TW202037603A - 異二聚免疫球蛋白 - Google Patents

Abstract

本申請案係有關異二聚抗體及使用方法。

Description

異二聚免疫球蛋白

本發明大體上係關於製備及使用用於治療與低骨礦物質密度相關之病症之異二聚抗體的方法。[ 以引用的方式併入電子提交材料 ] 以全文引用的方式併入本文中的是與此同時提交且如下鑒別之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表：2013年11月13日創建之名為「47233B_SeqListing.txt」之具有960,666個位元組的ASCII(文本)檔案。 [以引用方式之併入] 以下申請案據此以全文引用的方式併入：2006年4月25日申請之美國專利申請案第11/410,540號，其主張2006年4月17日申請之美國臨時專利申請案第60/792,645號、2006年3月13日申請之美國臨時專利申請案第60/782,244號、2006年2月24日申請之美國臨時專利申請案第60/776,847號及2005年5月3日申請之美國臨時專利申請案第60/677,583號之優先權；及2006年4月25日申請之美國專利申請案第11/411,003號(以美國專利第7,592,429號頒佈)，其主張2006年4月17日申請之美國臨時專利申請案第60/792,645號、2006年3月13日申請之美國臨時專利申請案第60/782,244號、2006年2月24日申請之美國臨時專利申請案第60/776,847號及2005年5月3日申請之美國臨時專利申請案第60/677,583號之優先權。以下申請案據此亦以引用的方式併入：2008年9月17日申請之美國專利申請案第12/212,327號，其主張2007年9月17日申請之美國臨時專利申請案第60/973,024號之優先權；及2010年6月29日申請之美國專利申請案第12/811,171號，其根據美國法典第371篇為2008年12月15日申請之國際專利申請案第PCT/US08/86864號之美國國家階段申請案，其主張2007年12月14日申請之美國臨時專利申請案第61/013,917號之優先權。

開發作為人類疾病之治療劑之雙特異性抗體具有巨大臨床潛力。雙特異性抗體可同時識別兩種不同抗原，中和不同病原性介體，募集不同類型之效應細胞，且調節信號路徑。然而，產生雙特異性抗體已極具挑戰性。廣泛應用雙特異性抗體已因難以開發用於產生展現有利半衰期、高穩定性、缺乏免疫原性以及大規模製造及純化之可行性之雙特異性抗體的平台而受阻。諸如DVD-Ig(雙可變域Ig)(Nature Biotechnology 25, 1290-1297 (2007))；交叉Ig[Schaefer W等人 (2011) PNAS 108(27): 11187-11192]；二合一Ig(Science 2009, 323, 1610)；BiTE®抗體[PNAS 92(15):7021-7025; 1995]之有前途之雙特異性抗體形式允許產生雙特異性抗體，但其具有不同種類之缺點。

本文描述自兩種不同先前存在抗體產生異二聚抗體之方法。 在一個態樣中，本文描述一種在以下各域中包含一或多個取代之異二聚抗體或其片段：第一CH₃ 域、第二CH₃ 域、CH₁ 域、C_L 域、V_H 域及V_L 域，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸。 在一些變化形式中，第一CH3域或第二CH3域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型人類IgG胺基酸序列中在CH3域中之相應位置處之一或多個帶正電荷胺基酸(例如離胺酸、組胺酸及精胺酸)經一或多個帶負電荷胺基酸(例如天冬胺酸及麩胺酸)置換。或者，第一CH3域或第二CH3域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型人類IgG胺基酸序列中在CH3域中之相應位置處之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。 在一些變化形式中，CH1域或CL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電荷胺基酸經一或多個帶負電荷胺基酸置換。或者，CH1域或CL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。 在一些變化形式中，本文所述之異二聚抗體之VH域或VL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電荷胺基酸經一或多個帶負電荷胺基酸置換。或者，VH域或VL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。 在另一態樣中，本文描述一種包含重鏈之異二聚抗體或其片段，該重鏈包含(a)在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代，(b)在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代，(c)在選自由位置352-360(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及(d)在選自由位置395-403(EU編號)組成之群之位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代，其中(a)之該帶電荷胺基酸與(b)之該帶電荷胺基酸具有相同電荷，且其中(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸之相反電荷。 在一些實施例中，第一胺基酸取代在AHo位置46處，第二胺基酸取代在EU位置183處，第三胺基酸取代在EU位置356處且第四胺基酸取代在EU位置399處。在一些實施例中，AHo位置46處之麩醯胺酸經麩胺酸置換，EU位置183處之絲胺酸經麩胺酸置換，EU位置356處之麩胺酸經離胺酸置換，且EU位置399處之天冬胺酸經離胺酸置換。 在另一態樣中，本文描述一種包含重鏈之抗體或其片段，該重鏈包含(a)在選自由AHo位置35-43組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代，(b)在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代，(c)在選自由位置388-398(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及(d)在選自由位置404-413(EU編號)組成之群之位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代，其中(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸之相反電荷。在一些實施例中，AHo位置46處之麩醯胺酸經離胺酸置換，EU位置183處之絲胺酸經離胺酸置換，EU位置392處之離胺酸經天冬胺酸置換且EU位置409處之離胺酸經天冬胺酸置換。 在另一態樣中，本文描述一種包含輕鏈之抗體或片段，該輕鏈包含(a)在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代，及(b)在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代。在一些實施例中，AHo位置46處之麩醯胺酸經麩胺酸置換且EU位置176處之絲胺酸經麩胺酸置換。 在另一態樣中，本文描述一種包含重鏈之抗體，該重鏈包含(a)在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代，(b)在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代，(c)在選自由位置352-360(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及(d)在選自由位置395-403(EU編號)組成之群之位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代，其中(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸具有負電荷且(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有正電荷。在一些實施例中，第一胺基酸取代在AHo位置46處，第二胺基酸取代在EU位置183處，第三胺基酸取代在EU位置356處且第四胺基酸取代在EU位置399處。在一些實施例中，抗體包含在AHo位置46及EU位置176處包含帶正電荷胺基酸之輕鏈。 在另一態樣中，本文描述一種包含第一重鏈及第二重鏈以及第一輕鏈及第二輕鏈之異二聚抗體，其中該第一重鏈在AHo位置46及EU位置183、356及399處包含胺基酸取代，其中該第二重鏈在AHo位置46及EU位置183、392及409處包含胺基酸取代，且其中該第一輕鏈及該第二輕鏈在AHo位置46及EU位置176處包含胺基酸取代，其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。在一些實施例中，第一重鏈之AHo位置46處之麩醯胺酸經麩胺酸置換，第二重鏈之AHo位置46處之麩醯胺酸經離胺酸置換，第一輕鏈之AHo位置46處之麩醯胺酸經離胺酸置換，第二輕鏈之AHo位置46處之麩醯胺酸經麩胺酸置換，第一重鏈之EU位置183處之絲胺酸經麩胺酸置換，第一重鏈之EU位置356處之麩胺酸經離胺酸置換，第一重鏈之EU位置399處之麩胺酸經離胺酸置換，第二重鏈之EU位置183處之絲胺酸經離胺酸置換，第二重鏈之EU位置392處之離胺酸經天冬胺酸置換，且第二重鏈之EU位置409處之離胺酸經天冬胺酸置換。 在本文所述之一些或任何實施例中，抗體結合硬化蛋白(sclerostin)之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域。 本文亦描述一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之異二聚抗體，其中該抗體包含含有硬化蛋白結合部分之第一重鏈及第一輕鏈以及包含DKK1結合部分之第二重鏈及第二輕鏈，其中該第一重鏈在AHo位置46及EU位置183、356及399處包含胺基酸取代，其中該第二重鏈在AHo位置46及EU位置183、392及409處包含胺基酸取代，其中該第一輕鏈及該第二輕鏈在AHo位置46及EU位置176處包含胺基酸取代，且其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。 在另一態樣中，本文描述一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之異二聚抗體，該抗體包含含有硬化蛋白結合部分之第一重鏈及第一輕鏈以及含有DKK1結合部分之第二重鏈及第二輕鏈，其中該第一重鏈在EU位置183、356及399處包含胺基酸取代，其中該第二重鏈在EU位置183、392及409處包含胺基酸取代，且其中該第一輕鏈及該第二輕鏈在EU位置176處包含胺基酸取代，其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。 本發明之另一態樣係關於一種結合硬化蛋白及DKK-1之異二聚抗體，其包含第一重鏈，該第一重鏈包含本文所述之任一硬化蛋白抗體之重鏈可變區胺基酸序列且在該第一重鏈之EU位置183、356及399處包含胺基酸取代；第二重鏈，該第二重鏈包含本文所述之任一DKK-1抗體之重鏈可變區胺基酸序列且在該第二重鏈之EU位置183、392及409處包含胺基酸取代；第一輕鏈，該第一輕鏈包含本文所述之任一硬化蛋白抗體之輕鏈可變區胺基酸序列且在該第一輕鏈之EU位置176處包含胺基酸取代；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含本文所述之任何DKK-1抗體之輕鏈可變區胺基酸序列且在該第二輕鏈之EU位置176處包含胺基酸取代；其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。 本發明之另一態樣係關於一種結合硬化蛋白及DKK-1之異二聚抗體，其包含第一重鏈，該第一重鏈包含選自由SEQ ID NO: 378及366組成之群之可變區胺基酸序列且在該第一重鏈之EU位置183、356及399處包含胺基酸取代；第二重鏈，該第二重鏈包含選自由SEQ ID NO: 1003及974組成之群之可變區胺基酸序列且在該第二重鏈之EU位置183、392及409處包含胺基酸取代；第一輕鏈，該第一輕鏈包含選自由SEQ ID NO: 376及364組成之群之可變區胺基酸序列且在該第一輕鏈之EU位置176處包含胺基酸取代；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含選自由SEQ ID NO: 1002及978組成之群之可變區胺基酸序列且在該第二輕鏈之EU位置176處包含胺基酸取代；其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。 在一些實施例中，結合硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體包含含有SEQ ID NO: 1038中所述之胺基酸序列之第一重鏈；含有SEQ ID NO: 1034中所述之胺基酸序列之第二重鏈；含有SEQ ID NO: 1039中所述之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO: 1035中所述之胺基酸序列之第二輕鏈。 在一些實施例中，結合硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體包含含有SEQ ID NO: 1038中所述之胺基酸序列之第一重鏈；含有SEQ ID NO: 1036中所述之胺基酸序列之第二重鏈；含有SEQ ID NO: 1039中所述之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO: 1037中所述之胺基酸序列之第二輕鏈。 在一些實施例中，結合硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體包含含有SEQ ID NO: 1040中所述之胺基酸序列之第一重鏈；含有SEQ ID NO: 1034中所述之胺基酸序列之第二重鏈；含有SEQ ID NO: 1041中所述之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO: 1035中所述之胺基酸序列之第二輕鏈。 在一些實施例中，結合硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體包含含有SEQ ID NO: 1040中所述之胺基酸序列之第一重鏈；含有SEQ ID NO: 1036中所述之胺基酸序列之第二重鏈；含有SEQ ID NO: 1041中所述之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO: 1037中所述之胺基酸序列之第二輕鏈。 在一些實施例中，結合硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體包含含有SEQ ID NO: 1046中所述之胺基酸序列之第一重鏈；含有SEQ ID NO: 1042中所述之胺基酸序列之第二重鏈；含有SEQ ID NO: 1047中所述之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO: 1043中所述之胺基酸序列之第二輕鏈。 在一些實施例中，結合硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體包含含有SEQ ID NO: 1046中所述之胺基酸序列之第一重鏈；含有SEQ ID NO: 1044中所述之胺基酸序列之第二重鏈；含有SEQ ID NO: 1047中所述之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO: 1045中所述之胺基酸序列之第二輕鏈。 在一些實施例中，結合硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體包含含有SEQ ID NO: 1048中所述之胺基酸序列之第一重鏈；含有SEQ ID NO: 1042中所述之胺基酸序列之第二重鏈；含有SEQ ID NO: 1049中所述之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO: 1043中所述之胺基酸序列之第二輕鏈。 在一些實施例中，結合硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體包含含有SEQ ID NO: 1048中所述之胺基酸序列之第一重鏈；含有SEQ ID NO: 1044中所述之胺基酸序列之第二重鏈；含有SEQ ID NO: 1049中所述之胺基酸序列之第一輕鏈及含有SEQ ID NO: 1045中所述之胺基酸序列之第二輕鏈。 本發明亦涵蓋一種包含重鏈之異二聚抗體，該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 1038、SEQ ID NO: 1046、SEQ ID NO: 1040及SEQ ID NO: 1048組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，異二聚抗體視情況包含選自由SEQ ID NO: 1039、SEQ ID NO: 1047、SEQ ID NO: 1041及SEQ ID NO: 1049組成之群之輕鏈胺基酸序列。 本發明亦涵蓋一種包含重鏈之異二聚抗體，該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 1034、SEQ ID NO: 1042、SEQ ID NO: 1036及SEQ ID NO: 1044組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，異二聚抗體視情況包含選自由SEQ ID NO: 1035、SEQ ID NO: 1043、SEQ ID NO: 1037及SEQ ID NO: 1045組成之群之輕鏈胺基酸序列。 在另一態樣中，本文描述一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之抗體，其中該抗體在以下各域中包含取代：第一CH3域、第二CH3域、CH1域及CL域，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸。 本文亦描述一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之抗體，其中該抗體包含具有包含一或多個胺基酸取代之CH3域的重鏈，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸。在一些實施例中，CH3域中之帶負電荷胺基酸(例如在EU位置D399、E356或E357處)經帶正電荷胺基酸取代。在一些實施例中，EU位置D399、E356及E357處之胺基酸經帶正電荷胺基酸(例如離胺酸)取代。 在替代性實施例中，CH3域中之帶正電荷胺基酸(例如在EU位置K370、K392或K409處)經帶負電荷胺基酸取代。在一些實施例中，如EU位置K370、K392及K409之胺基酸經帶負電荷胺基酸(例如天冬胺酸)取代。 在一些實施例中，異二聚抗體為抗體、雙特異性抗體、單特異性單價抗體、雙特異性大抗體、單域抗體、肽體、雙特異性肽體、單價肽體或受體融合蛋白。 亦提供包含編碼本文所述之任何異二聚抗體之核苷酸序列的核酸以及包含核酸之載體及包含核酸(或載體)之宿主細胞。 本發明之另一態樣係關於增加哺乳動物個體中之骨礦物質密度之方法，其包含以有效增加該個體中之骨礦物質密度之量向該個體投與本文所述之異二聚抗體。本發明亦包括使用本文所述之異二聚抗體增加骨礦物質密度之方法。如本文所述之使用方法可或者表徵為異二聚抗體增加骨礦物質密度之用途。 本發明亦包括包含本文所述之異二聚抗體及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或佐劑的組合物。在一些實施例中，在約4℃下儲存兩週之後，組合物中小於5%(或小於4%、或小於3%、或小於2%或小於1%或1%以下)之抗體呈聚集體形式。可例如藉由粒徑排阻層析法(SEC)或動態光散射(DLS)測定組合物中之抗體聚集量。 在另一態樣中，本文描述一種包含異二聚抗體或其片段及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或佐劑的組合物，該異二聚抗體或其片段在以下各域中包含一或多個取代：第一CH₃ 域、第二CH₃ 域、CH₁ 域、C_L 域、V_H 域及V_L 域，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸；其中在約4℃下儲存兩週之後，該組合物中小於5%之該抗體或片段呈聚集體形式。 在另一態樣中，本文描述一種包含結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之異二聚抗體及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或佐劑的組合物，該抗體在以下各域中包含取代：第一CH₃ 域、第二CH₃ 域、CH₁ 域及C_L 域，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸；其中在約4℃下儲存兩週之後，該組合物中小於5%之該抗體呈聚集體形式。 本文所用之章節標題僅出於組織目的且不應解釋為限制所述標的物。本說明書之主體內引用之所有參考文獻皆以全文引用的方式明確併入本文中。 標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養及轉型、蛋白質純化等。可根據製造商說明書或如此項技術中通常所達成或如本文所述來執行酶促反應及純化技術。以下程序及技術可通常根據此項技術中熟知及如本說明書整篇引用及論述之各種一般性及更特定參考文獻中所述之習用方法來執行。參見例如Sambrook等人, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y.，其出於任何目的以引用的方式併入本文中。除非提供明確定義，否則關聯本文所述之分析化學、有機化學以及醫學及醫藥化學使用之命名法及本文所述之分析化學、有機化學以及醫學及醫藥化學之實驗室程序及技術為此項技術中熟知且通常使用者。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及治療患者。

[ 相關申請案之交互參照 ] 本申請案主張2012年11月21日申請之美國臨時申請案第61/729,148號及2013年3月13日申請之美國臨時申請案第61/779,439號之優先權益，該等臨時申請案之揭露內容以全文引用的方式併入本文中。 本申請案係基於發現可藉由以可在不存在其他污染物質之情況下僅使兩種不同抗體之重鏈及輕鏈裝配至異二聚抗體中的方式工程改造兩種不同抗體之重鏈及輕鏈來產生異二聚IgG。在一個態樣中，藉由工程改造兩個重鏈之CH3區以使其僅形成異二聚體來達成異二聚配對。此外，藉由工程改造輕鏈(LC)與重鏈(HC)之間的界面殘基達成之靜電操縱防止當兩對不同重鏈及輕鏈裝配以形成所要四鏈異二聚抗體時，輕鏈與非同源重鏈錯配。如本文所述，一示範性策略包含在LC1/HC1界面處在第一輕鏈(LC1)中引入一或多個帶負電荷殘基(例如Asp或Glu)且在相伴重鏈(HC1)中引入一或多個帶正電荷殘基(例如Lys、His或Arg)，同時在LC2/HC2界面處在第二輕鏈(LC2)中引入一或多個帶正電荷殘基(例如Lys、His或Arg)且在相伴重鏈(HC2)中引入一或多個帶負電荷殘基(例如Asp或Glu)。靜電操縱效應引導LC1與HC1配對且引導LC2與HC2配對，因為在界面處之相反帶電荷殘基(極性)吸引，而在界面處之相同類型之帶電荷殘基(極性)產生排斥，從而使非所要HC/LC配對受抑制。 使選擇用於工程改造之LC/HC界面殘基包埋在VL/VH及CL/CH1界面內且在空間上接近。在不同抗體家族之中，目標殘基充分保守。工程改造輕鏈及重鏈以形成特定異二聚體之其他方式包括用一對半胱胺酸殘基置換VL/VH界面中之一對帶電荷殘基以形成二硫鍵來穩定Fab區，用疏水性殘基(例如麩醯胺酸)置換VL/VH界面中之一或多個親水性殘基(例如甘胺酸)，或工程改造VL/VH界面處之一對大/小殘基以施加鈕入孔(knob-into-hole)效應來容納正確LC/HC配對。本文所述之策略可用於在不使用人工連接子下自兩種先前存在抗體高效產生全長異二聚抗體。所得異二聚抗體穩定且可經受商業製造而無過度聚集或產量損失。因為此新型異二聚抗體可同時靶向兩種不同抗原或同一抗原上之兩種不同抗原決定基，所以其可具有獨特治療許多疾病之重大潛力。 如本文所用之術語「界面」係指由第一抗體域中之一或多個胺基酸與第二抗體域之一或多個胺基酸相互作用產生的締合表面。示範性界面包括CH1/CL、VH/VL及CH3/CH3。在一些實施例中，界面包括例如形成界面之胺基酸之間的氫鍵、靜電相互作用或鹽橋。 在一個態樣中，本文描述一種在以下各域中包含一或多個取代之異二聚抗體或其片段：第一CH₃ 域、第二CH₃ 域、CH₁ 域、C_L 域、V_H 域及V_L 域，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸。 本文所述之異二聚抗體可包含任何恆定區。輕鏈恆定區可為例如κ或λ型輕鏈恆定區，例如人類κ或λ型輕鏈恆定區。重鏈恆定區可為例如α、δ、ε、γ或μ型重鏈恆定區，例如人類α、δ、ε、γ或μ型重鏈恆定區。在一個實施例中，輕鏈或重鏈恆定區為天然存在之恆定區之片段、衍生物、變異體或突變蛋白質。 在一些變化形式中，第一CH3域或第二CH3域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型人類IgG胺基酸序列中在CH3域中之相應位置處之一或多個帶正電荷胺基酸(例如離胺酸、組胺酸及精胺酸)經一或多個帶負電荷胺基酸(例如天冬胺酸及麩胺酸)置換。或者，第一CH3域或第二CH3域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型人類IgG胺基酸序列中在CH3域中之相應位置處之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。 在一些變化形式中，CH1域或CL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電荷胺基酸經一或多個帶負電荷胺基酸置換。或者，CH1域或CL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。 在一些變化形式中，本文所述之異二聚抗體之VH域或VL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電荷胺基酸經一或多個帶負電荷胺基酸置換。或者，VH域或VL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。 在另一態樣中，本文描述一種包含重鏈之異二聚抗體或其片段，該重鏈包含(a)在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代，(b)在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代，(c)在選自由位置352-360(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及(d)在選自由位置395-403(EU編號)組成之群之位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代，其中(a)之該帶電荷胺基酸與(b)之該帶電荷胺基酸具有相同電荷，且其中(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸之相反電荷。 在本文中，使用AHo編號系統描述可變域之構架區(下述)內之特定胺基酸的位置。因為抗體CDR胺基酸序列長度在抗體與抗體之間不同，所以基於線性序列(假定第一殘基為位置1)對殘基編號會導致在各抗體之間，構架殘基具有不同位置編號。使用Kabat或EU編號流程可避免此衝突且使得能夠在抗體間比較構架位置。然而，結構等效位置可具有不同Kabat或EU編號。類似地，具有相同Kabat編號之殘基可存在於結構上之兩個不同位置處。Annemarie Honegger及Andreas Pluckthun開發在CDR區中引入間隙以使與所比對域之平均結構之偏差最小的結構基編號流程(AHo)。(Honegger, A.及Plückthun, A. (2001). J. Mol. Biol. 309, 657-670) 此導致當比較兩種不同抗體時，結構等效位置具有相同殘基編號。此使得能夠在抗體之間比較可變域構架區中之取代之影響。圖5-7分別提供人類重鏈、κ及λ可變域區域之AHo編號。 如本文所用，術語「構架」或「構架序列」係指可變區減去CDR之區域或序列。因為CDR序列之精確界定可藉由不同系統來確定，所以構架序列之含義易受相應不同解釋。六個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3以及重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區分成各鏈上之四個子區域(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在不將特定子區域指定為FR1、FR2、FR3或FR4之情況下，構架區代表單一天然存在之免疫球蛋白鏈之可變區內的組合FR。如本文所用，FR代表四個子區域之一，且FRs代表構成構架區之四個子區域之兩者或兩者以上。 「取代」胺基酸或胺基酸「之取代」係指將原始胺基酸殘基取代成一或多個其他胺基酸殘基。重鏈修飾 為使特定重鏈結合其同源輕鏈之效率最大，重鏈與輕鏈兩者均含有互補胺基酸取代。就「互補胺基酸取代」而言，其意謂對重鏈中之正電荷胺基酸之取代與對輕鏈中之與重鏈殘基締合之胺基酸的帶負電荷胺基酸取代配對。同樣，對重鏈中之負電荷胺基酸之取代與對輕鏈中之與重鏈殘基締合之胺基酸的帶正電荷胺基酸取代配對。 在一些實施例中，工程改造抗體重鏈可變區。圖5為人類重鏈可變域V區及J區之生殖系比對。在一些實施例中，異二聚抗體包含與人類生殖系重鏈可變區至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之重鏈可變區。 VH域內之V區界面殘基(亦即介導VH及VL域之裝配之胺基酸殘基)包括AHo位置1(Kabat位置1)、3(Kabat位置3)、42(Kabat位置35)、44(Kabat位置37)、46(Kabat位置39)、50(Kabat位置43)、51(Kabat位置44)、52(Kabat位置45)、53(Kabat位置46)、54(Kabat位置47)、57(Kabat位置50)、70(Kabat位置59)、103(Kabat位置89)、105(Kabat位置91)及107(Kabat位置93)。內部之J區界面殘基包括AHo位置139(Kabat位置103)、140(Kabat位置104)、141(Kabat位置105)及142(Kabat位置106)。在一些實施例中，一或多個界面殘基經帶電荷(帶正電荷或帶負電荷)胺基酸取代。 在一些實施例中，VH域之AHo位置46(Kabat位置39)處之胺基酸經帶正電荷胺基酸置換。在替代性實施例中，VH域之AHo位置46(Kabat位置39)處之胺基酸經帶負電荷胺基酸置換。 在一些實施例中，VH域之AHo位置51(Kabat位置44)及/或AHo位置141(Kabat位置105)處之胺基酸經帶電荷胺基酸置換。在一些實施例中，AHo位置51處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸，例如離胺酸。在替代性實施例中，AHo位置51處之胺基酸被取代成帶負電荷胺基酸，例如天冬胺酸。在一些實施例中，AHo位置141處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸，例如離胺酸。在替代性實施例中，AHo位置141處之胺基酸被取代成帶負電荷胺基酸，例如天冬胺酸。在一些實施例中，AHo位置51及AHo位置141處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸(例如離胺酸)或帶負電荷胺基酸(例如天冬胺酸)。此等實施例可進一步包含在AHo位置46處取代成帶正電荷或帶負電荷胺基酸。 重鏈之CH1區亦與輕鏈複合，且此區域可經工程改造以增加特定重鏈與其同源輕鏈配對之效率。可藉由以下手段來促進裝配：在或接近界面處將半胱胺酸殘基引入重鏈及輕鏈中以允許形成二硫鍵，改變胺基酸以產生鈕入孔效應，及與本文對於可變區所述之靜電工程改造類似之靜電工程改造。 在一些實施例中，異二聚抗體包含與人類生殖系重鏈CH1區至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之重鏈CH1區。 在一些實施例中，異二聚抗體之CH1域中之在選自由F126、P127、L128、A141、L145、K147、D148、H168、F170、P171、V173、Q175、S176、S183、V185及K213組成之群之EU位置處的一或多個胺基酸經帶電荷胺基酸置換。就此而言，供用帶負電荷或帶正電荷胺基酸取代之一特別較佳殘基為S183(EU編號系統)。在一些實施例中，S183經帶正電荷胺基酸取代。在替代性實施例中，S183經帶負電荷胺基酸取代。 本文所述之異二聚抗體視情況進一步包含兩個CH3域，其中至少一者含有將非天然帶電荷胺基酸引入域中之一或多個取代。在一些實施例中，各CH3域在CH3域中包含一或多個胺基酸取代以不利於同二聚化，且更佳地，有利於與相應CH3域之異二聚化。國際公開案第WO 2009/089004號(以全文引用的方式併入本文中)描述用於工程改造CH3域界面以在兩個含有CH3域之分子之間降低同二聚化且增加異二聚化之組合物及方法。在一些實施例中，CH3域之一或多個選自由399、356及357(EU編號系統)組成之群之位置處的胺基酸經帶負電荷胺基酸置換。在一些實施例中，一或多個選自由370、392及409(EU編號系統)組成之群之位置處的胺基酸經帶正電荷胺基酸置換。在替代性實施例中，CH3域之一或多個選自由399、356及357(EU編號系統)組成之群之位置處的胺基酸經帶正電荷胺基酸置換。在其他實施例中，一或多個選自370、392及409(EU編號系統)之群之位置處的胺基酸經帶負電荷胺基酸置換。在一些實施例中，異二聚抗體包含在位置399及356處包含帶正電荷胺基酸(例如D399K及E356K)之第一重鏈、及在位置392及409處包含帶負電荷胺基酸(例如K392D及K409D)之第二重鏈。 在一個態樣中，本文所述之異二聚抗體包含(a)在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代，(b)在選自由EU位置126-213組成之群之EU位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代，(c)在選自由EU位置352-360組成之群之EU位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及(d)在選自由EU位置395-403組成之群之EU位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代，其中(a)之該帶電荷胺基酸與(b)之該帶電荷胺基酸具有相同電荷，且其中(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸之相反電荷。舉例而言，在一些實施例中，(a)及(b)之帶電荷胺基酸具有正電荷且(c)及(d)之帶電荷胺基酸具有負電荷。在替代性實施例中，(a)及(b)之帶電荷胺基酸具有負電荷且(c)及(d)之帶電荷胺基酸具有正電荷。在一些實施例中，第一胺基酸取代在AHo位置46處，第二胺基酸取代在EU位置183處，第三胺基酸取代在EU位置356處且第四胺基酸取代在EU位置399處。 在另一態樣中，本文所述之異二聚抗體包含重鏈，該重鏈包含(a)在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代，(b)在選自由EU位置126-213組成之群之EU位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代，(c)在選自由EU位置388-397組成之群之EU位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及(d)在選自由EU位置404-413組成之群之EU位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代，其中(a)之該帶電荷胺基酸與(b)之該帶電荷胺基酸具有相同電荷，且其中(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸之相反電荷。舉例而言，在一些實施例中，(a)及(b)之帶電荷胺基酸具有正電荷且(c)及(d)之帶電荷胺基酸具有負電荷。在替代性實施例中，(a)及(b)之帶電荷胺基酸具有負電荷且(c)及(d)之帶電荷胺基酸具有正電荷。在一些實施例中，第一胺基酸取代在AHo位置46處，第二胺基酸取代在EU位置183處，第三胺基酸取代在EU位置392處且第四胺基酸取代在EU位置409處。 本文亦提供一種包含第一重鏈及第二重鏈以及第一輕鏈及第二輕鏈之異二聚抗體，其中該第一重鏈在位置46(AHo，Kabat 39)、183(EU)、356(EU)及399(EU)處包含胺基酸取代，其中該第二重鏈在位置46(AHo)、183(EU)、392(EU)及409(EU)處包含胺基酸取代，且其中該第一輕鏈及該第二輕鏈在位置46(AHo，Kabat 38)及176(EU)處包含胺基酸取代，其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。在一些實施例中，第一重鏈之AHo位置46(Kabat 39)處之麩醯胺酸經麩胺酸置換，第二重鏈之AHo位置46(Kabat 39)處之麩醯胺酸經離胺酸置換，第一輕鏈之AHo位置46(Kabat 38)處之麩醯胺酸經離胺酸置換，第二輕鏈之AHo位置46(Kabat 38)處之麩醯胺酸經麩胺酸置換，第一重鏈之位置183(EU)處之絲胺酸經麩胺酸置換，第一重鏈之位置356(EU)處之麩胺酸經離胺酸置換，第一重鏈之位置399(EU)處之麩胺酸經離胺酸置換，第二重鏈之位置183(EU)處之絲胺酸經離胺酸置換，第二重鏈之位置392(EU)處之離胺酸經天冬胺酸置換，及/或第二重鏈之位置409(EU)處之離胺酸經天冬胺酸置換。 在另一態樣中，本文描述一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之抗體，其中該抗體包含具有包含一或多個胺基酸取代之CH3域的重鏈，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸。在一些實施例中，CH3域中之帶負電荷胺基酸(例如在EU位置D399、E356或E357處)經帶正電荷胺基酸取代。在一些實施例中，EU位置D399、E356及E357處之胺基酸經帶正電荷胺基酸(例如離胺酸)取代。國際公開案第WO 2009/089004號(以全文引用的方式併入本文中)描述用於工程改造CH3域界面以在兩個含有CH3域之分子之間降低同二聚化且增加異二聚化之組合物及方法。輕鏈修飾 如上所論述，為使特定重鏈與其同源輕鏈之結合最大，重鏈與輕鏈兩者均較佳含有互補胺基酸取代以靜電操縱鏈裝配。因此，在各種實施例中，輕鏈包含一或多個互補於以上論述之重鏈取代之胺基酸取代。 在一些實施例中，輕鏈為κ輕鏈。圖6為人類κ輕鏈可變域V區及J區之生殖系比對。在一些實施例中，異二聚抗體包含與人類生殖系κ鏈可變區至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之κ鏈可變區。 VL域內之V區界面殘基(亦即介導VH及VL域之裝配之胺基酸殘基)包括AHo位置40(Kabat 32)、42(Kabat 34)、43(Kabat 35)、44(Kabat 36)、46(Kabat 38)、49(Kabat 41)、50(Kabat 42)、51(Kabat 43)、52(Kabat 44)、53(Kabat 45)、54(Kabat 46)、56(Kabat 48)、57(Kabat 49)、58(Kabat 50)、67(Kabat 51)、69(Kabat 53)、70(Kabat 54)、71(Kabat 55)、72(Kabat 56)、73(Kabat 57)、74(Kabat 58)、103(Kabat 85)、105(Kabat 87)、107(Kabat 89)、108(Kabat 90)及109(Kabat 91)。J區殘基包括AHo位置116、117及118。在一些實施例中，VL域中之一或多個界面殘基經較佳與引入同源重鏈可變域(亦即VH域)中之帶電荷胺基酸具有相反電荷之帶電荷胺基酸取代。在一些實施例中，VL域之AHo位置46(Kabat 38)處之胺基酸經帶正電荷胺基酸置換。在一些實施例中，諸如當VH域中之AHo位置46(Kabat 39)處之胺基酸經帶正電荷胺基酸取代時，VL域之AHo位置46(Kabat 38)處之胺基酸經帶負電荷胺基酸置換。 在一些實施例中，AHo位置51(Kabat 43)及/或AHo位置141(Kabat 100)處之胺基酸被取代成帶正電荷或帶負電荷胺基酸。此等實施例可進一步包括使AHo位置46處之胺基酸被取代成帶正電荷或帶負電荷胺基酸。在一些實施例中，AHo位置51處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸，例如離胺酸。在替代性實施例中，AHo位置51處之胺基酸被取代成帶負電荷胺基酸，例如天冬胺酸。在一些實施例中，AHo位置141處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸，例如離胺酸。在替代性實施例中，AHo位置141處之胺基酸被取代成帶負電荷胺基酸，例如天冬胺酸。在一些實施例中，AHo位置51及AHo位置141處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸(例如離胺酸)或帶負電荷胺基酸(例如天冬胺酸)。此等實施例可進一步包含在AHo位置46(Kabat 38)處取代成帶正電荷或帶負電荷胺基酸。 輕鏈之恆定區(亦即CL域)亦與重鏈複合，且此區域可經工程改造以增加特定輕鏈與其同源重鏈配對之效率。可藉由以下手段來促進裝配：在或接近界面處將半胱胺酸殘基引入重鏈及輕鏈中以允許形成二硫鍵，改變胺基酸以產生鈕入孔效應，及與本文對於可變區所述之靜電工程改造類似之靜電工程改造。 在輕鏈為κ輕鏈之實施例中，異二聚抗體之CL域中之在選自由F116、F118、S121、D122、E123、Q124、S131、V133、L135、N137、N138、Q160、S162、T164、S174及S176組成之群之位置(kappa輕鏈中之EU及Kabat編號)處的一或多個胺基酸經帶電荷胺基酸置換。在一些實施例中，供用帶負電荷或帶正電荷胺基酸取代之一示範性殘基為CL域之位置176(EU及Kabat編號系統)處之胺基酸。在一些實施例中，CL域之位置176處之胺基酸經帶正電荷胺基酸置換。在替代性實施例中，CL域之位置176處之胺基酸經帶負電荷胺基酸，例如天冬胺酸置換。 在一些實施例中，輕鏈為λ輕鏈。在一些實施例中，異二聚抗體之CL域中之在選自由T116、F118、S121、E123、E124、K129、T131、V133、L135、S137、E160、T162、S165、Q167、A174、S176及Y178組成之群之位置(λ鏈中之Kabat編號)處的一或多個胺基酸經帶電荷胺基酸置換。在一些實施例中，供用帶負電荷或帶正電荷胺基酸取代之一示範性殘基為CL域之位置176(EU及Kabat編號系統)處之胺基酸。在一些實施例中，CL域之位置176處之胺基酸經帶正電荷胺基酸置換。在替代性實施例中，CL域之位置176處之胺基酸經帶負電荷胺基酸，例如天冬胺酸置換。 圖7為人類λ輕鏈可變域V及J區之生殖系比對。在一些實施例中，抗原結合蛋白或抗體包含與人類生殖系λ鏈可變區至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之輕鏈可變區。 CL域中之人類生殖系λ鏈可變區之V區界面殘基包括AHo位置40(Kabat 32)、42(Kabat 34)、43(Kabat 35)、44(Kabat 36)、46(Kabat 38)、49(Kabat 41)、50(Kabat 42)、51(Kabat 43)、52(Kabat 44)、53(Kabat 45)、54(Kabat 46)、56(Kabat 48)、57(Kabat 49)、58(Kabat 50)、67(Kabat 51)、69(Kabat 53)、70(Kabat 54)、71(Kabat 55)、72(Kabat 56)、73(Kabat 57)、74(Kabat 58)、103(Kabat 85)、105(Kabat 87)、107(Kabat 89)、108(Kabat 90)及109(Kabat 91)。J區殘基包括AHo位置139及140。涵蓋用帶電荷胺基酸取代在此等位置處之一或多個胺基酸。在較佳實施例中，一或多個胺基酸經電荷與引入同源重鏈可變域中之帶電荷胺基酸相反之帶正電荷或帶負電荷胺基酸取代。 在一些實施例中，λ可變區之AHo位置51(Kabat 43)及/或AHo位置141(Kabat 100)處之胺基酸被取代成帶正電荷或帶負電荷胺基酸。此等實施例可進一步包括使AHo位置46處之胺基酸被取代成帶正電荷或帶負電荷胺基酸。在一些實施例中，AHo位置51處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸，例如離胺酸。在替代性實施例中，AHo位置51處之胺基酸被取代成帶負電荷胺基酸，例如天冬胺酸。在一些實施例中，AHo位置141處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸，例如離胺酸。在替代性實施例中，AHo位置141處之胺基酸被取代成帶負電荷胺基酸，例如天冬胺酸。在一些實施例中，AHo位置51及AHo位置141處之胺基酸被取代成帶正電荷胺基酸(例如離胺酸)或帶負電荷胺基酸(例如天冬胺酸)。此等實施例可進一步包含在AHo位置46處取代成帶正電荷或帶負電荷胺基酸。視情況選用之其他修飾 本文所述之異二聚抗體之重鏈可進一步包含一或多個影響含有重鏈之抗體結合一或多種Fc受體之突變。抗體之Fc部分之一個功能在於當抗體結合其目標時與免疫系統通訊。此通常稱為「效應物功能」。通訊會產生抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。ADCC及ADCP係經由Fc與免疫系統之細胞之表面上的Fc受體結合來介導。CDC係經由Fc與補體系統之蛋白質(例如C1q)結合來介導。 IgG子類介導效應物功能之能力不同。舉例而言，IgG1在介導ADCC及CDC方面優於IgG2及IgG4。可藉由將一或多個突變引入Fc中來增加或降低抗體之效應物功能。本發明之實施例包括具有經工程改造以增加效應物功能之Fc的異二聚抗體(U.S. 7,317,091及Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009；兩者均以全文引用的方式併入本文中)。效應物功能增加之示範性IgG1 Fc分子包括具有一或多個以下取代者[編號基於EU編號流程]： S239D/I332E S239D/A330S/I332E S239D/A330L/I332E S298A/D333A/K334A P247I/A339D P247I/A339Q D280H/K290S D280H/K290S/S298D D280H/K290S/S298V F243L/R292P/Y300L F243L/R292P/Y300L/P396L F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L G236A/S239D/I332E K326A/E333A K326W/E333S K290E/S298G/T299A K290N/S298G/T299A K290E/S298G/T299A/K326E K290N/S298G/T299A/K326E K334V L235S+S239D+K334V Q311M+K334V S239D+K334V F243V+K334V E294L+K334V S298T+K334V E233L+Q311M+K334V L234I+Q311M+K334V S298T+K334V A330M+K334V A330F+K334V Q311M+A330M+K334V Q311M+A330F+K334V S298T+A330M+K334V S298T+A330F+K334V S239D+A330M+K334V S239D+S298T+K334V L234Y+K290Y+Y296W L234Y+F243V+Y296W L234Y+E294L+Y296W L234Y+Y296W K290Y+Y296W 本發明之其他實施例包括具有經工程改造以降低效應物功能之Fc的異二聚抗體。效應物功能降低之示範性Fc分子包括具有一或多個以下取代者[編號基於EU編號流程]： N297A(IgG1) L234A/L235A(IgG1) V234A/G237A(IgG2) L235A/G237A/E318A(IgG4) H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2) C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1) C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgG1) L234F/L235E/P331S(IgG1) S267E/L328F(IgG1) 增加含有IgG Fc之蛋白質之效應物功能的另一方法係藉由降低Fc之海藻糖基化。自連接於Fc之雙觸角複合型寡醣移除核心海藻糖極大增加ADCC效應物功能而不改變抗原結合或CDC效應物功能。已知用於降低或消除含有Fc之分子(例如抗體)之海藻糖基化的若干方法。此等方法包括在某些哺乳動物細胞株中進行重組表現，該等細胞株包括FUT8基因剔除細胞株、變異CHO株系Lec13、大鼠融合瘤細胞株YB2/0、包含特異性針對FUT8基因之小干擾RNA之細胞株、及共表現β-1,4-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III及高爾基體β-甘露糖苷酶II之細胞株。或者，含有Fc之分子可在非哺乳動物細胞，諸如植物細胞、酵母或原核細胞(例如大腸桿菌(E. coli))中表現。因此，在某些實施例中，組合物包含海藻糖基化降低或完全缺乏海藻糖基化之抗體。 意欲基本上任何抗體可變域皆可併入本文所述之異二聚抗體形式中。示範性抗體可變域(及其特異性結合之抗原)包括但不限於以下中所述者：美國專利第7947809號及美國專利申請公開案第20090041784號(升糖素(glucagon)受體)、美國專利第7939070號、美國專利第7833527號、美國專利第7767206號及美國專利第7786284號(IL-17受體A)、美國專利第7872106號及美國專利第7592429號(硬化蛋白)、美國專利第7871611號、美國專利第7815907號、美國專利第7037498號、美國專利第7700742號及美國專利申請公開案第20100255538號(IGF-1受體)、美國專利第7868140號(B7RP1)、美國專利第7807159號及美國專利申請公開案第20110091455號(肌抑素(myostatin))、美國專利第7736644號、美國專利第7628986號、美國專利第7524496號及美國專利申請公開案第20100111979號(表皮生長因子受體之缺失突變體)、美國專利第7728110號(SARS冠狀病毒)、美國專利第7718776號及美國專利申請公開案第20100209435號(OPGL)、美國專利第7658924號及美國專利第7521053號(促血管生成素- 2(Angiopoietin-2))、美國專利第7601818號、美國專利第7795413號、美國專利申請公開案第20090155274號、美國專利申請公開案第20110040076號(NGF)、美國專利第7579186號(TGF-β II型受體)、美國專利第7541438號(結締組織生長因子)、美國專利第7438910號(IL1-R1)、美國專利第7423128號(備解素(properdin))、美國專利第7411057號、美國專利第7824679號、美國專利第7109003號、美國專利第6682736號、美國專利第7132281號及美國專利第7807797號(CTLA-4)、美國專利第7084257號、美國專利第7790859號、美國專利第7335743號、美國專利第7084257號及美國專利申請公開案第20110045537號(干擾素-γ)、美國專利第7932372號(MAdCAM)、美國專利第7906625號、美國專利申請公開案第20080292639號及美國專利申請公開案第20110044986號(澱粉狀蛋白(amyloid))、美國專利第7815907號及美國專利第7700742號(胰島素樣生長因子)、美國專利第7566772號及美國專利第7964193號(介白素-1β(interleukin-1β))、美國專利第7563442號、美國專利第7288251號、美國專利第7338660號、美國專利第7626012號、美國專利第7618633號及美國專利申請公開案第20100098694號(CD40)、美國專利第7498420號(c-Met)、美國專利第7326414號、美國專利第7592430號及美國專利第7728113號(M-CSF)、美國專利第6924360號、美國專利第7067131號及美國專利第7090844號(MUC18)、美國專利第6235883號、美國專利第7807798號及美國專利申請公開案第20100305307號(表皮生長因子受體)、美國專利第6716587號、美國專利第7872113號、美國專利第7465450號、美國專利第7186809號、美國專利第7317090號及美國專利第7638606號(介白素- 4受體)、美國專利申請公開案第20110135657號(β-KLOTHO)、美國專利第7887799號及美國專利第7879323號(纖維母細胞生長因子樣多肽)、美國專利第7867494號(IgE)、美國專利申請公開案第20100254975號(α-4 β-7)、美國專利申請公開案第20100197005號及美國專利第7537762號(活化素(ACTIVIN)受體樣激酶-1)、美國專利第7585500號及美國專利申請公開案第20100047253號(IL-13)、美國專利申請公開案第20090263383號及美國專利第7449555號(CD148)、美國專利申請公開案第20090234106號(活化素A)、美國專利申請公開案第20090226447號(促血管生成素-1及促血管生成素-2)、美國專利申請公開案第20090191212號(促血管生成素-2)、美國專利申請公開案第20090155164號(C-FMS)、美國專利第7537762號(活化素受體樣激酶-1)、美國專利第7371381號(甘丙肽(galanin))、美國專利申請公開案第20070196376號(胰島素樣生長因子)、美國專利第7267960號及美國專利第7741115號(LDCAM)、US7265212(CD45RB)、美國專利第7709611號、美國專利申請公開案第20060127393號及美國專利申請公開案第20100040619號(DKK1)、美國專利第7807795號、美國專利申請公開案第20030103978號及美國專利第7923008號(骨保護素(osteoprotegerin))、美國專利申請公開案第20090208489號(OV064)、美國專利申請公開案第20080286284號(PSMA)、美國專利第7888482號、美國專利申請公開案第20110165171號及美國專利申請公開案第20110059063號( PAR2)、美國專利申請公開案第20110150888號(鐵調素(HEPCIDIN))、美國專利第7939640號(B7L-1)、美國專利第7915391號(c-Kit)、美國專利第7807796號、美國專利第7193058號及美國專利第7427669號(ULBP)、美國專利第7786271號、美國專利第7304144號及美國專利申請公開案第20090238823號(TSLP)、美國專利第7767793號(SIGIRR)、美國專利第7705130號(HER-3)、美國專利第7704501號(共濟失調蛋白(ataxin)-1樣多肽)、美國專利第7695948號及美國專利第7199224號(TNF-α轉化酶)、美國專利申請公開案第20090234106號(活化素A)、美國專利申請公開案第20090214559號及美國專利第7438910號(IL1-R1)、美國專利第7579186號(TGF-β II型受體)、美國專利第7569387號(TNF受體樣分子)、美國專利第7541438號(結締組織生長因子)、美國專利第7521048號(TRAIL受體-2)、美國專利第6319499號、美國專利第7081523號及美國專利申請公開案第20080182976號(紅血球生成素(erythropoietin)受體)、美國專利申請公開案第20080166352號及美國專利第7435796號(B7RP1)、美國專利第7423128號(備解素)、美國專利第7422742號及美國專利第7141653號(介白素-5)、美國專利第6740522號及美國專利第7411050號(RANKL)、美國專利第7378091號(碳酸酐酶IX(CA IX)腫瘤抗原)、美國專利第7318925號及美國專利第7288253號(副甲狀腺激素(parathyroid hormone))、美國專利第7285269號(TNF)、美國專利第6692740號及美國專利第7270817號(ACPL)、美國專利第7202343號(單核細胞化學吸引蛋白質-1)、美國專利第7144731號(SCF)、美國專利第6355779號及美國專利第7138500號(4-1BB)、美國專利第7135174號(PDGFD)、美國專利第6630143號及美國專利第7045128號(Flt-3配體)、美國專利第6849450號(金屬蛋白酶抑制劑)、美國專利第6596852號(LERK-5)、美國專利第6232447號(LERK-6)、美國專利第6500429號(腦源性神經滋養因子)、美國專利第6184359號(上皮源性T細胞因子)、美國專利第6143874號(神經滋養因子NNT-1) 、美國專利申請公開案第20110027287號(原蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶克欣蛋白酶9型(PROPROTEIN CONVERTASE SUBTILISIN KEXIN TYPE 9，PCSK9))、美國專利申請公開案第20110014201號(IL-18受體)及美國專利申請公開案第20090155164號(C-FMS)。以上專利及公開之專利申請案就其揭露可變域多肽、可變域編碼核酸、宿主細胞、載體、製備編碼該等可變域之多肽之方法、醫藥組合物、及治療與含有可變域之抗原結合蛋白或抗體之各別目標相關的疾病之方法而言以全文引用的方式併入本文中。抗體及其片段 在一些實施例中，本文所述之異二聚抗體包含如本文所述之抗硬化蛋白及抗DKK1抗體及其片段(例如包含介導與硬化蛋白之結合之重鏈及輕鏈及介導與DKK1之結合之重鏈及輕鏈的異二聚抗體)。術語「抗體」係指完整抗體或其結合片段。抗體可包含完全抗體(免疫球蛋白)分子(包括具有全長重鏈及/或輕鏈之多株、單株、嵌合、人類化及/或人類形式)，或包含其抗原結合片段。抗體片段包括F(ab')₂ 、Fab、Fab'、Fv、Fc及Fd片段，且可併入單域抗體(例如奈米抗體)、單鏈抗體、大抗體、微抗體、內抗體、微型雙功能抗體、微型三功能抗體、微型四功能抗體、v-NAR及雙scFv (參見例如Hollinger及Hudson,Nature Biotechnology, 23 (9):1126-1136 (2005))。抗體多肽，包括纖維結合蛋白多肽單域抗體，亦揭露於美國專利第6,703,199號中。其他抗體多肽揭露於美國專利公開案第20050238646號中。 抗體片段可為合成或遺傳工程改造蛋白質。舉例而言，抗體片段包括由輕鏈可變區組成之經分離片段、由重鏈及輕鏈可變區組成之「Fv」片段、以及輕鏈可變區與重鏈可變區藉由肽連接子連接之重組單鏈多肽分子(scFv蛋白質)。 抗體片段之另一形式為包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的肽。如本文所用，術語「CDR」係指抗體可變序列內之補充決定區。在重鏈及輕鏈之各可變區中存在三個CDR，其被指定為各可變區之CDR1、CDR2及CDR3。如本文所用之術語「CDR組」係指存在於單一可變區中之能夠結合抗原的一組三個CDR。此等CDR之精確邊界已根據不同系統加以不同界定。由Kabat(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)及(1991))所述之系統不僅提供可適用於抗體之任何可變區之明確殘基編號系統，而且亦提供界定三個CDR之準確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)及Chothia等人, Nature 342:877-883 (1989))發現儘管在胺基酸序列之層面上具有巨大多樣性，但Kabat CDR內之某些子部分採用幾乎相同之肽骨架構形。此等子部分指定為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別指定輕鏈及重鏈區域。此等區域可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR之其他邊界已由Padlan(FASEB J. 9:133-139 (1995))及MacCallum (J Mol Biol 262(5):73245 (1996))描述。其他CDR邊界定義可不嚴格遵循一種以上系統，但將仍然與Kabat CDR重疊，儘管鑒於特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗研究結果，其可能縮短或延長。本文所用之方法可利用根據任何此等系統確定之CDR，但較佳實施例使用Kabat或Chothia確定之CDR。 CDR(亦稱為「最小識別單位」或「高變區」)係藉由例如構築編碼相關CDR之聚核苷酸獲得。此等聚核苷酸例如藉由使用利用抗體產生細胞之mRNA作為模板之聚合酶鏈反應以合成可變區來製備(參見例如Larrick等人,Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2 :106 (1991)；Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」,Monoclonal Antibodies Production, Engineering and Clinical Application , Ritter等人 (編), 第166頁, Cambridge University Press (1995)；及Ward等人, 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」,Monoclonal Antibodies: Principles and Applications , Birch等人, (編), 第137頁, Wiley-Liss公司 (1995))。 本文所述之方法及抗體鏈適用於產生異二聚抗體。如本文所用之「特異性結合」意謂抗原結合蛋白結合抗原優先於結合其他蛋白質。在一些實施例中，「特異性結合」意謂抗原結合蛋白對抗原之親和力高於對其他蛋白質之親和力。特異性結合抗原之抗原結合蛋白對抗原之結合親和力可小於或等於1 × 10^-7 M、小於或等於2 × 10^-7 M、小於或等於3 × 10^-7 M、小於或等於4 × 10^-7 M、小於或等於5 × 10^-7 M、小於或等於6 × 10^-7 M、小於或等於7 × 10^-7 M、小於或等於8 × 10^-7 M、小於或等於9 × 10^-7 M、小於或等於1 × 10^-8 M、小於或等於2 × 10^-8 M、小於或等於3 × 10^-8 M、小於或等於4 × 10^-8 M、小於或等於5 × 10^-8 M、小於或等於6 × 10^-8 M、小於或等於7 × 10^-8 M、小於或等於8 × 10^-8 M、小於或等於9 × 10^-8 M、小於或等於1 × 10^-9 M、小於或等於2 × 10^-9 M、小於或等於3 × 10^-9 M、小於或等於4 × 10^-9 M、小於或等於5 × 10^-9 M、小於或等於6 × 10^-9 M、小於或等於7 × 10^-9 M、小於或等於8 × 10^-9 M、小於或等於9 × 10^-9 M、小於或等於1 × 10^-10 M、小於或等於2 × 10^-10 M、小於或等於3 × 10^-10 M、小於或等於4 × 10^-10 M、小於或等於5 × 10^-10 M、小於或等於6 × 10^-10 M、小於或等於7 × 10^-10 M、小於或等於8 × 10^-10 M、小於或等於9 × 10^-10 M、小於或等於1 × 10^-11 M、小於或等於2 × 10^-11 M、小於或等於3 × 10^-11 M、小於或等於4 × 10^-11 M、小於或等於5 × 10^-11 M、小於或等於6 × 10^-11 M、小於或等於7 × 10^-11 M、小於或等於8 × 10^-11 M、小於或等於9 × 10^-11 M、小於或等於1 × 10^-12 M、小於或等於2 × 10^-12 M、小於或等於3 × 10^-12 M、小於或等於4 × 10^-12 M、小於或等於5 × 10^-12 M、小於或等於6 × 10^-12 M、小於或等於7 × 10^-12 M、小於或等於8 × 10^-12 M或小於或等於9 × 10^-12 M。抗硬化蛋白抗體 在一些實施例中，，本文所述之異二聚抗體包含含有抗硬化蛋白抗體之硬化蛋白結合部分。「抗硬化蛋白抗體」結合硬化蛋白或其部分以阻斷或損害人類硬化蛋白結合一或多種配體。硬化蛋白，SOST基因之產物，不存在於硬化性骨化病中，硬化性骨化病為一種特徵在於骨過度生長及強密質骨的骨骼疾病(Brunkow等人, Am. J. Hum. Genet., 68:577-589 (2001)；Balemans等人, Hum. Mol. Genet., 10:537-543 (2001))。人類硬化蛋白之胺基酸序列由Brunkow等人報導且在美國專利公開案第20070110747號中揭露為SEQ ID NO: 1(該專利公開案就其描述硬化蛋白結合劑及序列表而言全文併入本文中)。重組人類硬化蛋白/SOST可購自R&D Systems(Minneapolis, Minn., USA; 2006 目錄號1406-ST-025)。另外，重組小鼠硬化蛋白/SOST可購自R&D Systems(Minneapolis, Minn., USA; 2006 目錄號1589-ST-025)。研究級硬化蛋白結合單株抗體可購自R&D Systems(Minneapolis, Minn., USA; 小鼠單株：2006 目錄號 MAB1406；大鼠單株：2006 目錄號 MAB1589)。美國專利第6,395,511號及第6,803,453號以及美國專利公開案第2004/0009535號及第2005/0106683號大體上涉及抗硬化蛋白抗體。適用於本發明之情形下之硬化蛋白結合劑的實例亦描述於美國專利公開案第2007/0110747號及第2007/0072797號中，該等專利公開案據此以引用的方式併入本文中。關於產生硬化蛋白結合劑之材料及方法的其他資訊可見於美國專利公開案第20040158045號(據此以引用的方式併入)。 抗硬化蛋白抗體或其片段結合具有SEQ ID NO: 1之硬化蛋白或其天然存在之變異體的親和力(Kd)可小於或等於1 × 10^-7 M、小於或等於1 × 10^-8 M、小於或等於1 × 10^-9 M、小於或等於1 × 10^-10 M、小於或等於1 × 10^-11 M或小於或等於1 × 10^-12 M。使用多種技術測定親和力，該等技術之一實例為親和力ELISA分析。在各種實施例中，藉由BIAcore分析測定親和力。在各種實施例中，藉由動力學方法測定親和力。在各種實施例中，藉由平衡/溶解方法測定親和力。美國專利公開案第2007/0110747號含有對適於決定抗體對硬化蛋白之親和力(Kd)之親和力分析的其他描述。 在一些或任何實施例中，抗硬化蛋白抗體或抗體片段結合包含SEQ ID NO: 1中所述之胺基酸序列之硬化蛋白多肽且結合硬化蛋白之包含序列SEQ ID NO: 6(CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111)之區域。此區域在本文中亦稱為硬化蛋白之「環2」區域。硬化蛋白之在環2區域外部之區域在本文中定義為「非環2區域」。或者或此外，抗硬化蛋白抗體結合包含SEQ ID NO: 1之胺基酸57-146之硬化蛋白多肽。或者或此外，抗硬化蛋白抗體結合包含SEQ ID NO: 1之胺基酸89-103及/或SEQ ID NO: 1之胺基酸137-151之硬化蛋白多肽。或者或此外，抗硬化蛋白抗體結合包含SEQ ID NO: 1中所述之胺基酸序列的硬化蛋白多肽且結合SEQ ID NO: 1內之以下中之至少一者的序列：SEQ ID NO: 2 (DVSEYSCRELHFTR；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸51-64)、SEQ ID NO: 3 (SAKPVTELVCSGQCGPAR；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸73-90)、SEQ ID NO: 4 (WWRPSGPDFRCIPDRYR；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸101-117)、SEQ ID NO: 5 (LVASCKCKRLTR；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸138-149)、SEQ ID NO: 70 (SAKPVTELVCSGQC；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸73-86)、SEQ ID NO: 71 (LVASCKC；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸138-144)、SEQ ID NO: 72 (C1RELHFTR；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸57-64)、或SEQ ID NO: 73 (CIPDRYR；對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸111-117)。舉例而言，在一個態樣中，抗硬化蛋白抗體結合具有SEQ ID NO: 1之硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 2-5(及/或SEQ ID NO: 70-73)的子區域，視情況呈其天然三維構形。視情況，抗硬化蛋白抗體結合由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73之一或多者組成之肽(例如由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5組成之肽或由SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72及SEQ ID NO: 73組成之肽)。 在一些或任何實施例中，抗硬化蛋白抗體結合包含SEQ ID NO: 1之胺基酸89-103及137-151之硬化蛋白多肽。 在一些或任何實施例中，抗硬化蛋白抗體結合具有胺基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5之硬化蛋白多肽，其中SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 4在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置57及111處藉由二硫鍵接合，且SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 5藉由以下至少一者接合：(a)在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置82及142處之二硫鍵，及(b)在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置86及144處之二硫鍵；該多肽可保留具有SEQ ID NO:1之人類硬化蛋白之相應多肽區域的三級結構。或者或此外，抗硬化蛋白抗體結合具有胺基酸序列SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72及SEQ ID NO: 73之多肽，其中SEQ ID NO: 72與SEQ ID NO: 73在參考SEQ ID NO: 1之胺基酸位置57及111處藉由二硫鍵接合，且SEQ ID NO: 70與SEQ ID NO: 71藉由以下至少一者接合：(a)在參考SEQ ID NO: 1之胺基酸位置82及142處之二硫鍵，及(b)在參考SEQ ID NO: 1之胺基酸位置86及144處之二硫鍵。 視情況，抗硬化蛋白抗體結合基本上由胺基酸序列SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5組成之肽，其中SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 4在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置57及111處藉由二硫鍵接合，且SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 5藉由以下至少一者接合：(a)在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置82及142處之二硫鍵，及(b)在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置86及144處之二硫鍵。 視情況，抗硬化蛋白抗體結合基本上由SEQ ID NO: 1之多截短人類硬化蛋白蛋白質組成之多肽，其中(a)該多肽無SEQ ID NO: 1之胺基酸1-50、65-72、91-100、118-137及150-190，或(b)該多肽無SEQ ID NO: 1之胺基酸1-56、65-72、87-110、118-137及145-190。 在一些或任何實施例中，抗硬化蛋白抗體結合具有胺基酸序列SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72及SEQ ID NO: 73之多肽，其中SEQ ID NO: 72與SEQ ID NO: 73在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置57及111處藉由二硫鍵接合，且SEQ ID NO: 70與SEQ ID NO: 71藉由以下至少一者接合：(a)在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置82及142處之二硫鍵，及(b)在參考SEQ ID NO:1之胺基酸位置86及144處之二硫鍵。 在一些或任何實施例中，硬化蛋白多肽保留具有SEQ ID NO: 1之人類硬化蛋白之相應多肽區域的三級結構。 在一些或任何實施例中，抗硬化蛋白抗體結合(i)人類硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸51-64、73-90、101-117及138-149的部分，其中該部分具有以下至少一者、至少兩者或全部三者：(a)胺基酸57與111之間的二硫鍵；(b)胺基酸82與142之間的二硫鍵；及(c)胺基酸86與144之間的二硫鍵；或(ii)人類硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸57-64、73-86、111-117及138-144的部分，其中該部分具有以下至少一者、至少兩者或全部三者：(a)胺基酸57與111之間的二硫鍵；(b)胺基酸82與142之間的二硫鍵；及(c)胺基酸86與144之間的二硫鍵。 在一些或任何實施例中，抗硬化蛋白抗體亦結合具有SEQ ID NO: 6之抗原決定基。 用於產生本文所述之異二聚抗體之抗硬化蛋白抗體較佳在美國專利公開案第2007/0110747號中所述之細胞基分析及/或美國專利公開案第20070110747號中所述之活體內分析中調節硬化蛋白功能及/或結合美國專利公開案第2007/0110747號中所述之一或多種抗原決定基及/或交叉阻斷美國專利公開案第2007/0110747號中所述之一種抗體之結合及/或由美國專利公開案第2007/0110747號(以全文引用的方式且就其描述用於表徵抗硬化蛋白抗體之分析而言併入本文中)中所述之一種抗體交叉阻斷結合硬化蛋白。 在各種態樣中，當相較於每孔之硬化蛋白莫耳數，每孔存在小於6倍過量莫耳數之硬化蛋白結合位點時，抗硬化蛋白抗體亦能夠在MC3T3細胞基礦化分析中中和人類硬化蛋白。藉由培養物中之骨母細胞譜系細胞(初級細胞或細胞株)達成之礦化用作活體外骨形成模型。示範性細胞基礦化分析描述於美國專利公開案第20070110747號中例如實例8處(據此以引用的方式併入)。MC3T3-E1細胞(Sudo等人, J. Cell Biol., 96:191-198 (1983))及原始細胞株之次純系可在分化劑存在下生長後在培養物中形成礦物質。此等次純系包括MC3T3-E1-BF (Smith等人, J. Biol. Chem., 275:19992-20001 (2000))。對於MC3T3-E1-BF次純系以及原始MC3T3-E1細胞兩者，硬化蛋白可抑制導致且包括礦物質沈積之一系列事件之一或多者(亦即硬化蛋白抑制礦化)。能夠中和硬化蛋白之抑制活性之抗硬化蛋白抗體允許培養物在硬化蛋白存在下礦化，以使相較於在僅有硬化蛋白(亦即無抗體)治療組中量測之鈣量，例如磷酸鈣(量測為鈣)沈積存在統計顯著增加。 當以確定特定抗硬化蛋白抗體(或其他硬化蛋白抑制劑)是否可中和硬化蛋白為目標進行分析時，分析中所用之硬化蛋白之量合乎需要地為相較於在無硬化蛋白組中量測之鈣量，在僅有硬化蛋白組中導致磷酸鈣(量測為鈣)沈積統計顯著降低至少70%之硬化蛋白的最小量。抗硬化蛋白中和抗體定義為相較於在僅有硬化蛋白(亦即無抗體)治療組中量測之鈣量，導致磷酸鈣(量測為鈣)沈積統計顯著增加之抗體。為確定抗硬化蛋白抗體是否具有中和性，分析中使用之抗硬化蛋白抗體之量需要使相較於每孔之硬化蛋白莫耳數，每孔存在過量莫耳數之硬化蛋白結合位點。視抗體之效能而定，可能需要之過量倍數可為24、18、12、6、3或1.5，且熟習此項技術者熟悉測試一個以上濃度之結合劑(抗體)的常規規範。舉例而言，當相較於每孔之硬化蛋白莫耳數，每孔存在小於6倍過量莫耳數之硬化蛋白結合位點時，極強力抗硬化蛋白中和抗體將中和硬化蛋白。次強力抗硬化蛋白中和抗體將僅在12、18或24倍過量下中和硬化蛋白。 在細胞基分析，諸如骨特異性鹼性磷酸酶分析，例如國際專利公開案第WO 2008/115732號及美國專利第7,744,874號(就其描述細胞基分析及抗硬化蛋白抗體而言以全文引用的方式併入本文中)中所述之骨特異性鹼性磷酸酶分析中，抗硬化蛋白抗體中和人類硬化蛋白之IC50視情況為100 nM或100 nM以下、或75 nM或75 nM以下、或50 nM或50 nM以下、或25 nM或25 nM以下。骨特異性鹼性磷酸酶分析基於硬化蛋白降低多潛力鼠類細胞株C2C12中BMP-4及Wnt3a刺激之鹼性磷酸酶含量的能力。根據WO 2008/115732，中和抗硬化蛋白抗體在此分析中介導鹼性磷酸酶活性之劑量依賴性增加。 或者或此外，在HEK293細胞株中，在細胞基Wnt信號傳導分析，諸如描述於例如國際專利公開案第WO 2009/047356號(就其論述抗硬化蛋白抗體及細胞基分析而言以引用的方式併入本文中)中之涉及Wnt1介導之STF報導體基因誘導的Wnt分析中，抗硬化蛋白抗體中和人類硬化蛋白之IC50為100 nM或100 nM以下(例如75 nM或75 nM以下、或50 nM或50 nM以下)。或者或此外，在MC3T3細胞中，在BMP2誘導之礦化分析，諸如描述於例如國際專利公開案第WO 2009/047356號中之礦化分析中，抗硬化蛋白抗體中和人類硬化蛋白之IC50為500 nM或500 nM以下(例如250 nM或250 nM以下、150 nM或150 nM以下、100 nM或100 nM以下、或50 nM或50 nM以下)。 適用於本發明之情形下之抗硬化蛋白抗體的實例描述於國際專利公開案第2007/0110747號及第2007/0072797號中，該等公開案據此以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，抗硬化蛋白抗體交叉阻斷以下至少一者結合硬化蛋白：抗體Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-11、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23及Ab-24(其全部描述於美國專利公開案第20070110747號中)。或者或此外，抗硬化蛋白抗體由以下至少一者交叉阻斷結合硬化蛋白：抗體Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-11、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23及Ab-24 (其全部描述於美國專利公開案第20070110747號中)。術語「交叉阻斷(cross-block/cross-blocked/cross-blocking)」在本文中可互換使用以意謂抗體干擾其他抗體結合硬化蛋白之能力。抗體能夠干擾另一抗體結合硬化蛋白之程度且因此是否可稱其交叉阻斷可使用競爭結合分析來確定。在本發明之一些態樣中，交叉阻斷抗體或其片段使參考抗體之硬化蛋白結合降低在約40%與約100%，諸如約60%與約100%之間、詳言之在70%與100%之間、且更詳言之在80%與100%之間。偵測交叉阻斷之一特別適合定量分析使用利用表面電漿子共振技術量測相互作用程度之Biacore機器。另一適合定量交叉阻斷分析使用ELISA基方法來量測抗體之間就其結合硬化蛋白而言之競爭。 在一些實施例中，抗硬化蛋白抗體交叉阻斷包含全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白結合具有SEQ ID NO: 1之硬化蛋白及/或由包含全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白交叉阻斷結合具有SEQ ID NO: 1之硬化蛋白，其中包含全長重鏈及輕鏈之該免疫球蛋白包含本文揭露之CDR序列，諸如以下三組CDR序列之一：a)CDR-L1 SEQ ID NO: 284、CDR-L2 SEQ ID NO: 285、CDR-L3 SEQ ID NO: 286、CDR-H1 SEQ ID NO: 296、CDR-H2 SEQ ID NO: 297及CDR-H3 SEQ ID NO: 298；b) CDR-L1 SEQ ID NO: 48、CDR-L2 SEQ ID NO: 49、CDR-L3 SEQ ID NO: 50、CDR-H1 SEQ ID NO: 45、CDR-H2 SEQ ID NO: 46及CDR-H3 SEQ ID NO: 47；或c) CDR-L1 SEQ ID NO: 42、CDR-L2 SEQ ID NO: 43、CDR-L3 SEQ ID NO: 44、CDR-H1 SEQ ID NO: 39、CDR-H2 SEQ ID NO: 40及CDR-H3 SEQ ID NO: 41。或者或此外，抗硬化蛋白抗體交叉阻斷包含全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白結合具有SEQ ID NO: 1之硬化蛋白及/或由包含全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白交叉阻斷結合具有SEQ ID NO: 1之硬化蛋白，其中包含全長重鏈及輕鏈之該免疫球蛋白包含以下CDR：CDR-H1 SEQ ID NO: 245、CDR-H2 SEQ ID NO: 246、CDR-H3 SEQ ID NO: 247、CDR-L1 SEQ ID NO: 78、CDR-L2 SEQ ID NO: 79及CDR-L3 SEQ ID NO: 80。 或者或此外，抗硬化蛋白抗體交叉阻斷包含全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白結合具有SEQ ID NO: 1之硬化蛋白及/或由包含全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白交叉阻斷結合具有SEQ ID NO: 1之硬化蛋白，其中包含全長重鏈及輕鏈之該免疫球蛋白包含以下CDR：CDR-H1 SEQ ID NO: 269、CDR-H2 SEQ ID NO: 270、CDR-H3 SEQ ID NO: 271、CDR-L1 SEQ ID NO: 239、CDR-L2 SEQ ID NO: 240及CDR-L3 SEQ ID NO: 241。 適合抗硬化蛋白抗體及其片段之實例包括具有以下一或多者之抗體及抗體片段：本文明確揭露且美國專利公開案第2007/0110747號中揭露之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之區域之至少一者可具有至少一個胺基酸取代，其限制條件為抗體保留非經取代之CDR之結合特異性。示範性抗硬化蛋白抗體包括但不限於美國專利公開案第2007/0110747號之Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-11、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23及Ab-24。其他示範性抗硬化蛋白抗體包括但不限於27H6、19D11及20C3。 此外，抗硬化蛋白抗體可包含至少一個與選自以下之CDR具有至少75%一致性(例如100%一致性)的CDR序列：提供於序列表中且揭露於美國專利公開案第20070110747號中之SEQ ID NO: 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、78、79、80、81、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、351、352、353、358、359及360。此外，抗硬化蛋白抗體可包含至少一個與選自以下之CDR具有至少75%一致性(例如100%一致性)的CDR序列：提供於序列表中之SEQ ID NO: 417-422、425-430及433-438。抗硬化蛋白抗體較佳包含至少一個與選自以下之CDR具有至少75%一致性的CDR序列：全部提供於序列表中且描述於美國專利公開案第20070110747號中之SEQ ID NO: 245、246、247、78、79、80、269、270、271、239、240及241。如美國專利公開案第2007/0110747號中所述，抗硬化蛋白抗體可包含：a)CDR序列SEQ ID NO: 54、55及56及CDR序列SEQ ID NO: 51、52及53；b)CDR序列SEQ ID NO: 60、61及62及CDR序列SEQ ID NO: 57、58及59；c)CDR序列SEQ ID NO: 48、49及50及CDR序列SEQ ID NO: 45、46及47；d)CDR序列SEQ ID NO: 42、43及44及CDR序列SEQ ID NO: 39、40及41；e)CDR序列SEQ ID NO: 275、276及277及CDR序列SEQ ID NO: 287、288及289；f)CDR序列SEQ ID NO: 278、279及280及CDR序列SEQ ID NO: 290、291及292；g)CDR序列SEQ ID NO: 78、79及80及CDR序列SEQ ID NO: 245、246及247；h)CDR序列SEQ ID NO: 81、99及100及CDR序列SEQ ID NO: 248、249及250；i)CDR序列SEQ ID NO: 101、102及103及CDR序列SEQ ID NO: 251、252及253；j)CDR序列SEQ ID NO: 104、105及106及CDR序列SEQ ID NO: 254、255及256；k)CDR序列SEQ ID NO: 107、108及109及CDR序列SEQ ID NO: 257、258及259；l)CDR序列SEQ ID NO: 110、111及112及CDR序列SEQ ID NO: 260、261及262；m)CDR序列SEQ ID NO: 281、282及283及CDR序列SEQ ID NO: 293、294及295；n)CDR序列SEQ ID NO: 113、114及115及CDR序列SEQ ID NO: 263、264及265；o)CDR序列SEQ ID NO: 284、285及286及CDR序列SEQ ID NO: 296、297及298；p)CDR序列SEQ ID NO: 116、237及238及CDR序列SEQ ID NO: 266、267及268；q)CDR序列SEQ ID NO: 239、240及241及CDR序列SEQ ID NO: 269、270及271)CDR序列SEQ ID NO: 242、243及244及CDR序列SEQ ID NO: 272、273及274；或s)CDR序列SEQ ID NO: 351、352及353及CDR序列SEQ ID NO: 358、359及360。 抗硬化蛋白抗體可包含至少一個與選自以下之CDR具有至少75%一致性(例如100%一致性)的CDR序列：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-H1具有SEQ ID NO: 245中給出之序列，CDR-H2具有SEQ ID NO: 246中給出之序列，CDR-H3具有SEQ ID NO: 247中給出之序列，CDR-L1具有SEQ ID NO: 78中給出之序列，CDR-L2具有SEQ ID NO: 79中給出之序列，且CDR-L3具有SEQ ID NO: 80中給出之序列，其全部提供於序列表中且描述於美國專利公開案第20070110747號中。在各種態樣中，抗硬化蛋白抗體包含兩個CDR或六個CDR。視情況，抗硬化蛋白抗體包含含有SEQ ID NO: 378之重鏈(例如兩個重鏈)之全部或一部分及含有SEQ ID NO: 376之輕鏈(例如兩個輕鏈)之全部或一部分。 抗硬化蛋白抗體可包含至少一個與選自以下之CDR具有至少75%一致性(例如100%一致性)的CDR序列：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-H1具有SEQ ID NO: 269中給出之序列，CDR-H2具有SEQ ID NO: 270中給出之序列，CDR-H3具有SEQ ID NO: 271中給出之序列，CDR-L1具有SEQ ID NO: 239中給出之序列，CDR-L2具有SEQ ID NO: 240中給出之序列，且CDR-L3具有SEQ ID NO: 241中給出之序列，其全部提供於序列表中且描述於美國專利公開案第20070110747號中。在各種態樣中，抗硬化蛋白抗體包含至少兩個CDR或六個CDR。視情況，抗硬化蛋白抗體包含含有SEQ ID NO: 366之重鏈(例如兩個重鏈)之全部或一部分及含有SEQ ID NO: 364之輕鏈(例如兩個輕鏈)之全部或一部分。 或者，抗硬化蛋白抗體可具有重鏈，該重鏈包含CDR之H1、H2及H3且包含具有SEQ ID NO: 137、145或392中提供之序列之多肽或其變異體，其中CDR分別與SEQ ID NO: 245、246及247至少75%一致(例如100%一致)；及輕鏈，該輕鏈包含CDR之L1、L2及L3且包含具有SEQ ID NO: 133或141中提供之序列之多肽或其變異體，其中CDR分別與SEQ ID NO: 78、79及80至少75%一致(例如100%一致)(如美國專利公開案第2007/0110747號中所述)。 抗硬化蛋白抗體可具有重鏈，該重鏈包含CDR之H1、H2及H3且包含具有SEQ ID NO: 335、331、345或396中提供之序列之多肽或任何上述者之變異體，其中CDR分別與SEQ ID NO: 269、270及271至少75%一致(例如100%一致)；及輕鏈，該輕鏈包含CDR之L1、L2及L3且包含具有SEQ ID NO: 334或341中提供之序列之多肽或任何上述者之變異體，其中CDR分別與SEQ ID NO: 239、240及241至少75%一致(例如100%一致)(如美國專利公開案第20070110747號中所述)。涵蓋重鏈及輕鏈序列之所有組合(例如包含SEQ ID NO: 335之重鏈及包含SEQ ID NO: 334之輕鏈；包含SEQ ID NO: 331之重鏈及包含SEQ ID NO: 334之輕鏈；及包含SEQ ID NO: 345或396之重鏈及包含SEQ ID NO: 341之輕鏈)。 或者，抗硬化蛋白抗體具有包含具有SEQ ID NO: 137中提供之序列之多肽的重鏈、及包含具有SEQ ID NO: 133中提供之序列之多肽的輕鏈；包含具有SEQ ID NO: 145或392中提供之序列之多肽的重鏈、及包含具有SEQ ID NO: 141中提供之序列之多肽的輕鏈；包含具有SEQ ID NO: 335中提供之序列之多肽的重鏈、及包含具有SEQ ID NO: 334中提供之序列之多肽的輕鏈；包含具有SEQ ID NO: 331中提供之序列之多肽的重鏈、及包含具有SEQ ID NO: 341中提供之序列之多肽的輕鏈；或包含具有SEQ ID NO: 345或396中提供之序列之多肽的重鏈、及包含具有SEQ ID NO: 341中提供之序列之多肽的輕鏈(如美國專利公開案第2007/0110747號中所述)。或者，抗硬化蛋白抗體交叉阻斷針對硬化蛋白之任何以上提及之抗體(或由針對硬化蛋白之任何以上提及之抗體交叉阻斷)。 在一些實施例中，抗硬化蛋白抗體包含含有選自由SEQ ID NO: 1038、SEQ ID NO: 1046、SEQ ID NO: 1040及SEQ ID NO: 1048組成之群之胺基酸序列的重鏈；視情況進一步包含選自由SEQ ID NO: 1039、SEQ ID NO: 1047、SEQ ID NO: 1041及SEQ ID NO: 1049組成之群之輕鏈胺基酸序列。 抗硬化蛋白抗體之實例亦包括但不限於國際專利公開案第WO 2008/092894號、第WO 2008/115732號、第WO 2009/056634號、第WO 2009/047356號、第WO 2010/100200號、第WO 2010/100179號、第WO 2010/115932號及第WO 2010/130830號(其各自以全文引用的方式併入本文中)中揭露之抗硬化蛋白抗體，諸如國際專利公開案第WO 2008/115732號之包含CDR SEQ ID NO: 20-25(在本文中為SEQ ID NO: 416-421)之抗硬化蛋白抗體、國際專利公開案第WO 2008/115732號之包含CDR SEQ ID NO: 26-31(在本文中為SEQ ID NO: 422-427)之抗硬化蛋白抗體、國際專利公開案第WO 2008/115732號之包含CDR SEQ ID NO: 32-37(在本文中為SEQ ID NO: 428-433)之抗硬化蛋白抗體、國際專利公開案第WO 2009/047356號之包含CDR SEQ ID NO: 4、15、26、37、48及59(在本文中分別為SEQ ID NO: 443、454、465、476、487及498)之抗硬化蛋白抗體、或國際專利公開案第WO 2010/130830號之包含胺基酸序列SEQ ID NO: 135-143、153-161或171-179(在本文中分別為SEQ ID NO: 745-753、763-771、781-789)之至少一者的抗硬化蛋白抗體。抗 DKK1 抗體 在一些實施例中，本文所述之異二聚抗體包含含有抗DKK1抗體之DKK1結合部分。「抗DKK1抗體」結合DKK1或其部分以阻斷或損害人類DKK1結合一或多種配體。人類DKK1聚核苷酸及胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO: 810及811中。小鼠及大鼠DKK1之聚核苷酸及胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 812及813(小鼠)及SEQ ID NO: 814及815(大鼠)中。適用於本發明之情形下之抗DKK1抗體的實例描述於國際公開案第WO 2012/118903號中，該公開案之揭露內容以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，抗DKK1抗體交叉阻斷以下至少一者結合DKK1或與以下至少一者競爭結合DKK1：抗體11H10Hu、11H10Rat、2.4.1、2.20.1、2.37.1、2.40.1、2.41.1、2.47.1、5.17.1、5.23.1、5.25.1、5.31.1、5.32.1、5.40.1、5.65.1、5.76.1、5.77.1、5.78.1、5.80.1、5.85.1、6.37.5、6.116.6、6.139.5及6.147.4(其全部描述於國際公開案第WO 2012/118903號中)。或者或此外，抗DKK1抗體由以下至少一者交叉阻斷結合DKK1：抗體11H10Hu、11H10Rat、2.4.1、2.20.1、2.37.1、2.40.1、2.41.1、2.47.1、5.17.1、5.23.1、5.25.1、5.31.1、5.32.1、5.40.1、5.65.1、5.76.1、5.77.1、5.78.1、5.80.1、5.85.1、6.37.5、6.116.6、6.139.5及6.147.4。術語「交叉阻斷(cross-block/cross-blocked/cross-blocking)」在本文中可互換使用以意謂抗體干擾其他抗體結合DKK1之能力。抗體能夠干擾另一抗體結合DKK1之程度且因此是否可稱其交叉阻斷可使用競爭結合分析來確定。在一些態樣中，交叉阻斷抗體或其片段使參考抗體之DKK1結合降低在約40%與約100%，諸如約60%與約100%之間、或在70%與100%之間、或在80%與100%之間。偵測交叉阻斷之一特別適合定量分析使用利用表面電漿子共振技術量測相互作用程度之Biacore機器。另一適合定量交叉阻斷分析使用ELISA基方法來量測抗體之間就其結合DKK1而言之競爭。 在一些實施例中，抗DKK1抗體交叉阻斷包含全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白結合具有SEQ ID NO: 811之DKK1及/或由包含全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白交叉阻斷結合具有SEQ ID NO: 811之DKK1，其中包含全長重鏈及輕鏈之該免疫球蛋白包含本文揭露之CDR序列，諸如以下三組CDR序列之一：SEQ ID NO: 820-822、828-830、836-838、844-846、852-854、860-862、868-869、876-878、884-886、892-894、900-902、908-910、916-918、925-927、932-934、940-942、948-950、956-958、964-966、972-974、980-982、988-990、996-998、1004-1006、823-825、831-833、839-841、847-849、855-857、863-865、871-873、879-881、887-889、897-897、903-905、911-913、919-921、927-929、935-937、943-945、951-953、959-961、967-969、975-977、983-985、991-993、999-1001及1007-1009。 適合抗DKK1抗體及其片段之實例包括具有以下一或多者之抗體及抗體片段：本文明確揭露且國際公開案第WO 2012/118903號中揭露之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該公開案以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之區域之至少一者可具有至少一個胺基酸取代，其限制條件為抗體保留非經取代之CDR之結合特異性。示範性抗DKK1抗體包括但不限於抗體11H10Hu、11H10Rat、2.4.1、2.20.1、2.37.1、2.40.1、2.41.1、2.47.1、5.17.1、5.23.1、5.25.1、5.31.1、5.32.1、5.40.1、5.65.1、5.76.1、5.77.1、5.78.1、5.80.1、5.85.1、6.37.5、6.116.6、6.139.5及6.147.4(其全部描述於國際公開案第WO 2012/118903號中)。 在一些實施例中，抗DKK1抗體包含至少一個與選自由以下組成之群之CDR具有至少75%一致性(例如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少100%一致性)的CDR：820-822(Ab 11H10Hu之CDRL1-L3)、828-830(Ab 11H10Rat之CDRL1-CDRL3)、836-838(Ab 2.4.1之CDRL1-CDRL3)、844-846(Ab 2.20.1之CDRL1-CDRL3)、852-854(Ab 2.37.1之CDRL1-CDRL3)、860-862(Ab 2.40.1之CDRL1-CDRL3)、868-869(Ab 2.41.1之CDRL1-CDRL3)、876-878(Ab2.47.1之CDRL1-CDRL3)、884-886(Ab 5.17.1之CDRL1-CDRL3)、892-894(Ab 5.23.1之CDRL1-CDRL3)、900-902(Ab 5.25.1之CDRL1-CDRL3)、908-910(Ab5.31.1之CDRL1-CDRL3)、916-918(Ab 5.32.1之CDRL1-CDRL3)、925-927(Ab 5.40.1之CDRL1-CDRL3)、932-934(Ab 5.65.1之CDRL1-CDRL3)、940-942(Ab 5.76.1之CDRL1-CDRL3)、948-950(Ab5.77.1之CDRL1-CDRL3)、956-958(Ab 5.78.1之CDRL1-CDRL3)、964-966(Ab 5.80.1之CDRL1-CDRL3)、972-974(Ab 5.85.1之CDRL1-CDRL3)、980-982(Ab 6.37.5之CDRL1-CDRL3)、988-990(Ab 6.116.6之CDRL1-CDRL3)、996-998(Ab 6.139.5之CDRL1-CDRL3)、1004-1006(Ab 6.147.4之CDRL1-CDRL3)、823-825(Ab 11H10Hu之CDRH1-CDRH3)、831-833(Ab 11H10Rat之CDRH1-CDRH3)、839-841(Ab 2.4.1之CDRH1-CDRH3)、847-849 (Ab 2.20.1之CDRH1-CDRH3)、855-857(Ab 2.37.1之CDRH1-CDRH3)、863-865(Ab 2.40.1之CDRH1-CDRH3)、871-873(Ab 2.41.1之CDRH1-CDRH3)、879-881(Ab 2.47.1之CDRH1-CDRH3)、887-889 (Ab 5.17.1之CDRH1-CDRH3)、895-897(Ab 5.23.1之CDRH1-CDRH3)、903-905(Ab 5.25.1之CDRH1-CDRH3)、911-913(Ab 531.1之CDRH1-CDRH3)、919-921(Ab 5.32.1之CDRH1-CDRH3)、927-929(Ab 5.40.1之CDRH1-CDRH3)、935-937(Ab 5.65.1之CDRH1-CDRH3)、943-945 (Ab 5.76.1之CDRH1-CDRH3)、951-953(Ab 5.77.1之CDRH1-CDRH3)、959-961(Ab 5.78.1之CDRH1-CDRH3)、967-969(Ab 5.80.1之CDRH1-CDRH3)、975-977(Ab5.85.1之CDRH1-CDRH3)、983-985(Ab 6.37.5之CDRH1-CDRH3)、991-993(Ab 6.116.6之CDRH1-CDRH3)、999-1001(Ab 6.139.5之CDRH1-CDRH3)及1007-1009(Ab 6.147.4之CDRH1-CDRH3)。 在一些實施例中，抗DKK1抗體包含與選自由以下組成之群之抗DKK1重鏈可變域胺基酸序列具有至少75%一致性(例如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少100%一致性)的重鏈可變域胺基酸序列：SEQ ID NO: 819、827、835、843、851、859、867、875、883、891、899、907、915、923、931、939、947、955、963、971、979、987、995及1003。在一些實施例中，抗DKK1抗體包含與選自由以下組成之群之抗DKK1輕鏈可變域胺基酸序列具有至少75%一致性(例如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少100%一致性)的輕鏈可變域胺基酸序列：SEQ ID NO: 818、826、834、842、850、866、874、882、890、898、906、814、822、830、938、946、954、962、970、978、988、994及1002。 在一些實施例中，異二聚抗體之DKK1結合組分包含於各SEQ ID NO:中闡述之以下CDR之一者、兩者、三者、四者、五者或六者：820-822(Ab 11H10Hu之CDRL1-L3)、828-830(Ab 11H10Rat之CDRL1-CDRL3)、836-838(Ab 2.4.1之CDRL1-CDRL3)、844-846(Ab 2.20.1之CDRL1-CDRL3)、852-854(Ab 2.37.1之CDRL1-CDRL3)、860-862(Ab 2.40.1之CDRL1-CDRL3)、868-869(Ab 2.41.1之CDRL1-CDRL3)、876-878(Ab2.47.1之CDRL1-CDRL3)、884-886(Ab 5.17.1之CDRL1-CDRL3)、892-894(Ab 5.23.1之CDRL1-CDRL3)、900-902(Ab 5.25.1之CDRL1-CDRL3)、908-910(Ab5.31.1之CDRL1-CDRL3)、916-918(Ab 5.32.1之CDRL1-CDRL3)、925-927(Ab 5.40.1之CDRL1-CDRL3)、932-934(Ab 5.65.1之CDRL1-CDRL3)、940-942(Ab 5.76.1之CDRL1-CDRL3)、948-950(Ab5.77.1之CDRL1-CDRL3)、956-958(Ab 5.78.1之CDRL1-CDRL3)、964-966(Ab 5.80.1之CDRL1-CDRL3)、972-974(Ab 5.85.1之CDRL1-CDRL3)、980-982(Ab 6.37.5之CDRL1-CDRL3)、988-990(Ab 6.116.6之CDRL1-CDRL3)、996-998(Ab 6.139.5之CDRL1-CDRL3)、1004-1006(Ab 6.147.4之CDRL1-CDRL3)、823-825(Ab 11H10Hu之CDRH1-CDRH3)、831-833(Ab 11H10Rat之CDRH1-CDRH3)、839-841(Ab 2.4.1之CDRH1-CDRH3)、847-849 (Ab 2.20.1之CDRH1-CDRH3)、855-857(Ab 2.37.1之CDRH1-CDRH3)、863-865(Ab 2.40.1之CDRH1-CDRH3)、871-873(Ab 2.41.1之CDRH1-CDRH3)、879-881(Ab 2.47.1之CDRH1-CDRH3)、887-889 (Ab 5.17.1之CDRH1-CDRH3)、895-897(Ab 5.23.1之CDRH1-CDRH3)、903-905(Ab 5.25.1之CDRH1-CDRH3)、911-913(Ab 531.1之CDRH1-CDRH3)、919-921(Ab 5.32.1之CDRH1-CDRH3)、927-929(Ab 5.40.1之CDRH1-CDRH3)、935-937(Ab 5.65.1之CDRH1-CDRH3)、943-945 (Ab 5.76.1之CDRH1-CDRH3)、951-953(Ab 5.77.1之CDRH1-CDRH3)、959-961(Ab 5.78.1之CDRH1-CDRH3)、967-969(Ab 5.80.1之CDRH1-CDRH3)、975-977(Ab5.85.1之CDRH1-CDRH3)、983-985(Ab 6.37.5之CDRH1-CDRH3)、991-993(Ab 6.116.6之CDRH1-CDRH3)、999-1001(Ab 6.139.5之CDRH1-CDRH3)及1007-1009(Ab 6.147.4之CDRH1-CDRH3)。意欲異二聚抗體可包括來自單一抗體之兩個或兩個以上CDR、或來自本文所述之DKK1抗體之任何組合的兩個或兩個以上CDR。一些DKK1結合組分包括輕鏈CDR3與重鏈CDR3兩者。某些DKK1結合組分具有SEQ ID NO: 820-822、828-830、836-838、844-846、852-854、860-862、868-869、876-878、884-886、892-894、900-902、908-910、916-918、925-927、932-934、940-942、948-950、956-958、964-966、972-974、980-982、988-990、996-998、1004-1006、823-825、831-833、839-841、847-849、855-857、863-865、871-873、879-881、887-889、897-897、903-905、911-913、919-921、927-929、935-937、943-945、951-953、959-961、967-969、975-977、983-985、991-993、999-1001及1007-1009中闡述之CDR之變異形式，其中一或多個(亦即2、3、4、5或6個)CDR各自與SEQ ID NO: 820-822、828-830、836-838、844-846、852-854、860-862、868-869、876-878、884-886、892-894、900-902、908-910、916-918、925-927、932-934、940-942、948-950、956-958、964-966、972-974、980-982、988-990、996-998、1004-1006、823-825、831-833、839-841、847-849、855-857、863-865、871-873、879-881、887-889、897-897、903-905、911-913、919-921、927-929、935-937、943-945、951-953、959-961、967-969、975-977、983-985、991-993、999-1001及1007-1009中闡述之CDR序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性。舉例而言，異二聚抗體之DKK1結合組分可包括輕鏈CDR3與重鏈CDR3兩者，其各自與選自由SEQ ID NO: 822、830、838、846、854、862、870、878、886、894、902、910、918、926、934、942、950、958、966、974、982、990、998及1006組成之群之輕鏈CDR3序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性；且與選自由SEQ ID NO: 825、833、841、849、857、865、873、881、889、897、905、913、921、929、937、945、953、961、969、977、985、993、1001及1009組成之群之重鏈CDR3序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性。 提供之一些DKK1結合組分之CDR序列亦可不同於SEQ ID NO: 820-822、828-830、836-838、844-846、852-854、860-862、868-869、876-878、884-886、892-894、900-902、908-910、916-918、925-927、932-934、940-942、948-950、956-958、964-966、972-974、980-982、988-990、996-998、1004-1006、823-825、831-833、839-841、847-849、855-857、863-865、871-873、879-881、887-889、897-897、903-905、911-913、919-921、927-929、935-937、943-945、951-953、959-961、967-969、975-977、983-985、991-993、999-1001及1007-1009中闡述之CDR序列以使任何既定CDR之胺基酸序列有至多1、2、3、4或5個胺基酸殘基不同。與所列序列之差異通常為但不限於保守性取代。 在一些實施例中，抗DKK1抗體包含含有選自由SEQ ID NO: 1034、SEQ ID NO: 1042、SEQ ID NO: 1036及SEQ ID NO: 1044組成之群之胺基酸序列的重鏈；視情況進一步包含選自由SEQ ID NO: 1035、SEQ ID NO: 1043、SEQ ID NO: 1037及SEQ ID NO: 1045組成之群之輕鏈胺基酸序列。 在其他實施例中，異二聚分子之結合DKK1之部分係選自美國專利第7,709,611號、美國專利公開案第2008/0193449號、美國專利第7,642,238號、美國專利第7,700,101號及WO 2007/084344中揭露之彼等DKK1結合分子，該等專利之揭露內容皆以全文引用的方式併入本文中。編碼工程改造重鏈或輕鏈之聚核苷酸 本發明內涵蓋編碼本文所述之重鏈及/或輕鏈恆定域及/或可變域之核酸。本發明之核酸分子包括呈單股形式與雙股形式兩者之DNA及RNA以及相應互補序列。DNA包括例如cDNA、基因組DNA、化學合成DNA、藉由PCR擴增之DNA及其組合。本發明之核酸分子包括全長基因或cDNA分子以及其片段之組合。本發明之核酸優先源於人類來源，但本發明亦包括源於非人類物種者。 在自天然存在之來源分離核酸之情況下，「經分離核酸」為已與自其分離核酸之生物體之基因組中存在之鄰近遺傳序列分離的核酸。在自模板酶促合成或化學合成核酸(諸如PCR產物、cDNA分子或例如寡核苷酸)之情況下，應瞭解由此等方法產生之核酸為經分離核酸。經分離核酸分子係指呈各別片段形式或呈較大核酸構築體之組分形式之核酸分子。在一個較佳實施例中，核酸實質上不含污染性內源物質。核酸分子已較佳源於至少分離一次之呈實質上純淨形式且量或濃度使得能夠藉由標準生物化學方法(諸如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)中所概述者)鑒別、操作及回收其組成核苷酸序列之DNA或RNA。較佳以不由通常存在於真核基因中之內部非轉譯序列或內含子中斷之開放閱讀框形式提供及/或構築此等序列。非轉譯DNA之序列可存在於開放閱讀框之5'或3'，在5'或3'處，該等序列不干擾編碼區之操作或表現。 本發明亦包括在中等嚴格條件且更佳高度嚴格條件下雜交於編碼如本文所述之多肽之核酸的核酸。影響雜交條件之選擇之基本參數及對設計適合條件之指導由Sambrook、Fritsch及Maniatis(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 第9及11章；及Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel等人編, John Wiley & Sons公司, 第2.10及6.3-6.4章節)所闡述，且可易於由一般技藝人士基於例如DNA之長度及/或鹼基組成加以確定。一種達成中等嚴格條件之方法涉及使用含有5×SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)之預洗滌溶液；具有約50%甲醯胺、6×SSC之雜交緩衝液；及雜交溫度約55℃(或其他類似雜交溶液，諸如含有約50%甲醯胺之雜交溶液，其中雜交溫度為約42℃)，以及於0.5×SSC、0.1% SDS中進行約60℃之洗滌條件。通常，高度嚴格條件定義為如上雜交條件，但在約68℃下於0.2×SSC、0.1% SDS中進行洗滌。在雜交及洗滌緩衝液中，SSPE(1×SSPE為0.15 M NaCl、10 mM NaH₂ PO₄ 及1.25 mM EDTA，pH 7.4)可被替換成SSC(1×SSC為0.15 M NaCl及15 mM檸檬酸鈉)；在雜交完成之後進行洗滌15分鐘。應瞭解必要時可藉由應用如熟習此項技術者已知且以下進一步所述之支配雜交反應及雙鏈體穩定性之基本原則調整洗滌溫度及洗滌鹽濃度以達成所要嚴格程度(參見例如Sambrook等人, 1989)。當使核酸雜交於序列未知之目標核酸時，雜交物長度假定為雜交核酸之長度。當雜交序列已知之核酸時，雜交物長度可藉由比對核酸序列及鑒別具有最佳序列互補性之一或多個區域來確定。預期長度小於50個鹼基對之雜交物之雜交溫度應比雜交物之熔融溫度(Tm)小5至10℃，其中Tm係根據以下等式確定。對於長度小於18個鹼基對之雜交物，Tm(℃)=2(A+T鹼基數)+4(G+C鹼基數)。對於長度大於18個鹼基對之雜交物，Tm(℃)=81.5+16.6(log10 [Na+])+0.41(G+C%)-(600/N)，其中N為雜交物中之鹼基數，且([Na+]為雜交緩衝液中之鈉離子濃度(1×SSC之[Na+]=0.165 M)。較佳地，各此雜交核酸之長度為至少15個核苷酸(或更佳至少18個核苷酸、或至少20個核苷酸、或至少25個核苷酸、或至少30個核苷酸、或至少40個核苷酸、或最佳至少50個核苷酸)，或為其與之雜交之本發明核酸的長度之至少25%(更佳至少50%、或至少60%、或至少70%，且最佳至少80%)，且與其與之雜交之本發明核酸的序列一致性為至少60%(更佳至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，且最佳至少99.5%)，其中序列一致性係藉由在對準以使重疊及一致性最大，同時使如上更詳細所述之序列間隙最小時比較雜交核酸之序列來確定。 變異體通常藉由以下方式來製備：使用卡匣或PCR突變誘發或此項技術中熟知之DNA其他技術，使編碼多肽之DNA中之核苷酸經受位點特異性突變誘發以產生編碼變異體之DNA，及此後在如本文概述之細胞培養物中表現重組DNA。然而，可藉由使用確定技術進行活體外合成來製備包含變異CDR之具有多達約100-150個殘基之抗體或抗體片段。變異體通常展現與天然存在之類似物相同之定性生物活性，例如結合抗原，但亦可選擇具有改進特徵之變異體，如本文中將更充分概述。 如此項技術者將瞭解，歸因於遺傳密碼之簡併性，可製備極大數目之皆編碼本發明之CDR(及本文所述之異二聚抗體之重鏈及輕鏈或其他組分)的核酸。因此，在已鑒別特定胺基酸序列時，熟習此項技術者可藉由以不改變編碼蛋白質之胺基酸序列之方式，僅修改一或多個密碼子之序列來製備許多不同核酸。 本發明亦提供呈質體、表現載體、轉錄或表現卡匣形式之包含至少一種如上聚核苷酸之表現系統及構築體。此外，本發明提供包含此等表現系統或構築體之宿主細胞。 通常，用於宿主細胞中之表現載體將含有用於質體維持及外源性核苷酸序列之選殖及表現之序列。在某些實施例中總稱為「側接序列」之此等序列將通常包括以下核苷酸序列之一或多者：啟動子、一或多種增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及接受體拼接位點之完全內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列之序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入欲表現之編碼多肽之核酸的多連接子區域、及可選擇標記物元件。以下論述此等序列之各者。 視情況，載體可含有「標籤」編碼序列，亦即位於多肽編碼序列之5'或3'末端之寡核苷酸分子；寡核苷酸序列編碼多聚His(諸如六His)或市售抗體存在之另一「標籤」，諸如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒(hemaglutinin influenza virus))或myc。此標籤通常在多肽表現後融合於多肽，且可充當一種自宿主細胞親和純化或偵測多肽之手段。親和純化可例如藉由使用針對標籤之抗體作為親和基質進行管柱層析來達成。視情況，可隨後藉由各種手段，諸如使用用於裂解之某些肽酶自純化多肽移除標籤。 側接序列可為同源的(亦即來自與宿主細胞相同之物種及/或品系)、異源的(亦即來自除宿主細胞物種或品系以外之物種)、雜交的(亦即來自一種以上來源之側接序列之組合)、合成的或天然的。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體、或任何植物，其限制條件為側接序列在宿主細胞機構中具有功能性且可藉由宿主細胞機構活化。 適用於本發明之載體中之側接序列可藉由此項技術中熟知之若干方法之任一者獲得。通常，適用於本文中之側接序列將已先前藉由圖譜分析及/或藉由限制核酸內切酶消化鑒別且因此可使用適當限制核酸內切酶自適當組織來源分離 在一些情況下，側接序列之完整核苷酸序列可為已知的。在本文中，可使用本文對於核酸合成或選殖所述之方法合成側接序列。 無論已知全部或僅一部分側接序列，其可使用聚合酶鏈反應(PCR)及/或藉由用適合探針，諸如來自相同或另一物種之寡核苷酸及/或側接序列片段篩檢基因組文庫來獲得。當側接序列未知時，含有側接序列之DNA片段可自一段可含有例如編碼序列或甚至另外一或多種基因之較大DNA分離。分離可藉由以下方式達成：限制核酸內切酶消化以產生適當DNA片段，隨後使用瓊脂糖凝膠純化Qiagen®管柱層析(Chatsworth, CA)或熟練技術人員已知之其他方法進行分離。對用以達成此目的之適合酶之選擇將易於為一般技藝人士所顯而易知。 複製起點通常為彼等商購原核表現載體之一部分，且起點有助於在宿主細胞中擴增載體。若所選載體不含有複製起點位點，則可基於已知序列化學合成複製起點位點，且連接至載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs, Beverly, MA)之複製起點適於大多數革蘭氏陰性細菌，且各種病毒起點(例如SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或諸如HPV或BPV之乳頭狀瘤病毒)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。通常，複製起點組分不為哺乳動物表現載體所需(例如僅因為SV40起點亦含有病毒早期啟動子而常加以使用)。 轉錄終止序列通常位於多肽編碼區之末端之3'且用於終止轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列為G-C富集片段，繼之以多聚T序列。儘管序列易於自文庫選殖或甚至作為載體之一部分商購，但其亦可易於使用用於核酸合成之方法(諸如本文所述者)合成。 可選擇標記基因編碼為在選擇性培養基中生長之宿主細胞之存活及生長所必需的蛋白質。典型選擇標記基因編碼(a)賦予原核宿主細胞對抗生素或其他毒素，例如胺苄青黴素(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin)之抗性；(b)彌補細胞之營養缺陷不足；或(c)供應不可自複合或成分確定培養基獲得之關鍵養分之蛋白質。特定可選擇標記物為康黴素抗性基因、胺苄青黴素抗性基因及四環素抗性基因。有利的是新黴素(neomycin)抗性基因亦可用於在原核宿主細胞與真核宿主細胞兩者中進行選擇。 其他可選擇基因可用於擴增將表現之基因。擴增為產生對生長或細胞存活關鍵之蛋白質所需之基因在連續多代重組細胞之染色體內串聯重複的過程。適於哺乳動物細胞之可選擇標記物之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉型體置於選擇壓力下，其中僅轉型體藉助於載體中存在之可選擇基因而唯一適應於存活。選擇壓力係藉由在以下條件下培養經轉型細胞來施加：連續增加培養基中之選擇劑之濃度，藉此導致擴增可選擇基因與編碼另一基因(諸如抗體輕鏈或重鏈)之DNA兩者。因此，自擴增之DNA合成增加量之多肽。 核糖體結合位點通常為rnRNA之轉譯啟始所必需且特徵在於具有Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該元件通常位於啟動子之3'及欲表現之多肽之編碼序列的5'。在某些實施例中，一或多個編碼區可可操作地連接於內部核糖體結合位點(IRES)，從而允許自單一RNA轉錄物轉譯兩個開放閱讀框。 在一些情況下，諸如當在真核宿主細胞表現系統中需要糖基化時，可操作各種前序列或原序列以改良糖基化或產率。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點，或添加原序列，此亦可影響糖基化。最終蛋白質產物可在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一個胺基酸)具有一或多個與表現相伴之可能尚未完全移除之額外胺基酸。舉例而言，最終蛋白質產物可具有一或兩個見於肽酶裂解位點中之連接於胺基末端之胺基酸殘基。或者，若酶在成熟多肽內之此區域處切割，則使用一些酶裂解位點可產生所要多肽之略微截短形式。 本發明之表現及選殖載體將通常含有由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼多肽之分子之啟動子。啟動子為位於結構基因(通常在約100至1000 bp內)之起始密碼子上游(亦即5')之未轉錄序列，其控制結構基因之轉錄。啟動子依照慣例分組至以下兩個類別之一：誘導性啟動子及組成性啟動子。誘導性啟動子可反應於培養條件之某一變化(諸如存在或不存在某一養分或溫度變化)來引發在其控制下自DNA之轉錄程度增加。另一方面，組成性啟動子均一轉錄其所可操作地連接之基因，亦即少許控制或不控制基因表現。許多由多種潛在宿主細胞識別之啟動子為熟知的。藉由限制酶消化自來源DNA移除啟動子及將所要啟動子序列插入載體中來使適合啟動子可操作地連接於編碼例如重鏈或輕鏈的DNA。 適合與酵母宿主一起使用之啟動子亦在此項技術中為熟知的。酵母增強子有利地與酵母啟動子一起使用。適合與哺乳動物宿主細胞一起使用之啟動子為熟知的且包括但不限於自病毒之基因組獲得者，該等病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒及最佳猿猴病毒40(SV40)。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白(actin)啟動子。 可為相關之其他啟動子包括但不限於：SV40早期啟動子(Benoist及Chambon, 1981, Nature 290:304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人, 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663)；勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中含有之啟動子(Yamamoto等人, 1980, Cell 22:787-797)；皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445)；金屬硫蛋白(metallothionine)基因之啟動子及調控序列(Prinster等人, 1982, Nature 296:39-42)；及原核啟動子，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)。亦相關的是展現組織特異性且已用於轉殖基因動物中之以下動物轉錄控制區：在胰腺腺泡細胞中具有活性之彈性蛋白酶(elastase)I基因控制區(Swift等人, 1984, Cell 38:639-646；Ornitz等人, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)；在胰腺β細胞中具有活性之胰島素基因控制區(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)；在淋巴樣細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人, 1984, Cell 38:647-658；Adames等人, 1985, Nature 318:533-538；Alexander等人, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴樣及肥大細胞中具有活性之小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(Leder等人, 1986, Cell 45:485-495)；在肝中具有活性之白蛋白(albumin)基因控制區(Pinkert等人, 1987, Genes and Devel. 1 :268-276)；在肝中具有活性之α-胎蛋白(alpha-feto-protein)基因控制區(Krumlauf等人, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；Hammer等人, 1987, Science 253:53-58)；在肝中具有活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人, 1987, Genes and Devel. 1:161-171)；在骨髓細胞中具有活性之β-球蛋白基因控制區(Mogram等人, 1985, Nature 315:338-340；Kollias等人, 1986, Cell 46:89-94)；在腦中之寡樹突細胞中具有活性之髓磷脂(myelin)鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人, 1987, Cell 48:703-712)；在骨骼肌中具有活性之肌球蛋白(myosin)輕鏈-2基因控制區(Sani, 1985, Nature 314:283-286)；及在下視丘中具有活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人, 1986, Science 234:1372-1378)。 增強子序列可插入載體中以增加由高等真核生物轉錄編碼本發明之輕鏈或重鏈的DNA。增強子為DNA之順式作用元件，長度通常約10-300 bp，其作用於啟動子以增加轉錄。增強子具有相對定向及位置非依賴性，其已見於轉錄單元之5'位置與3'位置兩者處。可自哺乳動物基因獲得之若干增強子序列為已知的(例如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自病毒之增強子。此項技術中已知之SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子及腺病毒增強子為用於活化真核啟動子之示範性增強元件。儘管增強子可在載體中位於編碼序列之5'或3'，但其通常位於啟動子之5'位點處。編碼適當天然或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列可併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。對信號肽或前導物之選擇取決於欲在其中產生抗體之宿主細胞之類型，且異源信號序列可替換天然信號序列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能性之信號肽之實例包括以下：美國專利第4,965,195號中所述之介白素(interleukin)-7(IL-7)之信號序列；Cosman等人,1984, Nature 312:768中所述之介白素-2受體之信號序列；EP專利第0367 566號中所述之介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中所述之I型介白素-1受體信號肽；EP專利第0 460 846號中所述之II型介白素-1受體信號肽。 載體可含有一或多種當使載體整合入宿主細胞基因組中時有助於表現之元件。實例包括EASE元件(Aldrich等人 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38)及基質連接區(MAR)。MAR介導染色質之結構組構且可使整合載體與「位置」效應隔離。因此，當載體用於產生穩定轉染子時，MAR特別適用。許多天然及合成含MAR核酸在此項技術中為已知的，例如美國專利第6,239,328號；第7,326,567號；第6,177,612號；第6,388,066號；第6,245,974號；第7,259,010號；第6,037,525號；第7,422,874號；第7,129,062號。 本發明之表現載體可自諸如市售載體之起始載體構築。此等載體可或可不含有全部所要側接序列。當本文所述之一或多種側接序列未已存在於載體中時，其可個別地加以獲得且連接至載體中。用於獲得各側接序列之方法為熟習此項技術者所熟知。 在已構築載體且編碼輕鏈、重鏈、或輕鏈及重鏈序列之核酸分子已插入載體之適當位點中之後，所完成之載體可插入適合宿主細胞中以達成擴增及/或多肽表現。將表現載體轉型至所選宿主細胞中可藉由熟知方法來達成，該等方法包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、DEAE-葡聚糖介導之轉染或其他已知技術。所選方法將部分地隨欲使用之宿主細胞之類型而變。此等方法及其他適合方法為熟練技術人員所熟知，且例如闡述於Sambrook等人, 2001(上文)中。 當在適當條件下培養時，宿主細胞合成異二聚抗體，其可隨後自培養基收集(若宿主細胞將其分泌至培養基中)或直接自產生其之宿主細胞收集(若其未經分泌)。對適當宿主細胞之選擇將取決於各種因素，諸如所要表現量、合乎活性需要或為活性所必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及折疊成生物活性分子之容易性。宿主細胞可為真核或原核細胞。 可用作表現宿主之哺乳動物細胞株在此項技術中為熟知的且包括但不限於可自美國菌種中心(ATCC)獲得之永生化細胞株且用於此項技術中已知之表現系統中之任何細胞株皆可用於製備本發明之重組多肽。一般而言，用包含編碼所要異二聚抗體之DNA之重組表現載體轉型宿主細胞。可採用之宿主細胞尤其為原核生物、酵母或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。高等真核細胞包括昆蟲細胞及哺乳動物來源之確定細胞株。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括猴腎細胞之COS-7株系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等人, 1981, Cell 23:175)、L細胞、293細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物(諸如Veggie CHO及在無血清培養基中生長之相關細胞株(Rasmussen等人, 1998, Cytotechnology 28: 31))、HeLa細胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞株、及如藉由McMahan等人, 1991, EMBO J. 10: 2821所述之源於非洲綠猴腎細胞株CVI之CVI/EBNA細胞株(ATCC CCL 70)、人類胚腎細胞(諸如293、293 EBNA或MSR 293)、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、其他經轉型靈長類動物細胞株、正常二倍體細胞、源於活體外培養原生組織、原生外植體之細胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。視情況，當需要在各種信號轉導或報導體分析中使用多肽時，例如哺乳動物細胞株(諸如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49)可用於表現多肽。或者，有可能在諸如酵母之低等真核生物中或在諸如細菌之原核生物中產生多肽。適合酵母包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母菌株(Kluyveromyces strain)、念珠菌屬(Candida)或能夠表現異源多肽之任何酵母菌株。適合細菌菌株包括大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)或能夠表現異源多肽之任何細菌菌株。 若在酵母或細菌中製備抗體或片段，則可合乎需要的是例如藉由使適當位點磷酸化或糖基化來修飾其中產生之產物以獲得功能性產物。此等共價連接可使用已知化學或酶促方法達成。亦可藉由使本發明之經分離核酸可操作地連接於一或多種昆蟲表現載體中之適合控制序列及採用昆蟲表現系統來產生多肽。用於桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統之材料及方法可以套組形式自例如Invitrogen, San Diego, Calif., U.S.A.(MaxBac®套組)購得，且此等方法在此項技術中為熟知的，如Summers及Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin 第1555期 (1987)、以及Luckow及Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)中所述。無細胞轉譯系統亦可用於使用源於本文揭露之核酸構築體之RNA產生多肽，諸如抗體或片段。供與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之適當選殖及表現載體由Pouwels等人(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)加以描述。包含較佳可操作地連接於至少一種表現控制序列之本發明之經分離核酸的宿主細胞為「重組宿主細胞」。 在某些實施例中，可經由確定哪些細胞株具有高表現量且組成性產生具有所要結合性質之抗原結合蛋白來選擇細胞株。在另一實施例中，可選擇來自B細胞譜系之不產生其自身抗體，但能夠製備且分泌異源抗體之細胞株。治療方法 本文所述之異二聚抗體分子適用於治療或預防骨相關病症，諸如與骨母細胞或破骨細胞活性異常相關之骨相關病症。在一些實施例中，向罹患選自由以下組成之群之骨相關病症的個體投與異二聚抗體：軟骨發育不全、鎖骨顱骨發育不全、軟骨發育不良、纖維性發育不良、高雪氏病(Gaucher's Disease)、低磷酸鹽血性佝僂病、馬方氏症候群(Marfan's syndrome)、多發性遺傳性外生骨疣、神經纖維瘤病、骨發生不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化、硬化性病變、假關節(pseudoarthrosis)、化膿性骨髓炎、牙周病、抗癲癇藥物誘發之骨損失、原發性及繼發性副甲狀腺機能亢進、家族性副甲狀腺機能亢進症候群、失重誘發之骨損失、男性骨質疏鬆、絕經後骨損失、骨關節炎、腎性骨營養不良、滲透性骨病症、口腔骨損失、顎骨壞死、青少年佩吉特氏病(juvenile Paget's disease)、肢骨紋狀肥大(melorheostosis)、代謝性骨病、肥大細胞增多症、鐮狀細胞貧血/疾病、器官移植相關之骨損失、腎移植相關之骨損失、全身性紅斑狼瘡、關節黏連性脊椎炎、癲癇症、青少年關節炎、地中海貧血(thalassemia)、黏多醣貯積症、法布里病(Fabry Disease)、特納症候群(Turner Syndrome)、唐症候群(Down Syndrome)、克蘭費爾特症候群(Klinefelter Syndrome)、麻瘋、佩爾特氏病(Perthe’s Disease)、青少年特發性疹柱側凸、嬰兒發作性多系統發炎性疾病、溫徹斯特症候群(Winchester Syndrome)、蒙克斯病(Menkes Disease)、威爾遜氏病(Wilson's Disease)、缺血性骨病(諸如萊格-卡夫-佩爾特斯病(Legg-Calve-Perthes disease)及區域性遷移性骨質疏鬆)、貧血狀態、由類固醇引起之病狀、糖皮質素誘發之骨損失、肝素誘發之骨損失、骨髓病症、壞血病、營養不良、鈣缺乏症、骨質疏鬆、骨量減少、酒精中毒、慢性肝病、絕經後狀態、慢性發炎性病狀、類風濕性關節炎、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、月經過少、停經、妊娠相關之骨損失、糖尿病、甲狀腺機能亢進、甲狀腺病症、副甲狀腺病症、庫興氏病(Cushing's disease)、肢端肥大症、性腺低能症(hypogonadism)、不動或廢用(immobilization or disuse)、反射性交感神經營養不良症候群、區域性骨質疏鬆、骨軟化、與關節置換相關之骨損失、HIV相關之骨損失、與生長激素損失相關之骨損失、與囊性纖維化相關之骨損失、化學療法相關之骨損失、腫瘤誘發之骨損失、癌症相關之骨損失、激素消除性骨損失、多發性骨髓瘤、藥物誘發之骨損失、神經性厭食、疾病相關之面骨損失、疾病相關之顱骨損失、疾病相關之顎骨損失、疾病相關之頭骨損失、與老化相關之骨損失、與老化相關之面骨損失、與老化相關之顱骨損失、與老化相關之顎骨損失、與老化相關之頭骨損失及與太空旅行相關之骨損失。 在一些實施例中，本文所述之異二聚抗體適用於改良矯形程序、牙科程序、植入手術、關節置換、骨移植、骨整容手術及骨修復(諸如骨折癒合、骨不連接癒合、連接延遲癒合及面部重建)中之結果。包含一或多種異二聚抗體或片段之組合物可在程序、置換、移植、手術或修復之前、期間及/或之後投與。 異二聚抗體無需治癒患有病症之個體或完全防止骨相關病症之發作以達成有益生物反應。異二聚抗體可防治性地加以使用，意謂完全或部分防止骨相關病症或其症狀。異二聚抗體亦可治療性用於完全或部分改善骨相關病症或其症狀，或完全或部分防止骨相關病症或其症狀進一步進展。實際上，本發明之材料及方法特別適用於增加骨礦物質密度且歷經一段時期維持增加之骨礦物質密度。 在一些實施例中，歷經例如以下治療時期來進行本文所述之異二聚抗體之一或多次投與：約1週至約18個月(例如約1個月至約12個月、約1個月至約9個月或約1個月至約6個月或約1個月至約3個月)。在一些實施例中，歷經例如以下治療時期向個體投與一或多劑本文所述之異二聚抗體：約1個月至約12個月(52週)(例如約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月或約11個月)。在一些實施例中，向個體投與一或多劑異二聚抗體以維持骨礦物質密度。如本文所用之術語「維持骨礦物質密度」意謂由初始劑量之異二聚抗體所致之骨礦物質密度增加歷經約6個月、約9個月、約1年、約18個月、約2年之時程或歷經患者一生不降低超過約1%至約5%。應瞭解患者可需要交替治療階段以增加骨密度及維持骨密度。 此外，可為有利的是視選擇用於特定個體之治療方案而定，投與多劑異二聚抗體或分開投與各劑量。在一些實施例中，歷經1年(12個月，52週)或1年以下(例如9個月或9個月以下、6個月或6個月以下、或3個月或3個月以下)之時期定期投與異二聚抗體或其片段。就此而言，每約3天、或約7天、或2週、或3週、或4週、或5週、或6週、或7週、或8週、或9週、或10週、或11週、或12週、或13週、或14週、或15週、或16週、或17週、或18週、或19週、或20週、或21週、或22週、或23週、或6個月、或12個月一次向人類投與異二聚抗體或其片段。 在一些實施例中，以有效治療與骨礦物質密度降低相關之骨病症之量且持續有效治療與骨礦物質密度降低相關之骨病症之時間投與一或多劑異二聚抗體或其片段。在各種實施例中，每週向個體(例如人類個體)投與一或多個包含約50毫克至約1,000毫克異二聚抗體之劑量。舉例而言，一劑異二聚抗體可包含至少約5 mg、15 mg、25 mg、50 mg、約60 mg、約70 mg、約80 mg、約90 mg、約100 mg、約120 mg、約150 mg、約200 mg、約240 mg、約250 mg、約280 mg、約300 mg、約350 mg、約400 mg、約420 mg、約450 mg、約500 mg、約550 mg、約600 mg、約650 mg、約700 mg、約750 mg、約800 mg、約850 mg、約900 mg、約950 mg或多達約1,000 mg異二聚抗體。亦涵蓋介於任何及所有此等終點之間的範圍，例如約50 mg至約80 mg、約70 mg至約140 mg、約70 mg至約270 mg、約75 mg至約100 mg、約100 mg至約150 mg、約140 mg至約210 mg、或約150 mg至約200 mg、或約180 mg至約270 mg、或約280至約410 mg。在任何間隔下投與劑量，諸如一週多次(例如每週兩或三次)、一週一次、每兩週一次、每三週一次或每四週一次。在一些或任何實施例中，一週兩次投與劑量在約120 mg至約210 mg之範圍內之異二聚抗體。在一些或任何實施例中，一週兩次投與約140 mg劑量之異二聚抗體。 在一些實施例中，一或多劑異二聚抗體可包含每公斤體重約0.1至約50毫克(例如約5與約50毫克之間)或約1至約100毫克之間的異二聚抗體(mg/kg)。舉例而言，異二聚抗體之劑量可包含至少約0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、約10 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約26 mg/kg、約27 mg/kg、約28 mg/kg、約29 mg/kg、約30 mg/kg、約31 mg/kg、約32 mg/kg、約33 mg/kg、約34 mg/kg、約35 mg/kg、約36 mg/kg、約37 mg/kg、約38 mg/kg、約39 mg/kg、約40 mg/kg、約41 mg/kg、約42 mg/kg、約43 mg/kg、約44 mg/kg、約45 mg/kg、約46 mg/kg、約47 mg/kg、約48 mg/kg、或約49 mg/kg、或約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約75 mg/kg、約80 mg/kg、約85 mg/kg、約90 mg/kg、約95 mg/kg或多達約100 mg/kg。亦涵蓋介於任何及所有此等終點之間的範圍，例如約1 mg/kg至約3 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約8 mg/kg、約3 mg/kg至約8 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg至約40 mg/kg、約5 mg/kg至約30 mg/kg、或約5 mg/kg至約20 mg/kg。監測療法 可使用單一及雙重能量X射線吸光測定法、超音波、電腦斷層攝影術、放射線攝影術及磁共振成像來量測異二聚抗體介導之骨礦物質含量或骨密度增加。骨物質之量亦可由體重或藉由使用其他方法(參見Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res., 5:177-181 (1984))加以計算。動物模型在此項技術中用於測試醫藥組合物及方法對例如以下模擬人類疾病(諸如骨質疏鬆及骨量減少)狀況之參數之影響：骨損失、骨再吸收、骨形成、骨強度或骨礦化。此類模型之實例包括切除卵巢的大鼠模型(Kalu, Bone and Mineral, 15:175-192 (1991)；Frost及Jee, Bone and Mineral, 18:227-236 (1992)；及Jee及Yao, J. Musculoskel. Neuron. Interact., 1:193-207 (2001))。量測本文所述之異二聚抗體活性之方法亦可用於測定其他硬化蛋白抑制劑之功效。 在人類中，在臨床上可使用例如髖及脊柱之雙重x射線吸光測定法(DXA)來測定骨礦物質密度。其他技術包括定量電腦斷層攝影術(QCT)、超音波檢查術、單一能量x射線吸光測定法(SXA)及放射線攝影吸光測定法。通常用於量測之中心骨骼部位包括脊柱及髖；周邊部位包括前臂、手指、腕及踵。除超音波檢查術以外，美國醫藥協會指示BMD技術通常涉及使用x射線且基於輻射衰減取決於輻射路徑中組織之厚度及組成的原理。所有技術皆涉及使結果與標準資料庫進行比較。 或者，可藉由監測骨標記物含量來計量對一或多種硬化蛋白結合劑之生理反應。骨標記物為骨重塑過程期間產生之產物且由骨、骨母細胞及/或破骨細胞釋放。骨再吸收及/或骨形成「標記物」含量之波動暗示骨重塑/塑造之變化。國際骨質疏鬆基金會(IOF)推薦使用骨標記物來監測骨密度療法 (參見例如Delmas等人, Osteoporos Int., 增刊6:S2-17 (2000)，以引用的方式併入本文中)。指示骨再吸收(或破骨細胞活性)之標記物包括例如C-端肽(例如1型膠原蛋白之C末端端肽(CTX)或血清交聯C-端肽)、N-端肽(1型膠原蛋白之N末端端肽(NTX))、去氧吡啶啉(DPD)、吡啶啉、尿羥脯胺酸、半乳糖羥離胺酸、及酒石酸抗性酸性磷酸酶(例如血清酒石酸抗性酸性磷酸酶同功異型物5b)。骨形成/礦化標記物包括但不限於骨特異性鹼性磷酸酶(BSAP)、自I型原膠原之N末端及C末端延伸部分釋放之肽(P1NP、PICP)、及骨鈣蛋白(osteocalcin，OstCa)。若干套組可商購以偵測且定量諸如尿及血液之臨床樣品中之標記物。組合療法 相對於單獨使用治療相關劑量之各藥劑，藉由組合兩種或兩種以上靶向相同病原體或生物化學路徑或生物過程之藥劑來治療病變有時會使功效更大且副作用減少。在一些情況下，藥物組合之功效為累加性的(組合之功效約等於各單獨藥物之效應之總和)，但在其他情況下，效應為協同性的(組合之功效大於各單獨既定藥物之效應之總和)。如本文所用，術語「組合療法」意謂以同時方式(例如併行)傳遞兩種或兩種以上藥劑，或其中首先投與一種藥劑，隨後例如連續投與第二藥劑。 在一些實施例中，連同用於治療骨礦物質密度降低之照護標準治療劑一起投與異二聚抗體(亦即異二聚抗體及照護標準治療劑為相同治療計劃之一部分)。如本文所用，術語「照護標準」係指通常為臨床醫師接受之用於診斷有一種類型之疾病的某一類型之患者之治療劑。在一些實施例中，連同適用於治療骨礦物質密度降低或骨缺陷之第二骨增強劑一起投與異二聚抗體。在一些實施例中，骨增強劑係選自由以下組成之群：抗再吸收劑、骨形成劑(亦即合成代謝劑)、雌激素受體調節劑(包括但不限於雷洛昔芬(raloxifene)、巴多昔芬(bazedoxifene)及拉索昔芬(lasofoxifene))及對破骨細胞具有抑制效應之藥物。在一些實施例中，第二骨增強劑係選自由以下組成之群：雙膦酸鹽(包括但不限於阿侖膦酸鈉(alendronate sodium)(FOSAMAX®)、利塞膦酸鹽(risedronate)、伊班膦酸鈉(ibandronate sodium)(BONIVA®)及唑來膦酸(zoledronic acid)(RECLAST®))；雌激素或雌激素類似物；抗RANK配體(RANKL)抑制劑，諸如抗RANKL抗體(例如PROLIA®)；維生素D或維生素D衍生物或其模擬物；鈣源、組織蛋白酶-K(cathepsin-K，cat-K)抑制劑(例如奧丹昔布(odanacatib))、替勃龍(Tibolone)、降血鈣素(calcitonin)或鈣三醇(calcitriol)；及激素補充療法。在一些實施例中，第二骨增強劑包括但不限於副甲狀腺激素(PTH)或其肽片段、PTH相關蛋白質(PTHrp)、骨形態發生蛋白質、成骨素(osteogenin)、NaF、PGE2促效劑、士他汀(statin)、雷尼酸鍶(strontium ranelate)、硬化蛋白抑制劑(例如描述於例如美國專利第7,592,429號或第7,872,106號中之抗硬化蛋白抗體)及抗DKK1抗體或抑制劑。在一些實施例中，第二骨增強劑為Forteo®(特立帕肽(Teriparatide))、Preotact®或Protelos®。 在一些實施例中，採用本文所述之異二聚抗體之組合療法可在投與其他治療劑(例如第二骨增強劑)之前或之後間隔數分鐘至數週至數月範圍。舉例而言，各別用藥程式在彼此之約24小時內，例如在彼此之約6-12小時內或在彼此之約1-2小時內或在彼此之約10-30分鐘內投與。在一些情形下，可合乎需要的是顯著延長治療時期，其中不同用藥程式之各別投與之間間隔數天(2、3、4、5、6或7天)至數週(1、2、3、4、5、6、7或8週)。明確涵蓋用組合療法之一種或兩種藥劑/療法重複治療。維持治療方案 亦涵蓋在維持方案中使用第二骨增強劑及/或本文所述之異二聚抗體來例如預防或減緩骨礦物質密度損失。就此而言，本文所述之方法或用途視情況包含在用異二聚抗體進行之治療時期已結束之後，持續約1週至約5年之維持時期投與有效維持骨礦物質密度之一或多個量之第二骨增強劑。舉例而言，在一些實施例中，本文所述之方法或用途包含持續約至少約1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、3個月、13週、14週、15週、16週、4個月、17週、18週、19週、20週、5個月、21週、22週、23週、24週、6個月、25週、26週、27週、28週、7個月、29週、30週、31週或更長時間(例如8個月、9個月、10個月、11個月、1年、15個月、18個月、2年、3年、4年、5年或5年以上(例如歷經個體一生)之維持時期向個體投與第二骨增強劑。在一些實施例中，維持時期為約6-12週。在一些實施例中，維持時期為約4-12週或約1-3個月。在一些實施例中，維持時期為約12-20週或約3-5個月。在一些實施例中，維持時期為約20-32週或約5-8個月。在一些實施例中，維持時期為約24-36週或約6-9個月。在一些實施例中，維持時期為約1年、約2年、約3年、約4年、約5年或5年以上。「維持」骨礦物質密度包括使接受異二聚抗體治療之個體中經歷之骨礦物質密度參數維持在類似程度下。 類似地，本文所述之方法或用途視情況包含在治療時期已結束之後，隨後持續至少約1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、3個月、13週、14週、15週、16週、4個月、17週、18週、19週、20週、5個月、21週、22週、23週、24週、6個月、1年、2年、3年、4年、5年或5年以上(例如歷經個體一生)之維持時期投與有效維持骨礦物質密度之一或多個量之異二聚抗體。在一些實施例中，維持時期為約6-12週。在一些實施例中，維持時期為約4-12週或約1-3個月。在一些實施例中，維持時期為約12-20週或約3-5個月。在一些實施例中，維持時期為約20-32週或約5-8個月。在一些實施例中，維持時期為約24-36週或約6-9個月。在一些實施例中，維持時期為約1年、約2年、約3年、約4年、約5年或更長時間。醫藥組合物 在一些實施例中，本發明提供一種包含治療有效量之一種或複數種本發明之抗原結合蛋白以及醫藥有效稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑的醫藥組合物。本發明之醫藥組合物包括但不限於液體、冷凍及凍乾組合物。 較佳地，調配物質在所用劑量及濃度下對接受者無毒。在特定實施例中，提供包含治療有效量之異二聚抗體或片段的醫藥組合物。 在一些實施例中，醫藥組合物可含有用於調節、維持或保持例如組合物之pH值、容積莫耳滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透之調配物質。在此等實施例中，適合調配物質包括但不限於胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸、脯胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸(ascorbic acid)、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；增積劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼(caffeine)、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸(sorbic acid)或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如普洛尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲通(triton)、緩血酸胺(tromethamine)、卵磷脂(lecithin)、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物(較佳氯化鈉或氯化鉀)、甘露糖醇山梨糖醇)；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第18版, (A.R. Genrmo編), 1990, Mack出版公司。 在一些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者視例如預定投藥途徑、傳遞形式及所要劑量而確定。參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(上文)。在某些實施例中，此等組合物可影響異二聚抗體或片段之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑在性質方面可為水性或非水性。舉例而言，適合媒劑或載劑可為注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液，可能補充有用於非經腸投藥之組合物中常見之其他物質。與血清白蛋白混合之中性緩衝生理食鹽水或生理食鹽水為其他示範性媒劑。在特定實施例中，醫藥組合物包含pH值約7.0-8.5之Tris緩衝液或pH值約4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液，且可進一步包括山梨糖醇或其適合替代物。在本發明之某些實施例中，可藉由混合具有所要純度之所選組合物與視情況選用之調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(上文))來以凍乾餅或水溶液形式製備組合物以供儲存。此外，在一些實施例中，可使用諸如蔗糖之適當賦形劑將異二聚抗體或片段調配成凍乾物。 可選擇本發明之醫藥組合物以用於非經腸傳遞。或者，可選擇組合物以用於吸入或經由消化道傳遞，諸如經口傳遞。製備此等醫藥學上可接受之組合物屬於此項技術之技能。調配組分較佳以可為投藥部位接受之濃度存在。在某些實施例中，緩衝劑用於維持組合物在生理pH值或略微較低pH值下，通常在約5至約8之pH值範圍內。 當意欲非經腸投藥時，用於本發明中之治療組合物可以於醫藥學上可接受之媒劑中包含所要異二聚抗體或片段之無熱原、非經腸可接受之水溶液形式提供。特別適於非經腸注射之媒劑為異二聚抗體或片段於其中調配成經適當防腐之無菌等張溶液之無菌蒸餾水。在某些實施例中，製備涉及調配所要分子與可提供可經由儲槽注射傳遞之產品之控制或持續釋放的試劑，諸如可注射微球、生物可腐蝕粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體。在某些實施例中，亦可使用具有提升在循環中之持續時間之作用的透明質酸。在某些實施例中，可植入藥物傳遞裝置可用於引入所要異二聚抗體或片段。 可調配用於吸入之本發明之醫藥組合物。在此等實施例中，異二聚抗體或片段有利地調配成乾燥可吸入散劑。在特定實施例中，異二聚抗體或片段吸入溶液亦可與推進劑一起調配以用於氣霧劑傳遞。在某些實施例中，溶液可經霧化。經肺投藥及因此調配方法進一步描述於國際專利申請案第PCT/US94/001875號中，該申請案以引用的方式併入本文中且描述經肺傳遞化學修飾蛋白質。 亦意欲調配物可經口投與。以此方式投與之異二聚抗體或片段可與或不與慣常用於混配諸如錠劑及膠囊之固體劑型之載劑一起調配。在某些實施例中，膠囊可經設計以在於胃腸道中時釋放調配物之活性部分，此時生物可用性最大且全身前降解最小。可包括其他試劑以促進異二聚抗體或片段吸收。亦可採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。 其他醫藥組合物將為熟習此項技術者所顯而易知，包括涉及呈持續或控制傳遞調配物形式之抗原結合蛋白之調配物。調配多種其他持續或控制傳遞機構，諸如脂質體載劑、生物可腐蝕微粒或多孔珠粒及儲槽注射液之技術亦為熟習此項技術者所知。參見例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，其以引用的方式併入本文中且描述多孔聚合微粒之控制釋放以傳遞醫藥組合物。持續釋放製劑可包括呈定形物品，例如薄膜或微膠囊形式之半透性聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(如美國專利第3773919號及歐洲專利申請公開案第EP058481號中所揭露，其各自以引用的方式併入本文中)、L-麩胺酸與L-麩胺酸γ乙酯之共聚物(Sidman等人, 1983, Biopolymers 2:547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(Langer等人, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277及Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人, 1981(上文))或聚D(-)-3-羥丁酸(歐洲專利申請公開案第EP133988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法之任一者製備的脂質體。參見例如Eppstein等人, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP036676號；第EP088046號及第EP143949號，該等文獻及專利以引用的方式併入本文中。 通常以無菌製劑形式提供用於活體內投藥之醫藥組合物。滅菌可藉由經無菌過濾膜過濾達成。當凍乾組合物時，使用此方法進行之滅菌可在凍乾及復原之前或之後進行。用於非經腸投藥之組合物可以凍乾形式或以溶液形式儲存。非經腸組合物通常置放入具有無菌入口之容器，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞之靜脈內溶液袋或小瓶中。 本發明之態樣包括可用作醫藥組合物之自緩衝異二聚抗體或片段調配物，如以全文引用的方式併入本文中之國際專利申請案WO 2006/138181A2(PCT/US2006/022599)中所述。 如上所論述，某些實施例提供除異二聚抗體或片段之外亦包含一或多種賦形劑(諸如此章節中及本文其他地方以說明方式所述者)之異二聚抗體或片段組合物，特定言之醫藥異二聚抗體或片段組合物。就此而言，賦形劑可在本發明中用於廣泛多種目的，諸如調整調配物之物理、化學或生物性質(諸如調整黏度)及/或本發明之製程以改良有效性及/或使此等調配物及製程穩定以對抗歸因於例如在製造、運送、儲存、使用前製備、投與期間及此後產生之應激的降解及腐敗。 關於蛋白質穩定化及調配物質及就此而言適用之方法，有多個闡述可用，諸如Arakawa等人, 「Solvent interactions in pharmaceutical formulations,」 Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991)；Kendrick等人, 「Physical stabilization of proteins in aqueous solution,」RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter及Manning編 Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002)；及Randolph等人, 「Surfactant-protein interactions,」 Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)，其各自以全文引用的方式併入本文中，特定言之關於該等文獻之用於本發明之自緩衝蛋白質調配物之賦形劑及方法的部分，尤其關於用於獸醫學及/或人類醫學用途之蛋白質醫藥產品及方法。 可根據本發明之某些實施例使用鹽以例如調整調配物之離子強度及/或等張性及/或改良本發明之組合物之蛋白質或其他成分之溶解性及/或物理穩定性。 如所熟知，離子可藉由結合於蛋白質之表面上之帶電荷殘基及藉由遮蔽蛋白質中之帶電荷及極性基團且降低其靜電相互作用、吸引及排斥相互作用之強度來使蛋白質之天然狀態穩定。離子亦可藉由結合於特定言之蛋白質之變性肽鍵(--CONH)來使蛋白質之變性狀態穩定。此外，與蛋白質中之帶電荷及極性基團之離子相互作用亦可降低分子間靜電相互作用，且藉此防止或降低蛋白質聚集及不溶。 離子物質在其對蛋白質之影響方面顯著不同。已建立對離子及其對蛋白質之影響之許多種類分級，其可用於調配本發明之醫藥組合物。一個實例為郝夫麥士特序列(Hofmeister series)，其根據離子及極性非離子溶質對溶液中之蛋白質之構形穩定性的影響來將其分級。穩定性溶質稱為「低離液序列(kosmotropic)」溶質。去穩性溶質稱為「高離液序列(chaotropic)」溶質。低離液序列物通常在高濃度(例如＞1莫耳硫酸銨)下用於使蛋白質自溶液沈澱(「鹽析」)。高離液序列物通常用於使蛋白質變性及/或溶解(「鹽溶」)。離子「鹽溶」及「鹽析」之相對有效性劃定其在郝夫麥士特序列中之位置。 游離胺基酸可在根據本發明之各種實施例之異二聚抗體或片段調配物中用作增積劑、穩定劑及抗氧化劑以及用於其他標準用途。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸可用於使調配物中之蛋白質穩定。甘胺酸適用於凍乾中以確保恰當餅結構及性質。精胺酸可適用於在液體調配物與凍乾調配物兩者中抑制蛋白質聚集。甲硫胺酸適用作抗氧化劑。 多元醇包括糖，例如甘露糖醇、蔗糖及山梨糖醇；及多羥基醇，諸如甘油及丙二醇，及出於本文論述之目的，包括聚乙二醇(PEG)及相關物質。多元醇為低離液序列的。其為液體調配物與凍乾調配物兩者中之適用於保護蛋白質免遭物理及化學降解過程之穩定劑。多元醇亦適用於調整調配物之張力。 適用於本發明之所選實施例中之多元醇尤其為通常用於確保凍乾調配物中之餅之結構穩定性的甘露糖醇。其確保餅之結構穩定性。其通常與例如蔗糖之凍乾保護劑一起使用。山梨糖醇及蔗糖為用於調整張力且作為在運輸期間或在製造過程期間製備大塊期間防止凍融應激之穩定劑的較佳試劑。諸如葡萄糖及乳糖之還原糖(其含有游離醛或酮基團)可使表面離胺酸及精胺酸殘基糖化。因此，其通常不為供根據本發明使用之較佳多元醇。此外，形成此等反應性物質之糖，諸如在酸性條件下水解成果糖及葡萄糖，且因此導致糖化之蔗糖，亦就此而言不為本發明之較佳多元醇。PEG適用於使蛋白質穩定並適用作低溫保護劑且就此而言可用於本發明中。 異二聚抗體或片段調配物之實施例進一步包含界面活性劑。蛋白質分子可易吸附於表面上且易變性及隨後在空氣-液體、固體-液體及液體-液體界面處聚集。此等效應通常與蛋白質濃度成反比。此等有害相互作用通常與蛋白質濃度成反比且通常藉由物理攪動，諸如在產品之運送及處理期間產生之物理攪動加劇。 界面活性劑常規用於防止、最小化或降低表面吸附。就此而言，適用於本發明中之界面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨醇聚乙氧基化物之其他脂肪酸酯及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。 界面活性劑亦通常用於控制蛋白質構形穩定性。就此而言，界面活性劑之使用具有蛋白質特異性，因為任何既定界面活性劑通常皆將使一些蛋白質穩定且使其他蛋白質去穩。 聚山梨醇酯易經受氧化降解且如所供應，常含有會導致蛋白質殘基側鏈，尤其甲硫胺酸氧化之足量過氧化物。因此，聚山梨醇酯應小心使用，且當使用時，應在其最低有效濃度下採用。就此而言，聚山梨醇酯示範賦形劑應以其最低有效濃度使用之一般性準則。 異二聚抗體或片段調配物之實施例進一步包含一或多種抗氧化劑。在某種程度上，蛋白質之有害氧化可藉由維持適當環境氧及溫度程度及藉由避免暴露於光而在醫藥調配物中加以防止。抗氧化劑賦形劑亦可用於防止蛋白質之氧化降解。就此而言，適用抗氧化劑尤其為還原劑、氧/自由基清除劑及螯合劑。用於本發明之治療蛋白質調配物中之抗氧化劑較佳為水溶性的且在產品之整個保存期限期間維持其活性。就此而言，EDTA為本發明之一種較佳抗氧化劑。 本發明之調配物可包括作為蛋白質輔因子且為形成蛋白質配位複合物所必需之金屬離子，諸如為形成某些胰島素懸浮液所必需之鋅。金屬離子亦可抑制一些使蛋白質降解之過程。然而，金屬離子亦催化使蛋白質降解之物理及化學過程。 鎂離子(10-120 mM)可用於抑制天冬胺酸異構化成異天冬胺酸。Ca⁺² 離子(多達100 mM)可增加人類去氧核糖核酸酶之穩定性。然而，Mg⁺² 、Mn⁺² 及Zn⁺² 可使rhDNa酶去穩。類似地，Ca⁺² 及Sr⁺² 可使因子VIII穩定，因子VIII可由Mg⁺² 、Mn⁺² 及Zn⁺² 、Cu⁺² 及Fe⁺² 去穩，且其聚集可由Al+3離子增加。 異二聚抗體或片段調配物之實施例進一步包含一或多種防腐劑。當開發涉及自同一容器抽取一次以上之多劑量非經腸調配物時，防腐劑為必需的。其主要功能在於在藥物產品之整個保存期限或使用條款期間抑制微生物生長且確保產品無菌。通常使用之防腐劑包括苯甲醇、苯酚及間甲酚。儘管防腐劑具有與小分子非經腸劑一起使用之悠久歷史，但開發包括防腐劑之蛋白質調配物可具有挑戰性。防腐劑對蛋白質幾乎始終具有去穩效應(聚集)，且此已變為限制其在多劑量蛋白質調配物中使用之主要因素。迄今為止，大多數蛋白質藥物已調配僅供單次使用。然而，當多劑量調配物為可能時，其具有使得患者能夠得到方便及使得可銷售性能夠增加的累加優勢。一良好實例為人類生長激素(hGH)之多劑量調配物，其中開發防腐調配物已導致更方便之多次使用注射筆呈現物商業化。至少四種含有hGH防腐調配物之此等筆裝置當前可在市場上獲得。諾德托平(Norditropin)(液體，Novo Nordisk)、魯托平水溶液(Nutropin AQ)(液體，Genentech)及增若托平(Genotropin)(凍乾--雙室藥筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而索瑪托普(Somatrope)(Eli Lilly)係與間甲酚一起調配。 在調配及開發防腐劑型期間需要考慮若干態樣。必須使藥物產品中之有效防腐劑濃度最佳化。此需要以賦予抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性之一定濃度範圍測試劑型中之既定防腐劑。 正如所預期，開發含有防腐劑之液體調配物比凍乾調配物更具挑戰。冷凍乾燥產品可在無防腐劑下凍乾且在使用時用含有防腐劑之稀釋劑復原。此舉縮短防腐劑與蛋白質接觸之時間，從而使相關穩定性風險顯著最小。就液體調配物而言，防腐劑有效性及穩定性應歷經整個產品保存期限(約18至24個月)加以維持。一個需注意之要點為防腐劑有效性應在含有活性藥物及所有賦形劑組分之最終調配物中進行證明。 異二聚抗體或片段調配物通常將針對特定投藥途徑及方法、特定投藥劑量及投藥頻率、對特定疾病之特定治療以及尤其生物可用性及持久性之範圍加以設計。因此，可根據本發明設計用於藉由任何適合途徑傳遞之調配物，該途徑包括但不限於經口、經耳、經眼、經直腸及經陰道、及藉由非經腸途徑，包括靜脈內及動脈內注射、肌肉內注射及皮下注射。 一旦醫藥組合物已經調配，其可以溶液、懸浮液、凝膠劑、乳液、固體、晶體形式或以脫水或凍乾散劑形式儲存在無菌小瓶中。此等調配物可以備用形式或以在投與之前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。本發明亦提供用於產生單次劑量投藥單位之套組。本發明之套組可各自含有具有乾燥蛋白質之第一容器與具有水性調配物之第二容器兩者。在本發明之某些實施例中，提供含有單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及冷凍注射器)之套組。 欲採用之含有抗原結合蛋白之醫藥組合物的治療有效量將例如取決於治療情形及目標。熟習此項技術者將瞭解適用於治療之劑量將部分地視傳遞之分子、使用抗原結合蛋白所針對之適應症、投藥途徑及患者之尺寸(體重、身體表面或器官尺寸)及/或狀況(年齡及總體健康狀況)而變化。在某些實施例中，臨床醫師可滴定劑量且改變投藥途徑以獲得最佳治療效應。穩定性 如本文在包含異二聚抗體(或其抗原結合片段)之組合物之情形下所用之術語「穩定性」及「穩定」係指組合物中之異二聚抗體(或其抗原結合片段)在既定製造、製備、運輸及/或儲存條件下對聚集、降解或片段化具有抗性。包含高度穩定性之抗體調配物顯示可靠性及安全性增強且因此有利於臨床使用。 視情況藉由隨時間檢查組合物中之抗體之所要參數(例如重鏈及/或輕鏈之聚集、降解、化學修飾等)來評估組合物中之抗體穩定性。就此而言，通常在初始時間點(T0)及評估時間點(T1)，視情況當使抗體或其片段暴露於許多環境條件之任一者時檢查參數且進行比較。初始時間點可為例如最初以組合物形式調配抗體或其片段或最初檢查品質(亦即檢查以確定抗體組合物是否滿足關於聚集或降解之管理或製造規範)的時間。初始時間點亦可為以組合物形式再調配抗體或抗體片段(例如相較於初始製劑，在更高或更低濃度下再調配)所處之時間。在各種實施例中，評估時間點為在初始時間點之後約1週(或約2週、或約3週、或約4週、或約5週、或約6週、或約7週、或約8週、或約10週、或約3個月、或約6個月或約1年)。可在多種儲存條件下評估組合物中之抗體或其片段之所要參數(例如聚集或降解)，該等儲存條件諸如溫度-30℃、4℃、20℃或40℃；振盪；pH值；在不同容器材料(例如玻璃小瓶、預填充注射器等)中儲存及其類似儲存條件。 測定包含異二聚抗體之組合物中存在之聚集體的聚集度及/或類型及/或尺寸之示範性方法包括但不限於粒徑排阻層析(SEC)、高效粒徑排阻層析(HPSEC)、靜態光散射(SLS)、傅立葉轉換紅外光譜術(FTIR)、圓二色性(CD)、脲誘導之蛋白質展開技術、內在色胺酸螢光、示差掃描熱析法及1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)蛋白質結合技術。可藉由使分子經裝填有適當樹脂之管柱穿過來進行粒徑排阻層析(SEC)以基於分子尺寸分離分子，較大分子(例如聚集體)將在較小分子(例如單體)之前溶離。通常藉由280 nm下之UV吸光度偵測分子且可收集以供進一步表徵。高壓液體層析管柱常用於SEC分析(HP-SEC)。或者，可利用分析型超速離心(AUC)。AUC為一種測定液體樣品中之巨分子之沈降係數(以斯維德伯格(Svedberg)S加以報導)的正交技術。如同SEC一樣，AUC能夠使抗體片段/聚集體與單體分離並對其進行偵測且進一步能夠提供關於分子質量之資訊。組合物中之抗體或抗體片段聚集亦可藉由使用庫爾特計數器(coulter counter)進行粒子計數器分析或藉由使用濁度計進行濁度量測來表徵。混濁為溶液中之粒子使光散射之量之量度，且因此可用作蛋白質聚集之一般性指標。此外，非還原性聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)或毛細管凝膠電泳(CGE)可用於表徵組合物中之抗體或抗體片段之聚集及/或片段化狀態。 測定抗體降解之示範性方法包括但不限於粒徑排阻層析(SEC)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及連同SDS一起之毛細管電泳(CE-SDS)以及伴有線上MS探測之逆相HPLC。 在各種實施例中，在相關條件下，組合物中小於5%之本文所述之異二聚抗體或抗體片段呈聚集體形式。舉例而言，在-30℃、4℃、20℃或40℃下儲存約1週(或約2週、或約3週、或約4週、或約5週、或約6週、或約7週、或約8週、或約10週、或約3個月、或約6個月或約1年)之時期之後，組合物中小於4%、或小於3%、或小於2%、或小於1%之異二聚抗體或其片段呈聚集體形式。在一些實施例中，在約4℃下儲存兩週之後，組合物中小於5%(或小於4%或小於3%或小於2%或小於1%或1%以下)之本文所述之異二聚抗體或抗體片段呈聚集體形式。 舉例而言，在-30℃、4℃、20℃或40℃下儲存約1週(或約2週、或約3週、或約4週、或約5週、或約6週、或約7週、或約8週、或約10週、或約3個月、或約6個月或約1年)之時期之後，組合物中至少85%(或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%)之抗體或其片段視情況以非聚集體(亦即單體)形式存在。在一些實施例中，在約4℃下儲存兩週之後，至少85%(或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或99%以上)之抗體或其片段以非聚集體形式存在於組合物中。在一些實施例中，在約4℃下儲存兩週之後，至少99%之抗體以非聚集體形式存在於組合物中，及/或在40℃下儲存兩週之後至少95%之抗體以非聚集體形式存在於組合物中。 在各種實施例中，組合物中小於5%之本文所述之異二聚抗體或抗體片段降解。舉例而言，在相關條件下，組合物中小於4%、或小於3%、或小於2%、或小於1%或1%以下之異二聚抗體或其片段降解。舉例而言，在約-30℃、約4℃、約20℃或約40℃下儲存約1週(或約2週、或約3週、或約4週、或約5週、或約6週、或約7週、或約8週、或約10週、或約3個月、或約6個月或約1年)之時期之組合物中的視情況至少85%(或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%)之抗體或片段為完整的(亦即未降解)。在一些態樣中，在以組合物形式在約4℃下儲存兩週之時期之後，至少85%(或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或99%以上)之抗體或其片段為完整的(亦即非降解)。在一些實施例中，當以組合物形式在約4℃下儲存兩週時，至少99%之抗體或片段保持完整，及/或當以組合物形式在約40℃下儲存兩週時至少95%保持完整。 本文亦涵蓋組合物中之異二聚抗體(或其抗原結合片段)之功能或活性穩定性。偵測及/或定量例如結合目標之抗體、硬化蛋白中和及DKK-1中和之分析在此項技術中為已知的且在本文中描述於實例4-6中。視情況，相較於抗體或其片段在初始時間點時之活性，抗體或其片段在相關條件下顯示約50-100%活性。舉例而言，相較於初始時間點之活性，抗體或其片段保留之活性程度在約60-90%或70-80%之間。因此，相較於在初始時間點時之活性，抗體或其片段之功能穩定性包括保留至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之活性且可包括大於100%(諸如105%、110%、115%、120%、125%或150%或150%以上)之活性量測結果。 黏度 在一些實施例中，測定包含一或多種本文所述之異二聚抗體之組合物的黏度。如本文所用之術語「黏度」係指「絕對黏度」。絕對黏度，有時稱為動態或簡單黏度，為運動黏度與流體密度之乘積(絕對黏度=運動黏度×密度)。運動黏度之量綱為L² /T，其中L為長度且T為時間。通常，運動黏度用厘史(centistoke，cSt)表示。運動黏度之SI單位為mm² /s，其為1 cSt。絕對黏度用厘泊(cP)單位表示。絕對黏度之SI單位為毫帕-秒(mPa-s)，其中1 cP = 1 mPa-s。 可在向組合物中添加抗體之後數小時(例如1-23小時)、數天(例如1-10天)、數週(例如1-5週)、數月(例如1-12個月)或數年(例如1-2年、1-3年)量測組合物之黏度。可在儲存或投藥溫度，例如2-8℃或25℃(室溫)下進行黏度量測。在一些實施例中，液體或復原液體組合物在儲存及/或投藥溫度下之絕對黏度為15 cP或15 cP以下、或14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4 cP或4 cP以下。在一些實施例中，液體或復原液體組合物之絕對黏度為6 cP或6 cP以下。 在一些實施例中，在添加異二聚抗體之前及之後量測抗體組合物之黏度。量測黏度之方法在此項技術中為熟知的且包括例如使用毛細管黏度計或錐板流變儀。任何方法皆可使用，其限制條件為相同方法用於比較測試調配物與參考調配物。套組 包含一或多種本文所述之異二聚抗體之醫藥組合物可連同提供關於此等醫藥組合物之使用之說明書的包裝材料一起置放在容器(例如小瓶或注射器)內。通常，此等說明書將包括描述異二聚抗體濃度以及在某些實施例內可為復原醫藥組合物所必需之賦形劑成分或稀釋劑(例如水、生理食鹽水或PBS)之相對量的明確表述。其他實施例 亦涵蓋以下編號段落中提供之以下實施例： 1.   一種經分離抗體重鏈可變區，其在構架區內在AHo位置51或141處包含胺基酸取代，其中該取代在該位置處將帶正電荷胺基酸或帶負電荷胺基酸引入該重鏈可變區構架中。 2.   如段落1之經分離抗體重鏈可變區，其中AHo位置51或AHo位置141被取代成帶正電荷胺基酸。 3.   如段落2之經分離抗體重鏈可變區，其進一步包含在AHo位置46處被帶正電荷胺基酸取代。 4.   如段落2或段落3之經分離抗體重鏈可變區，其中AHo位置51被取代成帶正電荷胺基酸。 5.   如段落1、2或3之經分離抗體重鏈可變區，其中AHo位置141被取代成正電荷胺基酸。 6.   如段落3之經分離抗體重鏈可變區，其中AHo位置46及AHo位置141被取代成帶正電荷胺基酸。 7.   如段落2-6中任一者之經分離抗體重鏈，其中該帶正電荷胺基酸為離胺酸。 8.   如段落1之經分離抗體重鏈可變區，其中AHo位置51或AHo位置141被取代成帶負電荷胺基酸。 9.   如段落8之經分離抗體重鏈可變區，其進一步包含在AHo位置46處被帶負電荷胺基酸取代。 10.  如段落8或段落9之經分離抗體重鏈可變區，其中AHo位置51被取代成帶負電荷胺基酸。 11.  如段落8、9或10之經分離抗體重鏈可變區，其中AHo位置141被取代成帶負電荷胺基酸。 12.  如段落9之經分離抗體重鏈可變區，其中AHo位置46及AHo位置141被取代成帶負電荷胺基酸。 13.  如段落8-12中任一者之經分離抗體重鏈，其中該帶負電荷胺基酸為天冬胺酸。 14.  如段落1-13中任一者之經分離抗體重鏈可變區，其進一步包含重鏈CH1區。 15.  如段落14之經分離抗體重鏈可變區，其中該CH1區包含一或多個胺基酸添加、缺失或取代。 16.  如段落15之經分離抗體重鏈可變區，其中取代某一胺基酸以將帶正電荷或帶負電荷胺基酸引入該CH1區中。 17.  如段落16之經分離抗體重鏈可變區，其中在EU位置S183處引入該帶正電荷或帶負電荷胺基酸。 18.  如段落17之經分離抗體重鏈可變區，其中EU位置S183被取代成帶正電荷胺基酸。 19.  如段落18之經分離抗體重鏈可變區，其中該取代為S183K。 20.  如段落17之經分離抗體重鏈可變區，其中EU位置S183被取代成帶負電荷胺基酸。 21.  如段落20之經分離抗體重鏈可變區，其中該取代為S183D。 22.  一種抗體重鏈，其包含如段落1-21中任一者之經分離抗體重鏈可變區。 23.  如段落22之抗體重鏈，其中該重鏈包含含有一或多個不利於同二聚化之胺基酸取代之CH3區。 24.  如段落23之抗體重鏈，其中該CH3區中之帶負電荷胺基酸經帶正電荷胺基酸取代。 25.  如段落24之抗體重鏈，其中該帶負電荷胺基酸為EU位置D399、E356或E357。 26.  如段落25之抗體重鏈，其中該帶正電荷胺基酸為離胺酸。 27.  如段落26之抗體重鏈，其中該CH3區包含D399K及E356K取代。 28.  如段落23之抗體重鏈，其中該CH3區中之帶正電荷胺基酸經帶負電荷胺基酸取代。 29.  如段落28之抗體重鏈，其中該帶正電荷胺基酸為EU位置K370、K392或K409。 30.  如段落29之抗體重鏈，其中該帶負電荷胺基酸為天冬胺酸。 31.  如段落30之抗體重鏈，其中該CH3區包含K392D及K409D取代。 32.  一種抗體，其包含如段落24-27中任一者之抗體重鏈及如段落28-31中任一者之抗體重鏈。 33.  如段落22-31中任一者之抗體重鏈，其中該重鏈包含含有一或多個改變Fc效應物功能之胺基酸取代之CH2區。 34.  一種抗體κ輕鏈可變區，其在構架區內在AHo位置51或141處包含胺基酸取代，其中該取代在該位置處將帶正電荷或帶負電荷胺基酸引入該κ輕鏈可變區構架中。 35.  如段落34之抗體κ輕鏈可變區，其中AHo位置51或AHo位置141被取代成帶正電荷胺基酸。 36.  如段落35之抗體κ輕鏈可變區，其進一步包含在AHo位置46處被帶正電荷胺基酸取代。 37.  如段落35或36之抗體κ輕鏈可變區，其中AHo位置51被取代成帶正電荷胺基酸。 38.  如段落35、36或37之抗體κ輕鏈可變區，其中AHo位置141被取代成帶正電荷胺基酸。 39.  如段落35-38中任一者之抗體輕鏈，其中該帶正電荷胺基酸為離胺酸。 40.  如段落34之抗體κ輕鏈可變區，其中AHo位置51或AHo位置141被取代成帶負電荷胺基酸。 41.  如段落40之抗體κ輕鏈可變區，其進一步包含在AHo位置46處被帶負電荷胺基酸取代。 42.  如段落40或41之抗體κ輕鏈可變區，其中AHo位置51被取代成帶負電荷胺基酸。 43.  如段落40、41或42之抗體κ輕鏈可變區，其中AHo位置141被取代成帶負電荷胺基酸。 44.  如段落40-43中任一者之抗體輕鏈，其中該帶正電荷胺基酸為離胺酸。 45.  如段落34-44中任一者之抗體κ輕鏈可變區，其進一步包含κ輕鏈恆定區。 46.  如段落45之抗體κ輕鏈可變區，其中該κ輕鏈恆定區包含一或多個胺基酸添加、缺失或取代。 47.  如段落46之經分離抗體κ鏈可變區，其中取代某一胺基酸以將帶正電荷或帶負電荷胺基酸引入該κ輕鏈恆定區中。 48.  如段落47之經分離抗體κ鏈可變區，其中在Eu位置S176處引入該帶正電荷或帶負電荷胺基酸。 49.  如段落48之經分離抗體κ鏈可變區，其中Eu位置S176被取代成帶正電荷胺基酸。 50.  如段落49之經分離抗體κ鏈可變區，其中該取代為S176K。 51.  如段落48之經分離抗體κ鏈可變區，其中Eu位置S176被取代成帶負電荷胺基酸。 52.  如段落51之經分離抗體κ鏈可變區，其中該取代為S176D。 53.  一種抗體λ輕鏈可變區，其在構架區內在AHo位置51或141處包含胺基酸取代，其中該取代在該位置處將帶正電荷或帶負電荷胺基酸引入該λ輕鏈可變區構架中。 54.  如段落53之抗體λ輕鏈可變區，其進一步包含λ輕鏈恆定區。 55.  如段落54之抗體λ輕鏈可變區，其中該λ輕鏈恆定區包含一或多個胺基酸添加、缺失或取代。 56.  如段落55之經分離抗體λ鏈可變區，其中取代某一胺基酸以將帶正電荷或帶負電荷胺基酸引入該λ輕鏈恆定區中。 57.  如段落56之經分離抗體λ鏈可變區，其中在Kabat位置S176處引入該帶正電荷或帶負電荷胺基酸。 58.  如段落57之經分離抗體λ鏈可變區，其中S176被取代成帶正電荷胺基酸。 59.  如段落58之經分離抗體λ鏈可變區，其中該取代為S176K。 60.  如段落57之經分離抗體λ鏈可變區，其中S176被取代成帶負電荷胺基酸。 61.  如段落60之經分離抗體λ鏈可變區，其中該取代為S176D或S176E。 62.  一種經分離核酸，其編碼如段落1-21中任一者之抗體重鏈可變區、如段落22-31中任一者之抗體重鏈、如段落34-52中任一者之抗體κ輕鏈可變區、或如段落53-61中任一者之抗體輕鏈可變區。 63.  一種表現載體，其包含可操作地連接於啟動子之如段落62之經分離核酸。 64.  一種重組宿主細胞，其包含如段落62之經分離核酸。 65.  一種重組宿主細胞，其包含如段落63之表現載體。 66.  一種抗原結合蛋白，其包含如段落1-21中任一者之經分離重鏈可變區及如段落22-31或34-52中任一者之經分離輕鏈可變區。 67.  如段落66之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為包含兩個重鏈及兩個輕鏈之抗體。 68.  如段落67之抗原結合蛋白，其中該抗體為雙特異性抗體。 69.  一種醫藥組合物，其包含如段落66-68中任一者之抗原結合蛋白。 實例 實例1-藉由硬化蛋白抗體治療誘導DKK1表現 評估抗硬化蛋白抗體治療對不同動物模型之骨中之DKK1表現的影響。出乎意料的是在所有動物模型中，在用抗硬化蛋白抗體治療之動物之全骨提取物中偵測到DKK1表現顯著增加。在自正常動物、經絕期後骨質疏鬆動物模型及骨折癒合動物模型提取之骨中觀測到此表現增加。在抗硬化蛋白抗體治療後觀測之DKK1表現增加發生在所有三個測試物種(小鼠、大鼠及靈長類動物)中。 示範性研究詳情如下：每2週用4.5或22.5 mg/kg Ab-5(抗硬化蛋白抗體(SAB))治療13歲正常雄性食蟹獼猴(cynomolgus monkey)總計8週。在研究結束時，以人道方式使動物安樂死且收集組織，包括骨。自骨分離RNA且遵循製造商說明書，使用QuantiGene分支DNA(bDNA)分析(Affymetrix)及對食蟹獼猴DKK1 mRNA及持家基因具有特異性之探針組測定DKK1 RNA表現。圖8中說明之資料顯示在較低劑量(4.5 mg/kg)下肱骨中段中之DKK1表現增加且在最高劑量(22.5 mg/kg)下DKK1 mRNA受顯著誘導。亦在腰椎中觀測到DKK1表現增加。資料呈現為相較於持家(HKG)基因HPRT之經校正表現(+/-標準偏差)。圖8之圖上方之括號表示p＜0.05(ANOVA)。 本文呈現之資料顯示抗硬化蛋白抗體治療不依賴於疾病之發生誘導DKK1表現且可能可適用於包括人類之所有物種。誘導DKK1可限制抗硬化蛋白抗體之活性，且表明抑制硬化蛋白與DKK1兩者之治療劑顯示較佳活性。此外，DKK1表現增加可充當硬化蛋白抗體治療之生物標記。 實例2-產生連接子體 以下實例描述產生異二聚抗體(具有IgG1骨架)，其中使用G4S連接子共價連接(a)抗硬化蛋白抗體及(b)抗DKK1抗體之輕鏈及重鏈以形成結合硬化蛋白之單一多肽鏈及結合DKK1之單一多肽鏈(「連接子體」)。接著經由在CH3域處進行電荷配對取代(亦即一個重鏈含有K392D及K409D取代且另一含有E356K及D399K取代)使針對DKK1及硬化蛋白目標之多肽鏈或半抗體裝配成雙特異性抗體。電荷配對取代採用本文所述之靜電操縱機制，藉此藉由CH3區中帶負電荷殘基與帶正電荷殘基之間的吸引促進異二聚體形成(DKK1 Ab-硬化蛋白Ab)且由於在CH3-CH3界面之相應區域處具有相同電荷之胺基酸之間的排斥而阻礙同二聚體(兩個DKK1 Ab臂或兩個硬化蛋白Ab臂)。亦在CH1-CL域界面處引入電荷配對取代以降低聚集程度(重鏈中之S183K/E及輕鏈中之S176E/K)。此外，一些連接子體亦在VL-VH界面處具有工程改造域間二硫鍵以進一步穩定化重鏈-輕鏈相互作用。此藉由使重鏈中之G44(Kabat)及輕鏈中之G100(Kabat)取代成半胱胺酸殘基來達成。 上述方法導致高度聚集，如藉由粒徑排阻層析(SEC)所測定。為降低聚集程度，在輕鏈與重鏈之間在重鏈及輕鏈恆定區(CH1-CL1)中用電荷配對取代添加或置換G4S連接子。意欲聚集程度將由於向連接子體構築體中添加電荷配對取代而降低。 與CH1-CL界面中之電荷配對取代組合之連接子體設計仍然在若干構築體中產生非所要聚集問題。 實例3-產生無連接子之異二聚抗體 以下實例描述產生不具有連接子，但代之以在親本抗體之CH/CL界面與CH3/CH3界面兩者中包含電荷配對取代之異二聚抗體。在CH/CL及CH3/CH3界面中包含帶電荷取代之所得異二聚抗體在本文中稱為異二聚抗體形式1或異Ig-v1。 簡言之，將以下取代引入DKK1抗體6.37.5中：CH3域中之K392D(EU)及K409D(EU)取代、CH1域中之S183K(EU)取代、及CL域中之S176E(EU)取代。將以下取代引入硬化蛋白抗體27H6中：CH3域中之E356K(EU)及D399K(EU)取代、CH1域中之S183E(EU)取代、及CL域中之S176K(EU)取代。IgG1骨架用於異二聚形式1設計中。 兩種不同抗體之各種輸入DNA比率用於使IgG產量最大且使聚集程度(高分子量物質)最小。使用兩種抗體之等量DNA導致聚集程度最小。 為評估異Ig雙特異性抗體形成，純化物質且使其經受質譜分析。NR質量分析確認抗體產物具有兩個不同輕鏈及兩個不同重鏈。為確認特定輕鏈-重鏈配對，經由蛋白水解(Pierce Fab微量製備套組)產生Fab片段。質量分析僅顯示兩種物質，一種對應於DKK1抗體重鏈及輕鏈配對且另一對應於硬化蛋白抗體之重鏈及輕鏈配對。質量分析確認存在在硬化蛋白/DKK1異二聚抗體之兩臂中均具有正確輕鏈及重鏈配對之異二聚抗體。 質量分析指示在純化樣品中存在單一抗體物質，其中觀測質量與異二聚抗體之計算質量匹配。所得異二聚抗體具有兩個輕鏈及兩個重鏈，其中異二聚抗體之抗硬化蛋白部分之重鏈在CH1域中具有S183E(EU)取代且抗硬化蛋白部分之輕鏈在CL域中具有S176K(EU)取代。異二聚抗體之抗DKK1部分之重鏈在CH1域中具有S183K(EU)取代且DKK1部分之輕鏈在CL域中具有S176E(EU)取代。異二聚抗體之抗硬化蛋白部分之CH3域具有E356K(EU)及D399K(EU)取代且抗DKK1部分之CH3域在K392D(EU)及K409D(EU)處具有取代。 在獨立骨母細胞Wnt活化分析中評估產生之異二聚抗體在硬化蛋白及/或DKK1存在下活化典型Wnt信號傳導之能力，其中誘導細胞分化且以自分泌方式分泌活化Wnt信號傳導之因子。在分析中，MC3T3-E1細胞用Super-TOPFlash報導體構築體轉染，且選擇並評估穩定細胞株。MC3T3E1/TetONWnt1/螢光素酶為一種使用慢病毒轉導，用T細胞因子反應螢光素酶構築體、Tet抑制子構築體及多西環素(doxycycline)誘導性Wnt-1構築體工程改造之小鼠骨母細胞細胞株。在多西環素存在下，MC3T3E1/TetONWnt1/Luc細胞表現Wnt-1且經由Wnt-1結合細胞表面LRP5/6及捲曲受體，從而導致螢光素酶表現來誘導信號轉導。當在硬化蛋白及/或DKK1存在下培育MC3T3E1/TetONWnt1/Luc#5細胞時，Wnt信號傳導由此等蛋白質經由Lrp5/6 β螺旋槳1基元加以抑制。生物分析量測用固定濃度之硬化蛋白及/或DKK1處理之異二聚抗體及親本抗體之細胞基報導體分析中的劑量依賴性刺激效應。 純系C10顯示在與純化硬化蛋白或DKK1蛋白質一起培育之後，報導體活性由於Wnt路徑活化受抑制而降低。在擴增培養基(含有10% FBS、1×青黴素-鏈黴素-Glu及1.0 ug/ml嘌呤黴素(puromycin)之α-MEM培養基)中培養細胞。當細胞達到80%匯合時，將培養基變換成分化培養基「DM」(擴增培養基、50 ug/ml抗壞血酸及10 mM β-甘油磷酸鹽)，持續4天。在分化之後，此細胞株以自分泌方式產生觸發典型Wnt活化之內源性蛋白質。吸出培養基且添加100 μl含有各種濃度之單特異性或異二聚抗體(在37℃下與DKK1一起預培育4小時及/或與硬化蛋白一起預培育45-60分鐘)之新鮮DM至孔中持續24小時。遵循製造商說明書(Promega之螢光素酶分析系統，目錄號：E4530)量測螢光素酶活性。測試之各種大鼠及人類雙特異性抗體能夠在硬化蛋白與DKK1兩者存在下以劑量依賴性方式活化骨母細胞典型Wnt路徑，從而進一步顯示抗體可同時中和兩種可溶性蛋白質之Wnt抑制功能。 結果指示根據此實例中所述之方法產生之異二聚抗體與連接子體(其用作陽性對照)兩者均具有極類似活性，從而進一步確認輕鏈及重鏈之正確配對。 實例4-產生在CH3域、CH/CL域及VH/VL域中具有取代之異二聚抗體。 以下實例描述產生在CH3、CH/CL及VH/VL域之各者中具有一或多個取代以進一步有利於輕鏈及重鏈之正確配對的異二聚抗體。異二聚抗體之硬化蛋白部分係基於Ab-5及Ab-23且DKK1部分係基於抗體6.147及6.37.5。此處使用IgG2類別恆定域以防止ADCC且阻礙效應物功能。在VH/VL、CH/CL及CH3/CH3界面中包含帶電荷取代之所得異二聚抗體在本文中稱為異二聚抗體形式2或異Ig-v2。 當在一種細胞內部共表現兩種不同抗體時，轉錄且轉譯四個不同鏈(HC1、LC1、HC2、LC2)。HC可形成同二聚體(HC1-HC1)或異二聚體(HC1-HC2)；LC可與兩個不同HC一起隨機裝配。總計，可存在十種不同組合[Paul CarterJ Immunological Methods 248 (2001) 7-15]。可藉由工程改造C_H 3區來使非所要重鏈同二聚體最少以僅形成異二聚體。此實例顯示不合需要LC/HC配對可藉由工程改造LC/HC之界面以增強LC與其同源HC之正確配對加以消除。靜電操縱機制用於引導LC/HC之配對及裝配；相反極性吸引所要複合物次單元，而同二聚體次單元之相同極性為排斥性的。 當沿重鏈及輕鏈界面選擇殘基對用於經具有相反極性之帶電荷殘基(例如Asp或Lys)置換以控制LC與其同源HC之正確配對時，應用若干準則：1)所有位置在VL/VH界面與CL/C_H 1界面兩者內均緊密鄰近定位；2)所有位置皆經包埋且在大多數(若非全部)不同抗體家族之中充分保守；3)所有位置對表現及抗原結合皆具有最小影響；及4)引入帶電荷殘基不干擾侶伴蛋白BiP在抗體折疊及裝配過程中結合C_H 1區。 在VL/VH及Cκ/C_H 1界面處選擇用於工程改造之殘基列於表2中。在可變區中，VH中之主要AHo位置46(Q39 Kabat)、AHo位置51(Kabat G44)及AHo位置141(Kabat Q105)分別緊密鄰近於VL中之AHo位置46(Kabat Q38)、AHo位置141(Kabat Q100)及AHo位置51(Kabat A43)。在恆定區中，C_H 1區中之A141(EU)、P171(EU)及S183(EU)分別接觸Ck中之殘基F116(EU)、S162(EU)及S176(EU)，但C_H 1中之K147(EU)可與Ck區中之Q124(EU)、S131(EU)或T180(EU)相互作用。 表2：選擇位於VH/VL及CH1/Cκ界面處之胺基酸殘基用於引入電荷配對殘基。根據不同編號系統對VH及VL之生殖系殘基編號，粗體殘基為主要殘基。大多數抗體之VH/VL中之接觸殘基排列在同一列中。人類IgG1 CH1域之接觸Cκ區中之殘基的殘基亦用粗體表示且置於同一列中。FW：構架。

VH		VL
IMGT#	Kabat#	Eu#	AHo#	FW	殘基	接觸	IMGT#	Kabat#	Eu#	AHo#	FW	殘基
44	39	39	46	2	Q/ R/t	↔	44	38	38	46	2	Q/ G/H/L
49	44	44	51	2	G/ r/a	↔	*	100	100	141	4	Q / G /P
*	105	109	141	4	Q /k/r/s	↔	49	43	43	51	2	A /G/S/ P
CH 1		Ck
IMGT#	Kabat#	Eu#	AHo#	Ref#	殘基	接觸	IMGT#	Kabat#	Eu#	AHo#	Ref#	殘基
20	139	141	*	176	A	↔	5	116	116	*	158	F
82	175	171	*	212	P	↔	81	162	162	*	211	S
86	188	183	*	230	S	↔	86	176	176	*	230	S
26	145	147	*	182	K	↔	13	124	124	*	166	Q
26	145	147	*	182	K	↔	20	131	131	*	176	S
26	145	147	*	182	K	↔	90	180	180	*	234	T

異二聚抗體之Wnt1驅動之骨母細胞報導體分析顯示在DKK1與硬化蛋白兩者存在下典型Wnt信號傳導受強健活化，而對照DKK1抗體(6.37.5、6.147)及對照硬化蛋白抗體(Ab-23)僅部分逆轉抑制。 工程改造異二聚抗體能夠中和DKK1且阻斷重組Wnt3a誘導之TCF/LEF螢光素酶活性，如獨立細胞基分析中所見。在此分析中，在4℃下用100 ng/ml重組Wnt3a蛋白質(R&D Systems)誘導MC3T3 E1/STF-螢光素酶穩定細胞株中之Wnt信號傳導30分鐘。隨後用與對照PBS或異二聚抗體之起始於426.7 nM之兩倍連續稀釋液預混合的0.15 ug/ml人類DKK1蛋白質處理細胞。如上所述在24小時之後測定螢光素酶信號且藉由使用PRISM軟體繪製資料。結果指示可變區靶向硬化蛋白之環2區域(亦即SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111)與DKK1兩者之異二聚抗體能夠中和硬化蛋白及DKK1且增加由Wnt3a驅動之報導體活性。 實例5-親本及異二聚抗體之功能分析 對針對硬化蛋白之環2區域之抗硬化蛋白親本抗體(Ab23、Ab5、20C3)及針對非環2抗原決定基之抗硬化蛋白親本抗體(27H6、Ab13、Ab-D、Ab-3)的功能分析揭示各組抗體之獨特作用機制。進行競爭α篩檢結合分析以量測遞增濃度之親本硬化蛋白抗體對含his標籤之LRP6與經生物素標記之人類硬化蛋白之間的相互作用的影響。此分析揭示當結合硬化蛋白之環2區域之抗硬化蛋白抗體強力抑制硬化蛋白與LRP6之間的相互作用時，針對硬化蛋白之非環2區域之抗體使此等蛋白質之間的相互作用增加。此外，工程改造異二聚抗體顯示類似現象，其中不同於針對硬化蛋白之環2區域之異二聚抗體，針對非環2硬化蛋白抗原決定基之異二聚抗體(亦即27H6-6.37.5、6.147-27H6)促進LRP6與硬化蛋白之結合增加。發現所有異二聚抗體皆與人類DKK1競爭結合LRP6。 為瞭解此現象對典型Wnt路徑活化之影響，在使用骨母細胞及293細胞之TCF報導體細胞基分析中研究親本抗體及異二聚抗體。用結合LRP6 β螺旋槳1基元之Wnt1或結合LRP6 β螺旋槳3基元之Wnt3a刺激細胞。典型Wnt路徑活化藉由螢光素酶活性增加加以量度。在分析中，添加硬化蛋白及/或DKK1以抑制報導體活性且研究不同抗硬化蛋白或抗DKK1抗體之中和活性。儘管硬化蛋白抑制Wnt3a驅動之TCF報導體活化，但抗硬化蛋白非環2區域結合抗體(27H6)而非對照環2結合抗體(Ab5及Ab23)增強Wnt3a信號傳導。用含有針對硬化蛋白之非環2區域之抗硬化蛋白可變區的異二聚抗體獲得類似Wnt3a增強結果。相反，藉由硬化蛋白抑制，Wnt1活性由任一抗體恢復，如藉由不超過未處理對照之螢光素酶活性之螢光素酶活性增加所示。此等影響依賴於硬化蛋白之存在，因為在不存在硬化蛋白下，用針對硬化蛋白之非環2區域之異二聚抗體未觀測到增強作用。對其他異二聚抗體之類似分析顯示包含結合硬化蛋白之環2之抗硬化蛋白部分的異二聚抗體未能增強Wnt3a，而含有結合硬化蛋白之非環2區域之可變區的異二聚抗體增強Wnt3a信號傳導。此外，包含結合硬化蛋白之非環2區域之可變區的異二聚抗體在DKK1存在下增強Wnt3a信號傳導，而單特異性非環2異二聚抗體增強作用在DKK1存在下受抑制。在單獨DKK1存在下，所有典型Wnt活化皆受抑制，此與顯示DKK1之C末端區域結合LRP6之β螺旋槳3基元且阻斷Wnt3a類別蛋白質與此區域之相互作用的新近報導(Cheng等人, Nature Structural Mol Biol, 2011; Anh Dev Cell 2011)一致。此等資料表明經由硬化蛋白結合於β螺旋槳域1之抗體-配體複合物可以增加Wnt3a/β螺旋槳3活性之方式影響受體之構形。先前已報導由抗LRP6 β螺旋槳1結合抗體達成之類似Wnt3a依賴性增強現象，其中此等抗體增加癌症細胞株中之促有絲分裂性及腫瘤異種移植物之生長(Ettenberg等人, PNAS 2010)。 亦觀測到由非環2結合抗硬化蛋白抗體在非骨母細胞中達成之Wnt3a增強作用。此結果提升硬化蛋白/非環2結合抗體複合物可活化表現LRP6之任何細胞類型中之Wnt信號傳導的可能性，其限制條件為存在Wnt3類別蛋白質或β螺旋槳3結合蛋白且不存在DKK1。在異二聚抗體之情況下，增強作用可在DKK1存在下發生。基於此等觀測結果且為減小非骨母細胞中之促有絲分裂性之風險，用針對環2區域之在Wnt1骨母細胞TCF報導體分析中顯示使報導體活性強健增加之抗硬化蛋白可變區工程改造新穎異二聚抗體。 此外，結合硬化蛋白之非環2區域之親本抗硬化蛋白抗體不破壞硬化蛋白與其同源LRP受體之相互作用且保持LRP6相互作用或LRP4相互作用。儘管針對硬化蛋白之環2區域之親本硬化蛋白抗體及異二聚抗體抑制LRP6與硬化蛋白之間的相互作用，但其在共免疫沈澱實驗中未能抑制硬化蛋白與LRP4之間的相互作用。相反，含有抗非環2可變域之親本抗體或異二聚抗體皆使LRP4與硬化蛋白之間的結合降低(19D11、27H6、L8及N22)。在IgG2骨架中工程改造新穎異二聚抗體。 實例6-異二聚抗體顯示活體內活性。 以下實例顯示根據實例3及4中所述之方法產生之異二聚抗體在低骨礦物質密度之動物模型中使骨礦物質密度增加。 雄性10週齡B6D2F1小鼠用於此研究中。在研究開始時，將動物分成5組(n = 9/組)，各組在體重與股骨-脛骨區域處之藉由活體內DXA獲得之骨礦物質密度(BMD)兩者方面平衡。每週兩次持續3週用媒劑(脯胺酸)或硬化蛋白-Ab(Scl-Ab)、或DKK1-Ab或Scl-Ab與DKK1-Ab(組合)之組合或異二聚抗體(異Ig)皮下注射小鼠。抗體在12.5 mg/ml下給藥。每週藉由活體內DXA掃描動物以監測腰椎及股骨-脛骨區域處藥物治療之骨合成代謝活性。隨後在研究結束時使小鼠安樂死。收集股骨以藉由μCT進行離體密度測定及進行骨強度分析。 圖1說明以下異二聚抗體之活體內研究設計：(1)Ab23-Ab6.147 v2，(2)Ab5-Ab6.37.5 v1，及(3)Ab5-Ab6.147 v1。Ab-5用作單藥療法對照且DVD Ig 6.147-Ab23(描述於國際公開案第WO 2012/118903號中)用作此研究中之雙特異性抗體對照。由於分子量高於單藥療法對照及異二聚抗體，所以DVD Ig之劑量略微較高(17 mg/kg)。此處必須注意異二聚抗體形式針對各目標為單價，而DVD針對各目標為二價。因此，儘管就體積莫耳濃度而言，給藥含量使得DVD及異二聚抗體(異Ig)相等，但其在結合位點(互補位)之數目方面不同。 圖2比較上述單特異性Ig(Ab5)、雙特異性DVD(6.147-Ab23)及異二聚抗體1、2及3之間的在第3週在小鼠之腰椎及腿中達成的骨物質密度(BMD)增加百分比。 圖2中所示之資料明確顯示異二聚抗體Ab5-6.37.5 v1(異二聚抗體2-「異Ig2」)及785-6.147 v1(異二聚抗體3-「異Ig3」)使骨物質密度增加。然而，在可變域界面(VH/VL)中具有額外電荷配對取代之異二聚抗體Ab23-6.147 v2(異二聚抗體1-「異Ig1」)不增加BMD。預期在可變域中添加其他電荷配對取代將有助於達成輕鏈及重鏈之特定配對(例如Ab5輕鏈與Ab5重鏈配對)。但似乎在此情況下，可變域中之其他電荷配對取代導致異二聚抗體之穩定性不良。在此PD研究之後的PK研究實際上顯示異二聚抗體Ab23-6.147之DKK1臂具有不良活體內穩定性。 實例7-藥物動力學資料 進行四種不同藥物動力學分析(亦即硬化蛋白/DKK1分析；硬化蛋白/Fc分析；DKK1/硬化蛋白分析；及FC/FC橋式ELISA分析)以捕捉並偵測血清樣品中之異二聚抗體。 硬化蛋白/DKK1分析：簡言之，半區域盤用含1 μg/ml人類硬化蛋白之1× PBS塗佈且在4℃下培育隔夜。用I-Block緩衝液阻斷各盤至少1小時。於大鼠血清樣品中製備標準物(Std)及品質控制樣品(QC)。以1:30於緩衝液(1× PBS、1 M NaCl、0.5%吐溫20(tween 20)及10 mg/ml BSA)中稀釋標準物、QC及血清樣品。接著將稀釋Std、QC及樣品裝載入ELISA盤中且培育90分鐘。接著洗滌ELISA盤且添加含200 ng/ml生物素化人類DKK1之緩衝液並培育90分鐘。將盤洗滌且添加200 ng/ml結合有HRP之抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)並培育30分鐘。在將盤洗滌之後，添加TMB受質。在15分鐘之後藉由添加1 M硫酸終止反應。接著藉由SpectraMax盤讀取器讀取盤。硬化蛋白 /FC 分析 ：半區域盤用含1 μg/ml人類硬化蛋白之1× PBS塗佈且在4℃下培育隔夜。用I-Block緩衝液阻斷各盤至少1小時。於大鼠血清樣品中製備標準物(Std)及品質控制樣品(QC)。以1:30於緩衝液(1× PBS、1 M NaCl、0.5%吐溫20及10 mg/ml BSA)中稀釋標準物、QC及血清樣品。接著將稀釋Std、QC及樣品裝載入ELISA盤中且培育90分鐘。接著洗滌ELISA盤且添加10 ng/ml結合有HRP之抗人類Fc抗體Mab 1.35.1並培育90分鐘。在將盤洗滌之後，添加TMB受質。在15分鐘之後藉由添加1 M硫酸終止反應。接著藉由SpectraMax盤讀取器讀取盤。DKK1/FC 分析 ：半區域盤用含1 μg/ml人類DKK1之1× PBS塗佈且在4℃下培育隔夜。用I-Block緩衝液阻斷各盤至少1小時。於大鼠血清樣品中製備標準物(Std)及品質控制樣品(QC)。以1:30於緩衝液(1× PBS、1 M NaCl、0.5%吐溫20及10 mg/ml BSA)中稀釋標準物、QC及血清樣品。接著將稀釋Std、QC及樣品裝載入ELISA盤中且培育90分鐘。接著洗滌ELISA盤且添加10 ng/ml結合有HRP之抗hu Fc抗體Mab 1.35.1並培育90分鐘。在將盤洗滌之後，添加TMB受質。在15分鐘之後藉由添加1 M硫酸終止反應。接著藉由SpectraMax盤讀取器讀取盤。FC/FC 橋式 ELISA 分析 ：簡言之，半區域盤用含0.2 μg/ml抗人類Fc抗體Mab 1.35.1之1 × PBS塗佈並在4℃下培育隔夜。用I-Block緩衝液阻斷各盤至少1小時。於大鼠血清樣品中製備標準物(Std)及品質控制樣品(QC)。以1:30於緩衝液(1 × PBS、1 M NaCl、0.5%吐溫20及10 mg/ml BSA)中稀釋標準物、QC及血清樣品。接著，將稀釋Std、QC及樣品裝載入ELISA盤中且培育90分鐘。接著洗滌ELISA盤且添加50 ng/ml結合有HRP之抗人類Fc抗體Mab 1.35.1並培育30分鐘。在將盤洗滌之後，添加TMB受質。在10分鐘之後藉由添加1 M硫酸終止反應。接著藉由SpectraMax盤讀取器讀取盤。 圖3顯示測試之四種硬化蛋白-DKK1異二聚抗體(亦即Ab23-6.37.5 v1、Ab5-6.37.5 v1、Ab5-6.147 v2及Ab23-6.147 v2)之藥物動力學(PK)概況。結果指示在VH/VL域中包含帶電荷胺基酸取代之異二聚抗體負性影響穩定性，因為基於硬化蛋白/DKK1及DKK1/Fc分析之PK概況偏離硬化蛋白/Fc及Fc/Fc分析之PK概況。 實例8：在產生異二聚抗體期間藉由靜電操縱機制控制輕鏈與其同源重鏈之正確配對 當在一種細胞內部共表現兩種不同抗體時，轉錄且轉譯四個不同鏈(HC1、LC、HC2、LC2)。HC可形成同二聚體或異二聚體；LC可與兩個不同HC一起隨機裝配。可存在十種不同組合[Paul Carter J Immunological Methods 248 (2001) 7-15]。可藉由工程改造CH3區來使源於重鏈同二聚體之非所要副產物最少以僅形成異二聚體。此實例顯示不合需要LC/HC配對可藉由工程改造LC/HC之界面以增強LC與其同源HC之正確配對加以消除。靜電操縱機制用於引導LC/HC之配對及裝配，因為相反極性為吸引性的，而相同極性為排斥性的。 當沿重鏈及輕鏈界面選擇經具有相反極性之帶電荷殘基(例如Asp或Lys)置換以控制LC與其同源HC之正確配對的殘基對時，應用若干準則：1)所有位置在VL/VH界面與CL/CH1界面兩者內均緊密鄰近定位；2)所有位置皆經包埋且在大多數(若非全部)不同抗體家族之中充分保守；3)所有位置對表現及抗原結合皆具有最小影響；及4)引入帶電荷殘基不干擾侶伴蛋白BiP在抗體折疊及裝配過程中結合CH1區。 在VL/VH及Cκ/CH1界面處選擇用於工程改造Her2/EGFR異二聚抗體之殘基列於表2中。在可變區中，VH中之主要Q39(Kabat編號；AHo位置46)、G44(AHo位置51)及Q105(AHo位置141)分別緊密鄰近於VL中之Q38(Kabat編號；AHo位置46)、Q100(AHo位置141)及A43(AHo位置51)。在恆定區中，CH1區中之A141(Eu編號)、P171及S183分別接觸Ck中之殘基F116(Eu編號)、S162及S176，但CH1中之K147(Eu編號)可與Ck區中之Q124、S131或T180(Eu編號)相互作用。 使用來自抗EGFR抗體及抗HER2抗體之v基因構築概念驗證異二聚IgG。圖4顯示構成異二聚抗體變異體之不同組態。一個Fc鏈在CH2域中具有ADCC增強取代S298T + A330M + K334V且在CH3域中具有異二聚化取代K392D + K409D，而另一Fc鏈在下部鉸鏈區及CH2域中具有ADCC增強取代L234Y + K290Y + Y296W以及在CH3域中具有異二聚化取代E356K + D399K。抗體優先形成當以其Fab區特異性結合腫瘤細胞時可誘導強烈ADCC殺傷性之異二聚體。 表2：選擇位於VH/VL及CH1/Cκ界面處之胺基酸殘基用於引入電荷配對殘基。根據不同編號系統對VH及VL之生殖系殘基編號，粗體殘基為主要殘基。大多數抗體之VH/VL中之接觸殘基排列在同一列中。人類IgG1 CH1域之接觸Cκ區中之殘基的殘基亦用粗體表示且置於同一列中。FW：構架。 表2.

VH		VL
IMGT #	Kabat #	Eu #	AHo#	FW	殘基	接觸	IMGT #	Kabat #	Eu #	AHo#	FW	殘基
44	39	39	46	2	Q/ r/t	↔	44	38	38	46	2	Q/ G/H/L
49	44	44	51	2	G /R/A	↔	*	100	100	141	4	Q G /P
*	105	109	141	4	Q/ k/r/ s	↔	49	43	43	51	2	A/G/S/ P
CH 1		Ck
IMGT#	Kabat#	Eu#	AHo#	Ref #	殘基	接觸	IMGT #	Kabat #	Eu#	AHo#	Ref#	殘基
20	139	141	*	176	A	↔	5	116	116	*	158	F
82	175	171	*	212	P	↔	81	162	162	*	211	S
86	188	183	*	230	S	↔	86	176	176	*	230	S
26	145	147	*	182	K	↔	13	124	124	*	166	Q
26	145	147	*	182	K	↔	20	131	131	*	176	S
26	145	147	*	182	K	↔	90	180	180	*	234	T

在一概念驗證研究中，將Fn3標籤(12 KDa)插入在抗EGFr Ab2 HC之N末端處且使Fn3-Flag-His6標籤(14 KDa)同框融合於抗EGFr Ab2 LC之C末端，因此LC/HC之4種不同組合可在SDS-PAGE凝膠中根據不同尺寸加以區分：所要LC1/HC1::LC2-Fn3-FH/Fn3-HC2或非所要LC2-Fn3-FH/HC1::LC1/Fn3-HC2為176 KDa；非所要LC1/HC1:: LC1/Fn3-HC2為162 KDa；且非所要LC2-Fn3-FH/HC1::LC2-Fn3-FH/Fn3-HC2為190 KDa。176 KDa產物之組合物隨後在部分還原下藉由質譜加以確定。雙抗原結合盤ELISA用於篩檢具有較佳LC/HC配對之有利變異體。 研究不同變異體(表3)以獲得雙抗原結合性最高及LC/HC配對正確之最佳組合。當相較於不產生任何結合信號之單特異性抗Her2 Ab1(C01)或抗EGFr Ab2(C07)、及由LC/HC隨機配對之四個規則鏈構成之內部對照C11時，變異體1C02、1C04、2A05、2B04、2B05及5D03顯示與雙抗原(Her2及EGFr細胞外域)之結合以劑量依賴性方式改良。變異體2B05及5D03具有最強烈結合，因為曲線向左移動最多。在SDS-PAGE凝膠中，此等變異體亦主要形成全長異二聚體IgG1。表現測試指示添加調節劑XBP1略微加強異二聚抗體變異體之表現量，而另一調節劑ERP23很少加強表現。 表3：藉由靜電操縱機制製備之變異體。呈異二聚IgG1形式之抗Her2 Ab1及抗EGFr Ab2之VH/VL及CH1/CL界面的胺基酸變化，其中Ab1之HC在CH2域中具有S298T+A330M+K334V且在CH3域中具有K392D+K409D；Ab2之HC在下部鉸鏈及CH2域中具有L234Y+K209Y+Y296W且在CH3域中具有E356K+D399K。將Fn3標籤插入在抗EGFr Ab2 HC之N末端處且使Fn3-Flag-His6標籤同框融合於抗EGFr Ab2 LC之C末端。可變區(VH或VL)中之殘基係根據Kabat編號系統來編號，而恆定區(CH1或CL)中之殘基係根據Eu編號系統來編號。

	抗 Her2 Ab1 HC (K392D + K409D)	抗 Her2 Ab1 LC	抗 EGFr Ab2 HC (E356K + D399K)	抗 EGFr Ab2 LC
變 異 體	VH1	CH1	VL1	CL	VH2	CH1	VL2	CL
C12	Q39K+G44K		Q38D+ Q100D		Q39D+G44D		Q38K+ G100K
C13	Q39K+G44K		Q38D+ Q100D		Q39D+Q105D		Q38K+ A43K
C14	Q39K+G44K		Q38D+ Q100D		G44D+Q105D		G100K+A43K
C15	Q39K+Q105K		Q38D+ A43D		Q39D+G44D		Q38K+ G100K
C16	Q39K+Q105K		Q38D+ A43D		Q39D+Q105D		Q38K+ A43K
C17	Q39K+Q105K		Q38D+ A43D		G44D+Q105D		G100K+A43K
C18	G44K+Q105K		Q100D+A43D		Q39D+G44D		Q38K+G100K
C19	G44K+Q105K		Q100D+A43D		Q39D+Q105D		Q38K+A43K
C20	G44K+Q105K		Q100D+A43D		G44D+Q105D		G100K+A43K
1A01		K147K + S183K		Q124D+S176D		K147D + S183D		Q124K + S176K
1A02		K147K + S183K		Q124D+S176D		K147D + S183D		S131K + S176K
1A03		K147K + S183K		Q124D+S176D		K147D + S183D		S176K + T180K
1A04		K147K + S183K		S131D+S176D		K147D + S183D		Q124K + S176K
1A05		K147K + S183K		S131D+S176D		K147D + S183D		S131K + S176K
1A06		K147K + S183K		S131D+S176D		K147D + S183D		S176K + T180K
1B01		K147K + S183K		S176D+T180D		K147D + S183D		Q124K + S176K
1B02		K147K + S183K		S176D+T180D		K147D + S183D		S131K + S176K
1B03		K147K + S183K		S176D+T180D		K147D + S183D		S176K + T180K
1B04	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	Q124K + S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	Q124D + S176D

1B05	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	Q124K + S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S131D + S176D
1B06	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	Q124K + S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D + T180D
1C01	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	S131K + S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	Q124D + S176D
1C02	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	S131K + S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S131D + S176D
1C03	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	S131K + S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D + T180D
1C04	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	S176K + T180K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	Q124D + S176D
1C05	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	S176K + T180K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S131D + S176D
1C06	Q39K+Q105K	K147D + S183D	Q38D + A43D	S176K + T180K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D + T180D
1D01		K147K		Q124D		K147D		Q124K
1D02		K147K		Q124D		K147D		S131K
1D03		K147K		Q124D		S183D		S176K
1D04		K147K		S131D		K147D		Q124K
1D05		K147K		S131D		K147D		S131K
1D06		K147K		S131D		S183D		S176K
2A01		S183K		S176D		K147D		Q124K
2A02		S183K		S176D		K147D		S131K
2A03		S183K		S176D		S183D		S176K
2A04	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	Q124K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	Q124D
2A05	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	Q124K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
2A06	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	Q124K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D
2B01	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	Q124D
2B02	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
2B03	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D
2B04	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	Q124D
2B05	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
2B06	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D
2C01	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	Q124D
2C02	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
2C03	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D
5A01	Q39K+Q105K	A141D	Q38D + A43D	F116K	Q39D + Q105D	A141K	Q38K + A43K	F116D
5A02	Q39K+Q105K	A141D	Q38D + A43D	F116K	Q39D + Q105D	P171K	Q38K + A43K	S162D
5A03	Q39K+Q105K	A141D	Q38D + A43D	F116K	Q39D + Q105D	K147K	Q38K + A43K	S131D
5A04	Q39K+Q105K	A141D	Q38D + A43D	F116K	Q39D + Q105D	S183K	Q38K + A43K	S176D
5A05	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	Q39D + Q105D	A141K	Q38K + A43K	F116D
5A06	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	Q39D + Q105D	P171K	Q38K + A43K	S162D
5B01	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	Q39D + Q105D	K147K	Q38K + A43K	S131D
5B02	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	Q39D + Q105D	S183K	Q38K + A43K	S176D
5B03	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	Q39D + Q105D	A141K	Q38K + A43K	F116D
5B04	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	Q39D + Q105D	P171K	Q38K + A43K	S162D
5B05	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	Q39D + Q105D	K147K	Q38K + A43K	S131D
5B06	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	Q39D + Q105D	S183K	Q38K + A43K	S176D
5C01	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	Q39D + Q105D	A141K	Q38K + A43K	F116D
5C02	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	Q39D + Q105D	P171K	Q38K + A43K	S162D
5C03	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	Q39D + Q105D	K147K	Q38K + A43K	S131D
5C04	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	Q39D + Q105D	S183K	Q38K + A43K	S176D
5C05	Q39K+Q105K	A141D	Q38D + A43D	F116K	G44D + Q105D	A141K	G100K + A43K	F116D
5C06	Q39K+Q105K	A141D	Q38D + A43D	F116K	G44D + Q105D	P171K	G100K + A43K	S162D
5D01	Q39K+Q105K	A141D	Q38D + A43D	F116K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
5D02	Q39K+Q105K	A141D	Q38D + A43D	F116K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D
5D03	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	G44D + Q105D	A141K	G100K + A43K	F116D
5D04	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	G44D + Q105D	P171K	G100K + A43K	S162D
5D05	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
5D06	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D
6A01	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	G44D + Q105D	A141K	G100K + A43K	F116D
6A02	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	G44D + Q105D	P171K	G100K + A43K	S162D
6A03	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
6A04	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	S131K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D
6A05	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	G44D + Q105D	A141K	G100K + A43K	F116D
6A06	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	G44D + Q105D	P171K	G100K + A43K	S162D
6B01	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
6B02	Q39K+Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D

藉由短暫轉染HEK 2936E細胞來製備變異體1C02、1C04、2A05、2B05及5D03，且用蛋白質A管柱純化，接著用Superdex 200粒徑排阻管柱精製。自900 mL上清液，藉由分析型SEC獲得1.2~6.8 mg純度約100%之最終產物。在非還原SDA-PAGE凝膠中(圖4，左側)，所有變異體皆具有極主要全長IgG1，其中Fn3標籤插入在抗EGFr Ab2 HC之N末端處且Fn3-Flag-His6標籤同框融合於抗EGFr Ab2 LC之C末端。變異體2B05及5D03之純度最大，伴有極少量較小亮帶。在還原條件下，歸因於其不同尺寸分離四個不同鏈(Fn3-HC2在61 KDa處；HC1在50 KDa處；LC2-Fn3-Flag-His6在36 KDa處；LC1在23 KDa處)。四個不同鏈顯示在裝配之全長IgG1抗體中為1:1:1:1比率。藉由質譜確認組分及正確LC/HC配對。 實例9-Her2/EGFR異二聚抗體維持親本抗體之阻斷功能 此實例顯示實例7中所述之異二聚抗體維持製備其所始於之個別抗體之阻斷功能。此外，異二聚抗體能夠介導針對目標表現性細胞之ADCC。 除雙抗原結合之外，選擇變異體2B05及5D03以藉由細胞基分析測試其功能性。CHO細胞株用人類EGFr穩定轉染。當在培養基中添加配體EGF時，CHO細胞表面上之受體EGFr經活化且經磷酸化，從而打開下游信號路徑，諸如MAPK、ERK1/2、PI3K、JAK/STAT及PKC。2B05及5D03所源於之抗EGFr抗體阻斷配體EGF結合受體EGFr且在IC50 = 2.7 nM下抑制受體EGFr磷酸化。抗EGFr抗體與抗Her2抗體之組合在IC50 = 3.2 nM下類似地起作用。抗EGFr×Her2異二聚抗體變異體2B05與5D03兩者在受體EGFr磷酸化方面類似，IC50分別為4.2 nM及4.6 nM，從而指示異二聚抗體變異體2B05及5D03之抗EGFr Fab臂之作用與野生型抗EGFr抗體類似。 BT474為一種人類乳房腫瘤細胞株。BT474細胞在表面上表現Her2(Erb2)與Her3(Erb3)兩者。抗Her2抗體可結合Her2之域IV，從而觸發受體內化及降解[Wehrman TS,等人 (2006) PNAS 103(50):19063-19068及Buschenfelde CM等人 (2002) Cancer Res 62(8):2244-2247]。因此，抗體阻斷下游信號傳導路徑[Yakes FM,等人 (2002) Cancer Res 62(14):4132-4141及Scotti ML等人 (2008) Breast Cancer Res Treat 111(2):241-50]，諸如Raf/MEK 1及2/ERK 1及2及PI3K/Akt路徑。在BT474細胞中，抗Her2抗體不降低Her2磷酸化但抑制基底Her3磷酸化。當不在BT474細胞培養基中添加配體時，單獨Her2抗體在IC50 = 2.8 nM下阻斷Her3磷酸化。抗EGFr抗體與抗Her2抗體之組合在IC50 = 5.2 nM下類似地起作用。抗EGFr×Her2異二聚抗體變異體2B05與5D03兩者分別在IC50 = 3.0 nM及IC50 = 3.6 nM下抑制受體Her3基底程度磷酸化，從而指示抗Her2臂在起作用。 以上兩種不同細胞基分析之組合資料表明抗EGFr×Her2異二聚抗體變異體2B05及5D03之兩個臂在抑制EGFr及Her2之活化方面均恰當地起作用。 實例10-Her2/EGFR異二聚抗體能夠介導對腫瘤細胞之ADCC殺傷 N87為一種表現高含量Her2及中等含量EGFr之人類胃腫瘤細胞株。無關人類IgG1用作對照。抗EGFr×Her2異二聚抗體變異體2B05及5D03已在其Fc區中併入ADCC增強取代及異二聚化取代。進行ADCC分析以測試異二聚抗體變異體是否結合其特定抗原且誘導對N87細胞之殺傷。在1 μg/mL下，無關人類IgG1對照抗體具有本底溶解30%且在其經向下滴定時不顯示劑量依賴性反應。變異體2B05與5D03兩者在1 μg/mL濃度下均具有高得多之特異性溶解且以EC50分別為0.10 pM及0.19 pM顯示劑量依賴性反應。資料顯示異二聚抗體變異體2B05及5D03可結合目標EGFr及Her2，且藉由嚙合NK細胞來誘導對N87細胞之強烈殺傷。 實例11-替代性變異體亦可指導正確LC/HC配對 靜電操縱可與其他操縱技術組合。舉例而言，探究用一對半胱胺酸殘基置換VH/VL界面中之一對帶電荷殘基。該對半胱胺酸殘基緊密鄰近(4~5.6 Å)以形成二硫鍵，因此鎖定正確配對之LC/HC。藉由短暫轉染哺乳動物2936E細胞進行基於變異體2B05之電荷配對及Cys-Cys配對的七種不同組合(表4)。藉由SDS-PAGE凝膠分離上清液。儘管內部對照C11顯示介於148 KDa與250 KDa之間的四個不同亮帶，但變異體2C04及2C06主要產生全長IgG1；在各別Fab臂中之Q105C-A43C及G44C-G100C處具有不同二硫鍵之變異體2D04僅裝配成全長IgG1抗體，從而暗示電荷配對殘基及半胱胺酸配對殘基之組合可合作起作用以製備正確配對且折疊之異二聚抗體。 表4：藉由在可變區中組合電荷配對殘基及半胱胺酸配對殘基製備之變異體。可變區(VH或VL)中之殘基係根據Kabat編號系統來編號，而恆定區(CH1或CL)中之殘基係根據Eu編號系統來編號。將Fn3標籤插入在抗EGFr Ab2 HC之N末端處且使Fn3-Flag-His6標籤同框融合於抗EGFr Ab2 LC之C末端。

	抗 Her2 Ab1 HC (K392D + K409D)	抗 Her2 Ab1 LC	抗 EGFr Ab2 HC (E356K + D399K)	抗 EGFr Ab2 LC
變異體	VH1	CH 1	VL1	CL	VH2	CH 1	VL2	CL
2C04	Q39C + Q105K	K147D	Q38C + A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
2C05	Q39K+ Q105C	K147D	Q38D + A43C	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
2C06	Q39K + Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	G44C + Q105D	K147K	G100C + A43K	S131D
2D01	Q39K + Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	G44D + Q105C	K147K	G100K + A43C	S131D
2D02	Q39C + Q105K	K147D	Q38C + A43D	T180K	G44C + Q105D	K147K	G100C + A43K	S131D
2D03	Q39C + Q105K	K147D	Q38C + A43D	T180K	G44D + Q105C	K147K	G100K + A43C	S131D
2D04	Q39K + Q105C	K147D	Q38D + A43C	T180K	G44C + Q105D	K147K	G100C + A43K	S131D

亦測試用一對大/小殘基置換VH/VL界面中之一對帶電荷殘基[Zamyatnin AA (1972) Prog. Biophos. Mol. Biol. 24:107-123；Chothia C (1975) J. Mol. Biol. 105:1-14]。大/小殘基對可施加鈕入孔效應，從而在靜電操縱機制之組合中引導正確LC/HC配對。大殘基，例如色胺酸(W)具有體積227.8 Å3及可及表面積255 Å2；酪胺酸(Y)具有體積193.6 Å3及可及表面積230 Å2。小殘基丙胺酸(A)僅具有體積88.6 Å3及可及表面積115 Å2，而絲胺酸(S)類似地具有體積89 Å3及可及表面積115 Å2。製備且藉由西方墨點術測試基於異二聚抗體變異體2B05之一系列64個變異體(表5)。在藉由SDS-PAGE凝膠分離之後，變異體3A01、3A02、3A03、3A04、3A05、3A06、3B01、3B02、3B03、3B04、8A03及8A04僅顯示單一亮帶，從而指示四個不同鏈可裝配成全長異二聚抗體。在藉由SDS-PAGE凝膠分離之後，其他變異體具有多個亮帶，表明此等LC在與其同源HC配對方面可具有一些問題。 表5. 藉由在可變區中組合電荷配對殘基及大/小配對殘基製備之變異體。此處大殘基表示色胺酸(W)或酪胺酸(Y)，而小殘基表示丙胺酸(A)或絲胺酸(S)。可變區(VH或VL)中之殘基係根據Kabat編號系統來編號，而恆定區(CH1或CL)中之殘基係根據Eu編號系統來編號。將Fn3標籤插入在抗EGFr Ab2 HC之N末端處且使Fn3-Flag-His6標籤同框融合於抗EGFr Ab2 LC之C末端。

	抗 Her2 Ab1 HC (K392D + K409D)	抗 Her2 Ab1 LC	抗 EGFr Ab2 HC (E356K + D399K)	抗 EGFr Ab2 LC
變異體	VH1	CH1	VL1	CL	VH2	CH1	VL2	CL
3A01	Q39A + Q105K	K147D	Q38W + A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3A02	Q39A + Q105K	K147D	Q38Y + A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3A03	Q39S + Q105K	K147D	Q38W + A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3A04	Q39S + Q105K	K147D	Q38Y+ A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3A05	Q39K + Q105A	K147D	Q38D+ A43W	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3A06	Q39K + Q105A	K147D	Q38D+ A43Y	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3B01	Q39K + Q105S	K147D	Q38D+ A43W	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3B02	Q39K + Q105S	K147D	Q38D+ A43Y	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3B03	Q39W + Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3B04	Q39W + Q105K	K147D	Q38S+ A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3B05	Q39Y + Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3B06	Q39Y + Q105K	K147D	Q38S+ A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3C01	Q39K + Q105W	K147D	Q38D+ A43S	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3C02	Q39K + Q105Y	K147D	Q38D+ A43S	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
3C03	Q39A + Q105K	K147D	Q38W + A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3C04	Q39A + Q105K	K147D	Q38Y + A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3C05	Q39S + Q105K	K147D	Q38W + A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3C06	Q39S + Q105K	K147D	Q38Y+ A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3D01	Q39K + Q105A	K147D	Q38D+ A43W	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3D02	Q39K + Q105A	K147D	Q38D+ A43Y	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3D03	Q39K + Q105S	K147D	Q38D+ A43W	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3D04	Q39K + Q105S	K147D	Q38D+ A43Y	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3D05	Q39W + Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
3D06	Q39W + Q105K	K147D	Q38S+ A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
4A01	Q39Y + Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
4A02	Q39Y + Q105K	K147D	Q38S+ A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
4A03	Q39K + Q105W	K147D	Q38D+ A43S	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
4A04	Q39K + Q105Y	K147D	Q38D+ A43S	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
7A01	Q39A+ Q105K	K147D	Q38W+ A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7A02	Q39A+ Q105K	K147D	Q38Y+ A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7A03	Q39S+ Q105K	K147D	Q38W+ A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7A04	Q39S+ Q105K	K147D	Q38Y+ A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7A05	Q39K+ Q105A	K147D	Q38D+ A43W	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7A06	Q39K+ Q105A	K147D	Q38D+ A43Y	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7B01	Q39K+ Q105S	K147D	Q38D+ A43W	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7B02	Q39K+ Q105S	K147D	Q38D+ A43Y	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7B03	Q39W+ Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7B04	Q39W+ Q105K	K147D	Q38S+ A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7B05	Q39Y+ Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7B06	Q39Y+ Q105K	K147D	Q38S+ A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7C01	Q39K+ Q105W	K147D	Q38D+ A43S	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7C02	Q39K+ Q105Y	K147D	Q38D+ A43S	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
7C03	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44A + Q105D	K147K	G100W + A43K	S131D
7C04	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44A + Q105D	K147K	G100Y + A43K	S131D
7C05	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44S + Q105D	K147K	G100W + A43K	S131D
7C06	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44S + Q105D	K147K	G100Y + A43K	S131D
7D01	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44D + Q105A	K147K	G100K + A43W	S131D
7D02	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44D + Q105A	K147K	G100K + A43Y	S131D
7D03	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44D + Q105S	K147K	G100K + A43W	S131D
7D04	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44D + Q105S	K147K	G100K + A43Y	S131D
7D05	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44W+ Q105D	K147K	G100A + A43K	S131D
7D06	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44W+ Q105D	K147K	G100S + A43K	S131D
8A01	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44Y+ Q105D	K147K	G100A + A43K	S131D
8A02	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44Y+ Q105D	K147K	G100S + A43K	S131D
8A03	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44D + Q105W	K147K	G100K + A43S	S131D
8A04	Q39K + Q105K	K147D	Q38D+ A43D	T180K	G44D + Q105Y	K147K	G100K + A43S	S131D
8A05	Q39A+ Q105K	K147D	Q38W+ A43D	T180K	G44W + Q105D	K147K	G100A + A43K	S131D
8A06	Q39A+ Q105K	K147D	Q38W+ A43D	T180K	G44Y + Q105D	K147K	G100A + A43K	S131D
8B01	Q39A+ Q105K	K147D	Q38W+ A43D	T180K	G44W + Q105D	K147K	G100S + A43K	S131D
8B02	Q39A+ Q105K	K147D	Q38W+ A43D	T180K	G44Y + Q105D	K147K	G100S + A43K	S131D
8B03	Q39W+ Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44A + Q105D	K147K	G100W + A43K	S131D
8B04	Q39W+ Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44A + Q105D	K147K	G100Y + A43K	S131D
8B05	Q39Y+ Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44A + Q105D	K147K	G100W + A43K	S131D
8B06	Q39Y+ Q105K	K147D	Q38A+ A43D	T180K	G44A + Q105D	K147K	G100Y + A43K	S131D

實例12-在不存在標籤下使異二聚抗體最佳化 移除抗EGFr x Her2變異體2B05及5D03之標籤且藉由用四種DNA轉染哺乳動物2936E細胞以製備全長抗體或僅用兩種DNA轉染哺乳動物2936E細胞以評估錯配LC/HC配對之耐受性加以測試。當存在所有四個不同鏈時，兩種變異體均產生全長抗體，伴有大量半抗體。用編碼匹配LC1+HC1或LC2+HC2之兩種質體進行轉染亦產生全長同二聚體抗體，伴有大量半抗體。當LC2與其非同源HC1錯誤配對(LC2+HC1)時，存在少量產物顯示於凝膠中，而當LC1與其非同源HC2錯誤配對(LC1+HC2)時，不形成產物。表現測試暗示抗EGFr抗體之LC2耐受抗Her2抗體之HC1，而抗Her2抗體之LC1不耐受抗EGFr抗體之HC2。為使靜電操縱效應最大，藉由在相同空間位置處，但以相反極性引入電荷配對殘基來研究一系列新穎變異體(表6)。LC/HC界面互為相反的，當相同極性殘基靠近時為排斥的，或當相反極性殘基鄰近時為吸引的。 在轉錄且轉譯四個不同鏈之後，變異體V15及V20主要表現為完整抗體。在匹配HC/LC(亦即LC1+HC1或LC2+HC2)存在下，產生半抗體及同二聚體全長抗體。當錯配HC/LC(例如LC2+HC1)經共表現時，未觀測到產物，表明LC2不可與HC1相容。然而，LC1由HC2耐受以形成半抗體或同二聚體抗體，從而暗示V15及V20之LC1可與非同源HC2配對且得以裝配，接著分泌。相反，在轉錄且轉譯四個不同鏈之後，變異體V21、V23及V25主要表現為完整抗體。在兩個匹配鏈(亦即LC1+HC1或LC2+HC2)存在下，產生完整IgG抗體，從而指示LC可與其同源HC相容。在錯配LC2+HC1或LC1+HC2存在下，不形成產物，表明LC不耐受非同源HC。變異體V22不如同V21、V23及V25一般有效，因為當迫使錯配LC與非同源HC配對時觀測到次要產物。質譜分析顯示變異體V12、V21、V23及V25存在四個不同鏈(LC1+HC1+LC2+HC2)及正確LC/HC配對(LC1+HC1及LC2+HC2)。 表6. 呈異二聚IgG1形式之抗Her2 Ab1及抗EGFr Ab2之VH/VL及CH1/CL界面的採用相互排斥/吸引機制之胺基酸變化。抗Her2 Ab1之HC在CH2域中具有S298T+A330M+K334V且在CH3域中具有K392D+K409D；抗EGFr Ab2之HC在下部鉸鏈/CH2域中具有L234Y+K209Y+Y296W且在CH3域中具有E356K+D399K。可變區(VH或VL)中之殘基係根據Kabat編號系統來編號，而恆定區(CH1或CL)中之殘基係根據Eu編號系統來編號。

	抗 Her2 Ab1 HC (K392D + K409D)	抗 Her2 Ab1 LC	抗 EGFr Ab2 HC (E356K + D399K)	抗 EGFr Ab2 LC
變異體	VH1	CH1	VL1	CL	VH2	CH1	VL2	CL
V01	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	G44D + Q105D	K147K	G100K + A43K	S131D
V02*	Q39K+Q105C	K147D	Q38D + A43C	T180K	G44C + Q105D	K147K	G100C + A43K	S131D
V03	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	G44D + Q105D	A141K	G100K + A43K	F116D
V04	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	Q105D	A141K	A43K	F116D
V05	Q39K+Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	Q39D + Q105D	A141K	Q38K + A43K	F116D
V06	Q39K+Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	G44D + Q105D		G100K + A43K
V07	Q39K	P171D	Q38D	S162K	Q39D	A141K	Q38K	F116D
V08	Q39K	A141D	Q38D	F116K	Q39D	P171K	Q38K	S162D
V09	Q39K	A141D	Q38D	F116K	Q39D	A141K	Q38K	F116D
V10	Q39K	P171D	Q38D	S162K	Q39D	P171K	Q38K	S162D
V11	Q105K	A141D	A43D	F116K	Q105D	A141K	A43K	F116D
V12	Q105K	P171D	A43D	S162K	Q105D	P171K	A43K	S162D
V13	Q105K	A141D	A43D	F116K	Q105D	P171K	A43K	S162D
V14	Q105K	P171D	A43D	S162K	Q105D	A141K	A43K	F116D
V15	Q39K	S183D	Q38D	S176K	Q39D	S183K	Q38K	S176D
V16	Q105K	S183D	A43D	S176K	Q105D	S183K	A43K	S176D
V17	Q39K	S183D	Q38D	S176K	Q105D	S183K	A43K	S176D
V18	Q105K	S183D	A43D	S176K	Q39D	S183K	Q38K	S176D
V19	Q39K	A141D + S183K	Q38D	F116K + S176D	Q39D	A141K + S183D	Q38K	F116D + S176K
V20	Q39K	A141D + P171K	Q38D	F116K + S162D	Q39D	A141K + P171D	Q38K	F116D + S162K
V21	Q39K+ Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	Q39D + Q105D	K147K	Q38K + A43K	T180D
V22	Q39K+ Q105K	K147D	Q38D + A43D	T180K	Q39D + Q105D	K147K	Q38K + A43K	S131D
V23	Q39K+ Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	Q39D + Q105D	S183K	Q38K + A43K	S176D
V24	Q39K+ Q105K	P171D	Q38D + A43D	S162K	Q39D + Q105D	P171K	Q38K + A43K	S162D
V25	G44K + Q105K	S183D	Q100D + A43D	S176K	G44D + Q105D	S183K	G100K + A43K	S176D

實例13-最佳化EGFR/Her2異二聚抗體變異體顯示熱穩定性 藉由示差掃描熱析法(DSC)評估抗EGFr IgG2、抗Her2 IgG1、抗Her2去海藻糖基化IgG1及四種抗EGFr×Her2異二聚抗體變異體在相同溶劑條件下的溫度誘導展開。各蛋白質之熱分析圖由2或3個變遷組成。野生型抗Her2抗體顯示Fab/CH3之Tm在82℃下且CH2之Tm在72℃下；抗Her2抗體之無海藻糖基化形式不改變各別域之Tm但使焓略微降低。抗EGFr抗體具有類似溫度誘導展開概況。所有四種抗EGFr×Her2異二聚抗體變異體皆具有略微降低之在68℃下之CH2/CH3 Tm，因為其皆在CH2域中具有ADCC增強取代且在CH3域中具有異二聚化取代。就Fab域之Tm而言，變異體V12及V24具有自82℃至72℃之最大顯著降低；變異體V25具有在72℃及78℃下之兩個各別峰，而變異體V23具有在78℃下之單一峰。總之，四種異二聚抗體變異體顯示良好熱穩定性。資料表明所選用於在Fab區中引入電荷配對殘基之位置在某種程度上影響完整異二聚抗體之穩定性，其中各別域之Tm高於68℃。 實例14-靶向同一抗原之兩個不同抗原決定基之異二聚抗體 為顯示製備異二聚抗體之相同方法可應用於不同抗體，自兩種不同抗Her2抗體產生異二聚IgG。一種抗體結合Her2之域IV而另一結合Her2之域II。藉由用四種DNA轉染以製備全長抗體或僅用兩種DNA轉染以評估錯配LC/HC配對之耐受性來測試以相反方式引入VH/VL中之兩對電荷殘基及CH1/CL中之一對電荷殘基的變異體V23(表6)。類似於抗EGFr x Her異二聚抗體變異體V23，在轉譯且裝配四個不同鏈之後，抗Her2 x Her2異二聚抗體V23主要表現為完整抗體。在兩個匹配鏈(亦即LC1+HC1或LC2+HC2)存在下，產生半抗體及同二聚體抗體，從而指示LC可與其同源HC相容。在錯配鏈LC2+HC1或LC1+HC2存在下，完全不形成產物，表明LC不耐受其非同源HC。 實例15-帶電荷殘基之不同組合影響異二聚抗體表現及LC/HC配對 為研究電荷殘基之不同組合是否產生不同表現量或影響LC/HC配對，藉由在相同位置處以不同組合引入電荷配對殘基(表7)來製備若干抗Her2 x Her2異二聚抗體變異體。儘管V23B如同V23A一般具有正確LC/HC配對，但完整抗體或半抗體形式之表現量下降。然而，V23C及V23D耐受LC/HC錯配。總之，此組資料表明靜電操縱不為指導正確LC/HC配對之唯一因素；諸如形狀互補性之其他機制可在過程中起作用。 表7. 在VH/VL及CH1/CL界面之相同位置處之不同電荷配對組合的比較。可變區(VH或VL)中之殘基係根據Kabat編號系統來編號，而恆定區(CH1或CL)中之殘基係根據Eu編號系統來編號。抗Her2 Ab1之HC在CH2域中具有ADCC增強取代S298T+A330M+K334V且在CH3域中具有異二聚化變化K392D+K409D；抗Her2 Ab2之HC在下部鉸鏈/CH2域中具有ADCC增強取代L234Y+K209Y+Y296W且在CH3域中具有異二聚化變化E356K+D399K。

	抗 Her2 Ab1 HC (K392D + K409D)	抗 Her2 Ab1 LC	抗 Her2 Ab2 HC (E356K + D399K)	抗 Her2 Ab2 LC
變異體	VH1	CH1	VL1	CL	VH2	CH1	VL2	CL
V23A	Q39K+ Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K	Q39D + Q105D	S183K	Q38K + A43K	S176D
V23B	Q39D+ Q105K	S183K	Q38K + A43D	S176D	Q39K + Q105D	S183D	Q38D + A43K	S176K
V23C	Q39K+ Q105D	S183K	Q38D + A43K	S176D	Q39D + Q105K	S183D	Q38K + A43D	S176K
V23D	Q39D+ Q105D	S183K	Q38K + A43K	S176D	Q39K + Q105K	S183D	Q38D + A43D	S176K

實例16-穩定性及黏度研究 對包含本文所述之代表性異二聚抗體之組合物進行穩定性研究，且將抗體組合物之特徵與類似DVD(雙可變域)抗體組合物進行比較。抗體樣品於A52Su調配物(亦即10 mM乙酸鹽、9%蔗糖，pH 5.2)中儲存在4℃或40℃下兩週或兩個月之時期。使用例如SE-HPLC、CEX-HPLC、HIAC(次可見粒子)及目視檢查將抗體聚集量測為穩定性之替代物。結果以單體峰之百分比形式(亦即100%將指示未觀測到聚集)概述於表8中。 表8.

抗體類型	抗體名稱	在4℃下持續兩週之單體峰%	在40℃下持續兩週之單體峰%
異Ig	Ab-5-6.147v1	99.2	95.3
異Ig	Ab-23-6.147v1	99.6	98.0
異Ig	Ab-23-6.147v2	99.7	98.7
異Ig	Ab-5-6.37.5v1	99.6	96.1
異Ig	Ab-23-6.37.5v1	99.6	98.7
DVD	Ab-23-6.147	N/A	62
DVD	Ab-5-6.147	N/A	15
DVD	Ab-23-6.37.5	N/A	89
DVD	Ab-20C3-6.147	N/A	53

如藉由表8中所述之結果所顯示，相較於當儲存在類似條件下時A52Su中11%-85%之DVD抗體形成聚集體的測試DVD抗體，當在40℃下儲存兩週時，A52Su中小於5%之異Ig抗體形成聚集體。當在4℃下儲存兩週時，小於1%之測試異Ig抗體形成聚集體。 進行單獨研究以研究A52Su調配物中之DVD及異二聚抗體之黏度與不同濃度(70 mg/mL或150 mg/mL)之間的關係。使用具有錐/板幾何尺寸之流變儀(RV III+型，Brookfield Engineering Labs公司, Middleboro, Mass.)量測黏度。在量測期間用水浴維持樣品溫度在25℃下。主軸速度在15至125 rpm之範圍內，增量為10 rpm。用Rheocalc™軟體第2.7版進行資料收集。於A52Su調配物中測試之各種抗體之黏度量測結果以下提供於表9中。 表9.

抗體類型	抗體名稱	在70 mg/mL下之黏度(cP)	在150 mg/mL下之黏度(cP)
異Ig	Ab-5-6.147v1	4.5	35.7
異Ig	Ab-23-6.147v1	3.5	15.6
異Ig	Ab-23-6.147v2	4.2	16.8
異Ig	Ab-5-6.37.5v1	3.1	51.5
異Ig	Ab-23-6.37.5v1	2.1	13.7
DVD	Ab-23-6.147	4.3	94
DVD	Ab-5-6.147	4.4	65
DVD	Ab-23-6.37.5	4.6	43
DVD	Ab-20C3-6.147	4.6	15

如表9中所示，包含測試異二聚抗體或DVD抗體(70 mg/mL)之一的各組合物之黏度小於6 cP。當異二聚抗體在濃度150 mg/mL下存在於組合物中時，三種組合物之黏度小於17 cP。與異二聚抗體調配物不同，當DVD抗體在濃度150 mg/mL下存在時，僅一種DVD抗體調配物之黏度小於16 cP。 上述實例顯示本文所述之異二聚抗體比測試之雙特異性DVD抗體更穩定(亦即當在4℃下儲存兩週時，組合物中小於1%之抗體形成聚集體)。包含此等異二聚抗體之調配物亦滿足較佳黏度規範，且因此特別適於大規模製造。 實例17-靶向硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體促進靈長類動物中之骨合成代謝 為顯示靶向硬化蛋白及DKK1之異二聚抗體促進靈長類動物中之骨合成代謝，在40隻未處理4至6歲雌性食蟹獼猴中進行9週PK/PD研究。將動物分成三組，各組投與不同異二聚抗體。 每兩週向各組動物投與總計三次劑量(第1天及第15天投與IV劑量25 mg/kg，隨後在第43天投與一次25 mg/kg皮下劑量)。歷經研究之過程數次抽取血液。短暫離心、等分且冷凍血清以供隨後分析。對照包括未治療動物及用單一抗硬化蛋白抗體(Ab-5)或針對硬化蛋白及DKK1之中和異二聚抗體(形式1)或針對硬化蛋白及DKK1之雙可變域(DVD)抗體(6.147-AbL-Ab23)治療之動物。在基線時使用血清骨形成標記物量測結果(CICP、BSAP及骨鈣蛋白)及體重將所有動物隨機分組。 收集初始40個動物之血清樣品以進行預篩檢骨轉換標記物(BTM)評估。選擇23個動物且基於平衡之生物標記物概況及體重分配至治療組中。在基線(BL)預篩檢時，各組之間在所有BTM濃度方面皆不存在顯著差異(表10)。表 10. 在 BL 預篩檢時之血清 BTM 蛋白質濃度

BL 預篩檢	TRACP 5b (U/L)	OC (ng/ml)	BAP (U/L)	C1CP (ng/ml)	DKK1 (pg/ml)
	平均值±SEM	平均值±SEM	平均值±SEM	平均值±SEM	平均值±SEM
所有 n=40	8.3 ± 0.6	24.9 ± 1.4	221.5 ± 13.0	90.5 ± 8.1	907.5 ± 42.3
對照 n=2	7.0 ± 2.6	28.7 ± 12.0	167.1 ± 41.9	83.9 ± 53.0	969.3 ± 456.3
1/Ab-5 n=3	6.9 ± 0.6	23.9 ± 5.6	216.8 ± 64.9	78.6 ± 13.7	1004.8 ± 157.0
2/6.147-AbL- Ab23, n=4	11.1 ± 4.6	21.0 ± 3.3	219.1 ± 30.4	83.2 ± 22.6	949.6 ± 153.4
3/Ab-23-6.37.5.v.1 n=3	8.1 ± 1.8	25.0 ± 2.7	202.8 ± 36.2	73.6 ± 29.8	837.6 ± 55.2
4/Ab-5-6.37.5.v.1 n=4	5.5 ± 0.2	22.6 ± 2.3	179.5 ± 22.8	90.7 ± 20.6	790.9 ± 75.9
5/Ab-5-6.147.v.1 n=3	7.2 ± 1.1	25.6 ± 2.4	264.8 ± 62.4	64.4 ± 9.0	895.5 ± 173.0

絕對血清酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)資料顯示於表11中。TRACP為一種由骨再吸收破骨細胞以高量表現之酶。已顯示TRACP 5b適用作破骨細胞數目及骨再吸收之標記物。參見Halleen等人, Clin. Lab., 52:499-509, 2006，其揭露內容以全文引用的方式併入本文中。對相對於給藥前之TRACP 5b變化百分比之分析(表11及圖9)揭示DVD抗體6.147-AbL-Ab23及異二聚抗體Ab-23-6.37.5治療在第5天及第7天導致TRACP 5b顯著降低(相較於Ab-5治療之動物)。表 11. 血清 TRACP 5b( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)

研究之時間點	TRACP 5b( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)
組 0 對照 n=2	組 1 Ab-5 n=3	組 2 Ab-2 n=4	組 3 Ab-23-6.37.5 n=3	組 4 Ab-5-6.37.5 n=4	組 5 Ab-5-6.147 n=3
平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM
第 5 天	N/A	-4.2 ± 5.0	-19.1 ± 1.7**	-16.7 ± 1.8*	-5.0 ± 0.7	-11.4 ± 2.2
第 7 天	N/A	-8.8 ± 2.9	-25.3 ± 4.1*	-25.9 ± 2.2*	-8.4 ± 3.5	-17.5 ± 4.3
第 14 天	1.2 ± 10.2	-19.5 ± 11.1	-33.6 ± 3.2	-38.0 ± 7.4	-15.8 ± 2.2	-25.5 ± 10.2
第 21 天	N/A	-29.0 ± 8.3	-39.9 ± 3.1	-39.8 ± 11.4	-24.8 ± 2.6	-24.6 ± 10.3
第 28 天	6.3 ± 10.0	-24.2 ± 7.7	-33.5 ± 1.9	-32.0 ± 17.1	-27.0 ± 5.1	-26.1 ± 11.9
第 36 天	N/A	-19.3 ± 4.2	-7.8 ± 3.7	-13.0 ± 15.3	-13.4 ± 5.6	-9.9 ± 5.7
第 43 天	N/A	-10.1 ± 6.3	-6.9 ± 3.5	-2.9 ± 15.1	-8.1 ± 6.1	-9.9 ± 8.3
第 45 天	N/A	-20.6 ± 5.6	-20.7 ± 3.1	-15.0 ± 14.4	-3.5 ± 4.8	-18.9 ± 6.1
第 50 天	N/A	-20.7 ± 2.3	-37.9 ± 2.7	-32.4 ± 12.0	-4.3 ± 6.7	-27.1 ± 4.0
第 57 天	8.0 ± 20.0	-24.1 ± 1.3	-30.0 ± 5.1	-36.7 ± 9.4	-9.9 ± 5.4	-23.7 ± 6.5
第 64 天	-5.2 ± 13.4	-25.6 ± 3.1	-18.2 ± 8.1	-22.4 ± 9.4	-6.7 ± 5.8	-24.0 ± 6.9

相較於組1，*p ＜0.05，**p ＜0.01 相較於Ab-5治療之動物，在研究之第36、43及57天，異二聚抗體Ab-5-6.147之血清骨鈣蛋白(OC)濃度(表12及圖10)顯著較高。對相對於給藥前之血清OC變化之分析(表10及圖9)揭示異二聚抗體Ab-23-6.37.5治療導致此分析物持續自第21天至第45天之測試時間點顯著升高。相較於Ab-5-6.147治療之動物，用異二聚抗體Ab-5-6.147治療導致自第21天至第43天及在第50天及第57天OC顯著增加。表 12. 血清 OC( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)

研究之時間點	OC( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)
組 0 對照 n=2	組 1 Ab-5 n=3	組 2 Ab-2 n=4	組 3 Ab-14-6.37.5 n=3	組 4 Ab-5-6.37.5 n=4	組 5 Ab-5-6.147 n=3
平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM
第 5 天	N/A	3.1 ± 0.5	-9.2 ± 11.8	5.4 ± 27.3	4.0 ± 21.5	28.6 ± 17.5
第 7 天	N/A	59.9 ± 36.1	71.8 ± 27.6	24.2 ± 32.1	26.7 ± 24.5	38.7 ± 14.2
第 14 天	10.2 ± 11.8	83.0 ± 21.4	57.5 ± 5.3	146.0 ± 6.5	143.7 ± 22	156.2 ± 35.4
第 21 天	N/A	76.8 ± 8.0	127 ± 21.8	152.1 ± 21.8	178.5 ± 25.6*	193.4 ± 23.7*
第 28 天	31.2 ± 3.4	78.9 ± 25.2	49.5 ± 4.5	99.3 ± 34.7	195.9 ± 27.0*	184.5 ± 20.2*
第 36 天	N/A	46.3 ± 37.4	9.3 ± 7.8	39.2 ± 21.2	175.5 ± 19.2**	158.2 ± 19.3*
第 43 天	N/A	-5.0 ± 7.0	-7.9 ± 8.1	23.0 ± 16.3	83.7 ± 10.4***	91.9 ± 10.9***
第 45 天	N/A	-7.2 ± 20.5	-18.0 ± 6.3	-11.9 ± 11.7	48.2 ± 14.1*	44.8 ± 2.2
第 50 天	N/A	10.1 ± 13.4	43.9 ± 11.9	57.1 ± 20.3	62.6 ± 25.7	124.1 ± 6.8**
第 57 天	39.9 ± 31.8	23.3 ± 20.8	12.0 ± 3.4	34.4 ± 26.6	72.4 ± 20.2	136.7 ± 21.1**
第 64 天	46.2 ± 49.2	3.6 ± 20.0	-19.4 ± 12.0	2.6 ± 16.8	66.9 ± 8.9	65.1 ± 16.7

相較於組1，*p ＜0.05，**p ＜0.01，***p ＜0.001 分析血清骨鹼性磷酸酶(BAP)超過給藥前之變化百分比，其結果顯示於表13及圖11中。結果指示在第5天，異二聚抗體Ab-23-6.37.5治療之動物中之BAP顯著升高(相對於Ab-5組)。表 13. 血清 BAP( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)

研究之時間點	BAP ( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)
組 0 對照 n=2	組 1 Ab-5 n=3	組 2 Ab-2 n=4	組 3 Ab-23-6.37.5 n=3	組 4 Ab-5-6.37.5 n=4	組 5 Ab-5-6.147 n=3
平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM
第 5 天	N/A	3.5 ± 0.8	35.2 ± 6.4	47.9 ± 17.2*	15.1 ± 4.6	38.5 ± 10.3
第 7 天	N/A	26.6 ± 9.6	60.7 ± 9.3	67.7 ± 16.7	24.2 ± 6.3	60.6 ± 11.0
第 14 天	-15.9 ± 2.1***	125.2 ± 23.1	89.4 ± 8.0	153.6 ± 20.6	77.3 ± 9.8	129.8 ± 11.8
第 21 天	N/A	118.7 ± 24.4	123.7 ± 20.2	158.1 ± 21.3	110.2 ± 16.5	165.7 ± 8.1
第 28 天	-14.3 ± 4.0*	109.2 ± 15.9	82.2 ± 14.5	133.4 ± 26.0	119.8 ± 27.2	136.8 ± 13.4
第 36 天	N/A	72.5 ± 30.9	27.5 ± 10.1	34.6 ± 17.8	83.7 ± 34.5	80.0 ± 23.9
第 43 天	N/A	10.4 ± 19.7	-8.6 ± 8.0	6.6 ± 9.7	41.6 ± 24.7	25.5 ± 10.7
第 45 天	N/A	-7.6 ± 17.1	-9.9 ± 7.4	3.7 ± 10.5	43.7 ± 25.9	28.4 ± 15.1
第 50 天	N/A	48.7 ± 14.7	90.4 ± 19.1	121.3 ± 21.6	80.9 ± 20.5	110.5 ± 7.2
第 57 天	-11.0 ± 20.2	67.3 ± 14.1	59.5 ± 14.3	108.0 ± 35.9	103.9 ± 21.6	110.7 ± 13.5
第 64 天	-2.3 ± 28.5	46.4 ± 16.3	7.5 ± 7.9	35.2 ± 26.3	66.9 ± 22.5	62.3 ± 11.8

相較於組1，*p ＜0.05，***p ＜0.001 血清C1CP資料呈現於表14中。相較於Ab-5治療之動物，在第14天，DVD抗體6.147-AbL-Ab23治療組具有超過給藥前之顯著較低C1CP變化百分比(表14及圖12)。表 14. 血清 C1CP( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)

研究之時間點	C1CP( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)
組 0 對照 n=2	組 1 Ab-5 n=3	組 2 Ab-2 n=4	組 3 Ab-23-6.37.5 n=3	組 4 Ab-5-6.37.5 n=4	組 5 Ab-5-6.147 n=3
平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM
第 5 天	N/A	140.9 ± 31.9	197.1 ± 67.6	246.0 ± 119.2	59.6 ± 42.9	224.6 ± 67.5
第 7 天	N/A	392.0 ± 87.6	439.3 ± 168.8	569.2 ± 263.6	218.2 ± 64.2	317.5 ± 72.1
第 14 天	49.8 ± 7.2*	386.9 ± 80.9	96.0 ± 27.4*	346.3 ± 70.7	377.1 ± 103.8	332.3 ± 26.8
第 21 天	N/A	298.7 ± 33	515.2 ± 129.3	609.6 ± 135.7	450.3 ± 72.5	397.5 ± 11.2
第 28 天	80.9 ± 15.7	276.8 ± 76.7	103.4 ± 21.7	267.2 ± 130.4	519.3 ± 122.3	433.0 ± 71.1
第 36 天	N/A	46.6 ± 74.4	-49.0 ± 7.0	-44.9 ± 8.9	208.6 ± 64.5	54.4 ± 32.6
第 43 天	N/A	-55.5 ± 5.1	-60.1 ± 8.8	-54.3 ± 11.3	5.0 ± 38.0	-29.0 ± 8.1
第 45 天	N/A	31.7 ± 28.8	63.0 ± 18.1	52.8 ± 29.0	50.5 ± 35.3	105.5 ± 34.7
第 50 天	N/A	103.7 ± 33.6	248.9 ± 98.5	357.1 ± 153.6	130.4 ± 68.1	219.1 ± 24.3
第 57 天	38.2 ± 42.5	36.4 ± 19.5	-30.9 ± 12.4	7.5 ± 64.3	49.3 ± 45.1	47.4 ± 1.4
第 64 天	48.4 ± 62.8	-24.8 ± 25.4	-59.4 ± 4.2	-60.7 ± 9.9	-20.3 ± 10.6	-28.1 ± 12.5

相較於組1，*p ＜0.05 在對照與Ab-5治療之動物之間，跨越量測之所有時間點，絕對血清DKK1濃度以及相對於給藥前之變化百分比(表17)不顯著不同。表 17. 未處理雌性食蟹獼猴持續研究之持續時間的 DKK1 於血清中之濃度及自 第 1 天給藥前開始之變化 %

研究之時間點	DKK1(pg/ml)	研究之時間點	DKK1( 自第 1 天給藥前開始之變化 %)
組 0 對照 n=2	組 1 Ab-5 n=3	組 0 對照 n=2	組 1 Ab-5 n=3
平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM	平均值 ±SEM
第天 1 給藥前	1263.7 ± 366.9	1532.5 ± 140.8
第 5 天	N/A	1088.9 ± 117.4	第 5 天	N/A	-29.2 ± 1.8
第 7 天	N/A	1080.5 ± 136.9	第 7 天	N/A	-29.9 ± 2.5
第 14 天	1077.5 ± 452.9	1239.8 ± 142.5	第 14 天	0.8 ± 25.5	-19.3 ± 5.1
第 21 天	N/A	1288.1 ± 47.1	第 21 天	N/A	-14.8 ± 6.8
第 28 天	1199.3 ± 430.0	1438.3 ± 23.3	第 28 天	17.8 ± 37.6	-4.8 ± 7.3
第 36 天	N/A	1769.4 ± 32.3	第 36 天	N/A	17.6 ± 11.9
第 43 天	N/A	1895.6 ± 52.8	第 43 天	N/A	25.8 ± 12.5
第 45 天	N/A	1607.6 ± 99.8	第 45 天	N/A	7.7 ± 15.5
第 50 天	N/A	1523.5 ± 95.9	第 50 天	N/A	1.4 ± 13.1
第 57 天	1370.6 ± 427.0	1607.2 ± 91	第 57 天	39.5 ± 51.1	7.6 ± 15.6
第 64 天	1353.2 ± 440.0	1826.1 ± 146.9	第 64 天	36.4 ± 48.1	21.9 ± 18.4

總之，相較於Ab-5治療，DVD抗體6.147-AbL-Ab23治療在第5天(p＜0.01)及第7天(p＜0.05)短暫降低血清TRACP 5b(就相對於給藥前之變化百分比而言)。相較於Ab-5治療之動物，在第14天，DVD抗體6.147-AbL-Ab23治療組中之C1CP(就相對於給藥前之變化百分比而言)顯著降低(p＜0.05)。血清OC及BAP濃度不受DVD抗體6.147-AbL-Ab23治療影響。 相較於單獨Ab-5治療，在第5天及第7天，異二聚抗體Ab-23-6.37.5治療亦顯著降低血清TRACP 5b(就自給藥前開始之變化百分比而言)(p＜0.05)。相較於Ab-5治療組，在第5天，用異二聚抗體Ab-23-6.37.5治療之動物顯示BAP顯著較高(就相對於給藥前之變化百分比而言)(p＜0.05)，但未見OC及C1CP含量有顯著差異。 相較於單獨Ab-5治療，用異二聚抗體Ab-5-6.37.5治療在評估之任何時間點皆對血清TRAP5b、BAP或CICP無影響。然而，相較於Ab-5治療組，在第21天(p＜0.05)、第28天(p＜0.05)、第36天(p＜0.01)、第43天(p＜0.001)及第45天(p＜0.05)，異二聚抗體Ab-5-6.37.5治療組中之OC(就相對於給藥前之變化百分比而言)顯著增加。 類似地，相對於單獨Ab-5治療，TRAPCP 5b、BAP及C1CP濃度不受異二聚抗體Ab-5-6.147治療影響。相較於Ab-5治療組，在第36天(p＜0.05)、第43天(p＜0.05)及第57天(p＜0.01)，此組中之血清OC濃度顯著升高。相較於Ab-5治療組，在第21天、第28天、第36天(分別p＜0.05)、第43天(p＜0.001)、第50天及第57天(分別p＜0.01)，Ab-5-6.147治療組中之就相對於給藥前之變化百分比而言的血清OC顯著增加。 在對照與Ab-5治療之動物之間，跨越評估之所有時間點，血清DKK1濃度不顯著不同。 此實例中提供之此等資料顯示針對DKK1及硬化蛋白之異二聚抗體具有與親本Ab Ab-5類似之IgG樣藥物動力學性質，且在於食蟹獼猴中投藥之後導致特定骨形成標記物出眾增加。在非人類靈長類動物及齧齒動物中觀測之雙重DKK1及硬化蛋白抑制效應強調異二聚抗體治療骨病症之治療功效。 實例18-異二聚抗體之藥物動力學性質 在研究中表徵三種異二聚抗體(Ab23-6.37.5 v.1、Ab-5-6.37.5 v.1及Ab-5-6.147 v.1)之藥物動力學(PK)概況。 將食蟹獼猴分成藉由在第1天及第15天靜脈內投藥及在第43天皮下投藥來接受25 mg/kg Ab-5(組1)、34.4 mg/kg DVD抗體6.147-AbL-Ab23(組2)、或25 mg/kg Ab-23-6.37.5.v.1(組3)、Ab-5-6.37.5.v.1(組4)或Ab-5-6.147.v.1(組5)之各者的5個治療組。在第1研究日開始收集662個血清樣品(歷經64天)以供PK分析，其中亦在第15天及第43天獲取樣品。 使用如上在實例7中所述之四種不同酶聯免疫吸附分析(ELISA)(硬化蛋白/DKK1分析；硬化蛋白/Fc分析；DKK1/硬化蛋白分析；及FC/FC橋式ELISA分析)分析血清樣品。使用利用一對針對Ab-5之抗特應抗體進行之ELISA來分析來自組1之在完整Ab-5濃度之情況下的血清樣品。使用以下兩種不同ELISA分析來自組2之血清樣品：一種用以量測完整抗DKK1 Mab且一種用以量測總Mab濃度。使用以下三種不同ELISA分析來自組3、4及5之血清樣品：一種用以量測完整抗DKK1 Mab，一種用以量測完整抗硬化蛋白(SOST)Mab，且一種用以量測總Mab濃度。藉由ELISA測定完整(DKK1)血清Mab濃度，其中重組人類DKK1及抗人類Fc分別用作捕捉試劑及偵測試劑。藉由ELISA測定完整(SOST)血清Mab濃度，其中重組人類SOST及抗人類Fc用作捕捉試劑及偵測試劑。另外，藉由ELISA測定總血清Mab濃度，其中一對抗人類IgG Fc抗體用作捕捉試劑及偵測試劑。 三種異二聚抗體及陽性對照之PK概況描述於圖13中，且由第一IV劑量資料獲得之PK參數以下概述於表18中。 表18. Ab23-6.37.5 v.1、Ab-5-6.37.5 v.1及Ab-5-6.147 v.1異Ig候選物在食蟹獼猴中之由第1 IV劑量間隔獲得之PK參數估計值。

化合物 ( 完整)	劑量 (mg/kg)	T1/2 ( 天)	C0_ μM ( μM)	AUC0_ 無窮 ( 天* μM)	CL_ 預測 (mL/h/kg)	F (%)
Ab-5	25	4.6	4.24	18.0	0.394	63
DVD 6.147-AbL-Ab23	34.4	1.5	3.68	8.3	0.869	78
Ab-23-6.37.5.v.1	25	3.2	3.49	12.6	0.553	83
Ab-5-6.37.5.v.1	25	5.5	3.91	18.4	0.379	78
Ab-5-6.147.v.1	25	3.5	4.0	13.8	0.527	78

此研究中之5只猴產生針對不同Mab之結合性抗藥物抗體(ADA)，其使藥物暴露量降低；因此自分析排除此等個體。異二聚抗體Ab-5-6.37.5 v.1、Ab-5-6.147 v.1及Ab23-6.37.5 v.1之終末半衰期(T_1/2 )分別估計為5.5、3.5及3.2天。Ab-5-6.37.5 v.1之暴露量與Ab-5類似(AUC 0-無窮-18.4天*μM相較於18.0天*μM)，而相較於Ab-5，其他兩種異Ig之暴露量降低約25-30%。三種異Ig之生物可用性(F)類似，在78-83%之範圍內。 實例19-其他活體內實驗 在10週齡完整小鼠中進行三週研究以比較異二聚抗體(Ab-5-6.37.5.v.1)與親本Ab DKK1 Ab 6.37.5及Ab-5之各者及與兩種親本抗體(IgG)之組合的骨合成代謝活性(每組n = 6)。鑒於異二聚抗體為硬化蛋白及DKK1之單價抑制劑，評估兩個劑量之異二聚抗體(亦即25 mg/kg及12.5 mg/kg)以相對於用作對照之二價分子衡量價數對生物活性之影響。 一週兩次在12.5 mg/kg下用單藥療法(Ab-5及DKK1 Ab 6.37.5，分開投與)及異二聚抗體療法各自皮下給藥，且在對照組中類似地投與DKK1 Ab(6.37.5，12.5 mg/kg)加抗硬化蛋白Ab(Ab-5，12.5 mg/kg)之組合。此外，用異二聚抗體在25 mg/kg下給藥以相對於研究中使用之二價對照校正價數。一週一次藉由DXA量測骨礦物質密度。 圖14中說明之結果顯示由異二聚抗體治療介導之腰椎骨物質增加顯著優於兩種單藥療法。用降低劑量之異二聚抗體觀測之骨合成代謝活性不顯著不同於在用組合療法治療之小鼠中量測者。較高劑量之異二聚抗體略微優於組合療法，但此差異不顯著。在股骨中觀測到類似骨物質增加(資料未顯示)。 相較於用單獨抗硬化蛋白抗體或抗DKK1抗體進行之治療，在齧齒動物中觀測之同時雙重DKK1及硬化蛋白抑制強調異二聚抗體治療骨病症之治療功效。

圖1說明以下異二聚抗體之活體內研究設計：(1)Ab23-Ab6.147 v2，(2)Ab5-Ab6.37.5 v1，及(3)Ab5-Ab6.147。 圖2比較單特異性Ig(Ab5)、雙特異性DVD(6.147-Ab23)及異二聚抗體(1、2及3)之間的在第3週在小鼠之腰椎及腿中達成的骨物質密度(BMD)增加百分比。 圖3顯示四種硬化蛋白-DKK1異二聚抗體(亦即Ab23-6.37.5 v1、Ab5-6.37.5 v1、Ab5-6.147 v2及Ab23-6.147 v2)之藥物動力學(PK)概況。 圖4：使用不同方法之雙特異性抗體變異體之組態，(a)結合抗原A之可變區中之一對帶電荷殘基K/D與C_H 1/CL中之一對帶電荷殘基D/K組合以增強LC與其同源HC配對；結合抗原B之可變區中之一對帶電荷殘基D/K與C_H 1/CL中之一對帶電荷殘基K/D組合以增強LC與其同源HC配對。亦指示C_H 3域中之異二聚化電荷殘基。(b)結合抗原A之可變區中之一對帶電荷殘基D/K與C_H 1/CL中之兩對帶電荷殘基KK/DD組合以增強LC與其同源HC配對；結合抗原B之可變區中之一對帶電荷殘基K/D與C_H 1/CL中之兩對帶電荷殘基DD/KK組合以增強LC與其同源HC配對。亦指示C_H 3域中之用於異二聚化之電荷殘基。(c)結合抗原A之可變區中之兩對帶電荷殘基KK/DD與C_H 1/CL中之一對帶電荷殘基D/K組合以增強LC與其同源HC配對；結合抗原B之可變區中之兩對帶電荷殘基DD/KK與C_H 1/CL中之一對帶電荷殘基K/D組合以增強LC與其同源HC配對。亦指示C_H 3域中之用於異二聚化之電荷殘基。(d)結合抗原A之可變區中之兩對帶電荷殘基KK/DD與C_H 1/CL中之兩對帶電荷殘基DD/KK組合以增強LC與其同源HC配對；結合抗原B之可變區中之兩對帶電荷殘基DD/KK與C_H 1/CL中之兩對帶電荷殘基KK/DD組合以增強LC與其同源HC配對。亦指示C_H 3域中之用於異二聚化之電荷殘基。(e)結合抗原A之可變區中之一對帶電荷殘基K/D及一對半胱胺酸殘基與C_H 1/CL中之一對帶電荷殘基D/K組合以增強LC與其同源HC配對；結合抗原B之可變區中之一對半胱胺酸殘基及一對帶電荷殘基D/K與C_H 1/CL中之一對帶電荷殘基K/D組合以增強LC與其同源HC配對。亦指示C_H 3域中之用於異二聚化之電荷殘基。Ⓒ表示半胱胺酸殘基，在兩個半胱胺酸殘基之間形成之二硫鍵可以正確LC/HC配對使Fab區穩定。(f)結合抗原A之可變區中之一對帶電荷殘基K/D及一對小/大殘基與C_H 1/CL中之一對帶電荷殘基D/K組合以增強LC與其同源HC配對；結合抗原B之可變區中之一對帶電荷殘基殘基D/K及一對大/小殘基與C_H 1/CL中之一對帶電荷殘基K/D組合以增強LC與其同源HC配對。亦指示C_H 3域中之用於異二聚化之電荷殘基。突出三角表示大殘基；退縮三角表示小殘基。鈕入孔效應可與靜電操縱效應合作起作用以指導及穩定化正確LC/HC配對。 圖5：人類重鏈V區及J區之比對。編號係基於AHo系統。加亮界面殘基。 圖6：人類κ鏈V區及J區之比對。編號係基於AHo系統。加亮界面殘基。 圖7：人類λ鏈V區及J區之比對。編號係基於AHo系統。加亮界面殘基。 圖8為關聯DKK1 mRNA表現(y軸)與向食蟹獼猴投與之Ab-5之劑量(mg/kg)(x軸)的圖。說明之資料顯示硬化蛋白抗體治療誘導食蟹獼猴之肱骨中段及腰椎中之DKK1 mRNA表現。 圖9為描述在第1天(IV)、第15天(IV)及第43天(SC)接受25 mg/kg Ab-5、DVD抗體6.147-AbL-Ab23、異二聚抗體Ab23-6.37.5.v.1、異二聚抗體Ab5-6.37.5.v.1及異二聚抗體Ab5-6.147.v.1之食蟹獼猴中絕對血清酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)濃度(y軸)隨時間(x軸)之變化百分比的圖。 圖10為描述在第1天(IV)、第15天(IV)及第43天(SC)接受25 mg/kg Ab-5、DVD抗體6.147-AbL-Ab23、異二聚抗體Ab23-6.37.5.v.1、異二聚抗體Ab5-6.37.5.v.1及異二聚抗體Ab5-6.147.v.1之食蟹獼猴中血清骨鈣蛋白(OC)濃度(y軸)隨時間(x軸)之變化百分比的圖。 圖11為描述在第1天(IV)、第15天(IV)及第43天(SC)接受25 mg/kg Ab-5、DVD抗體6.147-AbL-Ab23、異二聚抗體Ab23-6.37.5.v.1、異二聚抗體Ab5-6.37.5.v.1及異二聚抗體Ab5-6.147.v.1之食蟹獼猴中血清骨鹼性磷酸酶(BAP)濃度(y軸)隨時間(x軸)之變化百分比的圖。 圖12為描述在第1天(IV)、第15天(IV)及第43天(SC)接受Ab-5、DVD抗體6.147-AbL-Ab23、異二聚抗體Ab23-6.37.5.v.1、異二聚抗體Ab5-6.37.5.v.1及異二聚抗體Ab5-6.147.v.1之食蟹獼猴中血清C1CP濃度(y軸)隨時間(x軸)之變化百分比的圖。 圖13為描述在IV及SC注射之後，Ab-5、DVD抗體6.147-AbL-Ab23、異二聚抗體Ab23-6.37.5.v.1、異二聚抗體Ab5-6.37.5.v.1及異二聚抗體Ab5-6.147.v.1之藥物動力學概況(濃度(nM)(y軸)對時間(小時)(x軸))的圖。 圖14為描述接受異二聚抗體(具有垂直條紋及斜條紋之棒條)、硬化蛋白抗體單藥療法(打點棒條)、DKK1抗體單藥療法(中空棒條)或組合硬化蛋白抗體及DKK1抗體(具有水平條紋之棒條)之小鼠之腰椎中骨物質相較於基線之變化百分比(y軸)的圖。

Claims (67)

1. 一種異二聚抗體或其片段，其在以下各域中包含一或多個取代：第一CH₃ 域、第二CH₃ 域、CH₁ 域、C_L 域、V_H 域及V_L 域， 其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸。
2. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該第一CH₃ 域或該第二CH₃ 域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型人類IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電荷胺基酸經一或多個帶負電荷胺基酸置換。
3. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該第一CH₃ 域或該第二CH₃ 域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型人類IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。
4. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該CH₁ 域或該C_L 域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電荷胺基酸經一或多個帶負電荷胺基酸置換。
5. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該CH₁ 域或該C_L 域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。
6. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該V_H 域或該V_L 域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電荷胺基酸經一或多個帶負電荷胺基酸置換。
7. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該V_H 域或該V_L 域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列以使野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電荷胺基酸經一或多個帶正電荷胺基酸置換。
8. 如請求項1至7中任一項之異二聚抗體或其片段，其中該帶正電荷胺基酸係選自由離胺酸、組胺酸及精胺酸組成之群。
9. 如請求項1至7中任一項之異二聚抗體或其片段，其中該帶負電荷胺基酸係選自由天冬胺酸及麩胺酸組成之群。
10. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該第一CH₃ 域包含用帶正電荷胺基酸置換麩胺酸。
11. 如請求項10之異二聚抗體或其片段，其中該麩胺酸為Glu356。
12. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該第一CH₃ 域包含用帶負電荷胺基酸置換天冬胺酸。
13. 如請求項12之異二聚抗體或其片段，其中該天冬胺酸為Asp356及Asp399。
14. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該第二CH₃ 域包含用帶負電荷胺基酸置換離胺酸。
15. 如請求項14之異二聚抗體或其片段，其中該離胺酸係選自由Lys392、Lys409、Lys439及Lys370組成之群。
16. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該CH₁ 域包含用帶負電荷胺基酸置換絲胺酸。
17. 如請求項16之異二聚抗體或其片段，其中該絲胺酸為Ser183。
18. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該C_L 域包含用帶正電荷胺基酸置換絲胺酸。
19. 如請求項18之異二聚抗體或其片段，其中該絲胺酸為Ser176。
20. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該V_H 域包含用帶負電荷胺基酸置換麩醯胺酸。
21. 如請求項20之異二聚抗體或其片段，其中該麩醯胺酸為Gln38(Kabat位置38、AHo位置46)。
22. 如請求項1之異二聚抗體或其片段，其中該V_L 域包含用帶正電荷胺基酸置換麩醯胺酸。
23. 如請求項22之異二聚抗體或其片段，其中該麩醯胺酸為Gln39(Kabat位置39、AHo位置46)。
24. 如請求項1至23中任一項之異二聚抗體或其片段，其係選自由抗體、雙特異性抗體、單特異性單價抗體、雙特異性大抗體、單域抗體、肽體、雙特異性肽體、單價肽體及受體融合蛋白組成之群。
25. 一種異二聚抗體或其片段，其包含含有以下之重鏈： (a)  在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代， (b)  在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代， (c)  在選自由位置352-360(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及 (d)  在選自由位置395-403(EU編號)組成之群之位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代， 其中(a)之該帶電荷胺基酸與(b)之該帶電荷胺基酸具有相同電荷，且 其中(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸之相反電荷。
26. 如請求項25之異二聚抗體或其片段，其中該第一胺基酸取代在AHo位置46處，該第二胺基酸取代在EU位置183處，該第三胺基酸取代在EU位置356處且該第四胺基酸取代在EU位置399處。
27. 如請求項25之異二聚抗體或片段，其中AHo位置46處之麩醯胺酸經麩胺酸置換，EU位置183處之絲胺酸經麩胺酸置換，EU位置356處之麩胺酸經離胺酸置換，且EU位置399處之天冬胺酸經離胺酸置換。
28. 一種抗體或其片段，其包含含有以下之重鏈： (a)  在選自由AHo位置35-43組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代， (b)  在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代， (c)  在選自由位置388-398(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及 (d)  在選自由位置404-413(EU編號)組成之群之位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代， 其中(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸之相反電荷。
29. 如請求項28之異二聚抗體或其片段，其中該第一胺基酸取代在AHo位置46處，該第二胺基酸取代在EU位置183處，該第三胺基酸取代在EU位置393處且該第四胺基酸取代在EU位置409處。
30. 如請求項29之抗體或其片段，其中AHo位置46處之麩醯胺酸經離胺酸置換，EU位置183處之絲胺酸經離胺酸置換，EU位置392處之離胺酸經天冬胺酸置換且EU位置409處之離胺酸經天冬胺酸置換。
31. 一種異二聚抗體或片段，其包含含有以下之輕鏈： (a)  在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代，及 (b)  在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代。
32. 如請求項31之異二聚抗體或其片段，其中該第一胺基酸取代在AHo位置46處且該第二胺基酸取代在EU位置176處。
33. 如請求項32之異二聚抗體或片段，其中AHo位置46處之麩醯胺酸經麩胺酸置換且EU位置176處之絲胺酸經麩胺酸置換。
34. 一種抗體或其片段，其包含含有以下之重鏈： (a)在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代， (b)在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代， (c)在選自由位置352-360(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及 (d)在選自由位置395-403(EU編號)組成之群之位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代， 其中(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸具有負電荷且(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有正電荷。
35. 如請求項34之抗體，其中該第一胺基酸取代在AHo位置46處，該第二胺基酸取代在EU位置183處，該第三胺基酸取代在EU位置356處且該第四胺基酸取代在EU位置399處。
36. 如請求項34之抗體或其片段，其包含在AHo位置46及EU位置176處含有帶正電荷胺基酸之輕鏈。
37. 一種異二聚抗體或其片段，其包含含有以下之重鏈： (a)  在選自由AHo位置42-50組成之群之AHo位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第一胺基酸取代， (b)  在選自由位置126-213(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第二胺基酸取代， (c)  在選自由位置388-397(EU編號)組成之群之位置處的在該位置處引入帶電荷胺基酸之第三胺基酸取代，及 (d)  在選自由位置404-413(EU編號)組成之群之位置處的引入帶電荷胺基酸之第四胺基酸取代， 其中(a)及(b)之該等帶電荷胺基酸具有正電荷且(c)及(d)之該等帶電荷胺基酸具有負電荷。
38. 如請求項38之異二聚抗體或其片段，其中該第一胺基酸取代在AHo位置46處，該第二胺基酸取代在EU位置183處，該第三胺基酸取代在EU位置392處且該第四胺基酸取代在EU位置409處。
39. 如請求項37之異二聚抗體或其片段，其包含在AHo位置46及EU位置176處含有帶負電荷胺基酸之輕鏈。
40. 一種異二聚抗體，其包含第一重鏈及第二重鏈以及第一輕鏈及第二輕鏈，其中該第一重鏈在AHo位置46及EU位置183、356及399處包含胺基酸取代，其中該第二重鏈在AHo位置46及EU位置183、392及409處包含胺基酸取代，且其中該第一輕鏈及該第二輕鏈在AHo位置46及EU位置176處包含胺基酸取代，其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。
41. 如請求項40之異二聚抗體，其中該第一重鏈之AHo位置46處之麩醯胺酸經麩胺酸置換，其中該第二重鏈之AHo位置46處之麩醯胺酸經離胺酸置換，其中該第一輕鏈之AHo位置46處之麩醯胺酸經離胺酸置換，其中該第二輕鏈之AHo位置46處之麩醯胺酸經麩胺酸置換，其中該第一重鏈之EU位置183處之絲胺酸經麩胺酸置換，其中該第一重鏈之EU位置356處之麩胺酸經離胺酸置換，其中該第一重鏈之EU位置399處之麩胺酸經離胺酸置換，其中該第二重鏈之EU位置183處之絲胺酸經離胺酸置換，其中該第二重鏈之EU位置392處之離胺酸經天冬胺酸置換，且其中該第二重鏈之EU位置409處之離胺酸經天冬胺酸置換。
42. 一種結合硬化蛋白及DKK-1之異二聚抗體，其包含 第一重鏈，該第一重鏈包含選自由SEQ ID NO: 378及366組成之群之可變區胺基酸序列且在該第一重鏈之EU位置183、356及399處包含胺基酸取代， 第二重鏈，該第二重鏈包含選自由SEQ ID NO: 1003及974組成之群之可變區胺基酸序列且在該第二重鏈之EU位置183、392及409處包含胺基酸取代， 第一輕鏈，該第一輕鏈包含選自由SEQ ID NO: 376及364組成之群之可變區胺基酸序列且在該第一輕鏈之EU位置176處包含胺基酸取代，及 第二輕鏈，該第二輕鏈包含選自由SEQ ID NO: 1002及978組成之群之可變區胺基酸序列且在該第二輕鏈之EU位置176處包含胺基酸取代； 其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。
43. 一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之抗體，其中該抗體在以下各域中包含取代：第一CH₃ 域、第二CH₃ 域、CH₁ 域及C_L 域， 其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸。
44. 一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之抗體，其中該抗體包含具有包含一或多個胺基酸取代之CH3域的重鏈，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸。
45. 如請求項44之抗體，其中該CH3域中之帶負電荷胺基酸經帶正電荷胺基酸取代。
46. 如請求項45之抗體，其中該帶負電荷胺基酸在EU位置D399、E356或E357處。
47. 如請求項45之抗體，其中EU位置D399、E356及E357處之該帶負電荷胺基酸各自經帶正電荷胺基酸取代。
48. 如請求項45或請求項47之抗體，其中該帶正電荷胺基酸為離胺酸。
49. 如請求項44之抗體，其中該CH3域中之正電荷胺基酸經帶負電荷胺基酸取代。
50. 如請求項49之抗體，其中該帶正電荷胺基酸在EU位置K370、K392或K409處。
51. 如請求項49之抗體，其中EU位置K370、K392及K409處之該等帶正電荷胺基酸各自經帶負電荷胺基酸取代。
52. 如請求項49或請求項51之抗體，其中該帶負電荷胺基酸為天冬胺酸。
53. 一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之異二聚抗體，其中該抗體包含 包含硬化蛋白結合部分之第一重鏈及第一輕鏈以及包含DKK1結合部分之第二重鏈及第二輕鏈，其中該第一重鏈在AHo位置46及EU位置183、356及399處包含胺基酸取代，其中該第二重鏈在AHo位置46及EU位置183、392及409處包含胺基酸取代，其中該第一輕鏈及該第二輕鏈在AHo位置46及EU位置176處包含胺基酸取代，且其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。
54. 一種結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之異二聚抗體，該抗體包含 包含硬化蛋白結合部分之第一重鏈及第一輕鏈以及包含DKK1結合部分之第二重鏈及第二輕鏈，其中該第一重鏈在EU位置183、356及399處包含胺基酸取代，其中該第二重鏈在EU位置183、392及409處包含胺基酸取代，且其中該第一輕鏈及該第二輕鏈在EU位置176處包含胺基酸取代，其中該等胺基酸取代在該等位置處引入帶電荷胺基酸。
55. 如請求項1至43中任一項之異二聚抗體，其中該抗體結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域。
56. 如請求項1至55中任一項之異二聚抗體，其為IgG免疫球蛋白。
57. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至56中任一項之異二聚抗體之核苷酸序列。
58. 一種載體，其包含如請求項57之核苷酸序列。
59. 一種經分離宿主細胞，其包含如請求項57之核酸或如請求項58之載體。
60. 一種增加哺乳動物個體中之骨礦物質密度之方法，其包含以有效增加該個體中之骨礦物質密度之量向該個體投與如請求項1至56中任一項之異二聚抗體。
61. 一種組合物，其包含如請求項1至56中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或佐劑。
62. 如請求項61之組合物，其中在約4℃下儲存兩週之後，該組合物中小於5%之該抗體呈聚集體形式。
63. 如請求項61之組合物，其中在約4℃下儲存兩週之後，該組合物中小於1%之該抗體係呈聚集體形式。
64. 如請求項62或請求項63之組合物，其中藉由粒徑排阻層析測定一定量之抗體以聚集體形式存在於該組合物中。
65. 一種組合物，其包含異二聚抗體或其片段及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或佐劑， 該異二聚抗體或其片段在以下各域中包含一或多個取代：第一CH₃ 域、第二CH₃ 域、CH₁ 域、C_L 域、V_H 域及V_L 域，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸； 其中在約4℃下儲存兩週之後，該組合物中小於5%之該抗體或片段呈聚集體形式。
66. 一種組合物，其包含結合硬化蛋白之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸86-111的區域之異二聚抗體及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或佐劑， 該抗體在以下各域中包含取代：第一CH₃ 域、第二CH₃ 域、CH₁ 域及C_L 域，其中該一或多個取代引入在靜電方面不利於同二聚體形成且在靜電方面有利於異二聚體形成的帶電荷胺基酸； 其中在約4℃下儲存兩週之後，該組合物中小於5%之該抗體呈聚集體形式。
67. 如請求項66或請求項67之組合物，其中在約4℃下儲存兩週之後，該組合物中小於1%之該抗體係呈聚集體形式。

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