HU217203B - Apolipoprotein molekuláris variánsának dimerje, és az előállítására szolgáló eljárás - Google Patents
Apolipoprotein molekuláris variánsának dimerje, és az előállítására szolgáló eljárás Download PDFInfo
- Publication number
- HU217203B HU217203B HU9302344A HU9302344A HU217203B HU 217203 B HU217203 B HU 217203B HU 9302344 A HU9302344 A HU 9302344A HU 9302344 A HU9302344 A HU 9302344A HU 217203 B HU217203 B HU 217203B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- apo
- dimer
- apolipoprotein
- pharmaceutical composition
- milano
- Prior art date
Links
- 239000000539 dimer Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 title claims description 46
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 title claims description 46
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 15
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 32
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 15
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 claims description 5
- 200000000007 Arterial disease Diseases 0.000 claims description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 3
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- -1 lipid compound Chemical class 0.000 claims description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003524 antilipemic agent Substances 0.000 claims 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 claims 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 claims 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 abstract description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 2
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 abstract 2
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 abstract 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 31
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 31
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 24
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 20
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 20
- 102100031358 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 15
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 14
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 14
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 13
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 13
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 13
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 13
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 13
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 12
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 11
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 9
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 9
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 9
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 8
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 7
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZEFNOZRLAWVAQF-UHFFFAOYSA-N Dinitolmide Chemical compound CC1=C(C(N)=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O ZEFNOZRLAWVAQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 3
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L (2-dodecoxy-2-oxoethyl)-[6-[(2-dodecoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]hexyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCCCCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCCCC XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014190 Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010011964 Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 239000002565 heparin fraction Substances 0.000 description 2
- 239000002634 heparin fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N isopropyl alcohol Natural products CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGYWXYFLXYIOCP-KBPBESRZSA-N (2s)-n-[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]-5-oxopyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 DGYWXYFLXYIOCP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 108010007858 5-oxo-prolyl-glycyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000037539 Acute peripheral arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010051113 Arterial restenosis Diseases 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 101100402795 Caenorhabditis elegans mtl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000252095 Congridae Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 1
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150115889 al gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000000923 atherogenic effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L calcium;3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000005800 cardiovascular problem Effects 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002093 isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004576 lipid-binding Effects 0.000 description 1
- 230000008604 lipoprotein metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 101150079876 mcrB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004141 reverse cholesterol transport Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000009489 vacuum treatment Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Abstract
A jelen találmány az Apőlipőprőtein Al-Milanő (Apő Al-M/Apő Al-M)alapvetően tiszta dimerjére vőnatkőzik, amelyet mőst első ízbenizőláltak a plazmából és jellemeztek. A találmány űgyancsak vőnatkőzikaz Apő Al-M/Apő Al-M-et tartalmazó gyógyszerkészítményekre. AzApőlipőprőtein Al-M dimer egy E. cőli rendszerből rekőmbinánstechnikával, vagy az Apőlipőprőtein Al-Milanő hőrdőzó egyedekplazmájából állítható elő. A találmány főglalkőzik tővábbá azatherőszklerózis és más kardiővaszkűláris betegségek kezeléséreszőlgáló módszerrel, valamint a dimernek a gyógyszerekben történőfelhasználásával. A dimert tartalmazó gyógyszer felhasználható azatherőszklerózis és más kardiővaszkűláris betegségek kezelésében, és akülönböző klinikai körülmények között artériásan vagy vénásanmegjelenő trőmbózis megelőzésére. A dimer ezenkívül a mőnőmerelőanyagaként is felhasználható. ŕ
Description
A jelen találmány az Apolipoprotein Al-Milano (Apó AlM/Apo Al-M) alapvetően tiszta dimeijére vonatkozik, amelyet most első ízben izoláltak a plazmából és jellemeztek. A találmány ugyancsak vonatkozik az Apó AlM/Apo Al-M-et tartalmazó gyógyszerkészítményekre.
Az Apolipoprotein Al-M dimer egy E. coli rendszerből rekombináns technikával, vagy az Apolipoprotein Al-Milano hordozó egyedek plazmájából állítható elő.
A találmány foglalkozik továbbá az atheroszklerózis és más kardiovaszkuláris betegségek kezelésére szolgáló módszerrel, valamint a dimemek a gyógyszerekben történő felhasználásával.
A dimert tartalmazó gyógyszer felhasználható az atheroszklerózis és más kardiovaszkuláris betegségek kezelésében, és a különböző klinikai körülmények között artériásán vagy vénásan megjelenő trombózis megelőzésére.
A dimer ezenkívül a monomer előanyagaként is felhasználható.
HU 217 203 B
A leírás terjedelme 28 oldal (ezen belül 13 lap ábra)
HU 217 203 Β
A jelen találmány az apolipoprotein Al-Milano (Apó AlM/Apo Al-M) alapvetően tiszta dimerjére, valamint az ezt tartalmazó gyógyszerkészítményre, továbbá a megfelelő előállítási eljárásra vonatkozik, történjék ez akár rekombináns technikával, akár közvetlenül a plazmából. A termék felhasználható az atheroszklerózis és kardiovaszkuláris (szív- és érrendszeri) betegségek gyógykezelése során, és mint az Apó Al-M vegyület egy előterméke.
A szérum magas koleszterolszintje és a szívkoszorúér-megbetegedések (coronary heart disease, CHD) kialakulása közötti nyilvánvaló összefüggés kórbonctani és szövettani vizsgálatok alapján többszörösen bebizonyosodott. Mindazonáltal csak a plazmában történő koleszteroltranszport összetett mechanizmusának vizsgálata során derült fény arra, hogy a plazmában keringő különböző összetételű lipoproteinek különböző mértékben játszanak szerepet a CHD kialakulásában.
A plazmában keringő lipoproteineket ténylegesen négy nagy csoportba sorolhatjuk: a chylomicronok (CM), az igen kis sűrűségű (very low density, VLDL), a kis sűrűségű (low density, LDL), és a nagy sűrűségű (high density, HDL) lipoproteinek. Míg a CM a bélben történő zsírfelszívódás rövid életű terméke, a VLDL és főként az LDL a szövetekbe, így például az artériák falába történő koleszteroltranszportért felelős. Ezzel ellentétben a HDL közvetlenül a koleszterolnak a perifériális szövetekben történő lebontásában vesz részt oly módon, hogy visszaszállítja a májba vagy az egyéb lipoproteinekbe, ez a mechanizmus a „fordított koleszteroltranszport” („reverse cholesterol transport”, RCT) néven ismeretes.
A HDL „védő” szerepét már számos tanulmány megerősítette (például Miller et al. Láncét. 1977:965-968 és Whavne et al. Atheroszklerózis 39:411-419, 1981). Ezen vizsgálatok alapján valószínű, hogy az LDL erősen és a VLDL kevésbé emelkedett szintje egyértelműen kapcsolatban áll a kardiovaszkuláris betegségek megnövekedett kockázatával, míg a magas HDL-szint látszólag a kardiovaszkuláris védelmet adja. A HDL védő szerepét erősen alátámasztják ezenkívül azok a nyulakon végzett in vivő kísérletek, amelyek kimutatták, hogy a HDL-infúzió megakadályozhatja a koleszterolindukált léziók kialakulását az artériákban (Badimon et al., Láb. Invest. 60:455-61, 1989), és/vagy elősegítheti ugyanezek visszafejlődését (Badimon et al., J. Clin. Invest. 85:1234-41, 1990).
Az utóbbi időben a HDL védőmechanizmusa(i)nak kutatásában az érdeklődés egyre inkább a HDL legfontosabb alkotórésze, az Al apolipoprotein (Apó Al) felé fordult. Az Apó Al magas szintje a plazmában ugyanis csökkenti a CHD és a koszorúerek lézióinak előfordulási valószínűségét (Maciejko et al., N. Engl. J. Med. 309:385-389, 1983; Sedis et al., Circulation 73:987-984, 1986).
A plazmában lévő Apó Al egy 243 aminosavból álló egyláncú polipeptid, amelynek az elsődleges szekvenciája ismert (Brewer et al., Biochem Biophys Rés. Commun 80:623-630, 1978). Az Apó Al egy 267 aminosavból álló prekurzorként szintetizálódik a sejtben.
Ennek a pre-propapolipoproteinnek még intracellulárisan először az N-terminálisáról hasad le egy 18 aminosavból álló szakasz, majd a plazmában vagy a nyirokban lévő specifikus proteázok működése következtében egy további 6 aminosavból álló szakasz is leválik a molekuláról.
Az Apó Al molekula legfontosabb szerkezeti elemének azt a 11 vagy 22 aminosavból álló ismétlődő szakaszt tartják, ami valószínűleg amfipatikus helikális konformációban van jelen (Segrest et al., FEBS Lett. 38:247-253, 1974). Ez a szerkezeti elem teszi lehetővé, hogy az Apó Al kifejtse fő biológiai aktivitásait, így a lipidkötést és a lecitin koleszterol acil-transzferáz (LCAT) aktiválást.
Az Apó Al egy másik, a közelmúltban leírt jellemzője az, hogy antivirális aktivitása van. Ezt in vitro kutatások mutatták ki és kiderült, hogy a molekula hatást gyakorol mind Herpes vírus törzsekre (Srinivas R. V. et al., Virology, 175; 48-57, 1990), mind pedig a humán immunodeficiencia vírusra, a HIV-re (Owe et al., J. Clin. Invest. 86; 1142-50, 1990). Ez a hatás valószínűleg az Apó Al amfipatikus helikális szakaszainak és a vírus burkoló glikoproteinjének kölcsönhatása révén megy végbe.
In vitro kutatások eredményei szerint az Apó Al molekula és a lecitin komplexei elősegítik a nem kötött állapotú koleszterol kiáramlását a tenyészetben tartott arteriális simaizomsejtekből (Stein et al., Biochem. Biophys Acta 380:106-118, 1975). E mechanizmus révén a HDL szintén képes gátolni ezeknek a sejteknek a szaporodását (Yoshida et al., Exp. Mól. Pathol. 41:258-266, 1984).
A közelmúltban mutatták ki, hogy az Apó Al vagy a HDL-infúziója szignifikáns biokémiai változásokat okozott a kísérleti állatokban, nevezetesen csökkentette az atheroszklerotikus léziók kiterjedését és komolyságát. Maciejko és Mao (Arteriosclerosis 2:407a, 1982) első cikke után Badimon et al. (lásd az előző hivatkozást) úgy találták, hogy koleszterollal etetett nyulakban HDL-infúzió (d= 1,063-1,325 g/ml) hatására szignifikánsan csökkent az atheroszklerotikus léziók kiterjedése (-45%) és a koleszterol-észter mennyisége (-58,5%). A szerzők kimutatták továbbá, hogy a HDLinfuzió a már kialakult léziók közel 50%-nak visszafejlődéséhez vezetett. Szintén a közelmúlt kutatásainak egyik eredménye, hogy a HDL-infúziók jelentősen megváltoztatják a plazma lipoprotein-összetételét Watanabe nyulakban, amelyekre az örökletes hiperkoleszterolémia miatt jellemzők a korán kifejlődő arteriális léziók. Ezekben az állatokban a HDL-infúziók hatására a védő HDL mennyisége több mint kétszerese lehet az atherogén LDL-nek.
A HDL szerepének a kutatása további stimulust kapott akkor, amikor kimutatták, hogy amellett, hogy állatkísérletekben megakadályozza az arteriális megbetegedéseket, az Apó Al fibrinolitikus aktivitást is kifejthet (Saku et al., Thromb. Rés. 39:1-8, 1985). Ronneberger (Xth Int. Congr. Pharmacol., Sidney 1987, p. 990.) mutatta ki, hogy az izolált Apó Al fokozza a fibrinolízist beagle kutyákban és Cynomologous maj2
HU 217 203 Β mokban. Hasonló aktivitást sikerült kimutatni in vitro humán plazmában is. Az említett szerző erősítette meg azt, hogy Apó Al-lal kezelt állatokban a lipidlerakódás és az arteriális plakk-képződés csökken.
A humán Apó Al elsőként leírt változata az AlMilan (Apó Al-M) apolipoprotein (Franceschini et al., J. Clin. Invest. 66:892-900, 1980). Erre az jellemző, hogy a 173-as Arg-ot Cys helyettesíti (Weisgraber et al., J. Bioi. Chem. 258:2508-2513, 1983). A mutáns apolipoprotein autoszomális domináns tulajdonságként öröklődik, és eddig a hordozók 8 generációját azonosították (Gualandrí et al., Am, J. Hűm. Génét. 37:1083-1097, 1984).
Az Apó Al-M hordozó egyén állapotára jellemző a HDL-koleszterol alacsony szintje. Ennek ellenére az érintettek látszólag nem mutatnak az arteriális betegségek irányában nagyobb hajlamot; a családfa tanulmányozása alapján arra következtettek, hogy ezek az egyének „védettek” az atheroszklerózissal szemben.
Az Apó Al-M lehetséges védőhatásának mechanizmusa a hordozó egyénekben látszólag a mutáns apolipoprotein szerkezetének a módosulásával kapcsolódik össze, konkrétan az egyik alfa-hélix eltűnésével és ennek következtében a hidrofób maradék fokozott felszínre kerülésével (Franceschini et al., J. Bioi. Chem. 260:1632-1635, 1985). A többszörös alfa-hélix-szerkezet feszessége fellazul, a molekula rugalmassága megnő, és így a normál Al-hoz képest könnyebben kapcsolódik lipidekkel. Sőt, mivel az apolipoprotein/lipid komplexek könnyen denaturálódnak, a mutánsokban a lipidforgalom is magasabb hatásfokkal megy végbe.
Az Apó Al-M apolipoprotein terápiás célokra történő felhasználását ma még gátolja az, hogy nincsen olyan módszer, amelynek segítségével a molekulát a szükséges mennyiségben és a megfelelő formában lehetne előállítani.
Az Apó Al-M egy másik nagyon jellemző tulajdonsága, hogy előszeretettel alkot dimert önmagával és komplexet az Apó Al-molekulával, mindkét esetben a Cys-maradékon keresztül. Apolipoproteinek keverékét tartalmazó plazmafrakciókkal nemrégiben végzett klinikai vizsgálatok azt mutatták, hogy a dimereknek és a komplexeknek a keringésben történő kialakulása lehet a felelős ezeknek a hordozóknak a csökkent féléletidejéért (Gregg et al. NATO ARW on Humán Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone SG, 1988).
Az Apó Al-M dimerek (Apó Al-M/Apo Al-M) in vitro körülmények között megakadályozzák a HDL-részecskék egymásba történő átalakulását (Franceschini et al., J. Bioi. Chem. 265:12224-12231, 1990).
A dimert tartalmazó keverékekkel végzett korábbi vizsgálatokat Apó Al-M hordozó egyének véréből szeparált Apó Al-M-mel végezték, amely így csak kis mennyiségben volt hozzáférhető.
Az Apó Al és különösen az Apó Al-M a plazma frakcionálásával történő előállítása nehézkes, ezért komolyan megfontolandó (Franceschini et al., J. Bioi. Chem. 260:16321-16325, 1985). Az izolálás és az előállítás nem történhet nagy mennyiségben, mert a kiindulási anyagból csak kis mennyiség áll rendelkezésre. Továbbmenve, a plazma frakcionálásából származó termékekkel való munka során számos kockázati tényezőt kell figyelembe venni, például a fertőző ágensekkel történő szennyeződés lehetőségét. Alapvető fontosságú, hogy ezt elkerüljük.
Kísérleteket végeztek a humán Apó Al előállítására rekombináns DNS-technológia felhasználásával. A 0 267 703 számú európai szabadalom az Apó Al-nak az E. coliból történő előállítását írja le. Az eljárás egy kiméra polipeptidet ír le, ahol az Apó Al részt összekapcsolták a B-galaktozidáz N-terminálisán lévő aminosavmaradékkal, vagy a protein A egy vagy több IgG-kötő doménjéval, vagy a humán pro-Apo Al szekvenciával.
Az Apó Al és az Apó Al-M élesztőtörzsekben történő expresszióját és a termékeknek az atheroszklerózis és a kardiovaszkuláris megbetegedések kezelése során történő felhasználását a WO 90/12879 számú irat ismerteti. Az Apó Al-t és az Apó Al-M-et kódoló géneket olyan DNS-szekvenciákkal láttuk el, amelyek az élesztő által felismerhető szekréciós és processzáló szignált tartalmaznak, ezeket az érett protein génjéhez felülről kapcsoltuk. Módosított MF-a-1 leaderszekvenciát használtunk, amelynek az utolsó aminosavai a következők voltak: His-Gly-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg.
Meglepő módon úgy találtuk, hogy a tisztított Apó Al-M/Apo Al-M dimer féléletideje a plazmában hosszabb, mint a monomer formáé, és hogy a normál Apó Al-lal összehasonlítva fokozott mértékben stimulálja a fibrinolízis folyamatait, például képes közvetlenül aktiválni a plazminogént (amire a normál Apó Al nem képes). Ezért a dimer molekula biológiai szempontból fontos lehet, és valószínű, hogy mint az Apó Al-M előanyaga is szerepet játszik. A dimer molekula különleges méretű HDL (igen sűrű lipoprotein) részecskéket alkot, ami nem figyelhető meg a monomer Apó Al-M-et vagy az Apó Al-t tartalmazó rekombináns HDL részecskék esetében.
A jelen találmány az Al-Milano apolipoprotein alapvetően tiszta dimerjeire vonatkozik, amelyeket a továbbiakban Apó Al-M/Apo Al-M-nek fogunk nevezni. A molekula legalább 90%-os, de előnyösen 98%-os tisztaságú. A molekulát plazmából izoláltuk és karakterizáltuk, ezenkívül rekombináns módszerrel is előállítottuk. A szabadalom ugyancsak vonatkozik az Apó Al-M/Apo Al-M molekulát tartalmazó gyógyszerkészítményekre, amelyek tartalmazhatnak tetszés szerinti stabilizáló ágenst, például stabilizáló lipidkeveréket, úgymint foszfolipidet és/vagy hordozómolekulát.
A gyógyszerkészítmény tartalmazhat még lipidtartalom-csökkentő faktort és/vagy olyan egyéb orvosságot, amely már ismert az atheroszklerózis és a kardiovaszkuláris betegségek kezelésében, úgymint a heparint, heparinfrakc iókat és -fragmentumokat vagy lipidtartalom-csökkentő faktorokat.
Az Apó Al-M apolipoprotein a következő módszerekkel állítható elő:
a) az Apolipoprotein Al-Milano előállítása rekombináns technológiával, amikor az Apolipoprotein Al3
HU 217 203 Β
Milano az E. coliban intracelluláris fúziós fehérje részeként keletkezik, erről hangyasavval lehasitható, majd ezután a jelen lévő monomerek dimerré alakíthatók, vagy
b) az Apolipoprotein Al-Milano előállítása rekombináns technológiával, amikor az Apolipoprotein AlMilano az E. coli kiválasztórendszerén keresztül monomer vagy dimer formában szekretálódik a baktérium tenyésztőközegébe, majd ezután a jelen lévő monomerek dimerré alakíthatók és a dimert lényegében tiszta formában állítjuk elő.
Az a) eljárás során az Apó Al-M a baktériumon belül intracellulárisan fúziós fehérjeként keletkezik. A fúziós partner a protein A módosított IgG-kötő doménje, és a hangyasav hasítási pontját a fúziós partner és az Apó Al-M között alakítottuk ki. A baktérium lizálása után a fúziós fehérjét immobilizált IgG-η tisztítottuk és hangyasavval hasítottuk. Az Apó Al-M-et és dimerjét SDS gélelektroforézissel Western blot-technikával mutattuk ki.
A 3. példában megmutatjuk, hogy az előállított Apó Al-M is termelhető a rekombináns E. coliban és dimerek is kialakíthatók. Mindazonáltal a hangyasav felhasználásával keletkező termék két aminosawal rövidebb az Nterminálisán. Ez a hiány feltételezhetően nincs hatással az Apó Al-M molekula aktivitására.
A 4. példában bemutatott b) módszer alkalmazásakor teljesen hibátlan molekula keletkezik.
Az igényelt Apó Al-M dimer előállítható még a következő módszerekkel:
c) Apolipoprotein Al-Milanót termelő egyedekből plazmát gyűjtünk, izoláljuk a HDL apolipoproteineket, majd több lépésben kromatográfíával, például Sephacryl kromatográfíával, szeparáljuk a dimer molekulát, vagy
d) Apolipoprotein Al-Milanót termelő egyedekből plazmát gyűjtünk, a monomer molekulát tisztítjuk, dimerré alakítjuk és addig tisztítjuk, míg lényegében tiszta formát nem kapunk.
Fontos, hogy a c)-ben ismertetett szeparáció sok lépésben történjen és előnyösen hosszú, például 300 cm hosszú oszlopon.
Ha monomer van jelen, azt a további példákban ismertetett módszerekkel mindig dimerré kell átalakítani.
A találmány tartalmazza ugyancsak az atheroszklerózis és a kardiovaszkuláris betegségek kezelésének módszerét és a dimer felhasználását az orvosság előállításában. A dimer ezenkívül szerepelhet mint az atheroszklerózis és a kardiovaszkuláris betegségek kezelése során felhasznált monomer előanyaga.
Ez az orvosság felhasználható az atheroszklerózis és a kardiovaszkuláris betegségek kezelésére, valamint a fontosabb szívkeringési problémák, úgymint a szívinfarktus, instabil angina, akut priferiális keringéselzáródás és szívérplasztikát követő resztenózis kialakulásának megakadályozására és kezelésére.
Krónikus arteriális megbetegedések kezelésekor, amelyekre az ér elzáródását okozó plakk jellemző, mind a szívkoszorúereket, mind a perifériális artériákat kezelni kell. A dimert önmagában is lehet adni infúzióban azzal a céllal, hogy a plakkban felhalmozódott lipidek eltávolítását indukáljuk, de tetszőlegesen adható együtt az atheroszklerózis és a kardiovaszkuláris betegségek bevezetett gyógyszereivel, úgymint a heparinnal, a heparinfrakciókkal és -fragmentumokkal és/vagy a keringésben lévő, az atheroszklerózis kialakulásáért felelős lipidek mennyiségét csökkentő gyógyszerekkel.
A dimert tartalmazó orvosság felhasználható a különböző klinikai feltételek között kialakuló trombózis megakadályozására és kezelésére, valamint a fibrinolízis elősegítésére.
Az Apó Al-M dimer szerkezetére jellemző a sok amfipatikus szakasz, ezért a dimemek feltételezhetően antivirális hatása van.
Most először, a jelen találmány felhasználásával, lehetővé vált a dimer lényegében tiszta, több mint 90%, sőt 98%-ban tiszta állapotban való előállítása. Szintén ez a találmány teszi lehetővé annak a kimutatását, hogy ennek a terméknek meglepő módon lényegesen pozitívabb hatása van a biológiai rendszerekre, mint az Apó Al-nak. Ezt a 7—10. példában mutatjuk be.
A találmány leírásához a következő ábrákat csatoltuk :
Az 1-2. ábra a kitermelés hatásfokát ábrázolja a fehérjekoncentráció %-ának függvényében [2.b) példa].
A 3. ábra az Apó Al-M/Apó Al-M képződésének kinetikáját ábrázolja 24 óra időtartam alatt [ 1 ,b2) példa],
A 4. ábra a szintetikus linkért ábrázolja [3.a) példa].
Az 5. ábra a plazmidot ábrázolja [3.a) példa].
A 6. ábra a fúziós fehérje hasítását követő Westemanalízis eredményét mutatja [3.d) példa].
A 7. ábra az Apó Al-M/Apó Al-M UV-spektrumát mutatja [5. példa].
A 8-10. ábra az UV-spektrumok második deriváltját ábrázolja [5. példa].
All. ábra a fluoreszcens spektroszkópia eredményét mutatja [5. példa].
A 12. ábra a CD-spektroszkópia eredményét ábrázolja [5. példa].
A 13. ábra az Apó Al, Apó Al-M és Apó Al-M/Apo Al-M-tartalmú rHDL-t mutatja [6. példa].
1. példa
A dimer izolálása a plazmából
a) Az apolipoproteinek előállítása
Vérmintákat gyűjtöttünk Na2-EDTA-n (1 mg/ml) különböző Apó Al-M apolipoproteinhordozó egyénektől éhgyomorra, és 4 °C-on centrifugálással plazmát preparáltunk. A plazma nagy sűrűségű lipoproteinjeit (HDL, d= 1,063-1,21 g/ml) 50,2 Ti rotorral felszerelt Beckman L5-5OB ultracentrifugában fokozatos ultracentrifugálással izoláltuk (Havel, R. 1, Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and Chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in humán serum. J. Clin. Invest. 34:1345-1354, 1955). 48 óráig, 40000 fordulat/perc fordulatszámmal, 4 °C-on történő ultracentrifugálás után a HDL-t tartalmazó legfelső frakciót 1:1 arányban 0,15 mol/1 NaCl, 0,01% Na2-EDTA és 1,21 g/ml KBr koncentrációjú pufferrel (pH = 7,4) hígítottuk, majd újra centrifugáltuk 40000 fordulat/perc for4
HU 217 203 Β dulatszámmal, 4 °C-on, 48 óráig. A HDL-t 5 mmol/1 NH4CO3, 0,01%Na2-EDTA, pH=7,4 pufferrel szemben tökéletesen dializáltuk, liofilizáltuk, valamint dietiléter:EtOH = 3:1 v/v keverékkel lipidmentesítettük. A fehérjekoncentrációt vagy aminosavanalízissel, vagy Lowry-módszerrel határoztuk meg (Lowry, Ο. H., Rosenbrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Bioi. Chem. 193:265-275, 1951).
b) Az Apó Al-M/Apo Al-M izolálása
Az Apó Al-M/Apó Al-M izolálásához az 1 .a) példában leírtak alapján előállított HDL apolipoproteineket szolubilizáltuk 6 mol/1 Guanidin HC1 (Gdn-HCl)-t tartalmazó 0,1 mol/1 Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH=7,4 pufferben. Az apolipoproteineket Sephacryl S-300 HR (2,6x300 cm) oszlopra vittük fel, és mol/1 Gdn-HCl-tartalmú 0,1 mol/1 Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH = 7,4 pufferrel hoztuk egyensúlyba. Az apolipoproteineket ugyanezzel a pufferrel, 1,5 ml/perc áramlási sebességgel, 10 ml-es frakciókat gyűjtve eluáltuk. Az Apó Al-M/Apó Al-M tartalmú frakciókat összeöntöttük, vákuummal koncentráltuk, és még egyszer felvittük az oszlopra.
A tiszta Apó Al-M/Apo Al-M dimert tartalmazó frakciókat összeöntöttük, 5 mmol/1 NH4HCO3, 0,01% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH=7,4 pufferrel szemben dializáltuk, liofilizáltuk, és -20 °C-on 3 mol/1 GdnHCl-tartalmú 0,1 mol/1 Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH = 7,4 pufferben tároltuk. Az Apó AlM/Apo Al-M preparátumok >98%-ban tiszták voltak, ezt nagy felbontású méretkizárásos kromatográfiával (high-performance size-exclusion chromatography, HPSEC), valamint nem redukáló közegben végzett SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) ellenőriztük.
Ezzel a módszerrel nagy tisztaságú Apó Al-M dimert izoláltunk a hordozó egyének plazmájából.
2. példa
A monomer tisztítása a plazmából és a dimerré való átalakítás
a) Az Apó Al-M tisztítása
Az Apó Al-M tisztításához az 1 .a) példában leírtak alapján előállított HDL apolipoproteineket 6 mol/1 Gdn-HCl és 1% 2-merkapto-etanol-tartalmú 0,1 mol/1 Trisz-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH = 7,4 pufferben szolubilizáltuk. 37 °C-on 4 órás inkubáció után a redukált Apo-HDL-oldatot Sephacryl S-200 (2,6 x 150 cm) oszlopra vittük fel, majd 4 mol/1 GdnHCl és 0,1% 2-merkapto-etanol-tartalmú 0,1 mol/1 Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3 pH = 7,4 pufferrel egyensúlyba hoztuk. Az apolipoproteineket ugyanezzel a pufferrel, 1,0 ml/perc áramlási sebességgel, 5 ml-es frakciókat gyűjtve eluáltuk. Az Al + Apó Al-M-nek megfelelő frakciókat összeöntöttük, mmol/1 NH4HCO3, 0,01% Na2-EDTA, pH=7,4 pufferrel szemben dializáltuk, majd liofilizáltuk. Az apolipoproteineket 6 mol/1 Gdn-HCl és 1% 2-merkapto-etanol-tartalmú 0,1 mol/1 Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH = 7,4 pufferben újra feloldottuk.
órás, 25 °C-on történő inkubálás után a 2-merkaptoetanolt Sephadex G25 kromatográfiával eltávolítottuk, és az apolipoproteineket azonnal egy 4 mol/1 Gdn-HCltartalmú 0,1 mol/1 Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH = 7,4 pufferrel egyensúlyba hozott Thiopropyl-Sepharose (1x10 cm) oszlopra vittük fel. Az oszlopot egy éjszakán át alacsony (0,15 ml/perc) áramlási sebességgel mostuk, majd a normál Apó Al-t 4 mmol/1 Gdn-HCl-tartalmú 0,1 mol/1 Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH = 7,4 pufferrel eluáltuk. Az Apó Al-M-et 4 mol/1 Gdn-HCl-t és 1% 2-merkaptoetanolt tartalmazó, de egyébként azonos összetételű pufferrel mostuk le. Az Apó Al-M-tartalmú frakciókat összeöntöttük, 5 mmol/1 NH4HCO3, 0,01% Na2-EDTA, pH=7,4 pufferbe dializáltuk, és 3 mol/1 Gdn-HCl és 0,1% 2-merkapto-etanol-tartalmú 0,1 mol/1 Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH=7,4 pufferben -20 °C-on tároltuk. Az Apó Al-M preparátumok >98%-ban tiszták voltak, ezt HPSEC, SDS-PAGE technikákkal, valamint izoelektromos fokuszálással ellenőriztük.
b) Az Apó Al-M/Apo Al-M szintézise
Az Apó Al-M-tartalmú oldatokat 25 mmol/1 TrisHCl pH=9,0 pufferbe dializáltuk. A redukált Apó AlM-et redukált glutation (GSH)(l-5 mmol/1) tartalmú 25 mmol/1 Tris-HCl pufferrel a kívánt végkoncentrációra (3,6-53,6 pmol/l) hígítottuk, majd 25 °C-on 5 perc időtartamig előinkubáltuk. Az oxidáció folyamata oxidált glutation (GSSG)(0,l -10,0 mmol/1) hozzáadásával indult be, és azonos hőmérsékleten szorosan lezárt csövekben 24 h időtartam alatt ment végbe. Az oxidáció folyamatát SDS-PAGE-val követtük (lásd fent). Festés és differenciálás után a géleket LKB Ultroscan XL lézeres denzitométerrel vizsgáltuk, és az egyes fehérjesávok százalékos megoszlását LKB 2400 Gelscan XL software felhasználásával számoltuk ki. Az oxidáció kinetikáját HPSEC technikával követtük.
A dimer szintézisének, nevezetesen az oxidáció folyamatának optimalizálása érdekében további kísérleteket végeztünk GSH/GSSG + Gdn-HCl, valamint GSH/GSSG + thioredoxin jelenlétében (Pigiet, V. P., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7643-7647, 1986).
Az Apó Al-M oxidációját zárt csövekben végeztük különböző koncentrációjú redukált/oxidált glutation (GSH/GSSG) jelenlétében. A keletkezett dimer menynyisége egyaránt függ a proteinkoncentrációtól (1. ábra, 1. táblázat), valamint a GSH/GSSG koncentrációjától és arányától. A fehérjekoncentráció 8,9 pmol/l-ről 53,6 pmol/l-re való emelkedése az Apó Al-M/Apo AlM hozamát 26-51%-kal növeli (1. ábra, 1. táblázat). A GSH/GSSG molekuláris arány 1/2-ről 1/16-odra való csökkenése a hozam 43%-kal való csökkenését eredményezi; másrészt a GSH/GSSG-koncentráció növekedése állandó GSH/GSSG molekuláris arány esetében egészen 42%-os Apó Al-M/Apo Al-M keletkezésnövekedéssel jár (2. ábra, 1. táblázat). A reakció hőmérséklete és a fehérjét denaturáló Gdn-HCl jelenléte nem befolyásolta az Apó Al-M/Apo Al-M keletkezés mértékét. Szignifikáns Apó Al-M/Apo Al-M képződést értünk el,
HU 217 203 Β amikor az Apó Al-M-et és a GSH/GSSG-t 0,2 mmol/1 thioredoxin jelenlétében inkubáltuk (1. táblázat).
Az oxidáció kinetikáját analitikai HPSEC-cel követtük. A dimer és monomer Apó Al-M jól elkülöníthető csúcsokat adott 10,8, illetve 12,7 perc retenciós időknél. Az Al-M/Al-M szintézis (GSH/GSSG mmol/1/4 mmol/1, Al-M-koncentráció 8,9 pmol/l) óra múlva majdnem befejeződött, az inkubációs idő 24 órára való növelése nem fokozta az Al-M/Al-M képződést (3. ábra).
1. táblázat Apó Al-M oxidáció
| Fehérje Umol/l | GSH mol/1 | GSSG mmol/1 | Hozam % | Megjegyzések |
| 3,6 | 1,0 | 0,1 | 34,8 | thioredoxin 0,2 mmol/1 |
| 8,9 | 1,0 | 2,0 | 9,1 | |
| 8,9 | 1,0 | 2,0 | 9,9 | 4 °C |
| 8,9 | 1,0 | 4,0 | 7,2 | |
| 8,9 | 1,0 | 4,0 | 7,7 | 4 °C |
| 8,9 | 1,0 | 8,0 | 6,6 | |
| 8,9 | 1,0 | 16,0 | 5,2 | |
| 8,9 | 2,0 | 4,0 | 19,6 | |
| 8,9 | 4,0 | 8,0 | 18,7 | |
| 8,9 | 5,0 | 10,0 | 23,9 | |
| 8,9 | 1,0 | 2,0 | 9,8 | Gdn-HCl 4 mol/1 |
| 17,9 | 2,0 | 4,0 | 23,3 | |
| 17,9 | 4,0 | 8,0 | 25,5 | |
| 17,9 | 5,0 | 10,0 | 27,5 | |
| 35,7 | 2,0 | 4,0 | 25,9 | |
| 35,7 | 4,0 | 8,0 | 27,7 | |
| 35,7 | 5,0 | 10,0 | 27,9 | |
| 53,6 | 2,0 | 4,0 | 25,4 | |
| 53,6 | 4,0 | 8,0 | 30,4 | |
| 53,6 | 5,0 | 10,0 | 36,1 |
A reakció körülményei:
puffer: 25 mmol/1 Trisz-HCl, pH=9,0 hőmérséklet: 25 °C időtartam: 24 óra
3. példa
Az Apó Al-M/Apo Al-M rekombináns előállítása a) A pKP644 expressziós vektor felépítése Az M13mpl8 bakteriofág Apolipoprotein Al-M cDNS kódját tartalmazó replikatív formáját (Sharpé, C. R. et al, Nucleic Acid Reserarch, Vol. 12, No 9, p. 3917. 1984, valamint Cheung, M. C. et al., Biochem. Biophys. Acta 960, pp. 73-82, 1988) BamHI restrikciós enzimmel emésztettük, és Low Gelling Temperature (LGT) agarózgél-elektroforézissel tisztítottuk.
Az Apó Al-M génnek megfelelő 822 bp nagyságú fragmentumot kivágtuk, és az előzetesen BamHI-vel emésztett és borjúból foszfodiészterázzal kezelt pUC9 plazmidhoz kapcsoltuk.
A ligációs keverékkel transzformáltuk a megfelelő E. coli JM83 törzset, és az ampicillin-, Χ-Gal-, valamint IPTG-tartalmú agaron felnövő fehér kolóniákat felszedtük. A plazmid DNS-t a gyártó cég előírásainak megfelelően QuiaGene oszlopokon preparáltuk és tisztítottuk (QuiaGene Inc, 9259 Eton Ave. Chatsworth, Cal. 91 311 USA). Az így keletkező pUC/Apo Al-Mnek nevezett plazmidot EcoRI és Ncol restrikciós endonukleázokkal emésztettük. A megfelelő orientáció ellenőrzése céljából a megemésztett keverék egy alikvotját agaróz elektroforézissel analizáltuk. Egy másik alikvot felhasználásával kötöttük hozzá a szintetikus „AApoAlEco” (4. ábra) linkért az Apó Al-M gén 5’-végére, és így állítottuk elő a 724 bázispárból álló AApo Al gént. A AApo Al-M szekvencia egy Asp-Pro helyet képez a kódolt protein N-terminálisán, amely megfelelő hasítási hely a hangyasav számára. A megfelelő E. coli JM83-as törzset a ligációs keverékkel transzformáltuk, és a keletkező pUC/ΔΑρο Al-M elnevezésű plazmidot QuiaGene oszlopokon izoláltuk a fenti leírás szerint.
A pUC/ΔΑρο Al-M plazmidot, valamint a pEZZ expressziós vektort EcoRI-vel és BamHI-vel emésztettük, LGT agaróz elektroforézissel tisztítottuk, majd ezek után a pUC/ΔΑρο Al 799 bázispár nagyságú és a pf pEZZ 2763 bázispár nagyságú ffagmentjét összekapcsoltuk. A ligációs keverékkel transzformáltuk a megfelelő E. coli RV308 törzset és a plazmid DNS-t a fentebb már ismertetett módon preparáltuk.
A kísérletek részletes leírását lásd Sambrook, J., Fritsch, E. F. és Maniatis, T. (1989) Molecular Clonings; A Laboratory Manual, 2nd edit., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. című könyvében.
A keletkező plazmidot pK644-gyel jelöltük (5. ábra).
b) A ΖΖ-ΔΑρο Al-M fuzionált fehéije expreszsziója
Az E. coli RV308-at 50 mg/ml kanamycintartalmú
LB-ben egy éjszakán át inkubáltuk 30 °C-on a pKP644 plazmiddal, majd 40 ml kultúra felülúszót 2x500 ml 0,2 g/1 Casaminosawal, 1 mmol/1 MgSO4-tal, 0,25% glükózzal és 50 mg/ml kanamycinnel kiegészített minimál médium A-ba (Curr. Meth. in Mól. Bioi.) oltottuk. A tenyészetet erőteljes keverés közben 24 óráig 37 °C-on inkubáltuk.
c) Az Apó Al-M előzetes tisztítása
A leírt plazmidot tartalmazó E. coli tenyészet (RV308/pK644) 1 literét centrifugáltuk, a leülepedett sejteket 30 ml 6 mol/1 Gdn-HCl-tartalmú 1 χ TS-ben (25 mmol/1 Tris HC1, 0,2 M NaCl, 1 mmol/1 EDTA) felszuszpendáltuk, és egy French Pressén (SLM Instruments Inc.) 1000 psi nyomással egyszer átnyomva homogenizáltuk. A keletkező szuszpenziót 1 órán át enyhe rázás közben szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd lecentrifugáltuk. Ezután a felülúszót 1 mol/1 GdnHC1 végső koncentrációra (vagyis 6 szorosára) hígítottuk, és 15 ml-es lxTS-sel egyensúlyba hozott Sepharose Fastflow IgG oszlopra vittük fel. Ezután az oszlo6
HU 217 203 Β pót 5 oszloptérfogatnak megfelelő lxTS-sel, majd 20 mmol/1 ammónium-acetáttal, pH=5,4, mostuk addig, amíg az eluátum pH-ja el nem érte az 5,4-es értéket. A kötődött anyagot 25 ml 0,2 mol/1 HAc-vel mostuk le és a frakciók abszorbanciáját 280 nm-en (A280) mértük. A sejttenyészet 1 literéből az A280 érték alapján számolva 1,9 mg anyagot nyertünk.
d) A fúziós protein tisztítása
Az eluátumot alikvotokban liofilizáltuk, és 75, 50 valamint 25%-os hangyasavban felszuszpendáltuk. Az oldatokat 37 °C-on 28 óráig inkubáltuk és a hangyasav eltávolítása végett liofilizáltuk. A hasítási termékeket SDS-PAGE-val és ezt követően Westem-analízissel vizsgáltuk. Hozzávetőleg 5 mg teljes proteint vittünk fel a 8-25%-os gradiens SDS-PAGE gélre nem redukáló körülmények között. Minden mintát kétszer fúttattunk meg. Az egyik gélt Coomassie-val festettük meg, a másikat a Westem-analízis során használtuk fel. A kísérletek eredményét a 6. ábra mutatja. Egy hasadási termék együtt vándorol a tisztított natív Apó Al-lal és a Westem-analízisben is jelet ad. A Westemanalízist tormaperoxidázzal konjugált poliklonális ellenanyagokkal (The Binding Site, Ltd., Cambridge) végeztük, és az eredményt a standard eljárással tettük láthatóvá.
A 6. ábra a fúziós protein hasítása után keletkező molekulák analízisének eredményét mutatja. „A” panel: Coomassie-val festett SDS-PAGE gél (8-25%).
1. sor: 25% hangyasav, 2. sor: 50% hangyasav, 3. sor: 75% hangyasav; 4. sor: tisztított natív Apó Al (Sigma) és 5. sor: LMW kontroll (Pharmacia). „B” panel: a második gél Westem-analízise. 1. sor: tisztított, natív Apó Al (Sigma); 2. sor: 75% hangyasav, 3. sor: 50% hangyasav; 4. sor: 25% hangyasav. A Westem-analízisben az Apó Al-M molekulatömegének kétszeresénél lévő sáv a dimer Apó Al-M jelenlétére utal.
4. példa
Az Apó Al-M bioreaktorban történő előállítása
Az Apó Al-M a periplazmikus térbe és a médiumba való közvetlen szekrécióját biztosító vektorok előállítása.
Törzsek és vektorok. A felhasznált Escherichia coli KI2 törzsek a következők voltak: HB101 F~, hsd S20(rB~, mB-) supE44, HB101 F~, hsd S20(rB~, mB ), supE44, ara 14, U, galK2, lacYl, proA2, rspL20, xyl-5, mtl-1, recA13, rB , mB~, mcrA(+), mcrB(+) (Boyer et al. J. Mól. Bioi. 41:459-472, 1969), DH5a F-, F80DlacZDM15, D(lacZYA-argF)U169, recAl, endAl, gyrA, I-, thi-I, hsdR17, (rk--,mk+), supE44, relAl, (BRL, USA). RV308 DlacX74, galOP: :IS2(galOP308), strA, I- (Maurer et al. J. Mól. Bioi. 139:147-161, 1980), és BC50 xyl-7, ara-14, T4-R, U. A HB101 és a DH5a törzseket a DNS-fragmentumok szubklónozására használtuk fel. A pUC9 plazmidot (Vieira et al., Gene 19:259-68, 1982) az S. Sidoliból (Milano) származó humán Apó Al cDNS kópia 821 bázispár hosszúságú BamHI fragmentjének szubklónozására használtuk. A humán Apó Al cDNS nukleotidszekvenciáját a GenBankból lehet megszerezni, a száma X02162 (Seilhammer et al., DNA 3:309-317, 1984). A vektor a pKP575 nevet kapta. A humán Apó Al-M DNS (az S. Sidoliból nyert cDNS kópia) 856 bázispár hosszúságú EcoRI-Pst I fragmentumát szintén a pUC9 plazmiddal szubklónoztuk. Ezt a terméket pKP576-tal jelöltük. A pKP683 és a pKP764 plazmidok a pTrc 99 plazmidok (Amannetal., Gene. 69:301-15,1988), egy, apUC4-Kból (Vieira et al., Gene. 19:259-268,1982. és Okaetal., J. Mól. Bioi. 147:217, 1981) származó kanamycinrezisztencia marker eredetű transzpozont (Tn903) tartalmazó pUC származék, valamint a pUEX2 fd bakteriofág transzkripció terminátorainak (T1T2) származékai (Bressan et al, 1987. Nucleic Acid. Rés. 15:10056).
A felhasznált módszerek. A plazmid DNS preparálása, valamint a kis mennyiségű expressziós analízis céljából a baktériumtörzseket 50 pg/ml ampicillinnel (Ap) vagy 70pg/ml kanamycinnel (Km) kiegészített Luria Berani (LB) vagy élesztő trypton (2xYT) médiumban tenyésztettük (Sambrook et al., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press). A sejtek agaron történő tenyésztéséhez 50 pg/ml Ap-nel és 70 pg/ml Km-nel szupplementált triptóz vér agar (Difco USA) alapot használtunk. A rekombináns DNS-technikákat a már idézett referenciának megfelelően hajtottuk végre (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). A restrikciós endonukleázokat és a T4 DNS ligázt a Boehringer Mannheim (Germany), a New England Biolabs (Beverly, USA) vagy a Pharmacia (Uppsala, Sweden) cégektől igényeltük. Az izopropilβ-D-galaktozidáz (IPTG) a Sigmától (USA) származott. A DNS-fragmentumok izolálására alacsony hőmérsékleten szilárduló és megolvadó agarózt (NuSieve GTG, FMC Bioproducts, USA) használtunk. Az amplifikációkat a PCR-ben a Perkin-Elmer/Cetus Instrumentstől (Norwalk, USA) származó DNS termál ciklizálóval és Taq DNS-polimerázzal végeztük. Az oligonukleotid linkereket és primereket PharmaciaLKB Gene Assembler Plus (Pharmacia, Uppsala, Sweden) segítségével a szilárd fázisú foszfit triészter módszer felhasználsával szintetizáltuk. A nukleotidszekvenciát az Applied Biosystem 373A DNS szekvenálóval a Taq DyeDeoxy™ Terminator Cycle szekvenáló kit (Applied Biosystem, USA) felhasználásával határoztuk meg.
A felhasznált DNS-számítógépprogramok. A plazmidtérképek megrajzolásához a Macintosh PlasmidARTIST (1.2 verzió) (Clontech, USA) programját, míg a DNS-szekvenciáknak a Digital VAX rendszerben történő kezeléséhez a GCG szekvenciaanalízis szoftvercsomagot (Genetics Computer Group, Inc, Madison Wisconsin USA) használtuk.
Az Apó Al-M keletkezése, expressziója és szekréciója a baktériumokban. A vektorok konstrukciójával az volt a célunk, hogy az Apó Al-M molekulát szekretáló E. coli rendszert fejlesszünk ki, amelyre az jellemző, hogy az Apó Al-M nagy mennyiségben szekretálódik a médiumban.
Két oligonukleotidot szintetizáltunk annak érdekében, hogy az Apó Al és az Apó Al-M cDNS-ét a bakteriális szignálszekvenciákat kódoló DNS-fragmentumokhoz fuzionáltathassuk. A pKP575 plazmid 14 bá7
HU 217 203 Β zispár hosszúságú EcoRI és Ncol, valamint a 40 bázispár hosszú Ncol fragmentumát a szintetikus 37 bázispár hosszú EcoRI Ncol fragmentummal helyettesítettük, így kaptuk a pKP580 elnevezésű plazmidot. Az ebben a szintetikus DNS-fragmentumban lévő Bbsl hasítási hely megegyezik az Miül hasítási hellyel, amely különböző, bakteriális szignálszekvenciákat kódoló fragmentumok klónozását teszi lehetővé. A pKP631 plazmidot úgy konstruáltuk, hogy a pKP575 (Apó Al) plazmid 702 bázispár hosszú NcoI-DralII fragmentumát helyettesítettük a pKP576 (Apó Al-M) 702 bázispár hosszú NcoI-DralII fragmentumával. A pKP682 plazmidból egy 820 bázispár hosszú BbsI-HindlII fragmentumot izoláltunk és a pKP683 plazmidvektor Miül és HindlII helyére inzertáltuk. Ez a vektor tartalmaz egy tac-promotert (Ptac), amely egy ompA szignálszekvencia származéka, valamint két transzkripciós terminátort és egy kanamycinrezisztencia markert. A pKP682-ból izoláltunk egy 1501 bázispár hosszúságú Nlul-Nrul fragmentumot és ugyanabba a vektorba inzertáltuk oly módon, hogy a Ptac promotert a Ptrc promoterrel helyettesítettük. Ezt az expressziós vektort pKP683-mal jelöltük. A pKP683 plazmidot úgy konstruáltuk, hogy a pKP683 plazmid 88 bázispár hosszú DralII-HindlII szakaszát egy erősebb transzlációs terminátorokat tartalmazó, 14 bázispár hosszúságú szintetikus DNS-fragmentummal helyettesítettük, és egy, a DralII kilógó 3’végére kapcsolt A bevezetésével tönkretettük a DralII helyet. Az E. coli transzformációját a már idézett referencia alapján hajtottuk végre (Sambrook et al., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Az expressziós kísérletek, valamint az Apó Al-M produkció során felhasznált plazmidkonstrukciókat restrikciós enzim térképezéssel elemeztük, az Apó Al-M strukturális génjét nukleotidszekvenálással határoztuk meg. A megfelelő plazmidokat tartalmazó, bioreaktorban tenyésztett E. coli törzseket a következőképpen állítottuk elő. A sejteket hagytuk szaporodni egy éjszakán át Km-nel szupplementált LB vagy 2xYT médiumban 30 °C-on rázóflaskákban. Centrifugálás után a sejteket az eredeti térfogat felének megfelelő fagyasztómédiumban (Gergen et al., Nucleic Acid Rés. 7:2115, 1979) szuszpendáltuk fel. Az alikvotokat 1 ml-es fagyasztóedényekbe töltöttük, és a további felhasználásig - 75 °C-on tároltuk.
A bioreaktorban tenyésztett sejtek növesztési médiumai. „A” médium: 16 g/1 trypton (Difco, USA), 8 g/1 élesztőkivonat (Difco, USA), 5 g/1 NaCl, valamint 0,05 g/1 kanamycin. „B” médium: 2,5 g/1 (NH4)2SO4, 3 g/1 KH2PO4, 2 g/1 K2HPO4, 0,5 g/1 Narcitrát, 5 g/1 élesztőkivonat (Difco, USA). Sterilizálás után a médiumot kiegészítettük a következőkkel: 10 g/1 kezdeti glükóz, 0,05 g/1 kanamycin, 1 g/1 MgSO4x7H2O és 0,07 g/1 tiamin-hidroklorid. A médiumokhoz ezenkívül nyomelemoldatot (1 ml/1) és vitaminoldatot (0,65 ml/1) adunk. A nyomelemoldat összetétele a következő: 27 g/1 FeCl3x6H2O, 4 g/1 ZnSO4x7H2O, 7 g/1 CoC12x6H2O, 7 g/1 Na2MoO4x2H2O, 8 g/1
CuSO4x5H2O, 2 g/1 H3BO3, 5 g/1 MnSO4x4H2O, g/1 CaCl2 x 2 H2O, valamint 50 ml/1 HC1. A vitaminoldat összetétele a következő: 0,5 g/1 kalcium-pantotenát, 0,5 g/1 kolin-klorid, 0,5 g/1 folsav, 1 g/1 inozitol, 0,5 g/1 nikotinamid, 0,5 g/1 piridoxin-hidroklorid, 0,05 g/1 riboflavin, valamint 0,5 g/1 tiamin-hidroklorid. Az oldat habosodásának megakadályozására adekanolt (0,2 ml/1) használtunk. Ha szükségesnek találtuk, további habosodásgátlókat alkalmaztunk a tenyésztés során.
Az RV308/pK683 tenyésztése 3,5 literes bioreaktorban. A fagyasztott kultúrát 500 ml „A” médiumba oltottuk és 2 literes csavart nyakú Erlenmeyer-lombikban 30 °C-on 8-10 óráig előinkubáltuk. A bioreaktor munkatérfogat 10%-ának megfelelő térfogatú sejtszuszpenziót vittünk át a bioreaktorba.
A tenyésztést 3,5 literes bioreaktorban (Belach AB, Sweden) 2,5 literes munkatérfogattal végeztük. A hőmérséklet 30 °C volt a növekedési fázis alatt indukció előtt, majd 37 °C-ra emelkedett. A pH-t 25%-os ammóniaoldattal 7,0-en tartottuk. A szellőzési ráta 1 vvm volt, és az oldott oxigén nyomását (dissolved oxygen tension, D.O.T.) a szellőztető sebességének szabályozásával 30%-on tartottuk. Miután a kezdeti glükóz elfogyott, egy glükózzal etetett adagot kezdtünk, majd a rendszer növekedését az oldat 60%-ának megfelelő glükóz adagolásával a glükózzal szabályoztuk. A kezdeti etetési sebességet (0,04 g/perc) 3 órán át tartottuk, majd 3 óra alatt fokozatosan 0,4 g/percre emeltük. A sejtnövekedést az optikai sűrűség (optical density, OD) változásának követésével kísértük figyelemmel. A felülúszó Apó Al-M koncentrációját radioimmunoesszével (Apolipoprotein Al RIA 100 kit, kát. no. 109152-01. Rabi Pharmacia, Sweden) határoztuk meg. 16 óra tenyésztés és 58-as OD-érték elérése után a fehérjeszintézist 0,5 mmol/1 IPTG hozzáadásával indítottuk be, és a hőmérsékletet 37 °C-ra emeltük. A fehéijeszintézis megindulása után 4 órával az Apó Al-M koncentrációja 2,3 g/1 volt, 2 óra múlva 2,5 g/1.
A BC50/pKP764 tenyésztése 3,5 literes bioreaktorban. A tenyésztést a fentiekben leírtakhoz hasonlóan hajtottuk végre azzal a különbséggel, hogy a bioreaktor médiumához nem adtunk kanamycint. 15 óra és 60-as OD-érték elérése után IPTG-t adtunk a tenyészethez és megemeltük a hőmérsékletet. 10 óra múlva az Apó AlM koncentrációja a felülúszóban 3,7 g/1, 22 órával a tenyésztés megindítása után pedig 4,4 g/1 volt.
A BC50/pKP764 tenyésztése 300 literes bioreaktorban. A tenyésztéshez egy 300 literes, 180 liter munkatérfogatú bioreaktort (Chemoferm AB, Sweden) használtunk. Az oltóanyagot egy 3,5 literes bioreaktorban az RV308/pKP683 tenyésztésekor leírtaknak megfelelően állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy az előinkubálási idő a rázkódó lombikokban 14 óra volt. Az oltóanyagot egy 18 liter munkatérfogatú, 50 liter magbioreaktorba vittük át. Mind a rázólombikokban, mind a bioreaktorban „A” médiumot használtunk. A médiumot a magbioreaktorban 5 g/1 glükózzal szupplementáltuk, s a hőmérsékletet 30 °C-on tartottuk. A pH és a szellőztetés megegyezett azzal, amit az RV308/pKP638 3,5 literes bioreaktorban történő te8
HU 217 203 Β nyésztésénél leírtunk, a D.O.T. sosem volt 30%-nál alacsonyabb. Amikor a sejttenyészet felülúszója elérte a 4-es OD-t, a magbioreaktor tartalmát a 300 literesbe helyeztük át. Ebben a bioreaktorban a hőmérséklet, a pH és a médium szellőztetése megegyezett az RV308/pKP683 3,5 literes bioreaktorban történő tenyésztésénél leirt értékekkel. A tenyésztés megkezdése előtt a D.O.T.-ot 30% fölötti vagy ekörüli értéken tartottuk úgy, hogy a szellőztető sebességét a maximumra állítottuk, és ezután növeltük a légnyomást. A tenyésztés megkezdése után a légnyomást 2 bárrá növeltük, ami 15-20% D.O.T.-ot eredményezett. A bioreaktorban történő tenyésztés 16. órája után, amikor a sejttenyészet felülúszója elérte az 51-es OD-t, a tenyészethez IPTG-t adtunk és a hőmérsékletet 37 °C-ra emeltük.
órával a tenyésztés megindítása után az Apó Al-M monomer és dimer formájának egyaránt 1,3 g/1 volt a koncentrációja, és a következő órában, amíg a bioreaktor lehűlt, az Apó Al-M koncentrációja 1,5 g/l-re növekedett.
Az oldatban lévő monomereket a hagyományos módszereknek megfelelően dimerré alakítottuk és tisztítottuk.
5. példa
A plazmából származó Apó Al-M/Apo Al-M jellemzése
Az 1. példában előállított tisztított Apó Al-M/Apó Al-M a túlterhelt, nem redukáló SDS-PAGE gélen egy sávot adott. Analitikai SDS-PAGE-n a fehérje látszólagos molekulatömege, ahogy az előre látható volt, 56 kD volt. Nem redukált denaturált IEF gélen az Apó Al-M/Apo Al-M komplex izoform mintát mutatott, amelyre az 5,3-5,6 pl tartományban elhelyezkedő, legalább 6 különböző fehéijesáv a jellemző.
Az Apó Al-M/Apo Al-M (1,1 mg/ml) UV-spektruma 280 nm-nél tipikus abszorbanciamaximumot mutatott, 290,2 nm-nél egy vállal (7. ábra). A számított fehérje E (1 cm, 1%) 280 nm-nél 16,9 volt. A tirozin oldalláncok számának meghatározása céljából Ragone (Ragone, R. et al., Determination of tyrosine exposure in proteins by second-derivative spectroscopy. Biochemistry 23:1871-1875, 1984) leírásának megfelelően az UV-spektrum második derivált analízisét hajtottuk végre. Az UV-spektrumok második deriváltjai 283 és 290,5 nm középponttal tipikusan két minimumot, 287 és 295 nm-nél tipikusan két maximumot mutattak (8-10. ábrák). A tirozinláncok relatív szabadsági foka (alfa) a natív Apó Al-M/Apo Al-M, illetve az Apó Al-M/Apo Al-M + DMPC 0,75, illetve 0,49 volt (2. táblázat).
2. táblázat
Az Apó Al-M/Apo Al-M fehérje jellemzői
| Apó Al-M/Apo Al-M | Apó Al-M/Apo Al-M + DMPC | |
| Molekulatömeg | 56,0 | |
| Izoelektromos pont | 5,3-5,61 |
| Apó Al-M/Apo Al-M | Apó Al-M/Apo Al-M + DMPC | |
| UV-spektrum: | ||
| E (1 cm, 1%) | 16,92 | |
| Szabad tirozin (alfa) | 0,752 | 0,492 |
| Fluoreszcens spektrum: | ||
| Exc. hullámhossz max. (nm) | 280 | 280 |
| Em. hullámhossz max. (nm) | 344 | 338 |
| CD-spektroszkópia: | ||
| alfa-hélix (%) | 52,2’ | 66,P |
| 57,84 |
1 legalább 6 izoform a denaturált IEF gélben 2 a magas érték sok szabad tirozinra utal 3 a fehérjekoncentráció: 0,1 mg/ml 4 a fchérjckoncentráció: 1,1 mg/ml
Az Apó Al-M/Apo Al-M molekulának mind a gerjesztési, mind az emissziós fluoreszcens spektrumát felvettük. Az Apó Al-M/Apo Al-M triptofanil maradékainak excitációs maximuma 280 nm-nél volt és ez nem változott a DMPC-vel való kapcsolódás után. Az emissziós spektrum (geijesztés 280 nm-en) 344 nm-nél mutat maximumot (11. ábra); a DMPC-vel való kapcsolódás ennek a maximumnak a kék felé való eltolódását eredményezte (338 nm), amely a maximumnál a fluoreszcenciaintenzitás 24%-os növekedésével járt (11. ábra).
Az Apó Al-M/Apo Al-M távoli UV CD-spektrumra 208 és 222 nm-nél tipikus minimumok, 195 nm-nél pedig maximum a jellemző (12. ábra). Az alfa-helix-tartalom a fehéijekoncentrációnak 0,1 mg/ml-ről 1,1 mg/mlre való növekedésével szignifikánsan emelkedik (12. ábra, 2. táblázat). Az Apó Al-M/Apo Al-M (0,1 mg/ml) DMPC-vel történő kapcsolódása a fehérje alfa-hélixstruktúrában további növekedést idézett elő (12. ábra,
2. táblázat).
A TERMÉK JELLEMZÉSÉRE SZOLGÁLÓ
MÓDSZEREK
A foszfolipidekkel történő inkubálás
A dimirisztoil-foszfatidil-kolin (DMPC) kimért mennyiségét etanolban feloldottuk és az oldószert N2ben elpárologtattuk; az oldószer fennmaradó része a 2 órás vákuumkezelés következtében távozott el. A DMPC 20 mmol/1 foszfátpufferben (pH = 7,4) lévő diszperzióját 100:1 =DMPC:Apó Al-M/Apo Al-M arányban adtuk hozzá az Apó Al-M/Apo Al-M oldathoz úgy, hogy az Apó Al-M/Apo Al-M végső koncentrációja 0,1 mg/ml legyen.
Spektroszkópia
Az Apó Al-M/Apo Al-M oldatokat 20 mmol/1 foszfátpufferrel szemben dializáltuk (pH=7,4), és ugyanezzel a pufferrel a kívánt fehérjekoncentrációra hígítottuk.
Az Apó Al-M/Apo Al-M és az Apó Al-M/Apo AlM + DMPC oldatok normál és második derivált UVspektrumát Jasco Uvidec-610, valamint Perkin Elmer
HU 217 203 Β
Lambda-2 spektrométerrel mértük meg 25 °C-on 1 cm-es kvarcküvettában. A tirozinmaradékok topográfiai helyzetét Ragone et al. (Ragone, R, Colonna, G., Balestrieri, C., Servillo, L., Irace, G., Determination of tyrosine exposure in proteins by second-derivative 5 spectroscopy. Biochemistry 23:1871-1875, 1984) képletének megfelelően vizsgáltuk:
alfa=(rn-ra)/(ru-ra) ahol az alfa a tirozin szabadsági foka az oldatban, rn és ru a derivált csúcsok arányai (a/b) a natív, illetve a 10 denaturált (6 mmol/1 Gdn-HCl-dal) Apó Al-M/Apo AlM esetében, ra pedig az annak az oldatnak a második derivált csúcsaránya, amely a szabad tirozint és triptofánt ugyanolyan arányban tartalmazza, mint az Apó Al-M/Apo Al-M. 15
Az Apó Al-M/Apo Al-M, és az Apó Al-M/Apo AlM + DMPC oldatok belső fluoreszcens spektrumát 25 °C-on Jasco FP-550 típusú spektrofotométerrel határoztuk meg.
Az Apó Al-M/Apo Al-M, valamint az Apó Al- 20 M/Apo Al-M + DMPC cirkuláris dikroizmus (CD) spektrumát 25 °C-on Jasco J500A spektropolariméterrel határoztuk meg. Az átlagos maradék ellipticitás értékeket [THEYA] fokxcm2xdmol 1 mértékegységben, a következő egyenlet alapján fejeztük ki 25 [THEYA] = [THEYA] x 106 lOxlxc, ahol a [THEYA] érték a megfigyelt ellipticitás fokokban kifejezve, 106 a fehérje átlagos maradék molekulatömegét jelenti, 1 a fényút cm-ekben, c a fehérjekoncentráció g/ml-ben kifejezve. Az alfa-helix százalékos arányát a következő egyenlet felhasználásával számítottuk ki:
% alfa-helix= [THEYA]208 nm - 4000 33 000-4000 (Greenfield, N., Fasman, G. D., Computed circular dichroism spectra fór the evaluation of protein conformation. Biochemistry 8:4108-4116, 1969). 40
Elektroforézis
Az analitikai izoelektromos fokuszálást és az SDS-PAGE-t a már leírtaknak megfelelően hajtottuk végre (Franceschini, G., Sirtori, M., Gianfranceschi, G., Sirtori, C. R. Relation between the HDL apoproteins 45 and Al isoproteins in subjects with the Al-M abnormality. Metabolism 30:502-509, 1981).
Az izoelektromos fokuszálást 6 mol/1 karbamidot és 4% amfolint tartalmazó 10%-os akrilamidgélen végeztük. Az egész éjszakán át tartó fokuszálás után a géleket 50 fixáltuk és ecetsavas/izopropil-alkoholos Coomassie Brilliant Blue R-250-nel festettük. Az ismeretlen fehérjecsíkok izoelektromos pontját (pl) a megfelelő migrációs távolság alapján már ismert fehérjék (ismert BioRad minták és az apo-HDL) pl-jének felhasználásával 55 számítottuk ki.
SDS-PAGE-hoz 0,1% SDS-tartalmú 14%-os akrilamidgéleket használtunk. A géleket a fentebb leírtaknak megfelelően kezeltük, és az ismeretlen fehérjék molekulatömegét a megfelelő migrációs távolság és is- 60 mert fehérjék (KABI-Pharmacia) logMW-jének felhasználásával számítottuk ki.
Magas felbontású tömegkizárásos kromatográfia (HPSEC)
Az analitikai HPSEC elválasztásokat 10 pm-es TSKG3000 SW oszloppal (7,5x300 mm) felszerelt Jasco folyadékkromatográffal végeztük. A HPSEC oszlopot 7,2 pH-jú, 0,1 mol/1 NaCl- és 8 mol/1 karbamidtartalmú 0,1 mol/1 foszfátpufferrel hoztuk egyensúlyba és ugyanezzel a pufferrel is mostuk. A fehéqéket 0,5 ml/perc áramlási sebességgel eluáltuk, az extinkciót 220 nm-en olvastuk le, a csúcsokhoz tartozó integráltakat HP-3390 típusú integrátort használva határoztuk meg.
6. példa
Az Apó Al, az Apó Al-M és az Apó Al-M/Apo Al-M molekulát tartalmazó rHDL-részecskék előállítása Nagy sűrűségű lipoprotein-részecskéket állítottunk újra össze (reconstituted high density lipoprotein particles, rHDL) a Nichols által ismertetett módszerrel (Nichols, A. V. et al. Biochim. Biophys Acta 750:353-364, 1983. valamint Matz, C. E. et al., J. Bioi. Chem. 257:4535-4541, 1982).
A rekombináns Apó Al-M dimert (lásd 4. példa) és a humán plazmából tisztított normál Apó Al-t 10 mmol/1 Tris-HCl, 0,15 mol/1 NaCl, 0,01% EDTA, 0,006% NaN3 összetételű, 8,0 pH-jú pufferben („A” puffer) oldottuk fel, amely 4 mol/1 Gdn-HCl-ot tartalmazott 6 mg/ml koncentrációban. Összehasonlításképpen az Apó Al-M/Apo Al-M egy részében a diszulfidhidakat redukáltuk oly módon, hogy az „A” + GdnHC1 pufferhez 20 mmol/1 DDT-t adtunk. A fehérjéket kimerítően dializáltuk az „A” pufferrel szemben, és ugyanezzel a pufferrel 5,2 mg/ml-re hígítottuk.
Foszfolipideket, tojás foszfatidil-kolint (egg phosphatidylcholine, EPC), vagy palmitoiloleil-foszfatidilkolint (palmitoyloleylphosphatidylcholine, POPC) oldottunk fel CHCl3-ben, N2-ben kiszárítottuk, és egy éjszakán át vákuum alatt tartottuk. Ezután annyi Nakolátot adtunk az oldathoz, hogy a kólát:PC tömegarány 0,55 legyen, majd 3 percig erőteljesen kevertük az oldatot szobahőn, és 4 °C-on 2 óráig inkubáltuk. Ezután annyi fehérjét adtunk hozzá, hogy a PC:fehérje tömegarány 2,17 (POPC) vagy 2,47 (EPC) legyen, az elegyet 3 percig kevertük szobahőmérsékleten és egy éjen át inkubáltuk 4 °C-on. Az inkubálás után a keveréket 5 napon át dializáltuk az „A” pufferrel szemben, majd 11000 fordulatszám/perc fordulatszámmal 5 percig Beckman-mikrofugában centrifugáltuk és a felülúszót összegyűjtöttük.
Az rHDL partikulumokat nem denaturáló poliakrilamid gradiens gélelektroforézissel (GGE) szeparáltuk, és a részecskék méretét a Nichols által leírt módszerrel határoztuk meg (Nichols, A. V. et al., in Meth. Enzymol. 128:417-431, 1986).
A fentiekben leírt művelet végrehajtása után majdnem az összes vizsgált apolipoprotein kapcsolódott a lipidekhez, ahogy azt a GGE géleken látható igen alacsony lipidmentes apolipoprotein csúcs bizonyítja. A fehérje az rHDL partikulumokból 68-100%-ban
HU 217 203 Β visszanyerhető, ezt 10 különböző preparátum esetében bizonyítottuk.
Rekonstruált HDL-részecskék GGE profiljait mutatja a 13. ábra. Az Apó Al vagy az EPC molekulával rekonstruált HDL nagy, 9,6 nm átmérőjű csúcsot ad a GGE gélen; ezenkívül kis mennyiségben kisebb vagy nagyobb átmérőjű más összetevők is kimutathatók voltak. Az EPC és Apó Al-M/Apo Al-M tartalmú rHDLrészecskék két kifejezett (8,6 és 12,9 nm átmérőjű) és két kevésbé kifejezett (7,9 és 10,8 nm átmérőjű csoportot alkottak (13. ábra); ugyanilyen méretű partikulumokat kaptunk, amikor az Apó Al-M/Apo Al-M molekulát POPC-vel rekonstruáltuk.
Mindhárom lipoprotein majdnem teljes mértékben képes volt beépülni a stabil lipid-protein komplexekbe különböző méretű, megoszlású és összetételű rHDL partikulumokba. Konkrétan a rekombináns Apó AlM/Apo Al-M molekulát tartalmazó rHDL-részecskék kétkomponensűek, a nagyobb egyedülálló az Apó AlM tartalmú rHDL partikulumok között.
Az Apó Al-M/Apo Al-M BIOLÓGIAI ÉRTÉKELÉSE
7. példa
Az Apó Al-M dimer és monomer kinetikai viselkedése normál recipiensekben
Humán kinetikai kutatások szerint a dimer molekulák hosszabb ideig cirkulálnak a vérkeringésben.
Egészséges önként jelentkezők 125I-dal jelölt Apó Al-M vagy Apó Al-M/Apo Al-M szuszpenziót kaptak intravénásán. A 3. táblázat a molekulák két különböző modell alapján kiszámított, órában kifejezett féléletidejét (Bt1/2), valamint szakaszos katabolikus rátáját (fractional catabolic rata, FCR) mutatja. Mindkettő azt bizonyítja, hogy a dimer katabolizmusa lényegesen lassabb, mint a monomeré.
Az Apó Al-M/Apo Al-M nagyon lassú lebomlása arra utal, hogy ezek a molekulák gátolják a lipoprotein konverziót és valószínűleg az Apó Al-M-molekula hatékony prekurzoraként játszanak fontos szerepet. Ezért könnyű előre megjósolni, hogy az Apó Al-M/Apo Al-M injekciójának eredményeként a molekula hosszú ideig jelen lesz a plazmában, ahol közvetlenül hatással van a lipoprotein metabolizmusra és a fibrinolitikus rendszerre.
3. táblázat
Az Apó Al-M/Apo Al-M, valamint az Apó Al-M monomer kinetikai viselkedése normál recipiensekben (n=2)
| Apó Al-M | Apó Al-M/ Apó Al-M | ||
| Monoexponenciális mód | flt,/2(h) | 16,07 | 52,04 |
| MRT (h) | 23,19 | 75,09 | |
| Biexponenciális mód | Bfi/2 (h) | 22,61 | 70,29 |
| MRT (h) | 28,97 | 89,16 | |
| FCR (h) | 2,3% óránként | 1,1% óránként |
Az Apó Al-M/Apo Al-M molekulának a fibrinolitikus rendszerre gyakorolt hatása
Bevezetés
A fibrinolitikus rendszer a legfontosabb védekezés a véredények falán történő fibrinlerakódás ellen, és mint ilyen ez a rendszer fontos szerepet játszik a trombózis elleni védekezésben.
A fibrin liziséért felelős enzim a plazmin. A plazminspecifikus aktivátorok (szöveti plazminogénaktivátor, t-PA és urokináz, uPA) hatására keletkezik inaktív prekurzorából, a plazminogénből. Mind az aktiválódási folyamatot, mind pedig a plazmin hatását specifikus inhibitorok - a plazminogénaktivátor inhibitor 1 (PAI), illetve az cx2 antiplazmin - szabályozzák. A következő ábra a fibrinolitikus rendszer sémáját mutatja.
PLAZMINOGÉNAKTIVÁTOROK -------PAI
PLAZMINOGÉN------PLAZMIN
------a2 ANTIPLAZMIN
FIBRIN-------FDP
FDP=fibrin degradációs termék
A 7. és 8. példában ismertetett vizsgálatok célja az volt, hogy megismerjük az Apó Al-M dimereknek a humán fibrinolitikus rendszerre gyakorolt hatását. Megvizsgáltuk a plazminogén autoaktivációját, illetve az uPA és a t-PA hatására bekövetkező aktivációját az Apó Al-M/Apo Al-M jelenlétében és hiányában. Kontrollként plazmából izolált humán Apó Al-t használtunk (Sigma, kát. no.: 9284).
A fibrinolitikus rendszer aktivációját kromogén szubsztrátok segítségével határoztuk meg. Ezek a szubsztrátok egy paranitro-anilin (p-NA) nevű kromogén csoportot tartalmaznak, amely a plazmin hatására lehasad a szubsztrátmolekuláról. A szabad p-NA erős sárga színű, ez 405 nm hullámhosszon könnyen kimutatható. A felszabadult p-NA mennyisége egyenesen arányos a keletkező enzimaktivitással.
Minden mérést a 2.01 SOFTmax™ program (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA) által vezérelt THERMOmax microplate reader segítségével végeztünk el.
Az ezekben a vizsgálatokban felhasznált anyagokat a 4. példában már ismertetett módon rekombináns formában állítottuk elő. A tisztítás ioncserével, hidrofób interakcióval, gélszűrő kromatográfiával, majd ezeket követően ultrafiltrációval és fagyasztva szárítással azaz hagyományos biokémiai módszerekkel - történt. Minden készítmény több mint 90%-ban tartalmazta a molekula dimer formáját, ahogy azt reverz fázisú HPLC-vel kimutattuk. A készítmény koncentrációját Kabi Pharmacia apolipoprotein Al RIA 100 esszé segítségével határoztuk meg.
Három készítményt vizsgáltunk, ezeket A-val, Bvel és C-vel jelöltük.
8. példa
A plazminogén autoaktivációja Apó Al-M/Apo
Al-M, illetve Apó Al jelenlétében
Glu-Plazminogént (94 pg/ml végkoncentrációban) inkubáltunk 3 órán át 37 °C-on 0,1 mol/1 Tris puffer11
HU 217 203 Β ben, pH = 7,6. A plazmin keletkezését az S-2251 szubsztrát (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA) segítségével követtük (Chromogenix AB, Mölndal, Sweden), amelyet 0,6 mmol/1 végkoncentrációban használtunk. Az ezekben a vizsgálatokban használt plazminogén a Chromogenix AB vagy az IMCO Inc. (Stockholm, Sweden) terméke volt.
Ezekben a vizsgálatokban az Apó Al-M/Apo Al-M készítményeink hatását vizsgáltuk. Összehasonlítottuk a 3,9-75 pg/ml végkoncentrációban jelen lévő Apó AlM/Apo Al-M), és a 125 pg/ml végkoncentrációban jelen lévő Apó Al-M jelenlétében keletkező plazmin menynyiségét azzal a plazminmennyiséggel, amely mindenféle adalék hozzáadása nélkül keletkezik (kontroll) (4. táblázat).
Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az Apó AlM/Apo Al-M más plazminogénaktivátorok távollétében is képes fokozni a plazminogénaktivációt. A plazmából származó Apó Al viszont semmilyen módon nem gyakorol hatást a plazminogénmolekulára.
4. táblázat
A spontán plazminogén - plazmin átalakulás. Az Apó Al-M/Apo Al-M és az Apó Al hatása. A 405 nm-en mért OD-ben kifejezett plazminaktivitás
| Minta | Apó végkoncentrációja (pg/ml) | θ^405 nm |
| Kontroll | 0 | 0,052 |
| + Apó Al + Apó Al-M/Apo Al-M | 125 | 0,049 |
| A | 75 | 0,288 |
| B | 31,3 | 0,325 |
| B | 15,6 | 0,153 |
| B | 7,8 | 0,104 |
| B | 3,9 | 0,067 |
A megfigyelt aktivitás az Apó Al-M/Apo Al-M molekulának tulajdonítható. Mindazonáltal ezen adatok alapján nem zárható ki annak a lehetősége, hogy az Apó Al-M/Apo Al-M készítmények szennyezésként tartalmaztak valamilyen proteolitikus enzime(ke)t, amely a plazminogén aktivációját okozhatta. További kísérleteket végeztünk ennek a lehetőségnek a kizárására.
Valamennyi, a fibrinolitikus vizsgálatok során használt Apó Al-M/Apo Al-M készítményt két kromogén szubsztrát, a plazminszerű aktivitásra érzékeny S2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA), illetve az Arg-specifikus proteázokra érzékeny S-2288 (H-D-Ile-ProArg-pNA) jelenlétében is teszteltük. A szubsztrátok a Chromogenix AB termékei. Az Apó Al-M/Apo Al-M végkoncentrációja a tesztekben és a fibrinolitikus kísérletekben azonos volt, és ilyen módon a különböző preparátumok esetében különbözhetett.
A teszt: 25 μΐ Apó Al-M/Apo Al-M 60-70 pg/ml végkoncentrációban.
150 μΐ 0,1 mol/1 Tris puffer, pH=7,8
0,6 mmol/1 50 μΐ S-2251 vagy 1,0 mmol/1 S-2288
A szubsztrátok nem specifikus hidrolízisének ellenőrzésére csak puffért és a megfelelő szubsztrátot tartalmazó mintákat is összeállítottunk. Minden mintát két párhuzamosban vizsgáltunk.
A mikrotiter lemezt 37 °C-on inkubáltuk, az abszorbanciát óránként olvastuk le.
5. táblázat
Két Apó Al-M/Apo Al-M termék (A és B) amidolitikus aktivitásának vizsgálata 4 órás 37 °C-on történő inkubálás után (405 nm-en mért OD)
| Apó Al-M/Apo Al-M | Szubsztrát | ||
| S-2251 | A | 0,023 | 0,022 |
| B | 0,022 | ||
| S-2288 | A | 0,037 | 0,034 |
| B | 0,037 |
Egy másik kísérletsorozatban az Apó Al-M/Apo AlM készítményeket egy irreverzibilis szerin proteáz gátlóval - a diizopropil-fluor-foszfáttal (DFP) (Sigma kát. no.: D-0789) - kezeltük. Az Apó Al-M/Apo Al-M végkoncentrációja 0,2 mol/1 KHCO3 pH=7,6 pufferben körülbelül 75 pg/ml volt. A DFP-t úgy adtuk az oldathoz, hogy végkoncentrációja 123 mmol/1 legyen. 4 órás inkubálás után a mintát egy éjszakán át a karbonátpuffért kétszer cserélve dializáltuk.
A DFP-vel kezelt, illetve a kezeletlen Apó AlM/Apo Al-M aktivitásának meghatározása a fentebb már leírt körülmények között történt. Plazminogénnel és S-2251 szubsztráttal történt 3 órás inkubálás után a DFP-vel kezelt Apó Al-M/Apo Al-M minták OD-je 405 nm-en 0,209, a kezeletlen Apó Al-M/Apo Al-M mintáké 0,234, míg a pusztán plazminogént tartalmazó mintáké 0,030 volt. Mindezek alapján arra következtettünk, hogy a megfigyelt plazminogénaktiváló hatás közvetlenül az Apó Al-M/Apo Al-M jelenlétének tulajdonítható, és nem valamilyen lehetséges proteolitikus szennyezés következménye.
9. példa
Az Apó Al-M/Apo Al-M hatása a plazminogénnek a t-PA és uPA plazminogénaktivátorokkal történő aktivációjára
Mind az urokináz (uPA), mind a szöveti plazminogénaktivátor (t-PA) a plazminogént plazminná alakítja egyetlen peptidkötés, az 560-as Arg és az 561-es Val közötti kötés proteolitikus hasításával. Míg a kétláncú urokináz közvetlenül képes aktiválni a plazminogént, a t-PA-nak az optimális hatás kifejtéséhez a fibrin jelenlétére is szüksége van. A katalitikus hatású fibrin, amely a t-PA-val és a plazminogénnel egy hármas molekulakomplexet alkot, a t-Pa enzimatikus hatékonyságát körülbelül 600 szorosára növeli.
A t-PA plazminogénaktiváló hatását a kereskedelmi forgalomban beszerezhető Spectrolyse® (fibrin) t-PA/PAI (Biopool AB, Umea, Sweden) kit felhasználásával vizsgáltuk.
HU 217 203 Β
Ebben a vizsgálatban a plazminogént a t-PA-val a D-But-CHT-Lys-pNA kromogén szubsztrát és a desAA fibrinogén (fibrin monomer) jelenlétében inkubáltuk, ez utóbbi aktivációs stimulátorként szerepelt. A keletkező plazmin a szubsztrátot hasítja, ennek eredményeképpen szabad pNA keletkezik.
Ehhez a rendszerhez hozzáadtuk az Apó Al-M/Apo Al-M készítményünket, és hatását összehasonlítottuk a Sigma által forgalmazott Apó A1 preparátummal. Kísérleteinkben mindkét lipoprotein hatását megvizsgáltuk fibrin jelenlétében vagy anélkül.
Egy jellemző példa kísérleteink közül:
μΐ Spectrolyse puffer μΐ Apo-készítmény vagy puffer μΐ t-PA (=1,7 IU/ml végkoncentráció)
150 μΐ Spectrolyse PÁR reagens (=a plazminogén és a szubsztrát keveréke) μΐ Desa fib (=fibrin monomer) vagy 10 μΐ puffer.
A mintákat mikrotiter tálcákon 3 óráig 37 °C-on inkubáltuk.
6. táblázat fivz Apó Al-M/Apó Al-M és az Apó A1 hatása a plazminogén t-PA hatására fibrin jelenlétében vagy hiányában bekövetkező aktivációjára. A 3 órás 37 °C-on történő inkubálás után kapott eredményeket 405 nm-en mért OD-értékekben fejeztük ki
| Minta | Apó végkoncentráció pg/ml | θ^405 nm + fibrin | θθ405 nm - fibrin |
| t-PA kontroll | 0 | 0,656 | 0,048 |
| + Apó A1 | 54 | 1,050 | 0,066 |
| + Apó Al-M/ Apó Al-M | |||
| A | 65 | 1,665 | 0,446 |
| B | 54 | 2,366 | 0,225 |
Megfigyeléseink szerint az Apó Al-M/Apo Al-M szignifikánsan fokozza a plazminogén aktivációját a fibrin jelenlététől függetlenül. Az Apó A1 kisebb mértékben és fibrin jelenlétében ugyan, de szintén fokozza az aktivációt. Fibrin hiányában az Apó Al-M/Apo AlM által előidézett stimuláció lényegesen meghaladja az Apó A1 hatását.
Az Apó Al-M/Apo Al-M készítmény a plazminogén uPA-val történő aktiválására is szignifikáns hatást gyakorol. Ezekben a vizsgálatokban a Calbiochem által forgalomba hozott nagy molekulasúlyú urokináz preparátumot használtuk.
A kísérletek során urokinázt (2,5 Ul/ml végkoncentráció), plazminogént (94 pg/ml végkoncentráció), valamint kromogén szubsztrátot (0,6 mmol/1 végkoncentráció) kevertünk össze. Ehhez a mintához adtuk az Apó Al-M/Apo Al-M készítményünket úgy, hogy végkoncentrációja 75, illetve 62 μg/ml legyen. A reakció 7,6 pH-jú 0,1 mol/1 Tris-pufferben játszódott le.
A t-PA-val végzett kísérletekhez hasonlóan az Apó Al-M/Apo Al-M hozzáadása után a plazmin urokináz hatására bekövetkező aktiválásának stimulációját figyeltük meg (7. táblázat).
7. táblázat
Az Apó Al-M/Apo Al-M hatása a plazminogén uPA hatására bekövetkező aktivációjára. Az eredményeket 4 órás 37 °C-on történő inkubálás után 405 nm-en mért OD-értékekben fejeztük ki
| Minta | Apó Al-M/Apo Al-M végkonccntráció (pg/ml) | θ^405 nm |
| uPA kontroll | 0 | 0,325 |
| + Apó Al-M/ Apó Al-M | ||
| A | 75 | 1,263 |
| B | 62 | 1,868 |
Az Apó Al-M/Apo Al-M preparátumnak ez a fibrinolízisre gyakorolt hatása akkor is megfigyelhető, ha a molekulát gyógyszerkészítményként egy hordozómolekulához kapcsoljuk. Vizsgálataink során lehetséges hordozóként foszfatidil-kolin (PC) (12 mg/ml) liposzómát alkalmaztunk. Az Apó Al-M/Apo AlM koncentrációja a liposzómában (C preparátum) 3,6 mg/ml volt.
További kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy milyen hatással vannak az Apó Al-M/Apo Al-M tartalmú, illetve a fehéijementes liposzómák a plazminogén (94 μg/ml végkoncentráció) uPA (2,5 Ul/ml végkoncentráció) hatására bekövetkező aktivációjára. A mintákat S-2255 jelenlétében 4 óráig 37 °C-on inkubáltuk, a keletkező plazmin mennyiségét folyamatosan regisztráltuk.
8. táblázat
A plazminogén uPA hatására bekövetkező aktivációja.
A liposzómában lévő Apó Al-M/Apo Al-M (C preparátum) hatása. Az eredményeket a 405 nm-en mért OD-értékekben fejeztük ki
| Minta | θθ405 nm |
| uPA + plazminogén | 0,221 |
| + fehérjementes liposzómák | |
| 250 pg/'ml PC | 0,499 |
| + Apó Al-M/Apo Al-M 75 pg/ml | |
| liposzómákban 250 pg/ml PC | 1,084 |
A fehérjementes liposzómák jelenlétében a plazminogénaktiváció körülbelül a kétszeresére növekedett. Az Apó Al-M/Apo Al-M tartalmú liposzómák jelenlétében ez a növekedés ötszörös volt - azzal a mintával összehasonlítva, amely csak urokináz aktivátort tartalmazott.
10. példa
Az Apó Al-M/Apo Al-M hatása az urokináz egyláncú és kétláncú formájának egymásba alakulására
Az egyláncú urokináz (single chain uPA, scuPA) a kétláncú urokináz (uPA) prekurzora. A scuPA-nak az uPA-zal összehasonlítva kis szintetikus szubsztrátokkal szemben igen alacsony az amidolitikus aktivitása, nevezetesen a scuPA amidolitikus aktivitása maximum
HU 217 203 Β
0,4%-a az uPA aktivitásának. Mindezek ellenére, bár a scuPA kétségtelenül koenzim, képes arra, hogy a plazminogént plazminná aktiválja. A plazminogén és a scuPA elegyében egymás után lejátszódó három reakció között feltételezhetően ott van a plazminogén plazminná történő aktiválása is:
1. scuPA + plazminogén —> scuPA + plazmin
2. plazmin + scuPA —> plazmin + uPA
3. uPA + plazminogén —> uPA + plazmin
A továbbiakban megvizsgáltuk a plazminogén jelenlétében történő scuPA-uPA átalakulás során lejátszódó folyamatokat. Az urokinázaktivitást urokinázspecifikus kromogén szubsztrát S-2444 (pyro-Glu-GlyArg-pNA, Chromogenix AB) segítségével határoztuk meg. A rendszerhez különböző Apó Al-M/Apo Al-M, valamint Apó A1 készítményeket adtunk, és az apolipoproteinmentes rendszerrel szemben mértük a keletkezett uPA mennyiségét. Ezekben a kísérletekben a Grünenthal GmbH (Aschen, Germany, kát. szám: 0088 808) által forgalmazott rekombináns egyláncú urokinázt használtuk.
pl Apó vagy puffer pl 0,05 mol/1 Tris, pH=7,6, amely 0,1 mol/1 NaCl-ot és 0,02% Tween 80-at tartalmaz pl scuPA, 454 pmol/1 végkoncentrációban pl S-2444, 1 mmol/1 végkoncentrációban pl plazminogén, 52,1 nmol/1 végkoncentrációban
A mintákat 37 °C-on 90 percig inkubáltuk. A keletkező uPA mennyiségének növekedését jelző OD-növekedést az inkubáció utolsó 30 percében folyamatosan regisztráltuk.
9. táblázat
Az Apó Al-M/Apó Al-M hatása a scuPA-uPA konverzióra. Az eredményeket a 405 nm-en mért mOD/min-ben fejeztük ki
| Minta | Apó vcgkonccntráció pg/ml | mOD/min |
| scuPA | 0 | 0,073 |
| + plazminogén | 0 | 13,2 |
| + Apó A1 | 62 | 11,8 |
| + Apó Al-M/Apo Al-M | ||
| B | 62 | 20,0 |
| A | 75 | 24,0 |
A scuPA-uPA konverziót az Apó Al-M/Apo Al-M stimulálta, míg a plazmából izolált Apó A1 készítménynek nem volt ebben a rendszerben szignifikáns hatása.
Az Apó Al-M/Apo Al-M készítménynek a fibrinolitikus tesztekre gyakorolt, most megfigyelt hatása, amelyet ezekben a kísérletekben felhasználtunk, lényegesen nagyobb volt, mint a plazmából izolált Apó A1 hasonló hatása. Az Apó Al-M/Apo Al-M készítmény az Apó Al-nál erősebben képes stimulálni a fibrinolitikus aktivitást. Valószínű, hogy a két molekula közötti hatásbeli különbség a közeljövőben in vivő is kimutatható lesz.
Claims (18)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Dimer Apolipoprotein Al-Milano készítmény, azzal jellemezve, hogy dimertisztasága legalább 90%-os.
- 2. Az 1. igénypont szerinti dimer Apolipoprotein Al-Milano készítmény, azzal jellemezve, hogy dimertisztasága legalább 98%-os.
- 3. Az 1. igénypont szerinti dimer Apolipoprotein Al-Milano készítmény, azzal jellemezve, hogy plazmából származik.
- 4. Az 1. igénypont szerinti dimer Apolipoprotein Al-Milano készítmény, azzal jellemezve, hogy rekombináns eljárással állították elő.
- 5. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti dimert és hordozót tartalmaz.
- 6. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti dimert, stabilizáló anyagot, és adott esetben hordozót tartalmaz.
- 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy lipidtartalom-csökkentő anyagot és hordozót tartalmaz.
- 8. Az 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a dimert stabilizáló lipidvegyülettel, adott esetben lipidtartalom-csökkentő anyaggal és adott esetben hordozóval együtt tartalmazza.
- 9. Az 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy foszfolipidet tartalmaz, adott esetben lipidtartalom-csökkentő anyaggal és hordozóval együtt.
- 10. Eljárás 1. igénypont szerinti dimer előállítására, azzal jellemezve, hogya) rekombináns eljárással, E. coliban, fúziós proteinként Apolipoprotein Al-Milanót állítunk elő, majd a jelen lévő monomereket dimerekké alakítjuk, majd ezt követően a dimer készítményt legalább 90%-os, előnyösen legalább 98%-os dimertisztaságig tisztítjuk, vagyb) az Apolipoprotein Al-Milanót rekombináns technikával állítjuk elő, ahol az E. coli expresszálja és a tenyésztő médiumba szekretálja az Apolipoprotein AlMilano monomer vagy dimer alakját, majd a jelen lévő monomereket dimerekké alakítjuk, majd ezt követően a dimer készítményt legalább 90%-os, előnyösen legalább 98%-os dimertisztaságig tisztítjuk, vagyc) az Apolipoprotein Al-Milano hordozó egyedekből plazmát gyűjtünk, izoláljuk a HDL apolipoproteineket, és a dimert több lépésben végzett kromatográfiával választjuk el, vagyd) az Apolipoprotein Al-Milano hordozó egyedekből plazmát gyűjtünk, a monomert tisztítjuk, dimerré alakítjuk, és a dimert tisztítással lényegében tiszta anyaggá alakítjuk.
- 11. Eljárás atheroszklerózis és más kardiovaszkuláris betegségek gyógyítására alkalmas gyógyszer előállítására, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti dimert gyógyászatilag elfogadható hordozó és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítünk.
- 12. Eljárás atheroszklerózis és más kardiovaszkuláris betegségek gyógyítására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti dimert monomer prodrogként alkalmasHU 217 203 Β formában gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítünk.
- 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítményt a főbb vérkeringési megbetegedések, úgymint szívizominfarktus, kiegyensúlyozatlan angina, akut perifériális érelzáródás és szivérplasztikát követő resztenózis megelőzésére és kezelésére alkalmas formában állítjuk elő.
- 14. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítményt krónikus arteriális rendellenesség kezelésére alkalmas formában állítjuk elő.
- 15. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítményt trombózis megelőzésére és kezelésére alkalmas formában állítjuk elő.
- 16. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítményt fibrinolízis5 stimulálására alkalmas formában állítjuk elő.
- 17. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítménybe lipidtartalom-csökkentő hatóanyagot is elegyítünk.
- 18. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezei ve, hogy az a) lépésben az intracelluláris fúziós proteint- E. coliban történő előállítását követően és a monomerek dimerré alakítását megelőzően - hangyasavval kezeljük.HU 217 203 Β
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9103701A SE9103701D0 (sv) | 1991-12-13 | 1991-12-13 | Apolipoprotein |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9302344D0 HU9302344D0 (en) | 1994-01-28 |
| HUT70270A HUT70270A (en) | 1995-09-28 |
| HU217203B true HU217203B (hu) | 1999-12-28 |
Family
ID=20384608
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9302344A HU217203B (hu) | 1991-12-13 | 1992-12-11 | Apolipoprotein molekuláris variánsának dimerje, és az előállítására szolgáló eljárás |
| HU95P/P00630P HU211667A9 (en) | 1991-12-13 | 1995-06-30 | Apolipoprotein |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00630P HU211667A9 (en) | 1991-12-13 | 1995-06-30 | Apolipoprotein |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5876968A (hu) |
| EP (1) | EP0571602B1 (hu) |
| JP (1) | JPH07502892A (hu) |
| AT (1) | ATE242269T1 (hu) |
| AU (2) | AU3175593A (hu) |
| BG (1) | BG61451B1 (hu) |
| BR (1) | BR9205640A (hu) |
| CA (1) | CA2103996C (hu) |
| CZ (1) | CZ289879B6 (hu) |
| DE (1) | DE69233092T2 (hu) |
| DK (1) | DK0571602T3 (hu) |
| EE (1) | EE03058B1 (hu) |
| ES (1) | ES2199939T3 (hu) |
| FI (1) | FI115771B (hu) |
| HU (2) | HU217203B (hu) |
| IL (1) | IL103956A (hu) |
| MX (1) | MX9207224A (hu) |
| NO (1) | NO315076B1 (hu) |
| NZ (2) | NZ280516A (hu) |
| PL (3) | PL172544B1 (hu) |
| PT (1) | PT571602E (hu) |
| RO (1) | RO115636B1 (hu) |
| RU (1) | RU2134696C1 (hu) |
| SE (1) | SE9103701D0 (hu) |
| SG (1) | SG47453A1 (hu) |
| SK (1) | SK86893A3 (hu) |
| WO (1) | WO1993012143A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA928989B (hu) |
Families Citing this family (91)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9103701D0 (sv) * | 1991-12-13 | 1991-12-13 | Kabi Pharmacia Ab | Apolipoprotein |
| SE9203753D0 (sv) * | 1992-12-11 | 1992-12-11 | Kabi Pharmacia Ab | Expression system for producing apolipoprotein ai-m |
| SE9500778D0 (sv) | 1995-03-03 | 1995-03-03 | Pharmacia Ab | Process for producing a protein |
| US6258596B1 (en) | 1995-05-22 | 2001-07-10 | Aventis Pharmaceuticals Products Inc. | Variants of apolipoprotein A-I |
| FR2734568B1 (fr) * | 1995-05-22 | 1997-06-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux variants de l'apolipoproteine |
| SE9603068D0 (sv) * | 1996-08-23 | 1996-08-23 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
| SE9603303D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
| SE9603304D0 (sv) * | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a compound |
| US6306433B1 (en) | 1997-08-12 | 2001-10-23 | Pharmacia Ab | Method of preparing pharmaceutical compositions |
| US20020064820A1 (en) * | 2000-03-13 | 2002-05-30 | Jean-Michel Dayer | Apo-A-I regulation of T-cell signaling |
| US6743778B2 (en) | 2000-04-21 | 2004-06-01 | Amgen Inc. | Apo-AI/AII peptide derivatives |
| BRPI0003386B8 (pt) * | 2000-08-08 | 2021-05-25 | Cristalia Produtos Quim Farmaceuticos Ltda | pró-droga homo ou heterodiméricas úteis no tratamento de doenças ou disfunções mediadas por fosfodiesterases; composições farmacêuticas contendo a pró-droga ou seus sais farmacêuticos aceitáveis; processo de obtenção destas pró-drogas |
| US8568766B2 (en) | 2000-08-24 | 2013-10-29 | Gattadahalli M. Anantharamaiah | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease |
| US6664230B1 (en) * | 2000-08-24 | 2003-12-16 | The Regents Of The University Of California | Orally administered peptides to ameliorate atherosclerosis |
| EP2343317A1 (en) * | 2000-11-10 | 2011-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ltd. | Apolipoprotein analogues |
| US7217785B2 (en) * | 2001-05-09 | 2007-05-15 | The Regents Of The University Of California | Cysteine-containing peptides having antioxidant properties |
| AU2002362612B2 (en) * | 2001-09-28 | 2007-11-15 | Cedars-Sinai Medical Center | Prevention and treatment of restenosis by local administration of drug |
| US20030162758A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-08-28 | Schwartz Daniel M. | Treatment for age-related macular degeneration (AMD) |
| US7470659B2 (en) | 2001-12-07 | 2008-12-30 | The Regents Of The University Of California | Methods to increase reverse cholesterol transport in the retinal pigment epithelium (RPE) and Bruch's membrane (BM) |
| US20030229062A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-12-11 | The Regents Of The University Of California | Treatments for age-related macular degeneration (AMD) |
| US7223726B2 (en) * | 2002-01-14 | 2007-05-29 | The Regents Of The University Of California | Apolipoprotein A-I mutant proteins having cysteine substitutions and polynucleotides encoding same |
| US20100204103A1 (en) * | 2002-05-08 | 2010-08-12 | The Regents Of The University Of California | Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux |
| JP2006502976A (ja) * | 2002-05-17 | 2006-01-26 | エスペリオン セラピューティクス，インコーポレイテッド | 虚血再潅流を治療する方法および組成物 |
| WO2003096983A2 (en) | 2002-05-17 | 2003-11-27 | Esperion Therapeutics, Inc. | Method of treating dyslipidemic disorders |
| SE0302312D0 (sv) * | 2002-10-04 | 2003-08-27 | Forskarpatent I Syd Ab | Peptide-based passive immunization therapy for treatment of atherosclerosis |
| DE10324447A1 (de) | 2003-05-28 | 2004-12-30 | Scil Proteins Gmbh | Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin |
| PE20050438A1 (es) * | 2003-10-20 | 2005-06-14 | Esperion Therapeutics Inc | Formulas farmaceuticas, metodos y regimenes de dosificacion para el tratamiento y la prevencion de sindromes coronarios agudos |
| WO2005051413A2 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-09 | Novartis Ag | Disease associated genes |
| CA2549529A1 (en) * | 2003-12-15 | 2005-06-30 | The Regents Of The University Of California | Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux |
| US8926958B2 (en) * | 2004-04-06 | 2015-01-06 | Cedars-Sinai Medical Center | Prevention and treatment of vascular disease with recombinant adeno-associated virus vectors encoding apolipoprotein A-I and apolipoprotein A-I milano |
| KR100560102B1 (ko) * | 2004-06-25 | 2006-03-13 | 한국생명공학연구원 | 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제 |
| US9487575B2 (en) * | 2004-07-14 | 2016-11-08 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for treatment of gynecologic cancers |
| US8206750B2 (en) | 2005-03-24 | 2012-06-26 | Cerenis Therapeutics Holding S.A. | Charged lipoprotein complexes and their uses |
| KR20080007491A (ko) | 2005-04-29 | 2008-01-21 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 염증성 반응을 특징으로 하는 병리를 치료하기 위한 펩티드및 펩티드 모방체 |
| WO2007000924A1 (ja) * | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Osaka University | プログラニュリン活性を抑制または促進する物質を含む医薬組成物、およびプログラニュリン活性を抑制または促進する物質のスクリーニング方法 |
| KR100719389B1 (ko) | 2005-10-18 | 2007-05-17 | 주식회사 녹십자 | 인간혈장으로부터 아포리포단백질 ａ-ｉ을 분리 정제하는방법 |
| US20070254832A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-11-01 | Pressler Milton L | Methods for the treatment of macular degeneration and related eye conditions |
| AU2007284801A1 (en) | 2006-08-08 | 2008-02-21 | The Regents Of The University Of Californina | Salicylanilides enhance oral delivery of therapeutic peptides |
| WO2008017906A1 (en) * | 2006-08-10 | 2008-02-14 | Plantechno S.R.L. | In-plant production of dimeric and/or oligomeric (comprising three or more units) forms of human apo a-1 protein muteins |
| US8541236B2 (en) * | 2006-12-08 | 2013-09-24 | University Of Washington | Mutant apolipoprotein A-1 polypeptide with increased resistance to oxidation and reactive carbonyls |
| JP2010537638A (ja) | 2007-08-28 | 2010-12-09 | ユーエービー リサーチ ファウンデーション | 合成アポリポ蛋白質ｅ模倣ポリペプチドおよび使用方法 |
| EP2682400B1 (en) | 2007-08-28 | 2017-09-20 | Uab Research Foundation | Synthetic apolipoprotein E mimicking polypeptides and methods of use |
| WO2009050266A2 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Pronota N.V. | Use of n-terminal and c-terminal proteomics technology to enhance protein therapeutics and diagnostics |
| MX2010004514A (es) | 2007-10-23 | 2010-07-28 | Cleveland Clinic Foundation | Apolipoproteina a-1 y peptidos mimeticos resistentes a la oxidacion. |
| US8241861B1 (en) | 2008-07-08 | 2012-08-14 | Insilicos, Llc | Methods and compositions for diagnosis or prognosis of cardiovascular disease |
| MX351819B (es) | 2008-11-10 | 2017-10-30 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Lipidos y composiciones novedosas para el suministro de terapeuticos. |
| CA2751342C (en) | 2009-01-29 | 2019-05-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid |
| CA2754043A1 (en) | 2009-03-12 | 2010-09-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
| SG10201402054UA (en) | 2009-05-05 | 2014-09-26 | Muthiah Manoharan | Lipid compositions |
| PT3431076T (pt) | 2009-06-10 | 2021-10-26 | Arbutus Biopharma Corp | Formulação lipídica melhorada |
| EP2810643A3 (en) | 2009-08-14 | 2015-03-11 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Lipid formulated compositions and mehods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus |
| US12419839B2 (en) | 2009-10-09 | 2025-09-23 | Signablok, Inc. | Methods and compositions for targeted delivery of protein fragments |
| US10894098B2 (en) | 2012-04-09 | 2021-01-19 | Signablok, Inc. | Methods and compositions for targeted imaging |
| WO2011044545A2 (en) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Sigalov Alexander B | Methods and compositions for targeted imaging |
| CA3044884A1 (en) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions for nucleic acid delivery |
| US8921304B2 (en) * | 2009-12-14 | 2014-12-30 | Scil Proteins Gmbh | Modified ubiquitin proteins having a specific binding activity for the extradomain B of fibronectin |
| EP2512449B1 (en) | 2009-12-18 | 2019-08-07 | The University of British Columbia | Methods and compositions for delivery of nucleic acids |
| WO2011139911A2 (en) | 2010-04-29 | 2011-11-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated single stranded rna |
| WO2011143362A1 (en) * | 2010-05-11 | 2011-11-17 | Esperion Therapeutics, Inc. | Dimeric oxidation-resistant apolipoprotein a1 variants |
| JP5893611B2 (ja) | 2010-06-03 | 2016-03-23 | アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | 活性剤の送達のための生分解性脂質 |
| US20130323269A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-12-05 | Muthiah Manoharan | Methods and compositions for delivery of active agents |
| WO2012016188A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
| US20130142760A1 (en) | 2010-08-18 | 2013-06-06 | Cedars-Sinai Medical Center | Atherosclerosis inhibition via modulation of monocyte-macrophage phenotype using apo a-i milano gene transfer |
| WO2012064824A1 (en) | 2010-11-09 | 2012-05-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
| DK2663548T3 (en) | 2011-01-11 | 2017-07-24 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | PEGYLED LIPIDS AND THEIR USE FOR PHARMACEUTICAL SUPPLY |
| WO2012109162A1 (en) | 2011-02-07 | 2012-08-16 | Cerenis Therapeutics Holding S.A. | Lipoprotein complexes and manufacturing and uses thereof |
| AU2012268970B2 (en) | 2011-06-15 | 2016-01-28 | Navigo Proteins Gmbh | Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins |
| EP2748191A1 (en) | 2011-08-25 | 2014-07-02 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Shortened tetranectin-apolipoprotein a-i fusion protein, a lipid particle containing it, and uses thereof |
| JP6250543B2 (ja) | 2011-09-27 | 2017-12-20 | アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | ジ脂肪族置換ｐｅｇ化脂質 |
| US9610324B2 (en) | 2012-07-11 | 2017-04-04 | Esperion Therapeutics, Inc. | Apolipoprotein mixtures |
| EP2853259A1 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-01 | Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) | Reconstituted high density lipoproteins composition and uses thereof |
| CN106488987A (zh) | 2014-05-02 | 2017-03-08 | 塞勒尼斯医疗控股公司 | Hdl疗法标志物 |
| EP3189069B1 (en) | 2014-07-31 | 2024-10-23 | UAB Research Foundation | Apoe mimetic peptides and higher potency to clear plasma cholesterol |
| JP6738340B2 (ja) | 2015-02-06 | 2020-08-12 | ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ | 新規なｅｇｆｒ結合タンパク質 |
| AU2016293063B2 (en) | 2015-07-16 | 2018-11-08 | Navigo Proteins Gmbh | Novel immunoglobulin-binding proteins and their use in affinity purification |
| WO2017013136A1 (en) | 2015-07-20 | 2017-01-26 | Scil Proteins Gmbh | Novel binding proteins based on di-ubiquitin muteins and methods for generation |
| JP2019526526A (ja) | 2016-05-04 | 2019-09-19 | ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ | ペプチドリンカーを含む化学的部分の部位特異的カップリングのための標的化合物 |
| WO2018029158A1 (en) | 2016-08-11 | 2018-02-15 | Repligen Corporation | Alkaline stable fc—binding proteins for affinity chromatography |
| TW201919686A (zh) | 2017-08-10 | 2019-06-01 | 法商塞勒尼斯醫療控股公司 | 脫輔基子(apomers) |
| ES2984285T3 (es) | 2017-08-10 | 2024-10-29 | Abionyx Pharma Sa | Cargómeros |
| WO2019091918A1 (en) | 2017-11-07 | 2019-05-16 | Navigo Proteins Gmbh | Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer |
| IL284097B2 (en) | 2018-12-18 | 2025-10-01 | Navigo Proteins Gmbh | FOLR1-binding proteins for cancer diagnosis and treatment |
| WO2021209823A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating acute conditions using lipid binding protein- based complexes |
| CA3197168A1 (en) | 2020-10-01 | 2022-04-07 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating eye diseases using lipid binding protein-based complexes |
| MX2023012223A (es) | 2021-04-15 | 2023-10-26 | Abionyx Pharma Sa | Uso de complejos a base de proteinas de union a lipidos en soluciones de conservacion de organos. |
| WO2023194797A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating eye diseases using lipid binding protein-based complexes |
| CN119317440A (zh) | 2022-04-06 | 2025-01-14 | 阿比奥尼克斯制药公司 | 使用基于脂质结合蛋白的复合物治疗白细胞增多、内皮功能障碍和心脏炎的方法 |
| IL317446A (en) | 2022-06-10 | 2025-02-01 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating acute conditions using complexes based on lipid-binding proteins |
| CA3258787A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Stanislas FAGUER | METHODS OF TREATMENT OF HYPERINFLAMMATORY DISEASES USING LIPID-BINDING PROTEIN COMPLEXES |
| AU2024207875A1 (en) | 2023-01-13 | 2025-07-24 | Abionyx Pharma Sa | Lipid binding protein molecule therapy |
| WO2025093929A1 (en) | 2023-10-31 | 2025-05-08 | Abionyx Pharma Sa | Lipid binding protein molecule therapy |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8625435D0 (en) * | 1986-10-23 | 1986-11-26 | Erba Farmitalia | Human apolipoprotein ai |
| IT1229996B (it) * | 1989-04-20 | 1991-09-20 | Cesare Sirtori | Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine. |
| SE9103701D0 (sv) * | 1991-12-13 | 1991-12-13 | Kabi Pharmacia Ab | Apolipoprotein |
-
1991
- 1991-12-13 SE SE9103701A patent/SE9103701D0/xx unknown
-
1992
- 1992-11-20 ZA ZA928989A patent/ZA928989B/xx unknown
- 1992-12-03 IL IL10395692A patent/IL103956A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 DK DK93900484T patent/DK0571602T3/da active
- 1992-12-11 SK SK868-93A patent/SK86893A3/sk unknown
- 1992-12-11 HU HU9302344A patent/HU217203B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 CA CA002103996A patent/CA2103996C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-12-11 PL PL92314894A patent/PL172544B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 PL PL92314896A patent/PL172168B1/pl unknown
- 1992-12-11 NZ NZ280516A patent/NZ280516A/en unknown
- 1992-12-11 NZ NZ246223A patent/NZ246223A/en unknown
- 1992-12-11 SG SG1996001800A patent/SG47453A1/en unknown
- 1992-12-11 RU RU93054168A patent/RU2134696C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 WO PCT/SE1992/000858 patent/WO1993012143A1/en not_active Ceased
- 1992-12-11 PT PT93900484T patent/PT571602E/pt unknown
- 1992-12-11 DE DE69233092T patent/DE69233092T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-11 PL PL92300262A patent/PL171907B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 MX MX9207224A patent/MX9207224A/es unknown
- 1992-12-11 AT AT93900484T patent/ATE242269T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 EP EP93900484A patent/EP0571602B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-11 US US08/104,063 patent/US5876968A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-11 RO RO93-01116A patent/RO115636B1/ro unknown
- 1992-12-11 JP JP5510842A patent/JPH07502892A/ja active Pending
- 1992-12-11 AU AU31755/93A patent/AU3175593A/en not_active Abandoned
- 1992-12-11 ES ES93900484T patent/ES2199939T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-11 BR BR9205640A patent/BR9205640A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-12-11 CZ CZ19931589A patent/CZ289879B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-08-11 BG BG98036A patent/BG61451B1/bg unknown
- 1993-08-12 NO NO19932866A patent/NO315076B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-08-12 FI FI933557A patent/FI115771B/fi not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-11-16 EE EE9400375A patent/EE03058B1/xx unknown
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00630P patent/HU211667A9/hu unknown
-
1996
- 1996-07-12 AU AU59473/96A patent/AU703283B2/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-03-01 US US09/259,434 patent/US6617134B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU217203B (hu) | Apolipoprotein molekuláris variánsának dimerje, és az előállítására szolgáló eljárás | |
| DK2673296T3 (en) | LIPOPROTEIN COMPLEXES AND PREPARATION AND APPLICATIONS THEREOF | |
| EP1379266B1 (en) | Modified annexin proteins and prevention and treatment of thrombosis | |
| JP3495365B2 (ja) | ブタ第ｖｉｉｉ因子ａ２ドメインをコードするｄｎａ | |
| JP4451514B2 (ja) | 血液凝固第ｖｉｉ因子改変体 | |
| Holvoet et al. | Phospholipid binding and lecithin-cholesterol acyltransferase activation properties of apolipoprotein AI mutants | |
| US20030181372A1 (en) | Apolipoprotein A-I mutant proteins having cysteine substitutions and polynucleotides encoding same | |
| JP2006223316A (ja) | 組換えフィブリン鎖、フィブリンおよびフィブリン−ホモログ | |
| JP3845101B2 (ja) | ヒト・アポリポ蛋白質ａｉおよびａｉ−ミラノを含有する医薬組成物 | |
| JPH11505712A (ja) | 新規のアポリポタンパク質ａ−ｉ変異体 | |
| NL8902454A (nl) | Mutanten van de humane plasminogeen activator inhibitor 1 (pai-1), hun bereiding en toepassing, en recombinante polynucleotiden die voor deze mutanten coderende genetische informatie omvatten. | |
| JP2009505652A (ja) | 乳酸菌においてアポリポタンパク質遺伝子生成物を生成するための組成物および方法 | |
| JP2942578B2 (ja) | 新しい結合特性を有する超酸化物不均化酵素類縁体 | |
| WO2012153620A1 (ja) | 医薬、機能性食品、目的蛋白質の安定化方法、融合蛋白質、核酸、並びに、組換え体 | |
| JP2012509670A (ja) | 血液凝固促進剤としてのヘビ第五因子及び使用方法 | |
| HK1198834B (en) | Lipoprotein complexes and manufacturing and uses therof | |
| HK1192266A (en) | Lipoprotein complexes and manufacturing and uses thereof | |
| JPH03109399A (ja) | ＰＰ４―δ、その調製および使用 | |
| JPH10113180A (ja) | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドをコードするｄｎａ及びペプチドの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: ESPERION THERAPEUTICS INC.,, US |
|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |