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JP5746861B2 - 哺乳動物のｎｇａｌに結合する抗体及びその使用 - Google Patents

哺乳動物のｎｇａｌに結合する抗体及びその使用 Download PDF

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JP5746861B2 JP2010530148A JP2010530148A JP5746861B2 JP 5746861 B2 JP5746861 B2 JP 5746861B2 JP 2010530148 A JP2010530148 A JP 2010530148A JP 2010530148 A JP2010530148 A JP 2010530148A JP 5746861 B2 JP5746861 B2 JP 5746861B2
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Description

（関連出願の情報）
本願は、全て２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号、６０／９８１，４７１号及び６０／９８１，４７３号並びに全て２００８年４月１６日に出願された米国非仮特許出願１２／１０４，４０８号、１２／１０４，４１０号及び１２／１０４，４１３号の優先権を主張し、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
（技術分野）
本発明は、哺乳動物のＮＧＡＬに結合する抗体及び抗体を使用する方法に関する。
リポカリンは、細菌からヒトまで様々な生物中に見出される細胞外リガンド結合タンパク質のファミリーである。リポカリンは、小さな疎水性分子の結合及び輸送、栄養素の輸送、細胞増殖の制御並びに免疫応答の調節、炎症及びプロスタグランジン合成など、多くの異なる機能を有している。さらに、幾つかのリポカリンは、細胞制御プロセスにも関与しており、様々な病状における診断及び予後のマーカーとしての役割を果たす。例えば、α糖タンパク質の血漿レベルは、妊娠中に、並びに癌化学療法、腎機能不全、心筋梗塞、関節炎及び多発性硬化症などの症状の診断及び予後においてモニターされる。
１９９３年に、ヒト好中球由来の新規リポカリン好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（又はＮＧＡＬ、リポカリン−２若しくはＬＣＮ２としても知られる。）が同定された。ＮＧＡＬは、単量体並びにホモ及びヘテロ二量体形態で存在する２５ｋＤａのリポカリンであり、後者は、ヒト好中球ゼラチナーゼとの４６ｋＤａ二量体として存在する。ＮＧＡＬの三量体形態も同定されている。ＮＧＡＬは、活性化されたヒト好中球の特異的顆粒から分泌される。相同的なタンパク質が、マウス（２４ｐ３／ウテロカリン）及びラット（α（２）−ミクログロブリン関連タンパク質／ν関連リポカリン）中に同定されている。構造的データは、８本鎖のβバレルを有するＮＧＡＬの典型的なリポカイン折り畳みを確認したが、リポカリン中に通常見られるより極性が高く、正に帯電したアミノ酸残基とともに整列された異常に大きな空洞を有している。２５ｋＤａＮＧＡＬタンパク質は、細菌由来のリポ多糖及びホルミルペプチドなどの小さな親油性物質を結合すると考えられており、炎症の調節物質として機能し得る。
急性腎不全又は慢性腎不全などの腎臓の傷害又は病気は、（病気、傷害などの）様々な異なる原因に由来し得る。腎臓の傷害及び病気の早期同定及び治療は、疾病の進行を妨げる上で有用である。現在、腎機能のバイオマーカーとして、血清クレアチニンがしばしば使用されている。しかしながら、血清クレアチニンの測定は、筋肉質量、性別、人種及び服薬によって影響を受ける。残念なことに、これらの制約のために、しばしば、著しい損傷が既に生じた後でなければ、腎臓病の診断が得られない。
ＮＧＡＬは、急性腎臓傷害又は腎臓病に対する初期マーカーである。活性化されたヒト好中球の特異的な顆粒によって産生される他に、ＮＧＡＬは、尿細管上皮の損傷に応答して、ネフロンによっても産生され、尿細管間質性（ＴＩ）傷害のマーカーである。ＮＧＡＬレベルは、正常な血清クレアチニンレベルと比べて、穏やかな「無症候性」腎虚血の後でさえ、虚血又は腎毒性由来の急性尿細管壊死（ＡＴＮ）において上昇する。さらに、ＮＧＡＬは、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の場合に、腎臓によって発現されることが知られている。上昇した尿のＮＧＡＬレベルは、進行性の腎不全として示唆されている。ＮＧＡＬは動物及びヒトの両モデルにおいて、虚血性又は腎毒性傷害後の極めて早期に、腎臓尿細管によって顕著に発現されることが以前に示されている。ＮＧＡＬは、尿中に素早く分泌され（ＮＧＡＬは、尿中において、容易に検出及び測定できる。）、虚血性傷害の他のあらゆる公知の尿又は血清マーカーの出現に先行する。このタンパク質はプロテアーゼ耐性であり、ＮＧＡＬの尿細管発現の忠実なマーカーとして尿中に回収できることを示唆する。さらに、例えば、血液からろ過される腎臓の外側に由来するＮＧＡＬは、尿中に出現せず、むしろ、近位尿細管によって定量的に吸収される。
ＮＧＡＬを検出するための様々なイムノアッセイが本分野において公知である。本明細書に前述されているように、ＮＧＡＬは、単量体として、二量体（ホモ二量体又はヘテロ二量体）として、及び三量体としてさえ見出される。従って、検査試料中のＮＧＡＬ単量体、二量体又は三量体を特異的に検出及び識別することができる新規抗体及びイムノアッセイに対する要望が本分野において存在する。さらに、検査試料中に含有される二量体に対する単量体の相対的割合を定量することができるイムノアッセイに対する要望も本分野において存在する。
このような新規抗体及びイムノアッセイは、とりわけ、患者中のあらゆる腎傷害又は腎臓病の程度を評価し、腎傷害又は腎臓病に罹患している患者の腎臓の状態をモニターし、又は患者中の何れかの腎傷害の程度を評価し、その後、患者の腎臓の状態をモニターするために使用することができる。本発明のさらなる目的及び利点が、本明細書に提供されている記載から明らかとなる。
一実施形態において、本発明は、配列番号１又は３３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む立体構造的エピトープに特異的に結合する単離された抗体に関する。単離された抗体は、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、完全にヒト化された抗体、部分的にヒト化された抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合されたＦｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性なそのエピトープ結合断片であり得る。
さらに、上記抗体は、ヒトＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つのさらなるアミノ酸に結合するヒトＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つのさらなるアミノ酸に結合し、前記アミノ酸は配列番号１又は３３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１７又は１１９からなる群から選択される。より具体的には、抗体は、配列番号１又は３３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１７にさらに結合する。あるいは、抗体は、配列番号１又は３３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１９にさらに結合する。あるいは、抗体は、配列番号１又は３３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１７及び１１９にさらに結合する。
別の実施形態において、本発明は、ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
別の実施形態において、本発明は、ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
さらに別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５に関する。
さらに別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体に関する。
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
別の実施形態において、本発明は、ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０に関する。
さらに別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体に関する。
さらに別の実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号１、２、３０又は３３に記載されているヒトＮＧＡＬタンパク質のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む立体構造的エピトープに特異的に結合する抗体；
（ｂ）ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する単離された抗体；
（ｃ）ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体；
（ｄ）ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体；
（ｆ）ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する単離された抗体；
（ｇ）ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体；
（ｈ）ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体；及び
（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体；
からなる群から選択される１つ又はそれ以上の抗体を含む免疫診断試薬に関する。
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３０又は３３に記載されている（特に、配列番号３０又は３３に記載されている）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する単離された抗体に関し、
（ａ）残基Ｎ１１６に関して、約１Ｈ＝９．４７又は約１５Ｎ＝１１８．３０に位置する共鳴位置；
（ｂ）残基Ｑ１１７に関して、約１Ｈ＝７．７９又は約１５Ｎ＝１１７．６７に位置する共鳴位置；
（ｃ）残基Ｈ１１８に関して、約１Ｈ＝８．７５又は約１５Ｎ＝１１６．４３に位置する共鳴位置；
（ｄ）残基Ｔ１４１に関して、約１Ｈ＝７．９９又は約１５Ｎ＝１０９．０６に位置する共鳴位置；
（ｅ）残基Ｋ１４２に関して、約１Ｈ＝７．８２又は約１５Ｎ＝１１４．２５に位置する共鳴位置；
（ｆ）残基Ｅ１４３に関して、約１Ｈ＝７．４０又は約１５Ｎ＝１１４．００に位置する共鳴位置；及び
（ｇ）残基Ｅ１５０に関して、約１Ｈ＝８．７０又は約１５Ｎ＝１１８．８０に位置する共鳴位置；
からなる群から選択される配列番号１、２、３０又は３３の（特に、配列番号３０又は３３の）残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の少なくとも４つのＴＲＯＳＹプロトン−窒素相関ＮＭＲスペクトルにおいて、
前記抗体をヒトＮＧＡＬタンパク質に添加した結果として、前記抗体が添加されていない場合と比べて、前記抗体は、
（１）１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍから約１．０ｐｐｍまでの擾乱、
（２）１５Ｎ共鳴位置における約０．３ｐｐｍから約３．０ｐｐｍまでの擾乱、又は
（３）共鳴強度の約２．５倍から約２０倍の減少、
を引き起こす。
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３０又は３３に記載されている（特に、配列番号３０又は３３に記載されている）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する単離された抗体に関し、
（ａ）残基Ｙ６４に関して、約１Ｈ＝９．１５又は約１５Ｎ＝１１３．３０に位置する共鳴位置；
（ｂ）残基Ｖ８４に関して、約１Ｈ＝９．３４又は約１５Ｎ＝１２１．５０に位置する共鳴位置；
（ｃ）残基Ｇ８７に関して、約１Ｈ＝８．３２又は約１５Ｎ＝１１１．６０に位置する共鳴位置；
（ｄ）残基Ｔ９３に関して、約１Ｈ＝９．３２又は約１５Ｎ＝１１２．２０に位置する共鳴位置；
（ｅ）残基Ｌ９４に関して、約１Ｈ＝７．７１又は約１５Ｎ＝１２２．３４に位置する共鳴位置；
（ｆ）残基Ｇ９５に関して、約１Ｈ＝９．３５又は約１５Ｎ＝１１４．１３に位置する共鳴位置；及び
（ｇ）残基Ｓ９９に関して、約１Ｈ＝８．１８又は約１５Ｎ＝１１４．４０に位置する共鳴位置；
からなる群から選択される配列番号１、２、３０又は３３の（特に、配列番号３０又は３３の）残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の少なくとも４つのＴＲＯＳＹプロトン−窒素相関ＮＭＲスペクトルにおいて、
前記抗体をヒトＮＧＡＬタンパク質に添加した結果として、前記抗体が添加されていない場合と比べて、前記抗体は、
（１）１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍから約１．０ｐｐｍまでの擾乱、
（２）１５Ｎ共鳴位置における約０．３ｐｐｍから約３．０ｐｐｍまでの擾乱、又は
（３）共鳴強度の約２．５倍から約２０倍の減少、
を引き起こす。
ヒトＮＧＡＬ野生型抗原配列（配列番号１）を示す。原型のヒトＮＧＡＬシグナルペプチド残基は、斜字体及び下線で記載されている。ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３プラスミド中の野生型ヒトＮＧＡＬ配列は、太字で記載されている。Ｃ末端中の６ＸＨｉｓタグは、下線で記載されている。 実施例１において論述されている野生型ヒトＮＧＡＬ配列を含有するプラスミドｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３（ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−ｈｉｓＡとしても知られる。）を示す。 ヒトＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体抗原配列（配列番号２）を示している。原型のヒトＮＧＡＬシグナルペプチドは、斜字体及び下線で記載されている。ｐＪＶ−ＮＧＡＬ（Ｓｅｒ８７）−Ｈｉｓ−Ａ３プラスミド中の野生型ＮＧＡＬ配列は、太字で記載されており、ＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体コドン配列は太字及び下線で記載されている。Ｃ末端中の６ＸＨｉｓタグにも、下線が付されている。 野生型ヒトＮＧＡＬポリヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。 変異体ヒトＮＧＡＬポリヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。 サブクローン１−９０３−４３０から得た精製された抗体が、親ｍＡｂ１−９０３−１０２と比較したときに、ビオチン標識されたヒトＮＧＡＬ抗原（ＮＧＡＬ−Ｂｔ）と類似の用量応答曲線を示すことを示すグラフであり、これにより、サブクローニングの工程がサブクローンの機能的な性能を変化させなかったことを示している。記号：（−黒菱形−）ＮＡＧＬ−ＢｔとｍＡｂ１−９０３−１０２；（−黒丸−）ＮＧＡＬ−ＢｔとｍＡｂ１−９０３−４３０；（−黒四角−）無関係のビオチン化された抗原（ＮＣＡｇ−Ｂｔ）とｍＡｂ１−９０３−１０２；（−ｘ−）ＮＣＡｇ−ＢｔとｍＡｂ１−９０３−４３０。 非特異的結合の不存在を示すために、陰性対照ｍＡｂを陰性対照のマッチするビオチン標識された抗原（ＮＣｍＡｂ）と一緒に含めたことを除き、図７は、１−２３２２細胞株に対する親及びサブクローン材料を比較する図６と同じ用量応答曲線を示す。記号：（−黒菱形−）ＮＡＧＬ−ＢｔとＮＣｍＡｂ；（−黒丸−）ＮＣＡｇ−ＢｔとｍＡｂ１−２３２２−４５５；（−黒四角−）ＮＣＡｇ−ＢｔとＮＣｍＡｂ；（−黒三角−）ＮＧＡＬ−ＢｔとｍＡｂ１−２３２２−１０１；（−ｘ−）ＮＣＡｇ−ＢｔとｍＡｂ１−２３２２−１０１；（−＊−）ＮＧＡＬ−ＢｔとのｍＡｂ１−２３２２−４５５。 ＮＧＡＬｍＡｂＣＩＡサンドイッチ形成に対する抗原滴定曲線のグラフであり、縦軸がＮＧＡＬ濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸が発光カウント／秒（ＬＣＰＳ）。記号：（−黒菱形−）アクリジン化された２１１−０１ｍＡｂ；（−黒四角−）アクリジン化された１−１８１−１２８ｍＡｂ；（−黒三角−）アクリジン化された１−４１９−１８２ｍＡｂ；（−ｘ−）アクリジン化された１−９０３−１０２ｍＡｂ；（−＊−）アクリジン化された２１１−０２ｍＡｂ。 モノクローナル抗体１−２３２２−４５５の様々な配列を示している。図９Ａは、可変重鎖（配列番号５及び７）のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列並びにＣＤＲ重鎖１（配列番号８）、ＣＤＲ重鎖２（配列番号９）及びＣＤＲ重鎖３（配列番号１０）に対するアミノ酸配列を示している。 モノクローナル抗体１−２３２２−４５５の様々な配列を示している。図９Ｂは、可変軽鎖（配列番号６及び１１）のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列並びにＣＤＲ軽鎖１（配列番号１２）、ＣＤＲ軽鎖２（配列番号１３）及びＣＤＲ軽鎖３（配列番号１４）に対するアミノ酸配列を示している。 モノクローナル抗体１−９０３−４３０の様々な配列を示している。図１０Ａは、可変重鎖（配列番号１５及び１７）に対するポリヌクレオチド及びアミノ酸配列並びにＣＤＲ重鎖１（配列番号１８）、ＣＤＲ重鎖２（配列番号１９）及びＣＤＲ重鎖３（配列番号２０）に対するアミノ酸配列を示している。 モノクローナル抗体１−９０３−４３０の様々な配列を示している。図１０Ｂは、可変軽鎖（配列番号１６及び２１）に対するポリヌクレオチド及びアミノ酸配列並びにＣＤＲ軽鎖１（配列番号２２）、ＣＤＲ軽鎖２（配列番号２３）及びＣＤＲ軽鎖３（配列番号２４）に対するアミノ酸配列を示している。 実施例７に記載されている異なる機能的エピトープに結合するモノクローナル１−２３２２−４５５に対する等温結合データのグラフである。記号：（−白丸−、実線）野生型ＮＧＡＬエピトープ；（−白四角−、実線）Ｓ１１２Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−白菱形−、長い破線）Ｑ１１７Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−ｘ−、短い破線）Ｈ１１８Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−＋−、点線）Ａ１１８Ｇ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−白三角−、極めて長い破線）Ｅ１４７Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ。 実施例７に記載されている異なる機能的エピトープに結合するモノクローナル１−９０３−４３０に対する等温結合データのグラフである。記号：（−白丸−、実線）野生型ＮＧＡＬエピトープ；（−白四角−、実線）Ｓ１４Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−白菱形−、長い破線）Ｋ１５Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−ｘ−、短い破線）Ｒ１０９Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−＋−、点線）Ｓ１５８Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−白三角−、極めて長い破線）Ｌ１５９Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ；（−黒丸−）Ｇ１６０Ａ変異を含むＮＧＡＬエピトープ。 ヒトＮＧＡＬのＸ線結晶構造上のＮＧＡＬエピトープ残基の分子モデル化を示している。図１３Ａは、抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体１−９０３−４３０相互作用のために不可欠な残基（Ａｒｇ１０９及びＬｙｓ１５）を示している。 ＮＭＲを用いてＮＧＡＬのエピトープを同定するために実施例８において使用した変異されたＮＧＡＬ（成熟ＮＧＡＬ配列から全てのシグナルペプチドを除去）のポリヌクレオチド配列（配列番号２９）及びアミノ酸配列（配列番号３０）を示している。アミノ酸残基８７及びヌクレオチド２６３の太字の配列は、修飾されたコドン中の変化を受けたヌクレオチド及び予想されるＣｙｓからＳｅｒへの変化を示している。残基７６及び１７５の斜字体で記載されたＣｙｓは、鎖内Ｓ−Ｓ結合（野生型ＮＧＡＬ中の残基７６、８７及び１７５に、３つのＣｙｓ残基が存在する。）を示す。最初のＭｅｔ残基は、原核生物中のみで産生され、真核生物中では産生されず、従って、本明細書において、存在する場合には残基−１としてカウントされ、原核生物中に存在するときに、真核生物に比べて、ポリヌクレオチド配列に対する類似の調整を行わなかった。ＴＧＡ終始コドンは、アミノ酸配列上のアスタリスクによって特定される。 実施例８に記載されているＮＧＡＬ（＋）ｍｕｔ８タンパク質の誘導及び精製から得られた試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。レーン：（１）サイズマーカー；（２）可溶化液上清；（３）可溶化液沈降物；（４）Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｒ）非結合画分及び（５）Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｒ）精製画分。 ｍＡｂ２３２２の過剰を添加した後のヒトＮＧＡＬの１Ｈ−１５ＮＴＲＯＳＹＨＳＱＣスペクトルの一部を示す。アサインメントは、公開データベースＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（データベースエントリー４２６７）に登録されたものに基づいており、観察された擾乱カテゴリーの例が示されている。（灰色の太い線によって示された）抗体結合によるシフトが、遊離のタンパク質の対応するスペクトル（細い黒線によって示されている。）上に重ね合わされている。 ヒトＮＧＡＬの１Ｈ−１５ＮＴＲＯＳＹＨＳＱＣスペクトルの一部を示しており、抗体結合によるシフト（灰色の太い線で描かれたスペクトル）が遊離のタンパク質の対応するスペクトル（細い黒線として示されている。）上に重ね合わされている。図１７Ａは、ｍＡｂ９０３の過剰の添加後のスペクトルの一部を示している。図１７Ｂは、ｍＡｂ２３２２の過剰の添加後におけるヒトＮＧＡＬのスペクトルの対応する一部を示している。これらの図の差によって、これらの抗体がＮＧＡＬ上の異なる表面上で相互作用することが確認される。アサインメントは、公開データベースＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（データベースエントリー４２６７）に登録されたものに基づいている。 ヒトＮＧＡＬの１Ｈ−１５ＮＴＲＯＳＹＨＳＱＣスペクトルの一部を示しており、抗体結合によるシフト（灰色の太い線で描かれたスペクトル）が遊離のタンパク質の対応するスペクトル（細い黒線として示されている。）上に重ね合わされている。図１７Ａは、ｍＡｂ９０３の過剰の添加後のスペクトルの一部を示している。図１７Ｂは、ｍＡｂ２３２２の過剰の添加後におけるヒトＮＧＡＬのスペクトルの対応する一部を示している。これらの図の差によって、これらの抗体がＮＧＡＬ上の異なる表面上で相互作用することが確認される。アサインメントは、公開データベースＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（データベースエントリー４２６７）に登録されたものに基づいている。 アミノ酸の位置（横軸）対相対的擾乱（縦軸）に関して本明細書中に記載されている様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合によって引き起こされたＮＧＡＬ骨格１Ｈ−１５Ｎ共鳴擾乱を示すグラフである。図１８Ａは、ｍＡｂ２３２２に対して観察された共鳴変化を示している。 アミノ酸の位置（横軸）対相対的擾乱（縦軸）に関して本明細書中に記載されている様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合によって引き起こされたＮＧＡＬ骨格１Ｈ−１５Ｎ共鳴擾乱を示すグラフである。図１８Ｂは、ｍＡｂ８０９に対して観察された共鳴変化を示している。 アミノ酸の位置（横軸）対相対的擾乱（縦軸）に関して本明細書中に記載されている様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合によって引き起こされたＮＧＡＬ骨格１Ｈ−１５Ｎ共鳴擾乱を示すグラフである。図１８Ｃは、ｍＡｂ２６９に対して観察された共鳴変化を示している。 アミノ酸の位置（横軸）対相対的擾乱（縦軸）に関して本明細書中に記載されている様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合によって引き起こされたＮＧＡＬ骨格１Ｈ−１５Ｎ共鳴擾乱を示すグラフである。図１８Ｄは、ｍＡｂ１８１に対して観察された共鳴変化を示している。 アミノ酸の位置（横軸）対相対的擾乱（縦軸）に関して本明細書中に記載されている様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合によって引き起こされたＮＧＡＬ骨格１Ｈ−１５Ｎ共鳴擾乱を示すグラフである。図１８Ｅは、ｍＡｂ９０３に対して観察された共鳴変化を示している。 アミノ酸の位置（横軸）対相対的擾乱（縦軸）に関して本明細書中に記載されている様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合によって引き起こされたＮＧＡＬ骨格１Ｈ−１５Ｎ共鳴擾乱を示すグラフである。図１８Ｆは、ｍＡｂ４１９に対して観察された共鳴変化を示している。 ヒトＮＧＡＬタンパク質の三次元（３Ｄ）構造上への擾乱された共鳴のマッピングを示している。具体的には、この図は、ヒトＮＧＡＬ（ｐｄｂｉｄ：１ｘ８９）の骨格リボン表記を示しており、擾乱された残基のアミドが球体と描かれ、シグナルペプチドを除去した成熟ヒトＮＧＡＬ配列に従って付番した。図１９Ａは、Ｋ１４２とＥ１５０の間の残基を含む、ｍＡｂ２３２２結合によって擾乱された残基の幾つかの位置を示している。図１９Ｂは、Ｌ１８及びＱ８８を含むｍＡｂ９０３によって擾乱された残基の幾つかの表面位置を示している。両方のリボンは、同じ配向である。 抗ＮＧＡＬｍＡｂ及びＮＧＡＬの結合曲線（横軸に遊離のＮＧＡＬ濃度及び縦軸に結合された割合）及び表９に列記されているそれらの計算された解離定数（Ｋｄ）を示している。記号：（−黒丸−）ｍＡｂ９０３；（−黒四角−）ｍＡｂ８０９；（−白丸−）ｍＡｂ２３２２；（−黒三角−）ｍＡｂ１８１；（−白三角−）ｍＡｂ２６９。 ＮＧＡＬの添加前（点線）及び添加後（実線）の様々な抗体対に対する二重チャンネル交差相関蛍光曲線を示している（横軸は時間（秒、対数目盛り）及び縦軸は標準化された蛍光交差相関関数ＧＸ（τ））。図２１Ａは、ｍＡｂ２３２２とｍＡｂ９０３対に対する結果を示している。図２１Ｂは、ｍＡｂ２３２２及びｍＡｂ８０９対に対する結果を示している。図２１Ｃは、ｍＡｂ８０９及びｍＡｂ１８１対に対する結果を示している。
ある種の哺乳動物のＮＧＡＬタンパク質に結合する抗体が発見された。これらの単独で又は組み合わされた抗ＮＧＡＬ抗体（本明細書において、「ＮＧＡＬ抗体」と広い意味で表記される。）は、例えば、診断アッセイの成分として様々な用途を有し、又はイムノアッセイキット中に存在する。
全てのＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに野生型ＮＧＡＬ組換え抗原（ｒＡｇ）及び変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬＮＧＡＬｒＡｇクローン、サブクローン、ハイブリッド及びハイブリドーマ（名称及び付番を含む。）は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（参照により、これらに関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。
Ａ．定義
本明細書に使用されているように、内容から明白である場合を除き、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数表記が含まれる。本明細書で数値範囲を記載する場合には、同一精度でその範囲内の各数値を明確に想定する。例えば、６から９の範囲では、６及び９に加えて、数値７及び８が想定され、６．０から７．０の範囲では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明確に想定される。
ａ）抗体
本明細書において使用される、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全又は部分的にヒト化）、動物抗体（一態様において、トリ（例えば、アヒル又はガチョウ））、別の態様において、サメ又はクジラ、さらに別の態様において、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）及びヒト以外の霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）を含む哺乳動物）、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）及び上記の何れかの機能的に活性なエピトープ結合断片を表す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。単純化のために、分析物に対する抗体は、「抗分析物抗体」又は単に「分析物抗体」（例えば、ＮＧＡＬ抗体）の何れかとしばしば称される。
ｂ）尿細管細胞傷害
本明細書において使用される「尿細管細胞傷害」という表現は、多数の疾病又は疾患のプロセスによって引き起こされ得る、突然の（急性）又は時間をかけてゆっくり低下する（慢性）腎若しくは腎臓不全又は機能障害を意味する。尿細管細胞傷害の急性及び慢性形態は何れも、生命を脅かす代謝異常をもたらし得る。
ｃ）急性腎臓病
「急性尿細管細胞傷害」は、急性虚血性腎傷害（ＩＲＩ）又は急性腎毒性腎傷害（ＮＲＩ）を意味する。ＩＲＩには、虚血傷害及び慢性虚血傷害、急性腎不全、急性糸球体腎炎及び急性尿細管間質性腎障害が含まれるが、これらに限定されない。ＮＲＩ毒性には、敗血症（感染）、ショック、外傷、腎臓結石、腎感染症、薬物毒性、毒（ｐｏｉｓｏｎ）又は毒物（ｔｏｘｉｎ）又は放射線造影色の注射後が含まれるが、これらに限定されない。
ｄ）慢性腎臓病
本明細書において互換的に使用される「慢性尿細管細胞傷害」、「進行性腎臓病」、「慢性腎臓病（ＣＲＤ）」、「慢性腎臓病（ＣＫＤ）」という用語には、突然の現象ではなく、ある期間にわたって発生して、尿細管細胞機能の漸進的低下又は尿細管細胞傷害の悪化を引き起こすあらゆる腎臓症状又は機能障害が含まれる。慢性腎臓病が継続した場合の１つの終末点は、「慢性腎不全（ＣＲＦ）」である。例えば、本明細書において互換的に使用される慢性腎臓病又は慢性腎傷害には、慢性的な感染によって引き起こされる症状又は機能障害、慢性的炎症、糸球体腎炎、血管疾患、間質性腎炎、薬物、毒物、外傷、腎臓結石、長期の高血圧、糖尿病、うっ血性心不全、鎌形赤血球貧血症及び他の造血機能障害に由来する腎障害、肝炎、ＨＩＶ、パルボウイルス及びＢＫウイルス（ヒトポリオーマウイルス）に関連する腎障害、嚢胞性腎臓病、先天性奇形、閉塞、悪性腫瘍、原因不明の腎臓病、ループス腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、局所的糸球体硬化症、微小変化型疾患、クリオグロブリン血症、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陽性血管炎、ＡＮＣＡ陰性血管炎、アミロイドーシス、多発性骨髄腫、軽鎖沈着症、腎臓移植の合併症、腎臓移植の慢性的拒絶、慢性同種移植腎障害及び免疫抑制剤の慢性効果が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、慢性腎臓病又は慢性腎傷害は、慢性腎不全又は慢性糸球体腎炎を表す。
ｅ）免疫診断試薬
本発明における「免疫診断試薬」は、ＮＧＡＬタンパク質の領域に特異的に結合する１つ又はそれ以上の抗体を含む。例えば、イムノアッセイにおける及び／又は検量用試料、対照及び免疫診断剤としての本発明のこのような抗体の使用が、本明細書に記載されている。しかしながら、本発明の抗体は、例えば、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（改良されたＮＧＡＬアッセイに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているような改良されたＮＧＡＬアッセイにおいても、場合によって使用することができる。
ｆ）ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列
ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列に関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおりである。このようなポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、本発明において、場合によって使用することができる。
一般に、本明細書において使用されるＮＧＡＬは、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＧｅｎｐｅｐｔＣＡＡ５８１２７（配列番号１）、ＡＡＢ２６５２９、ＸＰ ８６２３２２、ＸＰ ５４８４４１、Ｐ８０１０８、Ｐ１１６７２、Ｘ８３００６．１、Ｘ９９１３３．１、ＣＡＡ６７５７４．１、ＢＣ０３３０８９．１、ＡＡＨ３３０８９．１、Ｓ７５２５６．１、ＡＤ１４１６８．１、ＪＣ２３３９、１ＤＦＶＡ、１ＤＦＶＢ、１Ｌ６ＭＡ、１Ｌ６ＭＢ、１Ｌ６ＭＣ、１ＮＧＬＡ、１ＱＱＳＡ、１Ｘ７１Ａ、１Ｘ７１Ｂ、１Ｘ７１Ｃ、１Ｘ８９Ａ、１Ｘ８９Ｂ、１Ｘ８９Ｃ、１Ｘ８ＵＡ、１Ｘ８ＵＢ及び１Ｘ８ＵＣとして記載されているものなど、あらゆるＮＧＡＬ配列であり得る。ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド（例えば、ポリアミノ酸）配列は、天然に見出される配列に基づいて、天然に見出されるとおりであり、単離され、合成的、半合成的、組換え又はその他である。一実施形態において、ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬ（「ｈＮＧＡＬ」としても知られる。）である。別段の記載がなければ、ＮＧＡＬポリペプチド配列は、天然に典型的に見出される２０残基のアミノ酸シグナルペプチドを差し引いた（及び他のあらゆるシグナルペプチド配列を差し引いた）成熟ヒトＮＧＡＬ配列に従って付番される。シグナルペプチドが存在する場合、例えば、残基−１から−２０のように負の数字が付番され、コードポリヌクレオチド配列に対しては同じ付番が適用される。
同様に、ＮＧＡＬのＮ末端の開始Ｍｅｔ残基は、原核生物（例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））中で産生されたＮＧＡＬ又は合成（半合成を含む。）若しくは誘導された配列中のみに存在し、真核生物（例えば、ヒトを含む哺乳動物細胞及び酵母細胞）中で産生されるＮＧＡＬ中には存在しない。従って、存在する場合には、開始Ｍｅｔ残基は本明細書において負の数として（例えば、残基−１として）カウントされ、原核及び真核両バックグラウンド中でポリヌクレオチド配列が同じように複製及び転写され、差異は翻訳のレベルで存在するので、真核生物と比較して原核生物のバックグラウンド又は発現系中のポリヌクレオチド配列に対して類似の調整を行わなかった。
従って、本明細書の開示は、原核生物及び／又は真核生物バックグラウンド中に存在し及び／又は産生される（例えば、その結果、コドン認識に対する最適化を有する）異なる多数のＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を（例えば、免疫原として、及び／又は抗体結合研究において）使用することを包含する。要するに、配列は、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）成熟ＮＧＡＬ配列中のＮ末端に存在する開始Ｍｅｔ残基、（ｃ）成熟ＮＧＡＬタンパク質に先行するシグナルペプチドの先頭に存在する開始Ｍｅｔ残基及び（ｄ）当業者に自明なものなどの他の変動を保有若しくはコードしてもよく、又は保有若しくはコードしなくてもよい。
典型的な配列には、本明細書中に記載されているもの、すなわち、配列番号１（シグナルペプチドを含むＮＧＡＬ野生型ポリペプチド）、配列番号２（シグナルペプチドを含むＮＧＡＬ変異体ポリペプチド）、配列番号３０（シグナルペプチドを一切含まず、並びに原核生物中で産生され及びＭｅｔ開始コドンが存在するときには、Ｍｅｔ開始残基が先行し得るが、Ｍｅｔ開始コドンが存在するか否かに関わらず、真核生物中で産生されたときにはＭｅｔ開始残基が存在しないＮＧＡＬ変異体ポリペプチド）、配列番号３３（シグナルペプチドを一切含まず、並びに原核生物中で産生され及びＭｅｔ開始コドンが存在するときには、Ｍｅｔ開始残基が先行し得るが、Ｍｅｔ開始コドンが存在するか否かに関わらず、真核生物中で産生されたときにはＭｅｔ開始残基が存在しないＮＧＡＬ野生型ポリペプチド）；配列番号３（シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＮＧＡＬ野生型ポリヌクレオチド配列）；配列番号４（シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）；配列番号３２（何れかのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないが、Ｍｅｔ開始コドン、例えば、ＡＴＧあり又はなしに、場合によってＮ末端にさらに先行することができる、合成又は真核生物発現用のＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）、配列番号２９（何れかのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないが、Ｍｅｔ開始コドン、例えば、ＡＴＧあり又はなしに、場合によってＮ末端にさらに先行することができる、合成又は真核生物発現用のＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）が含まれるが、これらに限定されない。
ｇ）グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ
グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、免疫原として、及び／又は様々な抗体の結合を評価するために使用される）は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（参照により、この点に関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。
一般に、本明細書において使用される場合、本明細書において互換的に使用される「オリゴ糖部分」又は「オリゴ糖分子」という用語は、インビボ又はインビトロでのグリコシル化によって、（例えば、哺乳動物のＮＧＡＬなどのグリコシル化されたポリペプチドを産生するために）ポリペプチドに付着させることができる１つ又はそれ以上の単糖残基を含む炭水化物含有分子を表す。ポリペプチドに付着されたオリゴ糖部分の数が明示的に表示されている場合を除き、本明細書において引用される「オリゴ糖部分」という表記は全て、ポリペプチドに付着された１つ又はそれ以上のこのような部分を表すものとする。好ましくは、前記炭水化物含有分子を付着させることができるポリペプチドは、すなわち、本明細書中にさらに記載されている「グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ」を提供するために野生型又は変異体哺乳動物ＮＧＡＬである。
「インビボグリコシル化」という用語は、インビボで、例えば、例えばＮ結合型及びＯ結合型グリコシル化によって、ポリペプチドの発現のために使用されるグリコシル化細胞中での翻訳後プロセッシングの間に起こるオリゴ糖部分のあらゆる付着を意味するものとする。通常、Ｎ−グリコシル化されたオリゴ糖部分は、５つの単糖残基（すなわち、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及び３つのマンノース残基）から構成される共通の基本的コア構造を有する。正確なオリゴ糖構造は、グリコシル化を行う問題の生物及び具体的なポリペプチドに大きく依存する。
「インビトログリコシル化」という用語は、場合によって架橋剤を用いて、オリゴ糖部分をポリペプチドの付着基へ共有結合させることを通常含む、インビトロで行われる合成的グリコシル化を表す。インビトログリコシル化は、様々な異なる化学を用いて、化学的に合成されたオリゴ糖構造をポリペプチド（例えば、哺乳動物ＮＧＡＬなど）に付着させることによって達成することができる。例えば、使用され得る化学は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に付着させるために使用される化学であり、場合によって短いスペーサーを介して、オリゴ糖が官能基に連結される。インビトログリコシル化は、約０．０２から約２．０ｍＬの容量で、約０．５から約２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、約４．０から約７．０のｐＨの適切な緩衝液中で実施することができる。他のインビトログリコシル化法は、例えば、Ａｐｌｉｎ他によるＷＯ８７／０５３３０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ中のＬｕｎｄｂｌａｄ他によるＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９−３０６（１９８１）、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：３７５９−３７６５（１９８２）及びＤｏｅｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２１９３−２１９９（１９８２）に記載されている。
ｈ）ヒトＮＧＡＬ断片
ヒトＮＧＡＬ断片（例えば、免疫原として、様々な抗体の結合を評価するために使用される）は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（参照により、この点に関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。
一般に、本明細書において使用される「ヒトＮＧＡＬ断片」は、本明細書において、成熟ヒトＮＧＡＬ又はシグナルペプチドを含むＮＧＡＬの全体より少ない部分を含むポリペプチドを表す。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、３０又は３３の約５から約１７８まで又は約１７９の連続するアミノ酸を含む。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、３０又は３３の約５から約１７０の連続するアミノ酸を含む。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、３０又は３３の少なくとも約５個の連続するアミノ酸、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３のアミノ酸の少なくとも約１５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約２０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約２５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３のアミノ酸の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約３５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約４０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約４５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約５５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約６０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約６５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約７０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約７５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約８０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約８５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約９０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約９５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１００個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１０５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１１０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１１５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１２０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１２５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１３０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１３５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１４０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１４５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１５０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１６０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１６５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１７０個の連続するアミノ酸残基又は配列番号１、２、３０若しくは３３の少なくとも約１７５個の連続するアミノ酸残基を含む。
（例えば、免疫原として、及び／又は様々な抗体の結合を評価するために使用される）本発明において使用することが想定されるヒトＮＧＡＬ断片の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
（ａ）配列番号１、２、３０又は３３のアミノ酸残基１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７及び１１８を含む少なくとも約７個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まり、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基は、本明細書に前述されているように、負の付番が為される。）；
（ｂ）配列番号１、２、３０又は３３のアミノ酸残基１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８及び１１９を含む少なくとも約８個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｃ）配列番号１、２、３０又は３３のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む少なくとも約３６個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｄ）配列番号１、２、３０又は３３のアミノ酸残基１５及び１０９を含む少なくとも約９５個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｅ）配列番号１、２、３０又は３３のアミノ酸残基１５、１０９及び１５８を含む少なくとも約１４４個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｆ）配列番号１、２、３０又は３３のアミノ酸残基１５、１０９、１５８及び１５９を含む少なくとも約１４５個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；又は
（ｇ）配列番号１、２、３０又は３３のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９及び１６０を含む少なくとも約１４６個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）。
場合によって、本明細書に記載されているように使用されるこのようなヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号３、４又は３２の対応する配列によって部分的に又は完全にコードされる。これらの線に沿って、一実施形態において、本発明は、配列番号４若しくは３２の配列を含む又は配列番号４若しくは３２の配列からなる単離され、精製され、又は単離及び精製されたヒトＮＧＡＬポリヌクレオチドの使用を想定する。
ｉ）ＮＧＡＬハイブリッド
本明細書において使用される「ＮＧＡＬハイブリッド」又は「ＮＧＡＬハイブリドーマ」という用語は、目的の抗ＮＧＡＬ抗体を産生するハイブリドーマクローン又はサブクローン（明記されているとおりの）を表す。一般に、同じ種類のサブクローンから得られたものと比較すると、ハイブリドーマクローンによって産生された抗体の親和性には、幾らか小さな変動が存在し得る（例えば、クローンの純度を反映する。）。比較により、同じクローンを起源とし、さらに、目的の抗ＮＧＡＬ抗体を産生する全てのハイブリドーマサブクローンは、同じ配列及び／又は同じ構造の抗体を産生することが十分に確立されている。
ｊ）特異的結合
本明細書において、「特異的結合」という用語は、特定の部位において、別の結合パートナーよりある結合パートナー（例えば、２つのポリペプチド、ポリペプチドと核酸分子又は２つの核酸分子）に優先的に結合することと定義される。「特異的に結合する」という用語は、非特異的な標的分子（例えば、特異的に認識される部位を欠如する無作為な分子）に比べて、標的分子／配列に対する結合の優先性（例えば、親和性）は、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍及び最も好ましくは少なくとも１０倍又は２０倍であることを示す。
ｋ）結合パートナー
本明細書において使用される「結合パートナー」とは、結合ペアの一員、すなわち、分子の１つが第二の分子に結合する分子のペアである。特異的に結合する結合パートナーは、「特異的結合パートナー」と称される。イムノアッセイにおいて一般的に使用される抗原及び抗体結合パートナーの他に、他の特異的な結合パートナーは、ビオチン及びアビジン、炭水化物及びレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター及び受容体分子、補因子及び酵素、酵素阻害剤及び酵素などが含まれ得る。さらに、特異的な結合パートナーは、元の特異的結合パートナーの類縁体である対（例えば、分析物−類縁体）を含み得る。免疫反応性の特異的結合パートナーには、抗原、抗原断片、抗体及び抗体断片（モノクローナル及びポリクローナルの両方）並びにこれらの複合体が含まれる（組換えＤＮＡ法によって形成されるものを含む。）。
ｌ）エピトープ
本明細書において使用される「エピトープ」又は「目的のエピトープ」という用語は、認識され、その特異的結合パートナー上の相補的部位に結合することができる何れかの分子上の部位を表す。分子と特異的結合パートナーは、特異的結合ペアの一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、炭水化物抗原（糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖など（但し、これらに限定されない。））又は多糖であり得、その特異的結合パートナーは抗体であり得る（但し、これに限定されない。）。
特に、エピトープは、抗原（すなわち、抗体が結合するタンパク質）の特定領域（１つ又はそれ以上のアミノ酸から構成される。）を表す。より具体的には、抗原性エピトープは、抗体結合ドメインの表面上の相補的領域（パラトープ）と相互作用するタンパク質表面上の領域である。従って、エピトープは、抗体との静電的相互作用、疎水的相互作用及び水素結合に関与し、表面の正しい形状、その柔軟性及び構造的動力学に必要とされる残基も含有する。抗原性エピトープに対して強固な支持の役割を有する、埋め込まれた「第二球体」残基も存在する。
ｍ）結合定数（例えば、ＫＤ、ｋａ及びｋｄ）
本明細書において互換的に使用される「平衡解離定数」又は「ＫＤ」という用語は、平衡状態での滴定測定において得られた値又は会合速度定数（ｋｏｎ）によって解離速度定数（ｋｏｆｆ）を除することによって得られた値を表す。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数は、抗原への抗体の結合親和性を表すために使用される。
「相対親和性」又は「相対的ＫＲ」という用語は、抗血清検査試料又はクローニングされていないハイブリッド検査試料を含む検査集団内で抗体／抗原ＫＤを測定するために同じ検査方法を用いて明らかにされた抗原への抗体の結合力として定義することができ、従って、「絶対的な」特異性データではなく、相対的な親和性値を与える。（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２：４９（１９７７）及びＥｓｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅ７４（１９９１）参照）。
本明細書において互換的に使用される「会合速度定数」、「ｋｏｎ」又は「ｋａ」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原への抗体の結合速度又は抗体と抗原の間での複合体形成の速度を示す値を表す。
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）−＞Ａｂ−Ａｇ
本明細書において互換的に使用される「解離速度定数」、「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原から抗体が解離する速度又はＡｂ−Ａｇ複合体が経時的に遊離の抗体及び抗原へ分離することを示す値を表す。
Ａｂ＋Ａｇ＜−Ａｂ−Ａｇ
会合及び解離速度定数を測定するための方法は、本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術を用いることによって、平衡状態にある生理的緩衝液中で試料を調べるための高い感度及び能力が得られる。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（生物分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的アプローチ及び装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢから入手可能な装置、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することが可能である。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）も使用することが可能である。
ｎ）対象
本明細書において使用される「対象」及び「患者」という用語は、当該対象が治療の何れかの形態を有し、又は現在行っているかどうかに関わらず、互換的に使用される。本明細書において使用される「対象」という用語は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウスなど）、ヒト以外の霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）及びヒトを含む哺乳動物を表す。好ましくは、対象は、ヒトである。
ｏ）検査試料
本明細書において使用される「検査試料」という用語は、血清、血漿、血液（全血を含むが、これに限定されない。）、リンパ、尿又は対象の他の体液に由来する生物学的試料を表す。検査試料は、当業者に公知の定型的な技術を用いて調製することが可能である。好ましくは、検査試料は、尿又は血液である。
ｐ）前処理試薬（例えば、溶解、沈殿及び／又は可溶化試薬）
本明細書に記載されている診断アッセイにおいて使用される前処理試薬とは、何れかの細胞を溶解し、及び／又は検査試料中に存在する何らかの分析物を可溶化する試薬である。本明細書中にさらに記載されているように、前処理は、全ての試料に対して必要とは限らない。とりわけ、分析物（すなわち、ＮＧＡＬ）の可溶化には、試料に存在する何れかの内在性結合タンパク質からの分析物の放出を引き起こす。前処理試薬は、同種（分離工程を必要としない）又は異種（分離工程を必要とする）であり得る。異種の前処理試薬を使用すると、アッセイの次の工程に進む前に、検査試料からのあらゆる沈殿した分析物結合タンパク質の除去が存在する。前処理試薬は、（ａ）１つ若しくはそれ以上の溶媒及び塩、（ｂ）１つ若しくはそれ以上の溶媒、塩及び界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、（ｄ）界面活性剤及び塩又は（ｅ）細胞溶解及び／若しくは分析物の可溶化に適したあらゆる試薬若しくは試薬の組み合わせを場合によって含むことができる。また、単独の又は他の何れかの前処理剤（例えば、溶媒、界面活性剤、塩など）と組み合わせたプロテアーゼを使用することができる。
ｑ）固相
本明細書において使用される「固相」は、不溶性であり、又はその後の反応によって不溶性となり得るあらゆる物質を表す。固相は、捕捉剤を誘引及び固定化するその固有の能力のために選択され得る。あるいは、捕捉剤を誘引及び固定化する能力を有する連結剤を固相に付着することができる。連結剤には、例えば、捕捉剤そのものに、又は捕捉剤に連結された帯電物質に関して反対の電荷を帯びた帯電物質が含まれ得る。一般に、連結剤は、固相上に固定化され（又は固相に付着され）、及び結合反応を通じて捕捉剤を固定化する能力を有するあらゆる結合パートナー（好ましくは、特異的な）であり得る。連結剤によって、アッセイの実施前又はアッセイの実施中に、捕捉剤が固相物質に間接的に結合することが可能となる。固相は、例えば、プラスチック、誘導化されたプラスチック、磁気又は非磁気金属、ガラス又はケイ素であり得、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び当業者に公知の他の構成などであり得る。
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的とするものであって、その他、限定を意図するものではない。
Ｂ．グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ
本発明において使用されるグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（参照により、この点に関するその教示に関して組み込まれる。）に記載されているとおりである。一般に、本発明は、あらゆる種類の哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、単離された、組換え、変異体、野生型、合成、半合成など）、特に、場合によってグリコシル化されている哺乳動物ＮＧＡＬ、特に本明細書に記載されているようなヒトＮＧＡＬの使用を想定する。このような哺乳動物ＮＧＡＬは、例えば、抗体を作製するための免疫原として、及び／又はこのような抗体の結合を評価する際に使用される。
一実施形態において、本発明は、単離されたグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬの使用に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１つのオリゴ糖分子又は部分及び最大１０のオリゴ糖分子又は部分を含有するグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬに関する。本発明において使用されるグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬには、グリコシル化されたイヌＮＧＡＬ、グリコシル化されたネコＮＧＡＬ、グリコシル化されたラットＮＧＡＬ、グリコシル化されたマウスＮＧＡＬ、グリコシル化されたウマＮＧＡＬ、グリコシル化された非ヒト霊長類ＮＧＡＬ及びグリコシル化されたヒトＮＧＡＬが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬである。さらに、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型ＮＧＡＬ（すなわち、野生型イヌＮＧＡＬ、野生型ネコＮＧＡＬ、野生型ラットＮＧＡＬ、野生型マウスＮＧＡＬ、野生型ウマＮＧＡＬ、野生型非ヒト霊長類ＮＧＡＬ又は野生型ヒトＮＧＡＬなどの（但し、これらに限定されない。）あらゆる野生型哺乳動物ＮＧＡＬ）であり得る。好ましくは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号１（シグナルペプチドを含み、配列番号１の付番はシグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基の直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）又は配列番号３３（シグナルペプチドを含まない。）に示されているアミノ酸配列を有する野生型ヒトＮＧＡＬである。あるいは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬの対応するアミノ酸配列と比べたときに、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含むグリコシル化された変異体哺乳動物ＮＧＡＬであり得る。例えば、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型ヒトＮＧＡＬ（例えば、配列番号１又は３３参照）のアミノ酸配列は少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するヒトＮＧＡＬであり得る。具体的には、少なくとも１つのアミノ酸置換を、配列番号１又は３３のアミノ酸残基８７に施すことができる。具体的には、配列番号１又は３３に示されているアミノ酸８７のシステインをセリンと置換することができる（例えば、配列番号２及び３０参照）。セリン又はシステイン以外のアミノ酸（例えば、グリシン又はアラニン）に対する他の置換を施すこともできる。さらに、定型的な実験操作を用いて、当業者により、配列番号１又は３３のアミノ酸残基８７における単一のアミノ酸置換以外の他のアミノ酸置換、欠失又は付加を施すことができる。
本明細書において使用される哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、場合によってグリコシル化された）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、化学合成によって、又は化学合成と組換えＤＮＡ技術の組み合わせによって作製することができる。具体的には、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列を単離又は合成することによって構築され得る。上述のように、哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、場合によってグリコシル化された）は、野生型哺乳動物ＮＧＡＬであり得、又は１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含有する変異体哺乳動物ＮＧＡＬであり得る。このようなアミノ酸置換、欠失又は付加は、突然変異導入によるなど（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８０：１４７−１５１（１９８９）に記載されているような、周知の方法に従う部位指定突然変異導入、無作為突然変異導入又はシャッフリングを用いて）、本分野において公知の定型的技術を用いて施すことができる。
目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用することによるなど、オリゴヌクレオチドが所望の哺乳動物ＮＧＡＬ（野生型又は変異体）のアミノ酸配列に基づいて設計される化学合成によって、好ましくは、組換え哺乳動物ＮＧＡＬがその中で産生される宿主細胞中で好まれるコドンを選択することによって調製され得る。例えば、所望の哺乳動物ＮＧＡＬの一部をコードする幾つかの小さなオリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結又は連結連鎖反応（ＬＣＲ）によって合成及び組み立てられ得る。各オリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的組み立てのために５’又は３’突出を含有する。
（合成、部位指定突然変異導入又は別の方法によるなど）一旦組み立てられたら、目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、組換えベクター中に挿入され、所望の形質転換された宿主細胞中でのその発現のために必要な何れかの調節配列へ作用可能に連結され得る。
全てのベクター及び発現調節配列が、目的のポリヌクレオチド配列を発現するために等しく良好に機能し得るわけではなく、全ての宿主が同じ発現系とともに等しく良好に機能するわけではないが、当業者は、過度の実験操作なしに、本発明において使用するためのこれらのベクター、発現調節配列、最適化されたコドン及び宿主から容易に選択を行い得ると考えられる。ベクターは、宿主中で複製可能でなければならず、又は染色体中に組み込まれなければならないので、例えば、ベクターを選択する際には、宿主を検討しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力及びベクターによってコードされる何らかの他のタンパク質の発現（抗生物質マーカーなど）も検討すべきである。発現調節配列を選択する際には、様々な要因も検討され得る。これらには、配列の相対的な強さ、その調節可能性及び特に、潜在的な二次構造に関して、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列とのその適合性が含まれるが、これらに限定されない。宿主は、選択されたベクターとのその適合性、コドン使用、分泌特性、ポリペプチドを正しく折り畳む能力、発酵又は培養の必要性、タンパク質をグリコシル化する能力（又は能力の欠如）及びヌクレオチド配列によってコードされる産物の精製の容易さなどを検討することによって選択すべきである。
組換えベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外成分として存在し、その複製が染色体の複製から独立しているベクター（プラスミドなど）であり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、ベクターがその中に組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
ベクターは、好ましくは、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の転写のために必要とされる追加セグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。ベクターは、典型的には、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来する。本明細書に挙げられている宿主細胞中での発現に適した多数の発現ベクターが市販されており、又は文献に記載されている。真核生物宿主に対する有用な発現ベクターには、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスから得られる発現調節配列を含むベクターが含まれるが、これらに限定されない。具体的なベクターには、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）／Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）が含まれる。酵母細胞中で使用するための発現ベクターの例には、２μプラスミド及びその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４，９３１，３７３号参照）、ｐＪＳＯ３７ベクター（Ｏｋｋｅｌｓ，Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８２：２０２−２０７，（１９９６）に記載されている。）及びｐＰＩＣＺＡ、Ｂ又はＣ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。昆虫細胞中で使用するための発現ベクターの例には、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ ａｎｄＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒＭｕｌｌｅｒｉａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ” Ｃｅｌｌ，４５：６８５−６９８（１９８６）、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５及びｐＭｅｌｂａｃ（何れも、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能である。）が含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するための好ましいベクターは、ｐＪＶ（Ａｂｂｏｔｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡから入手可能）である。
使用可能な他のベクターは、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列のコピー数を増幅することができる。このような増幅可能なベクターは、本分野において周知である。これらのベクターには、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｉｎａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号、Ｋａｕｆｉｎａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃＤＮＡ Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｕｔｉｌｉｚｅｄ Ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１３０４−１３１９（１９８２））及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号及び欧州特許出願０３３８，８４１号参照）によって増幅され得るベクターが含まれるが、これに限定されない。
組換えベクターは、目的の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列をさらに含み得る。（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）このような配列の例は、ＳＶ４０の複製起点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１から３及び複製起点である。
ベクターは、選択可能なマーカー、すなわち、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子をコードする遺伝子など（Ｐ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ，４０：１２５−１３０（１９８５）参照）、その産物が宿主細胞中の欠損を相補する遺伝子又はポリヌクレオチドをコードする遺伝子もしくはポリヌクレオチド又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものも含み得る。糸状真菌の場合、選択可能なマーカーには、ａｍｄＳ、ｐｒｙＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「調節配列」という用語は、哺乳動物ＮＧＡＬの発現に必要な又は有利なあらゆる成分を表す。各調節配列は、哺乳動物ＮＧＡＬをコードする核酸配列にとって固有又は外来であり得る。このような調節配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサー又は上流活性化配列、シグナルペプチド配列及び転写終結因子が含まれるが、これらに限定されない。最小限、調節配列は、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列に作用可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。
本明細書において使用される「作用可能に連結された」という用語は、配列の正常な機能が発揮され得るような互いに対する配置での、酵素的連結又はその他の手段による２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列の共有結合を表す。例えば、プレ配列又は分泌リーダーをコードするポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドの分泌に関与するプロタンパク質としてポリペプチドが発現された場合に、ポリペプチドに対するポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されている。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼした場合に、コード配列に作用可能に連結されている。リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合に、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結された」とは、連結されているポリヌクレオチド配列が連続しており、分泌性リーダーの場合には、連続しており及び読み取り相にあることを意味する。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合には、標準的な組換えＤＮＡ法と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
本発明において、多様な発現調節配列が使用され得る。このような有用な発現調節配列には、前記発現ベクターの構造遺伝子に付随した発現調節配列及び原核若しくは真核細胞又はこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られているあらゆる配列並びにこれらの様々な組み合わせが含まれる。哺乳動物細胞中での転写を誘導するための適切な調節配列の例には、ＳＶ４０及びアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、例えば、アデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ドロソフィラ最小熱ショックプロテイン７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモン終結因子、ＳＶ４０又はアデノウイルスＥ１ｂ領域ポリアデニル化シグナル及びＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ， Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ， １９６：９４７−５０（１９８７））が含まれる。
哺乳動物細胞中での発現を改善するために、合成イントロンが、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列の５’非翻訳領域中に挿入され得る。合成イントロンの一例は、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）から得られる合成イントロンである。
昆虫細胞中での転写を誘導するための適切な調節配列の例には、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター及びバキュロウイルス３９Ｋ後初期遺伝子プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化配列が含まれるが、これらに限定されない。
酵母宿主細胞中で使用するための適切な調節配列の例には、酵母α接合系のプロモーター、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖系遺伝子又はアルコール脱水素酵素遺伝子由来のプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター及び誘導性ＧＡＬプロモーターが含まれる。
糸状真菌宿主細胞中で使用するための適切な調節配列の例には、ＡＤＨ３プロモーター及びターミネーター、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼ又はアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、エー・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼ、エー・ニガー又はエー・ニジュラス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｓ）グルコアミラーゼ、エー・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ又はリパーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター及びＡＤＨ３ターミネーターが含まれる。
哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。哺乳動物ＮＧＡＬがその中で発現される細胞から分泌されるべき場合には、シグナルペプチドが存在する。このようなシグナルペプチドが存在する場合、このようなシグナルペプチドは、ポリペプチドの発現のために選択された細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、目的の哺乳動物ＮＧＡＬに対して相同（例えば、目的の哺乳動物ＮＧＡＬとともに通常付随するシグナルペプチドであり得る。）若しくは異種（すなわち、目的の哺乳動物ＮＧＡＬとは別の源を起源とする。）であり得、又は宿主細胞に対して、相同又は異種であり得る（すなわち、宿主細胞から本来発現されるペプチドであり、又は宿主細胞から本来発現されないペプチド）。従って、シグナルペプチドは、原核生物性であり（例えば、細菌に由来する。）又は真核生物性（例えば、哺乳動物又は昆虫、糸状真菌又は酵母細胞に由来する。）であり得る。
シグナルペプチドの存在又は不存在は、例えば、哺乳動物ＮＧＡＬの産生のために使用される発現宿主細胞に依存する。糸状真菌において使用するために、シグナルペプチドは、アスペルギルス種のアミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ若しくはプロテアーゼ又はフミコラ・ラヌギノサリパーゼをコードする遺伝子に都合よく由来し得る。昆虫細胞中で使用する場合、シグナルペプチドは、鱗翅目のマンジュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）脂質動員ホルモン前駆体（米国特許第５，０２３，３２８号参照）、ミツバチのメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、エクジステロイドＵＤＰグルコシル転移酵素（ｅｇｔ）（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４：３４９−３５７（１９９３）などの昆虫遺伝子（ＷＯ９０／０５７８３参照）又はヒト膵臓リパーゼ（ｈｐｌ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２８４：２６２−２７２（１９９７））に由来し得る。
哺乳動物細胞中で使用するためのシグナルペプチドの具体例には、マウスＩｇκ軽鎖シグナルペプチドが含まれる（Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：８９−１０４（１９９２））。酵母細胞中で使用する場合、適切なシグナルペプチドには、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ．Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，２８９：６４３−６４６（１９８１））、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ．Ｖａｉｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４８：８８７−８９７（１９８７）参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０参照）及び酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ，６：１２７−１３７（１９９０）参照）が含まれる。
本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するために、細菌、真菌（酵母を含む。）、昆虫、哺乳動物又は他の適切な動物細胞若しくは細胞株及びトランスジェニック動物又は植物を含むあらゆる適切な宿主を使用し得る。イー・コリなどの非グリコシル化生物が使用される場合、本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するために、イー・コリ中での発現の後に、好ましくは、適切なインビトログリコシル化が行われる。
細菌宿主細胞の例には、バシラス、例えば、ビー・ブレビス（（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）又はビー・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス又はストレプトミセスの系統などのグラム陽性細菌又はイー・コリの系統などのグラム陰性細菌が含まれるが、これらに限定されない。細菌宿主細胞中へのベクターの導入は、形質転換受容細胞（例えば、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ８１：８２３−８２９（１９６１））又はＤｕｂｎａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５６：２０９−２２１（１９７１））を用いた例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８：１１１−１１５（１９７９）参照）、電気穿孔（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２−７５１（１９８８）参照）又は連結（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １６９：５７７１−５２７８（１９８７）参照）によって実施され得る。
適切な糸状真菌宿主細胞の例には、アスペルギルス、例えば、エー・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、エー・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の系統が含まれるが、これらに限定されない。真菌細胞は、当業者に公知の技術を用いて、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生を含む方法によって形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な手法は、欧州特許出願２３８０２３及び米国特許第５，６７９，５４３号に記載されている。フザリウム種を形質転換するための適切な方法は、「Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ， ７８：１４７−１５６（１９８９）」及びＷＯ９６／００７８７によって記載されている。酵母は、「Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ， Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ， Ｍ．Ｉ．， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １９４， ｐｐ １８２−１８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １５３：１６３（１９８３）；及びＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ， ７５：１９２０（１９７８）」によって記載されている手法を用いて形質転換され得る。
好ましくは、本発明の哺乳動物ＮＧＡＬは、インビボでグリコシル化される。哺乳動物ＮＧＡＬがインビボでグリコシル化される場合、宿主細胞は、哺乳動物ＮＧＡＬの所望されるグリコシル化を作製することができる宿主細胞の群から選択される。従って、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞から選択され得る。
適切な宿主細胞の例には、サッカロミセスの系統、例えば、エス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス、ピー・パストリス又はピー・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）などのピキア、エイチ・ポリモルファ又はヤロウィアなどのハンセニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の系統が含まれる。異種のポリヌクレオチドで酵母細胞を形質転換し、酵母細胞から異種のポリペプチドを産生する方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ （ＹｅａｓｔｍａｋｅｒＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔの製品プロトコール中）によって、及びＲｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ９９：１９３−１９８（１９９２）， Ｍａｎｉｖａｓａｋａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２１：４４１４−４４１５（１９９３）及びＧａｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １２１：１５９−１６４（１９９４）によって開示されている。
適切な昆虫宿主細胞の例には、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９又はＳｆ２１）又はトリコプルシア・ニー細胞（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）などの鱗翅目細胞株が含まれるが、これらに限定されない（米国特許第５，０７７，２１４号参照）。昆虫細胞の形質転換及び異種のポリペプチドの産生は、当業者に周知である。
適切な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ミドリザル細胞株（ＣＯＳ）、マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、ヒト細胞（ヒト胚性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）など）及び組織培養中の植物細胞が含まれる。好ましくは、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞株及びＨＥＫ２９３細胞株である。別の好ましい宿主細胞は、Ｂ３細胞株（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡ）又は別のジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）である。一態様において、本発明は、グリコシル化されたヒト野生型ＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３のアミノ酸配列を有するもの）を産生し、２００６年１１月２１日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０が付与されたＣＨＯ細胞株に関する。好ましくは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０を有するＣＨＯ細胞株によって産生される野生型ヒトＮＧＡＬは、約２５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。別の態様において、本発明は、グリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬを産生するＣＨＯ細胞株に関する。好ましくは、グリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬは、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸においてアミノ酸置換を含む。より好ましくは、アミノ酸置換は、セリンによるシステインの置換である（配列番号２又は３０参照）。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞株は、２００７年１月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８が付与されたＣＨＯ細胞株である。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８を有するＣＨＯ細胞株は、配列番号２又は３０のアミノ酸配列を含むグリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬを産生する。さらに別の態様において、本発明は、配列番号２又は３０のアミノ酸配列を含む単離された変異体グリコシル化されたヒトＮＧＡＬに関する。
哺乳動物の宿主細胞中に外来ポリヌクレオチドを導入する方法には、リン酸カルシウムによって媒介される形質移入、電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介される形質移入、リポソームによって媒介される形質移入、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００を用いる、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫによって記載されているウイルスベクター及び形質移入方法が含まれる。これらの方法は、本分野において周知であり、例えば、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ （１９９６）によって記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば、「Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ｅｄ．， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（１９９９）」及び「Ｈａｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｒａｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）」に開示されている確立された方法に従って実施される。
製造方法において、細胞は、本分野で公知の方法を用いて、哺乳動物ＮＧＡＬの産生に適した栄養素培地中で培養される。例えば、細胞は、振盪フラスコ培養、適切な培地中並びにグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを発現及び／又は単離させる条件下で行われる研究室用又は産業用発酵装置中での小規模若しくは大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ又は固体状態発酵を含む。）によって培養される。培養は、本分野において公知の手法を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養素培地中で行われる。適切な培地は、民間の業者から入手することができ、又は（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ中に）公開された組成に従って調製され得る。グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが栄養素培地中に分泌される場合、哺乳動物ＮＧＡＬは、培地から直接回収され得る。哺乳動物ＮＧＡＬが分泌されない場合には、細胞可溶化液から回収することができる。
得られた哺乳動物ＮＧＡＬは、本分野において公知の方法によって回収され得る。例えば、哺乳動物ＮＧＡＬは、遠心、ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈殿などの（但し、これらに限定されない。）慣用の手法によって、栄養素培地から回収され得る。
哺乳動物ＮＧＡＬは、クロマトグラフィー（イオン交換、アフィニティー、疎水性、等電点電気泳動及びサイズ排除など（但し、これらに限定されない。）、電気泳動手法（調製用等電点など（但し、これらに限定されない。））、溶解度の差（硫酸アンモニウム沈殿など（但し、これらに限定されない。））、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Ｊ−Ｃ Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）参照）などの（但し、これらに限定されない。）本分野において公知の様々な手法によって精製され得る。
本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ（野生型及び変異体）は、様々な異なる目的及び様々な異なる方法のために使用することができる。具体的には、本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、１つ若しくはそれ以上の検量用試料、１つ若しくはそれ以上の対照又は検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬを検出するためのアッセイ（好ましくは、イムノアッセイ）における１つ若しくはそれ以上の検量用試料の組み合わせとして使用することができる。これは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（抗原、検量用試料、対照及びキットに関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）及び２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（改良されたＮＧＡＬアッセイに関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）の主題である。
好ましくは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号１又は３３のアミノ酸配列を含む。あるいは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号２又は３０のアミノ酸配列を含む。
さらに、本明細書中にさらに論述されているように、哺乳動物ＮＧＡＬは、抗体産生のために動物を免疫化するための免疫原として使用することが可能であり、例えば、動物は、マウス、ウサギ、ニワトリ、ラット、ヒツジ、ヤギ、サメ、ラクダ、ウマ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒト又はその他の動物であり得る。一実施形態において、免疫原は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ、特に配列番号１、２、３０又は３３の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬを含む。別の実施形態において、哺乳動物ＮＧＡＬは、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類、ヒト又は他の哺乳動物のものである。
Ｃ．ヒトＮＧＡＬ抗体
本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）又はヒトＮＧＡＬ断片に特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、アミノ酸配列が野生型配列（配列番号１又は３３）の少なくとも１つのアミノ酸置換を含有して変異体又は非固有配列（例えば、配列番号２又は３０）を含むヒトＮＧＡＬにも場合によって結合する。
特に、一態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３、配列番号１の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基の直後に存在する成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）の連続していないアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む（又は、幾つかの実施形態では、これらからなる）エピトープ、特に、立体構造的エピトープに結合する単離された抗体を提供する。本明細書中に記載されている、立体構造的エピトープ（非連続エピトープとしても知られる。）は、順番に連続していないが、三次元空間中で互いに近接している残基によって形成されるエピトープの種類である。別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに少なくとも１つのヒトＮＧＡＬタンパク質の追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）を含む立体構造的エピトープに結合する単離された抗体を提供する。さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合する単離された抗体を提供する。
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体に関する。
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体に関する。
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体に関する。
さらに別の態様において、本発明は、２００６年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５に関する。さらに別の態様において、本発明は、２００６年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体に関する。マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生された抗体は、（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１７又は１１９である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１１２、１１７、１１８、１１９及び１４７を含む立体構造的エピトープに結合することができる。マウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメインを有する。
さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５及び１０９、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５及び１０９並びに野生型ＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５８、１５９又は１６０である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９又は１６０を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体に関する。
さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
さらに別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５及び１０９、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５及び１０９並びに野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５８、１５９又は１６０である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９又は１６０を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体に関する。
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離された抗体に関する。
別の態様において、本発明は、野生型ヒトＮＧＡＬに特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、並びに、さらに（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５及び１０９、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５及び１０９並びに野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５８、１５９又は１６０である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９又は１６０を含む立体構造的エピトープに結合する、単離された抗体に関する。
さらに別の態様において、本発明は、２００６年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０に関する。さらに別の態様において、本発明は、２００６年１１月２１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体に関する。マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生された抗体は、（１）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５及び１０９、（２）野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５及び１０９並びに野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質の少なくとも１つの追加のアミノ酸（追加のアミノ酸は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５８、１５９又は１６０である。）又は（３）野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は３３）のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９又は１６０を含む立体構造的エピトープに結合することができる。マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメインを有する。
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３０又は３３に記載されている（特に、配列番号３０又は３３に記載されている）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する単離された抗体に関し、
（ａ）残基Ｎ１１６に関して、約１Ｈ＝９．４７又は約１５Ｎ＝１１８．３０に位置する共鳴位置；
（ｂ）残基Ｑ１１７に関して、約１Ｈ＝７．７９又は約１５Ｎ＝１１７．６７に位置する共鳴位置；
（ｃ）残基Ｈ１１８に関して、約１Ｈ＝８．７５又は約１５Ｎ＝１１６．４３に位置する共鳴位置；
（ｄ）残基Ｔ１４１に関して、約１Ｈ＝７．９９又は約１５Ｎ＝１０９．０６に位置する共鳴位置；
（ｅ）残基Ｋ１４２に関して、約１Ｈ＝７．８２又は約１５Ｎ＝１１４．２５に位置する共鳴位置；
（ｆ）残基Ｅ１４３に関して、約１Ｈ＝７．４０又は約１５Ｎ＝１１４．００に位置する共鳴位置；及び
（ｇ）残基Ｅ１５０に関して、約１Ｈ＝８．７０又は約１５Ｎ＝１１８．８０に位置する共鳴位置；
からなる群から選択される、配列番号１又は３３の残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の少なくとも３つ、４つ又は５つ、特に、配列番号１、２、３０又は３３の（特に、配列番号３０又は３３の）残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の約２から６のＴＲＯＳＹプロトン−窒素相関ＮＭＲスペクトルにおいて、
前記抗体を（一般に、過剰に、特に化学量論的に過剰に）ヒトＮＧＡＬタンパク質に添加した結果として、前記抗体が添加されていない場合と比べて、前記抗体は、
（１）１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍから約１．０ｐｐｍ、特に、約０．０４ｐｐｍから約０．０６ｐｐｍ、特に、１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍの擾乱、
（２）１５Ｎ共鳴位置における約０．３ｐｐｍから約３．０ｐｐｍ、特に、約０．０１ｐｐｍから約２．０ｐｐｍの、特に約０．１ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ若しくは１５Ｎ共鳴位置における約０．６ｐｐｍの擾乱、又は
（３）共鳴強度の約２．５倍から約２０倍の減少、特に、蛍光強度の約３倍から約１５倍の減少、特に約４倍から約１０倍の減少、
を引き起こす。換言すれば、シフトは、野生型ＮＧＡＬタンパク質中の残基に対応する共鳴位置中に存在する。
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３０又は３３に記載されている（特に、配列番号３０又は３３に記載されている）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する単離された抗体に関し、
（ａ）残基Ｙ６４に関して、約１Ｈ＝９．１５又は約１５Ｎ＝１１３．３０に位置する共鳴位置；
（ｂ）残基Ｖ８４に関して、約１Ｈ＝９．３４又は約１５Ｎ＝１２１．５０に位置する共鳴位置；
（ｃ）残基Ｇ８６に関して、約１Ｈ＝８．３２又は約１５Ｎ＝１１１．６０に位置する共鳴位置；
（ｄ）残基Ｔ９３に関して、約１Ｈ＝９．３２又は約１５Ｎ＝１１２．８０に位置する共鳴位置；
（ｅ）残基Ｌ９４に関して、約１Ｈ＝７．７１又は約１５Ｎ＝１２２．７２に位置する共鳴位置；
（ｆ）残基Ｇ９５に関して、約１Ｈ＝９．３０又は約１５Ｎ＝１１３．７０に位置する共鳴位置；及び
（ｇ）残基Ｓ９９に関して、約１Ｈ＝８．１８又は約１５Ｎ＝１１４．５０に位置する共鳴位置；
からなる群から選択される配列番号１又は３３の残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の少なくとも３つ、４つ又は５つ、特に、配列番号１、２、３０又は３３の（特に、配列番号３０又は３３の）残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の約２から６のＴＲＯＳＹプロトン−窒素相関ＮＭＲスペクトルにおいて、
前記抗体を（一般に、過剰に、特に化学量論的に過剰に）ヒトＮＧＡＬタンパク質に添加した結果として、前記抗体が添加されていない場合と比べて、前記抗体は、
（１）１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍから約１．０ｐｐｍ、特に、約０．０４ｐｐｍから約０．０６ｐｐｍ、特に、１Ｈ共鳴位置における約０．０５ｐｐｍの擾乱、
（２）１５Ｎ共鳴位置における約０．３ｐｐｍから約３．０ｐｐｍ、特に、約０．０１ｐｐｍから約２．０ｐｐｍの、特に約０．１ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ若しくは１Ｈ共鳴位置における約０．６ｐｐｍの擾乱、又は
（３）共鳴強度の約２．５倍から約２０倍の減少、特に、約３倍から約１５倍の減少、特に共鳴強度の約４倍から約１０倍の減少、
を引き起こす。
Ｄ．ＮＧＡＬ抗体を作製及び使用する方法
本発明の抗体は、本分野において公知の様々な異なる技術を用いて作製することができる。例えば、野生型ヒトＮＧＡＬに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体は、適切な免疫原を含有する免疫原性調製物で適切な対象（ウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物など（但し、これらに限定されない。））を免疫化することによって産生され得る。免疫化のために使用することができる免疫原には、ヒトＮＧＡＬを発現することが知られている不死化された細胞株ＮＳＯから得られる細胞などの細胞が含まれ得る。
あるいは、免疫原は、精製された若しくは単離されたヒト野生型ＮＧＡＬタンパク質そのもの（すなわち、配列番号１又は３３）又はそのヒトＮＧＡＬ断片であり得る。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降又は本分野において周知である他の技術を用いて、タンパク質（ＮＳＯなど）を産生する細胞から単離された野生型ヒトＮＧＡＬ（配列番号１又は３３参照）を免疫原として使用することができる。あるいは、本分野において公知の定型的技術（合成装置など（但し、これに限定されない。））を使用する化学的合成を用いて、免疫原を調製することが可能である。
次いで、抗体が野生型ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片に結合するかどうかを測定するために、対象中で産生される抗体をスクリーニングすることができる。このような抗体は、本明細書中に記載されている方法を用いてさらにスクリーニングすることができる（例えば、実施例１参照）。例えば、これらの抗体が野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７又は野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸残基１５及び１０９（配列番号１又は３３参照）に結合するかどうかを測定するために、これらの抗体をアッセイすることができる。所望される特徴を有する抗体を同定するための適切な方法が、本明細書に記載されている（実施例１参照）。さらに、変異体ＮＧＡＬ（配列番号２又は３０参照）に結合する抗体を用いて得られた結果は、野生型ＮＧＡＬの結合へ完全に翻訳可能であること、及び抗体は野生型ヒトＮＧＡＬ（配列番号１又は３３参照）の同等の残基に結合することが完全に理解される。従って、便宜上、特定の事例において変異体ＮＧＡＬを使用しない合理的基礎が欠如しなければ、抗体の結合特性を評価するために、変異体ＮＧＡＬを使用することができる。
免疫原（すなわち、精製されたタンパク質、タンパク質を発現する腫瘍細胞又は組換え的に発現されたヒトＮＧＡＬタンパク質）の単位用量及び免疫化計画は、免疫化されるべき対象、その免疫状態及び対象の体重に依存する。対象中の免疫応答を増強させるために、免疫原はフロイントの完全又は不完全アジュバントなどのアジュバントとともに投与することができる。
上記されているような免疫原での対象の免疫化は、ポリクローナル抗体応答を誘導する。免疫化された対象中の抗体力価は、固定化された抗原、すなわち、本明細書に記載されているようなヒトＮＧＡＬ（配列番号１若しくは３３又はそのヒトＮＧＡＬ断片）を用いるＥＬＩＳＡなどの標準的な技術によって、経時的にモニターすることができる。
ヒトＮＧＡＬ（配列番号１若しくは３３又はそのヒトＮＧＡＬ断片）に対する抗体を生産する方法には、ヒト免疫グロビン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用することが含まれる（例えば、ＷＯ９１／００９０６、ＷＯ ９１／１０７４１又はＷＯ９２／０３９１８を参照）。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体を産生する細胞又は組織（例えば、ヒト骨髄細胞、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、ヒト胎児リンパ節組織又は造血性幹細胞）が移植された免疫欠損マウス中に抗原を導入することによって作製することができる。このような方法には、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス（例えば、ＷＯ９３／０５７９６、米国特許第５，４１１，７４９号又はＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１６３２−１６３９（１９８８））又はＲａｇ−１／Ｒａｇ−２欠損マウス中で抗体を生産することが含まれる。ヒト抗体免疫欠損マウスも市販されている。例えば、Ｒａｇ−２欠損マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手可能である。
モノクローナル抗体は、対象を免疫原で免疫化することによって作製することができる。免疫化後の適切な時点で、例えば、抗体力価が十分に高いレベルになった時点で、標準的な技術を用いてモノクローナル抗体を調製するために、抗体産生細胞を免疫化された動物から採集し、使用することができる。例えば、抗体産生細胞は、標準的な体細胞融合手法によって、ハイブリドーマ細胞を産生するために、骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させ得る。このような技術は本分野において周知であり、例えば、「Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５４９７ （１９７５）」によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４：７２ （１９８３））及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６ （１９８５））が含まれる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は、当業者に周知である。
モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し、及びヒトＮＧＡＬタンパク質で免疫化されたトランスジェニックマウスから抗体産生細胞、例えば、脾細胞を採集することによっても作製することができる。脾細胞は、ヒト骨髄腫との融合を通じて、又はエプシュタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）での形質転換を通じて不死化することができる。これらのハイブリドーマは、本分野において記載されているヒトＢ細胞又はＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を用いて作製することができる（例えば、Ｂｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開０ ６１４ ９８４号参照）。
野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（配列番号１又は３３）又はそのヒトＮＧＡＬ断片に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって、例えば、不死化されたヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する抗体を選択するためにスクリーニングすることによって、又は抗体が所望される特徴、すなわち、本明細書に記載されているアミノ酸残基においてヒトＮＧＡＬに結合する能力を有するかどうかを決定するために本明細書に記載されている抗体を検査することによって検出される。所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、例えば、限界希釈手法、例えば、Ｗａｎｄｓ他（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２ （１９８１））によって記載されている手法によってクローンがサブクリーニングされ、標準的な方法によって増殖され得る。
本明細書に記載されているスクリーニングアッセイ中で陽性検査結果を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ細胞が培地中にモノクローナル抗体を分泌することによって、完全な抗体を産生するのに十分な条件下及び時間で、栄養素培地中において培養することができる。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養技術及び培地は、本分野において全般に記載されている（例えば、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．（１９８０）参照。）。次いで、抗体を含有する馴化されたハイブリドーマ培養上清を収集することができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用の免疫グロブリン精製手法によって、場合によって培地から単離することができる。
モノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブリーを構築し、ヒトＮＧＡＬタンパク質を用いてライブラリーをスクリーニングすることによって操作することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製及びスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２７−９４００−０１；及びｔｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ， Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２４０６１２参照）。同様に、酵母ディスプレイベクターは本分野において公知であり、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能なｐＹＤ１）。要約すれば、野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（配列番号１又は３３）に特異的に結合する抗体を発現するファージ又は酵母細胞を同定及び単離するために、抗体ライブラリーがスクリーニングされる。好ましくは、ライブラリーの一次スクリーニングは、固定化された野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質又はその断片を用いたスクリーニングを含む。
スクリーニング後に、ディスプレイファージ又は酵母が単離され、選択された抗体をコードするポリヌクレオチドをディスプレイファージ又は酵母から（例えば、ファージ又は酵母ゲノムから）回収し、周知の組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクター中に（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ細胞、例えば、ＥＢＹ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）））サブクローニングすることができる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞中でさらに操作し（例えば、さらなる定常領域などのさらなる免疫グロブリンドメインをコードする核酸に連結される。）、及び／又は発現させることができる。
あるいは、抗体に対するヒト患者による応答を最小化するために、キメラ及びヒト化抗体などの抗体の組換え形態も調製することができる。非ヒト対象中で産生された又は非ヒト抗体遺伝子の発現に由来する抗体がヒトの中で治療的に使用される場合、抗体は様々な程度で外来と認識され、患者中で免疫応答が生成され得る。この免疫反応を最小限に抑え又は除去するための１つのアプローチは、キメラ抗体誘導体、すなわち、非ヒト動物可変領域及びヒト定常領域を組み合わせた抗体分子を作製することである。このような抗体は、元のモノクローナル抗体のエピトープ結合特異性を保持しているが、ヒトに投与されたときに免疫原性がより低下し得、従って、患者によって許容される可能性がより高い。
キメラモノクローナル抗体は、本分野において公知の組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。例えば、非ヒト抗体分子の定常領域をコードする遺伝子は、ヒト定常領域をコードする遺伝子で置換される（例えば、ＰＣＴ特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、欧州特許出願１８４，１８７号又は欧州特許出願１７１，４９６号を参照されたい。）。
抗原結合に関与していない可変領域の一部をヒト可変領域由来の等価な一部で置換することによって、キメラ抗体は、さらに「ヒト化」することができる。「ヒト化された」キメラ抗体の一般的な総説は、「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７（１９８５）及びＯｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４−２１４（１９８６）」に見出すことができる。このような方法には、重又は軽鎖の少なくとも１つから得られる免疫グロブリン可変領域の全部又は一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、及び発現させることが含まれる。次いで、ヒト化キメラ抗体又はその断片をコードするｃＤＮＡを適切な発現ベクター中にクローニングすることができる。あるいは、適切な「ヒト化された」抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）置換によって作製することができる（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５５２−５２５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１．５３４（１９８８）；及びＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，．１４１：４０５３−４０６０（１９８８）参照）。
野生型ヒトＮＧＡＬタンパク質（配列番号１又は３３）又はそのヒトＮＧＡＬ断片に対して特異的な抗体（例えば、ハムスター抗体）の結合特異性を保持する「ヒト」抗体ポリペプチド二量体を作製するために、エピトープインプリンティングも使用することができる。要約すれば、抗原への特異的結合を有する非ヒト可変領域（ＶＨ）及びヒト定常領域（ＣＨ１）をコードする遺伝子をイー・コリ中で発現させ、ヒトＶλ．Ｃλ遺伝子のファージライブラリーに感染させる。次いで、ヒトＮＧＡＬタンパク質への結合に関して、抗体断片を提示するファージをスクリーニングする。Ｖλ．Ｃλ．鎖の発現に関して、選択されたヒトＶλ遺伝子を再度クローニングし、これらの鎖を有するイー・コリをヒトＶＨＣＨ１遺伝子のファージライブラリーに感染させ、抗原によって被覆されたチューブを用いたスクリーニングの繰り返しにライブラリーを供する（ＷＯ９３／０６２１３参照）。
別の態様において、本発明は、抗体が抗体断片であることを想定する。例えば、抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、ジスルフィド結合されたＦｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれ得るが、これらに限定されない。抗体断片を作製するために、様々な技術が当業者に公知である。例えば、このような断片は、完全な抗体のタンパク分解的消化を介して得ることができ（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２４：１０７−１１７ （１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１（１９８５）参照）、又は組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、イー・コリから直接回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成するために化学的に連結することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２）参照）。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の集合を促進するために、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。あるいは、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、短い連結ペプチドを使用することにより軽及び／又は重鎖可変領域を連結することによって作製される（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：４２３−４２６（１９９８）参照）。連結ペプチドの例は、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号３１）である。次いで、薬物の付着又は固体支持体への付着など、さらなる機能のためにリンカーを修飾することが可能である。本発明において使用することができる他のリンカー配列の例は、「Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：４２３−４２６ （１９８８）， Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８５：５８７９−５８８３ （１９８８）」及び「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４ （１９９０）」に見出すことができる。
一本鎖変形物は、組換え的に又は合成的に作製することができる。ｓｃＦｖの合成的産生のために、自動化された合成装置を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え的産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドは、適切な宿主細胞（酵母、植物、昆虫若しくは哺乳動物などの真核生物又はイー・コリなどの原核生物の何れか）中に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの連結などの定型的操作によって作製することができる。本分野において公知の標準的タンパク質精製技術を用いて、得られたｓｃＦｖを単離することができる。さらに、ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も、本発明によって想定される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合が不可能なほど短く、これにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製するリンカーを用いて発現される二価の二重特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１１２１−１１２３（１９９４）参照）。
さらに、本明細書に記載されている本発明の幾つかの態様において（例えば、対照としての使用）、市販の抗ＮＧＡＬ抗体又は文献に記載されている抗ＮＧＡＬ抗体又はその作製方法を使用することが可能であり得る。これらには、（１）抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ Ａ／Ｓ， Ｇｅｎｔｏｆｔｅ， Ｄｅｎｍａｒｋから市販されているＨＹＢ２１１−０１、ＨＹＢ２１１−０２又はＨＹＢ２１１−０５）；（２）マウス抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体（例えば、クローン番号６９７、カタログ番号ＨＭ２１９３Ｂ、ＨｙＣｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；（３）ラット抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体（例えば、クローン番号２２０３１０、カタログ番号ＭＡＢ１７５７，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；（４）遊離のＮＧＡＬ形態（すなわち、ヘテロ二量体中に複合体化されていない形態）を検出すると称されるＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（Ｒ）ＮＧＡＬＥＬＩＳＡキットＤＬＣＮ２０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）中に含有される抗ＮＧＡＬ抗体（米国特許公開２００７／０１９６８７６号）；（５）マウスハイブリドーマ細胞中で産生されるウサギ抗ヒトＮＧＡＬモノクローナル抗体（ＥＰ０ ７５６ ７０８及び米国特許第６，１３６，５２６号）；（６）ヒトＮＧＡＬに対する精製されたモノクローナル又はポリクローナル抗体（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅｍ．， ２６８：１０４２５−３２（１９９３）；Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８（２）：１５５−６４（１９９６））；（７）ヒトＮＧＡＬに対するポリクローナル抗体（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００２／０３１５０７）及び／又は（８）ヒトＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体を作製するためのＮＧＡＬの溶媒に露出したペプチドループ領域の使用を論述する（米国特許第７，０５６，７０２号及び米国特許公開ＵＳ２００４／０１１５７２８号）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、様々な用途を有する。一態様において、本発明の抗体は、１つ又はそれ以上の免疫診断試薬として使用することができる。例えば、本発明の抗体は、検査試料中のヒトＮＧＡＬ抗原の存在を検出するための１つ又はそれ以上の方法において１つ又はそれ以上の免疫診断試薬として使用することができる。より具体的には、本発明の抗体は、検査試料中のヒトＮＧＡＬの存在を検出するためのイムノアッセイにおいて１つ若しくはそれ以上の捕捉抗体、１つ若しくはそれ以上の連結抗体又は１つ若しくはそれ以上の捕捉抗体及び１つ若しくはそれ以上の連結抗体の両方として使用することができる。
Ｅ．試料の収集及び前処理
例えば、本発明の抗体が免疫診断薬として及び／又はＮＧＡＬイムノアッセイキット中で使用される場合、尿、血液、血清及び血漿並びに他の体液を収集し、取り扱い及び処理するための本分野で周知の方法が本発明の実施に際して使用される。
検査試料は、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドなどの目的ＮＧＡＬ分析物の他に、さらなる部分を含み得る。例えば、試料は、対象から得られた全血試料であり得る。検査試料、特に、全血は、本明細書に記載されているようなイムノアッセイの前に、例えば、前処理試薬で処理することが必要であり得、又は所望され得る。前処理が不要である場合でさえ（例えば、多くの尿試料）、前処理は、場合によって、単に便宜のために実施され得る（例えば、市販のプラットフォーム上での計画の一環として）。前処理試薬は、異種の因子又は同質の因子であり得る。
本発明の異種の前処理試薬を用いると、前処理試薬は試料中に存在する分析物結合タンパク質（例えば、ＮＧＡＬを結合することができるタンパク質）を沈殿させる。このような前処理工程は、前処理剤の試料への添加によって形成された混合物の上清を沈殿した分析物結合タンパク質から分離することによって、あらゆる分析物結合タンパク質を除去することを含む。このようなアッセイでは、結合タンパク質が一切存在しない混合物の上清がアッセイにおいて使用され、抗体捕捉工程に直接進む。
同質の前処理試薬が使用される場合には、このような分離工程は存在しない。抗体捕捉工程において、検査試料と前処理試薬の混合物全体を捕捉抗体と接触させる。このようなアッセイのために使用される前処理試薬は、典型的には、抗体捕捉工程の前に又は抗体補足抗体で抗体と遭遇している間に、前処理された検査試料混合物中に希釈される。このような希釈に関わらず、抗体捕捉の間に、検査試料混合物中に前処理試薬のある量（例えば、５Ｍメタノール及び／又は０．６Ｍエチレングリコール）がなお存在する（又は残存する）。
前処理試薬は、本発明のイムノアッセイ及びキットとともに使用するのに適したあらゆる試薬であり得る。前処理は、（ａ）１つ若しくはそれ以上の溶媒（例えば、メタノール及びエチレングリコール）及び塩、（ｂ）１つ若しくはそれ以上の溶媒、塩及び界面活性剤、（ｃ）界面活性剤又は（ｄ）界面活性剤及び塩を場合によって含む。前処理試薬は本分野において公知であり、このような前処理は、文献に記載されているように（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ａｂｂｏｔｔ ＴＤｘ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ ｉｎ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ， Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．， ３６：１９６９−１９７３ （１９９０）及びＷａｌｌｅｍａｃｑ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ ＡｘＳＹＭ Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＴＤｘ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＥＭＩＴ Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａｓｓａｙｓ， Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５： ４３２−４３５ （１９９９）参照）に記載されているように、及び／又は市販されているように、ＡｂｂｏｔｔＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）及びＡＴＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）分析装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）上でのアッセイのために使用されるように使用され得る。さらに、前処理は、Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号、ＥＰ０ ４７１ ２９３、２００６年１２月２９日に出願された米国特許出願６０／８７８，０１７号及び２００６年６月２１日に出願された米国特許出願１１／４９０６２４号（参照により、前処理に関するその教示に関して全体が組み込まれる。）に記載されているように行うことができる。また、単独で又は他の何れかの前処理剤（例えば、溶媒、界面活性剤、塩など）と組み合わせて、プロテアーゼを使用することができる。
Ｆ．ＮＧＡＬイムノアッセイ
イムノアッセイは、サンドイッチフォーマットなどの（但し、これに限定されない。）本分野において公知のあらゆるフォーマットを用いて実施することができる。具体的には、本発明の一態様において、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を分離及び定量するために、少なくとも２つの抗体が使用される。より具体的には、少なくとも２つの抗体は、「サンドイッチ」と称される免疫複合体を形成するヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片のあるエピトープに結合する。一般に、イムノアッセイにおいて、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を捕捉するために、１つ又はそれ以上の抗体を使用することが可能であり（これらの抗体は、「捕捉」抗体としばしば称される。）、サンドイッチに検出可能な（すなわち、定量可能な）標識を結合するために、１つ又はそれ以上の抗体を使用することができる（これらの抗体は、「検出抗体」、「連結物」としばしば称される。）。
本発明の抗体は、例えば、検査試料中のヒトＮＧＡＬ抗原の存在を検出するための方法において、免疫診断剤として使用することができる。このような使用及びアッセイは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号に記載されている（このようなアッセイに関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）。捕捉抗体、検出抗体として、又は捕捉及び検出抗体として、本発明の抗体を用いて、優れたイムノアッセイ、特に、サンドイッチアッセイを実施することができる。本発明の抗体を使用する他の具体的なアッセイは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号に記載されている（このようなアッセイに関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）。
ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片に関して検査されている（例えば、これらを含有することが疑われている）検査試料は、少なくとも１つの捕捉抗体（又は複数の抗体）及び少なくとも１つの検出抗体（第二の検出抗体又は第三の検出抗体である。）と同時に又は順次に、任意の順序で接触させることができる。例えば、検査試料は少なくとも１つの捕捉抗体とまず接触させ、次いで（順次）少なくとも１つの検出抗体と接触させることができる。あるいは、検査試料は、少なくとも１つの検出抗体とまず接触させ、次いで（順次）少なくとも１つの捕捉抗体と接触させることができる。さらに別の代替例において、検査試料は、捕捉抗体及び検出抗体と同時に接触させることができる。
サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とする条件下で、ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を含有すると疑われる検査試料をまず少なくとも１つの第一の捕捉抗体と接触させる。２以上の捕捉抗体が使用される場合、第一の複数の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、検査試料中に予測されるヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の最大量のモル濃度過剰量で使用される。例えば、抗体の約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬ／ｍＬ緩衝液（例えば、微小粒子コーティング緩衝液）を使用することができる。
場合によって、検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させる前に、検査試料からの第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の分離を促進するために、少なくとも１つの捕捉抗体を固体支持体に結合させることができる。ウェル、管又はビーズの形態のポリマー性材料から作製された固体支持体など（但し、これらに限定されない。）、本分野において公知のあらゆる固体支持体を使用することができる。１つの抗体（又は複数の抗体）は、吸着によって、化学的連結剤を用いた共有結合によって又は本分野によって公知の他の手段によって、固体支持体に結合させることができる（但し、このような結合は、ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を結合する抗体の能力を妨害しない。）。あるいは、１つの抗体（又は複数の抗体）は、（例えば、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａから入手可能な、Ｐｏｗｅｒ−ＢｉｎｄＴＭ−ＳＡ−ＭＰストレプトアビジンによって被覆された微粒子を用いて）ストレプトアビジン又はビオチンで予め被覆された微粒子と結合させることができる。あるいは、１つの抗体（又は複数の抗体）は、抗種特異的モノクローナル抗体で予め被覆された微粒子を用いて結合させることができる。さらに、必要であれば、固体支持体は、抗体上の様々な官能基との反応性を許容するために誘導化することができる。このような誘導化には、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの（但し、これらに限定されない。）ある種のカップリング剤の使用が必要とされる。
ヒトＮＧＡＬ若しくはヒトＮＧＡＬ断片に関して検査されている及び／又はヒトＮＧＡＬ若しくはヒトＮＧＡＬ断片を含有すると疑われている検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させた後、第一の抗体（又は複数の抗体）−ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とするために、混合物を温置する。温置は、約２℃から約４５℃の温度で、約４．５から約１０．０のｐＨで、少なくとも約１分から約１８時間、好ましくは、約１から約２０分、より好ましくは約１８分間の期間、実施し得る。本明細書に記載されているイムノアッセイは、１つの工程で（検査試料、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つの検出抗体が全て、順次に又は同時に反応容器へ添加されることを意味する。）、又は２つ工程、３つの工程など、２以上の工程で実施することができる。
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後、次いで、複合体を少なくとも１つの検出抗体（（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の抗体検出複合体の形成を可能とする条件下で）と接触させる。少なくとも１つの検出抗体は、イムノアッセイにおいて使用される第二、第三、第四などの抗体であり得る。捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が２以上の検出抗体と接触される場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（複数の）検出抗体複合体が形成される。捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と同様に、少なくとも第二の（及び後続の）検出抗体を捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体と接触させる場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体の形成のために、上述の条件と類似の条件下での温置の期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体の形成前に、同時に又は後に、少なくとも１つの検出抗体（例えば、第二の検出抗体）に結合させることができる。本分野において公知のあらゆる検出可能な標識を使用することができる。例えば、検出可能な標識は、３Ｈ、１２５１、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６−リン酸脱水素酵素などの酵素的標識、アクリジニウムエステル、ルミナール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなどの化学発光標識、フルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナートなど）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリンなどの蛍光標識、量子ドット（硫化亜鉛がキャッピングされたセレン化カドミニウム）、温度測定標識又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識への導入、標識の手法及び標識の検出は、「Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｌｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．（１９９７）」及び「（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎによって出版されたハンドブックとカタログの組み合わせである）Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）」に見出される。
検出可能な標識は、直接又は連結剤を介して抗体に結合させることができる。使用可能な連結剤の例は、Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩）である。使用可能な他の連結剤は、本分野において公知である。検出可能な標識を抗体に結合するための方法は、本分野において公知である。さらに、Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとしても知られる。）又はＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（ＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとしても知られる。）など、抗体への検出可能な標識の連結を容易にする末端基を既に含有する多くの検出可能な標識を購入又は合成することができる。
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の定量前に、検査試料の残りから分離させることが可能であるが、分離させなければならないわけではない。例えば、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）がウェル又はビーズなどの固体支持体に結合されている場合、分離は、固体支持体との接触から（検査試料の）液体を除去することによって達成することができる。あるいは、少なくとも第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されている場合、第一の捕捉抗体は、第一の（複数の）抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の（複数の）抗体複合体を形成するために、ヒトＮＧＡＬ含有試料及び少なくとも１つの第二の検出抗体と同時に接触させた後、固体支持体との接触から液体（検査試料）を除去することができる。少なくとも１つの第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されていなければ、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の量の定量のために、検査試料から除去する必要はない。
標識された捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／検出抗体複合体（例えば、第一の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の検出抗体複合体）の形成後、本分野において公知の技術を用いて、複合体中の標識の量が定量される。例えば、酵素標識が使用されるのであれば、標識された複合体を、発色などの定量可能な反応を与える標識に対する基質と反応させる。標識が放射性標識であれば、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識であれば、１つの色（「励起波長」と知られる。）の光で標識を刺激し、刺激に応答して標識によって発光された別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することによって、標識が定量される。標識が化学発光標識であれば、標識は、視覚的に又は光測定装置、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを使用することによって、発光された光を検出して定量される。複合体中の標識の量が定量されたら、既知濃度のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の系列希釈を用いて作製された標準曲線の使用によって、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の濃度が測定される。ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の系列希釈を使用する以外に、標準曲線は、重量分析、質量分析法によって及び本分野において公知の他の技術によって作製することができる。
本明細書に記載されている方法（すなわち、イムノアッセイ及びキット）は、検査試料中に存在するＮＧＡＬのレベルの測定に基づいて、対象の尿細管細胞傷害状態を評価するために使用することができる。評価されるべき対象は、現在、尿細管細胞傷害を有し、又は尿細管細胞傷害を発症するリスクを有し得る。
本明細書に記載されている方法は、尿細管細胞傷害に対して対象を治療した後に、又は対象が尿細管細胞傷害を現在経験しながら、対象に対して実施することができる。
本明細書に記載されている方法は、対象中での薬物又は他の治療剤の腎毒性副作用をモニターするために使用することができる。
本明細書に記載されている方法は、外科的処置の後など（心臓手術、冠動脈バイパス手術、心血管手術、血管手術又は腎臓移植後など）、対象によって経験される現象の後に、対象が腎臓への低下した血液供給を経験した後に、（対象が、損傷を受けた心機能、卒中、外傷、敗血症及び脱水からなる群から選択される医学症状を有し、又は経験している場合）集中治療室への患者の入室後に、１つ若しくはそれ以上の医薬の対象への投与後に、又は１つ若しくはそれ以上の造影剤を対象に投与した後に、実施し、又は実行することができる。
本明細書中のある種の実施形態は、尿細管細胞傷害の状態を評価するために使用されたときに有利であることは言うまでもないが、イムノアッセイ及びキットは、他の疾病、例えば、癌、敗血症及びＮＧＡＬの評価を伴うあらゆる疾病、疾患又は症状においてＮＧＡＬを評価するためにも、場合によって使用することができる。
より具体的には、腎疾患、疾病及び傷害の評価の他に（例えば、米国特許公開２００８／００９０３０４号、２００８／００１４６４４号、２００８／００１４６０４号、２００７／０２５４３７０号及び２００７／００３７２３２号参照）、本明細書に記載されているアッセイ及びアッセイ成分は、他のあらゆるＮＧＡＬアッセイにおいて、又はＮＧＡＬレベル若しくは濃度の評価が有用であると判明し得る他のあらゆる状況、例えば、癌関連アッセイ（例えば、全般的に又はより具体的に、膵臓癌、乳癌、卵巣／子宮癌、白血病、大腸癌及び脳癌が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許公開２００７／０１９８７６号参照；米国特許第５，６２７，０３４号及び５，８４６，７３９号も参照）、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重篤な敗血症、敗血症ショック及び多発性臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）の診断（例えば、米国特許公開２００８／００５０８３２号及び２００７／００９２９１１号参照；米国特許第６，１３６，５２６号も参照）；血液学用途（例えば、細胞の種類の推測）；とりわけ子癇前症、肥満（メタボリックシンドローム）、インシュリン抵抗性、高血糖、組織再構築（ＭＭＰ−９と複合される場合、例えば、米国特許公開２００７／０１０５１６６号及び米国特許第７，１５３，６６０号参照）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症）、過敏性腸症候群（例えば、米国特許公開２００８／０１６６７１９及び２００８／００８５５２４参照）、神経変性疾患、呼吸器疾患、炎症、感染、歯周病（例えば、米国特許第５，８６６，４３２号参照）及び静脈血栓塞栓疾患を含む心血管疾患（例えば、米国特許公開２００７／０２６９８３６号）の評価においても場合によって使用することが可能である。
Ｇ．ＮＧＡＬイムノアッセイキット
本発明は、検査試料中の哺乳動物のＮＧＡＬ抗原の存在を検出するためのキットも想定する。このようなキットは、本明細書に記載されている免疫診断試薬（例えば、抗体）の１つ又はそれ以上を含み得る。より具体的には、キットがイムノアッセイを実施するためのキットである場合、キットは、本明細書に記載されている免疫診断試薬及び指示書を場合によって含むことができる。例えば、本明細書に記載されている免疫診断試薬及び抗体などの様々なイムノアッセイキットが、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（このようなアッセイに関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）に記載されている。
従って、本発明は、１つ若しくはそれ以上の組換え抗体又は本発明の哺乳動物ＮＧＡＬを含む診断用及び品質管理キットをさらに提供する。場合によって、本発明のアッセイ、キット及びキット成分は、市販のプラットフォーム上での使用（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬのＰｒｉｓｍ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）及びＥＩＡ （ビーズ）プラットフォーム上でのイムノアッセイ並びに他の市販の及び／又はインビトロ診断用アッセイ）に対して最適化される。さらに、前記アッセイ、キット及びキット成分は、他の形式で、例えば、電気化学的な又はその他の携帯式又は治療場所でのアッセイ系に対して使用することができる。例えば、本発明は、ＴｎＩ、ＣＫＭＢ及びＢＮＰを含む幾つかの心臓マーカーに対するサンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ− ＳＴＡＴ（Ｒ）， Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）電気化学的イムノアッセイ系に対して適用可能である。イムノセンサー及び使い捨て検査装置中でイムノセンサーを作動させる方法は、例えば、米国特許公開２００３０１７０８８１号、２００４００１８５７７号、２００５００５４０７８号及び２００６０１６０１６４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。電気化学的なイムノセンサー及びイムノセンサーの他の種類の製造に関するさらなる背景は、米国特許第５，０６３，０８１号（同じく、これらに関するその記述に関して、参照により組み込まれる。）に見出される。
場合によって、キットは、品質管理試薬（例えば、感度パネル、検量用試料及び陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は本分野において周知であり、例えば、様々な免疫診断用製品同封シート上に記載されている。ＮＧＡＬ感度パネルの一員は、例えば、適切なアッセイ緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）中に本発明のＮＧＡＬ抗体の既知量をスパイクすることによって、例えば、「低」から「高」にわたるＮＧＡＬ抗体の既知量を含有する可変量で場合によって調製することができる。これらの感度パネルの一員は、アッセイの性能特性を確立するために場合によって使用され、さらに、場合によって、イムノアッセイキット試薬の完全性及びアッセイの標準化の有用な指標である。
別の実施形態において、本発明は、アッセイの性能特性を評価し、並びに／又はアッセイ中に使用される抗原の完全性を定量及びモニターするための感度パネルとして使用するための１つ又はそれ以上の本発明の抗体を含む品質管理キットを提供する。
キットに提供される抗体は、蛍光色素、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能な標識を取り込むことができ、又はキットは、抗体を標識するための試薬若しくは抗体を検出するための試薬（例えば、検出抗体）及び／又は抗原を標識するための試薬若しくは抗原を検出するための試薬を含み得る。抗体、検量用試料及び／若しくは対照は別の容器中に与えることができ、又は、適切なアッセイフォーマット中に、例えばマイクロタイタープレート中に予め分配させることができる。
キットは、診断アッセイを実施し、又は緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などの品質管理評価を容易にするために必要とされる他の試薬を場合によって含み得る。検査試料を単離及び／又は治療するための緩衝液及び溶液などの他の成分（例えば、前処理試薬）も、キットに含め得る。キットは、１つ又はそれ以上の他の対照をさらに含み得る。キットの成分の１つ又はそれ以上は凍結乾燥させることができ、キットは、凍結乾燥された成分の再構成に適した試薬をさらに含み得る。
キットの様々な成分は、場合によって、適切な容器中に与えられる。上述のように、容器の１つ又はそれ以上は、マイクロタイタープレートであり得る。さらに、キットは、試料を保持又は保存するための容器（例えば、血液又は尿試料用の容器又はカートリッジ）を含むことができる。適宜、キットは、反応容器、混合容器及び試薬又は検査試料の調製を容易にする他の成分も場合によって含有し得る。キットは、注射器、ピペット、鉗子、測定用スプーンなどの検査試料の取得を補助するための１つ又はそれ以上の機器も含み得る。
キットは、紙形態又はディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み取り可能な形態で提供され得る使用説明書を場合によってさらに含み得る。
例として、限定することなく、ここで、本発明の実施例を記載する。
Ｈ．アッセイキットの改良
キット（又はその成分）並びに本明細書に記載されている成分及び方法を用いるアッセイによって、検査試料中のＮＧＡＬ抗原の濃度を測定する方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載されているように、並びに、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）としてＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）によって市販されているように、様々な自動化又は半自動化されたシステム（固相が微粒子を含むシステムを含む。）で使用するために改良することができる。
自動化されていないシステム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した自動化又は半自動化されたシステムの差の幾つかには、第一の特異的結合パートナー（例えば、ＮＧＡＬ捕捉抗体）が付着されている基質（サンドイッチ形成及び分析物の反応性に影響を与えることができる。）並びに捕捉の長さとタイミング、検出及び／又は何らかの場合によって行われる洗浄工程が含まれる。ＥＬＩＳＡなどの自動化されていないフォーマットは、試料及び捕捉試薬との相対的により長い温置時間を必要とし得るのに対して（例えば、約２時間）、自動化又は半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ），Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は相対的により短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）に関して約１８分間）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡなどの自動化されていない形式は、相対的により長い温置時間（例えば、約２時間）、連結物試薬などの検出抗体を温置し得るのに対して、自動化又は半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））は、相対的により短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）に関して約４分）を有し得る。
Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームには、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）及びＱｕａｎｔｕｍＴＭＩＩ並びに他のプラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。さらに、アッセイ、キット及びキット成分は、他のフォーマット、例えば、電気化学的又は他の携帯式若しくは治療地点でのアッセイ系において使用することができる。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに対して適用可能である。イムノセンサー並びに使い捨て検査装置におけるその製造及び操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許公開２００３／０１７０８８１号、米国特許公開２００４／００１８５７７号、米国特許公開２００５／００５４０７８号及び米国特許公開２００６／０１６０１６４号（これらに関する教示に関して、参照により、その全体が組み込まれる。）に記載されている。
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへのＮＧＡＬアッセイの改造に関して、以下の構成が好ましい。微小加工されたシリコンチップは、金電流測定作用電極及び銀−塩化銀参照電極の一対を用いて製造される。作用電極の１つの上で、固定化された捕捉抗体を有するポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）が電極の上にパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着される。このチップは、イムノアッセイに適した流体装置フォーマットを有するＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジ中に組み立てられる。カートリッジの試料保持チャンバーの壁の一部上に、アルカリホスファターゼ（又は他の標識）で標識された第二の検出抗体を含む層が存在する。カートリッジの流体袋内には、ｐ−アミノフェノールリン酸を含む水性試薬である。
作動時に、ＮＧＡＬ抗原を含有すると疑われる試料は、検査カートリッジの保持チャンバーに添加され、カートリッジはＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）読取装置中に挿入される。第二の抗体（検出抗体）が溶液中に溶解された後、カートリッジ内のポンプ要素がチップを含有する伝導路内に試料を押し出す。ここで、ポンプ要素は、ＮＧＡＬ抗原、ＮＧＡＬ捕捉抗体及び標識された検出抗体間でのサンドイッチの形成を促進するために、周期的に振動する。アッセイの最後から２番目の工程において、試料をチップから廃棄チャンバーの中に洗浄するために、液体は袋から伝導路の中に押し出される。アッセイの最後の工程において、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールリン酸と反応してリン酸基を切断し、放出されたｐ−アミノフェノールを作用電極において電気化学的に酸化させる。測定された電流に基づいて、読取装置は、埋め込まれたアルゴリズム及び工場で測定された較正曲線を用いて、試料中のＮＧＡＬ抗原の量を計算することができる。
さらに、本明細書に記載されている方法及びキットは、イムノアッセイを実施するための他の試薬及び方法を必ず包含することは言うまでもない。例えば、連結物希釈剤及び／又は検量用試料希釈剤として、例えば洗浄のために、本分野において公知の様々な緩衝液及び／又は使用するために容易に調製し、又は最適化され得る様々な緩衝液が包含される。典型的な連結物希釈剤は、ある種のキットにおいて使用され、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッキング剤、抗微生物剤及び界面活性剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）連結物希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）である。典型的な検量用試料希釈剤は、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッキング剤及び抗微生物剤を含有する緩衝液を含む、ある種のキットにおいて使用されるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒト連結物希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）である。
ＮＧＡＬマウス細胞株の開発
本明細書中に具体的に記載されていない全ての野生型ＮＧＡＬ組換え抗原（ｒＡｇ）及び変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬＮＧＡＬｒＡｇクローン、サブクローン、ハイブリッド及びハイブリドーマ（名称及び番号を含む。）、ベクター及びベクター構築物は全て、これらの全体が、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（これらに関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）に記載されている。参照を容易にするために、これらの材料の幾つか又は米国仮特許出願６０／９８１，４７０号から得られる図解も本明細書に含まれる。
具体的には、図１（ヒトＮＧＡＬ野生型抗原配列（配列番号１）を示す。）；図２（米国仮特許出願６０／９８１，４７０号の実施例１に記載されている野生型ヒトＮＧＡＬ配列を含有するプラスミドｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３（ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−ｈｉｓＡとしても知られる。）を示す。）；図３（ヒトＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体抗原配列（配列番号２）を示す。）；図４（野生型ヒトＮＧＡＬポリヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。）及び図５（変異体ヒトＮＧＡＬポリヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。）。
米国仮特許出願６０／９８１，４７０号中のこれらの材料の幾つか及びさらに市販されているポリペプチドは、本明細書にさらに記載されているように、特定の細胞株の作製及び／又は評価において使用された。特に、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）に対する免疫応答を刺激するための動物免疫原性試験において、２つのマウス系統及び１つのウサギ系統、すなわち、ＣＡＦ１／Ｊマウス、ＲＢＦ／ＤｎＪマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）及びＮＺＷウサギ（Ｃｏｖａｎｃｅ， Ｋａｌａｍａｚｏｏ， ＭＩ）を使用した。動物中に免疫化された４つのＮＧＡＬ抗原は、（１）ＮＳＯ骨髄腫細胞から産生された組換えヒトＮＧＡＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ））；（２）ＨＥＫ２９３細胞中で産生された組換えヒトＮＧＡＬ（一過性の発現系、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで行われた研究）；（３）ヒト白血球から単離された固有の哺乳動物由来ヒトＮＧＡＬ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ））；及び（４）イー・コリ中で産生された組換えＮＧＡＬ（ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ （Ｒｅｈｏｖｏｔ， Ｉｓｒａｅｌ））であった。
フロイントのアジュバント（Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）及びＲｉｂｉアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）を交互に、ＮＧＡＬ５μｇの５回の隔週免疫化をマウスに与えた。以下に記載されているＥＩＡで評価するために、５回目の免疫化の９から１４日後に、血清試料を採取した。アジュバント研究において、ウサギを使用し、４つのアジュバント計画の１つを用いて、ＮＧＡＬ２０μｇを用いて、５回の免疫化を毎月行った。内容は下記の通り：（１）Ａｄｊｕｌｉｔｅフロイントのアジュバント（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒａｍｏｎａ， ＣＡ）；（２）メチル化されていないＣｐＧヌクレオチドを含有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ，Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）と組み合わせたＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ水酸化アルミニウムゲルアジュバント（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）；（３）ＤｉｆｃｏフロイントアジュバントとＲｉｂｉアジュバントを交互に、及び（４）ＤｉｆｃｏフロイントアジュバントとＣｐＧ−ＯＤＮが補充されたＱｕｉｌＡ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を交互に行った。
ヒツジ抗マウスＩｇＧＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）又はヒツジ抗ウサギＩｇＧＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）を、５μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロタイターＥＩＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）上に被覆した。捕捉試薬を固相上に被覆した後、捕捉試薬を除去し、ＰＢＳ（ブロック溶液）中の２％ＢＳＡ溶液を用いて、プレート上に残存している全ての占有されていない結合部位をブロックした。プレートを洗浄し、対照抗体及び動物血清試料のｌｏｇ３系列希釈を１時間の温置のために添加した。プレートを蒸留水中で洗浄し、１．０μｇ／ｍＬから始まってブロック溶液中に希釈されたＮＧＡＬ抗原のｌｏｇ４系列希釈をプレートに添加し、１０分間温置させた。抗原を蒸留水でプレートから洗浄し、ブロック溶液中に１００ｎｇ／ｍＬになるように希釈されたビオチン標識されたヤギ抗ＮＧＡＬポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）を添加し、３０分間温置した。この温置後、蒸留水を用いて抗原をプレートから洗浄した。約２００ｎｇ／ｍＬになるように、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）をブロック溶液中に希釈し、プレートに添加し、３０分間温置した。プレートを蒸留水で洗浄し、シグナルを生成させるための発色原として、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及びｏ−フェニレンジアミン基質（ＯＰＤ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用した。４９２ｎｍでプレートを読み取り、Ｋａｌｅｉｄａ Ｇｒａｐｈソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｒｅａｄｉｎｇ， ＰＡ）を用いて、以下の式：
ｙ＝ｍ１＋ｍ２＊ｍ０（ｍ３＋ｍ０）
を用いてプロットすることによって、結果を分析した。
（ｍ１はバックグラウンドシグナルであり、ｍ２は最大シグナルであり、ｍ０は可変抗原濃度であり、ｙはシグナル（すなわち、光学密度）であり、及びｍ３は最大結合の５０％での抗原濃度である。）。総抗ＮＧＡＬ力価に基づいて、及び最大結合シグナルの５０％において生成される値であり、従って、最高親和性に変換されるＡｇ５０に基づいて、血清試料を互いに対して順位付けした。この検査は、「Ｆｒｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８５， ７７：３０５−３１９」に詳述されている検査と同様に行った。
総抗ＮＧＡＬ力価に基づいて、及び最小抗原濃度を用いて最大結合シグナルの５０％において生成され、従って、最高親和性に変換されるに基づいて、血清試料を互いに対して順位付けした。検査は、「Ｆｒｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７７：３０５−３１９（１９８５）」に詳述されている検査と同様に行った。結果は、表１Ａ、１Ｂ及びＣ１に示されている。
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表１Ａ及び１Ｂ中のマウス血清から得られたＥＩＡの結果は、ＣＡＦ１／ｊマウスがずっと高い力価及びＮＧＡＬ抗原に対する改善された相対的親和性（Ａｇ５０）を示すことを明確に示唆した。ＣＡＦ１／ｊマウスは、ＲＢＦ／Ｄｎｊマウスより強く、より高度に特異的な哺乳動物によって産生され及びグリコシル化された抗原に対する免疫応答を示した。これは、おそらく、「Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９１：２３７０−２３７６（２００１）」によって記載されているマウス免疫系への抗原の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）提示の役割によるものである。マウスのＣＡＦ１／ｊ系統は、グリコシル化された抗原を加工し、より効率的な免疫応答をもたらすために、ＲＢＦ／Ｄｎｊマウスより遺伝的に優れるように操作されたように見受けられる。
ウサギの血清試料から得られた表１Ｃ中の結果は、Ａｄｊｕｌｉｔｅフロイントアジュバントを用いてＨＥＫ２９３発現された組換えＮＧＡＬで免疫化されたウサギ血清は残りの３つのアジュバント計画を用いたウサギより、統計的により高い抗体力価を与えたことを示唆する。さらに、Ａｄｊｕｌｉｔｅフロイントのアジュバントを用いて免疫化されたウサギは、改善された相対的親和性を与えた。これらの動物は、ＣｐＧ−ＯＤＮと組み合わせて水酸化アルミニウムを用いて免疫化された動物と統計学的に類似していた。抗ＮＧＡＬ分泌性ハイブリドーマ細胞株を作製するために、ウサギＢ細胞が使用され得るのに対して（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬｉ．９２，９３４８−９３５２（１９９５））、アッセイ感度要件は、マウスハイブリドーマ細胞株を用いて充足された。
ＮＧＡＬ抗原に対して最高の力価及び親和性を首尾よく示した後、抗原の融合前強化免疫の前に、ＣＡＦ１／Ｊマウス番号１３、１４及び２０を７週間休息させた。融合の３日前に、マウスに麻酔をかけ、体腔を開け、脾臓を露出させるために、切開した。０．９％生理的溶液中に希釈された組換えヒトＮＧＡＬ抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）の１０μｇ注射を各マウスの脾臓中に直接与え、脾臓周囲の体腔中に、さらに１０μｇ与えた。手術用ステープルを用いて、切開を閉じ、融合前にマウスを休息させた。
融合の当日に、マウスを安楽死させ、抗ＮＧＡＬ脾細胞を含有する脾臓を採集し、ハイブリドーマ無血清培地（ＨＳＦＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中に配置した。「Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−７（１９７５）」によって記載されているように、細胞融合を行った。ＨＳＦＭを含有する別個のペトリ皿中に、各マウスの脾臓を置いた。ＨＳＦＭを含有する注射器及び細胞へらを用いて、各脾臓から脾細胞を灌流して流出させ、次いで、血球計を用いて計数した。各マウスから、約１．７×１０７個の脾細胞をプールし、細胞沈降物中への遠心によって洗浄し、ＨＳＦＭ中に再懸濁した。これらの脾細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞の等しい数と混合し、沈降物中に遠心した。ＨＳＦＭ中の５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量１３００から１６００、ＡＴＣＣ、ＭａｎａｓｓａｓＶＡ）に脾細胞及びＳＰ２／０細胞を曝露させることによって、融合を達成した。３０秒にわたって、細胞沈降物にＰＥＧ溶液１ｍＬを添加した後、さらに１分間温置した。３０秒にわたって、ＨＳＦＭの３０ｍＬをゆっくり添加することによって、ＰＥＧ及び沈降物を希釈した。次いで、遠心によって、融合された細胞を懸濁物から除去し、容器を傾けて上清を除去した。
ハイブリドーマを選択するために、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｏｇａｎ ＵＴ）、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）（Ｓｉｇｍａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＨＴ補充物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、ハイブリドーマクローニング因子（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）及びＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）が補充されたＨＳＦＭ４２８ｍＬ中に、細胞懸濁物を再懸濁した。２４個の９６ウェル細胞培養プレート中に、０．２ｍＬ／ウェルで細胞を播種した。５、７、１１及び１２日目に、吸引によって各ウェル中の培地の半分を除去し、１５％ＦＢＳ、ＨＴ補充物及びＬ−グルタミンが補充されたＨＳＦＭと置換した。抗体産生に関する上清のスクリーニングの前に、１０又は１３日間、ハイブリドーマを増殖させた。
ＥＩＡによって、細胞上清試料を抗ＮＧＡＬ抗体に関して分析した。ウサギ抗マウスＩｇＧＦｃ又はヒツジ抗マウスＩｇＧＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）の何れかを、５μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロタイターＥＩＡプレート上に被覆した。固相上に捕捉試薬を被覆した後、捕捉試薬を除去し、ブロック溶液を用いて、プレート上のあらゆる開放された結合部位をブロックした。次いで、ブロックされたプレートに細胞上清を添加し、室温で少なくとも１時間温置した。抗マウスＩｇＧＦｃは、上清から抗ＮＧＡＬマウス抗体を捕捉する。温置後、蒸留水を用いて上清を洗浄した。ビオチンで標識されたＮＧＡＬ抗原を、１００から２００ｎｇ／ｍＬでプレートに添加し、３０分間温置した。この温置後、蒸留水を用いて、抗原をプレートから洗浄した。約２００ｎｇ／ｍＬになるように、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をブロック溶液中に希釈し、プレートに添加し、３０分間温置した。ＮＧＡＬ−ビオチンを除去するためにプレートを蒸留水で洗浄し、シグナルを生成させるための発色原として、ｏ−フェニレンジアミン基質（ＯＰＤ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）を使用した。４９２ｎｍでプレートを読み取り、結果を分析した。ハイブリッドがバックグラウンドより少なくとも３倍大きなＥＩＡシグナルを有する場合に、ハイブリッドを陽性と考えた（下表２参照）。
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１０％ＦＢＳ及びＨＴ補充物が補充されたＨＳＦＭ中で、２４ウェルプレートに、陽性ハイブリッドを増殖した。３から７日の増殖後、相対的親和性の順位付けを行うために、ビオチン標識されたＮＧＡＬの複数の濃度が使用されたことを除き、上述のように、２４ウェル培養物をＥＩＡによって評価した（下表３及び４参照）。さらなる評価のために、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、このアッセイにおいて、ＮＧＡＬへの相対的に高い親和性を示したハイブリッドを培養フラスコに増殖させた。
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ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、ＮＧＡＬに対する相対的結合親和性に関して、ＮＧＡＬハイブリッド上清を評価し、これに従って、ＮＧＡＬ結合エピトープ群中でグループ分けした。親和性アッセイは、以下のように、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ捕捉バイオセンサー上で完結した。０．１％ＢＳＡ及び０．１％ＣＭ−デキストランを加えたＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を含有する走行緩衝液（以下、「走行緩衝液」）と、１０μＬ／分で、まず、フローセルを平衡化させた。次に、バイオセンサー上に上清由来の抗ＮＧＡＬ抗体を捕捉する各フローセルを横切って、上清１３μＬを浮遊させ、１つのフローセルは参照フローセルとしてブランクとした。次いで、走行緩衝液を用いて、５０μＬ／分で５分間、フローセルを洗浄し、チップを横切って１００ｎＭ濃度のＮＧＡＬ抗原１５０μＬを注射した後、走行緩衝液を５分注射した。センサーグラムを介して、相対的結合速度論、会合及び解離をモニターした。会合及び解離速度並びに総合ＫＤを測定するために、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、センサーグラムを分析した。下表５に、結果が示されている。
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ＮＧＡＬ上に異なる別個の結合エピトープを有することが知られている、ＨＹＢ２１１−０１、ＨＹＢ２１１−０２又はＨＹＢ２１１−０５として知られた３つの市販のモノクローナル抗体のうちの１つにＮＧＡＬが予め複合体を形成している場合に、各ＮＧＡＬハイブリッドｍＡｂがｍＡｂ−抗原−ｍＡｂサンドイッチを完了する能力を測定することによって、ＮＧＡＬ結合エピトープ群を決定した。簡潔に述べれば、上記親和性アッセイにおけるように、Ｆｃ捕捉バイオセンサー及び走行緩衝液の同じ種類を用いて、各フローセル上に、３つの社外販売業者のｍＡｂのそれぞれ１２μＬを搭載する前に、５μＬ／分で２分間、チップを走行緩衝液と平衡化させる。１つのフローセルはブランクとし、参照として使用する。走行緩衝液を用いてフロー細胞を２分間洗浄し、次いで、マウスＩｇＧの高度に濃縮された溶液１０μＬを用いて、全ての空のＦｃ捕捉部位をブロックする。１μＭＮＧＡＬ又は走行緩衝液のみの何れか１５μＬ上に浮遊させる前に、チップをさらに２分間平衡化させる。さらに２分の温置をもう一度行った後、ＮＧＡＬハイブリッド上清１５μＬをバイオセンサー表面上に浮遊させる。
走行緩衝液のみを表面上に注射したときと比べて、ＮＧＡＬの存在下で、ＮＧＡＬハイブリッドｍＡｂが有意なシグナルを生成する場合、そのＮＧＡＬハイブリッドｍＡｂは、市販のｍＡｂとのｍＡｂ−抗原−ｍＡｂサンドイッチを形成することができる。ＮＧＡＬハイブリッドは、社外販売業者のｍＡｂとサンドイッチを形成する能力に基づいて、３つの異なるエピトープ群にグループ分けされた。ｍＡｂがＮＧＡＬと上手くサンドイッチを形成した場合、陽性のスコアを与え、ペアを成すｍＡｂがＮＧＡＬへ同時に結合できるという証拠と考えた。各エピトープ群は、２つの他の群の何れかとサンドイッチを形成することができるが、それ自身の群の要素とは形成できない。（下表６参照）。
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ＮＧＡＬハイブリッドは、Ｂｉａｃｏｒｅ阻害データ及び速度論的スクリーニングに基づいて、相対的に順位付けられる。ハイブリッド１−９０３及び１−２３２２は、改善された相対的親和性で、２つの明確に異なるＮＧＡＬエピトープに結合したので、さらなる評価のために選択した。細胞株を安定化させ、混合された細胞集団が確実に存在しないようにするためのクローニングのために、これらのハイブリッドを選択した。
半固体組織培地中で細胞を増殖させ、ＣｌｏｎｅｐｉｘＦＬ装置（Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｌｔｄ．， Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いた継代培養のためにコロニーを取り出すことによって、ハイブリッド１−９０３をクローニングした。簡潔に述べれば、１０％ＦＢＳが補充されたＨＳＦＭの２倍濃度及びＣｌｏｎｅＭａｔｒｉｘメチルセルロース培地（Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｌｔｄ．， Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ， ＵＫ）の等容量中に、ハイブリッド細胞懸濁液を希釈した。半固体細胞懸濁液を組織培養プレート中に播種し、３７℃で約７日間温置した。細胞播種の時点で、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ溶液の５μｇ／ｍＬ溶液（Ｃｌｏｎｅ Ｄｅｔｅｃｔ， Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｌｔｄ．， Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を半固体培地に添加した。増殖を開始した単一の細胞が移動され、他の細胞と混合することはなかったので、半固体培地中で増殖されたコロニーは、クローンであると考えられる。コロニーによって産生されている抗体と蛍光を発するヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ−ＦＩＴＣとの間で免疫沈降反応が起こる。蛍光が明るいほど、より多くの抗体がコロニーによって産生される。
ＣｌｏｎｅｐｉｘＦＬ上の蛍光に関してコロニーを分析し（図６参照）、１０％ＦＢＳを加えたＨＳＦＭを含有する９６ウェル組織培養プレートへの自動化された転移のために、最も強いシグナルを有するコロニーを選択した。これらのプレートを７から１０日間温置し、上に先述されているように、抗ＮＧＡＬ力価に関してクローン上清を検査した。さらなる評価のために、クローン１−９０３−１０２を選択した。ＦＢＳを加えないＨＳＦＭにこの細胞株を引き離し、上記半固体培地を用いてサブクローニングした。大規模化及び細胞バンクへの保管の目的で、細胞株１−９０３−４３０も選択した。細胞バンクの長期間保存のために、液体窒素凍結装置を使用する。要約すると、抗ＮＧＡＬｍＡｂハイブリッド１−９０３−１０２は、サブクローン１−９０３−４３０が由来した親クローンである。
限界希釈によるクローニングのために、ハイブリッド１−２３２２を選択した。簡潔に述べると、１０％ＦＢＳを含有するＨＳＦＭ中にハイブリッド細胞を系列希釈し、９６ウェル組織培養プレート中に播種した。集密な増殖が明白になるまで、これらのプレートを温置した。上に先述されているように、抗ＮＧＡＬ力価に関して、クローン上清を検査した（図７参照）。さらなる評価のために、クローン１−２３２２−１０１を選択し、増殖のために、ＦＢＳを加えないＨＳＦＭ中に引き離した。上記半固体培地を用いて、この細胞株をサブクローニングした。大規模化及び細胞バンクへの保管の目的のために、細胞株１−２３２２−４５５を選択した。細胞バンクの長期間保存のために、液体窒素凍結装置を使用する。要約すると、抗ＮＧＡＬｍＡｂハイブリッド１−２３２２−１０１は、サブクローン１−２３２２−４５５が由来した親クローンである。
抗体の性質決定
Ｉｓｏｓｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、１−９０３−４３０及び１−２３２２−４５５細胞株の各々から精製された抗体を検査した。各試料に対して０．２μｇ／ｍＬの分取試料１５０μＬを発色チューブに添加し、混合した。各チューブにＩｓｏｓｔｒｉｐを加え、細片のバンド上で発色するまで、５から１０分間温置した。結果は、１−９０３−４３０及び１−２３２２−４５５の何れもがκ軽鎖を有するマウスＩｇＧ１サブタイプであることを示唆した。
抗体産生及び精製
１−９０３−４３０及び１−２３２２−４５５細胞株をＨＳＦＭ中で増殖させ、約０．５×１０−５細胞／ｍＬで、ローラー瓶の中に播種した。約１回転／分で回転させながら、１０から１４日間又は最終の終末培養が得られるまで、３７℃で培養物を温置した。最終ローラー瓶の上清を採集し、０．４５μＭフィルターで清澄化した。Ｐｅｌｌｉｃｏｎシステムを用いて、清澄化された上清を濃縮し、０．４５μＭフィルターを用いてろ過した。ｐＨ８．９の１．５Ｍグリシン／３ＮａＣｌ緩衝液の等容量を用いて、ｍＡｂ濃縮物を希釈し、次いで、ＡＫＴＡ自動化精製システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、予め平衡化された５ｍＬのプロテインＡカラム上に搭載した。次いで、結合緩衝液の５カラム容量を用いて、カラムを洗浄し、安定なベースラインが達成された時点で、ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液を用いて、ｍＡｂを溶出した。次いで、ＰＢＳ中への交換のために、Ｇ２５カラム７０ｍＬにｍＡｂを移した。抗体を分取し、−７０℃で保存した。
抗体結合親和性
Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ， Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ））を用いて、抗ＮＧＡＬ１−２３２２−４５５及び１−９０３−４３０ｍＡｂの両方に対する平衡解離定数を測定した（Ｄａｒｌｉｎｇ ａｎｄ Ｂｒａｕｌｔ， Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２（６）：６４７−６５７（２００４）参照）。ＩｇＧ抗体（１−２３２２−４５５又は１−９０３−４３０）の一定量をヒトＮＧＡＬ抗原の様々な濃度（５×１０−８Ｍから１０−１２Ｍ）とともに温置し、試料採取前に、平衡化に到達させた（３から８時間）。固相ポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）ビーズ上に固定化されたヒトＮＧＡＬ上に抗体／ヒトＮＧＡＬ反応混合物を注射することによって、遊離の結合部位の量を測定した。続いて、蛍光性ＣＹ５が連結されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ＧＡＭ−Ｃｙ５）を用いて、ヒトＮＧＡＬによって被覆されたビーズに結合された遊離の抗ＮＧＡＬ抗体を検出した。結合されたＧＡＭ−Ｃｙ５の程度は、ヒトＮＧＡＬによって被覆されたビーズに結合された抗ＮＧＡＬＩｇＧの量に比例した。製造業者（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｂｏｉｓｅ， Ｉｄａｈｏ）によって提供されたソフトウェアを用いて、反応試料中に存在する抗原の量に対して、遊離の結合部位の量を分析することによって、ＫＤを求めた。実験は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡ反応希釈剤中で行った。ＮＧＡＬ野生型抗原及びＮＧＡＬ変異体Ｃ８７Ｓ抗原に対する抗ＮＧＡＬ１−２３２２−４５５ＩｇＧ及び１−９０３−４３０ＩｇＧのＫＤが、下表７に報告されている。
Figure 0005746861
ＫｉｎＥｘＡによって測定された親和性の結果は、モノクローナル抗体１−２３２２−４５５が野生型ＮＧＡＬ及び変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬの両方に対して同じ親和性を有することを示した。モノクローナル抗体１−９０３−４３０は、変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬ抗原の親和性より高い親和性を野生型ＮＧＡＬ抗原に対して有する。
精製された抗体の能力
この実験の目的は、化学発光アッセイフォーマット中でサンドイッチを形成する能力に関してクローンを検査することであった。ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬで、白色の９６ウェルマイクロタイターイムノアッセイプレート上に、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃを被覆した。捕捉試薬が固相上に被覆された後、捕捉試薬を除去し、ＰＢＳ溶液中の２％Ｆｉｓｈゲルを用いて、プレート上の全ての開放された結合部位をブロックした。次いで、ブロック溶液を洗浄除去し、ｍＡｂ１−２３２２−１０１からの精製された抗体をＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬで添加し、室温で１時間温置した。この温置後、水でプレートを洗浄し、ＣＨＯ細胞中で産生されたＮＧＡＬｒＡｇを、ＰＢＳ中に、０から１００ｎｇ／ｍＬまでｌｏｇ２系列希釈でプレートに添加し、室温で１時間温置した。この温置後、水でプレートを洗浄し、二次ｍＡｂ試薬を添加する前に、未結合のヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ捕捉抗体を占拠させるために、ＦｉｓｈＧｅｌブロック中の１％正常マウス溶液で再びブロッキングした。このブロッキングの後、プレートを洗浄し、アクリジニウム標識された二次モノクローナル試薬を、ブロック溶液中に、２５０から５００ｎｇ／ｍＬで添加した。室温で３０分間、二次ｍＡｂを温置し、次いで、水で洗浄した。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ Ｐｒｅ−ｔｒｉｇｇｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｎｏ．６Ｅ２３−６５）及びＡｒｃｈｉｔｅｃｔ Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｎｏ．６Ｃ５５−６０）がその中に添加されているＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｊｅｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）上で、アッセイシグナルを読み取り、発光カウント／秒（ＬＣＰＳ）でフラッシュ化学発光を測定する。
図８は、抗原滴定曲線のグラフ化を示し、１−２３２２−１０１捕捉された抗体はこのアッセイにおいて検査されたエピトープ群１（すなわち、ＨＹＢ２１１−０１及び１−１８１−１２８）の２つの他の要素とサンドイッチを形成しないことを示す。
ＭＡｂ１−２３２２−１０１は、エピトープ群２（すなわち、１−９０３−１０２及びＨＹＢ２１１−０２）及びエピトープ群３（すなわち、１−４１９−１８２）の要素と首尾よくサンドイッチを形成することができる。このデータは、ＢＩＡＣｏｒｅ阻害エピトープグループ分けアッセイを用いて、ハイブリッド段階で同定されたエピトープのグループ分けを確認する。このデータは、二次抗体１−９０３−１０２とともに使用された捕捉ｍＡｂ１−２３２２−１０１が最良の抗体対であったことも示唆する。
抗体の配列決定
この実験の目的は、ＮＧＡＬｍＡｂ１−９０３−４３０可変遺伝子配列及びＮＧＡＬｍＡｂ１−２３２２−４５５可変遺伝子配列を決定することであった。
製造業者の推奨に従って、市販の試薬（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、適切なハイブリドーマ細胞培養物からｍＲＮＡを抽出した。標準的なプロトコールに従って、それぞれ、市販のマウスＩｇプライマーＭｕＩｇＧＶＨ３’−２及びＭｕＩｇｋＶＬ３’−１（Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ， Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、抽出されたｍＲＮＡからＩｇＧ重鎖ｃＤＮＡ及びκ軽鎖ｃＤＮＡを作製した。次いで、標準的な方法を用いて、上記されている同じ市販のマウスＩｇプライマーキットからのＩｇＧ及びＩｇκ特異的プライマーのプールを用いて、それぞれのｃＤＮＡから、可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）遺伝子をＰＣＲ増幅した。製造業者の指示に従って、市販のベクター（ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ， ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）中に、増幅されたＶＨ及びＶＬＰＣＲ産物をクローニングし、イー・コリ中に形質転換した。ＶＨ及びＶＬ遺伝子配列を同定するために、複数の形質転換されたイー・コリコロニーから単離されたプラスミドに対して、配列分析を行った（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ））。
ＮＧＡＬｍＡｂ１−２３２２−４５５及び１−９０３−４３０可変遺伝子及びポリペプチド配列が、図９ＡからＢ及び１０ＡからＢ並びに配列番号１７及び２１（ｍＡｂ１−９０３−４３０に対して）並びに配列番号７及び１１（ｍＡｂ１−２３２２−４５５に対して）に示されている。
ｍＡｂ結合のためにエネルギー的に重要なＮＧＡＬ残基の同定
抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体は、ＮＧＡＬの概ね完全長を包含する約１０から２０残基長の一連の直鎖配列に対して反応性を示さなかった。このことは、抗ＮＧＡＬ１−９０３−４３０及び１−２３２２−４５５ｍＡｂ系統が立体構造的エピトープ又は不連続なエピトープに反応したことを示唆する。従って、抗ＮＧＡＬｍＡｂの群との相互作用にとって重要な残基を決定するために、変異されていない（野生型（「ＷＴ」））ＮＧＡＬ抗原及び酵母接合タンパク質ＡＧＡ２への融合物として酵母表面上のＮＧＡＬ抗原のライブラリーを発現させるために、酵母ディスプレイ系を使用した（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １５：５５３−５５７（Ｊｕｎｅ １９９７）参照）。プライマーＮＧＡＬｐＹＤ４１ｆｏｒ及びＮＧＡＬｐＹＤ４１ｒｅｖを用いて、野生型ＮＧＡＬ抗原ＤＮＡコード配列をＰＣＲ増幅し、標準的な分子生物学技術を用いて、酵母ディスプレイベクターｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中にクローニングした。ｐＹＤ１ベクターは、ガラクトース誘導性プロモーター、Ｃ末端Ｖ５エピトープタグ並びに、それぞれ、ＥＢＹ１００及びイー・コリ選択のためのトリプトファン及びアンピシリンマーカーを含む。プライマーは、以下のとおりである。
ＮＧＡＬｐＹＤ４１ｆｏｒ：
Figure 0005746861
 ＮＧＡＬｐＹＤ４１ ｒｅｖ：
Figure 0005746861
プライマーｐＹＤ４１ｆｏｒ及びｐＹＤ４１ｒｅｖを用いて、製造業者の指示に従い、ＧｅｎｅｍｏｒｐｈＩＩ無作為突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ）を用いる変異誘発条件下で、野生型ＮＧＡＬ抗原ＤＮＡコード配列を増幅することによって、ＮＧＡＬ中に無作為な変異を含有するライブラリーを作製した。これらのプライマーは、以下のとおりである。
ｐＹＤ４１ｆｏｒ：
Figure 0005746861
 ｐＹＤ４１ｒｅｖ：
Figure 0005746861
記載されているように（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ ａｎｄ Ｇｉｅｔｚ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １６（５−６）：３３９−４６（Ｄｅｃ １９８９））、酵母中に形質転換した後、内在性の相同的組換え系を用いて、得られたレパートリーを直鎖化されたｐＹＤ１酵母ディスプレイベクター中に挿入した。再構成されたベクター上に存在する栄養要求性トリプトファンマーカーを用いて、形質転換された酵母細胞を選択的に回収した。変異体ライブラリーは、１７８残基のＮＧＡＬｒＡｇの各位置での全てのアミノ酸の置換の可能な数より二桁超高い５×１０６の多様な要素を含有していた。
ＮＧＡＬ抗原発現のために誘導された変異体ライブラリーは、抗ＮＧＡＬｍＡｂの群（１−２３２２−１０１及び１−９０３−１０２）を用いる、「Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ， ３４２：５３９−５５０（２００４））」に記載されているような蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）の連続する繰り返しのための最初のプールであった。抗ＮＧＡＬｍＡｂ１−２３２２−１０１及び１−９０３−１０２は、それぞれ、抗ＮＧＡＬサブクローン１−２３２２−４５５及び１−９０３−４３０が得られた親クローンである。一次ＮＧＡＬｍＡｂとともに細胞を温置し、洗浄し、フィコエリトリン（ＧａＭ−ＰＥ）と連結されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体を用いて、細胞表面に結合された残りのｍＡｂを検出した。選択の各巡において、特定の抗ＮＧＡＬｍＡｂによって結合され得る能力を破壊した変異を含有する完全長クローンを、結合相互作用を変化させなかった変異を含有するクローンから選択的に濃縮した。ｍＡｂ結合の喪失をもたらす変異の位置を特定するために、各ｍＡｂ選択から単離された多数の各クローンを配列決定した。次いで、ＮＧＡＬ抗原の立体構造を全体的に破壊する明白な変異を除去するために、溶媒が接近可能な表面領域に従って、変異体残基のリストを篩にかけた（下表８参照）。
Figure 0005746861
各ＮＧＡＬｍＡｂサブクローンの機能的エピトープ（直接接触残基）を確認するために、アラニンへの部位指定突然変異導入によって、エピトープ選択から同定されたＮＧＡＬｒＡｇ残基の各々の側鎖を変化させた。酵母細胞表面上に、各ＮＧＡＬｒＡｇアラニン変異体を発現させ、各ＮＧＡＬｍＡｂの滴定後に（５×１０−６Ｍから１×１０−１１Ｍ）、結合の量を測定することによって、親和性を測定した。簡潔に述べれば、室温で４時間から一晩、一次ＮＧＡＬｍＡｂ（１−２３２２−４５５又は１−９０３−４３０）とともに室温を温置し、洗浄し、フローサイトメトリーアッセイを用いて、フィコエリトリンが連結されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ＧａＭ−ＰＥ）を用いて、細胞表面上の抗原に結合されたままのｍＡｂを検出した。
親和性は、以下の式［１］を用いて計算した。
Figure 0005746861
 （Ｆは抗原結合チャンネル中の観察された平均蛍光強度（「観察された蛍光」）であり、Ｆｍａｘは飽和されたｍＡｂ結合での蛍光の量、ＬＦは遊離のリガンド濃度であり、ＫＤは平衡解離定数であり、及びＢはバックグラウンド蛍光である。）
ｍＡｂ結合に対する各アラニン置換のエネルギー的影響を評価するために、Ｇｉｂｂｓの自由結合エネルギーの変化（デルタデルタＧＡｌａ−ＷＴ）を測定した。以下の式［２］を用いて、アラニン置換時のＧｉｂｂｓの自由結合エネルギーの変化を計算した。
Figure 0005746861
 （Ｒは気体定数（１．９８７２×１０−３ｋｃａｌ／Ｍ・Ｋｅｌｖｉｎ）であり、Ｔは温度であり（２９７°Ｋｅｌｖｉｎ）であり、ＫＤ，Ａｌａ及びＫＤ，ＷＴは、それぞれ、変異体及び野生型抗原に対する平衡解離定数である。）
これらの実験に関して、式［１］を用いてＫＤを求めるために、観察された蛍光（Ｆ）を使用した。次いで、アラニン置換の際のＧｉｂｂｓの自由結合エネルギーの変化を求めるために、式［１］に由来するＫＤを式［２］において使用した。接触残基を求めるためのデータとして使用されたエピトープマッピング結合等温式が、図１１及び図１２に示されている。ＫＤは、変曲点で曲線の各々の横軸から読み取られる。
１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ以上のデルタデルタＧＡｌａ−ＷＴ値を有する残基を有意と考え、下表９に太字で列記されている。
Figure 0005746861
表９から明らかなように、抗ＮＧＡＬｍＡｂ１−２３２２−４５５は、セリン（Ｓ，Ｓｅｒ）１１２、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）１１８及びグルタミン酸（Ｅ，Ｇｌｕ）１４７残基に直接接触する。抗ＮＧＡＬ１−９０３−４３０は、リジン（Ｋ，Ｌｙｓ）１５及びアルギニン（Ｒ，Ａ４ｇ）１０９側鎖に直接接触する。これらの残基の何れかをアラニンに変化させる（及びこれらの側鎖を除去する）ことによって結合が喪失するので、抗ＮＧＡＬ１−９０３−４３０認識のために、これらの残基の両方が必要とされる。ヒトＮＧＡＬのＸ線結晶構造上のｍＡｂ結合変異のために不可欠なアミノ酸残基（ＰＤＢ１ＱＱＳ）の分子モデル化が、図１３に示されている。ヒトＮＧＡＬとの抗体結合において重要であるとして図１３に強調表示され及び本実施例に記載されている部位指定突然変異導入によって同定された残基も、以下の実施例に記載されているように、ＮＭＲを用いて同定されたことには注目する価値がある。
ＮＭＲを用いた抗体相互作用の性質決定
イー・コリ中でのヒトＮＧＡＬの発現
それぞれ、５’及び３’末端に、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位を有するように、成熟ヒトＮＧＡＬタンパク質（配列番号３３）をコードするポリペプチド配列を設計した。開始コドンがベクターによって供給されるシャイン・ダルガルノ配列の開始から最適な距離の下流に位置するように（典型的には、１２から１４塩基）、所望の配列のすぐ上流に、開始コドンをインフレームに挿入した。開始コドンの後に、設計された配列は、成熟ＮＧＡＬタンパク質（シグナルペプチドなし（配列番号３３参照））に加えて、６ヒスチジンのＣ末端配列をコードする。この配列は、イー・コリ中での高レベル発現に対してコドン最適化された。ＮＧＡＬタンパク質の一部をコードし、相補的な重複する末端を含有するオリゴヌクレオチドを徐冷し、末端を充填し、二段階ＰＣＲプロセスにおいて、得られた組み立てられた産物を増幅した。第一のＰＣＲ工程において、５’−クローニング部位（ＥｃｏＲＩ）及びＣ末端ヒスチジンタグの一部をコードする配列を組み立てられた遺伝子の末端に導入し、第二のＰＣＲ工程において、ヒスチジンタグをコードする配列の残りが取り込まれ、その後に停止コドンが続いた。増幅された産物を精製し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化し、同様に消化されたｐＫＲＲ８２６ベクター（非融合産物を生成するｐＬを基礎とする発現ベクター、例えば、米国特許第５，９２２，５３３号に記載されている。）中に連結した。イー・コリのプロテアーゼ欠損ＢＬ２１系統中に、連結産物を形質転換した。アンピシリン耐性によって、クローンを選択した。設計されたヒトＮＧＡＬ配列を有するクローン（ＮＧＡＬ（＋）１と称された。）が確認された。
発現されたＮＧＡＬがジスルフィド結合された二量体を形成する可能性を最小限に抑えるために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｃｅｄａｒ Ｃｒｅｅｋ，ＴＸ）（配列番号２９及び３０並びに図１４参照）を用いて、クローンＮＧＡＬ（＋）１のアミノ酸８７をＣｙｓ残基からＳｅｒ残基に変化させた。変異されたプラスミドの配列を確認し（配列番号２９に記載されており、残基−１にＭｅｔをコードする変異を受けたＮＧＡＬポリヌクレオチド配列）、得られたプラスミド（ＮＧＡＬ（＋）ｍｕｔ８と称される。）をプロテアーゼ欠損イー・コリ株ＢＬ２−２１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＡｐＢｉｏｔｅｃｈ）， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ，現在ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に形質転換した。
０．５５のＯＤ５９５に達するまで、細胞を３０℃で増殖させ、この時点で、発現を誘導するために温度を４２℃にシフトさせた。４２℃での誘導の３時間後、遠心によって細胞を採集し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、沈降された細胞を溶解した。発現されたＮＧＡＬは可溶化液の可溶性画分中に存在し、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｒ）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて精製し、０．１５ＭＮａＣｌ（ＰＢＳ）を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に透析した。
ＮＭＲ研究用の同位体標識されたＮＧＡＬの調製
本明細書に先述されているように、イー・コリ株ＢＬ２１中でタンパク質を発現させることによって、ヒトＮＧＡＬタンパク質を調製した。１００％２Ｈ２Ｏを含有する市販のリッチ培地（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＣＩＬ）， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＭＡ）中で細胞を増殖させることによって、２Ｈバックグラウンド中の均一に１５Ｎ標識されたヒトＮＧＡＬ試料を調製した。Ｕ−１３Ｃ−グルコース（３ｇ／Ｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＣＩＬ）， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＭＡ）及び１５ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＣＩＬ）， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＭＡ）を用いて、均一に１３Ｃ，１５Ｎ標識された試料をＭ９培地上で調製し、Ｈ２Ｏ及び１０μＭＦｅＳＯ４を添加した。本明細書に先述されているように、可溶性タンパク質を精製した。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ２３２２、ｍＡｂ８０９、ｍＡｂ２６９、ｍＡｂ１８１及びｍＡｂ９０３）からのＦａｂ断片の調製
選択されたハイブリドーマを大規模化し、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ−ＰｏｒｏｓＡ５０カラムを用いて、組織培地からモノクローナル抗体を単離した。さらなる研究のために、６つのモノクローナル抗体、すなわち、ｍＡｂ２３２２、ｍＡｂ８０９、ｍＡｂ２６９、ｍＡｂ１８１及びｍＡｂ９０３を選択した。
以下のように、一般的な消化プロトコールを用いて、パパインでのＩｇＧ抗体の限定的消化によって、Ｆａｂ断片を調製した。簡潔に述べると、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び１ｍＭＥＤＴＡの存在下で、１００：１（ｗ／ｗ）のＩｇＧ／パパイン比で固定化されたパパイン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）と、ＰＢＳ中の２から６ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の抗体を混合し、室温で回転装置の上に置いた。ＴｏｓｈｏＫ３４３３Ｇ２０００ＳＷｘＩＨＰＬＣカラム上で、３０分又は６０分ごとに、試料を走行させることによって、消化をモニターした。完了後、遠心によって、固定化された酵素を除去し、消化されていないＩｇＧ及びＦｃ断片を吸収させるために、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ−ＰｏｒｏｓＡ５０カラムに試料を通過させた。濃縮後、ＰＢＳに対してＦａｂ断片を透析した。ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによって、８０％より高いＦａｂ断片の純度が確認された（図１５参照）。Ｆａｂ調製物中の何れの不純物も５％を超えなかった。
ＮＭＲ実験（ＮＧＡＬ共鳴のアサインメント）
ＮＭＲ試料は、９０％Ｈ２Ｏ／１０％２Ｈ２Ｏ中に、０．１５から０．５０ｍＭの標識されたタンパク質を含有した。ヒトＮＧＡＬに対するタンパク質共鳴のアサインメントは、公開データベースＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（データベースエントリー４２６７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｒｂ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｄａｔａ／ｌｉｂｒａｒｙ ｇｅｎ ｓａｖｅｆｒａｍｅ）から得られた（Ｃｏｌｅｓ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８９： １３９−５７（１９９９）参照）。本実施例で使用した構築物はＣ８７Ｓ置換を有するが、その他の点では、「Ｃｏｌｅｓ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８９：１３９−５７（１９９９）」に記載されている研究において使用されたものと同じである。３ＤＨＮＣＡ（Ｙａｍａｚａｋｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，１１６５５−１１６６６（１９９４）参照）実験及び３Ｄ１Ｈ／１５Ｎ分解されたＮＯＥＳＹ（Ｆｅｓｉｋ， Ｓ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．７８， ５８８−５９３（１９８８）参照）スペクトルを取得し、公開されたアサインメントと比較した（Ｃｏｌｅｓ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２８９：１３９−５７（１９９９）参照）。Ｃ８７Ｓ変異に隣接する残基を除き、アサインメントに著しい差は観察されなかった。アサインメントは、ｐＨ６．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の５００μＭヒトＮＧＡＬからなる試料を用いて行った。全てのＮＭＲスペクトルは、ＢｒｕｋｅｒＤＲＸ６００又はＤＲＸ８００ＮＭＲ分光光度計上で、２５℃で収集した。
ＮＭＲ実験（結合によって誘導されたシフト）
ヒトＮＧＡＬ−Ｆａｂ複合体は１５０μＭ同位体標識されたヒトＮＧＡＬを含有し、６つのｍＡｂの各々から得られた非標識Ｆａｂ断片２００μＭを研究した。１５Ｎ，２Ｈ標識されたＮＧＡＬの１Ｈ−１５Ｎ−ＴＲＯＳＹＨＳＱＣ（Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４， １２３６６−７１（１９９７）及びＳｈｉｍａｄａ， Ｉ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３９４， ４８３−５０６（２００５）参照）スペクトル又は１３Ｃ，１Ｈ標識されたヒトＮＧＡＬ単独及びＮＧＡＬ−Ｆａｂ複合体中の１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣ（Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇ，ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．６９， １８５−１８８（１９８０）参照）を比較することによって、化学シフト又はピーク幅の増大をモニターした。抗体結合によって共鳴の擾乱が最低限であった場合に、化学的シフトの変化又は相対的な幅の増大は「変化なし」と分類され、又はスペクトルの変化の大きさに応じて、「中」若しくは「大きな」擾乱と分類した。これらの擾乱の例は、ｍＡｂ２３２２の添加後、ヒトＮＧＡＬに対して図１６に示されている。
ＮＭＲの結果及び考察
ＮＭＲは、タンパク質−タンパク質相互作用の接触残基又はエピトープの決定を可能にする方法である（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｉ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ３９４：４８３−５０６（２００５）， Ｃｌａｒｋｓｏｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．， ３１：１００６−９ （２００３）， Ｆｏｓｔｅｒ， Ｍ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４６：３３１−４０ （２００７）， Ｚｕｉｄｅｒｗｅｇ， Ｅ．Ｒ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４１：１−７（２００２）， Ｂｅｔｚ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９５：７９０９−７９１４ （１９９８）参照）。この方法は、タンパク質配列中で連続していないが、タンパク質の折り畳みのために近接している接触残基（いわゆる、「不連続」又は「立体構造的」エピトープ）を同定することができる。ＮＭＲスペクトルは、固有の抗原−抗体相互作用を反映し、接触の極めて強固な指標である。
図１６は、ヒトＮＧＡＬ及びヒトＮＧＡＬ／抗体ｍＡｂ２３２２複合体の１Ｈ−１５ＮＴＲＯＳＹＨＳＱＣスペクトルの一部を示す（Ｓｈｉｍａｄａ， Ｉ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ３９４：４８３−５０６（２００５）及びＦｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ， １３：５７０−８０（２００３）参照）。図１６は、複合体のスペクトル（太い灰色の線）中の共鳴の多くが、遊離のタンパク質のスペクトル（細い黒線）の共鳴位置上にほぼ正確に重なることを示している。これらのヒトＮＧＡＬ共鳴は、抗体結合によって著しい影響を受けない。一例が図１６中の９３Ｔであり、位置の著しいスペクトル変化を示さず、従って、抗体接触部位から遠いと推測される（Ｓｈｉｍａｄａ， Ｉ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ３９４：４８３−５０６（２００５）， Ｃｌａｒｋｓｏｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．， ３１：１００６−９（２００３）， Ｆｏｓｔｅｒ， Ｍ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４６：３３１−４０（２００７）， Ｚｕｉｄｅｒｗｅｇ， Ｅ．Ｒ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４１：１−７（２００２）参照）。しかしながら、抗体の存在によって非常に擾乱される１１５Ｙ及び１５０Ｅのような残基は、抗体と直接接触しており（第一の接触殻）、又は直接接触している残基と接触している残基（第二球体接触（ｓｅｃｏｎｄ ｓｐｈｅｒｅ ｃｏｎｔａｃｔ））と推定される。これらの接触結果は何れも、ＮＭＲによって検出可能なｍＡｂ接触のスペクトルのシグナチャをもたらす。残基１１５、１１８及び１５０に対する擾乱を示すこれらのデータは、実施例７中の機能喪失変異データ及び自由エネルギー結合データの変化と合致し、これらを補うものであって、ｍＡｂ２３２２によって残基１１２、１１８及び１４７が直接接触されていることを裏付ける。これらの残基又は付近の残基は、抗体の結合によって擾乱され得ると予想される。
１Ｈ−１５ＮＴＲＯＳＹＨＳＱＣスペクトルの他に、側鎖共鳴の擾乱は、特に、１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトルからのメチル基中において測定することができる。共鳴が重複しているので、１Ｈ−１３Ｃ共鳴のごく一部のみを分析において使用した。１Ｈ−１３Ｃから得られたこの追加のデータは、１Ｈ−１５ＮＴＲＯＳＹＨＳＱＣスペクトルの結果を補い、擾乱された共鳴を有する残基を列記する下表１０に含まれている。
Figure 0005746861
以下の分類に従って、表１０中の擾乱の大きさを順位付けした。
（ａ）「測定せず」−実験中の共鳴状態が不明瞭であったので、測定されなかった。ピークが十分に分割されておらず、擾乱を割り当てることができない。
（ｂ）「０」−変化なし、シフト＜０．２ｐｐｍ（１Ｈ＋１５Ｎ）。他のピーク同様に幅が広がっている。
（ｃ）「１」−小さなシフト：０．５ｐｐｍ＞シフト＞０．２ｐｐｍ（１Ｈ＋１５Ｎ）。
（ｄ）「２」−大きなシフト。シフト＞０．５ｐｐｍ（１Ｈ＋１５Ｎ）。
（ｅ）「３」−幅広い又は大きなシフト、ピークが消失。
（ｆ）重複したピークは、表１０に含まれていない。
図１７Ａに示されているように、ｍＡｂ９０３結合（図１７Ａ）による固有の抗原であるヒトＮＧＡＬの共鳴の擾乱を観察することができ、ｍＡｂ２３２２などの異なる抗体の結合によって観察される擾乱（図１７Ｂ）と区別することができる。これは、異なる結合界面が特徴的な異なるスペクトル変化をどのように有するかを図解する。このアプローチによって、抗原タンパク質であるヒトＮＧＡＬの異なる表面上で相互作用する抗体間の識別が可能とする。
図１８Ａから１８Ｆは、研究された全ての抗体に対して観察された共鳴変化を要約するグラフを示している。共鳴変化（縦軸）を配列（横軸）に対してグラフ化すると、擾乱された共鳴の全てが配列中で連続する残基から得られるわけではないことが明らかである。さらに、プロットは共鳴の同じ組を比較するので、共鳴の擾乱が抗体に関して異なっているときに観察することが容易である。このデータの比較から、６つの研究されているｍＡｂを３つの異なる群に組み合わせることができる。第一の群（「エピトープ群１」）には、図１８ＡからＤに示されているｍＡｂ２３２２、ｍＡｂ８０９及びｍＡｂ２６９及びｍＡｂ１８１が含まれる。残りの２つの抗体ｍＡｂ９０３（図１８Ｅ）及びｍＡｂ４１９（図１８Ｆ）は、明瞭に異なるＮＭＲ共鳴擾乱シグナチャを示し、２つの別個の群、すなわち、群２及び群３に割り当てられる（すなわち、それぞれ、「エピトープ群２」及び「エピトープ群３」）。
図１９ＡからＢは、共鳴が擾乱されている残基がタンパク質の三次元構造上にどのようにマッピングされるかを示している。ＮＭＲ（Ｃｏｌｅｓ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２８９：１３９−５７（１９９９）参照）及びＸ線結晶学（Ｇｏｅｔｚ， Ｄ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ， １０：１０３３−４３ （２００２）及びＨｏｌｍｅｓ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， １３：２９−４１ （２００５）参照）を用いて、ＮＧＡＬ三次元構造を決定した。予想通り、抗体結合によってその共鳴が影響を受けたアミノ酸残基は、タンパク質表面上に位置しており、抗体との接触相互作用に関与している可能性がある。これらのアミノ酸残基は、第一球体又は接触残基としばしば定義される。表面上に露出されておらず、タンパク質分子の内部に埋め込まれている所謂第二球体残基も存在する。これらのアミノ酸は、第一球体中の残基の位置決めに必要であり、この微小環境は、抗体と相互作用した際にも擾乱され得る。
その上、これらのアミノ酸残基は、結合エピトープのＮＭＲシグナチャにも寄与する。さらに、抗体と直接接触していないが、結合表面中での結合によって誘導される立体構造の調整のために擾乱された状態となるエピトープの周辺上の残基の共鳴中に擾乱を登録することもしばしば可能である。
図１９Ａに示されているように、ｍＡｂ２３２２によって（例えば、下表１１から、残基Ｋ１４２からＥ１５０まで）、ヒトＮＧＡＬのその共鳴が擾乱されている残基は全て、タンパク質の１つの表面上に存在する。これらの残基には、実施例７の自由エネルギー結合データの機能喪失変異及び変化によって独立に同定された残基１４７が含まれる。表面上で擾乱された残基は、直接接触球体中に存在する。第二球体中の残基はこれらの残基に接触し、結合による構造的再配置のために、間接的に擾乱される可能性がある。これらの残基は、抗体との相互作用表面を確定するために使用され得る。表面は、タンパク質の折り畳みのために近接している非連続的な残基からなる。従って、抗体は、タンパク質の固有状態に類似する折り畳みを認識する。
ｍＡｂ９０３結合によって擾乱される残基の対応する位置が、図１９Ｂに示されている。これは、図中に示されているように、ｍＡｂ２３２２のものから追放された相互作用表面がタンパク質の底部に位置していることを確定する。２つの接触領域は、重複しておらず、従って、それらを識別するために使用することができるＮＭＲ共鳴の擾乱によって確定された相互作用表面を有する。従って、それらがタンパク質の隣接する表面上に位置する場合でさえ、各抗体に特有な接触が存在する。実施例７中の機能喪失変異及び自由エネルギー結合データの変化によって同定された、擾乱された残基Ｌ１８及びＱ８８が残基１５及び１０９に近接していることに注目することも意味がある。
メチル（１Ｈ−１３Ｃ）基スペクトル及びアミド（１Ｈ−１５Ｎ）スペクトル中のシフト並びに（１Ｈ−１５Ｎ）スペクトルの幅の増大が、以下の表１１に要約されている。
Figure 0005746861
一般に、本実施例のデータは、機能喪失変異及び自由エネルギー結合データの変化に関して実施例７に得られたエピトープマッピングデータと一致し、これを補う。幾つかの事例において、１３Ｃ／１５Ｎマッピングデータの不存在は、シフトの規模が極めて大きいので、シフトしたピークの同定が妨げられることに起因し得る。
溶液中での抗体親和性及びサンドイッチ形成の測定
蛍光性標識及び消光物質でのＮＧＡＬ及びｍＡｂの標識化
Ｈｉｓ−ＢｉｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ， ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて、イー・コリ中で産生されたヒトＮＧＡＬ（Ｃ８７Ｓ）を精製した。ＢＨＱ−１０Ｓスクシンイミジルエステル（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｒ）， Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．Ｎｏｖａｔｏ， ＣＡ）を用いて、精製されたヒトＮＧＡＬを標識した。ＡＬＥＸＡＦｌｕｏｒ４８８カルボン酸、スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いて、抗ＮＧＡＬｍＡｂ（１−８０９−１７４、１−９０３−１０２、２−９４０５、１−２３２２−１０１）を標識した。ＰＢＳで平衡化されたＧ−２５カラム上で、標識されていないＢＨＱ−１０及びＡＬＥＸＡＦｌｕｏｒ４８８を除去した。
ＢＨＱ−１０Ｓからの寄与に関する補正を含めて、Ｃａｒｙ４分光光度計（Ｖａｒｉａｎ， Ｓｕｇａｒｌａｎｄ， ＴＸ）上で、Ｅ２７９ １ｍｇ／ｍＬ＝１．２５を用いて、１ｃｍキュベット中でのＵＶ吸収によって、標識されたＮＧＡＬの濃度を測定した。ＡＬＥＸＡＦｌｕｏｒ４８８からの寄与に関する補正を含めて、Ｅ２７９ １ｍｇ／ｍＬ＝１．５０を用いて、１ｃｍキュベット中でのＵＶ吸収によって、標識されたｍＡｂの濃度を測定した。
製造業者によって提供された指示書に従って、標識されたタンパク質の標識手法及び濃度測定を行った。
平衡解離定数の測定
直接的結合実験において、ＮＧＡＬ及び６つの抗ＮＧＡＬ抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。１５の試料の系列で、ｐＭからμＭ以下の範囲まで、ＢＨＱ−ＮＧＡＬ濃度を増分で増加させながら、ＡＬＥＸＡ４８８−ｍＡｂを一定の濃度（０．０５ｎＭ）に保った。３０分の温置後、ＳＬＭ８１００光子計数分光蛍光光度計上で全ての試料を測定した。４８０ｎｍで試料を励起し、５３０ｎｍ（３０ｎｍのバンド幅）干渉フィルター（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．， Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ， ＶＴ）を通じて、発光を収集した。全ての結合測定は、０．１５ＭｎａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で行った。
ＡＬＥＸＡ４８８標識された抗体（ｍＡｂ２３２２、ｍＡｂ８０９、ｍＡｂ２６９、ｍＡｂ１８１及びｍＡｂ９０３）の蛍光発光は、ＢＨＱ標識されたＮＧＡＬに結合すると、２５から４０％消光されることが見出された。残念ながら、ＡＬＥＸＡ４８８−ｍＡｂ４１９へのＢＨＱ−ＮＧＡＬの結合は、抗体蛍光を１０％未満消光し、このため、その滴定を正確に定量することが不可能であった。従って、ｍＡｂ４１９に対する解離定数は、測定されなかった。
蛍光強度の変化がＢＨＱ−ＮＧＡＬに結合された抗体の割合に正比例すると仮定すると、リガンドが結合していない（又は遊離の）ＢＨＱ−ＮＧＡＬの濃度は、以下の式［３］から計算することができる。
Figure 0005746861
 （リガンド総及びＡＢＳ総は、それぞれ、ＢＨＱ−ＮＧＡＬ濃度及び総抗体結合部位であり、Ｆ結合は結合された抗体部位の割合である。）。式［４］に従って、平衡解離定数（ＫＤ）を得るために、結合データを単純な結合モデルとフィッティングさせた。
Figure 0005746861
図２０は、抗ＮＧＡＬｍＡｂ及びＮＧＡＬの結合曲線を示し、抗ＮＧＡＬｍＡｂに対する計算された平衡解離定数（ＫＤ）が表１２に列記されている。
Figure 0005746861
表１２中の測定された値は全て、ＮＧＡＬへの高い親和性を示唆する。
サンドイッチ形成に対する抗ＮＧＡＬ抗体の評価
二重色蛍光交差相関分光法（ＤＣ−ＦＣＣＳ；ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて、６つの抗ＮＧＡＬｍＡｂに対して、２つの抗体及びヒトＮＧＡＬからなる複合体（以下、サンドイッチと称する。）を形成する能力を評価した。
ＤＣ−ＦＣＣＳの概念は、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：５７４０−５７４７ （１９９４）」に記載されているように、Ｅｉｇｅｎ及びＲｉｇｌｅｒによって定式化された。交差相関曲線は、２つの異なる発光波長に対して最適化された２つの光学チャンネル中で測定されたシグナルの時間的相関によって計算される。関心を有する２つの分子種に２つの異なる蛍光標識をタグ付加すると、分子複合体のみが、両チャンネル中で同時に検出することができる。これは、溶液中の分子複合体の濃度に比例する交差相関プロットの規模をもたらす。ＤＣ−ＦＣＣＳは、実際上、あらゆるサイズの分子に適用することができる。従って、ＤＣ−ＦＣＣＳは、自動相関機能分析を用いてこれらの種を分割するために、遊離の種及び結合された種の拡散係数の少なくとも２倍の差が存在する必要性によって制約を受ける伝統的な蛍光相関分光法（ＦＣＳ）の能力を拡張する（Ｍｅｓｅｔｈ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．， ７６：１６１９−３１ （１９９９）参照）。
ＤＣ−ＦＣＣＳの最初の実験的な実践は、異なる蛍光色素で標識された２つの一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の研究において達成された（Ｓｃｈｗｉｌｌｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．， ７２：１８７８−８６（１９９７）参照）。計算された交差相関曲線の大きさが形成された二本鎖ＤＮＡ複合体の量に依存するように、蛍光標識された各一本鎖ＤＮＡを別個のチャンネル中で独立にモニターした。その後、ＤＣ−ＦＣＣＳは、幾つかのＤＮＡプロセッシング酵素の活性を研究するために（Ｃｏｌｌｉｎｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３３：ｅ１６５（２００５）， Ｋｅｔｔｌｉｎｇ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９５：１４１６−２０（１９９８）及びＲａｒｂａｃｈ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２４：１０４−１１６（２００１）参照）、特異的なＤＮＡ配列を検出するために（Ｂｅｒｌａｎｄ， Ｋ．Ｍ．， Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １０８：１２７−１３６（２００４）参照）及びタンパク質への２つのＤＮＡ二重鎖の同時結合を性質決定するために（Ｒｉｐｐｅ， Ｋ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３９：２１３１−２１３９（２０００）参照）使用された。ＤＮＡ研究の他に、タンパク質−タンパク質相互作用の定量的性質決定に対して、ＤＣ−ＦＣＣＳを応用することが提案されている（Ｓｃｈｗｉｌｌｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ７７２：１８７８−１８８６（１９９７）及びＷｅｉｄｅｍａｎｎ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３：４９−６１（２００２）参照）。
ＤＣ−ＦＣＣＳ装置及びデータ解析
倒立ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴＥ３００蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｋａｎａｇａｗａ， Ｊａｐａｎ）が一体化された二重チャンネル蛍光相関分光測定装置ＡＬＢＡ（ＩＳＳ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＬ）を用いて、ＤＣ−ＦＣＣＳ実験を行った。
５Ｗ Ｍｉｌｌｅｎｎｉａ ＶＩ（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）を用いて拍動される、モードがロックされたＴｓｕｎａｍｉ Ｔｉｔａｎｉｕｍ−Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザーを、二光子励起光源として使用した。Ｔｓｕｎａｍｉは、１００ｆ秒パルス幅を用いて８０ＭＨｚで作動し、７００ｎｍと１０００ｎｍの間で整調可能である。レーザー光線は、ＮｉｋｏｎＰｌａｎＡｐｏ６０Ｘ／１．２Ｗ対物レンズの背部開口部を過充填して、回折限界の局所スポットを作製するために、６５０から１００００ｎｍ領域に対して被覆されたＨｉｇｈ Ｌａｓｅｒ Ｂｅａｍ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＨＢ−４Ｘ−ＡＲ．１６（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）を用いて、レーザー光線が拡大される。
試料へ励起光線を、及び発光蛍光を検出装置に誘導するために、二色性鏡（７００ＤＣＳＰＸＲ， Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．， Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ， ＶＴ）が顕微鏡中に取り付けられている。さらに、励起光の全ての漏れをさらに低下させるために、検出装置の前に、バンドパスフィルター（Ｅ７００ｓｐ−２ｐ， Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が配置されている。
検出ボックス（Ａｌｂａ ｂｏｘ）は、垂直に併置された、５０未満のダークカウント／秒を有する２つのＳＰＣＭ−ＡＱＲ−１５−ＳｉＡＰＤＳｉｎｇｌｅ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ．， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）からなる。ＤＣ−ＦＣＣＳ測定を行うときには、さらなる二色性の鏡Ｑ５６５１ｐ及び２つのバンドパスフィルターＨＱ５３５／５０、ＨＱ６４５／７５（全てＣｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、検出装置の前の光の通路に配置した。
ＩＳＳによって開発された特有のＦＣＳデータ獲得カード（ＩＳＳ，Ｃｈａｍｐａｇｎｅ， ＩＬ）は、さらなる分析又は悪いデータ点の除去のために使用することができる全ての生データを保存する。カードの他の特徴には、２つのチャンネルから別個に得られるデータを同時に保存し、最短４０ナノ秒（ｎｓ）又は最長１．３ミリ秒（ｍｓ）のデータを収集する能力が含まれる。
ローダミン１１０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）の分析的に調製された３５ｎＭ溶液を用いて、励起容積のサイズを較正した。ＦＣＳデータから計算された自己相関曲線を、単一成分モデル及び２７０μｍ２／秒に等しいローダミン１１０拡散係数を用いてフィッティングした。典型的には、得られたω値及びＺ０／ω比は、それぞれ、０．３μｍ及び４であった。
自己相関曲線を計算するために、強度自己相関関数を使用するＶｉｓｔａＦＣＳソフトウェア（ＩＳＳ）を用いて、ＤＣ−ＦＣＣＳデータを処理した。
９６マイクロウェル光学底プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）中に、試料を配置した。試料に対して８１０ｎｍ、３ｍＷに、励起波長を設定した。試料採取速度を２００ＫＨｚに設定し、各測定のために１，０００万の点を収集した。各試料は、二回測定した。１時間の温置後、各試料に対して実験を行った。
各抗体対において、一方の抗体は緑の蛍光色素（ＡＬＥＸＡ４８８）で標識し、他の抗体は赤色の蛍光色素（ＴｅｘａｓＲｅｄ）で標識した。標識された抗体を等濃度で（１０ｎＭｍＡｂの４０μＬ）混合し、リガンド（１５ｎＭＮＧＡＬ）を溶液に添加した。ＮＧＡＬを添加する前及び後に、交差相関曲線を各チャンネル中に獲得されたデータの組から計算し、データを標準化した。
２つのチャンネルｉ及びｊに対して、標準化された蛍光交差相関関数ＧＸ（τ）は、式［５］において、以下に定義されている。
Figure 0005746861
 （観察された蛍光Ｆ１（ｔ）と平均蛍光値＜Ｆ１＞の差デルタＦ１（ｔ）は、時間ｔの関数としてチャンネルｉ内の蛍光強度の変動を表す：デルタＦｉ（ｔ）＝Ｆｉ（ｔ）−＜Ｆｉ＞。減衰時間τ＝０において、Ｇ（０）の外挿された値は、自己又は交差相関関数の大きさを反映する。
ＤＣ−ＦＣＣＳ実験の結果
図２１は、ＮＧＡＬの添加前及び添加後に、３つの抗体対［（Ａ）ｍＡｂ２３２２及びｍＡｂ９０３；（Ｂ）ｍＡｂ２３２２及びｍＡｂ８０９；（Ｃ）ｍＡｂ８０９及びｍＡｂ１８１）］の交差相関曲線の例を示す。交差相関曲線の大きさは、形成された抗体サンドイッチの濃度に比例する。従って、交差相関曲線及びＧｘ（０）値の大きさの大きな増加は、生産的なサンドイッチ形成を示唆する。
例示のために、実際、抗体にＮＧＡＬを添加する前及び後のＧｘ（０）値の比である各抗体対に相対的な数を割り当てた（表１３）。全ての比の値は、バックグラウンドに対して補正した。「１」の値は、サンドイッチが形成されないことを示し、１．１と２．５の間の値は不良なサンドイッチ形成を示し、２．６を上回る全ての値は、生産的な抗体対形成を示す。
下表１３は、各抗体対にＮＧＡＬを添加する前及び後に、Ｇｘ（０）の比の値（補正されたバックグラウンド）を示す。
Figure 0005746861
表１３から明らかなように、ＤＣ−ＦＣＣＳ実験の結果は、前述されているＮＭＲの擾乱とよく一致する。すなわち、ｍＡｂ２３２２及びエピトープ群１から得られる他の抗体（例えば、ｍＡｂ１８１、ｍＡｂ２６９及びｍＡｂ８０９）は、ｍＡｂ９０３（エピトープ群２）と効果的にサンドイッチを作製する。これに対して、ｍＡｂ４１９（エピトープ群３）は、群１又は群２の何れかから得られた抗体とのサンドイッチ形成において効果的でない。
ＡＴＣＣ寄託情報
２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号（ＮＧＡＬ抗原に関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）に記載されているように、野生型ＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ６６２細胞株は、２００６年１１月２１日に、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０を与えられ、変異体ＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯＣ８７Ｓ細胞株（ＣＨＯ細胞クローン＃７３４（変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ７３４としても知られる。））は、２００７年１月２３日に、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８を与えられた。
マウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０及び１−２３２２−４５５は、２００６年１１月２１日に、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ）にそれぞれ寄託された。細胞株１−９０３−４３０には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６が割り当てられた。細胞株１−２３２２−４５５には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４が割り当てられた。
当業者に容易に理解されるように、本発明は目的を実施し、記載されている結果及び利点を得ると共に、それらに内在する結果及び利点を得るために好適である。本明細書に記載されている分子複合体及び方法、手順、処置、分子、具体的化合物は好ましい実施形態の本明細書における代表例であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者に容易に理解されるように、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示されている本発明に種々の置換及び変更を加えることができる。
本明細書に引用した全ての特許及び公報は、本発明が属する分野の当業者の技術水準を示唆するものである。全ての特許及び公報は、個別の各公報が参照により具体的且つ個別に取り込まれると記されているのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。特に、本開示と同時出願された以下の２つの米国特許出願、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号及び２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号の全体が、参照により組み込まれる。
本明細書に具体的に記載する本発明は、本明細書に具体的に開示しない要素、限定の不在下で適切に実施され得る。従って、例えば、本明細書の各事例において、「〜を含む」、「〜から本質的に構成される」及び「から構成される」という用語は何れも、相互に置き換えることができる。利用した用語及び表現は、限定ではなく、説明として使用されており、このような用語及び表現の使用において、表示及び記載されている特徴又はその部分の等価物を除外することを意図するものではなく、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲内で、種々の変更が可能であるとみなされる。従って、本発明は好ましい実施形態及び非必須の特徴によって具体的に開示されているが、当然のことながら本明細書に開示されている概念の変更及び変形が当業者によって採用することができ、並びにこのような変更及び変形は、添付の特許請求の範囲に定義するような本発明の範囲に含むものとみなす。さらに、「定義」においてある種の用語が定義されており、「詳細な説明」の他の箇所で別段の定義、記載又は論述が為されている場合には、このような定義、記載及び論述は全て、このような用語に帰するものと理解しなければならない。また、このような用語及び表現の使用に際して、表示及び記載されている特徴又はその部分の等価物を除外することを意図するものではない。さらに、小見出し（例えば、「定義」）が「詳細な説明」において使用されているが、このような使用は、参照を容易にするためのものに過ぎず、ある見出し内に行われた何れかの開示をその見出しのみに限定することを意図するものではない。むしろ、１つの小見出しの下に為されたあらゆる開示は、それぞれのあらゆる他の小見出し下の開示を構成するものとする。

Claims (9)

  1. 配列番号１、２、３０又は３３に記載のヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する単離抗体であって、
    （ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）重鎖１；配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖２；及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖３を含む可変重鎖、並びに
    （ｉｉ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖１；配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖２；及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖３を含む可変軽鎖
    を有する抗体。
  2. ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する単離抗体であって、前記抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する抗体である、抗体。
  3. 前記抗体が、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、完全にヒト化された抗体、部分的にヒト化された抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合されたＦｖ又は抗イディオタイプ抗体である、請求項１又は２に記載の単離抗体。
  4. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５。
  5. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体。
  6. （ａ）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）重鎖１；配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖２；及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖３を含む可変重鎖、並びに
    （ｉｉ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖１；配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖２；及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖３を含む可変軽鎖
    を有する単離抗体；
    （ｂ）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離抗体；及び
    （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体；
    からなる群から選択される１つ又はそれ以上の抗体を含む免疫診断試薬。
  7. （ｄ）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）重鎖１；配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖２；及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖３を含む可変重鎖、並びに
    （ｉｉ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖１；配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖２；及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖３を含む可変軽鎖
    を有する単離抗体；
    （ｅ）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離抗体；及び
    （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体；
    からなる群から選択される１つ又はそれ以上の抗体を更に含む、請求項６に記載の免疫診断試薬。
  8. 配列番号１又は３３に記載のヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合する、請求項１又は２に記載の単離抗体であって、
    （ａ）残基Ｙ６４に関して、１Ｈ＝９．１５又は１５Ｎ＝１１３．３０に位置する共鳴位置；
    （ｂ）残基Ｖ８４に関して、１Ｈ＝９．３４又は１５Ｎ＝１２１．５０に位置する共鳴位置；
    （ｃ）残基Ｇ８６に関して、１Ｈ＝８．３２又は１５Ｎ＝１１１．６０に位置する共鳴位置；
    （ｄ）残基Ｔ９３に関して、１Ｈ＝９．３２又は１５Ｎ＝１１２．８０に位置する共鳴位置；
    （ｅ）残基Ｌ９４に関して、１Ｈ＝７．７１又は１５Ｎ＝１２２．７２に位置する共鳴位置；
    （ｆ）残基Ｇ９５に関して、１Ｈ＝９．３０又は１５Ｎ＝１１３．７０に位置する共鳴位置；及び
    （ｇ）残基Ｓ９９に関して、１Ｈ＝８．１８又は１５Ｎ＝１１４．５０に位置する共鳴位置；
    からなる群から選択される配列番号１又は３３の残基に対応するアミノ酸に対するアミド共鳴位置の少なくとも４つのＴＲＯＳＹプロトン−窒素相関ＮＭＲスペクトルにおいて、
    前記抗体をヒトＮＧＡＬタンパク質に添加した結果として、前記抗体が添加されていない場合と比べて、前記抗体は、
    （１）１Ｈ共鳴位置における０．０５ｐｐｍから１．０ｐｐｍまでの擾乱、
    （２）１５Ｎ共鳴位置における０．３ｐｐｍから３．０ｐｐｍまでの擾乱、又は
    （３）共鳴強度の２．５倍から２０倍の減少、
    を引き起こす、抗体。
  9. 第一抗体及び第二抗体を含むキットであって、第一抗体は、
    （ａ）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）重鎖１；配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖２；及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖３を含む可変重鎖、並びに
    （ｉｉ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖１；配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖２；及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖３を含む可変軽鎖
    を有する単離抗体；
    （ｂ）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離抗体；及び
    （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２４を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２３２２−４５５によって産生される抗体；
    からなる群より選択され、
    第二抗体は、
    （ｄ）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）重鎖１；配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖２；及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ重鎖３を含む可変重鎖、並びに
    （ｉｉ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖１；配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖２；及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ軽鎖３を含む可変軽鎖
    を有する単離抗体；
    （ｅ）ヒトＮＧＡＬタンパク質に特異的に結合し、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する単離抗体；及び
    （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−９０３−４３０によって産生される抗体；
    からなる群から選択される、キット。
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