RS61158B1 - Anti-sklerostin antitelo, antigen vezujući fragment i njegova medicinska upotreba - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin (SOST gen) sa visokim afinitetom, i njegovim fragmentom za vezivanje antigena, kao i antitelo kao terapijski agens, posebno za u vezi sa genom SOST posredovane bolesti kostiju ili poremećaje kao što je osteoporoza, pri čemu subjekat ima koristi od povećanja barem jednog od parametara kao što su koštana masa, mineralna gustina kostiju, mineralni sadržaj kostiju, ili čvrstoću kostiju.

STANJE TEHNIKE

[0002] Osteoporoza (OP), uključujući postmenopauznu osteoporozu (PMO) i senilnu osteoporozu, je sistemski poremećaj metabolizma kostiju, koji karakteriše mala koštana masa i razgradnja mikrostrukture kosti, što kao rezultat daje smanjenu čvrstoću kostiju, povećanu krhkost kotiju, i sklonost prelomima. Prema statistici, oko 200 miliona ljudi boluje od osteoporoze u svetu, i učestalost pojave je porasla do prvih sedam od najčešćih bolesti i bolesti koje se često javljaju. Stopa raširenosti osteoporoze kod Kineskinja preko 60 godina je čak 60%, a stopa raširenosti za muškarce je takođe 40-50%.

[0003] Pored vežbe jačanja, uzimanje kalcijuma i vitamina D, širenje znanja za sprečavanje preloma i druge tradicionalne mere, sadašnje medicinsko lečenje je uglavnom ograničeno na smanjenje apsorpcije kosti za sprečavanje preloma. Lekovi protiv apsorpcije kosti uključuju kalcitonin, bisfosfonate, agense za zamenu estrogena i selektivne modulatore receptora estrogena (SERM), itd. Ovi inhibitori apsorpcije kosti, koji su predstavljeni bisfosfonatima, iako mogu da spreče dalji gubitak kosti, ne uspevaju da rekonstruišu izgubljenu kost, i takođe ovi inhibitori apsorpcije kosti ne uspevaju da suzbiju osteogenezu uz inhibiciju apsorpcije kosti. Hormonski lekovi imaju više rizika povezanog sa venskom trombozom i kardiovaskularnom bolešću. Još važnije, anabolički lekovi kosti, u svom pravom smislu, ne samo da poboljšavaju masu kosti, već takođe delotvorno poboljšavaju mikrostrukturu kosti i pospešuju osteogenezu. Međutim, ovo je upravo to što postojeći lekovi protiv apsorpcije kosti mogu da urade. U proteklih 15 godina, različite medicinske mere koje imaju za cilj smanjenje rizika od preloma se sistematski istražuju u kliničkim ispitivanjima, dok su stvarni dostupni lekovi i dalje potpuno ograničeni. Dakle, dokazalo se da osteogenezu stimulišu samo lekovi za paratiroidni hormon (PTH). Međutim, očigledni su brojni nedostaci. Na primer, nije trajno u pogledu preoblikovanja kosti ima nedovoljan učinak na oporavak preloma, takođe je neophodno da se perkutano isporuče svakog dana tokom više od jedne godine, i samo su isporučeni sa malom dozom; visoka cena i nije moguće da budu u upotrebi neprekidno više od dve godine; kao i da sigurnost izlaganja dovodi do upozorenja sa crnom kutijom od Agencije za hranu i lekove u SAD (US FDA), itd.

[0004] Sklerostin se koristi kao novi biološki cilj za razvoj leka; njegov princip je da bi osteoporozu bilo moguće lečiti regulisanjem anabolizma od strane osteoblasta. Takav cilj popunjava prazninu u oblasti lečenja osteoporoze regulisanjem metabolizma kosti metabolizam kosti.

[0005] Gen SOST je taj koji eksprimuje sklerostin koji je izlučni glikoprotein, i njegovu sekvencu aminokiseline karakteriše 190 ostataka i domen obruča koji obuhvata cistein. Pokazalo se da je uglavnom eksprimovan u ćelijama kosti, ali veoma slabo eksprimovanje u osteoblastima, hrskavici, jetri, bubregu, koštanoj srži, srcu, pankreasu i drugim lokacijama.

[0006] Studije su pokazale da sklerostin može da reguliše osteogenezu kroz inhibiranje Wnt signalne putanje vezivanjem na receptor LRP5/6 lipoproteina male gustine. Za sada, lekovi koji obuhvataju monoklonalno antitelo protiv cilja razvijenog od strane nekoliko kompanija su ušli u fazu III ili II kliničkih ispitivanja, prema opisanom redosledu. Indikacije ovih antitela su osteoporoza, oštećenje kosti/u vezi sa osteopatijom, i tako dalje. Sa tim povezani patenti su: WO2008133722, WO2010130830, WO2013063095, WO2014006100, WO2014081955, WO2005014650, WO2006119062, WO2008115732. Vredi pomenuti da su neke studije pokazale da antitela protiv sklerostina nisu u sukobu sa lečenjem korišćenjem tradicionalnih bisfosfonata, i da je ova dva leka moguće koristiti u kombinaciji.

[0007] Ovaj pronalazak obezbeđuje nova antitela razvijena protiv novog cilja za lečenje bolesti kostiju kao što je osteoporoza, pomenuto antitelo karakteriše visok afinitet, visoka efikasnost, produženi poluvek upotrebe i smanjeni broj isporuke leka pacijentu. Pored toga, novi molekuli iz ovog pronalaska imaju visoku rastvorljivost i dobru stabilnost, što omogućava proizvodnju preparata, čime se smanjuje trošak proizvodnje.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0008] Predmet ovog opisa je definisan patentnim zahtevima 1 do 9.

[0009] Ovaj pronalazak se odnosi na antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin, koji obuhvata teški lanac iz SEK ID BR: 26 i laki lanac iz SEK ID BR: 29.

[0010] Ovaj pronalazak se još odnosi na DNK molekul, koji kodira antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin kao što je definisano gore u tekstu.

[0011] Ovaj pronalazak se još odnosi na vektor ekspresije koji obuhvata DNK molekul kao što je definisano gore u tekstu.

[0012] Ovaj pronalazak još obuhvata ćeliju domaćina transformisanu sa vektorom ekspresije kao što je definisano gore u tekstu.

[0013] Ovaj pronalazak se još odnosi na ćeliju domaćina kao što je definisano gore u tekstu, pri čemu je ćelija domaćin ćelija sisara.

[0014] Ovaj pronalazak se još odnosi na ćeliju domaćina kao što je definisano gore u tekstu, pri čemu je ćelija domaćin ćelija CHO (jajnika kineskog hrčka).

[0015] Ovaj pronalazak se još odnosi na farmaceutsku supstancu, koja obuhvata antitelo kao što je definisano gore u tekstu, i jedan ili više farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, razblaživač ili nosač.

[0016] Ovaj se pronalazak još odnosi na antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin kao što je definisano gore u tekstu ili farmaceutsku supstancu kao što je definisano gore u tekstu, za upotrebu radi povećanja barem jednog od parametara kao što je koštana masa, mineralna gustina kosti, mineralni sadržaj kosti ili čvrstoća kosti.

[0017] Ovaj pronalazak se još odnosi na antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin kao što je definisano gore u tekstu ili farmaceutsku supstancu kao što je definisano gore u tekstu, za upotrebu za lečenje bolesti kostiju posredovane genom SOST ili poremećaja izabranog iz osteoporoze, osteopenije, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, periodontalne bolesti i multiplog mijeloma.

[0018] Antitela iz ovog pronalaska su himerna monoklonalna antitela ili humanizovana monoklonalna antitela, koja obuhvataju specifičnu ovde opisanu sekvencu polipeptida, čija je specifičnost to što se veže na humani sklerostin sa visokim afinitetom i može da se koristi da se poveća barem jedno iz grupe koja obuhvata koštanu masu, mineralnu gustinu kostiju, mineralni sadržaj kostiju i čvrstoću kostiju sisara, poželjno čoveka.

[0019] Ovaj opis obezbeđuje antitelo SOST ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji obuhvata najmanje jedan CDR region, pri čemu je pomenuti CDR region izabran iz sledećih sekvenci ili njegovih mutanata, ili sekvenci aminokiselina koje imaju najmanje 95% identičnost sa sledećim:

promenljivi region teškog lanca HCDR sekvence: SEK ID BR: 7, SEK ID BR:8 ili SEK ID BR:9; i

promenljivi region lakog lanca LCDR sekvence: SEK ID BR: 10, SEK ID BR: 11 ili SEK ID BR: 12.

[0020] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je obezbeđeno SOST antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu promenljivi region teškog lanca antitela obuhvata najmanje jedan HCDR region izabran iz sledećih sekvenci ili njenog mutanta: SEK ID BR: 7, SEK ID BR: 8 i SEK ID BR: 9.

[0021] U preporučenom izvođenju ovaj opis, obezbeđen ovde jeste antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena gena SOST kao što je opisano gore tekstu, pri čemu promenljivi region lakog lanca antitela obuhvata najmanje jedan LCDR region izabran iz sledeće sekvence ili njegov mutant: SEK ID BR: 10, SEK ID BR: 11 i SEK ID BR: 12.

[0022] U preporučenom izvođenju ovaj opis, obezbeđen ovde jeste SOST antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu antitelo obuhvata region HCDR sekvenci SEK ID BR: 7 (HCDR1), SEK ID BR: 8 (HCDR2) i SEK ID BR: 9 (HCDR3), ili njegov mutant, i region LCDR sekvenci SEK ID BR: 10 (LCDR1), SEK ID BR: 11 (LCDR2) i SEK ID BR: 12 (LCDR3), ili njegov mutant.

[0023] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je obezbeđeno SOST antitelo i njegov fragment vezivanja antigena kako što je opisano ovde u tekstu, pri čemu mutant CDR regiona jeste CDR region koji ima 1-3 mutacije aminokiseline koje optimizuje aktivnost antitela, pri čemu mutant regiona HCDR2 je prikazan kao SEK ID BR: 13.

[0024] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato SOST antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena kao što je prikazano gore u tekstu, pri čemu antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena jeste mišje antitelo ili njegov fragment.

[0025] U poželjnom izvođenju ovog opisa, ovde je dato SOST antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu sekvenca promenljivog regiona teškog lanca mišjeg antitela jeste prikazana kao SEK ID BR: 5, ili sekvence aminokiseline koje imaju najmanje 95% identičnosti sa SEK ID BR: 5.

[0026] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je obezbeđeno SOST antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu sekvenca promenljivog regiona lakog lanca mišjeg antitela jeste poznata kao SEK ID BR: 6, ili sekvence aminokiseline koje imaju najmanje 95% identičnosti sa SEK ID BR: 6.

[0027] U poželjnom izvođenju ovog opisa, ovde je dato SOST antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu sekvenca promenljivog regiona teškog lanca mišjeg antitela jeste prikazana kao SEK ID BR: 5, i sekvenca promenljivog regiona lakog lanca mišjeg antitela se pokazala kao SEK ID BR: 6.

[0028] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato mišje antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore, pri čemu promenljivi region teškog lanca antitela obuhvata FR region teškog lanca izveden iz mišjeg IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 ili nekog varijantnog rešenja.

[0029] U preporučenom izvođenju ovog opisa, obezbeđeno je mišje antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu iznad koji još obuhvata konstantni region teškog lanca izveden iz mišjeg IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 ili neke varijante.

[0030] U preporučenom izvođenju ovaj opis, ovde je dato mišje antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu promenljivi region lakog lanca antitela još obuhvata FR region lakog lanca izabran iz mišjeg κ ili λ lanca ili neke njegove varijante.

[0031] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato mišje antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, koji još obuhvata konstantni region lakog lanca izabran iz mišjeg κ ili λ lanca ili neke njegove varijante.

[0032] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je obezbeđeno SOST antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu sekvenca antitela jeste himerno antitelo ili humanizovano antitelo ili njegov fragment.

[0033] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore, pri čemu promenljivi region teškog lanca humanizovanog antitela još obuhvata FR region teškog lanca izveden iz humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 ili njegovog varijantnog rešenja.

[0034] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu sekvenca FR regiona teškog lanca na promenljivom regionu teškog lanca humanizovanog antitela jeste izvedena iz okvirne sekvence FR1, FR2, FR3 regiona i FR4 regiona teškog lanca klicine linije čoveka IGHV1-18<*>01, ili njegovog mutanta, poželjno sekvenca mutanta obuhvata 0-10 povratnih mutacija aminokiseline.

[0035] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu to humanizovano antitelo obuhvata sekvencu promenljivog regiona teškog lanca izabranu iz SEK ID BR: 14-16 ili njegov mutant ili sekvence aminokiseline koje imaju najmanje 95% identičnost sa SEK ID BR: 14-16.

[0036] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu sekvenca FR regiona lakog lanca na promenljivom regionu lakog lanca humanizovanog antitela jeste izvedena iz okvirne sekvence FR1, FR2, FR3 regiona i FR4 regiona lakog lanca humane klicine linije IGKV1-39 *01 i/ili IGKV4-1*01 ili njegov mutant, preporučljivo taj mutant obuhvata 0-10 povratnih mutacija aminokiseline.

[0037] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu to humanizovano antitelo obuhvata sekvencu promenljivog regiona lakog lanca izabran iz SEK ID BR: 17-19 ili njegov mutant ili skevence aminokiseline koje imaju najmanje 95% identičnost sa SEK ID BR: 17-19.

[0038] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu to humanizovano antitelo obuhvata promenljivi region teškog lanca izabranu iz SEK ID BR: 14-16 i promenljivi region lakog lanca izabran iz SEK ID BR: 17-19.

[0039] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu to humanizovano antitelo obuhvata kombinaciju sekvence promenljivog regiona teškog lanca i sekvence promenlijvog regiona lakog lanca izabrane iz jednog od (a) do (c):

(a) Promenljivi region teškog lanca Ab-5 sekvence iz SEK ID BR: 14, i promenljivi region lakog lanca Ab-5 sekvence iz SEK ID BR: 17;

(b) Promenljivi region teškog lanca Ab-9 sekvence iz SEK ID BR: 15, i promenljivi region lakog lanca Ab-9 sekvence iz SEK ID BR: 18; ili

(c) Promenljivi region teškog lanca Ab-10 sekvence iz SEK ID BR: 16, i promenljivi region lakog lanca Ab-10 sekvence iz SEK ID BR: 19.

[0040] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu konstantni region teškog lanca humanizovanog antiela obuhvata konstantni region izveden iz humanog IgG1 njegove varijatne, humanog IgG2 ili njegove varijante, humanog IgG3 ili njegove varijante, ili humanog IgG4 ili njegove varijante, preporučljivo konstantni region izveden iz humanog IgG1 ili njegove varijante ili humanog IgG4 ili njegove varijante, najpreporučljivije konstantni region izveden iz IgG4 ili njegove varijante. Konstantni region takođe može da obuhvati neke modifikacije kao što je "YTE" da promeni učinak.

[0041] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu to humanizovano antitelo obuhvata sekvencu teškog lanca pune dužine izabranu iz SEK ID BR: 24-26 ili sekvenci koje iamju najmanje 90% identičnosti sa SEK ID BR: 24-26.

[0042] U preporučenom izvođenju ovaj opis, ovde dat je humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu promenljivi region lakog lanca humanizovanog antitela još obuhvata FR region lakog lanca izabran iz mišjeg κ ili λ lanca ili neke njegove varijante.

[0043] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, koji još obuhvata konstantni region lakog lanca izabran iz humanog κ ili λ ili neke njegove varijante.

[0044] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu to humanizovano antitelo obuhvata sekvencu lakog lanca pune dužine izabranu iz SEK ID BR: 27-29 ili sekvence koje imaju najmanje 90% identičnosti sa SEK ID BR: 27-29.

[0045] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu to humanizovano antitelo obuhvata teški lanac pune dužine izabran iz SEK ID BR: 24-26 i laki lanac pune dužine izabran iz SEK ID BR: 27-29.

[0046] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato humanizovano SOST antitelo ili njegov fragment kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu to humanizovano antitelo obuhvata kombinaciju sekvence lakog lanca pune dužine i sekvence teškog lanca pune dužine izabranu iz jednog od sledećeg:

Ab-10: Teški lanac prikazan kao SEK ID BR: 24 i laki lanac prikazan kao SEK ID BR: 27; Ab-9: Teški lanac prikazan kao SEK ID BR: 25 i laki lanac prikazan kao SEK ID BR: 28; ili Ab-5: Teški lanac prikazan kao SEK ID BR: 26 i laki lanac prikazan kao SEK ID BR: 29.

[0047] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je dato SOST antitelo ili njegov fragment vezivanja antigena kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu fragment vezivanja antigena jest Fab, Fv, sFv ili F(ab’)2.

[0048] Ovaj opis još obuhvata DNK sekvencu koja kodira proizvod prekursora ekspresije SOST antitela ili njegovog fragmenta vezivanja antigena opisanog gore u tekstu.

[0049] Ovaj opis još obuhvata vektor ekspresije koji obuhvata DNK sekvencu kao što je opisano gore.

[0050] Ovaj opis još obuhvata ćeliju domaćina transformisanu sa vektorom ekspresije kao što je opisano gore u tekstu.

[0051] U preporučenom izvođenju ovog opisa, ovde je data ćelija domaćin kao što je opisano gore u tekstu, pri čemu je ćelija domaćin ćelije sisara preporučljivo ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0052] Ovaj opis još obezeđuje farmaceutsku supstancu, koja obuhvata SOST antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen kao što je opisano gore u tekstu, kao i jedan ili više farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, razblaživač ili nosač.

[0053] Ovaj opis još obezbeđuje upotrebu SOST antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen kao što je opisano gore u tekstu, ili farmaceutsku supstancu koja obuhvata isti, za pripremanje leka za pospešenje najmanje jednog od koštane mase, mineralne gustine kosti, mineralnog sadržaja kosti ili čvrstoće kosti.

[0054] Ovaj opis još obuhvata upotrebu SOST antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen kao što je opisano gore u tekstu, ili farmaceutsku supstancu koja obuhvata isti, za dobijanje leka za lečenje genom SOST posredovane bolesti ili poremećaja kosti, pri čemu je bolest ili poremećaj izabrana iz osteoporoze, osteopenije ili osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, periodontalne bolesti ili bolesti ili poremećaja višestrukog mijeloma; poželjno osteoporoze.

[0055] Ovaj pronalazak još obezbeđuje postupak za lečenje ili sprečavanje SOST genom posredovane bolesti ili poremećaja, obuhvata isporuku subjektu kom je potrebno terapijski delotvorne količine SOST antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen kao što je opisano gore u tekstu, ili farmaceutske supstance koja obuhvata isti; pri čemu je bolest ili poremećaj izabrana iz osteoporoze, osteopenije ili osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, periodontalne bolesti ili boleti ili poremećaja višestrukog mijeloma; poželjno osteoporoze.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0056]

Slika 1 pokazuje sa vremenom povezanu krivulju koncentracije leka humanizovanog anti-SOST antitela iz ovog pronalaska kod makaki majmuna. Rezultati pokazuju da je, pri istoj dozi, vredmpst AUC0-t (mg/ml*dan) dobijen korišćenjem humanizovanog antitela iz ovog pronalaska bila 22,3, što je bilo više od 2 puta od količine koja je utvrđena u slučaju Romosozumab (9,95) pozitivnog antitela.

Slika 2 je pokazala procenat povećanja mineralne gustine kosti (BMD) pršljena slabinskog dela dobijena korišćenjem humanizovanog anti-SOST antitela iz ovog pronalaska. Rezultati pokazuju da je efikasnost humanizovanog anti-SOST antitela iz ovog pronalaska bila zavisna od doze kod makaki majmuna. Humanizovano anti-SOST antitelo Ab-5 ima efikasnost od 10 mg/kg koja je uporediva sa 30 mg/kg pozitivnog molekula. Ovao znači da je kod majmuna efikasnost molekula iz ovog pronalaska bila tri puta u odnosu na Romosozumab pozitivni molekul.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0057] Dobro je poznato stručnjaku u ovoj oblasti da doza leka zavisi od raznoraznih činilaca uključujući, ali ne ograničeno na sledeće: aktivnost specifičnih jedinjenja koja su korišćena, starost pacijenta, težina pacijetna, zdravstveno stanje pacijenta, režim ishrane pacijenta, vreme isporuke, režim isporuke, brzina izlučivanja, kombinacija lekova, itd. Pored toga, optimalni modaliteti lečenja, kao što je režimi lečenja, dnevna doza antitela ili njegove supstance, ili tip farmaceutski prihvatljive soli, može da bude validiran prema tradicionalnim režimima lečenja.

[0058] Da bi se ovaj pronalazak lakše razumeo, izvesni tehnički i naučni pojmovi su specifično definisani dole u tekstu. Osim ako nije specifično drugačije definisano ovde na nekom drugom mestu u tekstu, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni ovde imaju isto značenje kako to obično razume prosečan stručnjak u ovoj oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak.

POJMOVI

[0059] Kako se ovde koristi, kod od jednog slova i kod od tri slova za amino kiseline su kako je opisano u J. Biol. chem, 243, (1968) p3558. Chem, 243, p3558 (1968).

[0060] Kada je ovde korišćen, pojam "Sklerostin" ili "SOST" ili "SOST protein" se odnosi na sklerostin (SOST) proizvod ekspresije gena (protein). Osim ako nije drugačije navedeno, kao što je mišji SOST (m-SOST) ili makaki majmun SOST (makaki-SOST), ovaj pojam se odnosi na humani SOST (h-SOST) u ovom pronalasku. Sekvence nukleotida humanog, mišjeg i makaki majmuna SOST korišćene u ovom pronalasku su dobijene iz GenBank, na primer, NP_079513.1 obezbeđuju humanu SOST sekvencu proteina.

1

[0061] Pojam "antitelo" kao referenca na anti-sklerostin antitelo iz ovog pronalaska (ili jednostavno, "antitelo iz ovog pronalaska"), kako je ovde korišćeno, se odnose na monoklonalno antitelo. Monoklonalno antitelo ili mAb prema ovom pronalasku se odnose na antitelo dobijeno od pojedinačnog soja ćelije klona koje nije ograničeno na eukariotsku, prokariotsku ili fag kloniranu liniju ćelije. Monoklonalna antitela ili fragmente vezivanja antigena moguće je dobiti rekombinacijom, na primer, tehnika hibridoma, tehnika rekombinacije, tehnika prikaza faga, tehnika sinteze, ili drugih kombinacija prethodnih stanja ili drugih tehnika već poznatih u ovoj oblasti.

[0062] "Monoklonalno antitelo" ili "antitelo iz ovog pronalaska" ili jednostavno "antitelo" može biti nedirnuto antitelo (koje obuhvata Fc region nedirnut ili pune dužine), ili deo ili fragment antitela koji obuhvata deo koji vezuje antigen, npr., Fab fragment, Fab’ fragment, ili F(ab’)2 fragment ili himerno ili humanizovano antitelo. Specifično preporučeni antigen vezujući fragmenti nekog antitela iz ovog pronalaska zadržavaju sposobnost da inhibiraju ili neutralizuju jednu ili više karakteristika bioaktivnosti sklerostina nekog sisara in vivo ili in vitro. Na primer, u jednom izvođenju, antigen vezujući deo antitela iz ovog pronalaska može inhibirati interakciju humanog sklerostina sa jednim ili više od njegovih liganda i/ili može inhibirati jednu ili više receptorom posredovanih funkcija humanog sklerostina.

[0063] Pored toga, "monoklonalno antitelo" ili "antitelo iz ovog pronalaska" ili jednostavno "antitelo" kako je ovde korišćeno može da bude Fv fragment pojedinačnog lanca koji je moguće proizvesti spajanjem DNK koja kodira LCVR i HCVR sa linker sekvencom (Videti, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp 269-315, 1994). Jasno je da bez obzira na to da li su precizirani antigen vezujući fragmenti ili delovi, pojam "antitelo" kako je ovde korišćen uključuje takve fragmente ili delove kao što su oblici pojedinačnog lanca. Osim ako nije drugačije naznačeno, protein je uključen unutar pojma "antitelo", dokle god taj protein zadržava sposobnost da specifično veže sklerostin.

[0064] Pojam "anti-sklerostin antitelo", "antitelo specifično za vezivanje na humani sklerostin", "anti-SOST antitelo", "anti-SOST", "SOST antitelo" ili "antitelo koje se vezuje na SOST" u ovom pronalasku se odnosi na antitelo koje je sposobno da veže SOST sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo moguće koristiti kao dijagnostičko sredstvo i/ili terapijski agens za ciljni SOST.

[0065] Kako je ovde korišćeno, pojam "specifično vezivannje" je određeno tehnikama dostupnim u ovoj oblasti, kao što je konkurentni ELISA, BIACORE® ogled, ili KINEXA® ogled. Na primer, pojam se takođe odnosi, kada antigen vezujući domen antitela iz ovog pronalaska jeste specifičan za specifičan epitop izveden pomoću brojnih antigena, u tom slučaju, antitelo koje izvodi domen vezivanja antigena može specifično da se veže na raznovrsne antigene koji nose takav epitop. Pojam "epitop" se odnosi na molekularni deo koji antitelo može prepoznati i vezati u antigen vezujućem regionu jednog ili više antitela.

[0066] Fraza "bioaktivnost" u vezi sa antitelom iz ovog pronalaska, uključuje, ali se ne ograničava na, epitop ili afinitet vezivanja antigena, sposobnost da neutrališe ili antagonizuje bioaktivnst sklerostina in vivo ili in vitro, IC50 izmeren u ogledu vezivanja sklerostin antitela in vitro vezivanje na i blokiranje humanog sklerostina i LRP-6 (npr., kao što je opisano u Primeru 1, 2 ovde) ili je izmereno u drugom in vitro ogledu aktivnosti, in vivo i/ili in vitro stabilnost antitela. Gorepomenuta svojstva ili karakteristike moguće je primetiti ili izmeriti korišćenjem tehnika poznatih u oblasti uključujući, ali ne i ograničeno na, ELISA, kompetitivnu ELISA tehniku, analiza rezonace površinskog plazmona, in vitro i in vivo oglede neutralizacije bez granice, vezivanje receptora i imunohemija sa segmentima tikiva iz različitih izvora (uključujući humana tkiva, tkiva primata) ili bilo koji drugi izvor kao što može biti slučaj.

[0067] Fraza "bioaktivnost" kao referenca na sklerostin, uključuje, ali se ne ograničava na, specifično vezivanje sklerostina na drugi protein (npr., receptor ili član TGF- β familije), jednu ili više funkcija humanog sklerostina posredovanih receptorom, transdukciju signala, imunogena svojstva, in vivo ili in vitro stabilnost, uticaj na nivo ili aktivnost drugog proteina in vivo ili in vitro (videti npr., Primer 1-5), nivo ekspresije sklerostina i raspodele tkiva.

[0068] Pojam "inhibira" ili "neutralizuje" kao što je korišćeno ovde u tekstu, u pogledu bioaktivnosti antitela iz ovog pronalaska, znači sposobnost da održivo antagonizuju, zabrane, spreče, obuzdaju, uspore, ometu, eliminišu, zaustave, smanje ili obrnu bioaktivnost sklerostina (npr., kao što je izmereno u primeru 2 ovde).

[0069] Pojam "Kabat numeracija" kako je ovde korišćen se prepoznaje u ovoj oblasti i odnosi na sistem numeracije ostataka aminokiseline koji su održiviji (t.j., hiperpromenljiv) od drugih ostataka aminokiselina u regionima teškog i lakog lanca nekog antitela (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci.190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242 (1991)). Pozicioniranje CDR u promenljivom regionu antitela prati Kabat numeraciju ili jednostavno "Kabat."

[0070] Pojmovi "subjekat" i "pacijent", ovde ravnopravno korišćeni, se odnose na sisara, poželjno na čoveka. U izvesnom izvođenju, subjekat se još karakteriše time što boluje od bolesti ili poremećaja ili stanja koje bi bilo poboljšano od smanjenog nivoa sklerostina ili smanjene bioaktivnosti aktivnosti sklerostina.

[0071] Pojam "vektor" se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji može da transportuje drugu nukleinsku kiselinu na koju je funkcionalno spojen. Takav pojam uključuje ali nije ograničen na plazmide i virusne vektore. Izvesni vektori su sposobni za autonomno umnožavanje u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni, dok drugi vektori mogu da budu integrisani u genom ćelije domaćina posle uvođenja u ćeliju domaćina, i time se vektori umnožavaju zajedno sa genomom domaćina. Pored toga, izvesni vektori su sposobni za usmeravanje ekspresije gena na koje su funkcionalno povezani. Takvi vektori se ovde pominju kao "vektori rekombinantne ekspresije" (ili jednostavno "vektori ekspresije"). Primeri vektora su dobro poznati u ovoj oblasti.

[0072] Kako je ovde korišćeno, izrazi "ćelija" "ćelija domaćina" i "kultura ćelije" se koriste ravnopravno i uključuju različitu ćeliju ili kulturu ćelije koja je primalac bilo kog izolovanog polinukleotida iz ovog pronalaska ili bilo kog rekombinantnog vektor(a) koji obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira HCVR, LCVR ili antitelo iz ovog pronalaska. Ćelija domaćin uključuje ćelije transformisane, transdukovane (prenete) ili inficirane jednim ili više rekombinantnih vektor(a) ili polinukleotid koji eksprimuje monoklonalno antitelo iz ovog pronalaska ili laki lanac ili njegov teški lanac.

[0073] Svaki teški lanac antitela pune dužine obuhvata promenljivi region teškog lanca N terminusa (ovde "HCVR") i konstantni region teškog lanca. Svaki laki lanac antitela pune dužine obuhvata promenljivi region lakog lanca N terminusa (ovde "LCVR") i konstantni region lakog lanca. HCVR i LCVR region moguće je još podpodeliti u region hipervarijabilnosti, koji je poznat pod pojmom region određivanja komplementarnosti ("CDR"). Ispreplitani sa CDR, za regione koji su očuvaniji se koristi pojam okvirni region ("FR"). Funkcionalna sposobnost antitela da veže specifični antigen ili epitop je u velikoj meri pod uticajem šest regiona određivanja komplementarnosti (CDR) prisutnih u promenljivom regionu antitela. Svaki HCVR i LCVR obuhvata tri CDR (HCDR1, HCDR2 i HCDR3 u HCVR i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 u LCVR) i četiri FR, raspoređena od amino terminusa do karboksi terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR sadrže većinu ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. CDR pozicioniranje unutar promenljivog regiona prati Kabat.

[0074] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda, i karakteriše ih specifičan kostantni region kao što je poznato u ovoj oblasti. Teški lanci se klasifikuju kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE, prema opisanom redosledu. Neke od ovih izotipova zauzvrat je moguće dodatno podeliti u podklase npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Svaki tip teškog lanca je naznačen specifičnim konstantnim regionom sa sekvencom već poznatom u ovoj oblasti. Konstanti region kapa lakog lanca i konstantni

1

regioni IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 teškog lanca su poželjni konstantni regioni u antitelima iz ovog pronalaska. Himerna antitela mogu imati konstantne regione koji su nehumanog porekla, poželjno pacovskog ili mišjeg.

[0075] Kako je ovde korišćeno, "region vezivanja antigena" ili "deo vezivanja antigena" se odnosi na deo unutar promenljivog regiona molekula antitela, koji obuhvata ostatke aminokiseline koji reaguju međusobno sa antigenom i daju antitelu specifičnost i afinitet za taj antigen. Ovaj deo antiela uključuje ostatke okvirnog regiona aminokiseline neophodne za održavanje propisne konformacije ostataka vezivanja antigena.

[0076] Poželjno antitelo iz ovog opisa obuhvata šest CDR koji imaju sekvence aminokiseline iz SEK ID BR: 7, 8, 9, 10, 11 i 12. Poželjnije antitelo iz ovog opisa obuhvata šest CDR koji imaju sekvence aminokiseline iz SEK ID BR: 19, 27, 28, 32, 36 i 40. Još poželjnije, optimizovani CDR u antitelima iz ovog opisa obuhvataju najmanje jednu supstituciju aminokiseline kada je upoređena sa CDR prisutnim u roditeljskom antitelu, optimizovani CDR u antitelima iz ovog opisa obuhvataju šest CDR koji imaju sekvence aminokiseline od SEK ID BR: 7, 13, 9, 10, 11 i 12. CDR ovih preporučenih antitela postoje na poziciji kao što je naznačeno u Tabeli 1 dole u tekstu. CDR se pozicioniraju u promenljivom regionu prema Kabat.

[0077] Preporučeno antitelo iz ovog opisa obuhvata HCVR sa sekvencom aminokiseline iz SEK ID BR 14, 15 i 16. Druga poželjna monoklonalna antitela iz ovog opisa obuhvataju LCVR sa sekvencom aminokiseline iz SEK ID BR: 17, 18 i 19. Još poželjnije, antitelo iz ovog opisa obuhvata LCVR od SEK ID BR: 17 i HCVR od SEK ID BR: 14. Alternativno antitelo iz ovog opisa obuhvata LCVR od SEK ID BR: 18 i HCVR od SEK ID BR: 15. Još poželjnije antitelo iz ovog opisa obuhvata HCVR od SEK ID BR: 16 i LCVR od SEK ID BR: 19. Takvi HCVR iz ovog opisa su poželjno povezani na konstantni region teškog lanca, poželjno humanog porekla, poželjno konstantni region teškog lanca IgG1 ili IgG4, još poželjnije konstantni region teškog lanca IgG4. Takvi LCVR su poželjno spojeni na konstantni region lakog lanca, poželjno humanog porekla, poželjno kapa lanac.

[0078] Jedno poželjno antitelo iz ovog opisa obuhvata polipeptid teškog lanca koji ima sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 24 i polipeptid lakog lanca koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 27.

[0079] Još jedno poželjno antitelo iz ovog opisa obuhvata polipeptid teškog lanca koji ima sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 25 i polipeptid lakog lanca koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 28.

[0080] Još jedno poželjno antitelo iz ovog pronalaska obuhvata polipeptid teškog lanca koji ima sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 26 i polipeptid lakog lanca koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 29.

[0081] U tabeli 1 dole u tekstu su SEK ID BR njihovih sekvenci.

Tabela 1 Spisak sekvenci promenljivog regiona mAb

[0082] Preporučljivo, antitelo iz ovog pronalaska još karakteriše to što ima KD za humani sklerostin manji od oko 10nM, 3nM, 1nM ili 0,3nM, još preporučljivije manje od oko 0,1 nM. Pored toga, preporučuje se da je takvo antitelo još definisano time što ima KD za sklerostin makaki majmuna manji od oko 10nM, 3nM, 1nM ili 0,3nM, ili još poželjnije manji od oko 0,1nM.

[0083] Preporučljivo, antitelo u ovom pronalasku je još karakteristično po tome što ima IC50 manji od 100nM ili manji, od oko 50 ili 30 nM ili manje, još poželjnije oko 25 nM, i još poželjnije oko 20 nM (npr., 17,9 nM) ili manje, kao što je mereno u eksperimentu blokiranja vezivanja između humanog sklerostina i LRP-6 (videti, npr., Primer 2 ovde u tekstu).

[0084] Još poželjnije, antitelo iz ovog pronalaska još karakteriše to što ima KD za humani sklerostin manji od oko 10nM, 3nM, 1nM ili 0,3nM, još poželjnije manji od oko O.lnM, i još poželjnije time što ima IC50 manji od 100nM ili manji, oko 50 ili 30 nM ili manje, još poželjnije oko 25 nM, i još poželjnije oko 20 nM (npr., 17,9nM) ili manje, kao što je izmereno u eksperimentu blokiranja vezivanja između humanog sklerostina i LRP-6. Šest CDR, HCVR, LCVR, HCVR i LCVR, ceo teški lanac, ceo laki lanac, ili ceo teški lanac i ceo laki lanac unutar pomenutog antitela su definisani specifičnom sekvencom kao što je prikazano u SEK ID BR ovde.

[0085] Još poželjnije, antitelo iz ovog pronalaska još karakteriše to što ima KD za humani sklerostin od manje od oko 10nM, 3nM, 1nM ili 0,3nM, još poželjnije manje od oko O.lnM, i takođe je karakterisano time što ima IC50 manji od 100nM ili manje, oko 50 ili 30 nM ili manje, još poželjnije oko 25 nM, i od toga poželjnije oko 20 nM (npr., 17,9 nM) ili manje, kao što je izmereno u eksperimentu blokiranja vezivanja između humanog sklerostina i LRP-6; i takođe je naznačeno time što ima KD od manje od 10nM, 3nM, 1nM ili 0,3nM, još poželjnije manje od oko O.lnM, kao što je izmereno u in vitro ELISA eksperimentu vezivanja sklerostin antitela upotrebom cijano sklerostina. Šest CDR, HCVR, LCVR, HCVR i LCVR, ceo teški lanac, ceo

1

laki lanac, ili ceo teški lanac i ceo laki lanac unutar pomenutog antitela su definisani specifičnom sekvencom kao što je prikazano u SEK ID BR ovde.

Ekspresija antitela

[0086] Ovaj pronalazak je takođe usmeren na ćelije domaćina koje eksprimuju antisklerostin antitelo iz ovog pronalaska. Uspostavljanje i izolacija linija ćelije domaćina koje proizvode antitelo iz ovog pronalaska moguće je postići korišćenjem standardnih tehnika poznatih u ovoj oblasti.

[0087] Veoma raznovrsni sistemi ekspresije domaćina poznati u ovoj oblasti mogu biti korišćeni da bi se eksprimovalo anatitelo iz ovog pronalaska, uključujući prokariotske (bakterijske) i eukariotske sisteme ekspresije (kao što je kvasac, bakulovirus, biljne, ćelije sisara i druge životinje, transgenske životinje, i ćelije hibridoma), kao što su i sistemi ekspresije prikaza faga.

[0088] Antitelo iz ovog pronalaska je moguće pripremiti rekombinantnom ekspresijom gena lakog i teškog lanca imunoglobulina u ćeliji domaćinu. Da bi se eksprimovalo antitelo rekombinantno, ćelija domaćin je transformisana, transduktovana, ili inficirana sa jednim ili više rekombinantnih vektora ekspresije koji nose DNK fragmente koji kodiraju teške i/ili lake lance imunoglobulina tog antitela, tako da su laki i/ili teški lanci eksprimovani u ćeliji domaćinu. Teški lanac i laki lanac mogu da budu eksprimovani nezavisno od različitih promotera na koje su funkcionalno povezani u jednom vektoru ili, alternativno, teški lanac i laki lanac mogu biti eksprimovani nezavisno od različitih promotera na koje su funkcionalno povezani u dva vektora (jedan eksprimuje teški lanac i jedan eksprimuje laki lanac). Opciono, teški lanac i laki lanac mogu da budu eksprimovani u različitim ćelijama domaćinima.

[0089] Dodatno, vektor rekombinantne ekspresije može da kodira signalni peptid koji olakšava izlučivanje anti-sklerostin antitela lakog i/ili teškog lanca iz ćelije domaćina. Gen anti-sklerostin antitela lakog i/ili teškog lanca je moguće klonirati u vektor, tako da signalni peptid jeste funkcionalno povezan u okviru na amino terminus gena lanca antitela. Signalni peptid može biti peptid signala imunoglobulina ili heterologni signalni peptid. Preporučljivo, rekombinantna antitela se izlučuju u podlogu u kojoj su ćelije domaćini kultivisane, iz kojih je antitela moguće oporaviti ili prečistiti.

[0090] Izolovana DNK koja kodira HCVR region može da se pretvori u gen teškog lanca pune dužine funkcionalnim povezivanjem HCVR kodirajuće DNK na drugi DNK molekul koji kodira konstantni region teškog lanca. Sekvence gena konstantnog regiona teškog lanca

1

ljudi kao i drugih sisara su poznate u ovoj oblasti. DNK fragmente koji obuhvataju ove regione moguće je dobiti npr., standardnim PCR pojačavanjem. Konstantni region teškog lanca može biti bilo kog tipa, (npr., IgG, IgA, IgE, IgM ili IgD), bilo koje klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) ili konstantni region potklase i bilo koja njegova alotipska varijanta kao što je opisano u Kabat (supra). Poželjniji konstantni region teškog lanca obuhvata konstantni region IgG1 ili njegovu varijantu ili IgG4 ili njegovu varijantu.

[0091] Izolovana DNK koja kodira LCVR region može biti pretvorena u gen lakog lanca pune dužine (kao i u Fab gen lakog lanca) funkcionalnim povezivanjem LCVR kodirajuće DNK na drugi DNK molekul koji kodira konstantni region lakog lanca. Sekvence gena konstantnog regiona lakog lanca ljudi kao i drugih sisara su poznate u ovoj oblasti. DNA fragmente koji obuhvataju ove regione moguće je dobiti postupcima kao što je standardno PCR pojačavanje. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region.

[0092] Preporučene ćelije domaćini sisara za upotrebu u svom pronalasku su ćelije CHO (ćelije jajnika kineskog hrčka) (npr., ATCC CRL-9096), HEK 293E ćelije (npr. ATCC CRL-1573), NS0 ćelije, SP2/0 ćelije i COS ćelije (ATCC npr., CRL-1650, CRL-1651). Dodatne ćelije domaćina za upotrebu u ovom pronalasku uključuju druge ćelije sisara, ćelije kvasca i prokariotske ćelije. Kada se vektori rekombinantne ekspresije koji kodiraju gene antitela uvedu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda dovoljnog da se omogući ekspresija antitela u ćelijama domaćina ili, poželjnije, tokom perioda vremena dovoljnog da se omogući izlučivanje antitela u podlozi kulture u kojoj se uzgajaju ćelije domaćina. Antitela je moguće oporaviti iz ćelije domaćina i/ili podoge kulture korišćenjem standardnih postupaka prečišćavanja.

[0093] Izraženi proizvod (u obliku celog antitela, lakog lanca i teškog lanca ili drugih oblika imunoglobulina) moguće je prečistiti u skladu sa standardnim postupcima u ovoj oblasti, uključujući taloženje amonijak sulfata, jonsku izmenu, afinitet, reverznu fazu, hromatografijom na koloni hidrofobnom interakcijom, gel elektroforezu i slično. Pretežno su čisti imunoglobulini sa od najmanje oko 90%, 92%, 94% ili 96% homogenosti poželjniji, i za farmaceutske upotrebe najpoželjnija je homogenost 98 do 99% ili viša. Pošto se prečiste, delimično prečišćena ili prečišćena do homogenosti kao što je poželjno, sterilna antitela mogu zatim da se koriste terapijski, kao što je ovde objašnjeno.

Humanizovano antitelo

[0094] Preporučljivo, antitelo iz ovog pronalaska koje treba koristiti za terapijsku upotrebu,

1

ima sekvencu okvira i konstantnog regiona (do mere da postoji u antitelu) izvedenu iz sisara, pomenuto antitelo moguće je koristiti kao terapijski agens za smanjenje mogućnosti za terapijsko antitelo da indukuje odgovor imunog sistema naspram terapijskog antitela kod sisara. Humanizovana antitela su od specifičnog interesa, jer su dragocena za terapijsku primenu i smanjenje verovatnoće odgovora humanog anti-mišjeg antitela koje je često postmatrano kada su antitela mišjeg porekla ili antitela koja obuhvataju delove mišjeg porekla isporučena humanom subjektu. Preporučljivo ubrizgana humanizovana antitela mogu imati vek poluraspada kao što se to prirodno javlja kod humanih antitela kada se uporede sa npr. mišjim antitelima, čime se omogućava manja učestalost isporuke ili manja doza koju treba isporučiti subjektu.

[0095] Pojam "humanizovano antitelo" kako je ovde korišćeno se odnosi na antitelo pri čemu najmanje jedan deo ima humano poreklo. Na primer, humanizovano antitelo može obuhvatiti delove izvedene iz antitela nehumanog porekla (kao što je miš) i delove izvedene iz antitela humanog porekla, spojene zajedno, npr., hemijski uobičajenim tehnikama (npr., sinteze) ili pripremljene kao dodirni polipeptid korišćenjem tehnika genetičkog inžinjeringa.

[0096] Preporučljivo, "humanizovano antitelo" ima CDR koji potiču od ili su izvedeni iz roditeljskog antitela (t.j., nehumanog antitela, poželjno mišjeg monoklonalnog antitela), dok okvirni i konstantni region, u meri u kojoj postoje jeste prisutan, (ili njegov značajan ili veći deo, t.j., najmanje oko 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) se kodiraju informacijom sekvence nukleinske kiseline koja nastaje u regionu imunoglobulina klicine linije čoveka (videti, npr., ImMunoGeneTics međunarodnu bazu podataka - International ImMunoGeneTics Database) ili u rekombinovanim ili mutiranim njegovim oblicima, bez obzira na to da li su ili ne pomenuta antitela proizvedena u humanoj ćeliji. Preporučljivo, najmanje dva, tri, četiri, pet ili šest CDR od humanizovanog antitela se optimizuje pomoću CDR ne-humanog roditeljskog antitela iz kog je izvedeno humanizovano antitelo, da bi se generisalo željeno svojstvo, npr., poboljšana specifičnost, afinitet ili neutralizacija, koju je moguće identifikovati ogledom skrininga (pretrage radi odabira), npr., ELISA ogledom. Preporučljivo optimizovani CDR u antitelu iz ovog pronalaska obuhvata najmanje jednu supstituciju aminokiseline kada je upoređeno sa onom koja je prisutna u roditeljskom antitelu. Izvesne supstitucije aminokiseline u CDR humanizovanih antitela iz ovog pronalaska, kada se uporede sa onima kod roditeljskih antitela (videti primer 4 ovde u tekstu), smanjuju verovatnoću nestabilnosti antitela (npr., uklanjanje Asn ostataka u CDR) ili smanjenu imunogenost antitela kada je isporučeno humanom subjektu (npr., kao što je predviđeno pomoću IMMUNOFILTER ™ Technology).

[0097] Humanizovana antitela poželjno sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz

1

nehumanog antitela. Humanizovana antitela mogu obuhvatiti ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaocu ni u CDR ili sekvencama okvira uvezenim iz roditeljskog antitela. Humanizovana antitela je moguće podvrći in vitro mutagenezi korišćenjem rutinskih postupaka u ovoj oblasti i, time, sekvencama aminokiseline okvirnog regiona od HCVR i LCVR regiona humanizovanih rekombinantnih antitela su sekvence koje, kako su izvedene iz onih koje se odnose na sekvence HCVR i LCVR klicine linije čoveka, ne moraju da postoje prirodno unutar repertoara klicine linije antitela čoveka in vivo. Razmatra se da su takve sekvence aminokiseline okvirnih regiona HCVR i LCVR humanizovanih rekombinantnih antitela najmanje 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% ili poželjnije najmanje 99% ili najpoželjnije 100% identične sekvenci klicine linije čoveka.

[0098] U preporučenom izvođenju, humanizovano antitelo iz ovog pronalaska obuhvata sekvencu okvira teškog lanca klicine linije čoveka i sekvencu okvira lakog lanca klicine linije čoveka. Takve okvirne sekvence moguće je dobiti iz javnih DNK baza podataka koje obuhvataju sekvence gena antitela klicine linije iz objavljenih referenci. Na primer, sekvence DNK klicine linije humanih gena promenljivog regiona teškog i lakog lanca moguće je nači u "VBase" bazi sekvenci klicine linije čoveka (dostupnoj na www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), kao i u Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekvence proteina od interesa za imuni sistem), 5th Ed. U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, pri čemu se mišje CDR sekvence SOST humanizovanog antitela biraju iz SEK ID BR: 7, 8, 9, 10, 11 i 12. Projektovani su i odabrani okviri promenljivi regioni humanog antitela, pri čemu sekvenca okvirnog regiona lakog lanca na promenljivom regionu lakog lanca tog antitela jeste izvedena iz FR sekvence regiona na promenljivom regionu lakog lanca antitela je izvedena iz FR1, FR2, FR3 regiona i FR4 regiona lakog lanca klicine linije čoveka IGKV1-39 * 01 i IGKV4-1 * 01; pri čemu FR sekvenca regiona teškog lanca na promenljivom regionu teškog lanca tog antitela jeste izvedena iz FR1, FR2, FR3 regiona i FR4 region teškog lanca klicine linije čoveka IGHV1-18 *01.

[0099] Postoji više postupaka dostupnih u ovoj oblasti za generisanje humanizovanih antitela. Na primer, humanizovana antitela je moguće proizvesti dobijanjem sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju HCVR i LCVR roditeljskog antitela (npr., mišje antitelo ili antitelo napravljeno pomoću hibridoma) koje specifično vezuje sklerostin, preporučljivo humani sklerostin, identifikuje CDR u pomenutom HCVR i LCVR (nehumanom), i kalemljenu kao što je CDR kodiranje humanih sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju okvir. Opciono, CDR region je moguće optimizovati nasumičnom mutagenezom ili na specifičnim lokacijama kako bi se zamenila jedna ili više aminokiselina u CDR sa različitom

1

aminokiselinom pre kalemljena CDR regiona u okvirni region. Alternativno, CDR region moguće je optimizovati posle umetanja u humani okvirni region korišćenjem postupaka dostupnih stručnjaku u ovoj oblasti.

[0100] Pošto se sekvence kodirajnja CDR presade (nakaleme) na druge izabrane humane sekvence kodiranja okvira, sekvence DNK dobijene kao rezultat kodiraju humanizovane sekvence promenljivog lakog i promenljivog teškog lanca se zatim eksprimuju da proizvedu humanizovano antitelo koje vezuje sklerostin. Humanizovani HCVR i LCVR mogu biti eksprimovani kao deo celine anti-sklerostin molekula antitela, t.j., kao protein fuzije sa humanim sekvencama konstantnog domena. Međutim, HCVR i LCVR sekvence je moguće eksprimovati i da proizvedu humanizovan anti-sklerostin Fv, u odsustvu konstantnih sekvenci.

[0101] Reference još opisuju postupke koji uključuju humanizaciju mišjeg antitela koje je moguće koristiti, uključuju npr., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991 i postupak Vintera (Winter) i saradnika [Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)].

Terapijske upotrebe

[0102] Farmaceutska supstanca koja obuhvata anti-sklerostin monoklonalno antitelo iz ovog pronalaska može da se koristi da bi se povećalo barem jedno od koštane mase, mineralne gustine kosti, mineralnog sadržaja kosti ili čvrstoće kosti bilo u kosti pršljena ili nepršljenskoj kosti, ili oba, kada je delotvorna količina isporučena humanom subjektu kom je potrebno. Farmaceutska supstanca obuhvata anti-sklerostin monoklonalno antitelo iz ovog pronalaska moguće je koristiti da bi se smanjila učestalost preloma kosti pršljena i/ili nepršljenske kosti, kada je delotvorna količina isporučena humanom subjektu kom je potrebno. Smanjenje učestalosti preloma uključuje smanjenje verovatnoće ili stvarne pojave preloma za humanog subjekta kada se uporedi sa netretiranom kontrolnom populacijom.

[0103] Pored toga, antitelo iz ovog pronalaska može biti korisno za lečenje stanja, bolesti, ili poremećaja kod kojih prisustvo sklerostina prouzrokuje ili doprinosi neželjenim patološkim dejstvima; ili smanjenju nivoa sklerostina ili bioaktivnosti sklerostina ima terapijsku korist kod humanih subjekata. Takva stanja, bolesti ili poremećaji uključuju, ali se ne ograničavaju na, osteoporozu, osteopeniju, osteoartritis, bol povezan sa osteoartritisom, periodontalnom bolešću ili višestrukim mijelomom. Subjekti mogu biti mužjaci ili ženke. Preporučljivo humani subjekat je pod rizikom od preloma kosti pršljena

2

i/ili nepršljenske kosti, još poželjnije humani subjekat je pod rizikom od, ili boluje od, osteoporoze. Humani subjekat je poželjno žena i još poželjnije žena u opasnosti od postmenopauzne osteoporoze. Smatra se da subjekat u bilo kom stadijumu osteoporoze može imati koristi od postupka iz ovog pronalaska.

[0104] Pored toga, razmatra se upotreba antitela iz ovog pronalaska u proizvodnji leka za lečenje najmanje jednog od gore opomenutog.

[0105] Pojmovi "terapija" i "lečenje" su predviđeni da se odnose na sve postupke kod kojih može biti usporavanja, prekida, zaustavljanja, kontrolisanja, ili zaustavljanja napredovanja poremećaja opisanih ovde, ali ne ukazuje obavezno i na ukupnu eliminaciju svih simptoma poremećaja. "Terapija", kako je ovde korišćeno, uključuje isporuku jedinjenja iz ovog pronalaska za lečenje bolesti ili stanja kod sisara, posebno kod čoveka, i uključuje: (a) inhibiranje daljeg napredovanja bolesti, t.j., zaustavljanje razvoja bolesti; i (b) ublažavanje bolesti, t.j. prouzrokovanje regresije bolesti ili poremećaja ili ublažavanje simptoma ili komplikacija bolesti. Režimi doziranja mogu biti prilagođeni da obezbede optimalan željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, može biti isporučena pojedinačna bolusna injekcija, nekoliko podeljenih doza mogu biti nezavisno isporučene tokom vremena ili doza može da bude proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno hitnost situacije koja se leči.

Farmaceutska supstanca

[0106] Antitelo iz ovog pronalaska moguće je ugraditi u farmaceutsku supstancu pogodnu za isporuku humanom subjektu. Antitelo iz ovog pronalaska moguće je isporučiti humanom subjektu samo ili u kombinaciji sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosačem i/ili razblaživačem u pojedinačnoj dozi ili u više doza. Takve farmaceutske supstance su projektovane da budu pogodne za izabrani režim isporuke, i farmaceutski prihvatljive razblaživače, nosače, i/ili ekscipijente kao što su disperzioni agensi, puferska sredstva, surfaktanti, konzervansi, agensi rastvaranja, agensi izotoničnosti, agensi stabilizacije i slični koji se koriste kao što je pogodno. Pomenute supstance je moguće projektovati u skladu sa uobičajenim tehnikama opisanim u farmaceutskom priručniku Remington, npr., (Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995) koji obezbeđuje priručnik formulacionih tehnika kao što je opšte poznato stručnjacima u toj oblasti. Pogodni nosači za farmaceutske supstance uključuju bilo koji materijal koji, kada je kombinovan sa monoklonalnim antitelom iz ovog pronalaska, zadržava aktivnost molekula i nereaktivan je sa imunim sistemom subjekta.

[0107] Farmaceutska supstanca koja obuhvata anti-sklerostin monoklonalno antitelo iz ovog pronalaska može da se isporuči subjektu koji je pod rizikom da ispolji patologije kao što je ovde opisano, npr., osteoporozu, osteoartritis ili druge degenerativne poremećaje kosti, korišćenjem standardnih tehnika isporuke.

[0108] Farmaceutska supstanca iz ovog pronalaska poželjno sadrži "delotvornu količinu" antitela iz ovog pronalaska. Delotvorna količina se odnosi na količinu neophodnu (u dozama i za periode vremena i za sredstva isporuke) da se postigne željeni terapijski rezultat. Delotvorna količina antitela može da varira zavisno od činilaca kao što su stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnost antitela ili dela antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Delotvorna količina je takođe količina kod koje terapijski korisna dejstva prevagnu nad bilo kakvim toksičnim ili štetnim dejstvom antitela.

[0109] Delotvorna količina je najmanje minimalna doza, ali manje od toksične doze, aktivni sastojak koji je neophodan da učestvuje u terapijskoj korisnosti za subjekta. Drugim rečima, delotvorna količina ili terapijski delotvorna količina antitela iz ovog pronalaska je količina koja kod sisara, poželjno ljudi, (i) povećava najmanje jedno od koštane mase, mineralne gustine kosti, mineralnog sadržaja kosti ili čvrstoće kosti, ili (ii) leči stanje, poremećaj ili bolest pri čemu prisustvo sklerostina prouzrokuje ili doprinosi neželjenom patološkom dejstvu, ili (iii) smanjuje nivo sklerostina ili bioaktivnost sklerostina daje kao rezultat korisno terapijsko dejstvo kod sisara, poželjno čoveka; pomenuto stanje, poremećaj ili bolest uključuju ali se ne ograničavaju na osteoporozu, osteopeniju, osteoartritis, reumatoidni artritis, periodontalnu bolest ili multipli mijelom.

[0110] U daljem tekstu, ovaj pronalazak je detaljnije opisan sa pozivom na primere. Međutim, obim ovog pronalaska nije ograničen na to.

[0111] U primerima ili primerima ispitivanja iz ovog pronalaska, gde nisu opisani specifični uslovi, eksperimenti se generalno izvode pod uobičajenim uslovima ili u skladu sa uslovima koje je sugerisao proizvođač sirovog materijala ili proizvoda. Videti Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Contemporary Molecular Biology Approach, koji su napisali Ausubel et al., Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NY. Kada poreklo reagenasa nije specifično navedeno, reagensi su komercijalno dostupni uobičajeni reagensi.

PRIMER

Primer1. SOST kloniranje i ekspresija

[0112] Sekvenca kodiranja humanog sklerostina sa His oznakom (His-h-SOST), sekvenca kodiranja humanog sklerostina sa Flag oznakom (h-SOST-Flag), sekvenca kodiranja mišeg sklerostina sa Flag oznakom (m-SOST-Flag), i sekvenca kodiranja sklerostina makaki majmuna sa Flag oznakom (makaki-SOST-Flag) su sintetisani od strane CRO Shanghai Xuguan Biotechnology Development Co., Ltd (Sekvence uzorka gornjeg rekombinantnog proteina sklerostina su projektovane pomoću ovog pronalaska), i klonirane u pTT5 vektor (Biovector, Kat #: 102762) prema opisanom redosledu. Rekombinantni SOST protein je eksprimovan u 293 ćeliji i prečišćen primerom 2. Prečišćeni protein je moguće koristiti u sledećim eksperimentima primera.

DNK sekvenca koja kodira humani sklerostin sa Histag (His-h-SOST):

2

DNK sekvenca koja kodira humani sklerostin sa Flagtag (h-SOST-Flag):

DNK sekvenca koja kodira mišji sklerostin sa Flagtag (m-SOST-Flag):

DNK sekvenca koja kodira makaki (cyno-) sklerostin sa Flagtag (cyno-SOST-Flag):

Primer 2. Prečišćavanje SOST rekombinantnog proteina

. Koraci prečišćavanja SOST rekombinantnog proteina sa His oznakom

[0113] Supernatant ekspresije ćelije je centrifugiran visokom brzinom da bi se uklonile nečistoće, i pufersko sredstvo je zamenjeno sa PBS, imidazol je dodat u krajnju koncentraciju od 5 mM. Nikl stub je ekvilibrisan sa PBS rastvorom koji sadrži 5 mM imidazola i opran sa 2-5 zapremina stuba. Posle toga, supernatant je dodat u kolonu. Stub je opran sa PBS rastvorom koji sadrži 5 mM imidazola sve dok A280 očitavanje nije smanjeno na polaznu vrednost. Zatim je hromatografski stub opran sa PBS plus 10 mM imidazola da bi se uklonili nespecifično vezani proteini, i prikupljen je efluent. Ciljni protein je procenjen sa PBS rastvorom koji obuhvata 300mM imidazola, i prikupljen je sadržaj sa vrha eluacije.

[0114] Prikupljeni efluent je dodatno prečišćen jonskom izmenom (SP kolona). Pripremiti rastvor A: 0,01M PB, pH 8,0. Pripremiti rastvor B: rastvor A 1M NaCl. Ciljni protein koji je eluiran PBS rastvorom koji sadrži imidazol je prvo dijaliziran naspram rastvora A, i SP stub je uravnotežen sa rastvorom A; uzorak je dodat; gradijent koncentracije B rastvora je 0-100%; ciljni protein je eluiran sa 10 količinama u stubu i prikupljen je sadržaj sa vrha eluacije. Dobijeni protein je bio identifikovan elektroforezom, mapiranjem peptida i LC-MS, i tačan uzorak je dodeljen za upotrebu. Dobijen je humani sklerostin sa His oznakom (Hish-SOST).

2

2. Koraci prečišćavanja SOST rekombinantnog proteina sa His oznakom

[0115] Uzorak je centrifugiran visokom brzinom da bi se uklonile nečistoće i koncentrovan do odgovarajuće zapremine. Flag afinitetni stub je uravnotežen sa 0,5xPBS i opran sa 2-5 zapremina kolone. Uzorci supernatanta su dodati u stub posle uklanjanja nečistoće. Stub je opran sa 0,5xPBS sve dok A280 očitavanje nije smanjeno na polaznu vrednost. Zatim, stub je opran sa PBS koji obuhvata 0,3 M NaCl, i protein nečistoće je opran i prikupljen. Ciljni protein je eluiran sa 0,1 M sirćetne kiseline (pH 3,5-4,0) i prikupljen, pH je podešena na neutralnu vrednost. Prikupljeni uzorak je bio identifikovan elektroforezom, mapiranjem peptida i LC-MS, i tačan uzorak je dodeljen za upotrebu.

[0116] Humani sklerostin sa Flag oznakom (h-SOST-Flag), mišji sklerostin sa Flag oznakom (m-SOST-Flag) i sklerostin makaki (cyno-) majmuna sa Flag oznakom (cyno-SOST-Flag) su dobijeni i korišćeni za test učinka antitela iz ovog pronalaska.

Primer3. Proizvodnja monoklonalnog antitela anti-humanog SOST

[0117] Anti-humano SOST monoklonalno antitelo je proizvedeno od strane imunizujućih miševa. Eksperimentalni SJL beli miševi, ženke, 6-nedelja starosti (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., broj licence za proizvodnju životinje: SCXK (Peking) 2012-0001).

[0118] Okruženje u kom su hranjeni: SPF nivo. Pošto su miševi kupljeni, životinje su čuvane u laboratoriji tokom 1 nedelje, sa 12/12 sati ciklusa svetla/tame na temperaturi od 20-25°C,vlažnost 40-60%. Miševi koji su aklimatizovani na okruženje su podeljeni u dve grupe (A/B), 10 miševa po svakoj grupi.

[0119] Humani SOST rekombinantni protein sa His oznakom (His-h-tag) je korišćen kao imunogen. U grupi A, Frojndov (Freund’s) adjuvans (sigma broj partije: F5881/F5506) je korišćen za emulzifikaciju: Prva imunizacija je izvedena sa potpuno Frojndovim (Freund’s) adjuvansom (CFA), i pospešujuće imunizacije su izvedene sa nepotpuno Frojndovim (Freund’s) adjuvansom (IFA). Odnos antigena prema adjuvansu je bio 1:1, 200 μl/200 μg/miša (prva imunizacija), 200 μl/100μg/miša (pospešenje). U grupi B, unakrsna imunizacija je izvedena sa Titermax (sigma broj partije: T2684) i Alum (Thremo broj partije: 77161). Odnos antigena prema adjuvansu (titermaks) je bio 1:1, i odnos antigena prema adjuvansu (Alum) je bio 3:1, 200 μl/200 μg/miša (prva imunizacija), 200 μl/100μg/miša (pospešenje). Antigen je emulzifikovan i inokulisan 0, 14, 28, 42, 56 dana.

[0120] Na dan 0, miš u A/B grupi je dobio injekciju intraperitonealno (IP) 50 μg/miša

2

emulzifikovanog antigena. A 14. dana, miševima je potkožno (s.c.) ubrizgana injekcija sa 25 μg/mišu na više mesta (obično 6-8 mesta na leđima). 28. i 42. dana, bilo na leđima ili intreperitonealna injekcija antigena je izabrana prema otocima na leđima i uslovima nadutosti u stomaku. Pospešena imunizacija je izvedena intraperitonealnom (IP) injekcijom rastvora antigena formulisanog na 200 μg/mišu 3 dana pre fuzije splenocita.

[0121] Titar krvi je testitran je izveden 22, 36, 50, i 64 dana, i aktivnost vezivanja mišjeg seruma na humani sklerostin je izmerena ELISA postupkom Primera ispitivanja 1, rezultat je pokazan u Tabeli 2. Posle četvrte imunizacije, miševi sa tendencijom visokog titra krvi na platformi su izabrani za fuziju splenocita. Ćelije hibridoma su dobijene fuzionisanjem splenocita sa mijelomnim Sp2/0 ćelijama (ATCC® CRL-8287™) korišćenjem optimizovanog postupka fuzije posredovane PEG-om. Aktivnost blokiranja vezivanja između humanog SOST i LRP-6 pomoću anti-humanog SOST antitela u mišjem serumu je detektovana kao Primer ispitivanja 2, i monoklonalni hibridoma soj Ab-1 ćelije sa dobrom aktivnošću vezivanja i blokiranja in vitro je izabrana, rezultati su prikazani u Tabeli 2<.>

Tabela2. Aktivnost mišjeg antitela in vitro

Primer 4. Humanizacija mišjeg anti-humanog sklerostin antitela

[0122] Izabran je monoklonalni hibridoma soj ćelije Ab-1 sa dobrom bioaktivnošću in vitro, hibridoma je bila sekvencirana, i humanizacija, rekombinantna ekspresija i procena aktivnosti su izvedeni u nastavku.

[0123] Proces sekvenciranja hibridoma je izveden kao u nastavku. Ćelije hibridoma su prikupljene u logaritamskoj fazi rasta, i RNK je izolovana u Trizol (Invitrogen 15596-018, u skladu sa instrukcijama sa kompleta), i zatim je reverzna transkripcija (PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, kat # 2680A) za RNK izvedena prema instrukciji. cDNK dobijene reverznom transkripcijom su pojačane tehnikom polimerazne lančane reakcije (PCR) korišćenjem mišjeg Ig-Primer kompleta (Novagen, TB326 Rev.B 0503) i sekvencionirane u kompaniji za sekvenciranje. Sekvence aminokiseline koje odgovaraju dobijenoj DNK sekvenci su prikazane kao SEK ID BR: 5 i SEK ID BR: 6:

2

Promenljivi region teškog lanca je dobijen iz ćelija hibridoma:

Promenljivi region lakog lanca je dobijen iz ćelija hibridoma:

[0124] Postupak humanizacije mišjeg anti-humanog SOST monoklonalnog antitela je izveden kao što je opisano u brojnim radovima u ovoj oblasti. Ukratko, domen konstantnog regiona roditeljskog (mišjeg antitela) je zamenjen humanim domenom konstantnog regiona, i klicina linija humanog antitela je izabrana prema homologiji između mišjeg i humanog antitela. Molekuli kandidata koji pokazuju dobru aktivnost u ovom opisu su humanizovani i rezultati su bili kao u nastavku.

1. CDR region mišjeg anti-sklerostin antitela

[0125] Ostaci aminokiseline VH/VL CDR su identifikovani i anotirani sistemom Kabat numeracije.

[0126] CDR sekvence mišjeg Ab-1 u ovom pronalasku su opisane u Tabeli 3:

Tabela 3. CDR sekvence mišjeg anti-sklerostin antitela

2. Odabir sekvence FR regiona humane klicine linije

[0127] Na osnovu VH/VL CDR uobičajena struktura mišjeg antitela, sekvence promenljivog regiona teškog i lakog lanca su upoređene sa bazom podataka klicine linije antitela, izabran

2

je uzorak klicine linije čoveka sa visokom homologijom. Pri čemu je okvirni region humanog lakog lanca klicine linije potekao od humanog gena kapa lakog lanca, i poželjno, IGKV1-39 *01 ili IGKV4-1 *01 uzoraka lakog lanca humane klicine linije je izabrano u ovom pronalasku. Okvirni region teškog lanca humane klicine linije je potekao od humanog teškog lanca, i poželjno, IGHV1-18 *01 uzoraka teškog lanca humane klicine linije je izabran u ovom pronalasku. CDR region mišjeg antitela Ab-1 je transplantiran u izabrani humanizovani uzorak, zamenom humanizovanog promenljivog regiona, i zatim je rekombinovan sa IgG konstantnim regionom. Na osnovu trodimenzionalne strukture mišjeg antitela, povratne mutacije su izvedene na uhvaćenim ostacima, na ostacima koji imaju direktne interakcije sa CDR regionima, kao i na ostacima koji imaju važna dejstva na konformacije VL i VH, i ostatke u CDR regionu koji ispoljavaju hemijsku nestabilnost (teški lanac CDR2 je optimizovan da bi se dobio novi teški lanac CDR2 sekvence DIDPNDGDILYNQKFRD , SEK ID BR: 13) su optimizovani, i dobijen je finalni humanizovani molekul. Sekvence promenljivog regiona teškog lanca finalnog humanizovanog molekula su prikazane kao SEK ID BR: 14-16, i ove sekvence je moguće kombinovati sa bilo čim iz konstantnog regiona teškog lanca prikazanim kao SEK ID BR: 20-22. Sekvence promenljivog regiona lakog lanca finalnog humanizovanog molekula su prikazane kao SEK ID BR: 17-19, i ove sekvence je moguće kombinovati sa sekvencama konstantnog regiona lakog lanca prikazanim kao SEK ID BR: 23, prema opisanom redosledu.

1. Promenljivi region teškog lanca:

[0128]

Promenljivi region teškog lanca Ab-5:

2

Promenljivi region teškog lanca Ab-9:

Promenljivi region teškog lanca Ab-10:

2. Konstantni region teškog lanca svakog antitela može da bude bilo koja od sledćeih sekvenci:

[0129]

Konstantni region teškog lanca humanog IgG4 (K ostaci aminokiseline su obrisani):

Konstantni region teškog lanca humanog IgG4:

Konstantni region teškog lanca humanog IgG2:

. Promenljivi region lakog lanca:

[0130]

Promenljivi region lakog lanca Ab-5:

Promenljivi region lakog lanca Ab-9:

Promenljivi region lakog lanca Ab-10:

4. Konstantni region lakog lanca potiče iz humanog κ lanca:

[0131]

1

[0132] Antitela su klonirana, eksprimovana i prečišćena kloniranjem gena i rekombinantnom ekspresijom, i zatim su detektovana ELISA ogledom vezivanja (Primer ispitivanja 1 i Primer ispitivanja 3), ogledom blokiranja vezivanja između antigena i receptora (Primer ispitivanja 2), Biacore (Primer ispitivanja 4), detekcija aktivnosti ćelije (Primer ispitivanja 5) itd., najzad, humanizovana antitela Ab-5, Ab-9, Ab-10 sa najboljom aktivnošću su odabrana, i sekvence su prikazane kao u nastavku:

Humanizovano antitelo Ab-10:

Teški lanac:

Laki lanac:

2

Humanizovano antitelo Ab-9: Teški lanac:

Laki lanac:

Humanizovano antitelo Ab-5:

Teški lanac:

Laki lanac:

[0133] Podaci o aktivnosti vezivanja između humanizovanog anti-human SOST antitela i humanog sklerostina (h-SOST- Flag) u ovom pronalasku su prikazani u Tabeli 4.

Primeri ispitivanja:

Procena bioaktivnosti in vitro

Primer ispitivanja 1: Ogled vezivanja ELISA

[0134] Sklerostin antitelo blokira vezivanje sklerostina sa njegovim receptorom na membranu ćelije, čime se blokira nizvodna signalna putanja sklerostina. ELISA eksperimenti su korišćeni da bi se detektovanola svojstva vezivanja sklerostin antitela. Sklerostin sa Flag oznakom (h-SOST-FLAG, kodiran SEK ID BR: 2) je bio biotinilisan priborom za označavanje biotinom (Dojido Chem, LK03), i imobilisan u EIA/RIA ploču sa 96 pregrada putem vezivanja na streptavidin sloj obloge kojom je premazan. Pošto je dodato antitelo, jačina signala je korišćena da bi se odredila aktivnost vezivanja između antitela i humanog sklerostina.

[0135] Streptavidin (Sigma, S4762-5MG) je razblažen do koncentracije od 5 µg/ml sa PBS puferom na pH 7,4 (Sigma, P4417-100TAB), i dodat u EIA/RIA ploču sa 96 pregrada (Corning,CLS3590-100EA) u količini od 5 µl/pregradi i zatim, ploča je inkubirana u inkubatoru na 37°C tokom 2 sata. Odbacivanje tečnosti, ploče su blokirane sa 200 µl/pregradi rastvora za blokiranje koji sadrži 5% obranog mleka (Guangming obrano mleko) u PBS, i inkubirane u inkubatoru na 37°C tokom 2,5 sata ili tokom noći na 4°C (16-18 sati). Posle blokiranja, blokirajući rastvor je odstranjen i ploča je oprana 5 puta sa PBST puferom (PH 7,4 PBS koji sadrži 0,05% tween-20). Biotinilisani SOST-FLAG protein (R&D SYSTEM, 1505-LR-025) je razblažen sa uzorkom puferskog stredstva za razblaživanje (PH 7,4 PBS sadrži 1%BSA) u 05 µg/ml i dodato je u svaku pregradu na 50 µl/pregradi, zatim je ploča inkubirana u inkubatoru na 37°C tokom 2 sata. Posle inkubacije, rastvor reakcije u ploči je odbačen, i ploča je oprana sa PBST tokom 6 puta, i zatim je 50 µl/pregradi antitela rastvora gradijenta sa uzorkom puferskog sredstva za razblaženje je dodato, i ploča je inkubirana u inkubatoru na 37°C tokom 2 sata. Ploča je oprana 6 puta sa PBST posle inkubacije, i zatim je dodata sa 100 µl/pregradi HRP-označenog kozjeg anti-mišjeg (Jackson Immuno Research, kat br. 115-035-003) ili HRP-označenog kozjeg anti-humanog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research, kat br. 109-035-003) razblaženo u uzorku za

4

razblaženje, i inkubirano na 37°C tokom 1 sat. Posle pranja ploča sa PBST tokom 6 puta, 50 µl/pregradi TMB supstrata (KPL, kat br. 52-00-03) je dodato u svaku pregradu, i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 10-15 min, reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µl 1M H2SO4 u svaku pregradu. Vrednost OD (optičke gustine) na talasnoj dužini od 450nm je očitana na NOVOStar čitaču mikroploče, i zatim su EC50 vrednosti vezivanja između sklerostin antitela iz ovog pronalaska i humanog sklerostina izračunate, rezultati su pokazani u Tabeli 4.

Tabela 4. Aktivnost vezivanja između humanizovanog anti-SOST antitela i humanog sklerostina (h-SOST-Flag)

[0136] Rezultati su pokazali da humanizovana anti-humana SOST antitela u ovom pronalasku zadržavaju istu aktivnost vezivanja kao njihovo roditeljsko antitelo.

Primer ispitivanja 2: Ogled anti-SOST antitelo blokira vezivanje sklerostina sa LRP-6

[0137] Sklerostin može da inhibira aktivnost wnt/ β-katenin signalne putanje kroz vezivanje sa ko-receptorom LRP5/LRP- 6 od wnt/ β-katenin signalne putanje na membrani ćelije, da bi se blokirala osteogeneza. U ovom eksperimentu, aktivnost pregledanog anti-humanog SOST antitela da bi se blokiralo vezivanje između humanog SOST/majmunskog SOST i humanog LRP-6 je detektovano korišćenjem ogleda blokiranja in vitro. Pozitivna kontrola je bio Romosozumab (Postupak dobjanja je kao onaj koji je opisan u referenci Svetske zdravstvene organizacije (WHO) Informacija o leku, sv.25, br.4, 2011, 413-465, P434)).

[0138] Postupak je da je kozje anti-humano Fc antitelo obloženo na EIA/RIA ploču sa 96 pregrada i zatim je LRP-6- Fc protein fuzije dodat za inkubaciju. Biotinilisan protein sklerostina i anti-sklerostin antitelo su istovremeno inkubirani, i zatim su dodati u ploču za inubaciju. Posle pranja ploče, količina vezivanja između biotinilisanog sklerostina i LRP-6 je izmerena, i IC50 vrednost aktivnosti blokiranja sklerostin antitela je izračunata.

[0139] Kozje anti-humano Fc antitelo je razblaženo u koncentraciju od 1 µg/ml sa PBS puferom na pH 7,4 (Sigma, P4417-100TAB), i dodat u EIA/RIA ploču sa 96 pregrada u količini od 100 µl/pregradi i zatim, ploča je inkubirana u inkubatoru na 37°C tokom 2 sata. Pošto je tečnost bačena, ploče su blokirane sa 200 µl/pregradi rastvora za blokiranje koji sadrži 5% obranog mleka (Guangming obrano mleko) u PBS, i inkubirano na 37°C tokom 2,5 sata. Posle blokiranja, blokirajući rastvor je odstranjen i ploča je oprana 5 puta sa PBST puferom (PH7,4 PBS koji sadrži 0,05% tween-20). LPR-6-Fc protein fuzije (R&D SYSTEM, 1505-LRP-025) je razblažen sa uzorkom puferskog sredstva za razblaživanje (PH7,4 PBS koji sadrži 1% BSA) do 1 µg/ml i dodato je 50 µl/pregradi, zatim je ploča inkubirana na 37°C tokom 2 sata. Humani sklerostin protein (R&D SYSTEM, 1406-ST/CF) u koncentraciji od 1,12 µg/ml je označen korišćenjem biotin pribora za označavanje (Dojido Chemical, LK03), i dodat je u ploču za razblaživanje u količini od 30 µl/pregradi, i 30 µl/pregradi probnog sklerostin antitela razblaženog do odgovarajuće koncentracije je dodato u svaku pregradu, zatim je ploča pomešana i inkubirana u inkubatoru na 37°C tokom 2 sata. Posle inkupacije, rastvor reakcije u ploči je odbačen. Ploča je oprana sa PBST tokom 6 puta, i zatim je mešavina antigena i antitela u ploči rastvora dodata u ploču i inkubirana na 4°C tokom noći (16-18 sati). Rastvor u ploči je odbačen, i ploča je oprana 6 puta sa PBST; zatim je 50 µl/pregradi polimera spreptavidin peroksidaze (Sigma, S2438-250UG), koji je razblažen sa uzorkom puferskog sredstva za razblaženje u odnosu od 1:600, je dodat u svaku pregradu, i ploča je inkubirana na 37°C tokom 1 sat. Posle pranja ploče tokom 6 puta sa PBST, 50 µl/pregradi TMB supstrata (KPL, kat br.52-00-03) je dodato u svaku pregradu, i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 3-10 min, reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µl 1M H2SO4 u svaku pregradu. Vrednost OD (optičke gustine) na talasnoj dužini od 450 nm je pročitana na NOVOStar čitaču mikroploče, i zatim su izračunate IC50 vrednosti sklerostin antitela za blokiranje vezivanja između humanog sklerostina i LRP-6, rezultati su prikazani u Tabeli 5.

[0140] Gornji postupak je moguće koristiti da bi se detektovale IC50 vrednosti sklerostin antitela u ovom pronalasku da bi se blokiralo vezivanje između majmunskog sklerostina (kodiranog i eksprimovanog SEK ID BR: 4 i zatim prečišćenog) i LRP-6, rezultati su prikazani u Tabeli 5<.>

Tabela5. Aktivnost humanizovanog SOST antitela u ovom pronalasku da bi se blokiralo vezivanje između sklerostina različitih vrsta i LRP-6

[0141] Rezultati su pokazali da aktivnost blokiranja za humanizovano anti-humano SOST antitelo u ovom pronalasku da bi se blokiralo vezivanje između humanog majmnunskog sklerostina i LRP-6 jeste uporediva sa aktivnošću Romosozumab pozitivnog.

Primer ispitivanja 3: Biacore određivanje

[0142] Biacore (GE) je korišćen da bi se odredio afinitet humanizovanog anti-SOST antitela sa humanim, majmunskim, mišjim SOST.

[0143] Anti-humano antitelo za registrovanje je kovalentno povezano na CM5 biosenzorni čip (kat. # BR-1000 -12, GE) od Biacore instrumenta (Biacore X100, GE) u skladu sa postupkom opisanim u instrukciji anti-humanog pribora za hvatanje (GE, kat.# BR-1008-39) za afinitet registrovanja (hvatanja) količine antitela za ispitivanje. Zatim, gradijent koncentracija SOST antigena (human SOST, R&D SYSTEM, kat.#1406-ST-025/CF, R&D; majmunski SOST, makaki cyno-SOST-Flag, dobijena prečišćavanje, kodirano SEK ID BR: 4 iz Primera 1; mišje SOST, m-SOST-Flag, dobijeno prečišćavanjem, kodirano pomoću SEK ID BR: 3 iz Primera 1) su protekli kroz površinu biočipa. Signal reakcije je detektovan u stvarnom vremenu korišćenjem Biacore instrumenta (GE, BiacoreX100) da bi se dobile krivulje udruživanja i razdruživanja. Posle svakog ciklusa razdruživanje je završeno u eksperimentu, biočip je opran i regenerisan sa rastvorom za regeneraciju u anti-humanom priboru za registrovanje. Amino-spojen pribor je korišćen u eksperimentima je kupljen od GE (Kat. # BR-1000-50, GE), i pufer je bio HBS-EP 10 x puferski rastvor (kat. # BR-1006-69, GE), i pufer je razblažen do 1 x (pH 7,4) sa D.I. Water.

[0144] Podaci koji su dobijeni su fitovani GE BIAevaluation verzija 4.1 softvera korišćenjem 1:1 Langmuir modela, i vrednost afiniteta je generisana, rezultati su prikazani u Tabeli 6.

Tabela 6. Aktivnost in vitro humanizovanog antitela naspram sklerostina na različitim vrstama

[0145] Humanizovano antitelo Ab-5 u ovom pronalasku ima visok afinitet sa humanim SOST i majmunskim SOST, i takav afinitet je više od 10 puta viši u poređenju sa pozitivnim molekulom.

Primer ispitivanja 4: Test aktivnosti anti-sklerostin antitela na ćeliji

[0146] U ovoj studiji, in vitro aktivnost SOST antitela u ovom pronalasku na ćelijama je procenjena prema EC50 vrednosti detektovanjem aktivnosti alkalin fosfataze (ALP) u ćelijama.

[0147] C2C12 ćelija (Kineska akademija nauka, banka ćelije, Katalog # GNM26) je kultivisana u DMEM podlozi koja sadrži 10% FBS, i provučena 2 do 3 puta nedeljno u odnosu od 1:5 ili 1:10. Tokom prolaza, podloga kulture je odbačena i 5ml od 0,25% tripsina je korišćeno da bi se obrao sloj ćelije, i zatim je tripsin uklonjen. Ćelije su razgrađene u inkubatoru tokom 3-5 minuta i vraćene u suspenziju u svežoj podlozi. 100 μL suspenzije ćelije je dodata u ploču kulture ćelija od 96 pregrada pri gustini od 5 x 10<4>ćelija/ml, podloga je bila DMEM sa 10% FBS, i samo 100μl DMEM podloge sa 10% FBS je dodato izvan ploče sa 96 pregrada. Zaim su ploče kultura kultivisane u inkubatoru tokom 24 sata (37°C, 5% CO2). Kada se primeti prianjanje podloga će biti bačena; i 70 μl DMEM podloge sa 10% FBS je dodato u svaku pregradu.10 μl od wnt3a (R&D, Katalog #5036-WN-010) u finalnoj koncentraciji od 100 ng/ml i SOST (R&D, Katalog # 1406-ST-025) u finalnoj koncentraciji od 5 μg/ml su dodati u svaku pregradu, prema opisanom redosledu. Test uzorci su razblaženi sa PBS u različite gradijente koncentracije, i 10 μl različitih koncentracija test uzorka je dodato u ploču u kojoj je kultura. Zatim je kultura inkubirana u inkubatoru tokom tri dana (37°C, 5% CO2). Podloga je odbačena, i 150 μl od ALP supstrata je dodato u svaku pregradu, i ploča kulture je inkubirana u inkubatoru tokom 2 sata. Vrednost OD (optičke gustine) na talasnoj dužini od 450nm je očitana na čitaču mikroploče (PerkinElmer, Katalog# VICTOR<3>), i zatim su EC50 vrednosti izračunate, rezultati su prikazani u Tabeli 7.

Table7. Test aktivnosti antitela u ovom pronalasku na ćelije

[0148] Rezultati su pokazali da aktivnost humanizovanog SOST antitela Ab-5 u ovom pronalasku deluje na ćelije uporediva sa aktivnošću Romosozumab pozitivnog antitela.

Farmakokinetička procena

Primer ispitivanja 5: Procena T1/2 humanizovanog anti-SOST antitela kod makaki majmuna

[0149] Tri makaki majmuna korišćena u eksperimentu su bila ženke, 4-5 godine starosti, manje od 4 kg, i kupljene su od Guangxi Guidong Primate Breeding Development Co., Ltd. Okruženje sa prehranom: uobičajena prostorija. Pošto su makaki majmuni kupljeni, svaki majmun je držan u odvojenom kavezu, i majmunima su ad libitum u neograničenim količinama dati voda i režim ishrane. Trajanje za prilagođavanje u laboratorijskom okruženju nije manje od 14 dana, sa regulacijom od 12/12 sati ciklusa svetlo/tama, na temperaturi od 23-29°C i relativnoj vlažnosti od 40-70%. Tri makaki majmuna su numerisana pre početka eksperimenta. Na dan eksperimenta, svaki makaki majmun je dobio injekciju potkožno sa lekom koji se testira ili pozitivnim molekulom (30 mg/kg) pri 8 ml/majmun/isporučene terapije.

[0150] Majmuni su fiksirani na stolicu za majmune i krv je uzeta preko vene lakta ili sfenozne vene (oko 1,5 mL krvi svakog uzorka) da bi se dobio serum i sačuvao na -20 stepeni. Vremenska tačka uzorkovanja krvi je bila: 12 sati pre isporuke, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 8 sati, 12 sati, 24 sata (drugi dan) posle isporuke prvog dana, trećeg dana, petog dana, sedmog dana, četrnaestog dana, dvadeset-prvog dana i dvadeset-osmog dana; Pošto su prikupljeni uzorci krvi, koncentracija seruma tog leka je detektovana pomoću ELISA i PK analiza je izvedena, dobijeni rezultati su prikazani u Tabeli 8.

Tabela8. T1/2 od humanizovanog anti-SOST antitela kod makaki majmuna

[0151] Ovi rezultati su pokazali da molekuli humanizovanog kandidata imaju duži poluvek raspada kod makaki majmuna in vivo, što je oko dva puta (Ab-5) koliko je utvrđeno za Romosozumab pozitivni molekul.

Procena biološke aktivnosti in vivo

Primer ispitivanja 6: Procena efikasnosti in vivo humanizovanog anti-SOST antitela kod makaki majmuna

[0152] Tri makaki majmuna korišćena u eksperimentu su bila ženke, 4-5 godine starosti, manje od 4 kg, su kupljene od Guangxi Guidong Primate Breeding Development Co., Ltd. Okruženje sa prehranom: uobičajena prostorija. Pošto su makaki majmuni kupljeni, svaki majmun je držan u odvojenom kavezu, i majmunima su ad libitum u neograničenim količinama dati voda i režim ishrane. Trajanje za prilagođavanje u laboratorijskom okruženju nije manje od 14 dana, sa regulacijom od 12/12 sati ciklusa svetlo/tama, na temperaturi od 23-29°C i relativnoj vlažnosti od 40-70%. Tri makaki majmuna su numerisana dan pre početka eksperimenta, i zatim je uzeta krv posle anestezije da bi se dobio serum i plazma, i testirani su mineralna gustina kosti i mineralni sadržaj kosti slabinskog i distalnog radijusa, vrednost dobijena kao rezultat je korišćena kao osnovna vrednost. Svaki makaki majmun je dobio injekciju potkožno sa lekom koji se testira (10, 30, 60 mg/kg, različite doze) i pozitivni molekuli (30mg/kg) u količini od 8 ml/majmun/isporuka sredstva. Lekovi su isporučeni jednom mesečno tokom ukupno 2 puta. Tokom eksperimenta, u četvrtoj i osmoj nedelji posle isporuke, životinje su testitrane za mineralnu gustinu kosti i mineralni sadržaj kosti pršljenova slabinskog dela i distalnog radijusa, prema opisanom redosledu.

[0153] Dva meseca posle eksperimenta, sve životinje su anestezirane i eutanizovane (sa viškom doze pentobarbital natrijuma). Posle toga su testirani mineralna gustina kosti i mineralni sadržaj kosti drugog do petog slabinskog i distalnog radijusa.

[0154] Rezultati su pokazani u Tabeli 9, Slika 1 i Slika 2.

Tabela 9. Efikasnost anti-humanog SOST antitela kod makaki majmuna

[0155] Rezultati pokazuju da je in vivo efikasnost humanizovanog anti-SOST antitela u ovom pronalasku bila zavisna od doze kod makaki majmuna. Efikasnost humanizovanog anti-SOST antitela Ab-5 u 10 mg/kg je bila jednaka pozitivnom molekulu u količini od 30 mg/kg (Slika 2). Ovo znači da je efikasnost humanizovanog anti-SOST antitela u ovom pronalasku dva puta viša od efikasnosti Romosozumab pozitivnog molekula kod majmuna. Kada je isporučeno u istoj dozi, AUC0-t (mg/ml*dan) humanizovano telo je bilo 22,3, što je više od 2 puta u odnosu na Romosozumab pozitivno antitelo (9,95) (videti Sliku 1).

Test rastvorljivosti

Primer ispitivanja7: Rastvorljivost humanizovanog anti-SOST antitela

[0156] Da bi se detektovala rastvorljivost humanizovanog anti-SOST antitela, antitelo Ab-

4

5 i Romosozumab pozitivno antitelo sa gradijentom povećanja koncentracija su detektovani za njihove sadržaje rastvorljivih monomera antitela, taloženje, i sadržaj polimera. U tom testu, početna koncentracija antitela je bila 10 mg/ml koje je rastvoreno u PBS puferskom rastvoru od PH 7,4. Uzorci su centrifugirani u koncetratoru ultrafiltracije (Millipore, Amicon Ultra-15 50K) na 4 stepena, na 4000 ob/min. Tokom centrifugiranja, uzorci su uzeti u intervalu od 5-10 minuta i koncentracija antitela je detektovana sve dok nije dostignuto 30 mg/ml i 90 mg/ml. Uzorci pod različitim uslovima koncentracije su uzeti i podvrgnuti SEC-HPLC analizi, prema opisanom redosledu, rezultati su prikazani u Tabeli 10.

Table10. Rastvorljivost anti-SOST antitela

[0157] Gornji rezultati su prikazali da kada je koncentracija antitela iz ovog pronalaska bila najviše do 90 mg/ml, i bez taloženja je postajala bistrina, i količina monomera antitela nije bila promenjena. Međutim, pozitivni molekuli su u istoj koncentraciji imali taloženje mase, i količina monomera antitela je bila smanjena od 95,8% do 92%.

Procena stabilnosti

Primer ispitivanja 8: Stabilnost humanizovanog anti-SOST antitela

[0158] Da biste testirali stabilnost humanizovanog anti-SOST antitela iz ovog pronalaska, antitelo Ab-5 i Romosozumab pozitivno antitelo su postavljeni u PBS pufer od pH 7,4 na 4 stepena tokom 7 dana. Korišćena su dva postupka da bi se detektovala stabilnost: jedan da bi se procenila količina formiranja nerastvorljivog taloga koji je vidljiv golim okom, i promena koncentracije nerastvorljivog taloga pre i posle postavljanja je izračunata; drugi postupak je da se testiraju promene rastvorljivovog sadržaja monomera antitela u uzorku pomoću SEC-HPLC. Početna koncentracija antitela je bila 30mg/ml, što je bila najviša rastvorljiva koncentracija koju je pozitivno antitelo moglo da dostigne. Rezultati su prikazani u tabeli 11.

Tabela11. Stabilnost anti-SOST antitela

[0159] Gornji rezultati su pokazali da je pozitivno antitelo imalo 19,3% taloga formiranog i smanjenje količine monomera antitela je primećeno posle 7 dana postavljanja, čak i ako se pozitivno antitelo ne taloži na početnoj tački svoje dostižne koncentracije (30 mg/ml). Dok je antitelo iz ovog pronalaska veoma stabilno bez bilo kakvog taloženja i rastvor je bio jasan.

[0160] Imajući u vidu rezultate rastvorljivosti i stabilnosti, antitelo iz ovog pronalaska ima bolji učinak od pozitivnog antitela sa stanovišta dobijanja antitela. Može biti napravljeno u visokoj koncentraciji, kao što je 90 mg/ml i da ostane stabilno uprkos svemu.

4

4

4

4

4

4

1

2

4

1

�

�

1

2

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin, obuhvata teški lanac SEK ID BR: 26 i laki lanac SEK ID BR: 29.

2. DNK molekul, koji kodira antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin prema patentnom zahtevu 1.

3. Vektor ekspresije koji obuhvata DNK molekul prema patentnom zahtevu 2.

4. Ćelija domaćin, koja je transformisana sa vektorom ekspresije prema patentnom zahtevu 3.

5. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je ćelija domaćin ćelija sisara.

6. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je ćelija CHO (jajnik kineskog hrčka).

7. Farmaceutska supstanca, koja obuhvata antitelo prema patentnom zahtevu 1, i jedan ili više farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, razblaživač ili nosač.

8. Antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutska supstanca prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu kao lek, povećanjem najmanje jednog od mase kosti, mineralne gustine kosti, mineralnog sadržaja kosti ili čvrstoće kosti.

9. Antitelo koje se specifično vezuje na humani sklerostin prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutska supstanca prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu za lečenje sklerostinom posredovanog oboljenja ili poremećaja kosti izabranog iz osteoporoze, osteopenije osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, periodontalne bolesti i multiplog mijeloma.

4