MX2007001221A

MX2007001221A - Anticuerpos para proteina dickkopf-1 (dkk-1).

Info

Publication number: MX2007001221A
Application number: MX2007001221A
Authority: MX
Inventors: Wenyan Shen; Ji Li; William Gleason Richards; Hsieng Sen Lu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2004-08-04
Filing date: 2005-08-04
Publication date: 2007-03-23
Also published as: US20060127393A1; EP2336177A1; US7709611B2; AU2005267722A1; US8101184B2; EP1786837A2; WO2006015373A3; AU2009245850A1; AU2005267722B2; US20100040619A1; JP4840939B2; US20120087912A1; CA2574881A1; WO2006015373A2; JP2011212022A; CA2574881C; ES2414460T3; JP2008508881A; EP1786837B1

Abstract

La presente invencion proporciona anticuerpos y fragmentos inmunologicamente funcionales de los mismos que unen especificamente los polipeptidos de Dkk-1. Los anticuerpos objeto y fragmentos se unen con alta afinidad a un epitope conformacional localizado en la region carboxi de la proteina Dkk-1. Los metodos para preparar tales anticuerpos o fragmentos de los mismos asi como composiciones fisiologicamente aceptables que contienen los anticuerpos o fragmentos, tambien se proporcionan. Tambien se describe el uso de los anticuerpos y fragmentos para tratar varias enfermedades incluyendo trastornos del hueso, enfermedades inflamatorias, enfermedades neurologicas, enfermedades oculares, enfermedades renales, enfermedades pulmonares y enfermedades de la piel.

Description

ANTICUERPOS PARA PROTEÍNA DICKKOPF-1 (DKK-1) Referencia Cruzada a las Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana 60/598,791, presentada el 4 de agosto de 2004, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Campo de la Invención La invención se refiere a agentes de unión selectiva para la proteína dickkopf-1 (Dkk-1), y más particularmente, a anticuerpos y dominios de unión al antígeno y regiones de CDR que median la unión selectiva a un epítope localizado en la porción media del carboxilo de la proteína Dkk-1. Antecedentes de la Invención El tejido óseo vivo exhibe un equilibrio dinámico entre la deposición y resorción del hueso. Estos procesos son mediados principalmente por dos tipos de células: osteoblastos, que secretan moléculas que comprenden la matriz orgánica del hueso, y osteoclastos, que median la disolución de la matriz del hueso y solubilidad de sales del hueso. En individuos jóvenes con hueso en crecimiento, el índice de deposición del hueso excede el índice de resorción del hueso, mientras que en individuos más viejos el índice de resorción puede exceder la deposición que conduce a la pérdida de masa ósea. La última situación puede conducir a incrementar el riesgo de la fractura del hueso y retraso o reparación incompleta de los huesos fracturados. Se entenderá que los mecanismos moleculares que son la base de estos procesos son críticos al desarrollo de la terapéutica para el tratamiento de enfermedades del hueso. La genética humana ha desempeñado un papel importante en la aclaración de estos mecanismos y ha permitido la identificación de múltiples factores implicados en la actividad catabólica y anabólica del hueso (Janssens and Van Huí, Hum Mol Gen, 11 (20):2385-93, 2002; Ralston, J Clin Endocrin Metab. 87(6):2460-66, 2002). Dickkopf-1 (Dkk-1) es un miembro de la familia dickkopf de las proteínas que han demostrado ser reguladores negativos de la trayectoria de señalización de Wnt canónica, que tiene un papel central en el desarrollo y formación del hueso (ver, por ejemplo, Glinka y colaboradores, Nature 391:357-62 (1998); Fedi y colaboradores, J Biol Chem 274(27): 19465-72 (1999); Zorn, Curr Biol 11.R592-95 (2001); y Krupnik y colaboradores, gen 238: 301-13 (1999)). Dkk-1 inhibe señalización de Wnt a través de su interacción con los co-receptores de Wnt LRP5 o LRP6 y las proteínas kremen (ver, por ejemplo, Bafico y colaboradores, Nature Cell Biol 3:683 (2001); Mao y colaboradores, Nature 411(17):321 (2001); Mao y colaboradores, Nature 417:664 (2002); y Semenov y colaboradores, Curr Biol 11:951-61 (2001). Medíante la unión de LRP5 (LRP6) y las proteínas kremen, Dkk-1 evita que LRP5 o LRP6 se asocien con los miembros de la trayectoria de Wnt y así previene la transducción de la señal mediada por Wnt, que a su vez resulta en la inhibición de la formación del hueso.

LRP5 es una proteína clave en la regulación de la masa ósea (ver, por ejemplo, Gong y colaboradores, Cell 107:513-23 (2001); Patel, N Eng J Med 346(20):1572 (2002)). Un trastorno autosomal recesivo caracterizado por la masa ósea baja (síndrome de osteoporosis-pseudoglioma, o "OPPG") se ha identificado que es causado por mutaciones de la pérdida de función en LRP5 (Gong y colaboradores, 2001). Además, las mutaciones de ganancia de función en LRP5 han demostrado que producen una masa ósea alta autosomal dominante en humanos (Little y colaboradores, Am J Human Genetics. 70(1): 11-19, 2002). Las mismas mutaciones en LRP5 que resultan en masa ósea alta pueden interferir con la capacidad de Dkk-1 para inhibir la señalización de LRP5 (ver, por ejemplo, Boyden y colaboradores, N Eng J Med. 346(20):1513-1521 , 2002). Así, Dkk-1 se caracteriza apropiadamente por ser un regulador negativo de la deposición del hueso. En vista de la implicación de Dkk-1 en la regulación de la formación del hueso y su papel en las otras varias enfermedades que se asocian con la pérdida de hueso (por ejemplo, cáncer y diabetes), existe una necesidad para mejorar anticuerpos anti-Dkk-1 para uso terapéutico y para otros propósitos. Breve Descripción de la Invención Una variedad de agentes de unión se proporciona para unir selectivamente Dkk-1. Los agentes también pueden bloquear o reducir la unión entre Dkk-1 y LRP5 y/o LRP6, de este modo estimulando por lo menos una actividad asociada en la señalización de Wnt. Los agentes pueden ser un anticuerpo o un fragmento inmunológico funcional de los mismos e así incluir anticuerpos con una estructura que ocurre naturalmente, así como polipéptidos que tienen un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo de dominio). Los anticuerpos y fragmentos pueden utilizarse para tratar una variedad de diferentes enfermedades incluyendo la prevención o tratamiento de condiciones relacionadas a la pérdida de masa ósea o para estimular la producción de nuevo hueso, así como varios trastornos no relacionados al hueso. También se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras útiles en la producción de anticuerpos y agentes de unión selectivos. Algunos de los anticuerpos y fragmentos funcionales inmunológicos que se proporcionan incluyen (a) una o más regiones que determinan la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) de la cadena ligera (LC, por sus siglas en inglés) seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:70; (ii) una CDR2 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:72; y (iii) una CDR3 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:74; (b) una o más CDRs de cadena pesada (HC por sus siglas en inglés) seleccionadas del grupo que consiste de (i) un CDR1 HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:76; (ii) un CDR2 de HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:78; y (iii) una CDR3 de HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:80; o (c) una o más CDRs de LC de (a) y una o más CDRs de HC (b). Tales anticuerpos o fragmentos pueden específicamente unirse a un polipéptido Dkk-1. Ciertos anticuerpos o fragmentos incluyen uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las CDRs antecedentes. Las cadenas ligeras y pesadas de otros anticuerpos o fragmentos son como se describen anteriormente pero tienen por lo menos 90% de identidad de secuencia a las secuencias anteriores. Aún otros anticuerpos o fragmentos de los mismos son unos que tienen una cadena ligera en la cual CDR1 tiene la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:70, CDR2 tienen la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:72 y/o CDR3 tiene la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:74. Algunos anticuerpos y fragmentos pueden también tener una cadena pesada en la cual CDR1 tiene la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:76, CDR2 tiene la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:78 y/o CDR3 HC tiene la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:80. Ciertos anticuerpos o fragmentos incluyen una CDR3 de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:74 y/o una CDR3 de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:80. Ciertos otros anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales se proporcionan incluyendo (a) una región variable (VL por sus siglas en inglés) de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con ia SEC ID NO:84, 28 ó 32; (b) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68; o (c) una VL de (a) y una VH de (b). Otros anticuerpos o fragmentos son similares en estructura pero la VL tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:84, 28 ó 32; y la VH tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68. En ciertos anticuerpos o fragmentos, la VL tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:84, 28 ó 32; y la VH tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, ó 68. Aún otros anticuerpos o fragmentos son unos que incluyen una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:84, 28 ó 32, y/o una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68. Algunos anticuerpos o fragmentos incluyen una cadena ligera que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 82, 26, ó 30 y/o una cadena pesada que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:89, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, ó 66.

También se incluyen anticuerpos aislados o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que específicamente unen una proteína Dkk-1 humana madura que consiste de 32-266 aminoácidos de la SEC ID NO:2, en donde el anticuerpo se une a un epítope que comprende dos bucles, los bucles se forman por los enlaces de disulfuro entre los 220 y 237 aminoácidos de la SEC ID NO:2 y entre los 245 y 263 residuos de cisteína de la SEC ID NO:2.

Otros anticuerpos o fragmentos que se describen compiten con un anticuerpo tal como los descritos anteriormente para la unión específica a un polipéptido Dkk-1. Por ejemplo, algunos anticuerpos y fragmentos compiten con un anticuerpo que consiste de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, en donde las cadenas pesadas consisten de 20-465 aminoácidos de la SEC ID NO:12 y las cadenas ligeras consisten de 21-234 aminoácidos de la SEC ID NO:10. Varios anticuerpos y fragmentos que se proporcionan pueden incluir una sola cadena ligera y/o pesada o un solo dominio ligero variable y/o un solo dominio pesado variable. Otros anticuerpos y fragmentos incluyen dos cadenas ligeras y/o dos pesadas. En estos casos en los cuales el anticuerpo o el fragmento incluye dos cadenas ligeras y/o pesadas, las dos cadenas ligeras en algunos casos son idénticas entres sí; asimismo, las dos cadenas pesadas en algunos casos son idénticas. Se proporcionan los anticuerpos que pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado. Los fragmentos inmunológicamente funcionales pueden incluir, pero sin limitarse a, un scFv, Fab, Fab', (Fab')2, o un anticuerpo de dominio. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento se disocia de un polipéptido Dkk-1 con un kd (koff) de 5 x 10"4 s"1 o menor. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de los anticuerpos anteriores y fragmentos inmunológicamente activos. Tales composiciones normalmente también incluyen un amortiguador, diluyente farmacéuticamente aceptable, portador, solubilizador, emulsificador o conservador. También se describe el uso de anticuerpos y fragmentos inmunológicamente activos anteriores en la preparación de una composición o medicamento farmacéutico. También se proporciona una variedad de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anteriores. Algunos ácidos nucleicos, por ejemplo, codifican (a) a un CDR de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:70, 72 y/o 74; y/o (b) un CDR de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:76, 78 y/o 80, tal que el CDR(s) codificado codifica un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que puede específicamente unir un polipéptido de Dkk-1. Ciertos otros ácidos nucleicos comprenden o consisten de una secuencia que codifica una región ligera variable (VL) y/o una región pesada variable (VH) de un anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo, en donde VL tiene por lo menos 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:84, 28 ó 32 y la VH tiene por lo menos 80% 90% o 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68. Algunos de los ácidos nucleicos incluyen una secuencia que codifica una VL que comprende o consiste de la SEC ID NO:84, 28 ó 32 y/o una secuencia que codifica una VH que comprende o consiste de la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68. Aún otros ácidos nucleicos incluyen las secuencias que codifican una VL o VH con las características de secuencia anteriores. Los vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos anteriores también se describen en la presente, como son las células (por ejemplo, células CHO) que comprenden tales vectores de expresión. También se describen métodos para producir un anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo de los mismos que cultivan células que contienen tales vectores de expresión. En otro aspecto, se describe el uso de los anticuerpos anteriores o fragmentos inmunológicamente funcionales en el tratamiento de una variedad de enfermedades. Ciertos métodos, por ejemplo, involucran administrar a un paciente en necesidad de los mismos una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo como se describe en la presente para tratar la artritis, enfermedades sensibles a la renovación de células madre, enfermedades inflamatorias, enfermedades neurológicas, enfermedades oculares, enfermedades renales, enfermedades pulmonares y enfermedades de la piel. Algunos métodos de tratamiento involucran el tratamiento de la artritis reumatoide, artritis psoriática o osteoartritis. Ciertos anticuerpos y fragmentos se utilizan para tratar una enfermedad que: (a) es sensible a la renovación de células madre y se selecciona del grupo que consiste de diabetes, paro cardíaco crónico y enfermedades del músculo; (b) es una enfermedad inflamatoria seleccionada del grupo que consiste de la enfermedad de Crohn, colitis y enfermedad inflamatoria del intestino; (c) es una enfermedad neurológica seleccionada del grupo que consiste de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y enfermedad de Huntington; (d) es una enfermedad ocular seleccionada del grupo que consiste de la degeneración macular y retinopatías; (e) es una enfermedad renal seleccionada del grupo que consiste de la enfermedad renal de etapa terminal, enfermedad renal crónica, glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial y nefropatía de IgA; (f) es una enfermedad pulmonar seleccionada del grupo que consiste de enfermedad pulmonar obstructora crónica, fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis enquistada; o (g) es una enfermedad de la piel resultante del daño inducido por quimioterapia al epitelio intestinal. Adicionalmente se proporciona en la presente métodos para tratar o prevenir la pérdida de masa ósea que comprende administrar a un paciente en necesidad de los mismos una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmentos inmunológicamente funcionales del mismo como se describe en la presente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional que comprende por lo menos un CDR de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de 44-54 aminoácidos de la SEC ID NO:10, 70-76 aminoácidos de la SEC ID NO:10 y 109-117 aminoácidos de la SEC ID NO:10, y/o por lo menos un CDR de cadena pesada seleccionados del grupo que consiste de 50-54 aminoácidos de la SEC ID NO:12, 69-85 aminoácidos de la SEC ID NO:12 y 118-128 aminoácidos de la SEC ID NO:12). En un aspecto de esta modalidad, el paciente es uno que sufre de cáncer que provoca metástasis al hueso, y en otro aspecto, el paciente es uno que sufre de mieloma múltiple. En aún otro aspecto, el paciente se selecciona de pacientes que tienen osteoporosis, osteopenia, enfermedad de Paget, períodontitis, artritis reumatoide y pérdida del hueso debido a la inmovilización. También se describen métodos para inducir la masa ósea creciente. Tales métodos involucran administrar a un paciente en necesidad de los mismos una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento inmunológícamente funcional del mismo según lo descrito en la presente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento ¡nmunológicamente funcional que incluye por lo menos un CDR de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de 44-54 aminoácidos de la SEC ID NO:10, 70-76 aminoácidos de la SEC ID NO:10 y 109-117 aminoácidos de la SEC ID NO:10, y/o por lo menos de un CDR de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de 50-54 aminoácidos de la SEC ID NO:12, 69-85 aminoácidos de la SEC ID NO:12 y 118-128 aminoácidos de la SEC ID NO:12). En un aspecto, el paciente sufre de cáncer que provoca metástasis al hueso, y en otro aspecto, el paciente sufre de mieloma múltiple. En aún otro aspecto, el paciente se selecciona de aquéllos que tienen osteoporosis, osteopenia, enfermedad de Paget, períodontitis, artritis reumatoide, artritis psoriática, espondilitis anquilosante y pérdida del hueso debido a la inmovilización. En un aspecto adicional de este método, el paciente es un recipiente o con injerto de hueso o uno que sufre de una fractura de hueso. También se proporciona un método para inducir la actividad de Wnt en un paciente en necesidad del mismo que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo como se describe en la presente (por ejemplo, por lo menos un CDR de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de 44-54 aminoácidos de la SEC ID NO:10, 70-76 aminoácidos de la SEC ID NO:10 y 109-117 aminoácidos de la SEC ID NO:10, y/o por lo menos de un CDR de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de 50-54 aminoácidos de la SEC ID NO:12, 69-85 aminoácidos de la SEC ID NO:12. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra un diagrama de cintas que representa la estructura tridimensional de un segmento de Dkk-1 humana localizado cerca del carboxi terminal de la proteína. Todo los números del aminoácido indicados en la figura corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. Las dos secuencias del péptido representadas en la figura representan las regiones que son importantes para el anticuerpo monoclonal 11H10 para específicamente unir a esta proteína. Los aminoácidos que se subrayan se creen desempeñan un papel importante para la unión del anticuerpo a la proteína Dkk-1. Los bucles que comprenden el epítope se sombrearon, uno de los dos bucles del epítope está sombreado ligeramente más oscuro que el otro bucle. Las porciones coloreadas muy claras del diagrama de cinta representan las partes del polipéptido que se creen desempeñan un papel menor en la interacción de unión entre el 11H10 a Dkk-1 humana. Las figuras 2A y 2B muestran los resultados µCT para ratones jóvenes y viejos tratados con 11H10 de rata. La figura 2A es una gráfica del Número Trabecular a diferentes niveles de dosificación del 11H10 de rata (5, 10 ó 20 mg/kg) en ratones viejos (8.5 meses de viejos) y ratones jóvenes (6-semanas de viejos) contra el vehículo (control negativo) y PTH (control positivo). La figura 2b es una gráfica del perímetro endosteal a diferentes niveles de dosificación del 11H10 de rata (5, 10 ó 20 mg/kg) en ratones viejos (8.5 meses de viejos) contra el vehículo (control negativo) y PTH (control positivo).

Las figuras 3A y 3B son gráficas que representan el porcentaje de cambio en BMD en ratones ovariectomizados (OVX) 28 días después de ser tratado con 11H10 de rata (3, 10 ó 30) contra el vehículo o PTH (100 µg/kg). Los ratones usados fueron de 5 meses post OVX. La figura 3A muestra el cambio en BMD en la tibia en día 28 con relación a la línea base. La figura 3B muestra el cambio en BMD en el lumbar el día 28 con relación a la línea base.

El figura 4 es una gráfica del porcentaje de cambio en BMD en ratones jóvenes tres semanas después de ser administrado 11H10 RT lgG1 o 11H10 RT lgG2 con relación a 11H10 o PTH de rata. Descripción Detallada de la Invención I. Definiciones A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tienen los significados que son entendidos comúnmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y técnicas de, cultivo de células y tejido, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y proteína y química del ácido nucleico e hibridación descritos en la presente son bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente según los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a través de la presente especificación a menos que se indique lo contrario. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lañe Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que se incorporan en la presente por referencia. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, según lo logrado comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. La terminología usada en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas, de la química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Las técnicas estándares pueden utilizarse para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y el suministro y tratamiento de pacientes. Los siguientes términos utilizados en esta descripción, a menos que se indique lo contrario, serán entendidos por tener los siguientes significados: "Dkk-1" como se utiliza en la presente incluye, por ejemplo, las formas nativas de rata, murino y humana del nucleótido de Dkk-1. Ejemplarmente las secuencias que codifican las proteínas humanas y murino Dkk-1 se muestran, respectivamente, en la SEC ID NOS:1 y 3; las secuencias de aminoácidos correspondientes se muestran, respectivamente, en la SEC ID NOS:2 y 4. La proteína humana Dkk-1 (SEC ID NO:2) tiene la secuencia líder que consiste de 1-31 aminoácidos de la SEC ID NO:2. Una secuencia de la proteína de rata Dkk-1 ejemplar se registra en el Acceso GenBank XP_219804. El término también incluye variantes de tales secuencias nativas que son inmunológicamente reactivas con estas proteínas nativas. Estas proteínas pueden inhibir la interacción entre LRP5 o LRP6 con Wnt. Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica la LRP5 humana en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la SEC ID NO:6. Una secuencia del nucleótido ejemplar que codifica la LRP6 humana se da en la SEC ID NO:7, y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la SEC ID NO:8. El término puede también referir a un fragmento de una forma nativa o variante de Dkk-1 que contiene un epítope al cual un anticuerpo puede específicamente unirse. El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" significa polímeros de una sola hebra (monocatenario) o doble hebra (bicantenario). Los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Las modificaciones incluyen modificaciones base tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa tales como 2',3'-didesoxirribosa, y modificaciones de enlace del internucleótido tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato. El término incluye las formas de una sola y doble hebras. El término "oligonucleótido" significa un polinucleótido que comprende 200 o menos nucleótidos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos son 10 a 60 bases en longitud. En otras modalidades, los oligonucleótidos son 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 a 40 nucleótidos en longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de una sola hebra o doble hebra, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. Un oligonucleótido de la invención puede incluir un marcado, incluyendo un radiomarcado, un marcado fluorescente, o un marcado hapteno o antigénico, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o pruebas de hibridación. Una "molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o un ARN de origen genómico, mARN, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que no se asocie con todos o una porción de un polinucleótido en el cual el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o ligado a un polinucleótido el cual no está ligado en la naturaleza. Para los propósitos de esta descripción, deberá entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular no comprende cromosomas intactos. Las moléculas del ácido nucleico aislado "que comprende" secuencias del ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias de codificación de hasta diez o aún de hasta veinte otras proteínas o porciones de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras operablemente ligadas que controlan la expresión de la región de codificación de las secuencias del ácido nucleico citado, y/o pueden incluir secuencias del vector.

Salvo se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de cualquier secuencia del polinucleótido de una sola hebra discutida en la presente es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias del polinucleótido de doble hebra se refiere como la dirección 5'. La dirección de adición 5' a 3' de las transcripciones de ARN nacientes se refiere como la dirección de transcripción; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN tienen las mismas secuencia como la transcripción de ARN que son 5' al extremo 5' de la transcripción de ARN se refieren como "secuencias corriente arriba"; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN tienen la misma secuencia como la transcripción de ARN que son el extremo 3' al 3' de la transcripción de ARN se refieren como "secuencias corriente abajo". El término "secuencia de control" se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede afectar la expresión y proceso de las secuencias de codificación a las cuales se liga. La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo hospedador. En modalidades particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión ribosomal, y una secuencia de terminación de transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para los factores de transcripción, secuencias de mejora de transcripción, y secuencia de terminación de transcripción. Las "secuencias de control" según la invención pueden incluir secuencias líder y/o secuencias asociadas de fusión. El término "vector" significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usada para transferir la información que codifica la proteína en una célula hospedadora. El término "vector de expresión" o "constructo de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula hospedadora y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (conjuntamente con la célula hospedadora) la expresión de una o más regiones de codificación heterólogas operativamente ligadas en las mismas. Un constructo de expresión puede incluirse, pero sin limitarse a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción, y, si los intrones están presentes, afectan el empalme del ARN de una región de codificación operablemente ligada al mismo. Como se utiliza en la presente, "operablemente ligado" significa que los componentes a los cuales se aplica el término están en una relación que permite que se realicen sus funciones inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que "operablemente ligado" a una secuencia que codifica una proteína se liga con la misma para alcanzar la expresión de la secuencia que codifica una proteína bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control. El término "célula hospedadora" significa una célula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con una secuencia de ácido nucleico y de este modo expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula madre, si o no la progenie es idéntica en morfología o en carácter genético a la célula madre original, siempre y cuando el gen de interés esté presente. El término "transducción" significa la transferencia de genes de una bacteria a otra, normalmente por bacteriófago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por retrovirus. El término "transfección" significa la absorción del ADN extranjero o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección es bien conocido en la técnica y se describen en la presente. Ver, por ejemplo, Graham y colaboradores, 1973, Virology 52:456; Sambrook y colaboradores, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Id.; Davis y colaboradores, 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; and Chu y colaboradores, 1981, Gene 13:197. Tales técnicas pueden utilizarse para introducir una o más fracciones del ADN exógenas en células hospedadoras adecuadas. El término "transformación" se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y se ha transformado una célula cuando se ha modificado por contener el nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, se transforma una célula donde se modifica genéticamente de su estado nativo introduciendo el nuevo material genético vía la transfección, transducción, u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN de transformación puede recombinarse con la célula físicamente integrando en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin ser replicado, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Una célula se considera por ser "establemente transformada" cuando el ADN de transformación se replica con la división de la célula. Los términos "polipéptido" o "proteína" significan una macromolécula que tiene la secuencia de aminoácido de una proteína nativa, es decir, una proteína producida por una célula que ocurre naturalmente y no-recombinante, o producida por una célula obtenida por bioingeniería genética o recombinante, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácido de la proteína nativa, o moléculas que tienen eliminaciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos "polipéptido" y "proteína" específicamente comprenden anticuerpos anti-Dkk-1, o secuencias que tienen eliminaciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácido del anticuerpo anti-Dkk-1. El término "fragmento del polipéptido" se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación del amino-terminal, una eliminación de carboxilo-terminal, y/o una eliminación interna como se compara con la proteína nativa de longitud completa. Tales fragmentos pueden también contener aminoácidos modificados como se comparan con la proteína nativa. En ciertas modalidades, los fragmentos son de aproximadamente 5 a 500 aminoácidos de largo. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser por lo menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ó 450 aminoácidos de largo. Los fragmentos del polipéptido útiles para esta invención incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de unión. En el caso del anticuerpo anti-Dkk-1, los fragmentos útiles incluyen pero no se limitan a una región de CDR, un dominio variable de una cadena pesada o ligera, una porción de una cadena del anticuerpo o apenas su región variable incluyendo dos CDRs, y similares. El término "proteína aislada" referido en la presente significa que una proteína objeto (1) está libre de por lo menos algunas otras proteínas con las cuales se encontraría normalmente, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de por lo menos aproximadamente 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se asocian en la naturaleza, (5) está operablemente asociado (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el cual no se asocia en la naturaleza, o (6) no ocurre en la naturaleza. El ADN genómico, ADNc, mARN u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos puede codificar una proteína aislada. Preferiblemente, la proteína aislada está sustancialmente libre de proteínas o de polipéptidos u otros contaminantes que se encuentren en su ambiente natural que interferirán con su búsqueda terapéutica, de diagnóstico, profiláctica, u otro uso. Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácido en donde uno o más residuos del aminoácido se insertan en, suprimen de y/o sustituye en la secuencia de aminoácidos con relación a otra secuencia del polipéptido. Las variantes de la invención incluyen proteínas de fusión. Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que se ha modificado químicamente de alguna manera distinta de inserción, eliminación, o variantes de sustitución, por ejemplo, vía conjugación a otra porción química. El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o a un fragmento del mismo que puede competir con el anticuerpo intacto para la unión específica al antígeno objetivo, e incluye anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos, y biespecíficos. Un anticuerpo intacto comprenderá generalmente de por lo menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de cadena completa, pero en algunos casos puede incluir pocas cadenas tales como anticuerpos que ocurren naturalmente en camélidos que pueden comprender solamente cadenas pesadas. Los anticuerpos según la invención pueden derivarse solamente de una sola fuente, o pueden ser "quiméricos", esto es, diferentes porciones del anticuerpo se pueden derivar de dos diversos anticuerpos. Por ejemplo, las regiones de CDR pueden derivarse de una fuente de rata o murino, mientras que la región de estructura de la región V se deriva de una diferente fuente animal, tal como un humano. Los anticuerpos o fragmentos de unión de la invención pueden producirse en hibridomas, mediante técnicas recombinantes del ADN, o por división enzimática o química de anticuerpos intactos. A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" incluye, además de los anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos, y muteínas de los mismos, los ejemplos de los cuales se describen más adelante. El término "cadena ligera" incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de los mismos tiene suficiente secuencia de región variable para conferir la especificidad de unión. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, V , y un dominio de región constante, C . El dominio de región variable de la cadena ligera está en el amino-terminal del polipéptido. Las cadenas ligeras según la invención incluyen cadenas kappa y cadenas lambda. El término "cadena pesada" incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de los mismos que tienen suficiente secuencia de región variable para conferir la especificidad de unión. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1, CH2 y CH3. El dominio de VH está en la amino-terminal del polipéptido, y los dominios de CH están en el carboxilo-terminal, con el CH3 que está más cercano al extremo -COOH. Las cadenas pesadas según la invención pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (incluyendo subtipos lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4), IgA (incluyendo subtipos IgAi e lgA2), IgM e IgE. El término "fragmento inmunológícamente funcional" (o simplemente "fragmento") de una cadena de inmunoglobulina, como se utiliza en la presente, se refiere a una porción de una cadena ligera del anticuerpo o cadena pesada que carece de por lo menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son biológicamente activos en donde ellos se unen específicamente al antígeno objetivo y pueden competir con los anticuerpos intactos para la unión específica a un epítope dado. En un aspecto de la invención, tal fragmento conservará por lo menos a un CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunas modalidades comprenderá una sola cadena pesada y/o cadena ligera o porción de las mismas. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse por técnicas recombinantes del ADN, o pueden producirse por división enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales de la invención incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena sencilla, y no pueden derivarse de cualquier fuente mamífera, incluyendo pero sin limitarse a humano, ratón, rata, camélida o conejo. Se contempla adicionalmente que una porción funcional de los anticuerpos inventivos, por ejemplo, uno o más CDRs, podrán covalente unirse a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a un objetivo particular en el cuerpo, que pose propiedades terapéuticas bifuncionales, o tiene un período del suero prolongado. Un "fragmento Fab" se comprende de una cadena ligera y regiones CH1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Una región "Fc" contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH1 y CH2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada están sostenidos por dos o más enlaces de disulfuro y por interacciones hidrofóbicas de los dominios CH3. Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio de VH y el dominio de CH1 y también la región entre los dominios de CH1 y CH2, tal que un enlace disulfuro intercadena se puede formar entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2. Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, tal que un enlace disulfuro intercadena se forma entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')2 así se compone de dos fragmentos Fab' que son sostenidos por un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. La "región de Fv" comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, pero carece de las regiones constantes. Los "anticuerpos de cadena sencilla" son moléculas de Fv en las cuales las regiones variables de cadena pesada y ligera han sido conectadas por un enlazador flexible para formar una sola cadena de polipéptido, que forma una región de unión al antígeno. Los anticuerpos de cadena sencilla se discuten detalladamente en la Publicación de la Solicitud de Patentes Internacional No. WO 88/01649 y Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778 y 5,260,203, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia. Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones de VH son covalentemente unidas con un enlazador del péptido para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones de VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden marcar los mismos o diferentes antígenos. Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión al antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen la misma especificidad del antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (ver más adelante). Un "anticuerpo multiespecífico" es uno que marca más de un antígeno o epítope.

Un anticuerpo "biespecífico", "dual-específico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido que tiene dos diferentes sitios de unión al antígeno. Los anticuerpos biespecífico son una especie de anticuerpo multiespecífico y no pueden producirse por una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, fusión de hibridomas o enlace de los fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny y colaboradores (1992), J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de unión de un anticuerpo biespecífico se unirán a dos diferentes epítopes, que pueden residir en los mismos o diferentes objetivos de la proteína. El término "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que se enlaza a un ligando, que previene la unión del ligando a su asociado de unión e interrumpe la respuesta biológica que resultaría de otra manera ligando la unión a su asociado de unión. Para evaluar la unión y especificidad de un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmento inhibirá sustancialmente la unión de un ligando a su asociado de unión cuando un exceso del anticuerpo reduce la cantidad de asociado de unión ligado al ligando por al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más (según lo medido en un ensayo de unión competitivo in vitro). En el caso de anticuerpos a Dkk-1, un anticuerpo neutralizante disminuirá la capacidad de Dkk-1 para unir LRP5 ó LRP6, de este modo induciendo un aumento mensurable en la actividad de Wnt.

El término "compite" cuando se utiliza en el contexto de anticuerpos que compiten para el mismo epítope significa la competencia entre los anticuerpos, es determinada por un ensayo en el cual el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional bajo prueba previene o inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común (por ejemplo, Dkk-1 o un fragmento del mismo). Numerosos tipos de ensayos de unión competitivos pueden utilizarse, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase sólida (RÍA por sus siglas en inglés), inmunoensayo de enzima directo o indirecto de fase sólida (ElA por sus siglas en inglés), ensayo de competición sandwich (ver, por ejemplo, Stahli y colaboradores (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); ElA de biotina-avidina directo de fase sólida (ver, por ejemplo, Kirkland y colaboradores, (1986) J. Immunol. 137:3614-3619) ensayos de marcado directo de fase sólida, ensayo sandwich de marcado directo de fase sólida (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RÍA de marcado directo de fase sólida usando el marcado 1-125 (ver, por ejemplo, Morel y colaboradores (1988) Molec. Immunol. 25:7-15); ElA biotina-avidina directo de fase sólida (ver, por ejemplo, Cheung, y colaboradores (1990) Virology 176:546-552); y RÍA marcado directo (Moldenhauer y colaboradores (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Normalmente, tal ensayo involucra el uso del antígeno purificado ligado a una superficie sólida o células que llevan cualquiera de éstos, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva es medida determinando la cantidad del enlace marcado a la superficie o células sólidas en presencia de la inmunoglobulina de prueba. La inmunoglobulina de prueba está generalmente presente en exceso. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competición (anticuerpos competentes) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítope que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítope adyacente suficientemente próximo al enlace del epítope por el anticuerpo de referencia para que el impedimento estérico ocurra. Los detalles adicionales con respecto a los métodos para determinar la unión competitiva se proporcionan en los ejemplos en la presente. Generalmente, cuando un anticuerpo competente está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ó 75%. En cierto caso, la unión es inhibida por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 97% o más. El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse por un agente de unión selectivo, tal como un anticuerpo, y además capaz de utilizarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a este antígeno. Un antígeno puede poseer uno o más epítopes que sean capaces de interactuar con diferentes anticuerpos. El término "epítope" incluye cualquier determinante capaz de específicamente unirse a una inmunoglobulina o a un receptor de células T. Un epítope es una región de un antígeno que está ligado por un anticuerpo que específicamente designa al antígeno, y cuando el antígeno es una proteína, incluye aminoácidos específicos que directamente se ponen en contacto con el anticuerpo. Más a menudo, los epítopes residen en las proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otras clases de moléculas, tales como ácidos nucleicos. El epítope determinante puede incluir agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y puede tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno objetivo particular preferiblemente reconocerán un epítope en el antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Un anticuerpo de la invención se dice para "específicamente unir" su antígeno objetivo cuando la constante de disociación (Kd) es = 10"8 M. El anticuerpo específicamente une el antígeno con "alta afinidad" cuando la Kd es = 5 x 10"9 M, y con "muy alta afinidad" cuando la Kd es = 5 x 10"10 M. En una modalidad de la invención, el anticuerpo tiene una Kd de = 10"9 M y una menor-velocidad de aproximadamente 1 x 10"4/seg. En una modalidad de la invención, la menor-velocidad es de < 1x10"5. En otras modalidades de la invención, los anticuerpos se unirán a Dkk-1 humana con una Kd de entre aproximadamente 10"8 M y 10"10 M, y en aún otra modalidad se unirá con una Kd = 2 x 10"10.

El término "identidad" se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, como se determina alineando y comparando las secuencias. "Por ciento de identidad" significa el por ciento de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula basada en el tamaño de la más pequeña de las moléculas que son comparadas. Para estos cálculos, los espacios (gap ("-")) en las alineaciones (si cualquiera) deben dirigirse por un modelo matemático particular o programa de computadora (es decir, un "algoritmo"). Los métodos que pueden utilizarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos alineados o polipéptidos incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo y colaboradores, 1988, SIAM J. Applied Math. 48: 1073. En el cálculo del por ciento de identidad, las secuencias que son comparadas se alinean de una manera que se proporciona la mayor igualación entre las secuencias. El programa de computadora usado para determinar el por ciento de identidad es el paquete del programa GCG, que incluye GAP (Devereux y colaboradores, 1984, Nucí Acid Res 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl). El algoritmo GAP de computadora se utiliza para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los cuales el por ciento de la identidad de secuencia debe determinarse. Las secuencias se alinean para la igualación óptima de su aminoácido o nucleótido respectivo (la "separación igualada", como se determina por el algoritmo). Una abertura de espacio penalizada (que se calcula como 3X la diagonal promedio, en donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que es utilizada; la "diagonal" es el puntuación o número asignado a cada igualación de aminoácido perfecta por la matriz de comparación particular) y una extensión de espacio penalizada (que es generalmente 1/10 veces la abertura de espacio penalizada), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan conjuntamente con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff y colaboradores, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff y colaboradores, 1992, Proc. Nati. Acad. Sd. USA 89: 10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se utiliza para el algoritmo. Los parámetros recomendados para determinar el por ciento de identidad para polipéptidos o secuencias del nucleótido que utilizan el programa GAP son los siguientes: Algoritmo: Needleman y colaboradores, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; Matriz de Comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y colaboradores, 1992, supra; Espacio Penalizado: 12 (pero sin la penalidad para espacios de extremo) Longitud de Espacio Penalizada: 4 Umbral de Similitud: 0 Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar lugar una igualación de solamente una región corta de dos secuencias, y esta región alineada pequeña puede tener identidad de secuencia muy alta aunque no hay relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método de alineación seleccionado (programa GAP) puede ajustarse si se desea para dar lugar a una alineación que separa por lo menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo. Como se utiliza en la presente, "sustancialmente puro" significa que la especie descrita de la molécula es la especie predominante presente, es decir, en una base molar que es más abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En ciertas modalidades, una molécula sustancialmente pura es una composición en donde la especie objeto comprende por lo menos 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras modalidades, una composición sustancialmente pura comprenderá por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En otras modalidades, la especie objeto se purifica mediante homogeneidad esencial en donde la contaminación de la especie no puede detectarse en la composición por métodos de detección convencionales y así la composición consiste de una sola especie macromolecular perceptible. El término "osteopenia" se refiere a un paciente con pérdida ósea de por lo menos una desviación estándar comparada con un paciente estándar considerado por tener densidad mineral del hueso normal (BMD por sus siglas en inglés). Para los presentes propósitos, la medida es determinada por la Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA por sus siglas en inglés) y la BMD del paciente se compara con una edad y estándar de género-igualado (puntuación Z). En osteopenia de determinación, las medidas de la BMD pueden tomarse de unos o más huesos. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un anticuerpo anti-Dkk-1 determinada para producir una respuesta terapéutica en un mamífero. Tales cantidades terapéuticamente efectivas son comprobadas fácilmente por un experto en la técnica. "Aminoácido" incluye su significado normal en la técnica. Los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Immunology—A Synthesis, 2a Edición, (E. S. Golub and D. R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991), incorporado en la presente por referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, ácidos D-amino) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos artificiales tales como aminoácidos a-, a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, y otros aminoácidos no convencionales pueden también ser componentes adecuados para los polipéptidos de la invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos y ácidos imino similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación del polipéptido usada en la presente, la dirección izquierda es la dirección del amino-terminal y la dirección derecha es la dirección del carboxilo-terminal, de acuerdo con el uso y convención estándar. II. Vista General La presente invención proporciona nuevas composiciones que comprenden anticuerpos y sitios de unión al antígeno de inmunoglobulinas específicas para Dkk-1 (por ejemplo, polipéptido que consisten de 32 a 266 aminoácidos de la SEC ID NO.2 o un polipéptido que consiste de 32 a 272 aminoácidos de la SEC ID NO:4). Algunos de estos anticuerpos y fragmentos del anticuerpo pueden reaccionar con Dkk-1 a partir de varias fuentes mamíferas, incluyendo Dkk-1 humana, de rata, de ratón. Algunos de los anticuerpos y fragmentos tienen mayor afinidad para Dkk-1 de una especie que otra (por ejemplo, algunos anticuerpos y fragmentos tienen mayor afinidad para Dkk-1 humana con respecto a Dkk-1 de rata o murino; otros anticuerpos tienen mayor afinidad para la Dkk-1 de rata o murino con respecto a la Dkk-1 humana). La invención también proporciona nuevos anticuerpos neutralizantes, incluyendo anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, así como anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos, que unen un epítope conformacional en la Dkk-1 humana. También se describen ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y fragmentos, así como métodos para expresar los anticuerpos usando estos ácidos nucleicos. En otro aspecto, la invención se refiere a moléculas (por ejemplo, fragmentos y polipéptidos inmunológicamente funcionales) que son capaces de exhibir propiedades unión inmunológicas de sitios de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se describen en la presente tienen una variedad de utilidades. Algunos de los anticuerpos y fragmentos, por ejemplo, son útiles en ensayos de unión específicos, purificación por afinidad de Dkk-1 o sus ligandos y en ensayos de protección para identificar otros antagonistas de actividad Dkk-1. Ciertos anticuerpos pueden utilizarse para tratar varias enfermedades que se asocian con la actividad de Dkk-1. Algunos anticuerpos y fragmentos pueden utilizarse así en una variedad de tratamientos relacionados con el hueso tal como densidad mineral ósea aumentada, síntesis del nuevo hueso, tratamiento de la pérdida ósea sistémica (por ejemplo, erosiones del hueso), reparación ósea, y tratamientos para varias formas de artritis. Algunos anticuerpos pueden también utilizarse para incrementar la actividad del osteoclasto e inducir la resorción del hueso. Ciertos anticuerpos y fragmentos que se describen, sin embargo, pueden utilizarse para tratar una variedad de diferentes enfermedades que no estén relacionados con enfermedades del hueso. Como se describe en mayor detalle más adelante, los ejemplos de tales enfermedades incluyen los que son deseable promover la renovación de células madre (por ejemplo, diabetes y enfermedades del músculo), enfermedades inflamatorias (por ejemplo, enfermedad de Crohn e inflamatoria del intestino), enfermedades neurológicas, enfermedades oculares, enfermedades renales y varios trastornos de la piel. lll. Anticuerpos y Fragmentos Inmunológicamente Funcionales Se proporciona una variedad de agentes de unión selectivos útiles para regular la actividad de Dkk-1. Estos agentes incluyen, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que contienen un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio, inmunoadhesiones, y polipéptidos con una región de unión al antígeno) y específicamente unido a un polipéptido Dkk-1 (por ejemplo, un polipéptido Dkk-1 humana, rata y/o murino). Algunos de los agentes, por ejemplo, son útiles en inhibir la unión de Dkk-1 a LRP5 y/o LRP6, y así pueden utilizarse para estimular una o más actividades asociadas con la señalización de Wnt.

A. Estructura del Anticuerpo gue Ocurre Naturalmente Se proporcionan algunos de los agentes de unión que tienen la estructura normalmente asociada con anticuerpos que ocurren naturalmente. Las unidades estructurales de estos anticuerpos normalmente comprenden uno o más tetrámeros, cada uno integrado por dos parejas de alelomorfos (acoplados ((dobles)) idénticas de las cadenas de polipéptido, aunque alunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tienen solamente una sola cadena pesada. En un anticuerpo normal, cada par o pareja de alelomorfos incluye una cadena "ligera" de longitud completa (en ciertas modalidades, aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en ciertas modalidades, aproximadamente 50-70 kDa). Cada cadena de inmunoglobulina individual se compone de varios "dominios de inmunoglobulina", cada uno consiste de aproximadamente 90 a 110 aminoácidos y que expresa un patrón de doblaje característico. Estos dominios son las unidades básicas de las cuales se componen los polipéptidos del anticuerpo. La porción amino-terminal de cada cadena incluye normalmente un dominio variable que es responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal es más conservada evolucionariamente que el otro extremo de la cadena y se refiere como la "región constante" o "región C". Las cadenas ligeras humanas se clasifican generalmente como cadenas ligeras kappa y lambda, y cada una de éstas contiene un dominio variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas se clasifican normalmente como cadenas mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y éstas definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varios subtipos, incluyendo, pero sin limitarse a, IgGi, lgG2l lgG3 y lgG . Los subtipos de IgM incluyen IgM-, e lgM2. Los subtipos de IgA incluyen \gk1 e lgA2. En humanos, los isotipos de IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos de IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo de IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región C de cadena pesada comprende normalmente uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de la región constantes de cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, cada una contiene tres dominios de región C conocidos como CHL CH2 y CH3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En ciertas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-Dkk-1 es del subtipo de IgGL lgG2 o lgG4. En cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, las regiones variable y constante se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también se incluye una región "D" de aproximadamente 10 más aminoácidos. Ver, por ejemplo, Fundamental Immunology, 2a ed., Capítulo. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press (incorporada en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman normalmente el sitio de unión al antígeno. Las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulina generalmente exhiben la misma estructura total, que comprende las regiones de estructura (FR por sus siglas en inglés) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, más a menudo llamadas "regiones determinantes de la complementariedad" o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par de cadena pesada/cadena ligera mencionadas anteriormente son alineadas normalmente por las regiones de estructura para formar una estructura que se enlaza específicamente con un epítope específico en la proteína objetivo (por ejemplo, Dkk-1). A partir de las regiones variables de cadena pesada y ligera que ocurren naturalmente N-terminal a C-terminal, ambas se conforman normalmente con el siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Un sistema numérico se ha ideado para asignar números a los aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema numérico se define en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 y 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), o Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia y colaboradores, 1989, Nature 342: 878-883.

Los ejemplos específicos de algunas de las cadenas ligera y pesada de longitud completa de los anticuerpos que se proporcionan y su nucleótido y secuencias de aminoácidos correspondientes se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Cadenas Ligera y Pesada Cada una de las cadenas ligeras listadas en la Tabla 1 puede combinarse con cualquiera de las cadenas pesadas mostradas en la Tabla 1 para formar un anticuerpo. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen L1 combinado con H1-H10, o L2 combinado con H1-H10 y L3 combinados con H1-H10 (es decir, L1H1, L1H2, L1H3, L1H4, L1H5, L1H6, L1H7, L1H8, L1H9, L1H10, L2H1, L2H2, L2H3, L2H4, L2H5, L2H6, L2H7, L2H8, L2H9, L2H10, L3H1, L3H2, L3H3, L3H4, L3H5, L3H6, L3H7, L3H8, L3H9 y L3H10. En algunos casos, los anticuerpos incluyen a por lo menos una cadena pesada y una cadena ligera de los listados en la Tabla 1. En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como un ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional puede incluir dos cadenas ligeras L1 y dos las cadenas pesadas L2, o dos cadenas ligeras L2 y dos cadenas pesadas H3, o dos cadenas ligeras L2 y dos cadenas pesadas H4 o dos L2 y dos cadenas pesadas H5 y otras combinaciones similares de pares de cadenas ligeras y pares de cadenas pesadas como se listan en la Tabla 1.

Como un ejemplo específico de tales anticuerpos, en una modalidad, el anticuerpo anti-Dkk-1 es un anticuerpo monoclonal derivado de ratas. Los anticuerpos ejemplares capaces de unirse al epítope conformacional mencionado anteriormente son los anticuerpos monoclonal 11H10 y 1F11 (ver, ejemplos más adelante), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera y una cadena pesada. La cadena ligera completa de 11H10 es codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO.9, y la cadena pesada completa de 11H10 por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO:11. Se muestran las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada correspondiente de 11H10, respectivamente, en la SEC ID NOS:10 y 12. Los residuos 1-20 de la SEC ID NO:10 y los residuos 1-19 de la SEC ID NO:12 corresponden a las secuencias de señal de éstas cadenas ligera y pesada de 11H10, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera sin la secuencia señal se muestra en la SEC ID NO:82; la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada que carece de la secuencia señal se muestra en la SEC ID NO:89.

Así, en un aspecto de la modalidad anterior, la cadena pesada puede consistir de 20-465 aminoácidos de la SEC ID NO:12 (es decir, H1, corresponde a la SEC ID NO:89), y en otro aspecto de esta modalidad, la cadena ligera pueden consistir de 21-234 aminoácidos de la SEC ID NO:10 (es decir, L1, corresponde a la SEC ID NO:82). En aún otro aspecto de esta modalidad, el anticuerpo comprende de una cadena pesada que consiste de 20-465 aminoácidos de la SEC ID NO:12 y una cadena ligera que consiste de 21-234 aminoácidos de la SEC ID NO:10. En algunos casos, el anticuerpo consiste de dos cadenas pesadas idénticas cada una consiste de 20-465 aminoácidos de la SEC ID NO:12 y dos cadenas ligeras idéntica cada una consiste de 21-234 aminoácidos de la SEC ID NO:10. Otro ejemplo específico es un anticuerpo que incluye la cadena ligera L2 (SEC ID NO:26) y la cadena pesada H2 (SEC ID NO:34). Las secuencias de codificación para éstas cadenas pesada y ligera se presentan respectivamente, en la SEC ID NOS:25 y 33. Estos anticuerpos pueden incluir dos cadenas pesadas y ligeras idénticas. Las otras cadenas pesadas y cadenas ligeras listadas en la Tabla 1 se pueden combinar de una manera similar. Otros anticuerpos que se proporcionan son variantes de los anticuerpos formados por combinación de las cadenas pesada y ligera mostradas en la Tabla 1 y comprenden cadenas ligeras y/o pesadas donde cada una tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad para las secuencias de aminoácidos de estas cadenas. En algunos casos, tales anticuerpos incluyen por lo menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras que en otros casos tales formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

B. Dominios Variables de Anticuerpos También se proporcionan anticuerpos que comprenden una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de VL1, VL2, VL3 y/o una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en VH1-VH10 como se muestra en la Tabla 2 más adelante, y fragmentos, derivados, muteínas y variantes inmunológicamente funcionales de éstas regiones variables de cadena ligera y pesada.

Los anticuerpos de este tipo se pueden señalar generalmente por la fórmula "VLxVHy", donde "x" es el número de la región variables de cadena ligera e "y" corresponden al número de la región variable de cadena pesada como se lista en la Tabla 2. En general, x e y son cada una 1 ó 2.

Tabla 2: Regiones Variables Así, VL2VH1 se refiere a un anticuerpo con un dominio de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de VL2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de VH1. Los anticuerpos que se proporcionan así incluyen, pero no se limitan a, los que tienen la siguiente forma: VL1VH1, VL1VH2, VL1VH3, VL1VH4, VL1VH5, VL1VH6, VL1VH7, VL1VH8, VL1VH9, VL1VH10, VL2VH1, VL2VH2, VL2VH3, VL2VH4, VL2VH5, VL2VH6, VL2VH7, VL2VH8, VL2VH9, VL2VH10, VL3VH1, VL3VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL3VH5, VL3VH6, VL3VH7, VL3VH8, VL3VH9 y VL3VH10. En algunos casos, los anticuerpos anteriores incluyen dos dominios de región variable de cadena ligera y dos dominios de región variable de cadena pesada (por ejemplo VL12VH12 etc.). Como un ejemplo específico de tales anticuerpos, ciertos anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos comprenden la región variable de la cadena ligera o región variable de la cadena pesada de 11H10, en donde la región variable de cadena ligera consiste de 21-127 aminoácidos de la SEC ID NO:10 (es decir, VL1, corresponde a la SEC ID NO:84) y la región variable de cadena pesada consiste de 20-139 aminoácidos de la SEC ID NQ:12 (es decir, VH1, corresponde a la SEC ID NO:91). En un aspecto de esta modalidad, el anticuerpo consiste de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. También se proporciona, por ejemplo, un anticuerpo que comprende a una región variable de cadena ligera que consiste de 21-127 aminoácidos de la SEC ID NO:10 o una unión al antígeno o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo y además comprende una región variable de cadena pesada que consiste de 20-139 aminoácidos de la SEC ID NO:12. Ciertos anticuerpos comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionado de L1, L2 o L3 en solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 residuos de aminoácidos, en donde cada tal diferencia de la secuencia es independientemente una eliminación, inserción o sustitución de un aminoácido. La región variable de cadena ligera en algunos anticuerpos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia a las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de VL1, VL2 o VL3. Se proporcionan algunos anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionado de H1-H10 en solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 residuos de aminoácidos, en donde cada tal diferencia de la secuencia es independientemente una eliminación, inserción o sustitución de un aminoácido. La región variable de cadena pesada en algunos anticuerpos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia a las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10. Aún otros anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales incluyen formas variantes de una cadena ligera variable y una cadena pesada variable como simplemente se describe. C. CDRs de Anticuerpos Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y regiones de estructura (FR) de un anticuerpo dado se pueden identificar usando el sistema descrito por Kabat y colaboradores en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept of Health and Human Services, Publicación PHS, NIH, NIH No. 91-3242, 1991. Ciertos anticuerpos que se describen en la presente comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas o tienen identidad de la secuencia sustancial a las secuencias de aminoácidos de una o más CDRs como se resume en la Tabla 3. Tabla 3: CDRs Los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan pueden incluir una, dos, tres, cuatro, cinco o todas las seis de las CDRs listadas anteriormente. Algunos anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales incluyen la CDR3 de cadena ligera y la CDR3 de cadena pesada. Ciertos anticuerpos tienen formas variantes de las CDRs listadas en la Tabla 3, con una o más (es decir, 2, 3, 4, 5 ó 6) de las CDRs cada una tiene por lo menos 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad de secuencia a una secuencia de CDR listada en la Tabla 3. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional puede incluir una CDR3 de cadena ligera y una CDR3 de cadena pesada donde cada una tiene por lo menos 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad de secuencia a la secuencia de CDR3 de cadena ligera y la CDR3 de cadena pesada, respectivamente, listadas en la Tabla 3. Las secuencias de CDR de algunos de los anticuerpos que se proporcionan pueden también diferir de las secuencias de CDR listadas en la Tabla 3 tal que la secuencia de aminoácidos para cualquier CDR dada difiere de la secuencia listada en la Tabla 3 por no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 residuos de aminoácidos. Las diferencias de las secuencias listadas son generalmente sustituciones conservadoras (ver más adelante). Como un ejemplo específico, los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan pueden comprender una o más de las siguientes secuencias de CDR de la cadena ligera de 11H10: CDR1: 44-54 aminoácidos de la SEC ID NO:10, que también corresponde a la SEC ID NO:70 (codificada por los 130-162 nucleótidos de la SEC ID NO:9 (SEC ID NO:85) o SEC ID NO:69); CDR2: 70-76 aminoácidos de la SEC ID NO:10, que también corresponde a la SEC ID NO:72 (codificada por los 208-228 nucleótidos de la SEC ID NO:9 (SEC ID NO:86) o SEC ID NO:71); CDR3: 109-117 aminoácidos de la SEC ID NO:10, que también corresponde a la SEC ID NO:74 (codificada por los 325-351 nucleótidos de la SEC ID NO:9 (SEC ID NO:87) o SEC ID NO:73); Los anticuerpos adicionales y fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales de la invención pueden comprender una o más de las secuencias siguientes de CDR de la cadena pesada de 11H10: CDR1: 50-54 aminoácidos de la SEC ID NO:12, que también corresponde a la SEC ID NO:76 (codificada por los 148-162 nucleótidos de la SEC ID NO:11 (SEC ID NO:92) o SEC ID NO:75); CDR2: 69-85 aminoácidos de la SEC ID NO:12, que también corresponde a la SEC ID NO:78 (codificada por los 205-255 nucleótidos de la SEC ID NO:11 (SEC ID NO:93) o SEC ID NO:77); CDR3: y 118-128 aminoácidos de la SEC ID NO:12, que también corresponde a la SEC ID NO:80 (codificada por los 352-384 nucleótidos de la SEC ID NO:11 (SEC ID NO:94) o SEC ID NO:79). Los polipéptidos que comprenden una o más de las CDRs de cadena ligera o pesada pueden producirse usando un vector adecuado para expresar los polipéptidos en una célula hospedadora adecuada como se describe en mayor detalle más adelante. Las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDRs que se describen en la Tabla 2 y 3 pueden utilizarse para preparar cualquiera de los varios tipos de fragmentos inmunológicamente funcionales los cuales se conocen en la técnica, pero no se limitan a, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena sencilla y scFvs. D. Anticuerpos y Epítopes de Unión Cuando un anticuerpo se dice para unir un epítope dentro de los residuos especificados, tales como Dkk-1, por ejemplo, que significan que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que consiste de residuos especificados (por ejemplo, un segmento especificado de Dkk-1). Tal anticuerpo no entra en contacto necesariamente con cada residuo dentro de Dkk-1. Ni cada sustitución o eliminación del aminoácido sencillo dentro de Dkk-1 necesariamente de manera significativa afecta la afinidad de unión. La especificidad de Epítope de un anticuerpo se puede determinar en variedad de maneras. Un proceso, por ejemplo, involucra probar una colección de péptidos traslapados de aproximadamente 15 aminoácidos que separan la secuencia de Dkk-1 y difieren en incrementos de un número pequeño de aminoácidos (por ejemplo, 3 aminoácidos). Los péptidos se inmovilizan dentro de los pozos de un placa de microtitulación. La inmovilización puede efectuarse mediante biotinilación un término de los péptidos. Opcionalmente, diferentes muestras del mismo péptido pueden biotinilarse en las N y C-terminales e inmovilizarse en pozos separados para propósitos de comparación. Esto es útil para identificar anticuerpos de extremo específico. Opcionalmente, los péptidos adicionales pueden incluirse para terminar en un aminoácido particular de interés. Esta proceso es útil para identificar anticuerpos de extremo específico a fragmento internos de Dkk-1. Un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional es protege para la unión específica para cada uno de los varios péptidos. El epítope se define como ocurre con un segmento de aminoácidos que es común para todos los péptidos a los cuales el anticuerpo muestre la unión específica. Los detalles con respecto a un proceso específico para definir un epítope se indican en el Ejemplo 6. Los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos que se unen a un epítope conformacional que está localizado en la porción carboxi-terminal de Dkk-1 (ver Figura 1), también se proporcionan. El carboxi-terminal de Dkk-1 contiene varios residuos de cisteína que forman un grupo de enlaces de disulfuro que crean varios bucles. La invención proporciona anticuerpos que se unen a dos de estos bucles, de este modo neutralizando la capacidad de Dkk-1 de suprimir la actividad de Wnt. Los anticuerpos ejemplares capaces de unirse al epítope conformacional mencionados anteriormente son los anticuerpos monoclonales 11H10 e 1F11, cada uno de los cuales comprende una cadena ligera y una cadena pesada. La cadena ligera completa de 11H10 es codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO:9, y la cadena pesada completa de 11H10 por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO:11. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada correspondientes de 11H10 (incluyendo secuencias de señal) se muestran, respectivamente, en la SEC ID NOS:10 y 12. Las formas maduras sin las secuencias de señal corresponden a la SEC ID NOS:82 y 89. El epítope que comprende estos dos bucles es formado por enlaces de disulfuro entre los residuos de cisteína 220 y 237 de la SEC ID NO:2 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 de la SEC ID NO:2. El cuerpo de los dos bucles que forman el epítope así incluye 221-236 y 246-262 aminoácidos de la SEC ID NO:2. Los segmentos dentro de este bucle que están involucrados en la unión incluyen 221-229 aminoácidos de la SEC ID NO:2 y 246-253 aminoácidos de la SEC ID NO:2. Así, ciertos anticuerpos y fragmentos que se proporcionan en la presente específicamente se unen a las regiones anteriores. Algunos de los anticuerpos y fragmentos, por ejemplo, se unen a un péptido que comprende o consiste de 221 a 262 aminoácidos de la SEC ID NO:2. En un aspecto de la invención, se proporcionan los péptidos que comprenden o consisten de 221-229 y/o 246-253 aminoácidos de la SEC ID NO:2. Otros péptidos comprenden o consisten de 221-236 y/o 246-262 aminoácidos de la SEC ID NO:2. Aún otros péptidos que se proporcionan comprenden o consisten de la región de 221 a 262 aminoácidos de la SEC ID NO:2 o 221-253 aminoácidos de la SEC ID NO:2. Tales péptidos son más cortos que la secuencia de proteína de longitud completa de una Dkk-1 nativa (por ejemplo, los péptidos pueden incluir una o más de las regiones anteriores y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150 ó 200 aminoácidos en longitud). Estos péptidos pueden fusionarse a otro péptido para incrementar la inmunogenicidad y así para estar en la forma de una proteína de fusión. E. Anticuerpos Competentes También se proporcionan anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que compiten con uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales ejemplificados para la unión específica a Dkk-1. Tales anticuerpos y fragmentos también pueden unirse al mismo epítope como uno de los anticuerpos ejemplificados. Se espera que los anticuerpos y fragmentos que compiten con o se unen al mismo epítope como el anticuerpo o fragmento ejemplificado muestren propiedades funcionales similares. Los anticuerpos y fragmentos ejemplificados incluyen los descritos anteriormente, incluyendo aquéllos con cadenas pesadas y ligeras, dominios de región variables y CDRs registradas en las Tablas 1-3. Los anticuerpos o fragmentos competentes inmunológicamente funcionales pueden incluir los que se unen al epítope descrito en la sección en anticuerpos y epítopes anteriores. Como un ejemplo específico, algunos anticuerpos o fragmentos competentes incluyen los que específicamente unen una proteína Dkk-1 que consiste de 32 a 266 aminoácidos de la SEC ID NO:2 o 32 a 272 aminoácidos de la SEC ID NO:4 y pueden prevenir o reducir la unión a la Dkk-1 humana de un anticuerpo que consiste de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, en donde las cadenas pesadas consisten de 20-465 aminoácidos de la SEC ID NO:12 y las cadenas ligeras consisten de 21-234 aminoácidos de la SEC ID NO:10. Otros anticuerpos competentes previenen o reducen la unión a la Dkk-1 humana de un anticuerpo que consiste de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas tales como las registradas en la Tabla 1. F. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos que se proporcionan incluyen anticuerpos monoclonales que se unen a Dkk-1. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, células del bazo inmortalizadas cosechadas a partir del animal transgénicos después de la terminación del programa de inmunización. Las células del bazo pueden inmortalizarse utilizando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, fusionándose con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para uso en procedimientos de fusión que producen hibridomas, preferiblemente son de las que no producen anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión, y deficiencias enzimáticas que se presentan incapaces del crecimiento en cierto medio selectivo que soporta el crecimiento de solamente las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de líneas celulares adecuadas para uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FQ, NSO/TJ, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; los ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6. En algunos casos, una línea celular de hibridoma es producida inmunizando un animal (por ejemplo, un animal transgénicos que tiene secuencias de inmunoglobulina humanas) con un inmunógeno Dkk-1; células del bazo cosechadas del animal inmunizado; fusionando las células del bazo cosechadas en una línea celular de mieloma, de este modo generando células de hibridoma; estableciendo líneas celulares de hibridoma a partir de células de hibridoma, e identificando una línea celular de hibridoma que produzca un anticuerpo que enlaza un polipéptido Dkk-1. Tales líneas celulares de hibridoma, y anticuerpos monoclonales Dkk-1 producidas por las mismas, se comprenden por la presente invención. Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden purificarse usando cualquier técnica conocida en la técnica. Los hibridomas o mAbs pueden protegerse adicionalmente para identificar los mAbs con propiedades particulares, tales como la capacidad de bloquear una actividad inducida de Wnt. Los ejemplos de tales protecciones se proporcionan en los ejemplos más adelante. G. Anticuerpos Quiméricos y Humanizados También se proporcionan anticuerpos quiméricos y humanizados basados en las secuencias anteriores. Los anticuerpos monoclonales para uso como agentes terapéuticos pueden modificarse de varias maneras antes del uso. Un ejemplo es un anticuerpo "quimérico", que es un anticuerpo integrado por segmentos de proteína de diferentes anticuerpos que covalente se unen para producir cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulina funcionales o porciones inmunológicamente funcionales de las mismas. Generalmente, una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica con u homólogo a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas con u homólogo a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. Para métodos relacionados a anticuerpos quiméricos, ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Morrison y colaboradores, Proc.

Nati Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1985), que se incorporan por este medio por referencia. Los injertos de CDR se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, y 5,530,101, que están todas incorporadas en la presente por referencia para todos los propósitos.

Generalmente, la meta de elaborar un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la cual el número de aminoácidos de la especie paciente prevista se maximice. Un ejemplo es el anticuerpo de "CDR-injertado", en el cual el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de las cadenas del anticuerpo son idénticas con u homologas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. Para uso en seres humanos, la región V o CDRs seleccionados de un anticuerpo de roedor a menudo se injerta en un anticuerpo humano, sustituyendo las regiones V o CDRs que ocurren naturalmente del anticuerpo humano. Un tipo útil de anticuerpo quimérico es un "anticuerpo humanizado". Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal cultivado inicialmente en un animal no humano. Ciertos residuos de aminoácidos en este anticuerpo monoclonal, normalmente de porciones que reconoce el no-antígeno del anticuerpo, se modifican para ser homólogos a los residuos correspondientes en un anticuerpo humano del isotipo correspondiente. La humanización puede realizarse, por ejemplo, utilizando varios métodos sustituyendo por lo menos una porción de una región variable de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,585,089, y 5,693,762; Jones y colaboradores, 1986, Nature 321:522-25; Riechmann y colaboradores, 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen y colaboradores, 1988, Science 239:1534-36). En un aspecto de la invención, las CDRs de las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos proporcionadas en la presente (ver Tabla 3) están injertadas en las regiones de estructura (FRs) a partir de anticuerpos de las mismas, o una diferente, especie filogenética. Por ejemplo, las CDRs de las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo 11H10 pueden injertarse a la FRs humana de consenso. Para crear la FRs humana de consenso, las FRs de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera humana pueden alinearse para identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. En otras modalidades, las FRs de la cadena pesada o cadena ligera del anticuerpo 11H10 se sustituyen por las FRs de una diferente cadena pesada o cadena ligera. En un aspecto de la invención, los aminoácidos raros en las FRs de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo anti-Dkk-1 no se sustituyen, mientras el resto de los aminoácidos de la FR se sustituye. Un "aminoácido raro" es un aminoácido específico que está en una posición en la cual este aminoácido particular no se encuentra normalmente en una FR.

Alternativamente, las regiones variables injertadas del anticuerpo 11H10 pueden utilizarse con una región constante que sea diferente de la región constante de 11H10. En otras modalidades de la invención, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo Fv de cadena sencilla. En ciertas modalidades, las regiones constantes de especies distintas de la humana pueden utilizarse junto con las regiones variables humano para producir anticuerpos híbridos. H. Anticuerpos Completamente Humanos También se proporcionan anticuerpos completamente humanos.

Los métodos están disponibles para elaborar anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer seres humanos al antígeno ("anticuerpos completamente humanos"). Un medio para llevar a cabo la producción de anticuerpos completamente humanos es la "humanización" del sistema inmune humoral de ratón. La introducción del sitio de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los cuales los genes de Ig endógenos se han inactivado es un medio para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos (MAbs por sus siglas en inglés) en el ratón, un animal que puede inmunizarse con cualquier antígeno deseable. La utilización de anticuerpos completamente humanos puede minimizar las respuestas inmunogenéticas y alérgicas que pueden ser causadas a veces administrando Mabs de ratón o derivatizado de ratón a humanos como agentes terapéuticos. Los anticuerpos completamente humanos pueden producirse inmunizando animales transgénicos (generalmente ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Los antígenos para este propósito normalmente tienen seis o más aminoácidos contiguos, y opcionalmente se conjugan a un portador, tal como un hapteno. Ver, por ejemplo, Jakobovits y colaboradores, 1993, Proc, Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits y colaboradores, 1993, Nature 362:255-258; y Bruggermann y colaboradores, 1993, Year in Immunol. 7:33. En un ejemplo de tal método, los animales transgénicos son producidos incapacitando el sitio de inmunoglobulina de ratón endógeno que codifica las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras de ratón en el mismo, e insertando en los fragmentos largos del genoma de ratón del genoma del ADN humano que contiene el sito que codifica las proteínas de cadena pesada y ligera humanas. Los animales parcialmente modificados, que tienen menos del complemento total del sitio de inmunoglobulina humana, entonces se cruzan para obtener un animal que tiene todas las modificaciones del sistema inmune deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecíficos para el inmunógeno pero tienen el humano en lugar de las secuencias de aminoácidos murinos, incluyendo las regiones variables. Para otros detalles de tales métodos, ver, por ejemplo, los documentos WO96/33735 y WO94/02602, que se incorporan por este medio por referencia. Los métodos adicionales con relación a ratones transgénicos para hacer anticuerpos humanos se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; 6,162,963; 5,545,807; 6,300,129; 6,255,458; 5,877,397; 5,874,299 y 5,545,806; en las Publicaciones PCT WO91/10741, WO90/04036, y en los documentos EP 546073B1 y EP 546073A1, los cuales se incorporan por este medio por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Los ratones transgénicos descritos anteriormente, referidos en la presente como ratones "HuMab", contienen un minilocus del gen de inmunoglobulina humana que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y y) y ligera K humanas no reestructuradas, junto con mutaciones designadas que inactivan el sitio de cadena µ y K endógena (Lonberg Lonberg y colaboradores, 1994, Nature 368: 856-859). Por consiguiente, la exhibición de los ratones redujo la expresión del IgM o K de ratón y en respuesta a la inmunización, y cambiando la clase que se sometió a transgenes de cadena pesada y ligera humana inducida y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG K humanos de alta afinidad (Lonberg y colaboradores, supra.; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y.

Acad. Sci. 764: 536-546). La preparación de ratones HuMab se describe detalladamente en Taylor y colaboradores, 1992, Nucleic Acids Research, 20: 6287-6295; Chen y colaboradores, 1993, International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y colaboradores, 1994, J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg y colaboradores, 1994, Nature 368: 856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113: 49-101; Taylor y colaboradores, 1994, International Immunology 6: 579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546; Fishwild y colaboradores, 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851; las referencias anteriores se incorporan por este medio por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Ver además Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; así como la Patente Norteamericana No. 5,545,807; Publicaciones Internacionales Nos. WO 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918, las descripciones de todas las cuales se incorporan por este medio por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se describen también en el documento WO 98/24893, y Méndez y colaboradores, 1997, Nature Genetics 15: 146-156, que se incorporan por este medio por referencia. Por ejemplo, las cepas de ratón transgénico HCo7 y HCo12 pueden utilizarse para generar anticuerpos anti-Dkk-1 humana. Usando tecnología del hibridoma, el MAbs humano antígeno-específico con la especificidad deseada puede producirse y protegerse de ratones transgénicos tales como los descritos anteriormente. Tales anticuerpos pueden reproducirse y expresarse usando un vector y células hospedadoras adecuados, o los anticuerpos se pueden cosechar de células del hibridoma cultivadas.

Los anticuerpos completamente humanos pueden también derivarse de bibliotecas de exposición en fagos (como se describe en Hoogenboom y colaboradores, 1991, J. Mol Biol 227:381; y Marks y colaboradores, 1991, J. Mol Biol. 222:581). Las técnicas de exposición en fago imitan la selección inmune a través de la exhibición de repertorios del anticuerpo en la superficie del bacteriófago filamentoso, y la selección subsiguiente del fago por su unión a un antígeno de opción. Una tal técnica se describe en la Publicación PCT No. WO99/10494 (incorpora por este medio por referencia), que describe el aislamiento de anticuerpos de alta afinidad y agonísticos funcionales para receptores MPL- y msk-usando tal proceso.

I. Anticuerpos Biespecíficos o Bifuncionales Los anticuerpos que se proporcionan también incluyen anticuerpos biespecíficos y bifuncionales que incluyen uno o más CDRs o una o más regiones variables como se describe anteriormente. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en algunos casos es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Los anticuerpos biespecífico no pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero sin limitarse a, fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachniann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny y colaboradores, 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553.

J. Varias Otras Formas Algunos de los anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan son formas variantes de los anticuerpos y fragmentos descritos anteriormente (por ejemplo, los que tienen las secuencias listadas en las Tablas 1-3). Por ejemplo, algunos de los anticuerpos o fragmentos son unos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras en una o más de las cadenas pesadas o ligeras, regiones variables o CDRs listadas en las Tablas 1-3.

Los aminoácidos que ocurren naturalmente pueden dividirse en clases basadas en propiedades de cadena lateral comunes: 1) hidrofóbico: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He; 2) hidrofílico neutral: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) ácido: Asp, Glu; 4) básico: His, Lys, Arg; 5) residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromático: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden comprender residuos de aminoácidos que no ocurren naturalmente, que se incorporan normalmente por síntesis del péptido química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de fracciones de aminoácidos. Las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de las clases anteriores para un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo que son homologas con los anticuerpos humanos, o en las regiones no-homólogas de la molécula. Al realizar tales cambios, de acuerdo a ciertas modalidades, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. El perfil hidropático de una proteína es calculado asignando a cada aminoácido un valor numérico ("índice de hidropatía") y entonces repetidamente promediar estos valores a lo largo de la cadena de péptido. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base de sus características de hidrofobicidad y carga. Siendo: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina ( + 1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). La importancia del perfil hidropático en conferir la función biológica interactiva en una proteína se entiende en la técnica (ver, ejemplo, Kyte y colaboradores, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Se conoce que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o relación hidropática similar y todavía conservar una actividad biológica similar. Al realizar los cambios basados en el índice hidropático, en ciertas modalidades, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2. En algunos aspectos de la invención, se incluyen los que están dentro de ±1, y en otros aspectos de la invención, se incluyen los qu están dentro de ±0.5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos semejantes pueden hacerse eficientemente en base de la hidrofilicidad, particularmente donde la proteína o péptido biológicamente funcional de este modo creado se desea para el uso en modalidades inmunológicas, como en el presente caso. En ciertas modalidades, la hidrofilicidad promedio local mayor de una proteína, como se maneja por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, tiene correlación con su inmunogeneicidad y unión al antígeno o 'inmunogeneicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácidos: arginina ( + 3.0); lisina ( + 3.0); aspartato ( + 3.0 ± 1); glutamato ( + 3.0 ± 1); serina ( + 0.3); asparagina (+0.2); glutamina ( + 0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptófano (-3.4). Al realizar los cambios basados en valores de hidrofilicidad similar, en ciertas modalidades, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, en otras modalidades, se incluyen los que están dentro de ±1, y aún otras modalidades, se incluyen los que están dentro de ±0.5. En algunos casos, uno puede también identificar epítopes a partir de secuencias de aminoácidos primarias en base de la hidrofilicidad. Estas regiones también se refieren como "regiones de relación epitópicas".

Las sustituciones de aminoácidos conservadoras ejemplares se indican en la Tabla 4.

Tabla 4 Sustituciones de Aminoácidos Un experto podrá determinar las variantes adecuadas de polipéptidos como se indica en la presente usando técnicas bien conocidas. El experto puede identificar las áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin actividad destructora por dirigirse a las regiones que no se cree que son importantes para la actividad. El experto también podrá identificar residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En modalidades adicionales, incluso las áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservadoras sin destruir la actividad biológica o sin adversamente afectar la estructura del polipéptido. Adicionalmente, el experto en la técnica puede revisar los estudios de función de la estructura que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de tal comparación, uno puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a los residuos de aminoácidos importantes para la actividad o estructuran en proteínas similares. El experto en la técnica puede optar por las sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes predichos. El experto en la técnica puede también analizar la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos con relación a la estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, el experto en la técnica puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. El experto en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales a los residuos de aminoácidos previstos que están en la superficie de la proteína, puesto que tales residuos pueden involucrarse en interacciones importantes con otras moléculas. Por otra parte, el experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una sola sustitución de aminoácidos en cada residuo de aminoácidos deseado. Estas variantes entonces pueden protegerse usando ensayos para la actividad que neutraliza Dkk-1, (ver los ejemplos más adelante) así produciendo la información con respecto a cuales aminoácidos pueden cambiarse y cuales no deben cambiarse. Es decir, basado en la información recolectó de tales experimentos de rutina, el experto en la técnica puede determinar fácilmente las posiciones de los aminoácidos donde otras sustituciones deben evitarse solamente o en combinación con otras mutaciones. Un número de publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Ver Moult, 1996, Cwr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou y colaboradores, 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou y colaboradores, 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou y colaboradores, 1978, Adv. Enzymol. Relat. Áreas Mol. Biol. 47:45-148; Chou y colaboradores, 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; and Chou y colaboradores, 1979, Biophys. J. 26:367-384. Por otra parte, los programas de computadora están actualmente disponibles para asistir para predecir la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en modelado por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una de la identidad de secuencia de mayor del 30%, o similar mayor de 40% a menudo tienen topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructural de proteína (PDB por sus siglas en inglés) ha proporcionado previsibilidad mejorada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de dobleces dentro de una estructura del polipéptido o proteína. Ver Holm y colaboradores, 1999, Nucí. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner y colaboradores, 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que existe un número limitado de dobleces en un polipéptido o proteína dada y que un número crítico de estructuras se ha resuelto, la predicción estructural llegará a ser dramáticamente más exacta. Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "roscado" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl y colaboradores, 1996, Structure 4:15-19), "ensayo de perfil" (Bowie y colaboradores, 1991, Science 253:164-170; Gribskov y colaboradores, 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov y colaboradores, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), y "unión evolutiva" (ver See Holm, 1999, supra; and Brenner, 1997, supra). En algunas modalidades de la invención, las sustituciones de aminoácidos se hacen que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión al ligando o antígeno, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en tales polipéptidos. Por ejemplo, las sustituciones solas o múltiples de aminoácidos (en ciertas modalidades, sustituciones de aminoácidos conservadoras) pueden hacerse en la secuencia que ocurre naturalmente. Las sustituciones pueden hacerse en donde la porción del anticuerpo que queda fuera del dominio(s) que forma los contactos intermoleculares). En tales modalidades, las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden utilizarse cuando no cambien sustancialmente las características estructurales de la secuencia madre (por ejemplo, uno o más aminoácidos de reemplazo que no interrumpen la estructura secundaria que caracteriza el anticuerpo madre o nativo). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias del polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; and Thornton y colaboradores, 1991, Nature 354: 105, que son cada uno incorporados en la presente por referencia. La invención también comprende variantes de glicosilación de los anticuerpos inventivos en donde el número y/o tipo de sitios de glicosilación se ha alterado comparado a las secuencias de aminoácidos del polipéptido madre. En ciertas modalidades, las variantes de la proteína del anticuerpo comprenden un número mayor o uno menor de sitios de glicosilación de N-enlazados que el anticuerpo nativo. Un sitio de glicosilación N-enlazado es caracterizado por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácidos designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácidos excepto prolina. La sustitución de los residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato de enlace al N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia prevendrán la adición de una cadena de carbohidrato de enlace al N presente en el polipéptido nativo. Por ejemplo, la glicosilación puede reducirse por la eliminación de un Asn o sustituyendo el Asn con un diferente aminoácido. En otras modalidades, se crean uno o más nuevos sitios de enlace al N. Los anticuerpos tienen normalmente un sitio de glicosilación de enlace al N en la región Fc. Por ejemplo, el anticuerpo 11H10 descrito en la presente tiene un sitio de glicosilación de enlace al N en el aminoácido 315 (SEC ID NO: 12). Las variantes del anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en donde uno o más residuos de cisteína en la secuencia de aminoácido madre o nativa se suprimen de o sustituyen con otro aminoácido (por ejemplo, serina). Las variantes de cisteína son útiles, inter alia cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteína pueden tener pocos residuos de cisteína que el anticuerpo nativo, y tienen normalmente un número par para minimizar las interacciones resultantes de los cisteínas impar. Las cadenas pesada y ligera, dominios de regiones variables y CDRs que se describen pueden utilizarse para preparar polipéptidos que contienen una región de unión al antígeno que pueda específicamente unir a un polipéptido Dkk-1. Por ejemplo, una o más CDRs listadas en la Tabla 3 pueden incorporarse en una molécula (por ejemplo, un polipéptido) covalente o no-covalentemente para hacer una inmunoadhesión. Una inmunoadhesión puede incorporar la CDR(s) como parte de una cadena de polipéptidos mayor, puede covalentemente ligar la CDR(s) a otra cadena de polipéptidos, o puede incorporar la CDR(s) no-covalentmente. La CDR(s) permite la inmunoadhesión para unir específicamente a un antígeno de particular interés (por ejemplo, un polipéptido o un epítope Dkk-1 del mismo). También se proporciona miméticos (por ejemplo, "péptidos miméticos" o "peptidomiméticos") basados en los dominios de región variable y CDRs que se describen en la presente. Estos análogos pueden ser péptidos, no-péptidos o combinaciones del péptido y regiones de no-péptido. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15: 29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; y Evans y colaboradores, 1987, J. Med. Chem.30: 1229, que se incorporan en la presente por referencia para cualquier propósito. Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelar molecular computarizadas. Generalmente, los peptidomiméticos de la invención son proteínas que son estructural similares a un anticuerpo que exhibe una actividad biológica deseada, tal como aquí la capacidad para específicamente unir Dkk-1, pero tiene una o más uniones del péptido opcionalmente sustituidas por un enlace seleccionado de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH = CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO-, por los métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un ácido D-amino del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede utilizar en ciertas modalidades de la invención para generar proteínas más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de la secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61: 387), incorporada en la presente por referencia), por ejemplo, agregando residuos de cisteína internos capaces de formar los puentes disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido. También se proporcionan derivados de los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se describen en la presente. El anticuerpo o fragmento derivatizado puede comprender cualquier molécula o sustancia que impartan una propiedad deseada al anticuerpo o fragmento, tal como una vida larga incrementada en un uso particular. El anticuerpo derivatizado puede comprender, por ejemplo, una porción detectable (o marcada) (por ejemplo, una molécula radiactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, un grano detectable (tal como un grano magnético o electrodenso (por ejemplo, oro)), o una molécula que se une a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina)), una porción terapéutica o de diagnóstico (por ejemplo, una porción radiactiva, citotóxica o farmacéuticamente activa), o una molécula que aumente la conveniencia del anticuerpo para un uso particular (por ejemplo, la administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro). Los ejemplos de moléculas que pueden utilizarse para derivatizar un anticuerpo incluyen albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano) y polietilenglicol (PEG). Los derivados enlazados a la albúmina y PEGilados de anticuerpos pueden prepararse usando técnicas bien conocidas en la técnica. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga o enlaza de otra manera a la transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede químicamente modificarse con, por ejemplo, un producto químico seleccionado del grupo que consiste de dextrano, poli(n-vinilpiurrolidona), polietilenglicoles, homopolímeros de propilenglicol, óxido de polipropileno/co-polímeros de óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcoholes de polivinilo. Otros derivados incluyen conjugaciones covalentes o agregados de anticuerpos anti-Dkk-1, o fragmentos de los mismos, con otras proteínas o polipéptidos, tal como por expresión de proteínas recombinantes de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a la N-terminal o C-terminal de un polipéptido del anticuerpo anti-Dkk-1. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido de señal heteróloga (o líder), por ejemplo, el líder de factor alfa de levadura, o un péptido tal como un epítope tag. Las proteínas de fusión que contiene el anticuerpo anti-Dkk-1 pueden comprender péptidos agregados para facilitar la purificación o identificación del anticuerpo anti-Dkk-1 (por ejemplo, poly-His). Un polipéptido del anticuerpo anti-Dkk-1 también puede enlazarse al péptido de FLAG como se describe en Hopp y colaboradores, Bio/Technology 6:1204, 1988, y Patente Norteamericana No. 5,011,912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítope reversible unido por un anticuerpo monoclonal específico (mAb), permitiendo el rápido ensayo y fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Los reactivo útiles para preparar proteínas de fusión en las cuales el péptido FLAG es fusionado en un polipéptido dado están disponibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO). Los oligómeros que contienen uno o más polipéptidos del anticuerpo anti-Dkk-1 pueden utilizarse como antagonistas Dkk-1. Los oligómeros pueden estar en la forma de dímeros, trímeros u oligómeros superiores enlazados covalentemente o no enlazados covalentemente. Los oligómeros que comprenden dos o más polipéptidos del anticuerpo anti-Dkk-1 se contemplan para el uso, con un ejemplo que es un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc. Una modalidad se dirige a oligómeros que comprenden polipéptidos del anticuerpo anti-Dkk-1 múltiples unidos vía interacciones covalentes o no-covalentes entre las fracciones del péptido fusionados a los polipéptidos del anticuerpo anti-Dkk-1. Tales péptidos pueden ser enlazadores del péptido (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de los polipéptidos del anticuerpo anti-Dkk-1 unidos a los mismos, como se describe más detalladamente más adelante. En modalidades particulares, los oligómeros comprenden de dos a cuatro polipéptidos del anticuerpo anti-Dkk-1. Las fracciones del anticuerpo anti-Dkk-1 del oligómero pueden estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los oligómeros comprenden los polipéptidos del anticuerpo anti-Dkk-1 que tienen actividad de unión de Dkk-1. En una modalidad, un oligómero es preparado usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados con varias porciones de polipéptidos derivados del anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi y colaboradores, 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn y colaboradores, 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh y colaboradores, 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusión Proteins", en Current Protocols in Immunology, Suppl.4, páginas 10.19.1-10.19.11. Una modalidad de la presente invención se dirige a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando un fragmento de unión Dkk-1 de un anticuerpo anti-Dkk-1 a la región Fc de un anticuerpo. El dímero puede hacerse con, por ejemplo, insertando una fusión del gen que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión del gen en las células hospedadoras transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitiendo que la proteína de fusión expresada ensamble muchas moléculas tipo anticuerpo, con lo cual los enlaces de disulfuro de intercadena se forman entre las fracciones de Fc para producir el dímero. El término "polipéptido Fc" como se utiliza en la presente incluye formas nativas y de muteina de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden las fracciones Fc (y oligómeros formados de las mismas) ofrecen la ventaja de la fácil purificación por cromatografía de afinidad sobre las columnas de proteína A o proteína G. Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 y Patentes Norteamericanas Nos. 5,426,048 y 5,262,522 (cada una de las cuales se incorpora por este medio por referencia), es un polipéptido de cadena sencilla que se extiende desde la región de bisagra N-terminal a la C-terminal nativa de la región Fc de un anticuerpo IgGI humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína Fc descrita en la Patente Norteamericana No. 5,457,035 y en Baum y colaboradores, 1994, EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, a menos que el aminoácido 19 se haya cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se haya cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se haya cambiado de Gly a Ala. La muteína exhibe afinidad reducida para los receptores Fc. En otras modalidades, la porción variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-Dkk-1 tal como la descrita en la presente puede sustituirse para la porción variable de una cadena pesada y/o ligera del anticuerpo. Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende el polipéptidos del anticuerpo anti-Dkk-1 múltiple, con o sin enlazadores de péptido (péptidos espaciados). Entre los enlazadores de péptido adecuado están los descritos en las Patentes Norteamericanas Nos.4,751,180 y 4,935,233. Otro método para preparar derivados del anticuerpo anti-Dkk-1 oligomérico involucra el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de la cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Las cremalleras de leucina son originalmente identificadas en varias proteínas de enlace de ADN (Landschulz y colaboradores, 1988, Science 240:1759), y posteriormente se han encontrado en una variedad de diferentes proteínas. Entre las cremalleras de leucina conocida son péptidos y derivados que ocurren naturalmente de las mismas que se dimeroizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y derivado de la cremallera de leucina de la proteína D del tensioactivo pulmonar (SPD por sus siglas en inglés) descrita en Hoppe y colaboradores, 1994, FEBS Letters 344:191, incorporada por este promedio por referencia. El uso de una cremallera de leucina modificada que permita la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada además se describe en Fanslow y colaboradores, 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En un proceso, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento o derivado del anticuerpo anti-Dkk-1 fusionado a un péptido de la cremallera de leucina se expresan en células hospedadoras adecuadas, y los fragmentos o derivados del anticuerpo anti-Dkk-1 oligoméricos solubles que se forman son recuperados del sobrenadante de cultivo. Algunos anticuerpos que se proporcionan tienen una afinidad de unión (Ka) para Dkk-1 de por lo menos 104 o 105/M x segundos medidos, por ejemplo, como se describe en los ejemplos más adelante. Otros anticuerpos tienen una ka de por lo menos 106, 107, 108 o 109/M x segundos. Ciertos anticuerpos que se proporcionan tienen una relación de disasociación baja. Algunos anticuerpos, por ejemplo, tienen una Koff de 1 x 10"4s"1, 1 x 10"5s"1 o inferior. En otra modalidad, la Koff es igual como un anticuerpo que tiene las siguientes combinaciones de los dominios de región variables VL1VH1, VL1VH2, VL1VH3, VL1VH4, VL1VH5, VL1VH6, VL1VH7, VL1VH8, VL1VH9, VL1VHIO, VL2VH1, VL2VH2, VL2VH3, VL2VH4, VL2VH5, VL2VH6, VL2VH7, VL2VH8, VL2VH9, VL2VH10, VL3VH1, VL3VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL3VH5, VL3VH6, VL3VH7, VL3VH8, VL3VH9, VL3VH10. En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-Dkk-1 que tiene una vida media de por lo menos un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano). En una modalidad, el anticuerpo tiene una vida media de por lo menos tres días. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de la misma tiene una vida media de cuatro días o mayor. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de la misma tiene una vida media de ocho días o mayor. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión al antígeno de la misma se derivatiza o modifica tal que tiene una vida media mayor con respecto al anticuerpo no derivatizado o sin modificar. En otra modalidad, el anticuerpo contiene mutaciones de punto para aumentar la vida media del suero, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000, incorporado por referencia. IV. Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos que codifican una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento, derivado, muteína, o variante del mismo, polinucleótidos suficientes para el uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores secuenciales para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos anti-sentido para inhibir la expresión de un polinucleótido, y secuencias complementarias de los anteriores, también se proporcionan. Los ácidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud. Pueden ser, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000 o más nucleótidos en longitud, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o sean parte de un ácido nucleico mayor, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser de una sola hebra o doble hebra y pueden comprender nucleótidos de ARNA y/o ADN, y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos del péptido). También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el epítope al cual se enlazan los anticuerpos proporcionados en la presente. Así, se incluyen algunos ácidos nucleicos que codifican los 221-229 y/o 246-253 aminoácidos de la SEC ID NO:2, al igual que los ácidos nucleicos que codifican los 221-236 y/o 246-262 aminoácidos de la SEC ID NO:2 y los que codifican los 221 a 262 aminoácidos de la SEC ID NO:2 o los 221-253 aminoácidos de la SEC ID NO:2. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión que incluyen estos péptidos. Los polipéptidos del anticuerpo que codifican el ADN (por ejemplo, cadena pesada o ligera, solamente domino variable, o longitud completa) pueden aislarse a partir de células B de ratones que se han inmunizado con Dkk-1 o un fragmento inmunogenético de los mismos. Puede aislarse el ADN por procedimientos convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La exposición en fago es otro ejemplo de una técnica conocida por medio de lo cual pueden prepararse los derivados de anticuerpos. En un proceso, los polipéptidos que son los componentes de un anticuerpo de interés se expresan en cualquier sistema de expresión recombinante adecuado, y los polipéptidos expresados se permiten montarse para formar moléculas del anticuerpo. Los ácidos nucleicos ejemplares que codifican las cadenas ligera y pesada, regiones variables y CDRs de los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan se listan en las Tablas 1-3 anteriores. Debido a la degeneración del código genético, cada una de las secuencias del polipéptido listadas en las Tablas 1-3 también se codifica por un gran número de otras secuencias de ácido nucleico además de las listadas en las Tablas 1-3. La presente invención proporciona cada secuencia de nucleótidos degenerada que codifica cada anticuerpo de la invención. La invención además proporciona ácidos nucleicos que hibridizan a otros ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos listada en las Tablas 1-3) bajo condiciones de hibridación particulares. Los métodos para hibridizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define en la presente, una condición de hibridación moderada rigurosa utiliza una solución de prelavado que contiene 5X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC por sus siglas en inglés), 0.5% de SDS, 1.0 mM de EDTA (pH 8.0), amortiguador de hibridación de aproximadamente 50% de formamida, 6X de SSC, y una temperatura de hibridación de 55°C (u otras soluciones de hibridación similares, tal como una que contiene aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de 42°C), y condiciones de lavado de 60°C, en 0.5X de SSC, 0.1% de SDS. Una condición de hibridación rigurosa hibridizada en 6X en SSC a 45°C, seguida por una o más lavadas en 0.1X de SSC, 0.2% de SDS a 68°C. Además, un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o disminuir la escasez de hibridación tal que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que son por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% idénticas entre sí normalmente permanecen hibridizadas entre sí. Los parámetros básicos que afectan la opción de las condiciones y dirección de hibridación para idear las condiciones adecuadas se indican en, por ejemplo, Sambrook, Fritsch, and Maniatís (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel y colaboradores, eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y pueden determinarse fácilmente por los técnicos en la técnica basado en, por ejemplo, la longitud y/o composición base del ADN. Los cambios pueden introducirse mediante mutación en un ácido nucleico, de este modo conduciendo a cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o derivado del anticuerpo de la invención) que es codificado. Las mutaciones pueden introducirse usando cualquier técnica conocida en la técnica. En una modalidad, se cambian uno o más residuos de aminoácidos particulares utilizando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis de sitio dirigido. En otra modalidad, se cambia uno o más residuos aleatoriamente seleccionados utilizando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis aleatorio. Sin embargo se hace, un polipéptido mutante puede expresarse y protegerse para una propiedad deseada.

Las mutaciones pueden introducirse en un ácido nucleico sin significativamente alterar la actividad biológica de un polipéptido que codifique. Por ejemplo, uno puede hacer sustituciones del nucleótido que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos no esenciales. Alternativamente, una o más mutaciones pueden introducirse en un ácido nucleico que cambian selectivamente la actividad biológica de un polipéptido que codifique. Por ejemplo, la mutación puede cambiar cuantitativa o cualitativamente la actividad biológica. Los ejemplos de cambios cuantitativos incluyen aumentar, reducir o eliminar la actividad. Los ejemplos de cambios cualitativos incluyen cambiar la especificidad del antígeno de un anticuerpo. En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para uso como cebadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácido nucleico de la invención. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solamente una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de longitud completa de la invención, por ejemplo, un fragmento que pueda utilizarse como una sonda o cebador o fragmento que codifica una porción activa (por ejemplo, una porción de unión de Dkk-1) de un polipéptido de la invención. Las sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para detectar el ácido nucleico o ácidos nucleicos similares, por ejemplo, transcripciones que codifican un polipéptido de la invención. La sonda puede comprender un grupo marcado, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor enzimático. Tales sondas pueden utilizarse para identificar una célula que exprese el polipéptido. En otro aspecto, la presente invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención o una porción de los mismos (por ejemplo, un fragmento que contiene uno o más CDRs o uno o más dominios de región variable). Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, vectores mamíferos no episomales y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinante. Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. Los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base de las células hospedadoras a utilizarse para la expresión, que operablemente se ligan a la secuencia de ácido nucleico a expresarse. Las secuencias reguladoras incluyen aquéllos de expresión constitutiva directa de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras (por ejemplo, mejorador del gen anterior SV40, promotor de virus de sarcoma de Rous y promotor de citomegalovirus), aquéllos de expresión directa de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras de tejido específico, ver Voss y colaboradores, 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis y colaboradores, 1987, Science 236:1237, incorporada por referencia en la presente en su totalidad), y aquéllas que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta al tratamiento o condición particular (por ejemplo, el promotor de metalotionina en células mamíferas y el promotor responsivo de tet-responsivo y/o estreptomicina en sistemas procarióticos y eucarióticos (ver identificación). Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como los elegidos de la célula hospedadora a transformarse, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras de este modo produciendo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente. En otro aspecto, la presente invención proporciona células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariótica (por ejemplo, E. coli) o célula eucariótica (por ejemplo, células de levadura, insecto o mamíferas (por ejemplo, células CHO)). El ADN del vector puede introducirse en células procariótica o eucariótica vía técnicas de transformación o - transfección convenientes. Para la transfección estable de células mamíferas, se conoce que, dependiendo de la técnica del vector de expresión y transfección usada, sólo una fracción pequeña de células puede integrar el ADN extranjero en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas estables con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección del fármaco (por ejemplo, las células que se les ha incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán), entre otros métodos. V. Preparación de Anticuerpos Los anticuerpos no humanos que se proporcionan pueden ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal que produce anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro, o primate no humano (tal como mono (por ejemplo, mono cinomólogo o rhesus) o simio (por ejemplo, chimpancé)). Los anticuerpos no humanos pueden utilizarse, por ejemplo, en cultivo de célula in vitro y aplicaciones basadas en cultivo celular, o cualquier otra aplicación donde una inmunorespuesta al anticuerpo no ocurre ni es insignificante, se puede prevenir, no es una preocupación, o se desea. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos pueden producirse inmunizando con Dkk-1 de longitud completa o con la mitad del carboxi-terminal de Dkk-1. Alternativamente, ciertos anticuerpos no humanos pueden ser elevados inmunizando con 221-236 aminoácidos y/o 246-262 aminoácidos de la SEC ID NO:2, que son segmentos de Dkk-1 humanas que forman parte del epítope al cual ciertos anticuerpos proporcionados en la presente se unen (por ejemplo, el 11H10, ver Figura 1). Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, o pueden sintetizarse en células hospedadoras que expresan el ADN recombinante. Los anticuerpos completamente humanos pueden prepararse como se describe anteriormente inmunizando animales transgénicos que contienen el sitio de inmunoglobulina humano o seleccionando una biblioteca que muestra el fago que esté expresando un repertorio de anticuerpos humanos. Los anticuerpos monoclonales (mAbs por sus siglas en inglés) de la invención pueden producirse por una variedad de técnicas, incluyendo metodología del anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación celular somática estándar de Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495. Alternativamente, otras técnicas para producir anticuerpos monoclonal pueden utilizarse, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema animal adecuado para preparar hibridomas es el sistema murino, que es un procedimiento muy bien establecido. Se conocen en la técnica, protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión. Para tales procedimientos, las células B de ratones inmunizados se fusionan con un asociado de fusión inmortalizado adecuado, tal como una línea celular de mieloma murino. Si se desea, ratas u otros mamíferos además pueden inmunizarse en vez de ratones y pueden fusionarse células B de tales animales con la línea celular de mieloma murino para formar hibridomas. Alternativamente, puede utilizarse una línea celular de mieloma de una fuente distinta de la de ratón. También son bien conocidos los procedimientos de fusión para elaborar hibridomas. Los anticuerpos de cadena sencilla que se proporcionan pueden formarse ligando fragmentos de dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) (ver, por ejemplo, Tabla 2) vía un puente de aminoácidos (enlazador de péptido corto), dando por resultado una cadena de polipéptido sencilla. Tales Fvs de cadena sencilla (scFvs) puede prepararse fusionando el ADN que codifica un enlazador de péptido entre ADNs que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH). Los polipéptidos resultantes pueden volverse a doblar en sí mismos para formar monómeros unidos al antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un enlazador flexible entre los dos dominios variables (Kortt y colaboradores, 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt y colaboradores, 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diversos polipéptidos que comprenden VL y VH, uno puede formar los scFvs multiméricos que enlazan diversos epítopes (Kriangkum y colaboradores, 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de cuerpos de cadena sencilla incluyen las descritas en la Patente Norteamericana No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward y colaboradores, 1989, Nature 334:544, de Graaf y colaboradores, 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Los anticuerpos de cadena sencilla derivados de anticuerpos proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, scFvs que comprenden las combinaciones de dominio variable: VL1VH1, VL1VH2, VL1VH3, VL1VH4, VL1VH5, VL1VH6, VL1VH7, VL1VH8, VL1VH9, VL1VHIO, VL2VH1, VL2VH2, VL2VH3, VL2VH4, VL2VH5, VL2VH6, VL2VH7, VL2VH8, VL2VH9, VL2VH10, VL3VH1, VL3VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL3VH5, VL3VH6, VL3VH7, VL3VH8, VL3VH9, VL3VH10. Los anticuerpos proporcionados en la presente que son de una subclase se pueden cambiar por anticuerpos de una diferente subclase usando métodos de cambio de subclase. Así, los anticuerpos de IgG pueden derivarse de un anticuerpo de IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión al antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo madre), pero también exhiben propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente de la del anticuerpo madre. Pueden utilizarse técnicas de ADN recombinantes. El ADN clonado que codifica polipéptidos del anticuerpo particulares puede utilizarse en tales procedimientos, por ejemplo, el ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Ver, por ejemplo, Lantto y colaboradores, 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16. Por consiguiente, los anticuerpos que se proporcionan incluyen los que comprenden, por ejemplo, las siguientes combinaciones del dominio variable: VL1VH1, VL1VH2, VL1VH3, VL1VH4, VL1VH5, VL1VH6, VL1VH7, VL1VH8, VL1VH9, VL1VHIO, VL2VH1, VL2VH2, VL2VH3, VL2VH4, VL2VH5, VL2VH6, VL2VH7, VL2VH8, VL2VH9, VL2VH10, VL3VH1, VL3VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL3VH5, VL3VH6, VL3VH7, VL3VH8, VL3VH9, VL3VH10 que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgE, e IgD) así como fragmentos Fab o F(ab')2 de los mismos. Por otra parte, si se desea un lgG4, también puede desearse para introducir una mutación de punto (CPSCP -> CPPCP) en la región de bisagra como se describe en Bloom y colaboradores, 1997, Protein Science 6:407, incorporado por referencia en la presente) para aliviar una tendencia a formar enlaces de disulfuro de cadena de intra-H que pueden conducir a la heterogeneidad en los anticuerpos de lgG4. Por otra parte, también se conocen técnicas para derivar anticuerpos que tienen diferentes propiedades (es decir, variar las afinidades para el antígeno al cual se unen). Una tal técnica, referida como redistribución de cadena, involucra exhibir los repertorios del gen de dominio variable de inmunoglobulina en la superficie del bacteriófago filamentoso, designada a menudo como la exposición en fago. La redistribución de cadena se ha utilizado para preparar anticuerpos de alta afinidad al hapten 2-feniloxazol-5-ona, como se describe por Marks y colaboradores, 1992, BioTechnology, 10:779. Las modificaciones conservadoras pueden hacerse a las cadenas pesada y ligera descritas en la Tabla 1 (y las modificaciones correspondientes a los ácidos nucleicos de codificación) para producir un anticuerpo anti-Dkk-1 que tiene características funcionales y bioquímicas. Los métodos para alcanzar tales modificaciones se describen anteriormente. Los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos de acuerdo a la invención pueden modificarse adicionalmente de varias maneras. Por ejemplo, si se van a utilizar para propósitos terapéuticos, pueden conjugarse con polietilenglicol (pegilados) para prolongar la vida media del suero o para el suministro de proteína mejorada. Alternativamente, la región V de los anticuerpos o fragmentos objetivo de la misma se puede fusionar con la región de Fc de una diferente molécula del anticuerpo. La región de Fc usada para este propósito se puede modificar de modo que no enlace el complemento, así reduciendo la probabilidad de inducir la lisis de la célula en el paciente cuando la proteína de fusión se utiliza como agente terapéutico. Además, los anticuerpos objetivo o fragmentos funcionales de los mismos se pueden conjugar con albúmina de suero humano para mejorar el vida media del suero del anticuerpo o fragmentos del mismo. Otro asociado de fusión útil para los anticuerpos o fragmentos inventivos del mismo es la transtiretina (TTR). La TTR tiene la capacidad de formar un tetrámero, así una proteína de fusión del anticuerpo-TTR puede formar un anticuerpo multivalente que pueda aumentar su avidez de unión. Alternativamente, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de los anticuerpos y fragmentos descritos en la presente pueden llevarse a cabo creando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura de la esqueleto molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) del volumen de la cadena lateral. Una "sustitución del aminoácido conservadora" puede involucrar una sustitución de un residuo de aminoácidos nativo con un residuo no nativo que tiene poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácidos en esta posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido puede también sustituirse con alanina, como se ha descrito previamente para mutagénesis de exploración de alanina. Las sustituciones de aminoácidos (si son conservadoras o no-conservadoras) de los anticuerpos objetivo se pueden llevar a cabo por los expertos en la técnica aplicando técnicas rutinarias. Las sustituciones de aminoácidos pueden utilizarse para identificar los residuos importantes de los anticuerpos proporcionados en la presente, o para aumentar o disminuir la afinidad de estos anticuerpos para Dkk-1 humana o para modificar la afinidad de unión de otros anticuerpos anti-Dkk-1 descritos en la presente. VI. Expresión de Anticuerpos Anti-Dkk-1 Los anticuerpos anti-Dkk-1 y fragmentos inmunológicamente funcionales pueden prepararse por cualquiera de un número de técnicas convencionales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Dkk-1 pueden producirse por sistemas de expresión recombinante, usando cualquier técnica conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet y colaboradores (eds.) Plenum Press, New York (1980): y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988). Los anticuerpos de la presente invención pueden expresarse en líneas celulares de hibridoma o en líneas celulares distinta de hibridomas. Los constructos de expresión que codifican los anticuerpos pueden utilizarse para transformar una célula hospedadora de mamífero, insecto o microbiana. La transformación puede realizarse usando cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo, por ejemplo empacando el polinucleótido en un virus o bacteriófago y transduciendo una célula hospedadora con el constructo por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las Patentes Norteamericanas Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (cuyas patentes se incorporan por este medio en la presente por referencia para cualquier propósito). El procedimiento de transformación óptimo usado dependerá de cual tipo de célula hospedadora se está transformando. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células mamíferas son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación del fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación de polinucleótido(s) en liposomas, mezclando ácido núcleos con lípidos positivamente cargados, y microinyección directa del ADN en núcleos. Los constructos de expresión recombinante de la invención normalmente comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende uno o más de los siguientes: una región constante de cadena pesada (por ejemplo, CH,, CH2 y/o CH3); una región variable de cadena pesada; una región constante de cadena ligera; una región variable de cadena ligera; una o más CDRs de la cadena ligera o pesada del anticuerpo anti-Dkk-1. Estas secuencias de ácido nucleico se insertan en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligadura estándares. En una modalidad, la región constante de cadena pesada o ligera 11H10 se añade al C-terminal de la región variable de cadena pesada o ligera Dkk-1-específica y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona normalmente por ser funcional en la célula hospedadora particular utilizada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora, permitiendo que pueda ocurrir la amplificación y/o expresión del gen). En algunas modalidades, se utilizan los vectores que usan ensayos de complementación de proteína-fragmento usando indicadores de proteína, tales como dihidrofolato reductasa (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,270,964, que se incorpora por este medio por referencia). Los vectores de expresión adecuados pueden adquirirse, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies o BD Biosciences (anteriormente "Clontech"). Otros vectores útiles para clonar y expresar los anticuerpos y fragmentos de la invención incluyen los descritos en Bianchi and McGrew, Biotech Biotechnol Bioeng 84(4):439-44 (2003), que se incorpora por este medio por referencia. Los vectores de expresión adecuados adicionales se discuten, por ejemplo, en Methods Enzymol, vol. 185 (D .V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press, que se incorpora por este medio por referencia. Normalmente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospedadoras contienen secuencias para el mantenimiento del plásmido o virus y para la clonación y expresión de secuencias del nucleótido exógeno. Tales secuencias, colectivamente referidas "secuencias flanqueadoras" incluyen normalmente una o más de las siguientes secuencias de nucleótido operativamente ligadas: un promotor, una o más secuencias mejoradas, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia del intrón completa que contiene un donante y sitio de empalme aceptador, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción de polipéptido, un sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de polienlazador para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresarse, y un elemento marcador seleccionable. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia de codificación "tag", es decir, una molécula de oligonucleótido localizada en el extremo 5' ó 3' de la secuencia de codificación, la secuencia de oligonucleótido que codifica polyHis (tal como hexaHis), u otra "tag" para los cuales los anticuerpos disponibles comercialmente existen, por ejemplo FLAG®, HA (hemaglutinina del virus de la influenza), o myc. La tag está normalmente fusionada en la proteína del anticuerpo en la expresión, y puede servir como un medio para la purificación de afinidad del anticuerpo de la célula hospedadora. La purificación de afinidad puede lograrse, por ejemplo, por cromatografía en columna usando anticuerpos contra la tag como una matriz de a afinidad. Opcionalmente, la tag se puede posteriormente retirar del polipéptido del anticuerpo purificado por varios medios tales como los que usan ciertas peptidasas para división. Las secuencias flanqueantes en el vector de expresión pueden ser homologas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula hospedadora), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula hospedadora), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o naturales. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la célula hospedadora. Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores de esta invención pueden obtenerse por cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Normalmente, las secuencias flanqueantes útiles en la presente habrán sido identificadas por mapeo y/o por digestión de endonucleasa de restricción y así pueden aislarse a partir de la fuente de tejido apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia del nucleótido completa de una secuencia flanqueante. Aquí, la secuencia flanqueante puede sintetizarse usando los métodos descritos en la presente para la síntesis o clonación del ácido nucleico. Donde toda o solamente una porción de la secuencia flanqueante se conoce, puede obtenerse usando PCR y/o protegiendo una biblioteca genómica con un oligonucleótido y/o fragmento de la secuencia flanqueante adecuado de la misma u otra especie. Donde la secuencia flanqueante no se conoce, un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante se puede aislar de una pieza mayor de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede lograrse por la digestión de la endonucleasa de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido por el aislamiento utilizando purificación del gel de agarosa, cromatografía en columna de Qiagen® (Chatsworth, CA), u otros métodos conocidos por el experto. La protección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para el experto en la técnica. Un origen de replicación es normalmente una parte de los vectores de expresión procarióticos, particularmente de los adquiridos comercialmente, y los soportes de origen en la amplificación del vector en una célula hospedadora. Si el vector de elección no contiene un origen del sitio de replicación, uno puede químicamente sintetizarse basado en una secuencia conocida, y ligado en el vector. Por ejemplo, el origen de la replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la bacteria gram-negativa mayor y varios orígenes (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), o papilomavírus tal como HPV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células mamíferas. Generalmente, un origen mamífero de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen de SV40 es entonces utilizado solamente debido a que contiene al promotor anterior). Los vectores de expresión y reproducción de la presente invención contendrán normalmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y operablemente ligado al ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional de los mismos. Los promotores son secuencias sin transcribir localizadas corriente arriba (es decir, 5') al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 bp) que controla la transcripción del gen estructural. Los promotores son convencionalmente agrupados en una de las dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los niveles crecientes iniciados de promotores inducibles de la transcripción de ADN bajo su control en respuesta a un cierto cambio en condiciones de cultivo, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en temperatura. Los promotores constitutivos, que por otra parte, inician la producción del producto de gen continua; es decir, existe poco o ningún control experimental sobre la expresión del gen. Una gran cantidad de promotores, reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales, es bien conocida. Un promotor adecuado está operablemente enlazado al ADN que codifica el anticuerpo anti-Dkk-1 eliminando el promotor de la fuente de ADN mediante la digestión con enzimas de restricción o amplificando el promotor mediante la reacción de la cadena de polimerasa e insertando la secuencia del promotor deseada en el vector.

Los promotores adecuados para uso con hospedadores de levadura son también bien conocidos en la técnica. Los mejoradores de levadura se utilizan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para uso con células hospedadoras mamíferas son bien conocido e incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos de genomas de virus tales como virus del polioma, virus fowlpox, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de hepatitis-B y más preferiblemente Simian Virus 40 (SV40). Otros promotores mamíferos adecuados incluyen promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, promotores de choque por calor y el promotor de actinia. Los promotores particulares útiles en la práctica de los vectores de expresión recombinante de la invención incluyen, pero no se limitan a: la región del promotor anterior de SV40 (Bernoist and Chambón, 1981, Nature 290: 304-10); promotor CMV; promotor contenido en la repetición terminal larga de 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, y colaboradores, 1980, Cell 22: 787-97); promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner y colaboradores, 1981, Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-45); secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster y colaboradores, 1982, Nature 296: 39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor beta-lactamasa (Villa-Kamaroff y colaboradores, 1978, Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A., 75: 3727-31); o el promotor tac (DeBoer y colaboradores, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25). También disponibles para uso están las siguientes regiones control transcripcionales de animales, que exhiben especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift y colaboradores, 1984, Cell 38: 639-46; Ornitz y colaboradores, 1986, Cold Spring Harbor Symp.

Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); la región control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22); región control del virus tumoral de mama de ratón que es activa en células testiculares, pecho, linfoides y mastocitos (Leder y colaboradores, 1986, Cell 45: 485-95); la región control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinkert y colaboradores, 1987, Genes and Devel V. 268-76); región control del gen de alfa-feto-proteína que es activa en el hígado (Krumlauf y colaboradores, 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer y colaboradores, 1987, Science 235: 53-58); región control del gen 1 -antitripsina alfa que es activa en el hígado (Kelsey y colaboradores, 1987, Genes and Devel. 1: 161-71); región control del gen de beta-globina que es activa en células mieloide (Mogram y colaboradores, 1985, Nature 315: 338-40; Kollias y colaboradores, 1986, Cell 46: 89-94); región control del gen de proteína básica de mielina que es activa en células oligodendrocitas en el cerebro (Readhead y colaboradores, 1987, Cell 48: 703-12); región control del gen de la cadena-2 ligera de miosina que es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314: 283-86); región control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que es activa en el hipotálamo (Masón y colaboradores, 1986, Science 234: 1372-78); y más particularmente la región control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl y colaboradores, 1984, Cell 38: 647-58; Adames y colaboradores, 1985, Nature 318: 533-38; Alexander y colaboradores, 1987, Mol. Cell Biol.7: 1436-44). Una secuencia mejorada puede insertarse en el vector para incrementar la transcripción en eucariotas mayores de un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de la presente invención. Los mejoradores son elementos que activan cis de ADN, de manera general de aproximadamente 10-300 bp en longitud, que actúan en promotores para incrementar la transcripción. Los mejoradores son relativamente independientes en orientación y posición. Se han encontrado 5' y 3' en la unidad de transcripción. Varias secuencias mejoradas disponibles de genes mamíferos se conocen (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). También puede utilizarse una secuencia mejorada de un virus. El mejorador SV40, mejorador del promotor anterior de citomegalovirus, mejorador de polioma, y mejoradores de adenovirus son ejemplarmente elementos mejoradores para la activación de promotores eucarióticos. Mientras que un mejorador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' en una molécula de ácido nucleico, estando normalmente colocado en un sitio 5' al promotor. En vectores de expresión, una secuencia de terminación de transcripción se localiza normalmente 3' del extremo de una región que codifica el polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Una secuencia de terminación de transcripción usada para la expresión en células procariótica es normalmente un fragmento rico en G-C seguida por una secuencia poly-T. Mientras que la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o aún se adquiere comercialmente como parte de un vector, puede también sintetizarse fácilmente usando métodos para la síntesis del ácido nucleico tal como los descritos en la presente. Un elemento del gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedadora desarrollada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos usados en vectores de expresión, codifican las proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o canamicina para las células hospedadoras procarióticas; (b) deficiencias auxotróficas de complemento de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen el gen de resistencia a la canamicina, gen de resistencia a la ampicilina y gen de resistencia a la tetraciclina. Un gen de resistencia a la neomicina bacterial puede también utilizarse para la protección de células hospedadoras procarióticas y eucarióticas. Otros genes de selección pueden utilizarse para amplificar el gen que será expresado. La amplificación es un proceso mediante el cual los genes que no pueden en una sola copia expresarse en niveles bastante altos para permitir la supervivencia y crecimiento de células bajo ciertas condiciones de protección, se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables de manera ampliada adecuados para células mam íferas incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y sin promotores de timidina cinasa. En el uso de estos marcadores, los transformantes de célula mamífera se ponen bajo presión de selección en donde solamente los transformantes se adaptan únicamente para sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. La presión de selección es impuesta cultivando las células transformadas bajo condiciones de las cuales la concentración del agente de protección en el medio sucesivamente se aumenta, de este modo permitiendo la supervivencia de solamente las células en las cuales se ha amplificado el gen de selección. Bajo estas circunstancias, el ADN adyacente al gen de selección, tal como el ADN que codifica un anticuerpo de la invención, se co-amplifica con el gen de selección. Como un resultado, las cantidades incrementadas del polipéptido anti-Dkk-1 se sintetizan a partir del ADN amplificado. Un sitio de u nión de ribosoma es generalmente necesario para la iniciación de traducción del mARN y es caracterizado por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento normalmente se localiza en 3' al promotor y 5' a la secuencia de codificación del polipéptido a expresarse. En algunos casos, por ejemplo donde la glicosilación se desea en un sistema de expresión de célula hospedadora eucariótica, varias presecuencias se pueden manipular para mejorar la glicosilación o rendimiento. Por ejemplo, puede alterarse el sitio de división de la peptidasa de un péptido de señal particular, o pro-secuencias agregadas, que también pueden afectar la glicosilación. El producto de proteína final puede tener, en la posición -1 (con relación al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales incidentes a la expresión, que no pudieron haber sido eliminados totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos residuos de aminoácidos encontrados en el sito de división de peptidasa, unidos al amino-terminal. Alternativamente, el uso de algunos sitios de división de la enzima puede dar lugar a una forma activa aún ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima corta en tal área dentro del polipéptido maduro. Donde un vector de expresión disponible comercialmente carece de algunas de las secuencias flanqueantes deseadas como se describe anteriormente, el vector puede modificarse individualmente ligando estas secuencias en el vector. Después de que el vector se haya elegido y modificado como se desee, una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional del mismo se inserta en el sitio apropiado del vector. El vector terminado que contiene las secuencias que codifican El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional inventivo del mismo se inserta en una célula hospedadora adecuada para la amplificación y/o expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión para un fragmento inmunológicamente funcional del anticuerpo anti-Dkk-1 del mismo en una célula hospedadora seleccionada puede lograrse por métodos i bien conocidos incluyendo métodos tales como transfección, infección, cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, método de DEAE-dextrano, u otras técnicas conocidas.

El método seleccionado en parte será una función del tipo de célula hospedadora a utilizarse. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el experto. La célula hospedadora transformada, cuando es cultivada bajo condiciones apropiadas, sintetiza un anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento funcional de la misma que puede recolectarse posteriormente del medio de cultivo (si la célula hospedadora lo secreta en el medio) o directamente desde la célula hospedadora que lo produce (si no se secreta). La protección de una célula hospedadora apropiada dependerá de varios factores, tales como niveles de expresión deseados, modificaciones del polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tal como glicosilación o fosforilación) y la facilidad de doblado en una molécula biológicamente activa. Las líneas celulares mamíferas disponibles como hospedadores para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), tal como células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células del riñon de hámster bebé (BHK), células del riñon de mono (COS), células hepatocelulares humanas del carcinoma (por ejemplo, Hep G2), y un número de otras líneas celulares. En ciertas modalidades, la mejor línea celular para expresar un constructo de ADN particular puede seleccionarse probando varias líneas celulares para determinar cuales tienen los mayores niveles de niveles de expresión y produzcan anticuerpos con propiedades de unión de Pkk-1 constitutivas. VI. Composiciones Farmacéuticas A. Formulaciones Ejemplares En ciertas modalidades, la invención también proporciona composiciones que comprenden anticuerpos anti-Dkk-1 objetivo o fragmentos inmunológicamente funcionales de las mismas junto con uno o más de los siguientes: un diluyente farmacéuticamente aceptable; portador; solubilizador; emulsionante; conservador; y/o adyuvante. Tales composiciones pueden contener una cantidad efectiva del anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional de las mismas. Así, también se incluye el uso de anticuerpos y fragmentos inmunológicamente activos que se proporcionan en la presente en la preparación de una composición o medicamento farmacéutico. Tales composiciones pueden utilizarse en el tratamiento de una variedad de enfermedades tales como las listadas más adelante en la sección de utilidades ejemplares.

Los componentes de formulación aceptables para preparaciones farmacéuticas son no tóxicos a recipientes en las dosificaciones y concentraciones utilizadas. Además de los anticuerpos e fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan, las composiciones de acuerdo a la invención pueden contener componentes para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales adecuados para formular composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio); amortiguadores (tales como acetato, borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de abultamiento (tales como manitol o glicina); agentes de quelación (tales como ácido tetraacético etilendiamina (EDTA)); agentes de complexión (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); rellenos; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina, gelatina o inmunoglobulinas de suero); colorante, saborizantes y agentes de dilución; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tales como sodio); conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, fenetilalcohol, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); solventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; agentes tensioactivos o humectantes (tales como plurónicos, PEG, esteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes que mejoran la estabilidad (tales como sucrosa o sorbitol); agentes que mejoran la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, sorbitol y manitol); vehículos de liberación; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos, (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company), incorporados por este medio por referencia. El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser acuoso o no acuoso en naturaleza. Los vehículos o portadores adecuados para tales composiciones incluyen agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La salina amortiguada natural o salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. Las composiciones que comprenden anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de las mismas pueden prepararse para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, los anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos pueden formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sucrosa. Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables al sitio de administración. Los amortiguadores se utilizan ventajosamente o para mantener la composición en pH fisiológico o en un pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 8.5, o alternativamente, entre aproximadamente 5.0 a 8.0. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender el amortiguador de TRIS de aproximadamente pH 6.5-8.5, o el amortiguador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, que pueden incluir adicionalmente sorbitol o un sustituyente adecuado por consiguiente. Una composición farmacéutica puede involucrar una cantidad efectiva de anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de la misma en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuadas para la fabricación de tabletas. Disolviendo las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones pueden prepararse en forma de dosis única. Los excipientes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, materiales inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes de unión, tales como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales están en la forma de formulaciones de liberación sostenida o controlada. Pueden utilizarse técnicas para formular una variedad de otro medio de liberación sostenida o controlada, tal como portadores de liposoma, micropartículas bioerodibles o granulos porosos e inyecciones de depósito (ver, para por ejemplo, documento PCT/US93/00829, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la liberación de composiciones farmacéuticas). Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo películas, o microcápsulas, poliésteres, hidrogeles, polilactidas (U.S. 3,773,919 y EP 058,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y colaboradores, 1983, Biopolymers 22: 547-556), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer y colaboradores, 1981, J Biomed Mater Res 15: 167-277) y Langer, 1982, Chem Tech 12: 98-105), etilenvinilacetato (Langer y colaboradores, ibid.) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Eppstein y colaboradores, 1985, Proc. Nati. Acad. Sd. USA 82: 3688-3692; EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949. La composición farmacéutica a utilizarse para la administración in vivo normalmente es estéril. La esterilización puede lograrse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Si se liofiliza la composición, la esterilización puede conducirse antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una solución. En ciertas modalidades, las composiciones parenterales se coloca en un envase que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica, o una jeringa pre-llenada estéril lista par utilizarse para inyección. Una vez formulada la composición farmacéutica de la invención, puede almacenarse en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para utilizarse o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituya antes de la administración. Los componentes usados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de alta pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente dañinos (por ejemplo, por lo menos grado National Food (NF), generalmente por lo menos grado analítico, y más normalmente por lo menos grado farmacéutico). Por otra parte, las composiciones previstas para uso in vivo son generalmente estériles. Al punto que un compuesto dado deba sintetizarse antes del uso, el producto resultante está de manera normal sustancialmente libre de cualquier agente potencialmente tóxico, particularmente cualquier endotoxina, que puedan estar presentes durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para administración parental son también estériles, sustancialmente isotónicas y hechas bajo las condiciones de GMP. La presente invención proporciona kits para producir unidades de administración multidosis o una sola dosis. Por ejemplo, los kits de acuerdo a la invención pueden cada uno contener un primer envase que tiene una proteína seca y un segundo envase que tiene un diluyente acuoso, incluyendo por ejemplo jeringas pre-llenadas de una sola y múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquidos, liojeringas o jeringas libres de aguja). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser de liberación parenteral, normalmente para inyección. Las inyecciones pueden ser intraocular, intraperitoneal, intraportal, intramusculares, intravenosas, intratecal, intracerebral (intra-parencimal), intracerebroventricular, intraarterial, intralesional, perilesional o subcutánea. Las gotas para ojos pueden utilizarse para administración intraocular. En algunos casos, las inyecciones pueden localizarse en la vecindad de un hueso o huesos particulares a los cuales el tratamiento es designado. Para administración parenteral, los anticuerpos pueden administrarse en una solución acuosa libre de pirógeno, parenteralmente aceptable que comprende los anticuerpos anti-Dkk-1 deseados o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual los anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos se formulan como una solución estéril, isotónica, preservada correctamente. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-Dkk-1 objetivo y fragmentos funcionales de los mismos pueden administrarse mediante inyección de bolo o continuamente por infusión, mediante el dispositivo de implantación, sistemas de liberación sostenida u otro medio para lograr la liberación prolongada. La composición farmacéutica también puede administrarse localmente vía la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Donde se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la liberación de la molécula deseada puede ser vía difusión, bolo de liberación medida, o liberación continua. La preparación puede formularse con el agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico; ácido po I ig I ico lico; o ácido copoli(láctico/glicólico) (PLGA), granulos o liposomas, que pueden proporcionar la liberación controlada o sostenida del producto el cual puede entonces liberarse vía una inyección de depósito. La formulación con ácido hialurónico tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Las composiciones objetivo que comprenden un anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento funcional de las mismas pueden formularse para la inhalación. En estas modalidades, un anticuerpo anti-Dkk-1 es formulado como un polvo seco para inhalación, o soluciones de inhalación de anticuerpo anti-Dkk-1 también pueden formularse con un propulsor para la liberación en aerosol, tal como por nebulización. La administración pulmonar se describe adicionalmente en el documento PCT/US94/001875, que describe la liberación pulmonar de proteínas químicamente modificadas, y que se incorpora por este medio por referencia. Ciertas composiciones farmacéuticas de la invención pueden liberarse a través del tracto digestivo, tal como oralmente. Los anticuerpos anti-Dkk-1 objetivo o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que se administran de esta manera pueden formularse con o sin estos portadores habitualmente usados en la composición de formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas. Una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación pre-sistémica. Los agentes adicionales pueden incluirse para facilitar la absorción del anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento funcional de los mismos. Para la administración oral, los aminoácidos modificados pueden utilizarse para conferir resistencia a las enzimas digestivas. También pueden utilizarse diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de desintegrantes de tableta y aglutinantes. Las composiciones objetivo que comprenden los anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de las mismas también pueden utilizarse ex vivo. En tales casos, las células, tejidos u órganos que se han eliminado del paciente se exponen a o cultivan con el anticuerpo anti-Dkk-1. Las células cultivadas pueden entonces implantarse nuevamente en el paciente o un paciente diferente o utilizarse para otros propósitos. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de las mismas pueden liberarse implantando ciertas células que se han diseñado genéticamente, usando métodos tales como los descritos en la presente, para expresar y secretar el polipéptido. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas, o pueden ser inmortalizadas. Para disminuir la oportunidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son normalmente biocompatible, protecciones (barreras) o membranas semipermeables poliméricas que permiten la liberación del producto(s) de proteína pero previenen la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes. B. Dosificación Las composiciones farmacéuticas que se proporcionan pueden ad ministrarse por tratamientos profilácticos y/o terapéuticos . U na "cantidad efectiva" se refiere generalmente a una cantidad que sea una cantidad suficiente, pero no-tóxica , del ingrediente activo (es decir, un anticuerpo anti-Dkk- 1 o frag mento inmunológicamente funcional del mismo) para alcanzarme el efecto deseado, que es una reducción o eliminación en la severidad y/o frecuencia de síntomas y/o mejora o remediación del daño. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a u na cantidad q ue sea suficiente para remediar un estado o síntomas de la enfermedad , o de otra manera prevenir, obstaculizar, retardar o invertir la progresión de una enfermedad o cualq uier otro síntoma indeseable. U na "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva para preveni r, obstaculizar o retardar el inicio de un estado o síntoma de la enfermedad. En general, la toxicidad y eficacia terapéutica del anticuerpo o fragmento pueden determinarse de acuerdo a procedi mientos farmacéuticos estándares en cultivos cel ulares y/o ani males experimentales , incluyendo , por ejemplo , determ inación de LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . El relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/E D50. Se prefieren composiciones que exhiben mayores índices terapéuticos. Los datos obtenidos de cultivos celulares y/o estudios animales pueden utilizarse en formular un intervalo de dosificaciones para humanos. La dosificación del ingrediente activo normalmente alineada dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen el' ED50 con poco o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación utilizada y la ruta de administración utilizada. La cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos a utilizarse terapéutica o profilácticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. El experto en la técnica apreciará que las dosis de dosificación apropiadas para el tratamiento, de acuerdo a ciertas modalidades, así variará dependiendo, en parte, de la molécula liberada, la indicación para la cual el anticuerpo anti-Dkk-1 es utilizado, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órgano) y/o condición (edad y salud general) del paciente. Un médico interno puede valorar la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Las dosificaciones normales van de aproximadamente 0.1 µg/kg hasta a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En ciertas modalidades, la dosificación puede ir desde 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 150 mg/kg; o 1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 µg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional del mismo en la formulación. Por ejemplo, un médico interno administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que alcanza el efecto deseado. La composición por lo tanto puede administrarse como una sola dosis, o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) por cierto tiempo, o como infusión continua vía un dispositivo o catéter de implantación. El tratamiento puede ser continuo por cierto tiempo o intermitente. El refinamiento adicional de la dosificación apropiada es hecho rutinariamente por el experto en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por ellos. Las dosificaciones apropiadas pueden comprobarse con el uso de datos dosis-respuesta apropiados. Para tratar un trastorno médico caracterizado por la expresión anormal o exceso de Dkk-1, una composición que comprende los anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales objetivos de los mismos puede administrarse al paciente en una cantidad y por un tiempo suficiente para inducir una mejora sostenida en por lo menos un indicador que refleje la severidad del trastorno. Una mejora se considera "sostenida" si el paciente exhibe la mejora en por lo menos dos ocasiones separadas por lo menos uno a siete días, o en algunos casos una a seis semanas. El intervalo apropiado dependerá de algún grado en el cual la condición de la enfermedad será tratada; está dentro del alcance del médico experto para determinar el intervalo apropiado para determinar si la mejora es sostenida. El grado de mejora se determina basado en signos o síntomas, y también puede utilizar cuestionarios que se administran al paciente, tal como cuestionarios de calidad-de-vida. Varios indicadores que reflejan el grado de la enfermedad del paciente pueden determinarse para determinar si la cantidad y tiempo del tratamiento son suficientes. El valor de la línea base para el indicador o indicadores elegidos es establecido mediante el examen del paciente antes de la administración de la primera dosis del anticuerpo. Preferiblemente, el examen de la línea base se hace dentro de aproximadamente 60 días de administración de la primera dosis. Si el anticuerpo se está administrando para tratar síntomas agudos, tal como por ejemplo para tratar un hueso fracturado, la primera dosis se administra tan pronto como prácticamente sea posible después de que la lesión ha ocurrido. La mejora es inducida administrando los anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales objetivo de los mismos hasta que el paciente manifieste una mejora en la línea base por el indicador o indicadores elegidos. En condiciones crónicas de tratamiento, este grado de mejora es obtenido repetidamente administrando este medicamento durante un período de por lo menos un mes o más, por ejemplo, por uno, dos o tres meses o más, o indefinidamente. Un período de uno a seis semanas, o aún una sola dosis, es a menudo suficiente para tratar condiciones agudas. Para lesiones o condiciones agudas, una sola dosis puede ser suficiente.

Aunque el grado de la enfermedad del paciente después del tratamiento puede parecer mejorado de acuerdo a uno o más indicadores, el tratamiento puede continuarse indefinidamente en el mismo nivel o a una dosis o frecuencia reducida. Una vez que el tratamiento se haya reducido o continuado, más adelante puede reasumirse en el nivel original si reaparecen los síntomas. Vil. Utilidades Ejemplares para Anticuerpos Anti-Dkk-1 A. Detección y Protección Los anticuerpos anti-Dkk-1 y fragmentos inmunológicamente funcionales objetivo de los mismos pueden utilizarse para detectar Dkk-1 en muestras biológicas. Tales usos permiten la identificación de célula o tejido que produce la proteína o servir como un diagnóstico para detectar las condiciones patológicas en las cuales Dkk-1 es sobreproducido o infraproducido. Los anticuerpos y fragmentos que se proporcionan también se pueden utilizar en métodos de protección para una molécula que se enlaza a Dkk-1. Una variedad de métodos de protección competitivos, por ejemplo, puede utilizarse. En algunos métodos, una molécula Dkk-1 o fragmento del mismo al cual un anticuerpo anti- Dkk-1 se une, se pone en contacto con un anticuerpo o fragmento descrito en la presente junto con otra molécula (es decir, una molécula candidato). Una reducción en unión entre el anticuerpo o fragmento y Dkk-1 es una indicación que las moléculas se unen a Dkk-1. La unión del anticuerpo o fragmento puede detectarse usando una variedad de métodos, por ejemplo, ELISA. La detección de unión entre el anticuerpo anti-Dkk-l o fragmento a Dkk-1 puede simplificarse detectablemente marcando el anticuerpo. En algunos métodos, una molécula que exhibe la unión en la pantalla inicial se analiza adicionalmente para determinarse si inhibe una actividad Dkk-1 (por ejemplo, si la molécula activa la señalización de Wnt). B. Tratamiento de Trastornos Relacionados al Hueso En otros aspectos, ciertos anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan pueden utilizarse para tratar pacientes con una variedad de diferentes enfermedades incluyendo, por ejemplo, enfermedades que son sensibles a la inhibición de la actividad de Dkk-1. Estos anticuerpos y fragmentos también pueden utilizarse para tratar enfermedades que son sensibles a la inducción de señalización de Wnt. El término "paciente" como se utiliza en la presente incluye sujetos humanos y animales a menos que se indique lo contrario. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, una variedad de enfermedades que involucran un trastorno del hueso incluyendo condiciones de baja masa ósea, pérdida del hueso sistémica, formación suprimida del hueso y erosiones del hueso. Algunos de los anticuerpos y fragmentos también pueden utilizarse en la reparación del hueso. Ciertos anticuerpos o fragmentos tienen uso terapéutico en actividad del osteoblasto estimulante y incremento de la densidad mineral del hueso o masa ósea. Estos anticuerpos y fragmentos así son útiles para tratar pacientes que sufren de los varios trastornos médicos que involucran pérdida de hueso excesiva o pacientes que requieran la formación de nuevo hueso incluso donde puede necesariamente no existir actividad del osteoblasto excesiva. El bloqueo de la actividad de Dkk-1 da lugar a la actividad del osteoblasto vía la señalización transmitida por las proteínas de Wnt. La actividad del osteoblasto excesiva es asociada con numerosos trastornos osteopénicos que pueden tratarse con los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan, incluyendo osteopenia, osteoporosis, períodontitis, enfermedad de Paget, pérdida ósea debido a la inmovilización, metástasis ósea lítica y artritis, incluyendo artritis reumatoide, artritis psoriática, espondilitis anquilosante y otras condiciones que involucran la erosión del hueso. Otras condiciones de masa ósea baja también pueden tratarse incluyendo una variedad de formas de osteoporosis, incluyendo pero sin limitarse a, osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida después del trasplante, osteoporosis asociado con quimioterapia (es decir, osteoporosis inducida por quimioterapia), osteoporosis inducida por inmovilización, osteoporosis debido a descargar mecánica, y osteoporosis asociada con uso anticonvulsivo. Enfermedades del hueso adicionales que pueden tratarse con algunos de los anticuerpos o fragmentos incluyen una enfermedad del hueso asociada con la falla renal y nutricional, gastrointestinales y/o hepáticas asociadas a enfermedades del hueso. Tam bién pueden tratarse diferentes formas de artritis , los ejemplos incl uyen osteoartritis y artritis reumatoide. Los anticuerpos y fragmentos tam bién pueden utilizarse para tratar la pérdida del hueso sistémica asociada con artritis (por ejem plo, artritis reumatoide) . En el tratam iento de la artritis, los pacientes pueden beneficiarse por inyecciones perilesionales o i ntralesionales de anticuerpos o frag mentos objetivo de los m ismos. Por ejem plo, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inyectarse adyacente a o directamente en una articulación inflamada, así estimulando la reparación del hueso dañado en el sitio . Alg unos cánceres se conocen para incrementar la actividad del osteoclasto e i nducir la resorción del hueso, tal como seno y cáncer de próstata. El m ieloma m últiple , que está presente en la méd ula ósea , también se asocia con la pérdida del hueso , en la parte probablemente debido a la expresión incrementada de Dkk- 1 por células plasmáticas, que entonces suprimen la actividad de creación del hueso de osteoblastos en la vecindad. Reduciendo la actividad de Dkk-1 administrando anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales objetivo de los m ismos pueden dar l ugar a un i ncremento en la actividad del osteoblasto que si rve para contrarrestar la actividad del osteoblasto excesiva , de este modo reduciendo la severidad de los trastornos mencionados anteriormente, reduciendo la erosión del hueso e induciendo la nueva formación del hueso en el paciente. El tratamiento con ciertos de los anticuerpos anti-Dkk-1 - específicos o fragmentos inmunológicamente funcionales pueden inducir a un incremento significativo en densidad m ineral del hueso en u n paciente q ue sufre de u n trastorno osteopénico. La inhibición de Dkk- 1 con los anticuerpos o fragmentos in munológ icamente funcionales descritos en la presente tam bién puede utilizarse en varias aplicaciones de reparación del hueso . Por ejem plo, ciertos anticuerpos y fragmentos pueden ser útiles en retardar la osteólisis de residuos desgastados asociada con articulaciones artificiales, acelerando la reparación de las fracturas del hueso, y mejorando la incorporación de los i njertos de h ueso en el hueso vivo circu ndantemente en el cual se han i njertado. Los anticuerpos Anti-Dkk-1 o fragmentos inm unológicamente funcionales de los mismos pueden ad m inistrarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, en com binación con agentes para terapia del cáncer, con agentes que inhiben la actividad del osteoclasto o con otros agentes que mejoran la actividad del osteoblasto. Por ejemplo, los anticuerpos inventivos pueden adm inistrarse a pacientes con cáncer que experimentan radioterapia o quimioterapia . Las q uim ioterapias utilizadas en combinación con los anticuerpos inventivos pueden incluir antracicl inas, taxol , tam oxifeno, doxoru bici na , 5-fluorouracilo , oxaloplatina, Velcade® (ácido [(1 R)-3-metil-1 -[[(2S)-1 -oxo-3-fenil-2-[(piracinilcarbonil)amino]propil]amino]butil]borónico) y/o otros fármacos de moléculas peq ueñas que se utilizan en el tratamiento del cáncer. Los pacientes con cáncer mama se beneficiarán de la ad m inistración de un inhibidor de aromatasa concurrentemente con tratamientos de combinación que comprenden un agente quimioterapéutico y un anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional de mismo. Los anticuerpos anti-Dkk-1 y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos pueden utilizarse solamente para el tratamiento de las condiciones anteriormente referidas dando por resultado la pérdida de masa ósea o en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que promueve (anabólico) el crecimiento del hueso o un agente anti-resorcivo del hueso que incluye pero no se limita a: factores morfogénicos del hueso designados BMP-1 a BMP-12; miembros de la familia factor-ß TGF-ß del crecimiento transformado; factores de crecimiento del fibroblasto FGF-1 a FGF-10; inhibidores de interleuquina-1 (incluyendo IL-1 ra, anticuerpos a IL-1 y anticuerpos a receptores IL- 1); Inhibidores de TNFa (incluyendo etanercept, adalibumab e infliximab); Inhibidores del ligando RANK (incluyendo RANK soluble, anticuerpos de osteoprotegerina y antagónico que específicamente unen RANK o ligando RANK), hormona paratiroides, prostaglandinas de serie E, bisfosfonatos y minerales que mejoran el hueso tal como fluoruro y calcio. Agentes anabólicos que pueden utilizarse en combinación con anticuerpos y fragmentos inventivos de los mismos incluyen la hormona paratiroides y factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), en donde el último agente es preferiblemente complejado con una proteína de unión de IGF. Un antagonista receptor de IL-1 adecuado para tal tratamiento de combinación se describen en el documento WO89/11540 y un receptor-1 de TNF soluble adecuado se describe en el documento WO98/01555. Los antagonistas del ligando de RANK ejemplares se describen, por ejemplo, en los documentos WO 03/086289, WO 03/002713, Patentes Norteamericanas Nos. 6,740,511 y 6,479,635. Todas las patentes anteriormente mencionadas y solicitudes de patente se incorporan por este medio por referencia). Además, los anticuerpos anti-Dkk-1 pueden administrarse a pacientes en combinación con anticuerpos que se unen a células tumorales e inducen un efecto citotóxico y/o citostático en el crecimiento del tumor. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen los que se enlazan a proteínas de superficie celular Her2, CDC20, CDC33, glicoproteína similares a mucina y receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR) presente en células tumorales e induzcan un efecto citostático y/o citotóxico en células tumorales que exhiben estas proteínas. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen HERCEPTIN® para el tratamiento del cáncer de mama y RITUXAN® para el tratamiento del linfoma de non-Hodgkin, e incluyen también fármacos basados en anticuerpos tales como ERBITUX® y AVASTIN®. También, la terapia de combinación puede incluir como agentes de la terapia del cáncer polipéptidos que selectivamente induzcan la apoptosis en células tumorales, tales como el polipéptido TRAIL relacionado a TNF. Los anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales objetivo de los mismos pueden administrarse concurrentemente con otros tratamientos y agentes terapéuticos que se administran para la misma condición. "Administración concurrente", como se utiliza en la presente, comprende tratamientos que se administran simultánea o secuencialmente. Los anticuerpos Anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos pueden administrarse profilácticamente para prevenir o mitigar el inicio de pérdida de masa ósea por cáncer en estadios iniciales (etapas I ó II), o pueden darse para mejorar una condición existente de la pérdida de masa ósea debido a la metástasis en un hueso. Los anticuerpos anti-Dkk-1 de la invención pueden utilizarse para prevenir y/o tratar el crecimiento de células tumorales en el hueso. El cáncer que provoca metástasis al hueso puede separarse fácilmente mientras las células tumorales estimulan los osteoclastos para reabsorber la matriz del hueso interna. El tratamiento con un anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional del mismo ayudará a mantener la densidad mineral del hueso en el sitio de tales metástasis estimulando la actividad del osteoblasto incrementada. Cualquier cáncer que tenga potencial para provoca metástasis al hueso puede prevenirse o tratarse con un anticuerpo anti-Dkk-l administrado antes o después de que haya ocurrido la metástasis. El mieloma múltiple es un ejemplo de un tipo de cáncer que puede prevenirse y/o tratarse con un anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo. Los pacientes afectados normalmente exhiben una pérdida de masa ósea debido a la activación del osteoclasto incrementada en regiones localizadas del hueso. Las células de mieloma producen directamente o indirectamente cualquier ligando RANK, una proteína que active los osteoclastos resultantes en la lisis del hueso que rodea las células de mieloma integradas en espacios de la médula ósea. Los osteoclastos normales adyacentes a la célula de mieloma alternadamente producen I L-6, conduciendo al crecimiento y proliferación de células de mieloma. Además las células múltiples de mieloma producen Dkk-1 de este modo inhibiendo la actividad del osteoblasto y además promoviendo la actividad resorciva del hueso en esta enfermedad. El tratamiento de un animal con un anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional del mismo instigará la actividad del osteoblasto, de este modo dando por resultado una masa ósea incrementada en el sitio de los tumores.

Tal tratamiento puede resultar en la reducción de dolor en el hueso, y puede además bloquear la metástasis al hueso previniendo la actividad resorciva que libera los nutrientes del hueso utilizados por las células tumorales. En el tratamiento de esta enfermedad, el anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento inmunológicamente funcional del mismo puede administrarse concurrentemente con anticuerpos antagónicos dirigidos contra el ligando RANK o los anticuerpos contra I L-6. C. Tratamiento de Otros Trastornos Además de los usos anteriores relacionados con trastornos del hueso, ciertos anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan pueden utilizarse para tratar otras enfermedades. El papel de Dkk-1 en estas varias enfermedades es soportado en parte por su expresión en varios diferentes tejidos. Los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales, por ejemplo, pueden utilizarse para tratar las enfermedades en las cuales es deseable promover la renovación de células madre. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, diabetes, infarto cardíaco crónico y varias enfermedades del músculo [por ejemplo, atrofia por inactividad que resulta, por ejemplo, de la inmovilización o reposo en la cama); debilidad por envejecimiento (sarcopenia de los ancianos); distrofias musculares; caquexia asociada al cáncer, SIDA o inflamación; desnutrición de proteína-energía en falla renal/uremia renal, y músculo que se pierde en la obesidad]. Varias enfermedades inflamatorias también pueden tratarse, incluyendo, por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis y enfermedad inflamatoria intestinal. Los anticuerpos y fragmentos pueden también utilizarse en el tratamiento de varias enfermedades neurológicas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington). Las enfermedades oculares (por ejemplo, degeneración macular y varias retinopatías) pueden también tratarse con ciertos de los anticuerpos y fragmentos. Las diferentes enfermedades renales (por ejemplo, enfermedad renal de etapa terminal, enfermedad renal crónica, glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial y nefropatía de IgA) también pueden tratarse con algunos anticuerpos. Adicionalmente, varias enfermedades pulmonares (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis cística) y varios trastornos de la piel, incluyendo enfermedades cutáneas y epidérmicas, también pueden tratarse. Los ejemplos de trastornos de la piel que pueden tratarse incluyen epitelio intestinal dañado (por ejemplo, daño inducido por quimioterapia), y otras enfermedades en las cuales es deseable estimular el crecimiento y supervivencia del epitelio intestinal. VIII. Kits También se proporcionan kits que incluyen un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional o una composición farmacéutica como se describe en la presente. Algunos kits incluyen un anticuerpo, fragmento o composición en un envase (por ejemplo, frasco o ampolla), y también pueden incluir instrucciones para el uso del anticuerpo o fragmento en varias aplicaciones de detección, protección y terapéuticas descritas anteriormente. El anticuerpo, fragmento o composición pueden estar en varias formas, incluyendo, por ejemplo, como parte de una solución o como un sólido (por ejemplo, polvo liofilizado). Las instrucciones pueden incluir una descripción de cómo prepararse, (por ejemplo, disolver o resuspender) el anticuerpo o fragmento en un fluido apropiado y/o cómo administrar el anticuerpo o fragmento para el tratamiento de las enfermedades descritas anteriormente (por ejemplo, trastornos del hueso tales como masa ósea baja, pérdida del hueso sistémica, formación del hueso suprimida y erosiones del hueso; renovación de cél ulas madre; enfermedades inflamatorias; enfermedades neurológicas; enfermedades oculares; enfermedades renales y trastornos de la piel) . Los kits también pueden incluir otros com ponentes, tales como amortiguadores, sales, iones de metales com plejos y otros agentes descritos anteriormente en la sección en composiciones farmacéuticas . Estos com ponentes pueden i ncluirse con el anticuerpo o fragmento o pueden estar en envases separados. Los kits también pueden incluir otros agentes terapéuticos para la administración con el anticuerpo o fragmento. Los ejem plos de tales agentes incluyen , pero no se limitan a, agentes para tratar cánceres , agentes promotores del hueso y anticuerpos que unen las células tumorales, y otros agentes listados anteriormente. Se proporcionan los siguientes ejem plos solamente para ilustrar ciertos aspectos de los anticuerpos , fragmentos y com posiciones que se proporcionan en la presente y así no debe interpretarse para limitar el alcance de la invención reivi ndicada . Eiemplo 1 Generación de anticuerpos monoclonales para Dkk-1 murino en ratones y ratas A. I nm unización La Dkk- 1 murino recombinante que se utilizó como antígeno se clonó a partir una biblioteca de ADNc de placenta de ratón usando secuencias públicas disponibles (GenBank Acceso # AF030433. 1 ) . La clonación de la Dkk-1 humana, que fue utilizado para probar la reactividad cruzada de anticuerpos Dkk-1 anti-ratón, como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,344,541. Para preparar la Dkk-1 de ratón para el uso como un antígeno, las botellas giratorias de 850 cm2 se sembraron con 4-5 x 107 de células adherentes 293T (células de riñon embriónicas humanas, obtenidas de Cellular and Molecular Technologies) durante la noche en DMEM con 5% de FBS, 1x de aminoácidos no esenciales, 1x pen/strep/glut y 1x de piruvato sódico (DMEM completo, GIBCO, Grand Island NY). Las células se transfectaron el siguiente día. Se diluyeron 675 µl del reactivo de transfección FuGeneß en 6.75 ml de DMEM sin suero (Roche Diagnostics) y 112.5 µg de pADNc3.1 ADN (este plásmido expresa la Dkk-1 de ratón conjugado a FLAG). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla de ADN se agregó a cada botella giratoria (aproximadamente 30 botellas en todos) e incubada en la incubadora con 5% de CO2. Después de 24 horas, se agregaron 100 ml de DMEM sin suero que contiene 1x de aminoácidos no esenciales, 1x de pen/strep/glut, 1x de piruvato sódico, 1x de suplemento de insulina-transferrina-selenio (Invitrogen) y 0.5% de DMSO a cada botella. El medio se cosechó y sustituyó por medio fresco cada 48 horas durante 14 días. Se purificó la Dkk-1 de ratón a partir del medio de cultivo clarificado concentrado. Los ratones y ratas se inmunizaron como se describe más adelante mediante la inyección con Dkk-1 murino recombinante de longitud completa. En algunos experimentos, los ratones (pero no las ratas) se inyectaron con muDkk-1 recombinante que había sido conjugado antes de la inyección a un péptido PADRE (Epimmune). Se realizó la conjugación reaccionando Dkk-1 murino con 25 veces de exceso molar N-succinimidilo 6-maleimideocaproato (MICA) (Fluka # 63177) a temperatura ambiente durante 3 horas. La Dkk-1 murino activado por maleimida se separó del MICA no tratado por una columna de 8 mm x 125 mm llenada con Sefadex G-25. Se incubó un mg de la Dkk-1 murino activado por maleimida con 0.5 mg del péptido PADRE (AKFVAAWTLKAAAC; SEC ID NO: 13) y 0.5 mg de un segundo péptido PADRE (CAKXVAAWTLKAAA (X = ciclohexil-alanina); SEC ID NO:14) a temperatura ambiente durante 1 hora y después dializado contra PBS. Los ratones Balb/c y ratones C57BL/6 (Jackson Laboratories) así como ratones transgénicos AGP3 (Khare y colaboradores, PNAS 97: 3370-3375, 2000) se inmunizaron designando los ganglios linfáticos de drenado periféricos o el bazo como se describe más adelante. Las ratas de Lewis se inmunizaron solamente marcando el bazo. Para designar los ganglios linfáticos, las inyecciones se dan 5 veces en 12 puntos subcutáneos (6 dorsales, 6 ventrales) durante 10-13 días usando una relación de 1:1 de Dkk-1 :adyuvante. El adyuvante usado fue cualquier ayudante de Freund completo/incompleto mezclado (Pierce) o RIBI (Corixa). Una a tres días después de la última inyección, los ganglios linfáticos periféricos de cada ratón inyectado se cosecharon y fusionados a células de mieloma SP2/0.Agl4 murino (ATCC No. CRL 1581) utilizando la fusión de la célula dielectroforética, como se describe más adelante. Para ratas inyectadas, los ganglios linfático se eliminaron 13 días después de la última inyección de antígeno y los linfocitos se fusionaron a células asociadas de fusión Y3 Ag 1.2.3 (ATCC No. CRL 1631), que se derivan de la rata. Para designar el bazo, los ratones se inyectaron subcutáneamente en 2-4 sitios usando una relación 1:1 de cualquier adyuvante de Freund muDkk-1 :completo o adyuvante de Freud muDkk-1-PADRE:completo. Una segunda inmunización se dio las 2 últimas semanas utilizando una relación 1:1 del adyuvante muDkk:RIBI o adyuvante muDkk-PADRE:RIBI en 2 sitios subcutáneos y 1 sitio intraperitoneal. Se tomaron muestras sanguíneas 10 días después para analizarse para respuesta del anticuerpo anti-mDkk-1. Las mejores respuestas se aceleraron mediante inyección' intraperitoneal con mDkk-1 en PBS. Cinco días después, los bazos se eliminaron por la preparación de los linfocitos que se fusionaron a células de mieloma SP2/0.Agl4 murino. B. Protocolo de fusión del linfocito Los linfocitos aislados de los ganglios linfáticos o bazos de animales inmunizados se fusionaron con células de rata SP2/0.Agl4 o Y3 Ag 1.2.3 murino utilizando el siguiente protocolo optimizado. Se prepararon suspensiones unicelulares a partir de células del bazo o células del ganglio linfático periférico (PLN), y filtradas a través de un tamiz celular de 100 µm en un tubo de 50 ml, usando 30-40 ml del medio sin suero. Los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos para recolectar las células. Para Usar glóbulos rojos (cuando estén presentes), las células se resuspendieron en 10 ml de amortiguador de lisis RBC (8.3 g/l de cloruro de amonio en 0.01 M TRIS/HCI, pH 7.2), y se agregó amortiguador de lisis adicional a un total de 30 mis. Las células se permitieron detenerse durante 2-5 minutos, después se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos. El procedimiento de lisis se repitió si un color rojo persistente en la pelotilla. Después de la etapa de lisis, las células se resuspendieron en un medio de SF, una alícuota se eliminó para conteo, después las células se lavaron en un total 50 mo del medio de SF. Antes de utilizarse para fusión, estas células se sometieron a dos redondeos del siguiente procedimiento de "protección". Esta protección se realizó para el propósito de la protección celular que es resistente a estas manipulaciones y se repitió dos veces como sigue. La protección consistió de someter las células por varias etapas del protocolo de fusión, esto es, centrifugación, incubación en amortiguador de fusión de ECF (Cytopulse Sciences Cytofusion Médium C, catálogo no. CPS-LCM) y exposición de la fase de alineación actual del proceso de fusión. Las células de mieloma SP2/0.AG 14 que se habían sometido a esta protección se designaron células "SP2/0-ECF-F" y las células Y3.AG 1.2.3 que se sometieron a protección se designaron células "Y3-ECF-F". Una etapa de enriquecimiento de células B se realizó solamente para ratones, excepto que no se realizó usando ratones AGP3. En breve, esta etapa consistió de suspender 107 de células del bazo o ganglio linfático en SF, agregando 10 µl de granulos magnéticos CD 90+ (Miltenyi Biotec Cat# 130-049-101) que se habían prelavado con medio de SF, mezclándose suavemente e incubando de 4-12°C durante 15 minutos. Después, las células se diluyeron 1:3 con medio y se filtraron a través de un tamiz de 40 µm. Hasta 2 x 108 de células totales (108 células positivas) se cargaron en una Columna LS+ (Miltenyi Biotec Cat# 130-042-401) y el efluente se recolectó como la fracción CD 90'. Antes de realizar la fusión, las cámaras de fusión se esterilizaron con 70% de etanol, después se secaron al aire en una cubierta estéril. Si el enriquecimiento de células B se realizó, las células de mieloma y CD 90" se combinaron 1:1 y mezclaron bien en un tubo de 50 ml. Cuando no se realizó ningún enriquecimiento de células B, el mieloma y esplenocitos o PMNs se combinaron a una relación 1:2.5. El medio sin suero se agregó a 40 ml y las células centrifugadas a 2000 RPM durante 5 minutos. Las pelotillas celulares se lavaron dos veces en 25 ml de amortiguador de fusión isoosmolar (ECF). Las células se resuspendieron en un volumen de ECF para dar una concentración final de 2x106 a 1x107 por ml. Dos ml de células suspendidas se transfirieron en la cámara de fusión de 2 ml, y los cables se conectaron. Sesenta V de CA se aplicaron durante 30 segundos, seguido por 3 pulsos sucesivos 1 segundo aparte de 1500 V de DC durante 30 microsegundos, seguido por 60 V de CA durante 3 segundos. Durante este procedimiento la exposición de células al amortiguador de fusión isoosmolar; incluyendo lavados, se guardado bajo 3 horas o menos. Después de la fusión, las células siempre se dejaron asentar sin alteraciones en la cámara de fusión a temperatura ambiente durante 15-45 minutos antes de otro procedimiento. Las células fusionadas se eliminaron de la cámara de fusión y resuspendidas a 1-5x105 células/ml en un medio de BD Quantum Yield (Becton Dickinson) que contiene 15% de IgG FBS bajo (Gibco), 1x PSG (Gibco), 55 µm ß-mercaptoetanol (Gibco), 1x OPI (Sigma) y 5% de factor de clonación de Origen (Igen International). En experimentos que involucran la fusión Y3Ag1.2.3 asociada, 1 ng/ml de I L-6 se sustituyó por el factor de clonación de Origen. Los pozos individuales de placas de cultivo de 96-pozos (Falcon) se sembraron con 100 µl de las células e incubados a 37°C en 6.5% de CO2. El día siguiente, 100 µl del mismo medio que contiene 1x HAT (Sigma) se agregaron a cada uno pozo y las placas se incubaron por 7 días adicionales, después de lo cual el medio se eliminó y sustituyó por 200 µl del mismo medio. El examen de ELISA se realizó después de un total de 10-14 días de incubación. Todas las fusiones se realizaron en células C de Cytopulse Sciences Cytofusion Médium (Cat# CPS-LCM). La fusión celular a células de mieloma se llevó a cabo como sigue, usando el ECM 2001 y monitor de pulso Enhancer 400. Las condiciones usadas se muestran abajo en la Tabla 5.

Tabla 5 Generalmente, los linfocitos fusionados se congelaron directamente después de la fusión para el último análisis. Para congelamiento, los frascos t-150 se sembrados con híbridos recientemente fusionados en una densidad celular de mieloma de entre 1-3x105 / ml en un medio de fusión, entonces se incubaron durante la noche a 37°C. El día siguiente, las células se cosecharon y congelaron en un 90% de FBS que contiene 10% de DMSO. Eiemplo 2 Aislamiento de hibridomas que producen anticuerpos neutralizantes para Dkk-1 Los hibridomas descritos en el Ejemplo 1 se examinaron primero usando un ensayo de ELISA. Las placas se prepararon para ELISA agregando 50 µl de 1-5 µg/ml de muDkk-1 recombinante en salino de fosfato amortiguado (PBS; GIBCO) a cada pozo de una placa de ELISA de unión alta (COSTAR®) durante 1 hora. Después, los pozos se incubaron durante 1 hora con 200 µl de PBS que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 1% de suero de cabra (GIBCO) para bloquear la unión no específica de los sobrenadantes del hibridoma. Las placas se lavaron con PBS, 40 µl de sobrenadante del hibridoma se agregaron a cada pozo, después las placas se incubaron durante una hora. Después de otro lavado con PBS, 50 µl de una dilusión 1:10,000 de anti-mu IgG de cabra (Fc-específico) que se conjugó a HRP (Pierce) o conjugado IgG.H + L anti-rata de cabra (Zymed) se agregaron a cada pozo y las placas incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo en PBS, después de lo cual se agregaron 50 µl de sustrato ABTS (2,2'-azino-bis(ácido benzotiazolina-6-sulfónico de 3-etilo; KPL)) por pozo. Este sustrato produce un producto verde soluble en agua en la reacción con HRP. La densidad óptica se leyó usando un lector de placa Spectramax (Molecular Devices) y los datos se interpretaron usando el software Softmax pro (Molecular Devices). La Tabla 6 abajo muestra los números de los clones de ELISA-positivos obtenidos de cada categoría de animales inmunizados. Todos los hibridomas de antígeno-reactivos se expandieron en los cultivos celulares para la producción y prueba adicional de los anticuerpos.

Tabla 6 A. Ensayo de TCF/lef-luciferasa Varios cientos de los hibridomas obtenidos como se describe en el Ejemplo 1, se probaron utilizando un constructo indicador de TCF/lef-luciferasa en el cual la expresión luciferasa está bajo el control de Wnt. Cuando las células transfectadas con este constructo se exponen a Wnt biológicamente activo, se induce la actividad de luciferasa. La actividad de luciferasa inducida por Wnt puede suprimirse agregando la proteína Dkk-1 recombinante a las células que contienen este constructo. Para los presentes experimentos, Wnt3a y Dkk-1 primero se agregan a las células en cantidades optimizadas para suprimir aproximadamente 80% de la expresión de luciferasa dependiente de Wnt. Se espera que la adición posterior de un anticuerpo anti-Dkk-1 a estas mismas células restaure la actividad de Wnt, así dando por resultado la expresión de luciferasa incrementada. Los sobrenadantes de los hibridomas así se probaron determinándose si eran capaces de restaurar la expresión de luciferasa en células transfectadas con el constructo de Wnt/luciferasa. La actividad de luciferasa se cuantificó como se describe más adelante. El día cero, las células recientemente tripsinizadas 293T se colocaron en placas a 2.5 x 104 células/pozo en placas de 96 pozos de fibronectina-revestida. Las células entonces se co-transfectaron con ADN que codifica luciferasa de luciérnaga y ADN que codifica la luciferasa de renilla. El día 1, para cada pozo, 10 ng del ADN de TC F/lef-luciferasa (TOPflash de Upstate, # 21-170) y 1 ng de ADN de luciferasa de renilla (pRL-TK; Promega #E2241) en 30 µl de DMEM (menos antibióticos) se mezclaron con 20 µl de 1:10 de Polyfect Transfection Reagent® (Qiagen 301107) e incubados durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de un complejo de PolyFect-ADN. Después de esta incubación, se agregaron 100 µl del medio de crecimiento al complejo. Entonces el medio de cultivo se eliminó de cada pozo y el complejo en el medio de crecimiento se agregó al pozo. El medio de crecimiento en los pozos se eliminó tres horas después y se sustituyó con medio condicionado. Después de tres días, las células se lavaron una vez con PBS, y a cada pozo se agregaron 40 µl del amortiguador de lisis pasivo recientemente hecho incluido en el kit de Dual Luciferase (Promega #PAE1960). El amortiguador de lisis pasivo también está disponible separadamente de Promega (#E1941). Las placas se agitaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para inducir la lisis. Diez µl del lisado para el ensayo se utilizaron para realizar el ensayo Dual Luciferase en placas de 96 pozos (VWR 62402-980), con Promega #PAE1960 de acuerdo al protocolo del fabricante. Usando Lmax de Molecular Devices (Luminómetro con inyectores duales), señales luminiscentes de luciérnaga y luciferasas de renilla se registrados y la relación de estas señales se utilizaron para determinar el CE50 y para trazar curvas de dosis-respuesta. Primero, el sustrato de luciferasa de luciérnaga se inyectó en un pozo con célula Usadas y la señal luminiscente registrada; entonces el sustrato de luciferasa de renilla se inyectó en el mismo pozo y la segunda señal luminiscente resultante se registró. La Tabla 2 anterior reporte los números de hibridomas que inducen un resultado positivo en este ensayo, así indicando que los monoclonales producidos son capaces de neutralizar Wnt. Examen de hibridoma usando un ensayo de la célula ST2 La línea celular estromal ST2 (RIKEN, Cell # RCB0224), derivada de la médula ósea de ratón, se utilizó para examen adicional de estos hibridomas que probaron positivo en el ensayo de luciferasa. En respuesta a la señalización de Wnt3a, las células ST2 se distinguen en osteoblastos que expresan osteoblasto marcador de la fosfatasa alcalina de proteína (ALP). La inducción de la ALP por Wnt3a en estas células puede bloquearse agregando el inhibidor Dkk-1 de Wnt al medio de cultivo. La expresión ALP puede restaurarse bajo estas condiciones exponiendo las células a un agente capaz de neutralizar la actividad de Dkk-1, tal como un anticuerpo anti-Dkk-1 neutralizante. Por consiguiente, los hibridomas se examinaron para que su capacidad restaure la actividad de la ALP a células ST2 en presencia de Wnt3a. En la preparación para el ensayo, las células ST2 se cultivaron en MEM-a, conteniendo 10% de suero bovino fetal, 1 x penicilina/estreptomicina/glutamina y 1 x piruvato sódico (todos estos reactivos se obtuvieron de GIBCO). Las células se colocaron en placas a 1 x 104 células/pozo en placas de 96 pozos con 22 µl del medio de cultivo por pozo. Las células se incubaron durante la noche por hasta 24 horas a 37°C en una incubadora humedecida con 5% de CO2. El día cero del ensayo, se agregaron 200 ng de Dkk-1 murino o humano recombinante en 20 µl de amortiguador más 20 µl del medio condicionado de Wnt3a derivado de una línea celular estable de L-Wnt3a murino a cada pozo. El medio condicionado proporcionó una fuente de Wnt3a. Estas cantidades de estos dos reactivos (es decir, Dkk-1 y Wnt3a) se ajustaron con relación entre sí para permitir aproximadamente 10% del intervalo dinámico completa de la expresión de la ALP en estas células. Después, cada anticuerpo a probarse fue titulado en DMEM a intervalos de 1:2 para determinar su capacidad de restaurar la actividad de la ALP. En el extremo alto del intervalo probado, cada pozo recibió 100 µg del anticuerpo por ml. El anticuerpo policlona la Dkk-1 anti-humano de cabra (R&D Systems, Cat#: AF1096) sirve como un control positivo. El medio condicionado simulado transfectado o el medio de cultivo ST2 descrito anteriormente, se utilizó como un control negativo. Después de agregar el anticuerpo o medio control, las placas se incubaron a 37° durante 72 horas. En el día 3, los medios fueron eliminados y las células fueron enjuagadas con TRIS 0.1 M (pH 7.4). Después, se agregó 150 µl de 0.1% de IGEPAL CA-630 (Sigma: Cat. No. 1-3021) en amortiguador de glicina por pozo, después de lo cual las placas que fueron congeladas a -80°C entonces se descongelaron. Una vez descongeladas, 100 µl de cada lisato celular fueron transferidos a las placas de 96 pozos frescas para ser probadas por ALP. Tal como el sustrato, 100 µl de 4 mg/ml de disodio p-nitrofenol fosfato (Sigma: Cat. No. 104-40) en amortiguador de glicina (0.1 M de glicina, 1 mM MgCI2, pH 10.5) fue agregado por pozo a una concentración de sustrato final de 2 mg/ml. Durante la hidrólisis por ALP, este sustrato rinde p-nitrofenol, que tiene un color amarillo. Las placas entonces fueron incubadas durante 30 minutos a 37°C para permitir la hidrólisis del sustrato por ALP. Después de esta incubación, las reacciones fueron detenidas agregando 50 µl de 0.5 N NaOH por pozo. Las placas fueron leídas a 405-410 nM. El análisis de ALP fue normalizado usando el BCA Protein Assay, realizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Pierce Cat. #23223, 23224). La normalización (PNP nmol/proteína mg) fue hecha para compensar la variación del número celular encontrado en cada pozo que podría interferir con una determinación de inducción fosfatasa alcalina. Los resultados del análisis de la ALP fueron comparados con los controles positivos y negativos y los resultados fueron reportados en la tabla 7. Los datos en la tabla 7 indican los del número mayor de clones probados, los dos que expresan la actividad de neutralización más potente fueron 1F11-2 y 11H10, ambos se derivan de la rata. Tabla 7 En resumen, un total de 19,250 hibridomas fueron protegidos en el análisis ELISA. De éstos, 728 unieron Dkk-1 en los análisis de ELISA y 10 fueron positivos en uno o ambos de los análisis de neutralización (análisis indicador de TCR/lef o el análisis celular ST2). Los datos en la tabla 7 indican que de los clones positivos, el clon 11H10 tienen la mejor actividad. Por ejemplo, el clon 11H10 tiene un CE50 de 3.5 nM contra 8 nm de Dkk-1 humana y un CE50 de 6.1 nM contra 8 nm de Dkk-1 de murino. Eiemplo 3 Unión de Afinidad de Monoclonales Contra Dkk-1 Según lo observado anteriormente, los hibridomas que exhiben la mejor actividad de neutralización de Dkk-1 en los análisis con base celular fueron 11H10 y 1F11 derivados de rata (ver el ejemplo 2). El anticuerpo 11H10 es del isotipo IgGi. Este ejemplo ilustra que estos dos anticuerpos se unen con alta afinidad a murino, rata y Dkk-1 de humano. Consistente con su mejor actividad de neutralización, el clon 11H10 también tiene una afinidad más alta para Dkk-1 en estos análisis que 1F11. Los análisis cinéticos fueron realizados para estudiar la unión de los anticuerpos 11H10 y 1F11 a Dkk-1 usando BiaCore 2000 (BIACORE, Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron Dkk-1 de rata (260 µg/ml), Dkk-1 de murino (690 µg/ml) y Dkk-1 de humano (900 µg/ml) en una superficie de la microplaqueta CM5, y varias concentraciones (0.78 nM a aproximadamente 100 nM) de los anticuerpos fueron inyectadas sobre las superficies de Dkk-1 inmovilizadas. Los sensorgramas de unión fueron analizados usando BIAevaluation 3.2.

Los datos se resumen en las tablas 8 y 9 posteriores. Tabla 8. Cinética de Unión de 1F11 Determinada por BiaCore Tabla 9. Cinética de Unión de 11H10 Determinada por BiaCore Fue evidente a partir de los resultados de BiaCore que 11H10 tenía la afinidad más alta para Dkk-1, y que su afinidad para el objetivo excede los límites de sensibilidad del análisis de BiaCore. Por consiguiente, la afinidad de la unión de 11H10 a Dkk-1 se determinó adicionalmente por un análisis de unión de equilibrio usando KinExA® 3000 más sensible (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). Para estas medidas, los granulos de Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) se cubrieron previamente con Dkk-1 de ratón, rata o humano y bloqueados con BSA. 100 pM, 300 pM, ó 1000 pM del anticuerpo 11H10 se mezclaron con varias concentraciones de Dkk-1 de humano, ratón o rata, que oscilan en una concentración de 1 pM a 50 nM, y se equilibraron a temperatura ambiente durante 8 horas. Las mezclas entonces fueron pasaron sobre los granulos de Dkk-1 revestidos. La cantidad de anticuerpo anti-Dkk-1 unido al granulo fue cuantificada usando el anticuerpo anti-rata-lgG de cabra marcado con una etiqueta fluorescente (Cy5; Jackson Immuno Research, West Grove, PA). La cantidad de señal fluorescente medida fue proporcional a la concentración del anticuerpo anti-Dkk-1 libre en cada mezcla de reacción en equilibrio. La constante de equilibrio de disociación (Kd) fue obtenida de la regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio de curva dual usando el software KinExA. Los resultados de los análisis KinExA para 11H10 indicaron que Kd hacia Dkk-1 de humano fue de 1.3 x 10"10 M, y hacia Dkk-1 de ratón y rata fue de 1.65 x 10"10 M y 5.4 x 10"10 M, respectivamente. Los estudios cinéticos de unión fueron conducidos con varias combinaciones diferentes de la cadena ligera y de cadenas pesadas (pares idénticos de cada cadena) listadas en la tabla 1 anterior. En general estos anticuerpos tienen valores de ka de entre 10* y 106 / Mxsegundos, y valores de koff (kd), entre de 10 * y 10"5 s'1. Eiemplo 4 Prueba in vivo del hibridoma 11H10 Los experimentos fueron conducidos para determinar si la neutralización de Dkk-1 en un modelo animal de ratón joven causaría un incremento en la densidad mineral del hueso (BMD) y en osteocalcina de suero, un marcador para la formación del hueso. Para estos experimentos, el anticuerpo 11H10 fue purificado del medio de las células de hibridoma de 11H10 cultivadas. El medio de cultivo cosechado se concentró 12 veces usando un dispositivo de ultrafiltración Pellicon (Amicon) ajustado con un módulo de canal de protección de 50 kD MWCO (Millipore). El medio concentrado fue filtrado a través de un filtro de 0.2 µm de poro, entonces se unió a Proteína G Sefarosa (Pharmacia). Después de lavar la Proteína G Sefarosa con por lo menos cuatro volúmenes de PBS, el anticuerpo fue eluido con amortiguador de elusión de IgG (Pierce), después se amortiguó a pH neutral agregando 5% v/v de 1M Tris-HCl. Después, el anticuerpo se dializó contra PBS. El dialisato se filtró a través de un filtro de 0.2 µm y fue probado para endotoxina con frascos de 0.06 EU/ml Pyrotell LAL (Associates of Cape Cod.). La concentración de proteína en el anticuerpo purificado fue determinada por la absorbencia a 280 nm usando un coeficiente de extinción de 1.35. Ratones macho BDF-1 de cuatro semanas de edad (APR 233757, Charles River) fueron inyectados subcutáneamente durante un período de tres semanas con una de las tres dosis del anticuerpo monoclonal 11H10 purificado (5, 10, ó 20 mg/kg), según lo indicado en la tabla 10. Se usaron cinco ratones por grupo. Los ratones de control negativo fueron inyectados con el vehículo (PBS), y los ratones de control positivo fueron inyectados con la hormona paratiroidea (aminoácidos 1-34), que es conocida por estimular la densidad incrementada del hueso en estos ratones (Dempster et al., Endocrine Reviews 14(6):690-709 (1993)). Se usó 100 µg/kg de PTH (1-34) en 0.001N HCl, 0.15M NaCI, 2% de BSA, pH 8.0 por inyección. Este experimento fue repetido una segunda vez exactamente de acuerdo a lo mostrado en la tabla 10, pero con un grupo adicional de ratones de control negativo, el cuál recibió 20 mg de IgG de rata. Además, estos experimentos se han repetido con 11H10 expresado recombinantemente. Tabla 10 La sangre fue recolectada en la línea base (día 0) y en los días 3, 5, 7, 14 (retro-orbitales), y en el día 21 (punción cardiaca terminal) para los análisis de osteocalcina y los paneles de química clínica. Los niveles de osteocalcina de suero fueron determinados usando un kit de análisis inmunoradiométrico específico (IRMA) para la osteocalcina de ratón (Immunotopics, Inc. San Clemente, CA). Las muestras de suero antes del análisis fueron equilibradas a temperatura ambiente y todos los análisis fueron realizados por duplicado. Los análisis utilizaron dos anticuerpos diferentes para la osteocalcina de ratón. El primero fue un anticuerpo de cabra policlonal purificado de afinidad que reconoce la región media de la región de la terminal C de la molécula de osteocalcina; este anticuerpo fue inmovilizado en granulos plásticos que se utilizarán como un reactivo de captura. El otro anticuerpo fue un anticuerpo policlonal purificado de afinidad que reconoce la terminal amino de la molécula de osteocalcina; este anticuerpo fue radioetiquetado para utilizar la osteocalcina de detección. Las muestras de suero de ratón fueron incubadas con un granulo revestido de anticuerpo y el anticuerpo etiquetado con 125l a temperatura ambiente durante 18 a 24 horas para permitir que la osteocalcina llegue a unirse por el anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo radioetiquetado para formar un "sandwich" de unión de granulo etiquetado. Después de la incubación, los granulos fueron lavados dos veces para retirar al anticuerpo etiquetado no unido, contados en un contador gamma, y las cuentas fueron corregidas para el antecedente. En estos análisis, la reactividad del complejo de anticuerpo fue proporcional directamente a la cantidad de osteocalcina de ratón en el suero. Las concentraciones de osteocalcina de ratón en las muestras se determinaron directamente a partir de una curva estándar generada del control de osteocalcina proporcionado para este propósito en el kit. Cerca del día 3 y después del mismo, todas las dosis de 11H10 habían inducido un incremento en la osteocalcina en comparación a los ratones tratados con vehículo. La magnitud de incremento fue dependiente de la dosis. Para las dosis de 10 mg/kg y 20 mg/kg, la magnitud del incremento fue era estadísticamente significativa contra el vehículo en el punto de 5 días, y para la dosis de 20 mg/kg, siguió siendo estadísticamente significativo en el punto de tiempo del día 7. Para todas las dosis administradas, la inducción de osteocalcina fue observada inmediatamente tres días después de que el tratamiento de 11H10 comenzó y las magnitudes de los incrementos observados de los incrementos totales fueron similares o mayores que las observadas en animales tratados con PTH. Para probar BMD, las radiografías completas del ratón fueron tomadas al final de la primera, segunda y tercera semanas a 56 kvp durante 49 segundos usando un sistema de rayos X Faxitron No. 43855A (Buffalo Grove, IL) y una película Kodak X-OMAT TL (Rochéster, NY). Las películas de rayos X resultantes fueron examinadas visualmente para aumentar la densidad del hueso en 10 huesos diferentes. No se observó ningún incremento en los grupos tratados con el vehículo o amortiguador de PTH. Sin embargo, los grupos tratados con PTH (1-34) o 11H10 exhibieron una densidad incrementada en cinco o más huesos alrededor de una semana, y en más de diez huesos alrededor del final de la semana tres. Al final del período de inyección de tres semanas, el análisis de pQCT BMD fue conducido en la metáfisis tibial próxima y medido para la densidad trabecular y cortical total. La BMD total medida por pQTC mostró una respuesta positiva en la dosis más alta de 11H10, principalmente debido a un incremento en la BMD trabecular. La tabla 11 presenta las medidas de BMD obtenidas en uno de los dos experimentos que fueron realizados. Los resultados similares fueron obtenidos en ambos experimentos. Los números en la tabla 11 representan el porcentaje de cambio en comparación con el control de vehículo. Los asteriscos en la tabla 11 indican que hubo una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo 11H10 y el grupo de control (ANOVA p<0.05). En general, la cantidad del incremento de BMD inducido por 11H10 fue comparable a la cantidad de incremento inducida por el control positivo de PTH (1-34). Tabla 11. Densidad Mineral del Hueso en ratones tratados con 11H10 Ejemplo 5 Prueba in vivo de varios anticuerpos Para tener acceso adicional a la capacidad de neutralizar Dkk1 para incrementar la masa del hueso, ratones jóvenes (6-semanas de viejos) y viejos (8.5-meses viejos) fueron tratados con 11H10 de rata como se describe anteriormente en el ejemplo 4. Los ratones fueron analizados para los cambios de BMD por pQCT y microCT (µCT). Para µCT, la arquitectura trabecular y la geometría cortical fueron examinadas en fémures de ratón usando un eXplore Locus SP Micro- CT System (GE Healthcare, Waukesha, Wisconsin, E.E.U.U.). Los fémures fueron colocados en crio-tubos de 2ml con un fantasma de densidad del hueso, llenado con PBS, y estabilizado con gasa. Los fémures enteros fueron explorados en rotaciones de 0.5° para 200° (80kVp, 80uA) calibrados con el fantasma de densidad, y reconstruidos para producir imágenes con un tamaño de voxel de 18 x 18 x 18 µm. Las regiones de interés fueron analizadas por los parámetros corticales, trabecular morfométricos y de densidad (software GEHC Micro View). El 10% central (en longitud) de la diáfisis del fémur fue analizado para los perímetros endosteal y periosteal promedio, así como el área cortical y BMD volumétrico (umbral = 640 mg/cc). Las regiones del hueso trabecular del fémur distal fueron aisladas y analizadas para los parámetros de BMD y estereología, incluyendo la fracción del volumen del hueso (BV/TV), el grueso trabecular (Tb, Th), el número trabecular (Tb, N), y BMD volumétrico (umbral = 320 mg/cc). Estas regiones fueron seleccionadas basándose en la longitud del fémur (10% de longitud) y localizadas próximas a la placa de crecimiento esponjoso. pQCT y µCT mostraron cambios significativos en BMD en r en los ratones jóvenes y viejos tratados con 11H10. Además, µCT permitió mostrar que neutralizar la actividad de Dkk1 con 11H10 de rata condujo a incrementos significativos en número trabecular en los ratones jóvenes y viejos (figura 2). La dosis más alta de 11H10 de rata en ratones viejos dio lugar a una disminución del perímetro endosteal, indicando que 11H10 de rata también afectó positivamente el crecimiento cortical del hueso, además del hueso cancellous. Para determinar si la neutralización de Dkk1 podría ayudar a restaurar la pérdida del hueso debido a la falta de estrógeno, los ratones oviarrectomizados (OVX) fueron tratados con 11H10 de rata (3, 10, 30 mg/kg dos veces por semana por inyección subcutánea). En este experimento, los ratones viejos CDF-1 de 7 meses, 5-meses post-OVX, fueron tratados con 11H10 de rata, PTH (100 µg/Kg) o vehículo. BMD fue analizado por pQCT en la línea base, día 7, 14, 21 y 28. Los datos a partir del día 28 se muestran abajo como por ciento de cambio de la línea base para la tibia y las vértebras lumbares (figura 3). En un experimento separado, la eficacia del isotipo de h11H10 RT lgG1 y el isotipo de h11H10 RT lgG2 (ver tablas 1 y 2 para las secuencias de cadenas ligeras y pesadas y de regiones variables) fue determinada en ratones jóvenes usando un protocolo similar al descrito anteriormente con la modificación que el isotipo de de h11H10 RT lgG1 y el isotipo de h11H10 RT lgG2 fueron comparados al 11H10 de rata y PTH (figura 4). Los datos indican que estos dos anticuerpos también incrementaron BMD, de acuerdo a lo determinado por el análisis de DEXA, en ratones. Los resultados de los experimentos descritos anteriormente indican que la neutralización de la actividad Dkk-1 con ciertos anticuerpos descritos en la presente, tiene un efecto anabólico en la formación del hueso. Ejemplo 6 Caracterización de los epítopes de Dkk-1 humana que se unen al anticuerpo de 11 H10 Dkk-1 humana contiene dos dominios ricos en disulfuro localizados cerca de la N-terminal y acerca del extremo de la C-terminal, referidos aquí como los dominios de disulfuro N- y C-terminal. El dominio de disulfuro N-terminal (más abajo, "dominio del disulfuro 1") contiene 55 residuos de aminoácidos (aminoácidos 85-139 de la SEC ID NO:2) y tiene 10 cisteínas que forman 5 enlaces de disulfuro intramoleculares. El dominio de disulfuro C-terminal (más abajo, "dominio de disulfuro 2") contiene aproximadamente 75 aminoácidos (aminoácidos 189-263 de la SEC ID NO:2) y contiene 10 cisteínas que forman 5 puentes de disulfuro intramoleculares, dando por resultado la formación de siete bucles en la proteína plegada completamente (ver figura 1). El dominio 2 de disulfuro de Dkk-1 se ha propuesto por tener una estructura molecular similar al doblez de la colipasa canónica, la estructura cristalina de la cual se ha determinado usando la colipasa porcina (Aravind, A. and Koonin, E. V., Current Biology 8:R477-479 (1998)). Los siete bucles en el dominio 2 de disulfuro de Dkk-1 humana consisten de los aminoácidos 190-194, 196-199, 202-209, 211-219, 221-236, 240-244 y 246-262 de la SEC ID NO:2. El tratamiento con un agente de reducción suprimió la capacidad de Dkk-1 de unir 11H10, indicando así que el epítope blanco por este anticuerpo fue conformacional y requirió el mantenimiento de por lo menos algunos de los enlaces de disulfuro en esta proteína. Para caracterizar este epítope conformacional, una estrategia fue aplicada la cual involucró la fragmentación de Dkk-1 humana con bromuro de cianógeno (CNBr) y varias proteasas diferentes, luego probando los fragmentos resultantes para ver si pueden aún unirse al anticuerpo de 11H10. Los datos resultantes permitieron determinar la localización del epítope. En breve, las digestiones del péptido fueron incubados con o sin el anticuerpo, pasados a través de una membrana de 10 K de corte para atrapar cualquier péptido que se hubiera unido al anticuerpo (-150,000 Da), después sometido al análisis del péptido por HPLC. Una reducción en la altura de un pico de HPLC en una muestra expuesta al anticuerpo indicó que los péptidos en ese pico se habían unido al anticuerpo y así formaron parte del epítope. Los picos individuales de la HPLC fueron recogidos y los péptidos identificados y analizados por la secuencia de N-terminal. Para determinar si los péptidos podrán unir 11H10, estos fueron sometidos a ensayos de interacción bioespecíficos en tiempo real con una estación de trabajo BiaCore, usando el anticuerpo de Proteína A-capturada anti-Dkk-1 como un biosensor para la unión. Todos los análisis de HPLC para estos estudios fueron realizados usando una columna de fase inversa C5 (1 mm i.d. x 10 cm de longitud). El análisis del péptido por HPLC fue realizado con un gradiente lineal a partir de 0.05% de ácido trifuloroacético (fase móvil A) al 90% de acetonitrilo en 0.05% de ácido trifuoroacético. Las columnas fueron reveladas por aproximadamente 70 minutos en un caudal de 0.15 ml/min. Digestión de CNBr La división de CNBr de hDkk-1 generó dos fragmentos grandes, CNBrl y CNBr2. Estos representados, respectivamente, por el dominio 2 de disulfuro y dominio 1 de disulfuro. CNBrl consistió de dos péptidos (aminoácidos 179-206 de la SEC ID NO:2 y aminoácidos 207-266 de la SEC ID NO:2) ligados por los enlaces de disulfuro. CNBr2 consistió similarmente de dos péptidos (aminoácidos 32-122 de la SEC ID NO:2 y aminoácidos 127-178 de la SEC ID NO:2), también ligados por los enlaces de disulfuro. Los resultados del análisis de BiaCore indicaron que 11H10 fue capaz de unirse significativamente a CNBrl pero no se unió a todos los CNBr2. Así, fue concluido que 11H10 se une a un epítope localizado en el dominio de disulfuro 2 de Dkk-1. Digestión de tripsina Dkk-1 humana fue digerida después con tripsina, que se divide después en arg y lys. Aproximadamente 200 µg de Dkk-1 en 0.5-1.0 mg/ml fueron incubados en PBS (pH 7.2) por 20 h a 37°C con 8 µg de una u otra de estas proteasas para alcanzar la digestión completa de Dkk-1. La cromatografía de HPLC de las digestiones de tripsina rindió picos múltiples. Para determinar que, si los hay, fragmentos trípticos conservaron la capacidad de unión al anticuerpo, la digestión fue incubada con un anticuerpo de 11H10 en una relación molar de 1:2 a 0°C por 2 horas. El anticuerpo y cualquier péptido unido a éste fueron capturados en una membrana de Microcon (corte 30,000 de peso molecular). Los péptidos en flujo-a través del filtro de Microcon fueron analizados en HPLC para determinar qué picos fueron reducidos o eliminados debido a la unión al anticuerpo. Los resultados de la HPLC para las muestras expuestas al anticuerpo fueron comparados con las digestiones de control que habían sido sometidas a los mismos procedimientos sin 11H10. De acuerdo a lo discutido abajo, ninguno de los fragmentos generados por la digestión de tripsina conservaron la capacidad de unir 11H10. El análisis de la secuencia fue conducido para identificar y analizar los péptidos en los picos recuperados de la HPLC después de la digestión de la tripsina. Dos picos, Tryp40.5 (tiempo de retención 40.5 minutos) (~6-7 kDa) y Tryp45 (~8 kDa), fueron confirmados que contuvieron secuencias que se trazaron, respectivamente, al dominio 2 de disulfuro y al dominio 1 de disulfuro. Ni Tryp40.5 ni Tryp45 se unieron a 11H10 cuando se probaron por la captura con la membrana de Microcon o por los experimentos de unión de BiaCore. Tryp40.5 consistió en siete péptidos pequeños (6 a 12 aminoácidos en longitud) ligados por cinco enlaces de disulfuro del dominio de disulfuro 2. Tres segmentos pequeños de la secuencia del dominio de disulfuro 2 faltaban en Tryp40.5. Estas secuencias faltantes eran los aminoácidos 204-208, 223-226 y 247-249 de la SEC ID NO:2).

Puesto que Tryp40.5 no puede unir 11H10, parece que uno o más de estos tres péptidos faltantes deben formar una parte esencial del epítope al cual este anticuerpo se une. Digestión de Endo Lys C La digestión de Dkk-1 humana con Endo LysC (se divide solamente después en lys) también generó varios picos cuando se sometió a HPLC como se describe anteriormente. Solamente una fracción de HPLC, LysC48.7, mostró una reducción en la altura de pico cuando la digestión fue incubada con el anticuerpo antes del análisis de HPLC. LysC48.7 consistió de tres fragmentos del péptido ligados por los cinco enlaces de disulfuro en el dominio 2 de disulfuro. El análisis de la secuencia indicó que estos tres péptidos consistieron de los aminoácidos 183-222, 227-249, y 250-266 de la SEC ID NO:2. El análisis de la secuencia reveló que LysC48.7 careció solamente de un segmento del dominio 2 de disulfuro, es decir, un péptido localizado en los aminoácidos 223-226 de la SEC ID NO:2. Así, LysC48.7 fue estructuralmente más intacto que Tryp40.8, que careció de tres segmentos del dominio 2 de disulfuro.

La capacidad de 11H10 de unir las fracciones de LysC fue determinada usando el ensayo de unión de BiaCore. Solamente la fracción de LysC48.7 mostró cualquier actividad de unión. La fracción LysC48.7 mostró un nivel fuerte de unión al anticuerpo. Sin embargo, la velocidad fue muy rápida con la unión lo que disminuyo rápidamente a los niveles anteriores. Estos datos indican que el epítope blanco para 11H10 no conservará la unión al anticuerpo cuando los aminoácidos 223-226 de la SEC ID NO:2 se acortan del dominio 2 de disulfuro. Por lo tanto, fue concluido que los residuos 223-226 pueden entrar en contacto directo con 11H10 cuando unen Dkk-1 o que estos residuos son esenciales para mantener la estructura tridimensional que permite al anticuerpo entrar en contacto efectivo con otros residuos de aminoácidos en la vecindad inmediata de los aminoácidos 223-226 en la proteína plegada. Digestión de AspN Para delinear además el epítope de unión-11H10, hDkk-1 fue digerida con la proteasa AspN y los fragmentos resultantes analizados como se describe anteriormente. De los picos de HPLC mayores generados por la digestión de AspN, tres fueron reducidos en altura si la digestión fue pre-expuesta a 11H10, indicando que estos péptidos se habían unido al anticuerpo. Los picos que unen el anticuerpo fueron AspN48.7, AspN49.6 y AspN52. El análisis de la secuencia indicó que estos tres picos del anticuerpo-reactivos fueron derivados del dominio 2 de disulfuro. AspN48.7 y AspN49.6 fueron idénticos en la secuencia de aminoácidos y cada uno de ellos consistió en dos péptidos ligados por los cinco enlaces de disulfuro en el dominio 2 de disulfuro. La diferencia en la migración de HPLC de estos dos picos fue probablemente debido a la heterogeneidad de las porciones del carbohidrato unidas a Asn256. Estos dos péptidos consistieron de los aminoácidos 166-231 y 232-266 de la SEC ID NO:2. AspN52 contuvo solamente un solo péptido, correspondiendo a los aminoácidos 166-266 de la SEC ID NO:2. Así, AspN52 es evidentemente un producto de la digestión parcial cuya secuencia traslapa en gran parte AspN48.7 y 49.6, aunque los últimos dos recibieron una grapa adicional entre Leu231 y Glu232 en relación con AspN52. Esta grapa ocurre en el bucle que está entre los aminoácidos 221 y 236 de la SEC ID NO:2. Los tres de estos picos demostraron la unión significativa a 11H10 en los experimentos de captura de Microcon y el análisis de unión de Biacore. Estos datos indican que la interrupción del enlace del péptido entre los aminoácidos 231 y 232 de hDkk-1 (SEC ID NO:2) no afecta la capacidad de 11H10 para reconocer su epítope blanco. Análisis de resultados de la digestión Los resultados anteriores indica que 11H10 se une a un epítope no lineal de Dkk-1 humana localizado en el dominio 2 de disulfuro de la proteína, y que el epítope reside en los dos bucles grandes formados por los enlaces de disulfuro Cys220-Cys245, Cys239- Cys263 y Cys20o-Cys237 de la SEC ID NO:2 (ver figura 1). De acuerdo a lo ilustrado en la figura 1, los dos bucles que forman el epítope están entre Cys220 y Cys237 y entre Cys245 y Cys263, el cuerpo de los dos bucles que comprenden así los aminoácidos 221-236 y 246-262 de la SEC ID NO:2. La digestión de tripsina de Dkk-1 abrió los bucles Cys220/Cys237 y Cys245/Cys263 eliminando los aminoácidos 223-226 y 247-249. Con estos dos péptidos eliminados, los productos de la digestión de tripsina no pudieron unir 11H10. Un tercer péptido (aminoácidos 204-208 de la SEC ID NO:2) también fue suprimido por la digestión de tripsina pero determinado por estar fuera del epítope debido a que otras proteasas pudieron reducir el enlace al anticuerpo sin acortar el bucle donde residen estos aminoácidos. La digestión de LysC, que redujo drásticamente la unión del anticuerpo, también abrió el bucle Cys220/Cys237 eliminando los aminoácidos 223-226 de la SEC ID NO:2 y el bucle Cys2 5/Cys263 dividiendo en un solo enlace del péptido en Lys2 9 (SEC ID NO:2). Así, los resultados de la digestión de LysC involucraron otra vez los bucles Cys220/Cys237 y Cys245/Cys263 para la unión de 11H10. La digestión de AspN se acortó en Glu232 (SEC ID NO:2) en el bucle Cys220/Cys23 sin la reducción de la unión del anticuerpo, sugiriendo así que la preservación de la conformación apropiada del epítope no requirió que este estuviera absolutamente intacto. Sin embargo, este bucle es claramente importante porque, de acuerdo a lo mostrado anteriormente, la eliminación de los aminoácidos 223-226 de la SEQ ID NO:2 por LysC de este mismo bucle destruyó la unión del anticuerpo. De acuerdo a estos análisis, el epítope que une 11H10 está localizado en la vecindad de los bucles Cys220/Cys237 y Cys2 5/Cys263 en el dominio 2 de disulfuro, así los aminoácidos 220-237 y los aminoácidos 245-263 de la SEC ID NO:2 son muy importantes para la unión del anticuerpo. Los bucles formados por los otros enlaces de disulfuro en este grupo disulfuro del dominio C-terminal no parecen estar involucrados en el reconocimiento por este anticuerpo. Los resultados muestran también que los enlaces de disulfuro en este dominio deben estar intactos para conservar el epítope en una configuración que permita la unión del anticuerpo. Dentro del epítope, las porciones mínimas que aparecerán necesarias para conservar la unión incluyen los aminoácidos 221-229 de la SEC ID NO:2 (esto seguido del hecho de que la división en Glu232 no tuvo ningún efecto en la unión) y los aminoácidos 246-253 de la SEC ID NO:2, como consideraciones estructurales, indican que Asn256 está ligado a las porciones de carbohidrato voluminosas que pueden enmascarar los otros aminoácidos en este bucle a partir de la unión a 11H10. Ejemplo 7 El anticuerpo 1F11 compite con 11H10 para la unión a Dkk-1 Los experimentos fueron conducidos para determinar si el anticuerpo monoclonal 1F11 puede unirse al mismo epítope en Dkk-1 que 11H10. Esta materia fue de interés porque estos anticuerpos monoclonales neutralizan la actividad biológica de Dkk-1. De acuerdo a lo mostrado en la tabla 12 siguiente, 1 F 11 neutraliza la actividad de Dkk-1 de ratón, rata y humana en el ensayo de TCF-izquierda, aunque no así como 11H10. Tabla 12 Los experimentos de la competición entre 11H10 e 1F11 fueron conducidos usando el BiaCore 2000, como se describe anteriormente. Las microplaquetas de BiaCore en las cuales se han inmovilizado 11H10 o 1F11, fueron utilizadas para capturar Dkk-1 humana. Después de la etapa de captura, 1F11 o 11H10 fue inyectado sobre las superficies de las microplaquetas para ver si la unión adicional a Dkk-1 pudo lograrse. En estos experimentos, ni los anticuerpos inyectados sobre las microplaquetas pudieron unirse a la Dkk-1 humana capturada, es decir, 11H10 no pudo unirse a Dkk-1 humana que se había capturado por 1F11, ni tampoco 1F11 se unió a Dkk-1 humana, la cual se había capturado por 11H10. Estos datos indican fuertemente que estos dos anticuerpos se unen al mismo epítope en Dkk-1 humana, sugiriendo así que este epítope particular objetivo es un medio particularmente efectivo para neutralizar la actividad de Dkk-1. Otros experimentos fueron conducidos para determinar si algunos de los otros anticuerpos incluyendo las cadenas pesadas y ligeras listadas en la Tabla 1 (pares idénticos de cadenas pesadas y ligeras) podrían competir para el mismo epítope de acuerdo a lo reconocido por 11H10 e 1F11 de rata y encontrándose que también fueron capaces de hacerlo.

Eiemplo 8 Unión de bloques de 11H10 de Dkk-1 a LRP6 Para determinar si 11H10 ejerció su efecto biológico interfiriendo con la interacción de Dkk-1 y LRP6, e interfiriendo LRP5, establecimos un análisis de unión de LRP6 Dkk-1 utilizando un citómetro de flujo. Esté análisis usa una proteína de fusión de LRP6-Fc obtenida comercialmente (R&D Systems, #1505-LR) y una Dkk-1 humana etiquetada con biotinaa de terminal amino. El constructo de fusión de Dkk-1 etiquetada con biotinaa fue generado por clonando hDkk-1 de codificación de ADN de modo que fue expresado fusionado a la terminal C de biotina en un constructo de expresión mamífera. Esté constructo fue transfectado temporalmente en las células 293T y el medio condicionado fue recolectado 48 horas después de la transfección. Para determinar si 11H10 fue capaz de interferir con Dkk-1 que se une a LRP6, se agregó LRP6 al medio condicionado con y sin 11H10. Después se agregaron granulos de estreptavidina a esta preparación, que permitió la unión de la proteína de fusión de biotina-Dkkl a los granulos. La unión de LRP6 a Dkk-1 fue determinada usando un anticuerpo conjugado con FITC específico para la porción de Fc del constructo de fusión de LRP6-Fc. La unión de LRP6 a Dkk-1 fue detectada usando el citómetro de flujo. Una señal de unión específica (la unión específica es igual a la señal total observada menos la señal observada en ausencia de Dkk-1) de 6.46 fue detectada con LRP6 y Dkk-1. La incubación de Dkk-1 con 11H10 antes de la adición de LRP6 redujo esta señal a 2.66, que fue menos del 50% de la unión específica observada sin el anticuerpo, de este modo se indicó que 11H10 interfiere con la unión de Dkk-1 a LRP6.

Ejemplo 9 Clonación de ADNcs de la cadena pesada v ligera de 11H10 ARN total fue aislado de células 11H10 de hibridoma de rata con el reactivo de TRIzol® (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, después se purificó adicionalmente usando una columna Qiagen RNeasy®. Un oligonucleótido de RACE (amplificación rápida de los extremos de ADNc) (5'-CGA CUG GAG CAC GAG GAC ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGU AGA AA-3'; SEC ID NO:15) fue ligado al ARN usando los componentes y el protocolo del GeneRacer™ Kit (Invitrogen). Este oligonucleótido proporciona dos sitios de cebado únicos en los extremos 5' de las moléculas de mARN. El primer filamento ADNc fue sintetizado a partir de este ARN modificado usando una cebador aleatorio con un adaptador de extensión (5'-GGC CGG ATA GGC CTC ACN NNN NNT -3'; SEC ID NO:16). Aprovechando las secuencias conservadas en los genes del anticuerpo de rata, las reacciones de PCR RACE fueron realizadas para amplificar ADNcs que codifican el anticuerpo anti-muDkk-1. Para clonar la cadena ligera completa de 11H10, PCR RACE se formó previamente usando el cebador de 5' GeneRacer™ (5' CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA-3'; SEC ID NO: 17) como el cebador delantero, y usando 5'-GCA ACÁ GTG GTA GGT CGC TTG TGG -3" (SEC ID NO: 18) como el cebador inverso. Este cebador inverso corresponde a los nucleótidos 74-98 en la región sin traducir 3' de cadena kappa. Este producto de PCR entonces fue utilizado como un patrón para una PCR anidada usando el cebador anidado 5' GeneRacer™ (5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA -3' (SEC ID NO:19) como el cebador delantero y el mismo cebador inverso (SEC ID NO:18). La PCR RACE para la región variable de las cadenas pesadas usó el cebador GeneRacer™ como el cebador delantero y como el cebador inverso utilizó 5'- AGG AGC CAG TGG ATA GAC AGA -3' (SEC ID NO: 20) que corresponde a de diecinueve a treinta y nueve nucleótidos en la región constante de IgG de rata. Este producto de PCR entonces fue utilizado como patrón para una PCR anidada usando el cebador anidado 5' GeneRacer™ como el cebador delantero y el misma cebador inverso primer 5'- AGG AGC CAG TGG ATA GAC AGA -3" (SEC ID NQ:20). Los productos de PCR RACE entonces fueron clonados en el vector de clonación pCR4-TOPO TA (Invitrogen). Las secuencias de ADN de éstos clones fueron determinadas usando cebadores del vector pCR4 que flanquean el sitio de clonación, los nucleótidos etiquetados con tiente y los secuenciadores ABI ADN. Las secuencias de consenso para las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de 11H10 fueron montadas y utilizadas para diseñar cebadores 5' PCR dirigidas en los extremos de terminal amino de las secuencias de codificación. Estos cebadores también contenidos contienen un sitio de restricción Salí para la clonación, y una secuencia Kozak. El cebador 5' PCR diseñado para la cadena ligera tiene la siguiente secuencia de nucleótido: 5'-AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GGT GTG CCT ACT CAT CTC -3' (SEC ID NO:21); para la cadena pesada, 5'- AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATC AGG CTC AGC TTG G -3' (SEC ID NO:22). Estos cebadores 5' entonces fueron utilizados con cebadores 3' dirigidos en los extremos de la terminal carboxi de las secuencias de codificación y contienen un sitio de restricción de Notl para la clonación. El cebador 3' para el de cadena ligera tiene la siguiente secuencia de nucleótido: 5'-AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCC TAA CAC TCA TTC CTG TTG A -3' (SEC ID NO:23); y el cebador 3' para la cadena pesada, 5'- AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GAG TGG GAG -3' (SEC ID NO:24). Estos cebadores fueron utilizados en reacciones de PCR para amplificar las regiones de codificación completas de los genes de cadena ligera y pasada del anticuerpo 11H10. Las secuencias clonadas fueron expresadas en células CHO como se describe en Bianchi y McGrew, 2003. Las secuencias de nucleotidos que codifican las cadenas ligera y pesada completas de 11H10 se muestran en las SEC ID NOS: 9 y 11, respectivamente, y las SEC ID NOS: 10 y 12 representan las secuencias de aminoácido. La cadena ligera de 11H10 tiene una secuencia principal que consiste de aminoácidos 1-20 (codificados por los nucleótidos 1-60 de la SEC ID NO:9), así la proteína madura comienza en el aminoácido 21 de la SEC ID NO: 10. La región variable de cadena ligera de 11H10 se codificada por los nucleótidos 61-381 de la SEC ID NO: 9 (ver, también SEC ID NO: 83), que corresponde a los aminoácidos 21-127 de la SEC ID NO: 10 (ver, también SEC ID NO: 84). El CDR1 de cadena ligera de 11H10 es codificado por los nucleótidos 130-162 de la SEC ID NO: 9 (ver también la SEC ID NO: 85), codificando los aminoácidos 44-54 de la SEC ID NO: 10 (ver también la SEC ID NO: 70); los CDR2 de cadena ligera de 11H10 son residuos codificados por 208-228 de la SEC ID NO: 9 (ver también la SEC ID NO: 86), que codifican los aminoácidos 70-76 de la SEC ID NO: 10 (ver también la SEC ID NO: 72); y CDR3 de 11H10 se codifica por los nucleótidos 325-351 de la SEC ID NO: 9 (ver también la SEC ID NO: 87), que codifican los aminoácidos 109-117 de la SEC ID NO: 10 (ver también la SEC ID NO: 74). La cadena pesada de 11H10 tiene una secuencia principal que consiste de aminoácidos 1-19 (codificados por los nucleótidos 1-57 de la SEC ID NO: 11), así la proteína madura comienza en el residuo 20 de la SEC ID NO: 12 y se codifica por los nucleótidos 58-1395. La región variable de cadena pesada es codificada por los nucleótidos 58-417 de la SEC ID NO: 11 (ver también la SEC ID NO: 90), que codifican los aminoácidos 20-139 de la SEC ID NO: 12 (ver también la SEC ID NO: 91). CDR1 de cadena pesada se codifica por los nucleótidos 148-162 de la SEC ID NO: 11 (ver también la SEC ID NO:92), que codifican los aminoácidos 50-54 de la SEC ID NO: 12 (ver también la SEC ID NO: 76); CDR2 de cadena pesada de 11H10 se codifica por los nucleótidos 205-255 de la SEC ID NO: 11 (ver también la SEC ID NO: 93), que codifican los aminoácidos 69-85 de la SEC ID NO: 11 (ver también la SEC ID NO: 78); y CDR3 de cadena pesada de 11H10 se codifica por los nucleótidos 352-384 de la SEC ID NO: 11 (ver también la SEC ID NO: 94), codificando los aminoácidos 118-128 de la SEC ID NO: 12 (ver también la SEC ID NO:80). Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente tienen solamente propósitos ilustrativos y que varias modificaciones o cambios en la luz de los mismos serán sugeridos a los expertos en la técnica y serán incluidos dentro del espíritu y alcance de los mismos y del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes citadas en la presente son incorporadas por este medio mediante referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente para así incorporarse por referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional del mismo, que comprende: (a) una o más regiones que determinan la complementariedad

(CDRs) de la cadena ligera (LC) seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:70; (ii) una CDR2 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:72; y (Mi) una CDR3 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:74; (b) una o más CDRs de cadena pesada (HC) seleccionadas del grupo que consiste de (i) un CDR1 de HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:76; (ii) un CDR2 de HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:78; y (iii) una CDR3 de HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:80; o (c) una o más CDRs de LC de (a) y una o más CDRs de HC de (b), en donde El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional del mismo puede específicamente unirse al polipéptido Dfck-1. 2. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 1, que comprende: (a) una o más CDRs de LC seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:70; (ii) una CDR2 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:72; y (iii) una CDR3 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:74; (b) una o más CDRs de cadena pesada (HC) seleccionadas del grupo que consiste de (i) un CDR1 HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:76; (ii) un CDR2 HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:78; y (iii) una CDR3 HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:80; o (c) una o más CDRs de LC de (a) y una o más CDRs de HC de (b).

3. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 2, que comprende: (a) una o más CDRs de LC seleccionadas del grupo que consiste de: (¡) una CDR1 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:70; (ii) una CDR2 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:72; y (iii) una CDR3 de LC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:74; (b) una o más CDRs de HC seleccionadas del grupo que consiste de (i) un CDR1 de HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:76; (ii) un CDR2 de HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:78; y (iii) una CDR3 de HC con por lo menos 80% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:80; o (c) una o más CDRs de LC de (a) y una o más CDRs de HC de (b).

4. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 3, que comprende la CDR3 de LC con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:74 o la CDR3 de HC con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:80.

5. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 4, que comprende la CDR3 de LC con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:74 y la CDR3 de HC con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:80.

6. El anticuerpo aislado o fragmento funcional de conformidad con la reivindicación 1, que comprende por lo menos dos CDRs de las CDRs listadas en (a) y (b).

7. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 6, que comprende por lo menos tres CDRs de las CDRs listadas en (a) y (b).

8. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 7, que comprende por lo menos cuatro CDRs de las CDRs listadas en (a) y (b).

9. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 8, que comprende por lo menos cinco CDRs de las CDRs listadas en (a) y (b).

10. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 9, que comprende todas las seises CDRs listadas en (a) y (b).

11. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 1, que es un anticuerpo de dominio.

12. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 1, que se disocia del polipéptido Dkk-1 con un kd de 5 x 10"4 s"1 o menor.

13. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal.

14. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 1, que es scFv, Fab, Fab' o un (Fab')2.

15. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 1, que es un humano o anticuerpo humanizado.

16. Un anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:84, 28 ó 32; (b) región variable de cadena pesada (VH) que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68; o (c) una VL de (a) y una VH de (b).

17. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 16, que consiste de dos VH idénticas y dos VL idénticas.

18. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 16, en donde la VL tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:84, 28 ó 32; y la VH tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68.

19. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 18, que consiste de dos VH idénticas y dos VL idénticas.

20. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 16, en donde la VL tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:84, 28 ó 32; y la VH tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la

SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68. 21. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 20, que consiste de dos VH idénticas y dos VL idénticas.

22. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 21, en donde la VL tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:84, 28 ó 32; y la VH tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:91, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 ó 68.

23. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 22, que consiste de dos VH idénticas y dos VL idénticas.

24. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 22, que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:82, 26, ó 30; una cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:89, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, ó 66; o una cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:82, 26, ó 30 y una cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:89, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, ó 66.

25. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 24, que consiste de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

26. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 16, que es un anticuerpo monoclonal.

27. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 16, que es un scFv, Fab, Fab' o un (Fab')2.

28. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 16, que es un humano o anticuerpo humanizado.

29. Un anticuerpo aislado ó un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que específicamente une una proteína Dkk-1 humana madura que consisten de 32-266 aminoácidos de la SEC ID NO:2, en donde el anticuerpo une a un epítope que comprende dos bucles, los bucles se forman por los enlaces de disulfuro entre los 220 y 237 aminoácidos de la SEC ID NO:2 y entre los 245 y 263 residuos de cisteína de la SEC ID NO:2.

30. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 29, que es un anticuerpo monoclonal.

31. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 29, que es un scFv, Fab, Fab' o un (FaV)2.

32. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 29, que es un humano o anticuerpo humanizado.

33. Un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que compite con un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24 para específica la unión a un polipéptido Dkk-1.

34. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 33, que compite con un anticuerpo que consiste de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, en donde las cadenas pesadas consisten de 20-465 aminoácidos de la SEC ID NO:12 y las cadenas ligeras consisten de 21-234 aminoácidos de la SEC ID NO:10.

35. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de conformidad con la reivindicación 34, que se disocia del polipéptido Dkk-1 con un kd de 5 x 10 * s"1 ó menor.

36. Un ácido nucleico que codifica (a) una CDR de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:70, 72 y/o 74; y/o (b) una CDR de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID NO:76, 78 y/o 80, en donde el ácido nucleico codifica un anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional del mismo.

37. Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la VH, VL o VH y VL del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo de conformidad con la reivindicación 16.

38. Un ácido nucleico que comprende un segmento del ácido nucleico que codifica la VH, VL o VH y VL del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo de conformidad con la reivindicación 22.

39. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 37.

40. Una célula aislada que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39.

41. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, que comprende la etapa de cultivar una célula de conformidad con la reivindicación 40.

42. Una composición que comprende un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 1 y un componente seleccionado del grupo que consiste de un amortiguador, diluyente farmacéuticamente aceptable, portador, solubilizador, emulsificador y conservador.

43. Una composición que comprende un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 16 y un componente seleccionado del grupo que consiste de un amortiguador, diluyente farmacéuticamente aceptable, portador, solubilizador, emulsificador y conservador.

44. Un método para tratar una enfermedad que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo de conformidad con la reivindicación 1, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de artritis, enfermedades sensibles para la renovación de células germinales, enfermedades inflamatorias, enfermedades neurológicas, enfermedades oculares, enfermedades renales, enfermedades pulmonares y enfermedades de la piel.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la enfermedad es artritis reumatoide, artritis psoriática y osteoartritis.

46. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la enfermedad (a) es sensible a la renovación de células madre y se selecciona del grupo que consiste de diabetes, paro cardíaco crónico y enfermedades del músculo; (b) es una enfermedad inflamatoria seleccionada del grupo que consiste de la enfermedad de Crohn, colitis y enfermedad inflamatoria del intestino; (c) es una enfermedad neurológica seleccionada del grupo que consiste de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y enfermedad de Huntington; (d) es una enfermedad ocular seleccionada del grupo que consiste de la degeneración macular y retinopatías; (e) es una enfermedad renal seleccionada del grupo que consiste de la enfermedad renal de etapa terminal, enfermedad renal crónica, glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial y nefropatía de IgA; (f) es una enfermedad pulmonar seleccionada del grupo que consiste de enfermedad pulmonar obstructora crónica, fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis enquistada; o (g) es una enfermedad de la piel resultante del daño inducido por quimioterapia al epitelio intestinal.