión de la inflamación presente y sobre si la molécula de anticuerpo se está usando profilácticamente o para tratar una afección existente.
La frecuencia de dosis dependerá de la vida media de la molécula de anticuerpo y la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una vida media corta (por ejemplo 2 hasta 10 horas) puede ser necesaria para dar uno o más dosis por día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una vida media larga (por ejemplo 2 hasta 15 días) puede sólo ser necesario para dar una dosificación una vez al día, una vez por semana o aún una vez cada 1 o 2 meses.
El portador farmacéuticamente aceptable no debe por si mismo inducir la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxica. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas lentamente metabolizadas , grandes tales como proteínas, polipéptidos , liposomas, polisacáridos , ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y partículas de. virus inactivas.
Las sales farmacéuticamente aceptables pueden usarse, por ejemplo sales de ácido mineral, tales como clorohidratos , bromohidratos , fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales- de acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos .
Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden adícionalmente contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes o sustancias amortiguadoras de pH, pueden presentarse en tales composiciones. Tales portadores permiten las composiciones farmacéuticas para formularse como comprimidos, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas espesas y suspensiones, por ingestión por el paciente.
Las formas adecuadas para administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo por inyección o infusión, por ejemplo por inyección por bolo o infusión continua. Donde el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservación, estabilización y/o dispersión.
Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratarse pueden ser animales. Sin embargo, en una o más modalidades las composiciones se adaptan para administración a sujetos humanos.
Adecuadamente en formulaciones de acuerdo con la descripción actual, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, por ejemplo si el pH de la formulación es 7 entonces un pl desde 8-9 o arriba puede ser apropiado. Aunque no se desea enlazarse por la teoría se cree que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con estabilidad mejorada, .por ejemplo el anticuerpo o fragmento permanece en la solución.
En una modalidad la formulación farmacéutica en un pH en el. intervalo de 4.0 hasta 7.0 comprende: 1 hasta 200mg/mL de un anticuerpo de acuerdo con la descripción actual, 1 hasta lOOmM de una solución amortiguadora, 0.001 hasta 1% de un tensoactivo, a) 10 hasta 500mM de un estabilizador, b) 10 hasta 500mM de un estabilizador y 5 hasta 500 mM de un agente de tonicidad, o c) 5 hasta 500 mM de un agente de tonicidad.
Por ejemplo la formulación en aproximadamente pH6 puede comprender 1 hasta 50mg/mL de anticuerpo, HC1 de L-histadina 20mM, trehalosa 240 mM y polisorbato 20 al 0.02%. Alternativamente una formulación en aproximadamente pH 5.5 puede comprender 1 hasta 50mg/mL de anticuerpo, : solución amortiguadora de citrato 20mM, sacarosa 240mM, arginina 20mM, y polisorbato 20 al 0.02%.' Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por cualquier número de rutas incluyendo, pero no limitado a, rutas oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular , intratecal, intraventricular , transdérmica, transcutánea (por ejemplo, ver WO98./2073 ) , subcutánea, intraperitoneal , intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Los Hiporocíos también pueden usarse para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos ^íquidos antes de la inyección también pueden prepararse .
El suministro directo de las composiciones generalmente se realizará por inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o suministrará al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse en una lesión. El tratamiento de dosificaciones puede ser un programa de dosis sencillo o un programa de dosis múltiple.
Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible para degradación en el tracto gastrointestinal. De esta manera, si la composición es para administrarse por una ruta usando el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protegen el anticuerpo de degradación pero que libera el anticuerpo una vez que se ha absorbido del tracto gastrointestinal.
Una discusión minuciosa de portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
En una modalidad la .formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas incluyendo inhalación .
Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles de medición que contienen gases propelentes o soluciones inhalables libres de gases propelentes. Los polvos inhalables de acuerdo con la descripción que contienen la sustancia activa pueden consistir únicamente de las sustancias activas mencionadas arriba o de una mezcla de las sustancias activas mencionadas arriba con excipiente fisiológicamente aceptable.
Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo glucosa o arabinosa), disacáridos (por ejemplo lactosa, sacarosa, maltosa), oligo- y pol isacáridos (por ejemplo dextranós), polialcoholes (por ejemplo sorbitol, manitol, xilitol), sales (por ejemplo cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos de unos con otros. Los mono- o disacáridos se usan adecuadamente, el uso de lactosa o glucosa, particularmente pero no exclusivamente en la forma de sus hidratos.
Las partículas para deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula menor de 10 micrones, tal como 1-9 micrones por ejemplo desde 0.1 hasta 5 pm, en particular desde 1 hasta 5 µp?. El tamaño de partícula del ingrediente activo (tal como el anticuerpo o fragmento) es de importancia primaria.
Los gases propelentes que pueden usarse para preparar los aerosoles inhalables se conocen en la técnica. Los gases propelentes adecuados se seleccionan de entre hidrocarburos tales como n-propano, . n-butano o isobutano y halohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propelentes antes mencionados pueden usarse en sí miso o en mezclas de los mismos.
Los gases propelentes particularmente adecuados son derivados de alcano halogenados seleccionados de entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados arriba, TG134a ( 1 , 1 , 1 , 2-tetrafluoroetano) y TG227 (1, 1, 1, 2, 3, 3, 3-heptafluoropropano) y mezclas de los mismos son particularmente adecuados.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propelentes también pueden contener otros ingredientes tales como cosolventes. estabilizadores, agentes activos de superficie (tensoactivos) , antioxidantes , lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes se conocen en la técnica.
Los aerosoles inhalables que . contienen gas propelente de acuerdo con la invención pueden contener hasta 5% en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, 0.002 hasta 5% en peso, 0.01 hasta 3% en peso, 0.015 hasta 2% en peso, 0.1 hasta 2% en peso, 0.5 hasta 2% en peso o 0.5 hasta 1% en peso de ingrediente activo .
Las administraciones alternativamente tópicas al pulmón también pueden ser por administración de una solución liquida o formulación de suspensión, por ejemplo empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizado conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Parí aster(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va . ) .
El anticuerpo de la invención puede suministrarse disperso en un solvente, por ejemplo, en la forma de una solución o una suspensión. Puede suspenderse en una solución fisiológica apropiada, por ejemplo, solución amortiguadora salina u otro solvente farmacológicamente aceptable o una solución amortiguadora. Las · soluciones amortiguadoras conocidas en la técnica pueden contener 0.05 mg hasta 0.15 mg de edetato de disodio, 8.0 mg hasta 9.0 mg de NaCl, 0.15 mg hasta 0.25 mg de polisorbato, 0.25 mg hasta 0.30 mg de ácido cítrico anhidro, y 0.45 mg hasta 0.55 mg de citrato de sodio por 1 mi de agua a fin de alcanzar un pH de alrededor de 4.0 hasta 5.0. Una suspensión puede emplear, por ejemplo, anticuerpo liofilizado.
Las formulaciones de solución o suspensiones terapéuticas también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones amortiguadoras (por ejemplo, solución amortiguadora de citrato, solución amortiguadora de fosfato, solución amortiguadora de acetato y solución amortiguadora de bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolipidos , proteínas (por ejemplo, albúmina de suero), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol, y glicercl. Las soluciones o suspensiones pueden encapsularse en liposomas o microesferas biodegradables . La formulación generalmente se proporcionará en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de fabricación estériles.
Estos pueden incluir producción y esterilización por filtración del solvente/solución amortiguadora usado para la formulación, suspensión aséptica del anticuerpo en la solución de solvente amortiguador estéril, y dispensación de la formulación en receptáculos estériles por. métodos familiares para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica .
La formulación nebulizable de acuerdo con la descripción actual puede proporcionarse, por ejemplo, como unidades de dosificación sencilla (por ejemplo, viales o recipientes de plástico sellados) empacados en envolturas de papel. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, por ejemplo, 2 mL, de solvente/solución amortiguadora.
Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser adecuados para suministro por medio de nebulización.
También se prevé que el anticuerpo de la presente invención puede administrarse por el uso de terapia génica . Con objeto de alcanzar eso, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes de ADN apropiados se introducen ' en un paciente de manera que las cadenas de anticuerpo se expresan de las secuencias de ADN y ensamblan i13 situ.
La presente invención también proporciona una¦ molécula de anticuerpo (o las composiciones que comprende la misma) para uso en el control de enfermedades inflamatorias, por ejemplo enfermedad inflamatoria aguda o crónica. Adecuadamente, la molécula de anticuerpo (o las composiciones que comprende de la misma) puede usarse para reducir el proceso inflamatorio o para prevenir el proceso inflamatorio.
En una modalidad se proporciona una reducción in vivo de células T activadas, en particular aquellas involucradas en respuestas inmunitarias inflamatorias inapropiadas , por ejemplo recluidas en la vecindad/ubicación de tal respuesta.
La reducción de células T activadas, como se emplea en la presente, puede ser una reducción, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más por ciento en comparación con el tratamiento anterior o sin tratamiento, De manera ventajosa, el tratamiento con un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención, puede permitir la reducción en el nivel de células T activadas, sin reducir el nivel general de células T de los pacientes (células T no activadas). Esto puede resultar en pocos efectos colaterales, y posiblemente prevenir la eliminación de células T en el paciente.
La presente invención también proporciona la molécula de anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que se media por OX40 o asocia con un nivel incrementado de OX40. La afección patológica, puede, por ejemplo seleccionarse del grupo que consiste de infecciones (víricas, bacterianas, hongos y parasíticas), choque endotóxico asociado con infección, artritis, artritis reumatoide, asma, COPD, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celiaca, enfermedad de ¦ la vesícula biliar, enfermedad Pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adhesiones quirúrgicas, apoplejía, Diabetes tipo I, enfermedad de lyme, artritis, meningoencefalitis , uveítis autoinmunitaria, trastornos inflamatorias mediados inmunitarios del sistema nervioso central y periférico tal como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barr , . dermatitis atópica, hepatitis autoinmunitaria, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía IgA, purpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de . Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, escleroderma , granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunitarios, pancreatitis, trauma (cirugía), enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo al trasplante, enfermedad del corazón incluyendo enfermedades isquémicas tales como infarto al miocardio así como aterosclerosis , coagulación intravascular, reabsorción ósea, osteoporosis , osteoartritis , periodontitis e hipocloridia .
En una modalidad el anticuerpo de acuerdo con la invención se emplea en el tratamiento de alergia, COPD, enfermedad autoinunitaria o artritis reumatoide.
La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención para uso en el tratamiento o profilaxis de dolor, particularmente dolor asociado con inflamación.
La' presente invención proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que se media por OX40 o asocia con un nivel incrementado de OX40, en particular el trastorno patológico es artritis reumatoide, asma o COPD.
La presente invención' proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una o más indicaciones médicas descritas en la. presente.
Una molécula de anticuerpo, fragmento o composición de la presente invención puede utilizarse en cualquier terapia donde se desea. para reducir los efectos de OX40 en el cuerpo humano o animal. El OX40 puede circularse en el cuerpo o puede presentarse en un nivel indeseablemente alto localizado en un sitio particular en el cuerpo, por ejemplo un sitio de inflamación.
En una modalidad la molécula de anticuerpo de la presente invención o una composición que comprende .la misma se usa para el control de enfermedad inflamatoria, por ejemplo como se describe en la presente.
La presente invención también proporciona un método para tratar sujetos humanos o animales que padecen de o en riesgo de un trastorno mediado por 0X40, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la molécula de anticuerpo de la presente invención, o una composición que comprende la misma.
En una modalidad se proporciona un proceso para purificar un anticuerpo (en particular un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención) que comprende las etapas : realizar cromatografía de intercambio de iones en modo no enlazado de manera que las impurezas se mantienen en la columna y el anticuerpo se eluye.
Las resinas de intercambio de iones adecuadas ¡para uso en el proceso incluyen resina Q.FF (suministrado por GE-Healthcare) . La etapa puede, por ejemplo realizarse en un pH alrededor de 8.
El proceso puede comprende además una etapa de captura inicial que emplea cromatografía de intercambio de iones, realizado per ejemplo en un pH de alrededor de 4 hasta 5, tal como 4.5. La cromatografía de intercambio de iones puede, por ejemplo emplear una resina tal como resina CaptoS o SP sefarosa FF (suministrado por GE-Healthcare) . El anticuerpo o fragmento luego puede eluirse de la resina que emplea una solución de sal iónica tal como cloruro de sodio, por ejemplo en una concentración de 200mM.
De esta manera las etapas o etapa de cromatografía pueden , incluir una o más etapas de lavado, como sea apropiado.
El proceso de purificación puede también comprende una o más etapas de filtración, tal como una etapa de diafiltración .
Un pl arriba de 8, tal como 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 o 9.0 del anticuerpo o fragmento se considera para ayudar en la purificación para proporcionar el anticuerpo o fragmento "libre" o "sustancialmente libre" de impurezas, tal como endotoxina, ADN y proteínas de célula hospedera.
De esta manera en una modalidad se proporciona un anticuerpo OX40 purificado o fragmento, por ejémplo un anticuerpo humanizado o fragmento, en particular un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención, en forma sustancial purificado de, en particular libre o sustancialmente libre de endotoxina y/o proteína de célula hospedera o ADN.
La forma purificada como se usa supra se pretende para referir a al menos 90% de pureza, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% p/p o más puro.
Sustancialmente libre de endotoxina se pretende generalmente para referir a un contenido de endotoxina de 1 EU por mg de producto de anticuerpo o menos tal como 0.5 o 0.1 EU por mg de producto.
Sustancialmente libre de proteina de célula hospedera o ADN se pretende generalmente para referir el contenido de proteina de célula hospedera y/o ADN 400pg por mg de producto de anticuerpo o menos tal como lOOpg por mg o menos, en particular 20pg por mg, como sea apropiado.
La molécula de anticuerpo de la presente invención también puede usarse en diagnóstico, por ejemplo en el diagnóstico in vivo y formación de imágenes de los estados de enfermedad que involucran 0X40.
"Que comprende" en el contexto de la especificación actual se pretende que signifique que incluye.
Donde las modalidades técnicamente apropiadas de la invención pueden combinarse.
Las modalidades se describen en la presente ya que comprenden ciertas características/elementos. La descripción también se extiende para separar modalidades que consisten o consisten esencialmente de las características/elementos.
La presente invención se describe además a manera de ilustración sólo en ios siguientes ejemplos, que se refieren a las Figuras acompañantes, en las cuales: EJEMPLOS Figura 1 en detalle : a) Región V de cadena ligera de anticuerpo A26 (SEQ ID NO: 7) b) Región V de cadena pesada de anticuerpo ?26 (SEQ ID NO: 9) c) CDRH1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5), CDRL3 (SEQ ID NO: 6) de anticuerpo A26) y CDRH2 (SEQ ID NO: 20) y CDRL1 (SEQ ID NO: 21) de anticuerpo CA044_00026. d) Cadena ligera de anticuerpo ?26 (SEQ ID NO: 11) e) Cadena ligera de anticuerpo A26 que incluye secuencia de señal (subrayada) (SEQ ID NO: 12) f) Cadena pesada de anticuerpo A26 (SEQ ID NO: 15) g) Cadena pesada de anticuerpo A26 que incluye secuencia de señal (subrayada) (SEQ ID NO: 16) h) Región variable de cadena ligera que codifica ADN de anticuerpo A26 (SEQ ID NO: 8) i) Región variable de cadena pesada que codifica ADN de anticuerpo A26 (SEQ ID NO: 10) j) Cadena ligera que codifica ADN de anticuerpo A26 (SEQ ID NO: 13) O ¿. k) Cadena ligera que codifica ADN de anticuerpo A26 que incluye secuencia de señal (SEQ ID NO: 14) 1) Cadena pesada que codifica ADN de anticuerpo A26 (SEQ ID NO: 17) m) Cadena pesada que. codifica ADN de anticuerpo A26 que incluye secuencia de señal (SEQ ID NO: 18) n) Cadena ligera y pesada que codifica ADN de anticuerpo A26 que incluye secuencias de señal y secuencias intergénicas IGS2 (SEQ ID NO: 19) .
Manipulaciones de ADN y métodos generales Se usó cepa E. coli INVaF' (Invitroge.n) para transformación y crecimiento de cultivo de rutina. Las enzimas de modificación y¦ restricción de ADN se obtuvieron de Roche Diagnostics Ltd. . and New England Biolabs . Las preparaciones de plásmido se realizaron usando kits de purificación es Plásmido Maxi (QIAGEN , No. de catalogo 12165) . Las reacciones de secuenciado de ADN se realizaron usando el kit de secuenciado terminador ABI Prisrn Big Dye (No. de catalogo 4304149) y corrieron en un secuenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems) . Los datos se analizaron usando el Au oAssembler (Applied Biosystems) . Los oligonucleótidos se obtuvieron de Invitrogen. Los genes que codifican secuencias de región V iniciales se diseñaron y 33 construyeron, por un enfoque de síntesis automático por Entelechon GmbH, y modificado para generar las versiones injertadas por mutagénesis dirigida al oligonucleótido . La concentración de Fab' se determinó usando ELISA de ensamble Fab' .
Ejemplo 1: Producción y humanización de un anticuerpo A26 anti-OX40 neutralizante Se inmunizaron ratas Sprague Dawley hembras con proteína de fusión recombinante de OX40 humano y mFC. El anticuerpo CA044_00026 que enlaza ??-4? humano se aisló usando los métodos descritos en WO92/02551. . Los genes para el dominio variable de cadena pesada (VH) y dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo CA044_00026 se aislaron y procesaron por secuencia siguiendo la clonación por medio de la PCR de transcripción inversa.
Una serie de regiones VL y VH humanizadas se diseñaron usando estructuras¦ aceptoras de región V humanas y al variar el número de residuos donadores en las regiones de estructura. Dos regiones VH -injertadas (gHl y 2) y 8 regiones VL injertadas (gLl-8) se diseñaron y los genes se construyeron por ensamble de oligonucleótido y mutagénesis PCR.' Los fragmentos Fab' de anticuerpo se construyeron para S 4 cada injerto usando los genes que codifican los dominios variables humanizados que se sub-clonaron en vector de expresión E. coli pTTOD, que contiene ADN que codifica el dominio CHl de cadena pesada Cyl humana (alotipo Glml7) y el dominio constante de cadena ligera kappa C humana (alotipo Klm3) (como se describe previamente en WO03/048208 ) . La región de bisagra está truncada y modificada, consiste del cambio de secuencia de Cys-Pro-Pro-Cys a Cys-Ala-Ala para generar una región de- bisagra con un residuo de cisteina sencillo disponible para enlace especifico del sitio de una porción PEG (ver Ejemplo 2).
Las secuencias que codifican el péptido de señal OmpA se enlazaron al extremo 5' de los genes que codifican tanto las cadenas pesadas como ligeras. En expresión, las secuencias de señal dirigen el transporte dé cada polipéptido al periplasma bacteriano. Después de la transubicación : a través de la membrana celular la secuencia de señal se desdobla completamente, permitiendo las cadenas ligeras y pesadas de Fab' maduro.
El vector pTTOD que contiene cada injerte se transformó en la cepa hospedera E.coli K12 W3110 y los fragmentos Fab' del anticuerpo producidos en E.coli por cultivo de t densidad de célula alta usando métodos estándares. Los anticuerpos se purificaron usando intercambio de cationes seguido por cromatografía de intercambio de aniones usando métodos estándares (Hump reys et al., 2002, Protein Exp'ression y Purification, 26, 309-320) .
Los varios fragmentos Fab' producidos se probaron en el enlace y bloqueo descrito de aquí en adelante y cada uno se evaluó en términos de su expresión en E.coli, su potencia relativa con el anticuerpo precursor, y lo adecuado para purificación y procesamiento cadena abajo. Esto lleva a la sección de injerto gL8gH2- que se nombró A26. Las secuencias de región V de este injerto se muestran en la Figura 1 (a) y (b) y en las SEQ ID NOs : 7 y 9 para la cadena ligera (gL2) y cadenas pesadas (gH2) respectivamente.
La estructura aceptora de cadena pesada es la secuencia de línea germinal humana VH3 1-3 3-07 con estructura 4 llegando de esta porción de la línea germinal JH4 de región JH humana. La estructura aceptora de cadena ligera es la secuencia de línea germinal humana VKl 2-1 lj-02, con estructura 4 legando de esta porción de la línea germinal JK4 de región JK humana. Los aminoácidos en las posiciones 37, 73, 78 y 94 (numeración Kabat) en la cadena pesada de la SEQ ID NO: 9 son residuos donadores (del anticuerpo precursor) que se encontraron para ser esenciales para retención de potencia completa. El residuo 64 dentro de. CDRH2 se convirtió del glutamato donador a la lisina aceptora (E64K) para crear una molécula con un pl superior, más favorable para purificación de intercambio de iones. Los aminoácidos en las posiciones 64 y 71 (numeración Kabat) en la cadena ligera de la SEQ ID NO: 7 son residuos donadores que se encontraron para ser esenciales para retención de potencia completa. Los residuos 27 y 28 dentro de CDR-L1 se convirtieron del glutamato y aspartato donador a la glutamina (E27Q) y serina (D28S) aceptora para crear una molécula con un pl superior, más favorable para purificación de intercambio de iones.
Las CDRs de este anticuerpo se muestran en la Figura 1(c) ya que son el CDRH2 original (SEQ ID NO: 20); y CDRL1 (SEQ ID NO: 21) que no se modifican. Las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa se muestran en las Figuras 1(d) y (f) respectivamente.
Los genes gL8 y gH2 se volvieron a diseñar en el nivel de ADN que contiene codones para tanto regiones variables como constantes optimizadas para expresión en E.coli y expresadas en el vector pTTOD(Fab') como se describa arriba. Las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras se muestran en las Figuras l(k), SEQ ID NO: 14 y (m) SEQ ID NO: 18 respectivamente.
La secuencia de proteína de este Fab' (incluyendo las regiones constantes) se proporciona en las SEQ ID NOS: 11 y 12 (cadena ligera sin y con péptido de señal OmpA) y SEQ ID NOS: 15 y 16 (cadena pesada sin y con péptido de señal OmpA). El vector de expresión dicistrónico pTTOD (A26 IGS2) incluye la secuencia proporcionada en la Figura 1 (n) y SÉQ ID NO: 19. La secuencia contiene una secuencia intergénica, IGS2, entre los genes de cadena ligera y pesada (Ver O03/048208) y la secuencia líder OmpA al inicio de tanto los genes de cadena pesada como ligera.
Ejemplo 2: Producción de A26Fab' -PEG El fragmento A26 de Fab' producido en E.coli y purificado como se describe en el Ejemplo 1 fue PEGilado de acuerdo con los métodos descritos en o WO2007/003898 J El PEG se enlazó a la cisteina de bisagra en la posición 226 (numeración lineal) de la cadena pesada (SEQ ID NO: 15) de manera que un grupo 1 i sil--maleimida se enlazó al residuo de cisteina en la posición 226 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 15), y cada grupo amino del residuo lisilo se ha ligado covalentemente a un residuo metoxipoli (etilenglicol ) que tiene un peso molecular de alrededor de 20,000 Da. El peso molecular total del PEG enlazado al anticuerpo fue por lo tanto aproximadamente 4O,O00Da, como se muestra en la Figura 2. 8d Ejemplo 3: Evaluación de la afinidad de A26 y A26Fab' -PEG para 0X40 La tecnología BIAcore vigila el enlace entre las biomoléculas en tiempo real y sin el requisito de etiquetado. Uno de los agentes que interactúan, nombrado el ligando, ya sea se inmoviliza directamente o captura en la superficie inmovilizada mientras que el otro, nombrado el analito, fluye en solución sobre la superficie capturada. El sensor detecta el cambio en masa sobre la superficie de sensor ya que el analito enlaza al ligando para formar un complejo en la superficie. Esto corresponde al' proceso de asociación. La disociación del analito del ligando se vigila cuando el analito se reemplaza por solución amortiguadora. En el ensayo BIAcore de afinidad, el ligando es el anticuerpo que se prueba y el analito es OX40 humano.
Instrumento : Biacore ® 3000, Biacore ??, Uppsala, Suecia.
Chip sensor: CM5 (grado alcanzado) Número de Catalogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Los chips se almacenaron a 4°C.
Kit de acoplamiento amina: Número de catalogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suecia Clorohidrato de etil-3- ( 3-dimetilaminopropil ) carbodiimida (EDC) . . Hecha hasta 75 mg/mL en agua destilada y almacenada en 200 µ?. alícuotas a-70°C.
N-Hidroxisuccinimida (NHS) . Hecha hasta 11.5 mg/mL en agua destilada y almacenada en 200 µ?, alícuotas a -70°C.
Clorohidrato de etanolamina 1 -NaOH pH 8.5. Almacenado en 200 µL alícuotas a -70°C.
Soluciones amortiguadoras: Solución amortiguadora de corrido: HBS-EP (siendo HEPES 0.01 M pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, Tensoactivo P20 al 0.005%). Número de catalogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia . Solución amortiguadora almacenada a 4°C.
Solución amortiguadora de inmovilización: Acetato 5.0 (siendo acetato de sodio 10 mM pH 5.0). Número de catalogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Solución amortiguadora almacenada a 4°C.
Captura de 1 igando : ' fragmento Affinipure F(ab' )2 IgG anti-humano de cabra, fragmento F(ab')2 específico. Jackson ImmunoResearch Inc ( Pennsylvan ia , EUA) Número de catalogo: 109-006-097. Reactivo almacenado a 4°C.
Ligando : Anticuerpos A26 y A26Fab' -PEG, almacenado a 4°C.
Analito : Dominio extraceluiar OX40 humano (185 aa) fusionado al TgG2a Fe de murino (232 aa) . (0.5mg/ml, Ancell No 513-020 lote 142305), almacenado a 4°C. i u Solución de regeneración- HC1 40 mM preparado por dilución con agua destilada de una solución madre 11.6 M ( BDH, Poole, Inglaterra. Número de catalogo: 101254H) .
NaOH 5 mM preparado por dilución con agua destilada de una solución madre 50 mM . Número de catalogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suecia.
Método de ensayo: El formato de ensayo se capturó del anticuerpo por F(ab' )2 anti-humano inmovilizado luego la valoración del dominio extracelular OX40 humano sobre la superficie capturada.
Un ejemplo del procedimiento se da a continuación: Se realizó BIA (Análisis de Interacción Biamblecular ) usando un BIAcore 3000 (BIAcore AB) . El fragmento Affinipure F(ab' ) 2 IgG anti-humano de cabra, fragmento F(ab' ) 2 especifico (Jackson ImmunoResearch ) se inmovilizo en un Chip Sensor CM5 por medio dé química de acoplamiento amina a un nivel de captura de «4000 unidades de respuesta (RUs) . La solución amortiguadora HBS-EP (HEPES lOmM pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, Tensoactivo P20 al 0.005%., BIAcore AB) se usó: como la solución amortiguadora de corrida con una velocidad de flujo de 10 µ?/min. Una inyección 1? µ? de Fab' en 0.5µ??/?? o Fab' -PEG en 50µ?/???, se usó para captura por el IgG-F(ab' ) 2 antihumano inmovilizado. El OX40 humano se tituló'' sobre el anticuerpo capturado en varias concentraciones (25nM hasta 0.78nM) a una velocidad de flujo de 30 µ?/?p??. La superficie se volvió a generar por una inyección 10 ^iL de HC1 40 mM, seguido por una inyección 5 de NaOH 5 mM a una velocidad de flujo de 10µ?1./]t???.
Las curvas de enlace de sustracción de respaldo se analizaron usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiendo los procedimientos estándares. Los parámetros cinéticos se determinaron del algoritmo fijado.
El valor de afinidad determinado para A26 estuvo en el intervalo de 19-45. pM y A26Fab'-PEG estuvo en el intervalo de 13.7-50.3pM.
La siguiente tabla muestra los datos de replicado para fragmento Fab humanizado no PEGilado A26 (fab*) y fragmento Fab A26 Fab' -PEG ( Fab-PEG* * ) , OX40 humano enlazado: Tabla 1 Muestra ka (1/Ms) Kd(l/s) KD (M) KD (pM) Fab* 4.86 + 1 6 E+05 1.29 + 0 07 E-05 2.96E- 11 29.6 Fab-PEG* * 4.76 + 2 1 E+05 1.30 + 0 46 E-05 3.13E- 11 31.3 * promedio de 5 determinaciones, ** promedió de 4 determinaciones Ejemplo 3a: Afinidad basada en células y capacidad de bloqueo de ligando de A26Fab' -PEG Afinidad basada en células Para determinar la afinidad de A26Fab'-PEG para superficie celular que expresa antigeno, se realizaron experimentos de enlace de saturación usando células T CD4+OX40+ activadas, y anticuerpo etiquetado FI TC . El enlace especifico de anticuerpo a receptor en equilibrio a través de un intervalo de concentraciones de ligando se usó para determinar KD, asumiendo que sólo una fracción muy pequeña de anticuerpo se enlazó al receptor en cualquier punto en la curva de enlace. 1 El enlace de equilibrio se describe usando la siguiente ecuación : ^encendido Receptoriibe + Anticuerpoiibre < ? Receptor-Anticuerpo ¦ ^apagado La velocidad de asociación de anticuerpo con receptor = kon x [Receptor ubre ! x [Anticuerpo iibre ] La velocidad de disociación del complejo de receptor-anticuerpo = kapagado x í. Receptor-Anticuerpo ] En equilibrio, las velocidades de asociación y disociación son iguales y una ecuación puede derivarse que describe la isoterma de enlace; en un grupo sentí-log el enlace es sigmoidal. El KD se define por kapagado / kencendido y puede calcularse de la curva de enlace como la concentración en la cual ocurre enlace medio-máximo.
El enlace de FITC etiquetado A26Fab' -PEG para células T CD4+OX40+ humanas activadas se midió por citometría dé flujo a través de un intervalo de concentración 4-log. Una curva de enlace representativa para A26Fab'-PEG se muestra en la Figura 3. Los 'valores KD obtenidos en células activadas de 3 donadores 'diferentes fueron 1.193nM, 1.0 1nM y 1.055nM.
El KD basado en célula de A26Fab'-PF,G (media ?.??ß??) es significativamente más débil que el enlace a OX40 recombinante medido por BIAcore (31.3pM). Esto puede ser debía a un número de factores. A26Fáb' -PEG puede tener afinidad superior para OX40 recombinante expresado como una proteína de fusión Fe dimérica, que tiene una' estructuré terciaria y cuaternaria diferente que OX40 expresado de superficie celular nativa, predicho para asociarse como un trímero no covalente en la membrana celular (Chan et. ai., 2000). Adi i'onalmente, la afinidad puede alterarse por gli osilación diferencial de OX40 recombinante contra nativo. El ambiente tridimensional de la membrana celular tal como circunvoluciones de membrana y proteínas co-lócalizadas también puede proporcionar obstáculos esféricos, limitando la accesibilidad de 0X 0 para A26Fab'-PEG. Por consiguiente, la afinidad basada en célula probablemente representa una medición más cercana de la afinidad de fármaco verdadera in vivo.
Métodos: Enlace A26Fab' -PEG a células T CD4+OX40+ activadas humanas .
Se aislaron PBMC por separación en un gradiente Ficoll y activaron con l g/mL PHA-L durante 3 días a 37°C, C02 al 5%, 100% de humedad. Las células T CD4+ se aislaron por selección negativa usando perlas magnéticas (Kit de aislamiento de célula T CD4+ II para Humano; Miltenyi Biotec) . Aproximadamente 1.2 x 105 células se incubaron en presencia del anticuerpo (intervalo de concentración final 10pg/mL -0.0006 g/mL (lllnM - 0.0068n )) durante 2 horas en hielo. Las células se lavaron antes del análisis por citometría de flujo usando un FACScalibur (Becton Dickinson) . Dos curvas de titulación se produjeron, una con A26Fab'-PEG y una seguna con gA33 Fab' -PEG con un control de enlace nc específico. El análisis de regresión lineal se usó para sustraer enlace no específico y la curva de enlace específico de esta manera generada se analizó por regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar KD.
Ejemplo 3b: Capacidad de bloqueo del ligando La capacidad de A26Fab'-PF.G para bloquear la interacción entre OX40 expresado de la superficie celular y OX40L recombinante se midió usando un ensayo de bloqueo de ligando basado en citometria de flujo. Brevemente, las células T CD4+OX40+ humanas activadas se pre-incubaron con una titulación de A26Fab' -PEG .. El OX40L recombinante se agregó posteriormente a las células y permitió enlazar en presencia de A26 Fab'-PEG. La proporciona del enlace OX40L luego se detectó por citometria de flujo usando un reactivo secundario etiquetado. La Figura 4 muestra una curva de inhibición representativa y demuestra que A26Fab'-PEG es capaz de bloquear completamente el enlace OX40L. El IC50 medio para inhibición de enlace de OX40L recombinante fue 4. InM (n = 2 donadores) .
Métodos: Inhibición de enlace 0X4OL a células T CD4+OX40+ humanas activadas por A26Fab'-PEG. Se aislaron PBMC por separación en un gradiente Ficoll y activaron con l g/mL PHñ- L durante 3 días a 37°C, C02 al 5%, 100% de humedad. 2.5 x 105 células se incubaron en presencia del anticuerpo (intervalo de concentración final 20pg/mL - 0.0003pg/mL (229 nM - 0.0035nM)) durante 10 minutos en hielo. OX40L (CD252 muCD8 ' biotinilado, Ancell) se agrego a una concentración final de 2 pg/ml e incubó durante uno 30 minutos adicionales en hielo. Las células se lavaron y enlace OX40L se detecta por incubación con estreptavadina etiquetada PE (Jackson Immunoresearch) antes del análisis por citometria de flujo usando un FACScalibur (Becton Dickinson) . Se usó gA33 Fab' -PEG co9mo un control- no especifico. La curva de inhibición se analizo por regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar el IC50. Los dates mostrados son de un donador representativo de dos.
Ejemplo 4: Potencia de A26Fab' -PEG en ensayos funcionales humanos Para evaluar su potencia en enlace OX40-OX40L endógeno de bloqueo durante interacciones celulares, A26 Fab' -PEG se probó en un intervalo de respuestas de célula T humana conducidas por antigeno.
Ejemplo 4a: Reacción de linfocitos mixtos Primero ' desarrollada en 1964 (Bach et al., 1964, Science 143, 813-814) la reacción alogénica de linfocito mixtos (MLR, por sus siglas en inglés) es un in vitro de activación y proliferación de, célula T aloreactiva (O' Flaherty et al., 2000, Immunology, 100, 239-299) , usando células mononucleares de sangre periférica entera (PBMCs) de dos donadores no relacionados. Las células T donadoras se activan a través del reconocimiento de antigenes de complejo de histocompatibiiidad principal alogénica (MHC) en PBMCs estimuladas donadoras no relacionadas, resultando en proliferación celular y producción de citocina (Lukacs et al., 1993, Am J Pathology, 143, 1179-1188). La aloreacción de linfocito T se ha mostrado para conducirse por tanto antigeno MCH alogénico como péptido de enlace (Sherman et al., 1993, Annu. Rev. Immunol, 11, 385-402), sugiriendo que una respuesta MLR puede ser contra tanto antigenos MHC alogénico estimuladores como péptidos de enlace. La magnitud de una respuesta MLR se correlaciona con el grado de, MHC ma emparejado entre el par respondedor-estimulador (Forjrester et al., 2004, Corneal Transplantation: An Immunological Guide to the Clinical Problem, Imperial College Press, 66-67). Una respuesta MLR resulta en la proliferación de células del donador respondedor y la producción de tanto citocinas derivadas de células T TH1 (IL-2, IFN-? y TNF-a) como TH2 (IL-4, IL-5, IL-10 y IL-13). El perfil de citocina exacto en un MLR se considera para ser especifico con el emparejado respondedor-estimulador (Jordán et al., 2002, J. Immunol. Métodos, 260, 1-14). Los ensayos MLR se han usado ampliamente en la investigación para estudio de trayectorias de activación de célula T y para cribar fármacos inmunosupresivos, y en ajustes clínicos para evaluar la función inmunitaria en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y predecir el rechazo del órgano donador posible en receptores de trasplante (Bromelow et al., 2001, J. Immunol. Methods, 247, 1-8) .
El efecto de A26Fab'-PEG en activación y proliferación de célula T aloreactiva humana in vitro se investigó usando un ensayo MLR esencialmente como se describe por O' Flaherty et al., 2000. Las PBMCs de dos donadores no relacionados se co-cultivaron en presencia y ausencia de A26Fab'-í?EG y la proliferación celular se midió ' por incorporación de 3H-timdina. Como se muestra en la Figura 5, la proliferación de célula T inhibida A26 Fab' -PEG en una manera dependiente de dosis con un valor IC50 de 2.149nM (0.1877 g/mL) y una inhibición máxima de 57%. Los sobrenadantes del MLR humano se analizaron en un ensayo de citocina humana de Descubrimiento de Escala Meso (MSD) para investigar el efecto de A26 Fab'-PEG en producción de citocina. La producción parcialmente inhibida A26Fab' -PEGilado de IF -y (55% de inhibición), IL-13 (50% de inhibición) y IL-5 (80% de inhibición) en el MLR (danos no mostrados) .
Método: Inhibición de la respuesta proliferativa MLR PBMC completa de una vía alogénica humana por A26Fab'-PEG. Las PBMCs humanas de dos donadores no relacionados se aislaron de sangre entera. Las células de un donador se inactivaron por irradiación ? para generar la población estimuladora. Las células del donador restante forman la población respondedora. Las poblaciones estimuladora y respondedora se mezclaron en una relación 1:1 (lxlO5 células/donador) y cultivaron en presencia de A26Fab'-PEG ( Ing-lOOpg/mL) durante 6 días. SE utilizó A33 Fab'-PEG (reactivo interno) como un reactivo de control. La proliferación celular se midió en el día 6 por incorporación de 3H-timidina ( 0.5 Ci/pozos) . Los datos se exhiben como inhibición de porcentaje con relación a la respuesta más estimuladora respondedora en ausencia del reactivo biológico, y son los datos combinados de 10 pares de donadores diferentes (media ± SEM) . Los valores IC50 se calcularon usando software Graphpad Prism®. Los resultados se muestran en Figura 5.
Ejemplo 4b: Respuesta de toxoide tetánico El toxoide tetánico (TT) induce respuestas inmunitarias especificas de células T fuertes en individuos vacunados. In vitro, las respuestas de memoria especificas de antigeno para pruebas de estimulación TT pueden detectarse al vigilar la proliferación y producción de citocina (TH1 y TH2 ) de PBMC (Bishop et al., 2005). La proliferación inhibida A26Fab' -PEG y producción de IL-5, IL-13, IFN-? y TNF-a (datos no mostrados) en una manera dependiente de dosis, con inhibición máxima de proliferación alcanza 38%. Los valeres IC50 para inhibición de proliferación, calculado para 2 donadores, fueron 0.58nM (0.051 g/mL) y l.llnM ( 0.097µ?/?t?) . La Fig. 6 muestra la curva de inhibición de proliferación A26Fab' -PEG para 1 donador.
Método: A26 Fab' -PEG inhibe la proliferación de PBMC expuesto a Toxoide tetánico .
Las PBMC se aislaron por separación en un gradiente Ficoll y expusieron a lpg/mL Toxoide tetánico (Calbiochem) en presencia de A26Fab'-PEG (intervalo de concentración 5pg/mL para 0.001 g/mL) en un volumen final de 200pL por pozo en una placa de fondo redondo de 96 pozos. Después de 5 días de incubación a 37°C, C02 al 5%, 100% de humedad, la proliferación celular se midió por incorporación 3H timidina ( 0.5µ??/????) en células activamente divididas. Los resultados de un donador representativo sencillo se presentan. Los valores IC50 se calcularon usando software Graphpad Prism®.
Ejemplo 4c: Respuesta de los ácaros del polvo en la casa El asma aguda severa puede dispararse por antigenos inhalados tales como ácaros del polvo en la casa (Tillie-Leblond et al., 2005, Allergy, 60, (1), 23-29), incluyendo especies del género Dermatophagoides pLeronyssinus . Tales alérgenos inducen respuestas proliferativas por células de sangre periférica y producción de citocina polarizada T H¿ , en pacientes atópicos pero no en paciente no atópicos (Ling et al., 2004, Lancet, 363, 608-615). Un ensayo in vitro se ajustó para determinar el efecto del bloqueo OX40 en la producción de la citocina TH2 IL-13 en respuesta a pruebas de estimulación de antigeno. Las PBMCs se tomaron de gente atópica con un registro IgE. especifico de alérgeno (RAST) entre 3 y 5 (escala 0 hasta 6) y estimulados con antigeno Dermatophagoides pteronyssinus en presencia de A26Fab'-PEG o anticuerpo de control. La producción IL-13 inhibida A26Fab' -PEG a un máximo de 60% con un valor IC50 de 1.23nM (Figura 7) . Adicionalmente, el A26 Fab'-PEG también potencialmente inhibe la producción de las citocinas IL-4, IL-5 y TNF-a en este ensayo mientras que potencia los niveles de la citocina reguladora IL-10 (Figura 8).
Método Figura 7: A26Fab' -PEG inhibe la producción IL-13 de PBMC expuesto a extracto alergénico Derxnatophagoides pteronyssinus. Las PBMC se aislaron de voluntarios alérgicos por separación en un gradiente Ficoll. Los PBMC purificados se expusieron a 25pg/mL extracto alergénico Dermatophagoides pteronyssinus (Greer) en presencia del anticuerpo de prueba (intervalo de concentración 10pg/mL hasta 0.0005pg/mL) en un volumen final de 200pL por pozo en una placa de fondo redondo de 96 pozos. Después de 6 días de incubación a 37 °C, C02 al 5%, 100% de humedad, los sobrenadantes se consecharon y procesaron por ensayo para contenido IL-13 por ELISA (Biosource) . La gráfica representa datos agrupados de tres donadores (media ± SEM) . Los valores IC50 se calcularon usando software Graphpad Prism®.
Método Figura 8: A26Fab' -PEG modula la producción de citocina de PBMC expuesta extracto alergénico Derma.tophagoi.des pteronyssinus . Las PBMC se aislaron de voluntarios alérgicos por .separación en un gradiente Ficoll. Las PBMC purificadas se expusieron a 25pg/mL extracto alergénico Dermatophagoides pteronyssinus (Greer) en presencia de 10µ?/p? A26Fab'-PEG (114nM) o control (TN3 Fab'-PEG) en un volumen final de de 200 L por pozo en una placa de fondo redondo de 96 po,zos. Después de 6 días de incubación a 37°C, CO2 al 5%, 100% de humedad, los sobrenadantes se cosecharon y procesaron por ensayo para contenido de citocina usando un ensayo de mancha múltiple (MSD, por sus siglas en inglés). Las gráficas representan datos agrupados de tres donadores (media ± SEM) . ; Sumario Los valores IC50 para A26Fab'-PEG en ensayos funcionales humanos se resumen en la Tabla 2. La potencia de A26Fab-PEG es similar a través de los tres ensayos y se correlaciona bien con la medición de afinidad basada en célula de:1.106nM. En estos ensayos, ya sea proliferación celular y/o producción de citocinas inf lamatorias múltiples se suprimió significativamente, demostrando que A26Fab'-PEGy profundamente inhibe la activación de célula T. Los ensayos de Toxoide tetánico y Ácaros del Polvo de la Casa ambos miden respuestas de memoria por células T de memoria,; lo que significa que A26Fab' -PEG es capaz de inhibir respuestas de célula T establecidas para una variedad de antigenos.
Tabla 2 Valores IC50 medios para A26Fab' -PEG en ensayos in vitro funcionales humanos La respuesta TH2 ce memoria atópica para antigeno de ácaros del polvo de la casa proporciona un ensayo in vitro 1 O 4 relevante para asma alérgica y los datos sugieren que A26Fab'-PEG puede ser una terapia efectiva en esta indicación. La co-estimulación OX40 previamente se ha ligado a inflamación de pulmón donde se sugiere jugar un papel critico en tanto la diferenciación de células T CD4+ nativas especificas de alérgeno en células TH2 inflamatorias como las respuestas de memoria de células TH2 de memoria (Wang & Liu, 2007, J. Clin. Invest, 117 (12), 3655-3657). Durante la inflamación alérgica, la lipopoyetina estromal timica de citocina innata (TSLP, por sus siglas en inglés) producida por células epiteliales estresadas conduce la maduración de células dendriticas humanas e induce la expresión de OX40L. OX40L funciona para promover polarización TH2 de células T CD4+ con un fenotipo inflamatorio de TNF-a potenciado pero sin producción IL-10 (Ito et al, 2005, J. Exp. Med, 202 (9), 1213-1223). En la respuesta HDM, A26 Fab' -PEG potentemente inhibe las citocinas TH2 clásicas IL-13, IL-5 y IL-4' así como TNF-OÍ. Ádicionalmente, en dos de cuatro donadores alérgicos A26Fab'-PEG potencia la producción IL-10. De esta manera, A26Fab'-PEG puede tener la capacidad no sólo de inhibir respuestas alérgicas sino también modularlos hacia un fenotipo regulador.
Ejemplo 5: A26Fab'-PEG inhibe la proliferación de célula T CD4+ y CD8+ en un modelo Hu-SCID .
El modelo Hu-SCID involucra reconstitución dé ratones SCID con PBMCs humanas que luego producen una respuesta xenogénica fuerte contra el ratón hospedero. Esta respuesta se rastrea por la proliferación de células T humanas en el ratón. Usando datos experimentalmente determinados en el PK de A26Fab'-PEG se diseñó un régimen de dosificación que resulta en concentraciones de plasma en estado estable de 8, 23 y 3 µg/ml A26Fab' -PEG . Los datos en la Figura 9 demuestran que las células T CD4+ y CD8+ se inhiben profundamente al mantener los niveles de plasma en estado estable de A26Fab'-PEG at 8, 23 y 34 µg/ml.
Método: A26Fab' -PEG inhibe proliferación de célula T CD4+ y CD8+ en un modelo Hu-SCID. Los ratones se administración una dosis cargada s.c. de 0.825, 2.475 o 8.25 mg/kg en él día -2 y luego diariamente dosis de mantenimiento s.c. de 0.25, 0.75 o 2.5 mg/kg respectivamente. Los ratones se redujeron de células NK por dosificación con ??ß? un día antes de transferir ocho millones P3MCs humanas en la cavidad peritoneal en el día 0. El experimento luego se finalizó en el dia 14 y la sangre, fluido de lavado peritoneal y homogenado de bazo se analizaron para celular CD4'r y CD8+. El día 14 los ratones fueron asesinados por dislocación cervical y sangraron por punción cardiaca. El número de células CD4+ y CD8+ humanas luego se determinó por análisis FACS. Los datos (n=10) se expresan como media ± SEM. La disminución en células CD4+ y CD8+ en la sangre después de la administración de A26Fab'-PEG se muestra en la Figura 9.
Ejemplo 6: Reactividad cruzada de A26Fab' -PEG con OX40 de primate no humano Para validar el uso de A26Fab'-PEG en modelos de enfermedad de primate . no humano (NHP) y toxicología pre-clínica, se compararon su afinidad relativa y potencia funcional, en células humanas y NHP.
Afinidad basada en células en células NHP Se aislaron células CD4+ T de cynomolgus y Rhesus de sangre periférica y se activan para expresar altos niveles de 0X40. Se midió la afinidad de A26Fab' -PEG por análisis de regresión no lineal de curvas de enlace de equilibrio como se muestra en la Figura 3. A26Fab' -PEG muestra una caída de menos de 2 veces en la afinidad para células CD44 T de cynomolgus o rhesus en comparación con humanas, lo que indica su reactividad: cruzada alta (Tabla 3).
Tabla 3 Comparación de afinidad basada en célula de A26Fab'-PEG en células humanas y NHP .
Se separaron NHP PBMC en un gradiente Linfolito (VH Bio) , se activaron con lpg/mL PHA-L durante 3 días a 37°C, C02 al 5%, 100% de humedad y las' células CD4÷ T se aislaron por selección negativa usando perlas magnéticas (kit de aislado de célula CD4+ T II para primate no humano; MiltenyiBiotec) . Se midieron las afinidades como se describe en el Ejemplo 3a (Figura 3).
Ejemplo 7: Estudio de eficacia en el modelo CIA de mono Cynomolgus Raciocinio para estudio y diseño de estudio La artritis inducida por colágeno en Cynomolgus es un modelo estándar usado para perfilar fármacos anti-artriticos potenciales antes de la experimentación en humanos. En manos del presente solicitante, este modelo responde a tratamientos dirigidos contra TNFoc e IL-6. Estos datos son consistentes con los hallazgos de RA clínicos con terapéuticos antihumanos equivalentes.
IOS La inducción de artritis en monos cynomolgus 1 requiere dos etapas de inmunización con colágeno II separadas por un periodo de 3 semanas. Los síntomas de artritis (hinchazón y endurecimiento de una o más articulaciones) pueden manifestarse en cualquier momento después de la segunda inmunización y se evaluaron semanalmente usando un registro de artritis. El experimento se corrió por 11 semanas en total. OX40 es una molécula de co-estimulación y de esta manera la interferencia con la función pudiera esperarse que tenga efectos en las fases de inmunización del moldeo. Se evaluaron tres regímenes de dosificación con A26 Fab'-PEG. Un grupo recibe A26Fab'-PEG (100mg/kg) sólo una vez el día antes de la primera inmunización. Un segundo grupo recibe ?26 Fab'-PEG (100rng/kg) sólo una vez el día después de la segunda inmunización y el tercer grupo, recibe A26 Fab'-PEG (lOOmg/kg) un día antes de la perima y segunda inmunizaciones. Un grupo de control de animales recibe un vehículo de solución amortiguadora de acetato. El inicio de la enfermedad en el grupo tratado con vehículo se caracterizó por elevaciones en suero en la proteína que reacciona con las proteínas C en fase aguda !CRP) y haptoglobina , (biomarcadores que se miden clínicamente en ensayos RA) . Se evaluó la integridad de las articulaciones por rayos X y por examen histológico.
Resultados y conclusión En animales tratados con A26Fab'-PEG el día antes de la primera inmunización, la severidad de la artritis generalmente fue menor que en el grupo tratado con vehículo. Estas diferencias en registro de artritis son estadísticamente importantes en los días 49, 63 y 76. La Figura 10 muestra un resumen general de los datos para animales individuales expresados como área bajo la curva para registros clínicos. La evaluación de rayos X de erosión ósea de las articulaciones también fue reducida (Tabla 4) ya que hubieron cambios histopatológicos (Figura 11) . Las concentraciones de CRP y haptoglobina tienden a ser menores que en el grupo de control. Se obtuvieron resultados similares para el grupo de animales dosificados con A26Fab'-PEG un día antes de la primera inmunización y un día antes de la segunda inmunización. Sin embargo, no hubo efecto anti artrítico convincente en animales que reciben A26Fab' -PEG sólo una vez el 'día antes de la segunda inmunizaciqn . Estos datos muestran un efecto anti artrítico de tratamiento anti 0X40 en CIA cynomolgus y demuestra la importancia de 0X 0 al inicio de la respuesta inmunitaria patogénica.
Figura 10: Inhibición de registro de artritis por A26 Fab' -PEG en CIA cynomolgus. Los datos muestran un área, bajo la curva (AUC) para animal individual para datos de registro clínico para animales de control que reciben solución amortiguadora de acetato antes de la primera y segunda inmunizaciones (Ac Ac) , animales que reciben antes de la primera inmunización, animales . que reciben antes de la primera inmunización (A26 Ac) , animales que reciben ?26 Fab'-PEG antes de la segunda inmunización (Ac A26) y animales que reciben A26 F.ab' -PEG antes de la primera y segunda inmunizaciones (A26 A26) . Las barras son medias Tabla 4 Efectos de tratamiento de A26 Fab' -PEG en registros de rayos X de erosión ósea Ac Ac animales que reciben vehículo de solución amortiguadora de acetato, A26 Ac animales que reciben A26Fab'-PEG antes de la primera inmunización, Ac A26 animales que reciben A26 Fab' -PEG antes de la segunda inmunización y A26 A26 animales que reciben A26 Fab' -PEG antes de la primera y la segunda inmunizaciones. Medias ± s.e.m., *p<0.05, **p<0.01 prueba Wilcoxin.
Método Figura 11: Reducción en el registro histológico total en CIA cynomolgus por A26Fab ' -PEG . Los datos muestran registros histológicos totales (que incorporan la degeneración del cartílago y hueso, fibrosis, tejido de granulación e hiperplasia) para animales individuales al final del estudio. Los animales- Ac Ac reciben vehículo de solución amortiguadora de acetato, los animales A26 Ac reciben A26 Fab' -PEG antes de la primera inmunización, los animales Ac A26 reciben A26Fab' -PEG antes de la 2a inmunización y los animales A26A26 reciben A26 Fab' -PEG antes de la Ia y2a inmunizaciones. Las barras son medias. Por supuesto se entenderá que la presente invención se ha descrito a modo sólo de ejemplo, no en una manera para limitar, y que las modificaciones del detalle pueden hacerse dentro del alance de las reivindicaciones más adelante. Las características preferidas de cada modalidad de la invención con como para cada una. de -las otras modalidades cambiando lo que haya que cambiar. Todas las publicaciones, incluyendo pero no limitado a patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorporan en la presente para referencia como si cada publicación individual fuera indicada específicamente e individualmente para incorporarse por referencia en la presente como se establece completamente.

Claims (40)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por le tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo antagónico que enlaza OX40 humano que comprende una cadena pesada, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO:l para CDR-Hl, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 20 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.
2. El anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:l para CDR-H.l, la secuencia dada en la SEQ ID O:2 o la SEQ ID NO: 20 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.
3. Un anticuerpo antagónico que enlaza 0X40 humano, que comprende una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la' secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 21 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
4. El anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende adiciona Imente una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 21 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
5. El anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 21 para CDR-Ll, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
6. Un anticuerpo antagónico que enlaza OX40 humano, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende tres CDRs y la secuencia de CDRH-1 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:l, la secuencia de CDRH-2 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDRH-3 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3.
7. El anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 6, que comprende adicionalmente una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDRs y la secuencia de CDRL-1 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4, la secuencia de CDRL-2 tiene al menós 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEO ID NO: 5 y la secuencia de CDRL-3 tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6.
8. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, .caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 9.
9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 7.
10. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque la molécula de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste' de: una molécula de anticuerpo completo que tiene cadenas ligeras y pesadas de longitud completa o un fragmento de las mismas, tal como un Fab, Fab' , Fab' modificado, Fíab';2, Fv, Vh, VL o fragmento scFv.
11. Un anticuerpo antagónico que enlaza OX40 humano, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 7.
12. Un anticuerpo antagónico que enlaza OX40 humano, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad o similitud con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11 y en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad o similitud con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11.
13. Un anticuerpo antagónico que enlaza OX40 humano, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID N0:.15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 11.
14. Un anticuerpo antagónico que enlaza OX40 humano, caracterizado porque las cadenas pesadas y ligeras son al menos 80% idénticas o similares a las correspondientes cadenas pesada y ligera del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13.
15. La molécula de anticuerpo antagónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14 caracterizada porque se ha modificado para permitir que una molécula efectora o reportera se una a esta.
16. La molécula de anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la modificación es la adición al extremo de terminal C de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora o reportera.
17. La molécula de anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los aminoácidos adicionales forman una región de bisagra modificada que contiene uno o dos residuos de cisteína a los cuales la molécula efectora o reportera puede unirse.'
18. La molécula de anticuerpo antagónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizada porque tiene una molécula efectora o una reportera unida a esta.
19. La molécula de anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la molécula efectora comprende uno o más polímeros.
20. La molécula de anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque uno o más polímeros es/son polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno recto o ramificado opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado.
21. La molécula de anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque uno o más polímeros es/son un metoxipoli (etilenglicol ) o poli ( etilenglicol ) .
22. La molécula de anticuerpo antagónico de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque tiene unido a uno de los residuos de cisteína en el extremo terminal C de la cadena pesada un grupo lisii-maleimida o lisil bis-maleimida en donde cada grupo amino del residuo lisilo se ha ligado covalentemente a un residuo metoxipoli ( etilenglicol ) que tiene un peso molecular de alrededor de 20,000 Da.
23. La molécula de anticuerpo antagónico que tienen especificidad para OX40 humano, caracterizada porque es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 11 y que tiene enlazado a la cisteína en la posición 226 de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida en donde cada grupo amino del residuo lisilo se- ha ligado covalentemente a un residuo metoxipoli (etilenglicol ) que tiene un peso molecular de alrededor de 20,000 Da.
24. Un anticuerpo antagónico, caracterizado porque tiene una afinidad de enlace para OX40 humano aislado (por ejemplo dominio extracelular humano) de ????? o mejor.
25. Un anticuerpo antagónico, caracterizado porque tiene una afinidad de enlace para superficie celular que expresa OX40 humano de 2nM o mejor.
26. Un anticuerpo antagónico, caracterizado porque enlaza OX40 humano, caracterizado porque enlaza al mismo epitopo como el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11.
27. Un anticuerpo antagónico, caracterizado porque enlaza OX40 humano que tiene una afinidad de enlace para OX40 humano aislado (por ejemplo dominio extracelular humano) de ????? o mejor y bloquea de forma cruzada el enlace del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11 a 0X40 humano o bloquea de forma cruzada el enlace de OX40 humano por el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11.
28. Un anticuerpo neutralizante antagonista, caracterizado porque enlaza OX40 humano que es capaz de inhibir la actividad de 0X OL humano (a una concentración final de 2'jg/ML) por 50% a una concentración de menos de 5nM de la actividad inhibidora que se mide en el OX40L enlazado al OX40 que se expresa en la superficie de células CD4+OX40+ T .
29. Un epitopo en OX40 humano, caracterizado porque está unido por el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11.
30. Una secuencia de AD aislado, caracterizada porque codifica las cadenas pasadas y/o ligeras de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
31. Un vector de clonación o expresión, caracterizado porque comprende una o más secuencias de AD de conformidad con la reivindicación 30.
32. El vector de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el vector comprende las secuencias dadas en la SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO:.13.
33. El vector de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el vector comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 19.
34. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende uno o más vectores de clonación o expresión de conformidad con la reivindicación 31 o la reivindicación 32 o la reivindicación 33.
35. El proceso para la producción del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 28, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 34 y aislar el anticuerpo.
'36. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
37. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque comprende adicionalmente otros ingredientes "activos .
38. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36 o la reivindicación 37, caracterizado porque es para uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que se media por OX40 o que se asocia con un nivel¦ incrementado de OX40.
39. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que se media por OX40 o que se asocia con un nivel incrementado de OX
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