MX2007013924A

MX2007013924A - Moleculas que unen antigeno que tienen regiones fc modificadas y union alterada a receptores fc.

Info

Publication number: MX2007013924A
Application number: MX2007013924A
Authority: MX
Inventors: Pablo Umana; Fiona Stuart; Peter Sondermann; Claudia Ferrara Koller; Peter Brunker
Original assignee: Glycart Biotechnology Ag
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2008-01-28
Also published as: KR20080032026A; CN101228189A; WO2007039818A2; EP1888649A2; ZA200709630B; AU2006298519A1; RU2007145509A; WO2007039818A3; CA2605781A1; JP2008539753A; BRPI0611445A2; IL187090A0; WO2007039818A8; US20070111281A1; NO20075635L

Abstract

La presente invencion se relaciona con moleculas que unen antigeno, que incluyen anticuerpos, que comprenden una region Fc que tiene una o mas modificaciones de aminoacidos en donde la molecula que une antigeno presenta union alterada a uno o mas receptores Fc como resultado de una o varias de las modificaciones. La invencion se relaciona adicionalmente con polinucleotidos y vectores que codifican para dichas moleculas que unen antigeno, con celulas hospedadoras que comprenden a las mismas, con metodos para la elaboracion de las moleculas que unen antigeno de la invencion y con su uso en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos, por ejemplo canceres.

Description

MOLÉCULAS QUE UNEN ANTIGENO QUE TIENEN REGIONES FC MODIFICADAS Y UNION ALTERADA A RECEPTORES FC CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con moléculas que unen antígeno, que incluyen anticuerpos y que comprenden una región Fc que tiene una o más modificaciones de aminoácidos en donde la molécula que une antígeno presenta unión alterada a uno o más receptores Fc como resultado de una o varias de las modificaciones. La invención se relaciona adicionalmente con polinucleótidos y vectores que codifican para dichas moléculas que unen antígeno, con células hospedadoras que las comprenden, con métodos para elaboración de las moléculas que unen antígeno de la invención y con su uso en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos, por ejemplo cánceres.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos proporcionan un enlace entre los sistemas inmunológicos humoral y celular, la IgG es la inmunoglobulina más abundante en suero. Aunque las regiones Fab del anticuerpo reconocen antígenos, la porción Fc se une a receptores Fcy (los FcyR) que se expresan subclase Fc?RI (Fc?RIA, Fc?RIB y Fc?RIC) están agrupados en la región lq21.1 del brazo largo del cromosoma 1; los genes que codifican para las isoformas FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB y Fc?RIIC) y los dos genes que codifican para Fc?RIII (Fc?RIIIA y FcyRÍIIB) están agrupados en la región lq22. Estos subtipos de FcR diferentes se expresan en tipos de células diferentes (véase J por ejemplo Ravetch, J.V. and Kinet, J.P. Annu . Rev.

Immuno7. 9 : 457-492 (1991)). Por ejemplo, en humanos se encuentra FcyRIIIB únicamente en neutrófilos mientras que FcyRIIIA se encuentra en macrófagos, monocitos, células citolít.icas naturales (NK) y una subpoblación de linfocitos T. De manera notable, FcyRIIIA es el único FcR presente en células NK, uno de los tipos de células implicados en ADCC. FcyRI, FcyRII y Fc?RIII son receptores de la superfamilia de inmunoglobulina (IgSF); Fc?RI tiene tres dominios IgSF en su dominio extracelular mientras que FcyRII y FcyRlII tienen únicamente dos dominios IgSF en sus dominios extracelulares . Otro tipo de receptor Fc es el receptor FC neonatal (fcRn) . FcRn es estructuralmente similar al complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) y consiste de una cadena a unida de manera no covalente a ß2-microglobulina . Recientemente se ha descubierto la importancia de activar el receptor Fc?RIIIa para la eliminación in vivo de dispon:.ble poca información respecto a la influencia de la glucosilación de FcyRIIIa sobre la actividad del receptor. La estructura cristalina de Fc?RIII no glucosilada en complejo con el fragmento Fc de hlgGl indica que la porción carbohidrato putativa de Fc?RIII unida potencialmente en Asn-162 puede apuntar hacia la cavidad central dentro del fragmer.to Fc (Shields, R.L. et al . , J. Biol . . Chem 211 (30) :26733-26740 (2002)), en donde los glucanos de núcleo rígido unidos a IgG-Asn-297 también se localizan (Huber, R. et al . , Na ture 264 (5585) : 415-420 (1976)). Esta distribución sugiere un enfoque posible de las porciones carbohidrato en ambas proteínas ante la formación de complejos. Para analizar la interacción entre IgGl y FcyRIIIa humano soluble (sh) a nivel molecular, la unión de variantes de shFb?RIIIa a distintas glucovariantes de anticuerpo ha sido evaluada por resonancia de plasmón de superficie (SPR) y en un sistema celular.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención se relaciona con una molécula que une antígeno glucomodificada que comprende una región Fc, en donde dicha región Fc tiene una estructura oligosacárida alterada como resultado de dicho proceso de glucomodificación y tiene por lo menos una modificación de aminoácido y en donde la molécula tiene antígeno presenta unión aumenta al receptor FcyRIII humano en comparación con la molécula que une antígeno la cual carece de dicha modificación. En una modalidad preferida, la molécula que une antígero glucomodificada no presenta unión aumentada a un receptor FcyRII humano tal como el receptor FcyRIIa o el receptor FcyRIIb. Preferiblemente, el receptor Fc?RIII se glucosila de manera que comprende oligosacáridos N unidos en Asnl62. En una modalidad, el receptor FcyRIII es FcyRIIIa. En otra modalicad, el receptor FcyRIII es FcyRIIIb. En algunas modalidades, el receptor FcyRIIIa tiene un residuo valina en la pos:.ción 158. En otras modalidades, el receptor FcyRIIIa tiene uin residuo fenilalanina en la posición 158. En una modalidad preferida, la molécula que une antígenlio glucomodificada de la presente invención contiene I una modificación que no incrementa sustancialmente la unión a un receptor Fc?RIII no glucosilado en comparación con una molécula que une antígeno la cual carece de dicha modificación. En una modalidad, la molécula que une antígeno glucomodificada de la presente invención comprende una sustitución en uno o más aminoácidos 239, 241, 243, 260, 262, 263, 264, 265, 268, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 30 0, 301, 302 ó 303. En algunas modalidades, la molécula que une antígeno glucomodificada comprende dos o más de las sustituciones que se incluyen en las tablas 2 y . En algunas modalicades, la molécula que une antígeno glucomodificada comprende dos o más sustituciones que se incluyen en la tabla La presente invención se relaciona adicionalmente con uria molécula que une antígeno glucomodificada que comprende una o más sustituciones que sustituyen a un residuo aminoácjido como se encuentra de manera natural con un residuo aminoaqido que interactúa con el carbohidrato unido a Asnl62 del recteptor FcyRIII. Preferiblemente, el residuo aminoácido que interactúa con el carbohidrato unido a Asnl62 del receptor Fc?RIII se selecciona del grupo que consiste de: Trp, His, Tyr, Glu, Arg, Asp, Phe, Asn y Gln. En una modalidad preferida, la molécula que une antígeno glucomodificada comprende una sustitución que se selecciona del grupo que consiste de: Ser239Asp, Ser239Glu, Ser239Trp, Phe243His, Phe243Glu, Thr260His, His268Asp, His268Glu. De manera alternativa o adicional, la molécula que une antígeno glucomodificada de acuerdo con la presente invencíón puede contener una o más sustituciones incluidas en las tablas 2 ó 4. En una modalidad preferida, la molécula que une antígeno glucomodificada de la presente invención se une al receptor Fc?RIII con una afinidad aumentada por lo menos 10%, con una afinidad aumentada por lo menos 20%, con una afinidad aumentada por lo menos 30%, con una afinidad aumentada por lo menos 40%, con una afinidad aumentada por lo menos 50%, con una afinidad aumentada por lo menos 60%, o con una afinidad aumentada por lo menos 70%, con una afinidad aumentada por lo menos £0%, con una afinidad aumentada por lo menos 90% o con una af:.nidad aumentada por lo menos 100% en comparación con la misma molécula que une antígeno que carece de dicha modificación. La molécula que une antígeno glucomodificada de la presente invención preferiblemente comprende una región Fc de IgG hup.ana . En una modalidad, la molécula que une antígeno es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende una región Fc. En una modalidad preferida, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es quimérico o humanizado. En algunas modalidades, la molécula que une antígeno glucomodificada de acuerdo con la invención presenta una función efectora aumentada. Preferiblemente, la función efectora aumentada es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada o citotoxicidad dependiente de complemento aumentada. La estructura oligosacárida alterada en las moléculas que unen antígeno glucomodificada de la presente invención preferiblemente comprende un número disminuido de residuos fucosa en comparación con la molécula de unión a antígeno glucomodificada . En una modalidad preferida por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80% o más de los oligosacáridos en la región Fc están no fucosiijados , La estructura oligosacárida alterada en las moléculas que unen antígeno glucomodificadas de la presente invención también pueden comprender un número aumentado de oligos=jcáridos bisectados en comparación con una molécula que une antígeno no glucomodificada . El oligosacárido bisectado puede ser de tipo híbrido o de tipo complejo. La presente invenci ón también abarca una molécula que une antígeno glucomcjdificada, en donde la estructura oligosacárida alteraca comprende un incremento en la relación de residuos GlcNAc respecto a residuos fucosa en comparación con la molécula que une antígeno no glucomodificada En una modalidad preferida, las moléculas que unen antígeno glucomodificadas de la presente invención unen selectivamente un antígeno que se selecciona del grupo que consiste de: antígeno CD20 humano, antígeno EGFR humano, antíge?o MCSP humano, antígeno MUC-1 humano, antígeno CEA humano, antígeno HER2 humano, y el antígeno TAG-72 humano. La presente invención también se relaciona con una molécula que une antígeno glucomodificada que comprende una región Fc, en donde la región Fc tiene una estructura oligosacárida alterada como resultado de la glucoalteración y tiene dor lo menos una modificación de aminoácido y en donde la molécula que une antígeno presenta especificidad aumentada por el receptor Fc?RIII humano en comparación con la molécula que une antígeno que carece de dicha modificación. Preferiblemente, la molécula que une antígeno glucomodificada de la presente invención no presenta especificidad aumentada por un receptor Fc?RII, tal como el receptor Fc?RIIIa humano o el receptor FcyRIIb humano. Preferiblemente el receptor FcyRIII está glucosijlado (es decir, comprende oligosacáridos N-unidos en Asnl62) En una modalidad, el receptor FcyRIII es FcyRIIIa En una modalidad alternativa, el receptor FcyRIII es FcyRIIIb. En algunas modalidades, el receptor FcyRIIIa tiene un res;.dúo valina en la posición 158. En otras modalidades, el receptor FcyRIIIa tiene un residuo fenilalanina en la posición 158. En una modalidad preferida, la modificación de aminoáóido de la molécula que une antígeno no incrementa sustanqialmente la especificidad por un receptor FcyRIII no glucosillado en comparación con una molécula que une antígeno la cual carece de la modificación. En una modalidad particularmente preferida, la modificjación comprende sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones de aminoácidos 239, 241, 243, 260, 262, 263, 2S4 , 265, 268, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302 o 303. En una modalidad preferida, la Preferiblemente, la molécula que une antígeno glucomódificada de la invención presenta especificidad aumentada que contiene una región Fc de IgG humana. En otra modalidad preferida, la molécula que une antígeno es un anticu rpo o un fragmento de anticuerpo que comprende una región Fc. En una modalidad particularmente preferida, el anticu rpo o fragmento de anticuerpo es quimérico o humanizado. La molécula que une antígeno glucomodificada de acuerdo con la invención preferiblemente presenta una función efectora aumentada por ejemplo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada o citotoxicidad dependiente de complemento aumentada. La estructura oligosacárida alterada puede comprender un número disminuido de residuos fucosa en comparación con una molécula con antígeno no glucomodificada , Por ejemplo, la invención abarca una molécula que une antígerio glucomodificada en donde por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o más de los oligosacáridos en la región Fc están no fucosi ados En otra modalidad, la estructura oligosacárida alteracfa puede comprender un número aumentado de oligosacáridos bisectados en comparación con una molécula que adicioralmente con vectores y células hospedadoras que comprenden a los polinucleótidos de la invención. La presente invención también se relaciona con un método para producir una molécula que une antígeno glucomcdificada que comprende una región Fc, en donde la región Fc tiene una estructura oligosacárida alterada como resultado de la glucoalteración y tiene por lo menos una modificación de aminoácido y en donde la molécula que une antígeno presenta unión aumentada a un receptor FcyRIII humano en comparación con una molécula que une antígeno la cual carece de dicha modificación, el método comprende: (i) cultivar la célula hospedadora de la invención bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido; y (ii) recuperar la molécula que une antígeno glucomodificada del medio de cultivo. La invención también se relaciona con un método para producir una molécula que une antígeno glucomodificada que comprende una región Fc, en donde la región Fc tiene una estructura oligosacárida alterada como resultado del proceso de glucomodificación y tiene por lo menos una modificación de aminoácido y en donde la molécula que une antígeno muestra selectividad aumentada por el receptor FcyRIII humano en comparación con la molécula que une antígeno la cual carece de dicha modificación, el método comprende: (i) cultivar la célula hospedadora de la invención bajo condiciones que permitan la expresión del polinu ¡leótido; y (ii) recuperar la molécula que une antígeno glucomcj>dificada del medio de cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura la a figura lc. Caracterización oligosa cárida de anticuerpos glucomodificados (GE) y natural es: (Fig. la) porción carbohidrato asociada con Asn297 de Fc pe IgGl humana. Los azúcares en negrillas definen el núcleo pentasacárido; la adición de los otros residuos azúcar es var:.able. La bisección del residuo GlcNAc unido ßl,4 se introduce por GnT-III humano. (Fig.lb) espectro MALDI-EM de oligosacáridos neutros liberados de anticuerpos nativos y GE. El valor m/z corresponde al ion oligosacárido asociado a sodio. Para confirmar el tipo de carbohidrato los anticuerpos se trajan con endoglucosidasa H la cual únicamente hidroliza híbridas pero no glucanos complejos. (Fig.lc) distribuciones de oligosacárido de las glucovariantes de IgG utilizadas en este estudio. Gluco-1 se refiere a una variante de anticuerpo glucomodificada generada a partir de la sobreexpresión de GnT-III solo. Gluco-2 se refiere a una variante de anticuerpo glucomojdificada generada por coexpresión de GnT-III y Manll recombinante Figura 2al a figura 2b2. Unión de shFc?RIIIa[Val-158] o shFc?RIIIa[Phe-158] a glucovariantes de IgGl inmovilizadas. La fase de asociación está representada por una barra continua por encima de las curvas. (Fig.2a) superposición de sensogramas de los eventos de unión para shFc?Rllla[Val-158] y shFcyRIIla [Phe-158] , respectivamente. Para ccmparar el evento de unión de los anticuerpos GE dentro de un intervalo de respuesta similar, se superponen los sensogramas que se obtienen a concentraciones de 800 nM o 6.4 µM para el anticuerpo nativo. Todos los sensogramas se normalizan al nivel de inmovilización. (Fig.2b) Análisis cinético para shFcyRIIIa [Val-158] y shFc?RIIIa[Phe-158] , que se unen a gluco-2. Las curvas ajustadas y los errores residuales (abajo) se derivan de un ajuste de curva no lineal. Figura 3a a figura 3c. Unión de los glucovariantes de IgG a shFc?RIIla[Val-158/Gln-162] . Todos los sensogramas se normalizan al nivel de inmovilización. (Fig.3a) superposición de sensogramas de los eventos de unión para shFc?Rllla[Val-158/Gln-162] . La fase de asociación se representa por una barra continua por encima de las curvas.

(Fig.3b ) superposición de sensogramas de los eventos de unión para slt?Fc?RIIIa[Val-158/Gln-162] . o shFc?RIIIa[Val-158] que se unen a WT o gluco-2. (Fig.3c) unión de célula completa de IgG a células Jurkat que expresan shFc?RIIIa[Val-158/Gln-162] y shFc?RIIIa[Vall58] no transfectadas. La unión de FcyRIIIa se proporciona en unidades arbitrarias. Figura 4a a figura 4b. La interacción propuesta de la FcyRI II glucosilada con el fragmento Fc de IgG. (Fig.4a) Se mué; stra en el recuadro la estructura cristalina de FcyRIII a en el complejo con el fragmento Fc de IgG natural (PDB c od igo le4k) . El rectángulo indica el recorte mostrado antes . Las dos cadenas del fragmento Fc y FcyRIII no glucosi lado se muestran como superficie con Asnl62 y el residuc fucosa indicados. Los glucanos unidos a Fc se mués t r an como esferas y barras. El residuo fucosa unido al carbohidrato de la cadena de fragmento Fc es respon sable del impedimento estérico de la intera cción propuesta con el carbohidrato FcyRIII.

(Fig.4 b) Modelo de interacción entre FcyRIII glucos ilado y el fragmento Fc (no fucosilado) de GE- IgG Dado que no está presente el residuo fucosa dentro de Ge-IgG, los carbohidratos unidos en Asnl62 del re ceptor pueden interactuar profundamente con GE- IgG. ja figura fue generada utilizando el programa PYMOL (w w.delanoscientific. com) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los términos se utilizan en la presente como se usan generalmente en la técnica a menos que se defina de otra manera en lo siguiente, ABREVIATURAS: Ig, inmunoglobulina; ADCC, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo; CDC, citotoxicidad dependiente de complemento; PBMC, células mononuoleares de sangre periférica; GE, glucomodificado, GlcNAc, N-acetilglucosamina; Man, mañosa, Gal, galactosa, Fue, fucosa; NeuAc, ácido N-acetilneuramínico; GnT-III, N-acetilglucosaminiltransferasa III; ka, constante de velocidad de asociación; kd, constante de velocidad de disociación. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo se pretende que incluya moléculas de anticuerpo complet.as, que incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales y multiespecíficos (por ejemplo biespecíficos) así cono fragmentos de anticuerpo que tengan la región Fc y que retengan la especificidad de unión y por lo menos una función efectora, por ejemplo ADCC y proteínas de fusión que incluyan una funcionalidad de región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y que retengan la especificidad de unión y por lo menos una función efectora. También se abarcan los anticuerpos quiméricos y humanizados así como los anticuerpos conjugados con secuencias de camello y con secuendias de primate. Como se utiliza en la presente, región Fc se pretende que se refiera a una región C terminal de una cadena pesada de IgG humana. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de Icadena pesada de IgG humana habitualmente se define como el tramo desde el residuo aminoácido en la posición Cys226 hasta la parte carboxilo terminal. Como se utiliza en la presente, el término región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina se pretende que incluya variantes alélicas que se producen de manera natural de una región Fc de una inmunoglobulina así como variantes que tengan alteraciones las cuales producen sustituciones, adiciones o supresiones pero las cuales no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina por mediar funciones efectoras (tal como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo). Por ejemplo se pueden suprimir uno o más aminoácidos de la parte N o C terminal de la región Fc de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes se pueden seleccionar de acuerdo con reglas generales conocidas en la técnica de manera que se tenga un efecto mínimo en la actividad (véase, por ej emplo, Bowie, J. U. et al . , Science 247:1306-10 (1990) ) Como se utiliza en la presente, el término molécula que une, an tígeno o ABM se refiere en su sentido más amplio a una molécula que une específicamente un determinante antigénico. Preferiblemente la ABM es un anticuerpo; no obstante también se contemplan por la presente invención anticuerpos de cadena sencilla, moléculas Fv de cadena sencilla, fragmentos Fab, diacuerpos, triacuerpos, tetracujerpos y similares. Mediante la frase se une específicamen te o se une con la misma especificidad, cuando se utiliza para describir una molécula que une antígeno de la invención se quiere indicar que la unión es selectiva para el antígeno y se puede diferenciar de interacciones no deseadas o no específicas. Como se utiliza en la presente, los términos fusión y quimérico, cuando se utilizan con referencia a polipéptidos tales como las ABM se refieren a polipéptidos que comprenden secuenqias de aminoácidos derivadas de dos o más polipéptidos heterólogos, tales como porciones de anticuerpos de especies diferentes. Para las ABM quiméricas, por ejemplo, los componentes que no unen antígeno se pueden derivar de una amplia variedad de especies que incluyen primates tales como chimpancés y humanos. La región constante de la ABM quimérica de manera más preferible es sustancialmente idéntica a la región constante del anticuerpo humano natural; la región variable del anticuerpo quimérico de manera más preferible es sustancialmente idéntica a la de un anticuerpo recombinante que tenga la secuencia de aminoácidos de la región variable murina Los anticuerpos humanizados son una forma particularmente preferida de anticuerpo de fusión o quimerino Como se utiliza en la presente, un polipéptido que tiene, por ejemplo, a ctividad de GnT-III se refiere a un poli Lpéptido que es capaz de catalizar la adición de un residuc N-acetilglucosamina (GlcNAc) en un enlace ß-1-4 manósico unido en ß del núcleo trimanosilo de oligosacáridos N-unidc s. Esto incluye los polipéptidos de fusión que presentan actividad enzimática similar a, aunque no necesariamente idéntica a una actividad de ß(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III, también conocida como ß- 1, -manosilglucoproteína, 4-ß-N-acetulglucosaminiltransferasa (EC 2 1.144) de acuerdo con el Nomenclature Committee of the International Union of Niochemistry and Molecular Biology (NC-I UBMB , medido en un análisis biológico particular, con o sin de?endencia de la dosis. En el caso en el que exista dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a la de GnT-III sino más bien sustancialmente similar a la dependencia de dosis en una actividad dada, en comparación con Gn -III (es decir, el polipéptido candidato presentará una actividad mayor o no mayor de 25 veces menor, y de manera preferíble, no mayor de aproximadamente diez veces menos actividad, y de manera mucho más preferible no mayor de aproximadamente tres veces menos actividad en relación a GnT-III) . Como se utiliza en la presente, el término varian te ana ogo) se refiere a un polipéptido que difiere de un polipeptido mencionado específicamente de la invención por inserciones, supresiones y sustituciones de aminoácidos creadas! utilizando, por ejemplo, técnicas de ADN recombilnante. Las variantes de las ABM de la presente invencijón incluyen moléculas que unen antígeno quiméricas, conjugadas con secuencias de primate o humanizadas en donde uno o varios de los residuos aminoácidos están modificados por sustitución, adición y/o supresión de manera tal que no afectan sustancialmente la afinidad de unión a antígeno o la función efectora de anticuerpo. La guía para determinar cuales residuos aminoácidos se pueden sustituir, agregar o suprimir sin eliminar las actividades de interés se puede encontrar al comparar la secuencia del polipéptido particular con la de péptidos homólogos y minimizar el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones de alta homología (regiones conservadas) o al sustituir los aminoácidos con secuencias de consenso. De manera alternativa, las variantes recombinantes que codifican para estos polipéptidos iguales o similares se pueden sintetizar o seleccionar haciendo uso de la "redundancia" en el código genético. Se pueden introducir diversas sustituciones de codones tales como cambios que no se expresan, los cuales producen diversos sitios de restricción con el fin de optimizar la clonación en un vector plasmídico o viral o la expresión en un sistema particular procariotico o eucariótico. Las mutaciones en la secuencia polinucleotídica se pueden reflejar en el polipéptido o los dominios de otros péptidos agregados al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, para cambiar características tales como afinidades de unión a ligandc , afinidades entre cadenas, o una velocidad de degrada ción/recambio . Preferiblemente, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de sustituir un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos se pueden realizar en base en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alaninaj, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagPna y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las "inserciones" o "supresiones" preferiblemente están en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos, de manera más preferible de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoáqidos. La variación permitida puede ser determinada experipjentalmente al realizar de manera sistemática inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en una mqlécula de polipéptido utilizando técnicas de ADN recombilnante y realizando análisis de las variantes recombi|nantes resultantes para determinar actividad. Como se utiliza en la presente, el término humanizado se utiliza para referirse a una molécula que une antígeno (ABM) derivada de una molécula que une antígeno no humana, por ejemplo un anticuerpo murino que retiene o que sustanqialmente retiene las propiedades de unión a antígeno de la rjaolécula de origen pero la cual es menos inmunogénica en humanos. Esto se puede obtener por diversos métodos que incluyen: (a) injertar únicamente las regiones determinadoras de complementariedad (CDR) no humanas en una infraestructura humana y regiones constantes con o sin retención de los residuos de infraestructura críticos (por ejemplo aquellos que sor importantes para retener una buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo) , o (b) transplantar la totalidad de los dominios variables no humanos, pero "ocultarlos" con una sección similar a humana por sustitución de residuos de superficie. Tales métodos se describen en Jones et al., Na ture 321:6069, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, AdV. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al . , Science 239:1534-1536 (1|988) ; Padlan, Molec . Immun . 28:489-498 (1991); Padlan, Molec . Immun . 31 (3) : 169-217 81994), la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad en este documento. Generalmente existen tres CDR (CDRl, CDR2 y CDR3) en cad uno de los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, los cuales están flanqueados por cuatro subregiones de infraestructura (es decir, FRl, FR2, FR3 y E'R4) : FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR . Una exposición de los anticuerpos humanizados se puede encontrar, por ejemplo, en la patente de E.U.A. número 6,632,927 y en la solicitud de E.U.A. publicada número 2003/0175269, ambas incorporadas en la presente en su totalidad. De manera similar, como se utiliza en la presente, el término conj ugados con secuencias de prima te se utiliza para referirse a una molécula que se une a antígeno derivada de una molécula que une antígeno que no es de primate, por ejemplo un anticuerpo murino que retiene o que retiene sustancialmente las propiedades de unión a antígeno de la molécula de origen pero la cual es menos inmunogénica en primates . En el caso en donde existen dos o más definiciones de un término el cual se utiliza y/o se acepta dentro de la técnica, la definición del término como se utiliza en la I presentje se pretende que incluya la totalidad de dichos signifi cados a menos que se establezca de manera explícita en sentido contrario. Un ejemplo específico es el uso del termine "región determinadora de complementariedad" ("CDR", por sus siglas en inglés) para describir sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. Esta región particular se ha descritlo por Kabat et al . , en el U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al . , J. Mol . Biol . 196: 901-917 (1&87), las cuales se incorporan en la presente como referencia, en donde las definiciones incluyen superposición o subconjuntos de residuos aminoácidos cuando se comparan unos con otros. No obstante, la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de la misma está diseñada para estar dentro del alcance del término como se define y utiliza en la presente. Los residuos aminoácidos apropiados los cuales abarcan las CDR ccmo se definen por cada uno de las referencias mencionadas en lo anterior se establecen a continuación en la tabla 1 como una comparación. Los números de residuos exactos los cuales abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar de manera sistemática cuales residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de Immunological Interest" (1983) (incorporada en la presente como referencia en su totalidad). Las secuencias de cualquier listadc de secuencia (es decir, la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 1 a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 2) no se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. No obstante, como se establece en lo antericr, está dentro de la habilidad habitual de una persona experta en la técnica determinar el esquema de numeración de Kabat de cualquier secuencia de región variable en la lista de secuencia en base en la numeración de las secuencias como se presentan en este documento. Mediante un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos, por ejemplo 95% idénti ca o que tenga 95% de identidad, a una referencia en la secuencia nucleotídica de la presente invención, se pretende que la secuencia nucleotídica del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos 95% idéntica a una secuencia nucleotídica de referencia se pueden suprimir o sustituir con otros nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia o se pueden insertair en la secuencia de referencia un número de nucleótjidos de hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuenqia de referencia De manera práctica, siempre que una molécula de ácido ijiucleico particular o un polipéptido es por lo menos ¡0%. 86%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia nucleotídica o secuencia polipeptídica de la presente invención se puede determinar convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia general entre una secuencia interrogada (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominada como alineación de secuencia global, se puede determinar utilizando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al . , Comp . App . Biosci . 6: 237-245 (.1990) . En una alineación de secuencia, las secuencia es interrogada y sujeto son ambas secuencias de ADN. Se puede comparar una secuencia de ARN al convertir las U a T. El resultado de dicha alineación de secuencia global es el porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos utilizados en la alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: matriz = unitaria, múltiplos de k = 4, castigo por malpareamiento = 1, castigo por unión = 30, longitud del grupo de aleatorización = 0, calificación de corte = 1, castigo por separación = 5, castigo por tamaño de separación = 0.05, tamaño de intervalo = 500 o la longitud de la secµencia nucleotídica sujeto, lo que sea más corto. Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia interrogada debido a su presiones 51 o 3' y no debido a supresiones internas debe realizarse una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no toma en consideración los cortes 5' y 3' de la secuenc ia sujeto cuando calcula el porcentaje de identidad.

Para secuencia sujeto truncadas en los extremos 5' o 3 J en relación a la secuencia interrogada, el porcentaje de identicad se corrige al calcular el número de bases de la secuencia interrogada que están 5' y 3' de la secuencia sujeto, las cuales no están pareadas/alineadas, como porcentaje de las bases totales de la secuencia interrogada.

Cuando un nucleótido es pareado/se determina la alineación por resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje después se resta del por ciento de identidad, calculado como el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificados para llegar a una calificación de porcentaje de identidad final. Esta calificación corregida es la que se utiliza para propósitos de la presente invención. Únicamente las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia sujeto se muestran por la alineación FASTDB, las cuales no están pareadas/alineadas con la secuencia interrogada, y son las que se calculan para los propósitos de ajustar manualmente la calificación de porcentaje de identidad. Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se alinea con una secuencia interrogada de 100 bases para determilnar el porcentaje de identidad. Las supresiones se producen en el extremo 5' de la secuencia sujeto y por lo tanto la alineación FASTDB no muestra pareamiento/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no pareadals representan 10% de la secuencia (número de bases en los ext.remos 5' y 3' que no coinciden/número total de bases en la slecuencia interrogada) de manera que se resta 10% de la califidación de identidad de porcentaje calculada por el programa FASTDB. Si las 90 bases remanentes coinciden perfectiamenté el porcentaje de identidad final será de 90! En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 bases con uná secuencia interrogada de 100 bases. Esta vez las supresiones son supresiones internas de manera que no hay bases en el extremo 5' o 3' de la secuencia sujeto que no estén areadas/alineadas con la secuencia interrogada. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solo las bases en el extremo 5' y 3' de la secuencia sujeto las cuales no están pareadas/alineadas con la secuencia interrogada son las que se corrigen manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para propósitos de la presente invención. Mediante un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos, por lo menos, por ejemplo 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos interrogada de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto sea idéntica a la secuencia interrogada exceptó que la secuencia polipeptídica sujeto puede incluir hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos interrogada. En otras palabra s, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoac idos interrogada, se pueden insertar, suprimir o sustitu ir con otros aminoácidos hasta 5% de los residuos aminoác idos de la secuencia sujeto. Estas alteraciones de la secuenc ia de referencia se pueden presentar en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier otra parte entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre residuqs en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De manera práctica, siempre que cualquier polipéptido particular es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 9 %, 98% o 99% idéntico a un polipéptido de referencia se puede determinar convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia general entre una secuencia interrogada (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominada como una alineación de secuencia global, se puede determinar utilizando el programa de computadora FASTDB en base en el algoritmo de Brutlag et al . , Comp . App . Biosci . 6:237-245 (1990). En una alineación de secuencia, las secuencias interrogada y sujeto son ambas secuenqias nucleotídicas o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación de secuencia global es el porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos utilizados en una alineación de aminoácidos FASTDB son: matriz = PAM 0, múltiplos de k = 2, castigo por malpareamiento = 1, castigo por unión = 20, longitud del grupo de aleatorización = 0, calificación de corte = 1, tamaño de intervalo = longitud de secuencia, castigo por separación = 5, castigo por tamaño de separacion = 0.05, tamaño de intervalo = 500 o la longitud de la secuencía de aminoácidos sujeto, lo que sea más corto. Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia interrogada debido a supresiones en las partes N o C terminales, y no debido a supresiones internas, debe realizarse los resultados una corrección manual. Esto es debido a que el programa FASTDB no toma en consideración cortes en las partes N y C terminales de la secuencia sujeto cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para secuencias sujeto truncadas en las partes terminales N y C, en relación a la secuencia interrogada, el por ciento de identidad se corrige al calcular el número de residuos de la secuenc ia interrogada que se encuentran en la parte N y C termina1 de la secuencia sujeto, los cuales no se hacen coincic ir/alinear con un residuo sujeto correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia interrogada. El hecho de que un residuo este pareado/alineado se detjermina por los resultados de la alineación de la secuencia FASTDB. Este porcentaje después se resta del porcentlaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anteridr utilizando los parámetros especificados para llevar una calificación final de porcentaje de identidad. Esta califiqación final de porcentaje de identidad es la que se utiliza para propósitos de la presente invención. Únicamente los residuos en las partes terminales N y C de la secuencia sujeto, los cuales no se hacen coincidir/o alinear con la secuencjia interrogada son los que se consideran para los propósitos de ajustar manualmente la calificación de porcentaje de identidad. Esto es, únicamente las posiciones de residuo interrogadas fuera de los residuos N y C terminales más alejados de la secuencia sujeto. Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos aminoácidos se alinea con una secuencia interrogada de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La supresión se produce en la parte N terminal de la secuencia sujeto y por lo tanto la alineación FASTDB no muestra una coincidencia/alineación de los primeros 10 residuos de la parte N terminal. Los 10 residuos no pareados representan 10% se la secuencia (número de residuos en las partes terminales N y C que no coinciden/número total de residuos en la secuencia interrogada) de manera que se resta 10% de la calificiación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. Si los 90 residuos remanentes coinciden perfectamente, el porcentaje de identidad final será de 90%. En otr|o ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 residuos con una secuencia interrogada de 100 residuos. Esta vez las supresiones son supresiones internas de manera que no hay reiiduos en las partes N o C terminales de la secuencia sujeto las cuales no estén pareadas/alineadas con la interrógada. En este caso, el porcentaje de identidad calcule do por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, únicame nte las posiciones de residuo fuera de los extremos N y C terminales de la secuencia sujeto, como se muestra en la alineadion FASTDB, los cuales no estén pareados/alineados con la secuencia interrogada es para los cuales se hace la correcejión manual. No necesitan realizarse otras correcciones manuales para propósitos de la presente invención. Como se utiliza en la presente, un ácido nucleico que hibridiza baj o condiciones rigurosas a una secuencia de ácido nucleico de la invención se refiere a un polinucleótido que hi ridiza, en una incubación durante la noche a 42 °C en una solución que comprende formamida 50%, 5X SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM) . fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), soluciójn de Denhardt 5x, sulfato de dextrano 10% y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, seguido! por lavado de los filtros en O.lx SSC a aproximadamente 65 °C. Como se utiliza en la presente, dominio de localización de Golgi se refiere a una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que reside en el aparato de Golgi él cual es responsable del anclaje del polipéptido en un lugar dentro del complejo de Golgi. Generalmente, los dominios de localización comprenden "colas" amino terminal de una enzima Como se utiliza en la presente, el término función efectona se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia natural o una región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticue Irpos incluyen, pero no se limitan a afinidad de receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés), fagocitosis celular dependiente de- anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés) , secreción de citocinas, captación de antígeno mediada por complejo inmunológico por células presentadoras de antíjgeno, regulación por disminución de receptores de la superfibie celular, etc.

Como se utiliza en la presente, los términos modif i ca r, modificado, que modifica , glucomodif icar , glucom codificado, que glucomodif ica y modificar la glucosi lación se considera que incluyen cualquier manipulación del patrón de glicosilación de un polipéptido como se presenta de maneras natural o recombinante, tal como una molécula que une antígeno (ABM, por sus siglas en inglés) , o un fragmento de la misma. La glucomodificación incluye modificación metabólica del mecanismo de glucosilación de una célula que incluye manipulaciones genéticas de las vías de síntesis de oligosacáridos para obtener glucosilación alterada de glucoproteínas que se expresan en células. Además, la glucomodificación incluye efectos de mutaciones y del ambiente celular en la glucosilación. En una modalidad, las modificaciones resultan en una forma alterada de actividad de glucosaminiltransferasa y/o actividad de fucosiltransferasa. Como se utiliza en la presente, el término célula hospeda dora abarca cualquier clase de sistema celular el cual pueda ser manipulado para generar los polipéptidos y las moléculas que unen antígeno de la presente invención. En una modalidad, la célula hospedadora es manipulada para permitir la pr >ducción de una molécula que une antígeno con glucoformas modificadas. En una modalidad preferida, la molécula que une antígeno es un anticuerpo, un fragmento de región Fc de IgG2 humana de secuencia natural; la región Fc de IgG3 humana de secuencia natural y la región Fc de IgG4 humana de secuencia natural así como las variantes que se encuent ran de manera natural de las mismas. Se contemplan otras secuencias y se obtienen fácilmente de diversos sitios en la red (por ejemplo el sitio de la red de NCBI) . Los términos receptor Fc y FcR se utilizan para descritjir un receptor que se une a una región Fc (por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) del equivalente funcional de una región Fc . Las porciones de receptor Fc están contempladas específicamente en algunas modalidades de la presente invención. En modalidades preferidas, el FcR es un FcR humano de secuencia natural. En otras modalidades preferidas, el FcR es uno el cual se une a un anticuerpo IgG (un receptor y) e incluye receptores de las subclases Fc?RI, Fc?RII y FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen a Fc?RIIa (un "receptor activante") y FcyRIIb (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activante FcyRIIa contiene un inmuno-receptor de motivo de activación basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. La inhibición del receptor Fc?RIIb contiene un inmuno-receptor de mot ivo de inhibición basado en tirosina (ITIM) en su dominic citoplásmico. El término también incluye al receptor neonata 1 FcRn, el cual es responsable de la transferencia de las Ig 3 maternas al feto. Un ejemplo de un receptor Fc abarcado por la presente invención es el precursor III-A del receptor de la región Fc de inmunoglobulina y de baja afinidad (receptor III-2 de Fc de IgG) (Fc-? RlII-a) (Fc-? con una afinidad peor que la del polipéptido de origen. Tales variantJes las cuales muestran unión disminuida a un FcR pueden presentar poca o nula unión apreciable a un FcR, por ejemplo 0-20% de unión al FcR en comparación con el polipédtido de origen. Una variante polipeptídica la cual une FcR con afinidad a umen tada en comparación con un polipéptido de origen es aquel el cual se une a cualquiera de uno o más de los FcR identificados en lo anterior en una afinidad de unión mayor que el anticuerpo de origen, cuando las cantidades de la variante polipeptídica y el polipéptido de origen en el análisis de unión son esencialmente las mismas, y todas las demás condiciones son idénticas. Por ejemplo, una variante polipeptídica con afinidad de unión FcR mejorada puede mostrar desde aproximadamente 1.10 veces hasta aproximadamente 10 veces de mejoría (es decir incremento) (de manera más típica de aproximadamente 1.2 veces aproximadamente 50 veces) en la afinidad de unión de FcR en comparación con el polipéptido de origen, cuando se determina la afimidad de unión de FcR, por ejemplo, en un análisis basado en FACS o un análisis de SPR (Biacore) . Como se utiliza en la presente, una modificación de aminoácido se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada. Las modificaciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a una sustitución, inserción y/o supresión de aminoácidos. En modalidades preferidas, la modificación de aminoácido es una sustitución (por ejemplo en una región Fc de un polipéptido de ori en) . Una modificación de aminoácido a una posición especificada (por ejemplo en la región Fc) se refiere a la sustitucion o supresión del residuo especificado, o la inserción de por lo menos un residuo aminoácido adyacente al residuo especificado. La inserción puede ser N terminal o C termina1 al residuo especificado. El término afinidad de unión se refiere a la constante de disociación al equilibrio (expresada en unidades de con entración) asociada con cada interacción de unión receptora Fc-Fc. La afinidad de unión se relaciona directamente con la relación de la velocidad de disociación cinética (generalmente reportada en unidades de inverso del tiempo, por ejemplo segundos"1) dividido entre la velocidad de asociacion cinética (generalmente reportada en unidades de concentración por unidad de tiempo por ejemplo molar/segundo) . En general no es posible establecer de manera inequívoca si los cambios en las constantes de disociación al equilibrio se deben a diferencias en las velocidades de asociacion, las velocidades de disociación o ambas a menos que ada uno de estos parámetros se determine experímentalmente (por ejemplo por medio de mediciones BIACORE (véase www . biacore . com) o SAPIDYNE. Como se utiliza en la presente, el término ci totoxi cidad cel ular mediada por Fc incluye citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y citotoxicidad celular mediada por una proteína de fusión Fc soluble que contiene una región Fc humana. Es un mecanismo inmunológico que lleva a la lisis de las "célula que son el objetivo de los anticuerpos" por "células efectoras inmunológicas humanas", en donde: las cél ulas efectoras inmunológicas humanas son una población de leucocitos que muestran receptores Fc en su superficie a través de los cuales se unen a la región Fc de anticuerpos o de proteínas de fusión Fc y realizan funciones efectoras. Dicha población puede incluir pero no se limita a células, mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y/o células citolíticas naturales (NK, por sus siglas en inglés) . Las cél ulas que son el objetivo de los anticuerpos son céJulas unidas por las ABM (por ejemplo anticuerpos o proteínas de fusión Fc) de la invención. En general, los anticuerpos o las proteínas de fusión Fc se unen a las células objetivo vía la parte N terminal de la proteína a la región Fc. Como se utiliza en la presente, el término ci totoxicidad celular mediada por Fc a umen tada se define como un incremento en el número de "células que son el objetivo de los anticuerpos" que son lisadas en un momento dado y a una concentración dada de anticuerpo o proteína de fusión en el medio circundante de las células objetivos por el mecanismo de citotoxicidad celular mediado por Fc definido en lo anterior y/o una reducción en la concentración de anticuerpo proteína de fusión Fc en el medio circundante a las células objetivo necesario para obtener la lisis de un número dado de "células que son el objetivo de los anticuerpos" en un tiempo dado por el mecanismo de citotoxicidad celular mediado por Fc. El incremento en la citotoxicidad celular mediada por Fc es relativo a la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo o la proteína de fusión Fc producida por el mismo tipo de células hospedadoras, utilizando los mismos métodos convencionales de producción, purificación, formulación y almacenamiento los cuales son conocidos por los expertos en la técnica pero los cuales no han sido producidos por células hospeda oras glucomodificadas para expresar la glucosiltransferasa GnT-III por los métodos que se describen en la presente. Mediante un anticuerpo que tiene ci totoxicidad celular dependien te de an ti cuerpo a umentada (ADCC, por sus siglas en inglés) se quiere indicar un anticuerpo, como se define en la presente el término, tiene ADCC aumentada, determinado por cualquier método adecuado conocido por aquellos habitualmente expertos en la técnica. Un análisis de ADCC in vitro aceptado es el siguiente: 1) el análisis utiliza células objetivo que se sabe expresan el antígeno objetivo reconocido por la región del antjicuerpo que se une a antígeno; 2) el análisis utiliza células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) humanas aisladals de sangre de donadores sanos seleccionados aleatoriamente, como células efectoras; 3) el análisis se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo: i) las PBMC se aislan utilizando procedimientos de centrifugación por densidad estándar y se suspenden a 5 x 106 células/ml en medio de cultivo de células RPMI; ii) las células objetivo se hacen crecer por métodos de cultivo de tejido estándar, se cosechan desde la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad mayor de 90%, se lavan en medio de cultivo de células RPMI, se marcan con 100 µ-Curies 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidald de 105 células/ml; iii) 100 µl de la suspensión de células objetivo final anterior se transfiere a cada pozo de placa de microtitulación de 96 pozos; iv) el anticuerpo se diluye de manera seriada de 4000 ngVml a 0.04 ng/ml en medio de cultivo de célula y se agregan 50 µl de las soluciones de anticuerpo resultantes a las céJulas objetivo en una placa de microtitulación de 96 pozos, probando por triplicado diversas concentraciones de anticuerpo que abarcan la totalidad del intervalo de concentjración anterior; v) para controles de liberación máxima (MR) , 3 pozos adicionales en la placa que contienen células objetivo marcadas reciben 50 µl de una solución acuosa 2% (V/V) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en vez de la solución de anticuerpo (inciso iv anterior); vi) para los controles de liberación espontánea (SR, 3 pozos adicionales en la placa que contiene las células objetivo marcadas reciben 50 µl de medio de cultivo de célula RPMI qn vez de la solución de anticuerpo (inciso iv anteríolr) ; ¡ vii) la placa de microtitulación de 96 pozos i después) se centrifuga a 50 x g durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4°C; viii) se agregan a cada pozo 50 µl de la suspensión PBMC (inciso i anterior) para proporcionar una relación de células efectoras/objetivo de 25:1 y las placas se colocan en un incubador bajo una atmósfera de C02 5% a 37°C dudante 4 horas; ix) el sobrenadante libre de células de cada pozo se eosecha y se cuantifica la radioactividad liberada experimentalmente (ER) utilizando un contador y) ; x) se calcula el porcentaje de lisis específica para c da concentración de anticuerpo de acuerdo con la fórmula (ER-MR) / (MR-SR) x 100, en donde ER es la radioactividad promedio cuantificada (véanse inciso ix anterior) para la concentración de anticuerpo, MR es la radioactividad promedio cuantificada (véase inciso ix anterior) para los MR control (véase inciso v anterior) y SE I es la radioactividad promedio cuantificada (véase inciso ix anterio::) para los controles SR (véase inciso vi anterior) ; 4) "ADCC aumentada" se define ya sea como un incremento en el porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentración de anticuerpo probado en lo anterior, y/o una reducción en la concentración de anticuerpo necesaria para obtener la mitad del porcentaje máximo de lisis específica que se observa dentro del intervalo de concentración de anticuerpo probado en lo anterior. El incremento en ADCC es relativo a ADCC, medido con el análisis anterior, mediadc por el mismo anticuerpo, producido por el mismo tipo ce células hospedadoras, utilizando los mismos métodoe estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento los cuales son conocidos por aquellos expertcs en la técnica pero que no han sido producidos por células hospedadoras manipuladas para sobreexpresar GnT-III.

Variantes de las Regiones Fc La presente invención proporciona polipéptidos, que incluyen moléculas que unen antígeno que tienen regiones Fc modificadas, secuencias de ácido nucleico (por ejemplo vectores) que codifican para dichos polipéptidos, métodos para generar polipéptidos que tienen regiones Fc modificadas y métocos para utilización de las mismas en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos. Preferiblemente, las regiones Fc modificadas de la presente invención difieren de una región Fc de origen no modificada en la modificación de por lo menos un aminoácido. El polipéptido "de origen", 'inicial1" o "no modificado" preferiblemente comprende por lo menos una porción de una región Fc de anticuerpo y se puede preparar utilizando técnicas disponibles en el arte para generar] polipéptidos que comprenden una región Fc o una porción de la misma. En modalidades preferidas, el polipéptido de origen es un anticuerpo. No obstante, el polipéptido de origen puede ser cualquier otro polipéptido que comprende por lo menos una porción de una región Fc (por ejemplo una molécula que une antígeno) . En algunas modalidades, se puede generar una región Fc modificada (por ejemplo de acuerdo con los métodos descritos en la presente) y se puede fusionar a un polipéptido heterólogo de elección tal como un dominio variable de anticuerpo o un dominio de unión de un receptor o ligando. En modalidades preferidas, los polipéptidos de la invención comprenden un anticuerpo completo que comprende las cadenas ligera y pesada que tienen una región Fc modificada , En modalidades preferidas, el polipéptido de origen comprende una región Fc o una porción funcional de la misma Generalmente, la región Fc del polipéptido de origen comprenderá una región Fc de secuencia natural y de manera preferible una región Fc de secuencia natural humana. No obstante, la región Fc del polipéptido de origen puede tener una más alteraciones o modificación en la secuencia de aminoacidos preexistentes con respecto a una región Fc de secuencia natural. Por ejemplo, la actividad de unión Clq de la reglón Fc puede haber sido alterada previamente o la afinidad de unión FcyR de la región Fc puede haber sido alterada. En modalidades adicionales, la región Fc del polipéptido de origen es conceptual (por ejemplo una idea mental o una representación visual en una computadora o de manera impresa), y aunque físicamente no existe, el manipulador de anticuerpos puede decidir sobre una secuencia de aminoácidos de una región Fc modificada deseada y generar un polipéptido que comprenda dicha secuencia o un ADN que codifique para la secuencia de aminoácidos de la región Fc modificada deseada. No obstante, en modalidades preferidas está disponible (por ejemplo comercialmente) un ácido nucleico que codifica para una región Fc de un polipéptido de origen y esta secuencia de ácido nucleico se altera para generar una secuencia de ácido nucleico variante que codifica para la región Fc modificada. Los polinucleótidos que codifican para un polipéptido que comprende una región Fc modificada se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica utilizando la guía de la presente invención para secuencias particulares. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a preparación por mutagénesis dirigida a sitio (o mediada por oligonucleótido) , mutagén?sis por PCR y mutagénesis de cásete o de un ácido nucleico preparado previamente que codifica para el polipéptido. La mutagénesis dirigida al sitio es un método preferido para preparar variantes de sustitución. Esta técnica es bien conocida en el arte (véase, por ejemplo, Cárter et al . , Nuclei c Acids Res . 13:4431-4443 (1985) y Kunkel et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 82:488 (1987), ambas incorporadas en la presente como referencia) . Brevemente, al llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio de ADN, eJ ADN de inicio se altera al hibridizar primero un oligonucleótido que codifica para la mutación deseada a una cadena sencilla de dicho ADN de inicio. Después de la hibridación, se utiliza ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena completa utilizando el oligonucleótido hibridizado como un cebador y utilizando la cadena única del ADN de' inicio como una plantilla. De esta manera, el oligonutleótido que codifica para la mutación deseada se inco >rpora en el ADN de cadena doble resultante. La mutagénesis por PCR también es adecuada para producir variantes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de inicio no modificado (véase, por ejemplo, Vallettfe et al . , Nuc. Acids Res . 1 1: 123-133 (1989), incorporado en la presente como referencia) . Brevemente, cuando se utilizan cantidades pequeñas de ADN plantilla como materia1 inicial en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en el ADN plantilla se pueden utilizar para generar cantidades relativamernte grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia plantilla únicamente en las posiciones en donde los cebadores difieren de la plantilla. Otro método para preparar variantes, la mutagénesis de case te, se basa en la técnica descrita por Wells et al . , Gene 34.-315-323 (1985), incorporada en la presente como referenlcia. El material inicial es un plásmido (u otro vector) que comprende el ADN polipeptídico de inicio que se va a mddificar. Se identifican uno o varios de los codones en el ADN de inicio que se van a mutar. Debe existir un sitio de endonucleasa de restricción único en cada lado de uno o varios de los sitios de mutación identificados. Si no existen dichos sitios de restricción se pueden generar utilizando el método de mutagénesis mediada por oligonucleótido descrita antes para introducirlos en los lugares apropiados en el ADN polipeptídico de inicio. El ADN plasmídico se corta en estos sitios para linealizarlo. Se sintetiza un oligonucleótido de cadena doble que codifica para la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contiene una o varias de las mutaciones deseadas utilizando procedimientos estándar, en donde dos cadenas del oligonucleótido se sintetizan por separado y después se hibridizan juntas utilizando técnicas estándar. Este oligonucleótido de cadena doble se denomina como un cásete. Este cásete se diseña para tener extremos 5' y 3' que son compatibles con los extremos del plásmido linealizado de manera que se pueden ligar directamente al plásmidD. Este plásmido ahora contiene la secuencia de ADN mutada . De manera alternativa o adicional, la secuencia de aminoácidos deseada que codifica para una variante polipeptídica se puede determinar y una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha variante de secuencia de aminoácidos se puede generar de manera sintética. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de origen se puede modificar con el fin de generar una región Fc variante con una afinidad o actividad de unión a receptor Fc alterada in vitro y/o in vivo y/o en una o más funciones efectoras alteradas, tal como actividad de citotoxicidad mediada! por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) , in vitro y/o in vivo. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de origen también se puede modificar con el fin de generar una región Fc modificada con propiedades de unión a complementos alteradlas y/o una vida media de circulación. Se pueden llevar a cabo modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la región Fc al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener: (a) la estructura de la infraestructura del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrof bicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se encuentran de man era natural se dividen en clases, en base en las propiec ades comunes de la cadena lateral: (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, . his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Las sustituciones conservadoras implicarán intercajmbiar un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Uno puede someter a ingeniería una región Fc para produc r una variante con una afinidad de unión alterada para u no o más de los FcR. Uno puede, por ejemplo, modifi? :ar uno o más residuos aminoácidos en la región Fc con el fin de alterar (por ejemplo aumentar o disminuir) la unión a un FcR. En las modalidades preferidas, la modifi :ación comprende uno o más de los residuos de la región Fc identificados en la presente (véase, por ej empl i, tabla 2) . Generalmente, uno realizará una sustitüción de aminoácidos en uno o más de los residuos de la reg ón Fc identificados en la presente considerando que llevan a cabo la unión de FcR con el fin de generar dicha variant:e en la región Fc . En las modalidades preferidas, se sup imirá o sustituirá un máximo de 1 a aproximadamente 10% de los residuos de región. Las regiones Fc en la presen e comprenden una o más modificaciones de aminoá idos (por ejemplo sustituciones) que prefer blemente retendrán por lo menos aproximadamente 80% y de mañera preferible por lo menos aproximadamente 90% y de mañera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 95% de la secuencia de la región Fc de origen o de una región Fc humana de secuencia natural. Uno también puede realizar regiones Fc modifiaadas por inserción de aminoácidos, variantes las cuales tienen una función efectora alterada. Por ejemplo, uno puede introducir por lo menos un residuo aminoácido (por jemplo uno o dos de los residuos aminoácidos y generalmente no más de diez residuos) adyacentes a una más de las posiciones de la región Fc identificadas en la present e que inciden en la unión de FcR. Por adyacente se quiere significar dentro de uno o dos residuos aminoácidos de un residuo en la región Fc identificado en la presente Dichas variaciones de región Fc pueden mostrar una unión FcR me; orada o disminuida y/o la función efectora. Con el fin de generar dichas variantes de inserción, uno puede evaluar la estructura de co-cristal de un polipéptido que comprende una región de unión de un FcR (por ejemplo, el dominio extracelular de FcR de interés) y la región Fc en la cua se van insertar uno más de los residuos aminoácidos (véase, por ejemplo, Sondermann et a l . , Na t ure 406-. 2 S1 (2000); Deisenhofer, Bi ochemi s try 20 (9) : 2361-2370 (1981); y Burmeister et a l . , Na ture 3442:379-383, (1994), la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia) con el fin de diseñar de manera razonada una región Fc modificada que presente por ejemplo una capacidad de unión a FcR mejorada. Al introducir las modificaciones de secuencia de aminoac:idos apropiadas en la región Fc de origen, uno puede enerar una variante de la región Fc la cual: (a) medie una o más de las funciones efectoras en presencia de célula efectoras humanas más o menos eficazmente y/o (b) que une un receptor Fcy (FcyR) o recepyor neonatal Fc (FcRn) con una afinidad mejor que el polipéptido de origen Dichas regiones Fc modificadas generalmente comprenderán por lo menos una modificación de aminoácido en la egión Fc . En modalidades preferidas, la región Fc del polipéótido de origen es una región Fc humana, por ejemplo IgGl humana natural (alotipos A y no A), una región IgG2, IgG3 o IgG4, que incluye todos los alotipos conocidos o descubiertos. Tales regiones tienen secuencias tales como las que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-2 En algunas modalidades, la región Fc de polipé;pitidos de origen es una región Fc no humana. Las región s Fc no humanas incluyen regiones Fc derivadas de especi s no humanas tales como, pero sin limitarse a sujeto equinos, porcinos, bovinos, murinos, caninos, felino , primates no humanos y sujetos aviares, por ejempl una región Fc de IgG natural no humana incluye todas as subclases y alotipos conocidos o descubiertos. En algunas modalidades, con el fin de generar una región Fc modificada con una función efectora mejorada (por ejemplo ADCC) el polipéptido de origen preferí blemente tiene actividad ADCC preexistente (por ejemplo el polipéptido de origen comprende IgGl humana o región Fc de IgG3 humana) . En algunas modalidades, una región Fc modificada con ADCC mejorada media ADCC de manera sustancialmente más eficaz que un anticuerpo con una secjuencia natural de IgGl o región Fc de IgG3. En modalidades preferidas, una o más modif idaciones de aminoácidos se introducen en el dominio CH2 de la región Fc de origen con el fin de generar una región Fc de IgG modificada con afinidad de unión o actividad a receptor y de Fc alterado (FcyR) . En algunas modalidades, una o más de las modi f i|cac i one s de aminoácidos se introducen en el dominijo CH2 de la región Fc de origen y se la 10 15 20 25 origen comprenden la sustitución del residuo existente con un residuo que se selecciona del grupo que consiste de: Trp, His, Tyr, Glu, Arg, Asp, Phe, Asn y Gln. En algunas modalidades, se introduce más de una modificación de aminoácidos en un dominio CH2 de la región Fc de ori gen con el fin de generar una región Fc de IgG modificada con afinidad de unión o actividad FcyR alterada al combinar cualquiera de las modificaciones individuales que se incluyen en la tabla 2 de manera que una modificación en una posición se puede combinar con una o más modificaciones adiciónales que se localizan en posiciones diferentes para producir dos o más modificaciones de la región Fc de origen. En modalidades preferidas se modificará un máximo de uno a aproximadamente diez residuos de la región Fc. Las regiones Fc en la presente comprenden una o más modificaciones (por ejemplo sustituciones) de aminoácidos y preferiblemente retendrán por lo menos aproximadamente 80% y de man ira preferible por lo menos aproximadamente 90% y de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 95% de la secuencia de la región Fc de origen o de una región Fc humana de secuencia natural. En algunas modalidades, se introducen una o más modificaciones de aminoácidos en el dominio CH2 de la región Fc de rigen lo que resulta en una unión reducida de manera significativa de la región Fc modificada para FcyRIIIa, por Ser239Asp/Phe243Glu/Thr260H His268GE-?, Ser239Glu/Ptae243Glu/Thr260His/His268Gjta, Ser239Trp/Phe243Glu/Thr260Hls/His268G£a En una modalidad preferida, más de una de las modificaciones de aminoácidos introducidas en el dominio CH2 de la región Fc de origen involucra cualquier combinación con Thr260His como se indica en la tabla 5. Los polipéptidos de la invención que tienen regiones Fc modificadas se pueden someter a una o más modificaciones adicionales, dependiendo del uso deseado o propuesto del polipéptido. Dichas modificaciones pueden involucrar, por ejemplo, alteración adicional de la secuencia de aminoácidos (sustitución, inserción y/o supresión de residuos aminoácidos), fusión a uno o varios polipéptidos heterólogos y/o modificaciones covalentes. Dichas modificaciones adicionales se pueden realizar antes, de manera simultánea o después de una o varias de las modificaciones de aminoácidos descritos en lo anterior lo que resultará en una alteración de la unión al receptor y/o la función efectora de Fc. De manera alternativa o adicional, puede ser útil combinar modificaciones de aminoácidos con una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que alteren la unión Clq y/o la función de citotoxicidad dependiente de complemento de la región Fc. El polipéptido de inicio de interés particular a este respecto es aquel que se une a Clq y presenta citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . Las sustituciones de aminoácidos descritas en la presente pueden servir para alterar la capacidad del polipéptido inicial para unirse a Clq y/o modificar su función de citotoxicidad dependiente de complemento (por ejemplo para reducir y preferiblemente suprimir estas funciones efectoras). No obstante, se contemplan en la presente polipéptidos que comprenden sustituciones en una o más de las posiciones descritas con una unión a Clq y/o una función de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) mejoradas. Por ejemplo, el polipéptido inicial puede ser incapaz de unirse a Clq y/o mediar CDC y se puede p.odificar de acuerdo con las enseñanzas en la presente de manera que adquiera estas funciones efectoras adicionales. Además, los polipéptidos con actividad de unión Clq preexistente y que opcionalmente tienen de manera adicional la capacidad de mediar CDC se pueden modificar de manera que una o ambas de esta actividades se incrementen. Las modificaciones de aminoácidos que alteran Clq y/o que modifican su función de citotoxicidad dependiente de complemento se describen, por ejemplo, en WO00/42072, la cual se incorpora en la presente como referencia. Como se describe en lo anterior, se puede diseñar una regPón Fc o una porción de la misma con función efectora alterada por ejemplo al modificar la unión a Clq y/o la unión a FcR y de esta manera cambiar la actividad CDC y/o la actividad ADCC. Por ejemplo, uno puede generar una región Fc modificada con unión Clq mejorada y unión Fc?III mejorada (por ejemplo al tener tanto una actividad ADCC mejorada como una actividad CDC mejorada) . De manera alternativa, cuando uno desea que se reduzca o se suprima la función efectora, uno puede manipular o modificar la región Fc con actividad CDC reducida y/o actividad ADCC reducida. En otras modalid.ades, uno puede incrementar únicamente una de estas actividades y opcionalmente también reducir la otra activid.ad, por ejemplo para generar una región Fc modificada con actividad ADCC mejorada pero con actividad CDC reducida, y viceversa. Otro tipo de sustitución de aminoácidos sirve para alterar al patrón de glucosilación del polipéptido. Esto se puede obtener, por ejemplo, al suprimir una o más porciones de carbohidrato encontradas en el polipéptido y/o al agregar uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el polipéptido. La glucosilación de polipéptidos tipicamente está N-unida u O-unida. N-unida se refiere a la unión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias peptidicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral asparagina. Asi, la presencia de cualquiera de estas secuencias peptidicas en un polipéptido genera un sitio potencial de glucosilación. La glucosilación 0-unida se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . En algunas modalidades la presente invención proporciona composiciones que comprenden una modificación del polipéptido de origen que tiene una región Fc en donde la región Fc modificada comprende por lo menos una modificación de aminoácido de un residuo de superficie (véase, por ejemplo Deisenhofer, Biochemistry 20 ( 9) : 2361-70 (1981) y O00/42072, ambas incorporadas en la presente como referencia) . En otras modalidades la presente invención proporciona composiciones que comprenden una modificación del polipépfcido de origen que tiene una región Fc en donde la región Fc modificada comprende por lo menos una modificación de un residuo aminoácido que no está en la superficie. En modalidades adicionales, la presente invención comprende una variante del polipéptido de origen que tiene una región Fc en donde la variante comprende por lo menos una modificación en un aminoácido de superficie y por lo menos una modificación en un aminoácido que no está en la superficie. Análisis para Polipéptidos que Tienen Regiones Fc Modificadas La presente invención proporciona adicionalmente diversoá análisis para el cribado de polipéptidos de la presente invención que tienen regiones Fc modificadas. Los análisis: de cribado se pueden utilizar para encontrar o confirmar regiones Fc modificadas útiles. Por ejemplo, se pueden cribar los polipéptidos con regiones Fc modificadas para encontrar variantes con unión FcR aumentada, o una o varias funciones efectoras tales como actividad ADCC o CDC (por ejemplo actividad ADCC o CDC aumentada o disminuida) . Además lambién se pueden cribar polipéptidos modificados con modificaciones de aminoácido en residuos que no están en la superficie (por ejemplo se puede cribar una región de Fc modificada con por lo menos una modificación de aminoácido de superficie y una modificación de aminoácido que no está en la superficie. Además, como se describe en lo siguiente, los análisis de la presente invención se pueden utilizar para encontr.ar o confirmar regiones Fc modificadas que tienen actividad terapéutica benéfica en un sujeto (por ejemplo tal como un humano con síntomas de una enfermedad que responde a anticue rpo o inmunoadhesina) . Se puede utilizar una variante de los tipos de análisis para evaluar cualquier cambio en un polipépitido que tenga una región Fc modificada en comparación con el polipéptido de origen (véanse los análisis de cribado que se proporcionan en O00/42072 incorporada en la presente como referencia) . Los análisis ejemplares adicionales se describan en lo siguiente. En modalidades preferidas, los polipéptidos que tienen regiones Fc modificadas de la presente invención son molécullas que unen antigeno que retienen esencialmente la capacidad de unir antigeno (via una región de unión de antigeno no modificada o una región de unión de antigeno modificada) en comparación con un polipéptido (de origen) no variante (por ejemplo la capacidad de unión preferiblemente es no menor de aproximadamente 20 veces o no menor de aproximadamente 5 veces la del polipéptido no variante) . La capacidad de unión de la variante de polipéptido respecto al antigeno se puede determinar utilizando técnicas tales como análisis de clasificación de células activado por flúorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RÍA) por ejemplo Para información más detallada acerca del evento de unión se puede realizar un análisis de interacción biológica utilizando SPR. Los análisis de unión de receptor de Fc (FcR) se pueden utilizar para evaluar los polipéptidos con regiones Fc modificadas de la presente invención. Por ejemplo, la unión de receptores Fc tales como Fc?RI, Fc?RII, Fc?RIIb, Fc?RIII, FcRn, etc., se pueden medir al titular el polipéptido modificado y medir la variante de polipéptido modificado unido utilizando un anticuerpo el cual se une específicamente a la vaciante polipeptidica en un formato ELISA estándar. Por ejemplq, una molécula que une antigeno que comprende una región Fc modificada de la presente invención se puede cribar en un análisis ELISA estándar para determinar la unión a un FcR. Una superficie sólida se puede recubrir con un antigeno, El excaso de antigeno se puede lavar y la superficie se bloquea. El polipéptido modificado (anticuerpo) es especifico para este antigeno y por lo tanto se une a la superficie recubierta con antigeno. Después se puede agregar un FcR conjugado a una marca (por ejemplo biotina) y se lava la superficie. En la siguiente etapa se agrega una molécula especifica para la etiqueta en el FcR (por ejemplo avidina conjugada a una enzima) . Posteriormente se puede agregar un sustrato con el fin de determinar la cantidad de unión del FcR al polipéptido con la región Fc modificada. Se pueden comparar los resultados de este análisis con la capacidad del polipéptido de origen que carece de la modificación para unir el misrro FcR. En modalidades preferidas, el FcR se selecciona de Fc?JI IA, Fc?RIIB y FcyRIIIA para IgG, dado que estos receptores (por ejemplo expresados de manera recombinante) pueden ser utilizados con éxito para el cribado de regiones Fc modificadas de la presente invención. De hecho, dichos análisis de unión con estos receptores preferidos inesperadamente permiten la identificación de regiones Fc modificadas útiles. Por lo tanto es inesperado que los polipéptidos modificados útiles (por ejemplo con unión FcR referenjeia) . i Se puede determinar la capacidad de los polipéptidos modificados para unir Clq y mediar la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . Por ejemplo, para determinar la unión de Clq, se puede realizar una prueba de unión de Clq por ELISA. Un análisis de unión de Clq ejemplar es como sigue. Las placas de anáJisis se pueden recubrir durante la noche a 4°C con polipéptido modificado de la invención o polipéptido de origen (control) en amortiguador de recubrimiento. Las placas las cuales expresan el antigeno al cual se une la variante polipepjtidica se pueden diluir a una densidad de ~1 x 106 células/ml. Las mezclas de la variante polipeptidica, el compleirento humano diluido y células que expresan el antigeno se pueden agregar a una placa de 96 pozos se cultivo de tejido de fondo plano y se permiten que se incube durante 2 horas a 37°C y C02 5% para facilitar la lisis celular mediada por complemento . Después se pueden agregar a cada pozo 50 µl de azul alamar (Accumed International) y se incuba durante la noche a 37 °C. Se puede medir la absorbancia utilizando un fluorímetro de 96 pozos con excitación a 530 nm, y emisión a 590 nm , Los resultados se pueden expresar en unidades de fluorescencia relativa (RFU, por sus siglas en inglés) . Se pueden calcular las concentraciones de muestra a partir de una curva estándar y el porcentaje de actividad en comparación con un polipéptido no variante se pueden reportar para el polipéptido variante de interés. En modalidades preferidas, el polipéptido modificado tiene una afinidad de unión por Clq humano que el polipéptido de origen. Dicha variante puede presentar, por ejemplo, una mejoría de aproximadamente dos veces o más, y de manera preferible aproximadamente cinco veces o más en la unión de Clq humano en comparación con el polipéptido de origen (por ejemplo a valores CI50 para estas dos moléculas) . Por ej emplo, la unión de Clq humano puede ser desde dos veqes a aproximadamente 100 veces (o mayor) de mejoría en la actividad de CDC in vitro o in vivo cuando se comparan los valores de CI50] . Los polipéptidos que tienen regiones Fc modificadas de la ppresente invención también se pueden cribar in vivo. Se puede utilizar cualquier tipo de análisis in vivo. Un ejemplo particular de un tipo de análisis se proporciona a continuación. Este análisis ejemplar permite la evaluación preclínica de regiones Fc modificadas in vivo. Un polipéptido modificado que se va a probar se puede incorporar en la región Fc de un anticuerpo particular que se sabe tiene cierta actividad. Por ejemplo, se puede incorporar una modificación en la región Fc de una IgG anti-CD20 por mutagédesis. Esto permite que la IgG de origen y la IgG con variante en Fc se compara directamente con RITUXAN (que se sabe promueve la regresión de tumor) . La evaluación preclínica se puede realizar en dos fases (una fase farmacocinética y una farmacodinámica). El objetivo de los estudios farmacocinéticos en fase I es determinar si existen diferencias en la velocidad de depuración entre la variante de Fc para IgG y el anticuerpo con la actividad conocida in vivo (por ejemplo RITUXAN) . Las diferencias en la velocidad de depuración pueden generar diferencias en la concentración i en estado estable de IgG en suero. De esta manera, si se detectap diferencias en las concentraciones en estado estable, estas deben ser normalizadas para permitir que se realice: comparaciones precisas. El objetivo de los estudios farmacodinámicos en fase II es determinar el efecto de las mutacioies de Fc sobre, en este caso, el crecimiento de tumor. Los estudios anteriores con RITUXAN utilizaron una dosis única la cual inhibe por completo el crecimiento de tumor. Debido a que esto no permite que se midan diferencias cuantitativas debe utilizarse un intervalo de dosis. La comparación farmacocinética en fase I de un polipéptido que tiene una región Fc modificada de la presente invención, el Fc de origen no modificado (por ejemplo de tipo silvestre) y RITUXAN se puede realizar de la siguiente manera. En primer lugar, se pueden inyectar intravenosamente 40 µg por animal y se cuantifica la concentración en plasma de IgG a las 0, 0.25, 0.5, 1, 24, 48, 168 y 336 horas. Los datos se pueden ajustar, por ejemplo, utilizando un programa farmacolcinético (WinNonLin) utilizando un modelo farmacocinético de dos compartimientos con retraso 0 para obtener la velocidad de depuración. La velocidad de depuracion se puede utilizar para definir la concentración en plasma en estado estable con la siguiente ecuación: C = Dosis/ (velocidad de depuración x T) en donde T es el interva |lo entre dos y C es la concentración en plasma en estado estable. Los experimentos farmacocinéticos se pueden realizar en un ratón que no presente tumor, por ejemplo, con un mínijmo de 5 ratones por punto de tiempo. Se puede utilizar un modelo en animales para la siguiente fase de la siguiente manera. El flanco derecho de ratón es CB 17-SCID se puede implementar con células 106 Raji subsecuentemente. El bolo intravenoso del polipéptido con la región Fc modificada, el polipéptido con Fc de origen (por ejemplo tipo silvestre) y RITUXAN se pueden iniciar inmediatamente después de la implantación y continúan hasta que el tamaño del tumor es mayor de 2 cm de diámetro. EL volumen! del tumor se puede determinar cada lunes, miércoles y viernes al medir la longitud, anchura y profundidad del tumor utilizalndo un calibrador (volumen de tumor = W x L x D) . Una gráfica del volumen del tumor versus tiempo proporcionará la velocidjad de crecimiento del tumor para el cálculo farmaccjdinámico. Se debe utilizar un mínimo de aproximadamente 10 animales por grupo. La comparación farmacodinámica en fase II del polipépjtido con la región Fc modificada de la invención, Fc de origen (por ejemplo tipo silvestre) y RITUXAN se puede realizalr de la siguiente manera. En base en los datos publica¡dos, RITUXAN a 10 µg/g a la semana inhibe completamente el crecimiento de tumor in vivo (Clynes et al . , Na t . Med. 2000 Abril; 6 (4 ): 443-6, 2000, incorporado en la presentíe como referencia) . Por lo tanto, se puede probar un interva!lo de dosis semanal de 10 µg/g, 5 µg/g, 1 µg/g, 0.5 µg/g y 0 µg/g. La concentración en plasma en estado estable a la cual se inhibe la velocidad de crecimiento de tumor en 50% se puede determinar gráficamente por la relación entre la concentración en plasma en estado estable y la eficacia. Se puede calcular la concentración en plasma en estado estable como se describe en lo anterior. Si es necesario, se puede ajustar T en consecuencia para cada polipéptido de región Fc modificado y Fc de tipo silvestre dependiendo de sus propiedades farmacocinéticas para obtener concentración en plasma en estado estable comparable al de RITUXAN. Los valores farmacodinámicos mejorados estadísticos del polipéptido modificado en comparación con el polipéptido de origen (por ejemplo Fc de tipo silvestre) y RITUXAN generalmente indicarán que el polipéptido modificado confiere actividad mejorada in vivo, En modalidades adicionales, las regiones Fc modificadas de la presente invención se criban de manera que se identifican las variantes que son útiles para uso terapéutico en por lo menos dos especies. Dichas variantes se denominan en la presente como "variantes mejoradas de especie doble" y son particularmente útiles para identificar variantes que son terapéuticas en humanos y también demuestran (o es probable que demuestren) eficacia en un modelo animal. A este respecto, la presente invención proporciona métodos para identificar variantes que tienen una fuerte probabilidad de ser aprobados para pruebas clínicas en humanos dado que los datos en modelos en animales probablemente soportarán cualquier aplicación de prueba en humanos realizada para agencias reguladoras gubernamentales (por ej emplo la U.S. Food and Drug Administration) . En algunas modalidades, los polipéptidos modifi Qados mejorados de especies dobles se identifican al realizar primero un análisis de ADCC utilizando células efectoras humanas para encontrar polipéptidos modificados mejorados y después se realiza un segundo análisis ADCC utilizando células efectoras de ratón, rata o de primate no humano para identificar un subconjunto de los polipéptidos modifiqados mejorados que son polipéptidos modificados mejorados de especie doble. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para identificar poli .ppééptidos modificados mejorados de especie doble, que comprende: a) suministrar: i) células objetivo, ii) una composición que comprende un polipéptido modificado candidato de un polipéptido de origen que tiene por lo menos una porción de una región Fc en donde el polipéptido modificado candidato comprende por lo menos una modificación de aminoácido en la región Fc y en donde el polipéptido modificado candidato media la citotoxicidad a célula objetivo en pre encia de una primera especie (por ejemplo humana) de células efectoras más eficazmente que el polipéptido de origen, y iii) células efectoras de la segunda especie (por ejemplo de ratón, rata o primate no humano) , y b) incubar la composición con las células objetivo bajo condiciones de manera tal que el polipéptido modificado candidato una las células objetivo y de esta manera se genere células objetivo unidas a polipéptido modificadas candidato, c) mezclar las células efectoras de segunda especie con las células objetivo unidas a polipéptido modificado candidato y d) medir la citotoxicidad de la célula objetivo mediada por el poli -pPééptido modificado candidato. En algunas modalidades, el método comprende además la etapa e) determinar si el poli -Péptido modificado candidato media la citotoxicidad de células objetivo en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido de origen, En algunas modalidades, el método comprende además la etapa de f) identificar un polipéptido modificado candidato como un poli Lpéptido modificado mejorado de especie doble que media la citotoxicidad de células objetivo en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido de origen. En modalidades preferidas, los poli -pPééptidos modificados de especie doble identificados después se criban in vivo en uno o más análisis en animales. En algunas modalidades, los polipéptidos modifiqados mejorados de especie doble se identifican al realizar cualquiera de los análisis anteriores utilizando componentes humanos (por ejemplo células humanas, receptores Fc humanos, etc.), para identificar polipéptidos mejorados que tienen regiones Fc modificadas y después realizar el mismo análisis (o un análisis diferente) con componentes animales no humanos (por ejemplo células de ratón, receptores Fc de ratón, etc.). A este respecto, un subconjunto de polipéptidos modificados que funcionan bien de acuerdo con los criterios dados en análisis basados en humanos y en análisis basados en segunda especie se pueden identificar. Un procedimiento ejemplar para identificar polipépridos mejorados de especie doble tienen regiones Fc modific.idas de la invención es como sigue. En primer lugar una secuencia de ácido nucleico que codifica para por lo menos una porción de una región Fc de IgG se modifica de manera que la secuencia de aminoácidos expresada tiene por lo menos ui cambio de aminoácido por lo que se genera una región Fc modificada. Esta variante de IgG expresada después se retiene vía antígeno sobre una placa de análisis. Después, la variantb retenida se criba para determinar unión a FcyRIII humano utilizando ELISA. Si la variante demuestra una unión a FcyRIII mejorada o comparable (en comparación con la región Fc de origen no mutada) , se criba la variante para determinar unión ci FcyRIII humano utilizando ELISA. Después se puede calcular la relación de especificidad relativa para la variants. Posteriormente se realiza un análisis ADCC con la variante utilizando los PBMC humanos o un subconjunto (células NK o macrófagos, por ejemplo) . Si se encuentra activicad ADCC aumentada, entonces se criba la variante en un segunde análisis ADCC utilizando PBMC de ratón o rata. De manera alternativa, o adicional, se puede realizar un análisis con la variante para unión a receptores de roedor clonados o líneas de células. Finalmente, si se encuentra que la var .ante mejora en el segundo análisis, se realiza una variante mejorada doble entonces se criba la variante in vivo en ratcnes o ratas.

Polipéptidos Ejemplares que Comprenden las Regiones Fc Modificadas de la Invención Las regiones Fc variantes de la presente invención pueden ser partes de moléculas más grandes, preferiblemente molécul|as que unen antígeno (AMB, por sus siglas en inglés). Cuanto más grandes sean las moléculas, por ejemplo anticuerpo monoclonal, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos, inmunoaldhesinas, etc. Como tales, es evidente que existe una amplia gama de aplicaciones para las regiones Fc modificadas de la presente invención. Para todas las posiciones descritas en la presente invención la numeración de una cadena pesada de inmunoglobulina es de acuerdo con EU index (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición United States Public health Service, National Institµtes of Health, Bethesda) . El "EU index es como en Kabat" se refiere a la numeración del residuo del anticuerpo EU IgGJ humano. Las moléculas que unen antígeno que comprenden las regiones Fc modificadas de la presente invención se pueden optimizlar para una diversidad de propiedades. Las propiedades que pueden ser optimizadas incluyen pero no se limitan a afinidad mejorada o reducida para un FcyR. En una modalidad preferijda, las regiones Fc modificadas de la presente invención se optimizan para poseer afinidad mejorada por FcyR activamente humano, preferiblemente, FcRI, Fc?RIIa, FcyRIIc, Fc?RIII|a y FcyRIIIb, de manera más preferible FcyRIIIa. En una modalidad preferida alternativa, la región Fc modificadas se optimizan para presentar afinidad reducida por el receptor inhibicor humano FcyRIIb. Los ABM de la invención proporcionan anticuerpos y fusiones de Fc con propiedades terapéuticas mejoradas en humanos, por ejemplo función efectora mejorada y una mayor potencia anticancerígena. En una modalidad alternativa, las regiones Fc modificadas de la presente invención se optimizan para tener afinidad reducida o anulada por FcyR humano que incluyen pero que no se limitan a Fc?PI, FcyRIIa, Fc?RIIb o FcyRIIc. Estas ABM de la invención se anticipa que proporcionen anticuerpos y fusiones Fc con propiedades terapéuticas mejoradas en humanos, por ejemplo función efectora reducida y toxicidad reducida. Las modalidades preferidas comprenden optimización de la unión Fc a FcyR humano; no obstante, en modalidades alternativas, las variantes de Fc de la presente invención poseen actividad mejorada o reducida por los FcyRs a partir de organismos no humanos que incluyen pero que no se limitan a ratones, ratas, conejos y monos. Las variantes de Fc que se optimizan para unión a Fc?R no humano pueden encontrar uso en experimentación . Por ejemplo están disponibles modelos de ratón para una diversidad de enfermedades que permiten la prueba de propiedades tales como eficacia, toxicidad y farmacocinética para un medicamento candidato dado. Como se conoce en la técnicas las células cancerosas se pueden injertar o inyectar en ratones para imitar un cáncer humano, un procedimiento denominado como xenoinjerto. Las pruebas de anticuerpos o fusiones Fc que comprenden regiones Fc modificadas que son optimizadas para uno o más Fc de ratón pueden proporcionar información valiosa respecto a la eficacia del anticuerpo o la fusión Fc, su mecanismo de acción y similares. Las regiones Fc modificadas de la presente invención se pueden derivar de polipéptidos Fc de origen que en si mismos son de una amplia gama de fuentes. El polipépttido Fc de origen puede estar codificado sustandialmente por uno o más genes Fc de cualquier organismo que incluyen pero que no se limitan a humanos, ratones, ratas, conejos, camellos, llamas, dromedarios, monos, preferí blemente mamíferos y de manera más preferible humanos y ratoraes. En una modalidad preferida, el polipéptido Fc de origen comprende un anticuerpo, denominado como el anticuerpo de origen. El anticuerpo de origen puede ser completamente humano, se puede obtener, por ejemplo, utilizando ratones transgenicos (Bruggemann et al . , 1991 , Curr Opin Biotechnol 8 : 55-4J58) o bibliotecas de anticuerpo humano acopladas con métodos' de selección (Griffiths et al . , 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108). El anticuerpo de origen no necesita presentarse de manera natural. Por ejemplo, el anticuerpo de origen puede ser un anticuerpo manipulado que incluye pero que no se limita a anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402) . El anticuerpo de origen puede ser una variante manipulada de un anticuerpo que es codificado sustancialmente por uno o más genes para anticuerpo natural. En una modalidad, el anticuerpo de origen ha tenido afinidad madurada, como se define en la técnica. De manera alternativa, el anticuerpo ha sido modificado de alguna otra manera, por ejemplo como se descrite en el documento de E.U.A. número de serie 10/339,788 presentado el 3 de marzo del 2003. Las regiones Fc modificadas de la presente invención pueden estar codificadas sustancialmente por genes de inmu oglobulina que pertenecen a cualquiera de las clases de anticuerpo. En una modalidad preferida, las regiones Fc modificadas de la presente invención encuentran uso en anticuerpos o fusiones de Fc que comprenden secuencias que pertenecen a la clase IgG de anticuerpos que incluyen IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4. En una modalidad alternativa, las regiones Fc modificadas de la presente invención encuentran uso en anticuerpos o fusiones de Fc que comprenden secuencias que pertenecen a las clases de anticuerpos IgA (que incluyen las subclases IgAl e IgA2), IgD, IgE, IgG o IgM. Las regiones Fc modificadas de la presente invención pueden comprender más de una cadena proteínica. Esto es, la presente invención puede encontrar uso en un anticuerpo o fusión de Fc que es un monómer o un oligómero y que incluye un homo-oligómero o un hetero- DÜgómero . Las regiones Fc modificadas de la presente invenci ón se pueden combinar con otras modificaciones de Fc que incluyen pero que no se limitan a modificaciones que alteran la función efectora o interacción con uno o más ligandos de Fc . Tal combinación puede proporcionar propiedades aditivas, sinergísticas o novedosas en las ABM de la invención. En una modalidad, las regiones Fc modificadas de la presente invención se pueden combinar con otras modificaciones Fc conocidas (Duncan et al . , 1988, Na ture 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al. , 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al., 1994, Transpl antation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Nati Acá d Sci USA 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Left 44:111-117; Lund et al., 1995, Fasejb J9: 115-119; Jefferi s et al., 1996, Immunol Left 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:411 -4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al., 2001, Immunol 166:2151-2515; Shields et al., 2001, J Biol Chem 2 76:6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Left 82:51-65 ; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; Hinton et al., 2004, J Biol C em 279:6213-6216) (Patentes de los Es ados Unidos Números 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572; 2004/0002587 Al) . Por lo tanto, las combinaciones de las regiones Fc modificadas de la presente invención con otras modificaciones Fc así como modificaciones Fc no descubiertas se contemplan con el objetivp de generar las ABM novedosas (por ejemplo anticuerpos o fusiones de Fc) con propiedades optimizadas. Virtualmente cualquier antígeno puede ser dirigido por las ABM y que comprende las regiones de Fc modificadas de la invisnción que incluyen pero que no se limitan a la siguiente lista de proteínas, subunidades, dominios, motivos y epítopos que pertenecen a la siguiente lista de proteínas: CD2, C 3, CD3E, CD4, CD11, CDlla, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (proteína p67) CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, CD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferón , inteferón ß, inteferón y; TNF- , TNFß2, TNFc, TNFay, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, TRAIL receptor-1, Al receptor de adenosina, receptor ß de linfotoxina, TAC1, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, EpCAM, integrina al, integrina ß2, integrina a4/ß7, integrina a2 , integrina a3, integrina a4 , integri|na a5, integrina a6, integrina av, integrina aVß3, FGFR-3, factor de crecimiento de queratinocitos, VLA-1, VLA-4, L-s¿lectina y anti-Id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de linfocitos T, B7-1, B7-2, VNRintegrina, TGFßl, TGFß2, eotaxina 1, BLyS (estimulador de linfocitos B) , complemento C5, IgE, factor VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1 ), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3) , Her4 (ErbB4), factor tisular, VEGF, VEGFR, receptor de endotelina, VLA-4, Hapteno NP-cap o NIP-cap, receptor a/ß de linfocito T, E-selectina, digoxina, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP, por sus siglas en inglés) y fosfatasa alcalina similar a PLAP testicular, receptor de transferrina, antígeno carcinoembriónico (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucina MUC1, MUC18, heparanasa I, miosina cardíaca humana, glucoproteína- 72 asociada a tumor (TAG-72), antígeno CA 125 asociado a tumor, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA, por sus siglas en inglés), antígeno asociado a melanoma de peso molecullar alto (HMW-MAA, por sus siglas en inglés), antígeno asociado a carcinoma, Gcoproteína Ilb/IIIa (GPIIb/IIIa) antígen asociado a tumor que expresa carbohidrato relacionado con Lewis Y, glucoproteína de envoltura GH de citomegalovirus humano (HCMV), HIV gpl20, HCMV, virus sincicial respiratorio RSV F, RSVF Fgp, VNR integrina, IL-8, antígeno asociado a tumor de citoqueratina, Hep B gpl20, CMV, gpllbllla, HIV IIIB gpl20 V3 bucle, virus sincicial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés), Fgp, glucoproteína gD del virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés), glucoproteína gB de HSV, glucoproteína de envoltura gB de HCMV y toxina de Clostridi um perfringens . Una persona habitualmente experta en la técnica apreciará que la lista mencionada antes de objetivos se refiere no solo a proteínas y biomoléculas específicas sino a la vía bioquímica o las vías que los comprenden. Por ejemplo, la referencia a CTLA-4 como un antígeno objetivo implica que los ligandos y receptores que constituyen la vía coestimuladora de linfocitos T, incluyendo a CTLA-4, B7-1, B7-2, CD28 y cualquier otro ligando o receptor no descubierto que se una a estas proteínas, son también objetivos. De esta manera, el objetivo como se utiliza en la presente se refiere no solo a la biomolécula específica sino al conjunto de proteínas que interactúan con el objetivo y a los miembros de la vía bioquímica a la cual pertenece el objetivo. Una persona experta en la técnica apreciará adicionalmente que cualquiera de los antígenos objetivo mencionados antes, los ligandcs o receptores que los unen u otros miembros de su vía bioquíirica correspondiente pueden estar unidos operablemente a las variantes Fc de la presente invención con el fin de generar una fusión Fc . Así, por ejemplo, una fusión Fc que está dirigida a EGFR se puede construir mediante enlace operable de una variante Fc a EGF, TGFa o cualquier otro ligando, descubierto o no descubierto que se una a EGFR. En consecuencia, una región Fc modificada de la presente invención se puede unir operablemente a EGFR con el fin de generar] una fusión de Fc que una EGF, TGFa o cualquier otro ligando descubierto o no descubierto que una EGFR. Así, virtualmente cualquier polipéptido, ya sea un ligando, receptor o algún otro tipo de proteína o dominio proteínico incluye pero no se limita a los objetivos mencionados antes y las proteínas que constituyen sus vías bioquímicas correspondientes, se pueden unir operablemente a las variantes Fc de la presente invención para desarrollar una fusión de Fc. Muchos de los anticuerpos y funciones Fc que se han aprobado para uso en ensayos clínicos o en el desarrollo se pueden beneficiar de las regiones Fc modificada de la presente invención. Tales anticuerpos y fusiones de Fc se denominan en la presente como "productos clínicos y candidatos". Así, en una modalidad preferida, las variantes Fc de la presente invención pueden encontrar uso en una gama de productos clínicos y candidatos. Por ejemplo muchos de los anticuerpos que se dirigen a CD20 se pueden beneficiar de las regiones Fc modificadas de la presente invención. Por ejemplo, las regiones Fc modificadas de la presente invención pueden encontrar uso en un anticuerpo que es sustancialmente similar a rituximab (RituxanMR, IDEC/Genentech/Roche) (véase, por ejemplo la Patente de E.U.A. No. 5,736,137), un anticuerpo anti-CD20 quimérico aprobado para tratar linfoma no Hodgkiniano; HuMax-CD20, un anticuerpo anti-CD20 que actualmente está en desarrollo por Genmab; un anticuerpo anti-CD20 descrito en la Patente de E.U.A. No. 5,503,362, AME-I33 (Applied Molecular Evolution) ; hA20 (I munomedics, Inc.); y HumaLYM (Intracel). Muchos de los anticuerpos que se dirigen a miembros de la familia de los receptores de factor de crecimiento epidérmico incluyendo a EGFR (ErbB-1) , Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), se pueden beneficiar de las variantes Fc de la presente invención. Por ejemplo, las variantes Fc de la presente invención pueden encontrar uso en un anticuerpo que es sustancialmente similar a trastluzumab (HerceptinMR, Genentech) (véase, por ejemplo la Patente de E.U.A. No. 5,677,171), un anticuerpo anti-Her2/neu humanizlado aprobado para tratar cáncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg. TM) , actualmente desarrollado por Genentech; un anticuerpo anti-Her2 descrito en la Patente de E.U.A. No. 4,753,894; cetuximab (Erbitux .MR, Imclone) (Patente de E.U A. No. 4,943,533; PCT WO 96/40210), un anticuerpo anti-EGFR quimérico en ensayos clínicos para una diversidad de cánceres; ABX-EGF (Patente de E.U.A. No. 6,235,883), que actualmente es desarrollado por Abgenix/Immunex/Amgen; HuMax-EGFr (Patente de E.U.A. No. de Serie 10/172,317) actualmente es desarrollado por Genmab; 425, EMD55900, EMD6200 y EMD7200 (Merck KGaA) (Patente de E.U.A. No. 5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys, 252 (2) : 549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35 (4 ): 315-20; Kettleborough et al., 1991, ¿>rotein Eng 4 (7) : 773-83) ; ICR62 (Institute of Cáncer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys 1993, 22 (1-3) :129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cáncer.1993, 67 (2) :247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cáncer, 73 (2) :228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cáncer, 105(2) : 273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (Patente de E.U.A. No. 5,891,996; 6,506,883; Mateo et al, 1997, Im unotechnology, 3(1) :71 -81) ; mAb-806 (Ludwig Institue for Cáncer Research, Memoria 1 Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Nati Acad S i USA. 100 (2) ; 639-44) ; KSB-102 (KS Biomedix) ; MR1-1 (IVAX, National Cáncer Institute) (PCT WO 0162931A2) y SC100 (Scance11) (PCT WO 01/88138). En otra modalidad, las regiones Fc modi ficadas de la presente invención pueden encontrar uso en alemtuzumab (CampathMR, Millenium) , un anticuerpo monoclona1 humanizado actualmente aprobado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de linfocitos B. Las re giones Fc modificadas pueden encontrar uso en una diversidad de anticuerpos o fusiones Fc que son sustancialmente similares a otros productos clínicos y candidatos que incluyen pero que no se limitan a muromonab-CD3 (Or thoclone OKT3MR) ) , un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Jonshon & Jonshon, ibritumomab tiuxetan (ZevalinMR) , un anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/ Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (MylotargMR) , un anticuerpo anti-CD33 (proteína p67) desarrollada por Celltech/Wyeth, alefacept (AmeviveMR) un anticuerpo anti-fusión LFA-3 Fc desarrollada por Biogen) , abciximab (ReoPro ) ) , desarrollado por Centocor/Lilly, basiliximab (SimulectMR) ) , desarrollado por Novartis, palivizumab (SynagisMR) ) , desarrollado por Medlmmune, infliximab (RemicadeMR) ) , un anticuerpo anti-TNFa desarrollado por Centocor, adalimumab (HumiraMR) , un anticuerpo anti-TNFalpha desarroliado por Abbott, HumicadeMR, un anticuerpo anti-TNFalpha desarrollado por Celltech, etanercept (EnbrelMR) , un anticuerpo anti-TNFalpha fusión Fc desarrollado por Immunex /Amgen, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti- IL8 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-MA1, un anticuerpo anti-MUC18 que está siendo desarrollado por Abgenix , Pemtumomab (R1549, . sup.90Y-muHMFGl) , un anticuerpo anti-MUC 1 en desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUCl que está siendo desarrollado por Antisorna , AngioMab (AS1405) que está siendo desarrollado por Antisorna , HuBC-1, que está siendo desarrollado por Antisoma, Thioplatino (AS1407) que está siendo desarrollado por Antisorna , AntegrenMR (natalizumab) , un anticuerpo anti-alpha-4-ß-1 ( VI,A 4), y alpha-4-ß-7 que está siendo desarrollado por Biogen, VLA-1 mAb, un anticuerpo anti-integrina VLA-1 que está siendo desarrollado por Biogen, LTBR mAb, un anticuerpo anti-receptor ß de linfotoxina (LTBR) que está siendo desarroliado por Biogen, CAT-152, un anticuerpo anti-TGF.2 que e 3tá siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, J695, un anticuerpo anti-IL-12 que está siendo desarroliado por Cambridge Antibody Technology y Abbott, CAT- 192, un anticuerpo anti-TGF.ß.l que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Genzyme,, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxina 1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B. TM. un anticuerpo anti-blys que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody anti-CD30 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmacsuticals, IDEC-152, un anticuerpo anti-CD23 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos anti-fabtor de migración de macrófago (MIF) que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotípico que está siendo desarrollado por Imclone IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR que está siendo desarrollado por Imclone DC101, un anticuerpo anti-flk-1 que está siendo desarrollado por Inclone, anticuerpos anti-caderina VE que está sdJendo desarrollado por Imclone, CEA-Cid (labetuzumab) un anticuerpo anti-antiantígeno carcinoembriónico (CEA) que está siendo desarrollado por Immunomedics, LymphoCideMR(Epratuzumab) , un anticuerpo anti-CD22 que está siendo desarrollado por Immunomedics, AFP-Cide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MyelomaCide que está siendo desarrollado por Immunomedics, LkoCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, ProstaCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MDX-010, un anticuerpo anti-CTL4 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-060, un ant icuerpo anti-CD30 que está siendo desarrollado por Medarex , MDX-070 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-018 que está siendo desarrollado por Medarex, Osidem M:* IDM-1), un anticuerpo anti-Her2 que está siendo desarroliado por Medarex e ImmunoDesigned Molecules, HuMax MRC. D4, un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarroliado por Medarex y Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL 15 que está siendo desarrollado por Medarex y Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa que está siendo desarroliado por Medarex y Centocor/J&J, CNTO 1275, un anticuerpo anti-citocina que está siendo desarrollado por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, antimolécula-1 de adhesión intracelular (ICAM-1) (CD54) anticuerpos que están siendo desarroliados por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo anti-receptor 3 de control de crecimiento de fibroblastos (FGFR-3) que está siendo desarrollado por MorphoSys, Nuvion MH visilizumab) un anticuerpo anti-CD3 que está siendo desarroliado por Protein Design Labs, HuZAFMR, un anticuerpo anti-interferón y que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, anti- . quadrature.5. quadrture.1 Integrina, que está síendo desarrollado por Protein Design Labs, anti-IL-12, que est á siendo desarrollado por Protein Design Labs, ING-1, un ant .cuerpo anti-Ep-CAM que está siendo desarrollado por Xoma y MLN01, un anticuerpo anti-integrina ß2 que está siendo desarroliado por Xoma. La aplicación de las regiones Fc modificada a la función] de anticuerpo y Fc mencionada antes de los productos clínicos y candidatos no significa que se limite a su composición precisa. Las regiones Fc modificadas de la presente invención se pueden incorporar en los candidatos clínicos y productos mencionados antes, o dentro de anticue trpos y fusiones de Fc que sean sustancialmente similares a los mismos. Las regiones Fc modificadas de la present s invención se pueden incorporar en versiones de los candidatos clínicos y productos mencionados antes que sean humaniz ados, madurados por afinidad, manipulados o modific ados de alguna otra manera, además, la totalidad del polipéptido de los productos clínicos y candidatos menciónados antes no necesitan utilizarse para construir un anticue rpo nuevo o fusión de Fc que incorpore la región Fc modificada de la presente invención; por ejemplo, únicamente la reg Lón variable de un producto clínico o anticuerpo candidato, una región variable sustancialmente similar o una versión humanizada, madurada en afinidad como manipulada o modificade de la región variable se puede utilizar. En otra modalidiad , la región Fc modificada de la presente invención puede encontrar uso en un anticuerpo o fusión Fc que se une al mismo epítopo, antígeno, ligando o receptor como uno de los productos clínicos y candidatos mencionados antes. Las regiones Fc modificadas de la presente invención pueden encontrar uso en una amplia gama de productos de fusión de anticuerpo y Fc. En una modalidad, el ABM de la presente invención es un reactivo terapéutico, de diagnóstico o de investigación, preferiblemente uno terapéutico. Las enfermedades y trastornos capaces de ser tratados o disminuidos por la ABM de la invención incluyen, pero no se limitan a enfermedades autoinmunes, enfermedades inmunológicas, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades neurológicas y enfermedades oncológicas y neoplásicas que incluyen cáncer. Mediante los términos "cáncer" y "canceroso" en la presente se hace referericia o se describe la condición fisiológica en mamíferios que está caracterizada típicamente por crecimiento celulari no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se li itan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (que incluye] liposarcoma) , tumores neuroendocrinos, mesotelioma, schwanqma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o cancere s linfoides. Los ejemplos más particulares de dichos canceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer de pulmón que influye cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón amicrosítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástriqo o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancriático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamá, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer I bulbar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y carcinoma anal, carcinoma del pene, cáncer testicular, cáncer esofágico, tumores del tracto biliar así como cáncer de las vías respiratorias y digestivas altas. Además, las variantes Fc de la presente invención se pueden utilizar para tratar condiciones que incluyen pero que no se limitan a insufiqiencia cardíaca congestiva (CHF, por sus siglas en inglés), vasculitis, rosácea, acné, eczema, miocarditis y otras condiciones del miocardio, lupus eritematoso sistémico, diabetes, espondilopatías, fibroblastos sinoviales y estroma de médula ósea; pérdida de hueso, enfermedad de Paget, osteoclastoma; mieloma múltiple; cáncer de mama, osteopenia difusa; malnutrición, enfermedad periodontal, enfermedad de Gaucher, histiocitosis de células de Langerhans, daño a la médula espinal, artritis séptica aguda, osteomalacia, síndro e de Cushing, displasia fibrosa monoostótica, displasia fibrosa poliostótica, reconstrucción periodontal y fracturas óseas; sarcoidosis; mieloma múltiple; cánceres óseos csteolíticos, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de riñon y cáncer rectal; metástasis óseas, administración del dolor en los huesos e hipercalcemia maligna humoral, espondilitis anquilosante y otras espondiloartropatías; rechazo de trasplante; infecciones virales, neoplasias hematológicas y condiciones similares a las neoplásicas, por ejemplo de linfoma de Hodgkin, linfomas no Hodgkinanos (linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica, micosis fungoide, linfoma de células de manto, linfoma folicular, linfoma de linfocitos B grandes difusos, linfoma de la zona marginal, leucemia de tricoleucocitos y leucemia linfoplasmacítica) , tumores de células precursoras linfocíticas que incluye leucemia linfoblastica aguda de linfocitos B/linfoma y leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T/linfoma, timoma, tumores de linfocitos T maduros y células NK que incluyen leucemias de linrocitos T periféricas y leucemia de linfocitos T adultos/linfornas de linfocitos T y leucemia linfocítica granular grande, histocitosis de células de Langerhans, neoplas Las mieloides tales como leucemias mielógenas agudas, que incluyen AML con maduración, AML sin diferenciación, leucemi a promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda y leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicos y trastornos mieloprolifertivos crónicos que incluyen leucemia mielóge na crónica, tumores del sistema nervioso central, por ejemplo tumores cerebrales (glioma, neuroblastoma, astroci toma, meduloblastoma, ependimoma y retinoblastoma) , tumores sólidos (cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células básales , cáncer pancreático, cáncer del ducto biliar, sarcoma de Kaposi, cáncer testicular, cánceres uterino, vaginal o cervical, cáncer de ovario, cáncer primario de hígado y cáncer endometrial y tumores del sistema vascular (angiosarcoma y hemagiopericitoma) , osteoporosis, hepatitis, VIH, SIDA, espondiloartritis, artritis reumatoide, enfermédades de intestino inflamatorio (IBD, por sus siglas en ing les) , septicemia y choque septicémico, enfermedad de Crohn, psoriasis, escleroderma, enfermedad de rechazo inverso o de ihjerto versus huésped (GVHD, por sus siglas en inglés), rechaz de injerto de islote alogénico, cánceres hemato ógicos tales como mieloma múltiple (MM) , síndrome mielod splásico (MDS, por sus siglas en inglés) y leucemia mielóg na aguda (AML, por sus siglas en inglés) , inflamación asociada con tumores, daño a nervios periféricos o enfermedades desmielinizantes . En una modalidad, una ABM que comprende una región Fc modificada de la presente invención se administra a un pacient e que tiene una enfermedad que involucra expresión inaprop, iada de una proteína. Dentro del alcance de la preseni e invención esto significa incluir enfermedades y trasto: nos caracterizados por proteínas aberrantes, debido, por ej emplo a alteraciones en la cantidad de una proteína presen' e, la presencia de una proteína mutante o ambas. Una abunda cia excesiva puede deberse a cualquier caso, incluy ndose pero no limitándose a la sobreexpresión a nivel molecu ar, aparición prolongada o acumulada en el sitio de acción o actividad aumentada de una proteína en relación a lo normal . Incluido dentro de esta definición están enfermedades y tra¿tornos caracterizados por una reducción de una proteínja. Esta reducción se puede deber a cualquier causa que incluy pero que no se limita a expresión reducida a nivel molecular, aparición agotada o reducida en el sitio de acción, formas mutantes de una proteína o actividad disminiiida de una proteína en relación a lo normal. Dicha abundancia excesiva o reducción de una proteína se puede medir en relación a la expresión normal, apariencia o actividad de una proteína y dicha medición puede jugar un papel ijmportante en el desarrollo y/o pruebas clínicas de las ABM de la presente invención.

Métodos de Manipulación La presente invención proporciona métodos de manipulación que se pueden utilizar para generar variantes de Fc. Un obstáculo principal que ha impedido en intentos anteriores la manipulación de Fc es que únicamente los intentos aleatorios de modificación han sido posibles, debido a en parte a la ineficiencia de las estrategias y los métodos de manipulación y a la naturaleza de alto rendimiento de la producción y cribado de anticuerpos. La presente invención describe métodos de manipulación que corrigen estas inconvenientes. Se contempla una diversidad de estrategias de diseño, métodos de cribado computacional, métodos de generación de biblioteca y métodos de producción experimental y cribado. Estas estrategias, enfoques, técnicas y métodos se pueden aplicar individualmente o en diversas combinaciones para manipular variantes de Fc optimizadas, Estrategias de Diseño Se proporciona una estrategia de diseño para manipular variantes de Fc en las cuales la interacción de Fc con a Itfún ligando de Fc se altera por manipulación de modificación de aminoácidos en la interfase o límite entre Fc y el ligando de Fc. Los ligandos de Fc en la presente pueden iinncclluuiirr pero no se limitan a los Fc?Rs, Clq, FcRn, proteína A o G y similares. Aprovechando las sustituciones energéticamente favorables en las posiciones Fc que inciden en la Lnterconexión de unión se pueden manipular variantes que mué stren conformaciones de interconexión nuevas, algunas de las cuales pueden mejorar la unión al ligando Fc, algunas de las cuales pueden traducir la unión de ligando Fc y algunas de las cuales pueden tener otras propiedades favorables. Dichas conformaciones de interconexión nuevas pueden ser el resultado, por ejemplo, de interacción directa ccoonn rreesiduos de ligando Fc que conformen la interfase o efectos indirectos causados por modificaciones de aminoácidos tales como perturbación de la cadena lateral o conformaciones de infraestructura. Se pueden seleccionar posiciones variables como cualquier posición que se considere que juegue uunn ppaappeel importante en la determinación de la conformación de la interfase. Por ejemplo se pueden seleccionar posiciones variables como se establece de los residuos que están dentro de cierlta distancia, por ejemplo 5 Angstroms, preferiblemente entre 1 y 10 Angstroms de cualquier residuo que constituya contacto directo con el ligando Fc. Se proporciona una estrategia de diseño adicional para g nerar variantes de Fc en las cuales se optimiza la conformación del carbohidrato de Fc en N297. La optimización como se utiliza en este contexto significa incluir cambios conforrracionales y de composición en el carbohidrato N297 que resulten en una propiedad deseada, por ejemplo afinidad aumentaba o reducida por un FcyR. Dicha estrategia está fúndamentada por la observación de que la estructura y conformación de carbohidratos afectan de manera perceptible la unión Fc/Fc?R y Fc/Clq (Umaña et al . , 1999, Na t Biotechnol 17:176-180; Davies et al . , 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; M}.mura et al . , 2001, J. Biol . Chem 275:45539-45547. ; Radaev et al . , 2001, 276 J Biol Chem:16478-16483; Shields et al . , 2002, J. Biol Chem 277:26733-26740; Shindawa et al . , 2003, uJ Biol . Chem 218 : 3466-3473) . Al explorar sustituciones energéticamente favorables en posiciones que interactúan con el carbohidrato se puede manipular una diversidad de calidad de variantes que muestran nuevas conformaciones de carbohidratos, algunas de las cuales pueden mejorar y algunas de las cuales pueden reducir la unión a uno o más ligandos Fc Aunque la mayor parte de las mutaciones cerca de la interfa e Fc/carbohidrato parecen alterar la conformación del carbohitirato se ha demostrado que algunas mutaciones alteran la comp sición de glucosilación (Lund et al . , 1996, J Immunol 157:49 63 -4969; Jefferis et al . , 2002, Immunol Lett 82:57-65). Se proporciona otra estrategia de diseño para generar variantes Fc en las cuales se optimice el ángulo entre os dominios C?2 y C?3. Como se utiliza en este context D, la optimización significa describir cambios conformacionales en el ángulo de domino C?2-C?3 que resultan en una propiedad deseada, por ejemplo afinidad aumentada o reducida por un FcyR. Este ángulo es una determinante importa nte de la afinidad Fc/Fc?R (Radaev et al . , 2001, J Biol . Chem 276:16478-16483) y muchas de las mutaciones distale 3 a la interfase Fc/Fc?R afectan potencialmente la unión a 1 modularla (Shields et al . , J. Biol . Chem 276:6591- 6604 ( 2001)). Al explorar las posiciones de sustitución energét icamente favorables que parecen jugar un papel clave en la determinación del ángulo C?2-C?3 y la flexibilidad de los domiinios uno en relación al otro se pueden diseñar una diversidad de variantes de calidad que muestren ángulos nuevos y niveles de flexibilidad, algunos de los cuales se pueden optimizar una propiedad Fc deseada. Se proporciona otra estrategia de diseño para generar variantes Fc en la cual Fc se vuelve a manipular para eliminar la dependencia estructural y funcional a la glucosi Lación. Esta estrategia de diseño involucra la optimización de la estructura Fc, estabilidad, solubilidad y/o función de Fc (por ejemplo afinidad de Fc por uno o más ligando s de Fc) en ausencia del carbohidrato N297. En una solucio , las posiciones que son expuestas a solvente en ausenci a de glucosilación son manipuladas de manera que son estable 3, estructuralmente consistentes con estructura Fc y no presentan tendencia a agregarse. C?2 es el único dominio Ig no píareado en el anticuerpo. Por lo tanto, el carbohidrato N297 al arca el parche hidrofóbico expueto que normalmente sería 1a interface para una interacción proteína-proteína con otro dóminio Ig, manteniendo la estabilidad e integridad estructural de Fc y manteniendo los dominios C?2 evitando que se agr guen a través del eje central. Los enfoques para optimizar Fc aglucosilado pueden involucrar, pero no se limitan a el diseño de modificaciones de aminoácidos que incrementan la estabilidad y/o solubilidad de Fc aglucosilado al inqorporar residuos polares y/o cargados que están orientados hacia adentro, hacia el eje del dímero C?2-C?2 y al dis sñar modificaciones de aminoácidos que incrementan directamente la interconexión Fc/Fc?R aglucosilada en la interface de Fc aglucosilado con algún otro ligando Fc. Se proporciona una estrategia de diseño adicional para variantes Fc de modificaciones las cuales se optimiza la conformación del dominio C?2. La optimización como se utiliza en este contexto significa describir cambios conformacionales en el ángulo del dominio C?2 que resulten en una propiedad deseada , por ejemplo afinidad aumentada o reducida por un FcyR. A1 explorar sustituciones energéticamente favorables en las posiciones C?2 que inciden en la conformación C?2 s« pueden manipular una diversidad de variantes de calidad que muestrean conformaciones C?2 nuevas, algunas de las cuales pueden obtener el objetivo de diseño. Dichas conformaciones C?2 nuevas pueden ser el resultado, por ejemplo, de conformaciones de infraestructura alternativas que son muestreadas por la variante. Se pueden seleccionar posiciones variables en cualquier posición que se considera que juega un papel importante en la determinación de la estructura, estabilidad, solubilidad, flexibilidad, función de C?2 y similares. Por ejemplo, los residuos de núcleo hidrofóbicos C?2, es decir, residuos C?2 que han sido captados parcial o completamente del solvente, se pueden volver a manipular. De manera alternativa, los residuos que no son del núcleo se pueden considerar, o los residuos que se piense que son importantes para determinar la estructura, estabilidad o flexibilidad de la infraestructura. Se proporciona otra estrategia de diseño adicional para optimización de Fc en la cual la unión a un FcyR, complemento o algún otro ligando de Fc se altera por modificaciones que modulan la interacción electrostática entre Fc y dicho ligando de Fc. Tales modificaciones se pueden considerar como una optimización del carácter electrostático global de Fc e incluyen la sustitución de aminoácidos neutros con un aminoácido cargado, la sustitución de un aminoácido cargado con un aminoácido neutro o la sustitución de un aminoácido cargado con un aminoácido de carga opuesta (es decir, inversión de carga) . Dichas modificaciones se pueden utilizar para llevar a cabo cambios eenn llaa aafinidad de unión entre una Fc y uno o más ligandos de Fc, po : ejemplo los FcyR. En una modalidad preferida las posiciones en las cuales las sustituciones electrostáticas pueden afectar la unión se seleccionan utilizando uno de una variédad de métodos bien conocidos para el cálculo de potenciales electrostáticos. En la modalidad más sencilla, se utiliza la ley de Coulomb para generar potenciales electrostáticos como una función de la posición en la proteína. Las modalidades adicionales incluyen el uso del cambio de Debye-Hückel para tomar en consideración los eeffeeccttooss de fuerza iónica y modalidades más sofisticadas tales como 1os cálculos de Poisson-Boltzmann. Dichos cálculos electrostáticos pueden aclarar posiciones y sugerir modificaciones específicas de aminoácidos para obtener el objetivo del diseño. En algunos casos, estas sustituciones se ppuueeddeenn anticipar para afectar de manera variable la unión a diferentes ligandos de Fc, por ejemplo para incrementar la unión para activación de los FcyR y al mismo tiempo disminuir la afinidad de unión para los FcyR inhibidores. Se han descrito anticuerpos quiméricos de ratón/Humano. Véase, por ejemplo, Morrison, S. L. et al . , PNAS 11:6851-6854 (1984); Publicación de Patente Europea No. 173494; Boulianna, G. L. et al . , Na ture 312:642 (1984); Neubei?er, M. S. et al . , Na ture 314:268 (1985); Publicación de Patente Europea No. 125023; Tan et al . , J. Immunol . 135:8564 (1985); Sun, L. K. et al . , Hybridoma 5(1):517 (1986); Sahagan et al . , J. Immunol . 137:1066-1074 (1986). Véase de manera general Muron, Na ture 312 : 591 (1984); Dicksor, Genetic Engineering News 5(3) (1985); Marx, Science 229:455 (1985) y Morrison, Science 229:1202-1207 (1985). En una modalidad particularmente preferida la ABM quimérica de la presente invención es un anticuerpo humanizado. Se conocen en la técnica métodos para humanizar anticuerpos que no son humanos. Por ejemplo, las ABM humanizadas de la presente invención se pueden preparar de acuerde con los métodos de la Patente de E.U.A. No. 5,225,539 para Winter; la Patente de E.U.A. No. 6.180,370 para Queen et al . ; la Patente de E.U.A. No. 6,632,927 para Adair et al . , la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0039649 para Foote; la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2004/0044187 para Sato et al . ; o la Publica ion de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2005/00 3028 para Leung et al . , los contenidos completos de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Preferíflemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuo aminoácidos introducidos en el mismo desde una fuente la cual es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan como residuos "import dos" los cuales típicamente adquieren la forma de un dominio variable "importado". La humanización se puede realiza fácilmente siguiendo el método de Winter y colabor dores (Jones et a l . , Na ture , 321 : 522 - 525 (1986); Riechmann et a l . , Na ture , 332 : 323-321 (1988); Verhoeyen et al . , S ci ence, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir secuencias de 1« región hipervariable por las secuencias corresp ndientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patent de E.U.A. No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustitu do por la secuencia correspondiente de una especie no humana En la práctica los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos en la región hipervariable y posiblemente algunos residuois FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Los anticuerpos humanizados sujeto generalmente comprenderán regiones constantes de inmunogfLobulinas humanas tales como IgGl. La selección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados para ser utilizados en la elaboración de los anticuerpos humanizados es muy importante para rf ducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra una biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanos conocídbs. La secuencia humana la cual sea más cercana a la ddeell rrcdedor es la que se acepta como la región de infraestructura (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims t al . , J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al . , J. Mol Biol . , 196: 901 (1987)). Otro método para la selección de la secuencia de infraestructura humana es comparar la secuencia de cada subregión individual de una infraestructura de roecor completa (es decir, FRl, FR2 , FR3 y FR4 ) o alguna combinación de las subregiones individuales (por ejemplo FRl y FR2) contra una biblioteca de secuencias de región variable humana conocidas que corresponden a la subregión de iinnffrraaeesstructura (por ejemplo determinada por la numeración de Kabat) y seleccionar la secuencia humana para cada subregión o combi.nación que sea más cercana a la del roedor (Leung, Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0040606A1, publicado el 27 de febrero del 2003) (el ccoonntteenníído completo de la cual se incorpora en la presente como teferencia. Otro método utiliza una región de infraestructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. Se puede utilizar la misma infraestructura para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al . , Nati . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al . , J Immunol . , 151:2623 (1993)) (la totalidad del contenido de cada uno de las cuales se incorpora en la presente como referencia) . Es importante de manera adicional que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para qbtener este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un procedimiento de análisis de las secuencias de origen y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias de origen y humanizada. Los modelos de inmunoglobulina tridimensional se pueden generar utilizando programas de computadora familiares para actuellos expertos en la técnica (por ejemplo InsightlI, accelrys inc (anteriormente MSI) o en http: //|swissmodel . expasy. org/ descrita por Schwede et al., Nucleib Acids Res. 2003 ( 13) : 3381-3385) . La inspección de estos nfiodelos permite el análisis del probable papel de los residuqs en el funcionamiento de la secuencia inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unir su antígeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar del receptor e importar secuencias de manera que se obtenga la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad mantenida por uno o varios antígenDs objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable están involucrados directa y casi sustancialmente en influir en la unión de antígeno. En una modalidad, las ABM de la presente invención comprenden una región Fc humana modificada. En una modalidad específica, la región constante humana es IgGl, como se establecen en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 1 y 2 y como se establece a continuación: Secuencia nucleotídica de la región constante de IgGl humana (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1) ACCAAGG3CCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGC ACAGCGG CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACT3AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACrCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAA AGCAGAGZCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCCT3GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA TGATCTC:CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTFFRFFRFFACGTGFAGCCACGAAGAC CCTGAGGrCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTFFAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG TCCTGCÍCCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCA GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Secuencia de aminoácidos de la región constante de IgGl humana (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2) TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGHVEVHNAKTKPREEQYN STYVVSVLTVLHQDWLNKGEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWSNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFiSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK No obstante también están abarcadas por la presente invencíón variantes e isoformas de la región Fc humana nativa Por ejemplo, las regiones Fc variantes adecuadas para uso en la presente invención se pueden producir de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de E.U.A. No. 6,737,0 56 para Presta (variantes de región Fc con función efectora alterada debido a una o más modificaciones de aminoácrdos) ; o en las Solicitudes de Patentes de E.U.A. Nos. 60/439,498; 60/456,041; 60/514,549 o WO 2004/063351 (regiones Fc variantes con afinidad de unión aumentada debido a la modificación de aminoácidos); o en la Patente de E.U.A. No. 10/672,280 o WO 2004/099249 (variantes Fc con unión alterada a FcyR (debido a la modificación de aminoácidos) , el contenido de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En otra modalidad, las moléculas que unen antígeno de la presente invención son modificadas para tener afinidad de unión mejorada de acuerdo, por ejemplo, con los métodos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2004/0132066 para Balint et al . , el contenido completo de la cual se incorpora en la presente como referencia. En una modalidad, la molécula que une antígeno de la presente invención se conjuga a una porción adicional tal como u a radiomarca o una toxina. Dichas ABM conjugadas se pueden producir por numerosos métodos que son bien conocidos en la técnica .

Una diversidad de radionúclidos son aplicables a la presente invención y aquellos expertos en la técnica tienen la capacidad para determinar con facilidad cuales radionúclidos son los más apropiados bajo una diversidad de circunstancias. Por ejemplo, el 131yodo es un radionúclido bien conocido utilizado para inmunoterapia dirigida. No obstante la utilidad clínica de la 131yodo se puede limitar por varios factores que incluyen: vida media física de 8 días, jdeshalogenación del anticuerpo yodado tanto en la sangre como en los sitios tumorales y características de emisión (por ejemplo un componente y grande) lo cual puede ser subóptimo para deposición de dosis localizada en el tumor, Con el advenimiento de agentes quelantes superiores la oportunidad para unir grupos quelantes metálicos a proteínas ha aumentado las oportunidades de utilizar otros radionúclidos tales como ?:L1indio y 930Ui.trio. A la 9s0ui:trio proporciona varios beneficios para la utilización de aplicaciones radioinmunoterapéuticas : la vida media de 64 horas de 90itrio es suficientemente prolongada para permitir acumulación de anticuerpo por el tumor y, a diferencia, por ejemplo de 131yodo, el 90itrio es un emisor ß puro de alta energía sin irradiación y acompañante en su extinción, con un intervalo en tejido de 100 a 1000 diámetros de célula. Además, la cantidad mínima de penetración de radiación permite la administración a pacientes ambulatorios de anticuerpos marcados con 90Itrio. De manera adicional, no se requiere la internacionalización del anticuerpo marcado por la célula que se va a destruir y la emisión local de radiación ionizante puede ser mortal para células tumores adyacentes que carezcan del antígeno objetivo.

Con respecto a los anticuerpos radiomarcados, la terapia con los mismos también se puede llevar a cabo utiliza :ndo un tratamiento de terapia único o utilizando tratamientos múltiples. Debido al componente de radionúclido, se prefiere que antes del tratamiento se "cosechan" células pluripotendales periféricas ("PSC" por sus siglas en inglés) o médula ósea ("BM" por sus siglas en inglés) para pacientes que puedén experimentar toxicidad de médula ósea potenci almente mortal lo que resulta de la radiación. Se cose ;chan BM y/o PSC utilizando técnicas estándar y después se purgan y congelan para posible reinfusión. Adicionalmente, se prefier a que antes del tratamiento se lleve a cabo un estudio de dosímetría diagnóstica utilizando un anticuerpo marcado diagnós tico (por ejemplo utilizando 111indio) en el paciente, con el propósito del cual asegurar que el anticuerpo marcado teraippééuticamente (por ejemplo utilizado 90ítrio) no se vuelva innecesariamente "concentrado" en algún órgano o tejido normal . En una modalidad preferida, la presente invención se relalciona con un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido de la invención. La inVención se relaciona adicionalmente con un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia por lo menos 80%, 8ß%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia nucleotídica de la invención. En otra modalidad, la invención se relaciona con un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la invención. La invención también abarca un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido de la invención que tiene uno o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otra modalidad, la presente invención se relacio na con un vector de expresión y/o una célula hospedadora la cual comprende uno o más polinucleótidos aislado 3 de la presente invención. Generalmente se puede utilizar cualquier tipo de líneas de célula cultivada para expresar la ABM de la present e invención. En una modalidad preferida se utilizan células HEK293-EBNA, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma u otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto o células vegetales como la línea celular de fondo para generar las células hospedadoras modificadas de la invención, La eficacia terapéutica de las ABM de la presente invención se puede mejorar al producirlas en una célula hospedadora que exprese adicionalmente un polinucleótido que codifica por un polipéptido que tiene actividad de glucosi Itransferasa. En una modalidad preferida, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de: un polipéptido que tiene actividad ß(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III; un polipéptido que tiene actividad a-manosidasa II, un polipéptido que tiene actividad ß-d,4) -galactosiltransferasa. En una modalidad, la célula hospedadora expresa un polipéptido que tiene actividad ß-(1,4)-N -acetilglucosaminiltransferasa III. En otra modalidad, la célula hospedadora expresa un polipéptido que tiene actividad ß ( 1, 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III así como un pol péptido que tiene actividad a-manosidasa II. En otra modalidad adicional, la célula hospedadora expresa un polipéptido que tiene actividad ß(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III, un polipéptido que tenga actividbd a-manosidasa II y un polipéptido que tenga actividad ß- (1, 4) -galactosiltransferasa. El polipéptido se expresará en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de la ABM. De manera alternativa, la célula hospedadora se puede modificar para tener expresión reducida de una glucosiltransferasa tal como a(l,6)-fucosiltransferasa. En una modalidad preferida, el poli .ppééptido que tenga actividad GnT-III es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización Golgi de un poli .peptido residente en el sistema de Golgi. En otra modalidad preferida, la expresión de las ABM de la presente invención en una célula hospedadora que expresa un polinucJeótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad GnT-III resulta en las ABM con afinidad de unión a receptor Fc aumentada y una función efectora aumentada. En consecuencia, en una modalidad, la presente invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende: (a) un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido que tiene actividad GnT-III; y (b) un polinucleótido aislado que codifica para una ABM de la presente invención, tal como un anticuerpo quimérico, de primate o humanizado. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene actividad GnT-III es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnT-III y el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa II. Los métodos para generar dichos polipéptidos de fusión y utilizarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras aumentadas se describen en la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/495,142 y la publicación de solicitud de patente de E.U.A. No. 20C 4/0241817 Al, cuyos contenidos completos de cada una de las cuales se incorporan expresamente en la presente como referencia. En una modalidad particularmente preferida, el anticuerpo quimérico comprende un Fc humano. En otra modalidad preferida, el anticuerpo conjugado con secuencias de primlate o humanizado. En una modalidad alternativa, las ABM de la presente invención se pueden mejorar al producirlas en una célula hospedadora que se ha sometido a ingeniería y que tiene actividad reducida, inhibida o eliminada de por lo menos una fucosiltransferasa tal como a-1, 6-nucleo fucosiltransferasa . En una modalidad, uno o varios de los polinucleótidos que codifican para una ABM de la presente invención se pueden expresar bajo el control de un promotor constitutivo o, de manera alternativa, un sistema de expresión regulado. Los sistemas de expresión regulados adecúados incluyen, pero no se limitan al sistema de expresión regulado por tetraciclina, un sistema de expresión inducible por ecdisona, un sistema de expresión de conmutador lac, ur sistema de expresión inducible por glucocorticoide, un sistema promotor inducible por temperatura y un sistema de expresión inducible por metal metalotioneina. Si varios de los ácidos nucleicos diferentes que codifican para una ABM de la pres ente invención están comprendidos dentro del sistema de la célula hospedadora, parte de los mismos se pueden expresar bajo el control de un promotor constitutivo mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor reguladb El nivel de expresión máximo se considera que es el nivel maás alto posible de expresión polipeptídica estable que no tiene un efecto adverso significativo sobre la velocidad de crecimiento de las células y se determinará utilizando experimentación sistemática. Los niveles de expresión se determinan por métodos conocidos generalmente en la técnica que incluyen análisis de Western blot utilzando un anticuerpo específico para la ABM o un anticuerpo específico para una etiqueta peptídica fusionada a la ABM; y análisis Northern blot. En una alternativa adicional, el polinucleótido puede estar unido operablemente a un gen indicadlor; los niveles de expresión de una ABM de la invención se determinan al medir una señal que se relaciona con el nivel de expresión del gen indicador. El gen indicador puede ser transcrito junto con uno o varios de los ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido de fusión como una molécula de ARNm única; sus secuencias codificantes respectivas se pueden unir ya sea por un sitio de entrada de ribosoir.a interno (IRES, por sus siglas en inglés) o por un mejorador de traducción independiente de remate (CITE, por sus siglas en inglés) . El gen indicador se puede traducir junto con por lo menos un ácido nucleico que codifica para un ABM quimérica de manera tal que se forme la cadena polipeptídica única. Los ácidos nucleicos que codifican para las ABM de la presente invención se pueden unir operativamente al gen indicador bajo el control de un promotor único de manera tal que el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de fusión y el gen indicador se transeriben en una molécula de ARN la cual de manera alternativa se empalma en dos moléculas de ARN mensajero (ARNm) separadas; uno de los ARN resultante se traducen en la proteína indicadora y la otra se traduce en un polipéptido de fusión. Los métodos los cuales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de una ABM de la invención junto con señales de control transcripcional/traduccionales apropiadas. Estos métodos incluyen técnicas de ABM recombinante in vi tro, técnicas de síntesis y recombinación in vivo/recombinación genética Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al . , MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) y Ausubel et al . , CURREN1 PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989). Una diversidad de sistemas de vector hospedador-expresión se pueden utilizar para expresar la secuencia codificante de las ABM de la presente invención.

Preferíblemente, las células de mamífero se utilizan como sistemas de células hospedadoras transfectadas con ADN plasmídi co recombinante o con vectores de expresión de ADN cósmido que contienen la secuencia codificante de la proteína de int res y la secuencia codificante del polipéptido de fusión. De manera más preferible, se utilizan como el sistema de células hospedadoras células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de rat <ji>n P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibri .doma , otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto o células vegetales. Algunos ejemplos de los sistemas de expresión y métodos de selección se describen en la siguientes referencias y referencias de esos documentos: Borth et al . , Biotechnol . Bioen . 11 (4) : 266-73 (2000-2001), en Werner et al . , Arzneimittelforschung/Drug Res. 4 s : 870-80 (1998), en Andersen y Krummen, Curr. Op .

Biote ichn ol . 13:117-123 (2002), en Chadd y Chamow, Curr. Op .

Biote ;chn ol . 12:188-194 (2001), y en Giddings, Curr . Op .

Biote >chn ol . 12 : 450-454 (2001). En modalidades alternativas se puíeden utilizar otro sistema de células hospedadoras eucari?ticas que incluyen células de levadura transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que confienen la secuencia codificante de una ABM de la presente invención tal como los sistemas de expresión descritos en la solicitud de patente de E.U.A. No. 60/344,169 y WO 03/056914 (métodos para producir glucoproteína similar a humana en una célula hospedadora eucariótica no humana) (el contenido de cada umo de los cuales se incorpora como referencia en su totalidad ) ; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo baculovirus) que contiene la secuencia codificante de una ABM quimérica de la invención; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo el virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo el plásmido Ti) que contienen las secuencias codificantes de la ABM de la invención que incluyen pero que no se limitan a los sistemas de expresión descritos en la patente de E.U.A. No. 6,815,184 (métodos para la expresión y secreción de polipéptidos biológicamente activos a partir de lenteja de agua manipulada genéticamente) ; WO 2004/057002 (producción de proteínas glucosiladas en células de plantas briofitas por introducción del gen. para glucosiltransferasa) y WO 2004/024927 (métodos para generar heterólogos extracelulares de proteínas no vegetales en protoplastos de musgo) ; y en las solicitudes de patentes de E.U.A. Nos. 60/365,769, 60/368,047 y WO 2003/078614 (procesamiento de glucoproteína en plantas transgénicas que comprende una enzima GnT-III de mamífero funcional) (el contenido de cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) ; o sistemas de células animales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo adenovirus, virus ele vaccinia) que incluyen líneas de células manipuladas para cqntener copias múltiples del ADN que codifica para una ABM quimérica de la invención ya sea amplificada de manera estable (CHO/dhfr) o amplificada de manera inestable en cromosomas doble minuto (por ejemplo líneas de células murinas) . En una modalidad, el vector comprende a uno o varios polinucleótidos que codifican para la ABM de la invención es policistrónico. Además, en una modalidad, la ABM mencionada antes es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. Para los métodos de esta invención, la expresión estable generalmente se prefiere a la expresión transitoria debido a que típicamente se obtienen resultados más reprodulcibles y también es más susceptible de producción a gran escala, aunque la expresión transitoria está abarcada por la invención. En vez de utilizar vectores de expresión los cuales contienen origenes de replicación virales, las células hospedadoras se pueden transformar con los ácidos nucleicos codificantes respectivos controlados por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo promotor, mejorador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extranjero, las células manipuladas se puede permitir que crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombi ante confiere resistencia a la selección y permite la selección de células las cuales tienen integrado de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crecen para formar focos los que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas de células Se pueden utilizar muchos sistemas de selección que incluyen pero que no se limitan a los genes para timidina cinasa de virus de herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223 ( (11997777)),, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 45:2026 (1962)) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)), los cuales pueden ser utilizados en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También se puede utilizar resistencia antimetabolito, la base de selección para dhfr, la cual confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al. , Nati. Acad. Sci. EUA 77:3567 (1989); O'Hare et al., Proc Nati. Acad. Sci. EUA 18:1521 (1981)); gpt, el cual confiere resistencia a ácido micofenólico (Mullingan & Berg, P Prroocc. Nati. Acad. Sci. EUA 18:2012 (1981)); neo, el cual confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre- Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); y hygro, el cual confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Se han descritos genes seleccionables aaddiicciioónnales, específicamente trpB, lo cual permite a las células) utilizar indol en lugar de triptofano; hisD, el cual permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 85:8047 1988)); el sistema de glutamina sintasa; y ODC (ornitina descarboxilasa) el cual confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2- (difluorometil) -DL-ornitina, DFMO (McConlogue, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987) La presente invención se relaciona adicionalmente ccoonn uunn método para modificar el perfil de glucosilación de las ABM de la presente invención que se producen por la célula hospedadora que comprende expresar en dicha célula hospedade ra un ácido nucleico que codifica para una ABM de la invención y un ácido nucleico que codifica para un poli .péptido con actividad de glucosiltransferasa o un vector que conprende dichos ácidos nucleicos. En una modalidad preferida , el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de : un polipéptido que tiene actividad de ß ( l , 4 ) -N-aceti .lglucosaminiltransferasa III; un polilpéptido que tiene actividad de a-manosidasa II y un polipéptido que tiene actividad de ß (1, 4) -galactosiltransferasa. En una modalidad, la célula hospedadora expresa un polipéptido que tiene actividad de ß ( 1, 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III. En otra medalidad, la célula hospedadora expresa un polipéptido qquuee ttiiene actividad ß (1, ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III as como un péptido que tiene actividad a-manosidasa II.

En otra modalidad adicional, la célula hospedadora expresa un poli .pé tido que tiene actividad ß ( l , 4 ) -N-acetilc lucosaminiltransferasa III, un polipéptido que tiene activicad a-manosidasa II y un polipéptido que tiene activicad ß (1, ) -galactosiltransferasa. Preferiblemente, el poli .ppééptido modificado es IgG o un fragmento del mismo que compren de una región Fc. En una modalidad particularmente preferi da, la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mi $mo. De manera alternativa o adicional, dichas células hosped, doras se pueden manipular para tener actividad reducic.a inhibida o eliminada de por lo menos una fucosi transferasa. En otra modalidad, la célula hospedadora es man Lpulada para que coexprese una ABM de la invención, GnT-III y manosidasa II (Manll) . Las ABM modificadas producidas por las células hospeda doras de la invención presentan una afinidad de unión al rec iptor Fc aumentada y/o una función efectora aumentada como Un resultado de la modificación. En una modalidad partic larmente preferida la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que contiene la región Fc. Prefer blemente, la afinidad de unión a receptor Fc aumentada es uni On incrementada a un receptor que activa Fc?, tal como el receptor Fc?lIIa. La función efectora aumentada prefer blemente es un incremento en uno o más de lo siguiente: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo aumentaba (ADCP, por sus siglas en inglés) secreción de citocina aumentada, captación de antígeno mediada por complej|? inmunológico por parte de las células presentadoras de antígeno aumentada, citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada, unión a células NK aumentada, unión a macrófagos aumentada, unión a células polimorfonucleares (PMN) aumentada, unión a monocitos aumentada, reticulado de anticuerpos unidos a objetivo aumentado, señalización directa que induce apoptosis aumentada, maduración de células dendríticas aumentada o cebado de linfocitos T aumentado. La presente invención también se relaciona con un método para producir una ABM de la presente invención que tiene oligosacáridos modificados en una célula hospedadora que comprende: (a) cultivar una célula hospedadora manipulada para expresar por lo menos un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de glucosiltransferasa bajo condiciones las cuales permiten la producción de una ABM de acuerdo con la presente invención, en dcnde el polipéptido que tiene actividad de glucosiltransferasa se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de la ABM producida por la célula hospedadora; y (b) aislar dicha ABM. En una modalidad preferida, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de: un polipéptido que tiene actividad de ßd,4)-Sl-acetilglucosamiltransferasa III; un polipéptido que tiene actividad de a-manosidasa II y un polipéptido que tiene actividbd de ß- (1, ) -galactosiltransferasa. En una modalidad, la célula hospedadora expresa un polipéptido que tiene actividbd de ß- (1, ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III. En otra modalidad, la célula hospedadora expresa un polipéptido que ti ne actividad ß- ( 1, ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III asíj como un polipéptido que tiene actividad a-manosidada II. En otra modalidad adicional la célula hospedadora expresa un polipéptido que tiene actividad ß(l,4)-acetilglucosaminiltransferasa III, un polipéptido que tiene actividad a-manosidada II y un polipéptido que tiene actividad ß (1, 4 ) -galactosiltransferasa. En una modalidad preferída, el polipéptido que tiene actividad GnT.III es un polipép ido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnT-III En una modalidad particularmente preferida, el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización de Golgi de un polipéptido que reside en el sistema de Golgi. Preferiblemente, el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa II o GnT-I. De manera alternativa, el dominio de localización de Golgi se selecciona del grupo que consiste de: el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnT-II | y el dominio de localización de una a 1-6 nucleofucosiltransferasa. Las AMB producidas por los métodos de la pjresente invención tienen afinidad de unión al receptor Fc aumentada y/o función efectora aumentada. Preferiblemente, la función efectora aumentada es una o más de las siguientes: citotoxlicidad celular mediada por Fc (que incluye citotoxlicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada] aumentada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) , aumentada, secreción de citocina aumentada, captación de ant:.geno mediada por complejo inmunológico por células presentadoras de antigeno aumentada, unión a células NK aumentada, unión a macrófagos aumentada, unión a monocitos aumentada, unión a células polimorfonucleares aumentada, señalización directa que induce apoptosis aumentada, reticulado de anticuerpos unidos a objetivo aumentado, maduración de células dendríticas aumentada o cebado de linfocitos T aumentado. La afinidad de unión al receptor Fc aumentada preferiblemente es unión aumentada a receptores que activan Fc tal como FcyRIIIa- En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo. En otra modalidad la presente invención se relaciona con una ABM quimérica que tiene una región fc modificada y la cual tiene una proporción aumentada de oligosabáridos bisectados en la región Fc del polipéptido. Se contemPla que dicha ABM abarque anticuerpos y fragmentos de los mismos que comprenden región Fc . En una modalidad preferí da, la ABM es un anticuerpo humanizado. En una modalidad, el porcentaje de oligosacáridos bisectados en la región Fc de la ABM es por lo menos 50%, de manera más preferíole por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, o por lo menos 90% y de manera más preferible por lo menos 90-95% de los oligosacáridos totales. En otra modalidad adiciona 1, la ABM producida por los métodos de la invención tiene una proporción aumentada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc como un resultado de la modificación de sus oligosacáridos por los métodos de la presente invención. En una modalidad, el porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es por lo menos 50%, de manera preferíble por lo menos 60% a 70%, de manera más preferible por lo menos 75%. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o complejo. En una modalidad particularmente preferida, la ABM producida por las células hospedadoras y los métodos de la invención tienen una proporcion aumentada de oligosacáridos bisectados, no fucosiladc s en la región Fc . Los oligosacáridos no fucosilados; bisectados pueden ser híbridos o complejos, Específicamente, los métodos de la presente invención se pueden utilizar para producir las ABM en las cuales por lo menos 5%, de manera más preferible por lo menos 20%, de manera mucho más preferible por lo menos 25%, de manera más preferíble por lo menos 30%, de manera más preferible por lo menos 3|5% de los oligosacáridos en la región Fc de la ABM son bisecta|dos y no fucosilados. Los métodos de la presente invencíón también se pueden utilizar para producir poli Lpéptidos en los cuales por lo menos 15%, de manera más preferíble por lo menos 20%, de manera más preferible por lo menos 15% , de manera más preferible por lo menos 30%, de manera más preferible por lo menos 35% de los oligosacáridos en la región Fc del polipéptido son bisectados híbridos no fucosiliados . En otra modalidad la presente invención se relaci Ona con una ABM quimérica que tiene una región Fc modificada y manipulada para tener una función efectora aumentad? y/o una afinidad de unión a receptor Fc aumentada, produci|da por los métodos de la invención. Preferiblemente, la func ion efectora aumentada es una o más de las siguientes: citotoxicidad celular mediada por Fc (que incluye citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada) aumentadc , fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) , aumentada, secreción de citocina aumentada, captación de antígeno mediado por complejo inmunológico por las células presentadoras de antígeno aumentada, unión a células NK aumenta|da, unión a macrófagos aumentada, unión a monocitos aumentada, unión a células polimorfonucleares aumentada, señalización directa que induce apoptosis aumentada, reticulado de anticuerpos unidos a objetivo aumentado, maduracjión de células dendríticas aumentada o cebado de linfocitos T aumentado. En una modalidad preferida, la afinidad de unión al receptor Fc aumentada es unión aumentada a un Receptor activador de Fc, de manera más preferible FcyRIIIa. En una modalidad, la ABM es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que contiene la región Fc o una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado , La presente invención se relaciona adicionalmente con composiciones farmacéuticas que comprenden las ABM de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención se relaciona adicionalmente con el uso de dichas composiciones farmacéuticas en el método de tratamiento de cáncer. Específicamente, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento o profilaxis de cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención . La presente invención se relaciona adicionalmente con el uso de dichas composiciones farmacéuticas en el método de tratamiento de una condición o lesión precancerosas.

Específicamente, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento o profilaxis de una condición o lesión precancerosas que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención. La presente invención proporciona además métodos para la generación y uso de sistemas de células hospedadoras para la producción de glucoformas de las ABM de la presente invención que tienen afinidad de unión a receptor Fc aumentada, preferiblemente unión a receptores activantes de Fc aumentada y/o que tienen funciones efectoras aumentadas que incluyen citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. La metodología de glucomanipulación que se puede utilizar con las AB1V de la presente invención ha sido descrita con mayor detalle en la Patente de E.U.A. No. 6,602684, la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2004/0241817 Al, la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0175884 Al, la Solicitud de Patente de E.U.A. Provisional No. 60/441,307 y el documento WO 2004/065540, el contenido completo de cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Las ABM de la presente invención de manera alternativa pueden ser glucomanipuladas para tener residuos de fucosa reducidos en la reg:.ón Fc de acuerdo con las técnicas descritas en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0157108 (Genentech) o en EP 1 176 195 Al, WO 03/084570, WO 03/085119 y en las Publicaciones de Solicitudes de Patente de E.U.A. Nos.: 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140 (todas para Kyowa Hakko Kyogyo Ltd, Los contenidos de cada uno de estos documentos se incorporan en la presente como referencia en su totalidad, Las ABI glucomodificadas de la invención también se pueden producir en sistemas de expresión que producen glucoproteínas modificadas, tales como las descritas en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 60/344,160 y WO 03/056914 ¡Glyco?i, Inc.) o en WO 2004/057002 y WO 2004/024927 (Greenovation) , el contenido de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Generacion de Líneas de Células para la Producción de Proteínas con Patrón de Glucosilación Alterado La presente invención proporciona sistemas de expresión de células hospedadoras para la generación de las ABM d la presente invención que tienen regiones Fc modificadas y patrones de glucosilación Fc modificados. En particular, la presente invención proporciona sistemas de células hospedadoras para la generación de glucoformas de las ABM de la presente invención que tienen un valor terapéutico mejorado Por lo tanto, la invención proporciona sistemas de expresión de células hospedadoras que se seleccionan o se manipulan para expresar un polipéptido que tiene actividad GnT-III . En una modalidad, el polipéptido que tiene actividad GnT-III es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización de Golgi de un polipéptido residente en el sistema de Golgi heterólogo. Específicamente, dichos sistemas de expresión de células hospedadoras se pueden manipular para incluir una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido que tiene GnT-III unido operablemente a un sistema promotor constitutivo o regulado. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una célula hospedadora que ha sido manipulada para ejjcpresar por lo menos un ácido nucleico que codifica para ur, polipéptido de fusión que tiene actividad GnT-III y que comprende el dominio de localización de Golgi de un polipéptido residente en el sistema de Golgi heterólogo. En un aspecto, la célula hospedadora es manipulada con una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen que cc difica para un polipéptido de fusión que tiene actividad GnT-III y que comprende el dominio de localización de Gol i de un polipéptido residente en el sistema de Golgi heterólogo . Generalmente, cualquier tipo de líneas de célula cultiva , incluyendo las líneas de células mencionadas antes se pue<cen utilizar como un fondo para la manipulación de las líneas hospedadoras de la presente invención. En una del prpducto del gen medido por inmunoanálisis o por su actividad biológica . En el primer enfoque, la presencia de la secuencia codificante de la ABM quimérica de la invención y la secuencia codificante del polipéptido que tiene actividad GnT-III se pueden detectar por hibridación ADN-ADN o ADN-ARN utilizajndo sondas que comprenden secuencias nucleotídicas que son homóóllogas a las secuencias codificantes respectivas, de manera respectiva, o porciones o derivados de las mismas. En el segundo enfoque se puede identificar y seleccionar el vector de expresión recombinante/sistema hospedade r en base en la presencia o ausencia de ciertas funciónes del gen "marcador" (por ejemplo actividad de timidina cinasa, resistencia a antibióticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etcétera) . Por ejemplo, si la secuencia codificante de la ABM de la invención o un fragmento de la misma y la secuencia codificante del poli -pPééptido que actividad GnT-III se insertan dentro de una secuencia de gen marcador del vector, se pueden identificar los re ombinantes que contengan las secuencias codificantes respectivas por ausencia de la función del gen marcador. De manera alternativa se puede colocar un gen marcador en Tándem con las secuencias codificantes bajo el control del promotor igual diferente utilizado para controlar la expresión de del marcador en la expresión de invención y la tiene actividad En el tercer enfoque se puede determinar por análisis de hibridación la actividad transcripcional para la región codificante de la ABM de la invención o un fragmento de la misma y la secuencia codificante del polipéptido que tenga actividad GnT-III. Por ejemplo, se puede aislar y analizar ARN por Northern blot utilizando una sonda homologa a las secuencias codificantes de la ABM de la invención o un fragmento de las mismas y la secuencia codificante del polipéptido que tiene actividad GnT-III o porciones particulares de la misma. De manera alternativa, los ácidos nucleicos totales de la células hospedadora se pueden extraer y analizar para hibridación con dichas sondas. En el cuarto enfoque, se puede determinar inmunoJógi camente la expresión de los productos de proteína, por ejemplo por las pruebas de Western blots, inmunoanálisis tal como radioinmunoprecipitación, inmunoanálisis unido a enzima y similares. La prueba final del éxito del sistema de expresión, no obstante, involucra la detección de los productos del gen biológicamente activos.

Generaqión y Uso de las ABM que Tienen Función Efectora Aumentaba que Incluyen Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo En modalidades preferidas, la presente invención proporciona glucoformas de las ABM quiméricas que tienen regiones Fc modificadas y que tienen una función efectora aumentada que incluye citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. La manipulación de glucosilación de los anticuerpos se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, llaa PPaatteeante de E.U.A. No. 6,602,684 incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Los análisis clínicos de los anticuerpos monoclcnales (mAb) no conjugados para el tratamiento de algunos tipos de cáncer recientemente han proporcionado resultados alentadores. Dillman, Cáncer Biother . & Radipph arm . 12 : 223-25 (1997); Deo et al . , Immunology Today 18 : 121 (1997) . Se ha aprobado una IgGl no conjutada quimérica para li nfoma no Hodgkiniano de linfocitos B de grado bajo o folicular. Dillman, Cáncer Biother. & Radippharm . 12 : 223-25 ((11999977)),, mientras que otro mAb no conjugado, una IgGl humanizada dirigida a tumores de mama sólidos también ha mostrado resultados promisorios en ensayos clínicos en fase III. Deoc et al . , Immunology Today 18 : 121 (1997). Los antígenos de estos dos mAb se expresan en gran cantidad en ssuuss ccéélulas tumorales respectivas y los anticuerpos median una ponente destrucción del tumor por células efectores in vitro e| in vivo. En contraste, muchos otros mAb no conjugados con especificidades de tumor fina no pueden activar las funcion¡es efectoras de potencia suficiente para ser clínicalmente útiles. Frost et al . , Cáncer 80 : 311 -33 (1997); Surfus et al . , J. Immunother . 19:184-91 (1996). Para algunos de estos mAb más débiles actualmente se está probando el tratamiento adjunto con citocina. La adición de citocinas puede estimular la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) al incrementar la actividjad y el número de linfocitos circulantes. Frost et al . , Ccincer 80:317-33 (1997); Surfus et al . , J. Immunother. 19:184-91 (1996). DAC, un ataque lítico sobre células a las que se dirigen los anticuerpos, se activa por unión de receptcjres de leucocito a la región constante (Fc) de los anticuerpos. Deo et al . , Immunology Today 18 : 121 (1997) Una solución diferente aunque complementaria para incrementar la actividad ADCC de las IgGl no conjugadas es manipular la región Fc del anticuerpo. Los estudios de manipulación de proteínas han demostrado que los FcyR interaqtúan principalmente con la región de bisagra de la molécula IgG. Lund et al . , J. Immunol . 157:4963-69 (1996). No obstante, la unión de FcyR también requiere la presencia de oligosacáridos unidos covalentemente en el Asn 297 conservado en la región CH2. Lund et al . , J. Immunol . 157:4963-69 determinantes oligosacáridos necesarios a los sitios Fc. No obstante, las IgG expresadas en estas líneas de células carecen de GlcNAc bisectante encontrados en bajas cantidades en las IgG de suero. Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995). En contraste, se ha observado que una IgGl humanizada producida por mieloma de rata (CAMPATH-1H) presenta una GlcNAc bisectante en algunas de sus glucoformas. Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995). El anticuerpo derivado de célula de rata alcanza un máximo similar en la actividad ADCC ir. vitro como los anticuerpos CAMPATH-1H producidos en líneas de células estándar, pero a concentraciones de anticuerpo significativamente menores. El antígeno CAMPATH normalmente está presente en altas concentraciones sobre células de linfoma y este mAb quimérico tiene una alta actividad ADCC en ausencia de GlcNAc bisectante. Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995). En la vía de glucosilación unida a N, se agrega GlcNAc bisectante por GnT-III. Schachter, Biochem . Cell Biol . 64: 163-81 (1986) . Estudios anteriores utilizando una línea de células CHO productora de un solo anticuerpo que previamente ha sido manipulada para expresar, de una manera regular externamente niveles diferentes de una enzima del gen para GnT-III clonado (Umana, P., et al Na ture Biotechnol . 17: 176-180 (1999)). Esta solución estableció por primera vez una relación entre la expresión de GnT-III y la actividad de ADCC del anticuerpo modificado. De esta manera, la invención contempla un ABM recombinante, quimérico o humanizado (por ejemplo anticuerpo) o un fragmento del mismo que tiene una región Fc modificada de uno o más de las modificaciones de aminoácido y que tiene glucosilación alterada que resulta de una actividad GnT-III aumentada. La actividad de GnT-III aumentada resulta en un incremento en el porcentaje de oligosacáridos bisectados así como una disminución en el porcentaje de residuos fucosa, en la reg ón Fc de ABM. Este anticuerpo, o un fragmento del mismo, tiene una afinidad de unión de receptor Fc aumentada y una función efectora aumentada. Además, la invención se relaciona con fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión que comprenden una región que es equivalente a la región Fc de inmunoglobulinas .

Aplicaciones terapéuticas de las ABM producidas de acuerdo con los métodos de la invención, En un sentido amplio, las ABM de la presente invención se pueden utilizar para dirigirse a células in vivo o in vitro que expresen un antígeno deseado. Las células que expresan el antígeno deseado pueden ser el objetivo para propósitos de diagnóstico o terapéuticos. En un aspecto, las ABM de la presente invención se pueden utilizar para detectar la presencia del antígeno en una muestra. En otro aspecto, las ABM de la presente invención se pueden utilizar para unir células que expresan antígeno in vitro o in vivo, por ejemplo para identificación o direccionamiento. Más particularmente, las ABM de la presente invención se pueden utilizar para bloquear o inhibir la unión a antígeno de un ligando de antígeno o de manera alternativa para tener como objetivo células que expresan antígeno para su destrucción. Las ABM de la presente invención se pueden utilizar solas, Ipara tener como objetivo y destruir células tumorales in vivo. Las ABM también se pueden utilizar junto con un agente terapéutico apropiado para tratar carcinoma humano, Por ej mplo, se pueden utilizar las ABM en combinación con método de tratamiento estándar o convencionales tales como quimiot|erapia, radioterapia o se pueden conjugar o enlazar a un medicamento terapéutico o una toxina así como una linfocina o un factor de crecimiento inhibidor de tumor, para suministro del agente terapéutico en sitio del carcinoma. Los conjugados de las ABM de la invención que son de primordial importancia son: (1) inmunotoxinas (conjugados de la ABM y una pojrción citotóxica) y (2) ABM marcadas (por ejemplo radiomalrcadas, marcadas con enzima o marcadas con fluorocromo) en las cuales la marca proporciona un medio para identificar complejos inmunológicos que incluyen a la ABM marcada. Las ABM también se pueden utilizar para inducir lisis a través de procedimientos de complemento naturales y para nteractuar con células citotóxicas dependientes de anticuerpo normalmente presentes. La porción citotóxica de una inmunotoxina puede ser un medícamento citotóxico o una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano o vegetal, o un fragmento enzimat icamente activo ("cadena A") de dicha toxina. Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas utiliza das son la cadena A de difteria, los fragmentos activos que no se unen de la toxina de difteria, la cadena A de exoioxina (de Pseudomonas aeruginosa ) , la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, a-sarcina , proteínas de Aleuri tes fordii , proteínas de diantin a, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordi ca charantia , curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y enomicina. En otra modalidad, las ABM se conjugan a medicamentos anticancerígenos de moléculas pequeña 3. Los conjugados de la ABM y dichas porciones citotóx icas se producen utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales. Los ejemplos de dichos agentes son SPDP, IT, derivados bifuncionales de imidoés teres tales como clorhidrato de adipimidato de dimetil o, esteres activos tales como suberato de disucci nimidilo, aldehidos tales como glutaraldehído, compuestos bis-azido tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazonio tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendianmina, diisocianatos tales qomo 2, 6-diisocianato de tolueno y compuestos de flúor bis-activos tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno. La porción] lisante de una toxina se puede unir al fragmento Fab de las ABM. Las toxinas apropiadas adicionales se conocen en la técn|ica, como es evidente, por ejemplo, en la solicitud de patente: de E.U.A. publicada No. 2002/0128448, incorporada en la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad, una ABM glucomodificada quimérica de la ijnvención se conjuga a la cadena A de ricina. De manera más ventajosa, la cadena A de ricina se desglucosila y se produce a través de medios recombinantes. Un método ventajoso de elaboración de la inmunotoxina de ricina se describe en Vitetta el al., Science 238: 1098 (1987), incorporada en la presente como referencia. Cuando se utiliza para destruir células cancerosas humanas in vitro para propósitos de diagnóstico, los conjugados típicamente se agregarán al medio de cultivo celular en una concentración de por lo menos aproximadamente 10 nM. La formulación y modo de administración para los in vitro no son críticas. Las formulaciones acuosas que son compatibles con el medio de cultivo o de perfusión se utilizarán normalmente. Se puede leer la citotoxicidad por técnicas convencionales para determinar la presencia o grado de cáncer Como se expone en lo anterior, una sustancia radiofarmacéutica citotóxica para tratar cáncer se puede elaborar al conjugar un isótopo radiactivo (por ejemplo I, Y, Pr) a una ABM glucomodificada quimérica que tenga sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo monoclonal murino. El término "porción citotóxica", como se utiliza en la presente, se pretende que incluya dichos isótopos. En otra modalidad, los liposomas se llenan con un medieamento citotóxico y los liposomas se recubren con las ABM de la presente invención. Las técnicas para conjugar dichos agentes terapeiuticos a anticuerpos son bien conocidas (véase, por ejemplo Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodi es and Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds), pp. 243 56 (Aléln R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drúg Delivery", in Con trolled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinsion et al. (eds), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy : A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clínical Applications, Pinchera et al. (eds), pp. 475-506 (1985) ; and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Propertíes Of Antibody Toxin Conjugates", Immunol . Rev. 62: 119 58 (1982) ) . Otras aplicaciones terapéuticas adicionales para las ABNJ de la invención incluye conjugación o enlace, por ejemplo por técnicas de ADN recombinantes a una enzima capaz de convertir un fármaco precursor en un medicamento citotóxico y el uso de dicho conjugado de enzima y anticuerpo en comlt)inación con el fármaco precursor para convertir el fármaco precursor en un agente citotóxico en el sitio del tumor (véase, por ejemplo, Senter et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . US A 85: 4842-46 (1988); Senter et al., Cáncer Research 49: 57 9-5792 (1989); y Senter, FASEB J. 4: 188 193 (1990)). Otro uso terapéutico adicional para las ABM de la invencíón involucra el uso, ya sea no conjugado, en presencia de comp; lemento o como parte de un medicamento de anticuerpo o un con ugado de toxina y anticuerpo, para eliminar células tumorales de médula ósea de pacientes con cáncer. De acuerdo con est a solución, se puede purgar médula ósea autologa ex vivo p r tratamiento con el anticuerpo y la médula ósea se administra por infusión nuevamente al paciente (véase, por ejemplo Ramsay et al., J. Clin . Immunol . 8(2): 81 88 (1988)). De manera similar, una proteína de fusión que comprende por lo menos una región que une antígeno de una ABM de la invención unida a por lo menos una porción funcion lmente activa de una segunda proteína que tiene actividad antitumoral, por ejemplo una linfocina u En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un método mejorado para tratar trastornos de proliferación celular en donde se expresa un antígeno asociadlo a tumor, particularmente en donde el antígeno asociadlo a tumor se expresa anormalmente (por ejemplo se sobreexpresa) , que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una ABM de la presente invención a un sujeto humano en necesidad de la misma. De manera similar otros trastornos de proliferación celular también pueden ser tratados por las ABM de la presente invención. Los ejemplos de dichos trastornos de proliferación celular incluyen, pero no se limitan a: hipergaimmaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad de proliferación celular, además de neoplasia, que se localizan en un sistema de órgano incluido. De acuerdo con la práctica de esta invención, el sujeto puede ser un sujeto humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino o aviar. También se incluyen en esta invención otros animales homeotérmicos . La presente invención proporciona adicionalmente métodos para inhibir el crecimiento de célula tumorales humanas , tratar a un tumor en un sujeto y tratar una enfermedad de tipo proliferativo en un sujeto. Estos métodos comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de ABM de la invención. Por lo tanto, es evidente que la presente invención abarca composiciones farmacéuticas, combinaciones y métodos para el tratamiento o profilaxis del cáncer o para el uso en el tratamiento o profilaxis de una condición o lesión precancerosa. La invención incluye composiciones farmacéuticas para el uso en el tratamiento o profilaxis de cánceres humanos tales como melanomas y cánceres de vejiga, cerebrej, de vías respiratorias y digestivas altas, páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata y riñon. Por ejemplo, la invención incluye composiciones farmacéuticas para uso en el trabamiento o profilaxis de cánceres tales como cánceres maligne s humanos, o para uso en el tratamiento o profilaxis de una condición precancerosa o una lesión que comprende una cantidald farmacéuticamente eficaz de una molécula que une antígeno de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El cáncer puede ser, por ejemplo cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células amicrociticas (NSCL) , cáncer de pulmón de células broncoalviolares, cáncer de hueáo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de las vías respiratorias y digestivas ocultas, melanoma cutáneo o intraoqular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer en la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinopa de las trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer del esofago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la tiroides, cáncer de la paratiroides, cáncer de las suprarrenales, sarcoma de tejido suave, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer de la vejijga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales , carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, leucemia crónica o aguda, linfoma linfocitícos, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores de la médula espinal, glioma del tallo cerebra 1, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependíiromas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenomas de lipofisis que incluyen versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. La condición o lesión precancerosa incluye, por eejjeemmpplloo! el grupo que consiste de leucoplacia oral, queratosis actíniqa (queratosis solar) , pólipos precancerosos del colon o recto , displasia epitelial gástrica, displasia adenomatosa, síndrome de cáncer de colon sin pólipos hereditarios (HNPCC) , esófago de Barrett, displasia de vejiga y condiciones cervicales precancerosas. Preferiblemente, dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de piel, cláncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro. La frase "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificaciones las cuales están, dentro del alcance del juicio médico razonable, como adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos de animales sin una cantidad excesiva de toxicidad, irritac ron, respuesta alérgica u otro problema o complicación, conmensurado con una relación razonable de beneficio/riesgo. Se puede utilizar cualquier material portador convencional. El material portador puede ser un material orgánico o uno inorgánico adecuado para administración enteral, percutánea o paraenteral. Los portadores adecuados incluyen agua, gelatina, goma arábiga, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, aceites vegetalss, polialquilenglicoles, jalea de petróleo y similarss. Además, las preparaciones farmacéuticas pueden contener otros agentes farmacéuticamente activos. Los aditivos adicionales tales como agentes saborizantes, estabilizantes, agentes emulsificantes, amortiguadores y similares se pueden agregar de acuerdo con las prácticas aceptadas para la elaboración de compuestos farmacéuticos. En una modalidad adicional, la invención se relaci na con una ABM de acuerdo con la presente invención ppaarraa uusso como un medicamento, en particular para uso en el tratami snto o profilaxis de cáncer o para uso en el tratamiento o profilaxis de una condición o lesión precancerosa. El cáncer puede ser, por ejemplo cáncer de pulmón, cáncer de pulmón amicrocitíco (NSCL) , cáncer de ppuullmmóónn de células broncoalveolares, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de las vías respiratorias y digestivas altas, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la tiroides, cáncer de la paratiroides, cáncer de las suprarrenales, sarcoma de tejido suave, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcincma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, leucemia crónica o aguda, linfomas linfocitícas, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores de la médula espinal, glioma del tallo cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependirromas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenomas de lipofisis que incluyen versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. La condición o lesión precancerosa incluye, por ejemplo el grupo que consiste de leucoplacia oral, queratosis actínica (queratosis solar) , pólipos precancerosos del colon o recto, displasia epitelial gástrica, displasia adenomatosa, síndrome de cáncer de colon sin pólipos hereditarios (HNPCC) , esófago de Barrett, displasia de vejiga y condiciones cervicales precancerosas. Preferiblemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebroJ Otra modalidad adicional es el uso de ABM de acuerdó con la presente invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de cáncer. El cáncer es como se define en lo anterior. Preferiblemente, dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de piel, cjáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerelbro, También de manera preferible, la molécula que une antígeno se utiliza en una cantidad terapéuticamente eficaz desde aproximadamente 1.0 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg. También de manera más preferible, la molécula que intravenosa. En un aspecto de la invención, las formulaciones terapéuticas que contienen los ABM de la invención se preparan para almacenamiento por mezclado de un anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables ( Remington ' s Pharma ceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) en forma de formulaciones liofilizadas o solucicnes acuosas. Los portadores, excipientes o estábil izantes adaptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol y m-cr sol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa! mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa sorbit l; contra iones formadores de sales tales como sodio; complej|os de metal (por ejemplos complejos de Zn-proteína) ; y/o teihsioactivos no iónicos tal como TWEENR, PLURONICSMR o polietijlenglicol (PEG) Los ABM de la presente invención se pueden administrar a un sujeto para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por actividad anormal de antígeno objetivo tal como un tumor, ya sea solo o combinado con terapia por ejemplo con un agente quimioterapéutico y/o con radioterapia. Los agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen cisplatino, doxorrubicina, topotecano, paclitaxel, vinblastina, carboplatino y etopósido. Además, los ABM de la presente invención se pueden utilizar como un sustituto para terapia IVIG. Aunque introducida por primera vez para el tratamiento de hipogammaglobulinemia, IVIG se ha demostrado desde entonces que tiene amplias aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de enfermedades infecciosas e inflamatorias. Dwyer, J. M., New England J. Med. 326: 107 (1992). Las especificidades policlonales encontradas en estas preparaciones se han demostrado que son las responsables para algunos de los efectos biológicos de IVIG. Por ejemplo, se ha utilizado IVIG como profilaxis contra agentes infecciosos y en el tratamiento de dermatitis necrotizante. Viard, I. et al., Science 282 : 490 (1998) . Independientemente de estos efectos específicos de antígeno, IVIG tiene actividades antiinflamatorias bien reconocidas, atribuidas generalmente a los dominics Fc de inmunoglobulina G (IgG) . Estas actividades, aplicadas por primera vez para el tratamiento de trombocitopenia inmune (ITP) (Imbach, P. et al., Lancet 1228 (1981); Blanchette, V. et al., Lancet 344: 703 (1994)) se han extendido al tratamiento de una diversidad de trastornos inflamatorios mediados inmunológicamente que incluyen citopenias autoinmunes, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, enfermedad autoinmune anti-factor VIII, dermatomiosistis, vasculitis y uveitis (van der Meche, F. G. et al., New Engl . J. Med. 326: 1123 (1992); Gajdos, P. et al., Lancet 406 (1984); Sultán, Y. et al., Lancet 765 (1984); Dalakas, M. C. et al., New Engl . J. Med. 329: 1993 (1993); Jayne, R. et al., Lancet 337: 1137 (1991); LeHoang, P. et al., Ocul . Immunol . Inflamm . 8: 49 (2000)). Una diversidad de explicaciones se han colocado de manera adelantada para explicar estas actividades que incluyen bloque del receptor Fc, atenuación del daño a tejido mediado por complemento, neutralización de autoanticuerpos por anticuerpos para idiotipo, neutralización de supreantígenos, modulación de producción de citocina y regulación por disminución de la respuestas de los linfocitos B (Ballow, M., J. Allergy Clin . Immunol . 100: 151 (1997); Debre, M. et al., Lancet 342 : 945 (1993); Soubrane, C. et al., Blood 81: 15 (1993) ; Clarkson, S. B. et al., N. Engl . J. Med. 314: 1236 (1986). Las formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea se describen en WO97/04801. Dichas formulaciones liofilizadas se pueden diluir con un diluyente adecuado a una concentración alta en proteína y la formulación diluida se puede administrar subcutáneamente al mamífero para ser tratado con la misma. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según se necesite para la indicación particular que sea tratada, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no se perjudiquen entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, una citocina o un agente inmunosupresor (por e emplo uno el cual actúe sobre linfocitos T tal como ciclosporina o un anticuerpo que se una a linfocitos T, por ejemplo uno el cual se una a LFA-1) . La cantidad eficaz de dichos agentes adicionales depende de la cantidad de antagonista presente en la formulación, el tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento y otros factores mencionados antes. Estos g'eneralmente se utilizan en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se utilizan en lo anterior o aproximadamente desde 1 hasta 99% de las dosificaciones utilizadas hasta ahora.

Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metacrilato de metilo), respectivamente en sistemas de suministro de medicamentos coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Dichas técnicas se describen en Remington ' s Pharma ceutical Sciences décima sexta edición, Osol, A. Ed. 1980) Las preparaciones de liberación sostenidas se pueden preparar. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímerbs hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, matrices las cuales están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli (alcohol vinílico)), poliláctidas (patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de ?-etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácico láctico-ácido glicólico degradable tal como LUPRON DEPOTMR (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido táctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido pbli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones para ser utilizadas en administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril Las composiciones de la invención pueden estar en una vartiedad de formas de dosificación las cuales incluyen, pero no se limitan a soluciones o suspensiones líquidas, comprimidos, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas poliméricas o microvesículas, liposomas y soluciones inyecta?|bles o suministrables por infusión. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones de la invención preferiblemente también incluyen portadores y adyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales conocidos en la técnica tales como albúmina sérica humana, intercambiadores de iones, alúmina, lecitina, sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio y sales o electrolitos tales como sulfato de protamina. El modo de administración más eficaz y el régimen de dosilficación para las composiciones farmacéuticas de esta invención depende de la gravedad y el curso de la enfermedad, la salud del paciente y la respuesta al tratamiento así como el juijcio del médico que realice el tratamiento. En consecuencia las dosificaciones de las composiciones pueden ajustarjse al paciente individual. No obstante, una dosis eficaz de las composiciones de esta invención generalmente estará en el intervalo desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 2000 mg/kg. Las moléculas que unen antígeno descritas en la presentje pueden estar en una variedad de formas de dosificación las cuales incluyen, pero no se limitan a solucicnes o suspensiones líquidas, comprimidos, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas poliméricas o microvefsículas, liposomas y soluciones inyectables o susceptibles de infusión. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica. La composición que comprende una ABM de la presente invención se formulará, dosificará y administrará de una manera consistente con las buenas prácticas médicas. Los factores para consideración en este contexto incluyen la enfermedad o trastorno particular que es tratado, el mamífero particular que es tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el protocolo de administración y otros factores conocidos por los médicos. La cantidad terapéuticamente eficaz del antagonjista que se va a administrar estará determinada por dichas consideraciones .

Como una proposición general, la cantidad terapéu ticamente eficaz del anticuerpo administrado párente raímente por dosis estará en el intervalo desde aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg del peso corporal del paciente al día, con un intervalo inicial típico de antagonista utilizaido que se encuentre en el intervalo desde aproximadamente 2 hasta 10 mg/kg. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo humanizado. Las dosificaciones adecuadas para dicho anticuerpo no conjugado están, por ejemplo, en el intervalo desde aproximadamente 20 mg/m2 hasta aproximadamente 1000 mg/m2. Por ejemplo, uno puede administrar al paciente una o más dosis de sustancialmente menos de 375 mg/m del anticuerpo, por ejemplo, cuando la dosis está en el intervalo desde aproximadamente 20 mg/m2 hasta aproximadamente 250 mg/m2, por ejemplo desde aproximadamente 50 mg/m2 hasta aproximadamente 200 mg/m2. Además, uno puede administrar una o más dosis iniciales del anticuerpo seguido por una o más dosis posteriores en donde la dosis de en mg/m2 del anticuerpo en una o varias de las dosis subsecuentes excede la dosis en mg/m2 del anticuerpo en una o varias de las dosis iniciales. Por ejemplo, la dosis inicial puede estar en el intervalo desde aproximadamente 20 mg/m2 hasta aproximadamente 250 mg/m2 (por ejemplo desde aproximadamente 50 mg/m2 hasta aproximadamente 200 mg/m2) y la dosis subsecuente puede estar en el intervalo desde aproximadamente 250 mg/m2 hasta aproximadamente 1000 mg/m2. No obstante, como se indica en lo anterior, estas cantidades sugeridas de ABM se someten en gran medida al criterio terapéutico. El factor clave al seleccionar una dosis apropiada y la programación es el resultado que se obtiene, como se indica en lo anterior. Por ejemplo, pueden ser necesarias inicialmente dosis relativamente mayores para el tratamiento de enfermedades que se están produciendo y agudas. Para obtener los resultados más eficaces, dependiendo de la anfermedad o trastorno, el antagonista se administra tan cercano al primer signo, diagnóstico, aparición o presentación de la enfermedad o trastorno como se pueda o durante la remisiones de la enfermedad o trastorno. En el caso de las ABM de la invención utilizadas para ttatar tumores, los resultados terapéuticos óptimos generalmente se obtienen con una dosis que es suficiente para saturar completamente al antígeno de interés sobre las células objetivo. La dosis necesaria para obtener saturación dependerá del número de moléculas de antígeno expresadas por célula tumoral (lo cual puede variar significativamente entre diferentes tipos de tumores) . Para tratar algunos tumores las concentraciones séricas tan bajas como 30 nM pueden ser eficaces para tratar algunos tumores, aunque concentraciones superiores de 100 nM pueden ser necesarias para obtener un efecto terapéutico óptimo con otros tumores. La dosis necesaria para obtener saturación para un tumor dado se pueden determinar fácilmente in vitro por radioinmunoanálisis o inmunoprecipitación . En general, para tratamiento combinado con radiación un régimen terapéutico adecuado involucra ocho infusiones semanales de una ABM de la invención a una dosis de carc a de 100-500 mg/m2 seguido por dosis de mantenimiento a 100-2 50 mg/m2 y radiación en la cantidad de 70.0 Gy a una dosis ce 2.0 Gy diariamente. Para terapia de combinación con quimioterapia, un régimen terapéutico adecuado involucra administrar una ABM de la invención como dosis de carga/mantenimiento semanalmente de 100/100 mg/m2, 400/250 mg/m2 500/250 mg/m2 en combinación con cisplatino a una dosis ce 100 mg/m2 cada tres semanas. De manera alternativa, se pueden utilizar gemcitabina o irinotecano en lugar de cisplatino. La ABM de la presente invención se administra por cualquier medio adecuado que incluye parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitorneal o subcutánea. Además, el antagonista se puede a|dministrar adecuadamente por infusión por pulsos, por ejemplo con dosis cada vez menores del antagonista.

Preferíblemente, la dosificación se suministra por inyeccipnes, de manera más preferible por inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o prolongada. Se pueden administrar otros compuestos, tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores y/o citocinas con los antagonistas de la present La administración combinada incluye la coadministración, uso de formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única y administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente existe un período de tiempo entre ambos (o todos) los agentes activos que ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Será claro que la dosis de la composición de la invenci ón necesaria para obtener curación puede reducirse aún más con optimización del protocolo. De acuerdo con la práctica de la invención, el portador farmacéutico puede ser un portador lipídico. El portador lipídico puede ser un fosfolípido. Además, el portador lipídico puede ser un ácido graso. Además, el portador lipídico puede ser un detergente. Como se utiliza en la presente, un detergente es cualquier sustancia que altera la te:nsión superficial de un líquido, generalmente disminuyéndola . En un ejemplo de la invención el detergente puede ser un detergente no iónico. Los ejemplos de detergentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a polisorbato 80 (tambié :n conocido como Tween 80 o (monooleato de polioxi stilensorbitano) , Brij y Tritón (por ejemplo Tritón WR 1339 y Tritón A 20) . De manera alternativa, el detergente puede ser un detergehte iónico. Un ejemplo de un detergente iónico incluye, pero no se limita a bromuro de alquiltrimetilamonio. De manera adicional, de acuerdo con la invención, el portador lipídico puede ser un liposoma. Como se utiliza en esta solicitud, un "liposoma" es cualquier vesícula unida a membrana la cual contenga cualquiera de las moléculas de la invencíoón o combinaciones de las mismas.

Artículos de manufactura En otra modalidad de la invención se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos en lo anterior. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o un inserto de empaque sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes se pueden conformar de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente retiene una composición la cual es eficaz para tratar la condición y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tenga un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es una ABM de la invención. El marbete o el inserto en el empaque indica que la composición es útil para tratar la condición de elección tal como una enfermedad o trastorno no maligno, por ejemplo enfermedad o trastorno hiperproliferativo benigno. Además, el artículo de manufactura puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo en donde la composición comprende una primera ABM la cual se une a un antígeno objetivo e inhibe el crecimiento de células las cuales sobreexpresan dicho antígeno; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un segundo anticuerpo el cual se une al antígeno y bloquea la activación de ligando de un receptor de antígeno. El artículo de manufactura en esta modalidad de la invención puede comprender además un inserto de empaque que indica que la primera y segunda composiciones de anti.cuerpos se pueden utilizar para tratar enfermedad o trastornos no malignos a partir de la lista de dichas enfermedades o trastornos en la sección de definición anterio'r. Además, el inserto de empaque puede instruir al usuario de la composición (que comprende un anticuerpo el cual se une a un antígeno objetivo y bloquea la activación de ligando de un receptor de antígeno objetivo) para terapia combinada con el anticuerpo y cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la sección precedente (por ejemplo un agente quimioterapéutico, un medicamento dirigido a antígeno, un agente anti-angiogénico, un agente inmunosupresor, inhibidor de tirosina cinasa, un compuesto antihormonal, un cardioprotector y/o citocina) . De manera alternativa o adicional, el artículo de manufactura puede comprender adicionalmente un segundo (o tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Se puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario que incluyen otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Los ejemplos a continuación explican la invención con mayior detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se proporcionan para permitir a una persona experta en la técnica comprender con mayor claridad y llevar a la práctica la presiente invención. No obstante, la presente invención no está limitada en alcance por las modalidades ejemplificadas las cuales se presentan como ilustraciones de aspectos sencillos de la invención únicamente y los métodos los cuales sean f Uncionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invunción. En realidad, diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en la presente se volverán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripeion precedente y los dibujos anexos. Tales modifiqaciones se pretende que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las patentes, solicitudes y public aciones mencionadas en esta solicitud se incorp oran en la presente como referencia en su totali dad.

EJEMPLOS A menos que se especifique de otra manera, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoácidos específicos en los siguientes ejemplos son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat . A menos que se indique de otra manera, los materiales y métodos utilizados para la producción de las moléculas que unen antígeno en estos ejemplos de trabajo concuerdan con las establecidas en los ejemplos de la solicitud de patente de E.U.A. No 10/981,738, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad EJEMPLO 1 MATERIALES Y MÉTODOS Líneas celulares, vectores de expresión y anticuerpos Las células HEK293-EBNA son un amable obsequio de Rene Fischer (ETH Zürich) . Las líneas de células adicionales en este estudio son células Jurkat (células T linfoblásticas humanas , ATCC número TIB-152) de líneas de células Jurkat que expresa n Fc?RIIIa[Val-158] así como Fc?RIIIa [Val-158/Gln- 162], creadas como se ha descrito previamente (Ferrara, C. et al., Bi otechnol . Bioeng. 93(5): 851-861 (2006)). Las células se cult ivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Los A DN que codifican para shFc?RIIIa [Val-158 ] y shFc?RI !Ia[Phe-158] se generan por PCR (Ferrara, C. et al., J. Biol . Chem . 281(8): 5032-5036 (2006)) y se fusionan a una etiquet a de hexahistidina lo que resulta en una proteína madura que termina después del residuo 191 (NH2- MRTEDL. . GYQG He ) -COOH, la numeración se basa en la proteína madura) como se ha descrito (Shields, R. L. et al., J. Biol .

Chem . 276(9): 6591-6604 (2001)). El Asn-162 de shFc?Ri: Ia[Val-158] se intercambia por Gln, por medio de PCR.

Todos Los vectores de expresión contienen el origen el replica oión OriP del virus de Epstein Barr para expresión en células HEK293-EBNA. Se producen anticuerpos GE y anti-CD20 nativos en células HEK-293 EBNA y se caracterizan por métodos estánda r. Los perfiles de oligosacárido neutro para los siglas en inglés) de glucovariantes de IgG humana se realiza en un chip CM5 utilizando el equipo de acoplamiento amina estándar (Biacore, Friburgo/Alemania) . Se hacen pasar diferentes concentraciones de Fc?R soluble con un caudal de 10 µl/p.in a través de las células de flujo. Las diferencias en el índice de refracción a granel se corrigen al restar la respuesta obtenida al flujo sobre una superficie acoplada a BSA. Sei utiliza la respuesta de estado estable para derivar la constante de disociación KD mediante acoplamiento de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Las constantes cinéticas se derivan utilizando el programa de BIAevaluación de instalación de acoplamiento de curva (v3.0, Biacore, Friburgo/Alemania), para ajustar las ecuaciones de velocidad para unión de Langmuir 1:1 por integración numérica. Unión de IgG a células que expresan Fc?RIIIa Se llevan a cabo experimentos como se ha descrito previamente (Ferrara, C. et al., Biotechnol . Bioeng. 93(5): 851-861 (2006) ) . Brevemente, se incuban células Jurkat que expresan hFc?RIIIa con variantes IgG en PBS, BSA 0.1% Después de uno o dos lavados con PBS, BSA 0.1%, se detecta la unión de anticuerpo al incubar con anticuerpo de chivo anti IgG específica F(ab')2 antihumano, F(ab')2 conjugado con FITC 1:200 (¡Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA/USA) (Shields, R. L. kt al., J. Biol . Chem . 276(9): 6591-6604 (2001)). La intensidad de fluorescencia con referencia a las variantes de anticuerpo unido se determinan en un equipo FACS Calibur (BD Biosciences, Allschwil/Suiza) . Modelado Se realiza el modelado en base en la estructura cristallina de Fc?RIII en complejo con el fragmento Fc derivadlo de IgG nativa (PDB código le4k) . Para este proposito, las coordenadas de la porción carbohidrato unidas a Asn-297 de la Fc se duplican y uno de los glucanos se ajusta manualmente como un cuerpo rígido a Asn-162 de Fc?RIII con el núcleo pentasacárido dirigido a la posición en donde está prlesente el residuo FUC del oligosacárido Asn-297 de Fc. El modeJo no se minimiza en energía y únicamente se genera para visualizar el modo de unión propuesto. RESULTADOS Caracterización bioquímica de receptores Fc?RIIIa solubles y glucovariantes de anticuerpo Se expresan ShFc?RIIIa [val-158 ] , shFc?RIIIa [Phe- 158] y shFc?RIIIa[Val-158/Gln-162] en células HEK293-EBNA y se purifican hasta homogeneidad. shFc?RIIIa- [Val-158 ] y - [Phe-15 ] purificados migran como una banda amplia cuando se someten a SDS-PAGE reductor con un peso molecular aparente de 40-50 kDa, el cual es ligeramente menor para el mutante shFc?RIIIa [Val-158/Gln-162 ] (datos no mostrados). Esto ke puede explicar por la eliminación de los carbohiidratos unidos a Asn-162. Ante N-desglucosilación enzimátjica, la totalidad de las tres variantes de receptor migran de manera idéntica en el intervalo de peso molecular aparente de 25 a 30 kDa y muestran tres bandas como se ha observado previamente para hFc?RIII unido a membrana (Edber?, J. C. & Kimberly, R. P., J. Immunol . 158(8): 3849-3857 (1997), Ravetch, J. V. & Perussia, B., J. Exp . Med. 170(2): 481-497 (1989)). Este patrón heterogéneo puede resultar de la presencia de carbohidratos O-unidos. El patrón de glucosilación de anticuerpo nativo está caracterizado por oligosacáridos complejos fucosilados bianterarios (figura lb, c) o heterólogos con respecto al contenido de galactosa terminal. Se producen anticuerpos GE en una línea celular que sobreexpresa N-acetilc lucosaminiltransferasa III (GnT-III), una enzima que catali?a la adición de GlcNAc bisectante (figura la) a la ß-manosa de núcleo. Se generan dos variantes de anticuerpo GE diferentes, se produce Gluco-1 por sobreexpresión de GnT-III solo y Gluco-2 por co-expresión de GnT-III y Man-II recombinante (Ferrara, C. et al., Biotechnol . Bi oeng. 93(5): 851-861 (2006), figura lb) . Tanto Gluco-1 como Gluco-2 se caracterizan por proporciones altas de oligosacáridos no fucosilados bisectados (88% de tipo híbrido y 90% de tipo complejo, respectivamente, figura lc) . Previamente hemos demostrado que ambas formas proporcionan incrementos similares en afinidad para Fc?RIIIa y ADCC aumentada en relación a los anticuerpos nativos pero difieren en su reactividad en análisis CDC (Ferrara, C. et al . , 13 iotechnol . Bioeng. 93(5): 851-861 (2006)). Las modific aciones IgG-oligosacárido generan anticuerpos con afinidad aumentada por shFc?RIIIa. Las interacciones de glucovariantes de anticuerpo con las variantes de shFcyRIIIa ([Val-158], [Phe-158]y [Val-158/Gln-162), shFcyRIIIb y smFcyRIIb se analizan por SPR. La unión de shFcyRIIIa [Val-158 ] con los anticuerpos GE es hast a 50 veces más fuerte que con el anticuerpo negativo (KD (Gluco -2) 0.015 µM versus KD(nativo) 0.75 µM, Tabla 6). De manera importante, la forma polimórfica de "baja afinidad" del receptor, shFcyRIIIa [ Phe-158 ] también se une a los anticue rpos GE con una afinidad significativamente mayor que la del anticuerpo nativo (KD(Giuco-i) 0.27 µM (18 veces), KD(G1UCO- , 0.18 µM (27 veces), KD,natiV0) 5 µM (Tabla 6)). La disocia ción de ambos variantes de receptor a partir de IgG natural es demasiada rápida para permitir una determinación directa de las constantes cinéticas para estas interac ciones. Aunque no es posible obtener parámetros cinétic os para la unión de los receptores Ab nativo, la superpc sición de los datos experimentales muestra cláramente que un efecto principal de la glucomodificación de lo ; anticuerpos es disociación disminuida de los recepteres (figura 2a). Para calcular las tasas de disociación de IgG natural en datos experimentales se superpone con curvas que simulan diferentes constantes de velocidad de disociación (no mostrado) . Esto indica que la totalidad del incremento en la afinidad por glucomodificación puede considerarse para una Kd disminuida.

Las cortstantes de velocidad de asociación (ka) de las dos formas polimórficas de shFcyRIIIa para los anticuerpos GE son s Lmilares pero la velocidad de asociación de shFcyRI IIa[Phe-158] es significativamente más rápida y toma en con lideración en gran medida la menor afinidad de este receptor (Tabla 6) . La afinidad de los anticuerpos hacia FcyRIIb humana y murina también se mide. Tanto GE como las IgG naturales unidas al receptor inhibidor humano shFcyRIIb con afinidades similares en el intervalo de KD = 1.55 - 2.40 µM (Tabla 6) . Para la versión murina de este receptor, la afinidad hacia IgGl humana tampoco se altera por glucomcdificación pero sorprendentemente es de 3.4 a 5.5 veces las del receptor FcyRIIb humano (Tabla 6) . La constante de disociación (KD) para la interacción del anticuerpo nativo con sh/mFc?RIIb únicamente se puede determinar por análisis en estado estable (Tabla 6) debido a que el equilibrio se alcanza demasiado rápido para una evaluac ion cinética (Figura 2a) .

TABLA 6 Resumen de las constan tes de afinidad determinadas por análisis al equilibrio y cinético IgGl Receptor Fo? ka (x 10 5 M~ kd (x 1(T Ko-cinética Ku-estado estable V1) (µM) (µM) nativo shFc?RIIIa[Val-158] nd* nd* nd* 0.75 ± 0.04 Gluco-1 shFc?RIIIa [Val-158] 2..4 + 0. .01 5.8 ± 0.024 ± nd Gluco-2 shFc?RIIIa [Val-158] 3..2 ± 0..01 0.01 •c?.001 0.015 5.1 ± 0.016 ± nativo shFc?RIIIa[Phe-158] nd* nd* nd* 5 ± 0.3 Gluco-1 shFc?RIIIa [Phe-158] 1..6 + 0. .09 32 ± 0. 1 0.,20 ± 0.001 0.27 ± 0.01 10 Gluco-2 shFc?RIIIa[Phe-158] 2..3 ± 0..01 29 ± 0. 1 0.,13 ± 0.001 0.18 ± 0.01 1 nativo shFc?RIIIa[Val- 5. .9 ± 0. ,05 90 ± 0. 4 0. .16 ± 0.001 0.24 ± 0.01 H Gluco-1 158/Gln-162] 4..7 ± 0.,02 89 ± 0.5 0.,19 ± 0.001 0.30 ± 0.01 00 Gluco-2 shFc?RIIIa[Val- 8..1 ± 0.,06 72 ± 0.3 0.,09 ± 0.001 0.20 ± 0.01 1 158/Gln-1621 nativo shFc?RIIb nd * nd * nd * 2.4 ± 0.01 Gluco-1 shFc?RIIb nd* nd* nd* 2.4 ± 0.05 Gluco-2 shFc?RIIb nd* nd* nd* 1.6 ± 0.05 15 nativo smFc?RIIb nd * nd * nd * 0.44 ± 0.01 Gluco-1 smFc?RIIb nd* nd* nd* 0.69 ± 0.01 Gluco-2 smFc?RIIb nd* nd* nd* 0.46 ± 0.01 Los errores se calculan para el ajuste de curva y para la desviación de dos experimentos (se necesita más detalle, no estoy seguro de que esto se haya realizado) nd = no determinado *cinética demasiado rápida para determinación exacta h, humana y m, ratón - La gluqosilación de Fc?RIIIa-regula la unión a glucovariantes de anticuerpo Una forma mutante de hFcyRIIIa que no se glucosila el Asn 162 (shFc?RIIIa[Val-158/Gln-162] ) se utiliza para analizar la influencia de una interacción potencial, mediada por carbohidratos, entre un oligosacárido en esta posición en el receptor e IgG. De manera interesante, ante la separación de Asnl 62, la IgG natural muestra un incremento al triple (KD = 0.24 µM, c.f. 0.75 µM) en la afinidad por el receptor, mmiieennttrraas que los anticuerpos GE muestran una disminución superior a 13 veces en la afinidad (Tabla 6) . Para unión a anticuerpos GE, la separación del sitio de glucosilación del receptor resulta en un incremento casi del doble en Ka, pero un inc emento superior a 14 veces en kd (Tabla 6) . Las KD déte :rm?nadas en estado estable y de manera cinética difieren en 1.6 y 2.2 veces para la unión de shFcyRIIIa [Val-158/Gln-162]. Ejsta discrepancia muy probablemente resulte de un alto error en el ajuste de la disociación muy rápida observada. Los resultados basados en SPR se corroboran en un ssiisstteemmaa celular utilizando células Jurkat que expresan FcyRIIIa. Las células Jurkat (líneas de linfocitos T humanos) represe ta un ambiente natural para la expresión de FcyRIIIa (Edberg , J.C. & Kimberly, R.P., J. Immunol . 158 (8) : 3849-3857 (1997) ) El mAb anti-Fc?RIIIa 3G8, el cual no diferencia eennttrree Fc?RIIIa [Val-158 ] y FcyRIIIa [Val-158/Gln-162 ] - (Drescher, B. et al . , Immunology 110 (3) : 335-340 (2003)), se utiliza para monitorear la expresión de FcyRIII en estas líneas de células. En este experimento, los anticuerpos GE se unen a FcyRIIIa [Val-158] mejor que el anticuerpo nativo (Figura 3c). La unión a FcyRIIIa [Val-158/Gln-162] no obstante es casi indetectable para todas las variantes de IgG, que incluyen IgG natural (figura 3c). Las constantes de velocidad de di ociación muy rápidas que se encuentran en el experimento de SPR para unión de FcyRIIIa [Val-158/Gln-162] ppaarraa llaa totalidad de las tres variantes de IgG puede explicar esta union despreciable en el análisis celular, Discusión Análisis cinético de la interacción Fc?RIIIa/IgG En general nuestras KD medidas concuerdan con las publicadas previamente por Okazaki et al . (Okazaki, A. et al . , Ji Mol . Biol . 336 (5) :1239-1249 (2004). Estos autores concluyeron que el incremento de afinidad del anticuerpo no fucosilado (GE) es causado de manera predominante por un incremento en ka. De manera contrastante, aunque no pudimos cuantificar ka y kd para la unión a IgG natural debido a la alta velocidad de la reacción, un análisis cualitativo de estos eventos de unión en comparación con aquellos que involucran anticuerpos GE muestran claramente una disociación significativamente más rápida de las variantes del receptor a - partir de IgG nativo (figura 2a). Por lo tanto, se puede concluir que las interacciones nuevas entre los asociados de unión qjue se forman o que están presentes mejoran.

Glucosilación de FcyRIIIa en Asnl62 modula la unión a anticuerpos Fc?RIIIa de origen de mamífero es una proteína altamenlte glucosilada con cinco sitios de glucosilación unidos a N. Como se establece la hipótesis a partir de la estructura cristalina del complejo Fc?RIII/IgGl-Fc (Sondermann, P. et al . , Na ture 406:267-273 (2000) (incorporado en la presente como referencia en su totalidad) , la ellítllnación de glucosilación en Asnl62 resulta en una afinidad aumentada por IgGl natural (Drescher, B. et al . , Immunol oy 110 (3) : 335-340 (2003)) probablemente por la eliminación de una oposición estérica de la porción de carbohidratos hFcyRIIIa [Asnl62 ] con el Fc . La eliminación del carbohidrato en los otros cuatro sitios de N-glucosilación no afecta la afinidad por IgG natural (Drescher, B. et al . , Immunol ogy 110 (3) -. 335-340 (2003)). Se construye una versión mutante del receptor de alta ai inidad el cual está no glucosilado en la posición 162 (shFcyRIlia [Val-158/Gln-162] ) para investigar adicionalmente la impcrtancia de la glucosilación de IgG y FcyRIIIa para su interacción. Como se esperaba, encontramos un incremento en - la afinidad por la interacción entre el anticuerpo nativo y la gl ICOsilación de Asnl62 deficiente de Fc?RIIIa [Val-158/Gln-162] (3 veces, Tabla 6) . No obstante, los anticuerpos GE se unieron más de diez veces de manera más débil al receptor mutante en comparación con shFcyRIIIa [Val-158 ] (Tabla 6) de receptor glucosilado nativo [Tabla 6) , lo que indica que el oligosacárido unido a Asnl62 de hFcyRIIIa favorece la interacción entre IgGl y su receptor Fc. Estos datos e corroboran en un sistema de análisis celular en donde 1os anticuerpos GE se unen de manera significativamente mejor a células que expresan FcyRIIIa [Val-158] en comparación a células que expresan FcyRIIIa [Val-158/Gln-162 ] (Figura 3c). En otr conjunto de experimentos, los presentes inventores demostraron que es comportamiento de unión de los anticuerpos con un contenido de coseno reducido considerablemente y que carece de GlcNAc bisectante (Fue-) generados por la expresión en cél las de mieloma YO (Lifely, M.R. et al . , Glycobiol . 5 (8) : 81 3-822 (1995)) es muy similar al de los anticuerpos GE (es de ir, la afinidad del receptor desglucosilado es menor que para el receptor nativo) . La ausencia del residuo fucosa en el JE y los Fue-anticuerpos por lo tanto parece ser el responsable principal de la afinidad incrementada de la forma glucosilada del receptor para estos anticuerpos (véase, por ejemplo Shinkawa, T. et al . , J. Biol . Chem . 218 (5) : 3466-73 (2003) ; Shields, R.L. et al . , J. Biol . Chem . 211 (30) : 26733- Fc?RIII . En un estudio reciente, Okazaki et al . sugieren que los anticuerpos no fucosilados se unen a FcyRIIIa con afinidad aumentada como resultado de la unión recién formada entre Tyr-296 del Fc y Lys-128 de FcyRIIIa (Huber, R. et al . , Na ture 264 (5585) : 415-420 (1976)). No obstante, ahora se ha encontrado que la afinidad aumentada de los anticuerpos no fucosilados dependen de la glucosilación del receptor. Dicho efecto de glucosilación del receptor indica que la unión Fc- Tyr296 /Lysl28-Fc?RIIIa es insignificante para la afinidad entre 1os anticuerpos GE y FcyRIIIa. Las formas a y b de Fc?RIII son las únicas formas de FcyF. humanas que poseen sitios de N-glucosilación dentro de la región de unión a IgG. Por lo tanto, se concluye que la afini .dad para IgG estará alterada por la glucosilación del receptor únicamente para estos dos FcyR. La comparación de las se uencias de aminoácidos de Fc?RIII de otras especies indica que el sitio de N-glucosilación Asnl62 es compartido por Fc?RI II de macacos, gatos, vacas y cerdos, mientras que carece en los FcyRIII conocidos de rata y ratón.

Recientemente se identificaron genes de ratón y rata (CD16-2 y numeros de banco de datos de proteína NP_997486, respectivamente) con una alta homología con Fc?RIII humano y los cu les codifican para proteínas que tienen el sitio de glucosilación Asnl62 han sido identificadas (Huber, R. et a l . , Na ture 264 (5585) : 415-420 (1976)), pero aún está por demostrarse la expresión funcional de las proteínas. La presencia de un sitio de glucosilación Asnl62- FcyRIIIa probablemente permite que el sistema inmunológico ajuste la afinidad hacia Fc?RIIIa ya sea por glucosilación diferencial de FcyRIII (Edberg, J.C. & Kimberly, R.P., J.

Immunol 158 (8) :3849-3857 (1997)) o por modulación del contenído de fucosa de IgG.

Equilibrio inmunológico entre FcyR activadores e inhibidores Se ha propuesto que una mejoría en la relación entre lias señales activadoras e inhibidoras incrementará la eficacib de los anticuerpos terapéuticos (Clynes, R.A. et al . , Na t . Med. 6 (4) : 443-446 (2000); Stefanescu, R.N. et al . , J. Clin . Immunol . 24 (4) : 315-326 (Julio 2004)). En un estudio actual, se ha encontrado que el receptor shFc?RIIIa inhibidor tiene afinidad similar por los anticuerpos nativos y GE, mientras que ambos variantes de receptor adyuvante se unen con mayor afinidad a los anticuerpos GE que al anticuerpo nativo (Tabla 6) . Esto indica que las modificaciones del oligosa árido de los anticuerpos GE incrementa de manera exclusiva la afinidad por los receptores activantes e indica que estos anticuerpos GE mostrarán una eficacia terapéutica incrementada . Los receptores inhibidores de los sFc?RIIb de ratón y humano están no glucosilados en Asnl62. La carencia de diferenciación para anticuerpos GE mostrados por estos dos receptores concuerda con la glucosilación de FcyR en Asnl62 que se considera esencial para la unión aumentada a las IgG no fucosiladas . El hallazgo de que FcyRII murino tenga una afinidad significativamente superior que FcyRIIb humano por los anticuerpos puede ser importante para una correcta interpretación de los experimentos in vivo utilizando modelos de ratcqn. La unión incrementada del receptor inhibidor en un modelo de ratón puede resultar en un umbral diferente de respuesta inmunológica que en los humanos.

Conclusión Estos estudios demuestran la importancia de las porciones de carbohidrato tanto de FcyRIIIa como de IgG para su interacción. Los datos proporcionan claridad adicional en la compleja formación e identifican la importe.nte interacción distinta entre los glucanos de Fc?RIIIa y el Fc de las glucoformas IgG no fucosiladas a nivel molecular. Este hallazgo proporciona la base para el diseño de nuevas variantes de anticuerpo que pueden generar' interacciones productivas adicionales con el carbohidrato de FcyRIIIa, el cual tiene implicaciones importantes para tratamientos con anticuerpos monoclonales .

- Ejemplo 2 Generacion de mutantes de anticuerpo Se generan mutantes de anticuerpo utilizando métodos de biología molecular estándar (por ejemplo PCR mutagénica, véase Dulau L, et al . Nucleic Acids Res . 11 ; 17 (7 ):2873 (1989)), utilizando IgGl humanizada como plantilla con una especificidad por CD20 o EGFR. El mutante de anticuerpo resultante que codifica para ADN posteriormente se clor a en un plásmido que contiene OriP y se utiliza para la transcepción transitoria de células HEK-293-EBNA (Invitrogen, Suiza) como se ha descrito previamente (Jordán, M. , et al . , Nuclei c Acids Res . 24, 596-601 (1996)). Los anticuerpos glucomodificados se producen por cotransfección de la células con dos plásmidos que codifican para anticuerpo GnT-III quimérico en una relación de 4:1, respectivamente, mientras que para el anticuerpo no modificado se omiten los plásmidos que codifican para las enzimas modificadoras de carbohidrato. Se cosechan sobreñadantes cinco días después de la transfección. Para algunos de los experimentos el anticuerpo se purifica a partir del sobrenadante utilizando dos etapas cromatográficas secuenciales como se ha descrito (Umaña, P. et al . , Na t . Biote hn ol . 1 1, 176-180 (1999)), seguido por cromatografía de exclusión de tamaño. Las fracciones pico que contienen el anticuerpo monomérico se acumulan y concentran.

Cuantificación del anticuerpo en sobrenadante de cultivo La cuantificación directa del anticuerpo presente en el sobrenadante de células EBNA transfectadas se realiza utilizando cromatografía de proteína A. Para este propósito se aplilcan 100 µl del sobrenadante a una columna llenada con proteína A inmovilizada en una resina. El anticuerpo unido se eluye utilizando un amortiguador de pH 3 después de separación de las proteínas no unidas con una etapa de lavado. La absorbancia a una longitud de onda de 280 nm provocada por el anticuerpo de elusión se integra y utiliza para sú cuantificación en combinación con los estándares de anticuerpo de concentración conocida.

Análisis de carbohidrato Las fracciones de CLAP que contienen el anticuerpo o los anticuerpos purificados se intercambian con amortiguador a Tris 2 mM, pH 7.0 y se concentran a 20 µl . Los oligosacáridos se liberan enzimáticamente de los anticuerpos por di estión con N-glucosidasa (PNGaseF, EC 3.5.1.52, QA-Bio, S n Mateo, CA, EUA) a 0.05 mU/µg de proteína en Tris 2 mM, pH 7 durante 3 horas a 37°C. Una fracción de la muestra tratada con PNGasaF posteriormente se digiere con Endoglyeosidase H (EndoH, EC 3.2.1.96, Roche, Basilea/Suiza) a 0.8 mU/µg de proteína para diferenciar entre los carbohidratos complejos e híbridos y se incuba durante 3 horas a| 37°C. Los oligosacáridos liberados se ajustan ácido acético 150 mM antes de la purificación a través de una resina de intercambio catiónico (resina AG50 -X8, forma de hidrógeno, malla 100-200, BioRad, Reinach/Suiza) y se empacan en una columna de cromatografía de micro-bio-spin (BioRad, Reinach/Suiza) como se ha descrito (Papac, D.I., Briggs, J.B., Chin, E.T., y Jones, A.J. (1998) Glycobiology T, 445-454) Se mezcla 1 µl de muestra en un tubo Eppendorf con 1 µl jle matriz recién preparada, la cual se prepara al disolver 4 mg de ácido 2, 5-dihidroxibenzoico y 0.2 mg de ácido 3-metoxisalicílico en 1 ml de etanol/cloruro de sodio acuoso 10 mM 1:1 (v/v). Después, 1 µl de esta mezcla se transfiere a la placa objetivo. Se permite que las • muestras sequen antes de medición utilizando un equipo Autoflex MALDI/TOF (Bruker Daltonics, Faellanden/Suiza) que opera en modo de ion positivo.

Análisis de unión de Fc?RIIIa Se transfectan células Jurkat (DSMZ-número ACC-282) o CHO (ECACC-número 94060607) con el plásmido que codifica para híc?RIIIa en combinación con la cadena y y se incuban con concentraciones conocidas de mutantes de IgG en PBS y BSA 0.1% dt rante 30 minutos a 4°C. Después de varios lavados se ddeetteeccttaa la unión de anticuerpo por incubación durante 30 min - a 4°C con anticuerpo de chivo anti IgG específico humano F(ab')2 F(ab')2 conjugado con FITC 1:200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, EUA) . La intensidad de flúorescencía de 10,000 células corresponde a las variantes de anticuerpo unidas se determinan en un equipo FACS Calibur (BD Biosciences, Allschwil, Suiza). De una manera similar, se genera una línea de células que expresan hFc?RIIIa la cual está no glucosilada en la pos Lción Asnl62 al intercambiar este residuo por una glutamina (Fc?RIIIa-Q162) . El análisis de unión se realiza como s describe en lo anterior utilizando esta línea de células Utilizando estos métodos, se pueden identificar mutantels de IgG que muestren una unión aumentada a hFc?RIIIa cuando la forma no fucosilada se compara con el anticuerpo mutante no modificado (fucosilado) . Además, dichos mutantes identificados por IgG preferiblemente tienen una afinidad aumentada a FcyRIIIa pero no a Fc?RIIIa-Q162 no glucosilado.

Análisis de unión de Fc?RIIb Se transfectan células CHO (ECACC número 94060607) con un plásmido que codifica para hFc?RIIb, lo que produce expresión en su superficie. En caso de que los mutantes de anticuejrpo probados se dirijan contra EGFR, se pueden utilizar células Raji también para este análisis. Las células se incµban con concentraciones conocidas de mutantes de IgG en PBS y BSA 0.1% durante 30 minutos a 4°C. Después de varios lavados se detecta la unión de anticuerpo por incubación durante 30 minutos a 4°C con anticuerpo de chivo anti-IgG específico humano F(ab')2, F(ab')2 conjugado con FITC 1:200 [Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA). La intensidad de fluorescencia de 10,000 células que corresponde con las variantes de anticuerpo unidos se determina en un equipo FACS Calibur (BD Biosciences, Allschwil, Suiza) . Utilizando los métodos descritos en lo anterior se pueden identificar mutantes de IgG que preferiblemente muestran una unión no alterada a hFc?RIIb en comparación con el antilcuerpo no modificado. En otra modalidad preferida de esta irjvención, las moléculas que preferiblemente se unen a FcyRIII en comparación con el FcyRIIb receptor inhibidor se reclaman. Esto en consecuencia también incluye mutantes que muestra una unión intermedia a Fc?RIII (es decir, entre el anticuerpo de tipo silvestre y el anticuerpo glucomodificado) , pero casi sin unión a Fc?RIIb. Tales mutantes de anticuerpo reclamados tienen una "relación de especificidad" superior a 1. Mediante el término "relación de especificidad" se quiere indicar especificidad por el receptor Fc?RIII humano como la relación de afinidad de unión respecto a otro receptor Fcy humano. Análisis de ADCC Se incuban células A431 EGFR positivas (ATCC número CRL-1555) o células Raji CD20-positivas (ATCC-número CCL-86) con mutantes de anticuerpo purificado o sobrenadantes de cultivo que los contienen (Invitrogen AG, Basilea, Suiza) durante 10 minutos, se diluyen de manera seriada con medio AIM-V (Invitrogen, Suiza). Se agregan a los pozos células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién preparada de un donador heterocigoto para Fc?RIIIa-Val/Phel58 y que carece de la expresión de FcyRIIc en una relación de efector a objetivo de 25:1. De manera alternativa se utilizan células NK-92 (DSMZ-número ACC-488) transfectadas con hFcyRIIIa y se utiliza la cadena y en vez de PBMC. Después de 4 horas de incubación a 37°C, se transfieren 100 µl de sobrenadante libre ce células a una placa nueva para la detección de LDH liberado por las células lisadas utilizando el equipo de detección de citotoxicidad (Roche, Basilea, Suiza) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Modeladlo Se realiza el modelado en base en la estructura cristalina de FcyRIIIa en complejo con un fragmento de Fc derivado de IgG natural (PDB código le4k) . Para dicho proposito las coordenadas de la porción de carbohidrato unida a Asn-297 de la Fc se duplican y uno de los glucanos se ajusta manualmente como un cuerpo rígido a Asn-162 de FcyRIIIa con el núcleo pentasacárido dirigido a la posición en donde está presente el residuo FUC. El modelo no se minimiza y únicamente se genera para visualizar el modo de unión propuesto.

Ejemplo 3 Materiales y métodos Expresión de mutantes de anticuerpo en células Hek293 EBNA Los mutantes de anticuerpo se generan por mutagénesis dirigida al sitio y el ADN resultante se clona en plásmido que contiene OriP y se utiliza para la transcripción transitoria de células HEK-293-EBNA (Invitrogen, Suiza) como se ha descrito previamente (Jordán, M., et al . , Nuclei c Acids Res . 24:596-601 (1996)). Varias glucoformas de estos anticuerpos se preparan por cotransfección del plásmido que codifica para el anticuerpo ya sea por GnT-III quimérico (Gl, caracterizado por carbohidratos bisectados no fucosilados principalmente híbridos) o con GnT-III quimérico y Manll (G2, caracterizado por proporciones altas de carbohidratos bisectados no gucosilados complejos) . Para anticuerpo no modificado se omiten los plásmidos que codifican para las enzimas modificadoras de carbohidrato. Los sobrenadantes se cosechan 5 días después de la transfección.

Cuantificación y purificación de anticuerpo en sobrenadante de cult ivo para análisis de carbohidratos y resonancia de plasmón de superficie La cuantificación directa del anticuerpo presente en el £ obrenadante de células EBNA transfectadas se realiza utilizando cromatografía de proteína A. Para ése propósito se aplican 100 µl de sobrenadante a una columna llenada con proteína A inmovilizada en una resina. El anticuerpo unido se eluye itilizando un amortiguador de pH 3 después de la separacion de las proteínas no unidas con una etapa de llaavvaaddoo.. La absorbancia a una longitud de onda de 280 nm provocada por el anticuerpo que eluye se integra y utiliza para sa cuantificación en combinación con estándares de anticuerpo de concentración conocida. La muestra eluida se utiliza para análisis de carbohidratos. Para aplicación de resonancia de plasmón de superficie se incuban 5 ml de sobrenadante extremo sobre extremo con 20 µl de esferas de proteína A y Sepharose (rpm Protein A Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences, Otelfingen, Suiza) durante la noche a temperatura ambiente. La muestra se transfiere a una columna de microcentrifugación vacia BioRad, Reinach, Suiza) y se centrifuga a 1000 x g durante 1 minuto. Las esferas retenidas se lavan una vez con Tris 10 mM, glicina 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 8.0.

La elución se realiza por incubación con 120 µl de Tris 10 mM, glicina 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 3.0 durante MALDI/TOF (Bruker Daltonics, Faellanden, Suiza) que opera en modo de ion positivo.

Cromatografía por exclusión de tamaño Para estudios de SPR, una muestra de 100 µl enriquecida con proteína A se purifica por cromatografía por exclusión de tamaño con un sistema Agilent 1100 con un automuestreador y una unidad MAD utilizando una columna Tricorn Superdex 200 10/300 GL (Amersham Biosciences, Otelfingen, Suiza) y amortiguador HSP-EB (HEPES 0.01 M, pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, Tween 20 0.005%) como amortiguador de corrimiento. La absorbancia a una longitud de onda de 280 nm provocada por el anticuerpo que eluye se integra y se utiliza para su cuantificación en combinación con los estándares de anticuerpo de concentración conocida.

Expresión de shFc?RIIIa-His6 y shFc?RIIb-His6 sosluble Se producen shFc?RIIIa-HiS6 y shFc?RIIb-His6 por expresión transitoria en células HEK293-EBNA (Jordán, M. et al . , N?cl . Acíds . Res . 24:596-601 (1996)) y se purifican a homogenleidad aprovechando la etiqueta de hexahistidina utilizando HiTrap Chelating HP (Amersham Biosciences, Otelfingen, Suiza) y una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño con amortiguador HSP-EB (HEPES 0.01 M, Ph 7.4 , NaCl 0.15 M,| EDTA 3 mM, Tween 20 0.005%). La concentración de las proteín s se determina como se ha descrito (Gill, S.C. & von Hippel, P.H., Anal . Biochem . 182 (2) : 319-326 (1989)).

Referencia de plasmón de superficie Se realizan experimentos SPR en un equipo Biacore 1000 cen HBS-EP como amortiguador de corrimiento (Biacore, Friburgo, Alemania) . El acoplamiento directo de aproxim.?damente 200-500 unidades de resonancia (RU) de los receptores Fcy humanos se realiza en un chip CM5 utilizando el equi.po de acoplamiento amina estándar (Biocore, Friburgo, Alemania) . Se pasan un conjunto de concentración de mutantes de IgG con un caudal de 30 µl/min a través de las celdas de flujo. Las diferencias de índice de refracción a granel se corrigen al rectar la respuesta obtenida al fluir sobre la superficie de referencia sin proteína inmovilizada. Se utiliza la respuesta en estado estable para derivar la constante de disociación KD mediante ajuste de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Se derivan las constantes cinéticas utilizando el programa BIAevaluation con instalación de acoplamiento de curva, para acoplar las velocidades de las ecuaciones a 1:1 de unión de Langmuir por integración numérica.

Resultados Los anticuerpos se diluyen en HBS-EP y se pasan sobre superficies con receptores inmovilizados. Utilizando el método descrito ahora es posible identificar mutantes de aminoácidos que no pueden ser identificados cuando se utiliza una versión no glucomodificada . Por ejemplo, los mutantes de anticuerpo S239W y F243E muestran una afinidad disminu ida a Fc?RIIIa cuando no están glucomodificados (no GE) pero tienen una KD casi idéntica en comparación con la del anticuerpo control cuando también son glucomodificados (GE) . De acuerdo con el principio descrito los mutantes exitosos deben presentar cualquiera de las siguientes características : A. El mutante de IgG GE tiene una afinidad aumentada por FcyRIIIa en comparación con IgG GE que carece de la modificación de aminoácidos. B. El mutante de IgG GE tiene afinidad aumentada por Fc?RIIIa, mediada por la porción de carbohidrato de Fc?RIIIa. Estos mutantes se pueden identificar por unión a FcyRIIIa que carece de glucos:. lación en la posición 162 ( Fc?RI I Ia-Ql 62 C. Los mutantes tienen una ka aumentada o una kd redtjcida en comparación con el anticuerpo control GE. De acuerdo con las características descritas en lo anterior, se han definido los siguientes tres grupos Ta a Los tres grupos se an v o e acuer o con as afinidaldes (aumentada (>) , disminuida (<) , o sin cambio (=) KD) , para los muiantes IgG (ya sea sin GE o glucoformas de GE) para shFc?RIIIa y shFc?RIIIa-Ql62 en comparación con el anticuerpo control en la glucoforma respectiva. Se seleccionaron los siguientes IgG mutantes: Tabla 8 88 T260H sin-GE / / 276.50 289. G2 15.12 19.54 12.93 160. 98 S239E sin-GE / / 15530 169.80 G2 3.57 2.79 7.83 Tabla 9. Constantes de disociación de las interacciones entre mutantes de IgG y shFc?RIIIa o shFcyRJl I Ia-Ql 62. Las interacciones entre shFcyRIIIa-H6 inpiovili zado y los mutantes de IgG se determinan por anjálisis cinético mientras que las interacciones entre shFc?RI I Ia-Ql 62 -H6 inmovilizado y los mutantes de IgG se determinan por análisis en estado estable. sin-GE = no sometido a glucomodi ficación ; Gl glucoforma preparada con GnT-III; G2 = glucoforma preparada con GnT-III y Manll.

Tabla 10 Ko RIIIa-H6 RIIIa-Q162-H6 RIII-H6 sin GE nd* H268D G2 Gl sin GE + + nd* 20 S239W G2 + + Gl + + sin GE + + nd* 22 F243E G2 + + Gl + + sin GE nd* 30 H268E G2 Gl sin GE nd* 43 S239D G2 Gl 85 F243H sin GE + nd* G2 88 T260H sin GE nd* G2 + 98 S239E sin GE nd* G2 Tabla 10 - Comparación con anticuerpo control de las interacciones que se obtienen con los mutantes de IgG seleccionados. Las glucoformas mutantes de IgG se comparan con su glucoforma respectiva del anticuerpo original y se marcan bomo unidas con KD o kd aumentada (+) , sin cambio (=) o reducida (-) . *=las velocidades de disociación son demasiado rápidas para determinación; se determina KD mediante experimentos en estado estable.

Tabla 11 Tabla 11 - Patrón de oligosacárido (por ciento relativo) de mut antes de anticuerpo en comparación con IgG control.

Discusión Los mutantes IgG seleccionados se dividen en tres grupos como se describe en la Tabla 7.

Grupo ij - S239W, F243E, F243H Estos mutantes de anticuerpo tienen su forma glucomcjdificada muy similar a los valores de KD para su interadción con shFc?RIIIa-H6 en comparación con el anticuerpo control glucomodificado, pero presentan una constante de tasa de disociación disminuida (kd disminuida 4 veces) . La afinidad de shFcyRIIIa que carece de glucosilación en la posición Q162 disminuye para estos mutantes en las glucofcjrmas glumodificada y no glucomodificada en comparación con las afinidades mostradas por las glucoformas respectivas para el anticuerpo control. Esto indica que la kd mejorada resulta de la porción carbohidrato y no de la mutación de aminoácido.

Grupo 2 - H268D, H268E, S239D, S239E Estos mutantes de anticuerpo presentan KD di sminu ida en las glucoformas glucomodi f icada y no glucom dificada para shFc?RI I Ia-H6 en comparación con el ant Lcuerpo control en las glucoformas respectivas. Para 1 a forma glucomodif icada , este es el resultado de u a constante de velocidad de disociación disminuida (4 a 2 veces disminuida kd) . De manera contra ria a los mutantes del grupo 1, estos ant icu rpos también tienen, en las glucoformas glucom dificada y no glucomodi f icada afinidades aument adas por shFc?RIIIa que carece de glucosilación en la posición Q162, en comparación con las af inidades mostradas por las glucoformas respectivas del an ticuerpo control, indicando la influencia de la mutaci ón de aminoácido en la afinidad mejorada.

Grupo 3 - T260H La forma glucomodi f icada de este mutante present.a una KD disminuida para shFc?RIIIa en compar ción con el anticuerpo control glucompdif icado , el cual es el resultado de una ka aumentada casi 3 veces para el mutante glucombdi ficado . La glucoforma no glucomodi f icada de este mutante tiene una afinidad similar por shFc?RlIIIa en comparación con el anticuerpo control no glucomodif icado . La unión de shFc?RIIIa que carece de glucosilación en la posición Q162 está grandemente disminuida para la glucoforma no glucomodi f icada de este mmtante en comparación con el anticuerpo control no glucomodi ficado , mientras que la unión para el mutante glucomodi ficado es similar a la del anticuerpo control glucomodif icado . Los perfiles de carbohidratos de la mayor parte de los mutantes seleccionados es analizan e indicah patrones de oligosacárido muy similares en comparación con el anticuerpo control.

Conclusión Se identificará un mutante de IgG que muestran una unión aumentada a hFc?RIIIa cuando no están fucosilados en comparación con el anticuerpo no modifilcado (fucosilado) . Además, algunos mutantes de IgG identif icados se pueden identificar por tener preferiblemente una afinidad aumentada a Fc?RIIIa pe cual carece de gl Además, el método de mutantes IgG con ca una kd disminuida o ón a esta fecha, el me e para llevar a la pr resulta claro de la pr

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una molécula que une antígeno glucomodificada (modificada en el patrón de glucosilación) caracterizada porque comprende una región Fc, en donde la región Fc tiene una estructura oligosacárida alterada como resultado de la glucomodificación y tiene por lo menos una modificación de aminoácidos y en donde la molécula que une antígeno presenta unión aumentada a un receptor Fc?RIII humano en comparación con la molécula que une antígeno la cual carece de dicha modificación. 2. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula que une antígeno no presenta unión aumentada a recepto|r Fc?RII humano, 3. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el receptor Fc?RII humano es el receptor Fc?RIIa humano. 4. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el receptor Fc?RII humano es el receptor FcyRIIb humano. 5. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el receptor Fc?RIII está glucosilado. 6. La molécula que une antígeno glucomodificada de conf ormidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el recéptor glucosilado comprende oligosacáridos N-unidos en Asnl62 7. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el recejptor FcyRIII es Fc?RIIIa. 8. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el recejptor Fc?RIII es Fc?RIIIb. 9. La molécula que une antígeno glucomodificada de con: ormidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el reo ¿ptor Fc?RIIIa tiene un residuo valina en la posición 158. 10. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el receptor Fc?RIIIa tiene un residuo fenilalanina en la posiciqn 158. 11. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la modificación no incrementa sustancialmente la unión a un receptor Fc?RIII no glucosilado en comparación con la moléculja que une antígeno que carece de dicha modificación. de: Trpj, His, Tyr, Glu, Arg, Asp, Phe, Asn y Gln. 17. La molécula que une antígeno glucomodificada de confiormidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la sustitución en uno o más de los aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: Ser239Asp, Ser239Glu, Ser239Trp, Phe243H|is, Phe243Glu, Thr260His, His268Asp o His268Glu. 18. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la sustitución en más de un aminoácido se selecciona de las sustituciones incluidas en la Tabla 5. 19. La molécula que une antígeno glucomodificada de confjormidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la sustitución se selecciona de una sustitución que se incluye en la Tabla 2. 20. La molécula que une antígeno glucomodificada de conf ormidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la mole cula que une antígeno se une al receptor Fc?RIII con una afinidad aumentada por lo menos 10% en comparación con la misma molécula que une antígeno que carece de dicha modificación. 21. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la región Fc es una región Fc de IgG humana. 22. La molécula que une antígeno glucomodificada de conf ¡ormidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizada porque la molécula que une antígeno es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende una región Fc. 23. La molécula que une antígeno glucomodificada de confiormidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el antijcuerpo o fragmento de anticuerpo es quimérico. 24. La molécula que une antígeno glucomodificada de confiormidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está humanizado. 25. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mol cula que une antígeno presenta una función efectora aumentada . 26. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la función efectora aumentada es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada o citotoxicidad dependiente de complemento aumentada 27. La molécula que une antígeno glucomodificada de confiormidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizada porque la estructura de oligosacárido alterado comprende un número disminuido de residuos fucosa en comparación con una molécula que une antígeno no glucomodificada , 28. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque por lo menos 20% de los oligosacáridos en la región Fc están no fucqsilados. 29. La molécula que une antígeno glucomodificada de confiormidad con la reivindicación 27, caracterizada porque por lo menos 50% de los oligosacáridos en la región Fc están no fucqsilados 30. La molécula que une antígeno glucomodificada de confjormidad con la reivindicación 27, caracterizada porque por lo menos 70% de los oligosacáridos en la región Fc están no fucosilados. 31. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque por lo menos 80% de los oligosacáridos en la región Fc están no fucosilados. 32. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizada porque la estructura oligosacárida alterada comprende un número aumentado de oligosacáridos bisectados en comparación con una molécula que une antígeno no glucomodificada . 33. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la mayor parte de los oligosacáridos bisectados son de tipo híbrido 34. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la mayor parte de los oligosacáridos bisectados son de tipo complej o. 35. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizada porque la estructura oligosacárida alterada comprende un número aumentado de oligosacáridos híbridos en comparé.ción con la molécula que une antígeno no glucomodificada . 36. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizada porque la estructura oligosacárida alterada comprerde un número aumentado de oligosacáridos complejos en comparación con la molécula que une antígeno no glucomc dificada . 37. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizada porque la estructura oligosacárida alterada comprende un incremento en la relación de residuos GlcNAc respectjo a residuos fucosa en comparación con la molécula que une ant|ígeno no glucomodificada . 38. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula que une antígeno une selectivamente un antígeno que se selecciona del grupo que consiste de: antígeno CD20 humano, antígeno EGFR humano, el antígeno MCSP humano, el antíger.o MUC-1 humano, el antígeno CEA humano, el antígeno HER2 humano y el antígeno TAG-72 humano. 39. La molécula que une antígeno glucomodificada caract rizada porque comprende una región Fc, en donde la región Fc tiene una estructura oligosacárida alterada como result do de la glucomodificación y tiene por lo menos una modifi ación de aminoácidos, en donde la molécula que une antígeno presenta especificidad aumentada por un receptor Fc?RII humano en comparación con la molécula que une antíge o que carece de dicha modificación. 40. La molécula que une antígeno glucomodificada de con ormidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la mol cula que une antígeno no presenta unión aumentada a un recepta r Fc?RII humano. 41. La molécula que une antígeno glucomodificada de con ormidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el receptor Fc?RII humano es el receptor Fc?RIIa humano. 42. La molécula que une antígeno glucomodificada de con ormidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el rec ptor FcyRII humano es el receptor Fc?RIIb humano. 43. La molécula que une antígeno glucomodificada de con ormidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el recéptor Fc?RIII está glucosilado. 52, caracterizada porque las sustituciones reemplazan el residuo aminoácido que se presenta de manera natural con un residuo aminoácido que interactúa con el carbohidrato unido en Asnl 62 del receptor Fc?RIII. 54. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el residuo aminoácido que interactúa con el carbohidrato unido en Asnl62 del receptor Fc?RIII se selecciona del grupo de: Trp, His, Tyr, Glu, Arg, Asp, Phe, Asn y Gln. 55. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la sustitución en uno o más de los aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: Ser239Asp, Ser239Glu, Ser239Trp, Phe243f-|is, Phe243Glu, Thr260His, His268Asp o His268Glu. 56. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque la sustitución en más de un aminoácido se selecciona de las sustituciones incluidas en la Tabla 5. 57. La molécula que une antígeno glucomodificada de confiormidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la sustitución se selecciona de una sustitución que se incluye¡ en la Tabla 2. 58. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la molécula que une antígeno se une al receptor Fc?RIII con especificidad aumentada por lo menos 10% en comparación con la misia molécula que une antígeno que carece de dicha modifiqación. 59. La molécula que une antígeno glucomodificada de confjormidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la región Fc es una región Fc de IgG humana. 60. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 59, caracterizada porque la molécula que une antígeno es un anticue ;rpo o un fragmento de anticuerpo que comprende una región Fc. 61. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es quimérico, 62. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está humanizado, 63. La molécula que une antígeno glucomodificada de confjormidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la molécula que une antígeno presenta una función efectora aumentada , 64. La molécula que une antígeno glucomodificada de confjormidad con la reivindicación 63, caracterizada porque la furción efectora aumentada es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada o citotoxicidad dependiente de complemento aumentada. 65. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 64, caracterizada porque la estructura de oligosacárido alterado comprende un número disminuido de residuos fucosa en comparación con una molécula que une antígeno no glucomodificada . 66. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque por lo menos 20% de los oligosacáridos en la región Fc están no fucosilados 67. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque por lo menos 50% de los oligosacáridos en la región Fc están no fucosilados. 68. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque por lo menos 70% de los oligosacáridos en la región Fc están no fucosilados 69. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque por lo menos 80% de los oligosacáridos en la región Fc están no fucosilados 70. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 64, caracterizada porque la estructura oligosacárida alterada comprende un número aumentado de oligosacáridos bisectados en comparación con una molécula que une antígeno no glucomodificada 71. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la mayor parte de los oligosacáridos bisectados son de tipo híbrido 72. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la mayor parte de los oligosacáridos bisectados son de tipo comple; o. 73. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 64, caracterizada porque la estructura oligosacárida alterada comprerjde un número aumentado de oligosacáridos híbridos en comparación con la molécula que une antígeno no glucomodificada . 74. La molécula que une antígeno glucomodificada de con::ormidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 64, caracterizada porque la estructura oligosacárida alterada comprerjde un número aumentado de oligosacáridos complejos en comparación con la molécula que une antígeno no glucomqdificada . 75. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 64, caracterizada porque la estructura oligosacárida alterada compre?de un incremento en la relación de residuos GlcNAc respecto a residuos fucosa en comparación con la molécula que une antjígeno no glucomodificada. 76. La molécula que une antígeno glucomodificada de confjormidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la molécula que une antígeno une selectivamente un antígeno que se selecciona del grupo que consiste de: antígeno CD20 humano, antígeno EGFR humano, el antígeno MCSP humano, el antíger.o MUC-1 humano, el antígeno CEA humano, el antígeno HER2 humano y el antígeno TAG-72 humano. 77. Un polinucleótido caracterizado porque codificja para un polipéptido que comprende una región Fc de anticuerpo o un fragmento de una región Fc de anticuerpo, en donde jLa región Fc o un fragmento del mismo tiene por lo menos una modificación de aminoácido y en donde el polipérjtido presenta unión aumentada a un receptor Fc?RIII humano en comparación con el mismo polipéptido que carece de dicha piodificación, 78. El polinucleótido de conformidad con la reivinc icación 77, caracterizado porque el polipéptido es una cadena pesada de anticuerpo. 79. El polinucleótido de conformidad con la reivinc icación 77, caracterizado porque el polipéptido es una proteína de fusión, 0. Un polipéptido caracterizado porque está codificado por el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 77. 81. El polipéptido de conformidad con la reivind|icación 80, caracterizado porque el polipéptido es una cadena pesada de anticuerpo. 2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el polipéptido es una proteína de fusión. 83. Una molécula que une anticuerpo caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 a 82. 84. Un vector, caracterizado porque comprende al polinudleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 77 a 79. 85. Una célula hospedadora caracterizada porque comprerjde al vector de conformidad con la reivindicación 84. 86. Un método para producir una molécula que une antígeio glucomodificada que comprende una región Fc, en donde la región Fc tiene una estructura oligosacárida alteraca como resultado de la glucomodificación y tiene por lo menos una modificación de aminoácidos y en donde la molécula que une antígeno presenta unión aumentada a un receptqr Fc?RIII humano en comparación con la molécula que une anttígeno que carece de dicha modificación, caracterizado porque comprende: (a) cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 85 bajo condiciones que permiten la expresión del polinucleótido; y b) recuperar la molécula que une antígeno glucomo|dificada del medio de cultivo. 7. Un método para producir una molécula que une antígeno glucomodificada que comprende una región Fc, en donde la región Fc tiene una estructura oligosacárida alterada como resultado de la glucomodificación y tiene por lo menos una modificación de aminoácido y en donde la molécula que une antígeno presenta especificidad aumentada por un receptor Fc?RIII humano en comparación con una molécula que une antígeno que carece de dicha modificación, caracterizado porque comprende: (a) cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 85 bajo condiciones que permiten la expresión del polinucleótido; y (b) recuperar la molécula que une antígeno glucomodificada del medio de cultivo. 88. La molécula que une antígeno glucomodificada de conformidad con la reivindicación 22 o la reivindicación 60, caracterizada porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es completamente humano. 89. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende una región Fc de anticuerpo o un fragmento de una región Fc de anticuerpo, caracterizado porque la región Fc o un fragmento del mismo tiene por lo menos una modificación de aminoácido y en donde el polipéptido es la molécula que une antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 76. 90. El uso de una molécula que une antígeno de conform|idad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 76, 83 u 88 para la preparación de un medicamento para el tratami ento o profilaxis de cáncer. 91. El uso de conformidad con la reivinc icación 90, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de las vi is respiratorias y digestivas altas, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cepebro. 92. El uso de una molécula de un antígeno de conformaidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 76, 83 u 88 para la elaboración de un medicamento para el tratami ento o profilaxis de una condición o lesión precanc erosa. 93. El uso de conformidad con la reivinc.icación 92, en donde la condición o lesión precan erosa se selecciona del grupo que consiste de leucop] asia oral, queratosis actínica (queratosis solar), pólipo precancerosos del colon o recto, displasia epitelial gástri a, displasia adenomatosa, síndrome de cáncer de colon sin pólipos hereditaria (HNPCC) , esófago de Barrett, displa ia de vejiga y condiciones cervicales precancerosas. 94. El uso de conformidad con cualquiera de las reivinc icaciones 90 a 93, en donde la molécula que une antíger.o se utiliza en una cantidad terapéuticamente eficaz desde aproximadamente 1.0 mg/kg hasta aproximadamente 102. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la molécula que une antígeno de conformidad con cua quiera de las reivindicaciones 1 a 76, 83 u 88 y un portadcr farmacéuticamente aceptable. 103. Un método para el tratamiento o profilaxis de cáncer caracterizado porque comprende administrar una cantidald terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 102 a un paciente en necesidad del mismo. 104. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro. 105. Un método para el tratamiento o profilaxis de una condición o lesión precancerosa caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la cojmposición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 102 a un paciente en necesidad del mismo. 106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la condición o lesión precancerosa se selecciona del grupo que consiste de leucopljasia oral, queratosis actínica (queratosis solar), pólipos precancerosos del colon o recto, displasia epitelial gástric:a, displasia adenomatosa, síndrome de cáncer de colon sin poliposis hereditaria (HNPCC) , esófago de Barrett, displasia de vejiga y condiciones cervicales precancerosas. 107. La molécula que une antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 76, 83 u 88, caracterizada porque es para uso en el tratamiento o profilaxis de cáncer. 108. La molécula que une antígeno de conformidad con la reivindicación 107, caracterizada porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro. 109. La molécula que une antígeno de conformidad con cu lquiera de las reivindicaciones 1 a 76, 83 u 88, caracterizada porque se utiliza en el tratamiento o profilaxis de una condición o lesión precancerosa. 110. La molécula que une antígeno de conformidad con la reivindicación 109, caracterizada porque la condición o lesión precancerosa se selecciona del grupo que consiste de leucoplasia oral, queratosis actínica (queratosis solar), pólipos precancerosos del colon o recto, displasia epitelial gástrica, displasia adenomatosa, síndrome de cáncer de colon sin poliposis hereditaria (HNPCC) , esófago de Barrett, displas ia de vejiga y condiciones cervicales precancerosas. 111. La molécula que une antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 a 76, 83 u 88, caracterizada porque se utiliza en terapia.