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CN111527107B - 结合hla-a2/wt1的抗体 - Google Patents

结合hla-a2/wt1的抗体 Download PDF

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CN111527107B CN201880081252.8A CN201880081252A CN111527107B CN 111527107 B CN111527107 B CN 111527107B CN 201880081252 A CN201880081252 A CN 201880081252A CN 111527107 B CN111527107 B CN 111527107B
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Abstract

本发明一般涉及结合HLA‑A2/WT1的抗体,包括双特异性抗原结合分子,例如用于活化T细胞。另外,本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸,以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该抗体的方法,以及在疾病的治疗中使用它们的方法。

Description

结合HLA-A2/WT1的抗体
发明领域
本发明一般涉及结合HLA-A2/WT1的抗体,包括双特异性抗原结合分子,例如用于活化T细胞。另外,本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸,以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该抗体的方法,以及在疾病的治疗中使用它们的方法。
发明背景
WT1(威尔姆斯瘤1,威尔姆斯瘤蛋白)是一种牵涉细胞增殖,分化,以及凋亡和器官发育的致癌转录因子,其在正常成人组织中的表达是罕见的(Hinrichs and Restifo,NatBiotechnol(2013)31,999-1008)。然而,WT1据报告在数种类型的血液学恶性和多种实体瘤中过表达(Van Driessche et al.,Oncologist(2012)17,250-259)。WT1是一种细胞内定位的核蛋白。细胞内蛋白质能在蛋白酶体中降解,加工和由主要组织相容性复合物(MHC)I呈递在细胞表面上作为T细胞表位,和受到T细胞受体(TCR)识别。因此,WT1衍生肽(诸如WT1RMF(RMFPNAPYL)和WT1VLD(VLDFAPPGA))在细胞表面上在HLA-A2的背景中呈递且能触发T细胞识别。
已经采取数种办法来利用WT1作为癌症(免疫)疗法的靶物,包括开发基于WT1衍生肽的癌症疫苗和过继性T细胞转移或WT1特异性T细胞。还已经生成针对HLA-A2/WT1RMF复合物的TCR样抗体,包括其双特异性衍生物(Dao et al.,Sci Transl Med(2013)5,176ra33；WO2012/135854；Dao et al.,Nat Biotechnol(2015)33,1079-1086；WO 2015/070061；WO2017/060201)。
结合靶细胞上的表面抗原和T细胞上的激活性T细胞抗原(诸如CD3)的双特异性抗体(在本文中也称作T细胞双特异性抗体或“TCB”)对于多种癌症的治疗具有广阔前景。此类抗体对它的两种靶物的同时结合会迫使靶细胞和T细胞之间的暂时相互作用,引起T细胞受体的交联和随后任何细胞毒性T细胞的激活和随后靶细胞的裂解。鉴于它们在靶细胞杀伤中的效力,靶物的选择和靶向性抗体的特异性对于T细胞双特异性抗体避免上和脱靶毒性是最为重要的。细胞内蛋白质(诸如WT1)代表有吸引力的靶物,但是仅仅对结合在细胞表面上呈递自细胞内蛋白质衍生的肽抗原的主要组织相容性复合物(MHC)的T细胞受体(TCR)样抗体可及。TCR样抗体的一个内在问题是与MHC分子本身或呈递除了期望肽以外的肽的MHC分子的潜在交叉反应性,这可能损害器官或组织选择性。
发明概述
本发明提供新颖的抗体,包括双特异性抗体,其结合HLA-A2/WT1且具有对于治疗目的特别有利的特性。
本发明人开发了新颖的结合HLA-A2/WT1的抗体,其具有出乎意料的,改善的特性。特别地,该抗体以优秀的亲和力和惊人的特异性结合HLA-A2/WT1。而且,发明人开发了结合HLA-A2/WT1和激活性T细胞抗原的双特异性抗原结合分子,掺入该新颖的HLA-A2/WT1抗体并组合优秀的功效和生产力与低的毒性和有利的药动学特性。
在第一个方面,本发明提供一种结合HLA-A2/WT1的抗体,其中该抗体包含(i)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:9的HCDR 1,SEQ ID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:12的LCDR 1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:17的HCDR 1,SEQ ID NO:18的HCDR 2,和SEQ ID NO:19的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:20的LCDR 1,SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:25的HCDR 1,SEQ ID NO:26的HCDR 2,和SEQ ID NO:27的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:28的LCDR 1,SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3的VL；
(v)包含SEQ ID NO:33的HCDR 1,SEQ ID NO:34的HCDR 2,和SEQ ID NO:35的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:36的LCDR 1,SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3的VL；
(vi)包含SEQ ID NO:41的HCDR 1,SEQ ID NO:42的HCDR 2,和SEQ ID NO:43的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:44的LCDR 1,SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3的VL；
(vii)包含SEQ ID NO:49的HCDR 1,SEQ ID NO:50的HCDR 2,和SEQ ID NO:51的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:52的LCDR 1,SEQ ID NO:53的LCDR 2和SEQ ID NO:54的LCDR 3的VL；
(viii)包含SEQ ID NO:57的HCDR 1,SEQ ID NO:58的HCDR 2,和SEQ ID NO:59的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:60的LCDR 1,SEQ ID NO:61的LCDR 2和SEQ ID NO:62的LCDR 3的VL；或
(ix)包含SEQ ID NO:65的HCDR 1,SEQ ID NO:66的HCDR 2,和SEQ ID NO:67的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:68的LCDR 1,SEQ ID NO:69的LCDR 2和SEQ ID NO:70的LCDR 3的VL。
在一个实施方案中,该抗体包含
(i)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(ii)包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iii)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iv)包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(v)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vi)包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vii)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(viii)包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；或
(ix)包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,该抗体是IgG,特别是IgG1抗体。在一个实施方案中,该抗体是全长抗体。在另一个实施方案中,该抗体是选自Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab')2分子的组的抗体片段。在一个实施方案中,该抗体是多特异性抗体。
本发明还提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中该第一抗原是HLA-A2/WT1且该第一抗原结合模块包含
(i)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:9的HCDR 1,SEQ ID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:12的LCDR 1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:17的HCDR 1,SEQ ID NO:18的HCDR 2,和SEQ ID NO:19的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:20的LCDR 1,SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:25的HCDR 1,SEQ ID NO:26的HCDR 2,和SEQ ID NO:27的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:28的LCDR 1,SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3的VL；
(v)包含SEQ ID NO:33的HCDR 1,SEQ ID NO:34的HCDR 2,和SEQ ID NO:35的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:36的LCDR 1,SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3的VL；
(vi)包含SEQ ID NO:41的HCDR 1,SEQ ID NO:42的HCDR 2,和SEQ ID NO:43的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:44的LCDR 1,SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3的VL；
(vii)包含SEQ ID NO:49的HCDR 1,SEQ ID NO:50的HCDR 2,和SEQ ID NO:51的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:52的LCDR 1,SEQ ID NO:53的LCDR 2和SEQ ID NO:54的LCDR 3的VL；
(viii)包含SEQ ID NO:57的HCDR 1,SEQ ID NO:58的HCDR 2,和SEQ ID NO:59的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:60的LCDR 1,SEQ ID NO:61的LCDR 2和SEQ ID NO:62的LCDR 3的VL；或
(ix)包含SEQ ID NO:65的HCDR 1,SEQ ID NO:66的HCDR 2,和SEQ ID NO:67的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:68的LCDR 1,SEQ ID NO:69的LCDR 2和SEQ ID NO:70的LCDR 3的VL,和
(b)特异性结合第二抗原的第二抗原结合模块。
在一个实施方案中,该第一抗原结合模块包含
(i)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(ii)包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iii)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iv)包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(v)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vi)包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vii)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(viii)包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；或
(ix)包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,该第二抗原是CD3,特别是CD3ε。在一个实施方案中,该第二抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:115的HCDR 1,SEQ ID NO:116的HCDR 2,和SEQ ID NO:117的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:118的LCDR 1,SEQ ID NO:119的LCDR 2和SEQ ID NO:120的LCDR 3的VL。在一个实施方案中,该第二抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第二抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个实施方案中,该第一和/或该第二抗原结合模块是Fab分子。在一个实施方案中,该第二抗原结合模块是Fab分子,其中Fab轻链且Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1,特别是可变域VL和VH是彼此替换的。在一个实施方案中,该第一抗原结合模块是Fab分子,其中在恒定域中位置124处的氨基酸是用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代的(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸是用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代的(编号方式依照Kabat),且在恒定域CH1中位置147处的氨基酸是用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代的(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸是用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代的(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个实施方案中,该第一和该第二抗原结合模块彼此融合,任选经由肽接头。在一个实施方案中,该第一和该第二抗原结合模块各自是Fab分子且或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端,或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合模块。在一个实施方案中,该第三抗原模块与该第一抗原结合模块同一。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含由第一和第二亚基构成的Fc域。在一个实施方案中,该第一,该第二和,在存在的情况中,该第三抗原结合模块各自是Fab分子；且或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端且该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端；且该第三抗原结合模块,在存在的情况中,在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。在一个实施方案中,该Fc域是IgG,特别是IgG1 Fc域。在一个实施方案中,该Fc域是人Fc域。在一个实施方案中,该Fc域的第一亚基的CH3域中的一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成隆起,该隆起可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中,且该Fc域的第二亚基的CH3域中的一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,该空腔内可安置第一亚基的CH3域内的隆起。在一个实施方案中,该Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。
依照本发明的另一个方面,提供有一种或多种分离的多核苷酸,其编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。本发明进一步提供一种或多种表达载体,其包含本发明的分离的多核苷酸,和一种宿主细胞,其包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体。在一些实施方案中,该宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。
在另一个方面提供一种生成结合HLA-A2/WT1的抗体的方法,其包含下述步骤:a)在适合于该抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞,并b)回收该抗体。本发明还涵盖一种结合HLA-A2/WT1的抗体,其通过本发明的方法生成。
本发明进一步提供一种药学组合物,其包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子和药学可接受载剂。
本发明还涵盖的是使用本发明的抗体,双特异性抗原结合分子和药学组合物的方法。在一个方面,本发明提供依照本发明的抗体,双特异性抗原结合分子或药学组合物,其用作药物。在一个方面提供依照本发明的抗体,双特异性抗原结合分子或药学组合物,其用于治疗疾病。在一个具体实施方案中,该疾病是癌症。
还提供的是依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子制造用于治疗疾病的药物的用途；以及一种治疗个体中的疾病的方法,其包含对所述个体施用治疗性有效量的包含药学可接受形式的依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的组合物。在一个具体实施方案中,该疾病是癌症。在任何上述实施方案中,该个体优选是哺乳动物,特别是人。
附图简述
图1。本发明的双特异性抗原结合分子的例示性构造。(A,D)“1+1CrossMab”分子的示图。(B,E)“2+1IgG Crossfab”分子的示图,其具有备选(alternative)次序的Crossfab和Fab构件(“倒转的”)。(C,F)“2+1IgG Crossfab”分子的示图。(G,K)“1+1IgG Crossfab”分子的示图,其具有备选(alternative)次序的Crossfab和Fab构件(“倒转的”)。(H,L)“1+1IgGCrossfab”分子的示图。(I,M)“2+1IgG Crossfab”分子的示图,其具有两个CrossFab。(J,N)“2+1IgG Crossfab”分子的示图,其具有两个CrossFab和备选(alternative)次序的Crossfab和Fab构件(“倒转的”)。(O,S)“Fab-Crossfab”分子的示图。(P,T)“Crossfab-Fab”分子的示图。(Q,U)“(Fab)2-Crossfab”分子的示图。(R,V)“Crossfab-(Fab)2”分子的示图。(W,Y)“Fab-(Crossfab)2”分子的示图。(X,Z)“(Crossfab)2-Fab”分子的示图。黑点:任选的Fc域中促进异二聚化的修饰。++,--:CH1和CL域中任选引入的相反电荷的氨基酸。Crossfab分子描绘为包含VH和VL区交换,但是在其中在CH1和CL域中没有引入电荷修饰的实施方案中可以备选地包含CH1和CL域的交换。
图2。实施例中制备的T细胞双特异性(TCB)抗体分子的图示。作为有电荷修饰的“2+1IgG CrossFab,倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换,WT1结合物中的电荷修饰,EE＝147E,213E；RK＝123R,124K)制备所有测试的TCB抗体分子。
图3。HLA-A2/WT1 IgG抗体对经肽脉冲的T2细胞的结合。(A)11D06IgG,(B)33H09-IgG,(C)11B09-IgG,(D)13B04-IgG,(E)5E11-IgG,(F)5C01-IgG,(G)11G06-IgG。
图4。结合经肽脉冲的T2细胞后HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)对T细胞的激活(NFAT报告物测定法)。(A)11D06-TCB,(B)33H09-TCB,(C)11B09-TCB,(D)13B04-TCB,(E)ESK1-TCB,(F)5E11-TCB。(G)5C01-TCB,(H)DP47GS-TCB。
图5。由HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)介导的对经肽脉冲的T2细胞的杀伤。(A)11D06-TCB,(B)33H09-TCB,(C)13B04-TCB,(D)11B09-TCB,(E)33F05-TCB,(F)5C01-TCB。
图6。由HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)介导的对HLA-A2+WT1+肿瘤细胞系的杀伤。(A)细胞系的概览。(B-E)(B)11D06-TCB,(C)33H09-TCB,(D)11B09-TCB,(E)13B04-TCB对细胞系的杀伤。(F)不同TCB对SKM-1细胞的杀伤。(G)不同TCB对BJAB细胞的杀伤。
图7。结合HLA-A2+WT1+肿瘤细胞系后HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)对T细胞的激活。(A)SKM-1细胞,(B)BJAB细胞。
图8。选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)不结合脱靶肽。(A-C)(A)11D06-TCB,(B)33H09-TCB,(C)ESK1-TCB对经肽脉冲的T2细胞的结合。(D-E)结合经肽脉冲的T2细胞后(D)11D06-TCB和(E)33H09-TCB对T细胞的激活。(F)肽的概览。
图9。选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)不结合另外的脱靶肽。(A-B)结合经肽脉冲的T2细胞后(A)11D06-TCB和(B)33H09-TCB对T细胞的激活。与RMF肽一起测试6种所示脱靶肽。(C-G)(C,E)11D06-TCB,(D,F)33H09-TCB和(G)ESK1-TCB对经肽脉冲的T2细胞的杀伤。与RMF和VLD肽一起测试19种所示脱靶肽。
图10。由选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)介导的对正常骨髓衍生的CD34+干细胞的不杀伤。(A)11D06-TCB,(B)33H09-TCB。
图11。RMF肽中对于选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)的结合残基通过丙氨酸扫描的鉴定。(A)RMF天然肽,(B)RMF R1Y肽,(C)RMF R1A肽,(D)RMF M2A肽,(E)RMF F3A肽,(F)RMF P4A肽,(G)RMF N5A肽,(H)RMF A6G肽,(I)RMF P7A肽,(J)RMF Y8A肽,(K)RMFL9A肽。(L)肽的概览。(M)EC50相对于RMF天然肽的EC50的倍数变化。(N)关键接触残基。
图12。NSG小鼠中单次注射后HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(11D06-TCB和33H09-TCB)的药动学概况。
图13。人源化小鼠中SKM-1异种移植物中HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)的功效研究。(A)研究设计。(B)处理组。(C)所有处理组中的肿瘤生长动力学(均值)。(D)媒介组中的单一肿瘤生长动力学。(E)11D06-TCB组中的单一肿瘤生长动力学。(F)33H09-TCB组中的单一肿瘤生长动力学。(G)统计学。基于第38天的计算(媒介作为对照组)。肿瘤生长抑制(TGI):TGI>100→肿瘤消退,TGI＝100→肿瘤停滞。处理对对照比(TCR):TCR＝1→无效果,TCR＝0→完全消退。
图14。HLA-A2/WT1抗体-pMHC复合物的晶体结构的概览。抗体(Fab片段)显示在顶部,重链着色深灰色且轻链着色浅灰色。未显示结晶的溶剂原子。(A)与HLA-A02/VLD pMHC复合的5C01 Fab的分辨率晶体结构。Fab-pMHC接触面积:肽贡献:(B)与HLA-A02/RMF pMHC复合的11D06 Fab的分辨率晶体结构。Fab-pMHC接触面积: 肽贡献:(C)与HLA-A02/RMF pMHC复合的ESK1 Fab的分辨率晶体结构(已发表,PDB ID 4WUU)。Fab-pMHC接触面积: 肽贡献:
图15。5C01 Fab-HLA-A2/WT1VLD pMHC结合界面的特写视图。突显了通过BIOVIADiscovery Studio 4.5鉴定的Fab和pMHC之间的必要化学相互作用。未显示溶剂原子。
图16。5C01 Fab残基(行)与HLA-A2/WT1VLD pMHC残基(列)的界面和相互作用矩阵。N＝近/邻近,H＝氢键,Pi＝π相互作用,SB＝盐桥。界面残基定义为在相互作用配偶缺失/存在下溶剂可及表面积经历变化的残基。
图17。11D06 Fab-HLA-A2/WT1RMF pMHC结合界面的特写视图。突显了通过BIOVIADiscovery Studio 4.5鉴定的Fab和pMHC之间的必要化学相互作用。未显示溶剂原子。
图18。11D06 Fab残基(行)与HLA-A2/WT1RMF pMHC残基(列)的界面和相互作用矩阵。N＝近/邻近,H＝氢键,Pi＝π相互作用,SB＝盐桥。界面残基定义为在相互作用配偶缺失/存在下溶剂可及表面积经历变化的残基。
图19。ESK1 Fab-HLA-A2/WT1RMF pMHC结合界面的特写视图(PDB ID 4WUU)。突显了通过BIOVIA Discovery Studio 4.5鉴定的Fab和pMHC之间的必要化学相互作用。未显示溶剂原子。
图20。ESK1 Fab残基(行)与HLA-A2/WT1RMF pMHC残基(列)的界面和相互作用矩阵。N＝近/邻近,H＝氢键,Pi＝π相互作用,SB＝盐桥。界面残基定义为在相互作用配偶缺失/存在下溶剂可及表面积经历变化的残基。
图21。由具有不同CD3结合物的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体介导的对HLA-A2+/WT1+SKM-1细胞的杀伤。
图22。由HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)介导的对经RMF肽脉冲的T2细胞的杀伤。
图23。HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)Aali-TCB(A),Daniel-TCB(B),ESK1-TCB(C)和11D06-TCB(D)对脱靶肽的结合的评估。
图24。NSG小鼠中单次注射后HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体11D06-TCB(V9)的药动学概况。
图25。人源化小鼠中SKM-1异种移植物中HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体11D06-TCB(V9)的功效研究。(A)所有处理组中的肿瘤生长动力学(均值)。(B)媒介组中的单一肿瘤生长动力学。(C)11D06-TCB(V9)组中的单一肿瘤生长动力学。(D)统计学。基于第48天的计算(媒介作为对照组)。肿瘤生长抑制(TGI):TGI>100→肿瘤消退,TGI＝100→肿瘤停滞。处理对对照比(TCR):TCR＝1→无效果,TCR＝0→完全消退。
图26。结合表达HLA-A02/WT1RMF pMHC复合物的CHO-K1细胞后HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(TCB)对T细胞的激活(NFAT报告物测定法)。实线:11D06-TCB(V9)(“2+1”格式)。虚线:“1+1CrossMab”格式的类似分子(11D06和V9结合物)。
发明详述
定义
除非在下文另外定义,术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。
如本文中使用的,术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白及其衍生物,例如片段。
术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常,双特异性抗原结合分子包含两种抗原结合位点,其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中,所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
如本文中使用的,术语“价”指抗原结合分子中规定数目的抗原结合位点的存在。因而,术语“对抗原的单价结合”指抗原结合分子中一个(且不超过一个)特异于抗原的抗原结合位点的存在。
“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点,即一个或多个氨基酸残基。例如,抗体的抗原结合位点包含来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点,Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文中使用的,术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中,抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如第二抗原结合模块)引导至靶部位,例如至特定类型的携有抗原性决定簇的肿瘤细胞。在另一个实施方案中,抗原结合模块能够经由其靶抗原例如T细胞受体复合物抗原来激活信号传导。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中,抗原结合模块可以包含抗体恒定区,如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任何一种:α,δ,ε,γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下2种同种型中的任何一种:κ和λ。
如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”或“抗原”指多肽大分子上与抗原结合模块结合,从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上,病毒感染的细胞的表面上,其它患病细胞的表面上,免疫细胞的表面上,游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。
术语“表位”表示抗原(或是蛋白质性质的或是非蛋白质性质的)上受到抗原结合模块结合的位点。表位可以自连续氨基酸串(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位),例如因抗原的折叠(即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠)而变成空间接近。线性表位典型地在蛋白质性质的抗原暴露于变性剂之后仍然受到抗原结合模块结合,而构象表位典型地在用变性剂处理之后遭到破坏。表位包含处于独特空间构象的至少3,至少4,至少5,至少6,至少7,或8-10个氨基酸。
除非另外指示,“CD3”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD3。该术语涵盖“全长”,未加工的CD3以及起因于细胞中加工的CD3的任何形式。该术语还涵盖CD3的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,CD3是人CD3,特别是人CD3的厄普西隆亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(版本189),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1。还见SEQ ID NO:107。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列显示于NCBI GenBank no.BAB71849.1。还见SEQID NO:108。
除非另外指示,“WT1”,也称作“威尔姆斯瘤1”或“威尔姆斯瘤蛋白”,指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然WT1。该术语涵盖“全长”,未加工的WT1以及起因于细胞中加工的WT1的任何形式。该术语还涵盖WT1的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,WT1是人WT1,特别是SEQ ID NO:106的蛋白。人WT1描述于UniProt(www.uniprot.org)登录号P19544(条目版本215),而人WT1的氨基酸序列还显示于SEQ ID NO:106。
“VLD”,“VLD肽”或“WT1VLD”意指具有氨基酸序列VLDFAPPGA (SEQ ID NO:77；SEQID NO:106的WT1蛋白的位置37-45)的WT1衍生肽。
“RMF”,“RMF肽”或“WT1RMF”意指具有氨基酸序列RMFRNAPYL(SEQ ID NO:78；SEQ IDNO:106的WT1蛋白的位置126-134)的WT1衍生肽。
“HLA-A2”,“HLA-A*02”,“HLA-A02”,或“HLA-A*2”(可互换使用)指HLA-A血清型组中的人白细胞抗原血清型。HLA-A2蛋白(由各自HLA基因编码)构成各自I类MHC(主要组织相容性复合物)蛋白(其进一步包含β2微球蛋白亚基)的α链。一种具体的HLA-A2蛋白是HLA-A201(也称作HLA-A0201,HLA-A02.01,或HLA-A*02:01)。在具体实施方案中,本文中描述的HLA-A2蛋白是HLA-A201
“HLA-A2/WT1”指HLA-A2分子和WT1衍生肽(在本文中也称作“WT1肽”),具体是RMF或VLD肽(分别是“HLA-A2/WT1RMF”和“HLA-A2/WT1VLD”)的复合物。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子特异性结合HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD复合物。
“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的,并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原性决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术,例如表面等离振子共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000)),以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。本文中描述了用于测定本发明的抗体和双特异性抗原结合分子的特异性的合适测定法,例如在下文实施例4,9和10中。在一个实施方案中,抗原结合模块对无关蛋白质的结合程度是该抗原结合模块对抗原结合的小于约10％,如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中,结合抗原的抗原结合模块,或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原,或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述,其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此,相等的亲和力可能包含不同的速率常数,只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量,包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
“降低的结合”,例如降低的对Fc受体的结合,指相应相互作用的亲和力降低,如例如通过SPR测量的。为了清楚,该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限),即完全消除相互作用。相反,“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。
如本文中使用的,“活化性T细胞抗原”指在T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原性决定簇,其在与抗原结合分子相互作用后能诱导T细胞活化。特定地,抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可诱导T细胞活化,其通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联进行。在一个具体的实施方案中,所述活化性T细胞抗原是CD3,特别是CD3的ε亚基(对于人序列,参见UniProt no.P07766(版本189),NCBI RefSeq no.NP_000724.1,SEQ ID NO:107；或对于食蟹猴[Macaca fascicularis]序列,参见UniProtno.Q95LI5(版本49),NCBI GenBank no.BAB71849.1,SEQ ID NO:108)。
如本文中使用的,“T细胞活化”指T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答,其选自:增殖,分化,细胞因子分泌,细胞毒性效应分子释放,细胞毒性活性和活化标志物的表达。合适的测量T细胞活化的测定法是本领域已知的且在本文中有描述。
如本文中使用的,“靶细胞抗原”指靶细胞表面上呈现的抗原性决定簇,所述靶细胞例如肿瘤中的细胞如癌细胞或肿瘤基质的细胞。在一个特别的实施方案中,所述靶细胞抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD,最特别是HLA-A2/WT1RMF。
如本文中使用的,术语“第一”,“第二”或“第三”就Fab分子等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述,这些术语的使用不意图赋予双特异性抗原结合分子的特定次序或取向。
“融合”意指构件(例如Fab分子和Fc域亚基)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL域组成的蛋白质。
“交换”Fab分子(也称作“Crossfab”)意指其中Fab重链和轻链的可变域或恒定域交换(即彼此替换)的Fab分子,即交换Fab分子包含由轻链可变域VL和重链恒定域1CH1构成的肽链(VL-CH1,N至C端方向),和由重链可变域VH和轻链恒定域CL构成的肽链(VH-CL,N至C端方向)。为了清楚,在其中Fab轻链和Fab重链的可变域交换的交换Fab分子中,包含重链恒定域1CH1的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。相反,在其中Fab轻链和Fab重链的恒定域交换的交换Fab分子中,包含重链可变域VH的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。
与之相反,“常规”Fab分子意指处于它的天然型式的Fab分子,即包含由重链可变和恒定域构成的重链(VH-CH1,N至C端方向),和由轻链可变和恒定域构成的轻链(VL-CL,N至C端方向)。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如,IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端,每条重链具有可变域(VH),也称作可变重域或重链可变区,接着是3个恒定域(CH1,CH2和CH3),也称作重链恒定区。类似地,从N端至C端,每条轻链具有可变域(VL),也称作可变轻域或轻链可变区,接着是恒定轻(CL)域(也称作轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一,其中一些可以进一步分成亚类,例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列,免疫球蛋白的轻链可以归入称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现出期望的抗原结合活性。
在用于本文时,术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即群体中包含的各个抗体是相同的和/或结合相同表位,除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外,此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此,修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征,而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体,包括但不限于杂交瘤方法,重组DNA方法,噬菌体展示方法,和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开,即并不处于它的天然环境中的抗体。不需要特定水平的纯化。例如,分离的抗体可以从其天然或自然环境中取出。就本发明的目的而言,在宿主细胞中表达的重组生成的抗体被视为分离的,已通过任何合适的技术分开,分级,或部分或基本上纯化的天然的或重组的抗体也是如此。因此,本发明的抗体和双特异性抗原结合分子是分离的。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95％或99％的纯度,如通过例如电泳(例如SDS-PAGE,等电聚焦(IEF),毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)方法测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述,见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指与天然抗体结构具有基本上类似的结构的抗体。
“抗体片段”指完整抗体以外的分子,其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2,双抗体,线性抗体,单链抗体分子(例如scFv),和单域抗体。对于某些抗体片段的综述,参见Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；亦参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的论述,参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域,或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段,包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生,如本文中描述的。
术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。具体地,抗原结合域包含抗体轻链可变域(VL)和抗体重链可变域(VH)。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。如本文中结合可变区序列使用的,“Kabat编号方式”指由Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文中使用的,所有重和轻链的恒定区和域的氨基酸位置是依照Kabat,etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的,在本文中称作“依照Kabat的编号方式”或“Kabat编号方式”。具体而言,将Kabat编号系统(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于卡帕和拉姆达同种型的轻链恒定域CL并将Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于重链恒定域(CH1,铰链,CH2和CH3),在这种情况中在本文中通过提到“依照Kabat EU索引的编号方式”来进一步澄清。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区。一般地,抗体包含6个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),且三个在VL中(L1,L2,L3)。本文中的例示性HVR包括:
(a)高变环,存在于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)CDR,存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)抗原接触,存在于氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2),和93-101(H3)(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a),(b),和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3),和94-102(H3)。
除非另有指示,可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等,见上文编号。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成:FR1,FR2,FR3和FR4。因而,HVR和FR序列一般以下列次序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个基本上整个可变域,其中所有或基本上所有HVR(例如,CDR)对应于非人抗体的那些,且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。此类可变域在本文中称作“人源化可变区”。任选地,人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。在一些实施方案中,将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代,例如为了恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合)的。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施方案中,人抗体衍生自非人转基因哺乳动物,例如小鼠,大鼠,或家兔。在某些实施方案中,人抗体衍生自杂交瘤细胞系。自人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中也认为是人抗体或人抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ和μ。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而,由宿主细胞生成的抗体可能经历翻译后切割,自重链的C端切除一个或多个,特别是一个或两个氨基酸。因此,通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体(在本文中也称作“切割变体重链”)。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447),或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或不存在。如果没有另外指明的话,包括Fc域(或本文中定义的Fc域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中表示无C端甘氨酸-赖氨酸二肽的。在本发明的一个实施方案中,依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中包含的包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链包含另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)。在本发明的一个实施方案中,依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中包含的包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链包含另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)。本发明的组合物,诸如本文所述药学组合物,包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体。抗体或双特异性抗原结合分子的群体可包含具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子。抗体或双特异性抗原结合分子的群体可以由具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子的混合物组成,其中至少50％,至少60％,至少70％,至少80％或至少90％的抗体或双特异性抗原结合分子具有切割变体重链。在本发明的一个实施方案中,包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体的组合物包含如下的抗体或双特异性抗原结合分子,其包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链。在本发明的一个实施方案中,包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体的组合物包含如下的抗体或双特异性抗原结合分子,其包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链。在本发明的一个实施方案中,此类组合物包含由如下分子构成的抗体或双特异性抗原结合分子的群体:包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链的分子；包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链的分子,和包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链的分子。除非本文中另外指定,Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统,也称作EU索引,如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(也参见上文)。如本文中使用的,Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一,即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如,IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的,具体地,促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一亚基和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰,其中所述修饰彼此互补,从而促进两个Fc域亚基的联合。例如,促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷,从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此,(异)二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生,其在融合至每个亚基的别的构件(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中,促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变,具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中,促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变,具体为氨基酸替代。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
如本文中使用的,术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列,糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰,以及这些办法的组合。
如本文中使用的,术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代,缺失,插入和修饰。可以进行替代,缺失,插入和修饰的任意组合来实现最终构建体,只要最终构建体拥有期望的特性,例如降低的对Fc受体的结合,或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如Fc区的结合特征,特别优选非保守性的氨基酸替代,即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸,3-甲基组氨酸,鸟氨酸,高丝氨酸,5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变,PCR,基因合成等。认为通过遗传工程以外的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如,从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的替代可指示为329G,G329,G329,P329G或Pro329Gly。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守性替代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,Clustal W,Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数,包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而,为了本文中的目的,％氨基酸序列同一性值是使用36.3.8c或更晚的版本FASTA包的ggsearch程序及BLOSUM50比较矩阵生成的。FASTA程序包由W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；和Pearson et al.(1997)Genomics 46:24-36撰写且自http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml公众可得。或者,可使用在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处可及的公共服务器来比较序列,使用ggsearch(全局蛋白质:蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；打开:-10；延伸:-2；Ktup＝2)以确保实施全局而非局部比对。百分比氨基酸同一性在输出比对标题中给出。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键,如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸分子”指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段,例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子,DNA或RNA。例如,就本发明的目的而言,包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本,以及正链和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子,核糖体结合位点或转录终止子。
“分离的编码[例如本发明的抗体或双特异性抗原结合分子]多核苷酸(或核酸)”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子,包括在单一载体或分开的载体中的此类多核苷酸分子,和在宿主细胞中的一个或多个位置处存在的此类核酸分子。
术语“表达盒”指重组或合成生成的,具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒或核酸片段中。通常,表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等。在某些实施方案中,表达盒包含编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”指用于在细胞中导入与其可操作联合的特定基因及指导其表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在细胞内,就通过细胞转录和/或翻译装置生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含表达盒,其包含编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同,但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养细胞如HEK细胞,CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞和植物细胞等,而且还包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
“激活Fc受体”是一种在抗体的Fc域衔接后,引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。人激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致通过免疫效应器细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的,术语“降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制,以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体,在给定的时间内裂解的靶细胞数目的降低,和/或通过ADCC机制,实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加。ADCC的降低相对于使用相同的标准生产,纯化,配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的),由同一类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC。例如,由在其Fc域包含降低ADCC的氨基酸替代的抗体所介导的ADCC中的降低,是相对于由在Fc域中无此氨基酸替代的相同抗体介导的ADCC而言。测量ADCC的合适测定法是本领域中公知的(参见例如PCT公开文本No.WO 2006/082515或PCT公开文本No.WO 2012/130831)。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。
药剂例如药学组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除,降低,延迟,最小化或预防疾病的不良作用。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬和马),灵长类(例如人和非人灵长类如猴),家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地,所述个体或受试者是人。
术语“药学组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效,且不含对会接受组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药学组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的,“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程,并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,降低疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展速率,改善或减轻疾病状态,及消退或改善的预后。在一些实施方案中,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子用于延迟疾病的形成或延缓疾病的进展。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书,其含有关于适应症,使用,剂量,施用,组合疗法,禁忌症的信息和/或关于使用此类治疗产品的警告。
实施方案的详细描述
本发明提供抗体和双特异性抗原结合分子,其结合HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD,最特别是HLA-A2/WT1RMF,而且具有优秀的亲和力和特异性,如治疗目的所需要的。另外,分子还具有其它对于治疗性应用有利的特性,例如就功效和/或安全性以及生产力而言。
HLA-A2/WT1抗体
本发明人开发了以特别好的亲和力和特异性结合HLA-A2/WT1的新颖抗体。例如,如实施例中显示的,本发明人开发了对HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF)胜过HLA-A2与其它结构相似肽的复合物具有惊人选择性的抗体。
如此,在某些方面,本发明提供一种结合HLA-A2/WT1且具有任何下述特征的抗体。
在一个实施方案中,该抗体具有低于约100nM,低于约75nM,或低于约50nM的解离常数(KD)的对HLA-A2/WT1的单价亲和力。在一个实施方案中,该抗体具有低于约1.5nM,低于约1nM,或低于约0.75nM的表观KD的对HLA-A2/WT1的二价亲和力(亲合力)。在一个实施方案中,就(表观)KD而言,该抗体的二价亲和力(亲合力)比该抗体的单价亲和力要高至少10倍,至少20倍,至少50倍,或至少100倍。
在一个实施方案中,该亲和力是于25℃通过表面等离振子共振(SPR)测定。在一个实施方案中,该单价亲和力是以Fab分子格式的该抗体测定的。在一个实施方案中,该二价亲和力(亲合力)是以IgG分子格式的该抗体测定的。
在一个具体实施方案中,该抗体的亲和力是如下测定的:
于25℃使用PBST作为运行缓冲液(10mM PBS,pH 7.4和0.005％(v/v)Tween 20)实施实验。使用来自BioRad Inc.(Hercules,CA)的配备有GLC和GLM传感器芯片的ProteOnXPR36生物传感器和偶联试剂(10mM乙酸钠pH4.5,磺基-N-羟基琥珀酰亚胺[sulfo-NHS],1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐[EDC]和乙醇胺)。在GLM芯片上以30μl/min实施固定化。使用标准胺偶联规程以垂直方向偶联pAb(山羊)抗人IgG,F(ab)2特异性抗体(Jackson ImmunoResearch):用EDC(200mM)和sulfo-NHS(50mM)的混合物活化所有六个配体通道5分钟。在活化表面后,立即跨越所有六个通道注射pAb(山羊)抗人IgG,F(ab)2特异性抗体(50μg/ml,10mM乙酸钠,pH 5)5分钟。最后,用注射1M乙醇胺-HCl(pH 8.5)5分钟来封闭通道。通过沿着五个分开的水平通道同时注射(30μl/min)5分钟来自大肠杆菌上清液捕捉Fab变体。沿着第六个通道注射条件化培养基以提供‘在线’空白,用于双重参照目的。通过沿着垂直通道注射HLA-WT1(例如HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)的稀释系列(100,50,25,12.5,6.25,0nM,50μl/min)2分钟来实施一击动力学测量。监测解离3分钟。在ProteOnManager v.2.1中分析动力学数据。反应点数据的加工牵涉应用点间参照和使用在线缓冲液空白的双重参照步骤(Myszka,J Mol Recognit(1999)12,279-284)。将来自副本一击注射的经过加工的数据拟合简单1:1Langmuir结合模型,无质量传输(O'Shannessy et al.,Anal Biochem(1993)212,457-468)。
本发明的抗体特异性结合HLA-A2/WT1(即HLA-A2分子和WT1衍生肽的复合物)。在一些实施方案中,本发明的抗体特异性结合HLA-A2/WT1RMF(即HLA-A2分子和WT1RMF肽的复合物)。在一个更加具体实施方案中,该抗体特异性结合HLA-A201/WT1RMF(即HLA-A201分子和WT1RMF肽的复合物)。本发明的结合HLA-A2/WT1RMF的抗体包括本文中描述的抗体11D06,33H09和5E11。在其它实施方案中,本发明的抗体特异性结合HLA-A2/WT1VLD(即HLA-A2分子和WT1VLD肽的复合物)。在一个更加具体实施方案中,该抗体特异性结合HLA-A201/WT1VLD(即HLA-A201分子和WT1VLD肽的复合物)。本发明的结合HLA-A2/WT1VLD的抗体包括本文中描述的抗体11B09,13B04和5C01。
在一个实施方案中,抗体的特异性结合是使用HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表达性细胞,特别是经肽脉冲的T2细胞通过流式细胞术测定的。
在一个具体实施方案中,抗体的特异性结合是如下测定的:
作为补充有10％ FBS(Gibco,目录号16140-071)和1％青霉素-链霉素(Gibco,目录号15070-063)的IMDM培养基(Gibco by Life Technologies,目录号31980-048)(完全培养基)中106个细胞/ml的细胞悬浮液制备T2细胞。将细胞以10ml的总体积保持在管中,并与10μl 10-2M(肽的终浓度:10-5M)肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO:77)或RMF肽(SEQ ID NO:78))一起于37℃以5％CO2温育2小时。在清洗后,在冷PBS中悬浮细胞并与滴定浓度的IgG格式的抗体(例如10μg/ml至0.00064μg/ml)一起于4℃温育1小时,继以与抗人IgG-Fc藻红蛋白(PE)缀合的二抗(Jackson Laboratories,目录号109-116-098)一起温育30分钟。在FACSLSR II(BD)上采集细胞,并在Graphpad Prism中作为PE的均值荧光强度(MFI)呈现数据。
在一个实施方案中,本发明的抗体并不显著结合单独的HLA-A2(即没有肽)或具有除了WT1衍生肽(诸如WT1RMF或WT1VLD)以外的肽的HLA-A2。
在一个实施方案中,该抗体并不在WT1衍生肽,特别是WT1RMF或WT1VLD缺失下显著结合HLA-A2。在一个实施方案中,该抗体以比在WT1衍生肽(具体是WT1RMF或WT1VLD)缺失下对HLA-A2的结合的EC50低至少5,至少10,至少15,至少20,至少25,至少50,至少75或至少100倍的EC50结合HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)。
在一个实施方案中,该抗体结合HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD),但并不显著结合具有选自表5中的肽(SEQ ID NO 79-105的肽)的肽的HLA-A2。在一个实施方案中,该抗体结合HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD),但并不显著结合具有任何表5中的肽(SEQ ID NO 79-105的肽)的HLA-A2。
在一个实施方案中,该抗体以比对具有选自表5中的肽(SEQ ID NO 79-105的肽)的肽的HLA-A2的结合的EC50低至少5,至少10,至少15,至少20,至少25,至少50,至少75或至少100倍的EC50结合HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)。在一个实施方案中,该抗体以比对具有任何表5中的肽(SEQ ID NO 79-105的肽)的HLA-A2的结合的EC50低至少5,至少10,至少15,至少20,至少25,至少50,至少75或至少100倍的EC50结合HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)。
在一个实施方案中,EC50是使用HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表达性细胞,特别是经肽脉冲的T2细胞通过流式细胞术测定。
在一个具体实施方案中,EC50是如下测定的:
作为补充有10％ FBS(Gibco,目录号16140-071)和1％青霉素-链霉素(Gibco,目录号15070-063)的IMDM培养基(Gibco by Life Technologies,目录号31980-048)(完全培养基)中106个细胞/ml的细胞悬浮液制备T2细胞(ATCC,目录号CRL-1992)。将细胞以10ml的总体积保持在管中,并与10μl 10-2M(肽的终浓度:10-5M)肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO:77)或RMF肽(SEQ ID NO:78))一起于37℃以5％ CO2温育2小时。在清洗后,在冷PBS中悬浮细胞并与滴定浓度的IgG格式的抗体(例如10μg/ml至0.00064μg/ml)一起于4℃温育1小时,继以与抗人IgG-Fc藻红蛋白(PE)缀合的二抗(Jackson Laboratories,目录号109-116-098)一起温育30分钟。在FACS LSR II(BD)上采集细胞,并在Graphpad Prism中作为PE的均值荧光强度(MFI)呈现数据。在Excel中使用附件(ID BusinessSolutions,Guildford,UK)计算EC50值。
在一个方面,本发明提供一种与包含SEQ ID NO:7的重链可变区(VH)序列和SEQID NO:8的轻链可变区(VL)序列的抗体竞争对HLA-A2/WT1,特别是HLA-A201/WT1RMF的结合的抗体。
可使用竞争测定法来鉴定与包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列的抗体(参照抗体)竞争对HLA-A2/WT1的结合的抗体。在某些实施方案中,此类竞争抗体结合受到参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细例示性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,in Methods inMolecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)且还描述于本文中的实施例。在一种例示性竞争测定法中,在包含第一经标记的结合HLA-A2/WT1的抗体(例如包含SEQ IDNO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列的抗体)和正在测试它与第一抗体竞争对HLA-A2/WT1的结合的能力的第二未标记的抗体的溶液中温育固定化HLA-A2/WT1。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化HLA-A2/WT1。在允许第一抗体结合HLA-A2/WT1的条件下温育后去除过量的未结合的抗体,并测量与固定化HLA-A2/WT1联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化HLA-A2/WT1联合的标记物的量相对于对照样品实质性降低,那么那指示第二抗体与第一抗体竞争对HLA-A2/WT1的结合。见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
在一个方面,本发明提供一种与包含SEQ ID NO:7的重链可变区(VH)序列和SEQID NO:8的轻链可变区(VL)序列的抗体结合HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF的相同表位的抗体。
筛选结合特定表位(即结合相同表位)的抗体可使用本领域常规的方法来进行,诸如例如但不限于丙氨酸扫描,肽印迹(见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463),肽切割分析,表位切除,表位提取,抗原的化学修饰(见Prot.Sci.9(2000)487-496),和交叉阻断(见“Antibodies”,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY))。
基于抗原结构的抗体概况分析(ASAP)(也称作修饰相关概况分析(MAP))容许将多种特异性结合HLA-A2/WT1的单克隆抗体基于每一种抗体的结合概况自多种化学或酶促修饰的抗原表面分仓(见例如US2004/0101920)。每个仓中的抗体结合相同表位,其可以是与由另一个仓所代表的表位截然不同或部分交叠的独特表位。
竞争性结合还可用于容易地确定抗体是否与参照抗HLA-A2/WT1抗体结合HLA-A2/WT1的相同表位或竞争结合。例如,与参照抗体“结合相同表位的抗体”指如下抗体,该抗体在竞争测定法中将参照抗体对它的抗原的结合阻断50％或更多,且反之,参照抗体在竞争测定法中将该抗体对它的抗原的结合阻断50％或更多。还例如,为了确定抗体是否与参照抗体结合HLA-A2/WT1的相同表位,容许参照抗体在饱和条件下结合HLA-A2/WT1。在去除过量的参照抗体后,评估所讨论的抗HLA-A2/WT1抗体结合HLA-A2/WT1的能力。如果抗体能够在参照抗体的饱和结合后结合HLA-A2/WT1的话,可以得出结论所讨论的抗体与参照抗体结合不同表位。但是,如果所讨论的抗体在参照抗体的饱和结合后不能够结合HLA-A2/WT1,那么所讨论的抗体可能结合与参照抗体所结合的表位相同的表位。为了确认所讨论的抗体是否结合相同表位或只是因空间原因而结合受阻,可使用常规实验(例如使用本领域可得的ELISA,RIA,表面等离振子共振,流式细胞术或任何其它定量或定性抗体结合测定法的肽突变和结合分析)。应当以两种设置进行这种测定法,即两种抗体作为饱和抗体。如果在两种设置中仅仅第一(饱和)抗体能够结合HLA-A2/WT1,那么可以得出结论,所讨论的抗HLA-A2/WT1抗体和参照抗-HLA-A2/WT1抗体竞争对HLA-A2/WT1的结合。
在一些实施方案中,如果如在竞争性结合测定法中测量的,1,5,10,20或100倍过量的一种抗体将另一种的结合抑制至少50％,至少75％,至少90％或甚至99％或更多的话,认为两种抗体结合相同或交叠表位(见例如Junghans etal.,Cancer Res.50(1990)1495-1502)。
在一些实施方案中,如果抗原中降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变本质上均也降低或消除另一种的结合的话,认为两种抗体结合相同表位。如果降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变的仅仅一个子集降低或消除另一种的结合的的话,认为两种抗体具有“交叠表位”。
在一个方面,本发明提供一种结合HLA-A2/WT1的抗体,其中依照任何下述实施方案,该抗体结合HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF的表位。该表位可以特别是通过晶体结构分析测定的。
在一个实施方案中,所述表位包含WT1肽,特别是SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的至少三个氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含WT1肽,特别是SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的至少四个氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含WT1肽,特别是SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的至少五个氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含WT1肽,特别是SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的至少六个氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含WT1肽的至少三个氨基酸残基,其中所述至少三个氨基酸残基选自与SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,M2,P4,N5,A6和Y8对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含WT1肽的至少四个氨基酸残基,其中所述至少四个氨基酸残基选自与SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,M2,P4,N5,A6和Y8对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含WT1肽的至少五个氨基酸残基,其中所述至少五个氨基酸残基选自与SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,M2,P4,N5,A6和Y8对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含WT1肽的至少六个氨基酸残基,其中所述至少六个氨基酸残基选自与SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,M2,P4,N5,A6和Y8对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,N5和A6对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,M2,P4,N5,A6和Y8对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基E58,R65,K66和Q155对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基E58,R65,K66和Q155对应的氨基酸残基,和与SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,N5和A6对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基E58,R65,K66,Q155和D61对应的氨基酸残基。在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基E58,R65,K66,Q155和A69对应的氨基酸残基。在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基E58,R65,K66,Q155和A150对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基E58,R65,K66,Q155,和D61,A69和A150中一个或多个对应的氨基酸残基,和与SEQ IDNO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,M2,P4,N5,A6和/或Y8对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基E58,D61,G62,R65,K66,A69,A150,Q155,A158,T163,E166,W167和R170对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基E58,D61,G62,R65,K66,A69,A150,Q155,A158,T163,E166,W167和R170对应的氨基酸残基,和与SEQ ID NO:78中显示的WT1RMF肽的氨基酸残基R1,M2,P4,N5,A6和/或Y8对应的氨基酸残基。
在一个实施方案中,所述表位并不包含与SEQ ID NO:138中显示的HLA-A2序列的氨基酸残基G56,D106,W107,R108,E161,G162和/或R169对应的氨基酸残基。
在又一个方面,本发明提供一种结合HLA-A2/WT1的抗体,其中抗体包含
(i)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:9的HCDR 1,SEQ ID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:12的LCDR 1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:17的HCDR 1,SEQ ID NO:18的HCDR 2,和SEQ ID NO:19的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:20的LCDR 1,SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:25的HCDR 1,SEQ ID NO:26的HCDR 2,和SEQ ID NO:27的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:28的LCDR 1,SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3的VL；
(v)包含SEQ ID NO:33的HCDR 1,SEQ ID NO:34的HCDR 2,和SEQ ID NO:35的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:36的LCDR 1,SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3的VL；
(vi)包含SEQ ID NO:41的HCDR 1,SEQ ID NO:42的HCDR 2,和SEQ ID NO:43的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:44的LCDR 1,SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3的VL；
(vii)包含SEQ ID NO:49的HCDR 1,SEQ ID NO:50的HCDR 2,和SEQ ID NO:51的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:52的LCDR 1,SEQ ID NO:53的LCDR 2和SEQ ID NO:54的LCDR 3的VL；
(viii)包含SEQ ID NO:57的HCDR 1,SEQ ID NO:58的HCDR 2,和SEQ ID NO:59的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:60的LCDR 1,SEQ ID NO:61的LCDR 2和SEQ ID NO:62的LCDR 3的VL；或
(ix)包含SEQ ID NO:65的HCDR 1,SEQ ID NO:66的HCDR 2,和SEQ ID NO:67的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:68的LCDR 1,SEQ ID NO:69的LCDR 2和SEQ ID NO:70的LCDR 3的VL。
在一个特定实施方案中,抗体包含包含SEQ ID NO:1的HCDR 1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:4的LCDR 1,SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的VL。
在另一个实施方案中,抗体包含包含SEQ ID NO:9的HCDR 1,SEQ ID NO:10的HCDR2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:12的LCDR 1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的VL。
在又一个实施方案中,抗体包含包含SEQ ID NO:17的HCDR 1,SEQ ID NO:18的HCDR 2,和SEQ ID NO:19的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:20的LCDR 1,SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3的VL。
在仍有又一个实施方案中,抗体包含包含SEQ ID NO:25的HCDR 1,SEQ ID NO:26的HCDR 2,和SEQ ID NO:27的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:28的LCDR 1,SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3的VL。
在一些实施方案中,抗体是人抗体。在一个实施方案中,VH是人VH且/或VL是人VL。在一个实施方案中,抗体包含任何上述实施方案中的CDR,而且进一步包含人框架,例如人免疫球蛋白框架。
在一个实施方案中,抗体包含
(i)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(ii)包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iii)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iv)包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(v)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vi)包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vii)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(viii)包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；或
(ix)包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在一个特定实施方案中,抗体包含包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中,抗体包含包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在又一个实施方案中,抗体包含包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在仍有又一个实施方案中,抗体包含包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,抗体包含
(i)与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(ii)与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(iii)与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(iv)与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(v)与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(vi)与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(vii)与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(viii)与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；或
(ix)与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个特定实施方案中,抗体包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在另一个实施方案中,抗体包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在又一个实施方案中,抗体包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在仍有又一个实施方案中,抗体包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在某些实施方案中,具有至少95％,96％,97％,98％,或99％同一性的VH或VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代),插入,或删除,但是包含序列的抗体保留结合HLA-A2/WT1的能力。在某些实施方案中,在VH(SEQ ID NO:7,15,23,31,39,47,55,63或71)中替代,插入和/或删除总共1至10个氨基酸和/或在VL(SEQ ID NO:8,16,24,32,40,48,56,64或72)中替代,插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中,替代,插入,或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地,抗体包含上文所述VH序列和/或VL序列,包括该序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中,抗体包含
(i)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL；
(ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL；
(v)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL；
(vi)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VL；
(vii)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL；
(viii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL；或
(ix)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,抗体包含
(i)SEQ ID NO:7的VH序列,和SEQ ID NO:8的VL序列；
(ii)SEQ ID NO:15的VH序列,和SEQ ID NO:16的VL序列；
(iii)SEQ ID NO:23的VH序列,和SEQ ID NO:24的VL序列；
(iv)SEQ ID NO:31的VH序列,和SEQ ID NO:32的VL序列；
(v)SEQ ID NO:39的VH序列,和SEQ ID NO:40的VL序列；
(vi)SEQ ID NO:47的VH序列,和SEQ ID NO:48的VL序列；
(vii)SEQ ID NO:55的VH序列,和SEQ ID NO:56的VL序列；
(viii)SEQ ID NO:63的VH序列,和SEQ ID NO:64的VL序列；或
(ix)SEQ ID NO:71的VH序列,和SEQ ID NO:72的VL序列。
在一个特定实施方案中,抗体包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和包含SEQID NO:8的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中,抗体包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQID NO:16的氨基酸序列的VL。
在又一个实施方案中,抗体包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH和包含SEQID NO:24的氨基酸序列的VL。
在仍有又一个实施方案中,抗体包含包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
在一个特定实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列。
在另一个实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在又一个实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ ID NO:24的VL序列。
在仍有又一个实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:31的VH序列和SEQ ID NO:32的VL序列。
在一个实施方案中,抗体包含人恒定区。在一个实施方案中,抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子,特别是包含人CH1,CH2,CH3和/或CL域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO:112和113(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:114(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,抗体包含包含与SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:112的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中,抗体包含包含与SEQ ID NO:114的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,重链恒定区可包含如本文中描述的Fc域中的氨基酸突变。
在一个实施方案中,抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中,抗体是IgG,特别是IgG1抗体。在一个实施方案中,抗体是全长抗体。
在一个实施方案中,抗体包含Fc域,特别是IgG Fc域,更加特别是IgG1Fc域。在一个实施方案中,Fc域是人Fc域。抗体的Fc域可单一地或组合地并入本文中涉及本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域描述的任何特征。
在另一个实施方案中,抗体是选自Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab’)2分子的组的抗体片段；特别是Fab分子。在另一个实施方案中,抗体片段是双抗体,三抗体或四抗体。
在又一个方面,依照任何上述实施方案的抗体可单一地或组合地并入如下面的节中描述的任何特征。
糖基化变体
在某些实施方案中,改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中,可以改变附着于它的寡糖。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的,双触角的寡糖,其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物,例如甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中,提供了抗体变体,其具有附着(直接或间接)于Fc区的非岩藻糖基化寡糖,即缺乏岩藻糖的寡糖结构。此类非岩藻糖基化寡糖(也称作“无岩藻糖基化”寡糖)特别是缺乏附着于双触角寡糖结构的主干中的第一个GlcNAc的岩藻糖残基的N连接的寡糖。在一个实施方案中,提供了具有Fc区中与天然或亲本抗体相比升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如,非岩藻糖基化寡糖的比例可以是至少约20％,至少约40％,至少约60％,至少约80％,或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比是相对于附着于Asn297的所有寡糖(例如复合的,杂合的和高甘露糖的结构)的总和,缺乏岩藻糖残基的寡糖的(平均)量,如通过MALDI-TOF质谱术测量的,例如如记载于WO2006/082515的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的EU编号方式)的天冬酰胺残基；然而,Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸,即在第294位和第300位之间。此类具有Fc区中升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体可以具有改善的FcRγIIIa受体结合和/或改善的效应器功能,特别是改善的ADCC功能。见例如US2003/0157108；US2004/0093621。
能够生成具有降低的岩藻糖基化的抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US2003/0157108；和WO 2004/056312,尤其在实施例11),和敲除细胞系,诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107),或GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性降低或消除的细胞(见例如US2004259150,US2005031613,US2004132140,US2004110282)。
在又一个实施方案中,提供了具有两分型寡糖的抗体变体,例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有如上所述降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如Umana et al.,Nat Biotechnol17,176-180(1999)；Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中,可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体,例如,“thioMAb”,其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中,替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点,并且可以用于将抗体与其它模块,诸如药物模块或接头-药物模块缀合,以创建免疫缀合物,如本文中进一步描述的。可以如例如美国专利No.7,521,541,8,30,930,7,855,275,9,000,130,或WO2016040856所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
抗体衍生物
在某些实施方案中,可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(均聚物或随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能,抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中,提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的,并且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种治疗剂,诸如细胞毒剂,化疗剂,药物,生长抑制剂,毒素(例如蛋白质毒素,细菌,真菌,植物或动物起源的酶活性毒素,或其片段),或放射性同位素缀合(成化学键)的如本文中描述的抗HLA-A2/WT1抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中,免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC),其中抗体与一种或多种上文提到的治疗剂缀合。典型地使用接头将抗体与一种或多种治疗剂连接。ADC技术(包括治疗剂和药物和接头的例子)的综述见Pharmacol Review 68:3-19(2016)。
在另一个实施方案中,免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体,酶活性毒素包括但不限于白喉A链,白喉毒素的非结合活性片段,外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)),蓖麻毒蛋白(ricin)A链,相思豆毒蛋白(abrin)A链,蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链,α-帚曲霉素(sarcin),油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白,香石竹(dianthin)毒蛋白,美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI,PAPII和PAP-S),苦瓜(Momordica charantia)抑制物,麻疯树毒蛋白(curcin),巴豆毒蛋白(crotin),肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂,白树毒蛋白(gelonin),丝林霉素(mitogellin),局限曲菌素(restrictocin),酚霉素(phenomycin),依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一个实施方案中,免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时,它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子,例如tc99m或I123,或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像,mri)用的自旋标记物,诸如再一次的碘-123,碘-131,铟-111,氟-19,碳-13,氮-15,氧-17,钆,锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物,诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC),亚氨基硫烷(IT),亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯),活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯),醛类(诸如戊二醛),双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺),双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺),二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯),和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如,可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可使用酸不稳定接头,肽酶敏感性接头,光不稳定接头,二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖,但不限于用交联试剂制备的此类缀合物,交联试剂包括但不限于BMPS,EMCS,GMBS,HBVS,LC-SMCC,MBS,MPBH,SBAP,SIA,SIAB,SMCC,SMPB,SMPH,sulfo-EMCS,sulfo-GMBS,sulfo-KMUS,sulfo-MBS,sulfo-SIAB,sulfo-SMCC,和sulfo-SMPB,及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯),它们是商品化的(例如,来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
多特异性抗体
在某些实施方案中,本文中提供的抗体是多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点(即不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中,多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些实施方案中,结合特异性之一针对HLA-A2/WT1,而其它(两种或更多种)特异性针对任何其它抗原。在某些实施方案中,双特异性抗体可以结合HLA-A2/WT1的两种(或更多种)不同表位。也可以使用多特异性(例如双特异性)抗体来将细胞毒性药剂或细胞定位于表达HLA-A2/WT1的细胞。多特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983)),和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168和Atwell et al.,J.Mol.Biol.270:26(1997))。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(见例如WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,和Brennan etal.,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny etal.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用共同轻链技术来规避轻链错配问题(见例如WO 98/50431)；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt etal.J.Immunol.147:60(1991)中所描述的,制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化改造抗体,包括例如“章鱼抗体”或DVD-Ig(见例如WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其它例子可以在WO 2010/115589,WO 2010/112193,WO 2010/136172,WO2010/145792,和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括包含结合HLA-A2/WT1和另一种不同抗原,或HLA-A2/WT1的两种不同表位的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体还可以以不对称形式提供,其具有一个或多个具有相同抗原特异性的结合臂中的域交换,即通过交换VH/VL域(见例如WO 2009/080252和WO 2015/150447),CH1/CL域(见例如WO 2009/080253)或整个Fab臂(见例如WO 2009/080251,WO 2016/016299,还见Schaefer et al.,PNAS,108(2011)1187-1191,和Klein et al.,MAbs 8(2016)1010-20)。还可以通过将带电荷的或不带电荷的氨基酸突变引入域界面以指导正确的Fab配对来改造不对称Fab臂。见例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种别的分子型式是本领域知道的且包括在本文中(见例如Spiess et al.,Mol Immunol 67(2015)95-106)。
本文中还包括的一种特定类型的多特异性抗体是设计成同时结合靶细胞,例如肿瘤细胞上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的激活性的,不变的构件,诸如CD3,从而再靶向T细胞以杀死靶细胞的双特异性抗体。因此,在某些实施方案中,本文中提供的抗体是多特异性抗体,特别是双特异性抗体,其中结合特异性之一针对HLA-A2/WT1且另一针对CD3。
对于这个目的可能有用的双特异性抗体型式的例子包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞啮合剂)分子,其中通过柔性接头融合两个scFv分子(见例如WO2004/106381,WO2005/061547,WO2007/042261,和WO2008/119567,Nagorsen andExpCell Res 317,1255-1260(2011))；双抗体(Holliger et al.,Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物,诸如串联双抗体(“TandAb”；Kipriyanov et al.,J Mol Biol 293,41-56(1999))；“DART”(双重亲和力再靶向)分子,它们基于双抗体型式但特征在于实现额外稳定化的C端二硫桥(Johnson et al.,J Mol Biol 399,436-449(2010)),和所谓的triomab,它们是完整杂合小鼠/大鼠IgG分子(综述见Seimetz et al.,Cancer Treat Rev36,458-467(2010))。本文中包括的特定T细胞双特异性抗体型式描述于WO 2013/026833,WO2013/026839,WO 2016/020309；Bacac et al.,Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
结合HLA-A2/WT1和第二抗原的双特异性抗原结合分子
本发明还提供一种双特异性抗原结合分子,即包含能够特异性结合两种截然不同抗原性决定簇(第一和第二抗原)的至少两种抗原结合模块的抗原结合分子。
基于他们开发的HLA-A2/WT1抗体,本发明人开发了结合HLA-A2/WT1和别的抗原,特别是激活性T细胞抗原,诸如CD3的双特异性抗原结合分子。
如实施例中显示的,这些双特异性抗原结合分子具有许多惊人的特性,包括好的功效和低的毒性。
如此,在某些方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中该第一抗原是HLA-A2/WT1,和(b)特异性结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中该双特异性抗原结合分子具有任何下述特征。
本发明的双特异性抗原结合分子特异性诱导T细胞介导的对表达HLA-A2/WT1(即HLA-A2分子和WT1衍生肽的复合物)的细胞的杀伤。在一些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子特异性诱导T细胞介导的对表达HLA-A2/WT1RMF(即HLA-A2分子和WT1RMF肽的复合物)的细胞的杀伤。在一个更加具体实施方案中,该双特异性抗原结合分子特异性诱导T细胞介导的对表达HLA-A2.01/WT1RMF(即HLA-A201分子和WT1RMF肽的复合物)的细胞的杀伤。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子对T细胞介导的杀伤的诱导是使用HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表达性细胞,特别是经肽脉冲的T2细胞,并测量在T细胞存在下在与双特异性抗原结合分子一起温育后来自所述细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放而测定的。
在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子对T细胞介导的杀伤的诱导是如下测定的:
作为补充有10％ FBS(Gibco,目录号16140-071)和1％青霉素-链霉素(Gibco,目录号15070-063)的IMDM培养基(Gibco by Life Technologies,目录号31980-048)(完全培养基)中106个细胞/ml的细胞悬浮液制备T2细胞(ATCC,目录号CRL-1992)。将细胞以10ml的总体积保持在管中,并与10μl 10-2M(肽的终浓度:10-5M)肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO:77)或RMF肽(SEQ ID NO:78))一起于37℃以5％ CO2温育2小时。自通过Ficoll(GEHealthcare,目录号17-1440-03)梯度离心自血沉棕黄层分离的PBMC纯化泛CD3+细胞。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,目录号130-096-535)通过MACS(MiltenyiBiotec)纯化总CD3+T细胞。如下实施细胞毒性测定法:将经肽脉冲的细胞(100μl)接种入96孔微量滴定圆底板(3x105个细胞/ml),与50μl T细胞(6x106个细胞/ml)和50μl在完全培养基中滴定的双特异性抗原结合分子(例如40μg/ml至0.00004μg/ml)于37℃以5％ CO2共培养18小时。其后,将50μl上清液转移入新的白色板,并添加25μl/孔CytoTox-Glo萤光素酶测定法(Promega,目录号G9291),用于于室温(RT)温育15分钟。通过EnVision(PerkinElmer)读取发光信号(用于测量LDH释放作为细胞死亡的指示)。作为相对发光单位(RLU)呈现数据。
本发明的双特异性抗原结合分子在表达HLA-A2/WT1(即HLA-A2分子和WT1衍生肽的复合物)的细胞存在下特异性激活T细胞。在一些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子在表达HLA-A2/WT1RMF(即HLA-A2分子和WT1RMF肽的复合物)的细胞存在下特异性激活T细胞。在一个更加具体实施方案中,该双特异性抗原结合分子在表达HLA-A201/WT1RMF(即HLA-A201分子和WT1RMF肽的复合物)的细胞存在下特异性激活T细胞。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子对T细胞的激活是通过测量(特别是流式细胞术)在HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表达性细胞,特别是经肽脉冲的T2细胞存在下与双特异性抗原结合分子一起温育后T细胞的CD25和/或CD69表达而测定的。
在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子对T细胞的激活是如下测定的:
作为补充有10％ FBS(Gibco,目录号16140-071)和1％青霉素-链霉素(Gibco,目录号15070-063)的IMDM培养基(Gibco by Life Technologies,目录号31980-048)(完全培养基)中106个细胞/ml的细胞悬浮液制备T2细胞(ATCC,目录号CRL-1992)。将细胞以10ml的总体积保持在管中,并与10μl 10-2M(肽的终浓度:10-5M)肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO:77)或RMF肽(SEQ ID NO:78))一起于37℃以5％ CO2温育2小时。自通过Ficoll(GEHealthcare,目录号17-1440-03)梯度离心自血沉棕黄层分离的PBMC纯化泛CD3+细胞。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,目录号130-096-535)通过MACS(MiltenyiBiotec)纯化总CD3+T细胞。如下实施细胞毒性测定法:将经肽脉冲的细胞(100μl)接种入96孔微量滴定圆底板(3x105个细胞/ml),与50μl T细胞(6x106个细胞/ml)和50μl在完全培养基中滴定的双特异性抗原结合分子(例如40μg/ml至0.00004μg/ml)于37℃以5％ CO2共培养18小时。在共温育18小时后收获细胞,并用针对CD3(Biolegend目录号300321),CD25(Biolegend目录号302606)和CD69(Biolegend目录号310914)的抗体染色以通过流式细胞术测量T细胞激活。
在另一个实施方案中,双特异性抗原结合分子对T细胞的激活是使用HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表达性细胞,特别是经肽脉冲的T2细胞,和报告T细胞系,特别是由NFAT(激活的T细胞的核因子)响应元件驱动表达萤光素酶报告物的Jurkat T细胞系测定的。
在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子对T细胞的激活是如下测定的:
作为补充有10％ FBS(Gibco,目录号16140-071)和1％青霉素-链霉素(Gibco,目录号15070-063)的IMDM培养基(Gibco by Life Technologies,目录号31980-048)(完全培养基)中106个细胞/ml的细胞悬浮液制备T2细胞(ATCC,目录号CRL-1992)。将细胞以10ml的总体积保持在管中,并与10μl 10-2M(肽的终浓度:10-5M)肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO:77)或RMF肽(SEQ ID NO:78))一起于37℃以5％ CO2温育2小时。在清洗后,将90μl经肽脉冲的细胞(2.2x105个细胞/ml的细胞悬浮液)接种入96孔微量滴定圆底板(20,000个细胞/孔,TPP,目录号92097),与50μl在NFAT的启动子下表达萤光素酶的Jurkat细胞(Jurkat-NFAT；Promega,目录号CS176501)(2x106个细胞/ml的细胞悬浮液)和10μl滴定的双特异性抗原结合分子(例如100μg/ml至0.0064μg/ml,在PBS中)于37℃以5％ CO2共培养16小时。其后,取出50μl上清液,并用100μl/孔Bright-Glo萤光素酶测定法(Promega,目录号E2620)替换,用于于室温(RT)温育。5分钟后,将180μl上清液转移入新的白色板以通过EnVision(PerkinElmer)测量发光信号。作为相对发光单位(RLU)呈现数据。
在一个实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子在表达单独的HLA-A2(即没有肽)或具有除了WT1衍生肽(诸如WT1RMF或WT1VLD)以外的肽的HLA-A2的细胞存在下并不显著诱导T细胞介导的杀伤或激活T细胞。
在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子在WT1衍生肽,特别是WT1RMF或WT1VLD缺失下在表达HLA-A2的细胞存在下并不显著诱导T细胞介导的杀伤或激活T细胞。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子以比在WT1衍生肽(具体是WT1RMF或WT1VLD)缺失下在表达HLA-A2的细胞存在下诱导T细胞介导的杀伤或激活T细胞的EC50低至少5,至少10,至少15,至少20,至少25,至少50,至少75或至少100倍的EC50在表达HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)的细胞存在下诱导T细胞介导的杀伤和/或激活T细胞。
在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子在表达HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)的细胞存在下诱导T细胞介导的杀伤和/或激活T细胞,但在表达具有选自表5中的肽(SEQ ID NO 79-105的肽)的肽的HLA-A2的细胞存在下并不显著诱导T细胞介导的杀伤或激活T细胞。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子在表达HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)的细胞存在下诱导T细胞介导的杀伤和/或激活T细胞,但在表达具有任何表5中的肽(SEQ ID NO 79-105的肽)的HLA-A2的细胞存在下并不显著诱导T细胞介导的杀伤或激活T细胞。
在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子以比在表达具有选自表5中的肽(SEQ ID NO 79-105的肽)的肽的HLA-A2的细胞存在下诱导T细胞介导的杀伤和/或激活T细胞的EC50低至少5,至少10,至少15,至少20,至少25,至少50,至少75或至少100倍的EC50在表达HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)的细胞存在下诱导T细胞介导的杀伤和/或激活T细胞。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子以比在表达具有任何表5中的肽(SEQ ID NO 79-105的肽)的HLA-A2的细胞存在下诱导T细胞介导的杀伤和/或激活T细胞的EC50低至少5,至少10,至少15,至少20,至少25,至少50,至少75或至少100倍的EC50在表达HLA-A2/WT1(具体是HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)的细胞存在下诱导T细胞介导的杀伤和/或激活T细胞。
在一个实施方案中,对T细胞介导的杀伤的诱导和/或对T细胞的激活是如上文所述测定的,而且EC50是在Excel中使用该附件(ID BusinessSolutions,Guildford,UK)计算的。
依照本发明的特定实施方案,双特异性抗原结合分子中包含的抗原结合模块是Fab分子(即由各自包含可变和恒定域的重和轻链构成的抗原结合域)。在一个实施方案中,第一和/或第二抗原结合模块是Fab分子。在一个实施方案中,所述Fab分子是人的。在一个特定实施方案中,所述Fab分子是人源化的。在还有另一个实施方案中,所述Fab分子包含人重和轻链恒定域。
优选地,抗原结合模块中至少一个是交换Fab分子。此类修饰减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错误配对,由此改进了重组生产中本发明的双特异性抗原结合分子的产量和纯度。在可用于本发明的双特异性抗原结合分子的一种具体的交换Fab分子中,Fab轻链和Fab重链的可变域(分别是VL和VH)是交换的。然而,甚至在有这种域交换的情况下,由于错配的重和轻链之间所谓的Bence Jones型相互作用,双特异性抗原结合分子的制备物可能包含某些副产物(参见Schaefer et al,PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步减少来自不同Fab分子的重和轻链的错配及由此提高想要的双特异性抗原结合分子的纯度和产量,可以在结合第一抗原(即HLA-A2/WT1)的Fab分子或结合第二抗原(例如活化性T细胞抗原,诸如CD3)的Fab分子的CH1和CL域中的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸,如本文中进一步描述的。在双特异性抗原结合分子中包含的常规Fab分子中(诸如例如图1A-C,G-J中所示)或在双特异性抗原结合分子中包含的VH/VL交换Fab分子中(诸如例如图1D-F,K-N中所示)(但并不在二者中都)进行电荷修饰。在具体的实施方案中,在双特异性抗原结合分子中包含的常规Fab分子(它在具体的实施方案中结合第一抗原,即HLA-A2/WT1)中进行电荷修饰。
在依照本发明的一个具体的实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合第一抗原(即HLA-A2/WT1)和第二抗原(例如活化性T细胞抗原,特别是CD3)。在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子能够通过同时结合HLA-A2/WT1和活化性T细胞抗原来交联T细胞和靶细胞。在一个甚至更具体的实施方案中,此类同时结合导致靶细胞(特别是HLA-A2/WT1表达性肿瘤细胞)的裂解。在一个实施方案中,此类同时结合导致T细胞的活化。在其它实施方案中,此类同时结合导致T淋巴细胞(特别是细胞毒性T淋巴细胞)的细胞应答,其选自下组:增殖,分化,细胞因子分泌,细胞毒性效应分子释放,细胞毒性活性,和活化标志物的表达。在一个实施方案中,在没有同时结合HLA-A2/WT1的情况下双特异性抗原结合分子对活化性T细胞抗原,特别是CD3的结合不导致T细胞活化。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒性活性重定向于靶细胞。在一个具体的实施方案中,所述重定向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
具体地,依照本发明任何实施方案的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中,T细胞是CD4+或CD8+T细胞,特别是CD8+T细胞。
第一抗原结合模块
本发明的双特异性抗原结合分子包含至少一个结合HLA-A2/WT1(第一抗原)的抗原结合模块,特别是Fab分子。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子包含两个结合HLA-A2/WT1的抗原结合模块,特别是Fab分子。在一个特定此类实施方案中,每个这些抗原结合模块结合相同的抗原性决定簇。在一个甚至更加特定实施方案中,所有这些抗原结合模块是相同的,即它们包含相同的氨基酸序列,包括与本文中描述的相同的CH1和CL域中氨基酸替代(如果有的话)。在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子包含不超过两个结合HLA-A2/WT1的抗原结合模块,特别是Fab分子。
在特定实施方案中,结合HLA-A2/WT1的抗原结合模块是常规Fab分子。在此类实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL是彼此交换/替换的Fab分子。
在备选实施方案中,结合HLA-A2/WT1的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL是彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。
HLA-A2/WT1结合模块能够将双特异性抗原结合分子指导至靶部位,例如特定类型的表达HLA-A2/WT1的肿瘤细胞。
双特异性抗原结合分子的第一抗原结合模块可单一地或组合地并入本文中涉及结合HLA-A2/WT1的抗体描述的任何特征,除非在科学上明显不合理或不可能。
如此,在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1且第一抗原结合模块包含
(i)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:9的HCDR 1,SEQ ID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:12的LCDR 1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:17的HCDR 1,SEQ ID NO:18的HCDR 2,和SEQ ID NO:19的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:20的LCDR 1,SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:25的HCDR 1,SEQ ID NO:26的HCDR 2,和SEQ ID NO:27的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:28的LCDR 1,SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3的VL；
(v)包含SEQ ID NO:33的HCDR 1,SEQ ID NO:34的HCDR 2,和SEQ ID NO:35的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:36的LCDR 1,SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3的VL；
(vi)包含SEQ ID NO:41的HCDR 1,SEQ ID NO:42的HCDR 2,和SEQ ID NO:43的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:44的LCDR 1,SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3的VL；
(vii)包含SEQ ID NO:49的HCDR 1,SEQ ID NO:50的HCDR 2,和SEQ ID NO:51的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:52的LCDR 1,SEQ ID NO:53的LCDR 2和SEQ ID NO:54的LCDR 3的VL；
(viii)包含SEQ ID NO:57的HCDR 1,SEQ ID NO:58的HCDR 2,和SEQ ID NO:59的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:60的LCDR 1,SEQ ID NO:61的LCDR 2和SEQ ID NO:62的LCDR 3的VL；或
(ix)包含SEQ ID NO:65的HCDR 1,SEQ ID NO:66的HCDR 2,和SEQ ID NO:67的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:68的LCDR 1,SEQ ID NO:69的LCDR 2和SEQ ID NO:70的LCDR 3的VL,和(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:1的HCDR 1,SEQID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:4的LCDR 1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的VL。
在另一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:9的HCDR 1,SEQ IDNO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:12的LCDR 1,SEQ IDNO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的VL。
在又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:17的HCDR 1,SEQID NO:18的HCDR 2,和SEQ ID NO:19的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:20的LCDR 1,SEQ IDNO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3的VL。
在仍有又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:25的HCDR 1,SEQ ID NO:26的HCDR 2,和SEQ ID NO:27的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:28的LCDR 1,SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3的VL。
在一些实施方案中,第一抗原结合模块是(衍生自)人抗体。在一个实施方案中,VH是人VH且/或VL是人VL。在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含任何上述实施方案中的CDR,而且进一步包含人框架,例如人免疫球蛋白框架。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含
(i)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(ii)包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iii)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iv)包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(v)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vi)包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vii)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(viii)包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；或
(ix)包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ IDNO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在仍有又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ IDNO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含
(i)与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(ii)与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(iii)与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(iv)与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(v)与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(vi)与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(vii)与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(viii)与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；或
(ix)与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在另一个实施方案中,第一抗原结合模块包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在仍有又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含
(i)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL；
(ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL；
(v)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL；
(vi)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VL；
(vii)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL；
(viii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL；或
(ix)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含
(i)SEQ ID NO:7的VH序列,和SEQ ID NO:8的VL序列；
(ii)SEQ ID NO:15的VH序列,和SEQ ID NO:16的VL序列；
(iii)SEQ ID NO:23的VH序列,和SEQ ID NO:24的VL序列；
(iv)SEQ ID NO:31的VH序列,和SEQ ID NO:32的VL序列；
(v)SEQ ID NO:39的VH序列,和SEQ ID NO:40的VL序列；
(vi)SEQ ID NO:47的VH序列,和SEQ ID NO:48的VL序列；
(vii)SEQ ID NO:55的VH序列,和SEQ ID NO:56的VL序列；
(viii)SEQ ID NO:63的VH序列,和SEQ ID NO:64的VL序列；或
(ix)SEQ ID NO:71的VH序列,和SEQ ID NO:72的VL序列。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。
在又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL。
在仍有又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ IDNO:8的VL序列。
在另一个实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ IDNO:16的VL序列。
在又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ IDNO:24的VL序列。
在仍有又一个实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:31的VH序列和SEQID NO:32的VL序列。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含人恒定区。在一个实施方案中,第一抗原结合模块是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL域的Fab分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO:112和113(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:114(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,第一抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:112的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链恒定区。特别地,轻链恒定区可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变且/或可包含一个或多个(特别是两个)N端氨基酸的删除或替代,如果在交换Fab分子中的话。在一些实施方案中,第一抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:114的氨基酸序列中包含的CH1域序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,重链恒定区(具体是CH1域)可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变。
第二抗原结合模块
本发明的双特异性抗原结合分子包含至少一个结合第二抗原(不同于HLA-A2/WT1)的抗原结合模块,特别是Fab分子。
在特定实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL是彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施方案中,结合第一抗原(即HLA-A2/WT1)的抗原结合模块优选是常规Fab分子。在双特异性抗原结合分子中包含超过一个结合HLA-A2/WT1的抗原结合模块,特别是Fab分子的实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块优选是交换Fab分子且结合HLA-A2/WT1的抗原结合模块是常规Fab分子。
在备选实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。在此类实施方案中,结合第一抗原(即HLA-A2/WT1)的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL是彼此交换/替换的Fab分子。在双特异性抗原结合分子中包含超过一个结合第二抗原的抗原结合模块,特别是Fab分子的实施方案中,结合HLA-A2/WT1的抗原结合模块优选是交换Fab分子且结合第二抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。
在一些实施方案中,第二抗原是激活性T细胞抗原(在本文中也称作“激活性T细胞抗原结合模块,或激活性T细胞抗原结合Fab分子”)。在一个特定实施方案中,双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够特异性结合激活性T细胞抗原的抗原结合模块。在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子提供对激活性T细胞抗原的单价结合。
在特定实施方案中,第二抗原是CD3,特别是人CD3(SEQ ID NO:107)或食蟹猴CD3(SEQ ID NO:108),最特别是人CD3。在一个实施方案中,第二抗原结合模块对人和食蟹猴CD3是交叉反应的(即特异性结合)。在一些实施方案中,第二抗原是CD3的厄普西隆亚基(CD3ε)。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含SEQ ID NO:115的HCDR 1,SEQ ID NO:116的HCDR 2,SEQ ID NO:117的HCDR 3,SEQ ID NO:118的LCDR 1,SEQ ID NO:119的LCDR 2和SEQ ID NO:120的LCDR 3。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:115的HCDR 1,SEQ IDNO:116的HCDR 2,和SEQ ID NO:117的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:118的LCDR 1,SEQ IDNO:119的LCDR 2和SEQ ID NO:120的LCDR 3的VL。
在一些实施方案中,第二抗原结合模块是(衍生自)人源化抗体。在一个实施方案中,VH是人源化VH且/或VL是人源化VL。在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含任何上述实施方案中的CDR,而且进一步包含受体人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列。在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且第二抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含SEQ ID NO:121的VH序列,和SEQ IDNO:122的VL序列。
在一个特定实施方案中,第二抗原结合模块包含SEQ ID NO:130的HCDR 1,SEQ IDNO:131的HCDR 2,SEQ ID NO:132的HCDR 3,SEQ ID NO:133的LCDR 1,SEQ ID NO:134的LCDR 2和SEQ ID NO:135的LCDR 3。
在另一个特定实施方案中,第二抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:130的HCDR 1,SEQ ID NO:131的HCDR 2,和SEQ ID NO:132的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:133的LCDR1,SEQ ID NO:134的LCDR 2和SEQ ID NO:135的LCDR 3的VL。
在一些实施方案中,第二抗原结合模块是(衍生自)人源化抗体。在一个实施方案中,VH是人源化VH且/或VL是人源化VL。在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含任何上述实施方案中的CDR,而且进一步包含受体人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:136的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列。在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:137的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个特定实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:136的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:137的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在另一个特定实施方案中,第二抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:136的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且第二抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:137的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含SEQ ID NO:136的VH序列,和SEQ IDNO:137的VL序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含人恒定区。在一个实施方案中,第二抗原结合模块是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL域的Fab分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO:112和113(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:114(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,第二抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:112的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链恒定区。特别地,轻链恒定区可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变且/或可包含一个或多个(特别是两个)N端氨基酸的删除或替代,如果在交换Fab分子中的话。在一些实施方案中,第二抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:114的氨基酸序列中包含的CH1域序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,重链恒定区(具体是CH1域)可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变。
在一些实施方案中,第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1,特别是可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子(即依照此类实施方案,第二抗原结合模块是交换Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定域是交换的)。在一个此类实施方案中,第一(和第三,如果有的话)抗原结合模块是常规Fab分子。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子中存在不超过一个结合第二抗原(例如激活性T细胞抗原诸如CD3)的抗原结合模块(即双特异性抗原结合分子提供对第二抗原的单价结合)。
电荷修饰
本发明的双特异性抗原结合分子可以在其中包含的Fab分子中包含如下的氨基酸替代,其特别有效地减少轻链与非匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物),在它们的一个(或多个,在分子包含超过两个抗原结合Fab分子的情况中)结合臂具有VH/VL交换的基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的生产中可发生错配(还可参见PCT公开文本No.WO 2015/150447,特别是其中的实施例,通过援引完整收入本文)。在它们的结合臂之一中具有VH/VL域交换的双特异性抗原结合分子中发生的想要的双特异性抗原结合分子与不想要的副产物,特别是Bence Jones型副产物相比的比率可以通过在CH1和CL域中的特定氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸来改善(在本文中有时称作“电荷修饰”)。
因而,在其中双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块均是Fab分子,且在抗原结合模块(特别是第二抗原结合模块)之一中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的一些实施方案中,
i)在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat),且其中在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用带负电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)；或
ii)在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat),且其中在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用带负电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
双特异性抗原结合分子没有同时包含i)和ii)下提到的修饰。具有VH/VL交换的抗原结合模块的恒定域CL和CH1没有彼此替换(即保持不交换)。
在一个更加具体的实施方案中,
i)在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)；或
ii)在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个此类实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在又一个实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个特定实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个更加具体的实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个甚至更加具体的实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在特定实施方案中,如果在第一抗原结合模块的恒定域CL和恒定域CH1中进行依照上述实施方案的氨基酸替代的话,第一抗原结合模块的恒定域CL是卡帕同种型的。
或者,依照上文实施方案的氨基酸替代可以在第二抗原结合模块的恒定域CL和恒定域CH1中进行,代替在第一抗原结合模块的恒定域CL和恒定域CH1中进行。在特定的此类实施方案中,第二抗原结合模块的恒定域CL是卡帕同种型的。
因而,在一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在又一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在仍有另一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。
在一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,具体是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ IDNO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,具体是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:9的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:12的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
双特异性抗原结合分子型式
依照本发明的双特异性抗原结合分子的各构件可以以多种构造彼此融合。例示性的构造绘于图1中。
在具体的实施方案中,双特异性抗原结合分子中包含的抗原结合模块是Fab分子。在此类实施方案中,第一,第二,第三等抗原结合模块在本文中分别可以称作第一,第二,第三等Fab分子。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块彼此融合,任选经由肽接头。在特定实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子。在一个此类实施方案中,第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在另一个此类实施方案中,第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在其中或是(i)第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端或是(ii)第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端的实施方案中,另外地第一抗原结合模块的Fab轻链且第二抗原结合模块的Fab轻链可以彼此融合,任选经由肽接头。
具有单一能够特异性结合靶细胞抗原诸如HLA-A2/WT1的抗原结合模块(诸如Fab分子)的双特异性抗原结合分子(例如如图1A,D,G,H,K,L中显示的)是有用的,特别是在预期靶细胞抗原在高亲和力抗原结合模块的结合后内在化的情况中。在此类情况中,存在超过一个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块可增强靶细胞抗原的内在化,由此降低它的利用度。
然而,在其它情况中,包含两个或更多个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块(诸如Fab分子)的双特异性抗原结合分子会是有利的(见图1B,1C,1E,1F,1I,1J,1M或1N中显示的例子),例如为了优化对靶部位的靶向或容许靶细胞抗原的交联。
因而,在特定实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合模块。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块结合第一抗原,即HLA-A2/WT1。在一个实施方案中,第三抗原结合模块是Fab分子。
在特定实施方案中,第三抗原模块与第一抗原结合模块相同。
双特异性抗原结合分子的第三抗原结合模块可单一地或组合地并入本文中涉及第一抗原结合模块和/或结合HLA-A2/WT1的抗体描述的任何特征,除非在科学上明显不合理或不可能。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含
(i)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:9的HCDR 1,SEQ ID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:12的LCDR 1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:17的HCDR 1,SEQ ID NO:18的HCDR 2,和SEQ ID NO:19的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:20的LCDR 1,SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:25的HCDR 1,SEQ ID NO:26的HCDR 2,和SEQ ID NO:27的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:28的LCDR 1,SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3的VL；
(v)包含SEQ ID NO:33的HCDR 1,SEQ ID NO:34的HCDR 2,和SEQ ID NO:35的HCDR3的VH,和包含SEQ ID NO:36的LCDR 1,SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3的VL；
(vi)包含SEQ ID NO:41的HCDR 1,SEQ ID NO:42的HCDR 2,和SEQ ID NO:43的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:44的LCDR 1,SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3的VL；
(vii)包含SEQ ID NO:49的HCDR 1,SEQ ID NO:50的HCDR 2,和SEQ ID NO:51的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:52的LCDR 1,SEQ ID NO:53的LCDR 2和SEQ ID NO:54的LCDR 3的VL；
(viii)包含SEQ ID NO:57的HCDR 1,SEQ ID NO:58的HCDR 2,和SEQ ID NO:59的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:60的LCDR 1,SEQ ID NO:61的LCDR 2和SEQ ID NO:62的LCDR 3的VL；或
(ix)包含SEQ ID NO:65的HCDR 1,SEQ ID NO:66的HCDR 2,和SEQ ID NO:67的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:68的LCDR 1,SEQ ID NO:69的LCDR 2和SEQ ID NO:70的LCDR 3的VL。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:1的HCDR 1,SEQID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:4的LCDR 1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的VL。
在另一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:9的HCDR 1,SEQ IDNO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:12的LCDR 1,SEQ IDNO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的VL。
在又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:17的HCDR 1,SEQID NO:18的HCDR 2,和SEQ ID NO:19的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:20的LCDR 1,SEQ IDNO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3的VL。
在仍有又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:25的HCDR 1,SEQ ID NO:26的HCDR 2,和SEQ ID NO:27的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:28的LCDR 1,SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3的VL。
在一些实施方案中,第三抗原结合模块是(衍生自)人抗体。在一个实施方案中,VH是人VH且/或VL是人VL。在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含任何上述实施方案中的CDR,而且进一步包含人框架,例如人免疫球蛋白框架。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含
(i)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(ii)包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iii)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(iv)包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(v)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vi)包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(vii)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；
(viii)包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL；或
(ix)包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ IDNO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在仍有又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VH,和包含与SEQ IDNO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含
(i)与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(ii)与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(iii)与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(iv)与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(v)与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(vi)与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(vii)与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；
(viii)与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列；或
(ix)与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在另一个实施方案中,第三抗原结合模块包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在仍有又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含
(i)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL；
(ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL；
(v)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL；
(vi)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VL；
(vii)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL；
(viii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL；或
(ix)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含(i)SEQ ID NO:7的VH序列,和SEQ IDNO:8的VL序列；
(ii)SEQ ID NO:15的VH序列,和SEQ ID NO:16的VL序列；
(iii)SEQ ID NO:23的VH序列,和SEQ ID NO:24的VL序列；
(iv)SEQ ID NO:31的VH序列,和SEQ ID NO:32的VL序列；
(v)SEQ ID NO:39的VH序列,和SEQ ID NO:40的VL序列；
(vi)SEQ ID NO:47的VH序列,和SEQ ID NO:48的VL序列；
(vii)SEQ ID NO:55的VH序列,和SEQ ID NO:56的VL序列；
(viii)SEQ ID NO:63的VH序列,和SEQ ID NO:64的VL序列；或(ix)SEQ ID NO:71的VH序列,和SEQ ID NO:72的VL序列。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。
在又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL。
在仍有又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ IDNO:8的VL序列。
在另一个实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ IDNO:16的VL序列。
在又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ IDNO:24的VL序列。
在仍有又一个实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:31的VH序列和SEQID NO:32的VL序列。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含人恒定区。在一个实施方案中,第三抗原结合模块是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL域的Fab分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO:112和113(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:114(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,第三抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:112或SEQ IDNO:113的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:112的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链恒定区。特别地,轻链恒定区可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变和/或可包含一个或多个(特别是两个)N端氨基酸的删除或替代,如果在交换Fab分子中的话。在一些实施方案中,第三抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:114的氨基酸序列中包含的CH1域序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,重链恒定区(具体是CH1域)可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变。
在特定实施方案中,第三和第一抗原结合模块各自是Fab分子且第三抗原结合模块与第一抗原结合模块相同。如此,在这些实施方案中,第一和第三抗原结合模块包含相同的重和轻链氨基酸序列且具有相同的域排列(即常规的或交换的)。而且,在这些实施方案中,第三抗原结合模块包含与第一抗原结合模块相同的氨基酸替代,如果有的话。例如,会在第一抗原结合模块和第三抗原结合模块中每个的恒定域CL和恒定域CH1中进行本文中作为“电荷修饰”描述的氨基酸替代。或者,可以在第二抗原结合模块(其在特定实施方案中还是Fab分子)的恒定域CL和恒定域CH1中进行,但是在第一抗原结合模块和第三抗原结合模块的恒定域CL和恒定域CH1中不进行所述氨基酸替代。
像第一抗原结合模块一样,第三抗原结合模块特别是常规Fab分子。然而,还涵盖其中第一且第三抗原结合模块是交换Fab分子(且第二抗原结合模块是常规Fab分子)的实施方案。如此,在特定实施方案中,第一和第三抗原结合模块各自是常规Fab分子,且第二抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它实施方案中,第一和第三抗原结合模块各自是交换Fab分子且第二抗原结合模块是常规Fab分子。
如果存在第三抗原结合模块的话,在一个特定实施方案中,第一和第三抗原模块结合HLA-A2/WT1,且第二抗原结合模块结合第二抗原,特别是激活性T细胞抗原,更加特别是CD3,最特别是CD3ε。
在特定实施方案中,双特异性抗原结合分子包含由第一和第二亚基构成的Fc域。Fc域的第一和第二亚基能够稳定联合。
依照本发明的双特异性抗原结合分子可具有不同的构造,即第一,第二(和任选地第三)抗原结合模块可以以不同方式彼此和与Fc域融合。各构件可以直接或优选地经由一个或多个合适的肽接头彼此融合。在Fab分子融合至Fc域的亚基的N端的情况中,它典型地经由免疫球蛋白铰链区。
在一些实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子且第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在此类实施方案中,第一抗原结合模块可以在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端或Fc域的另一亚基的N端。在特定此类实施方案中,所述第一抗原结合模块是常规Fab分子,且第二抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第一Fab分子是交换Fab分子且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子,第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端,且第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。此类构造示意性地在图1G和1K中描绘(这些例子中的第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子)。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子且第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一和第二Fab分子各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端。此类构造示意性地在图1A和1D中描绘(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一抗原结合模块是常规Fab分子)。第一和第二Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定实施方案中,第一和第二Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区,特别是在Fc域是IgG1 Fc域的情况中。
在一些实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子且第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在此类实施方案中,第二抗原结合模块可以在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端或(如上文描述的)Fc域的亚基之另一的N端。在特定此类实施方案中,所述第一抗原结合模块是常规Fab分子,且第二抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第一Fab分子是交换Fab分子且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子,第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端,且第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。此类构造示意性地在图1H和1L中描绘(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一抗原结合模块是常规Fab分子)。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在一些实施方案中,第三抗原结合模块,特别是第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在特定此类实施方案中,所述第一和第三Fab分子各自是常规Fab分子,且第二Fab分子是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第一和第三Fab分子各自是交换Fab分子且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个特定此类实施方案中,第二且第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端,且第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一,第二和第三Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一亚基的N端,且其中第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第二亚基的N端。此类构造示意性地在图1B和1E(在这些例子中第二抗原结合模块是VH/VL交换Fab分子,且第一且第三抗原结合模块是常规Fab分子),和图1J和1N(在这些例子中第二抗原结合模块是常规Fab分子,且第一和第三抗原结合模块是VH/VL交换Fab分子)中描绘。第二和第三Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定实施方案中,第二和第三Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区,特别是在Fc域是IgG1 Fc域的情况中。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一个此类实施方案中,第一和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端,且第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一,第二和第三Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一亚基的N端,且其中第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第二亚基的N端。此类构造示意性地在图1C和1F(在这些例子中第二抗原结合模块是VH/VL交换Fab分子,且第一且第三抗原结合模块是常规Fab分子)和图1I和1M(在这些例子中第二抗原结合模块是常规Fab分子,且第一和第三抗原结合模块是VH/VL交换Fab分子)中描绘。第一和第三Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定实施方案中,第一和第三Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区,特别是在Fc域是IgG1 Fc域的情况中。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在其中Fab分子在Fab重链的C端经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的每个亚基的N端的双特异性抗原结合分子的构造中,两个Fab分子,铰链区且Fc域本质上形成免疫球蛋白分子。在一个特定实施方案中,免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定实施方案中,免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中,免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中,免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其它实施方案中,免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施方案中,免疫球蛋白包含人恒定区,特别是人Fc区。
在本发明的一些双特异性抗原结合分子中,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合,任选经由肽接头。取决于第一和第二Fab分子的构造,第一Fab分子的Fab轻链可以在它的C端融合至第二Fab分子的Fab轻链的N端,或者第二Fab分子的Fab轻链可以在它的C端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N端。第一和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步降低不匹配Fab重和轻链的错配,而且还减少表达本发明的一些双特异性抗原结合分子需要的质粒的数目。
抗原结合模块可以直接或经由肽接头融合至Fc域或彼此融合,肽接头包含一个或多个氨基酸,通常约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知且本文中记载的。合适的,非免疫原性的肽接头包括例如(G4S)n,(SG4)n,(G4S)n或G4(SG4)n肽接头。“n”一般是1至10,通常是2至4的整数。在一个实施方案中,所述肽接头具有至少5个氨基酸的长度,在一个实施方案中5至100个氨基酸的长度,在又一个实施方案中10至50个氨基酸的长度。在一个实施方案中,所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm,其中G＝甘氨酸,S＝丝氨酸,且(x＝3,n＝3,4,5或6,和m＝0,1,2或3)或(x＝4,n＝2,3,4或5和m＝0,1,2或3),在一个实施方案中,x＝4和n＝2或3,在又一个实施方案中,x＝4和n＝2。在一个实施方案中,所述肽接头是(G4S)2。一种特别适合于将第一和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的肽接头是(G4S)2。一种适合于连接第一和第二Fab片段的Fab重链的例示性肽接头包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 110和111)。另一种合适的此类接头包含序列(G4S)4。另外,接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地,当Fab分子融合至Fc域亚基的N端时,其可以在有或无另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)),和如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在某些实施方案中,多肽是共价连接的,例如通过二硫键。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)),和如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在某些实施方案中,多肽是共价连接的,例如通过二硫键。
在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其它实施方案中,双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些这些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第二Fab分子的交换Fab轻链多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)),和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在其它这些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)),或如下多肽,其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)),在适宜时。
依照这些实施方案的双特异性抗原结合分子可进一步包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4)),或(ii)如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施方案中,多肽是共价连接的,例如通过二硫键。
在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其它实施方案中,双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些这些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第二Fab分子的交换Fab轻链多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)),和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在其它这些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)),或如下多肽,其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)),在适宜时。
依照这些实施方案的双特异性抗原结合分子可进一步包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4)),或(ii)如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施方案中,多肽是共价连接的,例如通过二硫键。
在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子不包含Fc域。在特定此类实施方案中,所述第一和,如果存在的话第三Fab分子各自是常规Fab分子,且第二Fab分子是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第一和,如果存在的话第三Fab分子各自是交换Fab分子且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个此类实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二抗原结合模块,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一和第二抗原结合模块均是Fab分子且第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。此类构造示意性地在图1O和1S中描绘(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一抗原结合模块是常规Fab分子)。
在另一个此类实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二抗原结合模块,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一和第二抗原结合模块均是Fab分子且第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。此类构造示意性地在图1P和1T中描绘(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一抗原结合模块是常规Fab分子)。
在一些实施方案中,第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合模块,特别是第三Fab分子,其中所述第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在某些此类实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一,第二和第三Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性地在图1Q和1U(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一和第三抗原结合模块各自是常规Fab分子),或图1X和1Z(在这些例子中第二抗原结合域是常规Fab分子且第一和第三抗原结合模块各自是VH/VL交换Fab分子)中描绘。
在一些实施方案中,第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合模块,特别是第三Fab分子,其中所述第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第一Fab分子的Fab重链的C端。在某些此类实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一,第二和第三Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第一Fab分子的Fab重链的C端。此类构造示意性地在图1R和1V(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一和第三抗原结合模块各自是常规Fab分子),或图1W和1Y(在这些例子中第二抗原结合域是常规Fab分子且第一和第三抗原结合模块各自是VH/VL交换Fab分子)中描绘。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与第三Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与第三Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第三Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链)(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))和第二Fab分子的Fab轻链多肽(VL(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第三Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第三Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链)(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))和第二Fab分子的Fab轻链多肽(VL(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第二Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))和第二Fab分子的Fab轻链多肽(VL(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第二Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))和第二Fab分子的Fab轻链多肽(VL(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:9的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:12的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:9的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:12的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:9的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:12的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在依照本发明的双特异性抗原结合分子的所有不同构造中,本文中描述的氨基酸替代,如果存在的话,可以在第一和(如果存在的话)第三抗原结合模块/Fab分子的CH1和CL域中,或在第二抗原结合模块/Fab分子的CH1和CL域中。优选地,它们在第一和(如果存在的话)第三抗原结合模块/Fab分子的CH1和CL域中。依照本发明的概念,如果在第一(和,如果存在的话,第三)抗原结合模块/Fab分子中进行如本文中描述的氨基酸替代的话,在第二抗原结合模块/Fab分子中不进行此类氨基酸替代。相反,如果在第二抗原结合模块/Fab分子中进行如本文中描述的氨基酸替代的话,在第一(和,如果存在的话,第三)抗原结合模块/Fab分子中不进行此类氨基酸替代。特别是在包含其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH1是彼此替换的Fab分子的双特异性抗原结合分子中进行氨基酸替代。
在依照本发明的双特异性抗原结合分子的特定实施方案中,特别是其中在第一(和,如果存在的话,第三)抗原结合模块/Fab分子中进行如本文中描述的氨基酸替代,第一(和,如果存在的话,第三)Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。在依照本发明的双特异性抗原结合分子的其它实施方案中,特别是其中在第二抗原结合模块/Fab分子中进行如本文中描述的氨基酸替代,第二抗原结合模块/Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。在一些实施方案中,第一(和,如果存在的话,第三)抗原结合模块/Fab分子的恒定域CL和第二抗原结合模块/Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别是用精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别是通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:9的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:12的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别是用精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:9的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:12的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别是通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:9的重链互补决定区(HCDR)1,SEQID NO:10的HCDR 2,和SEQ ID NO:11的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:12的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
依照任何上述实施方案,双特异性抗原结合分子的各构件(例如Fab分子,Fc域)可直接或经由本文中描述的或本领域已知的各种接头(特别是包含一个或多个氨基酸,通常约2-20个氨基酸的肽接头)融合。合适的,非免疫原性的肽接头包括例如(G4S)n,(SG4)n,(G4S)n或G4(SG4)n肽接头,其中n一般是1至10,典型地2至4的整数。
在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一和第三抗原结合模块；其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且其中第一和第三抗原结合模块各自是包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区的(常规)Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块；其中第二抗原是CD3且其中第二抗原结合模块是包含(i)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的轻链可变区,或(ii)包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:137的氨基酸序列的轻链可变区(特别是包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链可变区)的其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
在a)下的第一和第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一和第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；
且其中进一步地
在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在a)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在又一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一和第三抗原结合模块；其中第一抗原是HLA-A2/WT1,特别是HLA-A2/WT1RMF,且其中第一和第三抗原结合模块各自是包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区的(常规)Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块；其中第二抗原是CD3且其中第二抗原结合模块是包含(i)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的轻链可变区,或(ii)包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:137的氨基酸序列的轻链可变区(特别是包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链可变区)的其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
在a)下的第一和第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一和第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；
且其中进一步地
在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在a)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在依照本发明的这些方面的一个实施方案中,在Fc域的第一亚基中位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),且在Fc域的第二亚基中位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)且任选地位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在依照本发明的这些方面的又一个实施方案中,在Fc域的第一亚基中另外地位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换),且在Fc域的第二亚基中另外地位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在依照本发明的这些方面的仍有又一个实施方案中,在Fc域的第一和第二亚基每个中位置234处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L234A),位置235处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L235A)且位置329处的脯氨酸残基用甘氨酸残基替换(P329G)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在依照本发明的这些方面仍有又一个实施方案中,Fc域是人IgG1 Fc域。
在特定具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含与SEQ ID NO:123的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:125的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:139的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与SEQ ID NO:140的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽。在又一个特定具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的多肽和包含SEQID NO:140的氨基酸序列的多肽。
在另一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含与SEQ ID NO:123的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:124的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:125的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与SEQ IDNO:129的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽。在又一个特定具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的多肽。
在另一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含与SEQ ID NO:126的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:127的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:128的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与SEQ IDNO:129的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽。在又一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的多肽和包含SEQID NO:129的氨基酸序列的多肽。
Fc域
在特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含由第一和第二亚基构成的Fc域。理解的是,本文中涉及双特异性抗原结合分子描述的Fc域的特征可同等应用于本发明的抗体中包含的Fc域。
双特异性抗原结合分子的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体,其每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc域。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG Fc域。在一个具体的实施方案中,Fc域是IgG1 Fc域。在另一个实施方案中,Fc域是IgG4 Fc域。在一个更加具体的实施方案中,Fc域是包含位置S228(Kabat EU索引编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。此氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等,Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中,Fc域是人Fc域。在一个甚至更加具体的实施方案中,Fc域是人IgG1 Fc域。人IgG1 Fc区的一种例示性序列在SEQ ID NO:109中给出。
促进异二聚化的Fc域修饰
依照本发明的双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合模块,其可以融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个,如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中双特异性抗原结合分子的产量和纯度,如此在双特异性抗原结合分子的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。
因而,在具体的实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此,在一个实施方案中,所述修饰在Fc域的CH3域中。
有数种办法来修饰Fc域的CH3域以加强异二聚化,它们详细记载于例如WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012058768,WO 2013157954,WO2013096291。典型地,在所有此类办法中,Fc域的第一亚基的CH3域和Fc域的第二亚基的CH3域二者以互补方式进行工程化改造使得每个CH3域(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3域异二聚化(使得第一和第二CH3域异二聚化且两个第一CH3域或两个第二CH3域之间不形成同二聚体)。涵盖这些用于改善重链异二聚化的不同办法作为不同备选,与双特异性抗原结合分子中的减少重/轻链错配和Bence Jones型副产物的重-轻链修饰(例如一个结合臂中的VH和VL交换/替换及在CH1/CL界面中引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸的替代)组合。
在一个特定的实施方案中,所述促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。
节-入-穴技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。一般地,方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔,其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而,在一个具体的实施方案中,在双特异性抗原结合分子的Fc域的第一亚基的CH3域中,一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成隆起,其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中,而且在Fc域的第二亚基的CH3域中,一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,其中可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
优选地,所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组:精氨酸(R),苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),和色氨酸(W)。
优选地,所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组:丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T),和缬氨酸(V)。
可以通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。
在一个特定的实施方案中,在Fc域第一亚基(的CH3域)(“节”亚基)中,第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),而在Fc域第二亚基(的CH3域)(“穴”亚基)中,第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中,在Fc域第二亚基中,另外,第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在还有又一个实施方案中,在Fc域的第一亚基中,另外,第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或第356位的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是,第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换),而在Fc域的第二亚基中,另外,第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥,进一步稳定了二聚体(Carter,JImmunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个具体的实施方案中,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W,且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S,L368A和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个具体的实施方案中,将结合第二抗原(例如激活性T细胞抗原)的抗原结合模块融合(任选地经由结合HLA-A2/WT1的第一抗原结合模块和/或肽接头)至Fc域的第一亚基(其包含“节”修饰)。不希望受理论束缚,结合第二抗原,诸如激活性T细胞抗原的抗原结合模块与Fc域的含节的亚基的融合会(进一步)使包含两个结合激活性T细胞抗原的抗原结合模块的抗原结合分子的生成最小化(两条含节的多肽的空间碰撞)。
涵盖修饰CH3以增强异二聚化的其它技术作为依照本发明的备选,它们记载于例如WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954,WO 2013/096291。
在一个实施方案中,备选地使用EP 1870459中记载的异二聚化办法。这种办法基于在Fc域的两个亚基之间的CH3/CH3域界面中的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸。本发明的双特异性抗原结合分子的一个优选的实施方案是(Fc域的)两个CH3域之一中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的CH3域之另一中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变T366S,L368A,Y407V,和另外的Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C,T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C,T366S,L368A,Y407V,或所述双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C,T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C,T366S,L368A,Y407V和另外的Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(所有编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2013/157953中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366K且第二CH3域包含氨基酸突变L351D(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步包含氨基酸突变L351K。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含选自Y349E,Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2012/058768中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变L351Y,Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A,K409F。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含位置T411,D399,S400,F405,N390,或K392处的氨基酸突变,例如选自a)T411N,T411R,T411Q,T411K,T411D,T411E或T411W,b)D399R,D399W,D399Y或D399K,c)S400E,S400D,S400R,或S400K,d)F405I,F405M,F405T,F405S,F405V或F405W,e)N390R,N390K或N390D,f)K392V,K392M,K392R,K392L,K392F或K392E(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变L351Y,Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366V,K409F。在又一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A,K409F。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含氨基酸突变K392E,T411E,D399R和S400R(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2011/143545中记载的异二聚化办法,例如进行选自下组的位置处的氨基酸修饰:368和409(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO2011/090762中记载的异二聚化办法,它也使用上文所述节-入-穴技术。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366W且第二CH3域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366Y且第二CH3域包含氨基酸突变Y407T(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子或它的Fc域是IgG2亚类的且备选地使用WO 2010/129304中记载的异二聚化办法。
在一个备选的实施方案中,促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰,例如如记载于PCT公开文本WO 2009/089004的。一般地,此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基,从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。在一个此类实施方案中,第一CH3域包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K392或N392的氨基酸替代(优选K392D或N392D)且第二CH3域包含带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R))对D399,E356,D356,或E357的氨基酸替代(优选D399K,E356K,D356K,或E357K,更优选D399K和E356K)。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K409或R409的氨基酸替代,优选K409D或R409D。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步或二选一地包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸替代(所有编号方式依照Kabat EU索引)。
在还有又一个实施方案中,备选地使用WO 2007/147901中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变K253E,D282K,和K322D且第二CH3域包含氨基酸突变D239K,E240K,和K292D(编号方式依照Kabat EU索引)。
在仍有另一个实施方案中,可以备选地使用WO 2007/110205中记载的异二聚化办法。
在一个实施方案中,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代K392D和K409D,且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代D356K和D399K(编号方式依照Kabat EU索引)。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
Fc域赋予双特异性抗原结合分子(或抗体)以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而,同时它可能导致不想要的双特异性抗原结合分子(或抗体)对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外,Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放,其与双特异性抗原结合分子的T细胞活化特性(例如在其中第二抗原结合模块结合激活性T细胞抗原的双特异性抗原结合分子的实施方案中)和长半衰期组合,在系统性施用后引起细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。(携带Fc受体的)免疫细胞而非T细胞的活化甚至可能降低双特异性抗原结合分子(特别是其中第二抗原结合模块结合激活性T细胞抗原的双特异性抗原结合分子)的功效,原因是例如通过NK细胞对T细胞的潜在破坏。
因而,在具体的实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域展现出与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中,Fc域(或包含所述Fc域的双特异性抗原结合分子)展现出与天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力,和/或与天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1Fc域的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中,Fc域(或包含所述Fc域的双特异性抗原结合分子)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中,Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中,Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中,Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中,效应器功能是选自下组的一项或多项:CDC,ADCC,ADCP,和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中,效应器功能是ADCC。在一个实施方案中,Fc域展现出与天然IgG1 Fc域相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的双特异性抗原结合分子)展现出超过约70％,特别是超过约80％,更特别是超过约90％的天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时,实现基本相似的对FcRn的结合。
在某些实施方案中,Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中,双特异性抗原结合分子的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常,Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中,氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中,氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍,至少5倍,或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中,这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍,至少20倍,或甚至至少50倍。在一个实施方案中,包含工程化Fc域的双特异性抗原结合分子展现出与包含非工程化Fc域的双特异性抗原结合分子相比少于20％,特别是少于10％,更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中,Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中,Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中,Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更特别是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最特别是人FcγRIIIa。优选地,对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中,对补体成分的结合亲和力,特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中,对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的双特异性抗原结合分子)展现出非工程化形式的Fc域(或包含所述非工程化形式的Fc域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时,实现基本相似的对FcRn的结合,即保留Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗原结合分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子的Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的靶物结合的抗体的交联,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。在一个实施方案中,降低的效应器功能是选自下组的一项或多项:降低的CDC,降低的ADCC,降低的ADCP,和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中,降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中,降低的ADCC是小于20％的由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC。
在一个实施方案中,降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中,Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代:E233,L234,L235,N297,P331和P329(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个更特定的实施方案中,Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代:L234,L235和P329(编号方式依照KabatEU索引)。在一些实施方案中,Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个此类实施方案中,Fc域是IgG1 Fc域,特别是人IgG1 Fc域。在一个实施方案中,Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中,氨基酸替代是P329A或P329G,特别是P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个实施方案中,Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代:E233,L234,L235,N297和P331(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个更加特定的实施方案中,又一处氨基酸替代是E233P,L234A,L235A,L235E,N297A,N297D或P331S。在具体的实施方案中,Fc域包含在位置P329,L234和L235处的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。在更具体的实施方案中,Fc域包含氨基酸突变L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”,“PGLALA”或“LALAPG”)。具体而言,在具体的实施方案中,Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(Kabat EU索引编号方式),即在Fc域的第一和第二亚基每个中,第234位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L234A),第235位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L235A)且第329位的脯氨酸残基用甘氨酸残基替换(P329G)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个此类实施方案中,Fc域是IgG1 Fc域,特别是人IgG1 Fc域。氨基酸替代组合“P329G LALA”几乎完全消除了人IgG1 Fc域的Fcγ受体(以及补体)结合,如记载于PCT公开文本no.WO 2012/130831,其通过提述完整并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。
IgG4抗体展现出与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此,在一些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG4 Fc域,特别是人IgG4 Fc域。在一个实施方案中,IgG4 Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代S228P(编号方式依照Kabat EU索引)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能,在一个实施方案中,IgG4 Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代L235E(编号方式依照Kabat EU索引)。在另一个实施方案中,IgG4 Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个具体的实施方案中,IgG4 Fc域包含在位置S228,L235和P329处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代S228P,L235E和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。此类IgG4 Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831,其通过提述完整并入本文。
在一个具体的实施方案中,展现出与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A,L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc域,或包含氨基酸替代S228P,L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc域(编号方式依照Kabat EU索引)。
在某些实施方案中,已消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中,Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变,特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在上文和PCT公开文本no.WO 2012/130831中描述的Fc域以外,具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238,265,269,270,297,327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)(编号方式依照Kabat EU索引)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265,269,270,297和327的两个或更多个处的替代的Fc突变体,包括所谓的“DANA”Fc突变体,其具有残基265和297到丙氨酸的替代(美国专利No.7,332,581)。
可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。
可以容易地测定对Fc受体的结合,例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行,并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。或者,可使用已知表达特定Fc受体的细胞系,如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来估测Fc域或包含Fc域的双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的双特异性抗原结合分子的效应器功能。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等,Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等,J ExpMed 166,1351-1361(1987)。或者,可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如披露于Clynes等,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)的。
在一些实施方案中,Fc域对补体成分(特别是对C1q)的结合是降低的。因而,在其中Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定Fc域或包含Fc域的双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活,可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等,J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等,Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
还可以使用本领域已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
多核苷酸
本发明还提供分离的多核苷酸,其编码如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段。在一些实施方案中,所述片段是抗原结合片段。
可以将编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的多核苷酸以编码完整抗体或双特异性抗原结合分子的单一多核苷酸表达,或以共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗体或双特异性抗原结合分子。例如,抗体或双特异性抗原结合分子的轻链部分可以与抗体或双特异性抗原结合分子中包含抗体或双特异性抗原结合分子重链的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽会与轻链多肽联合以形成抗体或双特异性抗原结合分子。在另一个例子中,抗体或双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基之一和任选地(部分的)一个或多个Fab分子的部分可以与抗体或双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基中另一个和任选地(部分的)Fab分子的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时,Fc域亚基会联合以形成Fc域。
在一些实施方案中,分离的多核苷酸编码整个依照本文所述发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中,分离的多核苷酸编码依照本文所述发明的抗体或双特异性抗原结合分子中包含的多肽。
在某些实施方案中,多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是RNA,例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可以获得本发明的抗体或双特异性抗原结合分子,例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成进行。对于重组生成,分离一种或多种编码抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的),并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序此类多核苷酸。在一个实施方案中,提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等,CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒,病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒,其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的,“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG,TGA或TAA)不翻译成氨基酸,但可将其视为编码区的一部分(若存在的话),但任何侧翼序列例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5’和3’非翻译区等,不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如单一载体上),或存在于分开的多核苷酸构建体中,例如在分开的(不同的)载体上。此外,任何载体可含有单个编码区,或可包含两个或更多个编码区,例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽,其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸或核酸可以编码异源编码区,其与编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序,如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下时,即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力,则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此,如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录,那么启动子区将是与该核酸可操作联合。启动子可以是细胞特异性启动子,其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外,其它转录控制元件例如增强子,操纵基因,阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区,如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子,以及内含子-A),猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和家兔β-珠蛋白衍生的,以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地,内部核糖体进入位点或IRES,也称作CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征,如复制起点和/或染色体整合元件,如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合,分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如,如果期望分泌抗体或双特异性抗原结合分子,那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的核酸上游。依照信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出,就将信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽,其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中,使用天然的信号肽,例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者,可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如,可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替代。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记抗体或双特异性抗原结合分子的短蛋白序列的DNA纳入抗体或双特异性抗原结合分子(片段)编码多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个此类实施方案中,宿主细胞包含一种或多种载体(例如已用载体转化或转染),一种或多种载体包含编码本发明抗体或双特异性抗原结合分子(的部分)的一种或多种多核苷酸。如本文中使用的,术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持抗体或双特异性抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时,可用特定的表达载体转染或转导此类细胞,并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐,从而获得充足量的抗体或双特异性抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌,或各种真核细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO),昆虫细胞等。例如,可以在细菌中生成多肽,尤其在不需要糖基化时。在表达后,可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外,真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已被“人源化”,导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004),和Li等,Nat Biotech 24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株,特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如,适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞,如例如记载于Graham等,J Gen Virol 36,59(1977)),幼仓鼠肾细胞(BHK),小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞,如例如记载于Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)的),猴肾细胞(CV1),非洲绿猴肾细胞(VERO-76),人宫颈癌细胞(HELA),犬肾细胞(MDCK),牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A),人肺细胞(W138),人肝细胞(Hep G2),小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562),TRI细胞(如例如记载于Mather等,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)的),MRC 5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO,NS0,P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞等,但还包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0,Sp20细胞)。
本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链,从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。
在一个实施方案中,提供了生成依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的方法,其中方法包括在适合于抗体或双特异性抗原结合分子表达的条件下培养包含编码抗体或双特异性抗原结合分子的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的),并任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体或双特异性抗原结合分子。
本发明的双特异性抗原结合分子(或抗体)的各构件可以彼此遗传融合。双特异性抗原结合分子可设计为使其构件直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度,并可以测试功效。双特异性抗原结合分子不同构件之间的接头序列的例子在本文中提供。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合的各个构件(若期望的话),例如内肽酶识别序列。
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子一般至少包含能结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies,alaboratory manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建,可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
可以将任何动物种类的抗体,抗体片段,抗原结合域或可变区用于本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。可用于本发明的非限制性抗体,抗体片段,抗原结合域或可变区可以是鼠,灵长类或人起源的。如果抗体或双特异性抗原结合分子意图供人使用,那么可以使用嵌合形式的抗体,其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现,包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上,保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基),(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上,或(c)移植完整的非人可变域,但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro andFransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008),并且进一步记载于例如Riechmann etal.,Nature332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri etal.,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua etal.,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；和Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)和Klimkaet al.,Br.J.Cancer 83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。可以用于人源化的人框架区包括但不限于:使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosoket al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地,人抗体记载于vanDijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体,转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座,其替换内源免疫球蛋白基因座,或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中,一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述,见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584,其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429,其描述了技术；美国专利No.7,041,870,其描述了K-M技术,和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900,其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过自人抗体文库分离来生成人抗体,如本文中描述的。
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离在本发明中有用的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner et al.,Nature Reviews 16:498-508(2016)。例如,用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Frenzel et al.,mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan et al.,Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao et al.,Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)和Hoogenboom et al.,于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)和Marks and Bradbury,于Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)。
在某些噬菌体展示方法中,将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆,并在噬菌体文库中随机重组,然后可以对噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体,如记载于Winter et al.,Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体,而不需要构建杂交瘤。或者,可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫接种的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源,如由Griffiths et al.,EMBO Journal 12:725-734(1993)描述的。最后,也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段,并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库,如由Hoogenboom and Winter,Journal of MolecularBiology 227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如:美国专利No.5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490和美国专利公开文本No.2005/0079574,2007/0117126,2007/0237764和2007/0292936。本领域知道的用于对组合文库筛选具有一种或多种期望活性的抗体的方法的别的例子包括核糖体和mRNA展示,以及用于在细菌,哺乳动物细胞,昆虫细胞或酵母细胞上展示和选择抗体的方法。用于酵母表面展示的方法的综述见例如Scholler et al.,Methods in Molecular Biology 503:135-56(2012)和Cherf et al.,Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao etal.,Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)。用于核糖体展示的方法记载于例如He et al.,Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes et al.,PNAS 94:4937-4942(1997)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的抗体或双特异性抗原结合分子,技术如高效液相层析,离子交换层析,凝胶电泳,亲和层析,大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素,如净电荷,疏水性,亲水性等,而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化,能使用抗体或双特异性抗原结合分子结合的抗体,配体,受体或抗原。例如,对于本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化,可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离抗体或双特异性抗原结合分子,基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定抗体或双特异性抗原结合分子的纯度,包括凝胶电泳,高压液相层析等。
组合物,配制剂和施用路径
在一个别的方面,本发明提供包含本文中提供的任一种抗体或双特异性抗原结合分子的药学组合物,例如用于以下任一种治疗方法。在一个实施方案中,药学组合物包含本文中提供的任一种抗体或双特异性抗原结合分子以及药学可接受载体。在另一个实施方案中,药学组合物包含本文中提供的任一种抗体或双特异性抗原结合分子以及至少一种另外的治疗剂,例如如下文描述的。
还提供以适于体内施用的形式生成本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的方法,方法包括(a)获得依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子,并(b)将抗体或双特异性抗原结合分子与至少一种药学可接受载体配制在一起,由此配制成用于体内施用的抗体或双特异性抗原结合分子制剂。
本发明的药学组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的抗体或双特异性抗原结合分子。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性,即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利,变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开,制备含有抗体或双特异性抗原结合分子以及任选地另外的活性成分的药学组合物将是本领域技术人员已知的,如由Remington’s PharmaceuticalSciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990例示的,其通过提述并入本文。此外,对于动物(例如人)施用,会理解制剂应当满足FDA生物标准部门(FDA Office of BiologicalStandards)或其它国家的相应机构要求的无菌性,热原性(pyrogenicity),一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的,“药学可接受载体”包括任何和所有的溶剂,缓冲剂,分散介质,涂料材料,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗细菌剂,抗真菌剂),等张剂,吸收延缓剂,盐,防腐剂,抗氧化剂,蛋白质,药物,药物稳定剂,聚合物,凝胶,粘合剂,赋形剂,崩解剂(disintegration agent),润滑剂,甜味剂,芳香剂,染料,此类类似的材料及其组合,如本领域普通技术人员将已知的(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329,通过提述并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容,涵盖其在治疗或药学组合物中的使用。
可以通过任何合适的手段,包括胃肠外,肺内,和鼻内,及若期望用于局部治疗的话,损伤内施用来施用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以通过任何合适的路径,例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射进行。
胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用,例如皮下,皮内,损伤内,静脉内,动脉内,肌内,鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射,可以将本发明的抗体或双特异性抗原结合分子在水性溶液,优选地在生理学相容的缓冲液中配制,生理学相容的缓冲液如汉克(Hanks)氏溶液,林格(Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂。或者,抗体或双特异性抗原结合分子可以为粉末形式,用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。根据需要,通过将本发明的抗体或双特异性抗原结合分子以需要的量掺入到具有下文列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌,例如通过过滤流过无菌过滤膜进行。一般地,通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散剂,无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液,悬液或乳剂的无菌粉末的情况中,优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术,其将活性成分以及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应当是适当缓冲的,并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的,并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会领会的是,应当将内毒素污染最少保持于安全水平,例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受载体包括但不限于:缓冲剂如磷酸盐,柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质,如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物,如羧甲基纤维素钠,山梨糖醇,葡聚糖等。任选地,悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。另外,可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯,如乙基cleats或甘油三酯或脂质体。
可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂,例如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊剂中,在胶体药物投递系统(例如脂质体,清蛋白微球,微乳剂,纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液(macroemulsion)中包载。此类技术披露于Remington’sPharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack PrintingCompany,1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质,基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施方案中,可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,来产生可注射组合物的延长吸收。
在先前描述的组合物外,抗体或双特异性抗原结合分子还可以配制为贮存(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用此类长效配制剂。如此,例如抗体或双特异性抗原结合分子可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制,或配制为微溶性衍生物,例如微溶性盐。
可以通过常规的混合,溶解,乳化,包囊,包载或冻干过程来制备包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的药学组合物。可以以常规方式配制药学组合物,其使用一种或多种有助于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体,稀释剂,赋形剂或辅助剂。合适的配制剂依赖于选择的施用路径。
可以将抗体或双特异性抗原结合分子以游离酸或碱,中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acidaddition salt),例如与蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些,或与无机酸(如例如氢氯酸或磷酸)或与有机酸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠,钾,铵,钙或铁；或有机碱如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。
治疗方法和组合物
可以将本文中提供的任一种抗体或双特异性抗原结合分子用在治疗方法中。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可用作免疫治疗剂,例如在癌症的治疗中。
对于在治疗方法中的使用,将以与优良医学实践一致的方式配制,给药和施用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症,治疗的特定哺乳动物,个体患者的临床状况,病症的起因,药剂的投递部位,施用方法,施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。
在一个方面,提供用作药物的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在别的方面,提供用于治疗疾病的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,提供用于治疗方法的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,本发明提供如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子,用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中,本发明提供抗体或双特异性抗原结合分子,用于治疗患有疾病的个体的方法,方法包括对个体施用治疗有效量的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中,疾病是癌症。在某些实施方案中,方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在别的实施方案中,本发明提供如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子,用于诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施方案中,本发明提供抗体或双特异性抗原结合分子,用于在个体中诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞裂解的方法,方法包括对个体施用有效量的抗体或双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物,优选是人。
在一个别的方面,本发明提供本发明的抗体或双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中,药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个别的实施方案中,药物用于治疗疾病的方法,方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中,疾病是癌症。在一个实施方案中,方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在一个别的实施方案中,药物用于诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞的裂解。仍在别的实施方案中,药物用于在个体中诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞裂解的方法,方法包括对个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选是人。
在一个别的方面,本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中,方法包括对患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,对所述个体施用组合物,其包含药学可接受的形式的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中,疾病是癌症。在某些实施方案中,方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任何实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选是人。
在一个别的方面,本发明提供一种用于诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中,方法包括在存在T细胞,特别是细胞毒性T细胞的情况下使靶细胞与本发明的抗体或双特异性抗原结合分子接触。在一个别的方面,提供一种用于在个体中诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个此类实施方案中,方法包括对个体施用有效量的抗体或双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中,“个体”是人。
在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症,特别是癌症。癌症的非限制性例子包括血液学癌症,诸如白血病,膀胱癌,脑癌,头和颈癌,胰腺癌,胆癌,甲状腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,宫颈癌,子宫内膜癌,食道癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,前列腺癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,肉瘤,骨癌和肾癌。其它可使用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于下列各项中的新生物:腹部,骨,乳房,消化系统,肝,胰,腹膜,内分泌腺(肾上腺,副甲状腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头和颈,神经系统(中枢和外周),淋巴系统,骨盆,皮肤,软组织,脾,胸区,和泌尿生殖系统。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由血液学癌症(诸如白血病),肾癌,膀胱癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头和颈癌和前列腺癌组成的组。在一个实施方案中,癌症是血液学癌症,特别是白血病,最特别是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)或急性髓性白血病(AML)。熟练技术人员容易地认可在许多情况下,抗体或双特异性抗原结合分子可能不提供治愈而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中,具有一些益处的生理学变化也被视为治疗有益的。如此,在一些实施方案中,提供生理学变化的抗体或双特异性抗原结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者,患者或个体通常为哺乳动物,更特定地为人。
在一些实施方案中,对细胞施用有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中,对个体施用治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型,施用路径,患者的体重,抗体或双特异性抗原结合分子的类型,疾病的严重程度和进程,施用抗体或双特异性抗原结合分子是为了预防还是治疗目的,先前或同时的治疗干预,患者的临床史和对抗体或双特异性抗原结合分子的响应,以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药进度表,包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用,推注施用,和脉冲输注。
抗体或双特异性抗原结合分子适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或双特异性抗原结合分子可以是用于对患者施用的起始候选剂量,不管是例如通过一次或多次分开的施用,还是通过连续输注进行。根据上文提及的因素,一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在数天或更长时间里的重复施用,根据状况,治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。抗体或双特异性抗原结合分子的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中,剂量还可包括每次施用从约1微克/kg体重,约5微克/kg体重,约10微克/kg体重,约50微克/kg体重,约100微克/kg体重,约200微克/kg体重,约350微克/kg体重,约500微克/kg体重,约1毫克/kg体重,约5毫克/kg体重,约10毫克/kg体重,约50毫克/kg体重,约100毫克/kg体重,约200毫克/kg体重,约350毫克/kg体重,约500毫克/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,以及其中可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中,基于上文描述的数目,可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围,约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重的范围等。如此,可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用此类剂量,例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20,或例如约6剂的抗体或双特异性抗原结合分子)。可以施用起始较高的加载剂量,继之以一剂或多剂较低剂量。然而,可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测此疗法的进展。
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途,以治疗有效量施用或应用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子,或其药学组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内,尤其根据本文中提供的详细公开内容。
对于系统性施用,能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。
使用本领域中公知的技术,还能从体内数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的抗体或双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的可用患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天,通常约0.5至1mg/kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况中,抗体或双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量一般将提供治疗益处,而不导致实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定抗体或双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数,其可以表述为LD50/ED50比。优选展现出较大治疗指数的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地,剂量处于具有很小或无毒性的循环浓度(包含ED50)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素,例如采用的剂量形式,利用的施用路径,受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况,各个内科医生可以选择确切的配制剂,施用路径和剂量(参见例如Fingl等,1975,于:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1,通过提述完整并入本文)。
用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止,中断或调整施用(由于毒性,器官功能障碍等)。相反,如果临床应答不适当(排除毒性),主治内科医生还将知晓将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级将随待治疗的状况的严重程度,施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外,剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄,体重和应答而变化。
其它药剂和治疗
本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。此类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的活性成分,优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中,另外的治疗剂是免疫调控剂,细胞抑制剂,细胞粘着的抑制剂,细胞毒剂,细胞凋亡的激活剂,或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。在一个具体的实施方案中,另外的治疗剂是抗癌剂,例如微管破坏物,抗代谢物,拓扑异构酶抑制剂,DNA嵌入剂,烷化剂,激素疗法,激酶抑制剂,受体拮抗剂,肿瘤细胞凋亡的激活剂,或抗血管生成剂。
此类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于使用的抗体或双特异性抗原结合分子的量,病症或治疗的类型以及上文讨论的其它因素。抗体或双特异性抗原结合分子一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径,或以本文中描述的剂量的约1至99％,或通过凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。
上文记载的此类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分开的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用,在该情况中,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前,同时和/或之后发生。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子还可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一个方面,提供含有可用于治疗,预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋等。容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物,其自身或与另一组合物组合对于治疗,预防和/或诊断状况是有效的,并且可以具有无菌的存取口(例如,容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的状况。此外,制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器,其中组合物包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器,其中组合物包含另外的细胞毒性或其它方面治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页,其指示组合物可用于治疗特定状况。或者/另外,制品还可以包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲液,如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料,包括其它缓冲液,稀释剂,滤器,针,和注射器。用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中,本文中提供的任何抗HLA-A2/WT1抗体可用于检测生物学样品中HLA-A2/WT1的存在。在用于本文时,术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中,生物学样品包含细胞或组织,诸如前列腺组织。
在一个实施方案中,提供了在诊断或检测方法中使用的抗HLA-A2/WT1抗体。在又一方面,提供了检测生物学样品中HLA-A2/WT1的存在的方法。在某些实施方案中,方法包括在容许抗HLA-A2/WT1抗体结合HLA-A2/WT1的条件下使生物学样品与抗HLA-A2/WT1抗体接触,如本文中所描述的,并检测是否在抗HLA-A2/WT1抗体与HLA-A2/WT1之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中,使用抗HLA-A2/WT1抗体来选择适合用抗HLA-A2/WT1抗体治疗的受试者,例如其中HLA-A2/WT1是用于选择患者的生物标志物。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症,特别是前列腺癌。
在某些实施方案中,提供了经标记的抗HLA-A2/WT1抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光,发色,电子致密,化学发光,和放射性标记物),和例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块,诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P,14C,125I,3H,和131I,荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物,罗丹明(rhodamine)及其衍生物,丹酰,伞形酮,萤光素酶,例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456),萤光素,2,3-二氢酞嗪二酮,辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖类氧化酶,例如葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联),乳过氧化物酶,或微过氧化物酶,生物素/亲合素,自旋标记物,噬菌体标记物,稳定的自由基,等等。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践各种其它实施方案。
实施例1:针对HLA-A2/WT1的Fab结合物的生成
抗HLA-A2/WT1 Fab的选择和筛选
通过噬菌体展示自基于完整人框架及VL(3种不同长度)和VH域(6种不同长度)的CDR3中的序列多样性的合成Fab文库选择抗HLA-A2/WT1 Fab。
依照下面的方案在溶液中实施选择轮次(生物淘选):1.在用500nM无关生物素化HLA-A2/WT1VLD复合物包被的中性亲合素包被的96孔板中预清洁约1012个噬菌粒颗粒每个文库集合,2.将非HLA-A2/WT1VLD结合性噬菌粒颗粒与100nM生物素化HLA-A2/WT1RMF复合物一起在800μl的总体积中温育0.5小时,3.通过在摇床上添加80μl链霉亲合素包被的磁性颗粒达20分钟来捕捉生物素化HLA-A2/WT1RMF和特异性结合噬菌体,4.使用磁性颗粒分离器清洗各自磁性颗粒,用1ml PBS/Tween 20清洗5-10次和用1ml PBS清洗5-10次,5.通过添加l ml100mM三乙胺(TEA)达5-10分钟来洗脱噬菌体颗粒并通过添加1/2体积的1M Tris/HCl pH7.4来中和,6.用洗脱的噬菌体颗粒再感染对数期大肠杆菌TG1细胞,用辅助噬菌体VCSM13感染,在摇床上于30℃温育过夜并随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒,要用于下一个选择轮次。
使用100nM的恒定抗原浓度进行3至4轮选择。
在具有恒定抗原浓度的选择活动以外,用100nM,50nM,10nM和5nM的递减抗原浓度进行别的选择活动以选择具有更低亲和力的抗体。
HLA-A2/WT1结合测定法:用于表征通过噬菌体展示获得的Fab的夹心式ELISA
以96孔格式作为1ml培养物以细菌表达个体克隆并将上清液提交通过ELISA的筛选。特异性结合物定义为具有比背景高5倍的HLA-A2/WT1RMF信号和比背景低3倍的HLA-A2/WT1VLD信号。更加精确地,将中性亲合素96孔条板(Thermo Fisher)用10nM HLA-A2/WT1RMF或50nM HLA-A2/WT1VLD于37℃包被30分钟,继以将板用2％(w/v)牛奶-磷酸盐缓冲盐水(MPBS)(200μl/孔)于室温封闭1小时。将板用PBS清洗3次,然后添加含有Fab的细菌上清液并将板于室温温育1小时。在另一个3个PBS清洗步骤后,添加抗FLAG-HRP二抗(Sigma,目录号A8592)(1:4000)并将板在摇床上于室温温育1小时。将板用PBS清洗3次并通过添加100μl/孔BM Blue POD(Roche)来显色。通过添加50μl/孔1M H2SO4来停止酶促反应。于450nm读取OD(参照650nm),用于OD450-650的最终读出。将ELISA阳性克隆提交下文描述的动力学筛选实验。
HLA-A2/WT1结合测定法:用于动力学表征通过噬菌体展示获得的Fab的表面等离 振子共振
使用ProteOn XPR36生物传感器(BioRad)通过含有Fab的细菌培养物上清液的表面等离振子共振筛选来鉴定特异性结合物。简言之,在用洗脱的噬菌体颗粒感染指数期大肠杆菌TG1细胞后,将单集落形成单位(cfu)涂板并挑取,用于在96深孔板中接种1ml表达培养物。
于25℃使用PBST作为运行缓冲液(10mM PBS,pH 7.4和0.005％(v/v)Tween 20)实施所有实验。使用来自BioRad Inc.(Hercules,CA)的配备有GLC和GLM传感器芯片的ProteOn XPR36生物传感器和偶联试剂(10mM乙酸钠pH 4.5,磺基-N-羟基琥珀酰亚胺[sulfo-NHS],1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐[EDC]和乙醇胺)。
在GLM芯片上以30μl/min实施固定化。使用标准胺偶联规程以垂直方向偶联pAb(山羊)抗人IgG,F(ab)2特异性抗体(Jackson ImmunoResearch):用EDC(200mM)和sulfo-NHS(50mM)的混合物活化所有六个配体通道5分钟。在活化表面后,立即跨越所有六个通道注射pAb(山羊)抗人IgG,F(ab)2特异性抗体(50μg/ml,10mM乙酸钠,pH 5)5分钟。最后,用注射1M乙醇胺-HCl(pH 8.5)5分钟来封闭通道。在所有通道上最终的固定化水平是相似的,范围为11000至11500RU。通过沿着五个分开的水平通道同时注射(30μl/min)5分钟自大肠杆菌上清液捕捉Fab变体并导致范围为200至900RU的水平,取决于上清液中Fab的浓度。沿着第六个通道注射条件化培养基以提供‘在线’空白,用于双重参照目的。通过沿着垂直通道注射HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD的稀释系列(100,50,25,12.5,6.25,0nM,50μl/min)2分钟来实施一击动力学测量。监测解离3分钟。在ProteOn Manager v.2.1中分析动力学数据。反应点数据的加工牵涉应用点间参照和使用在线缓冲液空白的双重参照步骤(Myszka,JMol Recognit(1999)12,279-284)。将来自副本一击注射的经过加工的数据拟合简单1:1Langmuir结合模型,无质量传输(O'Shannessy et al.,Anal Biochem(1993)212,457-468)。
对于来自6孔格式的HEK生成的上清液的IgG的测量,通过沿着五个分开的水平通道(30μl/min)同时注射5分钟自HEK293上清液捕捉IgG变体并导致范围为200至400RU的水平。沿着第六个通道注射条件化培养基以提供‘在线’空白,用于双重参照目的。通过沿着垂直通道注射HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD的稀释系列(100,50,25,12.5,6.25,0nM,50μl/min)3分钟来实施一击动力学测量。监测解离5分钟。如上文所述分析动力学数据。
基于结合概况和测量到的对抗原的结合的特异性,结合物入围并在细胞结合测定法中测量。
所有选定结合物(11D06,33H09,13B04,11B09,33F05,5E11,13E08,5C01,11G06)的序列提供于本文中包括的序列表并汇总于下文表1。
表1:选定HLA-A2/WT1结合物的氨基酸序列
实施例2:HLA-A2/WT1 IgG和HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的制备
克隆
使用常规(非基于PCR的)克隆技术将编码蛋白质的cDNA克隆入载体系统(Evitria)。基因合成载体质粒。基于阴离子交换层析在低内毒素条件下制备质粒DNA。通过测量260nm波长处的吸收来测定DNA浓度。用Sanger测序验证序列的正确性(多至两个测序反应每种质粒,取决于cDNA的大小)。
生成
通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞(在Excell培养培养基中无血清悬浮培养)来生成IgG抗体和双特异性抗体。将细胞离心并用预温热的CD CHO培养基替换培养基。在CD CHO培养基中混合表达载体,添加聚乙烯亚胺(PEI),将溶液漩涡震荡并于室温温育10分钟。之后,将细胞与DNA/PEI溶液混合,转移至摇瓶并在具有5％ CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育后,添加具有补充物的Excell培养基。在转染后1天添加补充物。在7天后收获细胞上清液并通过标准方法来纯化。
或者,使用悬浮适应的CHO K1细胞(最初来自ATCC并适应悬浮培养中的无血清生长)进行生成。在eviGrow培养基(一种化学限定,无动物成分,无血清培养基)中培养种子。用eviFect转染试剂转染细胞,并在转染后在eviMake2(一种无动物成分,无血清培养基)中培养细胞。通过离心和随后的过滤(0.2μm滤器)来收获上清液。
纯化
参照标准方案自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之,通过使用蛋白A的亲和层析(HiTrap蛋白A HP柱,GE Healthcare)自细胞培养物上清液纯化含有Fc的蛋白。于pH 3.0实现洗脱,继以立即中和样品。浓缩蛋白并通过20mM组氨酸,140mM氯化钠,pH6.0中的大小排阻层析(HiLoad Superdex 200柱,GE Healthcare)将聚集的蛋白与单体蛋白分开。
分析
依照Pace et al.,Protein Science,1995,4,2411-1423,使用基于氨基酸序列计算的摩尔消化系数,通过测量280nm处的光密度(OD)来测定纯化的蛋白的浓度。使用Lab芯片GXII系统(Caliper Lifescience)通过在还原剂存在和缺失下的CE-SDS分析蛋白的纯度和分子量。于25℃使用在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸单盐酸盐,pH 6.7运行缓冲液中平衡的分析性大小排阻柱(TSKgel G3000 SW XL,Tosoh)通过HPLC层析实施聚集体含量的测定。
CD3双特异性抗体在本文中还称作“T细胞双特异性抗体”或“TCB”。在这个实施例中制备的双特异性抗体的一种示意性例示在图2中给出。
TCB的例示性序列在SEQ ID NO:123,124,125和129(11D06 TCB)和SEQ ID NO:126,127,128和129(33H09-TCB)中给出。使用相应的HLA-A2/WT1结合物的VH和VL序列,以类似方式构建其它TCB。
作为对照,制备了基于与抗体ESK1相似的结合物的HLA-A2/WT1 xCD3双特异性抗体(TCB)(Dao et al.,Sci Transl Med(2013)5,176ra33；WO2012/135854)–在本文中称作“ESK1-TCB”(可变区序列见SEQ ID NO:73和74)–以及非靶向性TCB(可变区序列见SEQ IDNO:75和76)。
遵循相同的方法生成和纯化所有分子。所有分子的最终质量都很好,在CE-SDS上具有几乎100％单体含量和100％纯度。
实施例3:HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的亲和力和亲合力的生化分析
为了测定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体对HLA-A2/WT1RMF的亲和力,于25℃在Biacore T200中实施表面等离振子共振(SPR)实验,以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4,0.15M NaCl,0.005％表面活性剂P20(GE Healthcare))。通过胺偶联在CM5芯片(GE Healthcare)上直接固定化抗人Fc特异性抗体(GE Healthcare,目录号BR-1008-39)。于5nM捕捉双特异性构建物达30秒。以30μl/min使HLA-A2/WT1RMF复合物在HBS-EP中的三倍稀释系列(1.03至250nM)经过配体达120秒以记录结合阶段。监测解离阶段达120秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环后使用以10μl/min注射3M MgCl2达30秒来再生芯片表面。通过减去在含有抗人Fc抗体,但是在它上面没有捕捉双特异性构建物的参照流动室上获得的响应来校正本体折射率(bulk refractive index)差异。通过使用BIAeval软件(GE Healthcare)拟合1:1Langmuir结合自动力学速率常数推导亲和力常数。
为了测定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体对HLA-A2/WT1RMF的亲合力和特异性,再次于25℃在Biacore T200上实施SPR实验,以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,0.005％表面活性剂P20(GE Healthcare))。通过胺偶联在CM5芯片(GEHealthcare)上直接固定化抗His抗体(Penta His,Qiagen目录号34660)。于5或10nM(分别用于双特异性抗体或IgG测量)以10μl/min捕捉HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD达30秒。以30μl/min使双特异性构建物在HBS-EP中的3倍稀释系列(1.23至100nM)经过配体达120以记录结合阶段。监测解离阶段达240秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环后使用注射10mM甘氨酸pH 2达60秒来再生芯片表面。通过减去在参照流动室(其含有抗His抗体,但是在它上面没有捕捉HLA-A2/WT1RMF)上获得的响应来校正本体折射率差异。即使它是2:1相互作用(分析物是二价的),通过使用BIAeval软件(GE Healthcare)拟合1:1Langmuir结合自动力学速率常数推导亲和力常数。这产生代表相互作用的亲合力的表观KD。
这些实验的结果汇总于下文表2。两种测试的HLA-A2/WT1抗体均以两位数纳摩尔(单价)亲和力/三位数皮摩尔(二价)亲和力(亲合力)结合HLA-A2/WT1RMF,而且在自IgG转变成双特异性格式时保持相同的亲和力/亲合力。虽然两种测试的抗体的亲和力相差约两倍,但是两种分子的亲合力在相同范围中。
没有检测到测试的HLA-A2/WT1抗体对HLA-A2/WT1VLD的结合(数据未显示)。
表2:通过SPR测定的选定HLA-A2/WT1 IgG和HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)对HLA-A2/WT1RMF的亲和力和亲合力数据的汇总
为了测定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体对CD3的亲和力,于25℃在BiacoreT200上实施表面等离振子共振(SPR)实验,以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,0.005％表面活性剂P20(GE Healthcare))。通过胺偶联在CM5芯片(GEHealthcare)上直接固定化抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare,目录号28-9583-25)。于5nM捕捉双特异性构建物达40秒。以30μl/min使CD3εδ-Fc融合分子在HBS-EP中的三倍稀释系列(12.35至3000nM)经过双特异性抗体达240秒以记录结合阶段。监测解离阶段达240秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环后使用以30μl/min两次注射10mM甘氨酸-HCl pH 2.1达60秒来再生芯片表面。通过减去在参照流动室(其含有抗人Fab抗体,但是在它上面没有捕捉双特异性构建物)上获得的响应来校正本体折射率差异。通过使用BIAeval软件(GE Healthcare)拟合1:1Langmuir结合自动力学速率常数推导亲和力常数。
结果汇总于表3。由于CD3结合物在两种测试的双特异性分子中是相同的,正如预期的,因此它们对CD3的亲和力本质上是相同的。
表3:通过SPR测定的选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)对CD3的亲和力数据的汇总
实施例4:为了针对HLA-A2/WT1肽RMF或VLD的特异性对IgG结合物的选择
我们首先通过流式细胞术在经肽脉冲的T2细胞上测量自噬菌体展示生成的IgG结合物的结合特异性。简言之,作为补充有10％ FBS(Gibco,目录号16140-071)和1％青霉素-链霉素(Gibco,目录号15070-063)的IMDM培养基(Gibco by Life Technologies,目录号31980-048)(完全培养基)中106个细胞/ml的细胞悬浮液制备T2细胞。将细胞以10ml的总体积保持在管中,并与10μl 10-2M(肽的终浓度:10-5M)肽(WT1 p37-45 VLD肽(SEQ ID NO:77)或p126-134 RMF肽(SEQ ID NO:78))一起于37℃以5％ CO2温育2小时。在清洗后,在冷PBS中悬浮细胞并与滴定浓度的IgG结合物(10μg/ml至0.00064μg/ml)一起于4℃温育1小时,继以与抗人IgG-Fc藻红蛋白(PE)缀合的二抗(Jackson Laboratories,目录号109-116-098)一起温育30分钟。在FACS LSR II(BD)上采集细胞,并在Graphpad Prism中作为PE的均值荧光强度(MFI)呈现数据。
如图3中显示的,11D06-IgG,33H09-IgG和5E11-IgG均结合经RMF肽脉冲的T2细胞,但是不结合未脉冲的或经VLD肽脉冲的T2细胞。与之对比,11B09-IgG,13B04-IgG和5C01-IgG(但非11G06-IgG)均特异性结合VLD肽,但非RMF肽。基于这些数据,选择用于转变成CD3双特异性抗体(TCB)的结合物。
实施例5:NFAT-Jurkat报告物测定法中HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)结合经肽脉冲的T2细胞后T细胞的激活
为了检查HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)的特异性,使用报告细胞系在NFAT的启动子下表达萤光素酶的Jurkat细胞(Jurkat-NFAT；Promega目录号CS176501)来测量当TCB结合经肽脉冲的T2细胞(ATCC,目录号CRL-1992)时T细胞的激活。简言之,作为补充有10％ FBS(Gibco,目录号16140-071)和1％青霉素-链霉素(Gibco,目录号15070-063)的IMDM培养基(Gibco by Life Technologies,目录号31980-048)(完全培养基)中106个细胞/ml的细胞悬浮液制备T2细胞。将细胞以10ml的总体积保持在管中,并与10μl10-2M(肽的终浓度:10-5M)肽(WT1 p37-45 VLD肽或p126-134 RMF肽)一起于37℃以5％ CO2温育2小时。在清洗后,将90μl经肽脉冲的细胞(2.2x105个细胞/ml的细胞悬浮液)接种入96孔微量滴定圆底板(20,000个细胞/孔,TPP,目录号92097),与50μl Jurkat-NFAT(2x106个细胞/ml的细胞悬浮液)和10μl滴定的TCB(100μg/ml至0.0064μg/ml,在PBS中)于37℃以5％ CO2共培养16小时。其后,取出50μl上清液,并用100μl/孔Bright-Glo萤光素酶测定法(Promega,目录号E2620)替换,用于于室温(RT)温育。在5分钟后,将180μl上清液转移入新的白色板以通过EnVision(PerkinElmer)测量发光信号。作为相对发光单位(RLU)呈现数据。
如图4中显示的,基于11D06和33H09结合物的TCB(分别是11D06-TCB和33H09-TCB)特异性识别HLA-A2/WT1RMF复合物并仅仅在用RMF肽脉冲的T2细胞存在下激活报告物Jurkat细胞上的NFAT。与其对比,基于ESK1样结合物的对照TCB(ESK1-TCB)不显示针对RMF肽的特异性。还有,基于5E11结合物的TCB(5E11-TCB)在经RMF和VLD肽脉冲的T2细胞二者存在下显示NFAT报告T细胞的激活,因而对下一轮筛选消除这种TCB。还鉴定出一些VLD肽特异性TCB,诸如基于11B09和13B04结合物的(分别是11B09-TCB和13B04-TCB)。作为阴性对照,在测定法中使用非靶向性TCB(DP47GS-TCB),其并不在经RMF或VLD肽脉冲的T2细胞存在下激活报告Jurkat细胞上的NFAT。5C01-TCB显示对VLD肽的识别,但是在更高浓度与RMF肽交叉反应。
实施例6:结合经肽脉冲的T2细胞后由HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)介导的T细胞细胞毒性
接下来,我们测量TCB的细胞毒性。靶细胞是如实施例5中描述的经肽脉冲的T2细胞。效应细胞是自通过Ficoll(GE Healthcare,目录号17-1440-03)梯度离心分离自血沉棕黄层的PBMC纯化的泛CD3+细胞。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,目录号130-096-535)通过MACS(Miltenyi Biotec)纯化总CD3+T细胞。如下实施细胞毒性测定法:将经肽脉冲的细胞(100μl)接种入96孔微量滴定圆底板(3x105个细胞/ml),与50μl T细胞(6x106个细胞/ml)和50μl在完全培养基中滴定的TCB(40μg/ml至0.00004μg/ml)于37℃以5％CO2共培养18小时。其后,将50μl上清液转移入新的白色板,并添加25μl/孔CytoTox-Glo萤光素酶测定法(Promega,目录号G9291),用于于室温(RT)温育15分钟。通过EnVision(PerkinElmer)读取发光信号(用于测量LDH释放作为细胞死亡的指示)。作为相对发光单位(RLU)呈现数据。
图5显示TCB介导的对RMF或VLD表达性靶细胞的特异性T细胞杀伤。我们发现11D06-TCB和33H09-TCB均显示对经RMF肽脉冲的T2细胞的特异性杀伤。33F05-TCB不介导对经RMF或VLD肽脉冲的细胞的特异性杀伤。另外,13B04-TCB和11B09-TCB介导对经VLD肽脉冲的T2细胞的有力杀伤。5C01-TCB显示对经VLD脉冲的T2细胞的杀伤,但是在更高浓度也显示对经RMF脉冲的细胞的杀伤,与NFAT报告物测定法中的观察结果一致(图4)。
实施例7:结合WT1+细胞系后由HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)介导的T细胞细胞毒性
为了确认TCB所致特异性杀伤,我们在WT1+肿瘤细胞系上实施细胞毒性测定法。HLA-A2+WT1+细胞系是SKM-1细胞(DZMZ No.ACC 547),和经HLA-A2/WT1RMF复合物转染的CHO细胞(CHO-WT1)(内部)。阴性对照是HLA-A2+WT1-细胞:BJAB(DZMZ No.ACC 757),ARH-77(DZMZ No.ACC 512),和经HLA-A2/MAGE-A4复合物转染的CHO细胞(CHO-MAGEA4)(内部),以及HLA-A2-WT1+细胞系:K562(ATCC No.CLL-243)(图6A)。如实施例6中所述实施细胞毒性测定法。11D06-TCB和33H09-TCB均显示对SKM-1和CHO-WT1细胞的有力杀伤,但非对任何HLA-A2+WT1-细胞和HLA-A2-WT1+细胞,指示这两种TCB具有针对WT1肽RMF的特异性(图6B,C)。与之对比,VLD肽特异性TCB无一显示对HLA-A2+WT1+细胞系的杀伤,而且如果它们在高浓度(10μg/ml)显示对WT1+细胞系的低效力杀伤的话,对WT1-细胞系同样看到相同程度的杀伤(图6D,E)。基于这些功能数据,我们选择11D06-TCB和33H09-TCB用于进一步评估。
我们还对我们的选定TCB与ESK1-TCB比较它们对肿瘤靶细胞的杀伤活性。有趣的是,尽管ESK1-TCB在介导SKM-1细胞杀伤中实现与11D06-TCB和33H09-TCB相比相似的效力,它还诱导对HLA-A2+WT-1-BJAB细胞的杀伤,指示ESK1-TCB结合不局限于HLA-A2/WT1RMF复合物(图6F,G)
我们测试对HLA-A2+WT1+的多种肿瘤细胞系的杀伤。基于杀伤的EC50值,将细胞系归入以<1μM的EC50杀伤的细胞系(在表4中标记“++”),以>1μM且<5μM的EC50杀伤的细胞系(在表4中标记“+”),和本质上不杀伤的细胞系(在表4中标记“否”)。
总之,选定TCB 11D06-TCB和33H09-TCB对13种HLA-A2+WT1+细胞系中的6种介导T细胞细胞毒性。对其它细胞系的杀伤的缺乏很可能是由于细胞表面上通过MHC I呈递的WT1的低表达。表4显示11D06-TCB的结果。33H09-TCB的结果是相似的(EC50值略微高于11D06-TCB)。
表4:选定TCB对WT1+细胞系的杀伤
实施例8:结合WT1+细胞系后由HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)介导的T细胞激活
TCB介导的对WT1+靶细胞的细胞毒性的一个先决条件是激活T细胞以获取效应子功能。我们在体外杀伤测定法期间在两种选定TCB,33H09-TCB和11D06-TCB存在下在T细胞和HLA-A2+WT1-细胞SKM-1或HLA-A2+WT1-细胞BJAB的共培养物中通过流式细胞术测量T细胞的激活状态,如实施例7中描述的。在共温育18小时后收获细胞,并用针对CD3(Biolegend目录号300321),CD25(Biolegend目录号302606)和CD69(Biolegend目录号310914)的抗体染色以通过流式细胞术测量T细胞激活。
如图7中显示的,两种TCB均在结合SKM-1细胞但非BJAB细胞后诱导CD3+T细胞上CD69和CD25的上调,指示TCB对由SKM-1细胞呈递的HLA-A2/WT1RMF复合物的特异性识别触发CD3介导的T细胞激活,最终导致对靶细胞的特异性裂解。
实施例9:选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)不结合报告的脱靶肽
开发T细胞受体(TCR)样抗体的一项主要潜在风险是抗体与自由正常组织表达的蛋白呈递的肽同源物的交叉反应性。由于Ataie et al.,J Mol Biol.(2016)428:194-205报告了ESK1抗体结合自蛋白MED13L和PIGQ衍生的序列相似肽,因此我们对我们的TCB测试它们对这两种肽的交叉反应性。这些肽的序列显示于图8F,和SEQ ID NO:79和80。在基于流式细胞术的结合测定法中,如实施例4中描述的,我们发现11D06-TCB和33H09-TCB均不结合PIGQ肽。两种TCB对MED13L肽的结合与天然WT1 RMF肽相比低几乎100倍(图8A,B)。尽管ESK1-TCB以低亲和力结合RMF肽,但是它以相似方式结合PIGQ肽且甚至更强结合MED13L(图8C),与ESK1 IgG的报告结合活性(Ataie et al.,JMol Biol.(2016)428:194-205)一致。
我们还使用实施例5中所述NFAT-报告物测定法测试交叉反应性。与结合数据一致,结合MED13L和PIGQ后Jurkat细胞上NFAT激活的强度比11D06-TCB和33H09-TCB结合WT1RMF肽后的激活弱至少100倍(图8D,E)。
实施例10:选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)不结合未鉴定的脱靶肽
针对自正常组织衍生的同源肽(共享关键识别残基)的交叉反应性可能引起严重的且不容易预测的TCR样抗体或基于TCR的T细胞疗法所致毒性(见例如Linette et al.,Blood(2013)122:863-71；报告针对由心脏组织表达的蛋白的脱靶反应性所致MAGE A3-TCR疗法的致命毒性)。因此,这些药剂的特异性是至关重要的。为了彻底定义我们的抗体的特异性,基于确认RMF肽中牵涉结合11D06的位置的晶体结构数据(见实施例15),我们通过掩盖肽组数据库(Swissprot和TrEMBL)中的RxxPNxxYx将我们的研究延伸至具有与WT1RMF肽(SEQ ID NO:78)相似的氨基酸序列的潜在脱靶肽。我们发现另外25种自不同蛋白衍生的肽,均具有对HLA-A2的高预测亲和力(表5)。然后,我们使用NFAT-报告物测定法(肽1-6)或T细胞细胞毒性测定法(肽7-25)测试我们的选定TCB对经肽脉冲的T2细胞的交叉反应性,如上文描述的。
对于测试的前6种肽,11D06-TCB没有对6种肽任一的交叉反应性。33H09-TCB显示对ARHGEF11的一些识别,但是NFAT激活的程度与天然RMF肽相比低>100倍(图9A,B)。类似地,对其它19种脱靶肽的交叉反应性比天然RMF肽低至少100倍,如通过对经肽脉冲的T2细胞的直接T细胞杀伤测量的(图9C,D)。这个结果在第二项实验中得到确认,其中还测试ESK1-TCB(图9E-G)。
总之,我们确认11D06和33H09(但非ESK1样结合物)显示对WT1 RMF肽,而非肽组中检测的潜在脱靶肽的特异性。
表5:另外的新鉴定的脱靶肽
实施例11:选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)不介导对CD34+干细胞的细胞毒性
已经报告了CD34+造血干细胞是WT1阳性的(Ramani and Cowell,J.Path(1996)179:162-8),因此如果TCB会结合它们的话,可能是潜在有害的。为了研究CD34+细胞是否内源呈递RMF肽,我们自来自Lonza的3名供体获得HLA-A2+骨髓衍生CD34+细胞,并在如上文实施例7中描述的杀伤测定法中测试我们的选定TCB。尽管11D06-TCB和33H09-TCB介导对SKM-1细胞的有力杀伤,但是它们对CD34+干细胞没有杀伤活性,指示这些干细胞可能并不在HLA-A2的背景中呈递RMF肽(图10)。
实施例12:通过丙氨酸扫描测定法定义选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)的结合残基
显然,我们的TCB具有与ESK1-TCB相比不同的对RMF肽的结合和功能活性。为了表征TCB对RMF肽的潜在结合基序,我们使用通过用丙氨酸个别替换每个氨基酸自天然序列衍生的肽阵列建立丙氨酸扫描测定法,并测量用这些肽脉冲的T2细胞所致NFAT-报告物信号(图11A-L)。作为跨越递增浓度的TCB的RLU呈现数据。我们将EC50相对于天然肽的EC50的倍数变化绘图,并认为≥10的倍数变化是显著的,意味着RMF肽的各自氨基酸残基对于11D06-TCB和33H09-TCB的识别可能是关键的(图11M)。我们得出结论,11D06-TCB和33H09-TCB均具有与残基R1,F3,N5和A6的关键接触(图11N),而ESK1显示具有与RMF肽R1,P4和N5的密切接触(Ataie et al.,J Mol Biol.(2016)428:194-205)。
实施例13:NSG小鼠中单次注射后HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)的药动学概况
将单剂0.5mg/kg 33H09-TCB或11D06-TCB注射入NSG小鼠。对所有小鼠静脉内注射200μl适宜溶液。为了获得每200μl正确量的化合物,用组氨酸缓冲液稀释储备溶液。于10分钟,1小时,3小时,6小时,24小时,48小时,72小时,96小时,6天,8天,10天和12天对三只小鼠每个时间点采血。通过ELISA在血清样品中分析注射的化合物。将生物素化抗huCD3-CDR抗体(Roche Diagnostics,Penzberg,Germany),测试样品,洋地黄毒苷标记的抗huFc抗体和抗洋地黄毒苷检测抗体(过氧化物酶(POD))逐步添加至96孔链霉亲合素包被的微量滴定板并在每一个步骤后于室温温育1小时。在每一个步骤后清洗板三次以去除未结合的底物。最后,通过添加ABTS(2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)底物溶液以形成有色反应产物来显现过氧化物酶结合的复合物。于405nm(参照波长490nm)光度法测定的反应产物强度与血清中的分析物浓度成比例。结果(图12)显示测试的两种克隆的稳定的PK行为,提示用于后续功效研究的一周一次日程表。
实施例14:人源化小鼠中SKM-1异种移植物中HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)的功效研究
HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的第一项功效研究旨在就完全人源化NSG小鼠中的人急性髓样白血病(AML)异种移植物(SKM-1；HLA-A2+,WT-1+)中的功效而言比较两种不同WT1结合物(11D06和33H09)。
SKM-1细胞(人AML)最初自ATCC获得并保藏于Roche Glycart内部细胞库。在5％CO2的水饱和气氛中在RPMI+10％ FCS+1％谷氨酰胺中培养细胞。将体外传代15与Matrigel一起(1:1比)用于皮下注射,存活率98％。
依照承诺的方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光照/12小时黑暗的日周期在无特定病原体的条件下维持实验开始时4-5周龄的雌性NSG小鼠(JacksonLaboratory)。实验性研究方案得到当地政府的审查和批准。在到达后,将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康监测。
对雌性NSG小鼠腹膜内注射15mg/kg白消安,1天后继以静脉内注射1x105个自脐带血分离的人造血干细胞。在干细胞注射后第14-16周,对小鼠舌下取血并通过流式细胞术对血液分析成功的人源化。依照它们的人T细胞频率将有效植入的小鼠随机化入不同处理组。在那时,如图13A中所示对小鼠皮下注射SKM-1肿瘤细胞并当肿瘤尺寸达到大约150mm3时(第10天)用化合物或组氨酸缓冲液(媒介)一周一次处理。对所有小鼠静脉内注射200μl适宜溶液。为了获得每200μl正确量的化合物,在必要时用组氨酸缓冲液稀释储备溶液。一周三次使用测径器测量肿瘤生长并如下计算肿瘤体积:
Tv:(W2/2)x L(W:宽度,L:长度)
如下计算肿瘤生长抑制(TGI)以及肿瘤对对照比(TCR):
图13显示所有处理组中的肿瘤生长动力学(均值)(图13C)以及每个组中的单一肿瘤生长动力学(图13D-F)。如显示的,两种TCB均展现肿瘤生长抑制,其中克隆11D06显示最强的肿瘤生长抑制,TGI为101.3(图13G)。
实施例15:HLA-A2/WT1抗体/pMHC复合物的晶体结构
通过将抗体在含1.05U纤溶酶(Roche,目录号602361)每mg的50mM Tris pH 8.0,150mM NaCl中于25℃温育72小时来制备Fab片段。使用用50mM Tris,100mM甘氨酸,150mMNaCl,pH 8.0平衡的4.5mL CaptureSelect CH1亲和柱(BAC BV,目录号191.3120)将切割下来的Fc与Fab片段分开。用50mM Tris,100mM甘氨酸,150mM NaCl,pH 2.0自柱洗脱Fab片段并用0.5M磷酸钠pH 8.0中和,之后加载到用20mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4平衡的大小排阻柱S75(GE Healthcare)上。通过进行分析性大小排阻(柱Tosoh,TSK-Gel G3000SWXL,在Agilent HPLC 1200系统上)和非还原和还原条件下的CE-SDS(Caliper LabChip GXII,Perkin Elmer)来实施质量控制。在液氮中冷冻纯化的Fab片段并保存于-80℃。
5C01抗体/pMHC复合物的结晶,数据收集和结构测定
结晶。通过混合1.2倍摩尔过量的基于5C01结合物的HLA-A2/WT1 Fab片段(Fab5C01)与HLA-A2/WT1VLD肽复合物(HLA-A02/WT1VLD pMHC)来制备抗体/pMHC复合物(Fab 5C01HLA-A02/WT1VLD pMHC)。于4℃温育1小时后将混合物浓缩至10mg/ml。于21℃在坐滴蒸气扩散设置中实施初始结晶试验。在1天内自0.2M酒石酸钠,20％聚乙二醇(PEG)3350出现晶体,将10％2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)添加至结晶微滴以改善晶体质量。直接自筛选板收获晶体,没有任何进一步的优化步骤。
数据收集和结构测定。为了数据收集,将晶体在含有15％甘油的沉淀溶液中于100K闪冻。在Swiss Light Source(Villigen,Switzerland)的光束线X10SA使用PILATUS6M检测仪于波长收集衍射数据。用XDS(Kabsch,W.Acta Cryst.D66,133-144(2010))加工数据并用SADABS(BRUKER)定标。复合物的晶体属于空间群P21212,晶胞轴 且衍射至的分辨率。使用蛋白质数据库(PDB)条目4NO5的晶体结构的坐标和内部Fab结构作为搜索模型,用PHASER(McCoy,A.J,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Storoni,L.C.,and Read,R.J.J.Appl.Cryst.40,658-674(2007))通过分子置换来确定结构。通过真实空间精化使用差异电子密度来放置肽和依照序列差异改变氨基酸。用来自CCP4套装(Collaborative Computational Project,Number 4Acta Cryst.D50,760-763(1994))和BUSTER(Bricogne,G.,Blanc,E.,Brandl,M.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W.,Roversi,P.,Sharff,A.,Smart,O.S.,Vonrhein,C.,Womack,T.O.(2011)Buster version 2.9.5Cambridge,United Kingdom:GlobalPhasing Ltd)的程序精化结构。用COOT(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,W.G.and Cowtan,K.Acta Cryst D66,486-501(2010))进行手工重建。
数据收集和精化统计量在表6中汇总。
表6:Fab 5C01 HLA-A02/WT1VLD pMHC的数据收集和精化统计量
*圆括号中的值是分辨率最高的壳的。
与HLA-A02/WT1VLD复合的Fab 5C01的结构
为了表征VLD肽与Fab 5C01的相互作用细节,结合表位和5C01与HLA-A02的互补位,我们以的分辨率确定5C01与HLA-A02/WT1VLD pMHC的复合物的晶体结构(图14A)。结构揭示Fab 5C01通过轻链CDR1和CDR3的主要贡献和通过重链的所有CDR结合pMHC。来自VLD肽(SEQ ID NO:77),残基Val1,Phe4和Pro7的侧链与Fab直接接触。肽的所有其它侧链指向HLA-A02分子。肽对接触表面积的贡献是约而观察到约的总Fab-pMHC接触面积。Fab 5C01-pMHC界面的特写在图15中显示。
用程序PISA(E.Krissinel and K.Henrick(2007)J.Mol.Biol.372,774-797)分析结合界面揭示Fab 5C01与HLA-A02经由8个氢键,π-π相互作用和范德华接触的相互作用样式。在重链CDR3(Trp97)和CDR2(Ser52,Ser53)的残基与HLA-A02的Glu63和Glu166之间形成侧链氢键。由Tyr91和Ile93的轻链骨架原子与Gln155建立别的氢键。另外,复合物经由轻链残基Trp32和Trp94与Gln155和His151的HLA-A02侧链的π-π相互作用的形成而稳定化。VLD肽的N端缬氨酸经由骨架氮与HLA-A02的Tyr171承担氢键。它的侧链的取向朝向由HLA-A02的Glu63和Trp167和Fab 5C01的重链的Trp97形成的口袋。另外,肽的Phe4形成面对与重链的Tyr100的相互作用的边界。汇总接触的示意性Fab 5C01-pMHC相互作用矩阵在图16中显示。
11D06抗体/pMHC复合物的结晶,数据收集和结构测定
结晶。通过混合1:1摩尔量的基于11D06结合物的HLA-A2/WT1 Fab片段(Fab11D06)与HLA-A2/WT1RMF肽复合物(HLA-A02/WT1RMF pMHC)来制备抗体/pMHC复合物(Fab11D06 HLA-A02/WT1RMF pMHC)。于21℃温育4小时后将混合物浓缩至20mg/ml。于21℃在坐滴蒸气扩散设置中实施初始结晶试验。在4天内自0.1M Tris pH 8.0,20％ PEG 4000出现晶体。直接自筛选板收获晶体,没有任何进一步的优化步骤。
数据收集和结构测定。如上文所述收集数据,加工并定标。复合物的晶体属于空间群P21,晶胞轴β＝90.57°且衍射至的分辨率。使用内部Fab和MHC复合物结构的坐标作为搜索模型,用PHASER通过分子置换来确定结构。通过真实空间精化使用差异电子密度来放置肽和依照序列差异改变氨基酸。如上文所述进行结构精化和手工重建。
数据收集和精化统计量在表7中汇总。
表7:11D06 HLA-A02/WT1RMF pMHC的数据收集和精化统计量
*圆括号中的值是分辨率最高的壳的。
与HLA-A02/RMF pMHC复合的Fab 11D06的结构
我们以的分辨率确定Fab 11D06与HLA-A02/RMF pMHC的复合物的晶体结构(图14B)。结构显示Fab 11D06通过所有CDR的贡献结合pMHC。残基Arg1,Met2,Pro4,Asn5,Ala6和Tyr8的RMF肽(SEQ ID NO:78)侧链与Fab的轻和重链直接接触。肽的剩余侧链指向HLA-A02分子。肽对接触表面积的贡献是约总Fab-pMHC接触面积对应于约Fab11D06-pMHC界面的特写在图17中显示。
用程序PISA分析结合界面揭示Fab 11D06与HLA-A02经由4个氢键,众多π-π相互作用和范德华接触的相互作用样式。在重链CDR1(Ser30,Ser31)和CDR3(Gly100A)的残基与HLA-A02的Glu58和Arg65之间观察到氢键。由轻链残基Asp50与HLA-A02 Arg65建立别的氢键。除其它外,重链的Trp100提供与HLA-A02的Arg65和Lys66和RMF肽的Pro4的范德华和π-π接触。RMF肽的N端精氨酸以它的侧链伸入由11D06的重链的Ile96的骨架羰基,Glu97和Ser31形成的极性口袋。与11D06和HLA-A02的另外的极性接触由RMF肽残基Asn5(它是与轻链CDR1的Trp32,轻链CDR3的Glu92连同HLA-A02的Gln155的氢键网络的一部分)承担。汇总接触的示意性Fab 11D06-pMHC相互作用矩阵在图18中显示。
自公共数据库取得的ESK1的3D结构:
为了比较,就它的Fab-pMHC接触而言类似地分析结合HLA-A02/RMF pMHC的抗体(Fab)ESK1的公众可得晶体结构(PDB ID 4WUU；http://www.rcsb.org/pdb/explore/ explore.do？structureId＝4WUU)。图14C显示Fab ESK1及HLA-A02/RMF pMHC晶体结构,角度与Fab 5C01与HLA-A02/VLD pMHC和Fab 11D06与HLA-A02/RMF pMHC的晶体结构(图14A和B)相同(在HLA-A02部分上对齐)。Fab ESK1-pMHC界面的特写在图19中显示,而汇总接触的示意性Fab ESK1-pMHC相互作用矩阵在图20中显示。
结果比较揭示5C01,特别是11D06覆盖且结合比ESK1更大比例的各自WT1肽,ESK1唯独与RMF肽的N端Arg形成特异性接触而结合界面的剩余部分由HLA-A02提供。基于这些观察结果可以得出结论,5C01和11D06应当比ESK1更低可能耐受脱靶肽,因为它们对在暴露位置具有非VLD或非RMF样侧链的肽创建显著更多空间位阻。
用BIOVIADiscovery Studio 4.5,Dassault Systèmes BIOVIA创建晶体结构的所有图形显示。
表位和互补位残基(半径)
下文显示结合物5C01,11D06和ESK1的表位和互补位的汇总。表位和互补位(基于邻近半径的定义)残基以粗体斜体突显。CDR残基以灰色背景突显。
HLA-A02
肽
Fab重链
Fab轻链
牵涉化学相互作用的残基
下文显示结合物5C01,11D06和ESK1的牵涉化学相互作用的残基的汇总。牵涉特异性化学相互作用的残基(比较图16,18和20)以粗体斜体突显。CDR残基以灰色背景突显。
HLA-A02
肽
Fab重链
Fab轻链
实施例16:具有不同CD3结合物的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)的比较
我们在如上文(实施例7)描述的测定法中使用SKM-1细胞,比较具有不同CD3结合物的11D06-TCB的杀伤活性的效力。CH2527是先前的实验中使用的TCB的CD3结合物(VH和VL序列见SEQ ID NO:121和122)。V9是Rodrigues et al.,Int J Cancer Suppl(1992)7,45-50和WO 1992/22653中描述的CD3结合物(VH和VL序列见SEQ ID NO:136和137),而40G5C描述于WO 2015/095392(VH和VL序列见WO 2015/095392的SEQ ID NO:184和185(“hu40G5c”))。
CD3结合物CH2527,40G5C和V9的亲和力在表8中显示。
如图21中显示的,我们观察到11D06-TCB(CH2527)显示与11D06-TCB(V9)相同的对HLA-A2+WT1+SKM-1细胞系的T细胞介导的杀伤的效力,而11D06-TCB(40G5C)显示强烈降低的杀伤效力。
表8:这项实验中比较的CD3结合物的亲和力
实施例17:结合经RMF肽脉冲的T2细胞后由HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)介导的T细胞细胞毒性
与具有不同HLA/WT1结合物(“Aali”和“Daniel”,见WO 2017/060201,分别是SEQID NO:5(VH)和6(VL)和SEQ ID NO:35(VH)和36(VL))的类似TCB比较11D06-TCB(V9)(完整序列见SEQ ID NO:123,125,139,140)的杀伤活性。还包括ESK1-TCB和非靶向性DP47-TCB作为对照。如实施例6中所述实施实验。将经RMF肽脉冲的细胞(100μl,2x105个细胞/ml)与50μl T细胞(2x106个细胞/ml)和TCB的系列稀释(50μl)于37℃以5％ CO2共培养24小时。
图22显示对RMF表达性靶细胞的TCB介导的特异性T细胞杀伤。我们发现11D06-TCB和ESK1-TCB对经RMF肽脉冲的T2细胞介导的有力杀伤,而基于HLA/WT1结合物“Aali”和“Daniel”的TCB(Aali-TCB和Daniel-TCB)仅仅在最高浓度显示对经RMF脉冲的细胞的弱杀伤。
实施例18:选定HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)不结合脱靶肽
我们还比较11D06-TCB(V9),Aali-TCB,Daniel-TCB和ESK1-TCB与实施例9和10中描述的脱靶肽的交叉反应性。
为了这个实验,使用表达抗PGLALA嵌合抗原受体(CAR)的Jurkat NFAT报告物细胞(CAR J测定法,见要求欧洲专利申请No.EP17209201.7的优先权的PCT申请,通过援引完整收入本文)。抗PGLALACAR识别TCB的Fc区中的P329G L234AL235A(“PGLALA”,EU编号方式)突变。使用如上文描述的经肽脉冲的T2细胞作为靶细胞。测定法的原理是共培养Jurkat-NFAT改造的效应细胞与靶细胞。只有在TCB同时结合CAR(经由PGLALA突变)和靶抗原后,NFAT启动子被激活并导致提高Jurkat效应细胞中的萤光素酶表达。在添加适当的底物后,活性萤火虫萤光素酶导致发光发射,这可以测量作为CAR介导的激活的信号。
简言之,收获靶细胞并测定存活力。在100μl培养基中在圆底96孔板(Greinerbio-one,#650180)中分配20,000个靶细胞/孔。使用未脉冲的T2细胞作为阴性对照。将50μl/孔稀释的TCB添加至靶细胞。随后,收获Jurkat-NFAT报告细胞并评估存活力,在细胞培养培养基中重悬浮并以100,000个细胞/孔(50μl/孔)添加至肿瘤细胞以获得5:1的最终效应对靶(E:T)比和200μl/孔的终体积。将细胞在增湿温箱中于37℃温育20小时。在温育时间结束时,将板适应室温(约15分钟)。自顶部取出125μl培养基/孔并添加25μl/孔One-Glo萤光素酶(Promega#E6120),并混合。然后将100μl/孔混合物转移至96孔平底板(Greiner bio-one,#655098)并将板在黑暗中温育15分钟,之后使用Perkin Elmer检测发光。
如图23中显示的,Aali-TCB(A),Daniel-TCB(B)和ESK1-TCB(C)导致与11D06-TCB(V9)(D)相比更弱的Jurkat NFAT报告细胞系激活(与图22中显示的更弱的杀伤对应)以及更小的对RMF肽和其它脱靶肽的识别之间的窗口。
实施例19:NSG小鼠中单次注射后HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(11D06-TCB(V9))的药动学概况
将单剂1mg/kg 11D06-TCB(V9)注射入人源化且荷瘤NSG小鼠。对小鼠静脉内注射200μl用组氨酸缓冲液稀释的TCB。于10分钟,6小时,24小时,72小时和7天对三只小鼠每个时间点采血。如实施例13中所述通过ELISA在血清样品中分析注射的化合物。
结果(图24)显示测试的TCB的稳定的PK行为,提示用于后续功效研究的一周一次日程表。
实施例20:人源化小鼠中SKM-1异种移植物中HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(11D06-TCB(V9))的功效研究
这项功效研究旨在评估完全人源化NSG小鼠中的人AML异种移植物(SKM-1)中11D06-TCB(V9)的功效。如实施例14中所述实施实验。
图25显示肿瘤生长动力学(均值,图25A)以及每个组中的单一肿瘤生长动力学(图25B,C)。如显示的,TCB展现肿瘤生长抑制,研究第48天时的TGI为78(图25D)。
实施例21:具有不同分子格式的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(“TCB”)的比较
我们与“1+1交叉Mab”格式的类似分子(如图1A中描绘的)比较11D06-TCB(V9)的活性。使用基于细胞的功能测定法监测活性,其检测在靶细胞存在下剂量依赖性方式的TCB介导的报告物细胞系(Jurkat NFAT)激活。本质上如上文实施例5中所述实施测定法,使用表达HLA-A02/WT1RMF pMHC复合物的CHO-K1细胞作为靶细胞。当TCB同时结合靶细胞上的HLA-A02/WT1RMF pMHC复合物和报告细胞上的T细胞受体(TCR)的CD3ε单位时(其导致CD3的超聚簇和由此TCR激活),发生报告细胞激活。随后相应的细胞内信号传导途径的启动导致转录因子NFAT的激活,其诱导NFAT驱动的萤光素酶报告物基因表达。在添加底物后通过发光读出来测量萤光素酶报告物的活性。
这项实验的结果在图26中显示。将反映靶物依赖性报告细胞激活的相对光单位(RLU)针对抗体浓度绘图。如图26中可见,在这种测定法中“1+1”格式的分子显示比“2+1”格式要低的活性。
氨基酸序列
***
尽管为了理解清楚的目的已经通过举例说明较为详细地描述了前述发明,但是该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提述明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 结合HLA-A2/WT1的抗体
<130> P34563
<150> EP17209205
<151> 2017-12-21
<160> 140
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Gly
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11B09 VH
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Gly Arg Trp Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11B09 VL
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Asp Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 35
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<213> 人工序列
<220>
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Ser Tyr Tyr Glu Ala Phe Asp Tyr
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
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Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
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Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
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<213> 人工序列
<220>
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Asn Ser Pro Asp Met Asn Gly Asn Ala Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 33F05 VH
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Tyr Tyr Glu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 40
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Pro Asp Met Asn Gly Asn Ala
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<220>
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Ser Tyr Ala Ile Ser
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 42
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5E11 HCDR3
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Ser Ser Tyr Asp Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 5E11 LCDR1
<400> 44
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
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Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5E11 LCDR3
<400> 46
Gln Gln Tyr Ser Phe Pro Pro Met Ile Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 5E11 VH
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Phe Pro Pro Met
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 13E08 HCDR2
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Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 13E08 LCDR2
<400> 53
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13E08 LCDR3
<400> 54
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1 5
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13E08 VH
<400> 55
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13E08 VL
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 HCDR1
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1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 HCDR2
<400> 58
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 HCDR3
<400> 59
Gly Ser Trp Val Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 LCDR1
<400> 60
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 LCDR2
<400> 61
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 LCDR3
<400> 62
Gln Gln Tyr Ser Ile Trp Phe Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 63
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 VH
<400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Trp Val Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 VL
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ile Trp Phe Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 HCDR1
<400> 65
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 HCDR2
<400> 66
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 HCDR3
<400> 67
Thr Gly Pro Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 LCDR1
<400> 68
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 LCDR2
<400> 69
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 LCDR3
<400> 70
Gln Gln Gly Phe Arg Gly Tyr Thr
1 5
<210> 71
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 VH
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Pro Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 72
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 VL
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Arg Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 73
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ESK1 VH
<400> 73
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Gly Tyr Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gln Tyr Ser Gly Tyr Tyr Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ESK1 VL
<400> 74
Gln Ala Trp Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg
1 5 10 15
Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn
85 90 95
Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 75
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 非靶向性VH
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 76
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 非靶向性VL
<400> 76
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 77
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 78
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 79
Arg Met Phe Pro Thr Pro Pro Ser Leu
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 80
Arg Met Phe Pro Gly Glu Val Ala Leu
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 81
Arg Leu Phe Pro Asn Leu Pro Glu Leu
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 82
Arg Met Phe Pro Asn Lys Tyr Ser Leu
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 83
Ala Met Asp Pro Asn Ala Ala Tyr Val
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 84
Arg Met Gly Pro Asn Ile Tyr Glu Leu
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 85
Asn Met Pro Pro Asn Phe Pro Tyr Ile
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 86
Tyr Thr Ile Pro Asn His Pro Tyr Leu
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 87
Arg Leu Phe Pro Asn Ala Lys Phe Leu
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 88
Arg Met Val Pro Arg Ala Val Tyr Leu
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 89
Lys Met Val Pro Ser Ile Pro Tyr Leu
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 90
Arg Ile Phe Pro Ser Tyr Ser Tyr Leu
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 91
Arg Leu Phe Pro Asn Ser Lys Phe Leu
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 92
Lys Met Thr Pro Cys Ile Pro Tyr Leu
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 93
Ser Met Phe Pro Ser Leu Lys Tyr Leu
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 94
Arg Leu Leu Pro Ser Ala Pro Thr Leu
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 95
Arg Leu Arg Pro His Val Pro Tyr Leu
1 5
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 96
Arg Met Asn Pro Asn Ser Pro Ser Ile
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 97
Arg Val Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Leu
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 98
Arg Leu Gln Leu Asn Asn Pro Tyr Leu
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 99
Arg Met Phe Phe Asn Gly Arg Tyr Ile
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 100
Arg Leu Ser Pro Asn Arg Pro Pro Leu
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 101
Glu Thr Phe Pro Asn Ser Trp Tyr Leu
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 102
Gly Leu Lys Pro Asn Ala Ile Tyr Leu
1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 103
Arg Gln Phe Pro Asn Ala Ser Leu Ile
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 104
Tyr Ile Phe Pro Asn Cys Pro Phe Leu
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 105
Arg Leu Arg Ile Asn Phe Pro Tyr Leu
1 5
<210> 106
<211> 449
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 106
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
<210> 107
<211> 207
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 107
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 108
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 108
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
<210> 109
<211> 225
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 109
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 111
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 112
<211> 107
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 112
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 113
<211> 105
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 113
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 114
<211> 328
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 114
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR1
<400> 115
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 116
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR2
<400> 116
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 117
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR3
<400> 117
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR1
<400> 118
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR2
<400> 119
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR3
<400> 120
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 121
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH
<400> 121
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 122
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VL
<400> 122
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 123
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 11D06 VH-CH1(EE)-Fc(穴, PGLALA)
<400> 123
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 124
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 11D06 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(节, PGLALA)
<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln
225 230 235 240
Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys
245 250 255
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val
260 265 270
Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn
275 280 285
Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly
290 295 300
Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala
305 310 315 320
Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly
325 330 335
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
340 345 350
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
355 360 365
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
370 375 380
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
385 390 395 400
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
405 410 415
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
420 425 430
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
435 440 445
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
450 455 460
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
465 470 475 480
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
485 490 495
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
500 505 510
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
515 520 525
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
530 535 540
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
545 550 555 560
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
565 570 575
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
580 585 590
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
595 600 605
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
610 615 620
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
625 630 635 640
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
645 650 655
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
660 665 670
Pro
<210> 125
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 11D06 VL-CL(RK)
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 126
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 33H09 VH-CH1(EE)-Fc(穴, PGLALA)
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 127
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 33H09 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(节, PGLALA)
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu
225 230 235 240
Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly
245 250 255
Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln
260 265 270
Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys
275 280 285
Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly
290 295 300
Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
420 425 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
435 440 445
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 128
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 33H09 VL-CL(RK)
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Gly Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 129
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH-CL
<400> 129
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR1 (V9)
<400> 130
Gly Tyr Thr Met Asn
1 5
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR2 (V9)
<400> 131
Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 132
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR3 (V9)
<400> 132
Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 133
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR1 (V9)
<400> 133
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR2 (V9)
<400> 134
Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR3 (V9)
<400> 135
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 136
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH (V9)
<400> 136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 137
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VL (V9)
<400> 137
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 138
<211> 275
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 138
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Glu
275
<210> 139
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 11D06 VH-CH1(EE)-CD3 (V9) VL-CH1-Fc(节, PGLALA)
<400> 139
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
225 230 235 240
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
245 250 255
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu
275 280 285
Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
290 295 300
Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
325 330 335
Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
355 360 365
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
370 375 380
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
385 390 395 400
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
420 425 430
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
435 440 445
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
450 455 460
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
465 470 475 480
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
485 490 495
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
500 505 510
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
515 520 525
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
530 535 540
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
545 550 555 560
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
565 570 575
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
580 585 590
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
595 600 605
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
610 615 620
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
625 630 635 640
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
645 650 655
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 140
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 (V9) VH-CL
<400> 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys
225

Claims (46)

1.一种结合HLA-A2/WT1的抗体,其中该抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),
该重链可变区(VH)包含:
如SEQ ID NO:1所示的重链互补决定区(HCDR)1,
如SEQ ID NO:2所示的HCDR 2,和
如SEQ ID NO:3所示的HCDR 3,且
该轻链可变区(VL)包含:
如SEQ ID NO:4所示的轻链互补决定区(LCDR)1,
如SEQ ID NO:5所示的LCDR 2,和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR 3。
2.权利要求1的抗体,其中
该重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列,且
该轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
3.权利要求1的抗体,其中
该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列,且
该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
4.权利要求1的抗体,其中该抗体是IgG抗体。
5.权利要求4的抗体,其中该抗体是IgG1抗体。
6.权利要求1的抗体,其中该抗体是全长抗体。
7.权利要求1的抗体,其中该抗体是选自Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab')2分子的组的抗体片段。
8.权利要求1的抗体,其中该抗体是多特异性抗体。
9.一种双特异性抗体,其包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,
其中该第一抗原是HLA-A2/WT1且该第一抗原结合模块是包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)的第一Fab分子,
该第一重链可变区(VH)包含:
如SEQ ID NO:1所示的重链互补决定区(HCDR)1,
如SEQ ID NO:2所示的HCDR 2,和
如SEQ ID NO:3所示的HCDR 3,且
该第一轻链可变区(VL)包含:
如SEQ ID NO:4所示的轻链互补决定区(LCDR)1,
如SEQ ID NO:5所示的LCDR 2,和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR 3,和
(b)特异性结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中该第二抗原是CD3且该第二抗原结合模块是包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)的第二Fab分子。
10.权利要求9的双特异性抗体,其中
该第一重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列,且
该第一轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
11.权利要求9的双特异性抗体,其中
该第一重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列,且该第一轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
12.权利要求9的双特异性抗体,其中该第二抗原是CD3ε。
13.权利要求9的双特异性抗体,其中
(i)该第二重链可变区(VH)包含:如SEQ ID NO:115所示的HCDR 1,如SEQ ID NO:116所示的HCDR 2和如SEQ ID NO:117所示的HCDR 3,且该第二轻链可变区(VL)包含:如SEQ IDNO:118所示的LCDR 1,如SEQ ID NO:119所示的LCDR 2和如SEQ ID NO:120所示的LCDR 3；或
(ii)该第二重链可变区(VH)包含:如SEQ ID NO:130所示的HCDR 1,如SEQ ID NO:131所示的HCDR 2和如SEQ ID NO:132所示的HCDR 3,且该第二轻链可变区(VL)包含:如SEQ IDNO:133所示的LCDR 1,如SEQ ID NO:134所示的LCDR 2和如SEQ ID NO:135所示的LCDR 3。
14.权利要求13的双特异性抗体,其中
(i)该第二重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列,且该第二轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列；或
(ii)该第二重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:136的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列,且该第二轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:137的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
15.权利要求13的双特异性抗体,其中
(i)该第二重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列,且该第二轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；或
(ii)该第二重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列,且该第二轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列。
16.权利要求9的双特异性抗体,其中在该第二抗原结合模块中,Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的。
17.权利要求16的双特异性抗体,其中在该第二抗原结合模块中,Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的。
18.权利要求9的双特异性抗体,其中在该第一抗原结合模块中,在恒定域CL中位置124处的氨基酸是用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代的,编号方式依照Kabat,且位置123处的氨基酸是用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代的,编号方式依照Kabat,且在恒定域CH1中位置147处的氨基酸是用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代的,编号方式依照Kabat EU索引,且位置213处的氨基酸是用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代的,编号方式依照Kabat EU索引。
19.权利要求9的双特异性抗体,其中该第一抗原结合模块和该第二抗原结合模块彼此融合,任选经由肽接头。
20.权利要求9的双特异性抗体,其中或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端,或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端。
21.权利要求9的双特异性抗体,其包含第三抗原结合模块,该第三抗原结合模块是Fab分子。
22.权利要求21的双特异性抗体,其中该第三抗原结合模块与该第一抗原结合模块相同。
23.权利要求9的双特异性抗体,其包含由第一和第二亚基构成的Fc域。
24.权利要求23的双特异性抗体,
其中或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端且该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端。
25.权利要求24的抗体,其包含第三抗原结合模块,该第三抗原结合模块是Fab分子且该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。
26.权利要求23的双特异性抗体,其中该Fc域是IgG Fc域。
27.权利要求26的双特异性抗体,其中该Fc域是IgG1 Fc域。
28.权利要求23的双特异性抗体,其中该Fc域是人Fc域。
29.权利要求23的双特异性抗体,其中该Fc域是人IgG1 Fc域。
30.权利要求23的双特异性抗体,其中该Fc域的第一亚基的CH3域中的一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成隆起,该隆起可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中,且该Fc域的第二亚基的CH3域中的一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,该空腔内可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
31.权利要求23的双特异性抗体,其中在该Fc域的第一亚基的CH3域中位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),且在该Fc域的第二亚基的CH3域中位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V),且任选地在该Fc域的第二亚基中另外地位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A),编号方式依照Kabat EU索引。
32.权利要求31的双特异性抗体,其中在该Fc域的第一亚基中另外地位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C),且在该Fc域的第二亚基中另外地位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C),编号方式依照Kabat EU索引。
33.权利要求23的双特异性抗体,其中该Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。
34.权利要求33的双特异性抗体,其中该一处或多处氨基酸替代在选自下组的位置处:E233,L234,L235,N297,P331和P329,编号方式依照Kabat EU索引。
35.权利要求23的双特异性抗体,其中该Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G,编号方式依照Kabat EU索引。
36.权利要求9的双特异性抗体,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块和第三抗原结合模块,其中该第一抗原是HLA-A2/WT1且其中该第一抗原结合模块和该第三抗原结合模块各自是常规Fab分子,包含:包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中该第二抗原是CD3且其中该第二抗原结合模块是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的,包含:包含SEQ IDNO:136的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链可变区；
c)由第一和第二亚基构成的人IgG1 Fc域；
其中
(i)在a)下的该第一和该第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代,编号方式依照Kabat,且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代,编号方式依照Kabat,且其中在a)下的该第一和该第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代,编号方式依照Kabat EU索引,且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代,编号方式依照Kabat EU索引；
(ii)a)下的该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至b)下的该第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且b)下的该第二抗原结合模块和a)下的该第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至c)下的该Fc域的亚基之一的N端；且
(iii)该Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W,且该Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S,L368A和Y407V,且该Fc域的每个亚基进一步包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G,编号方式依照Kabat EU索引。
37.权利要求9的双特异性抗体,其包含:包含与SEQ ID NO:123的序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:125的序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:139的序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与SEQ ID NO:140的序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽。
38.权利要求37的双特异性抗体,其包含:包含SEQ ID NO:123的序列的多肽,包含SEQID NO:125的序列的多肽,包含SEQ ID NO:139的序列的多肽,和包含SEQ ID NO:140的序列的多肽。
39.一种或多种分离的多核苷酸,其编码权利要求1至38任一项的抗体或双特异性抗体。
40.一种或多种载体,其包含权利要求39的多核苷酸。
41.权利要求40的载体,其是表达载体。
42.一种宿主细胞,其包含权利要求39的多核苷酸或权利要求40或41的载体。
43.一种生成结合HLA-A2/WT1的抗体的方法,其包含下述步骤:
a)在适合于表达该抗体的条件下培养权利要求42的宿主细胞,并
b)任选回收该抗体。
44.一种结合HLA-A2/WT1的抗体,其通过权利要求43的方法生成。
45.一种药学组合物,其包含权利要求1至38或44任一项的抗体或双特异性抗体和药学可接受载剂。
46.权利要求1至38或44任一项的抗体或双特异性抗体或权利要求45的药学组合物制造用于治疗疾病的药物的用途,其中所述疾病是急性髓性白血病(AML)。
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