SK86893A3 - Dimer of molecular variant of apoliprotein and processes for the production thereof - Google Patents

Description

k a v d i o v & £ k u i ár n u. o e h r a 11 u ..

Ochranná úloha lipoproteínov s vysokou hustotou ďalej nachádza silnú podporu v štúdiách in vivo, ktoré u k a z u j ú ·. ž e i n Ť ú z i e· lipoproteínov s vysokou hustotou u‘králikov môžu zabrániť vývoju arteriálneho poškodení cv v y v d i ολ π tť ho cholesterolom (Badimon a kol., Lab. Invest. 60. 435 - 461 /1989/) a/alebo vyvolávajú ústup rovnakého poškodenia íBadimon a kol.. J. Clin. Invest. 85, 1234 -1241 /1990/).

Nedávny záujem o štúdium ochranného mechanizmu alebo ochranných mechanizmov lipoproteínov s vysokou hustotou, sa sústredil na apolipoproteín Aľ (Apo AI), ktorý tvorí hlavnú zložku lipoproteínu s vysokou hustotou. Vysoké hladiny plazmy z Apo AI sú spojené so znížením rizika koronárnych srdcových chorôb a prejavmi koronárnych poškodení (Maciejko a kol., N. Engl. J. Med. 309. 385 - 389 /1983/, Sedlis a kol.. Circulation ZZ, 978 - 984 /1986/).

Plazma Apo AI je jediným polypeptidovým reťazcom 243 aminokyselín. ktorej primárna sekvencia je známa (Brewer a kol., Biochem. Biophys. Pes. Commun. 80, 623 - 630 /1978/). Apo AI sa vyrába synteticky ako prekurzor 267 aminokyseliny v bunkách. Tento pre-pro-apoliproteín je produkovaný N-terminá1nym štiepením n a j s k ô r v n ú t r o b u n e č n e, pri k t o r o m s a s t r á c a j ú 1 '8 a m 1 n o k y s e 1 i n y a potom sa ďalej štiepia 6 aminokyseliny v plazme alebo lymfe akt i v i t o u š p e c i f i c k ý c h p r o t e-:· a z .

Za hlavnú štruktúrnu podmienku Apo AI molekuly sa pokladá prítomnosť opakujúcich sa jednotiek 11 alebo 22 aminokyselín za predpokladu, že existuje amfipatická dvojzávitnicová stavba (Segrest a kol., FEBS Lett.38, 247 - 253 /1974/). Táto štruktúra umožňuje hlavné biologické aktivity Apo AI, to znamená lipidové väzby a aktiváciu cholesterolacy1transferázy lecitínom (LCAT).

Iná nedávno popísaná vlastnosť Apo AI spočíva v jeho protivírusovom účinku. Ten bol zistený zo štúdií in vitro a uplatňuje sa jednak proti kmeňom Herpes vírusu (R. V. Srinivas a kol.. Virology 4 a b z , z’ľ??ú/), tak tiež proti víru ľud s k o j imunitnej nedostatočnosti Hl V (Owe a k o 1.. J. C1 in In ves t. S.d, 1142-1150 /1990/). Tento účinok sa prejavuje vzájomnou reakciou medzi amfip a ti. c. k y m i d v o j z a v i c. 11 i c. o v y í u d. i_ o. s t am x *-i p o ŕ) I a g1 y k o p r o t e 3. n m i n a. porvchu v i rov.

Štúdie in vitro ukazujú, že komplexy Apo AI a lecitinu môžu napomáhať výtoku voľného cholesterolu z kultivovaných arteriálnych buniek hladkého svalu (Stein kol., Ciochem. Biophys. Acta 380. 106-118 /1975/). Týmto mechanizmom môžu lipoproteíny s vysokou hustotou tiež znižovať proliferáciu týchto buniek (Yoshida a kol., Exp. i'lol. Fathol. átl, 258-266 /1984/).

Nedávno sa zistilo, že infúzia Apo AI alebo lipoproteínu s vysokou hustotou podaná experimentálnym zvieratám poukazuje na signifikantné biologické zmeny, rovnako ako na zníženie rozsahu a obtiažnosti aterosklerotických poškodení. Podľa Pôvodných údajov, ktoré publikoval Maciejko a Mao íArteriosclerosis 2, 407a /1982/) a Badimon a kol., (pozri obidve vyššie citované štúdie) bolo zistené, že by sa mohol signifikantne znížiť rozsah aterosklerotického poškodenia (-45 X) a obsah cholesterolu (-58.5 X) 'j tkanive králika bohatom na cholesterol infúziou lipoproteínov s vysokou hustotou (d = 1,063 až 1,325 g/ml). Autori zmienených publikácií tiež zistili, že infúzia 1ipopproteínov s vysokou hustotou vedie k 50 7. regresii už vzniknutých poškodení.

523a /1987/), že infúzia 1ipoproteínov s vysokou hustotou môže z 1 o ž e n i e 1 i. p o p r o t e í n o v v s vrodenou h y p e r c h o 1 e s t e r o 1 é m iou, k t o r á ve d i e k vývoju vč a sn ýc h štádií arteriálneho poškodenia. Infúzie ipopretéínov s vysokou hustotou môžu viac ako zdvojnásobiť pomer medzi ochranne pôsobia cimi 1ipoproteínmi s vysokou hustotou a aterogennými lipoproteín mi s nízkou hustotou.

Schopnosť 1ipoproteínov s vysokou hustotou zabrániť ateriálnym chorobám na zvieracích modeloch ďalej podporuje pozorovanie, že Apo AI môže vyvolať fibrinolytickú aktivitu in vit.ro (Saku a kol.. Thromb. Res. 39, 1-8 /1985/). Ronneberger (Xth Int. Con

-Igr. Fharniacoi. , str. v 9 ú. bydney /1 ukazuje, že extraktívne Apq AI môže zvýšiť fibrinolýzu u psov Beagle a u opíc Cynomologus. Podobná aktivita sa môže pozorovať i vitro na ľudskej plazme. Tento autor bol schopný potvrdiť znížené ukladanie lipidov a zníženú tvorbu arterialych doštičiek u zvierat ošetrených Apo AI.

fipolipoproteín AI-Milano (A p o AI -M) je p r v ý po p isan ý mo 1ek ulárny variant ľudského Apo AI (Franceschini a kol., J.

Clin. Invest. .ώώ, 892-900 /1930/).' Tento variant je charakterizovaný náh radou Arg 1/3 za Cys /Weisgraber a kol., J. Biol. Chem. ZSS,

2508-2513 /1933/). Mutant apoproteínu je prenesený ako autozomáln y d o m i n a n t n ý z n a k a .i. d e n t i f i k o v a 1 i látky (Gualandri a kol.. Am. J.

/1934/).

sa ôsme generácie z nosnej

Hum. Genet. Z.Z, 1OS>—1097

Funkcia jednotlivej nosnej látky Apo AI-M je charakterizovaná zreteľným znížením hladiny HDL-cholesterolu. Napriek tomu, postihnutí jedinci zjavne neprejavujú žiadne zvýšené riziko arteriálneho ochorenia. 9 skutočnosti pri genealogickom vyšetrení ro diny sa ukazuje, že pacienti môžu byť chránení pred aterosklerózou.

Mechanizmus možného ochranného účinku Apo AI-M látke sa javí byť spojený s modifikáciou v štruktúre ná nosnej mu t a. n tného so stratou jednej κ-závitnice a zvýšeným obnažeJ. Biol /1935/) btrata tesnej š t r u k t ú r y n á s o b n ý c h «-závitníc vedie ku zvýšenej flexibilite molekuly, ktorá ie spo jená s väčšou pripravenosťou na reakciu s 1 ipidmi, v porovnaní s normálnym AI.. Okrem toho, komplexy apolipoproteínu s lipidom sú citlivejšie voči denaturácii, čo naznačuje, že uvoľňovanie lipidu sa tiež zlepší v prípade mutantu.

Terapeutické použitie apoproteínového Apo AI—M mutantu je v súčasnej dobe obmedzené tým, že nie je k dispozícii metóda, ktorá by umožňovala výrobu uvedených apo1 i poproteínov v dostatočnom množstve a vo vhodnej forme.

.i.iTy v e .i ιϊι i speciricky znak Apo h 1 - · M spočíva v jeho- schopnosti tvoriť sam so sebou diméry a vytvárať komplexy s Apo AII, v oboch prípadoch v dôsledku prítomnosti zvyšku Cys. Výsledky štúdií na frakciách krvi, ktoré obsahujú zmes apolipoproteínov, ukazujú, že prítomnosť dimérov a komplexov v krvnom obehu môže byť zodpovedná za zvýšenie polčasu vylučovania týchto látok na nosných ako nedávno popísal v klinických o n H uma n Apolipoprotein Mut ants:

pic Expression, Limone SG /1988/.

Diméry Apo AI-M (Apo AI-M/Apo AI-ľl) pôsobia ako inhibujúci faktor pri vzájomnej premene častíc 1ipoproteínu o vysokej hustote in vitro (Franceschini a kol., ä. Biol. Chem. 26.5, 12224-12231 /1990/).

Prv publikované štúdie zmesí obsahujúcich dimér boli založené na Apo AI-M separovanom z prirodzenej krvi osôb s Apo AI-M, ktorá bola dostupná len v malých množstvách.

F'otiaže pri produkcii Apo

AI a predovšetkým Apo

AI-M z frakcionácie plazmy sú mimoriadne vý znamné (Franceschini a kol., J /1935/)

Izolácia a produkcia sa nemôže uskutočňovať vo veľkom rner í tku pretože je dostupné len malé množstvo surového materiálu.

Okrem toho sa vyskytuje niekoľk o rizík spoje n ý c h produktami frakcionácie n a p r í k 1 a d k o n t a m i n A c i a i. n f e k c n ý m i á t k et iTl i . J e P O d S t et t Γι é , Že tLJIIIU —

Boli uskutočnené pokusy vyrábať ľudský Apo AI cestou génového inžinierstva. V európskom patentovom spise č. O 267 703 .je popísaná výroba Apo AI z Escherichia coli. Spôsob popisuje chimerické polypeptidy, kde Apo AI časť .je pripojená k dusíkatým koncovým! zvyškom aminokyseliny odvodenej od β-galaktózidázy alebo k jednému alebo väčšiemu počtu oblastí proteínu A viažucich IgG alebo k pro—sek.vencii ľudského Apo AI.

Expresia Apo AI a Apo AI-M na kvasinkových kmeňoch a použitie produkovaných komponentov pri ošetrovaní aterosk1erózy a kardiovaskulárnych chorôb je popísané v patentovej prihláške podanej pooľa zmluvy o patentovej spolupráci \F-CT) UJO 9Ú/12S79. Genesa za kódov činia Apo AI a Apo AI-M je tvorená IjlMA--sek vene i a m i kódujúcimi sekréciu stanoviteľnú u kvasiniek a spracovávajúcimi signálmi spojenými so sekvenciou proti smeru exprešie génu pre hotové proteiny. Používa sa modifikovaná MF-κ-1-vedúca sekvencia, v ktorej poslednými zvyškami sú His-Gly-5er-Leu-Asp-Lyz-Arg.

Terás sa s prekvapením zistilo. že čistený dimér Apo

AI-M/Apo AI-M má predĺžený polčas životnosti v plazme, v porovnaní k monoméru Apo AI-M a ďalej, že má zreteľne zlepšenú fibrinolýzu, ktorá celkove povzbudzuje schopnosti v porovnaní s normálnym Αρο AI, napr í k 1 ad j e sc hopný priamo aktivovať plasminogén (čo normálny Apo AI schopný nie je) a pozoruje sa, že môže bvť biologicky dôležitý a Že tiež dokáže pôsobiť ako prekurzor liečiva pre

Apo AI-M.

Táto látka tiež tvorí rekonštituovaný lipoproteín o vysokej hustote (HDL) vo forme častíc s rovnomernou veľkosťou·, ktorá sa nenachádzajú v časticiach rekombinantného 1ipoproteínu s vysokou hustotou, ktoré obsahujú Apo AI-M alebo Apo AI.

Tento vynález sa týka v podstate čistých dimérov apolipoproteínu AI-Milano, ktoré sa ďalej označujú ako Apo AI-M/Apo AI-M, s čistotou najmenej 90 X, výhodne najmenej 95 X, ktoré boli najskôr izolované a charakterizované z plazmy a ktoré sa tiež vyrábajú spôsobmi, založenými na génovom inžinierstve. Vynález sa tiež týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich Apo AI-M/Apo AI-M, poprípade spolu so stabilizačným činidlom, napríklad stabilizujúcou lipidovou zlúčeninou, ako je fosfolipid a/alebo nosnou látkou.

Farmaceutické prostriedky môžu tiež obsahovať prípravok znižujúci obsah lipidov a/alebo inú liečivú látku, ktorá je už známa pre liečbu aterosk1erózy a kardiovaskulárnych chorôb, ako je he— parin, heparinové frakcie a heparínové fragmenty alebo prípravky znižujúce obsah lipidov.

Apolipoprotem hpo Al-i-l sa môže vyrábať tým. z e sa nierstva (rekombinantnou technológiou), ako vnútrobunečnou fúziou proteínu

Escherichia co 1 i odštiepi sa apolipoproteín

AI - M i 1 a n o p ô s o b e n í m k y s e 1 i n y mravčej a potom sa prevedie ľubovoľn y p r í t o m n ý m o n o m é r na ci i m é r alebo

b) vyrobí apolipoproteín AI-Milano metódou génového inžinierstva írekombinantnou technológiou), pri ktorej sa apolipoproteín AI-Milano, monomér a dimér vylučujú do bakteriálneho kultivovaného prostredia v expresnom systéme v Escherichia coli a ľubovoľný prítomný monomér sa potom prevedie na dimér a čistí dimér na v podstate čistú formu.

vnútrobunečne v baktérii.

Apo ΑΙ-ΙΊ vyrába

Účastníkom fúzie formou fúzie proteínu je modifikovaný IgG viažúci. oblasť proteínu A, a štiepiace miesto pre kyselinu mrav čiu je navrhnuté medzi účastníkom fúzie a Apo AI-ľl. F'q lýze baktérie sa proteín získaný fúziou čistí na imobi1izovanom

I gG a od štiepi sa pôsobením kyseliny mravčej

Pri t. o m n o s ť Apo AI

M a dimé ru sa preukáže technickým spôsobom

Western analýzou na škvrne alebo SDS gólovou elektroforézou.

v príklade 3 je ukázané, že vyrobený Apo AI-M by sa mohol vyrábať rekombinantnou Escherichia coli a že sa tvoria diméry. Avšak použitie kyseliny mravčej vedie k produktu obmedzenému ovoma aminokyselinami na svojich koncových atómoch dusíka. 1 oto obmedzenie nepredpokladá zmenu aktivity Apo AI-M molekuly.

Systém popísaný pod b) je uvedený v príklade 4, v ktorom sa tvorí úplná presná molekula.

Chránený dimér sa môže tiež získať tým spôsobom.

že Sci plazma z apolipoproteínu AI-Milano na nosnej látsa HDL_ anol ipoproteíny, oddelí sa dimér za použitia chromatografie, napríklad chromatografické metódy Sephacryl chroí ϊί a o ‘-i r ä - n y , v n i e i< o .Ľ k y c h k r o k o c n alebo

d) zachytí plazma z apelipoproteínu AI-Mi lano na nosnej látke, čistý m o n orné r sa potom prevedie na dimér a čistý dimer na v podstate čistú formu.

< j e lI o 1 e ž 11 e. z e d e 1 e ι11 e

R O P 1 » eň Π í?

pod c) sa uskutočňuje v n i e i···', o l·

C i i S Ľ. U P i i lj U i i a v' y i i O d i i e na d i hum stí po i, napriklaú <_m.

Hokiaľ je pritoiuny moiiomér.

mal by Sc\ v Z by diméru, ako je uvedené v príkladoch popísaných ďalej.

Tento vynález zahrňuje spôsob ošetrovania aterosk1erózy a kardiovaskulárnych chorôb a ďalej použitie diméru pre výrobu liečiva. Dimér môže tiež pôsobiť ako prekurzor liečiva s monométoíti pre ošetrovanie aterosk 1 erózy a kardiovaskulárnych chorôb.

Toto liečivo sa môže používať pre ošetrovanie aterosk1erózy a kardiovaskulárnych chorôb a pre prevenciu a ošetrovanie závažných kardiocirkulárnych zdravotných ťažkostí, ako je infarkt myokardu. labilná angína, akútna periférna vaskulárna oklúzia a reste nóza po koronárnej angioplastike.

Ak sa ošetrujú chronické artériá1ne stavy, vykonáva sa ošetrovanie ako koronárnych tak tiež periférnych tepien, ktoré sú charakterizované okluznou doštičkou íocclusive plaque). Diméry sa používajú pre infúzie ako také, s cieľom vyvolať odstránenie tuku z doštičiek alebo poprípade v spojitosti so zavedenými ošetreniami aterosk1erózy a kardiovaskulárnych chorôb, ako pri Použití heparínu, heparínových frakcií a heparinových fragmentov a/alebo liečivých látok znižujúcich hladiny aterogénnych 1 ipoproteínov v krvnom obehu.

Liečivo obsahujúce dimér sa môže používať pre prevenciu a □šetrovovanie trombózy pri rozličných klinických stavoch a ďalej používať pre stimuláciu fibrinolýzy.

Amfipatické štruktúry sú prítomne vo vysokom rozsahu v dimére Apo AI-M a u diméru sa preto predpokladá, že má protivírový účinok.

1	p q j.:.· i“	v y r az, p r i	P O U 2	2.1.1 t. U ľ	· O T. o	vynálezu-, r	íT: Cj 2 H	v y.....
r- á h a f	d i. m é	ľ v	podstate v	č i s	tej Ťor	- f n e ·.	to znamená	S C b S όλ Γι G ΠΊ
väeši m	ako	90 %	a výhodne.'	i ši e	V el 1 ΓΠ	a !'. o	98 A. a tie	2 je íTít	j 2 ΙΊ c?
ukázať,	Z e	ten to	produkt má	prek	v ap:iv o	lepe	í biologický	ú č. inol-	Γ1 GÍ

biologické systémy v porovnaní s Apo AI, ako dokumentujú príklady 7 až 10, ktoré sa uvádzajú ďalej v tomto popise.

___Clšä—VÍli-C.SSjC'-Cjľl

Sú pripojené ďalej uvedené obrázky:

Obr. 1 a 2 znázorňujú výťažky v závislosti od percentuálnej koncentrácie proteínu, príklad 2 ta).

Obr. 3. znázorňuje kinetiku tvorby Apo AI-M/Apo AI-M v priebehu 24 hodín, príklad 1 b2).

Obr. 4 znázorňuje syntetický spojovník (linker), príklad 2' et ) Obr. 5 znázorňuje plazmid, príklad 3a).

Obr. é? znázorňuje Western analýzu po odštiepení proteínu z f ú z i e, p r 1 k 1 ad 3d ) .

Obr.. 7 znázorňuje ultrafialové spektrum Apo AI-M/Apo AI-M, príklad 5.

Obr. 8 až 10 znázorňujú druhú deriváciu ultrafialového spektra, príklad 5.

Obr. 11 znázorňuje fluorescenčnú spektroskopiu, príklad 5.

Obr. 12 znázorňuje spektrálny cirkulárny dichroizmus (CD spektroskopiu), príklad 5.

Obr. 13 znázorňuje rekonštituované lipoproteíny s vysokou hustotou, (rHDL) obsahujúce Apo AI, Apo AI-M a Apo AI-M/Apo

AI-M, príklad 6.

L ϋ Príklad 1

Izolácia diméru s plazmy

a) Výroby apo1 i poprotei nov

Vzorky krvi sa zhromažďujú na 1 mg/ml sodnej soli kyseliny etylendiamintetraoctovej z rôznych nosných látok apolipoproteínu Apo AI-TI a plazma sa pripraví odstreďovaním za nízkej rýchlosti pri teplote 4°C. Lipoproteíny s vysokou hustotou (HDL, d = 1,063 až 1,21 g/ml) sa z plazmy izolujú nasledovným spracovaním na rýchlobežnej odstredivke (R. J. Hasvel, H. A: Eder a ď. H. Bragdon, The Distribution and Chemical Composition of U1tracentrifugally Separated Lipoproteins in Human Sérum, J. Clin. Invest.

34. 1345-1354 /1955/). v rýchlobežnej odstredivke Beckmarn

L5-50B. ktorá má rotor 50.2 Ti. Po rýchlobežnom odstredení s -frekvenciou otáčok 40 000 za minútu pri teplote 4^QC v priebehu 4S hodín sa vrchná frakcia obsahujúca lipoproteíny s vysokou hustotou zriedi v pomere 1 : 1 s 0,15 ľl chloridom súdnym a 0,01 7. súdnou soľou kyseliny ety1éndiamintetraoctovej v roztoku bromidu draselného (hodnota pH 7,4, d ~ 1,21 g/ml) a znovu sa rýchlobežne odstreďuje pri -frekvencii otáčok 40 000 za minútu pri teplote 4°C počas 48 hodín. Lipoproteíny o vysokej hustote sa dôkladne dialyzu jú oproti 5 mi-1 hydrogenuhl ičitanu amónneho a 0,01 X súdnej soli kyseliny ety1éndiamintetraoctovej s hodnotou pH 7,4, lyofi1 i z u j ú a d e .1 i p i d á t. u j ú p ď s o b e n í m d i e t y 1 é t. e r u a e t a n o 1 u v obje m o v o m pomere 3 : 1. Koncentrácia proteínu sa stanoví alebo analýzou aminokyseliny alebo spôsobom, ktorý popísal Lowry a kol. (U. H.

Lowry, N. J. Rosenbrough, A. L.. Farr, R. J. Randall. Protein Measuremeňt with the Folin Pheno1 Reagent, J. Biol. Chem. 265-275 /19510.

b) Izolácia Apo AI-M/Apo AI-M

Pre izoláciu Apo AI-M/Apo

AI-M sa HDL apo1 ipoproteíny z príkladu la) solubilizujú v 0,1 M Tris-HCl, 0,04/í súdnej soli kyseliny ety1éndiamíntetraoctovej a dus íkovodí kove j, pri hodnote pH 7,4

0,01X súdnej soli kyseliny s obsahom 6 M hydrochloridu guanid ínu <.Gdn-HCl ) - A po 11 po p r c 1 u S-300 HR (o priemere 2.6 s 0,1 M Tris-HCl ·, 0.04 X s ó dne: octovej a 0,01 X sódnej soli kys jteíny sa vnesú na stĺpec Sephacrycm a dĺžke 300 cn>) ekvi 1ibrovaný i s o 11 k y s e 1 i n y e t. y 1 é* n d i a m i n o t e t r a — se1 i n y d u s í k ov od í kovej o hod n ote pH '7,4, s obsahom 4 M hydrochloridu guanidínu. Apolipoproteíny sa eluujú rovnakým tlmivým roztokom pri rýchlosti prietoku 1,5 ml/min. a frakcie o objeme 10 ml sa zachytávajú. Spojené -frakcie obsahujúce Apo AI-ľl/Apo ΑΙ-ΙΊ sa zahustia za zníženého tlaku a opäť sa vnesú na rovnaký stĺpec.

Frakcie obsahujúce čistý Apo AI-ľl/Apo AI-M sa zachytávajú a dialyzujú oproti 5mM hydrogenuhličitanu sodného a 0,01X súdnej soli kyseliny etyléndiamíntetraoctovej s hodnotou pH 7,4 , lyofilizujú a skladujú pri teplote -20°C v 0,1 M Tris-HCl, 0,042 sódnej soli kyseliny etyléndiamíntetraoctovej a 0,012 sódnej soli f

kyseliny dusíkovodí kovej s hodnotou pH 7,4, s obsahom a M hydrochloridu guanidínu. Apo AI-M/Apo AI-M má čistotu väčšiu ako 93 2, ako sa stanovilo vysokoúčinnou vylučovacou chromatografiou (HF'SEC, high-perf ormance size-exc 1 usion chromatography ) a SDSpolyakry lamidovou gólovou elektrof orézou (SDS-PAGE) za neredukčn ý c h pod m i en o k .

Týmto spôsobom sa izoluje čistý dimér Apo AI-M z plazmy z nos n ý c h 1 á t o k.

Príklad 2

Čistenie monoméru z plazmy a jeho následné prevedenie na dimér

a) Čistenie Apo Al-ľl

Pre čistenie monoméru Apo AI-M sa HDL apolipoproteíny z príkladu la) solubilizujú v 0,1 M Tris-HCl, 0,042 sódnej soli I···. y s e 1 x n y ety' 1 é n d i a m í n t s t r a o c t o v aj a ú, ú 1Z sódnej soli k. y s e 1 i n y dusíkovodí kovej s hodnotou pH 7.4, s obsahom 6 M hydrochloridu guanidínu a lží 2-merkaptoetanolu. Po inkubácii pri teplote 37°C v priebehu 4 hodín sa redukovaný Αρο-HDL vnesie na stĺpec Sephacrylu S-200 (o priemere 2,6 cm a dĺžke 150 cm), ekvi1 ibrovaný 0,1 M Tris-HCl, 0,042 sódnej soli kyseliny etyléndiaminotetraoctovej a 0,012 sódnej soli kyseliny dusíkovodí kovej s hodnotou pH 7,4,

S C) □ í:- «Λ i“í ·□ l	ΓΓ1 4- H i l .	/drochloridu	guanidínu a ό,1	% 2—m e r k a p t o e t a n o 1 u
Apoli pop	roteiny	sa eluuiú	r o v n a k ý m 11 m i. v ý m	roztokom- pri nízko
p r i. e t o k u	1 , ú m 1,	''min a frakci	e o o b j e m e 5 m 1	s a z a c h y t á v a j ú. S P o

j e n cí? frakcie zodpuveda júce Apo AI + Apo AI—H sa dial y žujú oproti m M h y drog é n u h 1 i č i t a n u a m ó n n e h o a 0, 017. súdnej soli etyléndiamíntetraoctovej s hodnotou pH /,4 a lyofilizujú kysoliny

Apo—

1ipoproteíny sa rozpustia v 0,1

M Tris-HCl,

0,047. sodnej soli ky — se 1 i n y e t y 1 é n d i a m í n t e t r a o c t o v e j sodnej soli kyseliny dusí kovod í kove j o hodnote pH 7,4, s obsahom t- M hydrochloridu guanidínu a 1% z-merkaptoetanolu. F-o inkubácii pr.i teplote 25°C po čas 4 hodín sa 2-merkaptoetanol odstráni chromatografiou na Sephadexe G25 a apolipoproetíny sa hneď vnesú na stĺpec Thiopropy1 —Sepharózy (o priemere 1 cm a dĺžke 10 cm), ekvilibro— vaný s 0,1 M Tris-HCl, 0,04% súdnej soli kyseliny etyléndiaminotetraoctovej a 0,01% súdnej soli kyseliny dusíkovodí kovej o hodnote pH 7,4, s obsahom 4 M hydroch1oridu guanidínu. Všetko sa recirkuluje cez noc za nízkej rýchlosti prietoku 0,15 ml/min. a normálny Apo AI sa eluuje s 0,1 M Tris-HCl, 0,04% súdnej soli kyseliny ety léndiamí ntetrao.c tove j a 0,01% súdnej soli kyseliny dusíkovodí kove j s hodnotou pH 7,4, s obsahom 4 M hydrochloridu guanidínu. Apo AI sa potom eluuje rovnakým tlmivým roztokom, ktorý obsahuje 4 M hydrochloridu Frakcie obsahujúce Apo AI-1'1 sa g e n u h 1 i č i t a n u a m -ú n n e h o a 0,01 7.

guanidínu a 1% 2-merkaptoetano1u spoja, dialyzujú proti 5 mM hydro súdnej soli kyseliny etyléndiami notetraoctovej o hodnote pH 7,4 lyofilizujú a skladujú pri. tepdusí k o v o d í k o v e. j o h o d n o t e p H / . 4,

M hydrochloridu guanidínu a ď stanovilo v y s o k o ú č i n n o u v y 1 u č o v a c o u

S D S — p o 1 y a k r y 1 a m i d o v o u q á 1 o v o u elektroforézou a izoelektrickou fo kusác iou.

b) Syntéza Apo AI—Μ/Apo AI—M

Roztoky Apo Ai-M sa dialyzujú oproti 25 mM Tris-HCl tlmivého roztoku s hodnotou pH 9,0. Redukovaný Apo ΑΙ-ľl sa zriedi na požadovanú konečnú koncentráciu (3,6 až 53,6 pM) s 25 mM Tris-HCl tlmivým roztokom , ktorý obsahuje 1 až 5 mM glutatiúnu (GSH) a nechá sa preinkubäu pri teplote zb⁴C počas o minút. Oxidácia sa iniciuje pridaním O. 1 až 10.0 m M ox idov-aneho glutat iónu (GSSG) a reakcia sa nechá prebiehať v nepriepustné uzavretej trubici pri rovnakej teplote počas 24 hodín. Oxidácia sa sleduje SDS-polyakrylamidovou gólovou elektroforézou (pozri údaje uvedené vyššie?). F'o napustení farbou a odstránení vzniknutých škvŕn sa gély podrobia meraniu na laserovom mikrofotometri LKB Ultroscan XL a vypočíta sa percentuálna distribúcia jednotlivých pásov proteinov za použitia soŤtwaru LKB 2400 Gelscan XL. Oxidačná kinetika sa sleduje vysokoúčinnou vylučovacou chromatograŤiou.

S cieľom dosiahnutia optimálnej syntézy diméru sa uskutočňovali pokusy s dodatočnou oxidáciou v prítomnosti glutatiónu/oxidovaného glutatiónu + hydroxidu guanidínu a glutatiónu/oxidovaného glutatiónu + tioredoxínu (V. F. F'igiet a kol., F'roc. Natl. Acad. Sci. USA S3, 7643-7647 /1906/).

Oxidácia Apo AI-M sa uskutočňuje v uzatvorenej trubici v prítomnosti premenných koncentrácií redukovaného alebo oxidovaného glutatiónu (glutatiónu/oxidovaného glutatiónu). Výťažky diméru pri reakcii závisia ako od koncentrácie proteínu (obr. 1, tabuľka 1), tak od koncentrácie alebo pomeru glutatiónu/oxidova-

ného glutatiónu (obr.	O X- f	tabuľka	1 ) . F'r:	i. zvýšení kor	i (— tť 1 » L Γ d L 1 c
proteínu z 3,9 na	53,6	.u M sa	zvýši	percentuálny	obsah Apo
AI-M/Apo AI-M z 26 na	51	% (obr. 1	., tabuľka 1). F'okles	molárneho

pomeru glutatiónu/oxidovaného glutatiónu z 1 : 2 na 1 : 16 má za následok zníženie výťažku o 43 X. Naproti tomu zvýšenie koncentrácie glutatiónu/oxidovaného glutatiónu s konštatným molárnym pomerom glutatiónu k oxidovanému glutatiónu. je spojeené so zvýšením tvorby Apo ΑΙ-Μ/Αρο AI-M až na 42 7. (obr. 2, tabuľka 1). Ako reakčná teplota trak prítomnosť látky denaturujúcej proteín (hydrochloridu guanidínu) neovplyvňujú stupeň tvorby Apo AI-M/Apo AI-M. Signifikantná tvorba Apo AI-M/Apo AI-M sa dosiahne tiež pri inkubácii Apo AI-M s g1utatiónom/oxidovaným glutatiónom v prítomnosti 0,2 mM tioredoxínu (tabuľka 1).

Kinetika oxidačnej reakcie sa sleduje analyticky pomocou vysokoúčinnej vylučovacej chromatograŤie. Dimérne a monomérne Apo AI-M majú charakteristické Piky pri dobe retencie 10,3 a 12,7

in i n u ~ z:· ,· n t.e z a i	\ t.....h. i · , \ r.....;vj · ····) ... x.i .... j . , . i -i. « »/ n j. ii k ti < i j v-t .l LA	t c, i. j. Cj n i.A a	4 ιτι ľ‘ i o x i d o v a n e i í o
giijtatiénu, 8,9	u M k o n c e n t r á c i. a AI - M)	i e. tak po	v e cJ i a c p r i p r a v e n á
v p r i e b e h u d· h o í	á i n a predĺženie ink·	.a bác i e až	n a d o b u 2 4 h o d í n
i i e p r i f'i 8 š a ďa 1 š i e	z v y & e n i e t v o r b y h 1 — M / i	äI-M (obr.	3) .

i abuľka 1

Oxidácia Apo ΑΙ--Γ1

Frotéin pľl

Výťažok

F’O 2 Π á (Ti k a

i)

t i o r ed o x 1 n ú .2 mM

5.9 1,02,0

8.9 1,02,0 ,9 1,04,0 , 9 1,04,0 ,9 1,08,0 , 9 1 ,018,0

8,9 2,04,0

8,9 4,0S, 0

S, 9 5,0 J. 0, 0 ω co co co

9, 1

9, 9 /12

7.7

8.8

5,2

19,8

18, 7

Odn-HCl 4M

Z* b, /	2 ·. 0	4, C)	x.’í L.1 i '7
•.í.·' b ·. /	4, (j	8, 0	77,7
•fcr —,· ·_' 1 Z	5,0	10, 0	t r~.· x_ z ? z

53. 6	2.0	4, 0
5 3. 6	4. C)	9,0
	5 n 0	10,0

25, 4

30,4

6,1

KeaKCne pooniienky : i im i vy roztok: T r i s—HL J. 2 b mH

Hodnota pH: 9.0

Doba: 24 hoci í n •i c

Spósob rekombinantnej výroby Apo AI-M/Apo AI-M a ) K o i ί š t u k c i a e? p r e s n e· h o v e k t o r a p k. F·' b 4 4

Replikačná forma bakterioŤágu ľli3mpl8 obsahujúceho komplementárnu DMA 'kódujúcu pre apolipoproteín AI-M (C. R. Sharpe a kol., Nucleic Acids Research, zv. 12. č. 9, str. 3917 /1954/ a M. C. Cheung a kol., Biocheem. Biophys. Acta 960, 73-82 /1988/) sa digeruje s reštrikčným enzýmom BamHI a čistí gólovou elektroforézou na agarózé pri. nízkej teplote gélovania (LTG). Fragment 822 bp odpovedajúci, génu Apo AI-M sa e x c i. tu j e? a ligu je na plazmid pUC9, predtým digerovaný s BamHI a spracuje s teľacou intestinálnou fosfodiesterázou.

Ligačná zmes sa použije pre transformáciu príslušnej Escherichi coli. JM83 a biele kolónie sa odoberú z agarových dosiek, ktoré obsahujú ampicilín. X-Gal a izopropy1-b-D-ga1 akto z id íIF'TG). F1 azmid-DNA sa pripraví a čistí na stĺpcoch QuiaGene (QuiaGene Inc.. 9259 E ton ave, . Chatsworth, California 9:1.311, USA) podľa doporučen ia výrobcu. Derivovaný plazmid, označený ako pUC/Apo AI-M, sa digeruje ?·> r

Eco RI a Nco

A1 i. k v ó t n a č a s ť d i g e nie správnej orientácie. Iná alikvotná na syntetický spojovník λΑρο génu _ΛApo AI, obsahu júceho kven v y t v a r a polohu A s p—r r o n a k o n c o v o íľi r' i

atóme dusíka kódovaného proteínu, čo umožňuje štiepenie pôsobením

kyse 1 iny	mravčej. Príslušná Escherichia coli JM93 sa transformuje
1 i gačnou	z ΓΓi e b c u a cl e r i. v o v a ιί ý p 1. a z m i. d ( o z n a č e n ý ei k o p U C / a A p o
AI-M) sa	izoluje na stĺpcoch QuiaGene, ako je popísané vyššie.

crl

F' laz m i d p U C / a A p ó AI — M expresný vektor pEZZ sa digerujú

S tilľ.O Hl 3 iíäiTiHI . C 1 S Ľ 1 iď CielOVOU ŕlf?ktrDTQr£ZOU Hci či q ä ľ ó Z e ΡΓ1 n í z k e j teplote gélovania a 799 b p tra qmenť pUC/..Apo Al—M sa viaže k 2/63 Rp tragmentu PtptxZ. LigaCnž ľnies sa použije na transtorm ciu príslušnej Escherichia ccli ER30S a plazmid DNA sa pripraví ako je uvedene vvssie.

Údaje o experiiiientôlych spôscbocn u v ad za J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis v No1ecu1ar Clonings, A Laboratory Manual,

2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

.· í mri ,· /17 O 7 / .

Derivovaný plazmid sa označuje ako pKF’ô44 (obr. 5).

b) exPresia fúzovanho proteínu ZZ-^Apo AI-M ml kultúry Escherichia coli RV30tí/pKF644 udržiavanej cez noc pri teplote 30 °C v prostredí Luria Bertani (LB) s 50 mg/ml

k a n a m y c í n u s a n a o č	kuje dvakrát vždy s 500 ml minimálneho
P r o s t r e d i a A ( C u r r. i	Meth. v Mol. Biol.). za pridania 0,2 g/1 ca-

saminokyselíπ, 1 m M síranu horečnatého, 0,2b 7. glukózy a 50

mg/ml kanamycínu. Kt	jltúra sa inkubuje pri teplote 37’C počas 24
hodín za intenzívnehí	□ trepania.

c) Počiatočné čistenie Apo A 1-1*1 liter kultúry

Escherichia coli popísaný plazmid sa odstredí a peletované bunky sa znova dujú v 30 ml l;;Tb (25 m 1*1 Tris-HCl, 0,2 1*1 chloridu sodného a 1 m 1*1 kyseliny etyléndiamíntetraoctovej) a ó 1*1 hydrochloridu guamdinu sa homogsn i zu j ú jediným priechodom cez Frensch Press (SLM Inštrument s Inc) pri pracovnom tlaku 687 k F'a. Výsledná suspenzia sa podrobí inkubácii za laboratórne j teploty pri opatrnom trepaní po ti od- a >.j d t r ti· d i sa.

b u p e r n a t a n t sa koncentráciu hydrochloridu guanidínu 1 1*1 (to znamená šesťkrát) a vnesie sa na stĺpec 15 ml Sepahrose FastFlow I gG ekvi1ibrovaný IxTS. Po naplnení sa stĺpec premyje lxTS-o objeme zodpovedajúcom päťnásobku objemu stĺpca a

PO 'tu ΓΠ S či

Premýva 20 m 1*1 octanu amónneho o h o d n o t e pH 5,4.

pokým hodnota pH eluátu nedosiahne hodnotu

5.4..

N a v i a z a n ý m a t. e r i á 1 sa eluuje s ml 0.2 1*1 kyseliny octovej .•In v

i

1,9 mg vztiahn u t é d ) S t i e p e n i e Ť ú z o v a n é h o pr o te í n u

E. 1 u á t s a r o z d e 11 n a a i i k v o t i i e

S a· c*. X Π E·. Ll bujú pri teplote 37° C počas hodín a potom sa lyofilizujú, aby

J.

sa odstránila kyselina mravčia

F r od u k ty štiepenia sa hodnotia z či použití a b’DS- po 1 y a k ry 1 am i d ove j a potom WesF' r i b 1 i ž n e 5 m g celkového proteínu sa naplní gél pre tíDS—pclyakrylamidovú ςιό 1 ovú elektroforézu,

S až 25% za nereduktivnych podmienok

Vzorky sa spracovávajú

Jeden gél sa sfarbí farbivom Coomassie a druhý gél sa použije pre Western analýzu.

Výsledky sú uvedené na obr. ώ. Jeden zo štiepnych produktov migruje spolu. s čistým prírodným Apo AI a spôsobuje zosilnenie signálu pri Western analýze. Western ana1 ý z y s a la s k u t o č ň u j ú za p o la ž i t i a p r o t i k 1 o n n ý c h kunj ugu vaných s peroxidázou získanou

Binding

Site Ltd - , Cambridge. Veľká Británia) a zviditeľnia sa f la z o v a n é h o p r o t e í n la lamidovú gólovú elektrofc

L, o o m a s s i e (8-2 b % b % k y s e* 1 i n a rn r v

Pr í rodný

- ••x T pruh

CjVedí- i_ľ'll'l

Plocha B s Western analýza duplikátu prírodný Apo AI (Sigma), pruh pruh

50% kyselina mravčia č·'.

pruh 4: 25% kyselina mravčia. Prítomnosť pásu pri dvojnásobnej molekulovej hmotnosti Apo AI-M pri Western analýze ukazuje, Že sú prítomné diméry Apo AI—M

F ľ í k 1 a c;

F r;:? d u k c i a Apo AI-M v bioreaktoroch konstruKĽia vektorov pre priamu sekreciu apo ίίΐ—ri v perip 1 azmovom p r i e s t o r e a r a s t. o v é p r o s t r e d i. e kmene a vektory; Použité k nie n e Escherichia coli KÍ 2 sú HB1O1 ! — ., h s O ‘old-Hrtí...... ír.fcj-- i supL44, HBlúl F~, insd S2Z(rB—. mB—), supE44.

arai4. I~, galK.2·. lacYl, proA2. rspL20. xyl-5, mtl-1. recA13, íhb . mcrňí + i, mcrB<-·. , (Boyer a kol», J. Mol. Biol. 41, 4 5 ú —4 7 2 / 196 Y / ) , D H 3 a F —. F S 0 D1 a c Ĺ D M15. D ( 1 a c Z Y A—a r g F ) U16 9, recAI, endAI. gyrA. I~ , thi-I, hsdR17, (n< ~, m« + >, supE44, erlAI, ( B R L. U S A ) , R V308 D1 a c X 7 4 ·. g a 1 □ F : : IS 2 ( g a 10 F 3 G S ) , s t r A, I — ( M a u r e r a kol., J. Mol. Biol. .133, 147-161 /1930/) a BC50 xyl-7, ara-14,

T 4—R.. ľ ~ . K m e n e H B101 a D H 5 a s a p o u ž í v a j ú n a su b k 1 on ovaň i e f r a g— mentov DNA. Flazmid pUC9 (Vieira a kol.. Geme 12» 259 — 268 /1982/) sa použije pre-? subk.1 onovanie fragmentu 821 bp BamHI z komplementárnej DNA kópie ľudského Apo AI, ktorý sa získal od S. Sidoli (Miláno. Taliansko). Nukleotidová sekvencia ľudského Apo AI komplementárnej DMA sa môže získať z GenBank pod prírastkovým číslom uloženia XD2162 (Seilhammer a kol., DNA 3, 309-317 /1984/). Tento vektor sa označuje ako pKF‘575. Tiež fragment 856 bp Eco Rl-Pst I ľudského Apo AI-M DNA (cDNA kópia získaná od S. Sidoli) sa subklonu je v plazmide pUC9. Tento derivát sa označuje ako pKF‘576. F'lazmidy pKF'683 a pKF'764 sú deriváty plazmidu pTrc 99 (Amann a kol., Cene í?S, 301-313 /1988/) a pUC derivát s transpozónom (Tn903) je derivátom značkovača odolného voči kanamycínu z PUL4-K (Vieira a kol.. , Geme lj£, 239—268 /1984/ a G k a a kol. , J. Biol. 147. 217 /1981/) a transkripcie terminátorov (T1T2) bakteriofágu fd z p(JEX2 (Bressan a kol.. Nucleic Acid Res. JL5, 10056 /1987/).

Použité spôsoby

Bakteriálnee kmene sa nechajú rásť v prostredí Luria Bertani <L.B) alebo v prostredí kvasinky trypton (2xYT) s ampicilínom (Ap) v koncentrácii 50 um/ml alebo kanamycínom (Km) v koncentrácii 70 pm/ml pre prípravu plazmidu DNA a pre expresnú analýzu malého rozsahu (Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press .·· ,ι. 7 ·:::· ; z .· i '··, i S V. i .'i. P u.i- O LA Γιο. 3 ·~·ί 3 i C.> v <-· j DwľG \ *..· i. i'CO·. U c:, í-s .·' ·. □ O P 1 ľ : C-Γί 3 uni/rni amp ic i 1 í nu alebo 7\.> um/ml kanamyc i n u sa použije pre rast b u n i. e k rt ď a g a r n v y (ľ h d cj s k a c h - F' o s t u p u j e s a c e c in n j. c k y í n s p ó s o b o m -i e nového inžinierstva ( rekombinan t n y mi b M A technikami). podľa úcia.....

jov, ktoré u v i e? d o 1 S a cri b r o o k a k o .1. , C, o 1 d S p r i. n q H a i· b i j r od firiem Boehringer Mannheim (SRN)

x.> , Ugh / aleoo Fharma tozid (IF'TG) sa získa od firmy Sigma (USA). Pri izolácii DNA fragmentov sa používa agaróza s nízkou teplotou gél ovaňia a topenia (NuSieve GTG. FMC Bioproducts, USA). PCR rozšírenie (amplifi kácia) sa uskutočňuje za použitia DNA tepelného cyklovača a Tag

DNA polymerázy od firmy Perkin-Elmer/Cetus Instruments (Norwalk, USA). 01igonuk1eotidové spojovníky a primery sa syntetizujú na zariadení Fharmacia-LKB Gene Assembler Plus od firmy Pharmacia ÍUppsala, Švédsko) za požitia triesteru kyseliny fosforitej v pevnej fáze. Stanovenie nuk1eotidových sekvencií sa uskutočňuje na systéme Applied Biosystem 373A DNA za použitia zariadenia Tag D y eDeoxy™ Terminátor Cycle Seouencing Kit od firmy Applied D.losy s tern (USA).

Používané DNA počítačové programy

Program Maclntosh F'lasmidAR i IST ( verzia 1,2) (Clontech, USA), ktorý . sa používa pre znázornenie plazmidových máp, a GCG e g u e n c e h n a 1 y s s p í. j r L w a r e r u k a g c* v t j í i e t i c s U u m n u t s r 0 ? o u p , Inc., Madison, Wisconsin, USA), ktorý sa používa pre riadenie DNA sekvenc i í na digitálnych počítačoch VAX.

Konštrukcia.

f-OITlOCuU e x p ľ e s i a a s e k r e u .1 a h po m i í* I v b d k t e r i a c n konštrukcií vektorov sa získa produkčný sek rečný systém pre

Apo AI-M v veľmi vysokou úrovňou

Apo AI—M segregovaného do rastového

Prostredia.

Obidva ol igonuk leotidy sa syntetizujú, pre fúziu Apo AI a Apo Ai-M komplementárnych DNA kópií na DNA fragmenty zakódujúce sekvencie bakteriálneho signálu. 14 bp Eco RI a Nco I fragment a 40 bp Nco I fragment pKF'575 sa nahradí syntetickým fragmentom 37 bp ilco 1 g .i. a z m .i. d e o z n a C e π o ι ϊί ď k o p k p b a u

i.

> .

I'..

pKF'631 je konštruovaný náhradou 702 b p Nco

I - Dra III fragmentu •L sa d o i 'i I u I ra.

t a c.....p r o m ó t o r b P Ml_LJ a H i d J.

III pKP 576 fragment 820 bp Ebs

I plazmidového vekto í ! t a c ) . d e r i. y a l si g n a i n e. j s e k v e n c i e ompA, dva terminábory prepisu (transkripcie) a značkovač odolný voči kanamycínu.

Fragment 1501 bp Nru I izoluje

PKF682 a zavedie do pod d bn é h o v e k t o r a že sa Ptac nahradí promótorom sa označuje ako pKF’68

PIa s m i d pkF'764 je konštruovaný náhradou

Hind III pkF’683 za 14 bp syntetický DNA fragment.

ktorý obsahuje si Inejšie terminátory translácie a rozrušuje miesto

Dra III aveden í m žitých c o1 i sa

III presahujúcom koniec 3 irans-formácia Esche us ku točň u je ak o p op í sa1 S & m brook

H a r b c· r L a b c r a t o r y F' r e s s /1989/. K o n š t r u k c i e pre expresiu pri pokusoch a pre výrobu Apo plazmidov pouAI-M sa ana 1 y z u j ú p o u ž i t í m r e š t r i k č n é h o e n z ý m o v é h o m a p o v a n i a gén Apo AI~ľl sa potvrdí stanovením nuk 1 eo t i dny c h sek venci í. Kmene

Escherichia coli s príslušnými plazmidmi použitými, pre rast v bi □reaktoroch sa pripravujú ako je uvedené ďalej. Bunky sa nechajú ij J.

t. r y p t o i i o o p .1. n s n o m k a n a m y c i n o m

')⁰ C - F' o o d s t r e d e n í bunky znova suspendujú v Polovičnom objeme /1979?

ktoré uviedol bergen a kol. v Nucleic A<

f

115

Alikvótne časti sa discergujú vo fľaštičkách pre sklado

Cl za mrazu o objeme 1 ml a skladujú pri teplote -75°C až do

Rastové prostredia pre rast buniek v bioreaktoroch g/1 try ptonu traktu g/1 chloridu sodného a 0.05 g/1 kanamycínu.

,k

0,05 g/1 kanamyci nu g / 1 h e p t a h yd rá tu síran u ho reč n a té ho a 0,07 g/1 h y drochloridu tiamínu a ďalej sa pridá 1 .ml/1 roztoku prvkov prvkov a 0,65 rn 1/1 r o z t o k u v i t a m í n o v . R o z t o k sto p o v ý c h hexahydrátu chloridu železitého heptahvdrátu síranu zinočnatého. / g/1 hexahydrátu chloridu ko mo1ybdenanu sodného,

S g/1 pentahyd rá tu síranu meďnat é ho

9/1 g/1 tetrahydrátu síranu manganatého, 11 g/1 dihydrátu chloridu vápenatého a 50 ml/1 kyseliny chlorovodíkovej. Roztok vitamínov obsahu je 0,5 g/1 pantotenátu vápenatého, 0,5 g/1 oholínchloridu

c.·

0, listovej, i g/1 inositolu, 0,5 g/1 nikotínamidu.

0, g/1 hydrochloridu pyridoxínu, 0,05 g/1 riboflavínu a 0, g/1 h y d r o c h 1 o r i. d u t i a m í n u. A k o p r o s t r i e d o k.

zabraňujúci peneniu množstve 0 e to potrebné, počas kultivácie sa môže p r o s t r i e d k u z a b r a rt u j ú c e h o p e n e n i u

Kultivácia Escherichia coli RV308/pKF'633 v b i o reaktor e s objemom

3,5 litrov

Fre naočkovanie 500 ml prostredia A sa použije zásobná kultúra a prekultivácia sa uskutočňuje v 2-litrovej Er počas S až 10 hodín. Naočkovaný objem n é h o o b j e m u b i o r e a k t. o r a s a b i. o r e a k t o r a. K u 11 i v á c i a s a o objem

P r a c q v n ý m o b j e m o m litro

Teplota sa udržiava ipred pri. v e d e n í m a po to m sa zvysi na

37^GC. Hodnota pH sa udržuje 7,0 pomocou 25% roztoku amoniaku.

Intn z i t a p ľ e v z d u s rt o v a n i a (a e ľ a c i a i sa zaisťuje n a •rf úrovni 1

V Vili a tlak rozpusteného kyslíka ÍD.O.T.) sa udržuje 30%, úpravou rýchlosti rýc hl obežného miešadl a. F o tom, a k. o sa spotrebuje počiatočné množstvo glukózy, uvedie sa do chodu glukozová fermentá cia fed-batch, udržiavajúca systém limitácie g1ukózy dávkovaním

60% roztoku glukózy. Počiatočná rýchlosť dávkovania 0,04 g/min sa udržuje počas 3 hodín a potom sa postupne zvýši na 0,4 g/min v priebehu 3 hustoty í OD).

hodín. Rast bunieek sa sleduje stanovením optickej Koncentrácia Apo ΑΙ-ΙΊ v s u Perná t an t e sa stanoví rásl oioirnuno1ogiukym stanovením ( A u u .1 i po p rote í n A í RIA 100 k i t, výrobok číslo 10915:,:1--01. Kabi F'harmacia hodinách kul tivácie pri optické j hustote 58X sa syntéza proteínu indukuje prídavkom 0,5 ml·! izopropy1-b-D-qa1aktozidu a teplota sa zvýši na /’C. Po 4 hodinách od začiatku indukovania činí koncentrácia

Apo hod ináč h q/ 1

Kultivácia E<C50/pKF'764 v bioreaktore s objemom 3,5 itrov

Kultivácia sa uskutočňuje ako je popísané vyššie s tým rozdielom, že sa do prostredia v bioreaktore nepridá kanamycin. F‘o hodinách, pri optickej hustote

60,

S či vnesie izopropy1-b-D-galaktozid ά nastane zvýšenie teploty. 0 hod í n neskôr je koncentrácia Apo ΑΙ-Μ v supernatante 3,7 g/1 a po hodinách po vyvolaní indukcie zodpovedá koncentrácia 4,4

9/1 .

Kultivácia EC50/pKF'764 v bioreaktore s objemom 300 litrov

Použije sa bioreaktor s objemom 300 litrov (Chemoferm AB, Švédsko) s pracovným objemom 180 litrov. Inokulum sa pripraví ako .je popísané vyššie pre rast RV308/pKF'683 v bioreaktore s objemom

3,5 litra s tým rozdielom, že doba prekultivácie za trepania v banke činí 14 hodín. Inokulum sa prenesie do 50-litrového nása dového bioreakotra s pracovným objemom trepacej banke je prostredie

Prostredie pre násadový bioreaktor a udržuje pri teplote 30°C. Hodnota pH sa

P rev z d ušňovan i e s a u s k u t o č ή u j e a k o je popísané v bioreaktore s objemom pričom tlak rozpusteného kys1 í k a nie je nikdy nižší .·· I

Keď sa kultúra kú hustotu 4, obsah násadového aktora s objemom 300 litrov. V tomto bioreaktore je teplota, bodri ota pH a prevzdušňovanie rovnaké, ako je popísané vyššie pre rast RV3ÚS/pKF'683 v bioreaktore s objemom 3,5 litrov. Pred indukciou sa tlak rozpusteného kyslíka udržuje na hodnote 30Z alebo vyššej zvyšovaním rýchlosti rých1 obežného miešadla až na jeho ma ;;ίιι-ιυιπ a potom sa zvysi tlak vzduchu. Po indukcii sa tlak vzduchu zvýši na 200 kPa, čim sa dosiahne tlak rozpusteného kyslíka 15 až 202. F'o 16 hodinách kultivácie v bioreaktore. ak kultúra má optickú hustotu 51. sa pridá izopropy1-b-D-galaktozid a teplota sa zvýši na 37°C.

r;

AI-ľl ako monoméru a diméru č in í 1 q z' 1 za hodín po indukcii a nasledujúcej hodiny.

k eď sa bi o r e a k tor chladí, koncentrácia Apo

Celé množstvo monoméru sa prevedie na dimér a ten sa čistí podľa obvyyklého spôsobu.

Príklad 5

Charakterizácia Apo ΑΙ-Μ/Αρο Al-M z plazmy

Vyčistený Apo AI-M/Apo AI-M z príkladu 1 poskytne jediný pás v preplnených neredukovaných géloch pri SDS-polyakrylamidovej gólovej elektroforéze. Pri analytickej SDS-polyakrylamidovej gólovej elektroforéze činí podľa očakávania zdanlivá relatívna hmotnosť proteinu 56 kD. Apo ΑΙ-ΙΊ/Αρο AI-M vykazuje komplexný charakteristický rys izoformy, ktorý je charakterizovaný prítomnosťou najmenej 6 rozdielnych proteínových pásov v rozmedzí izoelektrického bodu od 5,3 do 5,6 (pl) v neredukovaných denaturovaných IEF géloch.

1,1 mg/1 Apo .AI-M/Apo AI-M v ultrafialovom spektre prejavuje typické maximum absorbancie pri vlnovej dĺžke 280 nm, s posunom pri 290,2 nm íobr. 7). Vypočítaná E hodnota proteinu (1 cm, 12) pri vlnovej dĺžke 280 nm činí 16.9. Pre vyhodnotenie expozície tyroz í nových zvyškov v Apo AI-M/Apo AI-M sa vykoná sekundárna derivačná analýza ultrafialového spektra, ako popísal R. Ragone a kol. v Determination oť Tyrosine Exposure in Proteins by Second-derivative Spectroscopy, Biocnemistry 23. 1572—16/5 /1984/. Sekundárnee derivácie ultrafialového spektra obvykle vykazujú 2 maximálne hodnoty sústredené okolo 2S3 a 290,5 nm a 2 maximálne hodnoty sústredené· okolo 287 a 295 nm (obr. 8 až 10). Relatívny stupeň expozície (a) tyrozínu, vypočítaný pre prírodný Apo AI-M/Apo AI-M a Apo AI-M/Apo AI—M + DMPC (dimyristoylfosfatidylcholín), činí 0,75 a 0,49 (tabuľka 2).

i c< Lí U i k '--¹·

Charakteristiky Apo AI--1-1/A po AI-M proteínu

Apo AI-M/

Apo AI-H

Apo AI-M/

A po Hl r i -t- Dl Ί F’ L

Γ1 o 1 e k u 1 o v á h m o t n o s ť I z o e i e k t. ľ i c k ý b o d	( k. r.i)	3 6, U 5.3 - 5.61
U v s p e k t r o s k o p i a: E (1 cm. 1 Z)		16.92
Expozícia tyrozínu í ix ) Fluorescenčná spektroskopia:	0,752	0,49:
Exc vlnová dĺžka max	(nm)	280	280
Em vlnová dĺžka max	(nm)	344	3 3 8
CD spektroskopia:
(x - z á v i t n i c a Z		cr U x. 1 j— ™ 57,8*	66 - 1

¹ najmenej 6 izQŤoriem v denaturovaných IEF géloch vy so k á hodnota u k a x u i e na zvýšenú expozíciu tyrozínu ³ koncentrácia proteínu 0,1 m g/ml * k o n c t? n t r á c i a p r- o t o í n u 1.1 mg / m 1

Zaznamenáva sa ako excitácia, tak emisia -fluorescenčného spektra Apo AI~ľi/Apo AI—M v koncentrácii 0,1 mg/ml. Maximum vlnovej dĺžky pri excitácii tryptofanylovych rezíduí v Apo AI-M/Apo AI-M je pri 2S0 nm a nemení sa ďalším uvedením do styku s d imy r istoy 1 f osfatidy 1 chol inom. Emisné spektrum (excitácia pri. 2S0 nm) vykazuje maximum pri vlnovej dĺžke 344 nm (obr. 11). Uvedením do styku s dimyristolyfosfatidylcholinom vyvoláva posun smerom k modrej od tohoto maxima (33S nm), spojený s 24 X zvýšením intenzity fluorescencie pri maxime (obr. 11).

Spektrum Apo AI-M/Apo AI-M ďalekej ultrafialovej oblasti cirkulárneho dichroizmu je charakterizované typickými minimami pri 20S r, m o

maximom okolo nm (obr, 12). Obsah α-závitnice sa do 1.1 mq/ml (obr. 1

?) ) .

Uvedenie Apo

AI- M/Apo AI- ľl v koncentrácii 0.1 mg/ml do styku s dimyristoy1 fosfatidy1 ohol inom vyvoláva ďalšie zvýšenie α-závitnicovej štruktúry proteinu (obr,. 1 tabuľka

Spôsoby charakterizovania produktu

Inkubácia s fosfolipidmi

Odvážené hmotnostné množstvo dimyristoy1 fosfatidylcholínu (DMF'C) sa rozpustí v etanole a roztok sa odparuje pod dusíkovou atmosférou. Prípadné zvyšné rozpúšťadlo sa odstraňuje za znížené ho tlaku v priebehu 2 hodín. Disperzia dimyristoy1 fosfatidylcho línu v 20 mM fosfátového pufru s hodnotou pH

ΑΙ-Μ/Αρο AI-M (0,1 mg/konečný objem v ml) pri myristoy1 fosfatidylcholínu a Apo AI-M/Apo /,4 sa zmieša s Apo molárnom pomere diΑΙ-ľf zodpovedajúcom

S pe k t ros kopia

Roztoky Apo ΑΙ-!Ί/Αρο ΑΙ-ΙΊ sa dialyzujú oproti 20 mM fosfátového tlmivého roztoku s hodnotou pH 7,4 a zriedia sa rovnakým tlmi vý m roztokom na požadovanú koncentráciu proteinu.

Normálna a sekundárna derivácia ultrafialového spektra roztokov Apo AI-M/Apo AI—M a Apo AI-M/Apo AI-M s dimyristoy1 fosfatidylcholinom sa zaznamenáva na spektrometroch Jasco (Jvidec-610 a F'erkin Elmer Lambda-2 pri teplote 25^GC za použitia 1-cm kremíkových kyviet. Topografické umiestnenie tyrozínových zvyškov sa stanoví podľa rovnice, ktorú popísal Ragone a kol. (R.

Ragone, G. Colonna, C. Balestrieri. L. Servillo a G. Irace, Determination of Tyrosine Exposure in Proteins by Second-derivative Spectroscopy, Biochemistry 23, 1871-1875 /1984/ ) a - ( rn - r.a ) / ( ru - ra >

v ktorej (X znamená stupeň expozície tyrozínu k rozpúšťadlu :L O

ΟΊ	a r m	s u p o m e r y d e r i v á c i í	píkov (a z'b) pre	pr í rodný	a rozvinutý
		(v .4 M hydrochloridu	nuanidínu) Apo	AI-M/Apo	AI-M a
		z n a m e n á pomer d r u h e j	derivácie pikov	roztoku	obsahu j úceho

voľný tyrozin a tryptofán. ktoré sú zmiešané v rovnakom mol árnom pomere ako v prípade Apo AI-M/Apo AI-M.

Vnútorné fluorescenčné spektrum roztokov Apo AI-M/Apo AI-M a Apo AI-M/Apo AI-M s dimyristoyIfosfatidyIcholinom sa regisruje na spektrofluúrmetre Jasco FP-550 pri teplote 25°C.

Cirkulárny dichroizmus (CD spektra) roztokov Apo AI-M/Apo AI-M a Apo AI-M/Apo AI-M s dimyristoy1 fosfatidyIcholinom sa zaznamenávajú spektropo1arometrom Jasco J500A pri teplote 25°C. Stredné hodnoty eliptičnosti. zvyšku (THEYA) sa vyjadrujú v stupňoch x cm² x dmol-i a vypočítajú sa z rovnice (THEYA) x 106 (THEYA) = x 1 x c v ktorej

znamená pozorovanoú e1 iptičnosť, vyjadrenú v stupňoch, m o 1 e k u 1 cj v l.i h im o t i i o s t znamená dĺžku dráhy vyjadrenú v cm a.

znamená koncentráciu pro t e í nov, vyjadrenú v g/ml.

Percento α-závitnice sa vypočíta za použitia rovnice (ΓΗΕΥA)aoe nm ~ 4 OOO

X α-závi tn ica —

000

00ti t N. GreenŤield N a G.u.Fasman. Computed Circular Dichrois®

Spectra for the Evaluation o f F· rote i n Conf ormatin, Biochemistry

Q, 4109-4116 /1969/).

fokusácia a SDS-polyakrylamidová sa u s k útočňu j ú ak o už bo1o ň n a1 y t i c ká izoelektričká gélova elektrotoréza (SDb—FAGE) popísané skôr (G. Franceschini, M. C. r<. Sirtori, Relation between Isoproteins in Subject with the 502-509 /1991/).

Sirtori, G. Gianfrancheschi a the HDL Apoproteins and AI AI-M Abnormality, Metabolism 3£),

Izoelektrická fokusácia sa uskutočňu je v 10Z akrylamidových géloch, ktoré obsahujú 6 M močoviny a 4Z amfolínov (s hodnotou pH 4 až 6). F'o celonočnej fokusácii sa gély fixujú a odfarbia farbivom Coomassie Brilliant Blue R-250 v zmesi kyseliny octovej a izopropylalkoholu. Izoelektrický bod (pl) ľubovoľných neznámych pásov proteínu sa vypočíta vynesením izoelektrického bodu známych proteínov (štandardy od firmy Bio-Rad a apo-HDL) oproti príslušnej migračnej vzdialenosti.

Vysokoúčinná vylučovacia chromatografia

Analytické oddeľovanie vysokoúčinnou vylučovacou chromatografiou (HF’SEC) sa uskutoňuje za použitia kvapalinového chromatografu Jasco, ktorý je opatrený stĺpcom 10pm TSK-G3000 SW o priemere 7,5 mm a dĺžke 300 mm. Stĺpec sa pri vysokoúčinnej vylučovacej chromatografii ekvilibruje a eluuje 0,1 M fosfátovým 11 m i v ý m ľ” o z t o k o m a 0, 1 M c h 1 o r i d o m s ó d n y m o h o d n o t e ρ H / , 2, s o b— sahom 8 M močoviny. Froteíny sa eluujú pri rýchlosti prietoku 0,5 ml/min a odčítanie sa uskutočňuje pri vlnovej dĺžke 220 nm. Oblasti. pikov sa integrujú za použitia integračného prístroja HP-3390.

Príklad 6

Výroba častíc rekonštituovaných 1ipoproteínov s vysokou hustotou, ktoré obsahujú Apo AI, Apo AI-M alebo Apo AI-M/Apo AJ.-M

Častice rekonštituovaných 1 ipoproteínov s vysokou hustotoei (rHDL) sa vyrábajú s použitím technického postupu, ktorý uviedol

A. V. ím i c h o i s a kol. v Biochim. Biophys. Acta Ζ5ώ, 353-364 /1933/ a C. E. Ma t z a kol. v J. Biol. Chem. 25Z, 4535-4541 /1982/.

Rekombinančný Apo AI-ľl dimér (z príkladu 4) a normálny Apo AI. vyčistený z ľudskej plazmy, sa rozpustí v 10 ml Tris-HCl, 0,15 M chloridu sodného, 0,01/) kyseliny etyléndiamíntetraoctovej a 0,0062 súdnej soli kyseliny dusíkovodí kovej, s hodnotou pH 8 (tlmivý roztok A), s obsahom 4 M hydrochloridu guanidínu pri koncentrácii 6 mg/ml. Fre porovnanie sa disulfidová väzba v niektorých Apo AI-M/Apo AI-M redukuje prídavkom 20 mM BTT k timivému roztoku A a hydrochloridu guanidínu. Froteíny sa dialyzujú oproti timivému roztoku A a riedia na obsah 5,2 mg/ml rovnakým tlmivým roztokom.

Fosfolipidy, buď vaječný fosfatidylcholín (EFC) alebo paimitoyloley1 fosfatidylcholín (F'OFC), sa rozpustia v chloroforme, vysušia pod dusíkovou atmosférou a udržujú za zníženého tlaku cez noc. Potom sa pridá cholát súdny v hmotnostnom pomere cholátu a PC zodpovedajúcom 0,55, zmes sa intenzívne mieša počas 3 minút pri. laboratórnej teplote a potom inkubuje pri teplote 4°C počas 2 hodín. Potom sa pridá proteín v hmotnostnom pomere PC k proteínu 2,17 (fosfatidy1cholín) alebo 2,47 (palmitoyloley1fosfatidy1cholín) a zmes sa mieša počas 3 minút pri laboratórnej teplote a inkubuje pri teplote 4°C cez noc. Po dialýze v porovnaní s tlmivým roztokom A v priebehu 5 dní sa zmes odstreďuje pri frekvencii otáčok 11 000 za minútu počas 5 minút na odstredivke Beckman Microfuge a supernatant sa zachytí.

R e k o n š t i. t u o v a n ý 1 i p o p r o t e í n s v y s o k o u h u s t o t o u s a oddelí n e denaturujúccu polyakrylamidovou gradientovou gólovou elektroforézou (GGE) a veľkosť častíc sa stanoví ako už prv popísal A. V. Nichols a kol., v Meth. Enzymol., 128, 417-431 /1986/.

Všetky testované apolipoproteíny sú po popísaných postupoch temer vždy spojené s lipidmi, ako dokazujú veľmi malé piky apolipoproteínu zbaveného lipidu na géloch nedenaturujúcej polyakrylamidovej gradientovej gélovej elektroforézy. Výťažok proteínu v rekonštituovaných 1ipoproteínoch s vysokou hustotou kolíše od 68 do 1002 pri 10 rôznych prípravách.

F^:' r o f i J. > z n e d e n a t u r u i ú c e j pol y a k r y 1 a m i d o v e j g r a d i e n t o v e j elektroforézy častíc rekonštituovaného 1 ipiproteínu s vysokou hustotou sú uvedené na obr. 13. Lipopr.oteín s vysokou hustotou rekonštituovaný s Apo AI a vaječným fosfatidyIcholinom poskytuje hlavný pik pri nedenaturujúcej polyakrylamidovej gradientovej gélkovej elektroforéze s priemerom 9,6 nm, pričom minoritné zložky ako v oblastiach väčších tak menších častíc sa dajú tiež stanoviť. fiekonštituovaný lipoproteín s vysokou hustotou obsahujúci vaječný fosfatidyIcholín a Apo AI-M/Apo AI—M pozostáva z dvoch hlavných zložiek (s priemerom 8,ó a 12,9 nm) a dvoch minoritných zložiek (s priemerom 7,9 a 10,8 nm). Rovnaká veľkosť častíc sa dosiahne, ak sa Apo AI-M/Apo AI-M rekonštituuje s palmitoyloleylfosfatidyIcholinom.

Všetky tri apolipoproteíny sú zväčša úplne inkorporované do stabilných komplexov lipidu a proteínu, s rozdielnymi veľkosťami častíc rekonštituovaného lipoproteínu s vysokou hustotou, ich distribúciou a zložením. Predovšetkým rekonštituovaný lipoproteín s vysokou hustotou pripravený s rekombinantným Apo AI-M/APo AI-M pozostáva z dvoch hlavných zložiek, pričom väčšia je jedinečnou látkou zo skupiny rekonštituovaných lipoproteínov s vysokou hustotou, ktoré obsahujú Apo AI.

Biologické hodnotenie Apo AI-M/Apo AI-M

Príklad 7

Kinetické chovanie diméru Apo AI-M v porovnaní s Apo AI u normálnych príjemcov

Diméry vykazujú predĺženú dobu zotrvávania v krvnom obehu, ako sa ukazuje pri ďalej popísaných kinetických štúdiách na ľuďoch.

Zdravým dobrovoľníkom sa intravenózne podá Apo AI alebo Apo AI-M/Apo AI-M, ktoré sú označené s I. V tabuľke 3 sú uvedené hodnoty ftti/s> v plazme (v hodinách), vypočítané podľa dvoch rozdielnych modelov, rovnako ako frakcionovaná katabolická rýchlosť ÍFCR). Obidve tieto hodnoty potvrdzujú zjavne znížený katabolizmus diméru v porovnaní s monomérom.

Veľmi pomalý katabolizmus Apo AI-M/Apo AI-M ukazuje. že tieto molekuly môžu poškodiť konverziu 1 ipoproteínu a môžu pôsobiť ako účinný prekurz or pre hpo AI—M. V tomto prípade sa pri injekcii Apo AI-M/Apo AI-M dá predpok 1adať, že dimér môže zostať v plazme počas predĺženého časového obdobia. čo je priamo vo vzájomnom vzťahu s metabolizmom lipoproteínu a fibrinolytickým systémom.

Tabuľka

Kinetické chovanie Apo AI-M/Apo AI-M v porovnaní s monomérom Apo

AI u normálnych príjemcov (n = 2)

Apo AI-M

Apo AI-M/Apo AI-M

Mon oepon en c i á 1 n y	fitl/2	16,07	52,04
spôsob	(h)
	MRT	23.19	75,09
	( h )
B i e ;·: pon en c i á 1 n y	fitl/2	22,61	70,29
spôsob	( h)
	MRT	28.97	8 v, 16
	( h )
	FCR	2.37 z e	x 1. 1 X z a
	( h)	hodinu	hodinu
Účinok Apo AI-M/Apo AI-	-M na f y t:	irinoly tický	systéíľi

Úvod .Fibrinolytieký systém predstavuje hlavnú obranu proti ukladaniu fibrínov na stenách ciev a ako taký hrá dôležitú úlohu medzi mechanizmami, ktoré zabraňujú trombóze.

Enzým zodpovedný za lýzu fibrínu je plazmín.

Flazmín sa tvorí

i. n a k t i vo v a n é h o

P r ek u rzo rov é ho plazmi n o gén u úč i n k om špec i f ic kých ak tivátorov (tkanivového aktivátora p1azminogénu, t-F'A a urokinázy, uF'A) . (Tu i v nasledujúcich častiach popisu ide o Ľirokinázu s dvoma reťazcami, pokiaľ nie je uvedené inak. ) h k o a k. ·.. i vačn y proces, tak účinok pl azminu sa regu 1 u j ú ä p e c i. f i c k. ý m i i n h i b i t o r m i , i n h j. b í t. o r o m 1 a k t i v á t o r u p 1 a z m i n o génu (F'AI) ά fev - antiplazmínom. Schéma fibrinolytického systému ja Ľ ä k U t L.¹ ΐ

PLAZMINOGÉN

AKTIVATDRY i--PAI v

FLAZMINOGÉN ------------> FLAZMÍN

K₂ ΑΝΤΙPLAZMIM

FIBRÍN

FDF — produkt degradácie fibrínu

Pomocou skúšok uvedených v príkladoch 7 až 9 sa zistilo, ako Apo AI-M dimér pôsobí na ľudský fibrinolytický systém. Ako autoaktivácia plazminogénu, tak aktivácia plazminogénu pôsobením urokinázy a tkanivového aktivátora plaznimogénu sa študujú v prítomnosti alebo v neprítomnosti Apo AI-M/Apo AI-M. Apo AI človeka izolovaný z plazmy sa použije na kontrolné stanovenie (produkt firmy Sigma, c. A 9284),

Aktivácia fibrinolytického systému sa meria pomocou chromogénnych substrátov. Tieto substráty obsahujú chromoformovú skupinu p-nitroani1 ínu, ktorá sa môže odštiepiť zo substrátovej molekuly pôsobením plazmínu. Voľný p-nitroani1ín má intenzívne žltú farbu, ktorú je možné ľahko pozorovať pri vlnovej dĺžke 405 nm. Množstvo uvoľneného p-nitroani1ínu je priamo úmerné množstvu vytvorenej enzymatiekej aktivity.

Všetky výsledky merania sa dosahujú pri použití záznamových mikrodosiek THERMOmax riadených programom SOFTmax¹^ verzia 2,0:1, získaných z Molecular Devices, Menlo Park, Kalifornia, USA.

ľ’ouzits Sč<ržE pr i. týchto štúdiách sa vyrábajú rekombinäncne podľa príkladu 4. Čistenie zahrňuje použitie ionomeniča, hydrofóbne vzájomné reakcie a gélovu -filtračnú chromatografiu s následnou uitrafilträcioU a lyofi 1izáciou, čo vo všetkých prípadoch sú bežné biochemické metódy. Všetky skúmané šarže obsahujú 90 alebo viac % dimérnej formy, ako sa stanoví vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou na reverznej fáze. Koncentrácia sa stanovuje za použitia skúšky Kabi F’harmacia apo 1 ipoproteín AI RIA 100.

Vyhodnotia sa tri prípravky, A, B a C.

Príklad 8

Autoaktivácia plazminogénu v prítomnosti Apo AI-M/Apo AI-M a Apo

AI

Glu-plazminogén (s konečnou koncentráciou 94 pg/ml) sa inkubuje počas 3 hodín pri teplote 37°C v 0,1 mol/1 tris tlmivého roztoku s hodnotou pH 7,6. Vznik plazmínu sa sleduje pomocou chromogénneho substrátu S-2251 (H-B-Va1-L-Leu-Lyz-pNA) získaného od firmy Chromogenix AB, Molndal, Švédsko. Tento substrát sa používa v konečnej koncentrácii 0,6 mmol/1. F.1 azminogény používané pri týchto skúškach sa získali od firmy Chromogenix AB alebo od firmy IMCO Inc., Stockholm, Švédsko,

Pri tejto skúške sa testujú šarže Apo AI-M/Apo AI-M (s konečnou koncentráciou 3,9 až 75 ug/ml) a množstvo plazmínu vzniknutého v ich prítomnosti sa porovnáva s množstvom plazmínu vytvoreného v prítomnosti Apo AI (pri konečnej koncentrácii 125 yg/ml) a s množstvom plazmínu vzniknutého v neprítomnosti akýchkoľvek prísad (kontrolné stanovenie ) (tabuľka 4).

S prekvapením sa zistilo, že Apo AI-ľl/Apo AI-M môže zvýšiť aktiváciu plazminogénu v 'neprítomnosti ľubovoľných aktivátorov plazminogénu. Apo AI pochádzajúci z plazmy žiadnym spôsobom neovplyvňuje molekulu plazminogénu.

Tabuľka 4

Spontánny vznik p1azmínove j aktivity v plazminogéne. Účinok Apo ··< 1 - ! '1 / ι-i p o 41.....M a 4pg A i . ;· 1 a z m i n o v a aktivita q p t i c k á h u s t o t a < 0 D ) p r i v 1 n o v e· i d 1 ž k e 405 n m.

sa vyjadruje ako

v a ϋ 1 »··.»::(	Konečna koncentrácia Apo, pg/ml	OD 405 nm
i'., o 111 ľ o 1 n e s t u n o v e: i i e	o	0,052
f- Apo AI	l ’T-cr	0,049
+ Apo AI-M/Apo AI-M
A	/5	0,288
B	31,3	0,325
B	15,6	0, 153
B	7.3	0, 104
B	3,9	0,067

Dosiahnutá aktivita sa môže pričítať Apo AI-M/Apo AI-M.

Avšak na základe týchto údajov sa nedá vylúčiť, že Apo AI-M/Apo AI-M je kontaminovaný niektorým proteolytickým enzýmom alebo proteolytichými enzýmami, ktorý by mohol alebo ktoré by mohli aktivovať plazminogén. F're vylúčenie tejto možnosti sa vykonali experimenty .

Všetky príprav

Apo AI-M/Apo AI-M použité pri f ibririoly tichých skúškach sa testujú s chromogénnym substrátom S-2251 í

ktorý je citlivý voči aktivite podobnej plazmínu, a substrátom S-2288 (H-D-I1e-Pro-Arq-pNA), ktorý je citlivý voči proteázam špecifickým na Arg. Substráty sa získajú od firmy ChromogeniAD. Konečná koncentrácia Apo AI-M/Apo AI-M pri skúškach je rovnaká, ako koncentrácia používaná pri fibrinolytických skúškach ει mohla by sa meniť medzi rozličnými šaržami.

ll

Skúška: 25 u 1 Apo AI—Μ/Apo AI-M, konečná koncentrácia 60 až μg/ml,

150 μΐ 0,1 mol/1 Tris pufru s hodnotou pH 7,3, μ 1 0,6 mmol/1 S-2251 alebo p 1 J. . 'j ľíimíj 1; 1 S

Vzorka obsahujúca len tlmivý roztok a substrát sa použije ako kontrolná pre neSPecitickli hyd rol y z u substrátu. Všetky vzorky s a s k ú š a j ú d v o j m o.

Mikrotitračná doska sa inkubuje pri teplote 37°C a absorbana sa odpočítava v hodinových intervaloch.

Tabuľka 5

Amidolytická aktivita dvoch šarží Apo AI-1*1/Apo AI-M (A a B) po inkubácii pri teplote 37°C počas 4 hodín (optická hustota stanovená pri vlnovej dĺžke 405 nm).

Apo AI-M/Apo AI-M Substrát

		A B	0,023 0, 022	0,022
•	S-22SS	A	0.037	0,034
		B	0,037

f-' r i i n e j

sade experimentov sa na Apo AI-M/Apo AI-M pôsobí

i r e v e r z i b i 1 n ý m i n h i b í t o r o m s e r i n p r o t e á z y, d i i z o p r o p y 1 f 1 u ó r Ť o s Ť á tom (DFP, produkt firmy Sigma. Č. D 07Θ9). Konečná koncentrácia

Apo AI-M/Apo	AI - M v 0.2 m ο 1 / 1 h y d r o q e n u h 1 i č i t a n u d r a s e 1 n é h o
s hodnotou pH	7,6 ako pufru, je približne 75 pg/ml. Diizopropy1-
fluórfosfát s	konečnou koncentráciou 123 mmol/1 sa pridá k tomuto
roztoku a po	4 hodinách sa inkubovaná vzorka dialyzuje cez noc

oproti dvom šaržiam uhličitanového tlmivého roztoku.

Stanovenie aktivity, za použitia rovnakých podmnienok ako sú popísané vyššie, sa uskutočňuje na Apo AI-M/Apo AI-M spracovanom s di izopropy1 f 1uúrfosfátom a na nespracovanom Apo AI-M/Apo AI-M. Po trojhodinovej inkubácii s plazminogénorri a S-2251, optická hustota pri vlnovej dĺžke 405 nm činí 0,209 pre vzorky obsahujúce i ' í j 1 i' i / m Í-' O i—i j. ‘I i SPI* U L. C..< v <zil Ί V* d J. 1 *ú Cj P ľ ωρ/l í i U i...'ľ í uS fatom. O. .ľ-j· 4 pre vzorky obsahujúce nespracovaný Apo AI-M/Apo AI-M a 0,030 pre vzorky, ktoré obsahujú iba p 1azminogén.

Z tohto sa môže usudzovať, že pozorovaný účinok aktivujúci plazminogén je priamo spojený s prítomnosťou Apo AI-M/Apo AI-M a nie je dôsledkom nejakej prípadnej proteolytickej kontaminácie.

Príklad 9

Účinok Apo AI-M/Apo AI-M na aktiváciu p1azminogénu s plazminogénovými aktivátormi, tkanivovým aktivátorom plazminogénu a urokinázou

Urokináza (uPA) a tkanivový plazminogénový aktivátor (t-F'A) konvergujú plazminogén na plazmín proteolytickým štiepením jedinej peptidovej väzby Arg 560-Val 561 v molekule plazminogénu. Zatiaľ čo dva reťazce urokinázy môžu aktivovať plazminogén priamo. tkanivový aktivátor plazminogénu vyžaduje prítomnosť fibrínu pre? svoju optimálnu aktiváciu plazminogénu. Prítomnosť katalytických množstiev fibrínu, ktorý spolu s tkanivovým aktivátorom plazminogénu a plazminogénom tvorí ternárny komplex, bude zvyšovať .enzymatickú účinnosť tkanivového aktivátora plazminogénu približne 600-krát.

Aktivácia plazminogénu tkanivovým aktivátorom plazminogénu sa študuje za použitia komerčne dostupnej súpravy Spectrolyse* (fibrín) t—PA/PAI od firmy' BíopooI AB, Ume, Švédsko,

F'r i tejto skúške sa plazminogén inkubuje tkanivovým aktivátorom plazminogénu v prítomnosti chromogénneho substrátu D-But-CHT-Lyz-pNA a desAA fibrinogénu (monomérneho fibrínu), ktorý pôsobí ako stimulátor aktivácie. Vzniknutý plazmín štiepi substrát a uvoľňuje voľný p-nitroani 1 ín.

Apo AI-M/Apo AI-M sa pridá do tohoto systému a porovná sa s prípravkom Apo AI od firmy Sigma. Účinok oboch apo1 ipoproteínov sa testuje v systéme ako v prítomnosti, tak v neprítomnosti fibrínu .

f r .1.!·. 1 rjiL. t. es L u v a í_ i e ľ i o s y í» c e mu :

5 u 1 1.1 m i v é h o r oz t. o k u S p e c t r o J. y s e 25 ul Apo prípravku alebo tlmivého roztoku, ul tkanivového aktivátora elazminogénu (konečná koncentrácia 1,7 IU/ml).

150 p 1 reakčného činidla Spectrolyse PAR (zmes plazminogénu a substrátu) a ,pl Desa fib (monomérneho fibrínu) alebo μ 1 1.1 m i v é h o r o z t o k u.

Vzorky sa inkubujú na mikrotitračnej doske pri teplote 37°C počas 3 hodín.

Tabuľka 6

Účinok Apo AI-M/Apo AI-M a Apo AI na plazminogénovú aktiváciu tkanivovým aktivátorom plazminogénu v prítomnosti alebo v neprítomnosti fibrínu. Výsledky sú vyjadrené ako DPtická hustota (OD) po 3 hodinách inkubácie pri teplote 37°C pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Konečná kone.

Apo,ug/ml

OD 405 nm + fibrín □u 405 nm

- fibrín

t - F' A, k o n t r o 1 n é	0	O,656	0.04S
stanovenie
+ A p o AI	54	1,050	0,066
+ Apo AI-M/Apo AI-M
A	65	1.665	0,446
B	54	2, 366

Signifikantná stimulácia aktivity plazminogénu sa pozoruje s Apo AI-M/Apo AI-M, ako v prítomnosti, tak v neprítomnosti fibrínu. V neprítomnosti fibrínu je stimulácia Apo AI-M/Apo AI-M veľmi zreteľná, v porovnaní s veľmi malou stimuláciou spôsobenou Apo

P O 11·.·.·.¹11 c. i o 11 a 1 n y ui a kiež s i g n i T i k a n t n e

uč inok.	a k s a p 1 a z m i n o g é n a k t. i. v u j e p ô s o b e n í m u r o k i n á z y . i. J r o k i n á z u
použi tú	P r i t ý c ľ 11 o s k ú š k a c h p r e d s t a v u j e p r í p r a v o k s v y e o k o u

m o 1 e k u 1 o v o u h m o t n o s ť □ u - z í e k a n ý od f i r m y C a 1 b i o c h e rn.

(s konečnou koncentráciou lU/ml) sa zmieša

P1 a z rn i n o g é n o m (s konečnou k o n c e n t r á c i o u V 4 p g Z m 1 )

ČI chromogén ko i i ečn ou k pucentraciou

K tejto vzorke sa pridá Apo

AI-M/Apo AI-M v konečnej koncentrácii /5 alebo 62 pg/ml. Reakcia sa uskutočňuje v 0,1 mol/1 Tris tlmi všho roztoku s hodnotou pH 7,6.

Podobne ako s urokinázou sa pozoruje s tkanivovým aktivátorom silná stimulácia tvorby plazminu, ak sa Apo AI-M/Apo AI-M pridá k testovanej vzorke (tabuľka 7).

Tabuľka 7

Účinok Apo AI-M/Apo AI-M na aktiváciu plazminogénu pôsobením urokinázy. Výsledky sú vyjadrené ako optická hustota (OD) po inkubácii pri teplote 37°C počas 4 hodín pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Vzor k a

K o n e č n á k o n c e n t r á c i a

Apo AI-M/Apo AI-M u g / m 1

OD 405 nm u P a, k o n t r o 1 n é0 stanovenie + Apo AI-M/Apo AI—M

A75

B62

1,263

1,868 lento potenciálny účinok na fibrinolýzu tiež pretrváva, ak sa Apo AI-M/Apo AI-M spracuje na farmaceutický prostriedok spolu s nosnou látkou. Ako prípadná nosná látka sa používajú lipozómy, ktoré obsahujú fosfatidylcholín, PC

AI-M/Apo AI-M (šarža C) v lipozómoch (12 mg/ml). Koncentrácia Apo predstavuje 3,6 mg/ml.

ί· ·ι k 11 v a c i a p J. a z m i n o génu is koriecriou k oricentraciou y 4 m g/ml > urokinázou is konečnou I; on c en t r á c iou 2.5 IU/ml) sa testuje v prítomnosti Apo AI-M/Apo AI-M uloženého s lipozómmi a porovnáva s aktiváciou dosahovanou v prítomnosti lipozómov zbavených proteínu. Vzorky sa inkubujú pri teplote 37°C počas 4 hodín s S-2251 a vznik p-lazmínu sa sleduje kontinuálne.

Aktivácia p 1azminogénu pôsobením urokinázy. Účinok Apo AI-M/Apo

AI-M, šarže C, na lipozómy. Výsledky sú vyjadrené ako optická hustota í OD) pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Vzorka

OD uPa + plazminogén + lipozómy zbavené proteínu.

Z50 u g/ml PC + Apo AI-M/Apo AI-M, 75 ug/ml.

v lipozómoch, 250 pg/ml PC

Prítomnosť samotných lipozómov stimuluje aktiváciu p lazminogénu približne dvojnásobne. Prídavok Apo AI-M/Apo AI-M k Iípozóíľiom zvyšuje tento účinok štvornásobne, v porovnaní so vzorkou obs a h u j ú c o u .1. e n u r o k. i n á z u a k o a k t i v á t o r.

Príklad 10

Účinok Apo ΑΙ-Μ/Αρο AI-M na konverziu jediného reťazca urokinázy na dva. reťazce urokinázy

Urokináza s jediným reťazcom (scuPA) je prekurzorom urokinázy s dvoma reťazcami (uPA). Ma rozdiel od urokinázy s dvoma reťazcami má urokináza s jediným reťazcom len veľmi nízku amidolytickú aktivitu, vzhľadom k malým syntetickým substrátom. Amidolytická aktivita predstavuje najviac 0,4 7. z aktivity urokinázy.

Avšak urokinaza s jediným reťazcom. ktorá je napriek tomu proenzýmom, má schopnosť aktivovať p 1 azminogén na clazmin. V z-mesiach plazminogenu a urokmazy s jediným reťazcom bol navrhnutý sled 3 reakcii, ktoré majú za následok ak.tiváciu plazminogénu na plaz-

1) scuF'ft + pl azminogén -------------------scui-A + p lazmi n

2) piaznim + scuPA -------------------> p lazmi n + uPA

3) uF'a + plazminogén. ----------------uF'A + plazmín

Pôvodcovia tohto vynálezu študovali sled reakcii vedúcich ku konverzii reťazcami urokinázy s jediným reťazcom na urokinázu s dvoma v prítomnosti plazminogénu. Aktivita urokinázy sa stanovuje

Claims (14)

1. P o m o c o u c h r o m o g é n n e h o substrátu špecifického pre urokinázu b-2444 <pyro-Glu-Gly-Arg-pNA, Chromogenix AB). šarže

   Apo AI-M/Apo AI-M sa pridajú do systému a množstvo vytvorenej urokinázy s dvomi reťazcami sa porovná s aktivitou dosiahnutou pre vzorku bez prídavku apolipoproteínu. Urokináza s jediným

   reťazcom sa použitá pri týchto skúškach •je rekombinantným produktom získaným od firmyy Grunethal GmbH, Aachen, SRI’4 (obe hodná položka č. 0088808).

   25 ul Apo alebo tlmivého roztoku, ‘75 jj 1 0,05 rnol/1 Tris s hodnotou pH 7,6, ktorý obsahuje 0,1 mol/1 chloridu sodného a 0,02 Z Tween 80,

   25 u 1 scuPA. s konečnou koncentráciou 454 pmol/1,

   50 p 1 8-2444. s konečnou koncentráciou 1 mmol/1 a
2. 2b pl plazminogénu, s konečnou koncentráciou 52,1 nmol/1.

   Vzorky sa inkubujú pri teplote 37°C počas 90 minút. Zvýšenie o p t i c k e j h u s t o t y , k t o r é j e m e r a d 1 o m k v a n t i t y t v o r by u r o k i n á z y s dvoma reťazcami, sa zaznamenáva kontinuálne v priebehu posledných 30 minút inkubácie.

   Tabuľka 9

   Účinok Apo AI—Μ/Apo AI—M na konverziu urokinázy s jediným reťazcom na urokinázu s dvoma reťazcami. Výsledky sú vyjadrené ako mOD/min pri vlnovej dĺžke 405 nm.

   V E k J i' K cl

   Konečná koncentrácia mOD/min

   Apo, uq/1 scul-'A L) o, <J / + plazminogén ú 13,2 + Apo Hl bZ 11,8 +Apo AI-M/Apo AI-M B 20,0 A 75 24,0

   Konverzia urokinázy s jedným reťazcom na urokinázu s dvoma reťazcami v prítomnosti plazminogénu je podporovaná APo AI-M/Apo AI-M, zatiaľ čo Apo AI izolovaný z plazmy nemá signifikantný účinok na tento systém.

   Pozorované účinky Apo AI-M/Apo AI-M na fibrinolytické skúšky pri. týchto štúdiách sú vyššie v porovnaní s účinkami,, ktoré sú zrejmé u Apo AI izolovaného z plazmy. Apo AI-M/Apo AI-M má silnú schopnosť stimulovať fibrinolytickú aktivitu, ktorá prevýši Apo AI. Je pravdepodobné, že tento zvýšený účinok Apo AI-M/Apo AI-M, vyšší ako pre Άρο AI, bude tiež zistený in vivo.

   μ Γ Ε ί'·ΐ ϊ Ο

   J É η R LJ h Υ

   1. Dimér apo1 ipoproteínu AI-Milano v podstate v čistej forme.

   2. Dimér apo1 ipoproteínu AI-Milano podľa nároku totu najmenej 90 ž), výhodne najmenej 98 X.

   ktorý má čis
3. 3. Dimér apolipoproteínu AI-Milano podľa nároku 1, ktorý pochádza z plazmy.
4. 4.

   Dimér apolipoproteínu AI-Milano podľa nároku 1, ktorý je vyrobený rekombinačne.
5. 5. Farmakologický prostriedok, v y že obsahuje dimér podľa nároku 1 spolu s nosnou látkou.

   ó. Farmakologický prostriedok, v y z n a č u j ú c i že obsahuje -dimér podľa nároku spolu so stabilizačným prostriedkom a poprípade s nosnou látkou.
6. 7F a r m a k o 1 o g i. c k prostriedok pod ľa nárol·· alebo ú c i sa že je spolu s

   Pr í právkom znižujúcim lipidy a nosnou látkou.
7. 8. Farmakologický prostriedok y znač u j ú c i t ý iTi že obsahuje dimér spolu so z 1účen inou stabilizujúcou lipidy, poprípade s prípravkom znižujúcim lipidy a poprípade s nosnou látkou.
8. 9. Farmakologický prostriedok podľa nároku v y z n a Č u j ú c i s a t ý m , že obsahuje fosfolipid poprípade s prípravkom znižujúcim lipidy, a poprípade s nosnou látkou.

   iú. Spôsob vyroby diméru podľa nároku i. vyznačujúci s a t y m , z e s a

   a) vyrobí aoolipoprotein AI-Miláno rekpmbinačnou techno- lóqiou, ako vnútrobunečnou fúziou proteínu v Escherichia coli. odštiepi apolipoprotein AI-Milano pôsobením kyseliny mravčej a potom prevedie ľubovoľný monomér na dimér alebo

   b) vyrobí capol ipoprotein AI-Milano rekombinančnou technológiou, pri. ktorej sa apol ipoprotein AI-Milano, monomér a dimér vylučujú do bakteriálneho kultivačného prostredia v expresnom systéme v Escherichia coli a ľubovoľný prítomný monomér sa potom prevedie na dimér'alebo

   c) zachytí plazma z apolipoproteinu AI-Milano na nosných látkach, izolujú HDL apolipoproteíny a oddelí dimér za použitia chromatografie v niekoľkých krokoch alebo

   d) zachytí plazma z apol ipoproteinu. AI-Milano na nosných látkach, monomér čistí a potom prevedie na dimér a dimér čistí na v podstate čistú formu.
9. 11. Použitie diméru podľa nároku 1 pre výrobu liečiva obsahujúceho dimér, pre ošetrovanie aterosk1erózy a kardiovaskulárnych c horôb.
10. 12. Použitie diméru podľa nároku 1 pre výrobu liečiva obsahujúceho d imer, k t ory pô so b í a k o p rek u rzor 11e civa s mo ri o merom, ρ r e ošetrovanie aterosk1erózy a kardiovaskulárnych chorôb.
11. 13. Použitie podľa nároku 11 alebo 12 pre prevenciu a ošetrovanie závažných kardiocirkulárnych zdravotných ťažkostí, ako je infarkt. myokardu, labilná angína, akútna periférna vaskulárna oklúzia a restenóza po koronárnej angioplastike.
12. 14. Použitie podľa nároku 11 alebo 12 pre ošetrovanie chronických arteriá1nych stavov.

    1 b. í - a u z 11 i e podľa nároku 11 alebo 12 pre prevenciu a ošetrovanie pod ľa
13. 15 p i s· s t i m u J. á c i u f i b r i n o 1 ý z y .

    17.

    pod ľ si

    11 alebo 12, pri ktorom lie tiež o b a f < u je prípravok žujúci lipid.
14. 18. Spôsob ošetrovania aterosk1erózy a kardiovaskulárnych chorôb, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že sa podáva dimér podľa nároku 1 v terapeuticky účinnom množstve, poprípade s pridanou nosnou látkou, zlúčeninou stabilizujúcou lipid a/alebo prípravkom znižujúcim lipid, vo farmaceutický účinnom množstve.