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TW201006485A - Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof - Google Patents

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Publication number
TW201006485A
TW201006485A TW098118463A TW98118463A TW201006485A TW 201006485 A TW201006485 A TW 201006485A TW 098118463 A TW098118463 A TW 098118463A TW 98118463 A TW98118463 A TW 98118463A TW 201006485 A TW201006485 A TW 201006485A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
disease
binding
sequence
antibody
Prior art date
Application number
TW098118463A
Other languages
English (en)
Inventor
Tariq Ghayur
Alfred Hahn
Bernhard Mueller
Original Assignee
Abbott Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41398843&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201006485(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Abbott Lab filed Critical Abbott Lab
Publication of TW201006485A publication Critical patent/TW201006485A/zh

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201006485 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於多價且多特異性結合蛋白，製備方法且具 體言之係、關於其在診斷、預防及/或治療急性及慢性發炎 疾病、癌症及其他疾病中之用途。 本申請案為主張2008年6月3曰申請的美國臨時申請案第 61/130,776號及2008年6月24日申請的美國臨時申請案第 61/132,951號之優先權的非臨時申請案，該等申請案之内 谷係以引用的方式併入本文中。 【先前技術】 工权改造蛋白（諸如能夠結合兩個或兩個以上抗原之多 特異性抗體）在此項技術中為已知的。該等多特異性結合 蛋白可使用細胞融合、化學接合或重組DNA技術來生成。 雙特異性抗體已使用四源雜交瘤技術（參見Milstein，c. 及 A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40)基於表現具 有雙特異性抗體之所需特異性之鼠類單株抗體（mAb)之兩 種不同融合瘤細胞株之體細胞融合來產生。歸因於所得雜 交-融合瘤（或四源雜交瘤）細胞株内之兩個不同免疫球蛋白 (Ig)重鏈及輕鏈之隨機配對，生成多達十個不同Ig物種， 其中僅一者為功能性雙特異性抗趙。錯誤配對之副產物之 存在及顯著地降低之產率意謂需要複雜純化程序。 雙特異性抗體亦可藉由兩個不同mAb之化學接合來產生 (參見 Staerz，U.D.等人（1985) Nature 314(6012): 628-31)。 此方法不產生均質製劑。其他方法已使用兩個不同mAb或 140653.doc 201006485 較小抗體片段之化學接合（參見Brennan，Μ.等人（1985) Science 229(4708): 81-3) 〇 用以產生雙特異性抗體之另一方法為藉由異源雙功能交 聯劑使兩個親本抗體偶合，但因為交聯劑與親本抗體之反 應不為定點的’所以所得雙特異性抗體受顯著分子非均質 性的影響。為獲得雙特異性抗體之更均質製劑，兩個不同 Fab片段已以定點方式在其欽鍵半胱胺酸殘基處經化學交 聯（參見 Glennie，M.J.等人（1987) J. Immunol. 139(7): 2367_
75)。但此方法產生Fab’2片段，而非完全igG分子。 已開發多種其他重組性雙特異性抗體格式（參見
Kriangkum，J·等人（2001) Biomol. Eng. 18(2): 31-40)。其 中，串聯單鏈Fv分子及雙功能抗體及其各種衍生物最廣泛 使用。常規地，此等分子之構築由識別不同抗原之兩個單 鏈 Fv(scFv)片段開始（參見 Economides，a.N.等人（2003)
Nat· Med· 9(1): 47-52)。串聯scFv分子（taFv)代表僅僅藉由 額外肽連接子連接兩個scFv分子之簡明格式。存在於此等 串聯scFv分子中之兩個scFv片段形成獨立摺疊實體。可使 用各種不同連接子連接兩個scFv片段且連接子具有多達^ 個殘基之長度（參見Nakanishi，K.等人（2001) Ann. Rev.
Immunol. 19: 423-74)。雖然親本％卜片段通常可呈可溶形 式表現於細菌中，然而通常觀察到串聯^以分子在細菌中 形成不溶性聚集體。因此，例行上採用再摺疊方式或使用 哺乳動物表現系統產生可溶性串聯scFv分子。在最近研究 中’有文獻報導藉由轉殖基因兔及牛在活體内表現針對 140653.doc 201006485 CD28及黑色素瘤相關蛋白聚糖之串聯scFv(參見Gracie, J.A.等人（1999) J. Clin. Invest· 104(10): 1393-401)。在此 構築體中，兩個scFv分子藉由CH1連接子連接，且發現雙 特異性抗體之血清濃度高至1 〇〇 mg/L。使用包括改變區順 序或使用具有變化長度或可撓性之中間連接子之各種策 略，以便在細菌中表現可溶性。現在已報導少數研究使用 極短Ala3連接子或長甘胺酸/富集絲胺酸之連接子，在細 菌中表現可溶性串聯scFv分子（參見Leung，B.P.等人（2〇〇〇) • J. immimol. 164(12): 6495-502 ; Ito，A.等人（2003) j. Immunol. 170(9): 4802-9 ; Kami，Α·等人（2002) J.
NeUr〇immunol, 125(1·2): 134_4〇)。在另一最近研究中使 用呈現含有3或6個殘基長度之隨機化中間連接子之串聯 scFv譜系之噬菌體，以便在細菌中富集彼等呈可溶性及活 性形式產生之分子。此方法可以分離出具有ό胺基酸殘基 連接子之串聯scFv分子。（參見Arndt，Μ.及J. Krauss (2003) φ Meth〇ds Mo1. Bi〇l· 2〇7: 3〇5-21)。尚不明確此連接子序列 是否代表串聯scFv分子之可溶性表現之通用解決方案。然 而，此研究證明，由呈現串聯scFv*子之噬菌體與定向誘 變組合時，將成為富集此等可在細菌中呈活性形式表現之 分子的強大工具。 雙特異性雙功能抗體（Db)利用雙功能抗體格式以便表 現。雙功能抗體藉由將連接VH與VL區之連接子之長度減 小至約5個殘基而自scFv片段產生（參見Peipp，M及τ
Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4): 507-11)。連接 140653.doc 201006485 子尺寸之此減小有助於藉由VH與VL區之交越配對而使兩 個多肽鏈二聚化。雙特異性雙功能抗體藉由在同一細胞内 表現具有結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL構型）或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH構型）之兩個多肽鏈而產生。過去 已產生廣泛多種不同雙特異性雙功能抗體且其中大多數以 可溶形式表現於細菌中。然而，最近比較研究證明可變區 之定向可影響活性結合位點之表現及形成（參見Mack，M. 等人（1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92(15): 7021-5)。 然而，細菌中之可溶性表現代表優於串聯scFv分子之重要 優勢。然而，因為兩個不同多肽鏈表現於單一細胞内，所 以非活性均二聚體可與活性雜二聚體一起產生。此使執行 額外純化步驟以便獲得雙特異性雙功能抗體之均質製劑成 為必需。強制生成雙特異性雙功能抗體之一方法為產生孔 洞中之瘤節式（knob-into-hole)雙功能抗體。（參見Holliger, P.，T. Prospero，及 G. Winter (1993) Proc· Natl. Acad. Sci. U S A 90(14): 6444-8.18)。此方法對於針對 HER2 及 CD3 之 雙特異性雙功能抗體而言經證明。在抗HER2或抗CD3可變 區中，藉由以Phe交換Val37且以Trp交換Leu45而將較大瘤 節引入VH區中且藉由使Phe98突變至Met且使Tyr87突變至 Ala而在VL區中產生互補孔洞。藉由使用此方法，雙特異 性雙功能抗體之產生可自藉由親本雙功能抗體之72%增加 至藉由孔洞中之瘤節式雙功能抗體之90%以上。重要地， 產率由於此等突變僅稍微減少。然而，觀察到若干構築體 之抗原結合活性降低。因此，此相當精密之方法需要分析 140653.doc 201006485 各種構築體以便識別產生具有不變結合活性之雜二聚分子 之彼等突變。另外，此方法需要恆定區域處之免疫球蛋白 序列之突變修飾，因此產生非原生且非天然形式之抗體序 列，其可能導致增加之免疫原性、較差之活體内穩定性以 及不當藥物代謝動力學。 單鏈雙功能抗體（scDb)代表改良雙特異性雙功能抗體狀 分子之形成的替代策略（參見Holliger，P.及G. Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30 ； Wu, A.M. 等人（1996) Immunotechnology 2(1):第 21-36頁）。雙特異 性單鏈雙功能抗體藉由以具有約15個胺基酸殘基之長度之 額外中間連接子連接兩個形成雙功能抗體之多肽鏈而產 生。因此，具有與單體單鏈雙功能抗體對應之分子量（50-60 kDa)之所有分子為雙特異性的。若干研究已證明雙特 異性單鏈雙功能抗體在細菌中以可溶及活性形式表現，且 大多數經純化之分子以單體形式存在（參見Holliger，P.及 G. Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30 ; Wu, Α·Μ.等人（1996) Immunotechnol. 2(1): 21-36 ； Pluckthun, A.及 P. Pack (1997) Immunotechnol. 3(2): 83-105 ; Ridgway，J.B.等人（1996) Protein Engin. 9(7): 617-21) ^因此，單鏈雙功能抗體將串聯scFv(所有單體為雙特 異性的）與雙功能抗體（在細菌中可溶性表現）之優勢組合。 新近地，雙功能抗體已與Fc融合以生成更多Ig狀分子， 其命名為二雙功能抗體（參見Lu, D.等人（2004) J. Biol. Chem. 279(4): 2856-65)。另外，已描述在IgG之重鏈中包 140653.doc 201006485 含兩個Fab重複序列且能夠結合四個抗原分子之多價抗體 構築體（參見WO 〇177342ai，及河山吒κ等人（2〇〇3) j Immunol. 170(9): 4854-61) ° 在此項技術中存在對於能夠結合兩個或兩個以上抗原之 經改良之多價結合蛋白的需要。美國專利申請案第 11/507,050號提供能夠以高親和力結合兩個或兩個以上抗 原之結合蛋白之新穎家族，其稱為雙可變區免疫球蛋白 (DVD-Ig )。本發明提供能夠結合兩個或兩個以上抗原之 其他新穎結合蛋白。 【發明内容】 本發明係關於能夠結合兩個或兩個以上抗原之多價結合 蛋白。本發明提供能夠以高親和力結合兩個或兩個以上抗 原之結合蛋白之新穎家族。 在一實施例中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白，其 中多肽鏈包含VDl-(Xl)n_VD2_c_(X2)n，其中VDi為第一 可變區，VD2為第二可變區，c為恆定區，幻代表胺基酸 或多肽，X2代表Fc區域且n為〇或1。在一實施例中結合 蛋白中之VD1及VD2為重鏈可變區。在另一實施例中，重 鏈可變區係選自由以下各者組成之群：鼠類重鏈可變區、 人類重鏈可變區、CDR移植重鏈可變區及人源化重鏈可變 區。在另一實施例中，VD1及VD2能夠結合相同抗原。 在另一實施例中VD1及VD2能夠結合不同抗原。在另_ 實施例中’ C為重鏈恒定區。例如，χι為連接子其限 制條件為XI不為CH1。例如，χι為選自由以下各者組成 140653.doc 201006485 之群之連接子：AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 1)、 AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2)、AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4)、 SAKTTP(SEQ ID NO: 5)、RADAAP(SEQ ID NO: 6)、 RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8) 、RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9)、 SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10)、ADAAP(SEQ ID NO: 11) 、ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12)、 TVAAP(SEQ ID NO: 13)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14)、QPKAAP(SEQ ID NO: 15)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16)、AKTTPP(SEQ ID NO: 17)、AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18)、AKTTAP(SEQ ID NO: 19)、AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20)、ASTKGP(SEQ ID NO: 21)、ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23)、 GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24)、GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25)及 GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26)。在一實施例中，X2為Fc區域。在另一實施例中，X2 為變異Fc區域。 在一實施例中，本文中揭示之結合蛋白包含多肽鏈，其 中多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為第一 重鏈可變區，VD2為第二重鏈可變區，C為重鏈恆定區， XI為連接子，其限制條件為其不為CH1，且X2為Fc區域。 在一實施例中，結合蛋白中之VD1及VD2為輕鏈可變 區。在一實施例中，輕鏈可變區係選自由以下各者組成之 140653.doc -9· 201006485 群：鼠類輕鏈可變區、人類輕鏈可變區、CDR移植輕鏈可 變區及人源化輕鏈可變區。在一實施例中，VD1及VD2能 夠結合相同抗原。在另一實施例中，VD1及VD2能夠結合 不同抗原。在一實施例中，C為輕鏈恆定區。在另一實施 例中，XI為連接子，其限制條件為XI不為CL1。在一實施 例中，XI為選自由以下各者組成之群之連接子： AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 1) ' AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3)、 SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4)、SAKTTP(SEQ ID NO: 5)、 O RADAAP(SEQ ID NO: 6)、RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7)、 RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8)、RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10)、 ADAAP(SEQ ID NO: 11) ' ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12)、TVAAP(SEQ ID NO: 13)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14)、QPKAAP(SEQ ID NO: 15)、QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) 、 AKTTPP(SEQ ID NO: 17)、 ❹ AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18)、AKTTAP(SEQ ID NO: 19)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO: 20)、ASTKGP (SEQ ID NO: 21)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22)、 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23)、GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO: 25) 及 GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26)。在一實施例 中，結合蛋白不包含X2。 在一實施例中，可變重鏈及可變輕鏈包含相同連接子。 140653.doc •10· 201006485 在另一實施例中，可變重鏈及可變輕鏈包含不同連接子。 在另f施例中’可變重鏈及可變輕鍵包含短（約6個胺基 酸）連接子。在另-實施例中，彳變重鏈及可變輕鍵包含 長（多於6個胺基酸）連接子。在另一實施例中，可變重鏈包 含短連接子且可變輕鏈包含長連接子。在另—實施例中， 可變重鏈包含長連接子且可變輕鏈包含短連接子。 在-實施例中’本文中揭示之結合蛋白包含多肽鏈，其 中該多肽鏈包含VD1_(X1)n_VD2_c_(X2)n，其中vm為第 一輕鏈可變區，VD2為第二輕鏈可變區，c為輕鏈恆定 區，XI為連接子，其限制條件為其不為CH1，且χ2不包含 Fc區域。 在另一實施例中，本發明提供包含兩個多肽鏈之結合蛋 白，其中該第一多肽鏈包含VD1_(xl)n_VD2C(X2)n，其 中VD1為第一重鏈可變區，VD2為第二重鏈可變區，c為 重鏈恆定區，XI為連接子，其限制條件為其不為chi，且 X2為Fc區域；且該第二多肽鏈包含VDi_(xi)n_v⑴ (X2)n，其中VD1為第一輕鏈可變區，VD2為第二輕鏈可變 區，C為輕鏈恆定區，X1為連接子，其限制條件為其不為 CH1，且X2不包含Fc區域。在一特定實施例中，雙可變區 (DVD)結合蛋白包含四個多肽鏈，其中前兩個多肽鏈分別 包含VDl-(Xl)n_VD2心(χ2)η ’其中彻為第一重鏈可變 區，VD2為第二重鏈可變區’ c為重鏈恆定區，幻為連接 子，其限制條件為其不為CH1，且X2gFc區域；且另兩個 多肽鏈分別包含VD1_(xl)n_VD2_c_(X2)ri，其中VD1為第 140653.doc • 11 - 201006485 一輕鏈可變區，VD2為第二輕鏈可變區，C為輕鏈恆定 區，XI為連接子，其限制條件為其不為CH1，且X2不包含 Fc區域。此雙可變區（DVD)蛋白具有四個抗原結合位點。 在另一實施例中，本文中揭示之結合蛋白能夠結合一或 多個標乾。在一實施例中，標把係選自由以下各者組成之 群：細胞激素、細胞表面蛋白、酶及受體。在另一實施例 中，結合蛋白能夠調節一或多個標靶之生物功能。在另一 實施例中，結合蛋白能夠中和一或多個標靶。本發明之結 合蛋白能夠結合選自由淋巴介質、單核球激素、多肽激 © 素、受體或腫瘤標記物組成之群之細胞激素。例如，本發 明之DVD-Ig能夠結合以下中之兩者或兩者以上：澱粉狀 蛋白β(Αβ)(序列1)、Αβ(序列2)、Αβ(序列3)、腫瘤壞死因 子a(TNF-a)、介白素Ιβ(Ιί-Ιβ)、胰島素樣生長因子 1(IGF1)、騰島素樣生長因子2(IGF2)、介白素18(IL-18)、 介白素6(IL-6)、晚期糖基化終產物受體（RAGE)、神經生 長因子（NGF)、表皮生長因子受體（EGFR)(序列1)、 EGFR(序列2)、CD-20及排斥性導引分子（RGMA)(亦參見 W 表2)。在一特定實施例中，結合蛋白能夠結合選自由以下 各者組成之群之標靶對：Αβ(序列1)與Αβ(序列3)、TNF-a 與Αβ(序列2)、IL-Ιβ與Αβ(序列2)、Αβ(序列1)與Αβ(序列 2)、IGF1，2 與 Αβ(序列 2)、Αβ(序列 2)與 IL-18、IL-6 與 Αβ(序列 2)、TNF-a 與 Αβ(序列 3)、IL-Ιβ 與 Αβ(序列 3)、 Αβ(序列1)與Αβ(序列3)、IGF1,2與Αβ(序列3)、Αβ(序列3) 與 IL-18、IL-6與 Αβ(序列 3)、TNF-a與 Αβ(序列 1)、IL-Ιβ與 140653.doc -12- 201006485 Αβ(序列 1)、IGF1，2與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1)與 IL-18、IL-6與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1)與 RAGE、NGF與 IL-18、NGF與 IL-Ιβ、NGF 與 IL-6、TNF-α 與 EGFR(序列 2)、TNF-ct 與 RAGE、CD-20 與 EGFR(序列 1)、CD-20 與 EGFR(序列 2)、 RGMA與 TNF-α(參見實例 2.1 至 2.27)。 在一實施例中，能夠結合Αβ(序列1)及Αβ(序列3)之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 62及SEQ ID NO· 64組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 63及SEQ ID NO. 65組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，能 夠結合Αβ(序列1)及Αβ(序列3)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 62之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 63之DVD輕鏈胺基 酸序列。在另一實施例中，能夠結合Αβ(序列1)及Αβ(序列3) 之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 64之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 65之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF-α及Αβ(序列2)之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 66及SEQ ID NO. 68組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 67及SEQ ID NO. 69組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合TNF-a及Αβ(序列2)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 66之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 67之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF-a及Αβ(序列2) 之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 68之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 69之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合IL-Ιβ及Αβ(序列2)之結合蛋白 140653.doc • 13· 201006485 包含選自由SEQ ID NO. 70及SEQ ID NO. 72組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 71及SEQ ID NO. 73組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合IL-Ιβ及Αβ(序列2)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 70 之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 71之DVD輕鏈胺基 酸序列。在另一實施例中，能夠結合IL-Ιβ及Αβ(序列2)之 結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 72之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 73之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合Αβ(序列1)及Αβ(序列2)的結合 蛋白包含選自由SEQ ID NO. 74及SEQ ID NO. 76組成之群 的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 75及SEQ ID NO. 77組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合Αβ(序列1)及Αβ(序列2)的結合蛋白包含SEQ ID NO. 74之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 75之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合Αβ(序列1) 及Αβ(序列2)的結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 76之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 77之DVD輕鏈胺 基酸序列。 在一實施例中，能夠結合IGF1,2及Αβ(序列2)之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 78及SEQ ID NO. 80組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 79及SEQ ID NO. 8 1組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合IGF 1,2及Αβ(序列2)之結合蛋白包含SEQ ID NO-78 之 DVD 重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 79 之 DVD 輕鏈胺 140653.doc -14- 201006485 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合IGFl,2及Αβ(序列 2)之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 80之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 81之DVD輕鏈胺基酸序 列。 在一實施例中，能夠結合Αβ(序列2)及IL-18之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 82及SEQ ID NO. 84組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 83及SEQ ID NO. 85組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中’ 能夠結合Αβ(序列2)及IL-18之結合蛋白包含SEQ ID NO. 82 之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 83之DVD輕鍵胺基 酸序列。在另一實施例中，能夠結合Αβ(序列2)及IL-18之 結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID Ν〇. 84之DVD重鍵 胺基酸序列及SEQ ID NO: 85之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合IL-6及Αβ(序列2)的結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 86及SEQ ID NO. 88組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ NO. 87及SEQ ID NO. 89組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中’ 能夠結合IL-6及Αβ(序列2)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 86 之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID N0: 87之DVD輕鏈胺基 酸序列。在另一實施例中，能夠結合IL-6及Αβ(序列2)之結 合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 88之DVD重鏈胺 基酸序列及SEQ ID NO: 89之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF_a及Αβ(序列3)之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 90及SEQ ID NO. 92組成之群的 140653.doc 15 201006485 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 91及SEQ ID NO. 93組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合TNF-ct及Αβ(序列3)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 90之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 91之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF-α及Αβ(序列3) 之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 92之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 93之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合IL-Ιβ及Αβ(序列3)之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 94及SEQ ID NO. 96組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO· 95及SEQ ID NO. 97組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合IL-Ιβ及Αβ(序列3)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 94 之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO·· 95之DVD輕鏈胺基 酸序列。在另一實施例中，能夠結合IL-Ιβ及Αβ(序列3)之 結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 96之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 97之DVD輕鏈胺基酸序列。
在一實施例中，能夠結合Αβ(序列1)及Αβ(序列3)之結合 蛋白包含選自由SEQ ID NO. 98及SEQ ID NO. 100組成之 群的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 99及 SEQ ID NO. 101組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實 施例中，能夠結合Αβ(序列1)及Αβ(序列3)的結合蛋白包含 SEQ ID NO. 98之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 99之 DVD輕鏈胺基酸序列。在另一實施例+，能夠結合Αβ(序 列1)及Αβ(序列3)的結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID 140653.doc -16- 201006485
NO. 100之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 101之DVD 輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合IGF1，2及Αβ(序列3)之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 102及SEQ ID NO. 104組成之群 的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 103及SEQ ID NO. 105組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合IGF1,2及Αβ(序列3)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 102之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 103之DVD ® 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合IGF 1,2及 Αβ(序列3)之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 104之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 105之DVD輕鏈 胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合Αβ(序列3)及IL-18之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 106及SEQ ID NO. 108組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 107及SEQ ID NO. 109組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 ❿ 中，能夠結合Αβ(序列3)及IL-18之結合蛋白包含SEQ ID NO. 106之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 107之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合Αβ(序列3) 及IL-18之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 108之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 109之DVD輕鏈胺基酸 序列。 在一實施例中，能夠結合IL-6及Αβ(序列3)的結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 110及SEQ ID NO. 112組成之群的 140653.doc •17- 201006485 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. Ill及SEQ ID NO. 113組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合IL-6及Αβ(序列3)的結合蛋白包含SEQ ID NO. 110之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 111之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合IL-6及 Αβ(序列3)的結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 112之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 113之DVD輕鏈 胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF-α及Αβ(序列1)之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 114及SEQ ID NO. 116組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 115及SEQ ID NO. 117組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF-α及Αβ(序列1)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 114之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 115之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF-α及 Αβ(序列1)之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 116之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 117之DVD輕鏈 胺基酸序列。
在一實施例中，能夠結合IL-Ιβ及Αβ(序列1)之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 118及SEQ ID NO. 120組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 119及SEQ ID NO. 12 1組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合IL-Ιβ及Αβ(序列1)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 118之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 119之DVD 140653.doc -18- 201006485 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合IL-Ιβ及 Αβ(序列1)之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 120之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 121之DVD輕鏈 胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合IGF1，2及Αβ(序列1)的結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 122及SEQ ID NO. 124組成之群 的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 123及SEQ ID NO_ 125組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 ® 中，能夠結合IGF1，2及Αβ(序列1)的結合蛋白包含SEQ ID NO. 122之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 123之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合IGF 1,2及 Αβ(序列1)的結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 124之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 125之DVD輕鏈 胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合Αβ(序列1)及IL-18的結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 126及SEQ ID NO. 128組成之群的 Φ DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 127及SEQ ID NO. 129組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合Αβ(序列1)及IL-18的結合蛋白包含SEQ ID NO. 126之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 127之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合Αβ(序列1) 及IL-18的結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 128之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 129之DVD輕鏈胺基酸 序列。 140653.doc -19· 201006485 在一實施例中，能夠結合IL-6及Αβ(序列1)的結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 130及SEQ ID NO. 132組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 131及SEQ ID NO. 133組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合IL-6及Αβ(序列1)的結合蛋白包含SEQ ID NO. 130之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 131之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合IL-6及 Αβ(序列1)的結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 132之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 133之DVD輕鏈 胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合Αβ(序列1)及RAGE之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 134及SEQ ID NO. 136組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 135及SEQ ID NO. 137組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合Αβ(序列1)及RAGE之結合蛋白包含SEQ ID NO. 134之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 135之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合Αβ(序列1) 及RAGE之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 136 之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 137之DVD輕鏈胺基 酸序列。 在一實施例中，能夠結合NGF及IL-18之結合蛋白包含 選自由SEQ ID NO. 138及SEQ ID NO. 140組成之群的DVD 重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 139及SEQ ID NO. 141組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，能 140653.doc -20- 201006485 夠結合NGF及IL-18之結合蛋白包含SEQ ID NO. 138之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 139之DVD輕鏈胺基酸序 列。在另一實施例中，能夠結合NGF及IL-18之結合蛋白具 有反向取向且包含SEQ ID NO. 140之DVD重鏈胺基酸序列 及SEQ ID NO: 141之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合NGF及IL-Ιβ之結合蛋白包含 選自由SEQ ID NO. 142及SEQ ID NO. 144組成之群的DVD 重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 143及SEQ ID NO. ❿ 145組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，能 夠結合NGF及IL-Ιβ之結合蛋白包含SEQ ID NO. 142之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 143之DVD輕鏈胺基酸序 列。在另一實施例中，能夠結合NGF及IL-1 β之結合蛋白具 有反向取向且包含SEQ ID NO. 144之DVD重鏈胺基酸序列 及SEQ ID NO: 145之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合NGF及IL-6之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 146及SEQ ID NO. 148組成之群的DVD重 ❹ 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 147及SEQ ID NO-149組成 之群的 DVD輕鏈 胺基酸 序列。 在一實 施例中 ，能 夠結合NGF及IL-6之結合蛋白包含SEQ ID NO. 146之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO·· 147之DVD輕鏈胺基酸序 列。在另一實施例中，能夠結合NGF及IL-6之結合蛋白具 有反向取向且包含SEQ ID NO. 148之DVD重鏈胺基睃序列 及SEQ ID NO: 149之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF-α及EGFR(序列2)之結合 140653.doc -21- 201006485 蛋白包含選自由SEQ ID NO. 150及SEQ ID NO. 152組成之 群的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 1 5 1及 SEQ ID NO. 153組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實 施例中，能夠結合TNF-α及EGFR(序列2)之結合蛋白包含 SEQ ID NO. 150之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 151 之DVD輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF-a及EGFR(序列2)之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 152之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 153之DVD 輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF-a及RAGE之結合蛋白包 含選自由SEQ ID NO. 154及SEQ ID NO. 156組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 155及SEQ ID NO. 157組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF-a及RAGE之結合蛋白包含SEQ ID NO. 154之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 155之DVD輕鏈 胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF-a及RAGE 之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 156之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 157之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合CD-20及EGFR(序列1)之結合 蛋白包含選自由SEQ ID NO. 158及SEQ ID NO. 160組成之 群的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 159及 SEQ ID NO. 161組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實 施例中，能夠結合CD-20及EGFR(序列1)之結合蛋白包含 SEQ ID NO. 158之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 159 140653.doc -22- 201006485 之DVD輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合CD-20及EGFR(序列1)之結合蛋白具有反向取向且包含SEQ ID NO. 160之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 161之DVD 輕鏈胺基酸序列β 在一實施例中，能夠結合CD-20及EGFR(序列2)之結合 蛋白包含選自由SEQ ID NO. 162及SEQ ID NO. 164組成之 群的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 163及 SEQ ID NO. 165組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實 # 施例中，能夠結合CD-20及EGFR(序列2)之結合蛋白包含 SEQ ID NO. 162之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 163 之DVD輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合CD-20 及 EGFR(序列 2) 之結 合蛋白 具有反向取向且包含 SEQ ID NO. 164之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 165之DVD 輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合RGMA及TNF-α之結合蛋白包 含選自由SEQ ID NO. 166及SEQ ID NO. 168組成之群的 ^ DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO· 167及SEQ ID NO. 169組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合RGMA及TNF-a之結合蛋白包含SEQ ID NO. 166之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 167之DVD輕鏈 胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合RGMA及TNF-a 之結合蛋白具有反向取向且包含SEQiD NO· 168之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 169之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白， 140653.doc -23· 201006485 其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中：vm 為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一重鍵可變 區，VD2為自第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一 重鏈可變區；C為重鏈恆定區；（X1)n為連接子，其限制條 件為其不為CH1，其中該（χι)η#在或不存在；且（χ2)η為 Fc區域’其中該（Χ2)η存在或不存在。在一實施例中，& 區域不存在於該結合蛋白中。 在另一實施例中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白， 其中該多肽鏈包含VDl_(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中：VD1❹ 為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈可變 區，VD2為自第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二 輕鏈可變區；C為輕鏈恆定區；（X1)n為連接子，其限制條 件為其不為CH1，其中該（X1)n存在或不存在；且（χ2)η不 包含Fc區域，其中該（Χ2)η存在或不存在。在一實施例 中，（Χ2)η不存在於結合蛋白中。 在另一實施例中，本發明之結合蛋白包含第一及第二多 肽鏈，其中該第一多肽鏈包含第一 vD1_(xl)n_VD2_c_ ® (Χ2)η，其中VD1為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲 得之第一重鏈可變區；VD2為自第二親本抗體或其抗原結 合部分獲得之第二重鏈可變區；〇為重鏈恆定區；（χι)η為 連接子，其限制條件為其不為CH1，其中該（χι)η存在或不 存在；且（Χ2)η為Fc區域，其中該（又2)11存在或不存在；且 其中該第二多肽鏈包含第二VDi_(xi)n_vD2-C-(X2)n，其 中VD1為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕 140653.doc •24· 201006485 鏈可變區，VD2為自第二親本抗體或其抗原結合部分獲得 之第二輕鏈可變區；C為輕鏈恆定區；（χ1)η為連接子，其 限制條件為其不為CH1，其中該（χ1)η存在或不存在；且 (Χ2)η不包含Fc區域，其中該（χ2)η存在或不存在。在另一 實施例中’結合蛋白包含兩個第一多肽鏈及兩個第二多肽 鏈。在另一實施例中’（Χ2)η不存在於第二多肽中。在另 一實施例中’右F c區域存在於第一多肽中.，則其係選自由 原生序列Fc區域及變異序列j7c區域組成之群。在另一實施 例中，Fc區域係選自由來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、
IgA、IgM、IgE及IgD之Fc區域組成之群。 在另一實施例中，本發明之結合蛋白為能夠結合兩個抗 原之包含四個多肽鏈之DVD_Ig，其中第一及第三多肽鏈 包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中：VD1為自第一親本 抗體或其抗原結合部分獲得之第一重鍵可變區；VD2為自 第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變區； C為重鍵值定區；（又1)11為連接子，其限制條件為其不為 CH1，其中該（χΐ)η存在或不存在；且（乂2)11為1^區域，其 中該（Χ2)η存在或不存在；且其中第二及第四多肽鏈包含 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n ’其中：VD1為自第一親本抗體 或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈可變區；VD2為自第二 親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變區；C為 輕鏈恆定區；（Xl)n為連接子，其限制條件為其不為^⑴， 其中該（Xl)n存在或不存在；且（χ2)η不包含Fc區域，其中 該（X2)n存在或不存在。 140653.doc -25- 201006485 本發明提供一種藉由預選親本抗體來製造DVD-Ig結合 蛋白之方法。在一實施例中，製造能夠結合兩個抗原之雙 可變區免疫球蛋白之方法包含以下步驟：a)獲得能夠結合 第一抗原之第一親本抗體或其抗原結合部分；b)獲得能夠 結合第二抗原之第二親本抗體或其抗原結合部分；勹構築 包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n之第一及第三多肽鏈，其中 VD1為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一重鍵 可變區，VD2為自第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之 第二重鏈可變區；C為重鏈恆定區；（χι)η為連接子，其限 制條件為其不為CH1，其中該（Χ1)η存在或不存在；且 (Χ2)ηΛΡε區域，其中該02)11存在或不存在；d)構築包含 ν〇1-(χ1)η_νΐ)2_(：-(Χ2)η之第二及第四多肽鏈，其中ν〇ι 為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈可變 區，VD2為自第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一 輕鏈可變區；C為輕鏈恆定區；（X1)n為連接子，其限制條 件為其不為CH1 ’其中該（X1)n存在或不存在；且不 包含Fc區域，其中該（Χ2)η存在或不存在；幻表現該第一多 肽鏈、該第二多肽鏈、該第三多肽鏈及該第四多肽鏈以 使得生成能夠結合該第一抗原及該第二抗原之雙可變區免 疫球蛋白。 在另一實施例中，本發明提供一種生成具有所需性質之 能夠結合兩個抗原之雙可變區免疫球蛋白之方法，其包含 以下步驟：a)獲得第一親本抗體或其抗原結合部分，、=能 夠結合第一抗原且擁有至少一種藉由雙可變區免疫球蛋白 140653.doc -26- 201006485 所展現之所需性質；b)獲得第二親本抗體或其抗原結合部 刀其此夠、纟0合第一抗原且擁有至少一種藉由雙可變區免 疫球蛋白所展現之所需性f ; e)構築包MDi_(xi)n_vD2_ C (X2)n之第-及第二多肽鏈，其中：vdi為自第一親本 抗體或其抗原結合部分獲得之第一重鍵可變區；為自 第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變區； C為重鏈g疋區’⑻）n為連接子纟限制條件為其不為 CH1，其中該（Xl)n存在或不存在；且（X2)I^Fc區域，其 ❿中該（X2)n存在或不存在；d)構築包含VD1_(xl)n_VD2心 (X2)n之第二及第四多肽鏈，其中：乂出為自第一親本抗 體或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈可變區；VD2為自第 一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變區；匸 為輕鏈恆定區；（χι)η為連接子，其限制條件為其不為 CH1 ’其中該（χ1)η存在或不存在；且（χ2)η不包含以區 域，其中該（Χ2)η存在或不存在；e)表現該第一多肽鏈該 •第二多肽鏈、該第三多肽鏈及該第四多肽鏈，以使得生成 具有所需性質之能夠結合該第一及該第二抗原之雙可變區 免疫球蛋白。 在一實施例中，本文中揭示之第一及第二多肽鏈之VD1 自相同親本抗體或其抗原結合部分獲得。在另一實施例 中’本文中揭示之第一及第二多肽鏈之VD1自不同親本抗 體或其抗原結合部分獲得。在另一實施例中，本文中揭示 之第一及第二多肽鏈之VD2自相同親本抗體或其抗原結合 部分獲得。在另一實施例中’本文中揭示之第一及第二多 140653.doc -27- 201006485 肽鏈之彻自不同親本抗體或其抗原結合部分獲得β 在實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分與第二 親本抗體或其抗原結合部分為相同抗體。在另—實施例 中，第一親本抗體或其抗原結合部分與第：親本抗體或其 抗原結合部分為不同抗體。 在-實施例中，第-親本抗體或其抗原結合部分結合第 -抗原且第二親本抗體或其抗原結合部分結合第二抗原。 在-狀實施例中，第-與第二抗原為相同抗原。在另一 實施例中，親本抗體結合相同抗原上之不同抗原衫基。❹ 在另貝施例中’第一與第二抗原為不同抗原。在另一實 施例中第親本抗體或其抗原結合部分以不同於第二親 本抗體或其抗原結合部分結合第二抗原之效能之效能結合 第一抗原。在另一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合 部分以不同於第二親本抗體或其抗原結合部分結合第二抗 原之親和力之親和力結合第一抗原。 在另一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分及第 一親本抗體或其抗原結合部分係選自由人類抗體、€1：)11移® 植抗體及人源化抗體組成之群。在一實施例中，抗原結合 部分係選自由以下各者組成之群：Fab片段、F(ab，）2片 段、包含藉由鉸鏈區域處之雙硫橋鍵聯之兩個Fab片段的 二價片段；由VH及CH1區組成的Fd片段；由抗體之單臂之 VL及VH區組成之Fv片段、dAb片段、經分離之互補決定 區域（CDR)、單鏈抗體及雙功能抗體。 在另一實施例中’本發明之結合蛋白擁有第一親本抗體 140653.doc • 28 - 201006485
5、其抗原、纟D σ σ卩分或第二親本抗體或其抗原結合部分所展 現之至j一種所需性質。或者，第一親本抗體或其抗原結 π °卩刀及第二親本抗體或其抗原結合部分擁有雙可變區免 疫球蛋白所展現之至少一種所需性質。在一實施例中，所 需f質選自或多個抗體參數。在另一實施例中，抗體參 數係選自由以下各輕叙群：抗料異性、與抗原之親 和力、效能、生物功能、抗原決定基識別性、穩定性、溶 解性、生產效率、免疫原性、藥物代謝動力學、生物可用 性、組織交叉反應性及直系同源性抗原結合性。在一實施 例中，結合蛋白為多價的。在另—實施例+，結合蛋白為 多特異性的。本文中描述之多價及或多特異性結合蛋白具 有尤其自治療觀點而言之所需性質。例如，多價及或多特 異性結合蛋白可⑴比二價抗體更快地藉由表現抗體所結合 之抗原之細胞内在化（及/或分解代謝）；（2)為促效抗體； 及/或（3)誘導表現多價抗體能夠結合之抗原t細胞之細胞 死亡及/或細胞凋亡。提供多價及或多特異性結合蛋白之 至少-種抗原結合特異性之「親本抗體」可為藉由表現抗 體所結合之抗原之細胞内在化（及/或分解代謝）之一抗體； 且/或可為促效抗體、誘導細胞死亡之抗體及/或誘導細胞 凋亡之抗體，且如本文中描述之多價及或多特異性結合蛋 白可顯示此等性質中之一或多者之改良。另外，親：：體 可缺乏此等性質中之任一或多者，但當構築為如本文中描 述之多價結合蛋白時可被賦予該等性質。 在另-實施例中，本發明之結合蛋白具有如藉由表面電 140653.doc •29· 201006485 漿共振所量測之選自由以 乾之結合鱗f數(KQn):至少物與—或多個標 至少約Η)、-! 乂约10 M s,、至少約WM-V、 一二⑽M s、至少賴5m^至少約μ心」。在 施例中’本發明之結合蛋白具有如藉由表面 所量測之與-或多個標乾之結合速率 ::1 與51〇 Μ·ν之間、一… 10 Μ-S-丨之間或105M-V1與1〇6m.v丨之間。 、 ，另-實施例中’結合蛋白具有如藉由表面電漿共振所 測之選自由以下各者組成之群之與—或多個躲之脫離 速率常數（Koff)，其為至多約10·3,、至多約10·4〆、至 多約10.5’及至多約H)W在一實施例t，本發明之結 合蛋白具有如藉由表面電漿共振所量測之與一或多個標靶 之脫離速率常數(Koff)，其為 10-3 8“至1〇-4 s_,、1〇·4 s_^i〇 5 s^ 或 10·5 S·1 至 1〇·6 S·1。 在另一實施例中，結合蛋白具有選自由以下各者組成之 群之與一或多個標靶之解離常數（Kd):至多約1〇_7 M、至 多約ΙΟ·8 Μ、至多約ΙΟ-9 Μ、至多約1〇-ι〇 M、至多約1〇-„ M、❹ 至多約1〇-12 Μ及至多約ίο·13 M。在一實施例中，本發明之 結合蛋白具有ΗΓ7 Μ至1〇·8 μ、ΙΟ·8 Μ至ΙΟ·9 Μ、1〇_9 μ至 ΙΟ.1。Μ、ΙΟ·1。Μ至 10·11 Μ、ΙΟ.11 Μ至 10_12 Μ或 1〇」2 厘至 ίο·13 Μ之與其標靶之解離常數（KD) 〇 在另一實施例中’本文中描述之結合蛋白為進一步包含 選自由免疫黏附分子、顯像劑、治療劑及細胞毒性劑組成 之群之藥劑的接合物。在一實施例中，顯像劑係選自由以 140653.doc -30- 201006485 下各者組成之群：放射性標記、酶、螢光標記、發光標 圯、生物發光標記、磁性標記及生物素。在另一實施例 中’顯像劑為選自由以下各者組成之群之放射性標記： Η、14C、35S、90Y、99Tc、lllIn、丨25j、13 1J、I77Lu、166H〇 n I53 及 Sm。在另一實施例中’治療劑或細胞毒性劑係選自 由以下各者組成之群：抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長 因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴 素、毒素及細胞凋亡劑。 在另一實施例中’本文中描述之結合蛋白為結晶結合蛋 白且以晶體形式存在。在一實施例中，晶體為無載劑之醫 藥控制釋放晶體。在另一實施例中，結晶結合蛋白具有比 該結合蛋白之可溶性對應物更大之活體内半衰期。在另一 實施例中’結晶結合蛋白保留生物活性。 在另一實施例中’本文中描述之結合蛋白為糖基化的。 例如’糖基化作用為人類糖基化模式。 本發明之一態樣係關於編碼本文中揭示之結合蛋白之任 一者之經分離核酸。另一實施例提供包含本文中揭示之經 分離核酸之載體，其中該載體係選自由以下各者組成之 群：pcDNA、pTT(Durocher 等人 jc沾心卿以 2002，第30卷，第2期）、pTT3(具有額外多個選殖位點之 pTT)、pEFBOS(Mizushima，S.及Nagata，S·，（1990) iVwc/价 aci办 第 18卷，第 17期）、pBV、pJV、PcDNA3.1 TOPO、PEF6 TOPO及PB J。在一實施例中，載體為揭示於 美國專利申請案第61/021,282號中之載體。 140653.doc -31- 201006485 在另一態樣中，將宿主細胞以本文中揭示之載體轉型。 在一實施例中，宿主細胞為原核細胞。在另一實施例中， 宿主細胞為大腸桿菌（E.Coli)。在一相關實施例中，宿主 細胞為真核細胞。在另一實施例中，真核細胞係選自由原 生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。 在另一實施例中’宿主細胞為哺乳動物細胞（包括（但不限 於）CH0、COS、NS0、SP2、PER.C6)或真菌細胞（諸如釀 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))或昆蟲細胞（諸如 Sf9)。 在一實施例中，在單一重組性宿主細胞中產生（例如）具❹ 有不同特異性之兩個或兩個以上DVD-Ig。例如，抗體混 合物之表現已稱為 〇ligOCI〇nicsTM，（Merus B.v，The Netherlands)美國專利第 7,262,〇28號、第 7 429 486號。 本發明之另一態樣提供一種產生本文中揭示之結合蛋白 之方法，其包含在培養基中在足以產生結合蛋白之條件下
蛋白。 一實施例提供一 種釋放結合蛋白之組合物，
選自由以下各者組成之群之一 口贫曰之組合物，其中組合物 L含如本文中揭示之結晶結合 民劑。舉例而言，聚合載劑為 一或多者之聚合物：聚（丙烯 140653.doc •32· 201006485 酸）、聚（氰基丙烯酸酯）、聚（胺基酸）、聚（酸酐）、聚（縮 肽）、聚（酯）、聚（乳酸）、聚（乳酸-共-乙醇酸）或PLGA、聚 (b-羥基丁酸酯）、聚（己内酯）、聚（二氧雜環己酮）、聚（乙 二醇）、聚（（羥基丙基）甲基丙烯醯胺、聚[(有機）磷氮烯]' 聚（原酸酯）、聚（乙烯酵）、聚（乙烯吡咯啶酮）、順丁烯二酸 奸-院基乙烯謎共聚物、複合多元醇（pluronic polyol)、白 蛋白、海藻酸鹽、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、纖 維蛋白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、甘胺基聚糖 ❹ （glycaminoglycan)、硫酸鹽多醣、其摻合物及共聚物。舉 例而言’成份係選自由白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、 明膠、羥基丙基-β-環糊精、曱氧基聚乙二醇及聚乙二醇組 成之群。另一實施例提供一種治療哺乳動物之方法，其包 含向哺乳動物投與投與有效量之本文中揭示之組合物之步 驟。 本發明亦供一種包含如本文中揭示之結合蛋白及醫藥
學上可接受之載劑之醫藥組合物。在另一實施例中，醫藥 組合物包含用於治療病症之至少一額外治療劑。例如，額 外藥劑係選自由以下各者組成之群：治療劑、顯像劑、細 胞毒性劑、血管生成抑制劑（包括（但不限於）抗vegf抗體 或VEGF-陷阱）、激酶抑制劑（包括（但不限於）kdr及 抑制劑）、協同刺激分子阻斷劑（包括（但 抗―一叫黏附分心 不限於）抗LFA-1抗體、抗e/L選擇素枋栌 ，、 评I柷體、小分子抑制 劑）、抗細胞激素抗體或其功能性片段 (匕栝（但不限於）抗 140653.doc •33- 201006485 IL-18、抗TNF及抗IL-6/細胞激素受體抗體）、胺甲喋呤、 環孢素、雷帕黴素（rapamycin)、FK5〇6、可债測標記或報 導體、TNF拮抗劑、抗風濕病藥、肌肉鬆弛藥 '麻醉藥、 非類固醇消炎藥物（NSAID)、止痛劑 '麻醉劑、鎮靜劑、 局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗菌劑、抗牛皮癖劑、皮 質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫法、免疫球 蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替換藥物、放射性醫 藥品、抗抑鬱劑、抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物、尽促 效劑、吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞激素及細 胞激素拮抗劑。 在另一態樣中，本發明提供一種治療罹患能夠由本文中 揭示之結合蛋白結合之一或多個標靶為有害之病症的人類 個體之方法，其包含向人類個體投與本文中揭示之結合蛋 白以使得抑制人類個體之該或該等標靶之活性及減輕一種 或多種症狀或達成治療。例如，病症選自包含以下之群： 關節炎、骨關節炎、幼年型慢性關節炎、膿毒性關節炎、 萊姆氏關節炎（Lyme arthritis)、牛皮癬性關節炎、反應性 關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑性狼瘡症、克羅恩氏病 (Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、發炎性腸道疾病、胰島 素依賴型糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、牛皮 癬、皮炎、硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反 應、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤病、 動脈粥樣硬化、彌漫性血管内凝血、川崎氏疾病 (Kawasaki’s disease)、格雷氏病（Grave’s disease)、腎病症 140653.doc -34- 201006485 候群、慢性疲勞症候群、韋格納肉牙腫病（Wegener，s granulomatosis)、亨偌-絲奇恩賴紫癜（Hen〇ch_Sch〇enlein purpurea)、腎臟微觀脈管炎、慢性活性肝炎、葡萄膜炎、 敗企性休克、中毒性休克症候群、敗血症候群、惡病質、 傳染性疾病、寄生疾病、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫 性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病（Huntington’s chorea)、帕金森 氏病（Parkinson's disease)、阿茲海默氏症（Alzheimer，s disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡 參性腫瘤、心臟衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病（Addison's disease)、1型多腺體分泌不足及2型多腺體分泌不足症、 施後特氏症候群（Schmidt’s syndrome)、成年（急性）呼吸奢 迫症候群、脫髮、斑形脫髮、血清陰性關節病、關節病、 萊特爾氏病（Reiter’s disease)、牛皮癬性關節病、潰瘍性大 腸炎關節病、腸病性滑膜炎、衣原體、耶爾森氏菌屬及沙 門菌屬相關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣化疾病/動 鲁脈硬化、異位性過敏、自體免疫大皰疾病、尋常天疱瘡、 葉型天疱瘡、類天疱瘡、線性IgA疾病、自體免疫溶血貧 血症、庫姆陽性溶血貧血症、後天性惡性貧血幼年型惡 性貧血、肌痛腦炎/皇家自由疾病（Royal Free Disease)、慢 性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞性動脈炎、原發性硬化肝 炎、隱原性自體免疫肝炎、後天性免疫缺乏疾病症候群、 後天性免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、C型肝炎、一般變 異性免疫缺乏症（一般變異性低丙種球蛋白血症）、擴張性 心肌病、女性不育症、卵巢衰竭、卵巢早衰、纖維變性肺 140653.doc •35- 201006485 病、隱原性纖維性肺泡炎、發炎後間質肺病、間質肺炎、 結締組織病相關間質肺病、混合性結締組織病相關肺病、 全身性硬化症相關間質肺病、類風濕性關節炎相關間質肺 病、全身性紅斑性狼瘡症相關肺病、皮肌炎/多發性肌炎 相關肺病、修格蘭氏疾病（Sjogren's disease)相關肺病、僵 直性脊椎炎相關肺病、脈管炎擴散肺病、含鐵血黃素沉著 症相關肺病、藥物誘導之間質肺病、纖維化、放射性纖維 化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅細胞性肺炎、淋巴球 性滲透性肺病、感染後間質肺病、痛風性關節炎、自體免 疫性肝炎、1型自體免疫性肝炎（典型自體免疫或狼瘡樣肝 炎）、2型自體免疫性肝炎（抗lkM抗體肝炎）、自體免疫介 導之低血糖、B型抗胰島素症伴以黑棘皮病、曱狀旁腺機 能減退、與器官移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相 關之慢性免疫疾病、骨關節炎、原發性硬化性膽管炎、1 型牛皮癬、2型牛皮癖、特發性白血球減少症、自體免疫 性嗜中性細胞減少症、腎病N〇s、絲球體腎炎、腎臟之微 觀血g 乂、萊姆氏病、盤狀紅斑性狼瘡、特發性男性不育 症或NOS、精液自體免疫、多發性硬化症（所有亞型）、交 感性眼炎、因結締組織疾病繼發之肺循環血壓過高、古德 帕斯徹氏症候群（Goodpasture's syndrome)、多發性結節性 動脈炎之肺部表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、斯蒂 爾氏病（Still’s disease)、全身性硬化症、修格蘭氏症候 群、咼安氏疾病（Takayasu's disease)/動脈炎、自體免疫性 血小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺 140653.doc -36· 201006485 病、甲狀腺功能宄進、甲狀腺腫自體免疫性甲狀腺功能低 下（橋本氏病（Hashimoto’s disease))、萎縮性自體免疫性曱 狀腺功能低下、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、 原發性脈管炎、白斑症、急性肝臟疾病、慢性肝臟疾病、 酒精性肝硬變、酒精誘導之肝臟損傷、膽汁鬱積、特應性 肝臟疾病、藥物誘導之肝炎、非酒精性脂肪變性肝炎、過 敏症及哮喘、B群鏈球菌（GBS)感染、精神錯亂（例如抑誊 及精神分裂症）、Th2型及Thl型介導之疾病、急性及慢性 ® 疼痛（不同形式之疼痛）及癌症（諸如肺癌、乳房癌、胃癌、 膀胱癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌） 及造血·性惡性病（白血病及淋巴瘤）、無β脂蛋白血症、手足 發紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性淋 巴母細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病（AML)、急性或 慢性細菌感染、急性胰炎、急性腎功能衰竭、腺癌、心房 異位性心跳、AIDS癡呆複合症、酒精誘導之肝炎、過敏 參 性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移 植排斥、α-l-抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎縮性側索硬化、貧 血、心絞痛、前角細胞退化、抗Cd3療法、抗磷脂症候 群、抗受體過敏性反應、主動脈及周邊動脈瘤、主動脈剥 離、動脈高壓、動脈硬化、動靜脈瘺、共濟失調、心房纖 維性顫動（持續或突發性）、心房撲動、房室傳導阻滯、B 細胞淋巴瘤、骨移植排斥反應、骨髓移植（BMT)排斥反 應、束支傳導阻滯' 勃克氏淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma)、 燒傷、心律不整、心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、 140653.doc -37· 201006485 心肺分流術發炎反應、軟骨移植排斥、小腦皮質退化、小 腦病症、紊亂性或多源性心房頻脈、化學療法相關之病 症、慢性骨髓性白血病（CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎 病變、慢性淋巴細胞白血病（CLL)、慢性阻塞性肺病 (COPD)、慢性水楊酸鹽中毒、結腸直腸癌、充血性心臟 衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺心病、冠狀動脈病、克羅 伊茨費爾特-雅各布氏病（Creutzfeldt-Jakob disease)、培養 陰性敗jk症、囊腫性纖維化、細胞激素療法相關之病症、 拳擊員癡呆、脫髓鞘疾病、登革熱出血熱、皮炎、皮膚病 _ 狀、糖尿病（diabetes)、糖尿病（diabetes mellitus)、糖尿病 性動脈硬化疾病、泛發性路易體疾病（Diffuse Lewy body disease)、擴張充血型心肌病、基底神經節病症、中年唐 氏症候群（Down’s Syndrome)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥 物所誘導之藥物誘發運動病症、藥物過敏性、濕疹、腦脊 髓炎、心内膜炎、内分泌病、會厭炎、埃-巴二氏病毒感 染（epstein-barr virus infection)、紅斑性肢痛、錐體束外及 小腦病症、豕族性噬血淋巴組織細胞瘤病（familial © hematophagocytic lymph〇histi〇cytosis)、胎兒胸腺植入排 斥、弗里德賴希氏共濟失調（Friedreich，s ataxia)、功能性 周邊動脈病症、真菌敗血症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球 性腎炎、任何器官或組織之移植排斥、革蘭氏陰性敗血 症、革蘭氏陽性敗血症、歸因於細胞内有機體之肉芽膜、 毛細胞白血病、哈-斯二氏病、橋本甲狀腺炎、花粉熱、 心臟移植排斥、A色素沉著 '血液透析、溶血性尿毒症候 140653.doc -38. 201006485 群/溶解血栓性血小板減少性紫癜、出血、肝炎（a)、希氏 (His)束心律不整、HIV感染/HIV神經病、霍奇金氏病 (Hodgkin、disease)、過動性運動障礙、過敏性反應、過敏 性肺炎、高血壓、運動功能減退之運動障礙、下視丘_腦 下垂體-腎上腺軸分析、特發性阿狄森氏病、特發性肺纖 維化、抗體介導之細胞毒性、虛弱、嬰兒脊猶性肌萎縮、 主動脈發炎、A型流行性感冒、電離輕射曝露、虹膜睫狀 體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺灰後再灌注損傷 '缺血性中 _ 風、料龍風濕性關節炎、幼年型脊㈣肌萎縮、卡波 西氏肉瘤（KaP〇si，s sarcoma)、腎臟移植排斥、退伍軍人病 GegionelU)、利什曼病、麻風、皮質脊髓系統之病變、脂 肪水腫、肝移植排斥、淋巴水腫、癌疾、惡性淋巴瘤、惡 性組織細胞增多病、惡性黑色素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌 血症、代謝/特發性疾病、偏頭痛、線粒體多系統病症、 混合性結締組織病、單株丙種球蛋白病、多發性骨髓瘤、 ❹ 多發性系統退化（Meneel Dejerine_Thomas Shi_Drager 及
Machado-Joseph)、重症肌無力、胞内禽結核分枝桿菌結 核分枝桿菌、骨髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺血 性病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經退 化性疾病、神經性I肌肉萎縮、嗜中性白血球減少性發 燒、非雈可金淋巴瘤（non-hodgkins lymphoma)、腹主動脈 及其为支之閉塞、閉塞性動脈病症、〇kt3療法、睪丸炎/附 睪炎、睪丸炎/輸精管重新接合術、器官腫大、骨質疏鬆 症、騰腺移植排斥、騰腺癌、腫瘤形成徵兆症候群/惡性 140653.doc •39- 201006485 血鈣過多、甲狀旁腺移植排斥、骨盆發炎性疾病、常年性 鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周邊血管性病 症、腹膜炎、惡性貧血、肺囊蟲肺炎、肺炎、p〇EMs症候 群（多發性神經病、器官腫大、内分泌病、單株丙種球蛋 白病及皮膚變化症候群）、灌注後症候群、泵送後症候 群、MI後心切開術症候群、子癇前期、進行性核上性麻 痹、原發性肺動脈高壓、放射療法、里諾氏現象 (Raynaud’s phenomenon)及疾病、里諾氏疾病、雷富孫氏 病（Refsum’s disease)、規則性窄波QRS心動過速、腎血管 咼血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老 年性舞蹈病、路易體型之老年癡呆症、血清陰性關節病、 休克、鐮狀細胞貧血、皮膚同種移植排斥、皮膚變化症候 群、小腸移植排斥、實體腫瘤、特異性心律不整、脊椎共 濟失調、脊髓小腦退化、鏈球菌性肌炎、小腦結構損宏、 亞急性硬化性全腦炎、昏厥、心血管系統之梅毒、全身性 過敏症、全身性發炎反應症候群、全身性發作幼年型類風 濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、毛細血管擴張、血栓閉 塞性脈官炎、血小板減少症、毒性、移植、外傷/出血、 ΠΙ型過敏性反應、1¥型過敏性、不穩定絞痛、尿毒症、尿 敗血症、蓴痲疹、心臟瓣膜疾病、靜脈曲張、脈管炎、靜 脈疾病、靜脈血栓形成、心室纖維性顫動、病毒及真菌感 染、致命腦炎/無菌性腦膜炎、致命相關之嗜血細胞症候 群、魏尼凱-柯薩可夫症候群（WernickeK〇rsak〇ff yndrome)、威爾遜氏疾病（wiison’s disease)、任何器官或 140653.doc 201006485 組織異種移植排斥。 在一實％例令’可藉由本發明之組合物及方法治療或診 斷之疾病包括（但不限於）原發性及轉移性癌，包括乳房 癌結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下嚥部癌、食管 癌、月癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿 路癌（包括腎臟、膀胱及尿路上皮癌）、女性生殖道（包括子 呂頸、子呂及卵巢以及絨膜癌及妊娠期滋養層疾病）、男 ) 生生殖道（包括前列腺、精囊、睪丸及生瘦細胞腫瘤）、内 分泌腺（包括甲狀腺、腎上腺及垂體腺）及皮膚癌；以及血 管瘤、黑色素瘤、肉瘤（包括自骨質及軟組織中出現之彼 等内瘤以及卡波西氏肉瘤（Kap〇si，s sare〇ma)).、腦腫瘤、 神經腫瘤、眼睛腫瘤及腦膜腫瘤（包括星形細胞瘤、神經 膠質瘤、神經膠母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神 經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤）、自造血性惡性病（諸如 白血病）中出現之實體腫瘤及淋巴瘤（霍奇金及非霍奇金淋 巴瘤兩者）》 本發明之DVD-Ig亦可治療以下疾病中之一或多種：急 佳旭狀動脈症候群、急性特發性多發性神經炎、急性發炎 脫髓鞘多發性神經根神經病、急性局部缺血、成年斯蒂爾 氏病 '斑形脫髮、全身性過敏反應、抗磷脂抗體症候群、 再生障礙性貧血、動脈硬化、異位性濕疹、異位性皮炎、 自體免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關之自體免疫性病症、 自體免疫性腸病、自體免疫性聽力損失、自體免疫性淋巴 組織增生症候群（ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性 140653.doc -41 - 201006485 血小板減少症（AITP)、自體免疫性印巢早衰、眼瞼炎、支 氣管擴張、大皰性類天赫、d管疾病、災難性抗填脂 症候群、乳糜瀉、頸椎病、慢性局部缺血、瘢痕性類天疱 瘡伴以夕發性硬化症風險之臨床上分離症候群（CIS)、 結膜炎、兒童發作精神錯亂、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、 淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病、糖尿病、椎間盤突 出、椎間盤脫垂、藥物誘發的免疫性溶血性貧血、心内膜 炎、子宮内膜異位、内眼炎、上鞏膜炎、多形性紅斑、嚴 重多形性紅斑、姓娠期類天疱瘡、格-巴二氏症候群 (Guillain-Baw Syndrome; GBS)' 花粉熱、休兹氏症候群 (Hughes Syndrome)、特發性帕金森氏病、特發性間質性肺 炎、IgE介導之過敏症、免疫性溶血性貧血、包涵體肌 炎、傳染性眼睛發炎性疾病、發炎脫髓鞘病、發炎心臟 病、發炎腎病、特發性肺纖維化/常見間質性肺炎 (IPF/UIP)、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、庫斯毛 耳氏疾病（Kussmaul Disease)或庫斯毛耳麥爾氏疾病 (Kussmaul-Meier Disease) ' 蘭德里麻痹（Landry,s
Paralysis)、蘭格罕氏細胞組織細胞增多病仏如“沌⑽、 Cell Histiocytosis)、網狀青斑、黃斑退化、微觀多血管 炎、白赫鐵列夫症（Morbus Bechterev)、運動神經元病 症、黏膜類天疱瘡、多重器官衰竭、重症肌無力、骨趙發 育不良症候群、心肌炎、神經根病症、神經病、非甲非乙 型肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、少關節型兒童期 類風濕性關節炎（Pauciarticular JRA)、周邊動脈閉塞性疾 140653.doc .42· 201006485 病（PAOD)、周邊金管疾病（PVD)、周邊動脈疾病（pAD)、 靜脈炎、結節性多動脈炎（或結節性動脈周炎）、多軟骨 炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型JRA、多内分泌腺 分泌不足症候群、多發性肌炎、風濕、性多肌痛（PMR)、系 送後症候群、原發性帕金森氏病、前列腺及直腸癌及造血 性惡性病（白血病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅血球再生不 良、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊趙炎、再狹 窄、風濕性心臟病、薩福症（SAPHO)(滑膜炎、痤瘡、膿皰 ❿ 病、骨肥大及骨炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性、.肺休 克、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚矽 氧相關之結締組織病、角層下膿皰性皮膚病（Snedd〇n_ Wilkinson Dermatosis)、僵直性脊椎炎、史蒂芬-瓊森症候 群（SteVens-J〇hnson Syndrome; SJS)、全身性發炎反應症 候群、顳動脈炎、；形蟲視網膜炎、巾隸表皮壞死溶 解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、i型過敏 ❹性反應、II型糖尿病、蓴痲疹、常見間質性肺炎仰p)、脈 管炎、春季結膜炎、病毒視網膜炎、伏格特_小柳·原田症 候群（VKH症料）、濕性黃斑退化、創傷癒合、耶爾森氏 菌屬及沙門菌屬相關之關節病。 在一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分當單獨 或與放射療法及/或其他化療劑組合使用時用以治療癌症 或預防自本文中描述之腫瘤之轉移。 =另^樣中，本發明提供—種治療罹患病症之患者之 、、、包含如本文中討論在投與第二藥劑之前、同時或 140653.doc -43· 201006485 之後投與本文中揭示之結合蛋白中之任一者之步驟。在一 特定實施例中，第二藥劑係選自由以下各者組成之群：布 替对德（budenoside)、表皮生長因子、皮質類固醇、環孢 素、柳氮磺胺吡啶、胺基水揚酸鹽、6-酼基嘌呤、硫唑嘌 吟、曱确健吐、脂肪加氧酶抑制劑、美沙拉嗪 (mesalamine)、奥色拉秦（olsalazine)、巴柳氮 (balsalazide)、抗氧化劑、凝血脂素抑制劑、IL-1受體拮抗 劑、抗IL-Ιβ mAb、抗IL-6或IL-6受體mAb、生長因子、彈 性酶抑制劑、吡啶基-咪唑化合物、TNF、LT、IL-1、IL- φ 2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL- 18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF之抗體或促 效劑、CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、 CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配位體之抗體、 胺甲喋呤、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙 酯、來氟米特（leflunomide) 、NSAID 、布洛芬 (ibuprofen)、皮質類固醇、潑尼龍（prednisolone)、填酸二 酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗企栓形成劑、補體抑制劑、 腎上腺素劑、IRAK、NIK、IKK、p38、MAP激酶抑制 劑、IL-Ιβ轉化酶抑制劑、TNFa轉化酶抑制劑、T細胞信 號抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺》比啶、硫唑嘌 呤、6-酼基嘌呤、血管緊張素轉化酶抑制劑、可溶性細胞 激素受體、可溶性p55 TNF受體' 可溶性p75 TNF受體、 sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R、消炎細胞激素、11^4、1[-10 ' IL-11、IL-13及TGFp。在一特定實施例中，本文中揭 140653.doc -44· 201006485 示之醫藥組合物係藉由至少一種選自以下之模式投與患 者：非經腸、皮下、肌肉内、靜脈内、關節内、支氣管 内、腹内、囊内、軟骨内、腔内、體腔内（intraeelial)、小 腦内、側腦室内、大腸内、子宮頸内、胃内、肝内、心肌 内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺 内、肺内、直腸内、腎内、視網膜内、脊椎内、滑膜内、 胸腔内、子宮内、膀胱内、大丸藥、陰道、直腸、頰内、 舌下、鼻内及經皮。 本發明之一態樣向本發明之至少一種結合蛋白提供至少 一種抗個體基因型抗體。抗個體基因型抗體包括任何含有 如下分子之蛋白質或肽，該分子包含免疫球蛋白分子之至 少一部分，諸如（但不限於）其重鏈或輕鏈或配位體結合部 分之至少一個互補決定區域（CDR)、重鏈或輕鏈可變區 域、重鏈或輕鏈恆定區域、構架區域或其可併入本發明之 結合蛋白中之任何部分。 【實施方式】 本發明係關於能夠結合兩個或兩個以上抗原之多價及/ 或多特異性結合蛋白。具體言之，本發明係關於雙可變區 免疫球蛋白（DVD_Ig)，及其醫藥組合物，以及用於製得該 等DVD-Ig之核酸、重組性表現載體及宿主細胞。本發明 亦涵蓋使用本發明之DVD_Ig以活體外或活體㈣測特異 性抗原的方法。 …除非本文中另作定義，㈣關於本發明使用之科學及技 術術語具有—般熟習此項技術者料瞭解之含義。術語之 140653.doc •45- 201006485 應㈣確的，“若發生任何潛在的歧義，則 ^供之定義優先於任何詞典或外來定義。此外，除 ^形另外需要，㈣單數術語包括複數且複數術語包括 「在此中π案中，除非另有說明㈣「或」之使用 了:及/或」。此外，術語「正包括」以及其他形式（諸如 匕括」及「所包括」）之使用不為限制性的。又，除非 ::具體說明，否則諸如「元件」或「組件」之術語涵蓋 包含一個單元之元件及組件及包含超過—個亞單元之元件 及組件兩者。 〇 -般地’關於本文甲描述之細胞及組織培養分子生物 ，、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學及雜 父之命名法及其技術為在此項技術中熟知且通常使用之彼 等命名法及技術。除非另有指示，否則本發明之方法及技 術-般根據在此項技術中熟知且如貫穿本發明之說明書所 引用且討論之各種-般及更特定參照案中描述之習知方法 來執行。如在此項技術中通常實現或如本文中描述，酶促 反應及純化技術根據製造商說明書來執行。關於本文中描 述之分析化學、合成有機化學及藥物及醫藥化學所使用之 命名法及其實驗室程序及技術為在此項技術中熟知且通常 使用之彼等命名法、實驗室程序及技術。使用化學合成、 化學分析、醫藥製備、調配及傳遞及患者之治療之標準技 術0 為可更易於瞭解本發明’選定術語定義如下。 如本文中所用之術語「多肽」係指胺基酸之任何聚合 140653.doc •46- 201006485 鏈〇術注 Γ B4_ „ _ Π〇 狀」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦 係私胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋原生或人造蛋 白蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單 體或t σ的。除非情形另有相反陳述，否則本文中「多 狀」之使用意欲涵蓋多肽及其片段及變異體（包括變異體 之片^又）。對於抗原性多肽，多肽之片段視情況含有多肽 之至；一個鄰接或非線性抗原決定基。至少一個抗原決定 基片奴之精確邊界可使用此項技術中之普通技能來確認。 片奴包含至少約5個鄰接胺基酸、諸如至少約1〇個鄰接胺 基酸、至少約15個鄰接胺基酸，或至少約2〇個鄰接胺基 酸。多肽之變異體如本文中描述。 術浯「經分離之蛋白質」或「經分離之多肽」為根據其 起源或衍生來源不與在其原生狀態中伴隨其之天然相關組 份相關聯；大體上不含來自相同物種之其他蛋白質， ·藉由 來自不同物種之細胞表現；或不天然出現之蛋白質或多 肽。因此，經化學合成或在不同於天然源自其之細胞的細 胞系統中合成之多肽為與其天然相關組份「分離」的。亦 可藉由分離、使用在此項技術中熟知之蛋白質純化技術使 蛋白質大體上不含天然相關組份。 如本文中所用之術語「回收」係指藉由分離（例如）使用 在此項技術中熟知之蛋白質純化技術使化學物種（諸如多 肽）大體上不含天然相關組份之過程。 如本文中所用之「生物活性」係指分子之佐— 取多種固 有生物性質（如見於活體内之天然存在的性暫 J丨土貝，或藉由重 140653.doc •47· 201006485 組方式來提供或實現的性質）。生物性質包括（但不限於）結 合受體、誘發細胞增生、抑制細胞生長、誘發其他細胞激 素、誘發細胞凋亡及酶活性。生物活性亦包括1&分子之活 性。 ’ 如本文中所用的關於抗體、蛋白質或肽與第二化學物種 之相互作用之術語「特異性結合」或「特異性地結合」意 謂相互作用視關於化學物種之特定結構（例如抗原決定子 或抗原決疋基）之存在而定；例如，抗體識別且結合於特 異性蛋白質結構而非結合於一般蛋白質。若抗體對於抗原⑩ 決定基「A」為特異性的，則在含有經標記之「a」及抗 體之反應中，含有抗原決定基A(或游離、未標記之A)之分 子之存在減少結合於抗體之經標記之A之量。 如本文中所用之術語「抗體」廣泛地係指包含四個多肽 鏈（兩個重（H)鏈及兩個輕（L)鏈）之任何免疫球蛋白（Ig)分 子，或其保留Ig分子之基本抗原決定基結合特徵之任何功 能性片段、突變體、變異體或衍生物。該等突變體、變異 體或衍生物抗體格式在此項技術中為已知的。其非限制性® 實施例討論如下。 在全長抗體中，每一重鏈包含重鏈可變區域（本文中縮 寫為HCVR或VH)及重鍵恆定區域。重鏈亙定區域包含3個 區（CHI、CH2及CH3)。每一輕鏈包含輕鏈可變區域（本文 中縮寫為LCVR或VL)及輕鍵怪定區域。輕鏈恆定區域包含 一個區CL。VH及VL區域可進一步再分成散置有稱為構架 區域（FR)之更保守之區域的稱為互補決定區域（CDR)之高 140653.doc •48· 201006485 變區域。每一 VH及VL由3個CDR及4個FR組成，其自胺基 末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類 型（例如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及 IgY)、種類（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2)或子類。 術語「Fc區域」用以定義免疫球蛋白重鏈之C末端區 域，其可藉由完整抗體之番木瓜蛋白酶消化而生成。Fc區 域可為原生序列Fc區域或變異體Fc區域。免疫球蛋白之Fc ^ 區域一般包含兩個丨亙定區、CH2區及CH3區，且視情況包 含CH4區。置換Fc部分中之胺基酸殘基以改變抗體效應功 能在此項技術中為已知的。（Winter等人美國專利第 5,648,260號及第5,624,821號）。抗體之Fc部分介導若干重 要效應功能，例如細胞激素誘發、ADCC、吞嗤作用、補 體依賴性細胞毒性（CDC)及抗體及抗原-抗體複合物之半衰 期/清除率。視治療目標而定，此等效應功能在一些情況 0 下為治療性抗體所需但在其他情況下可為不必要或甚至有 害的。某些人類IgG同型、尤其IgGl及IgG3經由分別結合 於FcyRs及補體Clq而介導ADCC及CDC。新生兒Fc受體 (FcRn)為決定抗體之循環半衰期之關鍵組份。在另一實施 例中，置換抗體之恆定區域（例如抗體之Fc區域）中之至少 一個胺基酸殘基，以使得改變抗體之效應功能。免疫球蛋 白之兩個相同重鍵之二聚化藉由CH3區之二聚化所介導且 藉由鉸鏈區域内之雙硫鍵穩定化（Huber等人Nature; 264: 415-20 ; Thies等人 1999 J Mol Biol; 293: 67-79)。鉸鏈區 140653.doc -49- 201006485 域内之半胱胺酸殘基之突變以阻止重鏈-重鏈雙硫鍵將使 CH3區之二聚化不穩定。已識別負責CH3二聚化之殘基 (Dall’Acqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73)。因此，有可 能生成單價半Ig。引起關注地，已在自然界中發現IgG及 IgA子類兩者之此等單價半Ig分子（Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70 ; Biewenga 等人 1983 Clin Exp
Immunol 5 1: 395-400)。FcRn : Ig Fc區域之化學計量已測 定為 2:l(West 等人 2000 Biochemistry 39: 9698-708)，且半 Fc 足以介導 FcRn結合（Kim 等人 1994 Eur J Immunol; 24: 542-548)。破壞CH3區之二聚化之突變可能不對於其FcRn 結合具有更大反作用，此歸因於對於CH3二聚化較重要之 殘基位於CH3 b片狀結構之内部界面上，而負責FcRn結合 之區域位於CH2-CH3區之外部界面上。然而，半ig分子可 歸因於其尺寸小於規則抗體而在組織滲透方面具有某種優 勢。在一實施例中，置換本發明之結合蛋白之恆定區域 (例如Fc區域）中之至少一個胺基酸殘基，以使得破壞重鏈 之二聚化，產生半DVD Ig分子。IgG之消炎活性視IgG Fc 片段之N連接聚糖之唾液酸化而定。已測定消炎活性之精 確聚糖要求，以使得可產生合適IgGl Fc片段，由此生成 具有極大增強效能之完全重組性、唾液酸化IgG 1 Fc(Anthony, R.M.等人（2008) Science 320:373-376)。 如本文中所用之術語抗體之「抗原結合部分」（或簡言 之「抗體部分」）係指保留與抗原特異性結合之能力之抗 體之一或多個片段。已展示可由全長抗體之片段執行抗體 140653.doc •50· 201006485
之抗原結合功能。該等抗體實施例亦可為雙特異性、雙重 特異性或多特異性格式；特異性結合於兩個或兩個以上不 同抗原。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」内之結合片 段的實例包括（i)Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1區組 成之單價片段；（ii)F(ab')2片段，其為包含由在鉸鏈區域處 之雙硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；（iii)由VH及 CH1區組成之Fd片段；（iv)由抗體之單臂之VL及VH區組成 之Fv片段；（v)包含單一可變區之dAb片段（Ward等人， Φ (1989) 341:544-546 ; Winter 等人 PCT 公開案 WO 90/05144 A1，其係以引用的方式併入本文中）；及（vi)經分 離之互補決定區域（CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個區 (VL及VH)由獨立基因編碼，但其可使用重組方法由合成 連接子接合，該連接子能夠使其製造成其中VL及VH區域 成對以形成單價分子之單一蛋白質鏈（稱為單鏈Fv(scFv); 參見例如Bird 等人（1988)Science 242:423-426 ;及 Huston 等 人（1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。該等 φ 單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」内。 亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗 鱧為二價、雙特異性抗體，其中VH及VL區表現於單一多 肽鏈上，但使用太短而不允許同一鏈上之兩個區之間成對 的連接子，由此迫使該等區與另一鏈之互補區成對且產生 兩個抗原結合位點（參見例如Holliger，Ρ.等人（1993) iVoc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ； Poljak, R.J.# A(1994) 2:1121-1123)。該等抗體結合部分在此項技術中 140653.doc •51- 201006485 為已知的（Kontermann及 Dubel編，Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag· New York。第 790 頁（ISBN 3-540-41354-5))。另外，單鏈抗體亦包括「線性抗體」，其包含 與互補輕鍵多肽一起形成一對抗原結合區域之一對串聯Fv 區段（VH-CHl-VH-CHl)(Zapata 等人 Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995);及美國專利第 5,641，870號）。 貫穿此說明書使用術語「多價結合蛋白」以表示包含兩 個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。在一實施例中， 多價結合蛋白經工程改造以具有三個或三個以上抗原結合 位點，且一般不為天然出現之抗體。術語「多特異性結合 蛋白」係指能夠結合兩個或兩個以上相關或無關標靶之結 合蛋白。本發明之雙可變區（DVD)結合蛋白包含兩個或兩 個以上抗原結合位點且為四價或多價結合蛋白。DVD可為 單特異性的，亦即能夠結合一個抗原或為多特異性的，亦 即能夠結合兩個或兩個以上抗原。包含兩個重鏈DVD多肽 及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為DVD-Ig。DVD-Ig之每一半包含一重鏈DVD多肽及一輕鏈DVD多肽及兩個 抗原結合位點。每一結合位點包含一重鏈可變區及一輕鏈 可變區，且每一抗原結合位點有總共6個CDR涉及抗原結 合性。 如本文中所用之術語「雙特異性抗體」係指藉由以下技 術生成之全長抗體：四源雜交瘤技術（參見Milstein, C.及 A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934)：第 537-40頁），藉由 兩個不同單株抗體之化學接合（參見Staerz，U.D.等人 140653.doc -52- 201006485
Nature，1985. 314(6012):第 628 31頁），或藉由孔洞中之 •瘤節法或在Fc區域中引人突變之類似方法（參見η〇ιι_ • P.，T. Pr〇spero及 G. Winter，Pr0c Natl Acad Sci u s A，1993 90(14):第6444-8.18頁），該等技術產生多個不同免疫球 蛋白物質其中僅-個為功能性雙特異性抗體。藉由分子 功能，雙特異性抗體在其兩個結合臂之一者（一對hc/lc) 上結合一個抗原（或抗原決定基），且在其第二臂（不同對之 HC/LC)上結合不同抗原（或抗原決定基）。藉由此定義雙 ^ 特異性抗體具有兩個不同的抗原結合臂（在特異性及CDR 序列方面），且對於其結合之每一抗原而言為單價的。 如本文中所用之術語「雙重特異性抗體」係指可在其兩 個結合臂之每一者（一對HC/LC)中結合兩個不同抗原（或抗 原決定基）之全長抗體（參見PCT公開案w〇 〇2/〇2773)。因 此’雙重特異性結合蛋白具有兩個具備相同特異性及相同 CDR序列之相同抗原結合臂，且對於其結合之每一抗原而 言為二價的。 結合蛋白之「功能性抗原結合位點」為能夠結合標乾抗 原之一結合位點。抗原結合位點之抗原結合親和力不一定 如抗原結合位點來源其之親本抗體一樣強，但結合抗原之 能力必須可使用已知用於分析抗體與抗原結合之各種方法 中之任一者量測。另外，本文中多價抗體之每一抗原結合 位點之抗原結合親和力不必在數量上為相同的。 術語「細胞激素」為由細胞群體釋放之蛋白質之通稱， 該等蛋白質以細胞間介體形式作用於另一細胞群體。該等 140653.doc -53- 201006485 細胞激素之實例為淋巴介質、單核球激素及常規多肽激 素。包括於細胞激素中者為生長激素，諸如人生長激素、 N-甲硫胺醯人生長激素及牛生長激素；副甲狀腺素；甲狀 膝素·’騰島素；前胰島素；鬆弛素；前鬆弛素；醣蛋白激 素’諸如促濾泡素（FSH)、促甲狀腺素（TSH)及促黃體素 (LH);肝生長因子；纖維母細胞生長因子；促乳素；胎盤 生乳素；腫瘤壞死因子-α及_β ;苗勒_抑制物質（mullerian-mhibiting substance);小鼠促性腺激素相關肽；抑制素； 活化素；血管内皮生長因子；整合素；血小板生成素參 (τρο);神經生長因子’諸如NGF a ;血小板生長因子； 胎盤生長因子、轉型生長因子（TGF)，諸如TGF-a及TGF_ β，似胰島素生長因子_1&_η ;紅血球生成素（Ep〇);骨 誘導因子，干擾素，諸如干擾素_α、及群落刺激因子 (CSF)，諸如巨嗟細胞_CSF(M_CSF);粒細胞巨噬細胞_ CSF(GM-CSF);及粒細胞 _CSF(G_CSF);介白素（IL)，諸 wil-i、iL-2、IL-3、il_4、il_5、IL6、IL7、il_8、il-9、IL-10、il-11、IL_i2、il-13、IL-15、IL-18、IL-21、® IL-22、IL-23、IL_33 ;腫瘤壞死因子，諸如 TNF_a* TNF- P，及其他多肽因子，包括LIF及套組配位體（KL)。如本文 中所用，術語細胞激素包括來自天然來源或來自重組性細 胞。養物之蛋白質及原生序列細胞激素之生物活性等價 物。 術連接子」用以表示包含藉由肽鍵連接之兩個或兩 個以上胺基酸殘基之多肽且用以連接-或多個抗原結合部 140653.doc -54· 201006485 分。該等連接子多肽在此項技術中為熟知的（參見例如 Holliger, P.^ A(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ; Poljak，RJ·等人（1994) 2:1121-1123)。例
示性連接子包括（但不限於）AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 1)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2)、 AKTTPKLGG(SEQ ID NO·· 3)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4)、SAKTTP(SEQ ID NO: 5)、RADAAP(SEQ ID NO: 6)、 RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8) 、RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9)、 SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10)、ADAAP(SEQ ID NO: 11)、ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12)、 TVAAP(SEQ ID NO: 13)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) ' QPKAAP(SEQ ID NO: 15)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) ' AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ' AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18)、AKTTAP(SEQ ID NO: 19)、AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20)、ASTKGP(SEQ ID NO: 21)、 ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) ' GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24)、 GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO: 25)及 GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26)。 「免疫球蛋白恆定區」係指重鏈或輕鏈恆定區。人類 IgG重鏈及輕鏈恆定區胺基酸序列在此項技術中為已知 的。 如本文中所用之術語「單株抗體」或「mAb」係指自大 140653.doc -55- 201006485 體上同源抗體之群禮獲得之抗體，亦即構成群體之個體抗 ，除可以微^量存在的可能天然出現之突變外為相同的。 单株抗體為高度特異性的，其針對單一抗原。此外，與通 常包括針對不同決定子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗 體製劑形成對比’每一mAb針對抗原上之單一決定子。修 飾語「單株」不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗 體。 如本文中所用之術語「人類抗體」意欲包括具有來源於 人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區域之抗體。本 發明之人類抗體可包括不由A類生殖系免疫王求蛋白序列編 碼之胺基酸殘基（例如由活體外隨機或特定位點誘變或由 活體内鱧細胞突變所引入之突變），例如在CDR且尤其 CDR3中。然而，如本文中所用之術語「人類抗體」不意 欲包括來源於另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之生殖系之 CDR序列已移植於人類構架序列上之抗體。 如本文中所用之術語「重組性人類抗體」意欲包括藉由 重組性方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸 如使用轉染於宿主細胞中之重組性表現載體表現之抗體 (進一步描述於以下第II C部分中）、自重組性組合人類抗 體庫分離之抗禮（Hoogenboom H.R. (1997) TIB Tech. 15:62-70 ; Azzazy Η.及 Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445 ; Gavilondo J.V.及Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145 ; Hoogenboom H.及 Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378)，自相對於人類免 140653.doc -56- 201006485 疫球蛋白基因為轉殖基因之動物（例如小鼠）分離之抗體（參 見 Taylor，L. D.等人（1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 ; Kellermann S-A.及 Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597 ; Little M.等人（2000) Immunology Today 21:364-370)或藉由涉及將人類免疫球 蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、 表現、產生或分離之抗體。該等重組性人類抗體具有自人 類生殖系免疫球蛋白序列衍生之可變及恆定區域。然而， • 在某些實施例中，該等重組性人類抗體進行活體外誘變 (或當使用相對於人類Ig序列為轉殖基因之動物時，則為活 體内體細胞誘變）且因此重組性抗體之VH及VL區域之胺基 酸序列為雖然來源於人類生殖系VH及VL序列且與其相 關，但是可能不天然存在於活體内人類抗體生殖系譜系内 之序列。 「親和力成熟」抗體為其一或多個CDR中具有一或多個 變化之抗體，該或該等變化導致與不擁有彼等變化之親本 抗體相比，抗體對於抗原之親和力改良。例示性親和力成 熟抗體將具有對於標靶抗原之奈莫耳或甚至皮莫耳親和 力。親和力成熟抗體藉由在此項技術中已知之程序產生。 Marks等人BidlTechnology 10:779-783 (1992)描述藉由 VH 及VL區洗牌（domain shuffling)之親和力成熟。Barbas等人 Proc Nat. Acad. Sci，USA 91:3809-3813 (1994); Schier等 人 Gene 169:147-155 (1995) ; Yelton 155:1994-2004 (1995) ； Jackson 等人 J. Immunol. 140653.doc -57- 201006485 154(7):3310-9 (1995); Hawkins等人J. Mol. BioL 226:889- 896 (1992)描述CDR及/或構架殘基之隨機誘變且選擇性誘 變位置、接觸或超突變位置處之藉由活性增強胺基酸殘基 之選擇性突變如美國專利US 6914128B1中所描述。 術語「欲合抗體」係指包含來自一物種之重鍵及輕鍵可 變&域序列及來自另一物種之怪定區域序列的抗體，諸如 具有與人類恆定區域連接之鼠類重鍵及輕鏈可變區域之抗 體。 術語「CDR移植抗體」係指包含來自一物種之重鏈及輕 鏈可變區域序列但其中VH及/或VL之CDR區域中之一或多 者之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有鼠 類重鏈及輕鏈可變區域之抗體，其中鼠類CDR之一或多者 (例如CDR3)已經人類CDR序列置換。 術語「人源化抗體」係指包含來自非人類物種（例如小 鼠）之重鏈及輕鏈可變區域序列但其中VH及/或VL序列中 之至少一部分已改變為更「類似於人類」，亦即更與人類 生殖系可變序列相似的抗體。一種類型之人源化抗體為 CDR移植抗體’其中人類CDR序列引入非人類VH及VL序 列中以置換相應非人類CDR序列。「人源化抗體」亦為抗 體或其變異體、衍生物、類似物或片段，其免疫特異性地 結合於所關注之抗原且包含大體上具有人類抗體之胺基酸 序列之構架（FR)區域及大體上具有非人類抗體之胺基酸序 列之互補決定區域（CDr)。如本文中所用之CDR情形中之 術語「大體上」係指具有與非人類抗體CDR之胺基酸序列 140653.doc -58- 201006485 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至 少99% —致之胺基酸序列之CDR。人源化抗體包含大體上 所有至少一個且通常兩個可變區（Fab、Fab'、F(ab')2、 FabC、Fv)，其中所有或大體上所有CDR區域對應於非人 類免疫球蛋白（亦即供體抗體）之彼等CDR區域且所有或大 體上所有構架區域為人類免疫球蛋白一致序列之彼等構架 區域。在一實施例中，人源化抗體亦包含免疫球蛋白恆定 區域（Fc)、通常人類免疫球蛋白之彼恆定區域之至少一部 • 分。在某些實施例中，人源化抗體含有輕鏈以及至少重鏈 之可變區兩者。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、 CH3及CH4區域。在某些實施例中，人源化抗體僅含有人 源化輕鏈。在某些實施例中，人源化抗體僅含有人源化重 鏈。在特定實施例中，人源化抗體僅含有輕鏈及/或人源 化重鍵之人源化可變區。 術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「kabat標記」本文 中可互換使用。在此項技術_公認之此等術語係指對比在 抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區域中的其他胺 基酸殘基更可變（亦即高變）之胺基酸殘基進行編號的系 統（Kabat 等人（1971) 4m iVrjcac?, Sc!·· 190:382-391 及 Kabat, E.A.等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest > > U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開案第 91-3242期）。對於重鏈 可變區域，高變區範圍為CDR1之胺基酸位置31至35、 CDR2之胺基酸位置50至65，及CDR3之胺基酸位置95至 140653.doc -59- 201006485 102。對於輕鏈可變區域，高變區範圍為CDR1之胺基酸位 置24至34、CDR2之胺基酸位置50至56，及CDR3之胺基酸 位置89至97。 如本文中所用，術語「CDR」係指抗體可變序列内之互 補決定區域。在重鍵及輕鏈之可變區之每一者中存在三個 CDR，其對於可變區域之每一者指定為CDR1、CDR2及 CDR3。如本文中所用之術語「CDR組」係指出現於能夠 結合抗原之單一可變區域中之一組三個CDR。已根據不同 系統來不同地定義此等CDR之精確邊界。Kabat所描述之 系統（Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)及（1991))不僅提供適用於抗體之任何可變區域之明 確的殘基編號系統，而且提供定義三個CDR之精確殘基邊 界。此等 CDR可稱為 Kabat CDR。Chothia及同事（Chothia & Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)及 Chothia 等人 Nature 342:877-883 (1989))發現 Kabat CDR内之某些子部 分儘管具有胺基酸序列水準之極大相異性，但是採用幾乎 相同肽骨架構形。此等子部分指定為LI、L2及L3或H1、 H2及H3，其中「L」及「H」分別指定輕鏈及重鏈區域。 此等區域可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之 邊界。定義與Kabat CDR重疊之CDR之其他邊界已藉由 Padlan(FASEB J. 9:133-139 (1995))及 MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))描述。其他CDR邊界定義可能 不嚴格地遵循本文中系統之一者，但仍然與Kabat CDR重 140653.doc -60- 201006485 疊，即使鑒於特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著地 影響抗原結合之預測或實驗觀測結果而可將其縮短或延長 亦如此。雖然某些實施例使用Kabat或Chothia定義之 CDR，但是本文中使用之方法可利用根據任何該等系統定 義之CDR。 如本文中所用，術語「構架」或「構架序列」係指可變 區域減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之精確定義可藉 由不同系統確定，所以構架序列之含義經受相應地不同解 ® 釋。六個CDR(輕鏈之CDR-L1、-L2及-L3及重鏈之CDR-Hl、-H2及-H3)亦將輕鍵及重鍵上之構架區域在每一鍵上 劃分為四個子區域（FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位 於FR1與FR2之間，CDR2在FR2與FR3之間，且CDR3在 FR3與FR4之間。在不指定特定子區域為FR1、FR2、FR3 或FR4的情況下，如藉由其他所提及之構架區域代表單一 天然出現之免疫球蛋白鏈之可變區域内之組合FR。如本文 $ 中所用，FR代表四個子區域中之一者，且FRs代表構成構 架區域之四個子區域中之兩者或兩者以上。 如本文中所用，術語「生殖系抗體基因j或「基因片 段」係指藉由未經受導致便於表現特定免疫球蛋白之遺傳 重排及突變之成熟過程之非淋巴樣細胞編碼之免疫球蛋白 序列。（參見例如 Shapiro 等人 Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002) ; Marchalonis 等人 Adv Exp Med Biol· 484:13-30 (2001))。本發明之各種實施例所提供之優勢之 一源自以下認識：生殖系抗體基因與成熟抗體基因相比更 140653.doc -61 - 201006485 可能使物種中之個體所特有之基本胺基酸序列結構保守， 因此當治療性地用於彼物種中時不太可能被認為是來自外 來來源的。 如本文中所用，術語「中和」係指當結合蛋白特異性結 合抗原時，抵消抗原之生物活性。在一實施例中，中和結 合蛋白結合細胞激素且使其生物活性減少至少約20%、 40% ' 60%、80%、85%或更大 ° 術語「活性」包括DVD-Ig對於兩個或兩個以上抗原之 諸如結合特異性及親和力之活性。 術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合於免疫球蛋白 或T細胞受體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原 決定基決定子包括諸如胺基酸、糖側鏈、鱗醯基或項醯基 之分子之化學活性表面基團，且在某些實施例中可具有特 定三維結構特徵及/或荷質比特徵。抗原決定基為抗原之 藉由抗體結合之區域。在某些實施例中，當抗體在蛋白質 及/或巨分子之複雜混合物中識別其標靶抗原時，據稱其 特異性結合抗原。若抗體交叉競爭（一者阻止另一者之結 合或調節效應），則據稱抗體「結合於同一抗原決定基」。 另外，抗原決定基之結構定義（重疊、類似、相同）為提供 資訊的，但因為功能定義涵蓋結構（結合）及功能（調節、競 爭）參數，所以其通常更具相關性。 如本文中所用，術語「表面電漿共振」係指藉由（例如） 使用 BIAcore® 系統（BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 140653.doc -62- 201006485 來偵測生物感應器基質内之蛋白質濃度之變化而使得可分 析即時生物特異性相互作用的光學現象。對於進一步描 述，參見 J0nsson，U.等人（1993) 仏〇/.(："«.51:19- 26，JSnsson，U.等人（1991) l.oiec/mz.gwei 11:620-627 ; Johnsson，B.專人（1995) J. Mo/. i?ecog72z·，. 8:125-131 ;及 •Johnnson，Β·等人（1991) 198:268-277。 如本文中所用’術語「Kon」意指如在此項技術中已知 之結合蛋白（例如抗體）與抗原締合以形成（例如）抗體/抗原 ❹複合物之結合速率常數。「Κοη」亦稱為術語「締合速率常 數」或「ka」，其在本文中可互換使用。指示抗體與其標 靶抗原之結合速率或抗體與抗原之間之複合物形成速率之 此值亦藉由以下方程式展示： 抗體（「Ab」）+抗原（「Ag」）—Ab_ Ag。 如本文中所用，術語r K〇ff」意指如在此項技術中已知 之結合蛋白（例如抗體）自（例如）抗體/抗原複合物解離之脫 參離速率常數，或「解離速率常數」。此值指示如藉由以下 方程式所示之抗體自其標靶抗原解離或Ab-Ag複合物隨著 時間的過去而分離為游離抗體及抗原之解離速率：
Ab+Ag<—Ab-Ag。 如本文中所用之術語「Kd」意指「平衡解離常數」，且 係指在滴定量測中在平衡狀態下獲得之值，或藉由將解離 速率常數（koff)除以締合速率常數（k<)n)獲得之值。締合速率 常2解離速率常數及平衡解離常數用以代表抗體與抗原 之結合親和力。測定締合及解離速率常數之方法在此項技 140653.doc -63· 201006485 術中為熟知的。使用基於螢光之技術提供檢查在生理緩衝 液中處在平衡狀態下之試樣之高靈敏性及能力。可使用其 他實驗性方法及儀器’諸如BIAcore®(生物分子相互作用 分析）檢定（例如可構自 BIAcore International AB，a GE Healthcare company, Uppsala，Sweden之儀器）。另外，亦 可使用KinExA®(動態排除檢定）檢定，其可購自Sapidyne Instruments(Boise, Idaho)。 標記」及「可偵測標記」意謂連接至特異結合搭配物 (諸如抗體或分析物）以使得特異結合對之成員（諸如抗體及 分析物）之間之反應為可偵測的部分，且如此標記之特異 結合搭配物（例如抗體或分析物）稱為「經可偵測標記的」。 因此，如本文中所用之術語「經標記之結合蛋白」係指具 有所併入之提供結合蛋白之鑑定之標記的蛋白質。在一實 施例中，標記為可產生可藉由視覺或儀器方式偵測之信號 之可偵測標記物’例如併入經放射性標記之胺基酸或將可 藉由經標記之抗生物素蛋白偵測之生物素基部分連接至多 肽（例如含有螢光標記物之抗生蛋白鏈菌素或可藉由光學 或比色方法偵測之酶活性）。多肽之標記之實例包括（但不 限於）以下：放射性同位素或放射性核素（例如3H、 35S'9〇Y'"Tc'nil-12^131I>177Lu.-Ho^-Sm 色素原、螢光標記（例如FITC、若丹明（rh〇damine)、^ 元素磷光體）、酶標記（例如辣根過氧化酶 '螢光素酶、 性磷酸酶）；化學發光標記；生物素基；藉由二級報驾 識別之預定多肽抗原決定基（例如白胺酸拉鏈對序列、 140653.doc -64- 201006485 ==之結合位點、金屬結合區、抗原決定基標籤);及 1 ’諸如㈣合物。通常用於免疫檢定之標 性實例包括產生光之部分(例如n丫錠化合物)及產生勞光： :分(例如營光素)。本文中描述其他標記。在此方面，部 刀本身可能不經可㉝測標記但在與另一部分反應後可變得 使用「經可偵測標記」意欲涵蓋後-類型之可偵 I吾「接合物」係指與第二化學部分(諸如治療性或細 胞毒性劑）化學連接之結合蛋白（諸如抗體）。術語「劑」在 本文中用於表示化合物、化合物之混合物、生物巨分子或 由生物材料製成之提取物。在一實施例中，治療性或細胞 毒性劑包括（但不限於）百日咳毒素、紫杉盼、細胞分裂抑 素B紐才干菌肽D、溴化乙錠、吐根素、絲裂黴素、依託 泊苷（etop〇slde)、特諾波赛（ten〇p〇side)、長春新鹼長春 驗秋水仙驗、阿黴素（doxorubicin)、道諾黴素 ❹（daUn〇rublcln)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌 (mit〇xantrone)、米拉黴素（mithramycin)、放線菌素 d、^ 去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因（pr〇caine)、四卡因 (tetracaine)、利多卡因（lid〇caine)、普萘洛爾（pr〇pran〇1〇1) 及嘌呤黴素及其類似物或同系物。當用於免疫檢定之情形 中時’接合物抗體可為用作偵測抗體之經可偵測標記之抗 體。 如本文t所用之術語「晶體」及「結晶」係指以晶體之 形式存在之結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分。晶體 140653.doc -65- 201006485 為固態物質之一形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態 之其他形式。晶體由原子、離子、分子（例如蛋白質，諸 如抗體）或分子組裝體（例如抗原/抗體複合物）之規則、重 複、二維陣列組成。此等三維陣列根據在此領域中較好理 解之特定數學關係來排列。在晶體中重複之基本單元或構 築組塊稱為不對稱單元。不對稱單元以符合指定、經明確 疋義之晶體學對稱之排列方式重複提供了晶體之「晶 胞」。晶胞藉由在所有三維中規則平移（regular translati〇n) 之重複提供了晶體。參見Giege，R·及Ducruix, A Barrett’春
Crystallization 0f Nueleic Acids and Pr〇teins，a 卩咖仏“ Approach，第 2版，第 20 卜16 頁，〇xf〇rd Univershy press，
New York，New York，（1999)。 術浯「聚核苷酸」意謂兩個或兩個以上核苷酸（核糖核 苷酸或去氧核苷酸或任一類型之核苷酸之修飾形式）之多 聚形式。該術語包括單及雙鏈形式的DNA。 術》σ經分離之聚核苷酸」意謂一種聚核苷酸（例如來 源於基因組、cDNA或合成來源，或其某種組合），根據其© 來源’「經分離之聚核苷酸」不與在自然界中發現與「經 分離之聚核苷酸」在一起的聚核苷酸之全部或一部分相關 聯；與在自然界中不與其連接之聚核苷酸可操作地連接； 或在自然界中不作為更大序列之一部分而出現。 術語「載體」意指能夠輸送與其連接之另一核酸的核酸 刀子 類載體為「質體」，其係指其他DNA區段可連接於 其中的環狀雙鏈DNA環。另一類載體為病毒載體，其中其 140653.doc -66- 201006485 他DNA區段可連接於病毒基因組中。某些載體能夠於引入 其之宿主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起點的細菌 載體及游離型哺乳動物載體）。其他載體（例如非游離型哺 乳動物載體）一旦引入宿主細胞中後可整合於宿主細胞之 基因組中且藉此與宿主基因組一起複製。此外’某些載體 能夠引導其可操作地連接之基因之表現。該等載體在本文 中稱為「重組性表現載體」（或簡稱「表現載體」）。一般 而言’應用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形 ❹式。在本說明書中，因為質體為載體之最通常使用形式， 所以「質體」及「載體」可互換使用。然而，本發明意欲 包括該等提供等效功能之其他形式的表現載體，諸如病毒 載體（例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒）。 術可操作地連接」係指所描述組份處於允許其以其 預疋方式起作用之關係中的並置。「可操作地連接」於編 碼序列之控制序列以使得在與控制序列相容之條件下達成 φ 編碼序列之表現的方式而連接。「可操作地連接」之序列 包括與所關注之基因鄰接之表現控制序列及在對側或隔開 定距離起作用以控制所關注之基因的表現控制序列。如 本文中所用之㈣「表現控制序列」係指為實現其連接之 編碼序列之表現及處理所必需之聚核普酸序列。表現控制 序列包括口適轉錄啟始、終止、啟動子及強化子序列；有 效RNA處理信號，諸如剪接及聚腺普酸化信號；使細胞質 RNA穩疋化之序列’增強轉譯效率之序列（亦即一 致序列）；增強蛋白質穩定性之序列；及#需要時增強蛋 140653.doc •67· 201006485 白質分泌之序列。該等控制序列之性質視宿主有機體而不 同；在原核生物中，該等控制序列一般包括啟動子、核糖 趙結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，該等控制序 列-般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意 欲包括其存在對表現及處理必何少的組份，且亦可包括 其存在為有利的額外組份’例如前導序列及融合搭配物序 列。 轉型作用」係指外源DNA進入宿主細胞之任何過程。 轉型作用可使用在此項技術中熟知之各種方法在天然或人 工條件下進行。轉型作用可依賴於將外來核酸序列插入原 核或真核宿主細胞中之任何已知方法。該方法基於所轉型 之宿主細胞來選擇且可包括（但不限於）病毒感染、電穿 孔、脂質體轉染及粒子轟擊。該等「轉型」細胞包括其中 所插入DN A能夠以自主複製質體形式或作為宿主染色體之 一部分而複製之穩定轉型細胞。其亦包括瞬時表現所插入 DNA或RNA歷時有限時段的細胞。 術語「重組性宿主細胞」（或簡稱「宿主細胞」）意指外 源DNA已引入其中之細胞。在一實施例中，宿主細胞包含 兩個或兩個以上（例如，多個）編碼抗禮之核酸，諸如，例 如美國專利第7,262,028號所述之宿主細胞。應理解該等術 語意欲不僅意指特定個體細胞，且亦指該細胞之子代。因 為某些修飾可由於突變或環境影響而發生於繼代中，所以 該子代實際上不與母細胞一致但仍包括於如本文中所用之 術語「宿主細胞」之範疇内。在一實施例中，宿主細胞包 140653.doc • 68· 201006485 括選自任一生物界之原核及真核細胞。在另一實施例中， 真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在另一 實施例中’宿主細胞包括（但不限於）原核細胞株大腸桿 菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2及 PER.C6 ;昆蟲細胞株Sf9 ;及真菌細胞釀酒酵母。 標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及 轉型作用（例如電穿孔、脂質體轉染）。酶促反應及純化技 術可根據製造商說明書或如在此項技術中通常實現或如本 文中描述來執行。以上技術及程序可一般根據在此項技術 中熟知且如貫穿本發明之說明書所引用且討論之各種一般 及更特定參照案中描述之習知方法來執行。參見例如
Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第 2 版 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y, (1989))，其係出於任何目的以引用的方式併 入本文中。 如在此項技術中已知之「轉殖基因有機體」係指具有含 有轉殖基因之細胞之有機體，其中引入有機體（或有機體 之祖先）中之轉殖基因表現不天然表現於有機體中之多 肽。「轉殖基因」為DNA構築體，其穩定且可操作地整合 於轉殖基因有機體自其中發育之細胞之基因組中，引導所 編碼基因產物在轉殖基因有機體之一或多個細胞類型或組 織中之表現。 術語「調控」及「調節」可互換使用，且如本文中所用 係指所關注之分子之活性（例如細胞激素之生物活性）之改 140653.doc •69· 201006485 變或變化。調節可為所關注之分子之某一活性或功能之量 值之增大或減小。分子之例示性活性及功能包括（但不限 於）結合特徵、酶活性、細胞受體活化及信號轉導。 因此，術語「調節劑」為能夠改變或變化所關注之分子 之活性或功能（例如細胞激素之生物活性）之化合物β例 如’與不存在調節劑的情況下所觀察到之活性或功能之量 值相比’調節劑可導致分子之某一活性或功能之量值之增 大或減小。在某些實施例中，調節劑為抑制劑，其減小分 子之至少一種活性或功能之量值。例示性抑制劑包括（但 不限於）蛋白質、肽、抗體、肽體、碳水化合物或小有機 分子。肽體描述於（例如）WO 01/83525中。 術語「促效劑」係指當與所關注之分子接觸時與不存在 促效劑的情況下觀察到之活性或功能之量值相比導致分子 之某一活性或功能之量值增大的調節劑，所關注之特定促 效劑可包括（但不限於）多肽、核酸、碳水化合物或結合於 抗原之任何其他分子。 術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指當與所關注之分子接 觸時與不存在拮抗劑的情況下觀察到之活性或功能之量值 相比導致分子之某一活性或功能之量值減小的調節劑。所 關注之特定拮抗劑包括阻斷或調節抗原之生物或免疫活性 之彼等拮抗劑。抗原之拮抗劑及抑制劑可包括（但不限於） 蛋白質、核酸、碳水化合物或結合於抗原之任何其他分 子。 如本文中所用，術語「有效量」係指足以降低或改善病 140653.doc -70- 201006485 症或其—或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間，阻止病 症推進，導致病症消退，阻止與病症相關聯之一或多種症 狀之復發、發展、發作或進程，该測病症，或增強或改良 另一療法（例如預防劑或治療劑）之預防或治療作用的療法 之量。 、 「患者」及「個體」可在本文中可互換使用以指代動 物，諸如哺乳動物，包括靈長類（例如人類、猴及黑猩 猩）、非靈長類（例如母牛、豬、駱駝、美洲駝、馬、山 羊、兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、貓、狗、大鼠、小鼠、 鯨），鳥（例如鴨或鵝），及鯊魚。較佳地，患者或個體為人 類，諸如經治療或評估疾病、病症或病狀的人類，處於疾 病、病症或病狀之風險中之人類，患有疾病、病症或病狀 之人類’及/或經治療疾病、病症或病狀之人類。 如本文中所用，術語「試樣」以其最廣泛意義使用。如 本文中所用之「生物試樣」包括（但不限於）任意量之來自 Φ 活生物或原先活生物之物質。該等活生物包括（但不限於） 人類、小鼠、大鼠、猴、狗、兔及其他動物。該等物質包 括（但不限於）血液（例如全血）、血漿、血清、尿、羊水、 滑液、内皮細胞、白血球、單核細胞、其他細胞、器官、 組織、骨髓、淋巴結及脾臟。 「組份」及「至少一種組份」一般係指可包括於套組中 以根據本文中描述之方法及在此項技術中已知之其他方法 檢定試樣（諸如患者尿、血清或血衆試樣）之捕獲抗體、偵 測或接合抗體、對照、校準、一系列之校準、靈敏度套 140653.doc -71 - 201006485 組、容器、緩衝液、稀釋劑、鹽、酶、酶之輔因子、偵測 试劑、預處理試劑/溶液、基f (例如呈溶液形式）、停止溶 液及其類似物。因此，在本揭示案之情形中，「至少一種 組份」及「組份」可包括如上之多肽或其他分析物，諸如 =含分析物（諸如多肽）之組合物，其視情況（諸如）藉由結 合於抗分析物（例如抗多肽）抗體而固定在固體支撐物上。 -些組份可處在溶解狀態中或凍乾以便經復原用於檢定 中0 「對照」係指已知非分析物（「陰性對照」）或含有分析參 物（陽性對照」）之組合物。陽性對照可包含已知濃产之 分析物。「對照」、「陽性對照」及「校準」可在本文：可 互換使用以指代包含已知濃度之分析物之組合物。「陽性 對照」可用於確立檢定效能特徵且為試劑（例如分析物）之 完整性之適用指示物。 「預定截止」及「預定水準」一般係指用以藉由將檢定 結果相對於預錢止/水準進行比較來評估料/預後/治療 功效結果的檢定截止值，其中預定截止/水準已與各種臨⑩ 床參數（例如疾病之嚴重程度、進程/停滯（_p叫_〇η)/ 改良等）聯繫或相關聯。雖然本揭示案可提供例示性預定 水準’但是熟知截止值可視免疫檢定之性質（例如所用抗 體等）而變化。此外，針對其他免疫檢定來調適本文中之 本揭示案以基於此揭示案獲得用於彼等其他免疫檢定之免 疫檢定特定截止值完全在熟習此項技術者之普通技能内。 儘管預定截止/水準之精確值可在各檢定之間變化，但是 140653.doc •72- 201006485 如本文t描述之相互闕係（若存在）通紫為適用的。 如用於如本文中描述之診斷檢 (例如使試劑溶解、m μ ^ 預處理武劑」 劑冷解^及/或增溶）為一種使存在於 =何^溶解及/或使存在於試㈣之任何分析物增溶 的預處理試劑。如本文中進一步描述，預處理不一定用於 :部試樣。尤其，使分析物（例如所關注之多肽）增導 ==於試樣中之任何内源性結合蛋白釋放。預
離步 Γ質的（不需要分離步驟）或非均質的（需要分 ::驟1。猎由使用非均質預處理試劑，自試樣移除任何 Η之刀析物結合蛋白，然後進行檢定之下一步驟。 、在本文中七田述之免疫檢定及套組之情形中之「品質控制 ，劑」包括(但不限於)校準、對照及靈敏度套組。「校準」 或標準」（例如一或多個，諸如複數個）通常用於確立校 準(標準)曲線以便内插分析物(諸如抗體或分析物)之濃 度。或者，可使用接近預定陽性/陰性截止之單一校準。 可結合使用多個校準(亦即超過一個校準或變化量 以便構成「靈敏度套組」。 「風險」係指特定事件目前或在將來某—時點處發生之 可能性或機率。「風險分類」係指U使得醫師可將患 者刀類為發展特定疾病、病症或病狀之低、中、高或最高 風險的已知臨床風險因子。 &在特異結合對之成員（例如抗原（或其片段）與抗體（或其 ,原反應性片段))之間之相互作用之情形中之「特異」及 特異性」係指相互作用之選擇性反應性。短語「特異性 140653.doc -73- 201006485 結合於」及類似短語係指抗體（或其抗原反應性片段）特異 性結合於分析物（或其片段）且不特異性結合於其他實體之 能力。 「特異結合搭配物」為特異結合對之成員。特異結合對 包含兩個不同分子，其經由化學或物理方式彼此特異性結 合。因此，除普通免疫檢定之抗原與抗體特異結合對之 外，其他特異結合對可包括生物素與抗生物素蛋白（或抗 生蛋白鏈菌素）、碳水化合物與選擇素、互補核苷酸序 列、作用與受體分子、輔因子與酶、酶抑制劑與酶，及其 類似物。此外，特異結合對可包括為初始特異結合成員之 類似物之成員，例如分析物_類似物。免疫反應性特異結 合成員包括抗原、抗原片段及抗體，包括單株及多株抗體 以及複合物、片段及其變異體（包括變異體之片段），無論 經分離或重組產生。 如本文中所用之「變異體」意謂因胺基酸之添加（例如 插入）、缺失或保守性取代而在胺基酸序列方面不同於指 定多肽（例如IL-18、BNP、NGAL或HIV多肽或抗多肽抗 體）之多肽，但其保留指定多肽之生物活性（例如變異體IL_ 18可與抗IL-18抗體競爭以結合於IL_18) D胺基酸之保守性 取代（亦即以具有類似性質（例如親水性及程度及電荷區域 分布）之不同胺基酸置換胺基酸）在此項技術中公認為通常 涉及較小變化。如此項技術中所理解，此等較小變化可部 分地藉由考量胺基酸之水療指數來識別（參見例如Kyte等 人J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982))。胺基酸之水療指數 140653.doc •74· 201006485 基於其疏水性及電荷之考量。在此項技術中已知具有類似 水療指數之胺基酸可經取代且仍保留蛋白質功能。在一態 樣中，具有±2之水療指數之胺基酸經取代。胺基酸之親水 性亦可用於揭示導致蛋白質保留生物功能之取代作用。在 肽之情形中之胺基酸之親水性之考量允許計算彼肽之最大 局部平均親水性，已報導其為完全與抗原性及免疫原性相 關之適用度量（參見例如美國專利第4,5544(^號，其係以 引用的方式併入本文中）。如在此項技術中所理解，具有 類似親水性值之胺基酸之取代作用可導致肽保留生物活 性，例如免疫原性。在一態樣中，取代作用藉由具有彼此 ±2内之親水性值之胺基酸來執行。胺基酸之疏水性指數及 親水性值皆受彼胺基酸之特定側鏈的影響。與彼觀察結果 一致，與生物功能相容之胺基酸取代作用理解為視胺基 心’且尤其彼等胺基酸之側鍵之相對相似性（如藉由疏水 性、親水性、電荷、大小及其他性質所揭示）而定。「變異 φ 體」亦可用於描述已經差異性處理（諸如藉由蛋白水解、 磷酸化或其他轉譯後修飾）’仍保留其生物活性或抗原反 應性（例如結合於IL-18之能力）的多肽或其片段。除非情形 另有相反陳述，否則在本文中使用「變異體」意欲涵蓋變 異體之片段。 I·生成DVD結合蛋白 本發明係關於能夠結合一或多個標乾之雙可變區結合蛋 白及其製造方法。在一實施例中’結合蛋白包含多肽鏈， 其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為 140653.doc -75· 201006485 第一可變區’ VD2為第二可變區，c為恆定區，χι代表胺 基酸或多肽’ X2代表Fc區域且n為〇或1。本發明之結合蛋 白可使用各種技術生成。本發明提供表現載體、宿主細胞 及生成結合蛋白之方法。 A.生成親本單株抗體 DVD結合蛋白之可變區可自能夠結合所關注之抗原之親 本抗體（包括多株及mAb)獲得。此等抗體可天然出現或可 藉由重組性技術生成。 mAb可使用在此項技術中已知之多種技術製備，包括使 用融合瘤、重組及噬菌體呈現技術或其組合。例如，mAb 可使用包括在此項技術中已知且（例如）在以下參照案中教 不之彼等技術之融合瘤技術來產生：Hari〇w等人
Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press ，第 2 版 1988) ; HammerUng 等人
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-68UElsevier，Ν·γ·，1981)(該等參考案係以引用的方式全部 併入本文中）。如本文令所用之術語「單株抗體」不侷限 於經由融合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指來 源於單一純系（包括任何真核、原核或噬菌體純系）之抗 體，而不是產生其之方法。如在以下實例丨中討論，針對 所需特徵（包括穩定融合瘤生長、高抗體產生及所需抗體 特徵）而選擇、選殖及進一步篩選融合瘤。融合瘤可在同 基因型動物中、在缺乏免疫系統之動物（例如裸鼠）中活體 内培養及擴増，或在細胞培養物中活體外培養及擴增。選 140653.doc -76- 201006485 擇、選殖及擴增融合瘤之方法為一般熟習此項技術者熟知 的在一特定實施例中，融合瘤為小鼠融合瘤。在另一實 施例中，融合瘤在非人類、非小鼠物種（諸如大鼠、綿 羊、豬、山羊、牛或馬）中產生。在另一實施例中，融合 瘤為人類融合瘤，其中人類非分泌性骨髓瘤與表現能夠結 合特異性抗原之抗體之人類細胞融合。 如美國專利第5,627,052號、PCT公開案w〇 92/〇2551及
BabC〇Ck，J.S 等人（1996) hoc. iWj". 5Ά t/M 93:7843-7848中所描述，重組mAb亦使用在此項技術中稱 為經選擇之淋巴細胞抗體方法（SLAm；)之程序自單一、經 分離之淋巴細胞生成。在此方法中，識別分泌所關注之抗 體之單一細胞（例如來源於經免疫之動物之淋巴細胞），且 藉由反轉錄酶-PCR自細胞桎救重鏈及輕鏈可變區域cDNA 且此等可變區域可隨後在合適免疫球蛋白恆定區域（例如 人類恆定區域）之情形中表現於哺乳動物宿主細胞（諸如 φ COS或CHO細胞）中。藉由來源於經活體内選擇之淋巴細胞 之經擴增之免疫球蛋白序列轉染之宿主細胞可隨後進一步 進行活體外分析及選擇（例如藉由淘選經轉染之細胞）以分 離表現所關注之抗原之抗體之細胞。諸如藉由（諸如）在 PCT公開案WO 97/29131及PCT公開案wo 00/56772中描述 之彼荨方法之活體外親和力成熟方法，可進一步在活體外 操控經擴增之免疫球蛋白序列。 單株抗體亦藉由以所關注之抗原使包含一些或所有人類 免疫球蛋白基因座之非人類動物免疫來產生。在—實施例 140653.doc -77- 201006485 中，非人類動物為XENOMOUSE轉殖基因小鼠，其為包含 人類免疫球蛋白基因座之較大片段且缺乏小鼠抗體產生之 經工程改造小鼠品系。參見例如Green等人ATaiwre 7:13-21 (1994)及美國專利第 5,916,771 號、第 5,939,598 號、第 5,985,615號、第 5,998,209號、第 6,075,181 號、第 6,091，001 號、第 6，114,598 號及第 6，130,364 號。亦參見 1991年7月25日公開之WO 91/10741、1994年2月3日公開之 WO 94/02602、皆於 1996 年 10 月 31 日公開之 WO 96/34096 及 WO 96/33735、1998 年 4 月 23 日公開之 WO 98/16654、 1998年6月11日公開之WO 98/24893、1998年11月12日公開 之 WO 98/50433、1999 年 9 月 10 日公開之 WO 99/45031、 1999年10月21日公開之WO 99/53049、2000年2月24日公開 之 WO 00 09560及 2000 年 6 月 29 日公開之 WO 00/037504。 XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人類抗體之成人狀人 類譜系，且生成抗原特異性人類單株抗體。XENOMOUSE 轉瘦基因小鼠經由引入人類重鍵基因座及X輕鏈基因座之 兆鹼基大小、生殖系構型YAC片段而含有約80%之人類抗 體譜系。參見 Mendez 等人 iVaiwre Geweiz'cs 15:146-156 (1997) ，Green 及 Jakobovits ·/. Meof. 188:483-495 (1998) ，將其揭示内容以引用的方式併入本文中。 活體外方法亦可用於製得親本抗體，其中抗體庫經篩選 以識別具有所需結合特異性之抗體。重組抗體庫之此篩選 之方法在此項技術中為熟知的且包括在（例如）以下參照案 中描述之方法中；Ladner等人美國專利第5,223,409號； 140653.doc • 78- 201006485
Kang等人PCT等人第WO 92/18619號；Dower等人PCT公開 案第WO 91/17271號；Winter等人PCT公開案第WO 92/20791 號；Markland等人PCT公開案第號 WO 92/15679 ; Breitling# 乂 PCT公開案第 WO 93/01288號；McCafferty 等 人PCT公開案第WO 92/01047號；Garrard等人PCT公開案 第 WO 92/09690 號；Fuchs 等人（1991) 9:1370-1372 ; Hay 等人（1992) i/ww //yftr/i/owfls 3:81-85 ; Huse 等人（1989) 246:1275-1281 ; Φ McCafferty 等人 iVbiwre (1990) 348:552-554 ; Griffiths 等 人（1993) ·/ 12:725-734 ; Hawkins等人（1992) / Mo/ 和〇/ 226:889-896 ; Clackson 等人（1991) 352:624- 628 ; Gram 等人（1992) 89:3576-3580 ; Garrad 等人 (1991) jBz.o/Tec/mo/ogy 9:1373-1377 ; Hoogenboom 等人 (1991) Ywc JcW 19:4133-4137 ;及 Barbas 等人（1991) /WJS 88:7978-7982，美國專利申請公開案20030186374及 PCT公開案第WO 97/29131號，其各自之内容係以引用的 方式併入本文中。 本發明之親本抗體亦可使用在此項技術中已知之各種噬 菌體呈現方法生成。在噬菌體呈現方法中，功能抗體區呈 現於攜帶編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體顆粒之表面上。 特定言之，此噬菌體可用於呈現自譜系或組合抗體庫（例 如人類或鼠類）表現之抗原結合區。表現結合所關注之抗 原之抗原結合區之噬菌體可（例如）使用標記抗原或結合或 捕獲於固體表面或珠粒之抗原來藉由抗原選擇或識別。用 140653.doc -79· 201006485 於此等方法中之噬菌體通常為包括自噬菌體表現之fd及 Ml 3結合區之絲狀噬菌體，其中Fab、Fv或二硫化物穩定 化Fv抗體區重組融合於噬菌體基因III或基因VIII蛋白質。 可用於製得本發明之抗體之噬菌體呈現方法之實例包括揭 示於以下參照案中之彼等方法：Brinkman等人了.11111111111〇1· Methods 182:41-50 (1995) ; Ames等人J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995) ; Kettleborough 等人 Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994) ; Persic 等人 Gene 187 9-18 (1997); Burton等人Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT公開案第PCT/GB91/01134號、PCT公開案WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、 WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401，及美國專利 第 5,698,426 號、第 5,223,409 號、第 5,403,484 號、第 5,580,717 號、第 5,427,908 號、第 5,750,753 號、第 5,821,047 號、第 5,571,698 號、第 5,427,908 號、第 5,516,637 號、第 5,780,225 號、第 5,658,727 號、第 5,733,743號及第5,969，108號，其各自係以引用的方式全部 併入本文中。 如本文中之參照案所描述，在噬菌體選擇之後，來自噬 菌艎之抗體編碼區域可經分離且用以生成包括人類抗體之 完全抗體或任何其他所需抗原結合片段，且表現於任何所 需宿主（包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母 及細菌）中，此情況>(例如）如以下所詳述。例如，重組產生 Fab、FalV及F(ab')2片段之技術亦可使用在此項技術中已知 140653.doc -80- 201006485 之諸如揭示於以下參照案中之彼等方法之方法來採用： PCT 公開案 WO 92/22324 ; Mullinax 等人 BioTechniques 12(6):864-869 (1992);及 Sawai 等人 AJRI 34:26-34 (1995);及 Better 等人 Science 240:1041-1043 (1988)(該等 參考案係以引用的方式全部併入本文中）。可用於產生單 鏈Fv及抗體之技術之實例包括在以下參照案中描述之彼等 技術：美國專利4,946,778及5,258,498 ; Huston等人 Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu等人PNAS ❹ 90:7995-7999 (1993);及 Skerra等人 Science 240:1038-1040 (1988)。 代替藉由噬菌體呈現來篩選重組抗體庫，在此項技術中 已知用於筛選較大組合庫之其他方法可用於識別親本抗 體。如Szostak及Roberts之PCT公開案第WO 98/31700號及 Roberts，R.W.及 Szostak，J.W. (1997) Proc. Λ^ί/· JcW. t/M 94:12297-12302中所描述，一類型之替代表現系統為 重組抗體庫表現為RNA-蛋白質融合體的一系統。在此系 統中，藉由在其3,末端處攜帶嘌呤黴素，一種肽基受體抗 生素之合成mRNA之活體外轉譯而在mRNA與其編碼之肽 或蛋白質之間產生共價融合。因此，可基於所編碼肽或蛋 白質（例如抗體或其部分）之性質（諸如抗體或其部分與雙特 異性抗原之結合）來將特異性mRNA自mRNA之複雜混合物 (例如組合庫）富集。自該等庫之筛選所回收之編碼抗體或 其部分之核酸序列可藉由如本文中描述之重組方式（例如 在哺乳動物宿主細胞中）表現且另外可藉由其中已向最初 140653.doc -81 - 201006485 選擇之序列中引入突變之mRNA•肽融合體之額外篩選循 環，或藉由如本文中描述之用於重組抗體之活體外親和力 成熟之其他方法來進一步親和力成熟。 在另一方法中，親本抗體亦可使用在此項技術中已知之 酵母呈現方法來生成。在酵母呈現方法中，遺傳方法用以 將抗體區繫栓至酵母細胞壁且將其呈現於酵母之表面上。 詳言之，此酵母可用於呈現自譜系或組合抗體庫（例如人 類或鼠類）表現之抗原結合區。可用於製得親本抗體之酵 母呈現方法之實例包括在wittrup等人美國專利第鲁 6,699,658號中揭示之彼等方法，該專利係以引用的方式併 入本文中。 本文中描述之抗體可進一步修飾以生成CDR移植及人源 化親本抗體。CDR移植親本抗體包含來自人類抗體之重鏈 及輕鏈可變區域序列，其中Vh及/或Vl之一或多個CdR區 域經能夠結合所關注之抗原之鼠類抗體之CDR序列置換。 來自任何人類抗體之構架序列可充當CDR移植之模板。然 而’此構架上之直接鏈置換通常導致與抗原之結合親和力〇 之一些損失。人類抗體與初始鼠類抗體之同源性愈大，鼠 類CDR與人類構架之組合向CDR中引入可降低親和力之畸 變之可能性會愈小。因此’在一實施例中，經選擇以置換 除CDR以外之鼠類可變構架之人類可變構架具有與鼠類抗 體可變區域構架至少65%之序列一致性。在一實施例中， 除CDR以外之人類及鼠類可變區域具有至少70%序列一致 性。在一特定實施例中，除CDR以外之人類及鼠類可變區 140653.doc -82- 201006485 域具有至少75%序列一致性。在另一實施例中，除CDR以 外之人類及鼠類可變區域具有至少80%序列一致性。產生 該等抗體之方法在此項技術中為已知的（參見EP 239,400 ; PCT公開案WO 91/09967 ;美國專利第5,225,539號；第 5,530,101號；及第5,585,089號），飾面或重設表面（EP 592,106 ; EP 519,596 ; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991) ; Studnicka等人Protein Engineering 7(6):805-814 (1994) ; Roguska 等人 PNAS 91:969-973 ® (1994))，及鏈洗牌（美國專利第5,565,352號）及抗遺傳型抗 體。 人源化抗體為來自結合所需抗原之非人類物種抗體之抗 體分子，其具有來自非人類物種之一或多個互補決定區域 (CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區域。已知人類 Ig序列揭示於（例如）www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi、 www.atcc.org/phage/hdb.html 、 www.sciquest.com/ 、 www.abcam.com/ ' www.antibodyresource.com/onlinecomp.html ' ❿ ww w. public.iastate. edu/. about, pedro/res earch_tools.html 、 www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html、www.whfreeman.com/ immunology/CH-05/kuby05.htm ' www.library.thinkquest.org/ 12429/Immune/Antibody.html、www.hhmi.org/grants/lectures/ 1996/vlab/、www.path.cam.ac.ukAabout.mrc7/m-ikeimages.html、 www.antibodyresource.com/ 、mcb.harvard.edu/BioLinks/ Immuno-logy.html、www.immunologylink.com/、pathbox. wustl.edu八about.hcenter/index.-html、www.biotech.ufl.edu/. 140653.doc -83 - 201006485 about.hcl/、www.pebio.com/pa/340913/340913.html-、www.nal. usda.gov/awic/pubs/antibody/ 、www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/ Elisa.html、www.biodesign.com/table.asp、www.icnet.uk/axp/ facs/davies/lin-ks.html 、 www. biotech, ufl.edu/. about, feel/ protocol.html、www.isac-net.org/sites_geo.html、aximtl.imt. uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html、baserv.uci.kun.nl/. about, jraats/linksl.html 、 www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.
nwu.edu/、www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html、 www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html、imgt.cnusc.fr:8104/、 www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html 、 antibody.bath.ac.uk/、abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html、 www.unizh.ch/. about, hone gger/AHOsem-inar/SlideO 1 .html 、 www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/ 、 www.nimr.mrc.ac.uk/ CC/ccaewg/ccaewg.htm 、www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html、www.ibt.unam.mx/vir/structure/ stat_aim.html ' www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html ' ww w. cry st. bioc. cam. ac.uk/. abo-ut.fmolina/Web-p age s/Pept/ spottech.html 、 www.jerini.de/fr roducts.htm 、 www. patents.ibm.com/ibm.html 、Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)，其各自係以引用的方式全部併入本文中。如在此 項技術中已知，該等引入之序列可用於降低免疫原性或降 低、增強或修飾結合、親和力、結合速率、脫離速率、結 合性、特異性、半衰期或任何其他適合特徵。 140653.doc -84- 201006485 人類構架區域中之構架殘基可經來自CDR供體抗體之相 應殘基取代以改變（例如改良）抗原結合性。此等構架取代 作用藉由在此項技術中熟知之方法識別，例如藉由CDR與 構架殘基之相互作用之模型化以識別對於抗原結合較重要 之構架殘基及序列比較以識別特定位置處之異常構架殘 基。（參見例如Queen等人美國專利第5,585,089號； Riechmann等人Nature 332:323 (1988)，其係以引用的方式 全部併入本文中）。三維免疫球蛋白模型通常可購得且為 • 熟習此項技術者所熟知。可獲得說明且顯示所選候選免疫 球蛋白序列之大概三維構造結構的電腦程式。對於該等顯 示之檢視使得可分析該等殘基在候選免疫球蛋白序列之運 行中的可能作用（亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗 原之能力的殘基）。以此方式，可自一致及引入序列選擇 及組合FR殘基以便獲得所需抗體特徵，諸如對標靶抗原之 增大之親和力。一般而言，CDR殘基直接且最實質性地涉 及影響抗原結合性。抗體可使用在此項技術中已知之諸如 (但不限於）在以下參照案中描述之彼等技術之各種技術來 人源化：Jones 等人 Nature 321:522 (1986) ; Verhoeyen 等人 Science 239:1534 (1988)) ; Sims 等人 J. Immunol. 151: 2296 (1993) ; Chothia及 Lesk，J. Mol. Biol· 196:901 (1987); Carter 等人Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta 等人 J. Immunol. 151:2623 (1993) » Padlan,
Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991) » Studnicka 等人 Protein Engineering 7(6):805-814 (1994) ;R〇guska. 140653.doc -85 - 201006485
等人，PNAS 91:969-973 (1994)、PCT 公開案 WO 91/09967 、 PCT/: US98/16280 、 US96/18978 、 US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、 GB91/01134、GB92/01755、WO90/14443、WO90/14424、 W090/14430 ' EP 229246、EP 592,106、EP 519,596、EP 239,400、美國專利第 5,565,332 號、第 5,723,323 號、第 5,976,862號、第 5,824,514號、第 5,817,483 號、第 5814476 號、第 5763192 號、第 5723323 號、第 5,766886 號、第 5,714,352 號、第 6,204,023 號、第 6，180,370 號、第 5,693,762 號、第 5,530，101 號、第 5,585,089 號、第 5,225,539號、第4,816,567號，其各自係以引用的方式全部 併入本文中，包括其中所引用的參考案。 B.選擇親本單株抗體之標準 本發明之實施例係關於選擇具有在DVD-Ig分子中所需 之至少一或多種性質之親本抗體。在一實施例中，所需性 質選自一或多個抗體參數。在另一實施例中，抗體參數係 選自由以下各者組成之群：抗原特異性、與抗原之親和 力、效能、生物功能、抗原決定基識別性、穩定性、溶解 性、生產效率、免疫原性、藥物代謝動力學、生物可用 性、組織交又反應性及直系同源性抗原結合性。 B1.對抗原之親和力 治療性mAb之所需親和力可視抗原之性質及所需治療終 點而定。在一實施例中，因為細胞激素-細胞激素受體相 互作用通常為高親和力相互作用（例如<pM-<nM範圍），所 140653.doc -86 - 201006485 以當單株抗體阻斷該相互作用_，科抗體具有更高親和 力（Kd=0.01-0.50 PM)。在該等情況中，mAb對於其標靶之 親和力應等於或超過細胞激素（配位體）對於其受體之親和 力。另一方面，具有較小親和力（>nM範圍）之mAb可（例如） 在清除循環潛在致病蛋白中在治療上為有效的，例如結 合、螯合且清除Α-β澱粉狀蛋白之循環物質之單株抗體。 在其他情況中，藉由定點誘變來降低現有高親和力mAb之 親和力或使用具有對於其標靶之較低親和力之mAb可用於 ® 避免潛在副作用，例如高親和力mAb可螯合/中和所有其預 定標靶，由此完全消耗/消除標靶蛋白之功能。在此情況 中，低親和力mAb可螯合/中和可能會造成疾病症狀之標靶 (病理性或過度產生之含量）之一部分，因此使得標靶之一 部分可繼續執行其正常生理功能。因此，可能會降低&£1以 調整劑量及/或降低副作用。親本mAb之親和力可在合適地 靶向細胞表面分子以達成所需治療性結果中起作用。例 ❹如，若標靶以高密度表現於癌細胞上且以低密度表現於正 常細胞上，則與正常細胞相比，較低親和力mAb將結合腫 瘤細胞上之更大數目之標靶，導致經由ADCC或CDC消除 腫瘤細胞，且因此可具有所需治療作用。因此，選擇具有 所需親和力之mAb對於可溶性及表面標靶兩者可為相關 的。 經由受體與其配位體相互作用之後來信號轉導可視受 體-配位體相互作用之親和力而定。同樣地，可以設想 mAb對於表面受體之親和力可決定細胞内信號轉導之性質 140653.doc -87- 201006485 及mAb是傳遞促效信號還是拮抗信號。mAb介導之信號轉 導之基於親和力之性質可影響其副作用概況。因此，治療 性單株抗體之所需親和力及所需功能必須藉由活體外及活 體内實驗謹慎地測定。 結合蛋白（例如抗體）之所需Kd可視所需治療性結果而定 以實驗方式來測定。在一實施例中，選擇對於特定抗原之 親和力（Kd)等於或超過DVD_Ig對於相同抗原之所需親和力 的親本抗體。抗原結合親和力及動力學藉由Biac〇re或另一 類似技術來評估。在一實施例中，每一親本抗體具有選自魯 由以下各者組成之群之與其抗原之解離常數（Kd):至多約 1〇-7 Μ、至多約10-8 M、至多約1〇-9 M、至多約ι〇·,〇 M、 至多約ΙΟ·11 Μ、至多約l〇-12 M及至多約1〇-n M。自其獲得 VD1之第一親本抗體及自其獲得VD2之第二親本抗體可具 有對於相應抗原之類似或不同親和力（Kd)。每一親本抗體 具有如藉由表面電漿共振所量測之選自由以下各者組成之 群之與抗原之結合速率常數（κ〇η广至少約1〇2 Μ、」、至 少約103Μ、·1、至少約104M-〗S-】、至少約1〇5]νΓγι，及至_ 少約106 。自其獲得VD1之第一親本抗體及自其獲得 VD2之第二親本抗體可具有對於相應抗原之類似或不同社 合速率常數（K〇n)。在一實施例中，每一親本抗體具有如 藉由表面電漿共振量測之選自由以下各者組成之群之與抗 原之脫離速率常數（Koff):至多約1〇·3,、至多約1〇·4〆、至 ^約1〇_5’’及至多約10·?。自其獲得VD1之第一親本 ㈣及自其獲得VD2之第二親本抗體可具有對於相應抗原 140653.doc -88. 201006485 之類似或不同脫離速率常數（Koff)。 B2·效能 親本單株抗體之所需親和力/效能視所需治療性結果而 定。例如，對於受體-配位體（R_L)相互作用，親和力（kd) 等於或超過R-L kd(PM範圍）。對於簡單清除病理性循環蛋 白，kd可在低nM範圍中，例如清除循環A_p肽之各種物 質。另外，kd亦視標靶是否表現同一抗原決定基之多個複 本而定，例如靶向AP募聚物中之構形抗原決定基的mAb。 在VDI及VD2結合同一抗原但結合不同抗原決定基的情 況下，DVD-Ig含有用於同一抗原之4個結合位點，因此增 大結合性且由此增大DVD-Ig之表觀kd。在一實施例中， 選擇具有與DVD-Ig中之所需彼kd相等或較低之kd的親本 抗體。親本mAb之親和力考量亦可視DVD_Ig是否含有四個 或四個以上相同抗原結合位點（亦即DVD-Ig來自單一 mAb) 而定。在此情況下，表觀kd將歸因於結合性而大MmAb。 φ 該等DVD-Ig可用於交聯表面受體、增大中和效能、增強 病理蛋白之清除等。 在一實施例中，選擇對於特異性抗原之中和效能等於或 超過DVD-Ig對於相同抗原之所需中和潛力的親本抗體。 中和效能可藉由標把依賴性生物檢定來評估，其中合適類 型之細胞響應於標乾刺激而產生可量測信號（亦即增生或 細胞激素產生）’且藉由mAb之標靶中和可以劑量依賴性 方式減少信號。 B3.生物功能 140653.doc •89· 201006485 單株抗體可潛在地執行若干功能。此等功能中之一些列 於表1中。此等功能可藉由活體外檢定（例如基於細胞及生 物化學檢定）及活體内動物模型來評估。 表1 :治療性抗體之一些潛在應用 標靶(種類） 作用機制(標靶） 可溶性(細胞激素、其 他） 中和活性(例如細胞激素） 增強清除(例如Αβ募聚物） 增大半衰期(例如GLP 1) 細胞表面(受體、其他） 促效劑(例如GLP1 R ' EPO R等） 抬抗劑(例如整合素等） 細胞毒性(CD 20等） 蛋白質沈積 增強清除/降解(例如Αβ斑、澱粉狀蛋白沈積） 可選擇具有在本文中在表1中以實例描述之不同功能之 mAb以達成所需治療性結果。兩個或兩個以上所選親本單 株抗體可隨後以DVD-Ig格式使用以達成單一 DVD_Ig分子 中之兩個不同功能。例如，DVD-Ig可藉由選擇中和特定 細胞激素之功能之親本mAb且選擇增強病理蛋白之清除之 親本mAb來生成。類似地’可選擇識別兩個不同細胞表面 受體之兩個親本單株抗體’一 mAb具有對於一受體之促效 功能，且另一 mAb具有對於不同受體之拮抗功能。各自具© 有不同功能之此等兩個所選單株抗體可用於構築在單_分 子中擁有所選單株抗體之兩個不同功能（促效及拮抗）之單 一 DVD-Ig分子。類似地，各自阻斷相應受體配位體（例如 EGF及IGF)之結合的對於細胞表面受體之兩個拮抗單株抗 體可以DVD-Ig格式使用。相反地，可選擇拮抗性抗受體 mAb(例如抗EGFR)及中和性抗可溶介趙（例如 IGFl/2)mAb以製得 DVD-Ig。 140653.doc -90- 201006485 B4.抗原決定基識別： 蛋白質之不同區域可執行不同功能。例如，細胞激素之 特定區域與細胞激素受體相互作用以引起受體活化，而蛋 白質之其他區域可為使細胞激素穩定化所需。在此情況 下，可選擇特異性結合於細胞激素上之受體相互作用區域 且由此阻斷細胞激素-受體相互作用之mAb。在一些情況 下，（例如）結合多個配位體之某些趨化因子受體的情況 下，可選擇結合於僅與一配位體相互作用之抗原決定基 ❹ （趨化因子受體上之區域）的mAb。在其他情況中，單株抗 體可結合於標靶上不直接負責蛋白質之生理功能之抗原決 定基，但mAb與此等區域之結合可干擾蛋白質之生理功能 (位阻）或改變蛋白質之構形以使得蛋白質不能起作用（具有 多個配位體之受體之mAb改變受體構形以使得任何一個配 位體皆不可結合）。亦已識別不阻斷細胞激素與其受體之 結合，但阻斷信號轉導之抗細胞激素單株抗體（例如125- • 2H，一種抗 IL-18 mAb)。 抗原決定基及mAb功能之實例包括（但不限於）阻斷受體-配位體（R-L)相互作用（結合R相互作用位點之中和性 mAb);導致R結合減少或無R結合之位阻。Ab可在除受體 結合位點以外之位點處結合標靶，但仍藉由誘導構型變化 及消除功能（例如Xolair)、結合於R但阻斷信號轉導（125-2H)而干擾受體結合及標靶之功能。 在一實施例中，親本mAb需要靶向合適抗原決定基以獲 得最大功效。該抗原決定基應在DVD-Ig中為保守的。mAb 140653.doc -91 - 201006485 之結合抗原決定基可藉由若干方法測定，包括共結晶學、 mAb-抗原複合物之有限蛋白水解加上質譜分析肽定位 (Legros V.等人 2000 Protein Sci. 9:1002-10)、嗤菌體呈現 肽庫（O’Connor KH等人 2005 J Immunol Meth〇ds 299:21_ 35)以及誘變（Wu C.等人 2003 J Immunol 170:5571-7)。 B5·物理化學及醫藥性質： 藉由抗體之治療性治療通常需要投與高劑量，通常為若 干mg/kg(歸因於由通常大分子量引起之基於質量之低效 月b )。為適應患者順應性及充分地投入長期疾病療法及門_ 診治療，治療性mAb之皮下（s.c.)或肌肉内（im)投與為合 乎需要的。例如，s.c·投與之最大所需體積為約1() mL， 且因此需要>100 mg/mL之濃度以限制每劑量之注射數目。 在一實施例中，以一劑量方式投與治療性抗體。然而，該 等調配物之開發受蛋白質_蛋白質相互作用（例如，潛在地 增加免疫原性風險之聚集）制約且受處理及傳遞期間之限 制（例如黏度）制約。因此，臨床功效所需之較大數量及相 關開發制約因素限制了對於抗體調配物之潛力及高劑量方❿ 案中之s.c.投與之完全利用。很明顯蛋白質分子及蛋白質 溶液之物理化學及醫藥性質（例如穩定性、溶解性及黏度 特徵）非常重要。 Β5·1·穩定性： 「穩定」抗體調配物為其中之抗體在儲存後基本上保留 其物理穩疋性及/或化學穩定性及/或生物活性之一調配 物。穩定性可在選定溫度下歷時選定時段而量測。在一實 140653.doc -92· 201006485 施例中’調配物中之抗體在室溫（約3〇 定至少1月且/或在約2-8Ό下穩定至少丨 或在4〇C下穩 王y 1年，至少2年。此 外’在-實施例中，調配物在調配物之冷束(至(例如) -贼）及解康（以下稱為「冷」東/解;東循環」）之後轉定。在 另-實例中’「穩定」調配物可為少於約1〇%且少於約5% 之蛋白質以聚集體形式存在於調配物中 ^一調配物。
在活體外在各種溫度下穩定歷時延長時段之则_1§為 合乎需要的。可藉由快速篩選在活體外在高溫(例如4〇。〇 下穩疋2-4週之親本mAb且隨後評估穩定性來達成此。在2· 8°C下儲存期間，蛋白質顯示穩定性歷時至少^個月例 如至少24個月。可使用各種技術評估穩定性（單體、完整 分子之❶/。），諸如陽離子交換層析、尺寸排阻層析、sds_ PAGE以及生物活性測試。關於可用於分析共價及構形修 飾之分析技術之更全面清單，參見Cleland，； L、Langer， R.編著之 Formulation and delivery of peptides and proteins，第 1 版，Washington，ACS，第 22-45 頁中之
Jones, A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulati〇ns and delivery systems，及Lee，V_ H. 編著之 Peptide and protein drug delivery ’ 第 1 版，New
York，Marcel Dekker, Inc_，第 247-301 頁中之 Pearlman， R.、Nguyen, T. H.(1990) Analysis of protein drugs。 非均質性及聚集體形成：抗體之穩定性可使得調配物可 顯示少於約1 〇%，且在一實施例中少於約5%，在另一實施 例中少於約2%，或在一實施例中在0.5%至1.5%範圍内或 140653.doc -93· 201006485 更少之以聚集體形式存在之GMP抗體材料。尺寸排阻層析 為在偵測蛋白質聚集體中較敏感、可重現且極穩定之方 法。 除低聚集體含量之外’抗趙在一實施例中必須為化學穩 定的。化學穩定性可藉由離子交換層析（例如陽離子或陰 離子交換層析）、疏水性相互作用層析或其他方法（諸如等 電聚焦或毛細電泳）來測定。例如，抗體之化學穩定性可 使得在2-8°C下儲存至少12個月之後，與在儲存測試之前 之抗體溶液相比，陽離子交換層析中之代表未修飾抗體之 峰值可增大不超過2〇%，在一實施例中不超過丨〇%，或在 另一實施例中不超過5〇/〇。 在一實施例中’親本抗體展示結構完整性；正確的雙硫 鍵形成，及正確的摺疊：歸因於抗體之二級或三級結構之 變化之化學不穩定性可影響抗體活性。例如，如抗體之活 性所指示之穩定性可使得在2_8°c儲存至少12個月之後， 與在儲存測試之前之抗體溶液相比，抗體之活性可減小不 超過50%，在一實施例中不超過30%，或甚至不超過 10°/。，或在一實施例中不超過5%或1。/(^適合之抗原結合 檢定可用於測定抗體活性。 B5.2.溶解性： mAb之「溶解性」與正確地摺疊、單體IgG之產生有 關。IgG之溶解性因此可藉由HPLC評估。例如，可溶（單 體）IgG將引起HPLC層析上之單一峰值，而不溶性（例如多 聚及聚集體）將引起複數個峰值。因此，熟習此項技術者 140653.doc •94- 201006485 能夠使用常規HPLC技術偵測IgG之溶解性之增大或減小。 關於可用於分析溶解性之分析技術之更全面清單（參見 Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London，UK.編著者：Shamlou，P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions (1993)， 93-117.出版商：
Butterworth-Heinemann, Oxford, UK and Pearlman,
Rodney ; Nguyen, Tue H, Advances in Parenteral Sciences (1990), 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301)。治療性 mAb之溶解性是調配至通常為充分給藥所需之高濃度的關 健。如本文中概述，>100 mg/mL之溶解性可為適應有效抗 體給藥所需。例如，抗體溶解性在早期研究階段中可為至 少約5 mg/mL，在一實施例中在高級製程科學階段中至少 約25 mg/mL，或在一實施例中至少約100 mg/mL，或在一 實施例中至少約1 50 mg/mL。熟習此項技術者顯而易見蛋 白質分子之内在性質，即蛋白質溶液之物理化學性質為重 要的，例如穩定性、溶解性、黏度。然而，熟習此項技術 者瞭解存在可用作添加劑以有利地影響最終蛋白質調配物 之特徵之廣泛多種賦形劑。此等賦形劑可包括：⑴液體溶 劑、共溶劑（例如醇，諸如乙醇）；（ii)緩衝劑（例如填酸 酯、乙酸酯、檸檬酸酯、胺基酸緩衝液）；（iii)糖或糖醇 (例如薦糖、海藻糖、果糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨糖 醇、聚葡萄糖）；（iv)界面活性劑（例如聚山梨酸酯20、 40、60、80、泊洛沙姆（poloxamer)) ; (v)等滲性改質劑（例 如諸如NaCl之鹽、糖、糖醇）；及（vi)其他（例如防腐劑、 140653.doc -95- 201006485 螯合劑、抗氧化劑、螯合物質（例如EDTA)、可生物降解的 聚合物、載劑分子（例如HSA、PEG)。 黏度為關於抗體製造及抗體處理（例如透濾/超濾）、填 充-精整過程（泵送態樣、過濾態樣）及傳遞態樣（可注射 性、複雜裝置傳遞）之非常重要之參數。低黏度使具有高 濃度之抗體之液體溶液成為可能。此使得相同劑量可以較 小體積投與》較小注射體積擁有注射時較低疼痛感之優 勢’且溶液不一定需要具有等滲性以減小患者注射時之疼 痛。抗體溶液之黏度可使得在100 (1/s)之剪切速率下，抗 體溶液黏度低於200 mPa.s，在一實施例中低於125 mPa’s，在另一實施例中低於7〇 mPa.s，且在另一實施例中 低於25 mPa.s或甚至低於1 〇 mPa.s。 B 5.3.生產效率 有效地表現於哺乳動物細胞（諸如中國倉鼠印巢細胞 (CHO))中之DVD-Ig之生成在一實施例中需要本身有效地 表現於哺乳動物細胞中之兩個親本單株抗體。自穩定哺乳 動物株（亦即CHO)之產率在約〇·5 g/L以上，在一實施例中 在約1 g/L以上’且在另一實施例中在約2_5 g/L範圍内或 更大（Kipriyanov SM，Little Μ. 1999 Mol Biotechnol. 12.173-201 . Carroll S, Al-Rubeai M. 2004 Expert Opin Biol Ther. 4:1821-9)。 抗體及Ig融合蛋白在哺乳動物細胞中之產生受若干因素 的影響。經由併入強啟動子、強化子及選擇標記來將表現 載體工程改造可使所關注之基因自經整合之載體複本之轉 140653.doc •96- 201006485 錄最大化。允許高水準之基因轉錄之載體整合位點之識別 可加強自載體之蛋白質表現（Wurm等人2004, Nature Biotechnology, 2004，Vol/Iss/Pg. 22/11 (1393-1398))。此 外，生產水準受抗體重鏈與輕鏈之比率及蛋白質組裝及分 泌之過程中之各種步驟的影響（Jiang等人2006, Biotechnology Progress, Jan-Feb 2006，第 22卷，第 1期， 第 313-8頁）。 B 6.免疫原性 ® 治療性mAb之投與可導致免疫反應之特定發生（亦即針 對治療性mAb之内源性抗體之形成）。可誘導免疫原性之 潛在要素應在選擇親本單株抗體期間分析，且可在DVD-Ig構築之前採取降低該風險之步驟以優化親本單株抗體。 已發現小鼠來源之抗體在患者中為高度免疫原性的。包含 小鼠可變區域及人類恆定區域之嵌合抗體之生成引入降低 治療性抗體之免疫原性的合乎邏輯的下一步驟（Morrison及 Schlom, 1990)。或者，如藉由Riechmann等人，1988對於 參 治療性抗體所描述，免疫原性可藉由將鼠類CDR序列轉移 至人類抗體構架中（再成型/CDR移植/人源化）來降低。另 一方法稱為之「重設表面」或「飾面」，其以齧齒動物可 變輕及重鏈區起始，僅表面可達之構架胺基酸改變為人類 胺基酸，同時CDR及埋置之胺基酸仍來自親本齧齒動物抗 體（Roguska等人1996)。在另一類型之人源化中，代替移植 整個CDR，一技術僅移植「特異性決定區域」（SDR)，其 定義為涉及抗體與其標靶之結合之CDR殘基之子集 140653.doc -97- 201006485 (Kashmiri等人2005) »此需要經由分析抗體-標靶複合物之 可利用三維結構或突變分析抗體CDR殘基以測定何者與標 靶相互作用來識別SDR。或者，與鼠類、嵌合或人源化抗 體相比，完全人類抗體可具有降低之免疫原性。 降低治療性抗體之免疫原性之另一方法為消除預測為免 疫原性之某些特定序列。在一方法中，在第一代生物製劑 已在人類中測試且發現具有不可接受之免疫原性之後，可 將B細胞抗原決定基定位且隨後改變以避免免疫偵測。另 一方法使用預測且移除潛在T細胞抗原決定基之方法。已 開發計算方法以掃描且識別具有結合於MHC蛋白質之潛力 之生物治療劑之肽序列（Desmet等人2005)。或者，基於人 類樹突狀細胞之方法可用於識別潛在蛋白質過敏原中之 CD4+ T細胞抗原決定基（Stickler 等人2005 ; S.L. Morrison及 J· Schlom，//wporiaW v4c?v· Onco/· (1990)，第 3-18 頁；Riechmann, L.，Clark, M.，Waldmann, H.及 Winter, G. 「Reshaping human antibodies for therapy.」Nature (1988) 332: 323-327 » Roguska-M-A, Pedersen-J-T, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee-M, Cook-S, Lambert-J-M, Blattler-W-A, Rees-A-R, Guild-B-C. A comparison of two murine mAbs humanized by CDR-grafting and variable domain re surfacing. Protein engineering, {Protein-Eng}, 1996，第 9卷，第 895-904 頁； Kashmiri-Syed-V-S, De-Pascalis-Roberto, Gonzales-Noreen-R, Schlom-Jeffrey. SDR grafting--a new approach to 140653.doc • 98· 201006485 antibody humanization. Methods (San Diego Calif.)， {Methods}，2005 年 5 月，第 36卷，第 1期，第 25-34 頁； Desmet-Johan, Meersseman-Geert, Boutonnet-Nathalie, Pletinckx-Jurgen, De-Clercq-Krista, Debulpaep-Maja， Braeckman-Tessa，Lasters-Ignace. Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by a novel affinity scoring method and experimental validation. 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Journal of immunotherapy 2000，第 23卷，第 654-60頁）° B 7.活體内功效 為生成具有所需活體内功效之DVD-Ig分子，當以組合 形式給出時，生成且選擇具有類似所需活體内功效之mAb 為重要的。然而，在一些情況中，DVD-Ig可展現不能藉 由兩個獨立mAb之組合達成之活體内功效。例如，DVD-Ig 可使得兩個標靶緊密鄰近，產生不能藉由兩個獨立mAb 之組合達成之活性。額外合乎需要的生物功能在本文中在 B 3部分中描述。可基於諸如藥物代謝動力學伙、組織分 布、可溶相對於細胞表面標靶，及標靶濃度-可溶/密度-表 面之因素來選擇具有DVD-Ig分子中之所需特徵之親本抗 體。 B 8.活體内組織分布 為生成具有所需活體内組織分布之DVD-Ig分子，在一 140653.doc -99- 201006485 實施例中，必須選擇具有類似所需活體内組織分布概況之 親本mAb。或者，在其他時候，基於雙特異㈣向策略之 機制，當以組合形式給出時，可能不需要選擇具有類似所 需活艘内組織分布之親本mAbe例如，在—結合組份將 DVD-响向輸送至特定位點，由此將第二結合組份引至 同一靶點的DVD-Ig之情況下。例如，DVD_Ig之一結合特 異性可靶向胰腺（胰島細胞）且另一特異性可將引至胰 腺以誘導胰島素。 B 9.同型： 為生成具有包括（但不限於）同型、效應功能及循環半衰 期之所需性質之DVD-Ig分子，在一實施例中，選擇視治 療效用及所需治療終點而具有合適Fc效應功能之親本 mAb。存在五個主要重鏈種類或同型（其中一些具有若干 子型）且此等決定抗體分子之效應功能。此等效應功能存 在於抗體分子之鉸鏈區域、CH2及CH3區中。然而，抗體 分子之其他部分中之殘基亦可具有對於效應功能之作用。 欽鍵區域Fc效應功能包括：⑴抗體依賴性細胞毒性、（h) 補體（Clq)結合、活化及補體依賴性細胞毒性（Cdc)、（iii) 抗原-抗體複合物之吞嗤作用/清除及（iv)在一些情況中之細 胞激素釋放。抗體分子之此等Fc效應功能經由Fc區域與一 組種類特異性細胞表面受體之相互作用來介導。IgG 1同型 之抗體最具有活性’而IgG2及IgG4具有最少或無效應功 能。IgG抗體之效應功能經由與三個在結構上同源的細胞 Fc受體類型（及子型）(FcgRl、FcgRII及FcgRIII)之相互作用 140653.doc 201006485 來介導。IgG 1之此等效應功能可藉由將下部鉸鏈區域中之 為FcgR及Clq結合所需之特定胺基酸殘基突變（例如 L234A、L23 5A)來消除。Fc區域、尤其CH2_CH3區中之胺 基酸殘基亦決定抗體分子之循環半衰期。此Fc功能經由Fc 區域與新生兒Fc受體（FcRn)之結合來介導，該新生兒以受 體負責抗體分子自酸性溶酶體再循環回至周身循環。 mAb是具有活性還是非活性同型視抗體之所需治療終點 而定。同型之使用及所需治療結果之一些實例列於以下： ❹ a)若所需終點為可溶細胞激素之功能中和，則可使用非活 性同型； b) 若所需結果為清除病理蛋白，則可使用活性同型； c) 若所需結果為清除蛋白質聚集體，則可使用活性同型； d) 若所需結果為拮抗表面受體，則使用非活性同型 (Tysabri、igG4 ; OKT3、突變IgGl); e) 若所需結果為消除標靶細胞，則使用活性同型 瞻 （Herceptm、IgGl(且具有增強之效應功能）；及 〇若所需結果為自循環清除蛋白質而不進入CNS，則可使 用1gM同型（例如清除循環Ab肽物質）。 親本mAb<Fc效應功能可藉由在此項技術中熟知之各種 活體外方法測定。 如所討論，同型之選擇，且由此效應功能視所需治療終 疋在僅僅需要中和循環標把（例如阻斷受體-配位體 相互作用）之情況下，可能不需要效應功能。在該等情況 中’需要消除效應功能之同型或抗體Fc區域中之突變。在 140653.doc 201006485 消除標靶細胞為治療終點（例如消除腫瘤細胞）的其他情況 中，需要增強效應功能之同型或Fc區域中之突變或去岩藻 糖基化（Presta GL，Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656, 2006 » Satoh M., Iida S., Shitara K. Expert Opinion Biol. Ther· 6:1161-1173，2006)。類似地，視治療效用而定，抗 體分子之循環半衰期可藉由在Fc區域甲引入特定突變而調 節抗體-FeRn相互作用來縮短/延長（Dall’Acqua WF，Kiener PA, Wu H. J. Biol. Chem. 281:23 514-23 524, 2006 ； Petkova SB., Akilesh S·， Sproule TJ.等人 Internat. Immunol. 18:1759-1769, 2006 ; Vaccaro C., Bawdon R.，Wanjie S等人 PNAS 103:18709-18714, 2007)。 關於影響正常治療性mAb之不同效應功能之各種殘基之 公開資訊可能需要對於DVD-Ig加以確認°在DVD_IS格式 中，除經識別用於調節單株抗體效應功能之彼等殘基以外 之額外（不同）Fc區域殘基可能會是較重要的° 總體而言，關於何等Fc效應功能（同裂）在最終DVD_Ig% 式中至關重要之判定視疾病適應症、治療標鞋*、所需治療 終點及安全考慮而定。以下列出例示性合適重鍵及輕鍵亙 定區域，其包括（但不限於）： 〇 IgGl -異型：Glmz 〇 IgGl 突變體-A234、A235 〇 IgG2 -異型：G2m(n-) 〇 K-Km3 ο λ 140653.doc -102- 201006485
Fc受體及Clq研究：因抗體與細胞膜上之任何過度表現 之標靶複合所引起的不當抗體依賴性細胞介導型細胞毒性 (ADCC)及補體依賴性細胞毒性（CDC)之可能性可藉由（例 如L234A、L23 5A)鉸鍵區域突變來取消。存在於mAb之 IgG 1鉸鏈區域中之此等經取代胺基酸預期會導致mAb與人 類Fc受體（而非FcRn)之結合減少，此歸因於FcgR結合據信 出現於IgGl鉸鏈區域上之重疊位點内。mAb之此特徵可導 致優於含有野生型IgG之抗體之經改良之安全概況。mAb 與人類Fc受體之結合可藉由使用細胞株（例如THP-1、 K562)及表現FcgRIIb(或其他FcgR)之工程改造CHO細胞株 之流式細胞儀實驗來測定。與IgGl對照單株抗體相比， mAb展示降低的與FcgRI及FcgRIIa之結合，而與FcgRIIb之 結合未受影響。Cl q藉由抗原/IgG免疫複合物之結合及活 化觸發具有後續發炎及/或免疫調節反應之典型補體級 聯。IgG上之Clq結合位點已定位至IgG鉸鏈區域内之殘 基。Clq與增大濃度之mAb之結合係藉由ClqELISA評估。 如當與野生型對照IgGl之結合相比時所預期，結果證明 mAb不能結合於Clq。總體而言，L234A、L235A鉸鏈區域 突變消除mAb與FcgRI、FcgRIIa及Clq之結合但不影響 mAb與FcgRIIb之相互作用。此資料提示在活體内，具有 突變體Fc之mAb正常地與抑制性FcgRIIb相互作用但可能 不能與活化FcgRI及FcgRIIa受體或Clq相互作用。 人類FcRn結合：新生兒受體（FcRn)負責輸送IgG穿過胎 盤且控制IgG分子之分解代謝半衰期。可能需要增加抗體 140653.doc -103- 201006485 之末端半衰期以改良功效、降低劑量或投與頻率，或改良 定位至標靶。或者，進行相反過程可能為有利的，亦即減 小抗體之末端半衰期以降低全身暴露量或改良標靶對非標 靶結合比。裁適IgG與其補救受體FcRn之間之相互作用提 供增加或減小IgG之末端半衰期之一方式。循環中之蛋白 質（包括IgG)係經由某些細胞（諸如血管内皮之彼等細胞）實 施之微胞飲作用而溶解於流體相中。IgG可在稍微酸性條 件（pH值6.0-6.5)下結合核内體中之FcRn且可再循環至細胞 表面，在細胞表面處其在幾乎中性條件（pH值7.0-7.4)下釋 放。FcRn80、16、17上之Fc區域結合位點之定位展示跨物 種保守之兩個組胺酸殘基（His310及His435)決定著此相互 作用之pH值依賴性。使用噬菌體呈現技術，識別增加與 FcRn之結合且延長小鼠IgG之半衰期之小鼠Fc區域突變（參 見 Victor, G.等人；Nature Biotechnology (1997), 15(7)， 637-640)。亦已識別增加在pH值6.0下、而非在pH值7.4下 人類IgG對於FcRn之結合親和力之Fc區域突變（參見 Dall'Acqua William F, 等人，Journal of Immunology (2002), 169(9)，5171-80)。另外，在一情況中，對於恆河 猴FcRn亦觀察到結合之類似pH值依賴性增加（多達27倍）， 且此導致與親本IgG相比在恆河猴中之血清半衰期增加兩 倍（參見 Hinton, Paul R.等人，Journal of Biological Chemistry (2004)，279(8), 6213-6216)。此等觀測結果指示 藉由裁適Fc區域與FcRn之相互作用來延長抗體治療劑之血 漿半衰期為可行的。相反地，減弱與FcRn之相互作用之Fc 140653.doc -104- 201006485 區域突變可縮短抗體半衰期。 B.10藥物代謝動力學（PK): 為生成具有所需藥物代謝動力學概況之DVD-Ig分子， 在一實施例中，選擇具有類似所需藥物代謝動力學概況之 親本mAb。一個考慮因素為對於單株抗體之免疫原性反應 (亦即，HAHA，人類抗人類抗體反應；HAC A，人類抗嵌 合抗體反應）進一步使此等治療劑之藥物代謝動力學複雜 化。在一實施例中，將具有最少免疫原性或無免疫原性之 單株抗體用於構築DVD-Ig分子以使得所得DVD-Ig亦具有 最少免疫原性或無免疫原性。決定mAb之PK之一些因素包 括（但不限於）mAb之内在性質（VH胺基酸序列）、免疫原 性、FcRn結合及Fc功能。 因為齧齒動物中之PK概況與獼猴及人類中之單株抗體 之PK概況充分相關（或齧齒動物中之PK概況密切地預測獼 猴及人類中之單株抗體之PK概況），所以所選親本單株抗 體之PK概況可易於在齧齒動物中測定。如實例部分 1.2.2.3.八中描述來測定卩反概況。 在選擇具有所需PK特徵（及如本文中討論之其他所需功 能性質）之親本單株抗體之後，構築DVD-Ig。因為DVD-Ig 分子含有來自兩個親本單株抗體之兩個抗原結合區，所以 亦評估DVD-Ig之PK性質。因此，在測定DVD-Ig之PK性質 時，可採用基於來源於2個親本單株抗體之兩個抗原結合 區之功能來測定PK概況之PK檢定。可如實例1.2.2.3.A中 描述來測定DVD-Ig之PK概況。可影響DVD-Ig之PK概況之 140653.doc -105- 201006485 其他因素包括抗原結合區（CDR)定向、連接子尺寸及 Fc/FcRn相互作用。親本抗體之ρκ特徵可藉由評估以下參 數來分析：吸收、分布、新陳代謝及排泄。 吸收：迄今為止’治療性單株抗體之投與為經由非經腸 途徑（例如靜脈内[IV]、皮下[sc]或肌肉内[IM])。在sc或 IM投與之後自胞間隙將mAb吸收至系統循環中基本上經由 淋巴路經。可飽和、系統前、蛋白水解降解可導致在血管 外投與之後絕對生物可用性可變。通常，歸因於在高劑量 下蛋白水解容量飽和，可觀察到隨著單株抗體劑量增加，麕 絕對生物可用性增加。因為淋巴液緩慢排放至血管系統 中’所以mAb之吸收過程通常相當緩慢，且吸收之持續時 間可歷經數小時至好幾天。在sc投與之後之單株抗體之絕 對生物可用性大體上在5〇%至1 〇〇%之範圍内。在由dvd_
Ig構築體靶向之血腦障壁處由輸送介導之結構情況下，由 於在血腦障壁（BBB)處於CNS隔室（其中DVD-Ig經釋放以能 夠經由其第一抗原識別部位相互作用）中增強之跨細胞輸 送’在血漿中之循環時間可降低。 G 分布·在IV投與之後，單株抗體通常遵循兩階段金清 (或血漿）濃度-時間概況，以快速分布階段開始，接著為緩 慢消除階段。一般而言’雙指數藥物代謝動力學模型較好 地描述此類型之藥物代謝動力學概況。mAb在中央室中之 为布體積（Vc)通常等於或務微大於血聚體積（2_3公升）。血 清（血漿）濃度相對於時間概況之不同兩階段模式對於其他 非經腸投與途徑（諸如IM或SC)可能為不相仿的，此歸因於 140653.doc -106- 201006485 血清（血漿）濃度-時間曲線之分布階段由較長吸收部分所遮 蔽。許多因素（包括物理化學性質、位點特定且標靶定向 之受體介導之吸收、組織之結合能力及mAb劑量）可影響 mAb之生物分布。一些此等因素可造成mAb之生物分布之 非線性。 新陳代謝及排泄：歸因於分子尺寸，完整單株抗體不經 由腎臟排泄至尿中。其基本上藉由新陳代謝（例如分解代 謝）來滅活。對於基於IgG之治療性單株抗體，半衰期通常 在數小時或1-2天至20天以上之範圍内。mAb之消除可藉 由許多因素影響，該等因素包括（但不限於）對於FcRn受體 之親和力、mAb之免疫原性、mAb之糖基化程度、mAb對 於蛋白水解之敏感性及受體介導之消除。 B. 11人類及毒物學物種（tox species)之組織交叉反應性模 式： 相同染色模式提示可在毒物學物種中分析潛在人類毒 性。毒物學物種為研究無關毒性之彼等動物。 選擇滿足兩個標準之個體抗體。（1)適合於抗體標靶之 已知表現之組織染色。（2)人類與毒物學物種組織之間來自 相同器官之類似染色模式。 標準1:免疫及/或抗體選擇通常採用重組或合成抗原（蛋 白質、碳水化合物或其他分子）。與天然對應物之結合及 相對於無關抗原之對比篩選（counterscreen)通常為治療性 抗體之篩選漏斗（screening funnel)之一部分。然而，相對 於多種抗原之篩選通常為不切實際的。因此，對來自所有 140653.doc -107· 201006485 主要器官之人類組織進行組織交叉反應性研究用來排除抗 體與任何無關抗原之不當結合。 標準2 :對人類及毒物學物種組織（獼猴、狗、可能之齧 齒動物及其他，如在人類研究中測試相同36或37個組織） 之比較性的組織交又反應性研究有助於驗證毒物學物種之 選擇。在對冷凍組織切片之典型組織交叉反應性研究中， 治療性抗體可證明與已知抗原之預期結合及/或在較小程 度上基於任一低水準相互作用（非特異性結合、與類似抗 原之低水準結合、基於低水準電荷之相互作用等）與組織 之結合。在任何情況下，最相關毒物學動物物種為具有與 人類及動物組織結合之最高程度相符性的一物種。 組織交叉反應性研究遵循適當規章準則，包括EC CPMP Guideline III/5271/94「Production and quality control of mAbs」及 1997 US FDA/CBER「Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use j。將屍檢或活組織檢查獲得之人類組織之 冷洗切片（5 μιη)在物鏡上固定且乾燥。使用抗生物素蛋白-生物素系統執行組織切片之過氧化酶染色。FDA’s Guidance ▽ Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use j。 相關參照案包括 Clarke J 2004，Boon L. 2002a，Boon L 2002b, Ryan A 1999 ° 組織交叉反應性研究通常分兩個階段進行，第一階段包 括來自一人類供體之32個組織（通常：腎上腺、胃腸道、 140653.doc -108 - 201006485 前列腺、膀胱、心臟、骨絡肌、血細胞、腎臟、皮膚、骨 腾、肝、脊聽、乳房、肺、脾臟、小腦、淋巴結、睪丸、 大腦皮質、卵巢、胸腺、結腸、胰腺、曱狀腺、内皮、甲 狀旁腺、輸尿管、眼睛、垂體、子宮、輸卵管及胎盤）之 冷减切片。在第一階段中’完全交叉反應性研究藉由來自 3個無關成人之多達38個組織（包括腎上腺、血液、血管、 骨趙、小腦、大腦、子宮頸、食管、眼睛、心臟、腎臟、 大腸、肝、肺、淋巴結、乳房乳腺、卵巢、輸卵管、胰 _ 腺、曱狀旁腺、周邊神經、垂體、胎盤、前列腺、唾液 腺、皮膚、小腸、脊髓、脾臟、胃、橫紋肌、睪丸、胸 腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管、膀胱及子宮）來執行。研 究通常以最低限度兩個劑量水準來進行。 治療性抗體（亦即測試樣品）及同型匹配對照抗體可經生 物素標記以便抗生物素蛋白_生物素複合物（ABC)偵測；其 他偵測方法可包括FIT C (或以其他方式）標記之測試樣品之 參第三抗體偵測，或未標記之測試樣品與經標記之抗人類 IgG預複合。 簡言之，將屍檢或活組織檢查獲得之人類組織之冷凍切 片（約5 μιη)在物鏡上固定且乾燥。使用抗生物素蛋白-生物 素系統執行組織切片之過氧化酶染色。首先（在預複合偵 測系統之情況下），將測試樣品與第二經生物素標記之抗 人類IgG—起培養且發展成為免疫複合物。將2及1〇叫 之測試樣品之最終濃度下之免疫複合物添加於物鏡上之組 織切片上且隨後使組織切片與抗生物素蛋白-生物素-過氧 140653.doc 201006485 化酶套組一起反應30分鐘。隨後’將DAB(3,3,_二胺基聯 苯胺’過氧化酶反應之受質）塗覆歷時4分鐘以便組織染 色°將抗原-瓊脂糖珠粒用作陽性對照組織切片。 基於所討論之標靶抗原之已知表現，將任何特異性染色 判定為預期（例如與抗原表現一致）或非預期反應性。將任 何判定為特異性之染色關於強度及頻率進行計分。抗原或 血清競爭或阻斷研究可進一步輔助判定所觀察到之染色是 為特異性還是為非特異性。 若發現兩個所選抗體滿足選擇標準-適當組織染色、人❹ 類與毒物學動物特定組織之間之匹配染色_則可選擇其用 於DVD-Ig生成。 必須對於最終DVD-Ig構築體來重複組織交叉反應性研 究，但雖然此等研究遵循如本文中概述之相同方案，但是 因為任何結合可來自兩個親本抗體中之任一者，所以其分 析更複雜，且任何未經說明的結合需要藉由複雜抗原競爭 研究來確認。 顯而易見，若針對（1)缺少非預期組織交叉反應性觀測© 結果及（2)在相應人類與毒物學動物物種組織之間之組織交 叉反應性觀測結果之適當相似性來選擇兩個親本抗體，則 極大地簡化對如DVD-Ig之多特異性分子進行組織交又反 應性研究之複雜任務。 B.12特異性及選擇性： 為生成具有所需特異性及選擇性之DVD_Ig分子，需要 生成及選擇具有類似所需特異性及選擇性概況之親本 140653.doc •110- 201006485 mAb。 DVD-Ig之特異性及選擇性之結合研究歸因於四個或四 個以上結合位點而可為複雜的’兩個各自用於每一抗原。 簡言之，關於DVD-Ig使用ELISA、BIAcore、KinExA或其 他相互作用研究之結合研究需要監控一個、兩個或兩個以 上抗原與DVD-Ig分子之結合。雖然BIAcore技術可解析多 個抗原之順次、獨立結合，但是包括ELISA之更傳統方法 或如KinExA之更現代技術不能。因此，謹慎表徵每一親 Φ 本抗體為關鍵性的。在已針對特異性來表徵每一個體抗體 之後，DVD-Ig分子中之個體結合位點之特異性保留之確 認得以極大地簡化。 顯而易見，若在兩個親本抗體組合成DVD-Ig之前針對 特異性來進行選擇，則極大地簡化測定DVD-Ig之特異性 之複雜任務。 抗原-抗體相互作用研究可採用許多形式，包括許多典 型蛋白質蛋白質相互作用研究，包括elisa(酶聯免疫吸附 〇 檢定）、質譜分析、化學交聯、具有光散射之SEC、平衡透 析、凝膠滲透、超濾、凝膠層析、較大區分析SEC、微量 製備級超速離心（沈降平衡）、光譜學方法、滴定微量熱 法、沈降平衡（在分析超速離心機中）、沈降速度（在分析離 心機中）、表面電漿共振（包括BIAcore)。相關參照案包括 「Current Protocols in Protein Science」，John E. Coligan， Ben M. Dunn，David W. Speicher，Paul T，Wingfield(編）第 3 卷，第19及20章（由John Wiley & Sons Inc.出版）及其中包 140653.doc -Ill - 201006485 括之參照案及「Current Protocols in Immunology」，John E. Coligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Ethan M. Shevach，Warren Strober(編）（由 John Wiley & Sons Inc· 出版）及其中包括之參照案。 全血中之細胞激素釋放：mAb與人類血細胞之相互作用 可藉由細胞激素釋放檢定研究（Wing, M. G. Therapeutic Immunology (1995), 2(4), 183-190 ;「Current Protocols in Pharmacology」，S.J.Enna，MichaelWilliams，JohnW. Ferkany，Terry Kenakin，Paul Moser,(編）（由 John Wiley & Sons Inc.出版）；Madhusudan，S. Clinical Cancer Research (2004), 10(19)，6528-6534 ; Cox，J. Methods (2006)，38(4)， 274-282 ； Choi, I. European Journal of Immunology (2001), 31(1)，94-106)。簡言之，將各種濃度之mAb與人類全血一 起培養24小時。測試之濃度應涵蓋較寬範圍，包括模擬患 者中之典型血液含量之最終濃度（包括（但不限於1〇〇 ng/ml-100 pg/ml))。在培養之後，分析上清液及細胞溶解 產物中之IL-IRa、TNF-α、IL-lb、IL-6及IL-8之存在。將 對於mAb而言生成之細胞激素濃度概況與藉由陰性人類 IgG對照及陽性LPS或PHA對照產生之概況相比。藉由來自 細胞上清液及細胞溶解產物兩者之mAb展示之細胞激素概 況與對照人類IgG相當。在一實施例中，單株抗體不與人 類血細胞相互作用以自發地釋放發炎細胞激素。 DVD-Ig之細胞激素釋放研究歸因於四個或四個以上結 合位點而為複雜的，兩個各自用於每一抗原。簡言之，如 140653.doc • 112- 201006485 本文中描述之細胞激素釋放研究量測完全DVD-Ig分子對 於全血或其他細胞系統之作用’但可解析分子之哪—部分 導致細胞激素釋放。一旦已偵測到細胞激素釋放，必須確 定DVD-Ig製劑之純度，此歸因於一些共純化之細胞組分 可獨立地導致細胞激素釋放。若純度不造成問題，則可能 需要採用DVD-Ig之分裂（包括（但不限於）移除Fc部分、分 離結合位點等）、結合位點誘變或其他方法以將任何觀察 結果去卷積。顯而易見，若在兩個親本抗體組合成DVD_ ❹ 4之前針對缺乏細胞激素釋放來進行選擇，則極大地簡化 此複雜任務。 B.13毒物學研究之對於其他物種之交又反應性： 在一實施例中，所選個體抗體具有與適當毒物學物種 (例如獼猴）之足夠交叉反應性。親本抗體需要結合於直系 同源性物種標靶（亦即獼猴）且引起適當反應（調節、中和、 活化）。在一實施例中，與直系同源性物種標靶之交叉反 參應性（親和力/效能）應在人類標靶之10倍内。實務上，對於 多個物種（包括小鼠、大鼠、狗、猴（及其他非人類靈長 類））以及疾病模型物種（亦即針對哮喘模型之羊）來分析親 本抗體。親本單株抗體對於毒物學物種之可接受之交又反 應性使得可在相同物種中進行DVD-Ig-Ig之將來毒物學研 究。為此原因，兩個親本單株抗體應具有對於共同毒物學 物種之可接受之父又反應性，因此使得可在相同物種中進 行DVD-Ig之毒物學研究。 親本mAb可選自能夠結合特異性標靶且在此項技術中熟 140653.doc •113- 201006485 知之各種mAb。此等包括（但不限於）抗TNF抗體（美國專利 第6,258,562號）、抗IL-12及/或抗IL-12p40抗體（美國專利 第 6,914,128號）、抗IL-18 抗體（US 2005/0147610 A1)、抗 C5、抗 CBL、抗 CD147、抗 gpl20、抗 VLA-4、抗 CDlla、 抗CD18、抗VEGF、抗CD40L, 抗CD-40(參見例如WO 2007124299)抗 Id、抗 ICAM-1、抗 CXCL13、抗 CD2、抗 EGFR、抗 TGF-p2、抗 HGF、抗 cMet、抗 DLL-4、抗 NPR1、抗PLGF、抗ErbB3、抗E-選擇素、抗Fact VII、抗 Her2/neu、抗 F gp、抗 CD11/18、抗 CD14、抗 ICAM-3、抗 RON、抗 CD-19、抗 CD80(參見例如 W02003039486)、抗 CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2-整合素、抗α4β7、抗 CD52、抗HLA DR、抗CD22(參見例如美國專利第 5,789,554 號）、抗 CD20、抗 MIF、抗 CD64(FcR)、抗 TCRaP、抗 CD2、抗 Hep B、抗 CA 125、抗 EpCAM、抗 gpl20、抗 CMV、抗 gpllbllla、抗 IgE、抗 CD25、抗 CD33、抗 HLA、抗 IGF1，2、抗 IGFR、抗 VNR整合素、抗 IL-lcx、抗 IL-Ιβ、抗 IL-1 受體、抗 IL-2 受體、抗 IL-4、抗 IL-4 受體、抗 IL5、抗 IL-5 受體、抗 IL-6、抗 IL-6R、 RANKL、NGF、DKK、ανβ3、IL-17A、抗 IL-8、抗 IL-9、 抗 IL-13、抗 IL-13受體、抗IL-17 及抗IL-23、IL-23pl9(參 見 Presta LG. 2005 Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol. 116:731-6及 http://www.pa th.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodi es.html)。 140653.doc -114- 201006485
親本mAb亦可選自經批准用於臨床試驗或用於臨床使用 之開發中之各種治療性抗體。該等治療性抗體包括（但不 限於）利妥昔單抗（rituximab)(Rituxan®，IDEC/Genentech/ Roche)(參見例如美國專利第5,736，137號），經批准治療非 霍奇金氏淋巴瘤之嵌合抗CD20抗體；HuMax-CD20，目前 藉由Genmab開發之抗CD20，描述於美國專利第5,500,362 號中之抗 CD20 抗體，AME-133(Applied Molecular Evolution) ， hA20(Immunomedics, Inc) ， HumaLYM β (Intracel)及 PR070769(PCT/US2003/040426 ，題為 「Immunoglobulin Variants and Uses Thereof」），曲妥珠 單抗（trastuzumab)(Herceptin®, Genentech)(參見例如美國 專利第5,677,171號），經批准治療乳癌之人源化抗Her2/neu 抗體；帕妥珠單抗（pertuzumab)(rhuMab-2C4 ， Omnitarg®)，目前藉由Genentech開發；描述於美國專利第 4,753,894號中之抗Her2抗體；西妥昔單抗 (cetuximab)(Erbitux®，Imclone)(美國專利第 4,943,533號； ❹ PCT WO 96/40210)，各種癌症之臨床試驗中之嵌合抗 EGFR抗體；ABX-EGF(美國專利第6,235,883號），目前藉 由 Abgenix-Immunex-Amgen 開發；HuMax-EGFr(美國第 10/172,317 號），目前藉由 Genmab 開發；425 ， EMD55900，EMD62000，及 EMD72000(Merck KGaA)(美國 專利第 5,558,864 號；Murthy 等人 1987，Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60 ; Rodeck等人 1987，J Cell Biochem· 35(4):315-20 ; Kettleborough 等人 1991，Protein Eng· 140653.doc -115- 201006485 4(7):773-83) ； ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045 ; Modjtahedi等人 1993, J· Cell Biophys. 1993， 22(1-3):129-46 ; Modjtahedi 等人 1993，Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53 ； Modjtahedi 等人 1996，Br J Cancer, 73(2):228-35 ; Modjtahedi 等人 2003， Int J Cancer， 105(2):273-80) ； TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular，Cuba (美國專利第 5,891,996 號；美國專利第 6,506,883 號；Mateo 等人 1997， Immunotechnology, 3(1):71-81) ; mAb-806(Ludwig Institue ❺ for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth 等人 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44) ; KSB-102(KS Biomedix) ; MR1 -1 (IVAX, National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2)；及 SC 100(Scancell)(PCT WO 01/88138);阿倫單抗（alemtuzumab)(Campath®， Millenium)，目前經批准用於治療B細胞慢性淋巴細胞白 血病之人源化mAb ; 莫羅單抗（muromonab)-CD3 (Orthoclone OKT3®)，藉由 Ortho Biotech/Johnson & 零 Johnson開發之抗CD3抗體，替坦異貝莫單抗（Zevalin®)， 藉由IDEC/Schering AG開發之抗CD20抗體，吉妥珠單抗奥 0坐米星（Mylotarg®)，藉由Celltech/Wyeth開發之抗 CD33(p67蛋白質）抗體，阿法赛特（alefacept) (Amevive®)，藉由Biogen開發之抗LFA-3 Fc融合體，阿昔 單抗（abciximab)(ReoPro®)，藉由 Centocor/Lilly 開發，巴 利昔單抗（basiliximab)(Simulect®)，藉由Novartis開發，帕 140653.doc -116- 201006485 利珠單抗（palivizumab)(Synagis®)，藉由 Medimmune 開 發，英利昔單抗（infliximab)(Remicade®)，藉由Centocor 開 發之抗TNFa抗體，阿達木單抗（adalimumab)(Humira®)， 藉由Abbott開發之抗TNFcx抗體，Humicade®，藉由 Celltech開發之抗TNFa抗體，戈利木單抗（golimumab) (CNTO_148)，藉由Centocor開發之完全人類TNF抗體，依 那西普（etanercept)(Enbrel®)，藉由 Immun.ex/Amgen開發之 p75 TNF受體Fc融合體，來那西普（lenercept)，先前藉由 β Roche開發之p55TNF受體Fc融合體，ABX-CBL，藉由 Abgenix 開發之抗 CD147抗體，ABX-IL8，藉由Abgenix 開 發之抗IL8抗體，ABX-MA1，藉由Abgenix開發之抗 MUC18抗體，Pemtumomab(R1549，90Y-muHMFGl)，藉由 Antisoma 開發中之抗 MUC1 ，Therex(R1550)，藉由 Antisoma 開發之抗MUC1抗體，AngioMab(AS1405)，藉由 Antisoma開發，HuBC-1，藉由 Antisoma開發，Thioplatin (AS 1407)，藉由 Antisoma 開發，Antegren®(那他珠單抗 (natalizumab))，抗 α-4-β-1(νΧΑ-4)及α-4-β-7抗艘，藉由 Biogen開發，VLA-1 mAb，藉由Biogen開發之抗VLA-1整 合素抗體，LTBR mAb，藉由Biogen開發之抗淋巴毒素β受 體（LTBR)抗體，CAT-152，藉由 Cambridge Antibody Technology 開發之抗TGF-β〗抗體，ABT 874(J695)，藉由 Abbott 開發之抗 IL-12p40抗體，CAT-192，藉由 Cambridge Antibody Technology 及 Genzyme 開發之抗 TGFpi 抗體， CAT-213，藉由 Cambridge Antibody Technology 開發之抗嗜 140653.doc -117- 201006485 伊紅性粒細胞趨化因子l(Eotaxinl)抗體，LymphoStat-B®，藉由 Cambridge Antibody Technology及 HumanGenome Sciences Inc.開發之抗 Blys抗體，TRAIL-RlmAb ’ 藉由 Cambridge Antibody Technology及 HumanGenome Sciences, Inc.開發之抗TRAIL-R1抗體，Avastin®貝伐單抗 (bevacizumab)，rhuMAb-VEGF)，藉由 Genentech開發之抗 VEGF抗體，藉由Genentech開發之抗HER受體家族抗體， 抗組織因子（ATF)，藉由Genentech開發之抗組織因子抗 體，Xolair®(奥馬珠單抗（Omalizumab))，藉由 Genentech 開發之抗IgE抗艘，Raptiva®(依法珠單抗（Efalizumab)) ’ 藉由Genentech及Xoma開發之抗CDlla抗禮，MLN-02抗體 (原先 LDP-02)，藉由 Genentech及 Millenium Pharmaceuticals 開發，HuMaxCD4，藉由Genmab開發之抗CD4抗體， HuMax-IL15，藉由Genmab及Amgen開發之抗IL15抗體， HuMax-Inflam，藉由 Genmab 及 Medarex 開發，HuMax-Cancer’ 藉由 Genmab及 Medarex及 Oxford GcoSciences 開發 之抗肝素酶I抗體，HuMax-Lymphoma，藉由Genmab及 Amgen 開發，HuMax-TAC，藉由 Genmab 開發，藉由 IDEC Pharmaceuticals 開發之 IDEC-131 及抗 CD40L抗體，IDEC-151(克立昔單抗（Clenoliximab))，藉由 IDEC Pharmaceuticals 開發之抗 CD4抗體，IDEC-114，藉由 IDEC Pharmaceuticals 開發之抗CD80抗體 ，IDEC-152 ， 藉由IDEC Pharmaceuticals開發之抗CD23，抗巨嗟細胞遷徙因子 (MIF)抗體，藉由 IDEC Pharmaceuticals開發，BEC2，藉由 140653.doc • 118- 201006485
Imclone開發之抗遺傳型抗體，IMC-1C11，藉由Imclone開 發之抗KDR抗體，DC101，藉由Imclone開發之抗flk-Ι抗 體，抗VE鈣黏附蛋白抗體，藉由Imclone開發，CEA·
Cide®(拉貝珠單抗（labetuzumab))、抗癌胚抗原（CEA)抗 體，藉由Immunomedics開發，LymphoCide®(依帕珠單抗 (Epratuzumab))，藉由 Immunomedics開發之抗CD22抗體， AFP-Cide，藉由 Immunomedics 開發，MyelomaCide，藉由
Immunomedics 發，LkoCide，藉由 Immunomedics 開發， 瘳 ProstaCide，藉由 Immunomedics 開發，MDX-010，藉由
Medarex開發之抗 CTLA4抗體，MDX-060，藉由 Medarex開 發之抗CD30抗體，MDX-070，藉由Medarex開發，MDX- 018，藉由Medarex開發，藉由Medarex 及 Immuno-Designed
Molecules 開發之 Osidem®(IDM-l)及抗 Her2 抗體，
HuMax®-CD4，藉由 Medarex 及 Genmab 開發之抗 CD4 抗 體，HuMax-IL15，藉由Medarex 及 Genmab 開發之抗 IL15 抗 體，CNTO 148，藉由 Medarex 及 Centocor/J&J 開發之抗 ❹ - TNFa抗禮，CNTO 1275，藉由Centocor/J&J開發之抗細胞 激素抗體，MOR10 1及MOR102，藉由MorphoSys開發之抗 細胞間黏著分子-1(ICAM-1)(CD54)抗體，MOR201，藉由 MorphoSys開發之抗纖維母細胞生長因子受體3(FGFR-3)抗 體，Nuvion®(維西利珠單抗（visilizumab))，藉由 Protein Design Labs開發之抗 CD3抗體，HuZAF®，藉由 Protein Design Labs開發之抗γ干擾素抗體，抗α5β1整合素，藉由 Protein Design Labs開發，抗IL-12，藉由 Protein Design 140653.doc •119· 201006485
Labs開發，ING-l，藉由Xoma開發之抗Ep-CAM抗體， Xolair®(奥馬珠單抗），藉由Genentech及Novartis開發之人 源化抗IgE抗體，及MLN01，藉由Xoma開發之抗β2整合素 抗體，本文於本段中所引用之所有參考文獻係以引用的方 式明確併入本文中。在另一實施例中，治療劑包括 KRN330(Kirin)，huA33 抗體（Α33，Ludwig Institute for Cancer Research)，CNTO 95(aV 整合素，Centocor)， MEDI-522(a νβ3 整合素，Medimmune)，伏洛西單抗 (volociximab)(a νβΐ 整合素，Biogen/PDL)，人類 mAb 216(B細胞糖基化抗原決定基，NCI)，BiTE MT103(雙特異 性 CD 19><CD3，Medimmune)，4G7xH22(雙特異性 B 細胞 xFcyRl ，Medarex/Merck KGa) ，rM28(雙特異性 CD28xMAPG，美國專利第 EP1444268號），MDX447(EMD 82633)(雙特異性CD64xEGFR，Medarex)，卡托莫西單抗 (Catumaxomab)(雷默伏（removab))(雙特異性 EpCAMx 抗 CD3，Trion/Fres)，郭托默單抗（Ertumaxomab)(雙特異性 HER2/CD3，Fresenius Biotech)，奥戈伏單抗（oregovomab) (奥伏瑞（OvaRex))(CA-125，ViRexx)，Rencarex®(WX G250)(碳酸酐酶 IX，Wilex)，CNT0888(CCL2, Centocor)， TRC105(CD105(内皮因子），Tracon)，BMS-663513(CD137促 效劑，Brystol Myers Squibb)，MDX-1342 (CD19, Medarex)，希 普利珠單抗（Siplizumab)(MEDI-507)(CD2，Medimmune)，奥伏 托默單抗（Ofatumumab) (Humax-CD20)(CD20，Genmab)，利妥 昔單抗（美羅華（Rituxan))(CD20，Genentech)，維爾托佐單 140653.doc •120· 201006485 抗（veltuzumab) (hA20)(CD20, Immunomedics)，依帕珠單 抗（CD22，Amgen)，魯昔單抗（lumiliximab)(IDEC 152) (CD23, Biogen)，莫羅單抗-CD3(CD3, Ortho)，HuM291 (CD3 fc受體，PDL Biopharma)，HeFi-1，CD30，NCI)， MDX-060(CD30，Medarex)，MDX-1401(CD30, Medarex)， SGN-30(CD30, Seattle Genentics)，SGN-33(林妥珠單抗 (Lintuzumab))(CD3 3, Seattle Genentics)，紮木單抗 (Zanolimumab)(HuMax-CD4)(CD4, Genmab) ， HCD122(CD40, Novartis) ， SGN-40(CD40, Seattle
Genentics)，Campathlh(阿倫單抗（Alemtuzumab))(CD52, Genzyme)，MDX-1411(CD70, Medarex)，hLLl(EPB-l) (CD74.38， Immunomedics)，加利昔單抗（Galiximab) (IDEC-144)(CD80，Biogen)，MT293(TRC093/D93)(裂解膠 原蛋白，Tracon)，HuLuc63(CSl, PDL Pharma)，伊彼力默 單抗（ipilimumab)(MDX-010)(CTLA4， Brystol Myers Squibb)，曲默力莫單抗（Tremelimumab)(替西力莫單抗 (Ticilimumab)，CP-675,2)(CTLA4，Pfizer)，HGS-ETR1(邁 帕突莫單抗（Mapatumumab))(DR4 TRAIL-R1 促效劑， Human Genome Science/Glaxo Smith Kline)，AMG-655(DR5，Amgen)，艾坡單抗（Apomab)(DR5，Genentech)， CS-1008(DR5, Daiichi Sankyo)，HGS，ETR2(來沙木單抗 (lexatumumab))(DR5 TRAIL-R2促效劑，HGS)，西妥昔單 抗（Cetuximab)(艾比特思（£1^^1^))(£0?11，1111(：1〇116)，1]^(：-11F8(EGFR，Imclone)，尼妥珠單抗（Nimotuzumab)(EGFR， 140653.doc -121- 201006485 YM Bio)，盤尼圖單抗（Panitumumab)(維克替比（Vectabix)) (EGFR, Amgen)，紮魯突木單抗（Zalutumumab) (HuMaxEGFr)(EGFR, Genmab) ， CDX-110(EGFRvIII, AVANT Immunotherapeutics)，阿德木單抗（adecatumumab) (MT201)(Epcam, Merck)，依決洛單抗（edrecolomab) (Panorex, 17-1 A)(Epcam, Glaxo/Centocor) > MORAb-003 (葉酸受體a, Morphotech)，KW-2871(神經結醣脂GD3, Kyowa)，MORAb-009(GP-9, Morphotech) > CDX-1307 (MDX-1307)(hCGb, Celldex)，曲妥珠單抗（Trastuzumab) (赫賽汀（Herceptin))(HER2，Celldex)，帕妥珠單抗 (Pertuzumab)(rhuMAb 2C4)(HER2(DI), Genentech)，阿泊 珠單抗（apolizumab)(HLA-DRp 鏈，PDL Pharma)，AMG-479(IGF-1R，Amgen)、抗 IGF-1R R1507(IGF1-R，Roche)， CP 751871(IGF1-R，Pfizer)，IMC-A12(IGF1-R, Imclone)， BIIB022(IGF-1R, Biogen) ， Mik-P-l(IL-2Rb(CD122), Hoffman LaRoche)，CNTO 328(IL6，Centocor)，抗KIR(1-7F9)(殺傷細胞 Ig狀受體（KIR)，Novo)，Hu3S193 (Lewis(y)， Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research) > hCBE-ll(LTpR > Biogen) » HuHMFGl(MUC1, Antisoma/NCI)， RAV12(N連接之碳水化合物抗原決定基，Raven)，CAL(副 甲狀腺素關聯蛋白（卩丁11-^)，11111乂61811丫〇【〇&11£〇1'111&)，（1：1'-011(PD1, CureTech) > MDX-1106(ono-4538) (PD1, Medarex/ Ono)，MAb CT-011(PD1，Curetech)，IMC-3G3(PDGFRa， Imclone)，巴維昔單抗（bavituximab)(破脂醯絲胺酸， 140653.doc -122- 201006485
Peregrine)，huJ591(PSM.A，Cornell Research Foundation)， muJ591(PSMA, Cornell Research Foundation) ， GC1008(TGFb(泛）抑制劑（IgG4)，Genzyme)，英利昔單抗 (Infliximab)(雷米卡德（Remicade))(TNFa，Centocor)， A27_15(轉鐵蛋白受體，Salk Institute，INSERN WO 2005/111082)，E2.3(轉鐵蛋白受體，Salk Institute)，貝伐 單抗（Bevacizumab)(阿瓦斯汀（Avastin))(VEGF， Genentech) > HuMV833(VEGF, Tsukuba Research Lab-• WO/2000/0 34337, University of Texas)，IMC-18F1 (VEGFR1，Imclone)，IMC-1121(VEGFR2, Imclone)。 B.構築DVD分子： 設計雙可變區免疫球蛋白（DVD-Ig)分子以使得來自兩個 不同親本單株抗體之兩個不同輕鏈可變區（VL)藉由重組 DNA技術直接或經由短連接子串聯連接，其後為輕鏈恆定 區。類似地，重鏈包含串聯連接之兩個不同重鏈可變區 (VH)，其後為恆定區CH1及Fc區域（圖1A)。 ❹ 可變區可使用重組DNA技術自藉由本文中描述之方法中 之任一者生成之親本抗體獲得。在一實施例中，可變區為 鼠類重鏈或輕鏈可變區。在另一實施例中，可變區為CDR 移植或人源化可變重鏈或輕鏈區。在一實施例中，可變區 為人類重鏈或輕鏈可變區。 在一實施例中，第一及第二可變區使用重組DNA技術彼 此直接連接。在另一實施例中，可變區經由連接子序列連 接。在一實施例中，連接兩個可變區。三個或三個以上可 140653.doc 123- 201006485 變區亦可直接或經由連接子序列連接。可變區可結合同一 抗原或可結合不同抗原。本發明之DVD分子可包括一個免 疫球蛋白可變區及一個非免疫球蛋白可變區，諸如受體之 配位體結合區、酶之活性區。DVD分子亦可包含2個或2個 以上非Ig區。 連接子序列可為單一胺基酸或多肽序列。在一實施例 中，連接子序列係選自由以下各者組成之群·· AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 1)、AKTTPKLEE GEFSEARV(SEQ ID NO: 2)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO:❿ 3)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4)、SAKTTP(SEQ ID NO: 5) ' RADAAP(SEQ ID NO: 6) ' RADAAPTVS(SEQ ID NO:
7)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8)、RADAAAA (G4S)4(SEQ ID NO: 9)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ' ADAAP(SEQ ID NO: 11) ' ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12)、TVAAP(SEQ ID NO: 13)、TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14)、QPKAAP(SEQ ID NO: 15)、QPKAAPS Θ VTLFPP(SEQ ID NO: 16)、AKTTPP(SEQ ID NO: 17)、冒 AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18) ' AKTTAP(SEQ ID NO: 19)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO: 20)、ASTKGP(SEQ ID NO: 21)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22)、 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23)、GENKVEYAPAL MALS(SEQ ID NO: 24)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO: 25)及 GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26)。連接 子序列之選擇基於若干Fab分子之晶體結構分析。在Fab或 140653.doc •124· 201006485 抗體分子結構中之可變區與CH1/CL恆定區之間存在天然 撓性鍵。此天然鍵包含約10-12個胺基酸殘基，其由來自v 區之C末端之4-6個殘基及來自CL/CH1區之N末端之4-6個 殘基提供。本發明之DVD Ig使用CL或CH1之N末端5-6個 胺基酸殘基，或11 -12個胺基酸殘基分別作為DVD-Ig之輕 鏈及重鏈中之連接子來生成。CL或CH1區之N末端殘基， 尤其前5-6個胺基酸殘基採用不具有強二級結構之環構 形，因此可充當兩個可變區之間之撓性連接子。因為CL或 參 CH1區之N末端殘基為Ig序列之一部分，所以cl或CH1區 之N末端殘基為可變區之天然延伸，因此在很大程度上使 潛在地自連接子及接合出現之任何免疫原性最小化。 其他連接子序列可包括CL/CH1區之任何長度之任何序 列，但不包括CL/CH1區之所有殘基，例如cl/CH1區之前 5-12個胺基酸殘基’輕鏈連接子可來自Ck或cx，且重鏈連 接子可來源於任何同型之CH1，包括CY1、CY2、CY3、 參 〇γ4、Cal、Ca2、〇δ、Cs及邙。連接子序列亦可來源於其 他蛋白質，諸如Ig狀蛋白質（例如TCR、FcR、KIR)，基於 G/S之序列（例如G4S重複序列SEQ ID NO: 27)，鉸鏈區域 來源之序列及來自其他蛋白質之其他天然序列。 在一實施例中’恆定區使用重組DNA技術與兩個經連接 之可變區連接。在一實施例中，包含經連接之重鏈可變區 .之序列與重鏈恆定區連接且包含經連接之輕鏈可變區之序 列與輕鏈恆定區連接。在一實施例中，恆定區分別為人類 重鍵恒疋區及人類輕鍵伍定區。在一實施例中，Dvd重鍵 140653.doc -125· 201006485 進一步與Fc區域連接。Fc區域可為原生序列Fc區域或變異 體Fc區域。在另一實施例中，Fc區域為人類Fc區域。在另 一實施例中，Fc區域包括來自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、
IgA、IgM、IgE 或 IgD之 Fc 區域。 在另一實施例中，兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈DVD多 肽組合以形成DVD-Ig分子。表2列出適用於治療疾病（例如 用於治療癌症）之標靶之例示性抗體之VH及VL區域之胺基 酸序列。在一實施例中，本發明提供包含呈任何定向之在 表2中列出之VH及/或VL區域中之至少兩者的DVD。 Φ 表2:生成DVD-Ig之抗髖之VH及VL區域之胺基酸序列之 清單
SEQ ID No. ABT 唯一 ID 蛋白質 區域 序列 1234567890123456789012345678901234567890 28 AB001VH CD20 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQT PGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVS A 29 AB001VL CD20 QIVLSQSPAILSPSPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPG SSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLT工SRVEAE DAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKR 30 AB003VH EGFR (序列 1) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIR QSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQF SLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS 31 AB003VL EGFR (序列 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKP GKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP EDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKR 32 AB010VH IGF1,2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQA TGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAY MELSSLRSEDTAVYYCARDPYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS 33 AB010VL IGF1,2 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIENNHVSWYQQL PGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQ TGDEADYYCETWDTSLSAGRVFGGGTKLTVLG
• 126- 140653.doc 201006485
SEQ ID No. ABT -唯一 ID 蛋白質 區域 序列 1234567890123456789012345678901234567890 34 AB017VH TNF EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQA PGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS S 35 AB017VL TNF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKP GKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR 36 AB020VH NGF QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQP PGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS S 3*7 AB020VL NGF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKP GKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP EDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKR 38 AB032VH IL-lb QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQA PGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTLVTVSS 39 AB032VL IL-lb EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKP DQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEA EDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGTKVDIKR 40 AB033VH EGFR (序列 2) QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQS PGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA 41 AB033VL EGFR序列2) DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR 42 AB040VH IL-6 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGMGVSWIR QPSGKGLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSRLTISKDTSNNQV FLKITNVDTADTATYYCARRRIIYDVEDYFDYWGQGTTLT VSS 43 AB040VL IL-6 QIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPG SSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLT工SRMEAE DAATYYCQQWSGYPYTFGGGTKLEIKR 44 AB043VH Abeta (序列 1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQA PGKGLEWVAS工RSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSS 45 AB043VL Abeta (序列 1) DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNW LLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKR 46 AB044VH Abeta (序列 2) EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA PGKGLEWVAS 工 HNRGTIFYLDSVKGRFTISRDNVRNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYWGQGTSVTVSS 140653.doc -127- 201006485
SEQ ID No. ABT 唯一 ID 蛋白質 區域 序列 1234567890123456789012345678901234567890 47 AB044VL Abeta (序列 2) DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNGDTYLEW YLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR 48 AB045VH Abeta (序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQA PGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVSS 49 AB045VL Abeta (序列 3) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHW YLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR 50 AB046VH IL-18 EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSGYTVTSYWIGWVRQM PGKGLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQVTISADKSFNTAF LQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYPYTFDIWGQGTMVTVS S 51 AB046VL IL-18 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESISSNLAWYQQKP GQAPRLFIYTASTRATDIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDFAVYYCQQYNNWPSITFGQGTRLEIKR 52 AB052VH S1P EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCQSFGYIFIDHTIHWMRQM PGQGLEWMGAISPRHDITKYNEMFRGQVTISADKSSSTAY LQWSSLKASDTAMYFCARGGFYGSTIWFDFWGQGTMVTVS S 53 AB052VL S1P ETTVTQSPSFLSASVGDRVTITCITTTDIDDDMNWFQQEP GKAPKLLISEGN工LRPGVPSRFSSSGYGTDFTLTISKLQP EDFATYYCLQSDNLPFTFGQGTKLEIKR 54 AB059VH RGMa EVQLVESGGGLVQPGSSLKLSCVASGFTFSNYGMNWIRQA PKKGLEWIGMIYYDSSEKHYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LEMNSLRSEDTAIYYCAKGTTPDYWGQGVMVTVSS 55 AB059VL RGMa DVVLTQTPVSLSVTLGDQASMSCRSSQSLEYSDGYTFLEW FLQKPGQSPQLLIYEVSNRFSGVPDRFIGSGSGTDFTLKI SRVEPEDLGVYYCFQATHDPLTFGSGTKLEIKR 56 AB060VH RAGE QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGMNWVKQA PGKGLKWMGYINTNTGESIYSEEFKGRFAFSLETSASTAY LQINNLKNEDTATYFCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS 57 AB060VL RAGE DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQRP GQSPKLLIFSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTLSNMQP EDLADYFCQQYSSYPLTFGVGTKLELKR
在以下實例部分中提供能夠結合特異性標乾•之特異性 DVD-Ig分子及其製造方法之詳細描述。 C.產生DVD蛋白質 本發明之結合蛋白可藉由在此項技術中已知之許多技術 140653.doc • 128· 201006485 中之任一者產生。例如自宿主細胞表現，其中藉由標準技 術將編碼DVD重鏈及DVD輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞 中。各種形式之術語「轉染」意欲涵蓋通常用於將外源 DNA引入原核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿 孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。雖 然可在原核或真核宿主細胞中表現本發明之DVD蛋白質， 但是因為真核細胞（且尤其哺乳動物細胞）與原核細胞相比 更可能組裝且分泌經正確地摺疊及免疫活性之DVD蛋白 質，所以DVD蛋白質表現於該等真核細胞（例如哺乳動物 宿主細胞）中。 表現本發明之重組抗體之例示性哺乳動物宿主細胞包括 中國倉鼠卵巢（CHO細胞）（包括dhfr-CHO細胞，在Urlaub及 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. CASJ 77:4216-4220 中 描述，其與DHFR可選標記一起使用，（例如）如R.J. Kaufman及 P.A· Sharp (1982) Μο/· 5ζ·ο/. 159:601-621 中描 述）、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、SP2及PER.C6細胞。當 將編碼DVD蛋白質之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞 中時，DVD蛋白質係藉由培養宿主細胞歷經足以允許在宿 主細胞中表現DVD蛋白質或將DVD蛋白質分泌至宿主細胞 藉以生長之培養基中之時段而產生。DVD蛋白質可使用標 準蛋白質純化方法自培養基中回收。 在重組表現本發明之DVD蛋白質之例示性系統中，將編 碼DVD重鏈及DVD輕鏈兩者之重組表現載體藉由磷酸鈣介 導之轉染引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體内，將 140653.doc -129- 201006485 DVD重鏈及輕鏈基因各自可操作地與CMV強化子/AdMLP 啟動子調節元件連接以驅動基因之高水準轉錄。重組表現 載體亦攜帶DHFR基因，其允許使用胺甲喋呤選擇/擴增來 選擇已藉由載體轉染之CHO細胞。將所選轉化子宿主細胞 培養以允許表現DVD重鏈及輕鏈且將完整DVD蛋白質自培 養基中回收。將標準分子生物學技術用以製備重組表現載 體，轉染宿主細胞，選擇轉化子，培養宿主細胞及自培養 基回收DVD蛋白質。另外，本發明提供藉由在適合培養基 中培養本發明之宿主細胞直至合成本發明之DVD蛋白質來 合成本發明之DVD蛋白質之方法。該方法可進一步包含自 培養基分離DVD蛋白質。 DVD-Ig之重要特徵為其可以與習知抗體類似之方式產 生及純化。DVD-Ig之產生導致具有所需雙重特異性活性 之均質、單一主要產物，而無丨亙定區域之任何序列修飾或 任何種類之化學修飾。先前描述之生成「雙特異性」、「多 特異性」及「多特異性多價」全長結合蛋白之其他方法不 導致單一初級產物，而實際上導致經組裝之非活性、單特 異性、多特異性、多價、全長結合蛋白及具有不同結合位 點之組合的多價全長結合蛋白之混合物的細胞内或分泌產 生。作為一實例，基於藉由Mmer及Presta描述之設計 (PCT公開案WO 2001/077342(A1)，存在重鏈及輕鏈之16種 可能組合。因此，僅6.25%之蛋白質可能呈所需活性形 式，而非呈與其他15種可能組合相比之單一主要產物或單 一初級產物形式。使用通常用於大規模製造中之標準層析 140653.doc -130- 201006485 技術來將所需、完全活性形式之蛋白質自非活性及部分、舌 性形式之蛋白質分離有待證明。 ‘ 意外地，本發明之「雙重特異性多價全長結合蛋白」之 設計導致雙可變區輕鏈及雙可變區重鏈主要組裝為二 「雙重特異性多價全長結合蛋白」。 至少50%、至少75%且至少9〇%之經組裝且表現之雙可 變區免疫球蛋白分子為所需雙重特異性四價蛋白。本發明 ❹=態樣尤其增強本發明之商業效用。因此，本發明包括 在早一細胞中表現雙可變區輕鏈及雙可變區重鏈，從而產 生「雙重特異性四價全長結合蛋白」之單一初級產物的方 法。 本發明提供在單一細⑽中表現雙可變區輕鍵及雙可變區 重鏈，從而產生「雙重特異性四價全長結合蛋白」之「初 級產物」的方法’其中「初級產物」$包含雙可變區輕鍵 及雙可變區重鏈之所有組裝蛋白質之5〇%以上。 % 本發明提供在單一細胞中表現雙可變區輕鏈及雙可變區 重鏈，從而產生「雙重特異性四價全長結合蛋白」之單一 「初級產物」的方法，其中「初級產物」為包含雙可變區 輕鏈及雙可變區重鏈之所有組裝蛋白質之75%以上。 本發明提供在單一細胞中表現雙可變區輕鏈及雙可變區 重鏈，從而產生「雙重特異性四價全長結合蛋白」之單一 「初級產物」的方法，其中「初級產物」為包含雙可變區 輕鏈及雙可變區重鏈之所有組裝蛋白質之9〇%以上。 II.衍生之DVD結合蛋白： 140653.doc -131 - 201006485 以個實施例提供經標記之結合蛋白，其中本發明之結合 蛋白經衍生或與另-功能分子(例如另-狀或蛋白質)連 接。例如，本發明之經標記之結合蛋白可藉由使本發明之 結合蛋白(藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以1 他方式）與一或多個其他分子實趙功能性連接來衍生，該 或該等分子實體諸如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙功 能抗體）、可偵測劑、細胞毒性劑、醫藥劑，及/或可介導 結合蛋白與另一分子(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區域或聚 組胺酸標記）締合之蛋白質或肽。 本發月之、。蛋白可藉以衍生之適用可偵測劑包括螢光 化合物。例示性螢光可偵測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光 素、若丹明、5-二曱胺+萘項醯基氯、蕩紅蛋白及其類似 物。結合蛋白亦可藉由可偵測酶（諸如鹼性磷酸酶、辣根 過氧化酶、葡萄糖氧化酶及其類似物）來衍生。當結合蛋 白藉由可偵測酶衍生時，其藉由添加使該酶用來產生可偵 測反應產物之額外試劑來偵測。例如，當存在可偵測劑辣 根過氧化酶時，添加過氧化氫及二胺基聯笨胺產生顯色反 應產物’其為可偵測的。結合蛋白亦可藉由生物素衍生， 且經由抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合之間接量測來 偵測。 本發明之另一實施例提供結晶結合蛋白及包含該等晶體 之調配物及組合物。在另一實施例中，結晶結合蛋白具有 比該結合蛋白之可溶性對應物更大之活體内半衰期。在另 一實施例中，結合蛋白在結晶後保留生物活性。 140653.doc -132- 201006485 本發明之結晶結合蛋白可根據在此項技術中已知且如 WO 02072636中揭示之方法產生，該專利係以引用的方式 併入本文中。 本發明之另一實施例提供糖基化結合蛋白，其中抗體或 其抗原結合部分包含一或多個碳水化合物殘基。初期的活 體内蛋白質產生可經受進一步處理，其稱為轉譯後修飾。 詳言之，可以酶促方式添加糖（糖基）殘基，一種稱為糖基 化之方法。攜帶共價連接之寡醣側鏈之所得蛋白質稱為糖 ® 基化蛋白質或醣蛋白。抗體為在Fc區以及可變區中具有一 或多個碳水化合物殘基之醋蛋白。Fc區中之碳水化合物殘 基具有對於Fc區之效應功能之重要作用，及對於抗體之抗 原結合或半衰期之最少作用（r. Jefferis，价⑽c/m〇/ 21 (2005) ’第11_16頁）。相比之下，可變區之糖基化可具 有對於抗體之抗原結合活性之作用。可變區中之糖基化可 月b歸因於位阻而可具有對於抗體結合親和力之負作用（c〇, ⑩ M.S.等人 Mol· Immunol. (1993) 30:1361-1367)，或導致對 於抗原之親和力增加（Wallick，S.C.等人Exp. Med. (1988) 168:1099-1109 ; Wright，Α·等人 EMBO J. (1991) 10:2717 2723) ° 本發明之一態樣係關於生成糖基化位點突變體，其中結 合蛋白之Ο或N連接之糖基化位點已突變。熟習此項技術 者可使用標準熟知技術生成該等突變體。保留生物活性但 具有增大或減小之結合活性之糖基化位點突變體為本發明 之另一目標。 140653.doc •133· 201006485 在另一實施例中’本發明之抗體或抗原結合部分之糖基 化經修飾。例如，可製得非糖基化抗體（亦即抗體缺乏糖 基化）。可改變糖基化以（例如）增加抗體對於抗原之親和 力》該等碳水化合物修飾可藉由（例如）改變抗體序列内之 一或多個糖基化位點來實現。例如，可進行一或多個胺基 酸取代作用，從而導致消除一或多個可變區域糖基化位點 以由此消除彼位點之糖基化。該非糖基化可增加抗體對於 抗原之親和力。該方法進一步詳細描述於PCT公開案 W02003016466A2及美國專利第 5,714 35〇號及第 6 35〇 861 號中，其各自係以引用的方式全部併入本文中。 另外或替代地’可製得本發明之修飾結合蛋白，其具有 改變類型之糖基化，諸如具有降低量之岩藻糖基殘基之低 岩藻糖基化抗體（參見Kanda，Yutaka等人，journai 0f
Biotechnology (2007)，130(3)，300-310)或具有增加之二等 分GlcNAc結構之抗體。已證明該等改變之糖基化模式會 增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由（例 如）在具有改變之糖基化機構之宿主細胞中表現該抗體來 實現。具有改變之糖基化機構之細胞已在此項技術中描述 且可用作藉以表現本發明之重組抗體之宿主細胞以由此產 生具有改變之糖基化之抗體。參見例如Shields, R. L.等 人（2002) J. Biol· Chem. 277:26733-26740 ; Umana 等人 (1999) Nat. Biotech. 17:176-1 以及歐洲專利第 EP 1,176,195 號、PCT公開案 WO 03/035835、WO 99/54342 80，其各自 係以引用的方式全部併入本文中。 140653.doc .134- 201006485 蛋白質糖基化視所關注之蛋白質之胺基酸序列以及藉以 表現蛋白質之宿主細胞而定。不同有機體可產生不同糖基 化酶（例如糖基轉移酶及糖苷酶），且可利用不同受質（核苷 酉文糖）。歸因於該等因素，蛋白質糖基化模式及糖基殘基 之組成可視藉以表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用 於本發明之糖基殘基可包括（但不限於）葡萄糖、半乳糖、 甘鉻糖、石藻糖、n_乙醯葡萄胺糖及唾液酸。在一實施例 中，糖基化結合蛋白包含使得糖基化模式為人類模式之糖 © 基殘基。 熟1此項技術者已知不同蛋白質糖基化可導致不同蛋白 質特徵。例如，在微生物宿主（諸如酵母）中產生且利用酵 母内源性路徑糖基化之治療性蛋白質之功效與表現於哺乳 動物細胞（諸如CHO細胞株）中之相同蛋白質相比可降低。 該等醣蛋白亦可在人類中為免疫原性的且在投與之後展示 縮短之活體内半衰期。人類及其他動物中之特定受體可識 ❹別特定糖基殘基且促進蛋白質自血流快速清除。其他反作 用可包括蛋白質摺疊、溶解性、對蛋白酶的敏感度、流量 (trafficking)、輸送、區室化、分泌、藉由其他蛋白質或因 子識別性、抗原性或致過敏性之變化。因此，執業者可選 擇具有糖基化之特定組成及模式之治療性蛋白質，例如與 在人類細胞中或在預定個體動物之物種特定細胞中產生之 彼糖基化組成及模式相同、或至少類似之糖基化組成及模 式。 表現不同於宿主細胞之彼糖基化蛋白質之糖基化蛋白質 140653.doc • 135- 201006485 可藉由遺傳修飾宿主細胞以表現異種糖基化酶來達成。使 用在此項技術中已知之技術，執業者可生成展現人類蛋白 質糖基化之抗體或其抗原結合部分。例如，已遺傳地修飾 酵母菌株以表現非天然出現之糖基化酶以使得在此等酵母 菌株中產生之糖基化蛋白（醣蛋白）展現與動物細胞、尤其 人類細胞之彼糖基化相同之蛋白質糖基化（美國專利申請 案 20040018590 及 20020137134 及 PCT 公開案 WO 2005100584 A2)。 除結合蛋白之外，本發明亦係關於對於本發明之該等結 合蛋白具有特異性之抗遺傳型（抗Id)抗體。抗Id抗體為識 別通常與另一抗體之抗原結合區域相關之獨特決定子的抗 體。抗Id可藉由以結合蛋白或其含有CDR之區域將動物免 疫來製備。經免疫之動物識別免疫抗體之遺傳型決定子且 對其作出反應且產生抗Id抗體。顯而易見，可較容易地生 成併入DVD-Ig分子中之兩個或兩個以上親本抗體之抗遺 傳型抗體，且藉由在此項技術中完全認可之方法（例如 BIAcore、ELISA)確認結合研究以檢驗對於每一親本抗體 之遺傳型具有特異性之抗遺傳型抗體亦在DVD-Ig之情形 中識別遺傳型（例如抗原結合位點）。對於DVD-Ig之兩個或 兩個以上抗原結合位點中之每一者具有特異性之抗遺傳型 抗體提供量測患者血清中之人類DVD-Ig之DVD-Ig濃度之 理想試劑；DVD-Ig濃度檢定可使用「夾層檢定ELISA格 式」確立，其中第一抗原結合區域之抗體經塗布於固相 (例如BIAcore晶片、ELISA板等）上，以沖洗緩衝液沖洗、 140653.doc -136- 201006485 與血清試樣-起培養、另-沖洗㈣且最終與另—抗原結 合位點之另-抗遺傳型抗體-起培養、本身經酶標記以便 將結合反應定量。在-實施财，對於具有超㈣個不同 結合位點之DVD-Ig，兩個最外層結合位點（最遠離及接近 恆定區域）之抗遺傳型抗體將不僅辅助測定人類血清中之 DVD-Ig濃度而且證明分子在活體内之完整性。每一抗^抗 體亦可_「免疫原」以料在另—動物中之免疫反應， 產生所謂抗抗Id抗體。
此外，熟習此項技術者瞭解所關注之蛋白質可使用經遺 傳地工程改造以表現各種糖基化酶之宿主細胞庫來表現， 以使得庫之成員宿主細胞產生具有變異體糖基化模式之所 關注之蛋白質。執業者可隨後選擇及分離具有敎新顆糖 基化模式之所關注之蛋白質。在一實施例中，具有特定選 擇之新穎糖基化模式之蛋白質展現改良或改變之生物性 質。 III· DVD-Ig之用途 倘若本發明之結合蛋白能結合於兩個或兩個以上抗原， 則本發明之結合蛋白可用於使用習知免疫檢定（諸如酶聯 免疫吸附檢定（EUSA)、放射免疫檢定（RIA)或組織免疫組 織化學）來偵測抗原（例如在諸如血清或血漿之生物試樣 中）。DVD-Ig直接或間接經可偵測物質標記以有助於偵測 經結合或未經結合之抗體。適合可偵測物質包括各種酶、 輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料。適合酶之實例 包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β_半乳糖苷酶或乙醯膽 140653.doc -137- 201006485 驗酯酶；適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生 物素及抗生物素蛋白/生物素；適合螢光材料之實例包括 傘_、螢光素、異硫氛酸螢光素、若丹明（rh〇(jamine)、二 氣二嗓基胺勞光素、丹確醯氣或藻紅蛋白；發光材料之實 例包括魯米諾（luminol);且適合放射性材料之實例包括 3H、14c、35S、9°Y、99Tc、"lIn、125i、131l、177Lu、166h〇 或 153Sm。 在一實施例中，本發明之結合蛋白能夠在活體外及在活 體内兩者中和抗原活性。因此，該等DVD-Ig可用於（例如）參 在含有抗原之細胞培養物中、在人類個體中或在具有本發 明之結合蛋白與其交又反應之抗原之其他哺乳動物個體中 抑制抗原活性。在另一實施例中，本發明提供在罹患抗原 /舌性為有害的疾病或病症之個體中減少抗原活性之方法。 本發明之結合蛋白可出於治療性目的投與人類個體。 如本文中所用，術語「抗原活性為有害的病症」意欲包 括罹患病症之個體中之抗原之存在已展示或疑似造成病症 之病理生理異常或為促成病纟惡化之因素的疾病及其他病© 症。因此，抗原活性為有害的病症為減小抗原活性預期會 減輕病症之症狀及/或進程的病症。該等病症可（例如）藉由 罹患病症之個體之生物流體中之抗原濃度增加（例如個體 之金清、血漿、滑液等中之抗原濃度增加）來證明。可以 本發明之結合蛋白治療之病症的非限制性實例包括以下及 在關於本發明之抗體之醫藥組合物之部分中討論之彼等病 症0 140653.doc -138- 201006485 本發明之DVD-Ig可結合一個抗原或多個抗原。該等抗 原包括（但不限於）在以下資料庫中列出之標靶，該等資料 庫以引用的方式併入本文中。此等標靶資料庫包括彼等清 單： 治療性標乾（http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp); 細胞激素及細胞激素受體（http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi,及 http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/ ® cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)； 趨化因子（http://cytokine.medic.kumamoto_u‘ac.jp/CFC/CK/ Chemokine.html); 趨化因子受體及0?匚11(111^://〇3卩.1116(^0.1〇11118111〇1；0-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/)； 嗅覺受體（http://senselab.med_yale_edu/senselab/ORDB/ default.asp)； 受體（http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm); 參 癌標 |&(http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi); 作為潛在抗體標靶之所分泌之蛋白質（http:// spd.cbi.pku.edu.cn/); 蛋白質激酶（http://spd.cbi.pku_edu.cn/)及 人類 CD標記（http://content.labvelocity.eom/tools/6/1226/ CD_table一final」ocked.pdf)及（Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6)。 140653.doc -139- 201006485 DVD-Ig適用作治療劑以同時阻斷兩個不同標乾以增強 功效/安全及/或增加患者適用範圍（patient coverage)。該等 標靶可包括可溶標靶（TNF)及細胞表面受體標靶（VEGFR及 EGFR)。其亦可用以針對癌症療法在腫瘤細胞與T細胞 (Her2及CD3)之間誘導重定向細胞毒性，或針對自體免疫 疾病或移植在自體反應性細胞與效應細胞之間誘導重定向 細胞毒性，或在任何指定疾病中在任何標靶細胞與效應細 胞之間誘導重定向細胞毒性以消除導致疾病之細胞。 另外，當DVD-Ig經設計以靶向同一受體上之兩個不同 抗原決定基時，其可用於觸發受體叢集及活化。此可具有 製得促效性及拮抗性抗GPCR治療劑之益處。在此情況 下，DVD-Ig可用於靶向一個細胞上之兩個不同抗原決定 基（包括環區域及細胞外區兩者上之抗原決定基）以便叢集/ 信號轉導（兩個細胞表面分子）或信號轉導（在一個分子 上）。類似地，DVD-Ig分子可經設計以藉由靶向CTLA-4細 胞外區之兩個不同抗原決定基（或相同抗原決定基之2個複 本）觸發CTLA-4連接反應及負信號，導致免疫反應之向下 調節。CTLA-4為治療性治療許多免疫性病症之在臨床上 經驗證之標靶。CTLA-4/B7相互作用藉由減弱細胞週期進 程、IL-2產生及在活化之後T細胞之增生而負性地調節T細 胞活化，且CTLA-4(CD152)接合可向下調節T細胞活化且 促進免疫耐受性之誘發。然而，因為CTLA-4活化需要連 接反應，所以藉由CTLA-4之促效抗體接合來減弱T細胞活 化之策略為不成功的。如藉由晶體結構分析證明，CTLA- 140653.doc -140· 201006485 4/B7之分子相互作用呈「偏斜拉鏈」陣列形式（Stamper 2001 Nature 410:608)。然而，目前可利用之CTLA-4結合 試劑（包括抗CTLA-4 mAb)中無一者具有連接反應性質。 存在著手解決此問題之若干嘗試。在一情況中，細胞成員 結合單鏈抗體經生成，且顯著地抑制小鼠中之同種異體排 斥（Hwang 2002 JI 169:633)。在一獨立情況中，CTLA-4之 人工APC表面連接之單鏈抗體經生成且證明減弱T細胞反 應（Griffin 2000 JI 164:4433)。在兩種情況中，CTLA-4 連 • 接反應係藉由將成員結合之抗體緊密地定位於人工系統中 來達成。雖然此等實驗提供藉由觸發CTLA-4負信號轉導 來免疫向下調節之概念驗證，但是用於此等報導中之試劑 不適合於治療性使用。為此目的，CTLA-4連接反應可藉 由使用靶向CTLA-4細胞外區之兩個不同抗原決定基（或相 同抗原決定基之2個複本）之DVD-Ig分子來達成。基本原理 為跨越IgG之兩個結合位點之距離（約150-17〇 A)對於CTLA-4之活性連接反應（2個CTLA-4均二聚體之間30-50 A)而言 太大。然而，DVD-Ig(—個臂）上之兩個結合位點之間之距 離短得多，亦在30-50 A之範圍内，允許CTLA-4之適當連 接反應。 類似地，DVD-Ig可靶向細胞表面受體複合物之兩個不 同成員（例如IL-12Ra及β)。此外’ DVD-Ig可把向CR1及可 溶蛋白/病原體以驅動標靶可溶蛋白/病原體之快速清除° 另外，本發明之DVD-Ig可用於組織特異性傳遞（靶向組 織標記及疾病介體以便增強局部PK因此達成較高功效及/ 140653.doc -141 - 201006485 或較低毒性），包括細胞内傳遞（靶向内在化受體及細胞内 分子），傳遞至大腦内部（靶向轉鐵蛋白受體及CNS疾病介 體以便穿過血腦障壁）。DVD_Ig亦可充當經由結合於抗原 之非中和抗原決定基而將抗原傳遞至特定位置以及增加抗 原之半衰期之載體蛋白。此外，DVD-Ig可經設計以與植 入患者中之醫學裝置在實體上連接或靶向此等醫學裝置 (參見 Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B.，Zotarolimus eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006)，5 8(3), 437-446 ; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324 ； Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu, Peng; Grainger, David W., Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467 ； Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices., Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L., Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 3 77-397)。簡言之，將適當類型之細胞引導至醫學 植入物之位點可促進正常組織功能治癒及恢復。或者，亦 提供藉由與裝置偶合或靶向裝置之DVD來抑制在裝置植入 後釋放之介體（包括（但不限於）細胞激素）。例如，血管内 支架多年來已用於介入心臟病學中以清理阻塞之動脈及改 140653.doc •142- 201006485 良至心肌之血液流動。然而’已知常規裸金屬血管内支架 在一些患者中導致再狹窄（在經處理之區域中動脈再變窄） 且可產生血塊。近來，已描述藉由捕獲遍及血液而循環之 内皮祖細胞（EPC)來減少再狹窄且防止出現血塊的經抗 CD34抗體塗布之血管内支架。内皮細胞為内襯於血管、 允許血液平滑地流動之細胞。EPC黏附於血管内支架之硬 表面，形成平滑層，其不僅促進治癒而且防止再狹窄及血 塊（先前與使用血管内支架相關之併發症）(A〇ji等人2〇〇5 ) ® Am Coll Cardiol· 45(1〇):1574·9)。除改良需要血管内支架 之患者之後果之外，對於需要心血管繞道手術之患者亦具 有意義。例如，以抗EPC抗體塗布之修復血管（人工動脈） 消除使用來自患者腿或臂之動脈以進行繞道移植術的需 要。此減少手術及麻醉時間，其轉而減少冠狀動脈手術死 亡。DVD-Ig以使得其結合於細胞表面標記（諸如cd34)以 及已塗布於植入裝置上之蛋白質（或任何種類之抗原決定 ❹基，包括（但不限於）蛋白質、脂質及聚糖）的方式來設計以 有助於細胞募集。該等方法一般亦可應用於其他醫學植入 物。或者，可將DVD-Ig塗布於醫學裝置上且在植入及自 裝置釋放所有DVD後（或可能需要額外新鮮DVD_Ig之任何 其他需要，包括已加載之DVD_Ig之老化及變性），裝置可 藉由將新鮮DVD-Ig全身性投與患者而重新加載，其中 DVD-Ig經設計以藉由—組結合位點結合於所關注之標靶 (細胞激素、細胞表面標記（諸如CD34)等）且藉由另一組結 合位點、结合於裝置上所塗布之標把（包括任何種類之蛋白 140653.doc -143- 201006485 質、抗原決定基，包括（但不限於）脂質、聚糖及聚合物）。 此技術具有擴大經塗布之植入物之適用性之優勢。 A· DVD-Ig在各種疾病中之用途 本發明之DVD-Ig分子亦適用作治療各種疾病之治療性 分子。該等DVD分子可結合一或多個與特定疾病有關之標 靶。各種疾病中之該等標靶之實例描述如下。 1.人類自體免疫及發炎反應 許多蛋白質一般與自體免疫及發炎反應有關聯，其包括 C5、CCLl(I-3 09)、CCL11(嗜伊紅性粒細胞趨化因子）、 CCL13(mcp-4)、CCL15(MIP-ld)、CCL16(HCC-4)、CCL17 (TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-l)、CCL20 (MIP-3a) 、CCL21(MIP-2)、CCL23(MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2/嗜伊紅性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(TECK)、 CCL26、CCL3(MIP-la)、CCL4(MIP-lb)、CCL5(RANTES)、 CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCLIO(IP-IO)、 CXCLll(I-TAC/IP-9) 、 CXCL12(SDF1) 、 CXCL13 、 CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、 CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、 CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、 CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCRl(CCXCRl)、 IFNA2、IL10、IL13、IL17C、ILIA、IL1B、IL1F10、 IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9 ' IL22、IL5、 IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(内皮單核細胞·活化 細胞激素）、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、 140653.doc •144- 201006485 IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、 ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、 IL1R1 、IL1RN、IL8RB 、LTB4R、TOLLIP 、FADD 、 IRAKI、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、 TRAF1 、 TRAF2 、 TRAF3 、 TRAF4 、 TRAF5 、 TRAF6 、 ACVR1 、 ACVR1B 、 ACVR2 、 ACVR2B 、 ACVRL1 、 CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、 CNR1 、 CTLA4 、 CYSLTR1 、 FCER1A 、 FCER2 、 ❹ FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、 TLR3 、 TLR4 、 TLR5 、 TLR6 、 TLR7 、 TLR8 、 TLR9 、 TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、 CCL7 、CCL8 、CCL11 、CCL13 、CCL15 、CCL16 、 CCL17 、 CCL18 、 CCL19 、 CCL20 、 CCL21 、 CCL22 、 CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、 CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、 ❹ CXCL10 、 CXCL11 、 CXCL12 、 CXCL13 、 CXCR4 、 GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、 AMHR2 、BMPR1A 、BMPR1B 、BMPR2 、C19orfl0 (IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、 FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、ILIA、 IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、 IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、 IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、 140653.doc -145- 201006485 IL10RB、ILll、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、 IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、 IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、 KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、 MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、 TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、 TGFBR2 、 TGFBR3 、 TH1L 、 TNF 、 TNFRSF1A 、 TNFRSF1B 、 TNFRSF7 、 TNFRSF8 、 TNFRSF9 、 TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、 TNFSF11、VEGF、ZFPM2及 RNF110(ZNF144)。在一態樣 中，提供能夠結合本文中列出之一或多個標靶之DVD-Ig。 2.哮喘 過敏性哮喘之特徵在於存在嗜伊紅血球過多症、杯狀細 胞化生、上皮細胞變化、氣管過度反應（AHR)及Th2及Thl 細胞激素表現以及升高之血清IgE含量。現在廣泛接受氣 管發炎為構成哮喘之發病機制的基礎之關鍵因素，其涉及 諸如T細胞、B細胞、嗜伊紅細胞、肥大細胞及巨噬細胞之 發炎細胞與其分泌介艘（包括細胞激素及趨化因子）之複雜 相互作用。皮質類固醇為當今哮喘之最重要的消炎治療， 然而其作用機制為非特異性的且存在安全顧廣·，尤其在年 幼患者群體中。因此’使得更具特異性且乾向之療法之開 發正當。不斷有證據表明小鼠中之Π_13與嗜伊紅血球發 炎無關地模擬哮喘之許多特徵’該等特徵包括AHR、黏液 140653.doc -146- 201006485 分泌過多及氣管纖維化（Finotto等人International Immunology (2005)，17(8)，993-1007 ; Padilla等人 Journal of Immunology (2005)，174(12), 8097-8105) ° IL-13已因在導致與哮喘相關之病理性反應中具有關鍵 作用而牵涉在内。開發抗IL-13 mAb療法以降低IL-13在肺 中之作用為提供作為哮喘之新穎治療之重大希望的激勵人 心的新方法。然而，差別免疫路徑之其他介體亦與哮喘發 病機制有關，且除IL-13之外，阻斷此等介體可提供額外 ® 治療益處。該標靶對包括（但不限於）IL-13及促發炎性細胞 激素，諸如腫瘤壞死因子a(TNF-a)。TNF-α可擴大哮喘中 之發炎反應且可與疾病嚴重程度有關（McDonnell等人 Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.) 0 此表明阻斷IL-13 及TNF-α兩者可具有有利作用，尤其在嚴重氣管疾病中。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合標靶IL-13及TNFa 且用於治療哮喘。 ❹ 可評估發炎及AHR兩者之動物模型（諸如OVA誘導之哮 喘小鼠模型）在此項技術中為已知的且可用以測定各種 DVD-Ig分子治療哮喘之能力。研究哮喘之動物模型揭示 於 Coffman 等人 Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879 ; Lloyd 等人 Advances in Immunology (2001), 77, 263-295 ; Boyce 等人 Journal of Experimental Medicine (2005)，201(12)，1869-1873 ;及 Snibson 等人 Journal of the British Society for Allergy and Clinical 140653.doc -147- 201006485
Immunology (2005)，35(2), 146-52中。除此等標把對之常 規安全評估之外，免疫抑止程度之特定測試可為正當的且 有助於選擇最佳標乾對（參見Luster等人Toxicology (1994)， 92(1-3), 229-43 ; Descotes等人Developments in biological standardization (1992), 77 99-102 ; Hart 等人 Journal of
Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250- 257)。 基於本文中揭示之基本原理且使用功效及安全之相同分 析模型，可確定D VD-Ig分子可結合且可用於治療哮喘之 _ 其他標靶對。在一實施例中，該等標靶包括（但不限於）IL-13與IL-Ιβ，因為IL-Ιβ亦與哮喘中之發炎反應有關聯；IL-13與涉及發炎之細胞激素及趨化因子，諸如 IL-13與IL-9 ; IL-13 與 IL-4 ; IL_13 與 IL-5 ; IL-13 與 IL-25 ; IL-13 與 TARC ; IL-13 與 MDC ; IL-13 與 MIF ; IL-13 與 TGF-β ; IL-13 與LHR促效劑； IL-13 與 CL25 ; IL-13 與 SPRR2a ; IL-13 與SPRR2b ;及IL-13與ADAM8。本發明亦提供能夠結合選 自由以下各者組成之群之一或多個與哮喘有關之標靶之 ® DVD-Ig : CSFl(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、 FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、組織胺及組織胺受體、 ILIA、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、 IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、 IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB ' IL2RA、 IL4R、IL5RA、IL8RA ' IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、 IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、 •148- 140653.doc 201006485 CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、 CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24、CX3CL1、 CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、 CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、 XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、 TGFB1、TNF、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、 FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR及幾 丁質。 3·類風濕性關節炎 ® 類風濕性關節炎（RA)為全身疾病，其特徵在於關節滑膜 中之慢性發炎反應且與軟骨退化及關節旁骨骼侵蝕相關。 許多促發炎性細胞激素（包括TNF、趨化因子及生長因子） 表現於患病關節中。將抗TNF抗體或sTNFR融合蛋白全身 性投與RA之小鼠模型展示為消炎的且為關節保護性的。 RA患者中之TNF活性藉由靜脈内投與之英利昔單抗（嵌合 抗TNF mAb)而阻斷之臨床調查研究（Harriman G, Harper _ LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical trials in ❹ rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFa treatment. Ann Rheum Dis 58增刊 1:161-4)提供 TNF調節几-6、IL-8、MCP-1及VEGF產生、免疫及發炎細胞至關節中 之募集、血管生成及基質金屬蛋白酶·1及_3之血液含量之 減少的證據。對類風濕性關節炎中之發炎路徑之更好瞭解 導致識別與類風濕性關節炎有關之其他治療性標靶。諸如 介白素-6拮抗劑（IL-6受體抗體MRA，藉由Chugai, Roche開 發（參見 Nishimoto, Norihiro 等人 Arthritis & Rheumatism 140653.doc •149- 201006485 (2004)，50(6)，1761-1769)、CTLA4Ig(阿巴西普（abatacept)， Genovese Me 等人 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor a inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23)及抗B細胞療法（利妥昔單抗，Okamoto H, Kamatani Ν. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 351:1909)之有希望之治療在去年已在隨機化 受控試驗中經測試。已經識別出其他細胞激素且已展示在 動物模型中有益，包括介白素-15(治療性抗體 HuMax-IL_15，AMG 714 參見 Baslund, Bo 等人 Arthritis & Rheumatism (2005), 52(9)，2686-2692)、介白素-17及介白 素-18,且此等藥劑之臨床試驗目前在進行中。組合抗TNF 及另一介體之雙重特異性抗體療法具有增強臨床功效及/ 或患者適用範圍之巨大潛力。例如，阻斷TNF及VEGF兩 者可潛在地根除皆與RA之病理生理異常有關之發炎及血 管生成。亦涵蓋藉由特異性DVD Ig阻斷包括（但不限於）以 下各者之與RA有關之其他標靶對：TNF與IL-18、TNF與 IL-12、TNF 與 IL-23、TNF 與 IL-Ιβ、TNF 與 MIF、TNF 與 IL-17及TNF與IL-15。除此等標靶對之常規安全評估之 外，免疫抑止程度之特定測試可為正當的且有助於選擇最 佳標靶對（參見 Luster 等人 Toxicology (1994)，92(1-3)，229-43 ; Descotes 等人 Developments in biological standardization (1992), 77 99-102 ; Hart 等人 Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250- 257)。DVD Ig分子是否適用於治療類風濕性關節炎可使用 140653.doc -150- 201006485 臨床前動物RA模型（諸如膠原蛋白誘導之關節炎小鼠模型） 來評估。其他適用模型亦在此項技術中為熟知的（參見 Brand DD.，Comp Med. (2005) 55(2):114-22)。基於親本抗 體對於人類及小鼠直系同源物（othologues)之交又反應性 (例如對於人類及小鼠TNF、人類及小鼠IL-15等之反應 性），小鼠CIA模型中之驗證研究可以「匹配代用抗體」來 源之DVD-Ig分子進行；簡言之，基於兩個（或兩個以上）小 鼠標靶特異性抗體之DVD-Ig可在可能之程度上與用於人 類DVD-Ig構築之親本人類或人源化抗體之特徵匹配（類似 親和力、類似中和效能、類似半衰期等）。
4. SLE SLE之免疫致病性特點為多株B細胞活化，其導致高球 蛋白血症、自體抗體產生及免疫複合物形成。主要異常似 乎為歸因於普遍化T細胞失調而使T細胞不能抑制所禁止之 B細胞純系。另外，B與T細胞相互作用藉由若干細胞激素 (諸如IL-10)以及協同刺激分子（諸如CD40及CD40L、B7及 CD28及CTLA-4)而促進，其引發第二信號。此等相互作用 連同免疫複合物及細胞凋亡材料之吞噬細胞清除之削弱使 免疫反應得以保持，且導致組織損傷。以下標靶可與SLE 有關且可潛在地用於治療性介入之DVD-Ig方法：B細胞標 靶療法：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、 HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、 TNFSF5 、 TNFSF6 、 BLR1 、HDAC4 、HDAC5 、 HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、 140653.doc • 151 - 201006485 SLA2、CD81 、IFNB1 、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、 TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、 HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、 INHBA 、 KLF6 、 TNFRSF7 、 CD28 、 CD38 、 CD69 、 CD80 、 CD83 、 CD86 、 DPP4 、 FCER2 、 IL2RA 、 TNFRSF8 、TNFSF7 、CD24、CD37 、CD40、CD72 、 CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、 MS4A1 、ST6GAL1 、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA- DRA及NT5E ;協同刺激信號：CTLA4或B7.1/B7.2 ; B細胞 存活之抑制：BlyS、BAFF ;補體滅活：C5 ;細胞激素調 節：關鍵原理為任何組織中之淨生物反應為促發炎性或消 炎細胞激素之區域含量之間之平衡之結果（參見Sfikakis PP 等人 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7)。SLE視為具有經 證明之血清IL-4、IL-6、IL-10升高之Th-2驅動之疾病。亦 涵蓋能夠結合一或多個選自由IL-4、IL-6、IL-10、IFN-ot 及TNF-α組成之群之標靶之DVD Ig。本文中討論之標靶之 組合增強SLE之治療功效，其可在許多狼瘡臨床前模型中 測試（參見 Peng SL (2004) Methods Mol Med.;102:227-72)。基於親本抗體對於人類及小鼠直系同源物之交叉反 應性（例如對於人類及小鼠CD20、人類及小鼠IL干擾素a等 之反應性），小鼠狼瘡模型中之驗證研究可以「匹配代用 抗體」來源之DVD-Ig分子進行；簡言之，基於兩個（或兩 個以上）小鼠標靶特異性抗體之DVD-Ig可在可能之程度上 與用於人類DVD-Ig構築之親本人類或人源化抗體之特徵 140653.doc •152- 201006485 匹配（類似親和力、類似中和效能、類似半衰期等）。 5.多發性硬化症 多發性硬化症（MS)為病因基本上未知之複雜人類自體免 疫型疾病。遍及神經系統之髓磷脂鹼性蛋白（MBP)之免疫 學破壞為多發性硬化症之主要病理。MS為具有複雜病理 之疾病，其涉及CD4 +及CD8+ T細胞之浸潤及中枢神經系 統内之反應。已描述在MS中之細胞激素、反應性氣物質 及協同刺激分子在CNS中之表現。主要考慮因素為造成自 ® 體免疫性發展之免疫學機制。詳言之，抗原表現、細胞激 素與白血球相互作用及有助於平衡/調節其他Τ細胞（諸如 Th 1及Th2細胞）之調節性Τ細胞為治療性標靶識別之重要領 域。 IL-12為藉由APC產生且促進Thl效應細胞之分化的促發 炎性細胞激素。IL-12在患有MS之患者之顯現病灶中以及 在EAE感染之動物中產生。先前展示干擾IL-12路徑可有效 地預防齧齒動物中之EAE，且使用抗IL-12 mAb之IL-12p40 ❹ 之活體内中和在普通狨猴之髓磷脂誘導的EAE模型中具有 有利作用。 TWEAK為原構性表現於中枢神經系統（CNS)中之TNF家 族之一成員，具有視細胞類型而定之促發炎性、增生或細 胞凋亡作用。其受體Fnl4藉由内皮細胞、反應性星形膠質 細胞及神經元表現於CNS中。TWEAK及Fnl4 mRNA表現 在實驗性自體免疫性腦脊髓炎（EAE)期間在脊髓中增加。 當小鼠在致敏期之後經治療時，在C5 7BL/6小鼠之髓磷脂 140653.doc -153- 201006485 寡樹突神經膠質細胞醣蛋白（MOG)誘導之EAE中進行抗 TWEAK抗體治療導致疾病嚴重程度及白細胞浸潤減少。 本發明之一態樣係關於能夠結合一或多個（例如兩個）選 自由以下各者組成之群之標靶之DVD Ig分子：IL-12、 TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、 VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNy、GM-CSF、FGF、C5、CD52及CCR2。實施例包括作為有利於 治療MS之治療劑之雙重特異性抗IL-12/TWEAK DVD Ig。 評估DVD分子治療MS之適用性之若干動物模型在此項 © 技術中為已知的（參見Steinman L等人（2005) Trends Immunol. 26(11):565-71 ； Lublin FD.等人（1985) Springer Semin Immunopathol.8(3):197-208 ; Genain CP 等人（1997) J Mol Med. 75(3):187-97 ; Tuohy VK 等人（1999) J Exp Med. 189(7):1033-42 ; Owens T 等人（1995) Neurol Clin.l3(l):51-73 ;及，t Hart BA 等人（2005) J Immunol 175(7):4761-8)。基於親本抗體對於人類及動物物種直系 同源物之交叉反應性（例如對於人類及小鼠IL-12、人類及 _ 小鼠TWEAK等之反應性），小鼠EAE模型中之驗證研究可 以「匹配代用抗體」來源之DVD-Ig分子進行；簡言之， 基於兩個（或兩個以上）小鼠標靶特異性抗體之DVD-Ig可在 可能之程度上與用於人類DVD-Ig構築之親本人類或人源 化抗體之特徵匹配（類似親和力、類似中和效能、類似半 衰期等）。相同概念應用於其他非齧齒動物物種之動物模 型，其中針對預期藥理學及可能之安全研究來選擇「匹配 140653.doc -154· 201006485 代用抗體」來源之DVD-Ig。除此等標靶對之常規安全評 估之外，免疫抑止程度之特定測試可為正當的且有助於選 擇最佳標乾對（參見Luster等人Toxicology (1994)，92(1-3)，229-43 ; Descotes 等人 Developments in biological standardization (1992), 77 99-102 ； Jones R. 2000
Rovelizumab (ICOS Corp)· IDrugs.3(4):442-6)。 然而，MS不僅為免疫疾病，而亦具有極重要神經退化 組份。MS之疾病進程係歸因於累積性轴突喪失及破壞， 且藉由此等神經退化性過程測定患者之最終疾病分值 (Compston A. & Coles A. (2008) Lancet 372: 1502-1517 ； Trapp BD. & Nave KA. (2008) Annu.Rev. Neuroscience 31: 247-269)。數種機制可解釋MS中之轴突破壞。具有相關鈣 介導之神經毒性的神經傳遞質麩胺酸之過度釋放，氧化氮 釋放及隨後軸突破壞，神經營養支持物之喪失，反義或轴 突生長抑制分子（如RGM A、NOGO A、Semaphorins、 Ephrins)之大量積累可造成軸突指引之神經退化及成功轴 突再生之喪失。在中和針對如RGM A、NOGO A、 Semaphorins、Ephrins之組份之活性（具有針對如IL-12、 TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、 VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200.、IFNy、GM-CSF、FGF、C5、CD52及CCR2的促發炎細胞激素之中和 活性）的單一 DVD Ig分子中靶向將使得能夠同時集中於發 炎與神經退化，藉由當前治療MS原則之任一者均尚未達 成之目標。刺激神經退化可補償由MS中所觀察到之大量 140653.doc -155- 201006485 轴突神經退化所引起之功能招宝仓 刀月0 進而可使喪失的大腦功 能恢復。 6·敗血症 敗血症之病理生理異常係藉由革蘭氏陰性有機體（腊聚 糖[LPS]、知質八、内毒素）及革蘭氏陽性有機體（脂鱗壁 酸、肽聚聽）兩者之外膜組份引發。此等外膜組份能夠結 合於單核細胞表面上之CD14受體。藉助於近來描述之鐸 (toll)樣受體，隨後將信號傳輸至細胞，導致最終產生促發 炎性細胞激素腫瘤壞死因子_a(TNF_a)及介白素_1(IL_l}。碜 壓倒性發炎及免疫反應為敗血性休克之基本特徵且在敗血 症誘導之組織損傷、多個器官衰竭及死亡之發病機制中起 中心作用。細胞激素、尤其腫瘤壞死因子（TNF)及介白素 (IL-1)已展示為敗血性休克之關鍵介體。此等細胞激素具 有對於組織之直接毒性作用；其亦活化磷脂酶A2。此等及 其他作用導致血小板活化因子之濃度增加、促進氧化氮合 成酶活性、促進嗜中性白血球之組織浸潤及促進嗜中性白 血球活性。 ❹ 敗血症及敗血性休克之治療仍為臨床難題，且最近針對 發炎反應之使用生物反應改質劑（亦即抗TNF、抗MIF)之 有希望的試驗僅展示適度臨床益處。近來，關注已移向針 對逆轉伴隨之免疫抑制期之療法。實驗動物及垂危患者中 之研究證明淋巴器官及一些實質組織之增加之細胞凋亡造 成此免疫抑制、無反應性及器官系統功能障礙。在敗血症 候群期間，淋巴細胞細胞凋亡可藉由IL-2之缺乏或藉由糖 ^O653.d〇c -156- 201006485 皮質激素、顆粒酶（granzyme)或所謂「死亡」細胞激素： 腫瘤壞死因子α或Fas配位體之釋放而觸發。細胞凋亡經由 胞内及/或線粒體卡斯蛋白酶之自動活化而進行，其可受 Bcl-2家族之促細胞凋亡及抗細胞凋亡成員的影響。在實 驗動物中，細胞凋亡抑制劑之治療不僅可預防淋巴樣細胞 細胞凋亡；其亦可改善結果。雖然以抗細胞凋亡劑進行臨 床試驗部分地由於與其投與及組織靶向相關之技術難題而 仍遙遠，但是淋巴細胞細胞凋亡之抑制代表敗血症患者之 ® 有吸引力的治療標靶。同樣地，靶向發炎介體及細胞凋亡 介體兩者之雙重特異性劑可具有附加益處。本發明之一態 樣係關於能夠結合一或多個選自由以下各者組成之群之與 敗血症有關之標靶（在一實施例中兩個標靶）之DVD Ig : TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、 FasL、LPS、鐸樣受體、TLR-4、組織因子、MIP-2、 ADORA2A、CASP1、CASP4、IL-10、IL-1B、NFKB1、 PROC、TNFRSF1A、CSF3、CCR3、IL1RN、MIF、 NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、中期 因子、IRAKI 、NFKB2 、SERPINA1 、SERPINE1 及 TREM1 〇該等DVD Ig對於敗血症之功效可在此項技術中 已知之臨床前動物模型中評估（參見Buras JA等人（2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65及 Calandra T等人（2000) Nat Med. 6(2):164-70)。 7.神經性病症 7.1.神經退化性疾病 140653.doc -157- 201006485 神經退化性疾病為慢性（在該情況下，其通常具有年齡 依賴性）或急性（例如，中風、創傷性腦損傷、脊髓損傷等） 疾病。其特徵在於神經元功能之進行性喪失（神經元細胞 死亡、軸突喪失、神經炎營養失調、脫髓鞘）、活動性喪 失及記憶喪纟。對構成慢性神經退化性疾病（例如阿兹海 默氏症（Alzheimer’s disease))的基礎之機制的正處於形成 中之認識展示複雜病因且已識別造成其發展及進程的各種 因素，例如年齡、血糖狀態、澱粉狀蛋白產生及多聚合、 結合於其受體RAGE(晚期糖基化最終產物受體）之❹ 積累、大腦氧化應力增加、腦血流量減少、包括釋放發炎 細胞激素及趨化因子之神經發炎、神經元功能障礙及微神 經膠質細胞活化。因此，此等慢性神經退化性疾病代表多 個細胞類型與介體之間之複雜相互作用。該等疾病之治療 策略為有限的且主要構成以非特異性消炎劑（例如皮質類 固醇、COX抑制劑）阻斷發炎過程或藥齊j預防神經元喪失 及/或突觸功能。此等治療未能終止疾病進程。最近研究 表明更具靶向性之療法，諸如可溶A_b肽（包括A_b寡聚形© 式）之抗體可不僅有助於終止疾病進程而且亦有助於維持 記憶及其他認知功能。此等初步觀察結果表明靶向超過一 個疾病介體（例如A-b及促發炎性細胞激素（諸如TNF))之特 異性療法對於慢性神經退化性疾病而言可提供甚至比關於 靶向單一疾病機制（例如單獨可溶A_b)所觀察到之治療功 效更好的治療功效（參見C.E. Shepherd等人Neur〇bi〇1
Aging. 2005 Oct 24 ； Nelson RB., Curr Pharm Des. 140653.doc ·158- 201006485 2005; 1 1:3335 ； William L. Klein.; Neurochem Int. 2002; 41:345 ； Michelle C Janelsins 等人 J Neuroinflammation· 2005;2:23 ; Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004; 1:149 ; Igor Klyubin 等人 Nat Med. 2005; 11:556-61 ； Arancio O等人EMBO Journal (2004) 1-10 ; Bornemann KD 等人 Am J Pathol. 2001; 158:63 ; Deane R 等人 Nat Med· 2003; 9:907-13 ;及 Eliezer Masliah 等人 Neuron· 2005; 46:857) ° 本發明之DVD-Ig分子可結合一或多個與慢性神經退化 性疾病（諸如阿茲海默氏症）有關之標靶。該等標靶包括（但 不限於）與AD發病機制有關聯之任何介體（可溶或細胞表 面），例如AGE(S 100 A，兩性黴素（amphoterin))、促發炎 性細胞激素（例如IL-1)、趨化因子（例如MCP 1)、抑制神經 再生之分子（例如Nogo、RGM A)、增強神經突生長之分子 (神經營養因子）及可介導在血腦障壁處之輸送的分子（例如 轉鐵蛋白受體、胰島素受體或RAGE)。DVD-Ig分子之功效 可在臨床前動物模型中驗證，該等動物模型諸如過度表現 澱粉狀蛋白前體蛋白或RAGE且發展阿茲海默氏症樣症狀 之轉殖基因小鼠。另外，DVD-Ig分子可經構築且在動物 模型中測試功效且最佳治療性DVD-Ig可經選擇用於在人 類患者中測試。DVD-Ig分子亦可用於治療其他神經退化 性疾病，諸如帕金森氏症（Parkinson’s disease)。α-突觸核 蛋白與帕金森氏症病理有關。能夠靶向α-突觸核蛋白及發 炎介體（諸如TNF、IL_1、MCP-1)之DVD-Ig可證明為帕金 140653.doc •159- 201006485 森氏症之有效療法且涵蓋於本發明中。 或者’能夠靶向α-突觸核蛋白及RGMA之DVD-Ig不僅可 停止帕金森氏病患者之黑質的病理性進程，而亦可引起所 損壞神經突之再生，因為近期已展示rGm A在PD患者之 此區域中強烈地上調（B〇ssers κ等人（2〇〇9) Brain Path〇1 19: 91-107)。 7·2神經元再生及脊髓損傷 儘管對病理性機制的認識增加，脊髓損傷（SCI)仍為破 壞性病狀且代表以高度醫學需求為特徵之醫學適應症。大 多數脊髓損傷為挫傷或擠壓損傷且原發性損傷之後通常為 繼發性損傷機制（發炎介體，例如細胞激素及趨化因子）， 其惡化初始損傷且導致病灶面積顯著擴大，有時超過1〇 倍。SCI中之此等原發性及繼發性機制與腦損傷中之由其 他方式（例如創傷及中風）所引起之彼等機制極相似。不存 在令人滿意的治療且曱潑尼龍（MP)之高劑量快速注射為損 傷後8小時之窄時窗内之唯一所用療法。然而，此治療僅 意欲預防繼發損傷，而不會導致任何顯著功能恢復。其由 於缺乏明確功效及嚴重反作用（如免疫抑止，隨後感染， 及嚴重組織病理學肌肉變化）而受到大量批評。未批准刺 激内源性再生潛力之其他藥物、生物製劑或小分子，但近 年來有希望之治療原理及候選藥物已在SCI之動物模型中 展示功效，且恰在近期已提供第一批有希望之臨床資料。 在很大程度上在人類SCI中之功能恢復之缺乏係由在病灶 位點處、在傷疤組織中、在髓磷脂中以及在損傷相關之細 140653.doc •160· 201006485 胞上抑制神經突生長之因子所引起。該等因子為髓磷脂相 關之蛋白質NogoA、OMgp及MAG、RGM A、傷症相關之 CSPG(硫酸軟骨素蛋白聚糖）及對於反應性星形膠質細胞之 抑制因子（一些信號素（semaphorin)及ephrin)。然而，在病 灶位點處，不僅發現生長抑制分子，而且發現神經突生長 刺激因子，如神經營養因子、昆布胺酸、L1及其他。神經 突生長抑制及生長促進分子之此集合體可解釋阻斷單一因 子（如NogoA或RGM A)導致齧齒動物SCI模型中之顯著功能 ® 恢復，因為抑制影響之減少可將平衡自生長抑制移至生長 促進。然而，關於阻斷單一神經突外生長抑制分子所觀察 到之恢復為不全面的。為達成更快及更顯著恢復，阻斷兩 個神經突外生長抑制分子（例如Nogo及RGM A)或阻斷神經 突外生長抑制分子且增強神經突外生長增強分子（例如 Nogo及神經營養因子）之功能，或阻斷神經突外生長抑制 分子（例如Nogo)及促發炎性分子（例如TNF)可能為需要的 (參見 McGee AW 等人 Trends Neurosci. 2003; 26:193 ; ❿
Marco Domeniconi等人J Neurol Sci. 2005; 233:43 ; Milan Makwanal 等人FEBS J. 2005; 272:2628 ; Barry J. Dickson, Science. 2002; 298:1959 ; Felicia Yu Hsuan Teng 等人 J Neurosci Res. 2005; 79:273 ; Tara Karnezis 等人 Nature Neuroscience 2004; 7，736 ; Gang Xu 等人 J. Neurochem. 2004; 91; 1018)。
在一態樣中，提供能夠結合諸如以下各者之標靶對之 DVD-Ig : NgR與 RGM A ; NogoA與 RGM A ; MAG與 RGM 140653.doc -161 - 201006485 A ; OMGp 與 RGM A ; RGM A 與 RGM B ; RGM A 與 Semaphorin 3A ; RGM A 與 Semaphorin 4 ; CSPG 與 RGM A ;聚集蛋白聚糖（aggrecan)、中期因子、神經蛋白聚糖 (neurocan)、多功能蛋白聚糖（versican)、磷酸肌酸蛋白聚 糖（phosphacan)、Te38及TNF-α ; Αβ球聚體特異性抗體與 促進樹突&軸突分枝之抗體之組合。樹突病變及轴突損壞 或神經炎營養失調為AD之極早期病徵且已知NOGO Α限制 樹突生長且與髓磷脂相關且以上所述，例如RGM A、 MAG、OMGp之其他分子損害軸突再生長。可將該類型之 ab與SCI-候選（髓磷脂-蛋白質）Ab組合。其他DVD-Ig標靶 可包括以下各者之任何組合：NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、 MAG或Omgp。另外，標靶亦可包括與抑制神經突有關聯 之任何介艎（可溶或細胞表面），例如Nogo、Ompg、 MAG、RGM A、信號素、ephrin、可溶A-b、促發炎性細 胞激素（例如IL-1)、趨化因子（例如MIP la)、抑制神經再生 之分子。抗nogo/抗RGM A或類似DVD-Ig分子之功效可在 脊髓損傷之臨床前動物模型中驗證。另外，此等DVD-Ig 分子可經構築且在動物模型中測試功效且最佳治療性 DVD-Ig可經選擇用於在人類患者中測試。另外，可構築 DVD-Ig分子，其靶向單一受體上之兩個不同配位體結合 位點，該受體例如結合三個配位體Nogo、OMGp及MAG之 Nogo受體及結合A-b及S100 A之RAGE。此外，神經突外 生長抑制劑（例如nogo及nogo受體）亦在預防免疫疾病（如多 140653.doc -162· 201006485 發性硬化症）中之神經再生中起作用。已展示在多發性硬 化症之動物模型中抑制nogo-nogo受體相互作用可增強恢 復。因此，可阻斷免疫介體（例如細胞激素，如IL-12)及神 經突外生長抑制劑分子（例如nogo或RGM)之功能的DVD-Ig 分子可提供比單獨阻斷免疫或神經突外生長抑制劑分子更 快且更大之功效。 通常，抗體並不以有效且相關方式跨過血腦障壁 (BBB)。然而，在某些例如中風、外傷性腦損傷、多發性 ® 硬化症等之神經性疾病之情況下，BBB可能受損且允許增 加之DVD-Ig及抗體滲透入大腦中。在未發生BBB洩漏之其 他神經學病況中，可採用靶向内源性輸送系統，包括載體 介導之輸送體，諸如葡萄糖及胺基酸載體，及受體介導之 轉胞吞作用-在BBB之血管内皮處介導細胞結構/受體，因 此實現DVD-Ig之跨BBB輸送。實現該輸送之BBB處的結構 包括（但不限於）胰島素受體、轉鐵蛋白受體、LRP及 RAGE。此外，策略使得DVD-Ig亦能夠作為將潛在藥物輸 鲁 送到CNS中的梭使用，該等潛在藥物包括低分子量藥物、 奈米顆粒及核酸（Coloma MJ等人。（2000) Pharm Res. 17(3):266-74 ; Boado RJ 等人（2007) Bioconjug. Chem. 18(2):447-55)。 涵蓋能夠結合以下標靶對以治療神經疾病之DVD Ig : Αβ(序列1)與Αβ(序列3)、TNF與Αβ(序列2)、IL-lb與Αβ(序 列2)、Αβ(序列1)與Αβ(序列2)、IGF1，2與Αβ(序列2)、 Αβ(序列 2)與 IL-18、IL-6與 Αβ(序列 2)、TNF與 Αβ(序列 3)、 140653.doc -163 - 201006485 IL-lb 與 Αβ(序列 3)、Αβ(序列 1)與 Αβ(序列 3)、IGF1，2 與 Αβ(序列 3)、Αβ(序列 3)與 IL-18、IL-6與 Αβ(序列 3)、TNF與 Αβ(序列 1)、IL-lb 與 Αβ(序列 1)、IGF1,2 與 Αβ(序列 1)、 Αβ(序列1)與IL-18、IL-6與Αβ(序列1)、Αβ(序列1)與 RAGE、NGF與 IL-18、NGF與 IL-lb、NGF與 IL-6、TNF與 EGFR(序列 2)、TNF與 RAGE、CD-20與 EGFR(序列 1)、CD-20 與 EGFR(序列2) 、 RGMA 與 TNF(參 見實例 2.1 至 2·27) 。 8 ·致癌病症 單株抗體療法已作為癌症之重要治療模態而出現（von _ Mehren, Μ等人（2003) Annu· Rev. Med. 54:343-69)。抗體 可藉由誘導細胞凋亡、重定向之細胞毒性、干擾配位體-受體相互作用或阻止對於贅生性表型為關鍵性的蛋白質之 表現而發揮抗瘤作用。另外，抗體可靶向腫瘤微環境之組 份，從而擾亂極為重要的結構，諸如腫瘤相關之維管結構 之形成。抗體亦可靶向其配位體為生長因子之受體，諸如 表皮生長因子受體。因此，抗體可抑制刺激細胞生長之天 ❹ 然配位體結合於所靶向之腫瘤細胞。或者，抗體可誘導抗 遺傳型網路、補體介導之細胞毒性或抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 〇與單特異性療法相比，使用靶向兩個獨立腫瘤 介體之雙重特異性抗體可能會產生額外益處。 在另一實施例中，本發明之DVD能夠結合VEGF與磷脂 醯絲胺酸、VEGF 與 ErbB3 ' VEGF 與 PLGF、VEGF 與 R0B04、VEGF 與 BSG2、VEGF 與 CDCP1、VEGF 與 ANPEP 、VEGF 與 c-MET、HER-2 與 ERB3 、HER-2 與 140653.doc -164- 201006485 BSG2、HER-2 與 CDCPl、HER-2 與 ANPEP、EGFR 與 CD64、EGFR與 BSG2、EGFR與 CDCP1、EGFR與 ANPEP、 IGF1R與 PDGFR、IGF1R與 VEGF、IGF1R與 CD20、CD20 與 CD74、CD20與 CD30、CD20與 DR4、CD20與 VEGFR2、 CD20 與 CD52、CD20 與 CD4、HGF 與 c-MET、HGF 與 NRP1、HGF與磷脂醯絲胺酸、ErbB3與IGF1R、ErbB3與 IGF1,2、c-Met 與 Her-2、c-Met與 NRP1、c-Met與 IGF1R、 IGF1，2 與 PDGFR、IGF1，2與 CD20、IGF1，2與 IGF1R、IGF2 • 與 EGFR、IGF2 與 HER2、IGF2 與 CD20、IGF2 與 VEGF、 IGF2 與 IGF1R、IGF1 與 IGF2、PDGFRa 與 VEGFR2、 PDGFRa 與 PLGF、PDGFRa 與 VEGF、PDGFRa 與 c-Met、 PDGFRa與 EGFR、PDGFRb與 VEGFR2、PDGFRb與 c-Met、 PDGFRb 與 EGFR、RON 與 c-Met、RON與 MTSP1、RON與 MSP、RON與 CDCPl、VGFR1 與 PLGF、VGFR1 與 RON、 VGFR1 與 EGFR、VEGFR2 與 PLGF、VEGFR2 與 NRP1、 • VEGFR2 與 RON、VEGFR2 與 DLL4、VEGFR2 與 EGFR、 VEGFR2與 R0B04、VEGFR2與 CD55、LPA與 SIP、EPHB2 與 RON、CTLA4 與 VEGF、CD3 與 EPCAM、CD40 與 IL6、 CD40 與 IGF、CD40 與 CD56、CD40 與 CD70、CD40 與 VEGFR1、CD40 與 DR5、CD40 與 DR4、CD40 與 APRIL、 CD40與 BCMA、CD40與 RANKL、CD28與 MAPG、CD80與 CD40、CD80 與 CD30、CD80 與 CD33、CD80 與 CD74、 CD80與 CD2、CD80與 CD3、CD80與 CD19、CD80與 CD4、 CD80 與 CD52、CD80 與 VEGF、CD80 與 DR5、CD80 與 140653.doc -165- 201006485 VEGFR2、CD22 與 CD20、CD22 與 CD80、CD22 與 CD40、 CD22 與 CD23、CD22 與 CD33、CD22 與 CD74、CD22 與 CD19、CD22與 DR5、CD22 與 DR4、CD22 與 VEGF、CD22 與 CD52、CD30 與 CD20、CD30 與 CD22、CD30 與 CD23、 CD30 與 CD40、CD30 與 VEGF、CD30 與 CD74、CD30 與 CD19、CD30 與 DR5、CD30 與 DR4、CD30 與 VEGFR2、 CD30 與 CD52、CD30 與 CD4、CD138 與 RANKL、CD33 與 FTL3、CD33 與 VEGF、CD33 與 VEGFR2、CD33 與 CD44、 CD33 與 DR4、CD33 與 DR5、DR4 與 CD137、DR4 與 IGF1，2、DR4與 IGF1R、DR4與 DR5、DR5 與 CD40、DR5 與 CD137、DR5 與 CD20、DR5 與 EGFR、DR5 與 IGF1,2、DR5 與IGFR、DR5與HER-2及EGFR與DLL4。其他標靶組合包 括EGF/erb-2/erb-3家族之一或多個成員。DVD Ig可結合之 與致癌疾病有關之其他標靶（一或多個）包括（但不限於）選 自由以下各者組成之群之彼等者：CD52、CD20、CD19、 CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、ILIA、IL1B、IL2、 IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、 FGF10 、 FGF11 、 FGF12 、 FGF13 、 FGF14 、 FGF16 、 FGF17 ' FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、 FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、 FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、ILIA、 IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、 VEGF、CDK2、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、 IGF1R、IL2、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、 -166· 140653.doc 201006485 CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3 、 GNRH1、IGFBP6、ILIA、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、 TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、 CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENOl、ERBB2、ESR1、 ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、 NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、 FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、 TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、 ❿ INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、 NR2F6 、NR4A3 、 ESR1 、 ESR2 、NR0B1 、 NR0B2 、 NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、 NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、 NR4A1 、NR4A2 、 NR5A1 、NR5A2 、NR6A1 、PGR、 RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、 BRCA1 、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1 、COL6A1、 EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、
FGF14 、 FGF16 、 FGF17 、 FGF18 、 FGF2 、 FGF20 、 FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、 FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、 IGFBP6、IL12A、ILIA、IL1B、IL2、IL24、INHA、 INSL3 、 INSL4 、 KLK10 、 KLK12 、 KLK13 、 KLK14 、 KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、 MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、 PSAP、SERPINA3 、SHBG、TGFA、TIMP3 、CD44、 140653.doc -167- 201006485 CDHl、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、 CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、 CDH7、CDH8、CDH9、R0B02、CD44、ILK、ITGA1、 APC 、CD164 ' COL6A1 、MTSS1 、PAP 、TGFB1I1 、 AGR2 、 AIG1 、 AKAP1 、 AKAP2 、 CANT1 、 CAV1 、 CDH12、CLDN3、CLN3 、CYB5 、CYC1 、DAB2IP、 DES 、 DNCL1 、 ELAC2 、 EN02 、 EN03 、 FASN 、 FLJ12584 、FLJ25530 、GAGEB1 、GAGEC1 、GGT1 、 GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、❹ KRT2A 、 MIB1 、 PARTI 、 PATE 、 PC A3 、 PIAS2 、 PIK3CG、PPID、PR1 、PSCA、SLC2A2、SLC33A1 、 SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、 ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、 FGF2、FIGF、FLT1 、JAG1 、KDR、LAMA5、NRP1、 NRP2 ' PGF 、PLXDC1 、 STAB1 、 VEGF 、 VEGFC 、 ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、 NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1 、PF4、PROK2、 SERPINF1 、 TNFAIP2 、 CCL11 、 CCL2 、 CXCL1 、 CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、 IFNB1 、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1 、EFNA1 、 EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、 ITGB3 、 PDGFA 、 TEK 、 TGFA 、 TGFB1 、 TGFB2 、 TGFBR1 、CCL2、CDH5 、COL18A1 、EDG1 、ENG、 ITGAV 、 ITGB3 、 THBS1 、 THBS2 、 BAD 、BAG1 、 140653.doc • 168 - 201006485 BCL2、CCNAl、CCNA2、CCNDl、CCNEl、CCNE2、 CDH1(E_ 鈣黏素） 、 CDKNlB(p27Kipl)、 CDKN2A(pl6INK4a)、COL6A1、CTNNBl(b-索烴素）、 CTSB(組織蛋白酶 B)、ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2、 F3(TF)、FOSLl(FRA-l)、GATA3、GSN(膠溶素）、 IGFBP2 > IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(醣蛋白 130)、 ITGA6(a6 整合素）、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-Jun) 、 MKI67(Ki-67) 、 NGFB(NGF) 、 NGFR 、 ® NME1(NM23A) 、PGR、PLAU(uPA) 、PTEN、 SERPINB5(脈絲平（maspin))、SERPINEl(PAI-l)、TGFA、 THBS1(凝血栓蛋白-1)、TIE(Tie-l)、TNFRSF6(Fas)、 TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓撲異構酶 Iia)、TP53、 AZGP1(鋅-a_膽蛋白）、BPAG1(網蛋白）、 CDKNlA(p21Wapl/Cipl)、CLDN7(緊密連接蛋白-7)、 CLU(凝聚素）、ERBB2(Her-2)、FGF1、FLRT1(纖連蛋 白）、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6(a6 整合 素）、ITGB4(b 4 整合素）、KLF5(GC Box BP)、KRT19(角蛋 白19)、KRTHB6(毛髮特異II型角蛋白）、MACMARCKS、 MT3(金屬硫結合蛋白_111)、MUC1(黏蛋白）、PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2) ' S100A2、SCGB1D2(親月旨素 B)、 SCGB2A1(乳腺球蛋白2)、SCGB2A2(乳腺球蛋白1)、 SPRRlB(Sprl) 、 THBS1 、 THBS2 、 THBS4 及 TNFAIP2(B94)、RON、c-Met、CD64、DLL4、PLGF、 CTLA4、磷脂醯絲胺酸、R0B04、CD80、CD22、CD40、 140653.doc • 169- 201006485 CD23、CD28、CD80、CD55、CD38、CD70、CD74、 CD30、CD138、CD56、CD33、CD2、CD137、DR4、 DR5、RANKL、VEGFR2、PDGFR、VEGFR1、MTSP1、 MSP、EPHB2、EPHA1、EPHA2、EpCAM、PGE2、 NKG2D、LPA、SIP、APRIL、BCMA、MAPG、FLT3、 PDGFRa、PDGFRP、ROR1、PSMA、PSCA、SCD1 及 CD59。 IV.醫藥組合物 本發明亦提供包含本發明之結合蛋白及醫藥學上可接受 之載劑之醫藥組合物。將包含本發明之結合蛋白之醫藥組 合物用於（但不限於）診斷、偵測或監控病症，用於預防、 治療、控制或改善病症或其一或多個症狀及/或用於研 究。在一特定實施例中，組合物包含一或多種本發明之結 合蛋白。在另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種本發 明之結合蛋白及除本發明之結合蛋白以外用於治療病症之 一或多種預防或治療劑。在一實施例中，預防或治療劑已 知適用於或已用於或當前用於預防、治療、控制或改善病 症或其一或多個症狀。根據此等實施例，組合物可進一步 包含載劑、稀釋劑或賦形劑。 本發明之結合蛋白可併入適合於投與個體之醫藥組合物 中。通常，醫藥組合物包含本發明之結合蛋白及醫藥學上 可接受之載劑。如本文中所用，「醫藥學上可接受之載 劑」包括生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗 料、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似 140653.doc -170- 201006485 物。醫藥學上可接受之载劑之實例包括水 緩:生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物 或多者’以及其組合。在苹此會 你呆二貫轭例中，較佳於組合物中 包括等滲劑，例如糖、多元醢 夕几醇（諸如甘露糖醇、山梨糖 醇)’或氣化鈉。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含少 量增加抗體或抗體部分之存放期或有效性之辅助物質諸 如濕潤或乳化劑、防腐劑或緩衝劑。
已知各種傳遞系、统且其可詩投與一或多種本發明之抗 體或一或多種本發明之抗體與適用於預防、控制、治療或 改善病症或其一或多個症狀之預防劑或治療劑之組合，例 如封裝於脂質體、微粒、微囊中、能夠表現抗體或抗體片 段之重組細胞、受體介導之胞吞作用（參見例如Wu& Wu， J· Biol，Chem. 262:4429-4432 (1987)) ’ 核酸構築為反轉錄 病毒或其他載體之部分等。投與本發明之預防或治療劑之 方法包括（但不限於）非經腸投與（例如皮内、肌肉内、腹膜 内、靜脈内及皮下）、硬膜外投與、瘤内投與及黏膜投與 (例如鼻内及經口途徑）。另外，可採用肺部投與，例如藉 由使用吸入器或霧化器，及與氣溶膠化劑一起調配。參見 例如美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第 5,985,309 號、第 5,934,272 號、第 5,874,064 號、第 5,855,913號、第 5,290,540 號及第 4,880,078 號及 PCT 公開案 第 WO 92/19244號、第 WO 97/32572號、第 WO 97/44013 號、第WO 98/31346號及第WO 99/669〇3號，其各自係以 引用的方式全部併入本文中。在一實施例中，本發明之結 140653.doc -171 - 201006485 。蛋白、組合療法或本發明之組合物使用A〗kermes AIR⑧ 肺部藥物傳遞技術（Alkermes，Inc，Cambridge，Μ^)投 與。在一特定實施例中，本發明之預防或治療劑係以肌 内、靜脈内、瘤内、經口、鼻内、肺部或皮下方式投與。 預防或治療劑可藉由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或 快速注射，藉由經由上皮或黏膜皮膚襯層（例如口腔黏 膜、直腸及腸黏膜等）吸收且可與其他生物活性劑一起投 與。投與可為全身性或局部的。 在一實施例中，抗體偶合之碳奈米管（CNT)在活體外與 腫瘤細胞特異性結合，接著其藉由近紅外（NIR)光之高度 特異性切除可用於乾向肢瘤細胞。例如，經生物素標記之 極丨生月曰質可用於製備穩定、生物相容、非細胞毒性Cnt分 散液，其隨後連接至針對一或多種腫瘤抗原（例如cD22)之 不同紐崔萊（neutralite)抗生物素蛋白來源之dvD_ ig(chakravarty，p等人（2008) Proc Natl Acad Sci usa 105:8697-8702 。 在一特定實施例中，可能需要局部地向需要治療之區域 投與本發明之預防或治療劑；此可（例如）（但不限於）藉由 局部輸注、藉由注射或藉助於植入物達成，該植入物具有 多孔或無孔材料，包括膜及基質，諸如赛萊（sialastic)膜、 聚合物、纖維基質（例如Tissuel®)或膠原蛋白基質。在一 實施例中，向個體患病區域局部地投與有效量之一或多種 本發明之抗體拮抗劑以預防、治療、控制及/或改善病症 或其症狀。在另一實施例中，向個體患病區域局部地投與 140653.doc -172- 201006485 有效量之一或多種本發明之抗體以及有效量之除本發明之 結合蛋白以外之一或多種療法（例如一或多種預防或治療 劑）以預防、治療、控制及/或改善病症或其一或多個症 狀。 在另一實施例中，預防或治療劑可以控制釋放或持續釋 放系統來傳遞。在一實施例中，可使用泵以達成控制或持 續釋放（參見 Langer 同上；Sefton, 1987，CRC Crit· Ref. Biomed. Eng. 14:20 ; Buchwald等人 1980，Surgery 88:507 ; ❹ Saudek等人 1989，N. Engl. J. Med. 321:574)。在另一實施 例中，聚合材料可用於達成本發明之療法之控制或持續釋 放（參見例如 Medical Applications of Controlled Release, Langer 及 Wise(編），CRC Pres·，Boca Raton，Fla. (1974);
Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen 及 Ball(編），Wiley，New York (1984) ； Ranger及 Peppas, 1983，J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 ;亦參見Levy 等人 1985，Science 228:190 ; During等人 1989, Ann. Neurol. 25:351 ; Howard 等人 1989, J. Neurosurg. 7 1:105);美國專利第 5,679,377 號、美國專利第5,916,597號、美國專利第5,912,01 5號、美 國專利第5,989,463號、美國專利第5，128,326號、卩(^公開 案第WO 99/1 5 154號及PCT公開案第WO 99/20253號。用於 持續釋放型調配物之聚合物之實例包括（但不限於）聚（2-羥 基乙基曱基丙烯酸酯）、聚（曱基丙烯酸甲酯）、聚（丙烯 酸）、聚（乙烯-共-乙酸乙烯酯）、聚（甲基丙烯酸）、聚乙交 140653.doc •173. 201006485 酯（PLG)、聚酸酐、聚（N-乙烯吡咯啶鲖）、聚（乙烯醇）、聚 丙烯醯胺、聚（乙二醇）、聚丙交酯（PL A)、聚（丙交酯-共-乙交酯）(PLGA)及聚原酸酯。在一實施例中，用於持續釋 放型調配物中之聚合物為惰性的，不含可浸出之雜質、在 儲存時穩定，無菌且為生物可降解的。在另一實施例中， 控制或持續釋放系統可與預防或治療性標靶鄰近安置，因 此僅需要全身性劑量之一部分（參見例如Goodson，Medical Applications of Controlled Release同上，第 2卷，第 115-138 頁（1984)) 〇 控制釋放系統在Langer之評述中經討論（1990，Science 249:1527-1533)。熟習此項技術者已知之任何技術可用於 產生包含一或多種本發明之治療劑之持續釋放型調配物。 參見例如美國專利第4,526,938號、PCT公開案WO 91/05548、PCT 公開案 WO 96/20698、Ning 等人 1996, 「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Re lease Gel, j Radiotherapy &Oncology 39:179-189, Song 等人 1995, 「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,」PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397，Cleek等人 1997,「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,」Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854,及 Lam 等人 1997，「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local 140653.doc -174- 201006485
Delivery,, Pr〇c. Infl. Symp. Control Rel. Bioact. Mater 24:759-760,其各自係以引用的方式全部併入本文中。 在本發明之組合物為編瑪預防或治療劑之核酸之一特定 實施例中，核酸可藉由將其構築為適當核酸表現載體之一 部分且投與其以使得其變為細胞内來活體内投與以促進其 編碼之預防或治療劑之表現，此舉之實現係（例如）藉由使 用反轉錄病毒載體（參見美國專利第4,98〇,286號），或藉由 直接注射，或藉由使用微粒轟擊（例如基因槍；Bi〇listic， β Dupont)，或以脂質或細胞表面受體或轉染劑塗布，或藉 由將其與已知進入細胞核之同源異形盒（h〇me〇b〇x)樣肽連 接而投與（參見例如j〇li〇t等人1991，Pr〇c Natl Acad ϋ USA 88:1864-1868)。或者，可將核酸引入細胞内且併入宿 主細胞DNA内以便藉由同源重組表現。 本發明之醫藥組合物經調配以與其預定投與途徑相容。 投與途徑之實例包括（但不限於）非經腸（例如靜脈内、皮 參内、皮下）、經口、鼻内（例如吸入）、經皮（例如局部）、經 黏膜及直腸投與。在一特定實施例中，組合物根據常規程 序調配為適合於靜脈内、皮下、肌肉内、經口、鼻内或局 部投與人類之醫藥組合物，通常，靜脈内投與之組合物為 無菌等滲含水緩衝劑中之溶液。在必要時，組合物亦可包 括增溶劑及局部麻醉劑（諸如力諾坎（Hgn〇camne))以減輕注 射位點處之疼痛。 若本發明之組合物局部地投與，則組合物可調配為軟膏 劑、乳膏、經皮貼片、洗劑、凝膠、洗髮劑、喷霧劑、氣 140653.doc •175- 201006485 霧劑、溶液、乳液形式或熟習此項技術者熟知之其他形 式。參見例如 Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第 19版，
Mack Pub. Co.，Easton，Pa· (1995)。在一實施例中，對於 不可噴霧之局部劑型’採用包含與局部施用相容之載劑或 一或多種賦形劑且具有大於水之動態黏度之黏性至半固體 或固體形式。適合調配物包括（但不限於）溶液、懸浮液、 乳液、乳膏、軟膏劑、粉末、搽劑、油膏及其類似物，若 需要’其經滅菌或與助劑（例如防腐劑、穩定劑、濕潤參 劑、緩衝劑或鹽）混合以影響各種性質，諸如滲透壓。其 他適合局部劑型包括可喷霧氣霧劑製劑，其中在一實施例 中活性成份以及固體或液體惰性載劑與加壓揮發物（例 如氣體推進劑，諸如氟利昂（fre〇n))混合封裝或封裝於壓 擠觀中。若需要’亦可將濕化劑或保濕劑添加至醫藥組合 物及劑型I該等額外成份之實例在此項技術中為熟知 的。 々若本發明之方法包含組合物之鼻内投與，則組合物可以® 氣霧劑I式、喷霧劑、霧狀物或以滴劑形式調配。詳言 之根據本發明使用之預防或治療劑可便利地以自加壓包 裝或噴霧器中呈現之氣溶谬噴霧形式藉助於合適之推進劑 (例如一氣二氟甲烷、三氣氟甲烷、二氣四氟乙烷、二氧 1 匕碳或其他合適氣體）傳遞。在加壓氣溶勝情況下，劑量 I可藉由提供闕門以傳遞經計量之量來確定。用於吸入 盗或吹入器中(由(例如)明膠構成)之膠囊及濾筒可經調配 I40653.doc •176- 201006485 以含有化合物與合適粉劑基劑（諸如乳糖或澱粉）的粉末混 合物。 若本發明之方法包含經口投與，則組合物可以經口方式 以錠劑、膠囊、扁囊劑、膠囊錠、溶液、懸浮液形式及其 類似形式調配。錠劑或膠囊可藉由習知方法以醫藥學上可 接受之諸如以下之賦形劑來製備：黏結劑（例如預膠凝化 玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶_或羥丙基甲基纖維素）；填充 劑（例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣）；潤滑劑（例如硬脂 ® 酸鎂、滑石或二氧化矽）’崩解劑（例如馬鈐薯澱粉或羥基 乙酸澱粉鈉）；或濕潤劑（例如十二烷基硫酸鈉）。可由在此 項技術中所熟知之方法塗布該等旋劑·。經口投與之液體製 劑可採用（但不限於）溶液、糖漿或懸浮液之形式，或其可 呈現為在使用之前以水或其他合適媒劑組構之乾燥產物。 '•玄等液體製劑可由習知方法使用醫藥學上可接受之諸如以 下之添加劑來製備：懸浮劑（例如山梨糖醇糖漿、纖維素 φ 衍生物或氫化可食脂肪）；乳化劑（例如卵磷脂或阿拉伯 膠）；非水媒劑（例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物 油），及防腐劑（例如甲基或丙基_對_經基笨甲酸醋或山梨 酸）該等製劑亦可視情況而定含有緩衝鹽、調味劑、著 & @及甜味劑。& π投與之製劑可合適地經調配以便緩慢 釋放、控制釋放或持續釋放預防或治療劑。 本發明之方法可包含（例如）藉由使用吸入器或霧化器來 肺部投與以氣溶膠化劑調配之組合物。參見例如美國專利 第 6’019’968 號、第 5,985,320 號、第 5,985,309 號、第 140653.doc -177- 201006485 5,934,272 號、第 5,874,064 號、第 5,855,913 號、第 5,290,540號及第4,880,078號及卩(：1'公開案第胃0 92/19244 號、第 WO 97/32572 號、第 WO 97/44013 號、第 WO 98/3 1346號及第WO 99/66903號，其各自係以引用的方式 全部併入本文中。在一特定實施例中，本發明之結合蛋 白、組合療法及/或本發明之組合物使用Alkermes AIR®肺 部藥物傳遞技術（Alkermes, Inc., Cambridge, Mass·)投與。 本發明方法可包含投與經調配用於藉由注射（例如藉由 快速注射或連續輸注）非經腸投與之組合物。用於注射之 調配物可以單位劑型形式（例如在安瓶中或在多劑量容器 中）與經添加之防腐劑一起存在。組合物可採用如於油性 或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液的形式且可含有調配 劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活性成份 可呈在使用之前以合適之媒劑（例如無菌無熱原質水）組構 之粉末形式。 本發明之方法可另外包含投與調配為儲槽製劑之組合 物。該等長效調配物可藉由植入（例如皮下或肌内）或藉由 肌内注射投與。因此，（例如）可使用合適之聚合或疏水性 材料（例如以在可接受之油中之乳液形式）或離子交換樹 脂、或以微溶性衍生物形式（例如以微溶性鹽形式）來調配 組合物。 本發明之方法涵蓋投與調配為中性或鹽形式之組合物。 醫藥學上可接受之鹽包括以諸如自鹽酸、磷酸、乙酸、草 酸、酒石酸等衍生之彼等陰離子形成之彼等鹽及以諸如自 140653.doc -178- 201006485 納:鉀、錢、舞、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2_乙胺基 乙醇、組胺酸、普魯卡因等衍生之彼等陽離子形成之彼等 鹽。 常組α物之成份分開地或混合在一起以單位劑型形 式來，供，例&以指示活性劑的數量之密閉容器（諸如安 或藥囊）中之乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式。在投與 =式為輸注的情況下，組合物可以含有無菌醫藥等級水或 ❹鹽，之輸注瓶來分配。在投與模式為藉由注射的情況下， 可提供具有無菌注射水或鹽水之安瓶以使得成份可在投與 之前混合。 、 亦詳言之’本發明亦規定將本發明之一或多種預防或治療 ^或醫藥組合物封裝於指示藥劑的數量之密閉容器（諸如 域或藥囊)中。在一實施例中’本發明之一或多種預防 或治療劑或醫藥組合物以密閉容器中之乾燥滅菌珠乾粉末 $無水濃縮物形式提供且可經復原（例如藉由水或鹽水）至 參才又與個體之適當濃度。在一實施例中’本發明之一或多種 預防或治療劑或醫藥組合物以至少5 mg、至少1〇邮、至 夕15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 S至少75 或至少100 mg之單位劑量以密閉容器中之 乾燥無菌來乾粉末形式提供。本發明之;東干預防或治療劑 或醫藥組σ物應在2C與之間储存於其初始容器中且本 發明之預防或治療劑或醫藥組合物應在復原之後丨週内（例 如5天内、72小時内、48小時内、24小時内、12小時内、6 J時内、5小時内、3小時内或丨小時内）投與。在替代實施 14〇653.d〇c •179· 201006485 例中，本發明之一或多種預防或治療劑或醫藥組合物以液 體形式提供於指示藥劑數量及濃度之密閉容器中。在一實 施例中，液體形式之所投與組合物以至少〇,25 mg/ml、至 少 0.5 mg/ml、至少 1 mg/ml、至少 2.5 mg/mi、至少 5 mg/ml、至少 8 mg/ml、至少 1〇 mg/ml、至少 15 mg/kg、至 少 25 mg/ml、至少 50 mg/ml、至少 75 mg/ml 或至少 100 mg/ml提供於密閉容器中。液體形式應在之^與^充之間儲 存於其初始容器中。 本發明之結合蛋白可併入適合於非經腸投與之醫藥組合 物中。在一實施例中’抗體或抗體部分製備為含有0.^50 mg/ml結合蛋白之可注射性溶液。可注射性溶液可由弗林 特（flint)或琥珀小瓶、安瓿或預填充針筒中之液體或凍 乾劑型構成。緩衝劑可為L_組胺酸（1_5〇 mM)，最佳5_ 1〇 mM，處於pH值5.〇至'ο(最佳pH值6〇)。其他適合緩衝 劑包括（但不限於）琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸 鉀。氣化鈉可用於改變〇_3〇〇 mM(對於液體劑型最佳15〇 mM)之濃度下之溶液之毒性。可包括用於凍乾劑型之防凍 劑，主要為〇·10%蔗糖（最佳〇.5-1.〇°/〇)。其他適合防凍劑包 括海藻糖及乳糖。可包括用於凍乾劑型之增積劑，主要為 甘露糖醇（最佳2_4%)。穩定劑可用於液體及凍乾劑 型兩者中，主要為卜50 mM L-甲硫胺酸（最佳5_10 mM)。 八他適。增積劑包括甘胺酸、精胺酸，可以0-0.05¾聚山 梨醇酶-80(最佳〇·〇〇5_〇〇1%)形式包括在内。額外界面活 性劑包括（但不限於）聚山梨醇酯2〇&BRIJ界面活性劑。製 140653.doc 201006485
備為用於非經腸投與之可注射性溶液之包含本發明之結合 蛋白之醫藥組合物可進一步包含適用作佐劑之藥劑，諸如 用以增加治療性蛋白（例如抗體）之吸收或分散之彼等者。 尤其適用之佐劑為玻尿酸酶，諸如Hylenex(g)(重組人類玻 尿酸酶）。添加玻尿酸酶於可注射性溶液中可改良非經腸 投與（尤其皮下投與）之後之人類生物可用性。其亦允許在 疼痛及不適較少且注射位點反應之發生率最小化的情況下 更大之注射位點體積（亦即大於1 ml)。（參見WO ® 2004078140及US2006104968，其係以引用的方式併入本文 中）。 本發明之組合物可呈各種形式。此等包括（例如）液體、 半口體及固體劑型，諸如液體溶液（例如可注射性及可輸 注之溶液）、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質 體及检劑。所選形式視預定投與模式及治療應用而定。典 型組合物呈可注射或可輸注溶液之形式，諸如與用於以其 φ 他抗體使人類被動免疫之彼等組合物相似之組合物。所選 投與模式為非經腸（例如靜脈内、皮下、腹膜内、肌肉 内）。在一實施例中，抗體藉由靜脈内輸注或注射投與。 在另一實施例中’抗體藉由肌肉内或皮下注射投與。 治療組合物通常必須在製造及儲存條件下為無菌且穩定 的。組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適 合於較高藥物濃度之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉 由將活性化合物（亦即抗體或抗體部分）以所需量與本文中 列舉之成份之一者或成份之組合一起併入適當溶劑中，視 I40653.doc -181- 201006485 需要接著過濾滅菌來製備。通常藉由將活性成份併入含有 驗性分散介質及來自本文中所列舉之彼等成份之所需其他 成份的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射 溶液之無菌、凍乾粉末的情況下，製備方法為真空乾燥及 噴霧乾燥’其產生活性成份加上來自其先前無菌過渡溶液 之任何額外所需成份之粉末。可（例如）藉由使用塗料（諸如 卵磷脂）、藉由在分散液情況下維持所需粒徑及藉由使用 界面活性劑來保持溶液之適當流動性。可藉由將延遲吸收 之藥劑（例如單硬脂酸鹽及明膠）包括於組合物中來實現可❿ 注射性組合物之延長吸收。 雖然對於許多治療應用’在一實施例中，投與之途徑/ 模式為皮下注射、靜脈内注射或輸注，但是本發明之結合 蛋白可藉由在此項技術中已知之各種方法投與。如熟習此 項技術者所瞭解’投與之途徑及/或模式視所需結果而變 化。在某些實施例中，活性化合物可與保護化合物免於快 速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入 物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解、生® 物相容的聚合物，諸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙 酵酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之 許多方法受專利權保護或通常為熟習此項技術者所知。參 免例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery 办J.R. Robinson編，Marcel Dekker, Inc.，New York, 1978。 在某些實施例中，本發明之結合蛋白可（例如）與惰性稀 140653.doc -182- 201006485 釋劑或可同化之可食载劑一起經口投與。化合物（及（若需 要）其他成伤）亦可封裝於硬或軟殼明膠膠囊中壓縮成錠 劑，或直接併入個體之腾食中。對於經口治療投與，化合 物可與賦形劑合並且以可吸收性錠劑、頰内錠劑、片劑、 膝囊Sfc齊j懸、浮液、糖讓、糯米紙囊劑及其類似物之开; 式使用。為藉由除非經腸以外之投與來投與本發明之化合 物，可旎需要以材料塗布化合物或將化合物與材料一起 共投與以預防其失活。 β 補充活性化合物亦可併入該等組合物中。在某些實施例 中，本發明之結合蛋白與適用於與本發明之結合蛋白一起 治療病症之一或多種額外治療劑共調配及/或共投與。例 如，本發明之結合蛋白可與結合其他標靶之一或多種額外 抗體（例如結合其他細胞激素或結合細胞表面分子之抗體） 一起共調配及/或共投與。此外，本發明之一或多種抗體 可與以上治療劑中之兩者或兩者以上組合使用。該等組合 φ 療法可有利地利用所投與治療劑之較低劑量，因此避免與 各種單一療法相關之可能毒性或併發症。 在某些實施例中，結合蛋白與在此項技術中已知之延長 半衰期之媒劑連接。該等媒劑包括（但不限於）Fc區、聚乙 二醇及聚葡萄糖。該等媒劑描述於（例如）美國申請案第 〇9/428,082號及公開PCT申請案第99/25〇44號中，其係出於 任何目的以引用的方式併入本文中。 在特疋貫施例中，投與編碼本發明之結合蛋白或本發 明之另一預防或治療劑之核酸序列以經由基因療法治療、 140653.doc -183- 201006485 預防、控制或改善病症或其一或多種症狀。基因療法係指 藉由向個體投與所表現或可表現的核酸來執行之療法。在 本發明之此實施例中，核酸產生其所編碼之本發明抗體或 預防或治療劑，其介導預防或治療作用。 可根據本發明使用在此項技術中可利用之基因療法之任 何方法。對於基因療法之方法之一般評述，參見Goldspiel 等人 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505 ; Wu及 Wu，1991， Biotherapy 3:87-95 ; Tolstoshev, 1993， Ann. Rev.
Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 ; Mulligan, Science
260:926-932 (1993);及 Morgan 與 Anderson, 1993，Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 ； May, 1993， TIBTECH 11(5):155-215。可使用的在此項技術中通常已知之重組 DNA技術之方法描述於 Ausubel等人（編），Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993);及 Kriegler，Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)中。基因療 法之各種方法之詳細描述揭示於US20050042664 A1中，其 係以引用的方式併入本文中。 本發明之結合蛋白適用於治療藉由結合蛋白識別之標靶 為有害的各種疾病。該等疾病包括（但不限於）類風濕性關 節炎、骨關節炎、幼年型慢性關節炎、膿毒性關節炎、萊 姆氏關節炎、牛皮癖性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節 病、全身性紅斑性狼瘡症、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、 發炎性腸道疾病、胰島素依賴型糖尿病、甲狀腺炎、哮 140653.doc 201006485 而過敏性疾病、牛皮癖、皮炎、硬皮病、移植物抗宿主 疾病、益官移植排斥反應、與器官移植相關之急性或慢性 免疫疾病、肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、彌漫性血管内凝 血川崎氏疾病、格雷氏病、腎病症候群、慢性疲勞症候 群牟格納肉牙腫病、亨偌_絲奇恩賴紫癜、腎臟微觀脈 B ^慢性活性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休 克症候群、敗也症候群、惡病質、傳染性疾病、寄生疾 病、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏 舞蹈病、帕金森氏病、阿茲海默氏症、中風、原發性膽汁 性肝硬化、溶血性貧血、惡性腫瘤、心臟衰竭、心肌梗 塞、阿狄森氏病、1型多腺體分泌不足及2型多腺體分泌不 足症、施岔特氏症候群、成年（急性）呼吸窘迫症候群、脫 髮、斑形脫髮、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏病、 牛皮癖性關節病、潰瘍性大腸炎關節病、腸病性滑膜炎、 衣原體、耶爾森氏菌屬及沙門菌屬相關之關節病、脊椎關 參節病、動脈粥樣化疾病/動脈硬化、異位性過敏、自體免 疫大皰疾病、尋常天疱瘡、葉型天疱瘡、類天疱瘡、線性 IgA疾病、自體免疫溶血貧血症、庫姆陽性溶血貧血症、 後天性惡性貧A、幼年型惡性貧血、肌痛腦炎/皇家自由 疾病、k性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞性動脈炎、原發性 硬化肝炎、隱原性自體免疫肝炎、後天性免疫缺乏疾病症 候群、後天性免疫缺乏相關疾病、8型肝炎、c型肝炎、 一般變異性免疫缺乏症（一般變異性低丙種球蛋白血症）、 擴張性心肌病、女性不育症、印巢衰竭、卵巢早衰、纖維 140653.doc -185- 201006485 變性肺病、隱原性纖維性肺泡炎、發炎後間質肺病、間質 肺炎、結締組織病相關間質肺病、混合性結締組織病相關 肺病、全身性硬化症相關間質肺病、類風濕性關節炎相關 間質肺病、全身性紅斑性狼瘡症相關肺病、皮肌炎/多發 性肌炎相關肺病、修格蘭氏疾病相關肺病、僵直性脊椎炎 相關肺病、脈管炎擴散肺病、含鐵血黃素沉著症相關肺 病、藥物誘導之間質肺病、纖維化、放射性纖維化、閉塞 性細支氣管炎、慢性嗜伊紅細胞性肺炎、淋巴球性滲透性 肺病、感染後間質肺病、痛風性關節炎、自體免疫性肝 炎、1型自體免疫性肝炎（典型自體免疫或狼瘡樣肝炎）、2 型自體免疫性肝炎（抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介導之低 血糖、B型抗胰島素症伴以黑棘皮病、甲狀旁腺機能減 退、與器官移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之 慢性免疫疾病、骨關節炎、原發性硬化性膽管炎、1型牛 皮癬2型牛皮癖、特發性白血球減少症、自體免疫性嗜 中性細胞減少症、腎病NOS、絲球體腎炎、腎臟之微觀血 管炎、萊姆氏病、盤狀紅斑性狼瘡、特發性男性不育症或 NOS、精液自體免疫、多發性硬化症（所有亞型）、交感性 眼炎、因結締組織疾病繼發之肺循環血壓過高、古德帕斯 徹氏症候群、多發性結節性動脈炎之肺部表現、急性風濕 熱、類風濕性脊椎炎、斯蒂爾氏病、全身性硬化症、修格 蘭氏症候群、高安氏疾病/動脈炎、自體免疫性血小板減 少症、特發性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺病、甲狀 腺功能亢進、甲狀腺腫自體免疫性甲狀腺功能低下（橋本 140653.doc -186- 201006485 氏病）、萎縮性自體免疫性曱狀腺功能低下、原發性黏液 水遽、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性脈管炎、白斑症、急 性肝臟疾病、慢性肝臟疾病、酒精性肝硬變、酒精誘導之 肝臟損傷、膽汁鬱積、特應性肝臟疾病、藥物誘導之肝 炎、非酒精性脂肪變性肝炎、過敏症及哮喘、B群鍵球菌 (GBS)感染、精神錯亂（例如抑鬱及精神分裂症）、型及 Thl型介導之疾病、急性及慢性疼痛（不同形式之疼痛）及 癌症(諸如肺癌、乳房癌、[癌、膀胱癌、結腸癌、胰腺 癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌）及造血性惡性病（白血病 及淋巴瘤）、無β脂蛋白血症、手足發钳、急性及慢性寄生 或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病 (ALL)、急性骨髓白血病（AML)、急性或慢性細菌感染、 急性胰炎、急性腎功能衰竭、腺癌、心房異位性心跳、 AIDS癡呆複合症、酒精誘導之肝炎、過敏性結膜炎、過 敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥、a* ❹ 抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、 月!）角細胞退化、抗cd3療法、抗填脂症候群、抗受體過敏 性反應、主動脈及周邊動脈瘤、主動脈剝離、動脈高壓、 動脈硬化、動靜脈瘺、共濟失調、心房纖維性顫動（持續 或突發性）、心房撲動、房室傳導阻滞、B細胞淋巴瘤、骨 移植排斥反應、骨髓移植（BMT)排斥反應、束支傳導阻 滞、勃克氏淋巴瘤、燒傷、心律不整、心臟頓抑症候群、 心臟腫瘤、心肌病、心肺分流術發炎反應、軟骨移植排 斥、小腦皮質退化、小腦病症、混亂或多源性心房頻脈、 140653.doc •187· 201006485 化學療法相關之病症、慢性骨趙性白血病（cml)、慢性酒 精中毒、慢性發炎病變、慢性淋巴細胞白血病（CLL)、慢 性阻塞性肺病（COPD)、慢性水楊酸鹽中毒、結腸直腸 癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺心病、冠 狀動脈病、克羅伊茨費爾特-雅各布氏病、培養陰性敗血 症、囊腫性纖維化、細胞激素療法相 關之病症、拳擊員礙 呆、脫髓靭疾病、登革熱出血熱、皮炎、皮膚病狀、糖尿 病（diabetes)、糖尿病（diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬 化疾病、泛發性路易體疾病、擴張充血型心肌病、基底神 經節病症、中年唐氏症候群、阻斷Cns多巴胺受體之藥物 所誘導之藥物誘發運動病症、藥物過敏性、濕疹、腦脊髓 火、心内膜炎、内分泌病、會厭炎、埃-巴二氏病毒感 染、紅斑性肢痛、錐體束外及小腦病症、家族性噬血淋巴 組織細胞瘤病、胎兒胸腺植入排斥、弗里德賴希氏共濟失 調、功能性周邊動脈病症、真菌敗血症、氣性壞疽、胃潰 瘍、腎小球性腎炎、任何器官或組織之移植排斥、革蘭氏 陰性敗血症、革蘭氏陽性敗血症、歸因於細胞内有機體之 :芽腫、毛細胞白血病、哈-斯二氏病、橋本甲狀腺炎、 化粉熱、心臟移植排斥、血色素沉著、血液透析、溶血性 尿毒症候群/溶解▲栓性▲小板減少性紫癒、出血、肝炎 (A)、希氏（His)束心律不整、mv感染/mv神經病、霍奇 金氏病、過動性運動障礙、過敏性反應、過敏性肺炎、高 血壓、運動功能減退之運動障礙、下視丘-腦下垂體-腎2 腺軸分析、特發性阿狄森氏病、特發性肺纖維化、抗體介 140653.doc 201006485 導之細胞毒性、虛弱、嬰兒脊髓性肌萎縮、主動脈發炎、 A型流行性感冒、電離輻射曝露、虹_狀體^㈣Μ /視神經炎、缺血後再灌注損傷、缺▲性中風、幼年型類 風濕性關節炎、幼年型脊趙性肌萎縮、卡波西氏肉瘤、腎 臟移植排斥、退伍軍人病、利什曼病、麻風、皮質脊髓系 統之病變、脂肪水腫、肝移植排斥、淋巴水遽、遽疾、孽 性淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑色素瘤、腦膜 炎、腦膜炎球菌血症、代謝/特發性疾病、偏頭痛、線粒 體多系統病症、混合性結締組織病、單株丙種球蛋白病、 多發性骨髓瘤、多發性系統退化（Mencel Dejerine·、刪 Sln-Drager 及 Machado-Joseph)、重症肌無力、 ❹ 分枝桿菌、結核分枝桿菌、骨髓發育不良症候群j = 塞、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、 腎病、神經退化性疾病、神經性⑽肉萎縮、冑中性白血 球減少性發燒、非霍奇金淋巴瘤、腹主動脈及其分支之閉 塞、閉塞性動脈病症、okt3療法、睪丸炎/附睪炎、睪丸炎/ 輸精管重新接合術、器官腫大、骨質疏鬆症、胰腺移植排 斥、胰腺癌、腫瘤形成徵兆症候群/惡性血鈣過多、甲狀 旁腺移植排斥、骨盆發炎性疾病、常年性鼻炎、心包疾 病周邊動脈粥樣硬化疾病、周邊血管性病症、腹膜炎、 心、丨生貧血、肺囊蟲肺炎、肺炎、POEMS症候群（多發性神 經病、器官踵大、内分泌病、單株丙種球蛋白病及皮膚變 _疒侯群）、廣注後症候群、系送後症候群、後心切開 術症候群、子癇前帛、進行性核上性麻冑、原發性肺動脈 140653.doc 201006485 高壓、放射療法、里諾氏現象及疾病、里諾氏疾病、雷富 孫氏病、規則性窄波QRS心動過速、腎血管高血壓、再灌 注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、 路易體型之老年癡呆症、血清陰性關節病、休克、鐮狀細 胞貧血、皮膚同種移植排斥、皮膚變化症候群、小腸移植 排斥、實體腫瘤、特異性心律不整、脊椎共濟失調、脊髓 小腦退化、鏈球菌性肌炎、小腦結構損害、亞急性硬化性 全腦炎、昏厥、心血管系統之梅毒、全身性過敏症、全身 性發炎反應症候群、全身性發作幼年型類風濕性關節炎、 T細胞或FAB ALL、毛細血管擴張、血栓閉塞性脈管炎、 血小板減少症、毒性、移植、外傷/出血、m型過敏性反 應、IV型過敏性、不穩定絞痛、尿毒症、尿敗血症、蓴痲 疹、心臟瓣膜疾病、靜脈曲張、脈管炎、靜脈疾病、靜脈 血栓形成、心室纖維性顫動、病毒及真菌感染、致命腦炎/ 無菌性腦膜炎、致命相關之嗜血細胞症候群 '魏尼凱-柯 薩可夫症候群、威爾遜氏疾病、任何器官或組織異種移植 排斥。（參見Peritt等人PCT公開案第w〇 2002097048A2 號、Leonard等人PCT公開案第W0 9524918 A1號，及
Salfeld等人PCT公開案第 WO 00/56772A1 號）。 本發明之DVD-Ig亦可治療以下疾病中之一或多種：急 性冠狀動脈症候群、急性特發性多發性神經炎 '急性發炎 脱髓鞘多發性神經根神經病、急性局部缺血、成年斯蒂爾 氏病、斑形脫髮、全身性過敏反應、抗磷脂抗體症候群、 再生障礙性貧血、動脈硬化、異位性濕疹、異位性皮炎、 140653.doc •190· 201006485 自體免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關之自體免疫性病症、 自體免疫性聽力損失、自體免疫性淋巴組織增生症候群 (ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性血小板減少症 (AITP)、眼瞼炎、支氣管擴張、大皰性類天疱瘡、心血管
❹ 疾病、災難性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎病、慢性局部 缺血、瘢痕性類天疱瘡、伴以多發性硬化症風險之臨床上 分離症候群（CIS)、結膜炎、兒童發作精神錯亂、慢性阻 塞性肺病(COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜 病、糖尿病、椎間盤突出、椎間盤脫垂、藥物誘發的免疫 性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、内眼炎、上鞏 膜炎、多形性紅斑、嚴重多形性紅斑、姓娠期類天痕瘡、 格-巴二氏症候群（GBS)、花粉熱、休茲氏症候群、特發性 帕金森氏病、特發性間質性肺炎、IgE介導之過敏症、免 疫性溶血性貧血、包涵體肌炎、傳染性眼睛發炎性疾病、 發炎脫髓鞠病、發炎心臟病、發炎腎病、IpF/UIp、虹膜 炎、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、庫斯毛耳氏疾病或庫斯 毛耳-麥爾氏疾病、蘭德里麻痹、蘭格罕氏細胞組織細胞 增多病、網狀青斑、黃斑退化、惡性腫瘤、微觀多企管 炎、白赫鐵列夫症、運動神經元病症、黏膜類天疱瘡、多 重器官衰竭、重症肌無力、骨腾發育不良症候群、心肌 炎、神經根病症、神經病、非曱非乙型肝炎、視神經炎、 月質浴解、印巢癌、少關節型兒童期類風濕性關節炎、周 邊動脈閉塞性疾病（PACDD)、周邊血管疾病（pvD)、周邊動 脈疾病(PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎(或結節性動脈周 140653.doc -191- 201006485 炎）、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型jra、 多内分泌腺分泌不足症候群、多發性肌炎、風濕性多肌痛 (PMR)、泵送後症候群、原發性帕金森氏病、前列腺及直 腸癌及造血性惡性病（白血病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅 血球再生不良、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊 聽炎、再狹窄、風濕性心臟病、薩福症（滑膜炎、痤瘡、 膿皰病、骨肥大及骨炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性、 肺休克、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、 聚石夕氧相關之結締組織病、角層下膿皰性皮膚病、僵直性❹ 脊椎炎、史蒂芬·瓊森症候群⑻S)、全身性發炎反應症候 群、顳動脈炎 '弓形蟲視網膜炎、中毒性表皮壞死溶解、 橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、丄型過敏性反 應、II型糖尿病、蓴痲疹、常見間質性肺炎（UIp)、脈管 炎、春季結膜炎、病毒視網膜炎、伏格特_小柳_原田症候 群（VKH症候群）' 濕性黃斑退化及創傷癒合。 本發明之結合蛋白可用於治療罹患自體免疫疾病之人， 詳s之與發炎相關之彼等疾病’包括類風濕性關節炎、脊❿ 椎炎、過敏症、自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄膜炎。在 一實施例中’本發明之結合蛋白或其抗原結合部分用以治 療類風濕性關節炎、克羅恩氏病、多發性硬化症、胰島素 依賴型糖尿病及牛皮癬。 在—實施例中，可藉由本發明之組合物及方法治療或診 斷之疾病包括（但不限於）原發性及轉移性癌，包括乳房 癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下嚥部癌、食管 140653.doc -192- 201006485 癌、胃癌、胰腺癌、肝癌'膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿 路癌（包括腎臟、膀胱及尿路上皮癌）、女性生殖道（包括子 宮頸、子宮及卵巢以及絨膜癌及妊娠期滋養層疾病）、男 性生殖道（包括前列腺、精囊、睪丸及生殖細胞腫瘤）、内 分泌腺（包括甲狀腺、腎上腺及腦下垂體）及皮膚癌；以及 血管瘤、黑色素瘤、肉瘤（包括自骨質及軟組織出現之彼 等肉瘤以及卡波西氏肉瘤（Kaposi，s sarcoma))、腦腫瘤、 神經腫瘤、眼睛腫瘤及腦膜腫瘤（包括星形細胞瘤、神經 ® 膠質瘤、神經膠母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神 經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤）、自造血性惡性病（諸如 白血病）出現之實體腫瘤及淋巴瘤（霍奇金及非霍奇金淋巴 瘤兩者）。 在一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分當單獨 或與放射療法及/或其他化療劑組合使用時用以治療癌症 或預防自本文中描述之腫瘤之轉移。 本土明之抗體或其抗原結合部分可與藥劑組合，其包括 (但不限於）抗腫瘤劑、放射療法、化學療法，諸如DNA烷 化劑、順鉑、卡鉑、抗微管蛋白劑、紫杉醇、多西他赛 (d〇cetaxei)、紫杉酚、阿黴素、吉西他濱（gemcitabine)、 健擇（gemzar)、蒽環黴素、多柔比星（adriamycin)、拓撲異 構酶I抑制劑、拓撲異構酶Π抑制劑、5_氟尿嘧啶（5_FU)、 亞葉酸、伊立替康（irinotecan)、受體酪胺酸激酶抑制劑 (例如埃羅替尼（erlotinib)、吉非替尼（gefitinib))、c〇X-2 抑制劑（例如赛利克西（celecoxib))、激酶抑制劑及siRNA。 I40653.doc -193· 201006485 本發明之結合& 藉額外蛋白亦可與適用於治療各種疾病之一或多 種額外/α療劑一起投與。 本發明之結合蛋白 了早獨或！口使用以治療該等疾病。 ‘瞭解結合蛋白可單獨或與額外劑（例如治療劑）組合使 η卜劑藉由熟習此項技術者出於其預定目的而選 ▲ △額外劑可為技術公認之適用於治療藉由本發明 療之疾病或病狀的治療劑。額外劑亦可為將有利 屬性賦予冶療組合物之藥劑，例如實現組合物之黏度之藥 劑0 、
應進-步瞭解待包括於本發明内之組合為適用於其預定 目的之彼等組合。以下闡明之藥劑出於說明之目的而非意 欲限制Α本發明之一部分之組合可為本發明之抗體與至 少一種選自以下清單之額外劑。若組合使得所形成之組合 物可執打其預定功能，則組合亦可包括超過一種額外劑， 例如兩種或三種額外劑。 治療自體免疫及發炎疾病之組合為非類固醇消炎藥物， 亦稱為NSAID，包括如布洛芬（ibupr〇fen)之藥物。其他組© 合為包括潑尼龍之皮質類固醇，使用類固醇之熟知副作用 可藉由當與本發明之DVD Ig組合治療患者時逐漸減少所需 類固醇劑量來降低或甚至消除。本發明之抗體或抗體部分 可與其組合之用於類風濕性關節炎之治療劑之非限制性實 例包括以下：細胞激素抑制消炎藥物（CSAID);其他人類 細胞激素或生長因子之抗體或拮抗劑，例如丁>^、1^、11^- 1、IL-2、IL-3、IL，4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL_15、 140653.doc -194- 201006485 IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干擾素、EMAP-II、GM_ CSF、FGF及PDGF。本發明之結合蛋白或其抗原結合部分 可與細胞表面分子之抗體組合，諸如CD2、CD3、CD4、 CD8 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69 、 CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA或其配位體，包 括 CD154(gp39或 CD40L)。 治療劑之組合可在自體免疫及隨後發炎級聯中之不同點 處干擾；實例包括TNF括抗劑，如嵌合、人源化或人類 ® TNF抗體，Adalimumab(PCT公開案第 WO 97/29131 號）、 CA2(RemicadeTM)、CDP 571 及可溶ρ55或p75 TNF受體，其 衍生物（p75TNFRlgG(EnbrelTM)或 p55TNFRlgG(來那西普 (Lenercept))，以及TNFa轉化酶（TACE)抑制劑；類似地il-1抑制劑（介白素-1 -轉化酶抑制劑，IL-1RA等）出於相同的 原因可為有效的。其他組合包括介白素11。另一組合包括 自體免疫反應之關鍵參與者，其可與IL-12功能並行起作 用、視IL-12功能而起作用或與IL-12功能協同起作用；尤 其為IL-18拮抗劑，包括IL-18抗體或可溶IL-18受體或IL-18結合蛋白。已展示IL-12及IL-18具有重疊但不同之功能 且兩者之拮抗劑之組合可為最有效的。另一組合為非消耗 性抗CD4抑制劑。其他組合包括協同刺激路徑CD80(B7.1) 或CD86(B7.2)之拮抗劑，包括抗體、可溶受體或拮抗配位 體。 本發明之結合蛋白亦可與藥劑組合’該等藥劑諸如胺曱 喋呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺胺吡啶、美沙拉秦、奥色拉 140653.doc .195- 201006485 秦氣啥/經氣0έ、青徽胺（pencillamine)、硫代類果酸納（肌 肉内及經口）、硫°坐嗓吟、秋水仙驗（cochicine)、皮質類固 醇（經口、吸入及局部注射）、β·2腎上腺素受體促效劑（沙 丁胺醇（salbutamol)、特布他林（terbutaline)、沙美特羅 (salmeteral))、黃嘌呤（茶鹼、胺茶鹼）、色甘酸鹽、奈多羅 米（nedocromil)、酮替酚（ketotifen)、異丙托敍 (ipratropium)及氧托敍（oxitropium)、環孢素、FK506、雷 帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NS AID(例如布洛 芬）、皮質類固醇（諸如潑尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷 促效劑、抗血栓形成劑、補體抑制劑、腎上腺素劑、干擾 促發炎性細胞激素（諸如TNF-ot或IL-1)信號轉導之藥劑（例 如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑）、IL-1 β轉化 酶抑制劑、TNFa轉化酶（TACE)抑制劑、Τ細胞信號轉導抑 制劑（諸如激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮績胺°比 咬、硫"坐嗓呤、6-疏基嗓呤、血管緊張素轉化酶抑制劑、 可溶細胞激素受體及其衍生物（例如可溶ρ55或p75 TNF受 體及衍生物 p75TNFRIgG(EnbrelTM 及 p55TNFRIgG(來那西 普））、sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R)、消炎細胞激素（例如 IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 及 TGFP)、赛利克西、葉酸、 經氯喧硫酸鹽、羅非考昔（rofecoxib)、依那西普、英利昔 單抗、萘普生（naproxen)、伐地考昔（valdecoxib)、柳氮續 胺0比咬、甲潑尼龍、美儂西康（meloxicam)、甲潑尼龍乙酸 醋、硫代蘋果酸金納、阿司匹林、曲安奈德（triamcinolone acetonide)、丙氧芬萘績酸鹽/apap、葉酸、萘丁美酮 140653.doc -196- 201006485 (nabumetone)、雙氣芬酸（diclofenac)、。比羅昔康 (piroxicam)、依託度酸（etodolac)、雙氣芬酸鈉、惡丙唤 (oxaprozin)、羥考酮鹽酸鹽（oxycodone hcl)、重酒石酸二 氫可待因酮（hydroeodone bitartrate)/apap、雙氣芬酸納/米 索前列醇（misoprostol)、芬太尼（fentanyl)、阿那白滯素 (anakinra)(人類重組）、曲馬多鹽酸鹽（tramadol hcl)、雙水 楊酯、舒林酸（sulindac)、氰銘維生素/fa/維生素B6、乙醯 胺苯酚、阿侖膦酸鈉、潑尼龍、硫酸嗎啡、鹽酸利多卡 © 因、吲0朵美辛（indomethacin)、葡糖胺硫酸鹽（glucosamine sulf)/軟骨素、阿米替林鹽酸鹽（amitriptyline hcl)、確胺嘴 咬（sulfadiazine)、經考酮鹽酸鹽/乙醯胺苯盼、奥洛他定鹽 酸鹽（olopatadine hcl)、米索前列醇、萘普生納、奥美拉《坐 (omeprazole)、環破醢胺、利妥昔單抗、IL-1 TRAP、 MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗 IL-18、抗-1[15、81118-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特 (Roflumilast)、IC-485、CDC-801及美索普蘭（Mesopram)。 組合包括胺甲喋呤或來氟米特且在中等或嚴重類風濕性關 節炎情況中，包括環孢素。 亦可與結合蛋白組合使用以治療類風濕性關節炎之非限 制性額外劑包括（但不限於）以下：非類固醇消炎藥物 (NSAID);細胞激素抑制消炎藥物（CSAID) ; CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗TNFa抗體；Celltech/Bayer); cA2/英利昔單抗（嵌合抗TNFa抗體；Centocor) ; 75 kdTNFR-IgG/依那西普（75 kD TNF受體-IgG融合蛋白； 140653.doc -197- 201006485
Immunex ;參見例如 Jri/zrzD ά (1994)第 3 7， S295 卷；·/· /«ναί· Med· (1996)第 44 卷，235Α) ; 55 kdTNF-IgG(55 kD TNF 受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性靈長化抗 CD4 抗艎；IDEC/SmithKline ;參見例如dri/irzD ά (1995)第 38 卷，S185); DAB 486-IL-2 及/ 或 DAB 389-IL-2(IL-2 融合蛋白；Seragen ;參見例如 ά
Rheumatism (1993)第 36 卷，1223);抗 Tac(人源化抗11^-2Ra ; Protein Design Labs/Roche) ; IL-4(消炎細胞激素； ⑩ DNAX/Schering) ; IL-10(SCH 52000 ;重組IL-10，消炎細 胞激素；DNAX/Schering) ; IL-4 ; IL-10及 / 或 IL-4 促效劑 (例如促效抗體）；IL-1RA(IL-1受體拮抗劑； Synergen/Amgen);阿那白滯素（Kineret®/Amgen) ; TNF-bp/s-TNF(可溶TNF結合蛋白；參見例如Arthritis & (1996)第39卷，第 9期（增刊），S284 ; Jmer. «/. -//eari C7rcw/aior_y P/zp/o/og·} (1995)第 268 卷，第37-42頁）；R973401(IV型磷酸二酯酶抑制劑；參見 W 例如 ά /J/zeMWiziz'sm (1996)第 39卷，第 9期（增刊）， S282) ; MK-966(COX-2 抑制劑；參見例如 jri/zriik 及/zeM/wW/sm (1996)第39卷，第9期（增刊），S81);伊洛前列 素（Iloprost)(參見例如 Jri/zrzD ά Λ/zewmai^w (1996)第 39 卷，第9期（增刊），S82);胺甲喋呤；沙力度胺 (thalidomide)(參見例如dri/zriib (1996)第 39 卷，第9期（增刊），S282)及沙力度胺相關藥物（例如 140653.doc -198- 201006485
Celgen);來氟米特（消炎及細胞激素抑制劑；參見例如 JrMr/出ά 謂沾⑽（1996)第39卷，第9卷（增刊） S131 ； Inflammation Research (1996)第 45 卷，第 103 1〇? 頁）；胺甲環酸（纖溶酶原活化之抑制劑；參見例如 dri/zrzD 沿m (1996)第 39卷，第 9期（增刊）， S284) ; T-614(細胞激素抑制劑；參見例如心伙濩 仙⑼則…所（1996)第39卷，第9期（增刊），S282);前列腺 素 E1 (參見例如 (S： (1996)第 39卷，第9 ® 期（增刊），S282);替尼達普（Tenidap)(非類固醇消炎藥 物·’參見例如 Arthritis & Rheumatism (1996)第 39卷，第9 期（增刊），S280);萘普生（非類固醇消炎藥物；參見例如 ^_及叩_(1996)第7卷，第1209-1213頁）；美儂西康（非 類固醇消炎藥物）；布洛芬（非類固醇消炎藥物）；吼羅昔康 (非類固醇消炎藥物）；雙氯芬酸（非類固醇消炎藥物）；吲 °朵美辛（非類固醇消炎藥物）；柳氮磺胺D比啶（參見例如 φ 及/^则(1996)第 39卷，第 9期（增刊）， S281)’硫〇坐嗓吟（參見例如&灿⑽則沿历（Μ%) 第39卷’第9期（增刊），S281) ; ICE抑制劑（酶介白素_1β轉 化酶之抑制劑）；zap-70及/或lck抑制劑（酪胺酸激酶zap_7〇 或lck之抑制劑）；VEGF抑制劑及/或VEGF-R抑制劑（血管 内皮細胞生長因子或血管内皮細胞生長因子受體之抑制 劑；血管生成之抑制劑）；皮質類固醇消炎藥物（例如 SB203580) ; TNF-轉化酶抑制劑；抗IL-12抗體；抗江_18 抗體，介白素_11(參見例如c& (1996) 140653.doc 201006485 第39卷，第9期（增刊），S296);介白素-13(參見例如 Jri/zrz·"··? ά 及/zewmaibw (1996)第 39卷，第 9期（增刊）， S3 08)，介白素-17抑制劑（參見例如J&及/2ew wβw (1996)第39卷，第9期（增刊），S120);金；青黴胺；氣 喹；苯丁酸氮芥；羥氣喹；環孢素；環磷醯胺；全部淋巴 照射；抗胸腺細胞球蛋白；抗CD4抗體；CD5-毒素；經口 投與之肽及膠原蛋白；氣苯紮利二鈉（lobenzarit disodium);細胞激素調節劑（CRA)HP228 及 HP466 (Houghten Pharmaceuticals，Inc) ; ICAM-1反義硫代磷酸酯❹ 寡去氧核苦酸（ISIS 2302 ; Isis Pharmaceuticals, Inc);可 溶補體受體1(TP10 ; T Cell Sciences, Inc);潑尼松；奥古 蛋白（orgotein);葡糖胺聚糖多硫酸酯；米諾環素 (minocycline);抗IL2R抗體；海洋及植物脂質（魚及植物種 子脂肪酸；參見例如DeLuca等人（1995) /J/zew/w. Db. C/in. iVori/z Jm. 21:759-777);金諾芬（auranofin);保泰松 (phenylbutazone);曱氣芬那酸（meclofenamic acid);氟芬 那酸（flufenamic acid);靜脈内免疫球蛋白；齊留通® (zileuton);阿紮立平（azaribine);黴酚酸（rs-61443);他 克莫司（tacrolimus)(FK-506);西羅莫司（sir〇iimus)(雷帕黴 素）；胺普立糖（amiprilose)(赛若芬汀（therafectin));克拉 屈濱（cladribine)(2-氣去氧腺苷）；胺甲喋呤；bcl-2抑制劑 (參見 Bruncko, Milan 等人 Journal 〇f Medicinal Chemistry (2007)，50(4)，641-662)，抗病毒及免疫調節劑。 在一實施例中，結合蛋白或其抗原結合部分與用於治療 140653.doc -200- 201006485 類風濕性關即炎之以下樂劑中之—者組合投與：KDR之小 分子抑制劑、Tie-2之小分子抑制劑；胺甲喋呤；潑尼松； 赛利克西，葉酸，輕氣喧硫酸鹽；羅非考昔；依那西普； 英利昔單抗，來氟米特；萘普生；伐地考昔；柳氮續胺η比 啶；甲潑尼龍；布洛芬；美儂西康；曱潑尼龍乙酸酯；硫 代蘋果酸金鈉；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安奈德；丙氧芬 萘㉖酸鹽/apap ;葉酸；萘丁美酮；雙氯芬酸；吡羅昔康； 依度酸；雙氣芬酸納；惡丙嗪；經考鲷鹽酸鹽；重酒石 β 酸二氫可待因酮/apap ;雙氣芬酸鈉/米索前列醇；芬太 尼；阿那白滯素（人類重組）；曲馬多鹽酸鹽；雙水楊酯； 舒林酸；氰銘維生素/fa/維生素B6;乙醯胺苯酚；阿侖膦 酸鈉；潑尼龍；硫酸嗎啡；鹽酸利多卡因；吲哚美辛；葡 糖胺硫酸鹽/軟骨素；環孢素；阿米替林鹽酸鹽；磺胺嘧 咳’經考嗣鹽酸鹽/乙酿胺苯盼；奥洛他定鹽酸鹽；米索 刖列醇，萘普生納；奥美拉唾；黴紛酸嗎琳乙醋；環碟酿 ❹ 胺；利妥昔單抗；IL-1 TRAP ; MRA ; CTLA4-IG ; IL-18 BP，IL-12/23 ;抗 IL 18 ;抗11^15;^1尺8-790;8(：1〇- 469 ; VX-702 ; AMG-548 ; VX-740 ;羅氟司特；IC_485 ; CDC-801及美索普蘭。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於發炎性腸道疾病之 治療劑之非限制性實例包括以下：布替耐德；表皮生長因 子，皮質類固醇；環孢素；柳氮磺胺吡啶；胺基水揚酸 鹽’ 6-疏基。票呤；硫唑嘌呤；曱硝噠唑；脂肪加氧酶抑制 劑；美沙拉嗪；奥色拉秦；巴柳氮；抗氧化劑；凝血脂素 140653.doc •201 · 201006485 抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-Ιβ mAb ;抗IL-6 mAb ; 生長因子；彈性酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；其他人 類細胞激素或生長因子之抗體或拮抗劑，該等因子例如 TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及 PDGF。本 發明之抗體或其抗原結合部分可與細胞表面分子之抗體組 合，諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、 CD40、CD45、CD69、CD90或其配位體。本發明之抗體 或其抗原結合部分亦可與藥劑組合，該等藥劑諸如胺甲喋 呤、環孢素、FK5 06、雷帕黴素、黴紛酸嗎琳乙酯、來氟 米特、NSAID(例如布洛芬）、皮質類固醇（諸如潑尼龍）、 磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓形成劑、補體抑 制劑、腎上腺素劑、干擾促發炎性細胞激素（諸如TNF-α或 IL-1)信號轉導之藥劑（例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP 激酶抑制劑）、IL-1 β轉化酶抑制劑、TNFa轉化酶抑制劑、 T細胞信號轉導抑制劑（諸如激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑 制劑、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6-M基嘌呤、血管緊張 素轉化酶抑制劑、可溶細胞激素受體及其衍生物（例如可 溶p55 或 p75 TNF 受體、SIL-1RI、sIL-lRII、SIL-6R)及消炎 細胞激素（例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 及 TGFp)及 bcl-2 抑制劑。 結合蛋白可組合於其中之用於克羅恩氏病之治療劑之實 例包括以下：TNF拮抗劑，例如抗TNF抗體 Adalimumab(PCT 公開案第 97/29131 號；HUMIRA)、 140653.doc •202· 201006485 CA2(REMICADE)、CDP 571 、TNFR-Ig 構築體、 (p75TNFRIgG(ENBREL)及 p55TNFRIgG(LENERCEPT))抑 制劑及PDE4抑制劑。本發明之抗體或其抗原結合部分可 與皮質類固醇（例如布替对德及地塞米松（dexamethasone)) 組合。本發明之結合蛋白或其抗原結合部分亦可與藥劑 (諸如柳氮磺胺吡啶、5-胺基水揚酸及奥色拉秦）及干擾促 發炎性細胞激素（諸如IL-1)之合成或作用之藥劑（例如IL-Ιβ 轉化酶抑制劑及IL-Ira)組合。本發明之抗體或其抗原結合 ® 部分亦可與T細胞信號轉導抑制劑（例如酪胺酸激酶抑制劑 6-毓基嘌呤）一起使用》本發明之結合蛋白或其抗原結合部 分可與IL-11組合。本發明之結合蛋白或其抗原結合部分 可與美沙拉嗓、潑尼松、硫α坐嗓呤、疏嗓吟、英利昔單 抗、甲潑尼龍玻珀酸納、地芬諾醋（diphenoxylate)/阿托品 硫酸鹽（atrop sulfate)、洛B底丁胺鹽酸鹽、胺曱嗓呤、奥美 拉唑、葉酸、環丙沙星/右旋糖-水、重酒石酸二氫可待因 酮/apap、四環素鹽酸鹽、醋酸氟輕鬆（fluocinonide)、甲頌 ❹ 噠唑、硫柳汞/硼酸、消膽胺/蔗糖、環丙沙星鹽酸鹽、硫 酸莨菪鹼、鹽酸哌替啶、咪達唑侖鹽酸鹽（midazolam hydrochloride)、經考鋼鹽酸鹽/乙醯胺苯紛、鹽酸異丙 嗪、碌酸鈉、續胺甲°惡°坐（sulfamethoxazole)/甲氧苄咬 (trimethoprim)、赛利克西、聚卡波非（polycarbophU)、丙 氧芬萘確酸鹽、氫化可的松（hydrocortisone)、多種維生 素、巴柳氣二鈉（balsalazide disodium)、填酸可待因 (codeine phosphate)/apap、考來維余鹽酸鹽（colesevelam 140653.doc -203 - 201006485 hcl)、氰銘維生素、葉酸、左氧氟沙星（levofloxacin)、甲 潑尼龍、那他珠單抗（natalizumab)及干擾素γ組合。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於多發性硬化症之治 療劑之非限制性實例包括以下：皮質類固醇；潑尼龍；曱 潑尼龍；硫唑嘌呤；環磷醯胺；環孢素；胺甲喋呤；4-胺 基吡啶；替紮尼定（tizanidine);干擾素-pia(AVONEX ; Biogen);干擾素 _pib(BETASERON ; Chiron/Berlex);干 擾素 a-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)、干擾素-a(Alfa Wassermann/J&J)、干 擾素 β 1 A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)、聚乙二醇化干擾素 a2b(Enzon/Schering-Plough)、共聚物 l(Cop-l; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries，Inc.);高壓氧；靜脈内免疫球蛋白；克拉屈 濱；其他人類細胞激素或生長因子及其受體（例如TNF、 LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF 及 PDGF)之抗體或拮 抗劑。本發明之結合蛋白可與細胞表面分子之抗體組合， 該等分子諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、 w CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、 CD86、CD90或其配位體。本發明之結合蛋白亦可與藥劑 組合，該等藥劑諸如胺曱喋呤、環孢素、FK506、雷帕黴 素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬）、 皮質類固醇（諸如潑尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效 劑、抗血栓形成劑、補體抑制劑、腎上腺素劑、干擾促發 炎性細胞激素（諸如TNF-α或IL-1)信號轉導之藥劑（例如 140653.doc -204- 201006485 IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑）、IL-Ιβ轉化酶 抑制劑、TACE抑制劑、T細胞信號轉導抑制劑（諸如激酶 抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮確胺。比咬、硫唾嘌 呤、6-酼基嗓呤、血管緊張素轉化酶抑制劑、可溶細胞激 素受體及其衍生物（例如可溶ρ55或p75 TNF受體、311^-1RI、sIL-lRII、sIL-6R)、消炎細胞激素（例如11^-4、11^-10、IL-11、IL-13及 TGFP)及 bcl-2抑制劑。 本發明之結合蛋白可組合於其中之多發性硬化症之治療 ® 劑之實例包括干擾素-β，例如IFNpia及IFNpib ;克帕松、 皮質類固醇、卡斯蛋白酶抑制劑，例如卡斯蛋白酶-1之抑 制劑、IL-1抑制劑、TNF抑制劑，及CD40配位體及CD80 之抗體。 本發明之結合蛋白亦可與藥劑組合，該等藥劑諸如阿倫 單抗、屈大麻紛（dronabinol)、Unimed、達利珠單抗 (daclizumab)、米托蒽酿、紮利羅登鹽酸鹽、胺比咬 (fampridine)、醋酸格拉替美（glatiramer acetate)、那他珠 春 單抗、西那必多（sinnabidol)、a免疫因子NNS〇3、ABR-215062 、 AnergiX.MS 、 趨 化因子 受體拮 抗劑、 BBR-2778、卡勒胍素（calagualine)、CPI-1189、LEM(脂質體囊 封之米托蒽醌）、THC.CBD(大麻鹼促效劑）MBP-8298、美 索普蘭（PDE4抑制劑）、MNA-715、抗IL-6受體抗體、紐若 華（neurovax) 、 °比非尼酮阿羅卓普（pirfenidone allotrap)1258(RDP-1258)、sTNF-Rl、他侖帕奈、特立氟 胺（teriflunomide)、TGF-P2、替普利莫泰（tiplimotide)、 140653.doc -205- 201006485 VLA-4 拮抗劑（例如 TR-14035、VLA4-Ultrahaler、 Antegran-ELAN/Biogen)、干擾素γ拮抗劑、IL-4促效劑。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於心絞痛之治療劑之 非限制性實例包括以下：阿司匹林、硝酸甘油、單硝酸異 山梨醇、美托洛爾破涵酸鹽（metoprolol succinate)、阿替 洛爾（atenolol)、美托洛爾酒石酸鹽（metoprolol tartrate)、 胺氣地平苄續酸鹽（amlodipine besylate)、地爾硫卓鹽酸鹽 (diltiazem hydrochloride)、二石肖酸異山梨醇、氣°比格雷硫 酸氫鹽（clopidogrel bisulfate)、瑞笨地平、阿托伐他汀在弓 (atorvastatin calcium)、氯化If、β夫喃苯胺酸、辛伐他汀 (simvastatin)、維拉帕米鹽酸鹽（verapamil hcl)、地高辛 (digoxin)、普萘洛爾鹽酸鹽（propranolol hydrochloride)、 卡維地洛（carvedilol)、賴諾普利（lisinopril)、螺内S旨、氫 氣嗔嗪（hydrochlorothiazide)、依那普利順丁烯二酸鹽 (enalapril maleate)、納多洛爾（nadolol)、雷米普利 (ramipril)、依諾肝素納（enoxaparin sodium)、肝素納、練 沙坦（valsartan)、索他洛爾鹽酸鹽（sotalol hydrochloride)、 非諾貝特（fenofibrate)、依澤替米貝（ezetimibe)、布美他尼 (bumetanide)、洛沙坦 _ (losartan potassium)、賴諾普利 (lisinopril)/氫氣養°秦、非洛地平（felodipine)、卡托普利 (captopril)、比索洛爾反丁稀二酸鹽（bisoprolol fumarate) ° 本發明之結合蛋白可與其組合之用於僵直性脊椎炎之治 療劑之非限制性實例包括以下：布洛芬、雙氣芬酸及米索 140653.doc -206- 201006485 前列醇、萘普生、美儂西康、吲哚美辛、雙氣芬酸、賽利 克西、羅非考昔、柳氮項胺"比咬、胺甲喋吟、硫唾嘌呤、 米諾環素、潑尼松、依那西普、英利昔單抗。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於哮喘之治療劑之非 限制性實例包括以下：沙丁胺醇（albuterol)、沙美特羅 (salmeterol)/氟替卡松（fluticasone)、孟魯司特納 (montelukast sodium)、氟替卡松丙酸酯（fluticasone propionate)、布地奈德（budesonide)、潑尼松、沙美特羅經 β 萘甲酸鹽、左旋沙丁胺醇鹽酸鹽（levalbuterol hcl)、沙丁 胺醇硫酸鹽/異丙托銨、潑尼龍磷酸鈉、曲安奈德、二丙 酸倍氣米松、漠·化異丙托錢、阿奇黴素（azithromycin)、D比 布特羅乙酸鹽（pirbuterol acetate)、潑尼龍、無水茶驗、甲 潑尼龍琥珀酸鈉、克拉黴素、紮魯司特（zafirlukast)、福莫 特羅反丁稀二酸鹽（formoterol fumarate)、流感病毒疫.苗、 甲潑尼龍、阿莫西林三水合物（amoxicillin trihydrate)、氟 ©尼縮松（flunisolide)、過敏症注射液、色甘酸鈉、鹽酸菲 索特非那定（fexofenadine hydrochloride)、氟尼縮松/薄荷 腦、阿莫西林（amoxicillin)/棒酸鹽、左氧氟沙星 (levofloxacin)、吸入器輔助裝置、愈創甘油醚、地塞米松 填酸納、莫西沙星鹽酸鹽（moxifloxacin hcl)、鹽酸強力徽 素（doxycycline hyclate)、愈創甘油醚/d-美沙芬（d-methorphan)、p-麻黃鹼/c〇d/氣芬尼（chlorphenir)、加替沙 星（gatifloxacin)、西替利嗪鹽酸鹽（cetirizine hydrochloride)、糠酸莫美他松（m〇metasone furoate)、沙美 140653.doc •207· 201006485 特羅經萘甲酸鹽、笨佐那酯（benzonatate)、頭抱胺节 (cephalexin)、pe/氫可酮/氣芬尼、西替利嗪鹽酸鹽/偽麻黃 鹼、苯腎上腺素/cod/異丙嗪、可待因/異丙嗪、頭孢丙烯 (cefprozil)、地塞米松、愈創甘油醚/偽麻黃鹼、氯芬尼拉 明（chlorpheniramine)/ 氫可鋼、奈多羅米鈉（ned〇cr〇mii 腎上腺素、甲潑尼龍、羥異 敗盟 sodium)、特布他林硫 丙腎上腺素硫酸鹽（metaproterenol suifate) 本發明之結合蛋白可與其組合之用於c〇PD之治療劑之 非限制性實例包括以下：沙丁胺醇硫酸鹽/異丙托銨、溴 化異丙托銨、沙美特羅/氟替卡松、沙丁胺醇、沙美特羅 萘曱酸鹽、氟替卡松丙酸醋、潑尼松、無水茶驗、甲潑 尼龍琥站酸納、孟魯司特納、布地奈德、福莫特羅反丁稀 二酸鹽、曲安奈德 '左氧氟沙星、愈創甘㈣、阿奇徽 素、二丙酸倍氣米松、左旋沙丁胺醇鹽酸鹽、氟尼縮松、 頭孢曲松納、阿莫西林三水合物、加替沙星、紮魯司特、 阿莫西林/棒酸鹽、氟尼縮松/薄荷腦、氣芬尼拉明/氫可 嗣、經異丙腎上腺素硫酸鹽、甲潑尼龍、糠酸莫美他松、 P-麻黃驗/cod/氣芬尼 '吨布特羅乙酸鹽、p_麻黃驗/氣雷他 定u〇ratadine)、特布他林硫酸鹽、溴化D塞托錢、（R R)福 莫特羅、TgAAT、西洛司特（CilGmilast)、羅氟司特。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於Hcv之治療劑之非 限制性實例包括以下：干擾素_a_2a、干擾素、干優 素-a ―、干擾素-a-nl、聚乙二醇化干優素_、聚乙 -醇化干擾素-a-2b、病毒嗤、聚乙二醇化干擾素―病 140653.doc 201006485 毒°坐、熊去氧膽酸、甘草酸、胸腺法新（Thymalfasin)、邁 克瑟敏（Maxamine)、VX-497及用以經由介入以下標乾治療 HCV之任何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解螺 旋酶、HCV IRES(内部核糖體入口位點）。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於特發性肺纖維化之 治療劑之非限制性實例包括以下：潑尼松、硫唑嘌呤、沙 丁胺醇、秋水仙鹼、沙丁胺醇硫酸鹽、地高辛、γ干擾 素、甲潑尼龍sod succ、勞拉西泮（lorazepam)、0夫塞米 ® (furosemide)、賴諾普利、石肖酸甘油、螺内醋、環攝醯 胺、溴化異丙托銨、放線菌素d、阿替普酶（alteplase)、氟 替卡松丙酸酯、左氧氟沙星、羥異丙腎上腺素硫酸鹽、硫 酸嗎啡、羥考酮鹽酸鹽、氯化鉀、曲安奈德、無水他克莫 司、转、干擾素-α、胺甲。業吟、黴盼酸嗎淋乙S旨、干擾 素-γ-1 β。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於心肌梗塞之治療劑 之非限制性實例包括以下：阿司匹林、硝酸甘油、美托洛 爾酒石酸鹽、依諾肝素鈉、肝素鈉、氯吡格雷硫酸氫鹽、 卡維地洛、阿替洛爾、硫酸嗎啡、美托洛爾琥珀酸鹽、華 法林鈉（warfarin sodium)、賴諾普利、單石肖酸異山梨醇、 地高辛、呋塞米、辛伐他汀、雷米普利、替奈普酶、依那 普利順丁婦二酸鹽、托西邁、瑞替普酶（retavase)、洛沙坦 卸、喧那普利鹽酸鹽/mag carb、布美他尼、阿替普酶、依 那普利拉（enalaprilat)、胺破酿I鹽酸鹽（amiodarone hydrochloride)、替羅非班鹽酸鹽 m-水合物（tirofiban hcl m· 140653.doc -209- 201006485 hydrate)、地爾硫卓鹽酸鹽、卡托普利、厄貝沙坦、纈沙 坦、普萘洛爾鹽酸鹽、福辛普利鈉、鹽酸利多卡因、埃替 菲巴肽（eptifibatide)、頭抱0坐林納（cefazolin sodium)、硫 酸阿托平、胺基己酸、螺内酯、干擾素、索他洛爾鹽酸 鹽、氣化if、多庫g旨納（docusate sodium)、多巴盼丁胺鹽 酸鹽、阿普嗤余（alprazolam)、普伐他汀納（pravastatin sodium)、阿托伐他汀鈣、咪達唑侖鹽酸鹽（midaz〇lam hydrochloride)、鹽酸哌替啶、二硝酸異山梨醇、腎上腺 素、多巴胺鹽酸鹽、比伐盧定（bivalirudin)、羅素他灯、 依澤替米貝/辛伐他汀、阿伐麥布（avasimibe)、卡立泊來德 (cariporide)。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於牛皮癖之治療劑之 非限制性實例包括以下·· KDR之小分子抑制劑、Tie-2之小 分子抑制劑、鈣泊三醇、丙酸氣氟美松（cl〇ps〇1 propionate)、曲安奈德、齒貝他索丙酸酯（hal〇ps〇1 propionate)、他紮羅汀（tazarotene)、胺曱嗓吟、醋酸氣輕 鬆、經加強之二丙酸倍他米松、氟輕鬆（flu〇cin〇1〇ne acetonide)、阿曲汀（acitretin)、焦油洗髮精、倍他米松戊 酸鹽、糠酸莫美他松、嗣康嗅（ketoconazole)、普莫卡因/ 膚輕鬆（fluocinolone)、氫化可的松戊酸鹽、敗氣縮松 (flurandrenolide)、尿素、倍他米松（pmethas〇ne)、丙酸氣 氟美松（clopsol propi〇nate)/emoll、氟替卡松丙酸醋、阿奇 黴素、氫化可的松、增濕藥方、葉酸、地奈德 (desonide)、》比美莫司（pimecr〇iimus)、煤焦油、二 140653.doc -210- 201006485 二乙酸醋（diflorasone diacetate)、依那西普葉酸、乳酸、 甲氧沙林（methoxsalen)、he/次沒食子酸麵/znox/resor、甲 潑尼龍乙酸鹽、潑尼松、防曬劑、哈西奈德 (halcinonide)、水揚酸、蒽三酚、氣可托龍特戊酸酯 (clocortolone pivalate)、煤餾出物、煤焦油/水揚酸、煤焦 油/水楊酸/硫、去經米松（desoximetasone)、二氮雜環庚 烧、潤膚劑、醋酸氟輕鬆/潤膚劑、礦物油/蓖麻油/na lact、鑛物油/花生油、石油/十四烧酸異丙酯、補骨脂素、 水楊酸、皂/三溴沙侖（tribromsalan)、硫柳汞/硼酸、赛利 克西、英利昔單抗、環孢素、阿法賽特、依法珠單抗 (efalizumab)、他克莫司、吡美莫司、puvA、UVB、柳氮 罐胺π比咬。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於牛皮癣性關節炎之 治療劑之非限制性實例包括以下：胺曱喋呤、依那西普、 羅非考昔、賽利克西、葉酸、柳氮磺胺β比啶、萘普生、來 氟米特、甲潑尼龍乙酸鹽、吲哚美辛、羥氣喹硫酸鹽、潑 尼松、舒林酸、加強之二丙酸倍他米松、英利昔單抗、胺 甲喋呤、葉酸、曲安奈德、雙氣芬酸、二甲亞碾、吡羅昔 康、雙氯芬酸鈉、酮基布洛芬、美儂西康、甲潑尼龍、萘 丁美酮（nabumeteme)、托美丁鈉（tolmetin s〇dium)、鈣泊三 醇、環孢素、雙氣芬酸鈉/米索前列醇、醋酸氟輕鬆、葡 糖胺硫酸鹽、硫代蘋果酸金鈉、重酒石酸二氫可待因酮/ apap、布洛芬、利塞膦酸鈉（risedr〇nate s〇dium)、續胺， 啶、硫鳥嘌呤、伐地考昔、阿法赛特、依法珠單抗及bci_2 140653.doc •211 · 201006485 抑制劑。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於再狹窄之治療劑之 非限制性實例包括以下：西羅莫司（sirolimus)、紫杉醇、 依維莫司（everolimus)、他克莫司、佐他羅力莫 (Zotarolimus)、乙醯胺苯紛。 本發明之結合蛋白可與其組合之用於坐骨神經痛之治療 劑之非限制性實例包括以下：重酒石酸二氫可待因酮 /apap、羅非考昔、環苯紮平鹽酸鹽（cyclobenzaprine hcl)、曱潑尼龍、萘普生、布洛芬、羥考酮鹽酸鹽/乙醯胺 苯酚、賽利克西、伐地考昔、甲潑尼龍乙酸鹽、潑尼松、 磷酸可待因/apap、曲馬多鹽酸鹽/乙醯胺苯酚、美他沙 酮、美儂西康、美索巴莫（methocarbamol)、鹽酸利多卡 因、雙氯芬酸鈉、加巴噴丁、地塞米松、肌安寧 (carisoprodol)、酮 p各酸緩血酸胺（ketorolac tromethamine)、,°朵美辛、乙酿胺苯盼、二氮雜環庚烧、 萘丁美酮、羥考酮鹽酸鹽、替紮尼定鹽酸鹽、雙氣芬酸鈉 /米索前列醇、丙氧芬萘續酸鹽/apap、as a/經考酮/經考酮 ter (oxycodone ter)、布洛芬/重酒石酸二氫可待因_、曲馬 多鹽酸鹽、依託度酸、丙氧芬鹽酸鹽、阿米替林鹽酸鹽、 肌安寧/磷酸可待因/asa、硫酸嗎啡、多種維生素、萘普生 鈉、奥芬那君檸檬酸鹽（orphenadrine citrate)、替馬西泮 (temazepam) ° 本發明之結合蛋白可組合於其中之用於SLE(狼瘡）之治 療劑之實例包括以下：NSAID，例如雙氣芬酸、萘普生、 H0653.doc -212- 201006485 布洛芬、吡羅昔康、吲哚美辛；COX2抑制劑，例如賽利 克西、羅非考昔、伐地考昔；抗癔疾劑，例如羥氣喹；類 固酵，例如潑尼松、潑尼龍、布替耐德、地塞米松；細胞 毒素，例如硫唑嘌呤、環磷醯胺、黴酚酸嗎啉乙酯、胺甲 喋呤；PDE4之抑制劑或嘌呤合成抑制劑，例如驍悉 (Cellcept)。本發明之結合蛋白亦可與藥劑（諸如柳氮磺胺 0比咬、5-胺基水楊酸、奥色拉秦、硫唾嗓呤（Imuran))及干 擾促發炎性細胞激素（諸如IL-1)之合成、產生或作用之藥 ❹ 劑（例如卡斯蛋白酶抑制劑，如IL-1 β轉化酶抑制劑及IL-lra)組合。本發明之結合蛋白亦可與Τ細胞信號轉導抑制 劑（例如酷胺酸激酶抑制劑）或輕向T細胞活化分子之分子 (例如CTLA-4-IgG或抗B7家族抗體、抗PD-1家族抗體）一起 使用。本發明之結合蛋白可與IL-11或抗細胞激素抗體（例 如芳妥珠單抗（fonotolizumab ;抗IFNg抗體））或抗受體受體 抗體（例如抗IL-6受體抗體）及B細胞表面分子之抗體組合。 _ 本發明之抗體或其抗原結合部分亦可與LJP 394(阿貝莫司 (abetimus))、消耗或滅活B細胞之藥劑（例如利妥昔單抗（抗 CD20抗體））、lymphostat-B(抗 BlyS抗體）、TNF拮抗劑（例 如抗TNF抗體阿達木單抗（PCT公開案第WO 97/29131號； HUMIRA))、CA2(REMICADE)、CDP 571、TNFR-Ig構築 體、（p75TNFRIgG(ENBREL)及 p55TNFRIgG(LENERCEPT))及 bcl-2抑制劑一起使用，此歸因於已證明轉殖基因小鼠中之 bcl-2過度表現導致狼瘡樣表型（參見Marquina, Regina等人 Journal of Immunology (2004)，172(11)，7177,7185)，因此 140653.doc -213- 201006485 抑制預期具有治療作用。 本發明之醫藥組合物可包括「治療有效量」<「預防有 效量」之本發明之結合蛋白。「治療有效量」係指在必要 劑量及時段下有效達成所需治療結果之量。結合蛋白之治 療有效量可藉由熟習此項技術者判定且可根據諸如個體之 疾病病況、年齡、性別及重量及結合蛋白在個體中引起所 需反應之能力之因素而變化。治療有效量亦為抗體或抗體 部分之任何毒性或有害作用被治療有利作用超過者。「預 防有效量」係指在必要劑量及時段下有效達成所需預防結 果之量。通常，因為預防劑量在疾病之前或在疾病早期用 於個體中，所以預防有效量少於治療有效量。 可調整給藥方案以提供最佳所需反應（例如治療或預防 反應）。舉例而言，可投與單次大丸劑，可隨時間投與若 干分次劑量或劑量可如治療情況之迫切要求所指示按比例 減少或增加。尤其有利的為調配非經腸組合物成單位劑型 以便於投藥及劑量之均-性。如本文中所用之單位劑型係 指物理上適合作為單一劑量用於待治療之哺乳動物個體的 離散單位；各單位含有預定數量之計劃與所需醫藥載劑相 關聯用以產生所需治療作用的活性化合物。本發明之單位 劑型的規格由以下因素規定且直接視其而定：（a)活性化合 物之獨特特徵及待達成之特定治療或預防作用，及為此 項技術所固有之混配該活性化合物用於治療個體之敏感性 之限制。 本發明之結合i白之治療或預防有效量之例示性、非限 140653.doc -214- 201006485 制範圍為0.1-20 mg/kg，例如1-10 mg/kg。應注意劑量值可 隨待減輕之病狀之類型及嚴重程度而變化。應進一步瞭 解，對於任何特定個體，特定給藥方案應隨著時間的過去 根據個體需要及投與組合物或監督組合物之投與者之專業 判斷而調整，且本文中闡明之劑量範圍僅為例示性的且不 意欲限制所主張組合物之範疇或實務。 V.診斷 本文中之揭示内容亦提供診斷應用。此進一步闡明如 ⑩下。 I.檢定方法 本揭示案亦提供使用如本文中描述之至少一種DVD-Ig 測定試樣中之分析物（或其片段）之存在、量或濃度的方 法。如在此項技術中已知之任何適合檢定可用於該方法 中。實例包括（但不限於）免疫檢定，諸如夾心免疫檢定（例 如單株、多株及/或DVD-Ig夾心免疫檢定或其任何變化（例 如單株/DVD-Ig、DVD-Ig/多株等），包括放射性同位素偵 測（放射免疫檢定（RIA))及酶偵測（酶免疫檢定（EIA)或酶聯 免疫吸附檢定（ELISA)(例如Quantikine ELISA檢定，R & D Systems, Minneapolis, MN)))、競爭性抑制免疫檢定（例如 正向及反向）、螢光偏振免疫檢定（FPIA)、酶倍增免疫檢定 技術（EMIT)、生物發光共振能量傳遞（BRET)及均勻化學 發光檢定等。在基於SELDI之免疫檢定中，將特異性結合 所關注之分析物（或其片段）之捕獲試劑連接至質譜分析探 針（諸如預活化蛋白晶片陣列）之表面。隨後將分析物（或其 140653.doc -215- 201006485 片段）特異性捕獲於生物晶片上，且所捕獲之分析物（或其 片段）由質譜分析偵測。或者，可將分析物（或其片段）自捕 獲試劑溶離且由常規MALDI(基質輔助雷射脫附/離子化）或 由SELDI來偵測。化學發光微粒免疫檢定，尤其採用 ARCHITECT®自動分析器之一種免疫檢定（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)為較佳免疫檢定之實例。 將此項技術中熟知之收集、操控且處理尿、血液、血清 及血漿及其他體液之方法用於本揭示案之實務中，例如當 將如本文中描述之DVD-Ig用作免疫診斷試劑及/或用於分 析物免疫檢定套組中時。試樣可包含除所關注之分析物之 外之其他部分，諸如抗體、抗原、半抗原、激素、藥物、 酶、受體、蛋白質、肽、多肽、募核苷酸及/或聚核苷 酸。例如，試樣可為自個體獲得之全血試樣。在如本文中 描述之免疫檢定之前（例如）以預處理試劑來處理試樣、尤 其全血可能為必要的或需要的。甚至在預處理不必要的情 況下（例如大多數尿樣），可視情況進行預處理（例如作為商 業平台上之方案之一部分）。 預處理試劑可為適用於本發明之免疫檢定及套組之任何 試劑。預處理視情況包含：（a)—或多種溶劑（例如甲醇及 乙二醇）及視情況鹽，（b) —或多種溶劑及鹽及視情況清潔 劑，（c)清潔劑，或（d)清潔劑及鹽。預處理試劑在此項技 術中為已知的，且可（例如）如Abbott TDx，AxSYM®及 ARCHITECT® 分析器（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)上之檢定所用、如文獻（參見例如Yatscoff等人Abbott 140653.doc -216- 201006485 TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990)及 Wallemacq 等人 Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal
Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45·· 432-435 (1999))中描述及/或如可購得，來運用該預處 理。另外，預處理可如Abbott之美國專利第5,135,875號、 歐洲專利公開案第0 47 1 293號、美國臨時專利申請案 © 60/878,017(2006年12月29日申請）及美國專利申請公開案 第2008/0020401號（其關於預處理之教示全部以引用的方式 併入本文中）描述而進行。預處理試劑可為非均質劑或均 質劑。 藉由使用非均質預處理試劑，預處理試劑使存在於試樣 中之分析物結合蛋白（例如可結合於分析物或其片段之蛋 白質）沈澱。該預處理步驟包含藉由使藉由將預處理劑添 加至試樣來形成之混合物之上清液與沈澱之分析物結合蛋 白分開而將任何分析物結合蛋白移除。在該檢定中，不存 在混合物之上清液之任何結合蛋白用於該檢定中，直接進 行至抗體捕獲步驟。 對於使用均質預處理試劑，不存在該分離步驟。將試樣 與預處理試劑之整個混合物與分析物（或其片段）之經標記 之特異性結合搭配物接觸，該搭配物諸如經標記之抗分析 物抗體（或其抗原反應性片段）。在藉由第一特異性結合搭 配物捕獲之前或期間，該檢定所採用之預處理試劑通常稀 140653.doc •217- 201006485 釋於預處理試樣混合物中。儘管該稀釋，在捕獲期間一定 量之預處理試劑仍存在（或保留）於試樣混合物中。根據本 發明’經標記之特異性結合搭配物可為DVD-Ig(咬其片 段、變異體或變異體之片段）。 八 在非均質格式中，在自個體獲得試樣之後，製備第一混 合物。混合物含有對於分析物（或其片段）進行評估之試樣 及第一特異性結合搭配物，其中第一特異性結合搭配物及 含於試樣中之任何分析物形成第一特異性結合搭配物分 析物複合物。較佳地’第一特異性結合搭配物為抗分析物_ 抗體或其片段。第一特異性結合搭配物可為如本文中描述 之DVD-Ig(或其片段、變異體或變異體之片段）。添加試樣 及第-特異性結合搭配物以形成混合物之順序並非關鍵性 的。較佳地，將第一特異性結合搭配物固定於固相上。用 於免疫檢定中（對於第一特異性結合搭配物及視情況之第 二特異性結合搭配物）之固相可為在此項技術中已知之任 何固相，諸如（但不限於）磁性粒子、珠粒、試管、微量滴 定盤 '比色管、膜、支架分子、薄膜、渡紙、碟片及晶. 在形成含有第一特異性結合搭配物-分析物複合物之混 合物之後，使用在此項技術中已知之任何技術自複合物移 除任何未K合之分析物。例如，未經結合之分析物可藉 由洗蘇移除。然而’合意地’第一特異性結合搭配物超過 存在於試樣中之任何分析物而存在以使得存在於試樣中之 所有分析物藉由第一特異性結合搭配物結合。 140653.doc •218- 201006485 在移除任何未經結合之分析物之後，將第二特異性結人 搭配物添加至混合物以形成第一特異性結合搭配物-分析 物第—特異性結合搭配物複合物。第二特異性結合搭配 物較佳地為抗分析物抗體，其結合於分析物上之不同於分 析物上之藉由第一特異性結合搭配物結合之抗原決定基之 抗原決定基。另外，亦較佳地，第二特異性結合搭配物經 如上所述之可偵測標記來標記或含有該標記。第二特異性 結合搭配物可為如本文中描述之DVD_Ig(或其片段、變異 ® 體或變異體之片段）。 可使用如在此項技術中已知之任何適合可偵測標記。例 如’可偵測標記可為放射性標記（諸如3H、I25〗、35s、 〗4C、32P及33p)、酶標記（諸如辣根過氧化酶、鹼性過氧化 酶、葡萄糖6-磷酸脫氫酶及其類似物）、化學發光標記（諸 如°丫錠酯、硫酯或磺醯胺；魯米諾（lumin〇1)、異魯米諾 (isoluminol)、啡錠酯（phenanthridinium ester)及其類似 φ 物）、螢光標記（諸如螢光素（例如5-螢光素、6_羧基榮光 素、3'6-羧基螢光素、5(6)-羧基螢光素、6-六氣-螢光素、 6-四氣螢光素、異硫氰酸螢光素及其類似物））、若丹明、 藻膽蛋白、R-藻紅蛋白、量子點（例如硫化鋅封蓋之硒化 録）、測溫標記或免疫聚合酶鏈反應標記。標記、標記程 序及標記之偵測的緒論見於Polak及Van Noorden， Introduction to Immunocy to chemistry ,第 2 版，Springer Verlag，N.Y. (1997)，及Haugland，丑<3«办〇〇免 C72emz’ca/i (1996)(其為由 Molecular 140653.doc -219· 201006485
Probes, Inc.，Eugene, Oregon出版之組合手冊及目錄）中。 螢光標記可用於FPIA中（參見例如美國專利第5,593,896 號、第 5,573,904號、第 5,496,925號、第 5,359,093 號及第 5,352,803號，其係以引用的方式全部併入本文中）。吖錠 化合物可在均質或非均質化學發光檢定中用作可偵測標記 (參見例如 Adamczyk 等人 Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006) ; Adamczyk 等人 Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004) ; Adamczyk 等人 Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 39 17-392 1 (2004);及 Adamczyk 等人 Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003))。 較佳吖錠化合物為吖錠-9-甲醯胺。製備吖錠9-曱醯胺之 方法描述於 Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991) ; Adamczyk 等人 J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998) ; Adamczyk 等人 Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999) ; Adamczyk 等人 Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk 等人 Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly ^ A Luminescence Biotechnology： Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton，第 77-105 頁（2002) ; Adamczyk 等人 Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003);及美國專利第 5,468,646 號、第 5,543,524號及第5,783,699號中，其各自係以引用的方式將 其關於相同目的之教示全部併入本文中。另一較佳吖錠化 合物為吖錠-9-甲酸酯芳基酯。吖錠-9-曱酸酯芳基酯之實 例為10-甲基-9-(苯氧基羰基）吖錠氟磺酸酯（可購自Cayman 140653.doc •220- 201006485
Chemical，Ann Arbor, MI)。製備吖錠9-甲酸酯芳基酯之方 法描述於 McCapra等人Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965) ; Razavi 等人 Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi等人Luminescence 15: 239-244 (2000);及美國專利 第5,241,070號中，其各自係以引用的方式將其關於相同目 的之教示全部併入本文中。關於吖錠-9-甲酸酯芳基酯及其 使用之更多細節闡明於US 2008-0248493中。 化學發光檢定（例如使用如上所述之吖錠或其他化學發 ® 光劑）可根據 Adamczyk等人 Anal. Chim· Acta 579(1)·· 61-67 (2006)中描述之方法來執行。雖然可使用任何適合檢定格 式，但是微板化學發光計（Mithras LB-940，Berthold Technologies U.S.A.，LLC，Oak Ridge, TN)使得可迅速檢定 小體積之多個試樣。 添加試樣及特異性結合搭配物以形成化學發光檢定之混 合物之順序並非關鍵性的。若第一特異性結合搭配物以化 學發光劑（諸如吖錠化合物）可偵測地標記，則可偵測標記 之第一特異性結合搭配物-分析物複合物形成。或者，若 使用第二特異性結合搭配物且第二特異性結合搭配物以化 學發光劑（諸如吖錠化合物）可偵測地標記，則可偵測標記 之第一特異性結合搭配物-分析物-第二特異性結合搭配物 複合物形成。任何未經結合之特異性結合搭配物（無論標 記或未標記）可使用在此項技術中已知之任何技術（諸如洗 滌）自混合物移除。 可在添加上述吖錠化合物之前、同時或之後，將過氧化 140653.doc -221 - 201006485 氫原位生成於混合物中或提供或供應至混合物（例如過氧 化氫之來源為已知含有過氧化氫之一或多種緩衝液或其他 洛液）。過氧化氫可以諸如對於熟習此項技術者顯而易見 之許多方法來原位生成。 在同時或隨後添加至少-㈣性溶液至試樣後，生成指 示分析物之存在之可谓測信號，亦即化學發光信號。驗丨： 溶液含有至少-種驗且具有大於或等於1〇、較佳地大於或 等於12之PH值.鹼性溶液之實例包括（但不限於）氫氧化 鈉、氫氧化卸、氫氧化約、氫氧化錄、氫氧化鎮、碳酸參 鈉、％酸氫鈉、氫氧化鈣、碳酸鈣及碳酸氫鈣。添加至試 樣之鹼性溶液之量視鹼性溶液之濃度而定。基於所用鹼性 溶液之濃度，熟習此項技術者可易於測定添加至試樣之鹼 性溶液之量。 生成之化學發光信號可使用熟習此項技術者已知之常規 技術偵測。基於生成信號之強度，可定量試樣中之分析物 之量。具體5之，試樣中之分析物之量與生成信號之強度 成比例。存在之分析物之量可藉由將生成光之量與分析物® 之標準曲線比較或與參考標準相比來定量。標準曲線可藉 由質譜分析、重量分析方法及在此項技術中已知之其他技 術使用分析物之連續稀釋或已知濃度之溶液來生成。雖然 以上描述著重於使用吖錠化合物作為化學發光劑，但是一 般熟習此項技術者可易於將此描述調適以便使用其他化學 發光劑。 分析物免疫檢定通常可使用在此項技術中已知之任何格 140653.doc -222 - 201006485 式(諸一如(但不限於)夹心格式)來進行。具體言之，在一免 八檢疋格式中，使用至少兩種抗體以分離及定量試樣中之 析物諸如人類分析物或其片段。更特定言之，至少兩 種抗體、合於分析物（或其片段）上之不同抗原決定基，形 、，疫複口物’其稱為「夾心」。通常，在免疫檢定中， :或多種抗體可用於捕獲試樣中之分析物(或其片段)(此等 時常稱為「捕獲」抗體）且一或多種抗體可用於使可 貞》(亦即可定量）標記結合於夾心（此等抗體時常稱為「读 測抗體”戈「接合物」）。因此，在夾心免疫檢定格式之 凊形中’如本文中描述之DVD_Ig(或其片段、變異體或變 異體之片段）可用作捕獲抗體、偵測抗體或兩者。例如， Y種具有可結合分析物（或其片段）上之第一抗原決定基之 區的DVD-Ig可用作捕獲抗體且/或具有可結合分析物（或其 片奴）上之第二抗原決定基之區之另一DvDig可用作偵測 抗體。在此方面，具有可結合分析物（或其片段）上之第一 _ 抗原決定基之第一區及可結合分析物（或其片段）上之第二 抗原決定基之第二區之DVD_Ig可用作捕獲抗體及/或偵測 抗體。或者，具有可結合第一分析物（或其片段）上之抗原 決定基之第一區及可結合第二分析物（或其片段）上之抗原 决疋基之第二區之一 DVD-Ig可用作捕獲抗體及/或偵測抗 體以偵測且視情況定量兩個或兩個以上分析物。若分析物 可以超過一種形式（諸如單體形式及二聚/多聚形式（其可為 均聚或雜聚形式））存在於試樣中，則具有可結合僅暴露於 單體形式上之抗原決定基之區之一 DVD_Ig及具有可結合 140653.doc •223- 201006485 二聚/多聚形式之不同部分上之抗原決定基之區之另— DVD-Ig可用作捕獲抗體及/或偵測抗體，由此使得可偵測 且視情況定量不同形式之指定分析物。此外，採用具有單 一 DVD-Ig内及/或DVD-Ig之間之差異親和力之DVD_Ig可提 供結合性優勢。在如本文中描述之免疫檢定之情形中，將 一或多個連接子併入DVD-Ig之結構内通常可為有用的或 需要的。當存在連接子時，最佳地，連接子應具有足夠長 度及結構撓性以使得可藉由内區結合抗原決定基以及藉由 外區結合另一抗原決定基。在此方面，若DVD_Ig可結合_ 兩個不同分析物且一個分析物大於另一者，則合意地較大 分析物藉由外區結合。 一般而言，測試（例如懷疑含有）分析物（或其片段）之試 樣可與至少一種捕獲抗體及至少一種偵測抗體（其可為第 一偵測机體或第三偵測抗體或甚至連續編號之抗體，（例 如）如在捕獲及/或偵測抗體包含多種抗體的情況下）同時或 順次且以任何順序接觸。例如，試樣可首先與至少一種捕 獲抗體接觸且隨後（順次）與至少一種偵測抗體接觸。或❹ 者，試樣可首先與至少一種偵測抗體接觸且隨後（順次）與 至少一種捕獲抗體接觸。在另一替代方案中，試樣可同時 與捕獲抗體及偵測抗體接觸。 在夾心檢定格式中，在允許形成第一抗體/分析物複合 物之條件下使懷疑含有分析物（或其片段）之試樣首先與至 ^種第一捕獲抗體接觸。若使用超過一種捕獲抗體，則 形成包含兩種或兩種以上捕獲抗體之第一捕獲抗體/分析 H0653.doc -224- 201006485 物複合物。在夾心檢定中，抗體（亦即較佳地至少一種捕 獲抗體）以試樣中之預期最大量之分析物（或其片段）之莫耳 ^里而使用。例如，可使用每mL緩衝液（例如微粒塗布緩 衝液）約5 pg至約1 mg之抗體。 因為需要僅藉由一種抗體之結合而通常用以量測較小分 析物之競爭性抑制免疫檢定包含順次及典型格式。在順次 競爭性抑制免疫檢定中，將所關注之分析物之捕獲抗體塗 布於微量滴定盤之孔或其他固體支撐物上。當含有所關注 讎之分析物之試樣添加至孔時，所關注之分析物結合於捕獲 抗體。在洗滌之後，將已知量之經標記（例如生物素或辣 根過乳化辦（HRP))之分析物添加至孔。酶標記之受質為生 成信號所必需。HRP之適合受質之實例為3,3，,5,5，_四甲基 聯苯胺（TMB)。在洗滌之後，藉由經標記之分析物生成之 信號經量測且與試樣中之分析物之量成反比。在典型競爭 性抑制免疫檢定中，將所關注之分析物之抗體塗布於固體 眷 支撐物（例如微量滴定盤之孔）上。然而，不同於順次競爭 性抑制免疫檢定，試樣及經標記之分析物同時添加至孔。 試樣中之任何分析物與經標記之分析物競爭結合於捕獲抗 體。在洗務之後，藉由經標記之分析物生成之信號經量測 且與試樣中之分析物之量成反比。 視情況，在使試樣與至少一種捕獲抗體（例如第一捕獲 抗體）接觸之前，至少一種捕獲抗體可結合於固體支撐 物’其有助於第一抗體/分析物（或其片段）複合物自試樣分 離°捕獲抗體結合之受質可為有助於捕獲抗體-分析物複 140653.doc -225- 201006485 合物自試樣分離之任何適合固體支撐物或固相。 實例包括盤（諸如微量滴定盤）之孔、試管、多孔凝膠（例 如矽膠、瓊脂糖、聚葡萄糖或明膠）、聚合膜（例如聚丙烯 酿胺）、珠粒（例如聚笨乙烯珠粒或磁性珠粒）、濾紙/膜（例 如确化纖維素或对綸）之條帶、微粒（例如膠乳粒子、可磁 化微粒（例如具有氧化鐵或氧化絡核心及均聚或雜聚塗層 及約1-10微米之半徑之微粒））。受質可包含具有結合抗原 之適合表面親和力及允許偵測抗體到達之足夠孔隙率的適 合多孔材料。雖然可使用水合物狀態之凝膠材料，但是微❿ 孔材料通常為較佳的。該等多孔受質較佳地呈具有約001 至約0.5 mm、較佳地約〇」mm之厚度之薄片之形式。雖然 孔徑可相當大地變化，但是較佳地孔徑為約〇〇25至約15 微米’更佳約G.15至約15微米。該等受質之表面可藉由引 起抗體與受質共價鍵結之化學過程而活化。產生抗原或抗 鱧與觉質的通常藉由經由疏水性力之吸附所引起之不可逆
結合；或者，化學偶合劑或其他方式可用於使抗體與受質 共價結合’其限制斜為該結合不會干擾抗體結合分析物 之鲍力。❹，抗體可與微粒結纟，該等微粒先前已以抗 生蛋白鏈菌素（例如DYNAL⑧Magnetie⑽心，
Invitrogen，Carlsbad，CA)或生物素（例如使用 power·
BindTM-SA-MP抗生蛋白鍵菌素塗布之微粒(s_， Indianapolis’ IN))或抗物種特異性單株抗體塗布。若必 要’則可使受質衍Μ允許與抗體上之各種官能基反應。 該衍生作用需要使用某些偶合劍，其實例包括(但不限於) 140653.doc -226- 201006485 順丁烯二酸酐、N-羥基琥珀醯亞胺及1-乙基-3-(3-二甲基 胺基丙基）碳化二亞胺。若需要，可將其每一者對於分析 物具有特異性的一或多種捕獲試劑（諸如抗體（或其片段）) 在不同物理或可定址位置連接至固相（例如以生物晶片組 態（參見例如美國專利第6,225,047號；國際專利申請公開 案第WO "Mm3號·，美國專利第6,329,2〇9號·，國際專利 申請公開案第WO 00/56934號及美國專利第5,242,828 號））。若捕獲試劑連接至作為固體支撐物之質譜分析探 ® 針，則結合於探針之分析物之量可藉由雷射脫附離子化質 譜分析來偵測。或者’單一管柱可以不同珠粒填充，該等 珠粒以該或該等捕獲試劑衍生，由此將分析物捕獲於單一 位置中（參見抗體衍生、基於珠粒之技術，例如Luminex (Austin，TX)之 xMAP技術）。 在將檢定分析物（或其片段）之試樣與至少一種捕獲抗體 (例如第一捕獲抗體）接觸之後，培養混合物以便允許形成 ❹第一抗體（或多個抗體）_分析物（或其片段）複合物。培養可 在約4·5至約1〇.〇之pH值下、在約2它至約45它之溫度下， 且歷時至少約1分鐘至約18小時、較佳約i至約24分鐘、最 佳約4至約18分鐘之時段而執行。本文中描述之免疫檢定 可以一個步驟（意謂試樣、至少一種捕獲抗體及至少一種 偵測抗體全部順次或同時添加至反應容器中）或以超過一 個步驟（諸如兩個步驟、三個步驟等）而進行。 在形成（第一或多種）捕獲抗體/分析物（或其片段）複合物 之後，隨後使該複合物在允許形成（第一或多種）捕獲抗體/ 140653.doc -227. 201006485 分析物（或其片段）/第二偵測抗體複合物之條件下與至少一 種伯測抗體接觸。雖然出於清晰目的而說明為「第二」抗 體（例如第二偵測抗體），實際上在多個抗體用於捕獲或 偵測的情況下，至少一種偵測抗體可為用於免疫檢定中之 第二、第三、第四等抗體。若捕獲抗體/分析物（或其片段） 複合物與超過一種偵測抗體接觸，則形成（第一或多種）捕 獲抗體/分析物（或其片段）/(多種）偵測抗體複合物。如同捕 獲抗體（例如第一捕獲抗體）一樣，當至少一種（例如第二及 任何隨後）偵測抗體與捕獲抗體/分析物（或其片段）複合物參 接觸時，需要在與如上所述彼等條件相似之條件下之培養 時間以形成（第一或多種）捕獲抗體/分析物（或其片段）/(第 二或多種）偵測抗體複合物。較佳地，至少一種债測抗體 含有可偵測之標記。可偵測之標記可在形成（第一或多種） 捕獲抗體/分析物（或其片段）/(第二或多種）偵測抗體複合物 之前、同時或之後結合於至少一種貞測抗體（例如第二伯 測抗體）。可使用在此項技術中已知之任何可偵測之標記 (參見以上的討論，包括Polak及Van Noorden (1997)及參 Haugland (1996)參照案）。 可偵測之標記可直接或經由偶合劑結合於抗體。可使用 之偶合劑之實例為EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）碳 化二亞胺鹽酸鹽），其可購自Sigma-Aldrich，St. Louis， M0。可使用之其他偶合劑在此項技術中為已知的。使可 偵測標記結合於抗體之方法在此項技術中為已知的。另 外，可購得或合成已含有有助於可偵測標記與抗體偶合之 140653.doc • 228 - 201006485 端基的許多可偵測標記，諸如CPSP-吖錠酯（亦即9-[N-甲 苯磺酿基羧基丙基）]-l〇-(3-磺丙基）吖錠甲醯胺）或 SPSP-吖錠酯（亦即Nl〇-(3-磺丙基）-N-(3-磺丙基）-吖錠_9_甲 醯胺）。 (第一或多種）捕獲抗體/分析物/(第二或多種）偵測抗體複 合物可（但不必）在定量標記之前與試樣之其餘部分分離。 例如，若至少一種捕獲抗體（例如第一捕獲抗體）結合於固 體支撐物（諸如孔或珠粒）’分離可藉由移除（試樣之）流體 ® 以免與固體支撐物接觸而實現。或者，若至少第一捕獲抗 體結合於固體支撐物，則其可同時與含有分析物之試樣及 至少一種第二偵測抗體接觸以形成第一（多種）抗體/分析物/ 第二（多種）抗體複合物，接著移除流體（試樣）以免與固體 支樓物接觸。若至少一種第一捕獲抗體不結合於固體支樓 物’貝Η第一或多種）捕獲抗體/分析物/(第二或多種）偵測抗 體複合物不必自試樣移除以便定量標記之量。 φ 在形成經標記之捕獲抗體/分析物/偵測抗體複合物（例如 第一捕獲抗體/分析物/第二偵測抗體複合物）之後，複合物 中之標記之量使用在此項技術中已知之技術定量。例如， 若使用酶標記，則經標記之複合物與標記之受質反應，給 出諸如顯色之可定量反應。若標記為放射性標記’則標記 使用適當方式（諸如閃爍計數器）定量。若標記為螢光標 S己，則標記藉由以一種顏色之光（其稱為「激發波長」）刺 激標記且偵測響應於刺激而由標記發射之另一顏色（其稱 為發射波長」）來定量。若標記為化學發光標記，則標 140653.doc -229- 201006485 記藉由在視覺上或藉由使用發光計、x線膠片、高速照相 膠片、CCD相機等來偵測發光而定量。一旦已定量複合物 中之標記之量，則試樣中之分析物或其片段之濃度藉由適 當方式測定’諸如藉由使用已使用已知濃度之分析物或其 片段之連續稀釋而生成之標準曲線。除使用分析物或其片 段之連續稀釋以外，標準曲線可以重量分析方式、藉由質 譜分析且藉由在此項技術中已知之其他技術來生成。 在採用ARCHITECT®分析器之化學發光微粒檢定中，接 合物稀釋劑pH值應為約6.0 +/_ 0.2，微粒塗布緩衝液應維 持於約室溫（亦即約17至約27°C )下，微粒塗布緩衝液pH值 應為約6.5 +/· 0.2 ’且微粒稀釋劑pH值應為約7.8 +Λ 0.2。 固體較佳少於約0.2%、諸如少於約0.15%、少於約〇. 14%、 少於約0.13%、少於約0.12%或少於約〇·ΐΐ%，諸如約 0.10% 〇 FPIA係基於競爭性結合免疫檢定原理。當藉由線性偏振 光激發螢光標記化合物時，螢光標記化合物發射具有與其 旋轉速率成反比之偏振度的螢光。當螢光標記之示蹤物_ 抗體複合物藉由線性偏振光激發時，因為螢光團在吸收光 之時間與發射光之時間之間的旋轉受到限制，所以發射光 仍高度極化。當「游離」示緞化合物（亦即不結合於抗體 之化合物）藉由線性偏振光激發時，其旋轉比在競爭性結 合免疫檢定中產生之相應示蹤物-抗體接合物快得多。由 於不存在需要特殊處理及處置之放射性物質，因此FPIA比 RIA有利。另外，FPIA為可易於且迅速執行之均質檢定。 140653.doc 230· 201006485 鑒於上述’提供測定試樣中之 在、量或遒庳+ 士、I π卿v a，、月奴）之存 樣之八析彳二 該方法包含藉由以T檢定來檢定試 二之刀析物(或其片段)：(_(i,)可結合 體、抗體片段、可4士人# x “於为析物之抗體變異體、可結合於
刀析物之抗體變里體 H 、體之片&及可結合於分析物之DVD- g(或其片段、變異體或變異體片段）中之至少一者 貞測標記且（ii)包含將藉由可制標記生成之 ❹ 鲁 作為試樣中之分析物（咬盆 其片故）之存在、量或濃度之直接 或間接指示之信號與作為對照或校準中之分析物（或其片 w之存在、量或濃度之直接或間接^之生成信號進行 比較。校準視情況為—系列校準之—部分，其令每—校準 根據分析物濃度而不同於其他校準。 該方法可包含⑴使試樣與分析物（或其片段）之至少一種 第一特異性結合搭配物接觸以便形成第-特異性結合搭配 物/分析物(或其片段)複合物，該至少一種第一特異性結合 搭配物選自由以下各者組成之群：可結合於分析物之抗 體、抗體片段、可結合於分析物之抗體變異體、可結入 分析物之抗體變異體片段及可結合於分析物之DvD_ig(或 其片奴、變異體或變異體片段），（丨丨）使第—特異性結合搭 配物/分析物（或其片段）複合物與分析物（或其片段）之至少 一種第二特異性結合搭配物接觸以便形成第一特異性結合 搭配物/分析物（或其片段v第二特異性結合搭配物複合 物，該至少一種第二特異性結合搭配物選自由以下各者組 成之群··可結合於分析物之可偵測標記之抗分析物抗體、 140653.doc -231 -
I 201006485 可偵測標記之抗分析物抗體片段、可結合於分析物之可偵 測標記之抗分析物抗體變異體、可結合於分析物之可偵測 標記之抗分析物抗體變異體之片段及可偵測標記2Dvd_ ig(或其片段、變異體或變異體片段），及（iii)藉由偵測或 量測藉由在（11)中形成之第一特異性結合搭配物/分析物（或 其片段）/第二特異性結合搭配物複合物中的可偵測標記生 成之信號而測定試樣中之分析物之存在、量或濃度。分析 物（或其片段）之至少一種第一特異性結合搭配物及/或分析 物（或其片段）之至少一種第二特異性結合搭配物為如本文❿ 中描述之DVD-Ig(或其片段、變異體或變異體片段）之方法 可為較佳的.。 或者，該方法可包含：使試樣與分析物（或其片段）之至 少一種第一特異性結合搭配物接觸，該至少一種第一特異 性結合搭配物選自由以下各者組成之群：可結合於分析物 之抗體、抗體片段、可結合於分析物之抗體變異體、可結 合於分析物之抗體變異體片段及DVD-Ig(或其片段、變異 體或變異體片段）；及同時或順次、以任一順序使試樣與® 可與为析物（或其片段）競爭結合於至少一種第一特異性結 合搭配物且係選自由以下各者組成之群之至少一種第二特 異性結合搭配物接觸：可結合於第一特異性結合搭配物之 可偵測標記之分析物、可偵測標記之分析物片段、可結合 於第一特異性結合搭配物之可彳貞測標記之分析物變異體， 及可結合於第一特異性結合搭配物之可偵測標記之分析物 變異體之片段。存在於試樣中之任何分析物（或其片段）與 140653.doc •232- 201006485 至少一種第二特異性結合搭配物彼此競爭以分別形成第一 特異性結合搭配物’分析物(或其片段)複合物及第一特異性 結合搭配物/第二特異性結合搭配物複合物。該方法進- 步包含藉由偵測或量測藉由在(H)中形成之第-特異性結 口搭配物/第一特異性結合搭配物複合物中之可偵測標記 生成之信號來測定試樣中之分析物之存在、量或濃度，其 中藉由第一特異性結合搭配物/第二特異性結合搭配物複 合物中之可偵測標記生成之信號與試樣中之分析物之量或 _ 濃度成反比。 上述方法可進-步包含診斷、預測或評估試樣由其獲得 之患者之治療性/預防性治療之功效。若該方法進一步包 含評估試樣由其獲得之患者之治療性/預防性治療之功 效，則該方法視情況進一步包含視需要來改進患者之治療 性/預防性治療以改良功效。該方法可適用於自動系統或 半自動系統中。 φ 關於檢定方法（及其套組），可採用可購得之抗分析物抗 體或如文獻1f7描述之產生抗分析物之方法。各種抗體之商 業來源包括（但不限於）Santa Cruz Bi〇techn〇l〇gy lnc (Santa Cruz » CA) > GenWay Biotech > Inc. (San Diego . CA)及 R&D Systems (RDS ; Minneapolis，MN)。 通常，預定水準可用作藉以評估在檢定分析物或其片段 之試樣後獲得之結果（例如）以便偵測疾病或疾病風險之基 準。通常’在進行該比較中，預定水準藉由以足夠次數且 在適當條件下運作特定檢定以使得可產生分析物存在、量 140653.doc -233 · 201006485 或濃度與疾病、病症或病狀之特定階段或终 床標誌之聯繫或關聯來獲得。通常，預定水進V、特定臨 照個體（或個體群趙）而獲得 ^藉由檢定參 段、其降解產物及/或其酶分裂產物^析物可包括其片 :言之，相對於如用於監控疾病進 水準，分析物或其片段之量或漠度可為「無變化:二預： 利的」（或「有利地變化的），<「 變化的」）。「升“「= 利的」(或「不利地 -」成增加」係指試樣中之量 參 於典型或正常水準或範圍（例如預定水準）或高於另一= 水準或範圍（例如先前或基線試 ，考 少，伤扣4接士直 降低」或「減 係4试樣中之量或濃度低於典型或正常 (例如預定水準）或低於另一來考 /範圍 >号水準或範圍（例如 =。：語「改變」：指試樣中之量或濃度與典二 nm》7圍（例如預定水準）相比或與另—參考水準或 範圍（例如先前或基線試樣）相比改變（增大或減小卜 ，析物之典型或正常水準或範圍根據標準實務界定。因 為在一些情況中分析物之水準極低，所以當存在與业型或 範圍或參考水準或範圍相比之不能藉由實驗誤 變異解釋之任何淨變化時可視為已出現所謂的改 變之水準或變動。因此，在特^試樣中量測到之水準 與在來自所謂正常個體之類似試樣中測定出之水準或水準 範圍相比。在此情形中，「正常個體」為不具有（例如）可價 測疾病之個體，且「丨Τ：壹 . 趙分別為(例如)不展現可：時病稱為「對照」)患者或群 價列疾病之患者或群體。此外， 140653.doc •234- 201006485 假定分析物常規地不卩高水 「正常個體」可視為不 〜；大多數人類群體中， 度之分析物的個體，且「正：了偵測增加或升高量或濃 者或群體為不展現顯著可^時稱為「對照」）患 物的患者或群體。「表觀正或升高量或濃度之分析 當前正在評估之個體表析… 如正常水準為#，或在正常群趙之常:也為不可㈣的(例 之範圍内)，但在試樣中偵”、25至約75百分位數 SLt ±- 9- 丨時，以及當分析物以高於 I水丰存在於試樣中時，據信分析物 因此，本揭示案尤其提供旱升：」 或病狀或處於患上特定疾病㈠:有特疋疾病、病症 個體的方法，方法亦可涉及==風，中的 物。 V次檢疋其他標記及其類似 因此’本文中描述之方沐 ^ ^ ^ 方去亦可用於判定是否個體患有指 =、病症或病狀或處於發展指定疾病、病症或病狀風 險之中。具體言之，該種方法可包含以下步驟： (a)測定來自個體之試樣中 旦〒之刀析物（或其片段）之濃度或 里（例如使用本文中描 、、t、. 攻之方法或在此項技術中已知之方 法:），及 (〜）將^驟⑷中測定出之分析物（或其片段）之濃度或量與 疋水準進行比較，其中若步驟⑷中敎出之分析物之濃 又或量相對於預定水準為_的，㈣定個體不患有指定 =病、病症或病狀或處於指定疾病、病症或病狀風險之 。然而，若步驟⑷t測定之分析物之濃度或量相對於預 140653.doc •235· 201006485 定水準為不利的’則判定個體患有指定疾病、、 或處於指定疾病、病症或病狀風險之中。、、病症或病狀 另外，本文中提供監控個體之疾 地，該方法包含以下步驟： 、 之方法。最佳 ⑷測定來自個體之試樣中之分析物之濃 (b)測定來自個體之稍後試樣中之分析物：;；或量.及 ⑷將步驟⑻中敎出之分析物之濃度或=， 測定出之分析物之濃度或量進行比較，=”步驟⑷中
定出之濃度或量當與步驟⑷中測定出之; :=變:;為不利的’則判定個體之疾=或: 言，若如步驟(b)中測定出之分析物之濃 =量§與如㈣⑷中敎出之分析物之濃度或量相比時 為有利的，則衫個體之疾病已終止m改善。 視情況，該方法進一步包含將如步驟(b)中測定出之分 析物之濃度或量（例如）與預定水準進行比較。此外，若該 比較展示如步驟⑻中測定出之分析物之濃度或量（例如）相
對於默水準不利地改變，則該方法視情況包含以一或多 種醫藥組合物治療個體一段時間。 另外°亥等方法可用於監控接受一或多種醫藥組合物治 療之個體中之治療。具體言之，該等方法涉及在已向個體 投與一或多種醫藥組合物之前提供來自個體之第一試樣。 接著，測疋來自個體之第一試樣中之分析物之濃度或量 (例如使用本文中描述或如在此項技術中已知之方法）。在 測定分析物之濃度或量之後，視情況隨後將分析物之濃度 140653.doc •236· 201006485 或量與預定水準相比。若如. 第—試樣中測定出之分析物 之辰度或置低於預定水準， 個體不以—或多種醫藥組a 物&療。然而，若如在第—試樣中 '' 古於if— 疋出之分析物之濃度 4重间於預疋水準’則個體 以或多種醫藥组合物治療一 #又時間。個體以該或該等醫藥 寻晉樂組合物治療之時段可藉由孰 %此項技術者確定（例如時段 … 14天至約】年）。 τ為約7天至約兩年，較佳約 在以該或該等醫藥組合物治 ^ ^ ^ 潦之k程期間，隨後自個體 獲得第二及後續試樣。兮 樣5式樣數目及自個體獲得該等試樣之 時間不為關鍵性的。例如，第_ 罘一忒樣可在首次向個體投與 该或該等醫藥組合物之後第 J 傻弟/天獲得，第三試樣可在首次 向個體投與該或該等醫藥組合物之後第2週獲得，第四試 樣可在百次向個體投與該或該等醫藥組合物之後第3週獲 得’第五試樣可在首次向個體投與該或該等醫藥組合物之 後第4週獲得等。 φ 在自個體獲得每—帛二或後續試樣之後，測定第二或後 續試樣中之刀析物之濃度或量（例如使用本文中描述或如 在此項技術中已知之方法）。如在第二及後續試樣中之每 一者中測定出之分析物之濃度或量隨後將與如第一試樣 (例如最初視情況與預定水準相比之試樣）中測定出之分析 物之濃度或量相比。若如步驟（c)中測定出之分析物之濃度 或量當與如步驟（a)中測定出之分析物之濃度或量相比時為 有利的，則判疋個體之疾病已終止、消退或改善，且應繼 續向個體投與步驟（b)之該或該等醫藥組合物。然而，若步 140653.doc -237- 201006485 驟（C)中測定出之濃度 * &上 4重步驟（a)中測定出之分析物 之廣度或量相比時未變析物 已梏锖、推N 或為不利的，則判定個體之疾病 盘靜 化，且個體應以較高濃度之步驟⑻中投 m中投m療或個體應以不同於步驟 ㈣/、 心亥或該等醫藥組合物之-或多種醫藥組合 >口'。具體言之’個體可以不同於個體先前接受之該或
該等醫藥組合物之—十' 史赵：較& , A s多種邊樂、《§_合物治療以減少或降低 該個體之分析物水準。 通常，對於可能進行重複測試之檢定（例如監控疾病進 程及/或治療反應）’在自個體獲得第-試樣之後之時段處 獲得第二或後續試樣。具體言之，來自個體之第二試樣可 在自個體獲得第-試樣之後數分鐘、數小時、數天、數週 或數年獲付。例如，第二試樣可在自個體獲得第—試樣之 後約1分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約3〇分鐘、 約45分鐘、約60分鐘、約2小時、約3小時、約4小時、約$ 小時、約6小時、約7小時 '約8小時、約9小時、約⑺小 時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小 時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約2〇 小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、約2 天、約3天、約4天、約5天、約ό天、約7天、約2週、約3 週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約1〇 週、約11週、約12週、約13週、約14週、約15週、約16 週、約1 7週、約1 8週、約19週、約20週、約2 1週、約22 週、約23週、約24週、約25週、約26週、約27週、約28 140653.doc -238· 201006485 週約29週、約30週、約31週、約32週、約33週、約34 週、約35週、約36週、約37週、約38週、約”週、約 週約41週、約42週、約43週、約44週、約45週、約46 週、約47週、約48週、約49週、約50週、約51週、約52 週、約1.5年、約2年、約2.5年、約3.〇年、約3.5年、約4 〇 年、約4.5年、，約5·〇年、、約5 5年、約6 〇年、約以年、約 7.0年、約7.5年、約8.0年、約8.5年、、約9.0年、約9.5年或 約10·0年之時段處自個體獲得。 © 當用以監控疾病進程時，上述檢定可用於監控罹患急性 病狀之個體之疾病進程。急性病狀，亦稱為危急護理病 狀，係指急性、危急生命的疾病或其他涉及（例如）心血管 系統或排泄系統的危急醫學病狀。通常，危急護理病狀係 指在基於醫院之背景（包括（但不限於）急救室、重病監護 室、外傷中心或其他緊急護理背景）中需要急性醫學介入 或藉由護理人員或其他基於現場之醫務人員之照護的彼等 ❹ 病狀。對於危急5蔓理病狀’通常在較短時段，亦即數分 鐘’數小時或數天（例如約1分鐘、約5分鐘、約丨〇分鐘、 約15分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約6〇分鐘、約2小時、 約3小時、約4小時、約5小時、約6小時 '約7小時、約8小 時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小 時、約14小時、約15小時、約Ιό小時、約17小時、約18小 時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小 時、約24小時、約2天、約3天、約4天 '約5天、約6天或約7 天）内進行重複監控，且初始檢定同樣地通常在疾病或病 140653.doc -239- 201006485 狀發作之較短時段（例如㈣分鐘、m 檢定亦可用於監控罹患慢性或非急性病狀 之進程。非危急護理或非急性病狀係指除急性、危 的疾病或涉及(例如管系統及/或排㈣統之乂 = 醫學病狀以外的病狀。通常，㈣性餘包 = 約2天、約3天、約4天、 3週、約4週、約5週、 約10週、約11週、約12 約17週 約23週 約29週 約3 5週 約41週 約47週 約1.5年 ^例如一數天、數週、數月或數年=: 時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、 約7小時、約8小時、約9小時、約1〇小時、約u小時、約 12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約 17小時、約18小時、約19小時、約2〇小時、約2ι小時約 22小時、約23小時、約24小時 約5天、約6天、約7天、約2週、約 約6週、約7週、約8週、約9週 週、 約 13週、 週、 約 19週、 週、 約 25週、 週、 約 31週、 週 約 37週、 週 * 約 43週、 週 '約 49週、 年 ‘約 2.5 年、 約16週 約22週 約28週 約34週 約40週 約46週 約52週 約18 約24 約30 約36 約42 約48 .約2 約14週、約15週 約20週、約21週 約26週、約27週 約32週、約33週 約3 8週、約3 9週 約44週、約45週 約50週、約51週 約3.0年、約3.5年、約4.0年、約4.5年、矣 5.0年、約5.5.年、約6.0年、約6.5年、約7.〇年、約7.5年 約8.0年、約8·5年、約9.0年、約9·5年或約1〇.〇年）内進;| 140653.doc •240- 201006485 重複監控’且初始檢定同樣地通常在 v庆病或病狀發作 長時段（例如約數小時、數天、數月或數年）内、— 此外，上述檢定可使用自個體獲得之 中第一試樣自一來源（諸如尿、血清漿獾仃，其 0 $血漿）獲得。視情 況，上述檢定可隨後使用自個體獲 .^ 、乐二試樣重複，其 中第二試樣自另一來源獲得。例 ' Θ1 ^ 右第一試樣自尿獲 ❹ 參 仔，則第二試樣可自血清或血漿獲得。可將使用第 及第二試樣自檢定獲得之結果進行比 1 個體之疾病或病狀之狀態。 較可用於評估 另外，本揭示案亦係關於判定易& ^ > 匁α杀或正惟患指定疾 病、病症或病狀之個體是否將受益於治 之，本揭示案係關於分析物陪伴診斷方法及產物。因此: 如本文中描述之「監控個體之疾 、扃之>α療」之方法進一步 最佳地亦可涵蓋選擇或識別療法之候選者。 因此，在特定實施例中，太想-也丄 本揭不案亦提供判定患有指定 疾病、病症或病狀或處於指定 .^, 疋疾病、病症或病狀之風險之 中的個體是否為療法之候選者 ^ ^ 百夂方法。通常，個體為已經 串、病、病症或病狀之—些症狀或實際上已經診斷為 狀風險病、病症或病狀，或處於指定疾病、病症或病 風險之中’且/或在展示如本文中圹、+、夕尤剎言痒斗、甚 夕八把& 个又中描述之不利濃度或量 之刀析物或其片段的一個體。 該方法視情況包含如本文中描述之檢定其中在以一或 多種醫藥組合物（例如尤1 m ^ 八乂與涉及分析物之作用機制有 關之醫藥）、以免疫抑制療法七 J像决或以免疫吸附療法治療個體 140653.doc -241 - 201006485 之月j及之後評估分析物，或其中在該治療之後評估分析物 且分析物之濃度或量相對於預定水準來比較。在治療之後 觀察到之刀析物之不利濃度或量確認個體將不受益於接受 進步或持續/α療，而在治療之後觀察到之分析物之有利 的濃度或量確認個體將受益於接受進一步或持續治療。此 確财助於管㈣床研究，讀供㈣良之患者護理。 不。而喻’雖然本文中某些實施例當用於評估如本文中 定疾病 '病症或病狀時為有利的’但是檢定及套 、’可用於評估其他疾病、病症及病狀中之分析物。檢定方鲁 法亦可涉及檢定其他標記及其類似物。 人檢定方法亦可用於識別改善指定疾病、病症或病狀之化 σ物。例如，表現分析物之細胞可與候選化合物接觸。與 化合物接觸之細胞中之分析物的表現量可使用本文中描述 之檢定方法與對照細胞中之彼表現量相比。 II.套組 亦提供對於試樣中之分析物（或其片段）之存在、量或濃 度而檢定試樣之套組。套組包含至少―種用於檢定試樣之© y刀析物（或其片段）的組份及用於檢定試樣之分析物（或其片 )的說月書。至少一種用於檢定試樣之分析物（或其片段） 的、伤可包括包含視情況固定於固相上之抗分析物dVD_
Ig(或其片段、變異體或變異體片段）之組合物。 套、、且可包含至少一種用於藉由免疫檢定（例如化學發光 粒免疫檢疋）檢定試樣之分析物的組份，及用於藉由免 疫檢定（例如化學發光微粒免疫檢定）檢定試樣之分析物的 140653.doc -242- 201006485 ❹ ❹ 說月曰例如’套組可包含分析物之至少一種特異性結合 搭配物’諸如抗分析物、單株/多株抗體（或其可結合於分 析物之片焱、其可結合於分析物之變異體，或可結合於分 析物之變異體片段）或抗分析物DVD-Ig(或其片段、變異體 或變/、體片奴）’其任一者可為經可偵測標記的。替代地 或另外，套組可包含可偵測標記之分析物（或其可結合於 杬刀析物、單株/多株抗體或抗分析物DVD-Ig(或其片段、 變異體或變異體片段）之片段），其可與試樣中之任何分析 物脱爭結合於抗分析物、單株/多株抗體（或其可結合於分 析物之片1其可結合於分析物之變異體，或可結合於分 析物之變異體片段）或抗分析物DVD-Ig(或其片段、變異體 或變異體片段），其任一者可固定於固體支揮物上。套組 可包含校準或對照，例如分離或純化之分析物。套組可包 ::於：打檢定之至少-種容器(例如管、微量滴定盤或 …其可已以(例如)第一特異性結合搭配物塗布…或 緩衝液，諸如檢㈣衝液或洗務緩衝液，其任—者可提供 為可债測標記（例如酶標記）之濃溶液、受質溶液，或停止 :液。較佳地，套組包含為執行檢定所必需 亦即試劑、標準、緩衝液、稀釋劑等。說明書可呈 或電腦可讀形式，諸如磁盤、CD、dvd或其類似物。 物^抗人體如(Γ抗分析物抗體或抗分析物靖姻示縱 =入如本文中描述之可偵測標記，諸如螢光團、放 學發光標記或其類似物，或套 色團 匕括進仃可偵測標記之 140653.doc -243- 201006485 試劑。抗體、校準及/或對照可提供於獨立容 配至適當檢定格式中，例如至微量滴定盤中。5 視情況，套組包括品質控制組份(例如靈敏 準及陽性對照）。品㈣㈣敎製#在此項中為;; 知的且描述於各種免疫診斷產物之插人頁上。靈敏度^ 成員視情況用以確立檢定效能特徵，且進—步視 疫檢定套組試劑之完整性及檢定之標準化㈣用指示物。 套組亦可視情況包括進行診斷檢定或有助於品質控制評 估所需之其他試劑’諸如緩衝液、鹽、酶'酶辅因子、酶 受質、偵測試劑及其類似物。分離及/或處理試樣之其他 組份（諸如緩衝液及溶液）（例如預處理試劑）亦可包括於套 組:。套組可另外包括一或多個其他對照。套組之組份中 之一或多者可凍乾，在該情況下套組可進一步包含適合於 復原凍乾組份之試劑。 套組之各種組份視情況根據需要提供於適合容器中，例 如微量滴定盤。套組可進-步包括保持或财試樣之容器 (例如尿δ式樣之容器或濾筒）。若適當，套組視情況亦可含 有反應容器、混合容器及有助於製備試劑或試樣之其他組 件。套組亦可包括有助於獲得試樣之一或多個儀器，諸如 針筒、移液管、鉗子、量測匙或其類似物。 右可偵測標記為至少一種吖錠化合物，則套組可包含至 > 一種吖錠-9-甲醯胺、至少一種吖錠_9_甲酸酯芳基酯或 其任何組合。若可偵測標記為至少一種吖錠化合物，則套 組亦可包含過氧化氫來源’諸如緩衝液、溶液及/或至少 140653.doc -244. 201006485 一種鹼性溶液。若需要，套組可含有固相，諸如磁性粒 子、珠粒、試管、微量滴定盤、比色管、膜、支架分子、 薄膜、濾紙、碟片或晶片。 III.調適套組及方法 藉由檢定（諸如如本文中描述之免疫檢定）測定試樣中之 分析物之存在、量或濃度之套組（或其組件）以及方法可經 調適用於各種自動及半自動系統（包括固相包含微粒之彼 等系統），如（例如）在美國專利第5,089,424號及第 © 5,006,309 號中描述，且如（例如）藉由 Abbott Laboratories (Abbott Park，IL)作為 ARCHITECT®所商業銷售者。 自動或半自動系統與非自動系統（例如ELISA)相比之一 些差異包括第一特異性結合搭配物（例如抗分析物、單株/ 多株抗體（或其片段、其變異體或其變異體片段）或抗分析 物DVD-Ig(或其片段、其變異體或其變異體片段））所連接 之受質，兩種方式皆可影響夾心形成及分析物反應性；及 捕獲、偵測及/或任何可選洗滌步驟之長度及時間選擇。 ® 非自動格式（諸如ELISA)可能需要試樣及捕獲試劑之相對 較長的培養時間（例如約2小時），而自動或半自動格式（例 如 ARCHITECT®，Abbott Laboratories)可具有相對較短的 培養時間（例如對於ARCHITECT®約1 8分鐘）。類似地，非 自動格式（諸如ELISA)可培養偵測抗體（諸如接合試劑）歷時 相對較長的培養時間（例如約2小時），而自動或半自動格式 (例如ARCHITECT®)可具有相對較短的培養時間（例如對於 ARCHITECT® 約 4分鐘）。 140653.doc -245 - 201006485 可購自Abbott Laboratories之其他平台包括（但不限 於）AxSYM®、IMx®(參見例如美國專利第5,294,404號，其 係以引用的方式全部併入本文中）、PRISM®、EIA(珠粒） 及Quantum™ II以及其他平台。另外，檢定、套組及套組 組件可以其他格式使用，例如在電化學或其他手持或定點 護理檢定系統上。本揭示案（例如）適用於執行夾心免疫檢 定之商業 Abbott 定點護理（i-STAT®，Abbott Laboratories) 電化學免疫檢定系統。免疫感應器及其製造方法及在一次 性使用測試裝置中之操作描述於（例如）美國專利第 5,063,081號、美國專利申請公開案第2003/0170881號、美 國專利申請公開案第2004/00 18577號、美國專利申請公開 案第2005/0054078號及美國專利申請公開案第 2006/0160164號中，其係以引用的方式將其關於相同目的 之教示全部併入本文中。 詳言之，關於將分析物檢定針對I-STAT®系統進行調 適，以下組態為較佳的。顯微製造之矽晶片經製造具有一 對金電流測定操作電極及銀-氣化銀參考電極。在一個操 作電極上’將具有固定化抗分析物、單株/多株抗體（或其 片段、其變異體或其變異艎片段）或抗分析物DVD-Ig(或其 片段、其變異體或其變異體片段）之聚苯乙烯珠粒（0.2 mm 直徑）黏附於電極上之圖案化聚乙烯醇之聚合物塗層。將 此晶片組裝至具有適合於免疫檢定之射流格式之I-STAT® 濾筒中。在濾筒之試樣保持腔室壁之一部分上，存在包含 分析物之特異性結合搭配物之層，該特異性結合搭配物諸 140653.doc -246- 201006485 如抗分析物、單株/多株抗體（或其可結合分析物之片段、 其變異體，或其變異體片段）或抗分析物DVD-Ig(或其可結 合分析物之片段、其變異體，或其變異體片段），其皆可 經可偵測標記。在濾筒之流體小袋内，為包括對胺基苯紛 磷酸酯之含水試劑。 操作中’將懷疑含有分析物之試樣添加至測試濾筒之保 持腔室’且將濾筒插入I-STAT®讀取器中。在分析物之特 異性結合搭配物溶解於試樣中之後，濾筒内之泵元件迫使 ® 試樣進入含有晶片之導管内。在此，其經振動以促進夾心 之形成。在檢定之倒數第二個步驟中，迫使流體離開小袋 且進入導管以將試樣洗滌脫離晶片且進入廢物腔室中。在 檢定之最後步驟中，鹼性磷酸酶標記與對胺基苯酚磷酸酯 反應以裂解磷酸酯基且允許釋放出之對胺基笨酚在操作電 極處以電化學方式氧化。基於所量測電流，讀取器能夠藉 助於嵌入演算法及工薇確定之校準曲線來計算試樣中之分 析物之量。 ❿丄 不s而喻，如本文中描述之方法及套組必然涵蓋進行免 疫檢定之其他试劑及方法。例如，涵蓋諸如在此項技術中 已知且/或可易於製備或優化以作為接合稀釋劑、微粒稀 釋劑及/或作為校準稀釋劑（例如）用於洗滌之各種緩衝液。 例示性接合稀釋劑為用於某些套組（Abbott Laboratories， Abbott Park，IL)中且含有2_(n_嗎啉基）乙磺酸（M]gs)、 ^蛋白質阻斷劑、抗微生物劑及清潔劑之ARCHITECT® 接合稀釋劑。例示性校準稀釋劑為用於某些套組(場 140653.doc •247- 201006485
Laboratories，Abbott Park ’ IL)中之 ARCHITECT® 人類校 準稀釋劑，其包含含有mes、其他鹽、蛋白質阻斷劑及抗 微生物劑之緩衝液。另外’如2008年12月31日申請之美國 專利申請案第61/142,048號描述’（例如）在I-Stat濾筒格式 中，可使用與作為信號放大器之信號抗體連接之核酸序列 可獲得經改良之信號生成。 熟習此項技術者顯而易見，本文中描述之本發明之方法 之其他適合修改及調適為明顯的且可使用適合等價物來進 行，而不背離本發明或本文中揭示之實施例之範疇。現在 ® 已詳細地描述本發明，參照以下實例將更明確地瞭解本發 明，該等實例僅為達成說明之目的而包括在内且不意欲限 制本發明。 實例 實例1 :設計、構築及分析DVD-Ig 實例1.1:用以識別及表徵親本抗體及DVD-Ig之檢定 除非另作說明，否則以下檢定貫穿該等實例用於識別及 表徵親本抗體及DVD-Ig。
實例1.1.1 :用以測定親本抗體及DVD-Ig對於其標靶抗原 之結合及親和力之檢定 實例1.1.1.A:直接結合ELISA 篩選結合所需標靶抗原之抗體之酶聯免疫吸附檢定執行 如下。在4°C 下將高結合ELISA板（Coming Costar # 3369， Acton，ΜΑ)以100微升/孔之磷酸鹽緩衝生理食鹽水（1 OX PBS，Abbott Bioresearch Center，Media Prep# MPS-073， 140653.doc -248- 201006485
Worcester，ΜΑ)中之10微克/毫升之所需標粗抗原（R&D Systems，Minneapolis，MN)或所需標乾抗原細胞外區/FC 融合蛋白（R&D Systems，Minneapolis，MN)或單株小鼠抗 聚組胺酸抗體（R&D Systems # MAB050，Minneapolis， MN)塗布隔夜。各板以含有0.02%吐溫20(Tween 20)之PBS 洗滌四次。在室溫下將各板藉由添加300微升/孔阻斷溶液 (脫脂乾乳粉，各個零售供應商，稀釋至PBS中之2%)而阻 斷歷時1/2小時。在阻斷之後，將各板以含有0.02%吐溫20 ® 之PBS洗滌四次。 或者，將100微升/孔之10 gg/ml之組胺酸（His)標籤之所 需標粗抗原（R&D Systems，Minneapolis，MN)添加至以如 上所述之單株小鼠抗聚組胺酸抗體塗布之ELISA板且在室 溫下培養1小時。各孔以含有0.02%吐溫20之PBS洗滌四 次。 將100微升之在如上所述之阻斷溶液中稀釋之抗體或 DVD-Ig製劑添加至如上所述製備之所需標靶抗原板或所 需標靶抗原/FC融合體板或抗聚組胺酸抗體/His標籤之所需 標靶抗原板且在室溫下培養1小時。各孔以含有0.02%吐溫 20之PBS洗滌四次。 將100微升之10 ng/mL山羊抗人類IgG-FC特異性HRP接 合抗體（Southern Biotech # 2040-05，Birmingham，AL)添 加至所需標靶抗原板或抗聚組胺酸抗體/組胺酸標籤之所 需標靶抗原板之每一孔。或者，將100微升之10 ng/mL山 羊抗人類IgG-κ輕鏈特異性HRP接合抗體（Southern Biotech 140653.doc -249- 201006485 # 2060-05 Birmingham，AL)添加至所需標把抗原/FC融合 體板之每一孔且在室溫下培養1小時。各板以含有0.02%吐 溫20之PBS洗滌4次。 將 100 微升之增強 TMB 溶液（Neogen Corp. #308177，K Blue，Lexington，KY)添加至每一孔且在室溫下培養10分 鐘。將反應藉由添加50 pL 1Ν硫酸終止。將各板在450 nm 之波長下以分光光度法讀取。 表3含有用於直接結合檢定中之抗原之清單。 表4含有在直接結合ELISA檢定中測試之彼等抗體及 DVD-Ig構築體之表示為以nM為單位之EC50的結合資料。 在直接結合ELISA中，有時觀察不到結合，此可能歸因 於當塗布於塑性表面上時標靶抗原上之抗體結合位點經 「遮蔽」或抗原「變形」。DVD-Ig不能結合其標靶亦可歸 因於直接結合ELIS A格式施加於DVD-Ig之空間限制。在直 接結合ELISA格式中不結合之親本抗體及DVD-Ig在其他 ELISA格式（諸如FACS、Biacore或生物檢定）中結合於標靶 抗原。如先前所示，DVD-Ig之不結合亦藉由調整DVD-Ig 之兩個可變區之間的連接子長度來恢復。 表3:用於直接結合ELISA中之抗原
檢定 抗原 供應商名稱 供應商 目錄號 RGMa RGM-A 排斥性導引分子A R&D 2459-RM RAGE RAGE RAGE/FC嵌合體 R&D 1145-RG IL-18 IL-18 IL-18 MBL B003-5 IGF1 IGF-1 IGF-I R&D 291-G1 IGF2 IGF-2 IGF-II R&D 292-G2 IL-Ιβ IL-Ιβ IL-Ιβ R&D 201-LB TNFa TNFa TNFaTNFSFlA R&D 210-TA EGFR EGFR EGF R/FC嵌合體 R&D 1095-ER /FOFc區域融合 140653.doc -250- 201006485 表4:親本抗體與DVD構築體之直接結合elisa 親本抗艎 或 DVD ID N-末端可變區 c-末端可蠻1¾ 直接結合 ELISA N-末端VD EC50fnM) 直接結合 ELISA C-末端VD EC50(nM) AB017 Τί sIF 0.4 4 DVD223 Αβ(序列1) TNF 8.59 DVD224 TNF Αβ(序列1) 0.43 AB032 IL-lb ( 序列1) 5.2 7 DVD225 Αβ(序列1) iL-ib (序列 η 3938.56 DVD226 IL-lb (序列 1) Αβ(序列Π 9.52 AB010 IGF1,2 ' 10.1, 2.93 DVD229 Αβ(序列1) IGF1,2 210.16, 130.87 DVD230 IGF1,2 Αβ(序列I) 4.84,2.44 AB058 IL-18(序列 1) 3.7 7 DVD231 Αβ(序列1) IL-18(序列 1) 50.62 DVD232 IL-18(序列 1) Αβ(序列1) 0.68 AB033 EGFR 〔序列1) 0.6 8 DVD236 EGFR(序列 1) CD-20(序列 l) 0.49 ABO 17 TNF 0.1 9 AB033 EGFR(序列 1) 0.63 DVD289 TNF EGFR(序列 1) 0.32 3.65 DVD290 EGFR(序列 1) TNF 0.54 41.05 AB017 TNF 0.19 AB059 RGMa 0.13 DVD291 TNF RGMa 0.17 0.98 DVD292 RGMa TNF 2.16 775.32 AB060 RAGEl 〔序列1) 1.69 DVD293 RAGE(序列 1) Αβ(序列1) 7.32 DVD294 Αβ(序列1) RAGE(序列 1) 1.53 AB060 RAGE(序列 1) 0.64 AB017 TNF 0.50 DVD295 RAGE(序列 1) TNF 0.48 6.57 DVD296 TNF RAGE(序列 1) 0.33 1.05
所有DVD構築體之結合經維持且可與親本抗體之彼結合 相當。DVD構築體 DVD289、DVD291、DVD294 及 DVD296 之所有N-末端可變區以及C-末端可變區以與親本抗體類似 之高親和力結合。 140653.doc -251 - 201006485
實例 l.l.l.B : Αβ 1-42 ELISA 進行ELISA檢定以篩選結合所需標靶抗原之抗體如下。 在6°C下以稀釋於塗布緩衝液中之1〇〇微升/孔之1 pg/ml Αβ 1-42 塗布 Maxisorb NUNC Immuno板隔夜。以含有0.02% 吐 溫20之PBS將各板洗滌3次。藉由將用於ELISA(Roche)之 阻斷試劑溶解於100 mL水中製備阻斷溶液，且接著在使用 前進一步1:10稀釋。藉由添加265微升/孔之阻斷溶液將板 在室溫下阻斷2小時。阻斷後，以含有0.02%吐溫20之PBS 將板洗滌三次。 將抗體或DVD-Ig在PBST+0.5% BSA中稀釋至100 ng/pL 且連續1:3稀釋。向板添加100微升抗體或DVD-Ig製劑且在 室溫下培養2小時。以含有0.02%吐溫20之PBS將各孔洗滌 3次。 向板之各孔添加1:5〇〇〇稀釋之200微升抗人類POD且在 室溫下培養1小時。以含有0.02%吐溫20之PBS將各板洗滌 3次。 向各孔添加1〇〇微升TMB溶液且培養1〇分鐘《藉由混合 20 mL 100 mM 乙酸鈉 pH 4.9 與 200 pL TMB 溶液（Roche #92817〇6〇)及29.5 0[3°/〇112〇2製備丁]^丑溶液。藉由添加5〇 pL IN硫酸終止反應。在450 nm之波長下分光光度讀取 板。結果展示於表5中。 140653.doc •252· 201006485
表S :親本抗體及DVD構築體之AiS 1-42 ELISA 親本抗體或 DVD ID N-末端可變區 C-末端可變區 Αβ ELISA N末端VD EC50(nM) Αβ ELISA C末端VD EC50(nM) AUfiA^X :列1) 0.0 12 Αβ(序列1) TNF 0.014 f>VD??4 TNF Αβ(序列1) 0.032 AR041 Am :列1) 0.0 12 DVD225 Αβ(序列1) IL-lb(序列 1) 0.016 DVD226 IL-lbi 序列 1) Αβ(序列1) 0.045 AB043 Αβ(月 :列1) 0.0 12 DVD229 Αβ(序列1) IGF 1,2 0.016 DVD230 IGF 1,2 Αβ(序列1) 0.039 AB043 Αβ(月 :列1) 0.0 12 DVD231 Α(3(序列1) IL-18(序列 1) 0.014 DVD232 几-18(序列1) Αβ(序列1) 0.048 AB043 Αβ(^ :列1) 0.0 12 DVD233 Αβ(序列1) IL-6 0.013 AB043 Αβ(序列1) 0.0 12 DVD293 RAGE(序列 1) Αβ(序列1) 0.048 DVD294 Αβ(序列1) RAGE(序列 1) 0.014 AB043 Αβ(^ :列1) 0.0 12 DVD201 7C6 Αβ(序列1) 0.024 DVD202 Αβ(序列1) 7C6 0.017 所有DVD構築體之結合經維持且相當於親本抗體。所有 φ N-末端可變區以與親本抗體類似之高親和力結合。
實例 1.1.1.C : Αβ 20-42 ELISA 進行ELISA檢定以篩選結合所需標靶抗原之抗體如下。 將Αβ 20-42球聚體（gi〇bulomer)及PBS在37°C下預熱1分 鐘。在4°C下以稀釋於PBS中之100微升/孔之2 pg/ml Αβ 20-42球聚體塗布高結合ELISA板（Corning Costar #3369, Acton, ΜΑ)隔夜。以 320微升 /孔之100% superblock PBS緩 衝液（Thermo Scientific, #37515)阻斷板且在室溫下培養45 140653.doc •253- 201006485 分鐘。阻斷後，以含有0.02%吐溫20之PBS將板洗滌三 次。 將抗體或DVD-Ig在PBS中之10% superblock中稀釋至 2000 ng/mL、1000 ng/mL、200 ng/mL、40 ng/mL、8 ng/mL、1.6 ng/mL及 0.3 2 ng/mL。一式三份向板添加 100 微 升抗體或DVD-Ig製劑，且在室溫下培養2小時。以含有 0.02%吐溫20之PBS將各孔洗滌5次。 向板之各孔添加1:40,000稀釋之100微升山羊抗人類HRP 接合抗體（Pierce #31412)且在室溫下培養30分鐘。以含有 0.02°/。吐溫20之PBS將各板洗滌5次。 將 100微升 TMB 溶液（Invitrogen-Zymed ; #00-2023)添加 至各孔且培養5分鐘。藉由添加100 μί 2N硫酸終止反應。 在450 nm之波長下分光光度讀取板。結果展示於表6中。 140653.doc 254- 201006485
表6 :親本抗體及DVD構築艟之Αβ 20-42 ELISA 親本抗體或 DVD ID N-末端可#薛 C-末端可變區 Αβ ELISA N末端VD EC50(nM) Αβ ELISA C末端VD EC50(nM) AB044 Αβ(序列2) 0.3 19 DVD201 Αβ(序列2) Αβ(序列1) 0.397 DVD202 Αβ(序列1) Αβ(序列2) 0.178 所有DVD構築體之結合經維持且可相當於親本抗體。
實例 1.1.1.D :捕獲 ELISA 將 ELISA板（Nunc，MaxiSorp，Rochester，NY)在 4°C 下 ❹ 與抗人類Fc抗體（PBS中之5 pg/ml ，Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)—起培養隔夜。將各板 在洗滌緩衝液（含有0.05%吐溫20之PBS)中洗滌三次，且在 25°C下在阻斷緩衝液（含有1% BSA之PBS)中阻斷1小時。 將各孔洗滌三次，且將連續稀釋之含有0.1% BSA之PBS中 之每一抗體或DVD-Ig添加至各孔中且在25°C下培養1小 時。將各孔洗滌三次，且將經生物素標記之抗原（2 nM)添 加至板且在25°C下培養1小時。將各孔洗滌三次，且在 ® 25°C下與抗生蛋白鏈菌素-HRP(KPL #474-3000，
Gaithersburg，MD) —起培養1小時。將各孔洗蘇三次，且 每孔添加 100 μΐ ULTRA-TMB ELISA(Pierce，Rockford， IL)。在顯色之後，將反應以IN HCL終止且量測450 nM下 之吸光度。結果展示於表7中。 實例1.1.1.E :使用BIACORE技術之親和力測定 140653.doc -255 - 201006485
表7:用於Biacore分析之試刺 檢定 抗原 供應商名稱 供應商 目錄號 IL-lp 重組人類IL-Ιβ R&D systems 201-LB TNFa 重組人類 TNF-a/TNFSFl A R&D systems 210-TA EGFR 重組人類EGF受體 R&D systems 1095-ER ECD=細胞外區 /FC=抗原/IgG FC區融合蛋白 BIACORE方法： BIACORE 檢定（Biacore, Inc, Piscataway，NJ)藉由結合速 率及脫離速率常數之動力學量測來測定抗體或DVD-Ig之 親和力。抗體或DVD-Ig與標靶抗原（例如經純化之重組標 靶抗原）之結合在25°C下藉由Biacore® 1000或3000儀器 (Biacore® AB，Uppsala, Sweden)使用電泳HBS-EP(10 mM HEPES[pH 7.4] > 150 mM NaCl ' 3 mM EDTA及 0.005%界 面活性劑P20)藉由基於表面電漿共振之量測來測定。所有 化學品自Biacore® AB(Uppsala，Sweden)獲得或另外來自如 本文中描述之不同來源。例如，約5000 RU之在10 mM乙 酸鈉（卩114.5)中稀釋之25 08/1111山羊抗小鼠1§〇、（[〇丫）、片 段特異性多株抗體（Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL) 使用標準胺偶合套組根據製造商說明書及程序直接固定於 CM5研究級生物感應器晶片。生物感應器表面上之未反應 的部分以乙醇胺阻斷。流槽2及4中之改質羧曱基聚葡萄糖 表面用作反應表面。流槽1及3中不具有山羊抗小鼠IgG之 未改質羧曱基聚葡萄糖用作參考表面。對於動力學分析， 得自1:1朗谬爾結合模型之速率方程藉助於Biaevaluation 4.0.1軟體同時擬合於所有八個注射液之締合及解離相（使 140653.doc -256- 201006485 用整體擬合分析）。將經純化之抗體或DVD-Ig稀釋於 HEPES-緩衝鹽水中以便捕獲於山羊抗小鼠IgG特定反應表 面。將待捕獲為配位體之抗體或DVD-Ig(25 pg/ml)以5 ml/min之流動速率注射於反應基質上。締合及解離速率常 數kon (Μ、·1)及koff (s·1)在25 μΐ/min之連續流動速率下測 定。藉由在10-200 nM範圍内之不同抗原濃度下進行動力 學結合量測來得出速率常數。隨後藉由下式：Kr^k^f/ka 由動力學速率常數計算抗體或DVD-Ig與標靶抗原之間的 ® 反應之平衡解離常數（Μ)。結合記錄為時間函數且計算動 力學速率常數。於此檢定中，可量測到快至ΙΟ6 Μ、·1之結 合速率及慢至10'6s_1之脫離速率。結果展示於表8中。 表8:親本抗體及DVD構築體之BIACORE分析 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可 變區 (VD) c末端可變 區 (VD) k〇n (M-ls-1) k〇ff (s-D KD (M) ABO 17 TNF 3.37E+06 9.57E-05 2.84E-11 DVD223 TNF 3.80E+04 1.04E-04 2.74E-09 DVD224 TNF 1.03E+06 8.60E-05 8.36E-11 ABO 17 TNF 3.37E+06 9.57E-05 2.84E-11 AB033 EGFR(序列 1) 7.81E+05 1.30E-03 1.67E-09 DVD289 TNF 1.25E+06 8.82E-05 7.05E-11 DVD289 EGFR (序列1) 8.73E+04 6.77E-04 7.76E-09 DVD290 EGFR (序列1) 1.06E+06 1.31E-03 1.23E-09 DVD290 TNF 1.74E+06 1.45E-04 8.31E-11 AB017 TNF 3.37E+06 9.57E-05 2.84E-11 AB059 RGMA 9.52E+05 6.09E-04 6.40E-10 DVD291 TNF 1.74E+06 1.45E-04 8.31E-11 DVD291 RGMA 3.89E+04 5.04E-04 1.30E-08 DVD292 RGMA 1.72E+06 5.23E-04 3.04E-10 DVD292 TNF 5.66E+04 1.25E-04 2.21E-09 AB017 TNF 3.37E+06 9.57E-05 2.84E-11 DVD295 TNF 3.90E+05 1.04E-03 2.68E-09 DVD296 TNF 1.35E+06 7.40E-05 5.48E-11 140653.doc -257- 201006485 藉由Biacore技術表徵之所有DVD-Ig構築體之結合經維 持且可與親本抗體之彼結合相當。所有N-末端可變區以與 親本抗體類似之高親和力結合。 實例1.1.2 :用以測定親本抗體及DVD-Ig之功能活性之檢定 實例1.1.2.A:細胞激素生物檢定 含有抗細胞激素或抗生長因子序列之抗細胞激素或抗生 長因子親本抗體或DVD-Ig抑制或中和標靶細胞激素或生 長因子生物活性之能力係藉由測定抗體或DVD-Ig之抑制 潛力來分析。例如，可使用抗IL-4抗體抑制IL-4介導之IgE 產生之能力。例如，將人類初始B細胞自周圍血液中分 離，分別地將白血球層藉由Ficoll-paque密度離心分離，接 著藉由對於人類slgD FITC標記之山羊F(ab)2抗體具有特異 性之 MACS 珠粒（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach， Germany)，接著抗FITC MACS珠粒磁性分離。將磁性揀選 之初始B細胞調整至XVI 5中之3χ105個細胞/亳升且在10天 培養期間在37°C下在5% C02存在下以96孔板每孔100 μία 6x6陣列塗布於由PBS填充孔圍繞之板中心。每一待測試 之抗體各自製備一個板，其由各自具有未誘導及經誘導之 對照之3個孔組成且將起始於7 pg/ml且以3倍稀釋運作降至 29 ng/ml最終濃度之一式五份重複抗體滴定液添加於50 μΐ 四倍濃縮預稀釋液中。為誘導IgE產生，將各自50 μΐ之20 ng/ml rhIL-4加上0.5 pg/ml最終濃度之抗CD40單株抗體 (Novartis，Basel，Switzerland)添加至每一孔，且在培養 期結束時藉由標準夾心ELISA方法測定IgE濃度。 140653.doc -258 - 201006485 實例1.1.2.B:細胞激素釋放檢定 分析親本抗體或DVD-Ig導致細胞激素釋放之能力。藉 由靜脈穿刺自三個健康供體取出周圍血液至肝素化 vacutainer管中。將全jk以RPMI-1 640培養基1:5稀釋且以 0.5毫升/孔置於24孔組織培養板中。將抗細胞激素抗體（例 如抗IL-4)稀釋至RPMI-1640中且以0.5毫升/孔置於板中以 得到200、100、50、10及1 pg/mL之最終濃度。全血在培 養板中之最終稀釋度為1:10。LPS及PHA作為細胞激素釋 © 放之陽性對照以2 pg/mL及5 pg/mL最終濃度添加至獨立孔 中。多株人類IgG用作陰性對照抗體。實驗以一式兩份進 行。將各板在37°C下在5% C02下培養。24小時後將各孔内 容物轉移至試管中且在1200 rpm下旋轉5分鐘。收集無細 胞上清液且冷凍用於細胞激素檢定。將在板上及在管中留 下之細胞以0·5 mL溶解溶液溶解，且置於-20°C下且解 凍。添加0.5 mL培養基（以使得體積達到與無細胞上清液 試樣相同之水準）且收集細胞製劑且冷凍用於細胞激素檢 參 定。藉由ELIS A檢定無細胞上清液及細胞溶解產物之細胞 激素水準，例如 IL-8、IL-6、IL-Ιβ、IL-1RA或 TNF-α之水 準。 實例1.1.2.C:細胞激素交叉反應性研究 分析針對所關注之細胞激素之抗細胞激素親本抗體或 DVD-Ig與其他細胞激素交叉反應之能力。將親本抗體或 DVD-Ig固定於Biacore生物感應器基質上。藉由首先以100 mM N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)及400 mM N-乙基-N’-(3-二甲 140653.doc -259- 201006485 參 基胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)活化基質上之羧基 而將抗人類Fc mAb經由游離胺基與聚葡萄糖基質共價鍵 聯。將約5〇41^之在乙酸鈉（!^4.5)中稀釋之25 0§/11^濃度 之每一抗體或DVD-Ig製劑注射於活化生物感應器且蛋白 質上之游離胺直接與活化羧基結合。通常，固定5〇〇〇共振 單位（RU)。藉由注射1 μ乙醇胺來滅活未反應的基質EDC_ 酯。藉由使用標準胺偶合套組固定人類Ig(J1/K而將第二流 槽製備為參考標準。使用CM生物感應器晶片來執行spR量 測。將待要於生物感應器表面上分析之所有抗原稀釋於含 有0·01ο/〇Ρ20之HBS-EP電泳緩衝液中。 為檢驗細胞激素結合特異性，將過量的所關注之細胞激 素（100 ηΜ，例如可溶重組人類者）注射於抗細胞激素親本 抗體或固定化生物感應器表面（5分鐘接觸時間）。 在注射所關注之細胞激素之前且緊接著其後，使單獨删- EP緩衝液流經每—流槽。採用基線與對應於完成細胞激素 馨 注射之後約3〇秒之時點之間的信號之淨差異代表最終結合 值。又，反應以共振單位來量測。若觀察到結合事件，則 在注射下-試樣之前使用10 mM HC1使生物感應器基質再 生，否則將電泳緩衝液注射於基質上。人類細胞激素（例 如1 !"、IL-9、IL_10、il_u、il_12、ili3、ili5、il_ 16、IL_17、IL_18、il_19、IL 2〇、il_22、“π”、 考表1 i™F仪勝7)亦同時注射於固定化小鼠1_〖參 錄任何非特異性結合本底。藉由製備參考及 140653.doc 201006485 反應表面，Biacore可自動地自反應表面資料減去參考表面 資料以便消除大多數折射率變化及注入雜訊。因此，可確 定歸因於抗細胞激素抗體或DVD-Ig結合反應之真實結合 反應。 當將所關注之細胞激素注射於固定化抗細胞激素抗體 時’觀察到顯著結合。1 〇 mM HC1再生完全移除所有非共 價締合之蛋白質。感應圖譜之檢查展示固定化抗細胞激素 抗體或DVD-Ig與可溶細胞激素之結合為強力且穩固的。 ® 在以所關注之細胞激素確認預期結果之後，分別地對於每 一抗體或DVD-Ig來測試其餘重組人類細胞激素之組。記 錄每一注射循環之抗細胞激素抗體或DVD-Ig結合或未經 結合之細胞激素之量。使用來自三個獨立實驗之結果確定 每一抗體或DVD-Ig之特異性概況。選擇與所關注之細胞 激素預期結合且不結合於任何其他細胞激素的抗體或 DVD-Ig 〇 實例:組織交又反應性 ❹ 如下所述，組織交又反應性研究以三個階段進行，其中 第一階段包括32個組織之冷凍切片，第二階段包括多達38 個組織，且第三階段包括來自3個無關成人之額外組織。 研究通常以兩個劑量水準來進行。 階段1 ·將人類組織（來自由屍檢或活組織檢查所獲得之 來自一個人類供體之32個組織（通常：腎上腺、胃腸道、 則列腺、膀胱、心臟、骨絡肌、血細胞、腎臟、皮膚、骨 趙、肝、脊髓、乳房、肺、脾臟、小腦、淋巴結、睪丸、 140653.doc -261 - 201006485 大腦皮質、卵巢、胸腺、結腸、胰腺、曱狀腺、内皮、曱 狀旁腺、輸尿管、眼睛、垂體、子宮、輸卵管及胎盤））之 冷凍切片（約5 μηι)在物鏡上固定且乾燥。使用抗生物素蛋 白-生物素系統執行組織切片之過氧化酶染色。 階段2·將人類組織（來自由屍檢或活組織檢查所獲得之 來自3個無關成人之38個組織（包括腎上腺、血液、血管、 月髓·、小腦、大腦、子宮頸、食管、眼睛、心臟、腎臟、 大腸、肝、肺、淋巴結、乳房乳腺、卵巢、輸卵管、胰 腺、甲狀旁腺、周邊神經、垂體、胎盤、前列腺、唾液_ 腺、皮膚、小腸、脊髓、脾臟、胃、橫紋肌、睪丸、胸 腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管、膀胱及子宮之冷凍切片 (約5 μιη)在物鏡上固定且乾燥。使用抗生物素蛋白生物素 系統執行組織切片之過氧化酶染色。 階段3 :將獼猴組織（來自由屍檢或活組織檢查所獲得之 來自3個無關成年猴之38個組織（包括腎上腺、血液、企 管、骨髓、小腦、大腦、子宮頸、食管、眼睛、心臟、腎 臟、大腸、肝、肺、淋巴結、乳房乳腺、卵巢、輸卵管、⑩ 胰腺、甲狀旁腺、周邊神經、垂體、胎盤、前列腺、唾液 腺、皮膚、小腸、脊髓、脾臟、胃、橫紋肌、睪丸、胸 腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管、膀胱及子宮））之冷凍切片 (約5 μιη)在物鏡上固定且乾燥。使用抗生物素蛋白，生物素 系統執行組織切片之過氧化酶染色。 將抗體或DVD-Ig與經生物素標記之二次抗人類一起 培養且發展為免疫複合物。將抗體或DVD-Ig最終濃产為2 140653.doc -262- 201006485 及10 pg/mL之免疫複合物添加於物鏡上之組織切片上且隨 後使組織切片與抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶套組反應 30分鐘。隨後，施加DAB(3,3'-二胺基聯苯胺）（過氧化酶反 應之受質）歷時4分鐘以便組織染色。將抗原-瓊脂糖珠粒用 作陽性對照組織切片。標靶抗原及人類血清阻斷研究充當 額外對照。將抗體或DVD-Ig之最終濃度為2及10 pg/mL之 免疫複合物與標靶抗原（最終濃度100 gg/mL)或人類血清 (最終濃度10%)—起預培養30分鐘，且隨後添加於物鏡上 ® 之組織切片上且隨後使組織切片與抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶套組反應30分鐘。隨後，施加DAB(3,3'-二胺基 聯苯胺）（過氧化酶反應之受質）歷時4分鐘以便組織染色。 基於所討論之標靶抗原之已知表現，將任何特異性染色 判定為預期（例如與抗原表現一致）或非預期反應性。將任 何判定為特異性之染色關於強度及頻率進行計分。階段 2(人類組織）與階段3(獼猴組織）之間的組織染色判定為類 似或不同的。 實例1.1.2.E :藉由VEGF親本抗體及DVD-Ig構築體抑制 HUVEC增生/存活 在塗布以供檢定之前，將正常人臍血管内皮細胞或 HUVEC(繼代 2-6)維持於補充有£01^[-28111§16(511〇13(1^〇112&-Clonetics ， Walkersville ， MD ，#CC-4176)之 EBM-2 (Lonza-Clonetics，Walkersville，MD)中。在膠原蛋白塗布 之黑色96孔板上，在不存在生長因子的情況下，將 HUVEC細胞以10,000個細胞/孔塗布於具有0.1% FBS之 140653.doc -263- 201006485 (100 μ1)ΕΜΒ-2中。第二天，在不存在生長因子之情況 下，培養基經〇·1% FBS置換。第二天，培養基經1〇〇 μΐ ΕΜΒ-2(無生長因子或血清）置換且培養四小時，然後添加 VEGF及抗體/DVD-Ig。將抗VEGF單株抗體或DVD-Ig(在67 nM、6.7 nM及0.67 nM之最終濃度下）稀釋於具有0.1% bsA 之EMB-2中且在25°C下以50 μΐ與重組人類VEGF165(50 ng/ml)—起預培養1小時。隨後將抗體/DVD-Ig及VEGF混 合物添加至細胞（50 μΐ)中，且將各板在37。(：下在濕潤、5% C〇2氛圍中培養72小時。藉由使用ATPlite套組（Perkin © Elmer，Waltham，ΜΑ)根據製造商說明書評估ATP水準來 間接量測細胞存活/增生。 實例1.1.2.F : IL-la/p生物檢定及中和檢定 在100 μί體積中以1.5-2X104個細胞/孔塗布MCR5細胞且 在37°C、5% C02下培養隔夜。在完全MEM培養基中製備 抗體之20 pg/mL操作儲備液（4倍濃度）。於Marsh稀釋板中 在完全MEM中進行8點連續稀釋（5 pg/mL_0.0003 gg/mL)。 Ο 一式四份向96孔V型底（Costar# 3894)板添加65 μι/孔之各 抗體稀釋液’且亦添加65 μί 200 pg/mL之IL-la或IL-Ιβ溶 液或含有50 Pg/mL IL-la與IL-Ιβ之溶液的65 μι混合溶 液。對照孔接受 65 μι 200 pg/mL IL-la 或 IL-Ιβ或50 pg/mL 混合Ιί-1α/β(4倍濃度）加65 MEM培養基，且培養基對 照孔接受130 培養基）。培養丨小時後，將1〇〇叫Ab/Ag 混合物添加至MRC5細胞。所有孔體積等於200 μι。所有 培養板試劑均呈1X濃度。培養1 6-20小時後，將孔内容物 140653.doc -264- 201006485 (150 μ!〇轉移至96孔圓底板（Costar# 3799)且置於-20°C冷凍 相中。藉由使用人類IL-8 ELISA套組（R&D Systems, Minneapolis, MN)或hIL-8化學發光套組（MDS)測試上清液 之hIL-8含量。藉由計算相對於IL-Ια、IL-Ιβ或IL-Ια/β單 獨對照值之抑制百分比來測定中和效能。結果展示於表9 中。 表9 : IL-Ιβ親本抗體及DVD-Ig構築體之IL-Ιβ中和檢定 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) C末端可變區 (VD) Ν 末端 VD IL-Ιβ 中和檢定EC50 ηΜ C末端VD IL-Ιβ中和檢 定 EC50 ηΜ AB032 IL-Ιβ 0.05 DVD225 Αβ(序列1) IL-Ιβ 12.74 DVD226 IL-Ιβ Αβ(序列1) 0.028 在N末端或C末端位置含有來自AB032之VD的所有DVD-Ig在MRC5IL-lIa/p中和檢定中展示中和作用。 實例 1.1.2.G:中和huTNFa 使L929細胞生長至半長滿密度且使用0.05%胰蛋白酶 (0化〇〇#253 00)收集。以？68洗滌細胞，計數且以1£6個細 胞/mL再懸浮於含有4 pg/mL放線菌素D之檢定培養基中。 將細胞以50 μί之體積及5E4個細胞/孔接種於96孔板 (Costar#3599)中。將DVD-IgTM及對照IgG在檢定培養基 中稀釋至4倍濃度且進行連續1:3稀釋。將huTNFa在檢定培 養基中稀釋至400 pg/mL。將抗體試樣（200 μ!〇按1:2稀釋 方案添加至huTNFa(200 μΙ〇且使其在室溫下培養0.5小 時。 將100 μί DVD-IgTM/huTNFa溶液添加至塗布細胞達1〇〇 140653.doc -265· 201006485 pg/mL huTNFa及 25 nM-0.00014 nM DVD-IgTMi 最終濃 度。將各板在37°C、C02下培養20小時。為量化生存力， 自各孔移除100 μί且添加10 μι WST-1試劑（Roche目錄號 11644807001)。將各板在檢定條件下培養3.5小時，在500 xg下離心且將75 pL上清液轉移至ELISA板（Costar目錄號 3369)〇在8戶6(；1；1'〇1113\190£1^18八板讀取器上在〇〇 420-600 nm讀取各板。表10提供結果。 表10 : huTNFa親本抗體及DVD-Ig構築體之HuTNFa中和 檢定 親本抗逋或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) C末端可變區 (VD) N 末端 VDTNFa 中和檢定EC50 nM C末端VDTNFg[中 和檢定EC50 nM AB017 TNF 0.077 DVD224 TNF Αβ(序列1) 0.142 DVD291 TNF RGMa 0.248 DVD295 RAGE TNF 0.841 DVD296 TNF RAGE 0.158 DVD289 TNF EGFR(序列 1) 0.122 在N末端或C末端位置含有來自AB017之VD的所有DVD-Ig在TNFa中和檢定中展示中和作用。 實例1.1.2.H: IL-6誘導之pSTAT3檢定 在 DMEM 中以 2 mM 1-糙醯胺酸、10 mM HEPES、100 U/mL Pen/strep、1.5g/L碳酸氫納、4.5 g/L 葡萄糖、1 mM 丙酮酸鈉、10% FBS及2 ng/mL GM-CSF培養TF-1細胞。在 10 μί體積中以1.5-2X105個細胞/孔塗布TF-1細胞且在檢定 培養基（完全DMEM減GM-CSF)中在37°C、5% C02下培養 隔夜。將細胞塗布於96½孔白色檢定板中。在PBS中製備 140653.doc -266- 201006485 抗體之500 pg/mL操作儲備液（4倍濃度）。於Marsh稀釋板中 在檢定培養基中1:5連續稀釋抗體及DVD-Ig。向含有細胞 之96 1/2白色檢定板一式三份添加5 pL/孔之各抗體稀釋液。 在冰上將細胞及抗體或DVD-Ig預培養30分鐘。在無内毒 素之D-PBS(0.1% BSA)中製備IL-6之10 pg/mL儲備液且以 檢定培養基製備100 ng/mL之操作儲備液（4倍濃度）。將5 pL/孔之100 ng/mL IL-6添加至各孔。將各板在37°C下培養 3 0分鐘。藉由向所有孔添加5 pL 5倍細胞溶解緩衝液溶解 ® 細胞且將板在室溫下震盪10分鐘。在-20°C下冷凍板且進 行 pSTAT3 SureFire檢定（Perkin Elmer)。 在室溫下解凍各板且向各孔添加含有α筛選受體珠粒 (Alpha Screen Acceptor Beeds)之30 μι/孔之反應緩衝液加 活化缓衝液混合物（40份反應緩衝液、10份活化緩衝液及1 份受體珠粒）。以箔密封板以保護其不受光照射，且將其 在37°C下輕輕攪拌2小時。向各孔添加含有α篩選供體珠粒 之稀釋緩衝液（12.5 μί/孔）（20份稀釋緩衝液對1份供體珠 粒）。以箔密封板，且將其在37°C下輕輕攪拌2小時。使板 升至室溫，且在α篩選板讀取器上讀數。 實例1.1.2.1 :腫瘤受體單株抗體或DVD-Ig之活體外生長抑 制作用 將20 gL稀釋於D-PBS-BSA(具有0.1% BSA之達爾伯克磷 酸鹽緩衝生理食鹽水）中之腫瘤受體單株抗體或DVD-Ig添 加至人類腫瘤細胞，其最終濃度為180 pL中0.01 pg/mL-100 pg/mL。將各板在37°C下在濕潤、5% C02氛圍中培養3 140653.doc -267- 201006485 天。使用MTS試劑’根據製造商說明書（Pr〇inega, Madison, WI)量化各孔中活細胞之數目以測定腫瘤生長抑 制百分比。將未經抗體處理之孔用作〇%抑制之對照，而 不具有細胞之孔視為展示1 〇〇%抑制。 實例1.1.2.J :親本或DVD-Ig抗體在活體外之殺雎瘤作用 可分析結合於腫瘤細胞上之標靶抗原之親本抗體或 DVD-Ig的殺腫瘤活性。簡言之，將親本抗體或DVD-Ig稀 釋於D-PBS-BSA(具有0_1% BSA之達爾伯克氏磷酸鹽緩衝 生理食鹽水）中且添加至人類腫瘤細胞中，最終濃度為〇.〇 1 © pg/mL至 100 pg/mL(200 μί)。將各板在37°C 下在濕潤、5% C02氛圍中培養3天。每一孔中之活細胞數目係使用MTS試 劑根據製造商說明書（Promega，Madison，WI)定量以測定 腫瘤生長抑制之百分比。未經抗體處理之孔用作0%抑制 之對照，而不具有細胞之孔視為展示100%抑制。 對於細胞凋亡之評估，卡斯蛋白酶-3活化係藉由以下方 案測定：在室溫下伴以震盪將96孔板中之抗體處理之細胞 溶解於 120 μί之 lx溶解緩衝液（1.67 mM Hepes(pH 7.4)、7 ® mM KC1、0.83 mM MgCl2、0.11 mM EDTA、0.11 mM EGTA、0.57% CHAPS、ImM DTT、lx蛋白酶抑制劑混合 物鍵劑；無 EDTA ; Roche Pharmaceuticals，Nutley，NJ) 中歷時20分鐘。在細胞溶解之後，添加80 μί之卡斯蛋白 酶-3 反應緩衝液（48 mM Hepes(pH 7.5)、252 mM蔗糖、 0.1% CHAPS、4 mM DTT及 20 μΜ Ac-DEVD-AMC受質； Biomol Research Labs, Inc.，Plymouth Meeting，PA)且將 140653.doc • 268- 201006485 各板在37°C下培養2小時。將各板在1420 VICTOR Multilabel Counter (Perkin Elmer Life Sciences » Downers Grove，IL)上使用以下設置來讀取：激發=360/40、發射 =460/40。相對於同型抗體對照處理之細胞，來自抗體處 理細胞之螢光單位的增加指示細胞凋亡。 實例1.1.2.K :藉由親本抗體及DVD-Ig構築體抑制細胞增生 在96孔碟中，將U87-MG人類神經膠質瘤腫瘤細胞以100 μι中2,000個細胞/孔塗布於補充有5%胎牛血清之RPMI培 ® 養基中，且在37°C、5% C02下培養隔夜。第二天，將細胞 以連續稀釋之抗體或DVD-Ig(0.013 nM至133 nM劑量範圍） 處理，且在37°C下在濕潤、5% C02氛圍中培養5天。細胞 存活/增生係藉由使用ATPlite套組（Perkin Elmer， Waltham，ΜΑ)根據製造商說明書評估ATP水準來間接量 測。 實例1.1.2.L : VEGF親本抗體及DVD-Ig構築體防止 VEGF165舆VEGFR1之相互作用
在 4°C 下將 ELISA板（Nunc，MaxiSorp，Rochester，NY) 與含有重組VEGFR1細胞外區-Fc融合蛋白（5 pg/ml，R&D systems，Minneapolis，MN)之100 μι PBS — 起培養隔夜。 將各板在洗滌緩衝液（含有〇·〇5%吐溫20之PBS)中洗滌三 次，且在25°C下在阻斷緩衝液（含有1% BSA之PBS)中阻斷 1小時。在25°C下將連續稀釋之存於含有0.1% BSA之PBS 中之每一抗體/DVD-Ig與50 μΐ之2 nM經生物素標記之VEGF 一起培養1小時。隨後將抗體/DVD-Ig·生物素標記之VEGF 140653.doc •269· 201006485 混合物（100 μΐ)添加至VEGFRl-Fc塗布之孔且在25°c下培 養10分鐘。將各孔洗滌三次，且隨後在25°C下與100 μΐ之 抗生蛋白鏈菌素-HRP(KPL #474-3000，Gaithersburg， MD)—起培養1小時。將各孔洗滌三次，且每孔添加100 μΐ 之 ULTRA-TMB ELISA(Pierce，Rockford，IL)。在顯色之 後將反應以IN HCL終止且量測450 nM下之吸光度。 實例1.1.2.M :受髏磷酸化經親本抗體或DVD-Ig構築艟之 活«外抑制 將人類癌細胞以40,000細胞/孔在180 μΐ無血清培養基 (DMEM+0.1% BSA)中塗布至96孔板，且在37°C、5% C02 下培養隔夜。以100 μΐ/孔之受體捕獲Ab(4 pg/ml最終濃度） 塗布Costar EIA板（Lowell, MA)，且在室溫下培養隔夜， 同時震盪。次日，洗滌受體抗體塗布之ELISA板（以 PBST=PBS 中 0.05% Tween 20，pH 7.2-7.4洗滌三次），且 添加 200 μΐ 阻斷溶液（PBS 中 1% BSA、0.05% NaN3，pH 7.2-7.4)以在室溫下於震盪器上阻斷2小時。共培養人類腫 瘤細胞與抗體或DVD-Ig與配為體。將在D-PBS-BSA(具有 0.1% BS A之達爾伯克氏磷酸鹽缓衝生理食鹽水）中稀釋之 單株抗體或DVD-Ig在0.01 pg/ml-100 pg/ml之最終濃度下 添加至人類癌細胞中。同時將生長因子在1-100 ng/mL之 濃度（200 μ!〇下添加至細胞中，且將細胞在37°C下在濕 潤、5°/。C02氛圍中培養1小時。將細胞溶解於120微升/孔 之冷細胞提取緩衝液（10 mM Tris(pH 7_4)、100 mM NaC卜 1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM NaF、1 mM原釩 140653.doc -270- 201006485 酸鈉、1%曲拉通X-100、10%甘油、0.1% SDS及蛋白酶抑 制劑混合物）中，且在4°c下伴以震盪而培養20分鐘。將細 胞溶解產物（100 μΐ)添加至ELISA板，且在4°C下伴以輕微 震盪培養隔夜。第二天，洗滌ELISA板，且添加微升/ 孔之 pTyr-HRP偵測 Ab(p-IGF1RELISA套組，R&D System # DYC17 70，Minneapolis，MN)，且在 25 °C 下在黑暗中將各 板培養2小時。按照製造商說明書將各板顯影以測定磷酸 化° β 實例1.1.2.Ν : VEGFR2(KDR)磷酸化經VEGF親本抗艟及 DVD-Ig構築體之抑制 以20,000細胞/孔（100 μΐ)在96孔板中在補充有1〇°/〇 FBS 之DMEM中塗布表現人類VEGFR2(KDR)之ΝΙΗ3Τ3細胞。 次日，以DMEM洗滌細胞兩次，且在無FBS之DMEM中血 清饑餓3小時。在25°C下，預培養稀釋於具有〇·1% BSA之 DMEM中的抗-VEGF親本抗體或DVD-Ig(最終濃度7 ηΜ、 6.7 ηΜ及 0.67 ηΜ)與重組人類 VEGF165(50 ng/ml)達 1 小時。 φ 隨後將此等抗體/DVD-Ig及VEGF混合物添加至細胞中且將 各板在37°C下在濕潤、5% C02氛圍中培養10分鐘。將細胞 以冰冷PBS洗滌兩次且藉由添加100微升/孔之補充有0.1% NP40 之細胞溶解緩衝液（Cell Signaling，Boston，MA)溶 解。匯合雙重試樣且將170 μΐ添加至先前以抗VEGFR2抗 體（R&D systems，AF357，Minneapolis，ΜΝ)塗布之 ELISA板之孔中且在25°C下伴以輕微震盪培養兩小時。將 孔以洗滌緩衝液（含有0.05%吐溫20之PBS)洗滌五次，且在 140653.doc -271 - 201006485 25°C下與50 μΐ之經生物素標記之抗磷酸酪胺酸抗體之 1:2000 稀釋液（4G10; Millipore, Billerica，ΜΑ) —起培養 1 小時。將孔以含有0.05%吐溫20之PBS洗滌五次，且隨後 在25°C下與抗生蛋白鏈菌素-HRP(KPL #474-3000, Gaithersburg, MD) —起培養1小時。將孔以抗生蛋白鏈菌 素-HRP(KPL #474-3000, Gaithersburg，MD)洗滌三次。將 孔以含有0.05%吐溫20之PBS洗滌三次’且每孔添加100 μΐ 之ULTRA-TMB ELISA(Pierce，Rockford，IL)。在顯色之後 將反應以IN HCL終止且量測450 nM下之吸光度。 實例1.1.2.0 : DVD-Ig對人類癌皮下側翼異種移植物生長 之功效 使A-43 1人類表皮樣癌細胞在組織培養燒瓶中活體外生 長至99%生存力、85%長滿。在研究第0天’ 19-25公克之 SCID雌性小鼠（Charles Rivers Labs，Wilmington, MA)在其 由側翼中皮下注射有1 x 1 〇6人類腫瘤細胞（1:1 matrigel)。在 小鼠尺寸匹配具有約2〇〇至320 mm3之平均腫瘤體積的組 後’啟始投與（IP、QD、3次/週）人類IgG對照或DVD-Ig。 在腫瘤細胞注射後約第1 〇天開始每週兩次量測腫瘤。 實例1.1.2.P:如藉由流式細胞儀所評估之單株抗艘舆人類 贐瘸細胞株表面之結合 將過度表現所關注之細胞表面抗原之穩定細胞株或人類 腫瘤細胞株自組織培養燒瓶採集且再懸浮於含有5%胎牛 血清之填酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)(PBS/FBS)中。在染色 之前，將人類腫瘤細胞在冰上與PBS/FCS中之5吨/ml之 140653.doc -272· 201006485 (100 μΐ)人類IgG —起培養。在冰上將1-5x105個細胞與 PBS/FBS中之抗趙或DVD-Ig(2 pg/ml) —起培養30-60分 鐘。將細胞洗務兩次且添加100 μΐ之F(alT)2山羊抗人類
IgG、Fey-蒸紅蛋白（PBS中之1:200稀釋液）(Jackson
ImmunoResearch，West Grove，PA，目錄號 109-116-170)。在冰上培養30分鐘之後，將細胞洗滌兩次且再懸浮 於PBS/FBS中。使用 Becton Dickinson FACSCalibur(Becton Dickinson，San Jose，CA)量測榮光。
表11展示DVD-Ig構築體之FACS數據。幾何平均值為n個 螢光信號之乘積〇1 xa2xa3""an)之η次根。藉由對數轉換 數據’幾何平均值係用以正規化數據分布之權重。下表含 有親本抗體及DVD-Ig構築體之FACS幾何平均值。 表11 : DVD-Ig構築想之螢光活化細胞揀選
C末端可變區 (VD) FACS幾何平 均值N末端 FACS幾何平 均值C末端 192.34 48.84 239.34 DVD289 DVD290 TNF EGFR(序列 2) EGFR(序列 2) TNF EGFR(序列 2)
親本抗體或 DVD-Ig ID AB033 N末端可變區 (VD) 所有DVD展示與其細胞表面標乾之結合。DVD^N_末端 區如同親本抗體-樣或比親本抗體更好地結合其在細胞表 面上之標把。結合可藉由調整連接子長度而恢復或改良。 實m.u.Q··如藉由流式细胞儀所評估之親本受艎抗想及 DVD-Ig構築鱧與人類腫瘤細胞株表面之結合 將過度表現細胞表面受紅較細祕或人類腫瘤細胞 140653.doc •273· 201006485 株自組織培養燒瓶採集且再懸浮於含有1%胎牛血清之達 爾伯克氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水（DPBS)(DPBS/FCS)中。 在冰上將1-5χ105個細胞與DPBS/FCS中之100 μί抗體或 DVD_Ig(10 ug/mL)—起培養30-60分鐘。將細胞洗滌兩次 且添加50 μΐ之山羊抗人類IgG-藻紅蛋白（DPBS/BSA中之 1:50稀釋液）（Southern Biotech Associates，Birmingham， AL目錄號2040-09)。在冰上培養30-45分鐘之後，將細胞 洗滌兩次且再懸浮於125微升/孔之DPBS/FCS中之1%甲醛 中。使用 Becton Dickinson LSRII(Becton Dickinson，San Jose，CA)量測螢光。 實例1·2:生成所關注之人類抗原之親本單株抗體 能結合於所關注之人類抗原及其變異體且中和所關注之 人類抗原及其變異體之親本小鼠mAb如下獲得： 實例1.2.A:以所關注之人類抗原使小鼠免疫 在第1天，將與完全弗氏佐劑或Immunoeasy佐劑 (Qiagen，Valencia，CA)混合之20微克重組純化人類抗原 (例如IGF 1，2)皮下注射至五個6-8週齡Balb/C、五個C57B/6 小鼠及五個AJ小鼠中。在第24天、第38天及第49天’將與 不完全弗氏佐劑或Immunoeasy佐劑混合之20微克之重組純 化人類抗原變異體皮下注射至相同小鼠中。在第84天或第 112天或第144天’將1 Μ·8所關注之重組純化人類抗原向小 鼠靜脈内注射。 實例1.2.B :生成融合瘤 將自實例1 ·2·Α中描述之經免疫小鼠獲得之脾細胞根據 140653.doc -274- 201006485 在 Kohler，G.及 Milstein (1975) Nature, 256:495 中描述之既 定方法與SP2/0-Ag-14細胞以5:1之比率融合以生成融合 瘤°在96孔板中，將融合產物以每孔2.5xl〇6個脾臟細胞之 密度塗布於含有偶氮絲胺酸及次黃嘌呤之選擇培養基中。 融合後七至十天，觀察到巨觀融合瘤集落❶將來自每一含 有融合瘤集落之孔之上清液藉由ELISA測試所關注之抗原 之抗體的存在（如實例11.1. A中描述）。隨後測試展示抗原 特異性活性之上清液之活性（如實例1.1.2之檢定中描述）， ® 例如在諸如實例1 · 1 ·2.Ι中描述之彼生物檢定之生物檢定中 中和所關注之抗原之能力。 實例1.2.C :識別及表徵所關注之人類標靶抗原之親本單 株抗體 實例1.2.C.1 :分析親本單株抗髏中和活性 檢定融合瘤上清液之親本抗體之存在，該等抗體結合根 據實例1.2.Α及1.2.Β生成之所關注之抗原’且亦能夠結合 ❹ 所關注之抗原之變異體（「抗原變異體」）。隨後測試具有 在兩種檢定中呈陽性之抗體之上清液的抗原中和效能，例 如實例1.1.2.1之細胞激素生物檢定。在生物檢定中，由產 生抗體之IC50值低於1000 ρΜ，在一實施例中低於100 ρΜ 之融合瘤進行擴增且藉由限制稀釋法選殖^將融合瘤細胞 在含有10°/。低IgG胎牛血清之培養基（Hyclone #SH30151， Logan，UT)中擴增。平均地，每一融合瘤採集250 mL上 清液（來源於無性繁殖系群體），將其濃縮且藉由如Harlow, Ε·及 Lane, D. 1988 「Antibodies: A Laboratory Manual」 140653.doc -275· 201006485 中描述之蛋白質A親和性層析法純化。經純化mAb抑制其 標靶抗原活性之能力（例如）係使用如實例1.1.2.1中描述之 細胞激素生物檢定來測定。 實例1.2.C.2:分析親本單株抗體與所關注之獼猴標靶抗原 之交又反應性 為判定本文中描述之所選mAb是否識別所關注之獼猴抗 原，如本文中描述（實例1.1.1.G)，使用重組獼猴標靶抗原 進行BIACORE分析。另外，mAb針對所關注之重組獼猴抗 原之中和效能亦可在細胞激素生物檢定（實例1.1.2.1)中量 測。將具有良好獼猴交叉反應性（在一實施例中，在人類 抗原之反應性之5倍内）之mAb選擇用於將來表徵。 實例1.2.D:測定每一鼠類抗人類單株抗體之可變區域之 胺基酸序列 分離cDNA、重組抗人類小鼠mAb之表現及表徵如下進 行。對於每一胺基酸序列之測定，藉由離心法分離約 1 X 106個融合瘤細胞，且遵循製造商說明書之指示，以 Trizol 處理（Gibco BRL/Invitrogen，Carlsbad，CA.)，分離 總RNA。總RNA按照製造商說明書之指示，使用 Superscript First-Strand合成系統（Invitrogen ’ Carlsbad， CA)合成第一股DNA。採用寡聚去氧胸苷酸（oligo(dT))引 發合成第一股，以選擇聚（A)+ RNA。第一股cDNA產物隨 後藉由PCR，使用經設計用於擴增鼠類免疫球蛋白可變區 域之引子（Ig-Primer Sets，Novagen，Madison，WI)來擴 增。PCR產物經瓊脂糖凝膠解析、切除、純化且隨後以 140653.doc -276- 201006485 TOPO Cloning套組次選殖至pCR2.1-TOPO載體 (Invitrogen，Carlsbad，CA)中，且轉形至TOP10化學感受 態大腸桿菌（Invitrogen，Carlsbad，CA)中。針對轉化子執 行群落PCR，以識別含有插入物之純系。使用QlAprep Miniprep套組（Qiagen，Valencia，CA)自含有插入物之純 系中分離質體DNA。使用M13前置及M13反置引子 (Fermentas Life Sciences，Hanover MD)將質體中之插入物 在兩個鏈上測序以測定可變重鏈或可變輕鏈DNA序列。識 ® 別mAb之可變重鏈及可變輕鏈序列。在一實施例中，用於 下一步驟開發（人源化）之前導mAb之組的選擇標準包括以 下： 除了 CH2中之標準一者以外，抗體不含有任何N連接之 糖基化位點（NXS) 除每一抗體中之正常半胱胺酸之外，抗體不含有任何額 外半胱胺酸 將抗體序列與VH及VL之最接近人類生殖系序列比對且 ❹ 應對於在其他天然人類抗體中之出現情況檢查任何異常 胺基酸 若其不影響抗體活性，則N-末端麩醯胺酸（Q)改變為麩 胺酸（E)。此將減少歸因於Q環化之非均質性 有效信號序列切割由質譜分析予以確認。此可以COS細 胞或293細胞材料進行 對於可導致活性損失之Asn之脫醯胺作用之風險來檢查 蛋白質序列 140653.doc •277- 201006485 抗體具有低水準之聚集 抗體具有>5-10 mg/mi(在研究階段中）；>25 mg/ml之溶 解性 藉由動態光散射（DLS) ’抗體具有標準尺寸（5_6 nm) 抗體具有低電荷非均質性 抗體缺乏細胞激素釋放（參見實例1.12B) 抗體對預定細胞激素具有特異性（參見實例1 .丨2 C) 抗體缺乏非預期之組織交又反應性（參見實例i . i 2.D) 抗體在人類與獼猴組織交又反應性之間具有相似性（參 見實例1.1.2.D) 資例1.2.2:重组人源化親本抗體 實例1.2.2.1:重组嵌合抗人類親本抗體之構築及表現 藉由細读中之同源重組將編瑪鼠輯抗人類親本mAb之重 鏈怪定區域之DN A經編碼含有2個鉸鍵區域胺基酸突變之 人類IgGl恒定區域之CDNA片段置換。此等突變為位置 23 4(EU編號）處之白胺酸變化為丙胺酸及位置235處之白胺 酸變化為丙胺酸（Limd等人1991，J. Immunol.， 147:2657)。此等抗體之每一者之輕鏈恆定區域經人類κ恆 定區域置換。全長嵌合抗體係藉由接合至pB〇s表現質體 之嵌合重鏈及輕鏈cDNA之共轉染瞬時表現於c〇S細胞中 (Mizushima及 Nagata，Nucleic Acids Research 1990，第 18 卷，第5322頁）。含有重組嵌合抗體之細胞上清液係藉由 蛋白質Α瓊脂糖層析純化且結合之抗體係藉由添加酸緩衝 液來溶離。將抗體中和且滲析於PB s中。 140653.doc -278- 201006485 編碼嵌合mAb之重鏈cDNA與其嵌合輕鏈cDNA(兩者接 合於pBOS載體中）共轉染至COS細胞中。含有重組嵌合抗 體之細胞上清液係藉由蛋白質A瓊脂糖層析純化且結合之 抗體係藉由添加酸緩衝液來溶離。將抗體中和且透析至 PBS 中。 隨後測試經純化之嵌合抗人類親本mAb之結合能力（藉 由Biacore)及功能活性，（例如）如實例m.G及1.1.2.B中 描述抑制細胞激素誘導之IgE產生。選擇維持親本融合瘤 mAb之活性的嵌合mAb用於將來開發。 實例1.2.2.2:人源化抗人類親本抗體之構築及表現 實例1.2.2.2.A:選擇人類抗體構架 使用Vector NTI軟體將每一鼠類可變重鏈及可變輕鏈基 因序列分別地相對於44個人類免疫球蛋白生殖系可變重鏈 或46個生殖系可變輕鏈序列（得自NCBI Ig Blast網站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.)進行 比對。 人源化係基於胺基酸序列同源性、CDR聚類分析、在所 表現人類抗體中之使用頻率及關於人類抗體之晶體結構之 可利用資訊。考慮到對於抗體結合、VH-VL配對之可能作 用及其他因素’在鼠類及人類構架殘基為不同的情況下， 將鼠類殘基突變為人類殘基，有些例外。基於與鼠類抗體 可變區域之實際胺基酸序列擁有高度同源性（亦即序列相 似性）之人類生殖系抗體序列（或其子群）之分析來設計其他 人源化策略。 140653.doc -279- 201006485 同源性模擬係用以識別鼠類抗體序列特有的經預測對於 抗體結合位點（CDR)之結構至關重要的殘基。同源性模擬 為藉以生成蛋白質之近似三維座標的計算方法。初始座標 之來源及對於其進一步細化之指導為第二蛋白，其三維座 標已知且其序列與第一蛋白之序列有關的參考蛋白。兩種 蛋白質序列之間的關係係用以在參考蛋白與需要其座標之 蛋白質（標把蛋白）之間生成對應。參考蛋白與標乾蛋白之 初級序列經比對，且兩種蛋白質之相同部分之座標直接自 參考蛋白轉移至標靶蛋白。兩種蛋白質之錯配部分（例如 起因於殘基突變、插入或缺失）之座標由一般結構模板構 建且細化能量以確保與已轉移之模型座標的連貫性。此計 算蛋白結構可進一步細化或直接用於模擬研究中。模型結 構之品質係藉由參考蛋白與標靶蛋白相關之論點之準確度 及構築序列比對之精確度來確定。 對於鼠類mAb，BLAST搜尋與目視檢查之組合用以識別 適合參考結構。參考胺基酸序列與標靶胺基酸序列之間的 25%序列一致性視為嘗試同源性模擬操練必需之最低限 度。序列比對人工地構築且模型座標以程式Jackal生成（參 見 Petrey，D·等人（2003) Proteins 53(增刊 6) : 43〇 435)。 所選抗體之鼠類及人類構架區域之初級序列共有顯著一 致性。不同之殘基位置為將鼠類殘基包含於人源化序列中 以便保留鼠類抗體之所觀察到結合效能的候選者。在人類 與鼠類序列之間不同的構架殘基之清單人卫地構築。表^ 展示對於此研究所選之構架序列。 140653.doc 201006485 表12:人類IgG重鏈恆定區及輕鏈恆定區之序列
蛋白質 SEQ ID NO 序列 12345678901234567890123456789012345678901 野生型hlgGl恆定區域 58 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKEWfiYVDG ^/EVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK 突變hlgG恆定區域 4 59 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFTWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK Igk恆定區域 60 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC IgA·怪定區域 61 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHR SYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
指定構架殘基影響抗艎之結合性質的可能性視其與CDR 殘基之接近度而定。因此，使用模型結構，在鼠類與人類 序列之間不同的殘基根據其自CDR中之任何原子之距離而 分等級。處於任何CDR原子之4.5A内之彼等殘基識別為最 重要的且經推薦為將鼠類殘基保留於人源化抗體中（亦即 回復突變）之候選者。 經由電腦構築之人源化抗體係使用寡核苷酸構築。對於 每一可變區域cDNA，各自具有60-80個核苷酸之6個寡核 苷酸經設計以在每一寡核苷酸之5'及/或3'末端處藉由20個 核苷酸彼此重疊。在黏接反應中，在dNTP之存在下，所 有6個寡核苷酸經組合、沸騰且黏接。添加DNA聚合酶I、 較大（Klenow)片段（New England Biolabs #M0210， -281 - 140653.doc 201006485
Beverley ’ ΜΑ.)以填滿重疊寡核苷酸之間的約40 bp間隙。 執行PCR以使用含有與修飾pBOS載體中之多個選殖位點互 補之懸垂序列的兩個最外層引子來擴增整個可變區域基因 (Mizushima，S.及Nagata，S. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 17)。將源自每一 cDNA組合件之PCR產物經瓊脂糖凝膠分 離且將與預測可變區域cDNA尺寸對應之譜帶切除且純 化。藉由細菌中之同源重組將可變重鏈區域同框插入編碼 含有2個鉸鏈區域胺基酸突變之人類igGl恆定區域之CDNA 片段上。此等突變為位置234(EU編號）處之白胺酸變化為 丙胺酸及位置23 5處之白胺酸變化為丙胺酸（Lund等人 (1991) J_ Immunol. 147:2657)。可變輕鏈區域係藉由同源 重組與人類κ恆定區域一起同框插入。菌落經分離且提取 質體DNA。cDNA插入物全部經測序。與每一抗體對應之 正確的人源化重鏈及輕鏈經共轉染至COS細胞中以瞬時產 生全長人源化抗人類抗體》含有重組嵌合抗體之細胞上清 液係藉由蛋白質A瓊脂糖層析純化且結合之抗體係藉由添 加酸緩衝液來溶離。將抗體中和且透析至PBS中。 實例1.2.2.3:人源化抗艎之表徵 經純化人源化抗體抑制功能活性之能力（例如）使用如實 例1 · 1.2.A中描述之細胞激素生物檢定來測定。人源化抗禮 與重組人類抗原之結合親和力使用如實例丨丨丨B中描述之 表面電漿共振（Biacore®)量測來測定。將來自生物檢定之 ICso值及人源化抗體之親和力分等級。完全維持親本融合 瘤mAb之活性的人源化mAb選為用於將來開發之候選者。 140653.doc •282· 201006485 將頂部2-3個最有利的人源化mAb進一步表徵。 實例1.2.2.3.A:人源化抗體之藥物代謝動力學分析 藥物代謝動力學研究在Sprague-Dawley大鼠及獼猴中執 行。向雄性及雌性大鼠及獼猴靜脈内或皮下給予單次劑量 之4mg/kg mAb且使用抗原捕獲ELIS A分析試樣，且藥物代 謝動力學參數係藉由非房室模型分析來測定。簡言之，將 ELISA板以山羊抗生物素抗體（5 mg/ml，4°C，隔夜）塗 布，以Superblock(Pierce)阻斷，且在室溫下在10% ® Superblock TTBS中與50 ng/ml之生物素標記之人類抗原一 起培養2小時。將血清試樣連續稀釋（0.5%血清，TTBS中 之10% Superblock)且在室溫下在板上培養30分鐘。以HRP 標記之山羊抗人類抗體執行偵測且藉助於標準曲線使用四 參數邏輯斯諦擬合來測定濃度。藥物代謝動力學參數之值 係藉由非房室模型使用WinNonlin軟體（Pharsight Corporation，Mountain View，CA)測定。選擇具有良好藥 _ 物代謝動力學概況（T1/2為8-13天或更好，具有低清除且極 好生物可用性50-100%)之人源化mAb。 實例1.2.2.3.B :人源化單株抗體之物理化學及活體外穩定 性分析 尺寸排阻層析 將抗體以水稀釋至2.5 mg/mL且20 mL在Shimadzu HPLC 系統上使用 TSK 凝膠 G3 000 SWXL 管柱（Tosoh Bioscience， 目錄號k5539-05k)分析。將試樣以211 mM硫酸鈉、92 mM 磷酸鈉（pH 7.0)以0.3毫升/分鐘之流動速率自管柱溶離。 140653.doc -283 - 201006485 HPLC系統操作條件為以下： 移動相：211 mM Na2S04、92 mM Na2HP〇4*7H2〇、pH 7.0 梯度：同溶劑 流動速率：0.3毫升/分鐘 偵測器波長：280 nm 自動取樣器冷卻器溫度：4°C 管柱烘箱溫度：周圍 電泳時間：50分鐘 表13含有如藉由上述方案測定之表示為單體（預期分子 量之未凝集蛋白質）百分比之親本抗體及DVD-Ig構築體之 純度資料。 表13:如藉由尺寸排阻層析測定之親本抗體及DVD-Ig構 築«之純度 親本抗艟或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) C末端可變區 (VD) 單體％ (純度） AB032 IL-1B 100 DVD225 Αβ(序列1) IL-1B 86.5 DVD226 IL-1B Αβ(序列1) 95.8 AB017 Τ1 viF 95.9 DVD223 Αβ(序列1) TNF 91.6 DVD224 TNF Αβ(序列1) 81.7 AB017 Τ] SiF 95.9 AB059 RGMA 100 DVD291 TNF RGMA 91.9 DVD292 RGMA TNF 93.3 AB017 TNF 95.9 AB060 RAGE 91.9 DVD295 RAGE TNF 94.1 DYD296 TNF rage 97.9 AB017 T KF 95.9 AB033 EGFR (序列l) 100 DVD289 TNF EGFR(序列 1) 85.4 DVD290 EGFR(序列 1) TNF 95.6 140653.doc •284· 201006485 DVD-Ig展示大多數DVD-Ig展示>90%單體之極好SEC概 況。此DVD-Ig概況與對於親本抗體觀察到之彼概況類 似。
SDS-PAGE 抗體係藉由在還原及非還原條件下之十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析《阿達木單抗 (Adalimumab)批次AFP04C用作對照。對於還原條件，將 試樣與2xtris甘胺酸SDS-PAGE試樣緩衝液（Invitrogen，目 ® 錄號LC2676，批號 1323208)以及 100 mM DTT 1··1混合，且 在60°C下加熱30分鐘。對於非還原條件，將試樣與試樣緩 衝液1:1混合且在100°C下加熱5分鐘。將還原試樣（每泳道 10 mg)裝載至12%預洗鑄之tris-甘胺酸凝膠（Invitrogen，目 錄號EC6005box，批號6111021)上，且非還原試樣（每泳道 10 mg)裝載至8%-1 6%預澆鑄tris-甘胺酸凝膠（Invitrogen， 目錄號、EC6045box，批號 6111021)上。將 SeeBlue Plus 2(Invitrogen，目錄號LC5925，批號1351542)用作分子量 _ 標記。將凝膠在XCell SureLock微型單元凝膠箱 (Invitrogen，目錄號EI0001)中電泳且蛋白質係藉由首先施 加75之電壓以使試樣在凝膠中堆疊，接著125之恆定電壓 直至染料前部達到凝膠底部來分離。所用電泳緩衝液為自 lOxtris甘胺酸 SDS緩衝液（ABC，MPS-79-080106)製備之 lxtris甘胺酸SDS緩衝液。凝膠以膠狀藍染（Invitrogen目 錄號46-7015，46-7016)染色隔夜且以Mmi-Q水脫色直至本 底清澈為止。將染色凝膠隨後使用Epson Expression掃描 140653.doc -285- 201006485 器（1680型，S/NDASX003641)掃描。 沈降速度分析 將抗體裝載至各自具有三個標準兩區段式碳環氧樹脂中 心件的試樣腔室中。此等中心件具有1.2 cm光程長度且經 構造具有藍寶石窗。將PBS用於參考緩衝液且每一腔室含 有 140 μΐ^。所有試樣同時使用 Beckman ProteomeLab XL-I 分析超速離心機（序號PL106C01)中之4孔洞（AN-60Ti)轉子 來同時檢查。 電泳條件經程式化且離心機控制係使用ProteomeLab(5.6 版）執行。允許試樣及轉子在分析之前熱平衡一小時（20.0 土 〇.1。〇。適當單元裝載之確認係在3000 rpm下執行且記 錄每一單元之單一掃描。沈降速度條件為以下：
試樣單元體積：420 mL 參考單元體積：420 mL 溫度：20°C 轉子速度：35,000 rpm 時間：8:00小時 UV波長：280 nm 徑向步長：0.003 cm 數據收集：每步驟一個數據點，而無信號平均。 掃描總數：100 完整抗體之LC-MS分子量量測 完整抗體之分子量係藉由LC-MS分析。將每一抗體以水 稀釋至約1 mg/mL。將具有蛋白質微圈閉（microtrap) 140653.doc -286- 201006485 (Michrom Bioresources，Inc，目錄號 004/25109/03)之 1100 HPLC(Agilent)系統用以脫鹽且將5 mg試樣引入API Qstar pulsar i質譜儀（Applied Bio systems)中。短梯度用以溶離試 樣。梯度以50毫升/分鐘之流動速率之移動相A(HPLC水中 之0.08% FA、0.02% TFA)及移動相B(乙腈中之0.08% FA及 0.02% TFA)運作。質譜儀在4.5千伏喷霧電壓下以2000至 3500質荷比之掃描範圍操作。 抗體輕及重鏈之LC-MS分子董量測 ® 抗體輕鏈（LC)、重鏈（HC)及脫糖基化HC之分子量量測 係藉由LC-MS分析。抗體以水稀釋至1 mg/mL，且試樣在 37°C下以10 mM DTT之最終濃度還原至LC及HC歷時30分 鐘。為使抗體脫糖基化，將100 mg之抗體在37°C下與2 mL 之PNGase F、5 mL之10% N-辛基糖普一起以100 mL之總 體積培養隔夜。在脫糖基化之後，將試樣在37°C下以1〇 mM DTT之最終濃度還原歷時30分鐘。具有C4管枉 (Vydac，目錄號 214TP5115，S/N 060206537204069)之 ❹
Agilent 1100 HPLC系統係用以脫鹽且將試樣（5 mg)引入API Qstar pulsar i質譜儀（Applied Biosystems)中。短梯度用以 溶離試樣。梯度以50毫升/分鐘之流動速率之移動相 A(HPLC水中之0.08% FA、0.02% TFA)及移動相B(乙腈中 之0.08% FA及0.02% TFA)運作。質譜儀在4.5千伏喷霧電 壓下以800至3500質荷比之掃描範圍操作。 肽定位 在室溫下，將抗體以75 mM碳酸氫銨中之6 Μ最終濃度 140653.doc -287- 201006485 之鹽酸胍變性15分鐘。在37°C下，將變性之試樣以最終濃 度10 mM之DTT還原60分鐘，接著在黑暗中在37°C下以50 mM碘乙酸（IAA)烷基化30分鐘。在烷基化之後，在4°C下 將試樣相對於四公升之1 〇 mM碳酸氫銨透析隔夜。將透析 之試樣以10 mM碳酸氫錢（pH 7.8)稀釋至1 mg/mL，且在 37°C下將1〇〇 mg抗體以胰蛋白酶（Promega，目錄號V5111) 或 Lys-C(Roche，目錄號 11 047 825 001)以 l:20(w/w)胰蛋 白酶/Lys-C:抗體比率消化4小時。消化係以1 mL之1 N HC1 中止。對於以質譜儀偵測進行之肽定位，將40 mL消化液 以Agilent 1100 HPLC系統藉由C18管柱（Vydac，目錄號 218TP51，S/N NE9606 10.3.5)上之逆相高效液相層析 (RPHPLC)分離。肽分離係以使用50毫升/分鐘之流動速率 之移動相A(HPLC等級水中之0.02% TFA及0.08% FA)及移 動相B(乙腈中之0.02% TFA及0.08% FA)的梯度來運作。 API QSTAR Pulsar i質譜議以正模式在4.5千伏噴霧電壓及 800至2500質荷比之掃描範圍下操作。 雙硫鍵定位 為使抗體變性，將1〇〇 mL抗體與300 mL存於100 mM碳 酸氫銨中之8 Μ鹽酸胍混合。檢查pH值以確保其在7與8之 間且在室溫下在最終濃度6 Μ之鹽酸胍中將試樣變性15分 鐘。將一部分變性試樣（100 mL)以Milli-Q水稀釋至600 mL 以產生最終濃度1 Μ之鹽酸胍。在37°C下，將試樣（220 mg)以胰蛋白酶（Pr omega，目錄號V5111，批號22265901) 或 Lys-C(Roche，目錄號 11047825001，批號 12808000)以 140653.doc -288 - 201006485 1:50胰蛋白酶或1:50 Lys-C:抗體（w/w)比率（4·4 mg酶：220 mg試樣）消化約16小時。將额外5 mg胰蛋白酶或Lys-C添加 至試樣中且在37°C下允許消化再進行2小時。藉由添加1 mL TFA至每一試樣而終止消化。消化之試樣在Agilent HPLC系統上藉由使用C18管柱（Vydac，目錄號218TP51 S/N NE02063 0-4-1A)之RPHPLC分離。分離係以使用50毫 升/分鐘之流動速率之移動相A(HPLC等級水中之0.02% TFA及0.08% FA)及移動相B(乙腈中之0.02% TFA及0.08% β FA)的用於肽定位之相同梯度來運作。HPLC操作條件與用 於肽定位之彼等條件相同。API QSTAR Pulsar i質譜議以 正模式在4_5千伏喷霧電壓及800至2500質荷比之掃描範圍 下操作。雙硫鍵係藉由使觀察到之肽MW與藉由雙硫鍵連 接之胰蛋白酶或Lys-C肽之預期MW匹配而指定。 游離酼基測定 用以定量抗體中之游離半胱胺酸之方法係基於愛耳門試 劑（Ellman's reagent)，5,5 0-二硫代-雙（2-硝基笨曱 酸）(DTNB)，與巯基（SH)之反應，其產生特徵發色團產 物，5-硫代-(2-硝基苯曱酸）（TNB)。反應說明於下式中： DTNB + RSH ㊣ RS-TNB + TNB- + H+ TNB-之吸光度係使用Cary 50分光光度計在412 nm下量 測。吸光度曲線係使用2酼基乙醇（b-ME)之稀釋液作為游 離SH標準來作圖且蛋白質中之游離毓基之濃度係自試樣在 412 nm下之吸光度來測定。 b-ME標準原料係藉由將14.2 M b-ME以HPLC等級水連續 140653.doc -289- 201006485 稀釋至0.142 mM之最終濃度來製備。隨後製備每一濃度之 一式三份之標準物。將抗體使用amicon ultra 10,000 MWCO離心過濾器（Millipore，目錄號UFC801096，批號 L3KN525 1)濃縮至10 mg/mL且將緩衝液改變為用於阿達木 單抗之調配緩衝液（5.57 mM碟酸二氫鈉、8.69 mM磷酸氫 二鈉、106.69 mM NaC卜 1.07 mM檸檬酸鈉、6.45 mM檸 檬酸、66.68 mM甘露糖醇（pH 5.2)、0.1%(w/v)吐溫）。在 室溫下，將試樣在震盪器上混合20分鐘。隨後將180 mL之 100 mMTris緩衝液（pH 8.1)添加至每一試樣及標準物，接 著添加300 mL存於10 mM磷酸鹽緩衝液中之2 mM DTNB (pH 8.1)。在充分混合之後，在Cary 50分光光度計上量測 試樣及標準物在412 nm下之吸收。標準曲線係藉由將游離 SH之量與b-ME標準物之OD412 nm作圖來獲得。試樣之游 離SH含量係基於此曲線在減去空白之後來計算。 弱陽離子交換層析 將抗體以10 mM磷酸鈉（pH 6.0)稀釋至1 mg/mL。電荷非 均質性係使用具有WCX-10 ProPac分析管柱之Shimadzu HPLC 系統（Dionex，目錄號 054993，S/N 02722)來分析。 在管柱上，將試樣裝載於80%移動相A( 10 mM磷酸鈉，pH 6.0)及 20°/。移動相 B(l〇 mM 磷酸鈉，500 mM NaCl，pH 6.0) 中且以1.0毫升/分鐘之流動速率溶離。 募醣概況 將在抗體之PNGase F處理之後釋放之寡醣以2-胺基苄醯 胺（2-AB)標記試劑衍生。螢光標記之募醣係藉由正相高效 140653.doc -290- 201006485 液相層析（NPHPLC)分離且各種形式之寡醣係基於與已知 標準物之滯留時間比較來表徵。 首先將抗體以PNGaseF消化以自重鏈之Fc部分裂解N連 接之募醣。將抗體（200 mg)與2 mL PNGase F及3 mL之10% N-辛基糖苷一起置放於500 mL Eppendorf管中。添加磷酸 鹽緩衝生理食鹽水以使最終體積達到60 mL。在37°C下將 試樣在設定在700 RPM下之Eppendorf恆溫混勻器中培養隔 夜。亦將阿達木單抗批次AFP04C作為對照以PNGase F消 ® 化。 在PNGase F處理之後，將試樣在95°C下在設定在750 RPM下之Eppendorf怪溫混勻器中培養5分鐘以沈殿析出蛋 白質，隨後將試樣置放於1〇,〇〇〇 RPM下之Eppendorf離心 機中2分鐘以使沈澱出之蛋白質旋轉減慢。將含有寡醣之 上清液轉移至500 mL Eppendorf管且在65°C下在速比韋克 (speed_vac)中乾燥。 _ 將寡醣使用自Prozyme購得之2AB標記套組（目錄號GKK- 參 404，批號132026)以2AB標記。將標記試劑根據製造商說 明書製備。將乙酸（150 mL，提供於套組中）添加至DMSO 小瓶（提供於套組中）且藉由將溶液上下吸移若干次來混 合。將乙酸/DMSO混合物（100 mL)轉移至2-AB染料之小瓶 (剛好在使用之前）且混合直至染料完全溶解。隨後將染料 溶液添加至還原劑之小瓶（提供於套組中）且完全混合（標記 試劑）。將標記試劑（5 mL)添加至每一乾燥寡醣試樣小瓶， 且澈底地混合。將反應小瓶置放於設定在65°C及700-800 140653.doc -291 · 201006485 RPM下之Eppendorf恆溫混勻器中反應2小時。 在標記反應之後，將過量螢光染料使用來自Prozyme之 GlycoClean S濾筒（目錄號GKI-4726)移除。在添加試樣之 前，將濾筒以1 milli-Q mL水洗滌，然後以1 mL 30%乙酸 溶液洗滌5次。剛好在添加試樣之前，將1 mL乙腈 (Burdick and Jackson，目錄號AH015-4)添加至渡筒。 在所有乙腈穿過濾筒之後，將試樣滴注於新洗滌之碟片 之中心上且使得吸附於碟片上10分鐘。將碟片以1 mL之乙 腈洗滌，接著以1 mL 96%乙腈洗滌五次。將濾筒置放於 1.5 mL Eppendorf管上且將2-AB標記之寡糖以milli Q水溶 離3次（每次400 mL)。 將寡醣使用與Shimadzu HPLC系統連接之Glycosep N HPLC(目錄號GKI-4728)管柱分離。Shimadzu HPLC系統由 系統控制器、脫氣器、二元泵、具有試樣冷卻器之自動取 樣器及螢光偵測器組成。 高溢下之穩定性 抗體之緩衝液為使用Amicon ultra離心過濾器之5.57 mM 磷酸二氫鈉、8.69 mM磷酸氫二鈉、106.69 mM NaCl、 1_07 mM檸檬酸鈉、6.45 mM檸檬酸、66.68 mM甘露糖 醇、〇.l0/〇(w/v)吐溫（pH 5.2);或 10 mM組胺酸、10 mM 甲 硫胺酸、4%甘露糖醇（pH 5.9)。將抗體之最終濃度以適當 缓衝液調節至2 mg/mL。隨後將抗體溶液過濾滅菌且在無 菌條件下製備0.25 mL等分試樣。將等分試樣保持於-80°C、5°C、25°C或40°C下歷時1、2或3週。在培養期結束 140653.doc -292- 201006485 時，將試樣藉由尺寸排阻層析及SDS-PAGE分析。 該等穩定性試樣係藉由在還原及非還原條件下之SDS-PAGE分析。所用程序與本文中描述者相同。凝膠以膠狀 藍染（Invitrogen目錄號46-7015，46-7016)染色隔夜且以
Milli-Q水脫色直至本底清澈為止。染色凝膠隨後係使用
Epson Expression 掃描器（1680 型，S/N DASX003641)掃 描。為獲得更大敏感性，相同凝膠使用銀染色套組（〇wl Scientific)來銀染色且使用由製造商給出之推薦程序。 ❹ 實例1.2.2.3.C .人源化單株抗想單獨或與化學療法組合對 於人類癌異種移植物之生長之功效 將人類癌細胞在活體外在組織培養燒瓶中生長至9 9 %生 存力、85%長滿。19-25公克之SCID雌性或雄性小鼠 (Charles Rivers Labs)在耳朵上作標記且剃毛。在研究第〇 天，將0.2 ml之2χ106個人類腫瘤細胞（1:1基底膠）向小鼠皮 下接種至右側腹中。在小鼠經尺寸匹配劃分至具有約j5〇 ❹ 至2〇〇 mm3之平均腫瘤體積之小鼠的分離籠中之後，開始 投與（IP ’ Q3D/週）媒劑（PBS)、人源化抗體及/或化學療 法。在接種後約第1 0天開始每週兩次藉由一對測徑規量測 腫瘤且根據式V=LxW2/2(V :體積，mm3 ; L :長度， mm : W :寬度，mm)計算腫瘤體積。相對於僅接受媒劑或 同型對照mAb之動物中的腫瘤，在以mAb單獨或與化學療 法組合治療之動物中發現腫瘤體積減少。
實例1.2.2.3.D :基於FACS之重定向細胞毒性（rCTL)檢定 人類CD3+ T細胞係藉由負選擇富集管柱（R&D 140653.doc •293· 201006485
Systems，Minneapolis，MN ;目錄號HTCC-525)自先前經 冷凍之分離周圍血液單核細胞（PBMC)中分離。T細胞在以 D-PBS(Invitrogen ，Carlsbad ，CA)中之 10 pg/mL 抗 CD3(OKT-3，eBioscience，Inc.，San Diego，CA)及 2 pg/mL 抗 CD28(CD28.2，eBioscience，Inc.，San Diego， CA)塗布之燒瓶（通氣孔蓋，Corning，Acton，MA)中刺激4 天且在具有L-麵胺醯胺、55 mM β-ΜΕ、Pen/Strep、10% FBS 之完全 RPMI 1640培養基（Invitrogen，Carlsbad，CA) 中之30 U/mL IL-2(Roche)中培養。隨後在用於檢定中之 前，將T細胞在30 U/mL IL-2中靜置隔夜。根據製造商說 明書將 DoHH2 或 Raji標靶細胞以 PKH26(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)標記。在rCTL檢定中始終使用含有L-麩胺醯 胺及 10% FBS(Hyclone，Logan，UT)之 RPMI 1640 培養基（無 紛，Invitrogen，Carlsbad，CA)。（參見 Dreier 等人（2002) Int J Cancer 100:690) ° 將效應T細胞（E)及標靶（T)以105及104個細胞/孔之最終 細胞濃度分別塗布於96孔板（Costar #3799，Acton, MA) 中，以產生10:1之E:T比率。將DVD-Ig分子稀釋以獲得濃 度依賴性滴定曲線。在隔夜培養之後，將細胞成團且以D-PBS洗滌一次，隨後再懸浮於含有D-PBS中之0.1% BSA(Invitrogen，Carlsbad，CA)、0.1% 疊氮化納及 0.5 pg/mL碘化丙錠（BD)之FACS緩衝液中。將FACS數據收集 於FACS Canto II機（Becton Dickinson，San Jose，CA)上且 在Flowjo(Treestar)中分析。計算經DVD-Ig處理之試樣中 140653.doc •294· 201006485 之活標靶百分比除以總標靶（對照，無處理）百分比以測定 特異性溶解百分比。在Prism(Graphpad)中計算IC50。 測試CD3/CD20 DVD-Ig之重定向毒性且其在活體外展示 IC50=325 pM之腫瘤殺死。此CD3/CD20 DVD-Ig之序列揭 示於美國專利申請案第20070071675號中。 實例1.4 :生成DVD-Ig 使用如本文中描述而選擇之兩種親本單株抗體（一種相 對於人類抗原A，且另一種相對於人類抗原B)來構築能夠 β 結合兩種抗原之DVD-Ig分子。 實例1.4.1 :生成具有兩個連接子長度之DVD-Ig 使用含有234及235處之突變以消除ADCC/CDC效應功能 之μΐ Fc之恆定區域。生成四種不同抗A/B DVD-Ig構築 體：兩種具有短連接子且兩種具有長連接子，每一者呈兩 個不同區定向：VA-VB-C及VB-VA-C(參見表14)。源自人類 Cl/Ck或CH1區之N-末端序列之連接子序列如下： 對於DVDAB構築體： 輕鏈（若抗A具有λ):短連接子：QPKAAP(SEQ ID NO: 15);長連接子 QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) 輕鏈（若抗A具有κ):短連接子：TVAAP(SEQ ID NO: 13);長連接子 TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 141) 重鏈（γΐ):短連接子：ASTKGP(SEQ ID NO: 21);長連 接子 ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22) 對於DVDBA構築體： 輕鏈（若抗B具有λ):短連接子：QPKAAP(SEQ ID NO: 140653.doc -295- 201006485 15);長連接子 QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NOM6) 輕鏈（若抗B具有κ):短連接子（SEQ ID NO: 13): TVAAP ;長連接子 TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) 重鏈（γΐ):短連接子：ASTKGP(SEQ ID NO: 21);長連 接子 ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22) 將重鏈及輕鏈構築艎次選殖至pBOS表現載體中，且表 現於COS細胞中，接著藉由蛋白質A層析純化。經純化材 料進行SDS-PAGE及SEC分析。 表14描述用以表現每一抗A/B DVD-Ig蛋白質之重鏈及輕 鏈構築體。 表14 :抗A/B DVD-Ig構築體
DVD-Ig蛋白質 重鏈構築逋 輕鍵構築艎 DVDABSL DVDABHC-SL DVDABLC-SL DVDABLL DVDABHC-LL DVDABLC-LL DVDBASL DVDBAHC-SL DVDBALC-SL DVDBALL DVDBAHC-LL DVDBALC-LL 實例1.4.2 : DVDABSL及DVDABLL之DNA構築體之分子 選殖 為生成重鏈構築體DVDABHC-LL及DVDABHC-SL，A抗 體之VH區使用特異性引子（3'引子含有分別用於SL/LL構築 體之短/長線性序列）經PCR擴增；同時B抗體之VH區使用 特異性引子（5’引子含有分別用於SL/LL構築體之短/長線性 序列）擴增。根據標準PCR技術及程序執行兩個PCR反應。 兩種PCR產物經凝膠純化，且一起用作用於隨後重疊PCR 反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將重疊PCR 產物次選殖至Srf I及Sal I二重消化pBOS-hCyl、z非a哺乳 140653.doc -296· 201006485 動物表現載體（Abbott)中。 為生成輕鏈構築體DVDABLC-LL及DVDABLC-SL，A抗 體之VL區使用特異性引子（3’引子含有分別用於SL/LL構築 體之短/長線性序列）經PCR擴增；同時B抗體之VL區使用 特異性引子（5吲子含有分別用於SL/LL構築體之短/長線性 序列）擴增。根據標準PCR技術及程序執行兩個PCR反應。 兩種PCR產物經凝膠純化，且一起用作用於隨後使用標準 PCR條件之重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源 ® 重組方法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Not I二重消化 pBOS-hCk哺乳動物表現載體（Abbott)中。如下所述，類似 方法·已用以生成DVDBASL及DVDBALL。 實例1.4.3 : DVDABSL及DVDABLL之DNA構築體之分子 選殖 為生成重鏈構築體DVDBAHC-LL及DVDBAHC-SL，抗 體B之VH區使用特異性引子（3·引子含有分別用於SL/LL構 築體之短/長線性序列）經PCR擴增；同時抗體A之VH區使 ❹ 用特異性引子（5'引子含有分別用於SL/LL構築體之短/長線 性序列）擴增。根據標準PCR技術及程序執行兩個PCR反 應。兩種PCR產物經凝膠純化，且一起用作用於隨後使用 標準PCR條件之重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準 同源重組方法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Sal I二重消 化pBOS-hCyl、z非a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為生成輕鏈構築體DVDBALC-LL及DVDBALC-SL，抗體 B之VL區使用特異性引子（3’引子含有分別用於SL/LL構築 140653.doc -297- 201006485 體之短/長線性序列）經PCR擴增；同時抗體A之VL區使用 特異性引子（5’引子含有分別用於SL/LL構築體之短/長線性 序列）擴增。根據標準PCR技術及程序執行兩個PCR反應。 兩種PCR產物經凝膠純化，且一起用作用於隨後使用標準 PCR條件之重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源 重組方法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Not I二重消化 pBOS-hCk哺乳動物表現載體（Abbott)中。 實例1.4.4 :構築及表現額外DVD-Ig 實例1.4.4.1:製備DVD-Ig載體構築艎 用於併入DVD-Ig中之識別特異性抗原或其抗原決定基 的特異性抗體之親本抗體胺基酸序列可藉由如上所述之融 合瘤之製備而獲得或可藉由將已知抗體蛋白質或核酸測序 而獲得。另外，可自文獻獲得已知序列。序列可用於使用 標準DNA合成或擴增技術來合成核酸且使用標準重組DNA 技術將所需抗體片段組裝至表現載體中，以便表現於細胞 中〇 例如，核酸密碼子自胺基酸序列測定且寡核苷酸DNA藉 由 Blue Heron Biotechnology, Inc. (www.blueheronbio.com) Bothell, WA USA來合成。將募核苷酸組裝至300-2,000鹼 基對雙鏈DNA片段中，選殖至質體載體中且經序列檢驗。 選殖之片段使用酶法組裝以產生完整基因且次選殖至表現 載體中。（參見 7,306,914、7,297,541、7,279，159、 7,150,969 ' 20080115243 、 20080102475 ' 20080081379 > 20080075690 、 20080063780 、 20080050506 、 20080038777 、 140653.doc -298- 201006485 20080022422 、 20070289033 、 20070287170 、 20070254338 、 20070243194 、 20070225227 、 20070207171 、 20070150976 、 20070135620 、 20070128190 、 20070104722 、 20070092484 、 20070037196 ' 20070028321 ' 20060172404 ' 20060162026 ' 20060153791 、 20030215458 、 20030157643)。 將一組pHybE載體（美國專利申請案第61/021,282號）用於 親本抗體及DVD-Ig選殖。源自pJP183; pHybE-hCgl,z,非a V2之VI用於具有野生型恆定區域之抗體及DVD重鏈之選 Ο 殖。源自pJP191; pHybE-hCk V2之V2用於具有κ恆定區域 之抗體及DVD輕鏈之選殖。源自pJP192; pHybE-hCl V2之 V3用於具有λ恆定區域之抗體及DVD輕鏈之選殖。以λ信號 肽及κ恆定區域構建之V4用於具有λ-κ雜交V區之DVD輕鏈 之選殖。以κ信號肽及λ恆定區域構建之V5用於具有κ-λ雜 交V區之DVD輕鏈之選殖。源自pJP183; pHybE-hCgl，z,非a V2之V7用於具有（234,235 AA)突變體恆定區域之抗體及 DVD重鏈之選殖。 參考表15,許多載體用於親本抗體及DVD-Ig VH及VL鏈 之選殖。 表15:用以選殖親本抗艟及DVD-Ig之載體 ID 重鏈載髏 輕鏈載體 AB001 VI V2 AB003 VI V2 AB010 VI V3 AB017 VI V2 AB020 VI V2 AB032 VI V2 AB033 VI V2 AB040 VI V2 140653.doc •299· 201006485 AB043 VI V2 AB044 VI V3 AB045 VI V2 AB046 VI V2 AB052 VI V2 AB059 VI V2 AB060 VI V2 DVD 193 VI V2 DVD 194 VI V2 DVD 195 VI V2 DVD 196 VI V2 DVD 197 VI V2 DVD 198 VI V2 DVD201 VI V2 DVD202 VI V2 DVD203 VI V5 DVD204 VI V4 DVD205 VI V2 DVD206 VI V2 DVD207 VI V2 DVD208 VI V2 DVD209 VI V2 DVD210 VI V2 DVD211 VI V2 DVD212 VI V2 DVD215 VI V2 DVD216 VI V2 DVD217 VI V5 DVD218 VI V4 DVD219 VI V2 DVD220 VI V2 DVD221 VI V2 DVD222 VI V2 DVD223 VI V2 DYD224 VI V2 DVD225 VI V2 DVD226 VI V2 DVD229 VI V5 DVD230 VI V4 DVD231 VI V2 · DVD232 VI V2 DVD233 VI Y2 DVD234 VI Y2 DVD235 VI V2 DVD236 VI V2 DVD239 VI V2 DVD240 VI V2 DVD243 VI V2 140653.doc -300- 201006485
赢 將DVD-Ig載體構築體轉染於293t a a ,+, φ J鈿胞中以便產生DVD-Ig
蛋白質。所用293瞬時轉染程序A 馬公開於Durocher等人 (2002) Nucleic Acids Res. 30(2、.> V ’ U):E9 及 Pham 等人（2005)
Biotech. Bioengineering 90(3):33^ . . L 中之方法之改進。用 於轉染中之試劑包括： • HEK 293-6E細胞（穩定表現EBNai之人類胚腎細胞株； 自 National Research C_cil Canada獲得），其在設定於 13 0 rpm、3 7°C 及 5% C〇2下之诸、BB , , 碼濶恆溫箱中、在一次性 ❹ 錐形瓶（Erlenmeyer flask)中培養。 •培養基：Freestyle 293 表現培養基（invitr〇gen 12338_ 018)加上25 pg/mL遺傳徽素（G4l8KInvitr〇gen 1〇131_ 027)及 0.1。/〇 泊洛尼克（Pluronic)F_68(Invitr〇gen 24〇4〇_ 032)。
•轉染培養基：FreeStyle 293表現培養基加上1〇 mM HEPES(Invitrogen 15630-080) 〇 •聚伸乙基亞胺（PEI)原料：1 mg/mL無菌儲備溶液（pH 140653.doc -301 - 201006485 7.0)，其以線性25 kDa PEI(Polysciences)製備且儲存於 -15°C以下。 •胰蛋白脒補料培養基：胰蛋白腺Nl(Organotechnie ’ 19554)在FreeStyle 293表現培養基中之5% w/v無菌原 料。 用於轉染之細胞製劑：在轉染之前約2-4小時，藉由離心 採集HEK 293-6E細胞且將其以每mL約1百萬個活細胞之細 胞密度再懸浮於培養基中。對於每一轉染，將40 mL細胞 懸浮液轉移至一次性250 mL錐形瓶中且培養2-4小時。 〇 轉染：將轉染培養基及PEI原料預加溫至室溫（RT)。對於 每一轉染，將25 pg質體DNA及50 pg聚伸乙基亞胺（PEI)組 合於5 mL之轉染培養基中且在RT下培養15-20分鐘以使得 形成DNA:PEI複合物。對於BR3-Ig轉染，每一轉染使用25 pg之BR3-Ig質體。將每一 5 mL DNA:PEI複合混合物添加 至先前製備之40 mL培養物中且放回至設定於130 rpm、 37°C及5% C02下之濕潤恆溫箱。在20-28小時之後，將5 mL騰蛋白腺補料培養基添加至每一轉染中且持續培養六® 天。 表16含有以毫克/公升為單位表現於293細胞中之親本抗 體或DVD-Ig構築體之產率數據。 表16 :親本抗鱧及DVD-Ig構築艟在293細胞中以產率計的 瞬時表現 140653.doc • 302· 201006485
親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) c末端可變區 (VD) 表現產率(mg/L) AB044 Αβ(序列2) 48.8 AB017 TNF 123.2 AB044 Αβ(序列2) 48.8 AB044 Αβ(序列2) 48.8 AB032 IL-1B 27 AB044 Αβ(序列2) 48.8 DVD201 Αβ(序列2) Αβ(序列1) 7 DVD202 Αβ(序列1) Αβ(序列2) 41.4 ABO 10 IG] FI,2 38.6 AB044 Αβ(序列2) 48.8 AB044 Αβ(序列2) 48.8 AB040 IL-6 25.8 AB044 Αβ(序列2) 48.8 ABO 17 TNF 123.2 AB032 IL-1B 27.0 AB010 IGF 1,2 38.6 AB040 IL-6 25.8 ABO 17 n NiF 123.2 DVD223 Αβ(序列1) TNF 18.2 DVD224 TNF Αβ(序列1) 30.6 AB032 IL-1B 27 DVD225 Αβ(序列1) IL-1B 4.4 DVD226 IL-1B Αβ(序列1) 2.2 AB010 IG] FI,2 38.6 DVD229 Αβ(序列1) IGF 1,2 64 DVD230 IGF 1,2 Αβ(序列1) 11.4 DVD231 Αβ(序列1) IL-18 11.2 DVD232 IL-18 Αβ(序列1) 18.4 AB040 IL-6 25.8 DVD233 Αβ(序列1) IL-6 5.8 AB060 RAGE 107.2 DVD293 Αβ(序列1) RAGE 48.4 DVD294 RAGE Αβ(序列1) 87 AB020 NGF 28 AB020 NGF 28 AB032 IL-1B 27 AB020 NGF 28 AB040 IL-6 25.8 AB017 TNF 123.2 AB033 EGFR (序列2) 44.4 DVD289 TNF EGFR(序列 2) 14 DVD290 EGFR(序列 2) TNF 4.8 ABO 17 T NF 123.2 140653.doc -303 - 201006485 AB060 RAGE 107.2 DVD295 RAGE TNF 46.4 DVD296 TNF RAGE 39.6 AB001 CD20 90.2 AB017 TNF 123.2 AB059 RGMa 17.8 DVD291 TNF RGMa 5.8 DVD292 RGMa TNF 0.6 AB001 CD20 90.2 AB033 EGFR 〔序列2) 44.4 DVD235 CD20 EGFR(序列 2) 0 DVD236 EGFR(序列 2) CD20 7.2 所有DVD在293細胞中表現較好。DVD可易於經蛋白質 A管柱純化。在大多數情況下，可易於自293細胞之上清液 獲得 >5 mg/L純化 DVD-Ig。 實例1.4.5 : A/B DVD-Ig之表徵及前導選擇 抗A/B DVD-Ig之結合親和力在Biacore上相對於蛋白質A 及蛋白質B兩者來分析。DVD-Ig之四價性質係藉由Biacore 上之多重結合研究來檢驗。同時，DVD-Ig對於蛋白質A及 蛋白質B之中和效能係如本文中描述分別藉由生物檢定來 評估。最好地保留原始親本mAb之親和力及效能之DVD-Ig 分子經選擇用於如本文中對於每一 mAb描述之深入物理化 學及生物分析（大鼠PK)表徵。基於分析之收集，將最終前 導DVD-Ig推進至CHO穩定細胞株發育中，且得自CHO之 材料用於獼猴中之穩定性、藥物代謝動力學及功效研究及 預調配活性。 實例2:生成且表徵雙可變區免疫球蛋白（DVD-Ig) 根據實例1.4.4.1，使用具有已知胺基酸序列之親本抗體 的雙可變區免疫球蛋白（DVD-Ig)係藉由合成編碼DVD-Ig 可變重鏈及DVD-Ig可變輕鏈序列之聚核苷酸片段且將片 140653.doc -304- 201006485 段選殖至pHybC-D2載體中來生成。如實例1.4.4.2中描 述，將DVD-Ig構築體選殖且表現於293細胞中。DVD-Ig蛋 白質係根據標準方法來純化。功能特徵係根據如所示之實 例1 · 1.1及1.1.2中描述之方法來測定。本發明之DVD-Ig之 DVD-Ig VH及VL鏈提供如下。 實例2.1 :生成AP(序列1)及Αβ(序列3)DVD-Ig 表17
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變a名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 62 kmi93H AB044VH A.B045VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFT ISRDNVRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNS YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLE LVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLY LQMNSLRAEDTAWYCASGDYWGQGTLVTVSS €3 VD193L AB044VL AB045VL DVLVTQSPLSIiPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNG DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPDIVMTQSPLSLPVTPGEP ASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR 64 VD194H AB045VH AB044VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM SWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYW GQGTLVTVS SASTKGPEVKLVESGGGLVKPGGS L RLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVASIH NRGTIF YLD S VKGRFTIS RDNVRNT L YLQMN S LR AEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYWGQGTSVTVSS 65 VD194L AB045VL AB044VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNG DTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWT FGGGTKVEIKRTVAAPDVLVTQSPLSLPVTPGEP ASISCRSTQTLVHRNGDTYLEWYLQKPGQSPQSL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR 305- 140653.doc 201006485 實例2.2:生成TNF及Αβ(序列2)DVD-Ig 表18
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 66 VD195H AB044VH AB017VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFT ISRDNVRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNS YAMDYWGQGT SVTVS SASTKGPEVQLVESGGGLV QPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLE WVSAITWNS GHI DYADS VEGRFTIS RDNAKNS LY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQG TLVTVSS 67 VD195L AB044VL AB017VL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNG DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAAS TLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATY YCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR 68 VD196H AB017VH AB044VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAM HWVRQAPGKGLEWVSAITWN S GHI DYADS VEGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYL STAS S LDYWGQGTLVTVS SASTKGPEVKLVESGG GLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISRDNVRNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYWGQG TSVTVSS 69 VD196L AB017VL AB044VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLA WYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGT KVEIKRTVAAPDVLVTQSPLSLPVTPGEPASISC RSTQTLVHRNGDTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR
306· 140653.doc 201006485 實例2.3:生成IL-Ιβ及AP(序列2)DVD-Ig 表19
S£Q ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 70 VD197H AB044VH AB032VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFT IS RDNVRNT L YLQMN S LRAEDT AVY YCT RGRSN S YAMDYWGQGTSVTVS SASTKGPQVQLVES GGGW QPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPGKGLE WVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFT 工 S RDNS KNTLY LQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTLV TVSS 71 VD197L AB044VL AB032VL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNG DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPEIVLTQSPDFQSVTPKEK VTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLL工KYAS QSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAY YCHQSSSLPFTFGPGTKVDIKR 72 VD198H AB032VH AB044VH QVQLVES GGGWQPGRS LRLS CAAS GFT FSVYGM NWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRF ΤΙ S RDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVY YCARDLRT GP FDYWGQGTLVTVS SASTKGPEVKLVESGGGLV KPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE WVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISRDNVRNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYWGQGTSV TVSS 73 VD198L AB032VL AB044VL EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLH WYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSG TDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGT KVDIKRTVAAPDVLVTQS PLS LPVTPGEPASI SC RSTQTLVHRNGDTyLEWYLQKPGQSPQSLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR 307- 140653.doc 201006485 實例2.4 :生成Ap(序列1)及Αβ(序列2)D VD-Ig 表20
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變s名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 74 VD201H AB044VH AB043VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFT ISRDNVRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNS YAMDYWGQGTSVTVS SASTKGPEVQLLES GGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLE WVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTL VTVSS 75 VD201L AB044VL AB043VL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNG DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPDWMTQSPLSLPVTPGEP ASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRL IYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKR 76 VD202H AB043VH AB044VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM SWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHY S GS S D YWGQGTLVTVS SASTKGPEVKLVESGGGL VKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISRDNVRNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSMSYAMDYWGQGTS VTVSS 77 VD202L AB043VL AB044VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDG KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRE'S GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRT FGQGTKVEIKRTVAAPDVLVTQSPLSLPVTPGEP ASISCRSTQTLVHRNGDTYLEWYLQKPGQSPQSL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR
308- 140653.doc 201006485 實例2.5:生成IGF1，2及Αβ(序列2)DVD-Ig 表21
SEQ ID KO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 78 VD203H ΛΒ044νΗ AB010VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFT ISRDNVRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNS YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPQVQLVQSGAEVK KPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLE WMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAY MELSSLRSEDTAVYYCARDPYYYYYGMDVWGQGT TVTVSS 79 VD203L AB044VL AB010VL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNG DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPQSVLTQPPSVSAAPGQKV TISCSGSSSNIENNHVSWYQQLPGTAPKLLIYDN NKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEAD YYCETWDTSLSAGRVFGGGTKLTVLG 80 VD204H AB010VH AB044VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDI NWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRV TMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPYY YYYGMDWGQGTTVTVSSASTKGPEVKLVESGGG LVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKG LEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISRDNVRNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYWGQGT SVTVSS 81 VD204L AB010VL AB044VL QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIENNHV SWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKS GTSATLGITGLQTGDEADYYCETWDTSLSAGRVF GGGTKLTVLGQPKAAPDVLVTQSPLSLPVTPGEP ASISCRSTQTLVHRNGDTYLEWYLQKPGQSPQSL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR
-309· 140653.doc 201006485 實例2.6:生成Ap(序列2)及IL-18DVD-Ig 表22
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變S名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 82 VD205H AB044VH AB046VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFT ISRDNVRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNS YAMDYWGQGTSVTVS SASTKGPEVQLVQSGTEVK KPGESLKISCKGSGYTVTSYWIGWVRQMPGKGLE WMGFIYPGDSETRYSPTFQGQVTISADKSFNTAF LQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYPYTFDIWGQG TMVTVSS 83 VD205L AB044VL AB046VL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNG DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPEIVMTQSPATLSVSPGER ATLSCRASESISSNLAWYQQKPGQAPRLFIYTAS TRATDIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVY YCQQYNNWPSITFGQGTRLEIKR 84 VD206H AB046VH AB044VH EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSGYTVTSYWI GWVRQMPGKGLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQV TISADKS FNTAFLQWS S LKAS DTAMYYCARVGSG WYPYTFDIWGQGTMVTVSSASTKGPEVKLVESGG GLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISRDNVRNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYWGQG TSVTVSS 85 VD206L AB046VL AB044VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESISSNLA WYQQKPGQAPRLFIYTASTRATDIPARFSGSGSG TEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPSITFGQG TRLEIKRTVAAPDVLVTQSPLSLPVTPGEPASIS CRSTQTLVHRNGDTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR
310. 140653.doc 201006485 實例2.7:生成IL-6及Ap(序列2)DVD-Ig 表23
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 86 VD207H AB044VH AB040VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFT ISRDNVRNTLYLQMN SLRAEDTAVYYOTRGRSNS YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPQVTLKESGPGIL QPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGMGVSWIRQPSGKG LEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSRLTISKDTSNNQV FLKITNVDTADTAT YYCARRRIIYDVEDYFDYWG QGTTLTVSS 87 VD207L AB044VL AB040VL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLVHRNG DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPQIVLIQSPAIMSASPGEK VTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSN LASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYY CQQWS GYPYT FGGGT KLEIKR 88 VD208H AB040VH AB044VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGM GVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSR LTISKDTSNNQVFLKITNVDTADTATYYCARRRI IYDVEDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPEVKLVES GGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISRDNVR NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYWG QGTSVTVSS 89 VD208L AB04 0VL A.B044VL QIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYW YQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGT SYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTK LEIKRTVAAPDVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCR STQTLVHRNGDTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR 311 · 140653.doc 201006485 實例2.8:生成TNF及Αβ(序列3)DVD-Ig 表24
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變a名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 90 VD209H AB045VH ^B017VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM SWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYW GQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPGRSL RLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAIT WNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKVS YLSTAS S LDYWGQGTLVTVS S 91 VD209L AB045VL AB017VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNG DTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWT FGGGTKVEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAAS TLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATY YCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR 92 VD210H AB017VH AB045VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAM HWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYL STAS S LDYWGQGTLVTVS SASTKGPEVQLVES GG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGK GLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVS S 93 VD210L AB017VL AB045VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLA WYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGT KVEIKRTVAAPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR
312- 140653.doc 201006485 實例2.9:生成IL-ip及Αβ(序列3)DVD-Ig 表25
SKQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 94 VD211H AB045VH AB032VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM SWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRF TIS RDNAKNTL YLQMNS LRAEDTAVYYCAS GD YW GQGTLVTVSSASTKGPQVQLVESGGGWQPGRSL RLSCAASGFT FSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAIIW YDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGL RAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTLVTVSS 95 VD211L AB045VL AB032VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNG DTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWT FGGGTKVEIKRTVAAPEIVLTQSPDFQSVTPKEK VTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYAS QSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAY YCHQSSSLPFTFGPGTKVDIKR 96 VD212H AB032VH AB045VH QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGM NWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAWYCARDLRT GPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLE LVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVSS 97 VD212L AB032VL AB045VL EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLH WYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSG TDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGT KVDIKRTVAAPDIVMTQS PLSLPVTPGEPASI SC RSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR
❹ 313- 140653.doc 201006485 實例2.10 :生成Αβ(序列1)及AP(序列3)DVD-Ig 表26
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 98 VD215H AB045VH AB043VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM SWVRQAPGKGLELVASINSNGGST YYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYW GQGTLVTVSSASTKGPEVQLLESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIR SGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSS 99 VD215L AB045VL AB043VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNG DTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWT FGGGTKVEIKRTVAAPDWMTQSPLSLPVTPGEP ASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRL IYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKR 100 VD216H AB043VH AB045VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM SWVRQAPGKGLEWVASIRS GGGRT YYS DNVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHY SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGL ELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTL YLQMN S LRAEDTAVY YCAS GD YWGQGT LVT VS S 101 VD216L AB043VL AB045VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDG KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRT FGQGTKVEIKRTVAAPDIVMTQSPLSLPVTPGEP ASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR -314·
140653.doc 201006485 實例 2.11:生成 IGF1，2 及 Ap(序列 3)DVD-Ig 表27
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 102 VD217H AB045VH ABOIOVH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM SWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYW GQGTLVTVSSASTKGPQVQLVQSGAEVKKPGASV KVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMN PNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNT SISTAYMELS SL RS EDTAWYCARDP YYYYYGMDVWGQGTTVTVS S 103 VD217L AB045VL AB010VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNG DTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWT FGGGTKVEIKRTVAAPQSVLTQPPSVSAAPGQKV TISCSGSSSNIENNHVSWYQQLPGTAPKLLIYDN NKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEAD YYCETWDTSLSAGRVFGGGTKLTVLG 104 VD218H AB010VH AB045VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDI NWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRV TMTRNTSISTAYMELS S LRSEDTAVY YCARDP YY YYYGMDWGQGTTVTVS SASTKGPEVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKG LELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVSS 105 VD218L AB010VL AB045VL QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIENMHV SWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKS GTSATLGITGLQTGDEADYYCETWDTSLSAGRVF GGGTKLTVLGQPKAAPDIVMTQSPLSLPVTPGEP ASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR
315· 140653.doc 201006485 實例2.12:生成AP(序列3)及IL-18DVD-Ig 表28
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 106 VD219H AB045VH AB046VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM SWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAWYCASGDYW GQGTLVTVSSASTKGPEVQLVQSGTEVKKPGESL KISCKGSGYTVTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGFIY PGDSETRYSPTFQGQVTISADKSFNTAFLQWSSL KASDTAMYYCARVGSGWYPYTFDIWGQGTMVTVS S 107 VD219L AB045VL AB046VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNG DTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWT FGGGTKVEIKRTVAAPEIVMTQSPATLSVSPGER ATLSCRAS ESIS SNLAWYQQKPGQAPRLFIYTAS TRATDIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVY YCQQYNNWPSITFGQGTRLEIKR 108 VD220H AB046VH AB045VH EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSGYTVTSYWI GWVRQMPGKGLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQV TISADKSFNTAFLQWSSLKASDTAMYYCARVGSG WYPYTFDIWGQGTMVTVSSASTKGPEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGK GLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVS S 109 VD220L AB046VL AB045VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESISSNLA WYQQKPGQAPRLFIYTASTRATDIPARFSGSGSG TEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPSITFGQG TRLEIKRTVAAPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASIS CRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR
316- 140653.doc 201006485 實例2.13:生成IL-6及Ap(序列3)DVD-Ig 表29
S£Q ID NO DVD可變 區名稱 外可變s 名稱 内可變s名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 110 VD221H AB045VH AB040VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM SWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYW GQGTLVTVSSASTKGPQVTLKESGPGILQPSQTL SLTCSFSGFSLSTNGMGVSWIRQPSGKGLEWLAH IYWDEDKRYNPSLKSRLTISKDTSNNQVFLKITN VDTADTATYYCARRRIIYDVEDYFDYWGQGTTLT VSS 111 VD221L AB045VL AB040VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNG DTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWT FGGGTKVEIKRTVAAPQIVLIQS PAIMSAS PGEK VTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSN LASGVPVRFSGSGSCiTSYSLTISRMEAEDAATYY CQQWSGYPYTFGGGTKLEIKR 112 VD222H AB040VH AB045VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGM GVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSR LTISKDTSNNQVFLKITNVDTADTAT YYCARRRI IYDVEDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPEVQLVES GGGLVQPGGS LRLS CAAS GFT FS S YGMSWVRQAP GKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVT VSS 113 VD222L AB040VL AB045VL QIVLIQS PAIMSASPGEKVTMTCSAS S SVSYMYW YQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGT SYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTK LEIKRTVAAPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR SSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR 317- 140653.doc 201006485 實例2·14:生成TNF及Ap(序列1)DVD-Ig 表30
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變a名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 114 VD223H AB043VH AB017VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM SWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHY SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGL VQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGL EWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQ GTLVTVSS 115 VD223L AB043VL AB017VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDG KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRT FGQGTKVEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAAS TLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATY YCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR 116 VD224H AB017VH AB043VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAM HWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVS YL STAS S LDYWGQGTLVTVS SASTKGPEVQLLES GG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYQ^SWVRQAPGK GLEWVASIRS GGGRT YYS DNVKGRFTIS RDN S KN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQ GTLVTVSS 117 VD224L AB017VL AB043VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLA WYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGT KVEIKRTVAAPDWMTQSPLSLPVTPGEPASISC KSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVS KLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKR
318- 140653.doc 201006485 實例2.15:生成11^-10及人0(序列1)〇¥〇-^ 表31
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 118 VD225H AB043VH ΛΒ032νΗ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM SWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHY SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVQLVESGGGV VQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPGKGL EWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTL VTVSS 119 VD225L AB043VL AB032VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDG KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRT FGQGTKVEIKRTVAAPEIVLTQSPDFQSVTPKEK VTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYAS QSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAY YCHQSSSLPFTFGPGTKVDIKR 120 VD226H A.B032VH A.B043VH QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGM NWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRT GPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLE WVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTL VTVSS 121 VD226L AB032VL AB043VL EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLH WYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSG TDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGT KVDIKRTVAAPDWMTQSPLSLPVTPGEPASISC KSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVS KLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKR ❹ 319- 140653.doc 201006485 實例 2.16:生成 IGF1，2及 Ap(序列 1)DVD-Ig 表32
SEQ ΣΟ NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變匾名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 122 VD229H AB043VH AB010VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM SWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHY SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVQLVQSGAEV KKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGL· EWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTA YMELSSLRSEDTAVYYCARDPYYYYYGMDVWGQG TTVTVSS 123 VD229L AB043VL AB010VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDG KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRT FGQGTKVEIKRTVAAPQSVLTQPPSVSAAPGQKV TISCSGSSSNIENNHVSWYQQLPGTAPKLLIYDN NKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEAD YYCETWDTSLSAGRVFGGGTKLTVLG 124 VD230H AB010VH AB043VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDI NWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRV TMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPYY YYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPEVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKG LEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNT L YLQMN S LRAEDTAVY YCVRYDH YS GS S D YWGQG TLVTVSS 125 VD230L AB010VL AB043VL QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIENNHV SWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKS GTSATLGITGLQTGDEADYYCETWDTSLSAGRVF GGGTKLTVLGQPKAAPDWMTQSPLSLPVTPGEP ASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRL IYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYTCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKR
•320 140653.doc 201006485 實例2.17:生成入0(序列1)及1[-18〇乂〇-1旦 表33
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 126 VD231H AB043VH AB04 6VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM SWVRQAPGKGLEWVASIRS GGGRT YYS DNVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHY SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVQSGTEV KKPGESLKISCKGSGYTVTSYWIGWVRQMPGKGL EWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQVTISADKS FNTA FLQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYPYTFDIWGQ GTMVTVSS 127 VD231L AB043VL AB046VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDG KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFS FGQGTKVEIKRTVAAPEIVMTQSPATLSVSPGER ATLSCRASESISSNLAWYQQKPGQAPRLFIYTAS TRATDIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVY YCQQYNNWPSITFGQGTRLEIKR 128 VD232H AB046VH AB043VH EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSGYTVTSYWI GWVRQMPGKGLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQV ΤI SADKS FNTAFLQWS S LKAS DTAMYYCARVGSG WYPYTFDIWGQGTMVTVS SASTKGPEVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGK GLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQ GTLVTVSS 129 VD232L AB046VL AB043VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESISSNLA WYQQKPGQAPRLFIYTASTRATDIPARFSGSGSG TEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPSITFGQG TRLEIKRTVAAPDWMTQSPLSLPVTPGEPASIS CKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLV SKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKR 321 · 140653.doc 201006485 實例2.18:生成11^-6及入释(序列1)〇¥0-；^ 表34
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變a 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 130 VD233H AB043VH AB040VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM SWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHY SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVTLKESGPGI LQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGMGVSWIRQPSGK GLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSRLTISKDTSNNQ VFLKITNVDTADTAT YYCARRRIIYDVEDYFDYW GQGTTLTVSS 131 VD233L AB043VL AB040VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDG KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRT FGQGTKVEIKRTVAAPQIVLIQSPAIMSASPGEK VTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSN LASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYY CQQWSGYPYTFGGGTKLEIKR 132 VD234H AB040VH AB043VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGM GVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSR LTISKDTSNNQVFLKITNVDTADTATYYCARRRI IYDVEDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPEVQLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAP GKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYW GQGTLVTVSS 133 VD234L AB040VL AB043VL QIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYW YQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGT SYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTK LEIKRTVAAPDWMTQSPLSLPVTPGEPASISCK SSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSK LDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CWQGTH FP RT FGQGT KVEIKR -322·
140653.doc 201006485 實例2.19:生成Ap(序列1)及RAGEDVUg 表35
DVD可變 外可變區 内可變區名 序列 SEQ 區名稱 名稱 稱 ID 1234567890123456789012345678901234 NO 134 VD293H AB060VH AB043VH QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGM NWKQAPGKGLKWMGYINTNTGESIYSEEFKGRF AFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARSRMV TAYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPEVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKG LEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNT L YLQMNS LRAEDTAVYYCVRYDHYS GS S D YWGQG TLVTVSS 135 VD293L AB060VL AB043V1 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVA WYQQRPGQSPKLLIFSASNRYTGVPDRFTGSGSG TDFTLTLSNMQPEDLADYFCQQYSSYPLTFGVGT KLELKRTVAAPDWMTQSPLSLPVTPGEPASISC KSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVS KLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKR 136 VD294H AB043VH AB060VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM SWVRQAPGKGLEWVASIRS GGGRT YYS DNVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHY SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPQIQLVQSGPEL KKPGETVKISCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGL KWMGYINTNTGESIYSEEFKGRFAFSLETSASTA YLQINNLKNEDTATYFCARSRMVTAYGMDYWGQG TSVTVSS 137 VD294L· AB043VL AB060VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDG KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRT FGQGTKVEIKRTVAAPDIVMTQSQKFMSTSVGDR VSITCKASQNVGTAVAWYQQRPGQSPKLLIFSAS NRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTLSNMQPEDLADY FCQQYSSYPLTFGVGTKLELKR 323· 140653.doc 201006485 實例 2.20:生成 NGF 及 IL-18DVD-Ig 表36
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變匾名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 138 VD239H AB046VH AB020VH EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSGYTVTSYWI GWVRQMPGKGLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQV TISADKS FNTAFLQWS SLKASDTAMYYCARVGS G WYP YTFDIWGQGTMVTVS S ASTKGPQVQLQE S GP GLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGK GLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYW GQGTLVTVSS 139 VD239L AB046VL AB020VL EIVHTQSPATLSVSPGERATLSCRASESISSNLA WYQQKPGQAPRLFIYTASTRATDIPARFSGSGSG TEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPSITFGQG TRLEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQ EHTLPYTFGQGTKLEIKR 140 VD240H AB020VH AB046VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDL NWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVT ISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWY ATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVQSGT EVKKPGESLKISCKGSGYTVTSYWIGWVRQMPGK GLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQVTISADKSFN TAFLQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYPYTFDIW GQGTMVTVSS 141 VD240L AB020VL AB046VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLN WYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGT KLEIKRTVAAPEIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASESISSNLAWYQQKPGQAPRLFIYTASTRATD IPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQY NNWPS 工 TFGQGTRLEIKR 324-
140653.doc 201006485 實例 2.21:生成 NGF 及 IL-ipDVD-Ig 表37
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變匾名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 142 VD243H AB032VH AB020VH QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGM NWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRT GPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVQLQESGPGLV KPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLE WIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQG TLVTVSS 143 VD243L AB032VL AB020VL EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLH WYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSG TDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGT KVDIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQE HTLPYTFGQGTKLEIKR 144 VD244H AB020VH AB032VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDL NWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVT IS KDT S KNQFS LKL S S VTAADTAVYYCARGG YWY ATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVQLVESGG GWQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPGK GLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQG TLVTVSS 145 VD244L AB020VL A.B032VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLN WYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGT KLEIKRTVAAPEIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC RASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSG VPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQS SSLPFTFGPGTKVDIKR
325 · 140653.doc 201006485 實例2.22:生成NGF及IL-6DVD-Ig 表38
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變匾 名稱 内可變匾名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 146 VD247H AB040VH AB020VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGM GVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSR LTIS KDT SNNQVFLKITNVDTADTAT YYCARRRI IYDVEDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPQVQLQES GPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPP GKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFD YWGQGTLVTVSS 147 VD247L AB040VL AB020VL QIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYW YQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGT SYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTK LEI KRTVAAPDIQMTQS PS SLSASVGDRVTITCR ASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGV PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEH TLPYTFGQGTKLEIKR 148 VD248H AB020VH AB040VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDL NWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVT ISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWY ATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVTLKESGP GILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGMGVSWIRQPS GKGLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSRLTISKDTSN NQVFLKITNVDTADTATYYCARRRIIYDVEDYFD YWGQGTTLTVSS 149 VD248L AB020VL AB040VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLN WYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGT KLEIKRTVAAPQIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTC SASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGV PVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWS GYPYTFGGGTKLEIKR
326- 140653.doc 201006485 實例2.23:生成TNF及EGFR(序列2)DVD-Ig 表39
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變a 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 150 VD289H AB017VH AB033VH EVQLVESGGGLVQPGRS LRLS CAASGFT FDDYAM HWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRF TISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCAKVS YL STAS S LDYWGQGTLVTVS SASTKGPQVQLKQSGP GLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGK GLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQ VFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQ GTLVTVSA 151 VD289L AB017VL AB033VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIFiNYLA WYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGT KVEIKRTVAAPDILLTQS PVILSVS PGERVS FSC RASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISG IPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQN NNWPTTFGAGTKLELKR 152 VD290H AB033VH AB017VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGV HWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLS INKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYY DYEFAYWGQGTLVTVSAZISTKGPEVQLVESGGGL VQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGL EWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQ GTLVTVSS 153 VD290L AB033VL AB017VL DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIH WYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSG TDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGT KLELKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRY NRAPYTFGQGTKVEIKR
327· 140653.doc 201006485 實例2.24:生成TNF及RAGEDVD-Ig 表40
S£Q ID NO DVD可變 匾名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 154 VD295H AB060VH AB017VH QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGM NWVKQAPGKGLKWMGYINTNTGESIYSEEFKGRF AFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARSRMV TAYGMDYWGQGT S VTVS SASTKGPEVQLVES GGG LVQPGRSLRLS CAAS GFT FDD YAMHWVRQAPGKG LEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNS Ι^ΥΙ^ΜΝΒΙ^ΗΑΕϋΤΑνΥΥεΑΚνΒΥΙ^ΤΑεεί^Υν^ QGTLVTVSS 155 VD295L AB060VL AB017VL DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVA WYQQRPGQSPKLLIFS7VSNRYTGVPDRFTGSGSG TDFTLTLSNMQPEDLADYFCQQYSSYPLTFGVGT KLELKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRY NRAPYTFGQGTKVEIKR 156 VD296H AB017VH AB060VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAM HWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYL STASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPQIQLVQSGP EIiKKPGETVKI S CKAS G YT FTNFGMNWVKQAP GK GLKWMGYINTNTGESIYSEEFKGRFAFSLETSAS taylqinnlknedtatyfcarsrmvtaygmdywg QGTSVTVSS 157 VD296L AB017VL AB060VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLA WYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGT KVEIKRTVAAPDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITC KASQNVGTAVAWYQQRPGQSPKLLIFSASNRYTG VPDRFTGSGSGTDFTLTLSNMQPEDLADYFCQQY SSYPLTFGVGTKLELKR
328- 140653.doc 201006485 實例 2·25 :生成 CD-20及 EGFR(序列 1)DVD-Ig 表41
S£Q ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 158 VD255H AB001VH AB003VH QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNM HWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKA TLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYY GGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPQVQLQESGP GLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSP GKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSK TQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQ GTMVTVSS 159 VD255L AB001VL AB003VL QIVLSQSPAILSPSPGEKVTMTCRASSSVSYIHW FQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGT SYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTK LEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQ ASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGV PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFD HLPLAFGGGTKVEIKR 160 VD256H AB003VH AB001VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDY YWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSR LTISIDTSKTQFSLKLS SVTAADTAIYYCVRDRV TGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPQVQLQQPGAEL VKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGL EWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTA YMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGA GTTVTVSA 161 VD256L AB003VL AB001VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGT KVEIKRTVAAPQIVLSQSPAILSPSPGEKVTMTC RASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGV PVRE'SGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWT SNPPTFGGGTKLEIKR 329- 140653.doc 201006485 實例 2.26 :生成 CD-20及 EGFR(序列 2)DVD-Ig 表42
SEQ ID NO DVD可變 區名稱 外可變區 名稱 内可變£名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 162 VD235H AB001VH AB033VH QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNM HWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKA TLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYY GGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPQVQLKQSGP GLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGK GLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQ VFFKMN S LQ SNDTAIYYCARALT YYDYE FAYWGQ GTLVTVSA 163 VD235L AB001VL AB033VL QIVLSQSPAILSPSPGEKVTMTCRASSSVSYIHW FQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGT SYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTK LEIKRTVAAPDILLTQS PVILSVS PGERVS FSCR ASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGI PSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNN NWPTTFGAGTKLELKR 164 VD236H AB033VH AB001VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGV HWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLS INKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAI YYCARALT YY DYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQQPGAEL VKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGL EWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTA YMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNWGA GTTVTVSA 165 VD236L AB033VL AB001VL DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIH WYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSG TDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGT KLELKRTVAAPQIVLSQSPAILSPSPGEKVTMTC RASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGV PVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWT SNP PTFGGGTKLEIKR
330· 140653.doc 201006485 實例2.27:生成RGMA及TNFDVD-Ig 表43
S£Q ID NO 〇\0)可《 區名稱 外可變區 名稱 内可變區名 稱 序列 1234567890123456789012345678901234 166 VD291H AB017VH AB059VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAM HWVRQAPGKGIiEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYL STASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGG GLVQPGSSLKLSCVASGFTFSNYGMNWIRQAPKK GLEWIGMIYYDSSEKHYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLEMNSLRSEDTAIYYCAKGTTPDYWGQGVMV TVSS 167 VD291L AB017VL AB059VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLA WYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGT KVEIKRTVAAPDWLTQTPVSLSVTLGDQASMSC RSSQSLEYSDGYTFLEWFLQKPGQSPQLLIYEVS NRFSGVPDRFIGSGSGTDFTLKISRVEPEDLGVY YCFQATHDPLTFGSGTKLEIKR 168 VD292H AB059VH • AB017VH EVQLVESGGGLVQPGSSLKLSCVASGFTFSNYGM NWIRQAPKKGLEWICT4IYYDSSEKHYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLEMNSLRSEDTAIYYCAKGTTP DYWGQGVMVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPG RSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQ7VPGKGLEWVS AITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQM NSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLV TVSS 169 VD292L AB059VL AB017VL DWLTQTPVSLSVTLGDQASMSCRSSQSLEYSDG YTFLEWFLQKPGQSPQLLIYEVSNRFSGVPDRFI GSGSGTDFTLKISRVEPEDLGWYCFQATHDPLT FGSGTKLEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAAS TLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATY YCQRYNRAPYT FGQGTKVEIKR -331 - 140653.doc 201006485 實例2.28 :用以選殖親本抗體及DVD-Ig序列之選殖載 體序列 表44
SEQ ID NO 栽«名稱 170 VI
核苷at序对123456789012345678901234567890123456789012345678901 GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGC GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGG ATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAA TAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGG CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCC CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACQACATCTCTGCCCCTTCTTCGCG GGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGC CCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGA CTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTG GCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTG CCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACAT GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTC CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATG GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGG CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCT TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAA GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATA AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAA CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCT GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT GGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT GCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA GGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTT TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT ❿ 140653.doc -332- 201006485
GGTAAG AAACGC
GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCT CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC AA.CAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC VGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG ^CGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG GGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG 140653.doc 333 _ 201006485 171 V2
AACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGAT TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGSGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTG CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGC TTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCT TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGG TATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCG CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG GGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCC GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGC GTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG GAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAA AAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCG GGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTC TTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTG GGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGA ATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGT GGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAG ATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGA CCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATT TGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGG ACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGC ATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCA CATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTG ACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATC CTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGT GTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCC AGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCC TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTT ATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGT AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACG GGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGC GATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGA TTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATC AAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCC TTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGT GAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGA CGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAA ACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTT TAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCA TCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGA TACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCA TGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGC AGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCC ACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAA TTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGG VTAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCAC =lCCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATAC CTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTG GAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGG TCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGG GTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATA TCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCAT
ACTGTAAAAM TGCGGTCAAAC 140653.doc 334· 201006485
TAAAAG TTAACG ❹
AGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAA TAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATA CTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGC ATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCT AATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCG GGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTG AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGAT AATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGG AACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCAT GAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTG CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGA AGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGG TAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCA AGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATT ATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCT GACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGG GGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTT GCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATT AATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGG GTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAG ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGA CCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATT \GGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCC \CGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACC AACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC ACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGA. AAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGG CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATT TTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGC GGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTG AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAG CGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTA GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCC TAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTT TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAG ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTA GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCG CACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAAC CGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGT AGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGT 140653.doc -335 - 201006485 172 V3
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140653.doc •336- 201006485
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140653.doc -338- 201006485
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AAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCC TTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCC CGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGG AGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAA GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTG GCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGT TTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTC GGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTC TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGC CCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGA AAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCG GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTC CAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTG GGGGGAGGGGTTTTATGCGA.TGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGAC TGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCT TTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAG TTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGA CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGACTTGGACCCCACTCCTCT TCCTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG CAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCG GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC AGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGC TGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA GAATGTTCATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCT CGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGA ATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGG TCGA.GATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACG AACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATG T7VATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACAT GTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACA TCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTG GAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACTSACATTGCCTTTATGTGTA ACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGG GGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGT GTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATA AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGT ATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGA AGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGAT ATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTC CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAG GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTC GTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAG GTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGG GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACi CCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATC CAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCT CACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATAC TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGC GGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACG CCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTG TGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACT iVTAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGC VCCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTG VGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAG \TTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCC TCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTA GCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGG ❹ GTAAAATA GGTCAAAC VTAAGT \CAAA1
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140653.doc -340- 201006485 ❹
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ATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGAGTTTGGG
CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC 本發明將在分子生物學及藥物傳遞領域中熟知之技術全 部以引用的方式併入。此等技術包括（但不限於）在以下公 開案中描述之技術： Ausubel等人（編）
Current Protocols in Molecular ⑬
Biology, John Wiley &Sons5 NY (1993)；
Ausubel，F.M.等人編，Short Protocols In . Molecular Biology(第 4版 1999)John Wiley & Sons，NY. (ISBN 0-471-32938-X) °
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<210> 1 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 1
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 15 10 15 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 2
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 15 10 15 _ Val <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 3
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 4 140653-序列表.doc 201006485
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 5
Ser Ala Lys Thr Thr Pro <210〉 6 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 6
Arg Ala Asp Ala Ala Pro <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 7
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 8
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 9
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 10 <211> 18 -2- 140653·序列表.doc 201006485 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 10
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Scr Glu Ala 15 10 15
Arg Val <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 11
Ala Asp Ala Ala Pro 參 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 12
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 13
Thr Val Ala Ala Pro 1 5
<210> 14 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 14
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 140653-序列表.doc 201006485 <400> 15
Gin Pro Lys Ala Ala Pro <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 16
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 17 <21l> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 17
Ala Lys Thr Thr Pro Pro 1 5 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 18
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <2I3>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 19
Ala Lys Thr Thr Ala Pro 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 20
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 4- 140653-序列表.doc 201006485 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成肽 <400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser l 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 24
Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> FRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 25
Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser 15 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 26
Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gin Val Gin Tyr Pro Ala Ser 15 10 15 <210> 27 <211> 5 140653-序列表.doc 201006485 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 28 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 28
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多狀 <400> 29
Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Pro Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr lie 20 25 30
His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr 35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Aia Ser Gly Va】Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 -6- 140653-序列表.doc 201006485
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 30 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 30
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp lie Gly His He Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser He Asp Thr Ser Lys Thr Gin Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala lie Tyr Tyr 85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly 100 305 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 31 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 31
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 140653-序列表.doc 201006485
Tyr Asp Ala Scr Asn Leu Gtu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin His Phe Asp His Leu Pro Leu 85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> ,人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 32
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Asp lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly Leu Giu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 33
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15
Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Glu Asn Asn 20 25 30 140653-序列表.doc 201006485
His Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu 85 90 95
Ser Ala Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 34 <211> 12〗 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 34
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 35
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr -9- 140653-序列表.doc 201006485 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 36 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> · <223>人工序列之描述··合成多肽 <400> 36
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr 20 25 30
Asp Leu Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly lie lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp 丁yr Asn Ser Ala Val Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 37
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 -10- 140653-序列表.doc 201006485
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser 乙eu G]n Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu His Thr Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105
<210> 38 <211> 118 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 38
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala He lie Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gin Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr 丁rp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 -11 - 140653-序列表.doc 201006485 <400> 39
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg 100 105 <210> 40 <211> 119 <212> PRT <^13>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 40
Gin Val Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60
Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <2I0> 41 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 -12· 140653-序列表.doc 201006485 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 41
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Val lie Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn 20 25 30 lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu He 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser He Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 42 <211> 123 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 42
Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn 20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gin Val 65 70 75 80
Phe Leu Lys lie Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Arg lie lie Tyr Asp Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 107 -13- 140653-序列表.doc 201006485 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 43
Gin lie Val Leu lie Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30
Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 44 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 44
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 -14- 140653·序列表.doc 201006485 <210〉 45 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 45
Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 46 <211〉 118 <212> ?RT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 46
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg G3n Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 •15· 140653-序列表.doc 201006485
Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 47
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His Arg 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 48 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 48
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45
Ala Ser lie Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr •16· 140653-序列表.doc 201006485 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 49 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 49
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 50 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 50
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp He Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Phe lie Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Thr Phe 50 55 60 •17- 140653-序列表.doc 201006485
Gin Gly Gin Val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Gly Ser Gly Trp Tyr Pro Tyr Thr Phe Asp lie Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 109 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 51
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser lie Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Phe lie 35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Trp Fro Ser 85 90 95
He Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 52 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 52
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Gin Ser Phe Gly Tyr lie Phe lie Asp His 20 25 30
Thr lie His Trp Met Arg Gin Met Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 -18- 140653·序列表.doc 201006485
Gly Ala He Ser Pro Arg His Asp lie Thr Lys Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60
Arg Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Ser Thr lie Trp Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <21l> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 53
Glu Thr Thr Val Thr Gin Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys lie Thr Thr Thr Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30
Met Asn Trp Phe Gin Gin Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Ser Glu Gly Asn lie Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Lys Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Asp Asn Leu Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 54 <211> 115 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 54
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Ser 15 30 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 -19· 140653-序列表.doc 201006485
Gly Met Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser 115 <210> 55 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 55
Asp Val Val Leu Thr Gin Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 15 10 15
Asp Gin Ala Ser Met Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30
Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe lie Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala 85 90 95
Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110
Arg <210> 56 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 56
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu -20_ 140653-序列表.doc 201006485 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser lie Tyr Ser Glu Glu Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 57
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Phe Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Asn Met Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 58 <211> 330 <212> PRT <213>智人 <400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys -21 - 140653-序列表.doc 201006485 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val ΊΤιγ Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Vai Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 -22- 140653·序列表.doc 201006485
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 59 <211> 330 <212> PRT <213>智人 <400> 59
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Scr Val Val Thr Val Pro Scr Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Set Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr -23· 140653-序列表.doc 201006485 245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro GIu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 60 <211> 106 <212> PRT <213>智人 <400> 60
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 61 <211> 105 <212> PRT <213>智人 <400> 61
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15
Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe 20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 -24· 140653-序列表.doc 201006485
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 50 55 60
Tyr Ala Ala Scr Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser 65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 62 <211> 236 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 62
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 參
Scr Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Giy Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu 115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp 145 150 155 160
Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Ala Ser lie Asn 165 170 175
Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn 195 200 205 -25- 140653·序列表.doc 201006485
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp 210 215 220
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 63 <211> 231 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 63
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His Arg 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser 115 120 125
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser 130 135 140
Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu 145 150 155 160
Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn 165 170 175
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 180 185 190
Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 195 200 205
Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Ήκ Phe Gly Gly Gly 210 215 220 -26- 140653-序列表.doc 201006485
Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 225 230 <210> 64 <211> 236 <212> PRT <213>人工序列 <220> i：223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 64
Glu Val Gin Leu Val Glu Sex Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45
Ala Ser lie Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 130 135 140
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe 165 170 175
Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val 180 185 190
Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp 210 215 220
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 65 <211> 231 -27- 140653·序列表.doc 201006485 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 65
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser 115 120 125
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr 130 135 140
Gin Thr Leu Val His Arg Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Giu Trp Tyr Leu 145 150 155 160
Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn 165 170 175
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 180 185 190
Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 195 200 205
Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 210 215 220
Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 225 230 <210> 66 <211> 245 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 140653-序列表.doc -28- 201006485 <400> 66
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu 115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu 130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp 145 150 155 160
Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala lie Thr 165 170 175
Trp Asn Ser Gly His He Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe 180 185 190
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn 195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser 210 215 220
Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 67 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 67
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly -29- 140653-序列表.doc 201006485 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His Arg 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 115 120 125
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Gly lie Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 145 150 155 160
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val 165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg 195 200 205
Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 68 <211> 245 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 68
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 •30· 140653·序列表.doc 201006485
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu 115 120 125
Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Scr Ser Tyr Ala 145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 165 170 175
Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg 210 215 220
Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 69 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 69
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie -31 - 140653-序列表.doc 201006485 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 115 120 125
Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His 130 135 140
Arg Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin 195 200 205
Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 70 <211> 242 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 70
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60 -32- 140653·序列表 _doc 201006485
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu 115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu 130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Gly Met Asn Trp 145 150 155 160
Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala lie lie Trp 165 170 175 ❿
Tyr Asp Gly Asp Asn Gin Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn 195 200 205
Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu 210 215 220
Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240
Ser Ser <210> 71 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 ® <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 71
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Scr Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His Arg 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie •33- 140653-序列表.doc 201006485 65 70 75 80
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Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe 115 120 125
Gin Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Ser lie Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin 145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Scr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin 195 200 205
Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 72 <211> 242 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400〉 72
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala lie lie Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gin Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 -34-
140653·序列表.doc 201006485
Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Scr Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Lys Leu 115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp 145 150. 155 160
Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser lie His 165 170 175
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Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Arg Ser 210 215 220
Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val 225 230 235 240
Ser Ser <210> 73 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 73
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn SeT Leu Glu Ala 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Phe 85 90 95
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Pro Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 115 120 125
Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His 130 135 140
Arg Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin 195 200 205
Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly TTbr Lys Leu Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 74 <211> 243 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 74
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
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Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
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Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140
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Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Arg 165 170 275
Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn 195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp 210 215 220
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Val Ser Ser <210> 75 <211> 231 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 75
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His Arg 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Giu lie Lys 100 105 110
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Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys 165 170 375
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 180 185 190
Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 195 200 205
Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly 210 215 220
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Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Va! Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser He Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Lys 115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140
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Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn 195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Arg 210 215 220
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Val Ser Ser
<210> 77 <211> 231 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 77
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Pro Gin Arg Leu 】le Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
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Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 110
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Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Set lie Ser Cys Arg Ser Thr 130 135 140
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Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn -39- 140653-序列表.doc 201006485 165 170 175
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 180 185 190
Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 195 200 205
Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 210 215 220
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Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
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Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 130 135 140
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Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser 195 200 205
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro 210 215 220
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Thr Val Ser Ser <210> 79 <211> 230 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 79 魯
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His Arg 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
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Gly lie Thr Gly Leu Gin Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu •41 - 140653-序列表.doc 201006485 195 200 205
Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr 210 215 220
Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 80 <211> 244 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 80
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
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Asp lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
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Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser 165 170 175 lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190
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Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly 210 215 220 •42- 140653-序列表.doc 201006485
Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val 225 230 235 240
Thr Val Ser Ser <210> 81 <211> 231 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 81
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15
Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Glu Asn Asn 20 25 30
His Va] Ser Trp Tyr Gin Gin 乙eu Pro Gly Thr A]a Pro Lys Leu Leu
lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu 85 90 95
Ser Ala Gly Arg Val Phc Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser 115 120 125
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr 130 135 140
Gin Thr Leu Val His Arg Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu 145 150 155 160
Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn 165 170 175
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 180 185 190
Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 195 200 205
Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 210 215 220
Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 43- 140653·序列表.doc 201006485 225 230 <210> 82 <211> 245 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 82
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu 115 120 125
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Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Phe lie Tyr 165 170 175
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Ser Gly Trp Tyr Pro Tyr Thr Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met 225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser 245 -44· 140653·序列表.doc 201006485 <210> 83 <211> 227 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 83
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His Arg 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr 115 120 125
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Glu Ser lie Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ala Pro Arg Leu Phe lie Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp lie 165 170 175
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 180 185 190
He Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 195 200 205
Tyr Asn Asn Trp Pro Ser He Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu 210 215 220 lie Lys Arg 225 <210> 84 <211> 245 <212> PRT <213>人工序列 45- 140653-序列表.doc 201006485 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 84
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Phe He Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Thr Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Gly Ser Gly Trp Tyr Pro Tyr Thr Phe Asp lie Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu 115 120 125
Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 165 170 175
Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg 210 215 220
Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Giy Thr Ser 225 230 235 240
Val ^ Val Ser $ <210> 85 <211> 227 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描逑：合成多肽 ·46· 140653-序列表.doc 201006485 <400> 85
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Scr Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser lie Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Phe lie 35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Trp Pro Ser 85 90 95
lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu He Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110
Ala Pro Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr 115 120 125
Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val 130 135 140
His Arg Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 145 150 155 160
Gin Ser Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 165 170 175
Val Pro Asp Arg Phe Set Gly Set Gly Set Gly Thr Asp Phe Thr Leu 180 185 190
Lys lie Set Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe 195 200 205
Gin Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 210 215 220 lie Lys Arg 225 <210> 86 <211> 247 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 86
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15 -47- 140653-序列表.doc 201006485
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Thr Leu 115 120 125
Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu 130 135 140
Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn Gly Met Gly Val 145 150 155 160
Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His 165 170 175 lie Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg 180 185 190
Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gin Val Phe Leu Lys He 195 200 205
Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg 210 215 220
Arg lie lie Tyr Asp Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 225 230 235 240
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 <210> 87 <211> 225 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 87
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leu Val His Arg 20 25 30 •48· 140653-序列表.doc 201006485
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Gin lie Val Leu lie Gin Ser Pro Ala lie 115 120 125
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 130 135 140
Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser 145 150 155 160
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 165 170 175
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He 180 185 190
Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 195 200 205
Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 210 215 220
Arg 225
<210> 88 <211> 247 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 88
Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn 20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 •49· 140653-序列表.doc 201006485
Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gin Val 65 70 75 80
Phe Leu Lys lie Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Arg He lie Tyr Asp Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125
Pro Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 145 150 155 160
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 165 170 175
Val Ala Ser lie His Asn Arg Gly Thr lie Phe Tyr Leu Asp Ser Val 180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr 195 200 205
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 210 215 220
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 225 230 235 240
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 89 <211> 225 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 89
Gin lie Vai Leu lie Gin Ser Pro Ala He Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30
Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 -50- 140653-序列表.doc 201006485
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Set* Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Asp Val Leu Val Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 115 120 125
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Thr Gin Thr Leii Val His Arg 130 135 140
Asn G]y Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 145 150 155 160
Pro Gin Ser Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 165 170 175
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 180 185 190
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 195 200 205
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 210 215 220
Arg 225 <210> 90 <211> 239 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 ⑩ <400> 90
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45
Ala Ser lie Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 -51 - 140653-序列表.doc 201006485
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125
Leu Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 130 135 140
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His He 165 170 175
Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn 180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser 210 215 220
Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 91 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 91
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 -52· 140653-序列表.doc 201006485 ATg Thr Val Ala Ala Pro Asp He Gin Met Thr Gin Set Pro Ser Set 115 120 125
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Gly lie Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 145 150 155 160
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val 165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg 195 200 205
Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 210 215 220 ❿ <210> 92 <211> 239 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 92
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu 115 120 125 •53· 140653-序列表.doc 201006485
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser 130 135 140
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Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Ala 165 170 175
Ser lie Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 180 185 190
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220
Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 93 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 93
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
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Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr 130 135 140
Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160 -54· 140653-序列表.doc 201006485
Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala GIu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin 195 200 205
Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val GIu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 94 <211> 236 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 94
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Scr Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45
Ala Ser lie Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125
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Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala lie lie Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gin 165 170 175 -55- 140653·序列表.doc 201006485
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn 180 185 190
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp 195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp 210 215 220
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 95 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 95
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
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Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 96 <211> 236 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 96
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
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Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190
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Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp 210 215 220 -57- 140653-序列表.doc 201006485
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 97 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 97
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 115 120 125
Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr 130 135 140
Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin 195 200 205
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Lys Arg 225 <2!0> 98 <211> 237 •58· 140653-序列表.doc 201006485 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 98
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45
Ala Ser lie Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Scr 100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125
Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 130 135 140
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr 165 170 175
Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Scr 210 215 220
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Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser lie Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin 115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 145 150 155 160
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Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly 210 215 220
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Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 195 200 205 Ήιγ Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 210 215 220
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Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 145 150 155 160
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45
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<2幻> 人工序列之描述：合成多肽 <400> 107
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Gin lie Val Leu lie Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 180 185 190
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 195 200 205
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Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala lie 165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg 180 185 190
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met 195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val 210 215 220
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 115 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 115
Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 •74- 140653·序列表.doc 201006485
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Pro Gin Arg Leu He Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Va! Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Gly lie Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 145 150 155 160
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val 165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg 195 200 205
Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 116 <211> 246 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 116
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie TTir 丁rp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 -75· 140653-序列表.doc 201006485
Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu 115 120 125
Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser 130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 165 170 175
Ser lie Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 180 185 190
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 210 215 220
Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 225 230 235 240
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Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30
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Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 -76- 140653-序列表.doc 201006485
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Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Gin Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Scr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin 195 200 205
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Lys Arg 225 <210> 118 <211> 243 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 118
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val G3n Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 -77- 140653·序列表.doc 201006485
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Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
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Gin Ser lie Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin 145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin 195 200 205
Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 120 <211> 243 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 120
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu 115 120 125 -79- 140653·序列表.doc 201006485
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Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Arg 165 170 175
Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn 195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp 210 215 220
His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240
Val Ser Ser <210> 121 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 121
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser 20 25 30
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Pro Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 115 120 125 -80 - 140653·序列表.doc 201006485
Gly Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp 130 135 140
Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Gin Arg Leu lie Tyr Leu Val Set Lys Leu Asp Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ISO 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin 195 200 205
Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 參 <210> 122 <211> 245 <212> FRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 122
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
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Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp lie Asn 145 150 155 160 -81 · 140653-序列表.doc 201006485
Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met 165 170 175
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Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp 210 215 220
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Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95
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Ser Ala Ala Pro Gly Gin Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser 130 135 140
Ser Asn lie Glu Asn Asn His Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly 145 150 155 160 • 82· 140653-序列表.doc 201006485
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Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Scr Tyr 20 25 30
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Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 195 200 205
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Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15
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His Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu 85 90 95
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Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 195 200 205
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Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
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Tyr Asn Asn Trp Pro Ser Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu 210 215 220 -86· 140653-序列表.doc 201006485 lie Lys Arg 225 <210〉 128 <211> 246 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 128
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly GIu 15 10 15
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 165 170 175
Ser lie Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 180 185 190
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 210 215 220
Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser 245 -87- 140653-序列表.doc 201006485 <210> 129 <211> 227 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 129
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser lie Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Phe lie 35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
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Ala Pro Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr 115 120 125
Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 130 135 140
Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys Pro Gly 145 150 155 160
Gin Ser Pro Gin Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly 165 170 175
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 180 185 190
Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp 195 200 205
Gin Gly Thr His Phe Pro Ar£ Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 210 215 220 lie Lys Arg 225 <210> 130 <211> 248 <212> PRT <213>人工序列 -88 - 140653 -序列表.doc 201006485 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 130
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr 35 40 45
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Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95
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Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Asn 130 135 140
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Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala 180 185 190
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Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30
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Pro Asp lie Leu Leu Thr Gin Set Pro Val lie Leu Ser Val Ser Pro 115 120 125
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Asn He His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 145 150 155 160 lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly He Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
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Ser Glu Asp He Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro
Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 210 215 220 <210> 152 <211> 246 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 152
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Ser Arg Leu Scr lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Scr Gin Val Phe Phe 65 70 75 80
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Arg Ala Leu ?〇r Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin 115 120 125
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 -110- 140653-序列表.doc 201006485 lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Set 165 170 175
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Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser lie Tyr Ser Glu Glu Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
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Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Arg Met Val Thr Ala TyT Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val 115 120 125
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu 130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met 145 150 155 160
His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 165 170 175 lie Thr Trp Asn Scr Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly 180 185 190 -111- 140653-序列表.doc 201006485
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin 195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 210 215 220
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 155 <211> 221 <212> PRT <2!3>人工序列 <220> <223>人工序列之描述··合成多肽 <400> 155
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Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin 180 185 190
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro 195 200 205 -112- 140653·序列表.doc 201006485
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Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 210 215 220
Arg Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 225 230 235 240 140653-序列表.doc -113· 201006485
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 157 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 157
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
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Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu -116- 140653-序列表.doc 201006485 35 40 45
Trp lie Gly His lie Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser lie Asp Thr Ser Lys Thr Gin Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala lie Tyr Tyr 85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin 115 120 125
Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Scr Val Lys 130 135 140
Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 145 150 155 160
Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp He Gly Ala lie 165 170 175
Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys 180 185 190
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Scr Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu 195 200 205
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 210 215 220
Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ala 245 <210> 161 <211> 220 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 161
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Scr Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 -117· 140653-序列表.doc 201006485
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
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201006485 cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcct£gcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaggaat tctctagaga tccctcgacc tcgagatcca ttgtgcccgg gcgccaccat ggagtttggg ctgagctggc tttttcttgt cgcgatttta aaaggtgtcc agtgc <210> 171 <211> 6521 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成聚核苷酸 <400> 171 acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaasagc ttcaacaggg gagagtgttg agcggccgct cgaggccggc aaggccggat cccccgacct cgacctctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt ggtcgagatc cctcggagat ctctagctag aggatcgatc cccgccccgg acgaactaaa cctgactacg acatctctgc cccttcttcg cggggcagtg catgtaatcc cttcagttgg ttggtacaac ttgccaactg ggccctgttc cacatgtgac acgggggggg accaaacaca aaggggttct ctgactgtag ttgacatcct tataaatgga tgtgcacatt tgccaacact gagtggcttt catcctggag cagactttgc agtctgtgga ctgcaacaca acattgcctt tatgtgtaac tcttggctga agctcttaca ccaatgctgg gggacatgta cctcccaggg gcccaggaag actacgggag gctacaccaa cgtcaatcag aggggcctgt gtagctaccg ataagcggac cctcaagagg gcattagcaa tagtgtttat aaggccccct tgttaaccct aaacgggtag catatgcttc ccgggtagta gtatatacta tccagactaa ccctaattca atagcatatg ttacccaacg ggaagcatat gctatcgaat tagggttagt aaaagggtcc taaggaacag cgatatctcc 140653-序列表.doc • 129- 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 7185 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 201006485 caccccatga gctgtcacgg ttttatttac atggggtcag gattccacga gggtagtgaa 1140 ccattttagt cacaagggca gtggctgaag atcaaggagc gggcagtgaa ctctcctgaa 1200 tcttcgcctg cttcttcatt ctccttcgtt tagctaatag aataactgct gagttgtgaa 1260 cagtaaggtg tatgtgaggt gctcgaaaac aaggtttcag gtgacgcccc cagaataaaa 1320 tttggacggg gggttcagtg gtggcattgt gctatgacac caatataacc ctcacaaacc 1380 ccttgggcaa taaatactag tgtaggaatg aaacattctg aatatcttta acaatagaaa 1440 tccatggggt ggggacaagc cgtaaagact ggatgtccat ctcacacgaa tttatggcta 1500 tgggcaacac ataatcctag tgcaatatga tactggggtt attaagatgt gtcccaggca 1560 ggsaccaaga caggtgaacc atgttgttac actctatttg taacaagggg aaagagagtg 1620 gacgccgaca gcagcggact ccactggttg tctctaacac ccccgaaaat taaacggggc 1680 tccacgccaa tggggcccat aaacaaagac aagtggccac tctttttttt gaaattgtgg 1740 agtgggggca cgcgtcagcc cccacacgcc gccctgcggt tttggactgt aaaataaggg 1800 tgtaataact tggctgattg taaccccgct aaccactgcg gtcaaaccac ttgcccacaa I860 aaccactaat ggcaccccgg ggaatacctg cataagtagg tgggcssgcc aagataggg£ 1920 cgcgattgct gcgatctgga ggacaaatta cacacacttg cgcctgagcg ccaagcacag 1980 ggttgttggt cctcatattc acgaggtcgc tgagagcacg gtgggctaat gttgccatgg 2040 gtagcatata ctacccaaat atctggatag catatgctat cctaatctat atctgggtag 2100 cataggctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag 2160 tatatgctat cctaatttat atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag 2220 catatgctat cctaatctat atctgggtag tatatgctat cctaatctgt atccgggtag 2280 catatgctat cctaatagas attagggtag tatatgctat cctaatttat atctgggtag 2340 catatactac ccaaatatct ggatagcata tgctatccta atctatatct gggtagcata 2400 tgctatccta atctatatct gsgtagcata ggctatccta atctatatct gggtagcata 2460 tgctatccta atctatatct gggtagtata tgctatccta atttatatct gggtagcata 2520* Sgctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct 卿tagtata 2580 tgctatccta atctgtatcc gggtagcata tgctatcctc atgataagct gtcaaacatg 2640 agaattttct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat 2700 gataataatg gtttcttaga cetcaggtss cacttttcgg sgaaatgtgc gcggaacccc 2760 tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccs ctcatgagac aataaccctg 2820 ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccatgtcgc 2880 ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt 2940 gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcs aactggatct 3000 caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac 3060 ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtfitt gacgccgggc aagagcaact 3120 cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttsag tactcaccag tcacagaaaa 3180 gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga 3240 taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt 3300 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201006485 agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgca gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac afigaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctctagcta gaggtcgagt ccctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctttgcaaa gatggataaa gttttaaaca gagaggaatc tttgcagcta atggaccttc taggtcttga aaggagtggg aattggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt ggttcccgcg ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc acctggctgc agtacgtgat tcttgatccc gagcttcggg ttggaagtgg 140653·序列表.doc -131 - 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 201006485 gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg cctcgtgctt gagttgag£c 5640 ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg caccttcgcg cctgtctcgc 5700 tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga cctgctgcga cgcttttttt 5760 ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca agatctgcac actggtattt cggtttttgg 5820 ggccgcgggc ggcgaiCgggg cccgtgcgic ccagcgcaca tgttcggcga ggc££gscct 5880 gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc ctgctctggt 5940 gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc 6000 accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg 6060 gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt 6120 tccfitcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct 6180 cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttagst tggggggagg ggttttatgc 6240 gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat 6300 gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca 6360 gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaggaattc tctagagatc 6420 cctcgacctc gagatccatt gtgcccgggc gcaccatgga catgcgcgtg cccgcccagc 6480 tgctgggcct gctgctgctg tggttccccg gctcgcgatg c 6521 <210> 172 <211> 6513 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成聚核苷酸 <400> 172 caacccaagg ctgccccctc ggtcactctg ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc 60 aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc 120 tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa 180 agcaacaaca agtacgcg£c cagcagctac ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc 240 cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat £aagggagca ccstggagaa gacagtggcc 300 cctacagaat gttcatgagc ggccgctcga ggccggcaag gccggatccc ccgacctcga 360 cctctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 420 tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttggt cgagatccct cggagatctc 480 tagctagagg atcgatcccc gccccggacg aactaaacct gactacgaca tctctgcccc 540 ttcttcgcgg gscagtgcat gtaatccctt cagttggttg gtacaacttg ccaactgggc 600 cctgttccac atgtgacacg gggggggacc aaacacaaag gggttctctg actgtasttg 660 acatccttat aaatggatgt gcacatttgc caacactgag tggctttcat cctggagcag 720 actttgcagt ctgtggactg caacacaaca ttgcctttat gtgtaactct tggctgaagc 7S0 tcttacacca atgctggggg acatgtacct cccagggscc caggaagact acgggaggct 840 acaccaacgt caatcagagg ggcctgtgta gctaccgata agcggaccct caagagggca 900 ttascaatae tstttataag gcccccttgt taaccctaaa cgggtagcat atgcttcccg 960 ggtagtagta tatactatcc agactaaccc taattcaata gcatatgtta cccaacggga 1020 -132- 140653-序列表.doc 201006485
agcatatgct cccatgagct ttttagtcac tcgcctgctt taaggtgtat ggacgggggg tgggcaataa atsgggtggg gcaacacata accaagacag gccgacagca acgccaatgg gggggcacgc aataacttss cactaatggc gattgctgcg tgttggtcct gcatatacta aggctatcct atgctatcct atgctatcct atgctatcct atactaccca tatcctaatc tatcctaatc tatcctaatc tatcctaatc attttcttga aataatggtt ttgtttattt aatgcttcaa tattcccttt agtaaaagat cagcggtaag taaagttctg tcgccgcata tcttacggat atcgaattag gtcacggttt aagggcagtg cttcattctc gtgaggtgct ttcagtggtg atactagtgt gacaagccgt atcctagtgc gtgaaccatg gcggactcca ggcccataaa gtcagccccc ctgattstaa accccgggga atctggagga catattcacg cccaaatatc aatctatatc aatttatatc aatctatatc aatagagatt aatatctgga tatatctggg tatatctggg tatatctggg tgtatccggg agacgaaagg tcttagacgt ttctaaatac taatattgaa tttgcggcat gctgaagatc atccttgaga ctatgtggcg cactattctc ggcatgacag ggttagtaaa tatttacatg gctgaagatc cttcgtttag cgaaaacaag gcattgtgct aggaatgaaa aaagactgga aatatgatac ttgttacact ctggttgtct caaagacaag acacgccgcc ccccgctaac atacctgcat caaattacac aggtcgctga 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201006485 tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac £gagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga ggaattctct agagatccct cgacctcgag atccattgtg cccgggcgcc accatgactt ggaccccact cctcttcctc accctcctcc tccactgcac aggaagctta teg <210> 173 <211> 6515 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成聚核苷酸 <400> 173 acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgageagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgs aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga etaegagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg agcg£ccgct cgaggccggc aaggeeggat cccccgacct cgacctct'gg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt ggtegagate cctcggagat ctctagctag aggategate cccgccccgg acgaactaaa cctgactacg acatctctgc cccttcttcg cggggcagtg catgtaatcc cttcagttgg ttggtacaac ttgccaactg ggccctgttc cacatgtgac acg£gggggg accaaacaca aaggggttct ctgactgtag ttgacatcct tataaatgga tgtgcacatt tgccaacact gagtggcttt catcctggag cagactttgc agtctgtgga ctgcaacaca acattgcctt tatgtgtaac tcttggctga agctcttaca ccaatgctgg gggacatgta cctcccaggg gcccaggaag actacgggag gctacaccaa cgtcaatcag aggggcctgt gtagctaccg ataagcgsac cctcaagagg 140653·序列表.doc •135· 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6513 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 201006485 gcattagcaa tagtgtttat aaggccccct tgttaaccct aaacgggtag catatgcttc 960 ccgggtagta gtatatacta tccagactaa ccctaattca atagcatatg ttacccaacg 1020 ggaagcatat gctatcgaat tagggttagt aaaagggtcc taaggaacag cgatatctcc 1080 caccccatga gctgtcacgg ttttatttac atggggtcag gattccacga gggtagtgaa 1140 ccattttagt cacaagggca gtggctgaag atcaaggagc gggcagtgaa ctctcctgaa 1200 tcttcgcctg cttcttcatt ctccttcgtt tagctaatag aataactgct gagttgtgaa 1260 cagtaaggtg tatgtgaggt gctcgaaaac aaggtttcas gtgacgcccc cagaataaaa 1320 tttggacggg gggttcagtg gtggcattgt gctatgacac caatataacc ctcacaaacc 1380 ccttgggcaa taaatactag tgtaggaatg aaacattctg aatatcttta acaatagaaa 1440 tccatggg£t ggggacaagc cgtaaagact ggatgtccat ctcacacgaa tttatggcta 1500 tgggcaacac ataatcctag tgcaatatga tactggggtt attaagatgt gtcccaggca 1560 gggaccaaga caggtgaacc atgttgttac actctatttg taacaagggg aaagagagtg 1620 sacgcc^aca gcagcggact ccactggUg tctctaacac ccccgaaaat taaacggggc 1680 tccacgccaa tggggcccat aaacaaagac aagtggccac tctttttttt gaaattgtgg 1740 cgcgtcagcc cccacacgcc gccctgcggt tttggactgt aaaataaggg 1800 tgtaataact tggctgattg taaccccgct aaccactgcg gtcaaaccac ttgcccacaa 1860 aaccactaat ggc&ccccgg ggaatacctg cataagtag^ tgggcgggcc aagatagggg 1920 cgcgattgct gcgatctgga ggacaaatta cacacactt£ cgcctgagcg ccaagcacag 1980 £gttgttggt cctcatattc acgaggtcgc tgagagcacg gtgggctaat gttgccatgg 2040
Stagcatata ctacccaaat atct£gatag catatgctat cctaatctat atctgggtag 2100 cataggctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag 2160 tatatgctat cctaatttat atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag 2220 catatgctat cctaatctat atctgggtag tatatgctat cctaatctgt atccgggtag 2280 catatgctat cctaatagag attagggtag tatatgctat cctaatttat atctggstag 2340 catatactac ccaaatatct ggatagcata tgctatccta atctatatct gggtagcata 2400 tgctatccta atctatatct gggtagcata ggctatccta atctatatct gggtagcata 2460 tgctatccta atctatatct gggtagtata tgctatccta atttatatct ggstagcata 2520 ggctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct gggtagtata 2580 tgctatccta atctgtatcc gggtagcata tgctatcctc atgataagct gtcaaacatg 2640 agaattttct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat 2700 gataataatg gtttcttaga cstcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 2760 tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 2820 ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc 2880 ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt 2940 gaaagtaaaa gatgctgaag atcasttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct 3000 caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac 3060 ttttaaastt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacsccgg^c aagagcaact 3120 cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa 3180 •136 140653·序列表 _doc 201006485
gcatcttacg taacactgcg tttgcacaac agccatacca caaactatta g&aggcggat tgctgataaa agatggtaag tgaacgaaat agaccaagtt gatctaggtg gttccactga tctgcgcgta gccggatcaa accaaatact accgcctaca gtcgtgtctt ctgaacgggg atacctacag gtatccggta cgcctggtat gtgatgctcg gttcctggcc tgtggataac cgagcgcagc ccccgcgcgt gggcagtgag acactttatg aggaaacagc caggcagaag ctccgcccat taattttttt agtgaggagg gttttaaaca aattggctcc ggggggaggg aagtgatgtc gatggcatga gccaacttac atgggggatc aacgacgagc actggcgaac aaagttgcag tctggagccg ccctcccgta agacagatcg tactcatata aagatccttt gcgtcagacc atctgctgct gagctaccaa gttcttctag tacctcgctc accgggttgg ggttcgtgca cgtgagctat agcggcaggg ctttatagtc tcaggg£ggc ttttgctggc cgtattaccg gagtcagtga tggccgattc cgcaacgcaa cttccggctc tatgaccatg tatgcaaagc cccgccccta tatttatgca cttttttgga gagaggaatc ggtgcccgtc gtcggcaatt gtgtactggc cagtaagaga ttctgacaac atgtaactcg gtgacaccac tacttactct gaccacttct gtgagcgtgg tcgtagttat ctgagatagg tactttagat ttgataatct ccgtagaaaa tgcaaacaaa ctctttttcc tgtagccgta tgctaatcct actcaagacg 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140653-序列表.doc 201006485
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ggtcgggctg 4200 aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 4260 cctacagcgt gagctatgag aaagc^ccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 4320 tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcac^ags gagcttccag ggggaaacgc 4380 ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 4440 atgctcgtca ggggsgcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcsgcct ttttacggtt 4500 cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 4560 ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 4620 gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacscaaac cgcctctccc 4680 cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 4740 cagtgagcgc aacgcaatta atstgagtta gctcactcat tasgcacccc aggctttaca 4800 ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 4860 aaacagctat gaccatgatt acgccaagct ctagctagag gtcgagtccc tccccagcag 4920 gcagaagtat gcaaagcats catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc 4980 cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 5040 ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt 5100 gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct ttgcaaagat ggataaagtt 5160 ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctas gtcttgaaag gagtgggaat 5220 tgsctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 5280 g£gaggggtc ggcaattgaa ccggtfccta gagaaggtgg cgcggfgtaa actgggaaag 5340 •140· 140653·序列表.doc
201006485 tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gsscgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttasttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga ggaattctct agagatccct cgacctcgag atccattgtg cccgggcgcc accatggaca tgcgcgtgcc cgcccagctg ctgggcctgc tgctgctgtg gttccccggc tcgcgatgc <210> 175 <211> 7-185 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成聚核苷酸 <400> 175 gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgaggag 140653·序列表.doc -141 - 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6519 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 201006485 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccstgsacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagcggccg ctcgaggccg gcaaggccgg 1020 atcccccgac ctcgacctct ggctaataaa gsaaatttat tttcattgca atagtgtgtt 1080 ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag sgcaaatcat ttggtcgaga 1140 tccctcggag atctctagct agaggatcga tccccgcccc ggacgaacta aacctgacta 1200 cgacatctct gccccttctt cgcggggcag tgcatgtaat cccttcagtt ggttggtaca 1260 acttgccaac tgggccctgt tccacatgtg acacgggggs ggaccaaaca caaaggggtt 1320 ctctgactgt agttgacatc cttataaatg gatgtgcaca tttgccaaca ctgagtggct 1380 ttcatcctgg agcagacttt scastctgtg gactgcaaca caacattgcc tttatgtgta 1440 actcttggct gaagctctta caccaatgct gsssgacatg tacctcccag gggcccagga 1500 agactacggg aggctacacc aacgtcaatc agaggggcct gtgtagctac cgataagcgg 1560 accctcaasa gggcattagc aatagtgttt ataaggcccc cttsttaacc ctaaacgggt 1620 agcatatgct tcccgggtag tagtatatac tatccagact aaccctaatt caatagcata 1680 tgttacccaa cgggaagcat atgctatcga attagggtta gtaaaagggt cctaaggaac 1740 agcgatatct cccaccccat sagctgtcac ggttttattt acatggggtc aggattccac 1800 gagggtagtg aaccatttta stcacaaggg cagtggctga asatcaagga gcgggcagtg 1860 aactctcctg aatcttcgcc t^cttcttca ttctccttcg tttagctaat agaataactg 1920 ctgagttgtg aacagtaagg tgtatgtgag gtgctcgaaa acaaggtttc aggtgacgcc 1980 cccagaataa aatttggacg gggggttcag tggtggcatt gtgctatgac accaatataa 2040 ccctcacaaa ccccttgggc aataaatact agtgtaggaa igaaacattc tgaatatctt 2100 taacaataga aatccatggg gtggggacaa gccgtaaaga ctggatgtcc atctcacacg 2160 aatttatggc tatgggcaac acataatcct agtgcaatat gatactsggg ttattaagat 2220 gt£tcccag£ cagggaccaa gacaggtgaa ccatgttgtt acactctatt tgtaacaagg 2280 ggaaagagag tggacgccga cagcagcgga ctccactggt tgtctctaac acccccgaaa 2340 attaaacggg gctccacgcc aatggggccc ataaacaaas acaagtggcc actctttttt 2400 ttgaaattgt ggagtggggg cacgcgtcag cccccacacg ccgccctgcs gttttg^act 2460 gtaaaataag ggtgtaataa cttggctgat tgtaaccccg ctaaccacts cggtcaaacc 2520 acttgcccac aaaaccacta atggcacccc ggggaatacc tgcataagta ggtgggcggg 2580 ccaagatagg ggcgcgattg ctgcgatctg gaggacaaat tacacacact tgc^cctjgag 2640 cgccaagcac agggttgttg gtcctcatat tcacgaggtc gctgagagca cggtsggcta 2700 atgttgccat gggtagcata tactacccaa atatctggat agcatatgct atcctaatct 2760 atatctgggt agcataggct atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct 2820 atatctgggt agtatatgct atcctaattt atatctgggt agcatasgct atcctaatct 2880 atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt agtatatgct atcctaatct 2940 gtatccgggt agcatatgct atcctaaUg agattagggt a£tatatgct atcctaattt 3000 -142· 140653-序列表.doc 201006485
« atatctgggt ctgggtagca ctgggtagca ctgggtagca ctgggtagta ctgtcaaaca ggttaatgtc gcgcggaacc acaataaccc tttccgtgtc agaaacgctg cgaactggat aatgatgagc gcaagagcaa agtcacagaa aaccatgagt gctaaccgct ggagctgaat aacaacgttg aatagactgg tggctggttt agcactgggg ggcaactatg ttggtaactg ttaatttaaa acgtgagttt agatcctttt ggtggtttgt cagagcgcag gaactctgta cagtggcgat gcagcggtcg caccgaactg aaaggcggac tccaggggga gcgtcgattt ggccttttta agcatatact tatgctatcc tatgctatcc taggctatcc tatgctatcc tgagaatttt atgataataa cctatttgtt tgataaatgc gcccttattc gtgaaagtaa ctcaacagcg acttttaaag ctcggtcgcc aagcatctta gataacactg tttttgcaca gaagccatac cgcaaactat atggaggcgg attgctgata ccagatggta gatgaacgaa tcagaccaag aggatctagg tcgttccact tttctgcgcg ttgccggatc ataccaaata gcaccgccta aagtcgtgtc ggctgaacgg agatacctac aggtatccgg aacgcctggt ttgtgatgct cggttcctgg acccaaatat taatctatat taatctatat taatctatat taatctgtat cttgaagacg tggtttctta tatttttcta ttcaataata ccttttttgc aagatgctga gtaagatcct ttctgctatg gcatacacta cggatggcat cggccaactt acatggggga caaacgacga taactggcga ataaagttgc aatctggagc agccctcccg atagacagat tttactcata tgaagatcct gagcgtcaga taatctgctg aagagctacc ctgttcttct catacctcgc ttaccgggtt mgttcgtg agcgtgagct taagcggcag atctttatag cgtcaggggg ccttttgctg ctggatagca ctgggtagca ctgggtagta ctgggtagca ccgggtagca aaagggcctc gacgtcaggt aatacattca ttgaaaaagg ggcattttgc agatcagttg tgagagtttt tggcgcggta ttctcagaat gacagtaaga acttctgaca tcatgtaact gcgtgacacc actacttact aggaccactt cggtgagcgt tatcgtagtt cgctgagata tatactttag ttttgataat ccccgtagaa cttgcaaaca aactcttttt agtgtagccg tctgctaatc ggactcaaga cacacagccc atgagaaagc ggtcggaaca tcctgtcggg gcggagccta gccttttgct tatgctatcc taggctatcc tatgctatcc tatgctatcc tatgctatcc gtgatacgcc ggcacttttc aatatgtatc aagagtatga cttcctgttt ggtgcacgag cgccccgaag ttatcccgtg gacttggttg gaattatgca acgatcggag cgccttgatc acgatgcctg ctagcttccc ctgcgctcgg gggtctcgcg atctacacga ggtgcctcac attgatttaa ctcatgacca aagatcaaag aaaaaaccac ccgaaggtaa tagttaggcc ctgttaccag cgatagttac agcttggagc gccacgcttc ggagagcgca tttcgccacc tggaaaaacg cacatgttct taatctatat taatctatat taatttatat taatctatat tcatgataag tatttttata ggggaaatgt cgctcatgag gtattcaaca ttgctcaccc tgggttacat aacgttttcc ttgacgccgg agtactcacc gtgctgccat gaccgaagga gttgggaacc cagcaatggc ggcaacaatt cccttccggc gtatcattgc cggggagtca tgattaagca aacttcattt aaatccctta gatcttcttg cgctaccagc ctggcttcag accacttcaa tggctgctgc cggataaggc gaacgaccta ccgaagggag cgagggagct tctgacttga ccagcaacgc ttcctgcgtt 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 -143- 140653-序列表.doc 201006485 atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 5280 cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 5340 caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 5400 cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 5460 accccasgct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaatts tgagcggata 5520 acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctctagc tagaggtcga 5580 gtccctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 5640 tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 5700 cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc 5760 tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagcttt£ca 5820 aagatggata aagttttaaa cagagaggaa tctttgcagc taatggacct tctaggtctt 5880 gaaaggagtg ggaattggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt 5940 ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg 6000 ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga 6060 accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag 6120 aacacaggta aglgccgtgt gtggttcccg cgggcctgsc ctctttacgs gttatggccc 6180 ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg 6240 ggttggaagt ggstgggaga sttcsasscc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc 6300 ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg csaatctggt ggcaccttcg 6360 c£cctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgct^c 6420 gacgcttttt ttctgecaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat 6480 ttcggttitt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc 6540 gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg 6600 gcctgctct£ gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct 6660 ggcccgstcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg 6720 gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag 6780 gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accggficgcc 6840 gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga 6900 ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc 6960 Ctggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt sagtttggat cttggttcat 7020 tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagsaat 7080 tctctagaga tccctcgacc tcgagatcca ttgtgcccgs scgccaccat ggagtttggg 7140 ctgagctggc tttttcttgt cgcgatttta aaaggtgtcc agtgc 7185 -144- 140653-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201006485 七、申請專利範圍： 1. 一種包含多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包含VD1-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中： VD1為第一重鏈可變區； VD2為第二重鏈可變區； C為重鍵怔定區， XI為連接子，其限制條件為其不為CH1 ; X2為Fc區域；且 ❿ η為0或1 ; 其中該結合蛋白能夠結合選自由以下各者組成之群之一 對抗原：Αβ(序列1)與Αβ(序列3)、TNF-α與Αβ(序列2)、 IL-Ιβ與 Αβ(序列 2)、Αβ(序列 1)與 Αβ(序列 2)、IGF1，2與 Αβ(序列 2)、Αβ(序列 2)與 IL-18、IL-6 與 Αβ(序列 2)、 TNF-a與Αβ(序列3)、IL-Ιβ與Αβ(序列3) ' Αβ(序列1)與 Αβ(序列 3)、IGF1，2與 Αβ(序列 3)、Αβ(序列 3)與 IL-18、 IL-6與 Αβ(序列 3)、TNF-a與 Αβ(序列 1)、IL-Ιβ與 Αβ(序列 ® 1)、IGF1，2 與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1)與 IL-18、IL-6 與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1)與 RAGE、NGF 與 IL-18、NGF 與 IL-Ιβ、NGF 與 IL-6、TNF-a與 EGFR(序列 2)、TNF-a與 RAGE、CD-20與 EGFR(序列 1)、CD-20與 EGFR(序列 2)、 RGMA與 TNF-a。 2. 如請求項1之結合蛋白，其中VD1及VD2包含選自由以下 各者組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO : 28、30、 32 、 34 、 36 、 38 、 40 、 42 、 44 、 46 、 48 、 50 、 52 、 54及 140653.doc 201006485 56 ° 3. 一種包含多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包含VD1-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中： VD1為第一輕鏈可變區； VD2為第二輕鏈可變區； C為輕鍵丨亙定區； XI為連接子，其限制條件為其不為CH1 ; X2不包含Fc區域；且 η為0或1 ; 其中該結合蛋白能夠結合選自由以下各者組成之群之一 對抗原：Αβ(序列1)與Αβ(序列3)、TNF-α與Αβ(序列2)、 IL-Ιβ 與 Αβ(序列 2)、Αβ(序列 1)與 Αβ(序列 2)、IGF1,2 與 Αβ(序列 2)、Αβ(序列 2)與 IL-18、IL-6 與 Αβ(序列 2)、 TNF-a與Αβ(序列3)、IL-Ιβ與Αβ(序列3)、Αβ(序列1)與 八戸（序列3)、1〇卩1，2與人0(序列3)、八0(序列3)與1!^-18、 IL-6與 Αβ(序列 3)、TNF-a與 Αβ(序列 1)、IL-Ιβ與 Αβ(序列 1)、IGF1，2 與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1)與 IL-18、IL-6 與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1)與 RAGE、NGF 與 IL-18、NGF 與 IL-Ιβ、NGF 與 IL-6、TNF-a 與 EGFR(序列 2)、TNF-a 與 RAGE、CD-20與 EGFR(序列 1)、CD-20與 EGFR(序列 2)、 RGMA與 TNF-a。 4. 如請求項3之結合蛋白，其中該VD1輕鏈可變區及該VD2 輕鏈可變區包含選自由以下各者組成之群之胺基酸序 列：SEQ ID NO : 29、31、33、35、37、39、41、43、 140653.doc 201006485 45、47、49、51、53、55及57。 5·如請求項1或3之結合蛋白，其中η為0。 6. -種包含第一及第二多狀鏈之結合蛋白，其中 "亥第一多肽鏈包含第一 VD1_(xl)n_VD2-C-(X2)n，其 中： VD1為第一重鏈可變區； VD2為第二重鏈可變區； C為重鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為其不為cH1 ;且 X2為Fc區域；且 其中該第二多肽鏈包含第二VD1_(xl)n_VD2_c· (X2)n，其中： VD1為第一輕鏈可變區； VD2為第二輕鏈可變區； C為輕鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為其不為Chi ; X2不包含Fc區域；且 η為0或1 ’其中該結合蛋白能夠結合選自由以下各者 組成之群之一對抗原：Αβ(序列丨）與Αβ(序列3)、TNF-a 與Αβ(序列2)、IL-Ιβ與Αβ(序列2)、Αβ(序列1)與Αβ(序列 2) 、IGF 1，2 與 Αβ(序列 2)、Αβ(序列 2)與 IL-1 8、IL-6 與 Αβ(序列 2)、TNF-α與 Αβ(序列 3)、IL-Ιβ與 Αβ(序列 3)、 Αβ(序列1)與Αβ(序列3)、IGF1，2與Αβ(序列3)、Αβ(序列 3) 與 IL-18、IL-6與 Αβ(序列 3)、TNF-a與 Αβ(序列 1)、IL- 140653.doc 201006485 邱與入0(序列1)、1〇?1,2與入0(序列1)、八6(序列1)與1[-18、IL-6 與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1)與 RAGE、NGF 與 IL-18、NGF與 IL-Ιβ、NGF與 IL-6、TNF-α與 EGFR(序列 2)、 TNF-α 與 RAGE、CD-20 與 EGFR(序列 1)、CD-20 與 EGFR(序列 2)、RGMA與 TNF-α。 7. 如請求項6之結合蛋白，其中該VD1重鏈可變區及該VD2 重鏈可變區包含選自由以下各者組成之群之胺基酸序 歹|J ： SEQ ID NO : 28、30、32、34、36、38、40、42、 44、46、48、50、52、54及56，且其中該VD1輕鏈可變 區及該VD2輕鏈可變區包含選自由以下各者組成之群之 胺基酸序列：SEQ ID NO : 29、31、33、35、37、39、 41 、 43 、 45 、 47 、 49 、 51 、 53 、 55及57 ° 8. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中XI或X2為選自由 SEQ ID NO 1至26組成之群之胺基酸序列。 9. 如請求項6之結合蛋白，其中該結合蛋白包含兩個第一 多肽鏈及兩個第二多肽鏈。 10. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該Fc區域係選自由 原生序列Fc區域及變異序列Fc區域組成之群。 11. 如請求項10之結合蛋白，其中該Fc區域係選自由以下各 者之Fc區域組成之群：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA、IgM、IgE及 IgD。 12. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD1及該第二多肽鏈之該VD1分別自同一個第一及第二 親本抗體或其抗原結合部分獲得。 140653.doc 201006485 13. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第—多肽鏈之該 VD1及該第二多肽鏈之該VD1分別自不同第一及第二親 本抗體或其抗原結合部分獲得。 14. 如請求項1、3或6之結合蛋白’其中該第一多肽鏈之該 VD2及該第二多肽鏈之該ν〇2分別自同一個第一及第二 親本抗體或其抗原結合部分獲得。 15. 如請求項丨、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD2及該第二多肽鏈之該VD2分別自不同第一及第二親 本抗體或其抗原結合部分獲得。 16. 如請求項13至15中任—項之結合蛋白，其中該第一親本 抗體及該第二親本抗體結合該抗原上之不同抗原決定 基。 17. 如請求項13至15中任一項之結合蛋白，其中該第一親本 抗體或其抗原結合部分與該第一抗原之結合效能不同於 參 該第二親本抗體或其抗原結合部分與該第二抗原的結合 效能。 18 如請求項13至15中任一項之結合蛋白，其中該第一親本 抗體或其抗原結合部分與該第一抗原的結合親和力不同 於該第二親本抗體或其抗原結合部分與該第二抗原之結 合親和力。 19.如請求項13至15中任一項之結合蛋白，其中該第一親本 抗體或其抗原結合部分及該第二親本抗體或其抗原結合 部分係選自由人類抗體、CDR移植抗體及人源化抗體組 成之群。 ^ 140653.doc 201006485 20.如請求項13至15中任一項之結合蛋白，其中該第一親本 抗體或其抗原結合部分及該第二親本抗體或其抗原結合 部分係選自由以下各者組成之群：Fab片段、F(ab,)2片 段、包含藉由鉸鏈區域處之雙硫橋連接之兩個Fab片段 的二價片段、由VH及CH1區組成的Fd片段、由抗體之單 臂之VL及VH區組成之Fv片段、dAb片段、經分離之互補 決定區域（CDR)、單鏈抗體及雙功能抗體。 21·如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該結合蛋白擁有該 第一親本抗體或其抗原結合部分或該第二親本抗體或其 抗原結合部分所展現之至少一種所需性質。 22. 如請求項21之結合蛋白，其中該所需性質係選自一或多 個抗體參數。 23. 如請求項21之結合蛋白，其中該等抗體參數係選自由以 下各者組成之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效 能、生物功能、抗原決定基識別性、穩定性、溶解性、 生產效率、免疫原性、藥物代謝動力學、生物可用性、 組織交又反應性及直系同源性抗原結合性。 24. —種能夠結合兩個抗原之包含四個多肽鍵之結合蛋白， 其中兩個多肽鏈包含VDl-(Xl)n_VD2-C-(X2)n，其中： VD1為第一重鏈可變區； VD2為第二重鏈可變區； C為重鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為其不為CH1 ;且 X2為Fc區域；且 140653.doc -6 - 201006485 其中兩個多肽鏈包含VD1_(xl)n_VD2_c_(X2)n，其 中： VD1為第一輕鏈可變區； VD2為第二輕鏈可變區； C為輕鏈恆定區； X1為連接子’其限制條件為其不為CH1 ; X2不包含Fc區域；且 η為0或1 ’其中該VDl重鏈可變區及該ν〇2重鏈可變區 包含選自由以下各者組成之群之胺基酸序列：SEq m NO . 28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、 50、52、54及56 ’且其中該VD1輕鏈可變區及該VD2輕 鍵可變區包含選自由以下各者組成之群之胺基酸序列： SEQ ID NO : 29、31、33、35、37、39、41、43、45、 47 、 49 、 51 、 53 、 55及57 。 25. —種能夠結合兩個抗原之包含四個多肽鏈之結合蛋白， 其中兩個多肽鏈包含VD1_(xl)n_VD2_c_(X2)n，其中： VD1為第一重鏈可變區； VD2為第二重鏈可變區； C為重鏈恆定區； XI為連接子’其限制條件為其不為CH1 ; X2為Fc區域；且 η為0或1 ;且 其中兩個多肽鏈包含VDl-(Xi)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一輕鍵可變區； 140653.doc 201006485 VD2為第二輕鍵可變區； C為輕鏈恆定區； X1為連接子，其限制條件為其不為CH1 ; X2不包含Fc區域；且 η為0或1 ; 其中該DVD-Ig結合選自由以下各者組成之群之至少一種 抗原：殿粉狀蛋白P(AP)(序列1)、Αβ(序列2)、Αβ(序列 3)、腫瘤壞死因子a(TNF_a)、介白素⑻胰島素 樣生長因子1(IGF1)、胰島素樣生長因子2(IGF2卜介白 素18(IL-18)、介白素6(IL_6)、晚期糖基化終產物受體 (Rage)、神經生長因子（ngf)、表皮生長因子受體 (EGFR)(序列丨）、EGFR(序列2)、CD_2〇及排斥性導引分 子（RGMA)。 26. 如請求項卜3、6、24或25之結合蛋白，其中藉由表面 電漿共振量測該結合蛋白與該一或多個標靶的結合速率 常數(κ〇η)係選自由以下各者組成之群中·至少約1〇2 Μ·νι、 至少約103 Μ-1，、至少約1〇4 、至少約1〇5 Μ、·,及 至少約ΙΟ6 Μ·、·1。 27. 如請求項1、3、6、24或25之結合蛋白，其中藉由表面 電漿共振量測該結合蛋白與該一或多個標靶的脫離速率 常數(Koff)係選自由以下各者組成之群中：至多約1〇·3，、至 多約10·4 s-ι、至多約1〇-5 s-i及至多約1〇-6 s_】。 28. 如請求項！、3、6、24或25之結合蛋白其中該結合蛋 白與該一或多個標靶之解離常數（Kd)係選自由以下各者 140653.doc 201006485 組成之群中：至多約1〇-7 M、至多約1〇-8 M 至多約ΙΟ·10 Μ 1〇-13 Μ。 至多約ΙΟ-9 Μ、 至多約10·1ΐΜ、至多約ι〇·12μ及至多約 29. 30.
    31. 一種結合蛋白接合物，其包含如請求項1、3、6、24或 25中任—項之結合蛋白，該結合蛋白接合物進一步包含 、、由以下各者組成之群之藥劑.免疫黏附分子、顯像 劑、治療劑及細胞毒性劑。 如”月求項29之結合蛋白接合物，其中該藥劑為選自由以 下各者組成之群的顯像劑：放射性標記、酶、螢光標 記、發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。 如明求項30之結合蛋白接合物，其中該顯像劑為選自由 以下各者組成之群之放射性標記：3Η、MC、35S、9QY、 "TC、"％、1251、13〗I、mLu、166H〇及 153Sm。 32.
    如研求項30之結合蛋白接合物，其中該藥劑為選自由以 下各者組成之群的治療劑或細胞毒性劑：抗代謝物、烧 化齊丨抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、 抗有、’糸分裂劑、蒽環黴素、毒素及細胞凋亡劑。 33. 如請求項1、3、6 白為結晶結合蛋白 24或25之結合蛋白，其中該結合蛋 34·如4求項33之結合蛋白，其中該晶體為無載劑之醫藥控 制釋放晶體。 35·如請求項33之結合蛋白其中該結合蛋白之活體内半衰 期超過該結合蛋白之可溶性對應物。 36.如明求項33之結合蛋白，其中該結合蛋白保留生物活 140653.doc 201006485 性。 3 7. —種經分離核酸，其編碼如請求項1、3、6、24或25中 任一項之結合蛋白胺基酸序列。 3 8. —種載體，其包含如請求項37之經分離核酸。 39. 如·請求項38之載體，其中該載體係選自由以下各者組成 之群：pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、 pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO及 pBJ。 40. —種宿主細胞，其包含如請求項38之載體。 4 1.如請求項40之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞。 42. 如請求項41之宿主細胞，其中該宿主細胞為大腸桿菌 (E.Coli)。 43. 如請求項40之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。 44. 如請求項43之宿主細胞，其中該真核細胞係選自由原生 生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。 45. 如請求項43之宿主細胞，其中該真核細胞為選自由哺乳 動物細胞、禽類細胞及昆蟲細胞組成之群的動物細胞。 46. 如請求項45之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞。 47. 如請求項45之宿主細胞，其中該宿主細胞為COS。 48. 如請求項43之宿主細胞，其中該宿主細胞為酵母細胞。 49. 如請求項48之宿主細胞，其中該酵母細胞為釀酒酵母 {Saccharomyces cerevisiae) ° 5 0.如請求項45之宿主細胞，其中該宿主細胞為昆蟲Sf9細 胞。 51. —種產生結合蛋白之方法，其包括在培養基中，在足以 140653.doc -10- 201006485 產k、’° 13蛋白之條件下培養如請求項40至50中任一 所述之宿主細胞。 項 52. 53. 54. • 55. 56. 57. 58. Ο 如月求項51之方法，其中所產生之50%-75%結合蛋白Α 雙重特異性四價結合蛋白。 ’"、 如凊求項51之方法’其中所產生之75%_9〇〇/。結合 ,.h. ^ -¾ 雙重特異性四價結合蛋白。 如明求項51之方法，其中所產生之9〇% 95%結合蛋白 雙重特異性四價結合蛋白。 種蛋白質，其係根據如請求項5丨之方法產生。 一種醫藥組合物，其包含如請求項β36及55中任 之結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。 如請求項56之醫藥組合物，其進一纟包含至少—種額 治療劑。 如請求項57之醫藥組合物，其中該額外藥劑係選自由以 下各者組成之群：治療劑、顯像劑、細胞毒性劑、血管 生成抑制劑、激酶抑制劑、協同刺激分子阻斷劑、黏附 分子阻斷劑、抗細胞激素抗體或其功能性片段、胺甲喋 呤（methotrexate)、環孢素（cycl〇sp〇dn)、雷帕黴素 (rapamycin)、FK506、可偵測標記或報導體、tnf拮抗 劑、抗風濕病藥、肌肉鬆弛藥、麻醉藥、非類固醇消= 藥物（NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉 劑、神經肌肉阻斷劑、抗菌劑、抗牛皮癬劑、皮質類固 醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫法、免疫球蛋 白、免疫抑制劑、生長激素、激素替換藥物、放射性醫 140653.doc •11· 201006485 藥 抗抑鬱劑、抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物、β 促效劑吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞激素 及細胞激素拮抗劑。 59. 60. 一種治療個體之疾病或病症之方法，其係藉由向該個體 投與如請求項〗至36及55中任一項所述之結合蛋白來達 成治療。 如明求項59之方法，其中該病症係選自由以下各者組成 之群.類風濕性關節炎、骨關節炎、幼年型慢性關節 炎、腹毒性關節炎、萊姆氏關節炎（Lyme arthrhis)、牛❿ 皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅 斑桂·狼瘡症、克羅恩氏病（Crohn's disease)、潰瘍性結腸 ^ 發炎性腸道疾病、胰島素依賴型糖尿病、甲狀腺 炎、哮喘、過敏性疾病、牛皮癖、皮炎、硬皮病、移植 物抗伯主疾病、器官移植排斥反應、與器官移植相關之 急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤病、動脈粥樣硬化 '彌漫 性血管内凝血、川崎氏疾病（Kawasaki,s disease)、格雷 氏病（Grave’s disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、© 韋格納肉牙腫病（Wegener's granulomatosis) '亨保-絲奇 恩賴紫瘋（Henoeh-Schoenlein purpurea)、腎臟微觀脈管 炎、慢性活性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休 克症候群、敗血症候群、惡病質、傳染性疾病、寄生疾 病、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓 氏舞蹈病（Huntington’s chorea)、帕金森氏病（parkinson，s disease)、阿茲海默氏症（Alzheimer's disease)、中風、原 140653.doc •12· 201006485 發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性腫瘤、心臟衰 竭 〇肌梗塞、阿狄森氏病（Addison’s disease)、I型多 腺體分泌不足及Π型多腺體分泌不足症、施密特氏症候 群（Schmidt’s syndrome)、成年（急性）呼吸窘迫症候群、 脫髮、斑形脫髮、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏 病（Reiter’s disease)、牛皮癬性關節病、潰瘍性大腸炎關 節病、腸病性滑膜炎、衣原體、耶爾森氏菌屬及沙門菌 屬相關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣化疾病/動脈硬 化、異位性過敏、自體免疫大皰疾病、尋常天疱瘡、葉 型天疱瘡、類天疱瘡、線性IgA疾病、自體免疫溶血貧 血症、庫姆陽性溶血貧血症、後天性惡性貧血、幼年型 惡性貧企、肌痛腦炎/皇家自由疾病（R〇yal卜“ Disease)、慢性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞性動脈炎、 原發性硬化肝炎、隱原性自體免疫肝炎、後天性免疫缺 乏疾病症候群、後天性免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、c 型肝炎、一般變異性免疫缺乏症（一般變異性低丙種球蛋 白血症）、擴張性心肌病、女性不育症、卵巢衰竭、卵巢 早衰、纖維變性肺病、隱原性纖維性肺泡炎、發炎後間 質肺病、間質肺炎、結締組織病相關間質肺病、混合性 結締組織病相關肺病、全身性硬化症相關間質肺病、類 風濕性關節炎相關間質肺病、全身性紅斑性狼瘡症相關 肺病、皮肌炎/多發性肌炎相關肺病、修格蘭氏疾病 (Sjdgren’s diSease)相關肺病、僵直性脊椎炎相關肺病、 脈管炎擴散肺病、含鐵血黃素沉著症相關肺病、藥物誘 140653.doc -13- 201006485 :、門質肺病、纖維化、放射性纖維化、閉塞性細支氣 e炎It 嗜伊紅細胞性肺炎、淋巴球性滲透性肺病、 感染後間質肺病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、1 免疫陡肝炎（典型自體免疫或狼瘡樣肝炎）、2型自 體免疫性肝炎（抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介導之低血 糖、B型抗胰島素症伴以黑棘皮病、甲狀旁腺機能減 退與器g移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關 之慢性免疫疾病、骨關節炎、原發性硬化性膽管炎、1 型牛皮癖、2型牛皮癬、特發性白金球減少症、自體免❹ 疫性嗜中性細胞減少症、腎病N〇s、絲球體腎炎、腎臟 微觀血g炎、萊姆氏病、盤狀紅斑性狼瘡、特發性男 性不育症或NOS、精液自體免疫、多發性硬化症（所有亞 型）、父感性眼炎、因結締組織疾病繼發之肺循環血壓過 高、古德帕斯徹氏症候群（G〇〇dpastureis syndr〇me)、多 發性結節性動脈炎之肺部表現、急性風濕熱、類風濕性 脊椎炎、斯蒂爾氏病（Stiu，s disease)、全身性硬化症、 修格蘭氏症候群、高安氏疾病（Takayasu，s disease)/動脈© 炎、自體免疫性血小板減少症、特發性血小板減少症、 自體免疫性甲狀腺病、甲狀腺功能亢進、甲狀腺腫自體 免疫性甲狀腺功能低下（橋本氏病（Hashimoto，s disease))、萎縮性自體免疫性f狀腺功能低下、原發性 黏液水腔、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性脈管炎、白斑 症、急性肝臟疾病、慢性肝臟疾病、酒精性肝硬變、酒 精誘導之肝臟損傷、膽汁鬱積、特應性肝臟疾病、藥物 140653.doc -14- 201006485 誘導之肝炎、非酒精性脂肪變性肝炎、過敏症及哮喘、 B群鏈球菌（GBS)感染、精神錯亂（例如抑鬱及精神分裂 症）、Th2型及Thl型介導之疾病、急性及慢性疼痛（不同 形式之疼痛）及癌症，諸如肺癌、乳房癌、胃癌、膀胱 癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌，及 造血性惡性病（白血病及淋巴瘤）、無P脂蛋白血症、手足 發紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性 淋巴母細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病（AML)、急性 或慢性細菌感染、急性騰炎、急性腎功能衰竭、腺癌、 心房異位性心跳、AIDS癡呆複合症、酒精誘導之肝炎、 過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種 異體移植排斥、α-l-抗姨蛋白酶缺之症、肌萎縮性側索 硬化、貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、抗 磷脂症候群、抗受體過敏性反應、主動脈及周邊動脈 瘤、主動脈剝離、動脈高壓、動脈硬化、動靜脈瘺、共 濟失調、心房纖維性顫動（持續或突發性）、心房撲動、 房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植排斥反應、骨趙 移植（BMT)排斥反應、束支傳導阻滞、勃克氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma)、燒傷、心律不整、心臟頓抑症候 群、心臟腫瘤、心肌病、心肺分流術發炎反應、軟骨移 植排斥、小腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多源性心 房頻脈、化學療法相關之病症、慢性骨髓性白血病 (CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎病變、慢性淋巴細胞 白血病（CLL)、慢性阻塞性肺病（COPD)、慢性水楊酸鹽 140653.doc 15 201006485 中毒、結腸直腸癌'充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性 皮炎、肺心病、冠狀動脈病、克羅伊茨費爾特_雅各布氏 病（Creutzfeldt-Jakob disease)、培養陰性敗血症、囊腫 性纖維化、細胞激素療法相關之病症、拳擊員癡呆、脫 趟勒疾病、登革熱出血熱、皮炎、皮膚病狀、糖尿病 (diabetes)、糖尿病（diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬 化疾病、泛發性路易體疾病（Diffuse Lewy body disease)、擴張充血型心肌病、基底神經節病症、中年唐 氏症候群（Down's Syndrome)、由阻斷CNS多巴胺受體之 藥物所誘導之藥物誘發運動病症、藥物過敏性、濕瘆、 腦脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、會厭炎、埃-巴二氏病 毒感染（epstein-barr virus infection)、紅斑性肢痛、錐體 束外及小腦病症、家族性噬血淋巴組織細胞瘤病 (familial hematophagocytic lymphohistiocytosis)、胎兒胸 腺植入排斥、弗里德賴希氏共濟失調（Friedreich，s ataxia)、功能性周邊動脈病症、真菌敗血症、氣性壞 疽、胃潰瘍、腎小球性腎炎 '任何器官或組織之移植排 斥、革蘭氏陰性敗血症、革蘭氏陽性敗企症、歸因於細 胞内有機體之肉芽腫、毛細胞白血病、哈-斯二氏病 (Hallervorden-Spatz disease)、橋本甲狀腺炎、花粉熱、 心臟移植排斥、血色素沉著、血液透析、溶血性尿毒症 候群/溶解企栓性jk小板減少性紫癜、出血、肝炎（a)、 希氏（His)束心律不整、HIV感染/HIV神經病、霍奇金氏 病（Hodgkin's disease)、過動性運動障礙、過敏性反應、 140653.doc •16· 201006485 過敏性肺炎、高血壓、運動功能減退之運動障礙、下視 丘-腦下垂體-腎上腺軸分析、特發性阿狄森氏病、特發 性肺纖維化、抗體介導之細胞毒性、虛弱、嬰兒脊髓性 肌萎縮、主動脈發炎、A型流行性感冒、電離輕射曝 露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺血後再灌注 損傷、缺血性中風、幼年型類風濕性關節炎、幼年型脊 髓性肌萎縮、卡波西氏肉瘤（Kaposi，s sarc〇ma)、腎臟移 f排斥、退伍軍人病（legi_lla)、利什曼病、麻風、皮 質脊髓系統之病變、脂肪水遽、肝移植排斥、淋巴水 腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑 色素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝/特發性疾病、 偏頭痛、線粒體多系統病症、混合性結締組織病、單株 丙種球蛋白病、多發性骨趙瘤、多發性系統退化 Dejerine-Thomas Shi-Dragei^Machad〇_J〇seph)、重症肌 無力、胞内禽結核分枝才旱菌、結核分枝桿菌、骨趙發育 • 不良症候群、心肌梗塞、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新 生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經退化性疾病、神經W 肌肉萎縮、嗜中性白血球減少性發燒、非霍奇金淋巴瘤 (non-hodgkins lymphoma)、腹主動脈及其分支之閉塞、 閉塞性動脈病症、〇kt3療法、睪丸炎/附睪炎、睪丸炎/ 輸精管重新接合術、器官腫大、骨質疏鬆症、騰腺移植 排斥、胰腺癌、腫瘤形成徵兆症候群/惡性血鈣過多、甲 狀旁腺移植排斥、骨盆發炎性疾病、常年性鼻炎、心包 疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周邊血管性病症、腹膜 140653.doc -17- 201006485 炎、惡性貧血、肺囊蟲肺炎、肺炎、POEMS症候群（多 發性神經病、器官腫大、内分泌病、單株丙種球蛋白病 及皮膚變化症候群）、灌注後症候群、泵送後症候群、 MI後心切開術症候群、子癇前期、進行性核上性麻痹、 原發性肺動脈高壓、放射療法、里諾氏現象（Raynaud,s phenomenon)及疾病、里諾氏疾病、雷富孫氏病 (Refsum's disease)、規則性窄波qrs心動過速、腎企管 高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、 老年性舞蹈病、路易體型之老年癡呆症、血清陰性關節 病、休克、錄狀細胞貧血、皮膚同種移植排斥、皮膚變 化症候群、小腸移植排斥、實體腫瘤、特異性心律不 整、脊椎共濟失調、脊髓小腦退化、鏈球菌性肌炎、小 腦結構損害、亞急性硬化性全腦炎、昏厥、心血管系統 之梅毒、全身性過敏症、全身性發炎反應症候群、全身 性發作幼年型類風濕性關節炎、τ細胞或FAB ALL、毛 細血管擴張、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少症、毒 性、移植、外傷/出血、III型過敏性反應、IV型過敏 性、不穩定絞痛、尿毒症、尿敗血症、蓴痲疹、心臟瓣 膜疾病、靜脈曲張、脈管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形 成、〜至纖維性顫動、病毒及真菌感染、致命腦炎/無菌 性腦膜炎、致命相關之嗜血細胞症候群、魏尼凱-柯薩可 夫症候群（wernicke-K〇rsakoff syndrome)、威爾遜氏疾病 (Wilson’s disease)、任何器官或組織異種移植排斥急 性冠狀動脈症候群、急性特發性多發性神經炎急性發 140653.doc 201006485 炎脫聽勒多發性神經根神經病、急性局部缺血、成年斯 蒂爾氏病（Still’s disease)、斑形脫髮' 全身性過敏反 應、抗磷脂抗體症候群、再生障礙性貧血、動脈硬化、 異位性濕疹、異位性皮炎、自體免疫性皮炎、與鏈球菌 感染相關之自體免疫性病症、自體免疫性腸病、自體免 疫性聽力損失、自體免疫性淋巴組織增生症候群 (ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性印巢早衰、眼 驗炎、支氣管擴張、大皰性類天疱瘡、心血管疾病、災 難性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎病、慢性局部缺血、 瘢痕性類天疱瘡、伴以多發性硬化症風險之臨床上分離 症候群（CIS)、結膜炎、兒童發作精神錯亂、慢性阻塞性 肺病（COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病、糖 尿病、椎間盤突出、椎間盤脫垂、藥物誘發的免疫性溶 血性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、内眼炎、上鞏膜 炎、多形性紅斑、嚴重多形性紅斑、妊娠期類天疱瘡、 格-巴一氏症候群（Guillain-Barr0 syndrome ; GBS)、花粉 熱、休茲氏症候群（Hughes syndrome)、特發性帕金森氏 病、特發性間質性肺炎、IgE介導之過敏症、免疫性溶 血性貧血、包涵體肌炎、傳染性眼睛發炎性疾病、發炎 脫藤鞘病、發炎心臟病、發炎腎病、特發性肺纖維化/常 見間質性肺炎（IPF/UIP)、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角膜 結膜炎、庫斯毛耳氏疾病（Kussmaul disease)或庫斯毛耳-麥爾氏疾病（Kussmaul-Meier disease)、蘭德里麻痒 (Landry's paralysis)、蘭格罕氏細胞組織細胞增多病 140653.doc •19· 201006485 (Langerhan's cell histiocytosis)、網狀青斑、黃斑退化、 微觀多血管炎、白赫鐵列夫症（morbus bechterev)、運動 神經元病症、黏膜類天疱瘡、多重器官衰竭、重症肌無 力、骨趙發育不良症候群、心肌炎、神經根病症、神經 病、非甲非乙型肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、 少關節型兒童期類風濕性關節炎（pauciarticular JRA)、 周邊動脈閉塞性疾病（PAOD)、周邊血管疾病（PVD)、周 邊動脈疾病（PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎（或結節性 動脈周炎）、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節 型JRA、多内分泌腺分泌不足症候群、多發性肌炎、風 濕性多肌痛（PMR)、泵送後症候群、原發性帕金森氏 病、前列腺及直腸癌及造血性惡性病（白血病及淋巴 瘤）、前列腺炎、純紅血球再生不良、原發性腎上腺機能 不全、復發性視神經脊髓炎、再狹窄、風濕性心臟病、 薩福症（saPh〇)(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥大及骨 炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性、肺休克、鞏膜炎、坐 骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚錢相關之結締 組織病、角層下膿皰性皮膚病（snedd〇n wilkins〇n dermatosis)、僵直性脊椎炎、史蒂芬瓊森症候群 (Stevens-Johnson Syndrome ; SJS)、全身性發炎反應症候 群、顧動脈炎、弓形蟲視網膜炎、中毒性表皮壞死溶 解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、㈤過 敏性反應、Π型糖尿病、#轉、常見間質性肺炎 (mp)、脈管炎、春季結膜炎、病毒視網琪炎、伏格特- 140653.doc •20· 201006485 小柳-原田症候群（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome ； VKH syndrome)、濕性黃斑退化、創傷癒合、耶爾森氏 菌屬及沙門菌屬相關之關節病。 61. 如請求項60之方法，其中係藉由至少一種選自以下之模 式投與該個體：非經腸、皮下、肌肉内、靜脈内、關節 内、支氣管内、腹内、囊内、軟骨内、腔内、體腔内 (intracelial)、小腦内、側腦室内、大腸内、子宮頸内、 胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹媒 内、胸膜内、前列腺内、肺内、直腸内、腎内、視網膜 内、脊椎内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、大丸 藥、陰道、直腸、頰内、舌下、鼻内及經皮。 62. —種生成能夠結合兩個抗原之雙可變區免疫球蛋白之方 法，其包含以下步驟： a) 獲得能夠結合第一抗原之第一親本抗體或其抗原結 合部分； b) 獲得能夠結合第二抗原之第二親本抗體或其抗原結 合部分； c) 構築包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n之第一及第三多肽 鏈，其中： VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 一重鏈可變區； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 二重鏈可變區； C為重鍵怪定區； 140653.doc •21· 201006485 XI為連接子，其限制條件為其不為Cjj 1 ; X2為Fc區域；且 η為0或1 ;及 d) 構築包含VDl-(Xl)n-VD2_c_(X2)n之第二及第四多 肽鍵，其中： VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 一輕鍵可變區； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 二輕鏈可變區； C為輕鏈恆定區； X1為連接子’其限制條件為其不為Ch 1 ; X2不包含Fc區域；且 η為0或1 ;及 e) 表現該第一多肽鏈、該第二多肽鏈、該第三多肽鏈 及該第四多肽鏈； 以使得生成能夠結合該第一抗原及該第二抗原之雙可 變區免疫球蛋白，其中該結合蛋白能夠結合選自由以下 各者組成之群之一對抗原：Αβ(序列1)與Αβ(序列3)、 TNF_〇^ Αβ(序列 2)、IL-Ιβ 與 Αβ(序列 2)、Αβ(序列 1)與 Αβ(序列 2)、IGF1，2 與 Αβ(序列 2)、Αβ(序列 2)與 IL-18、 IL-6與 Αβ(序列 2)、TNF-α與 Αβ(序列 3)、IL-Ιβ與 Αβ(序列 3)、Αβ(序列 1)與 Αρ(序列 3)、IGF12 與 Αρ(序列 3)、 Αβ(序列 3)與 IL-18、IL-6與 Αβ(序列 3)、TNF-a與 Αβ(序列 1)、IL-Ιβ與 Αβ(序列 1)、IGF12與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1) 140653.doc •22· 201006485 與 IL-18、IL-6 與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1)與 RAGE、NGF 與 IL-18、NGF與 IL-Ιβ、NGF與 IL-6、TNF-α與 EGFR(序 歹|J2)、TNF-α與 RAGE、CD-20與 EGFR(序列 1)、CD-20與 EGFR(序列 2)、RGMA與 TNF-α。 63. 如請求項62之方法，其中該VD1重鏈可變區及該VD2重 鏈可變區包含選自由以下各者組成之群之胺基酸序列： SEQ ID NO : 28、30、32、34、36、38、40、42、44、 46、48、50、52、54及56且其中該VD1輕鏈可變區及該 β VD2輕鏈可變區包含選自由以下各者組成之群之胺基酸 序歹|J ： SEQ ID NO : 29、31、33、35、37、39、41、 43 、 45 、 47 、 49 、 51 、 53 、 55及57 。 64. 如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 部分及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自由人類 抗體、CDR移植抗體及人源化抗體組成之群。 65. 如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 I 部分及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自由以下 參 各者組成之群：Fab片段、F(ab’）2片段、包含藉由鉸鏈區 ^ 域處之雙硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段、由VH及 CH1區組成的Fd片段、由抗體之單臂之VL及VH區組成 之Fv片段、dAb片段、經分離之互補決定區域（CDR)、單 鏈抗體及雙功能抗體。 66. 如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 部分擁有該雙可變區免疫球蛋白所展現之至少一種所需 性質。 140653.doc -23- 201006485 67·如請求項62之方法，其中該第二親本抗體或其抗原結合 4为擁有該雙可變區免疫球蛋白所展現之至少一種所需 性質。 68. 如請求項62之方法，其中該Fc區域係選自由原生序列以 區域及變異序列Fc區域組成之群。 69. 如請求項62之方法，其中該Fc區域係選自由以下各者之 Fc 區域組成之群：IgG1、IgG2、IgG3、Ig(}4、igA、 IgM、IgE及 igD。 70. 如明求項66之方法，其中該所需性質係選自一或多個抗馨 艎參數。 71. 如明求項67之方法’其中該所需性質係選自一或多個抗 體參數。 72.如4求項7G之方法，其中該等抗體參數係選自由以下 者組成之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效能、 物功能、抗原決定基識別性、穩定性、溶解性、生產
    率、免疫原性、藥物代謝動力學、生物可用性、組織 叉反應性及直系同源性抗原結合性。 73·如明求項71之方法’其中該等抗體參數係選自由以下 者組成之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效能、 物功能、抗原決定基識別性、穩定性、溶解性、生產 1=原性、藥物代謝動力學、生物可用性、組織: 叉反應性及直系„性抗原結合性。 74.如請求項62之方法，其 邱八& #货> 、第一親本抗體或其抗原結< °刀…的結合親和力不同於該第二親本抗肩 140653.doc -24- 201006485 或其抗原結合部分與該第二抗原之結合親和力。 75. 如^項62之方法，其中該第—親本抗體或其抗原結合 =該第-抗原的結合效能不同於該第二親本抗體或 其抗原結合部分與該第二抗原之結合效能。 76. -種生成具有所需性質之能夠結合兩個抗原之雙可變區 免疫球蛋白的方法，其包含以下步驟： 4獲得能夠結合第—抗原且擁有該雙可變區免疫球蛋 參 白所展現之至少一種所需性質之第一親本抗體或其抗原 結合部分； b) 獲得能夠結合第二抗原且擁有該雙可變區免疫球蛋 白所展現之至少一種所需性質之第二親本抗體或其抗原 結合部分； c) 構築包含VDl-(Xl)n_VD2_c_(X2)n之第一及第三多肽 鏈，其中： VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 一重鍵可變區； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 二重鏈可變區； C為重鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為其不為CH1 ; X2為Fc區域；且 η為0或1 ; d)構築包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n之第二及第四多 肽鏈，其中： 140653.doc -25- 201006485 VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 一輕鍵可變區； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 二輕鍵可變區； C為輕鍵恨定區； XI為連接子，其限制條件為其不為CH1 ; X2不包含Fc區域；且 η為0或1 ; e)表現該第一多肽鏈、該第二多肽鏈、該第三多肽鏈 及該第四多肽鏈； 以使得生成具有所需性質之能夠結合該第一抗原及該 第二抗原之雙可變區免疫球蛋白，其中該結合蛋白能夠 結合選自由以下各者組成之群之一對抗原：Αβ(序列1)與 Αβ(序列 3)、TNF-α與 Αβ(序列 2)、IL-Ιβ 與 Αβ(序列 2)、 Αβ(序列1)與Αβ(序列2)、IGF1，2與Αβ(序列2)、Αβ(序列 2)與 IL-18、IL-6與 Αβ(序列 2)、TNF-a與 Αβ(序列 3)、IL-1β與Αβ(序列3)、Αβ(序列1)與Αβ(序列3)、IGF1,2與 Αβ(序列 3)、Αβ(序列 3)與 IL-18、IL-6 與 Αβ(序列 3)、 TNF-a與 Αβ(序列 1)、IL-Ιβ與 Αβ(序列 1)、IGF1，2與 Αβ(序 列 1)、Αβ(序列 1)與 IL-18、IL-6與 Αβ(序列 1)、Αβ(序列 1) 與 RAGE、NGF 與 IL-18、NGF 與 IL-Ιβ、NGF 與 IL-6、 TNF-a 與 EGFR(序列 2)、TNF-a 與 RAGE、CD-20 與 EGFR(序列 1)、CD-20 與 EGFR(序列 2)、RGMA 與 TNF-a ° 140653.doc -26-
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