TWI359027B - Bivalent, bispecific antibodies - Google Patents

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1359027 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於新穎的雙價雙特異性抗體、其製造及用 途0 【先前技術】 工程蛋白，諸如能結合兩種或兩種以上抗原之雙特異性 或多特異性抗體在此項技術中已知。該等多特異性結合蛋 白可使用細胞融合、化學結合或重組DNA技術產生。 最近已開發出多種重組雙特異性抗體形式，例如藉由 (例如）IgG抗體形式與單鏈域融合而得之四價雙特異性抗 體（參見’例如 Morrison, S.L.等人，Nature Biotech 15 (1997) 159-163 ; W02001077342 ;及 Coloma，M.j，Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234)。 另外已開發出抗體核心結構（IgA、igD、igE、igG或 IgM)不再保留之其他若干新形式，諸如雙功能抗體、三功 能抗體或四功能抗體、微型抗體、若干單鏈形式（scFv、 Bis-scFv)，其能結合兩種或兩種以上抗原（Η〇ι丨iger p等 人 ’ Nature Biotech 23 (2005) 1 126-1136 2005 ; Fischer N·， L6ger O.，Pathobiology 74 (2007) 3-14 ; Shen J等人， Journal of Immunological Methods 3 18 (2007) 65-74 ; Wu， C.等人，Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297)。 所有該等形式均使用連接子以使抗體核心、lgD、 IgE、IgG或IgM)與另一結合蛋白（例如scFv)融合或使（例 如）兩個 Fab 片段或 SCFV 融合（Fischer N., L6ger 0.， 136473.doc ^359027

Pathobiology 74 (2007) 3·14)。儘管顯而易見連接子對雙 特異性抗體之工程化有利，但其亦可造成治療配置中之問 題。事實上，此等外來肽可能引出針對連接子本身或蛋白 質與連接子之間的接合子之免疫反應。此外，此等肽之可 撓性質使其更傾向於蛋白質裂解，潛在地導致抗體穩定性 差、聚集及免疫原性增加。另外，吾人可能希望藉由維持 與天然產生抗體之高度相似性來保留效應功能，諸如補體 依賴性細胞毒性（CDC)或抗體依賴性細胞毒性（ADCC)，其 係經Fc部分介導。 因此，理想地，吾人應旨在開發一般結構與天然產生抗 體（如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)極為相似、與人類序列 具最小偏差之雙特異性抗體。 在一種方法中，與天然抗體極為相似之雙特異性抗體係 使用四源雜父瘤技術（參見Milstein，c及A c CueU〇,

Nature，305 (1983) 537-40)基於兩種表現具有雙特異性抗 體之所要特異性之鼠類單株抗體的不同融合瘤細胞株的體 、’田胞融σ而產生。由於所得雜交融合瘤（或四源雜交瘤）内 兩條不同抗體重鏈及輕鏈之隨機配對，因此產生多達十種 不同抗體種類’其中僅一種為所要的功能性雙特異性抗 體由於存在錯配副產物且產量顯著降低，意謂需要複雜 的、屯化私序（參見，例 WM〇rris〇n, S丄，Nature Bi〇tech 25 (2007) 1233-1234)。-般而言，若使用重組表現技術，則 錯配副產物之相同問題仍存在。 種避免錯配副產物問題之方法（其稱為，杵入臼（kn〇bs_ 136473.doc 1359027 into-holes)1)旨在藉由將突變引入CH3域中以改變接觸界面 來促使兩條不同抗體重鏈配對。在一條鏈上’龐大胺基酸 經具有短側鏈之胺基酸置換以產生•臼，。相反地’具有大 側鏈之胺基酸被引入另一CH3域中以產生'杵'。藉由共同 表現此兩條重鏈（及兩條相同輕鏈，其須適於兩條重鏈）， 觀測到異源二聚體形成C杵-臼'）對比同源二聚體形成（'臼-臼'或'杵-杵’）之高產量（Ridgway JB，Presta LG，Carter P; 及WO 1996 02701 1)。異源二聚體之百分率可藉由使用噬菌 體呈現法重塑兩個CH3域之相互作用表面及引入雙硫橋以 穩定該等異源二聚體來進一步增加（Merchant A.M等人， Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ； Atwell S, Ridgway JB, Wells JA，Carter P·，J Mol Biol 270 (1997) 26-35)。样入白 技術之新方法描述於例如EP 1870459A1中。儘管此形式似 乎極具吸引力，但當前尚無描述朝臨床進展之資料。此策 略之一重大限制在於兩種親本抗體之輕鏈須相同以防止錯 配及形成非活性分子。因此，此技術並不適於自針對第一 抗原及第二抗原之兩種抗體起始容易地開發針對兩種抗原 之重組雙價雙特異性抗體’此係由於此等抗體之重鏈及/ 或相同輕鏈須最優化。

Xie，Z.等人 ’ J Immunol Methods 286 (2005) 95-101 提出 使用經由杵入臼技術與FC部分組合之scFv的新雙特異性抗 體形式。 【發明内容】 本發明係關於一種雙價雙特異性抗體，其包含： 136473.doc a) 與第-抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鍵；及 b) 與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈，其中可 變域VL及VH經彼此置換。 本發月之另實施例為一種製備本發明之雙價雙特異性 抗體之方法， 其包含以下步驟： a) 用以下載體使宿主細胞轉化： -包含編碼與第—抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鍵 的核酸分子的載體， 包含編碼與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 的核酸刀子的載體’其中可變域及I經彼 換； b) 在允許該抗體分子合忐 成之條件下培養該宿主細胞；及 c) 自該培養物回收該抗體分子。 本發明之另一實施例為-種宿主細胞，其包含： 匕3編碼與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 的核酸分子的載體， -包含編碼與第二抗原牲 得特·異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 的核酸分子的載體，並士 其中可變域VL及VH經彼此置 換。 本發明之另一實施例為一 ^ ^ 馬 種包含本發明之抗體之組合 物，杈佳醫藥組合物或診斷組合物。 種醫：與：另實施例為一種包含本發明之抗體及至少-種醫樂學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。 136473.doc -9- 1359027 本發明之另一實施例為一 法’其特徵在於將治療有效 者0 種/台療需要治療之患者之方 量之本發明之抗體投與該患 【實施方式】 本發明係關於-種雙價雙特異性抗體，其包含： a) 與第-抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈；及 b) 與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈，其令可 變域VL及VH經彼此置換。

因此，該雙價雙特異性抗體包含： a)與第一抗原特異性結合之抗體之第一輕鏈及第一 重鏈；及 b)與第二抗原特異性結合之抗體之第二輕鏈及第二 重鏈，其中第一輕鏈及第二重鏈之可變域及VH 經彼此置換。

因此，對於該與第二抗原特異性結合之抗體而言，以下 情況適用： 在輕鏈内 可變輕鏈域VL經該抗體之可變重鏈域Vh置換； 且在重鍵内 可變重鏈域VH經該抗體之可變輕鏈域VL置換。 如本文所用之術語"抗體”係指完整單株抗體。該等完整 抗體由兩對”輕鏈"（LC)與"重鏈，，（HC)組成（該等輕鏈（LC)/ 重鏈對在本文中縮寫為LC/HC) »該等抗體之輕鏈及重鏈為 由若干域組成之多肽。在完整抗體中，各重鏈包含重鍵可 136473.doc • 10- 1359027 變區（本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定 區包含重鏈恆定域CHI、CH2及CH3(抗體類別IgA、IgD及 IgG)及視情況之重鏈恆定域CH4(抗體類別IgE及IgM)。各 輕鏈包含輕鏈可變域VL及輕鏈恆定域CL。一種天然產生 完整抗體IgG抗體之結構展示於（例如）圖1中。可變域VH及 VL可進一步細分成高變區（稱為互補判定區（CDR))，間隔 有較為保守之區（稱為構架區（FR))。各VH及VL包含以下 列次序自胺基末端至羧基末端排列的三個CDR及四個FR : FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(Janeway CA，Jr等人(2001). Immunobiology·，第 5版，Garland Publishing ; 及 Woof J，Burton D Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99) 〇 兩 對重鏈與輕鏈（HC/LC)能夠與同一抗原特異性結合。因 此，該完整抗體為雙價單特異性抗體。該等"抗體"包括（例 如）小鼠抗體、人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體及基因 工程化抗體（變異抗體或突變抗體），只要保留其特徵性特 性即可。尤其較佳者為人類抗體或人類化抗體，尤其如重 組人類抗體或重組人類化抗體。 存在由以下希臘字母表示之五種類型之哺乳動物抗體重 鍵：α、δ、ε、γ及 p(Janeway CA，Jr等人（2001). Immunobiology.， 第5版，Garland Publishing)。所存在之重鏈類型界定抗體 類別：此等鏈分別見於IgA、IgD、IgE、IgG及IgM抗體中 (Rhoades RA，Pflanzer RG (2002). Human Physiology，第 4 版，Thomson Learning)。不同重鏈在尺寸及組成方面不 同；α及γ含有約450個胺基酸，而μ及ε具有約550個胺基 136473.doc 1359027 酸。 各重鍵具有兩個區’恒定區及可變區β怪定區在相同同 型之所有抗體中皆相同，但在不同同型之抗體中不同。重 鏈γ、α及δ具有包含三個恆定域CHI、CH2及CH3(成一直 線）之恆定區及用於增加可撓性之鉸鏈區（Woof J, Burton D Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99);重鏈μ及ε具有包含四個 恆定域CHI、CH2、CH3及CH4之恆定區（janeway CA，Jr等 人（2001). Immunobiology，第 5版，Garland Publishing)。 重鏈之可變區在由不同B細胞產生之抗體中不同，但對於 由單一 B細胞或B細胞純系產生之所有抗體皆相同。各重 鏈之可變區的長度為約110個胺基酸且包含單一抗體域。 在哺乳動物中’僅存在兩種類型之輕鏈，其稱為?1及1<。 輕鏈具有兩個連續域：一個怪定域C L及一個可變域VL。 輕鏈之近似長度為211至217個胺基酸。輕鏈較佳為忙輕 鏈’且恆定域CL較佳來源於κ輕鏈（恆定域Ck)。 如本文所用之術語"單株抗體”或”單株抗體組合物"係指 單一胺基酸緻成之抗體分子之製劑。 本發明之"抗體"可為任何類別（例如IgA、IgD、IgE、 IgG及IgM ’較佳為^(^或IgE)或亞類（例如IgGi、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl及IgA2，較佳為IgGl)，因此，產生本 fx明之雙彳貝雙特異性抗體的兩種抗體具有相同.亞類（例如 IgGl、IgG4及類似者’較佳為IgG1)iFc部分，較佳相同 異型（例如高加索人）之Fc部分。 "抗體之Fc部分"為熟習此項技術者所熟知之術語且基於 136473.doc 12 1359027 抗體之木瓜蛋白酶裂解來定義。本發明之抗體含有（作為 Fc部分）較佳來源於人類源之Fc部分及較佳人類恆定區之 所有其他部分。抗體之以部分直接涉及於補耀活化、Clq 結合、C3活化及Fc受體結合中。儘管抗體對補體系統之影 響視某些條件而定’但與Clq結合係由Fc部分中之規定結 合位點引起。該等結合位點在現有技術中已知且（例如）由

Lukas，T.J.等人，j. Imrnun〇i. U7 (1981) 2555-2560 ; Brunhouse，R.&Cebra，J.J.，Mol.Immunol.l6 (1979) 907_ 917，Burton，D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen，J.E.等人，]\4〇1.1〇11111111〇1.37 (2000) 995-1004 ’ Idusogie，E.E.等人’1.11111111111〇1.164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh，M.等人’】.\^1'〇1.75 (2001) 12161- 12168 ; Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;及EP 0 307 434描述。該等結合位點為（例如）L234、 L235 、 D270 、 N297 、 E318 、 K320 、 K322 、 P331 及 P329(根據Kabat之EU索引編號，見下文）。亞類IgG1、 IgG2及IgG3之抗體通常顯示補體活化、ciq結合及C3活 化，而IgG4並不活化補體系統’不結合C1 q且不活化C3。 較佳地，Fc部分為人類Fc部分。 術語”嵌合抗體"係指通常藉由重組DNA技術製備之包含 來自一種來源或物種之可變區（亦即，結合區）及至少一部 分來源於不同來源或物種之恆定區的抗體。包含鼠類可變 區及人類丨亙定區之嵌合抗體為較佳的。本發明所涵蓋之其 他較佳形式之”欲合机體為怪疋區與原始抗體之彼恆定區 136473.doc 1359027 相比已加以修飾或改變以產生本發明之特性、尤其關於 Clq結合及/或Fc受體（FcR)結合之特性。該等嵌合抗體亦 稱作"類別轉換抗體·％嵌合抗體為包含編碼免疫球蛋白可 變區之DNA區段及編碼免疫球蛋白恆定區之DNA區段的經 表現免疫球蛋白基因之產物。產生嵌合抗體之方法涉及此 項技術中所熟知之習知重組DNA技術及基因轉染技術。參 見’例如Morrison, S.L.等人，Proc· NaU八㈤託丨USA 81 (1984) 6851-6855 ;美國專利第 5 2〇2 238 號及第 5,204,244 號。 術s吾"人類化抗體’’係指構架或"互補判定區"（CDR)已經 修飾成包含與親本免疫球蛋白之特異性相比具不同特異性 之免疫球蛋白之CDR的抗體。在一較佳實施例中，將氣類 CDR移植至人類抗體之構架區中以製備"人類化抗體，^參 見，例如 Riechmann，L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 ;及 Neuberger，M.S.等人，Nature 314 (1985) 268- 270。尤其較佳之CDR對應於表示識別上文對於嵌合抗體 所述之抗原之序列的彼等CDR。本發明所涵蓋之其他形式 之"人類化抗體"為恆定區與原始抗體之彼恆定區相比已另 外加以修飾或改變以產生本發明之特性、尤其關於〇1(1結 合及/或Fc受體（FcR)結合之特性。 如本文所用之術語"人類抗體"意欲包括具有來源於人類 生瘦系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗 體在現有技術中已為熟知的（van Dijk，M.A.及van de

Winkel，J.G·，Curr. Opin. Chem. Biol· 5 (2001) 368-374)。 136473.doc 14 1359027 人類抗體亦可在能夠於免疫後在無内源性免疫球蛋白產生 之情況下產生完整譜系或選定譜系範圍之人類抗體的轉殖 基因動物（例如小鼠）中產生。人類生殖系免疫球蛋白基因 陣列在該生殖系突變小鼠中之轉移將引起抗原挑釁後產生 人類抗體（參見，例如Jakobovits，A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 90 (1993) 2551-2555 ; Jakobovits，A.等 人 ’ Nature 362 (1993) 255-258 ; Bruggemann，M_等人， Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人類抗體亦可在噬菌體呈 現庫中產生（Hoogenboom，H.R.及 Winter, G_, J_ Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ; Marks, J.D.等人，J· Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole等人及Bo erner等人之技術亦可用於 製備人類早株抗體（Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第 77 頁（1985);及 Boerner， P.等人，J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。如對於本發明之 嵌合抗體及人類化抗體已提及，如本文所用之術語"人類 抗體"亦包含在恆定區中（例如）藉由"類別轉換"，亦即以部 分之變化或突變（例如自IgGl至IgG4及/或IgGl/IgG4突變） 而加以修飾以產生本發明之特性、尤其關於C 1 q結合及/或 FcR結合之特性的該等抗體。 如本文所用之術語"重組人類抗體"意欲包括由重組方式 製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如，自諸如 NS0或CHO細胞之宿主細胞或自轉殖有人類免疫球蛋白基 因之動物（例如小鼠）分離之抗體或使用轉染至宿主細胞中 之重組表現載體所表現之抗體。該等重組人類抗體具有呈 136473.doc 1359027 重排形式之可變區及恆定區。太 本發明之重組人類抗體已經 歷活體内體細胞超突變。因丨士，α 殳囚此，重組抗體之VH區及VL·區 之胺基酸序列為儘管來源於且咮 、五沙及人類生殖系VH序列及 VL序列，但可能不天鈇在力 …仔在於活體内人類抗體生殖系譜 内之序列。

如本文所用之"可變域"（輕鏈之可變域（VL)、重鏈之可變 區（VH))表示直接涉及於抗體與抗原結合中之輕鏈與重鏈 對中之每__者。可變人類輕鏈及重鏈之域具有相同的一般 結構且各域包含由三個"高變區，，（或互補判定區，cdr)連 接，序列廣泛保守的四個構架（FR)區。構架區採用戸摺疊 構形且CDR可形成連接p摺疊結構之環。各鏈中之CDR由 構架區保持呈其二維結構且與來自另一鏈之CDR一起形成 抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈CDR3區在本發明之抗體 之結合特異性/親和力中起尤其重要之作用且由此提供本 發明之另一目的。

術語"高變區”或”抗體之抗原結合部分"當於本文中使用 時係指抗體十負責抗原結合之胺基酸殘基^高變區包含來 自"互補判定區"或"CDR"之胺基酸殘基。''構架"或”fr”區 為不同於如本文所定義之高變區殘基之彼等可變域區。因 此’抗體之輕鏈及重鏈自N末端至C末端包含域FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4 〇 各鏈上之 CDR 係由該等構架胺基酸分隔。尤其，重鏈之CDR3為對抗原 結合起最大作用之區。CDR及FR區係根據Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest 5 第 5版， 136473.doc 1359027

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD (1991)之標準定義來確定。 重鏈之"但定域”及輕鏈之"恆定域"並不直接涉及於抗體 與抗原之結合中’但展現各種效應功能。視其重鏈之恆定 區之胺基酸序列而定’抗體或免疫球蛋白分成以下類別： 如本文所用之術語”雙價雙特異性抗體”係指如上文所述 之抗體，其中兩對重鏈與輕鏈（HC/LC)中之每一者與不同 φ 抗原特異性結合，亦即，第一重鏈及第一輕鏈（起源於針 對第一抗原之抗體）一起與第一抗原特異性結合，且第二 重鏈及第二輕鏈（起源於針對第二抗原之抗體）一起與第二 抗原特異性結合（如圖2所描繪）；該等雙價雙特異性抗體能 夠同時與兩種不同抗原特異性結合而不與兩種以上抗原結 〇，此一方面與僅能與一種抗原結合之單特異性抗體，且 另一方面與（例如）可同時與四種抗原分子結合之四價四特 異性抗體形成對比。 • ㈣本發明，所要雙價雙特異性抗體與不當副產物相比 之比率可藉由僅置換一對重鏈與輕鏈（HC/LC)中之某些域 而改良。兩個HC/LC對中之第一對起源於與第一抗原特里 性結合之抗體且保持基本上不變，而兩個11(：/1^：對中之第 -對起源於與第：抗原特異性結合之抗體且藉由以下置換 而改變： 、 • ·冑鏈：該與第二抗原特異性結合之抗體之可變輕鏈域 VL經可變重鏈域VH置換，及 鏈"亥與第—抗原特異性結合之抗體之可變重鍵域 136473.doc 1359027 VH經可變輕鏈域VL置換。 因此，所得雙價雙特異性抗體為人工抗體，其包含： a) 與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鍵；及 b) 與第二抗原特'異性結合之抗體之輕鍵及重鏈， 其中該輕鏈（與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈） 含有可變域VH而非VL，且 其中5亥重鍵（與第一抗原特異性.結合之抗體之重鏈） 含有可變域VL而非VH。 在本發明之另一態樣中’所要雙價雙特異性抗體與不當 副產物相比之該改良比率可由以下兩種替代方法中之一者 來進一步改良： A)第一替代方法（參見圓3): 本發明之該雙價雙特異性抗體之CH3域可藉由"杵入臼” 技術改變，該技術以若干實例詳細描述於（例如）W〇 96/027011，Ridgway JB等人，Protein Eng 9 (1996) 617-621 ;及 Merchant Α·Μ·等人，Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681中。在此方法中，兩個CH3域之相互作用表面經改 變以增加含有此兩個CH3域之兩條重鏈的異源二聚。兩個 CH3域（或兩條重鏈之兩個CH3域）中之每一者可為"杵"，而 另一者為"臼"。雙硫橋之引入穩定異源二聚體（Merchant A.M等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell S，

Ridgway JB, Wells JA, Carter P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35)且增加產量。 因此，在較佳實施例中，第一 CH3域及第二CH3域各自 136473.doc 18 1359027 在包含抗體CH3域之間的原始界面之界面處會合的雙價雙 特異性抗體之CH3域係藉由"杵入臼"技術改變，該技術包 括藉由將雙硫橋引入CH3域中而進一步穩定（描述於w〇 96/027011，Ridgway JB等人，protein Eng 9 (1996) 617-621 ; Merchant A.M等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ;及 Atwell S，Ridgway JB，Wells JA，Carter P·，J Mol Biol 270 (1997) 26-35中）以促進雙價雙特異性抗體形成。 因此’在本發明之一態樣中，該雙價雙特異性抗體之特 徵在於： 一條重鏈之CH3域及另一條重鏈之CH3域各自在包含抗 體CH3域之間的原始界面之界面處會合； 其中該界面經改變以促進雙價雙特異性抗體形成，其中 該改變之特徵在於： a) —條重鏈之CH3域經改變， 使得在雙價雙特異性抗體内會合另一條重鏈之CH3域之 原始界面的一條重鍵之CH3域之原始界面内，胺基酸殘基 經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，進而在一條重鏈 之CH3域之界面内產生隆凸’該隆凸可定位於另一條重鍵 之CH3域之界面内的空腔中； 及 b) 另一條重鏈之CH3域經改變， 使得在雙價雙特異性抗體内會合第一 CH3域之原始界面 的第二CH3域之原始界面内’胺基酸殘基經具有較小側鍵 體積之胺基酸殘基置換，進而在第二CH3域之界面内產生 I36473.doc 1359027 空腔，第一 CH3域之界面内之隆凸可定位於該空腔内。 較佳地，該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基係選自由精 胺酸（R)、苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸（W)組成之 群。 較佳地，該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基係選自由丙 胺酸（A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)組成之群。 在本發明之一態樣中，兩個CH3域進一步藉由在各CH3 域之相應位置中引入半胱胺酸（C)作為胺基酸來改變以使 得兩個CH3域之間可形成雙硫橋。 在本發明之另一較佳實施例中，（例如）EP 1870459A1中 所述，藉由使用殘基R409D、K3 70E(K409D)(對於杵殘基） 及D399K、E3 57K(對於臼殘基）來改變兩個CH3域。 或 B)第二替代方法（參見圖4): 藉由一個恆定重鏈域CH3經恆定重鏈域CH1置換，且另 一個恆定重鏈域CH3經恆定輕鏈域CL置換。 置換重鏈域CH3之恆定重鏈域CH1可為任何Ig類別（例如 IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM)或亞類（例如 IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2)。 置換重鏈域CH3之恆定輕鏈域CL可為λ型或κ型，較佳為 κ型。 因此，本發明之一較佳實施例為一種雙價雙特異性抗 體，其包含： a)與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈；及 136473.doc -20- b)與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈，其中可 變域VL及VH經彼此置換， 且其中，視情況 c) 一條重鍵之CH3域及另一條重鏈之CH3域各自在 包含抗體CH3域之間的原始界面之界面處會合； 其中該界面經改變以促進雙價雙特異性抗體形成， 其中該改變之特徵在於： ca) 一條重鏈之CH3域經改變， 使得在雙價雙特異性抗體内會合另一條重鏈CH3域 之原始界面的一條重鏈CH3域之原始界面内，一個 胺基酸殘基經一個具有較大侧鏈體積之胺基酸殘基 置換’進而在一條重鏈之CH3域之界面内產生一個 隆凸’該隆凸可位於另一條重鏈之CH3域之界面内 的一個空腔中； 及 cb) 另一條重鏈之CH3域經改變， 使得在雙價雙特異性抗體内會合第一 CH3域之原始 界面的第二CH3域之原始界面内，一個胺基酸殘基 經一個具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，進而 在第一 CH3域之界面内產生一個空腔，第一 cH3域 之界面内之一個隆凸可位於該空腔内； 或d) 一個恒疋重鏈域CH3經一個但定重鏈域chi置換， 另一個恒定重鍵域CH3經一個，J·互定輕鍵域CL置換。 136473.doc -21 · 1359027 本文所用之術語I，抗原”或"抗原分子"可互換使用且係指 抗體可特異性結合之所有分子。雙價雙特異性抗體與第一 疒原及第一不同抗原特異性結合。本文所用之術語"抗原" :括例如蛋白f、蛋白質上之不同抗原決定基(如本發明 3義内之不同抗原)及多醣。此主要包括細菌、病毒及其 他微生物之部分（外鞘（coats)、莢膜（capsu丨es)、細胞壁、 鞭毛、纖毛（fimbrae)及毒素）。脂質及核酸僅在與蛋白質 及多醣組合時方具抗原性。非微生物外源性（非自身）抗原 可包括來自移植組織及器官或在輸入血細胞表面上之花 叙印白及蛋白質。較佳地，抗原係選自由細胞激素、細 胞表面蛋白、酶及受體細胞激素、細胞表面蛋白、酶及受 體組成之群。 腫瘤抗原為由腫瘤細胞表面上之MHC χ或MHC n分子呈 現之彼等抗原。此等抗原有時可由腫瘤細胞呈現且從不由 正常細胞呈現。在此狀況下，其稱為腫瘤特異性抗原 (TSA)且通常由腫瘤特異性突變而產生。更常見者為由腫 瘤細胞及正常細胞呈現之抗原，且其稱為腫瘤相關抗原 (TAA)。識別此等抗原之細胞毒性τ淋巴細胞可能會在腫瘤 細胞增殖或轉移之前將其殺死。腫瘤抗原亦可以（例如）突 變受體之形式處於腫瘤表面上，在此狀況下該等腫瘤抗原 將由B細胞識別。 在一較佳實施例中’雙價雙特異性抗體特異性結合之兩 種不同抗原（第一抗原及第二抗原）中之至少—者為腫瘤抗 原。 136473.doc -22- 1359027 在另一較佳實施例中，雙價雙特異性抗體特異性結合之 兩種不同抗原(第一抗原及第二抗原)中之兩者均為腫瘤抗 原；在此狀況下，第一抗原及第二抗原亦可為同一腫瘤特 異性蛋白上之兩種不同抗原決定基。 在另一較佳實施例中，雙價雙特異性抗體特異性結合之 兩種不同抗原（第一抗原及第二抗原）中之一者為腫瘤抗原 另者為效應細胞抗原，例如T細胞受體、CD3、CD16 及類似者。 在另一較佳實施例中，雙價雙特異性抗體特異性結合之 兩種不同抗原（第一抗原及第二抗原）十之一者為腫瘤抗原 且另一者為抗癌物質，諸如毒素或激酶抑制劑。 如本文所用之"特異性結合"或"與…特異性結合"係指特 異性結合抗原之抗體。較佳地，抗體特異性結合此抗原之 結合親和力具有1〇-9 m〇】/bt1〇-9 m〇l/l以下（例如〗〇_丨〇 mol/Ι)之KD值，較佳具有10-丨〇m〇1/丨或1(rlQm〇1/1以下（例如 ίο m〇i/i)之〖^值。結合親和力係以標準結合檢定，諸如 表面電漿共振技術（Biacore@)來測定。 術语''抗原決定基"包括能與抗體特異性結合之任何多肽 決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之 化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷酿基或磺醯 基，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或 特疋電荷特徵。抗原決定基為抗原中由抗體結合之區。在 某些實施例中，當抗體優先識別蛋白質及/或巨分子之複 雜混合物中之其靶抗原時，該抗體被稱為特異性結合抗 136473.doc •23- 原。 二發明之另一實施例為-種製備本發明之雙價雙特異性 抗體之方法， 其包含： a)用以下載體使宿主細胞轉化： -包含編碼與第-抗原特異性結合之抗體之輕鏈及 重鏈的核酸分子的載體， 包3編碼與第二抗原特異性結合之抗體之輕鍵及 重鏈的核酸分子# ^ . 刀卞的載體，其中可變域VL及VH經彼 此置換； )在允許該抗體分子合成之條件下培養該宿主細 胞；及 c)自該培養物回收該抗體分子。 一般而言，存在編碼該與第一抗原特異性結合之抗體之 輕鏈及重鏈的兩個載體及編碼該與第二抗原特異性結合之 抗體之輕鏈及重鏈的另外兩個載體。兩個載體中之一者編 碼各別輕鏈且兩個載體中之另一者編碼各別重鏈。然而， 在製備本發明之雙價雙特異性抗體之替代方法令，僅一個 編碼與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈的第—載 體及僅一個編碼與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重 鏈的第二裁體可用於使宿主細胞轉化。 本發明涵蓋一種製備抗體之方法，其包含在允許該等抗 體分子合成之條件下培養相應宿主細胞及自該培養物。 收 該等抗體，例如藉由表現以下核酸序列來達成： 136473.doc -24· 1359027 -編碼與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈的第一核酸 序列， -編碼該與第一抗原特異性結合之抗體之重鏈的第二核 酸序列， -編碼與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈的第三核酸 序列’其令可變輕鏈域VL經可變重鏈域vh置換，及 -編碼該與第二抗原特異性結合之抗體之重鏈的第四核 酸序列’其中可變重鏈域VH經可變輕鏈域VL置換。 籲 纟發明之另-實施例為一種宿主細胞，其包含： -包含編碼與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 的核酸分子的载體， -包含編碼與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 的核酸分子的载體’其中可變域^1及VH經彼此置換。 本發明之另一實施例為一種宿主細胞，其包含： a) 包含編碼與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈的核酸 分子的載體及包含編碼與第一抗原特異性結合之抗體之重 ® 键的核酸分子的載體， b) 包a編碼與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈的核酸 彳+的載體及包含編碼肖第二抗原特異性結合之抗體之重 鏈的核酸分子的载體，其中可變域VL及VH經彼此置換。 本發明之又一實施例為一種包含本發明之雙價雙特異性 抗體之組合物’較佳醫藥組合物或診斷組合物。 本發明之另一實施例為一種包含本發明之雙價雙特異性 抗體及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。 136473.doc •25- 1359027 本發明之另一實施例為一種治療需要治療之患者之方 法，其特徵在於將治療有效量之本發明之雙價雙特異性抗 體投與該患者。 如本文所用之術語”核酸或核酸分子”意欲包括dna分子 及腿分子。核酸分子可具有單鏈或雙鏈，但較佳為雙鍵 DNA 〇 如本文所用之表述·，細胞"、”細胞株，，及"細胞培養物"可 互換使用且所有該等名稱均包括子代。因此，詞"轉化體” 及"經轉化細胞"包括初級個體細胞及來源於該細胞之培養 物，與轉移之數目無關。亦應瞭解，所有子代由於有意或 無意之突變而在DNA含量方面可能不精確一致。包括具有 與在原始經轉化細胞中篩選之功能或生物活性相同之功能 或生物活性的變異子代。在意欲不同名稱時，將自上下文 顯而易見。 如本文所用之術語"轉化"係指載體/核酸轉移至宿主細胞 中之過程。若將無強大細胞壁障壁之細胞用作宿主細胞，

則轉染係（例如）藉由如Graham及Van der Eh，U (1978) 546頁及以後内容所述之磷酸鈣沈澱法來進行。然 而，亦可使用（諸如）藉由核注射或藉由原生質體融合將 DNA引入細胞中之其他方法。若使用原核細胞或含有實質 細胞壁構造之，則（例如）一種轉染方法為如Cohen，F. N等 人，PNAS. 69 (1972) 7110頁及以後内容所述使用氯化鈣 進行約處理。 使用轉化來重組產生抗體在現有技術中已為熟知的且描 136473.doc •26- 1359027 述於（例如）Makrides，S.C·，Protein Expr· Purif. 17 (1999) 183-202 ’ Geisse，S.等人，pr〇tein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 » Kaufman, R.J.} Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161，Werner, R.G.等人，Arzneimitteif〇rschung 48 (1998) 870-880 之評論文章中以及1186,331，415及1184,816,567 中。 如本文所用之"表現”係指使核酸轉錄成mRNA之過程及/ 或使經轉錄mRNA(亦稱為轉錄物）隨後轉譯成肽、多肽或 蛋白質中之過程。轉錄物及經編碼多肽統稱作基因產物。 兔·聚核苷酸來源於基因組DNA，則真核細胞中之表現可包 括mRNA之拼接。 "載體"為將所插入之核酸分子轉移至宿主細胞.中及/或宿 主細胞之間的核酸分子、尤其自我複製型核酸分子。該術 語包括主要功能在於將DNA或RNA插入細胞中（例如染色 體整合）之載體、主要功能在於DNA或RNA複製之複製載 體及功能在於DNA或RNA轉錄及/或轉譯之表現載體。亦 包括提供一種以上所述功能之載體。 ”表現載體"為當引入適當宿主細胞中時可轉錄及轉譯成 多肽之聚核苷酸。，，表現系統"通常係指包含可起作用以得 到所要表現產物之表現載體的合適宿主細胞。 本發明之雙價雙特異性抗體較佳係由重組方式產生。該 等方法在現有技術中廣泛已知且包含在原核細胞及真核細 胞中進行蛋白質表現，隨後分離抗體多肽且通常純化至醫 藥學上可接受之純度。對於蛋白質表現而言，編碼輕鏈及 136473.doc • 27- 1359027 重鏈或其片段之核酸係藉由標準方法插入表現載體中。在

如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS 細胞、酵母或大腸桿菌（E. coli)細胞之適當原核或真核宿 主細胞中進行表現，且自該等細胞（上清液或溶解後之細 胞）回收抗體。雙價雙特異性抗體可存在於完整細胞中、 細胞溶解產物中或以部分純化之形式或大體上純之形式存 在。藉由包括鹼/SDS處理、管柱層析及此項技術中所熟知 之其他技術的標準技術進行純化以去除其他細胞組份或其 他污染物’例如其他細胞核酸或蛋白質。參見Ausubel，F. 等人編，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York (1987)。 在NSO細胞中之表現係由（例如）Barnes, L M等人，

Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ;及 Barnes，L.M.等人， Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270描述。瞬間表現係由 (例如）Durocher，Y.等人，Nucl· Acids. Res. 30 (2002) E9描 述。可變域之選殖係由Orlandi，R·等人，Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter, P.等人，proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ;及 Norderhaug，L.等 人，J· Immunol. Methods 204 (1997) 77-87描述。較佳瞬間 表現系統（HEK 293)係由 Schlaeger，E.-J.及 Christensen, K.， Cytotechnology 30 (1999) 71-83 a*Schlaeger，E.-J.，J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199描述》 舉例而言，適合於原核生物之控制序列包括啟動子、視 情況之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟 136473.doc • 28 - 1359027 動子、強化子及聚腺芽酸化信號。 當使核酸與另一枋缺— 作方式連接"。舉例=列^能關係時’其係"以可操 DNA表現為參與多肽分』二則序列或分泌性前導子之 連接至該多肽之购白’則其係以可操作方式 錄，則其係以可摔作方^動化子影響編碼序列轉 ” 式連接至該序列丨或若核糖體&^ 位點經定位以有利於隸鈴θ, ^ ^ ^糖體結合 碼序列其仙可操作方式連接至編 — 敖而言’ ”以可操作方式連接"意謂經連接之 DNA序列為相連的，且在分泌性前導子之狀況下為相連的 且為同閱讀框的。然而，強化子無須為相連的。連接係藉 由在便利的限制性位點處接合而實現。若該等位點不^ 在’則根據習知規範使时成寡核㈣接附子或連接子。 雙價雙特異性抗體適宜藉由習知免疫球蛋白純化程序自 培養基分離’該等程序諸如蛋白fA環脂糖、經磷灰石層 析、凝膠電泳、透析或親和層析。編碼單株抗體之⑽八或 RNA易於使用習知程序分離及定序。融合瘤細胞可充當該 DNA及RNA之來源。一旦分離，即可將DNA插入表現載體 中’接著使該等表現載體轉染至不會以其他方式產生免疫 球蛋白之宿主細胞（諸如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤 細胞）中，以獲得在宿主細胞中重組單株抗體之合成。 雙價雙特異性抗體之胺基酸序列變異體（或突變體）係藉 由將適當核苷酸變化引入抗體DNA中或藉由核苷酸合成來 製備。然而，該等修飾可僅在（例如）如上文所述之極有限 範圍中進行。舉例而言’修飾不改變上文所提及之抗體特 136473.doc -29- 1359027 徵（諸如IgG同型及抗原結合），但可改良重組產生之產 量、蛋白質穩定性或有利於純化。 提供以下實例、序列表及圖式以幫助理解本發明，本發 明之真實範疇陳述於隨附申請專利範圍中。當然，可在不 脫離本發明之精神下對所述程序作出修改。

序列表 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5

SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 野生型<10?-111>抗體重鏈之胺基酸序列 野生型<IGF-111>抗體輕鏈之胺基酸序列 <IGF-1R> VL-VH交換抗體之重鏈 ***(HC***)之胺基酸序列，其中重鏈域 VH經輕鏈域VL置換-變異體A <IGF-1R> VL-VH交換抗體之輕鏈 ***(LC***)之胺基酸序列，其中輕鏈域 VL經重鏈域VH置換-變異體A IGF-1R胞外域His-抗生蛋白鏈菌素結合 肽-標籤（IGF-1R-His-SBP ECD)之胺基酸 序列. 野生型血.管生成素-2(Angiopoietin-2)<ANGPT2>4iL體重鏈之胺基酸序列 野生型血管生成素-2 <ANGPT2>抗體輕 鏈之胺基酸序列 用於杵入臼技術之具有T366W交換之CH3 域（杵）的胺基酸序列 136473.doc -30- 1359027 SEQ ID NO: 9 用於杵入臼技術之具有T366S、L368A、 Y407V交換之CH3域（臼）的胺基酸序列 SEQ ID NO: 10 <IGF-1R> VL-VH 交換抗體之重鏈

***(HC***)之胺基酸序列，其中重鏈域 VH經輕鏈域VL置換-變異體B SEQ ID NO: 11 <IGF-1R> VL-VH 交換抗體之輕鏈

***(LC***)之胺基酸序列，其中輕鏈域 VL經重鏈域VH置換-變異體B SEQ ID NO: 12 IGF-1R胞外域His-抗生蛋白鏈菌素結合 肽-標籤（IGF-1R-His-SBP ECD)之胺基酸 序列 實例 材料及一般方法 關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資 訊在 Kabat， E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)中給 出。抗體鏈之胺基酸係根據EU編號來編號及命名 (Edelman，G.M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85 ; Kabat，Ε·Α·等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)) o 重組DNA技術 如 Sambrook, J.等人，Molecular cloning: A laboratory 136473.doc 31 1359027 manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York，1989中所述，使用標準方法來操縱 DNA »根據製造商之說明書使用分子生物試劑。 基因合成 所要基因區段係自藉由化學合成製得之寡核苷酸製備。 侧接有獨特限制性核酸内切酶裂解位點之600-1 800 bp長基 因區段係藉由寡核苷酸之黏接及接合（包括PCR擴增）來裝 配且隨後經由指定限制性位點（例如KpnI/SacI或AscI/PacI) 選殖至基於pPCRScript(Stratagene)之pGA4選殖載體中。 經次選殖之基因片段之DNA序列係藉由DNA定序來確證。 基因合成片段係根據Geneart(Regensburg，Germany)之給定 規格定製》 DNA序列測定 DNA 序列係藉由 MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)或 Sequiserve GmbH(Vaterstetten, Germany)戶斤進 行之雙鏈定序來測定。 DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理 使用 GCG(Genetics Computer Group, Madison，Wisconsin) 之套裝軟體1〇·2版及Infomax之Vector NT1 Advance組套8.0 版來進行序列生成、定位、分析、註解及說明。 表現載體 對用於瞬間表現（例如在HEK293 EBNA或HEK293-F中） 之表現質體之所述抗體變異體的表現，應用基於具有 CMV-内含子A啟動子之cDNA組織或基於具有CMV啟動子 136473.doc -32- 之基因組組織的細胞。 除抗體表現卡匣以外，載體亦含有： -允許此質體在大腸桿菌中複製之複製起點，及 -在大腸桿菌中賦予安比西林（ampiciUin)抗性之P内醯胺 酶基因。 抗體基因之轉錄單元包含以下元件： •5·末端之獨特限制性位點， -來自人類細胞巨大病毒之即刻早期強化子及啟動子， -在cDNA組織之狀況下接著為内含子a序列， -人類抗體基因之5'未轉譯區， -免疫球蛋白重鏈信號序列， -具有免疫球蛋白外顯子-内含子組織之cDNA組織形式 或具有免疫球蛋白外顯子-内含子組織之基因組組織形式 的人類抗體鏈（野生型或具有域交換）， -具有聚腺苦酸化信號序列之3’未轉譯區，及 -31末端之獨特限制性位點。 如下文所述之包含所述抗體鏈之融合基因係藉由PCR及/ 或基因合成產生且以已知重組方法及技術藉由（例如）使用 各別載體中之獨特限制性位點連接相應核酸區段來裝配。 經次選殖之核酸序列係藉由DNA定序來驗證。對於瞬間轉 染’藉由自經轉化之大腸桿菌培養物（Nucleobond AX， Macherey-Nagel)進行質體製備來製備較大量之質體。 細胞培養技術 如 Current Protocols in Cell Biology (2000)，Bonifacino, 136473.doc •33· 1359027 J.S·，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.及

Yamada，K.M.(編），John Wiley & Sons，Inc.中所述使用標 準細胞培養技術β 雙特異性抗體係藉由如下文所述在附著性生長ΗΕΚ293-ΕΒΝΑ中或在懸浮生長之HEK29-F細胞中瞬間共同轉染各 別表現質體來表現。 在ΗΕΚ293-ΕΒΝΑ系統中瞬間轉染 雙特異性抗體係藉由在培養於補充有1 0%超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)、2 mM L-麩胺醯胺（Gibco)及250 pg/ml遺傳黴素（Gibco)之DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養 基（Dulbecco's modified Eagle's medium)，Gibco)中之附著 性生長HEK293-EBNA細胞（表現艾伯斯坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr-Virus)核抗原之人類胚腎細胞株293 ;美國菌 種保存中心（American type culture collection)寄存編號 ATCC CRL-10852號’批號959 218)中瞬間共同轉染各別表 現質體（例如編碼重鍵及經修飾重鍵，以及相應輕鍵及經 修飾輕鏈）來表現。對於轉染，以4:1 (3:1至6:1範圍内）之

FuGENE™試劑（μΐ)與DNA(pg)比率使用FuGENE™ 6轉染試 劑（Roche Molecular Biochemicals)。分別使用 等莫 耳）（1··2至2:1範圍内）之（經修飾及野生型）輕鏈編碼質體與 (經修飾及野生型）重鏈編碼質體之莫耳比自各別質體表現 蛋白質。第3天用L-麩胺醯胺（至4 mM)、葡萄糖[Sigma]及 NAA [Gibco]餵養細胞。轉染後第5天至第u天藉由離心收 集含有雙特異性抗體之細胞培養物上清液且將其儲存於· 136473.doc •34· 1359027 20°C下。關於人類免疫球蛋白在（例如）ΗΕΚ293細胞中之重 組表現的一般資訊在Meissner, P.等人’ Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203 中給出。 在HEK293-F系統中瞬間轉染 雙特異性抗體係藉由根據製造商之說明書使用HEK293-F系統（Invitrogen)瞬間轉染各別質體（例如編碼重鏈之質體 及編碼經修飾重鏈之質體，以及編碼相應輕鏈之質體及編 碼經修飾輕鏈之質體）而產生°簡言之，用四種表現質體 及293fectin或fectin(Invitrogen)之混合物轉染在搖瓶中或 攪拌式醱酵槽中於無血清Freestyle 293表現培養基 (Invitrogen)中懸浮生長之 HEK293-F 細胞（Invitrogen)。對 於2 L搖瓶（Corning)而言，使HEK293-F細胞於600 mL中以 1.0E*6個細胞/毫升之密度接種且在120 rpm、8% C02下培 育。第二天，用由A)20 mL Opti-MEM(Invitrogen)以及 600 Kg以等莫耳比編碼重鏈或經修飾重鏈（分別）及相應輕鏈之 總質體DNA(1 pg/mL)及B)20 mL Opti-MEM + 1_2 mL 293 fectin或fectin(2 μΙ/mL)構成之約42 mL混合物以約1.5E*6 個細胞/毫升之細胞密度轉染細胞。根據葡萄糖消耗，在 醱酵過程中添加葡萄糖溶液。5· 10天後收集含有所分泌抗 體之上清液且直接自上清液純化抗體或將上清液冷凍且儲 存。 蛋白質測定 經純化之抗體及衍生物之蛋白質濃度係藉由測定280 nm 下之光學密度（OD)，使用基於Pace等人，Protein Science， 136473.doc •35- 1359027 1995, 4, 241 1-1423之胺基酸序列所計算之莫耳消光係數測 定。 上清液中抗體濃度之測定 細胞培養物上清液中抗體及衍生物之濃度係藉由蛋白質 A瓊脂糖珠粒（Roche)進行免疫沈澱來估測。60 pL蛋白質A 瓊脂糖珠粒在TBS-NP40(50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，1% Nonidet-P40)中洗滌三次。隨後，將1-15 mL細 胞培養物上清液施加於在TBS-NP40中預平衡之蛋白質A瓊 脂糖珠粒。在室溫培育1小時後，珠粒在Ultrafree-MC過濾 柱（Amicon)上用 0,5 mL TBS-NP40洗務一次，用 0.5 mL 2x 磷酸鹽緩衝鹽水（2xPBS，Roche)洗滌兩次，且用0.5 mL 100 mM檸檬酸鈉（pH 5.0)簡單洗滌四次。藉由添加35 μΐ NuPAGE® LDS樣本緩衝液（Invitrogen)溶離結合之抗體。 一半樣本分別與NuPAGE®樣本還原劑組合或保持未還 原，且在70°C加熱10分鐘。隨後，將5-30 μΐ施加於4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(對於非還原之 SDS-PAGE用MOPS緩衝液，對於還原之SDS-PAGE用含有 NuPAGE®抗氧化劑電泳緩衝液（running buffer)添力口劑 (Invitrogen)之 MES 緩衝液）且用庫馬斯藍（Coomassie Blue) 染色。 細胞培養物上清液中抗體及衍生物之濃度係藉由親和 HPLC層析定量測量。簡言之，將含有與蛋白質A結合之抗 體及衍生物之細胞培養物上清液施加於AgilenlHPLC 11 00 系統上於200 mMKH2P04、100mM檸檬酸鈉（pH7·4)中之 136473.doc -36- 1359027

Applied Biosystems Poros A/20管柱，且用 200 mM NaCl、 100 mM檸檬酸（pH 2.5)自基質溶離。藉由UV吸光度及峰面 積積分定量所溶離之蛋白質。經純化之標準IgG 1抗體用作 標準物。 或者’細胞培養物上清液中之抗體及衍生物之濃度係藉 由夾心IgG-ELISA來量測。簡言之，將StreptaWell High Bind抗生蛋白鏈菌素A-96孔微量滴定盤（R0che)用100微升/ 孔0.1 pg/mL經結合生物素抗人IgG捕捉分子F(ab')2<h-Fcy> BI(Dianova)在室溫下塗佈1小時或者在4°C下塗佈隔夜且隨 後用 200微升/孔 PBS、0.05% Tween(PBST，Sigma)洗務三 次。將100微升/孔含有各別抗體之細胞培養物上清液於 PBS(Sigma)中之連續稀釋液添加至孔中且在室溫下於微量 滴定盤震盪器上培育1-2小時。將孔用200微升/孔PBST洗 滌三次且在室溫下於微量滴定盤震盪器上用1〇〇 μ1 〇」 pg/mL之F(ab’）2<hFcY>P〇D(Dianova)作為偵測抗體偵測經 結合之抗體1 -2小時《將未結合之偵測抗體用2〇〇微升/孔 PBST洗滌三次以除去且藉由添加100微升ABTS/孔來偵測 經結合之彳貞測抗體。在Tecan Fluor光譜儀上於405 nm之量 測波長（參考波長492 nm)下進行吸光度測定。 蛋白質純化

蛋白質係參考標準方案自經過濾之細胞培養物上清液純 化。簡言之，將抗體施加於蛋白質A瓊脂糖管柱（GE healthcare)且用pBS洗滌。在pH 2.8下達成抗體溶離，隨後 立即中和樣本。藉由於PBS中或於20 mM組胺酸、150 mM 136473.doc •37· 1359027

NaCl(pH 6.0)中進行尺寸排除層析（Superdex 200，GE Healthcare)自單體抗體分離聚集蛋白質。將單體抗體溶離 份彙集，必要時使用（例如）MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)離心濃縮器濃縮，冷凍且儲存於_2〇°C或-80°C下。 提供一部分樣本用於後續蛋白質分析及分析表徵，例如藉 由SDS-PAGE、尺寸排除層析或質譜分析。

SDS-PAGE 根據製造商之說明書使用NuPAGE®預製凝膠系統 (Invitrogen)。詳言之’使用 10%或4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS預製凝膠（pH 6.4)及NuPAGE® MES(還原凝膠， 含有NuPAGE®抗氧化劑電泳緩衝液添加劑）或MOPS(非還 原凝膠）電泳緩衝液。 分析型尺寸排除層析 用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之尺寸排除層析係藉由 HPLC層析來進行。簡言之，將經蛋白質八純化之抗體施加 於 Agilent HPLC 1100 系統上於 300 mM NaCl、50 mM 尺112?04/1<：21^04(?117.5)中之丁〇3〇11丁81<：凝膠030008\¥管柱 或施加於Dionex HPLC系統上於2 x PBS中之Superdex 200 管柱（GE Healthcare)。藉由UV吸光度及峰面積積分來量化 所溶離之蛋白質。BioRad凝膠過濾標準物15 1-1901充當標 準物。 質譜分析 交換抗體之總脫糖基化質量係經由電喷霧電離質譜分析 (ESI-MS)來測定及確證。簡言之，將100 經純化抗體用 136473.doc •38· 1359027 於 100 mM ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04(ρΗ 7)中之 50 mU Ν·醣苷酶 F(PNGaseF，ProZyme)以至多2 mg/ml之蛋白質濃度在37 C 下脫糖基化12-24小時且隨後經由在Sephadex G25管柱（GE Healthcare)上進行HPLC來脫鹽。脫糖基化及還原後藉由 ESI-MS測定各別重鏈及輕鏈之質量。簡言之’將於115 μ1 中之50 pg抗體與60 μΐ 1Μ TCEP及50 μΐ 8 Μ胍鹽酸鹽一起 培育，隨後脫鹽。在配備有NanoMate源之Q-Star Elite MS 系統上經由ESI-MS測定總質量及經還原重鏈及輕鏈之質 量。

IGF-1R ECD結合ELISA 在ELIS A檢定中以IGF-1R胞外域（ECD)評估所產生抗體 之結合特性。為此，將與N末端His-抗生蛋白鏈菌素結合 肽標籤（His-SBP)融合之包含天然前導序列及α鏈之人類 IGF-IR胞外域之LI-富含半胱胺酸-12域（根據McKern等 人，1997 ; Ward等人，2001)的 IGF-1R胞外域（殘基 1-462) 選殖至pcDNA3載體衍生物中且在HEK293F細胞中瞬間表 現。IGF-1R-His-SBP ECD之蛋白質序列係以SEQ ID NO: 12給出。將StreptaWell High Bind抗生蛋白鏈菌素A-96孔 微量滴定盤（Roche)用100微升/孔含有可溶性IGF-1R-ECD-SBP融合蛋白之細胞培養物上清液在4°C下塗佈隔夜且用 200微升/孔 PBS、0.05% Tween(PBST，Sigma)洗滌三次。 隨後，將100微升/孔各別抗體及作為參考之野生型<igf-1R>抗體於包括1% BSA(部分V，Roche)之PBS(Sigma)中的 連續稀釋液添加至孔中且在室溫下於微量滴定盤震盪器上 136473.doc -39- 1359027 培育1 -2小時。對於連續稀釋液，將相同量之經純化抗體 塗覆於孔上。將孔用200微升/孔PBST洗滌三次且在室溫下 於微量滴定盤震盪器上用100微升/孔0.1 pg/mL(l :8000)之 卩(&1)')2<1^0丫>?〇〇(〇丨&11(^3)作為偵測抗體偵測經結合之抗 體1-2小時。將未結合之偵測抗體用200微升/孔PBST洗滌 三次以除去且藉由添加100微升ABTS/孔來偵測經結合之 4貞測抗體。在Tecan Fluor光譜儀上於405 nm之量測波長 (參考波長492 nm)下進行吸光度測定。 IGF-1R ECD Biacore 所產生抗體與IGF-1R ECD之結合亦係藉由使用 BIACORE T100 儀器（GE Healthcare Biosciences AB， Uppsala，Sweden)進行表面電漿共振來研究。簡言之，對 於親和力量測’經由胺偶合使山羊抗人IgG，JIR 109-005-098抗體固定於CM5晶片上用於呈現針對經標記之人類 IGF-1R ECD-Fc 之抗體。在 25。〇下在 HBS 緩衝液（HBS-P(10 mM HEPES ’ 150 mM NaC卜 0.005% Tween 20，pH 7.4)) 中量測結合。添加呈不同濃度之溶液形式之IGF_1R ECD(R&D Systems或經内部純化卜藉由8〇秒至3分鐘之 IGF-1R ECD注射來量測締合；藉由將晶片表面用HBS緩衝 液洗務3-1 0分鐘來量測解離且使用1:丨朗哥謬爾結合模型 (Langmuir binding model)估測 kd值。由於 <IGF-1R>抗體 之負載密度及捕捉莖較低，因此獲得單價IGF1R ECD結 合。樣本曲線減去陰性對照數據（例如緩衝液曲線）用於校 正系統固有基線漂移且用於減小雜訊信號。使用Biac〇re 136473.doc «40. 1359027 τι 00評估軟體1.1.1版來分析感測圖譜且計算親和力數據。 圖11展示Biacore檢定之流程。 實例1

可變域CL及CH1經彼此置換之單特異性雙價<16[-1只>抗 體（本文中縮寫為<IGF-1R> VL-VH交換抗體）的產生、表 現、純化及表徵 實例1A 製造單特異性雙價<IGF-1R> VL-VH交換抗體之表現質體 此實例中所述之單特異性雙價<IGF-1R> VL-VH交換抗 體之重鏈可變域及輕鏈可變域的序列（包括各別前導序列） 係來源於WO 2005/005635中所述之人類<IGF-1R>抗體重 鏈（SEQIDNO: 1，質體4843-pUC-HC-IGF-lR)及輕鏈（SEQ ID NO: 2，質體4842-pUC-LC-IGF-lR)，且重鏈恆定域及 輕鏈恆定域係來源於人類抗體（Ck及IgGl)。 將編碼<IGF-1R>抗體前導序列、輕鏈可變域（VL)及人類 重鏈恆定域1(CH1)之基因區段接合且與人類γΐ重鏈恆定域 (鉸鏈-CH2-CH3)之Fc域之5'末端融合。編碼由VH域經VL 域交換（VH-VL交換）產生之各別融合蛋白之DNA係藉由基 因合成而產生且於下文表示為<IGF-1R> HC“*(SEQ ID NO: 10)。最初，VL-CH1域係與略微不同之序列（SEQ ID NO: 3)融合；由此連接之表現量減少，因此選擇顯示與野 生型抗體相當之表現量的SEQ10。 <IGF-1R>抗體前導序列、重鏈可變域（VH)及人類輕鏈 恆定域（CL)之基因區段係接合為獨立鏈。編碼由VL域經 136473.doc 41 1359027 VH域交換（VL-VH交換）產生之各別融合蛋白之DNA係藉由 基因合成而產生且於下文表示為<IGF-1R> LC***(重鏈 ***)(SEQ ID NO: 11)。最初，VH-CL域係與略微不同之序 列（SEQ ID NO: 4)融合；由於此連接之表現量減少，因此 選擇顯示與野生型抗體相當之表現量的SEQ ID NO: 11。 圖5及圖6展示經修飾<IGF-1R> HC**重鏈及經修飾 <IGF-1R> LC**輕鏈之蛋白質序列之示意圖。 在下文中簡要描述各別表現載體：

載鱧 pUC-HC**-IGF-lR 載體 pUC-HC“-IGF-lR為（例如）用於在 HEK293(EBNA) 細胞中瞬間表現VL-VH交換<IGF-1R>重鏈HC**(cDNA組 織化表現卡匣；具有CMV-内含子A)或用於在CHO細胞中 穩定表現之表現質體。 除<IGF-1R>HC**表現卡匣以外，此載體亦含有： -允許此質體在大腸桿菌中複製之來自載體pUC 18之複製 起點，及 -在大腸桿菌中賦予安比西林抗性之β-内醯胺酶基因。 <IGF-1R>HC**基因之轉錄單元包含以下元件： -5'末端之AscI限制性位點， -來自人類細胞巨大病毒之即刻早期強化子及啟動子， -接著為内含子A序列， -人類抗體基因之5'未轉譯區， -免疫球蛋白輕鏈信號序列， -與人類γΐ重鏈恆定域（鉸鏈-CH2-CH3)之Fc域之5'末端融 136473.doc -42- 1359027 合的編碼人類重鏈可變域（VH)與人類κ輕鏈恆定域（CL)之 融合體的人類<IGF-1R>成熟HC**鏈， -具有聚腺苷酸化信號序列之3’未轉譯區，及 -3'末端之限制性位點SgrAI。 重鏈 ** VL-VH 交換 <IGF-1R> HC** 表現載體 pUC-HC**-IGF-1R之質體圖譜展示於圖7中。<IGF-1R> HC"之胺基 酸序列（包括信號序列）係以SEQ ID NO: 10給出。

載體 pUC-LC**-IGF-lR 載體 pUC-LC**-IGF-lR為（例如）用於在 HEK293(EBNA) 細胞中瞬間表現VL-VH交換<IGF-1R>輕鏈LC**(cDNA組 織化表現卡匣；具有CMV-内含子A)或用於在CHO細胞中 穩定表現之表現質體。 除<IGF-1R>LC**表現卡匣以外，此載體亦含有： -允許此質體在大腸桿菌中複製之來自載體PUC18之複製 起點，及 -在大腸桿菌中賦予安比西林抗性之β_内醯胺酶基因。 <IGF-1R>LC**基因之轉錄單元包含以下元件： -5'末端之限制性位點Sse8387I， -來自人類細胞巨大病毒之即刻早期強化子及啟動子， -接著為内含子A序列， -人類抗體基因之5,未轉譯區， •免疫球蛋白重鏈信號序列， -編碼人類輕鏈可變域（VL)與人類γ1重鏈恆定域（CH1)之 融合體的人類<IGF-1R>&體成熟LC**鍵， I36473.doc -43· 1359027 -具有聚腺苷酸化信號序列之3'未轉譯區，及 -3·末端之限制性位點Sail及Fsel » 輕鏈 ** VL-VH 交換 <IGF-1R> LC** 表現載體 pUC-LC**-IGF-1R之質體圖譜展示於圖8中。<IGF-1R> LC"之胺基 酸序列（包括信號序歹1J )係以SEQ ID NO: 11給出。 質體 pUC-HC**-IGF-lR及 pUC-LC**-IGF-lR可用於瞬間 或穩定共同轉染至（例如）HEK293、HEK293 EBNA或CHO 細胞（2載體系統）中。出於比較原因，自與此實例中所述類 似的質體 4842-pUC-LC-IGF-lR(SEQ ID NO: 2)及 4843-pUC-HC-IGF-lR(SEQ ID NO: 1)瞬間表現野生型 <IGF-1R> 抗體。 為使在HEK293 EBNA細胞中之瞬間表現達成較高表現 量，可將<IGF-1R> HC**表現卡匣經由AscI、SgrAI位點且 將<IGF-1R> LC**表現卡匣經由Sse8387I及Fsel位點次選 殖至4700 pUC-Hyg_OriP表現載體中，該表現載體含有：

OriP元件，及 潮黴素抗性基因作為選擇性標記。 可將重鏈及輕鏈轉錄單元次選殖至兩個獨立4700-pUC-Hyg-OriP載體中以供共同轉染（2載體系統）或可將其選殖至 一個共用4700-pUC-Hyg-OriP載體中（1載體系統）以供隨後 用所得載體瞬間或穩定轉染。圖9展示基本載體4700-pUC· OriP之質體圖譜。

實例1B 製造單特異性雙價<1GF-1 R> VL-VH交換抗體表現質體 136473.doc -44 - 1359027 包含野生型<IGF-1R>抗體之經交換Fab序列之<IGF-1R> 融合基因（HC**及LC**融合基因）係以已知重組方法及技 術藉由連接相應核酸區段來裝配。 編碼IGF-1R HC**及LC**之核酸序列各自藉由化學合成 法合成且隨後選殖至Geneart(Regens burg, Germany)之基於 pPCRScript(Stratagene)之 pGA4選殖載體中。將編碼IGF-1R HC**之表現卡匣經由PvuII及BmgBI限制性位點接合至 各別大腸桿菌質體中，產生最終載體pUC-HC**-IGF-lR ; 將編碼各別IGF-1R LC"之表現卡匣經由PvuII及Sail限制 性位點接合至各別大腸桿菌質體中，產生最終載體卩1；(：-LC**-IGF-1R。藉由DNA定序來驗證經次選殖之核酸序 列。對於瞬間及穩定轉染，藉由自經轉化之大腸桿菌培養 物（Nucleobond AX，Macherey-Nagel)進行質體製備來製備 較大量之質體。

實例1C 瞬間表現單特異性雙價<IGF-1R> VL-VH交換抗體、純化 及藉由質譜分析確證一致性 重組<IGF-1R> VL-VH交換抗體係藉由如上文所述在 HEK293-F懸浮細胞中瞬間共同轉染質體pUC-HC"-IGF-1R及 pUC-LC**-IGF-lR來表現。 經表現且經分泌之單特異性雙價<IGF-1 R> VL-VH交換 抗體係自經過濾之細胞培養物上清液如上文所述藉由蛋白 質A親和層析來純化。簡言之，將來自瞬間轉染之含有 <IGF-1 R> VL-VH交換抗體之細胞培養物上清液藉由離心 136473.doc -45- 1359027 及過濾而淨化且施加於用PBS緩衝液（10 mM Na2HP04、1 1111^1〇^2?04、137 1111\4\3(：1及2_7 1111^〖(：1，？117.4)平衡之 蛋白質A HiTrap MabSelect Xtra 管柱（GE Healthcare)。將 未結合之蛋白質用PBS平衡緩衝液、接著0.1 M檸檬酸鈉緩 衝液（pH 5.5)洗去且用PBS洗滌。用100 mM檸檬酸鈉（ρΗ 2.8)達成抗體溶離，接著用每2 ml溶離份300 μ1 2 Μ Tris(pH 9.0)立即中和樣本。藉由在 HiLoad 26/60 Superdex 200製備級管柱（GE Healthcare)上於20 mM組胺酸、150 mM NaCl(pH 6.0)中進行尺寸排除層析自單體抗體分離聚 集蛋白質且隨後使用MILLIPORE Amicon Ultra-1 5離心濃 縮器濃縮單體抗體溶離份。將<IGF-1R> VL-VH交換抗體 冷凍且儲存於-20°C或-80°C下。如上文所述藉由在存在及 不存在還原劑之情況下進行SDS-PAGE且隨後用庫馬斯亮 藍染色來分析<IGF-1R> VL-VH交換抗體之完整性。藉由 分析型尺寸排除層析確證<IGF-1R> VL-VH交換抗體之單 體狀態（圖12)。提供經表徵之樣本用於後續蛋白質分析及 功能表徵。ESI質譜分析確證完全脫糖基化<IGF-1R> VL-VH交換抗體之理論分子量。

實例1D 在IGF-1R ECD結合ELISA中且藉由Biacore分析單特異性 雙價<IGF-1R> VL-VH交換抗體之IGF-1R結合特性 單特異性雙價<IGF-1R> VL-VH交換抗體之結合特性係 如上文所述在ELISA檢定中以IGF-1R胞外域（ECD)來評 估。為此，將與N末端His-抗生蛋白鏈菌素結合肽標籤 136473.doc -46- (His-SBP)融合之包含天然前導序列及α鏈之人類IGF-IR胞 外域之LI-富含半胱胺酸-12域（根據McKern等人，1997 ; Ward等人，2001)的IGF-1R胞外域（殘基1-462)選殖至 pcDNA3載體衍生物中且在HEK293F細胞中瞬間表現。 IGF-1R-His-SBP ECD之蛋白質序列在上文給出。所獲得之 滴定曲線顯示<IGF-1R> VL-VH交換抗體具功能性且顯示 在方法誤差内與野生型<IGF-1R>抗體相當之結合特徵及動 力學且由此似乎具完全功能性（圖13)。 此等發現係由各別經純化抗體之Biacore確證。

實例1G 藉由FACS以IGF-1R過度表現124細胞分析單特異性雙價 <IGF-1R> VL-VH交換抗體之IGF-1R結合特性 為確證<IGF-1 R> VL-VH交換抗體與在124細胞（表現重組 人類IGF-1R之NIH3T3細胞，Roche)表面上過度表現之 IGF-1R的結合活性，藉由FACS進行研究。簡言之，將每 個FACS管5 X 10E5個124細胞與經純化<IGF-1R> VL-VH交 換抗體及作為參考之野生型<IGF-1 R>抗體之稀釋液一起培 育且在冰上培育1小時。用4 ml冰冷PBS(Gibco)+ 2% FCS(Gibco)洗去未結合之抗體。隨後，將細胞離心（以400 g，5分鐘）且在避光下於冰上用F(ab')2 <hFcy>PE結合物 (Dianova)偵測經結合之抗體歷時卜丨、時。用4 ml冰冷PBS + 2% FCS洗去未結合之偵測抗體。隨後，將細胞離心（5 min，400 g)，再懸浮於 300-500 μί PBS 中且在 FACSCalibur 或 FACS Canto(BD FL2 通道，每次擷取為 136473.doc -47- 1359027 10,000個細胞）上量化經結合之偵測抗體。實驗期間，包括 各別同型對照以排除任何非特異性結合。<IGF-1R> VL-VH交換抗體及野生型<IGF-1R>參考抗體與124細胞上之 IGF-1R的結合引起相當的平均螢光強度濃度賴性偏移。 實例2

單特異性雙價<ANGPT2>野生型抗體之描述 實例2A 製造單特異性雙價<ANGPT2>野生型抗體之表現質體 此實例中所述之單特異性雙.價ANGPT2 <ANGPT2>野生 型抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域的序列（包括各別前導 序列）係來源於WO 2006/045049中所述之人類<ANGPT2> 抗體重鏈（SEQ ID NO: 6)及輕鏈（SEQ ID NO: 7) ’且重鏈 恆定域及輕鏈恆定域係來源於人類抗體（Ck及IgG 1)。 將野生型<ANGPT2>抗體選殖至與先前實例1A中所述之 載體類似的質體SB04-pUC-HC-ANGPT2(SEQ ID NO: 6)及 SB06-pUC-LC-ANGPT2(SEQ ID NO: 7)中。 出於比較原因且用於共同表現實驗（參見實例3)，自質 體 SB04-pUC-HC-ANGPT2 及 SB06-pUC-LC-ANGPT2 瞬間 (共同）表現野生型<ANGPT2>抗體。

實例2B 製造單特異性雙價<ANGPT2>野生型抗體表現質體 編碼<ANGPT2> HC及LC之核酸序列各自藉由化學合成 法合成且隨後選瘦至Geneart(Regensburg，Germany)之基於 pPCRScript(Stratagene)之pGA4選殖載體中。將編碼 136473.doc -48 · 1359027 <ANGPT2> HC之表現卡匣選殖至各別大腸桿菌質體中’ 產生最終載體SB04-pUC-HC-ANGPT2 ;將編碼各別 <ANGPT2> LC之表現卡匣選殖至各另|J大腸桿菌質體中， 產生最終載體SB06-pUC-LC-ANGPT2 »藉由DNA定序來驗 證經次選殖之核酸序列》對於瞬間及穩定轉染，藉由自經 轉化之大腸桿菌培養物（Nucleobond AX, Macherey-Nagel) 進行質體製備來製備較大量之質體。 實例3

在與IGF-1R特異性結合之重鏈及輕鏈中恆定域VL及VH經 彼此置換之雙特異性雙價<ANGPT2-IGF-1R>抗體（本文中 縮寫為<ANGPT2 IGF-1R> VL-VH交換抗體）的表現 實例3A <IGF-1R> VL-VH交換抗體及<ANGPT2>野生型抗體在 HEK293 EBNA細胞中之瞬間共同表現及純化以得到雙特 異性<ANGPT2-IGF-1R> VL-VH交換抗體 為產生經由一側之<IGF-1R> VL-VH交換抗體Fab識別 IGF-1R且經由另一側之<ANGPT2>野生型Fab區識別 <ANGPT2>之功能性雙特異性抗體，將編碼<IGF-1R> VL-VH交換抗體之兩個表現質體（實例1A)與編碼<ANGPT2>野 生型抗體之兩個表現質體（實例2A)—起共同表現。假設野 生型重鏈HC與VL-VH交換重鏈HC**產生統計上之締合， 由此產生雙特異性且雙價之〈IGF-1R-ANGPT2> VL-VH交 換抗體。在假設兩種抗體得以同等充分表現且不考慮副產 物之情況下，此應產生1:2:1比率之三種主要產物： 136473.doc •49- 1359027 A)<IGF-1R> VL-VH 交換抗體，B)雙特異性 <IGF-1R-ANGPT2> VL-VH交換抗體，及C)<ANGPT2>野生型抗 體。可預期若干種副產物。然而，由於僅VL-VH域交換， 因此副產物之頻率與完全Fab交換相比應減小。請注意， 由於<ANGPT2>野生型抗體顯示比<IGF-1R>野生型抗體及 <IGF-1R> VL-VH交換抗體高之表現瞬間表現量，因此 <ANGPT2>野生型抗體質體與<IGF-1R> VL-VH交換抗體質 體之比率向有利於<ANGPT2>野生型抗體之表現移動。 為產生主要產物A)<IGF-1R> VL-VH交換抗體、B)雙特 異性 <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH 交換抗體及 C)<ANGPT2> 野生型抗體之混合物，如上文所述在懸浮HEK293-F細胞 中瞬間共同轉染四種質體PUC-HC**-IGF-1R及pUC-LC**-IGF-1R 及質體 SB04-pUC-HC-ANGPT2 及 SB06-pUC-LC-ANGPT2。所收集之上清液含有主要產物A)<IGF-1R> VL-VH交換抗體、B)雙特異性<ANGPT2-IGF-1R> VL-VH交換 抗體及C)<ANGPT2>野生型抗體之混合物且表示為"雙特異 性VL-VH交換混合物"。藉由離心收集含有雙特異性VL-VH交換混合物之細胞培養物上清液且隨後如上文所述進 行純化。 如所述藉由在存在及不存在還原劑之情況下進行SDS-PAGE且隨後用庫馬斯亮藍染色且藉由尺寸排除層析來分 析抗體混合物之完整性。SDS-PAGE顯示如預期有2種不同 重鏈及輕鏈存在於製劑中（還原凝膠）（圖14)。提供經表徵 之樣本用於後續蛋白質分析及功能表徵。 136473.doc -50- 1359027

實例3B 在細胞FACS橋接檢定中針對124 IGF-1R表現細胞偵測功 能性雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體 為確證在來自實例3A中所述之瞬間共同表現的主要產物 A)<IGF-1R>VL-VH交換抗體、B)雙特異性〈ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體及C)<ANGPT2>野生型抗體之經純化 雙特異性VL-VH交換混合物中功能性雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體的存在，進行針對124細胞（表現 重組人類IGF-1R之NIH3T3細胞，Roche)之細胞FACS IGF-1R-ANGPT2橋接檢定。檢定原理描繪於圖10中。存在於經 純化抗體混合物中之雙特異性<ANGPT2-IGF-1 R>VL-VH交 換抗體能夠同時與124細胞中之IGF-1R且與ANGPT2結合； 且由此將以兩個相對F ab區橋接其兩種乾抗原。 簡言之，將每個FACS管5xl0E5個124細胞與整個經純化 抗體混合物一起培育且在冰上培育1小時（滴定160微克/毫 升混合物）。將各別經純化抗體野生型<IGF-1R>及 <ANGPT2>作為對照施力α於124細胞。用4 ml冰冷PBS (Gibco)+2°/〇 FCS(Gibco)洗去未結合之抗體，將細胞離心 (以400 g，5分鐘）且在冰上用50 μΐ 2 pg/mL人類ANGPT2 (R&D Systems)偵測經結合之雙特異性抗體歷時1小時。隨 後，將未結合之ANGPT2用4 ml冰冷PBS(Gibco) + 2°/〇 FCS(Gibco)洗滌一次或兩次以除去，將細胞離心（以400 g，5分鐘）且在冰上用 50 μΐ 5 gg/mL<ANGPT2> mlgGl-生 物素抗體（BAM0981，R&D Systems)偵測經結合之ANGPT2 136473.doc 1359027 歷時45分鐘；或者，將細胞與50 μΐ 5 pg/mL mlgGl-生物 素-同型對照（R&D Systems) —起培育。用4 ml冰冷 PBS(Gibco)+2% FCS(Gibco)洗去未結合之偵測抗體，將細 胞離心（以400 g，5分鐘）且在避光下於冰上用50 μΐ 1:400 抗生蛋白鏈菌素-PE結合物（ΙηνΗΓί^εη/Ζγπ^ίΐχ貞測經結合 之偵測抗體歷時45分鐘。用4 ml冰冷PBS+2% FCS洗去未 結合之抗生蛋白鏈菌素-PE結合物。隨後，將細胞離心（5 min，400 g)，再懸浮於 300-500 pL PBS 中且在 FACSCalibur(BDFL2通道，每次擷取為10,000個細胞）上量 化經結合之抗生蛋白鏈菌素-PE結合物。實驗期間，包括 各別同型對照以排除任何非特異性結合。另外，包括經純 化單特異性雙價IgGl抗體<IGF-1R>及<ANGPT2>作為對 昭〇 圖15中之結果顯示與來自交換抗體（<IGF-1R> VL-VH交 換抗體）與野生型抗體（<ANGPT2>野生型抗體）共同表現之 經純化抗體交換混合物（<ANGPT2-IGF-1R> VL-VH交換抗 體）一起培育引起螢光顯著偏移，其指示能夠同時與124細 胞中之IGF-1R且與ANGPT2結合之功能性雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH交換抗體存在；且由此以兩個 相對Fab區橋接其兩種靶抗原。與此相對，各別<IGF-1R> 及<Ang-2>對照抗體在FACS橋接檢定中不會引起螢光偏 移。 總而言之，此等資料顯示藉由共同表現各別野生型質體 及交換質體，可產生功能性雙特異性抗體。正確雙特異性 136473.doc -52. 1359027 抗體之產量可藉由（例如）使用杵入臼技術以及雙硫鍵穩定 化（參見實例4)促使野生型重鏈及經修飾交換重鏈正確異源 二聚而增加。 實例4 具有經修飾CH3域（杵入臼）之雙價雙特異性<ANGPT2-IGF-1R> VL-VH交換抗體的表現 為進一步改良雙特異性〈ANGPT2-IGF-1 R> VL-VH交換 抗體之產量，將杵入臼技術應用於<IGF-1R> VL-VH交換 抗體及野生型<ANGPT2>抗體之共同表現以獲得均質且具 功能性之雙特異性抗體製劑。出於此目的，使<IGF-1R> VL-VH交換抗體之重鏈* HC*中之CH3域經具有T366W交 換之SEQ ID NO: 8之CH3域（杵）置換且使野生型 <ANGPT2>抗體之重鏈中之CH3域經具有T366S、L368A、 Y407V交換之SEQ ID NO: 9之CH3域（臼）置換，或反之亦 然。另外，可包括雙硫鍵以增加穩定性及產量以及形成離 子橋且增加異源二聚產量之額外殘基（EP 1870459A1)。 如實例3中所述進行所得具有經修飾CH3域（杵入白）之雙 價雙特異性<ANGPT2-IGF-1R> VL-VH交換抗體的瞬間共 同表現及純化。 請注意，異源二聚之最優化可（例如）藉由使用不同杵入 臼技術達成，該等技術諸如將額外雙疏橋引入CH3域中（例 如將Y349C引入"杵鏈"中及將D356C引入"臼鏈"中）及/或與 由 EP 1870459A1 所述之殘基 R409D、K370E(K409D)(對於 杵殘基）及D399K、E357K(對於白殘基）的使用組合。 136473.doc -53- 1359027 【圖式簡單說明】 圏1具有包含典型次序之可變域及恆定域之兩對重鏈與 輕鏈的對一種抗原具特異性之天然產生完整抗體IgG之示 意圖。 圖2包含以下各者之雙價雙特異性抗體之示意圖：幻與 第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈；及b)與第二抗 原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈，其中可變域VL及VH 經彼此置換。 囡3包含以下各者之雙價雙特異性抗體之示意圖：a)與 第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈；及b)與第二抗 原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈，其中可變域VL及vh 經彼此置換’且其中兩條重鏈之CH3域係由杵入臼技術而 改變。 圓4包含以下各者之雙價雙特異性抗體之示意圖：3)與 第一抗原特異性結合之抗體之輕鍵及重鏈；及b)與第二抗 原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈，其中可變域VL及VH 經彼此置換，且其中兩條重鏈之怪定重鏈域CH3中之一者 經亙疋重鏈域CH1置換；且另一個恆定重鍵域CH3經恆定 輕鏈域CL置換。 圓5 <IGF-1R> VL-VH交換抗體之重鏈** <IGF1R> HC**之蛋白質序列圖解。 圓6 <IGF-1R> VL-VH交換抗體（具有κ恆定輕鏈域CL)之 輕鏈"<IGF-1R〉LC“之蛋白質序列圖解。 圓 7 重鏈<IGF_lR> HC"* 表現載體 pUcHc“*_iGF_ 136473.doc •54- 1359027 序列表 <πο>瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120>雙價雙特異性抗體 <130> 24678 ΕΡ <140> 097149168 <141> 2008-12-17 <150> ΕΡ 07024864 <151〉 2007-12-21 <160> 12 <170> Patentln version 3.2

<210> 1 <211> 467 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>野生型<IGF-1R>·^體重鏈之胺基酸序列 <400> 1

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15

Val Gin Cys Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Gin Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala lie 工le Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 115 120 125 136473-序列表.doc 1359027

Arg Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His 210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly .245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 340 345 350 2 136473-序列表,doc 1359027

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460

Pro Gly Lys 465 <210> 2 <211> 235 <212> PRT <213> 人工 <220>

<223>野生型<10厂111>抗體輕鏈之胺基酸序列 <400> 2

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 136473-序列表.doc 1359027

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110

Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 19〇

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> 人工 <220>

<223> <IGF-1R>VL-VH交換抗體之重鏈*** (HCm)之胺基酸序列，其中重鏈域VH經輕 鏈域VL置換-變異體A 136473-序列表.doc 1359027 <400> 3

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110

Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Ser Val Ser 115 120 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135 140

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 145 150 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 165 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 180 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 195 200 205 136473-序列表doc 1359027

Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 210 215 220

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 290 295 300

Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315 320

Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 325 330 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys 340 345 350

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 355 360 365

Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 385 390 395 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 420 425 430 •6 136473-序列表.doc 1359027

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 4 <211> 243 <212> PRT <213> 人工 <220>

<223> <IGF-1R>VL-VH交換抗體之輕鏈*** (LC***)之胺基酸序列，其中輕鏈域VL經重 鏈域VH置換-變異體A <400> 4

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15

Val Gin Cys Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Gin Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala lie lie Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 115 120 125

Arg Gly Thr Leu Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 130 135 140 136473-序列表.doc 1359027

Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 145 150 155 160

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 165 170 175

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val 180 185 190

Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 195 200 205

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 210 215 220

Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 225 230 235 240

Gly Glu Cys <210> 5 <211> 557 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> IGF-1R胞外域His-抗生蛋白鏈菌素結合肽-標籤（IGF_1R-His-SBPECD)之胺基酸序列 <400> 5

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 15 10 15

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu lie 20 25 30

Cys Gly Pro Gly lie Asp lie Arg Asn Asp Tyr Gin Gin Leu Lys Arg 35 40 45

Leu Glu Asn Cys Thr Val lie Glu Gly Tyr Leu His lie Leu Leu lie 50 55 60

Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 136473·序列表.doe 1359027 65 70 75 80 lie Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95

Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val lie Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110

Tyr Asn Tyr Ala Leu Val lie Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp lie 115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn lie Thr Arg Gly Ala lie Arg lie Glu 130 135 140

Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu lie 145 150 155 160

Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr lie Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175

Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 , 185 190

Glu Lys Thr Thr lie Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205

Asn Arg Cys Gin Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220

Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255

Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270

Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn lie Leu Ser Ala 275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val lie His Asp Gly Glu Cys Met 9· 136473-序列表.doc 290 295 300

Gin Glu Cys Pro Ser Gly Phe lie Arg Asn Gly Ser Gin Ser Met Tyr 305 310 315 320

Cys lie Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335

Lys Thr Lys Thr lie Asp Ser Val Thr Ser Ala Gin Met Leu Gin Gly 340 345 350

Cys Thr lie Phe Lys Gly Asn Leu Leu lie Asn lie Arg Arg Gly Asn 355 360 365

Asn lie Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu lie Glu Val Val 370 375 380

Thr Gly Tyr Val Lys lie Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400

Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu lie Leu Gly Glu Glu Gin Leu Glu Gly 405 410 415

Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gin Asn Leu Gin Gin Leu Trp 420 425 430 IKsp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr lie Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445

Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu lie Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gin Ser Lys Gly Asp lie Asn Thr Arg 465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Ala Ala Ala Leu 485 490 495

Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro Gly Thr His His His His His His Ser 500 505 510

Gly Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly 10- 136473·序列表.doe 1359027 515 520 525

Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro 530 535 540

Gin Gly Gin Arg Glu Pro Ser Gly Gly Cys Lys Leu Gly 545 550 555 <210> 6 <211> 471 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗體重鏈之胺基酸序列

<400> 6

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Glu Gly 1 5 10 15

Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr lie Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 7\xg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp lie Leu Thr Gly Tyr 115 120 125

Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 .11 - 136473·序列表,doc 1359027

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala 165

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 170

Pro Glu 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 195 200

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 205

Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys 220

Val Val Thr Val 210

Pro Ser Ser Ser 215

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 355 360 365 -12· 136473-序列表.doc 1359027

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 7 <211> 219 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>野生型血管生成素-2<^0?72>抗體輕鏈之胺基酸序列 <400> 7

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 13· 136473-序列表,doc 1359027

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 90 95

Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>用於杵入臼技術之具有T366W交換之CH3域（杵）的胺基酸序列 <400> 8

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 15 10 15 • 14· 136473-序列表.doc 1359027

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>用於杵入臼技術之具有T366S、L368A、Y407V交換之CH3域（臼）的胺基酸序列 <400> 9

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 15 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe 20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 15- 136473-序列表.doc 1359027 85 90 95

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 10 <211> 440 <212> PRT <213> 人工 <220>

<223> <IGF-1R>VL-VH交換抗體之重鏈*« (HC*°)之胺基酸序列，其中重鏈域VH經輕 鏈域VL置換-變異體B <400> 10

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Ser Ser Ala Ser 100 105 110

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 115 120 125

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 16- 136473·序列表.doc 1359027 145 150 155 160

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 180 185 190

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 195 200 205

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 275 280 285

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 305 310 315 320

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 325 330 335

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 340 345 350

Lys Asn Gin Val 355

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 360 365

Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr •17· 136473-序列表.doc 1359027 370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 11 <211〉 225 <212> PRT <213> 人工 <220>

<223> <Κ}Ρ·1ΙΙ>νί·νΗ交換抗體之輕鏈*« (LC***)之胺基酸序列，其中輕鏈域VL經重 鏈域VH置換-變異體B <400> 11

Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Gin Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala lie lie Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 18- 136473·序列表.doc 1359027 100 105 110

Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie 115 120 125

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 130 135 140

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 145 150 155 160

Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 165 170 175

Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 180 185 190

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 195 200 205

His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 210 215 220

Cys 225 <210> 12 <211> 557

<212> PRT <213> 人工 <220> <223> IGF-1R胞外域His-抗生蛋白鏈菌素結合肽-標籤（IGF-IR-His-SBPECD)之胺基酸序列 <400> 12

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 15 10 15

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu lie 20 25 30

Cys Gly Pro Gly lie Asp lie Arg Asn Asp Tyr Gin Gin Leu Lys Arg 35 40 45 -19· 136473·序列表.doc 1359027

Leu Glu Asn Cys Thr Val lie Glu Gly Tyr Leu His lie Leu Leu lie 50 55 60

Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 lie Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95

Gly TVsp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val lie Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110

Tyr Asn Tyr Ala Leu Val lie Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp lie 115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn lie Thr Arg Gly Ala lie Arg lie Glu 130 135 140

Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu lie 145 150 155 160

Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr lie Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175

Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190

Glu Lys Thr Thr lie Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205

Asn Arg Cys Gin Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220

Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255

Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 -20- 136473-序列表.doc 1359027

Gly Trp Arg Cys Val Asp. Arg Asp Phe Cys Ala Asn lie Leu Ser Ala 275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val lie His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300

Gin Glu Cys Pro Ser Gly Phe lie Arg Asn Gly Ser Gin Ser Met Tyr 305 310 315 320

Cys lie Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335

Lys Thr Lys Thr lie Asp Ser Val Thr Ser Ala Gin Met Leu Gin Gly 340 345 350

Cys Thr lie Phe Lys Gly Asn Leu Leu lie Asn lie Arg Arg Gly Asn 355 360 365

Asn lie Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu lie Glu Val Val 370 375 380

Thr Gly Tyr Val Lys lie Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400

Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu lie Leu Gly Glu Glu Gin Leu Glu Gly 405 410 415

Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gin Asn Leu Gin Gin Leu Trp 420 425 430

Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr lie Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445

Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu lie Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gin Ser Lys Gly Asp lie Asn Thr Arg 465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Ala Ala Ma Leu 485 490 495 •21 - 136473-序列表.doc 1359027

Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro Gly Thr His His His His His His Ser 500 505 510

Gly Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly 515 520 525

Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro 530 535 540

Gin Gly Gin Arg Glu Pro Ser Gly Gly Cys Lys Leu Gly 545 550 555

22- 136473-序列表.doc

Claims (1)

1359027 年修'正本I第097149168號專利申請案 -------5中文申請專利範圍替換本(100年12月） 十、申請專利範圍： 1. 一種雙價雙特異性抗體，其包含： a) 與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈；及 b) 與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈，其中 可變域VL及VH互相置換。 2.如請求項1之抗體，其特徵在於： 一條重鏈之CH3域及另一條重鏈之CH3域各在一個包 含該等抗體CH3域之間的原始界面之界面會合（meet);

其中該界面經改變以促進該雙價雙特異性抗體形成， 其中該改變之特徵在於： a)—條重鏈之CH3域經改變， 使得在該雙價雙特異性抗體内會合另一條重鏈CH3域 之原始界面的一條重鏈CH3域之原始界面内，一個胺基 酸殘基經一個具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，進 而在一條重鏈CH3域之界面内產生一個隆凸，該隆凸可 位於另一條重鏈CH3域之界面内之一個空腔中；

公告本 及 b)另一條重鏈之CH3域經改變， 使得在該雙價雙特異性抗體内會合第一 CH3域之原始 界面的第二CH3域之原始界面内，一個胺基酸殘基經一 個具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，進而在該第二 CH3域之界面内產生一個空腔，該第一 CH3域之界面内 之一個隆凸可位於該空腔内。 3.如請求項2之抗體，其特徵在於： 136473-1001212.doc 1359027 該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基係選自由精胺酸 (R)、苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸（W)組成之群。 4. 如請求項2或3中任一項之抗體，其特徵在於： 該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基係選自由丙胺酸 (A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)組成之群。 5. 如請求項2或3中任一項之抗體，其特徵在於： 兩個CH3域係藉由在各CH3域之相應位置中引入半胱 胺酸（C)胺基酸而進一步改變。 6. 如請求項1之抗體，其特徵在於： 兩條重鏈之恆定重鏈域CH3之一經一個恆定重鏈域 CH1置換；另一個恆定重鏈域CH3經一個恆定輕鏈域cl 置換。 7. 一種製備如請求項1之雙價雙特異性抗體之方法，其包 含以下步驟： a) 用以下載體轉化宿主細胞： -包含編碼與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 的核酸分子的載體， -包含編碼與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 的核酸分子的載體，其中可變域VL&VH互相置換； b) 該宿主細胞在允許該抗體分子合成之條件下培養；及 c) 自該培養物回收該抗體分子。 8. 一種宿主細胞’其包含： -包含編碼與第一抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 的核酸分子的載體； 136473-1001212.doc 1359027 -包含編碼與第二抗原特異性結合之抗體之輕鏈及重鏈 ' 的核酸分子的載體，其中可變域VL及VH互相置換。 - 9. 一種組合物，其包含如請求項1至6中任一項之雙價雙特 異性抗體。 10. 如請求項9之組合物，其係诊斷組合物或醫藥組合物。 11. 如請求項9之組合物，其係醫藥組合物，包含如請求項1 至6中任一項之雙價雙特異性抗體及至少一種醫藥上可 接受之賦形劑。

136473-1001212.doc 1359027 第U97149168號專利申請案 中文圖式替換頁（100玍12月） EC50 305 pM

:::EC50 165 pM

野生i<IGF-]R>抗體與 IGF-1R-ECD 之結合 <IGF-1R> VL-VH交換抗體與 IGIMR-ECD之結合 圖13

Da 50 1· Do J00，Da "5 KDa rJj kDa Da J5 kDs /0 kDa 還原 非還原 SDS-PAGE 圖14 136473-iig-10〇]2]2.doc •10- 1359027 第097149168號專利申請案 中文圖式替換頁Π00车丨2月）

136473-fig-1001212.doc

圖15