NO315076B1 - Dimerpreparat av molekyl¶rvariant av apolipoprotein og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav, til fremstilling av et medikamentfor behandling av aterosklerose og kardiovaskul¶re sykdommer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår den hovedsakelig rene dimer av apolipoprotein AI-Milano (Apo AI-M/Apo AI-M) og far-masøytiske preparater inneholdende denne dimer. Den angår også fremstillingsprosessen ved rekombinant teknikk så vel som ved isolering fra plasma. Produktet kan anvendes for behandling av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer og som en retarder-ende formulering av Apo AI-M.

Bakgrunn

Den klare korrelasjon mellom forhøyede nivåer av serumkolesterol og utviklingen av koronar hjertesykdom (CHD)

er gjentatte ganger blitt bekreftet, basert på epidemiologiske og lengdestudier. Definisjonen av komplekse mekanismer av kolesteroltransport i plasma har imidlertid muliggjort erkjen-nelsen av en Belektiv funksjon av sirkulerende lipoproteiner ved bestemmelse av risikoen for CHD.

Det er i realiteten fire hovedsirkulerende lipoproteiner: kylomikroner (CM), lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med lav densitet (LDL) og lipoproteiner med høy densitet (HDL). Mens CM utgjør et kortlivet produkt av intestinal fettabsorpsjon, er VLDL og i særdeleshet LDL, ansvarlig for kolesteroltransport inn i vev, innbefatt-ende f.eks. de arterielle vegger. Derimot er HDL direkte involvert i fjerningen av kolesterol fra perifert vev, idet det bærer det tilbake til leveren eller til andre lipoproteiner ved en mekanisme kjent som "revers kolesteroltransport" (RCT).

HDL<1>s "beskyttende rolle" er blitt bekreftet i en rekke studier (f.eks. Miller et al., Lancet, 1977:965-968 og Whayne et al., Atherosclerosis 1981; 39:411-419). I disse

synes de forhøyede nivåer av LDL, og i mindre grad av VLDL, å være klart assosiert med en forhøyet kardiovaskulær risiko, mens høye HDL-nivåer synes å gi kardiovaskulær beskyttelse. HDL's beskyttende rolle er blitt ytterligere sterkt understøt-tet av in vivo studier som viser at HDL-infusjoner i kaniner kan hindre utvikling av kolesterolfremkalte, arterielle lesjoner (Badimon et al., Lab. Invest. 60, 455-61, 1989) og/eller fremkalle regresjon av samme (Badimon et al., J.

Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990).

Nyere interesse vedrørende studien av de beskyttende mekanismer av HDL er blitt fokusert på apolipoprotein AI (Apo AI) , hovedkomponenten av HDL. Høye plasmanivåer av Apo AI er assosiert med redusert risiko for CHD og nærvær av koronare lesjoner (Maciejko et al., N. Engl. J. Med. 1983; 309:385-389, Sedlis et al., Circulation 1986; 73:978-984).

Plasma-Apo AI er en enkel polypeptidkjede på 243 aminosyrer hvis primærsekvens er kjent (Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978; 80:623-630). Apo AI syntet-iseres som en 267 aminosyreforløper i cellen. Dette pre-pro-apolipoprotein bearbeides ved N-terminal spaltning først intracellulært hvor 18 aminosyrer tapes og deretter med en ytterligere spaltning av 6 aminosyrer i plasmaet eller lymfen ved aktiviteten av spesifikke proteaser.

Det viktigste strukturelle krav til Apo AI-molekylet er antatt å være nærvær av repeterende enheter på 11 eller 22 aminosyrer, antatt å foreligge i amfipatisk spiralform (Segrest et al., FEBS Lett. 1974; 38:247-253). Denne struktur muliggjør de biologiske hovedaktiviteter av Apo AI, dvs. lipidbinding og lecitinkolesterolacyltransferase- (LCAT) aktivering. En annen nylig beskrevet egenskap hos Apo AI er dets antivirale aktivitet. Denne er blitt rapportert fra in vitro studier og utøves både mot Herpes-virusstammer (Srinivas R.V. et al., Virology, 1756, 48-57, 1990) og også mot det humane immunsvekkelsesvirus, HIV, (Owe et al., J. Clin. Invest., 86, 1142-50, 1990). Denne aktivitet synes å bli utøvet ved hjelp av en interaksjon mellom amfipatiske spiraldeler av Apo AI og omhylningsglykoproteiner av virusene.

In vitro studier indikerer at kompleksene av Apo AI og lecitin kan aktivere utstrømningen av fri kolesterol fra

dyrkede, arterielle glattmuskelceller (Stein et al., Biochem. Biophys. Acta 1975; 380:106-118). Ved denne mekanisme kan HDL også redusere prolifereringen av disse celler (Yoshida et al., Exp. Mol. Pathol. 1984; 41:258-266).

Mer nylig er infusjonen av Apo AI eller av HDL i for-søksdyr blitt vist å utøve signifikante, biokjemiske forand-ringer, så vel som å redusere graden og strengheten av atero-skierotiske lesjoner. Etter en første rapport av Maciejko og Mao (Arteriosclerosis 1982; 2:407a) fant Badimon et al. Ise de to angitte studier ovenfor) at de kunne signifikant redusere graden av aterosklerotiske lesjoner (-45%) og deres kolester-olesterinnhold (-58,5%) i kolesterol-forede kaniner ved infu-sjon av HDL (d=l,063-1,325 g/ml). De fant også at infusjonene av HDL førte til en nær opp til 50% regresjon av etablerte lesjoner. Det var også mulig å vise (Esper et al., Arteriosclerosis 1987; 7:523a) at infusjoner av HDL markert kan for-andre plasma-lipoproteinsammensetningen av Watanabe-kaniner med beheftet hyperkolesterolemi som utvikler tidlige, arterielle lesjoner. I disse kan HDL-infusjoner mer enn fordoble forholdet mellom det beskyttende HDL og det aterogene LDL.

HDL's potensial for å forhindre arteriell sykdom i dyremodeller er ytterligere blitt stimulert ved den observasjon at Apo AI kan utøve en fibrinolytisk aktivitet in vitro (Saku et al., Thromb. Res. 1985; 39:1-8). Ronneberger (Xth Int. Congr. Pharmacol-, Sidney 1987, s. 990) viste at ekstrak-tivt Apo AI kan øke fibrinolyse i beagle-hunder og i cynomo-loge aper. En lignende aktivitet kan observeres in vitro på humanplasma. Denne forfatter var i stand til å bekrefte en reduksjon av lipidavsetning og arteriell plakkdannelBe i Apo AI-behandlede dyr.

Apolipoproteinet AI-Milano (Apo AI-M) er den først beskrevne molekylære variant av humant Apo AI (Franceschini et al., J. Clin. Invest. 1980; 66:892-900). Det er karakterisert ved substitusjon av Arg 173 med Cys (Weisgraber et al., J. Biol. Chem. 1983; 258:2508-2513). Det mutante apoprotein over-føres som et autosomalt, dominerende trekk, og 8 generasjoner av bærere er blitt identifisert (Gualandri et al., Am. J. Hum. Genet. 1984; 37:1083-1097).

Statusen for Apo AI-M-bærerindividet er karakterisert ved en bemerkelsesverdig reduksjon i HDL-kolesterolnivå. Til tross for- dette utviste tilsynelatende ikke de angrepne personer noen økt risiko for arteriell sykdom; ved undersøkelse av stamtreet synes det virkelig som at disse personer kan være "beskyttet" mot aterosklerose.

Mekanismen for den mulige beskyttende effekt av Apo

AI-M i bærerne synes å være bundet til en modifikasjon i Btrukturen til det mutante apolipoprotein, med tap av én alfa-spiral og en økt eksponering overfor hydrofobe rester (Franceschini et al., J. Biol. Chem. 1985; 260:1632-1635). Tapet av den tette struktur av de multiple alfa-spiraler fører til en økt fleksibilitet av molekylet som assosierer lettere med lipider, sammenlignet med normalt AI. Enn videre er apolipoprotein/lipidkomplekser mer ømfintlige overfor denaturering, noe som antyder at lipidfjerningen også er forbedret når det gjelder mutanten.

Den terapeutiske anvendelse av Apo AI-M-mutanten er for tiden begrenset av mangel på en metode som muliggjør fremstilling av angitte apolipoproteiner i tilstrekkelig mengde og i en egnet form.

Et annet meget spesifikt trekk ved Apo AI-M er dets evne til å danne dimerer med seg selv og komplekser med Apo All, i begge tilfeller på grunn av nærvær av Cys-resten. Fra

studier på blodfraksjoner inneholdende en blanding av apolipoproteiner, var det indikasjoner som viste at nærvær av dimerer og komplekser i sirkulasjonen kan være ansvarlig for den økte elimineringshalveringstid av disse i bærerne, nylig beskrevet i kliniske studier (Gregg et al., NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone SG, 1988).

Apo AI-M-dimerer (Apo AI-M/Apo AI-M) virker som en inhiberende faktor ved den indre omdannelse av HDL-partikler in vitro (Franceschini et al., J. Biol. Chem. 1990; 265:12224-12231).

Tidligere studier av blandinger inneholdende dimeren, har vært basert på Apo AI-M separert fra naturlig blod fra personer med Apo AI-M, som således bare kunne erholdes i små mengder.

Vanskeligheten med å fremstille Apo AI og i særdeleshet Apo AI-M fra plasmafraksjonering er relativt betydelig (Franceschini et al., J. Biol. Chem. 1985; 260:16321-16325). Isolering og produksjon kan ikke foretas i stor målestokk da bare en liten mengde av råmaterialet er tilgjengelig. Enn videre er det flere risikoer forbundet med plasmafraksjoner-ingsprodukter, slik som forurensning med infeksiøse midler. Det er vesentlig at dette unngås.

Forsøk er blitt gjort på å fremstille humant Apo AI ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi. I Europa-patentpubli-kasjon nr. 0267703 er fremstillingen av Apo AI fra E. coli beskrevet. Prosessen beskriver et kimært polypeptid hvori Apo AI-delen fusjoneres til de N-terminale aminosyrerester av beta-galaktosidase, eller til ett eller flere IgG-bindende domener av protein A, eller til prosekvensen av humant Apo AI.

Ekspresjonen av Apo AI og Apo AI-M i gjærstammer og anvendelse av de fremstilte komponenter ved behandling av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer er beskrevet i

W090/12879. Genene som koder for Apo AI og Apo AI-M, ble til-veiebrakt med DNA-sekvenser som koder for en gjær-gjenkjenne-lig sekresjon og bearbeidelsessignaler fusjonert oppstrøms for genet for de modne proteiner. En modifisert MF-alfa-l-leder-sekvens ble anvendt hvori de siste rester var: HisGlySerLeuAspLysArg.

Foreliggende oppfinnelse

Det er nå overraskende blitt funnet at den rensede dimer Apo AI-M/Apo AI-M har en forlenget plasmahalveringstid sammenlignet med den monomere Apo AI-M, og enn videre at den har en markert forbedret fibrinolysestimulerende egenskap sammenlignet med normalt Apo AI, eksempelvis dens evne til direkte å aktivere plasminogen (som normalt Apo Al ikke gjør), en observasjon som kan være av biologisk betydning, og også muligheten til å virke som et prolegemiddel for Apo AI-M. Den danner også rekonstituert HDL- (lipoprotein med høy densitet) partikler av unik størrelse som ikke finnes i rekombinante HDL-partikler inneholdende Apo AI-M eller Apo AI.

Foreliggende oppfinnelse angår dimerpreparat, kjennetegnet ved at det omfatter Apolipoprotein -AI-Milano, heretter kalt Apo-AI-M, med en renhet på minst 90 %, fortrinnsvis minst 98%, som for første gang er blitt isolert og karakterisert fra plasma og som også er blitt fremstilt ved rekombinante metoder. Foreliggende oppfinnelse angår også et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter

dimeren sammen med en bærer.

Videre er det farmasøytiske preparatet ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at det omfatter den rensede dimer sammen med en eller flere av de følgende forbindelser; liposomer, et stabiliseringsmiddel, lipidsenkende middel, lipidstabiliBerende midler eller fosfolipider, eventuelt med en bærer.

Fremgangsmåten for fremstilling av dimeren er ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved: a) fremstilling av Apolipoprotein AI-Milano ved rekombinant teknologi som intracellulært fusjonsprotein i E. coli, avspaltning av Apolipoprotein AI-Milano med maursyre og deretter omdannelse av enhver tilstedeværende monomer til dimeren, eller

b) fremstilling av Apolipoprotein AI-Milano ved rekombinant teknologi hvori Apolipoprotein AI-Milano, monomer og

dimer utskilles i det bakterielle kulturmedium i et ekspres-jonssystem i E. coli og at enhver tilstedeværende monomer deretter omdannes til dimeren, eller

c) oppsamling av plasma fra Apolipoprotein AI-Milano-bærere, isolering av HDL-apolipoproteiner og separering av

dimeren ved anvendelse av kromatografi i flere trinn, eller

d) oppsamling av plasma fra Apolipoprotein AI-Milano-bærere, rensing av monomeren og deretter omdannelse til

dimeren og rensing av dimeren til en hovedsakelig ren form.

Hvis monomer er til stede, skal den alltid omdannes til dimerformen som vist i de etterfølgende eksempler.

Oppfinnelsen innbefatter anvendelse av dimeren ved fremstilling av et medikament omfattende dimeren for behandling av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer. Dimeren kan også ifølge oppfinnelsen anvendes ved fremstilling av et medikament omfattende dimeren, som virker som et prolegemiddel for monomeren, for behandling av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer.

Dette medikament kan anvendes for behandling av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer og for forhindring og behandling av kardiosirkulerende hovedlidelser slik som myokardialt infarkt, ustabil angina, akutte, perifere, vasku-

lære okklusjoner og restenose etter koronar angioplasti.

Når kroniske, arterielle tilstander behandles, behandles både koronar- og også periferarteriene som er karakterisert ved okklusiv plakk. Dimerene vil bli anvendt for in-fusjon per se med det mål å fremkalle fjerning av fett fra-plakkene eller eventuelt i assosiasjon med etablerte behand-linger av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer, slik som anvendelse av heparin, heparinfraksjoner og heparinfragmenter og/eller legemidler som reduserer de sirkulerende nivåer av aterogene lipoproteiner.

Medikamentet inneholdende dimeren, kan anvendes for forhindring og behandling av trombose i forskjellige kliniske omstendigheter og kan anvendes ved Btimulering av fibrinolyse.

Amfipatiske strukturer er til stede i høy grad i Apo AI-M-dimeren, og dimeren er antatt å ha en antiviral effekt.

Ved anvendelse av foreliggende oppfinnelse er det nå for første gang blitt mulig å fremstille dimeren i en hovedsakelig ren form, mer enn 90% og så mye som mer enn 98%, og også å vise at dette produkt har en overraskende bedre effekt på biologiske systemer sammenlignet med Apo AI, noe som er blitt vist i foreliggende eksempler 7-10 nedenfor.

Følgende figurer er vedheftet:

Figur 1 og 2 som illustrerer utbytteavhengigheten i % av proteinkonsentrasjon, Eksempel 2b),

figur 3 som illustrerer kinetikken ved dannelse av Apo AI-M/Apo AI-M i løpet av 24 timer, eksempel 1 b2),

figur 4 som illustrerer syntetisk linker, eksempel 3a) ,

figur 5 som illustrerer plasmid, eksempel 3a),

figur 6 som illustrerer Western-analyse etter spaltning av fusjonsprotein, eksempel 3d),

figur 7 som illustrerer UV-spekteret av Apo AI-M/Apo AI-M, eksempel 5,

figur 8-10 Bom illustrerer andre derivative UV-spek-tra, eksempel 5,

figur 11 som illustrerer fluorescensspektroskopi, eksempel 5,

figur 12 som illustrerer CD-spektroskopi, eksempel 5,

figur 13 som illustrerer rHDL inneholdende Apo AI, Apo AI-M og Apo AI-M/Apo AI-M, eksempel 6.

Eksperimentelt

Eksempel 1

Isolering av dimeren fra plasma

a) Fremstilling av apolipoproteiner

Fastende blodprøver ble oppsamlet på Na2-EDTA

(1 mg/ml) fra forskjellige apolipoprotein Apo AI-M-bærere, og plasma ble fremstilt ved lavhastighetssentrifugering ved 4°C. Plasmalipoproteiner med høy densitet (HDL, d = 1,063-1,21 g/ml) ble isolert ved sekvensvis ultrasentrifugering (Havel R.J., Eder H.A., Bragdon J.H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in

human serum. J. Clin. Invest. 1955; 34:1345-1354) i en Beckman L5-50B ultrasentrifuge utstyrt med en 50,2 Ti-rotor. Etter en 48-timers ultrasentrifugering ved 40.000 opm ved 4°C ble topp-fraksjonen inneholdende HDL, fortynnet 1:1 med en 0,15 M NaCl, 0,01% Naa-EDTA, KBr-løsning (pH 7,4, d = 1,21 g/ml) og resen-trifugert ved 40.000 opm, 4°C i 48 timer. HDL ble dialysert

grundig mot 5 mM NH4HC03( 0,01% Na2-EDTA, pH 7,4, ble lyofilisert og delipidert med dietyleter/EtOH (3:1 volum/volum). Proteinkonsentrasjonen ble målt enten ved aminosyreanalyse eller ved metoden ifølge Lowry et al. (Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193:265-275).

b) Isolering av Apo AI-M/Apo AI-M

For å isolere Apo AI-M/Apo AI-M ble HDL-apolipoproteiner fra eksempel la) oppløst i 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Naa-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 6 M guanidin-HCl (Gdn-HCl). Apolipoproteinene ble anbrakt på en "Sephacryl" S-300 HR-kolonne (2,6 x 300 cm) ekvilibrert med 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 4 M Gdn-HCl. Apolipoproteiner ble eluert med den samme buffer ved en strøm-ningshastighet på 1,5 ml/min.; fraksjoner på 10 ml ble oppsamlet. Oppsamlede fraksjoner inneholdende Apo AI-M/Apo AI-M, ble konsentrert under vakuum og anbrakt på nytt på samme kolonne. Fraksjonene inneholdende det rene Apo AI-M/Apo AI-M, ble samlet, dialysert mot 5 mM NH4HCO3, 0,01% Na2-EDTA, pH 7,4, lyofilisert og lagret ved -20°C i 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 3 M Gdn-HCl. Apo AI-M/Apo AI-M-preparatene var >98% rene som sjekket ved størrelses-eksklu-sjonskromatografi med høy ytelse (HPSEC) og SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) under ikke-reduserende betingelser. Ved denne metode ble ren dimer av Apo AI-M isolert fra plasma fra bærere.

Eksempel 2

Rensing av monomeren fra plasma og omdannelse deretter til dimeren

a) Rensing av Apo AI-M

For å rense Apo AI-M-monomeren ble HDL-apolipoproteiner fra eksempel la) oppløst i 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na3-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 6 M Gdn-HCl og 1% 2-merkaptoetanol. Etter 4 timers inkubering ved 37°C ble det reduserte apo-HDL anbrakt på en "Sephacryl" S-200-kolonne (2,6 x 150 cm) ekvilibrert med 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 4 M Gdn-HCl og 0,1% 2-merkaptoetanol. Apolipoproteiner ble eluert med den samme buffer, i en strømningshastighet på 1,0 ml/min., og fraksjoner på 5 ml ble oppsamlet. Oppsamlede fraksjoner svarende til apo AI + apo AI-M, ble dialysert mot 5 mM NH4HC03, 0,01% Na2-EDTA, pH 7,4, og lyofilisert. Apolipoproteiner ble oppløst i 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 6 M Gdn-HCl og 1% 2-merkaptoetanol. Etter en 4-timers inkubering ved 25°C ble 2-merkaptoetanol fjernet ved "Sephadex" G25-kromatografi, og apolipoproteinene ble umiddelbart anbrakt på en tiopropyl-Sepharose-kolonne (1 x 10 cm) ekvilibrert med 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 4 M Gdn-HCl. Etter resirkulering over natten ved en lav strømningshastighet (0,15 ml/min.) ble normalt Apo AI eluert med 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 4 M Gdn-HCl. Apo AI-M ble deretter eluert med den samme buffer inneholdende 4 M Gdn-HCl og 1% 2-merkaptoetanol. Apo AI-M-holdige fraksjoner ble samlet, dialysert mot 5 mM NH4HCO3, 0,01% Na3-EDTA, pH 7,4, lyofilisert og lagret ved - 20°C i 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, inneholdende 3 M Gdn-HCl og 0,1% 2-merkaptoetanol. Apo AI-M-preparater var >98% rene, som sjekket ved HPSEC, SDS-PAGE og isoelektrisk fokusering.

b) Apo AI-M/Apo AI-M-syntese

Apo AI-M-løsninger ble dialysert mot 25 mM Tris-HCl-buffer, pH 9,0. Det reduserte Apo AI-M ble fortynnet til den ønskede sluttkonsentrasjon (3,6-53,6 uM) med 25 mM Tris-HCl-buffer inneholdende redusert glutation (GSH) (1-5 mM) og pre-inkubert ved 25°C i 5 minutter. Oksidasjon ble startet ved tilsetning av oksidert glutation (GSSG) (0,1-10,0 mM) og for-ble i tett lukkede rør ved den samme temperatur i 24 timer. Oksidasjonen ble overvåket ved SDS-PAGE (se ovenfor). Etter beising og avbeising ble gelene scannet med et LKB "Ultroscan" XL-laserdensitometer, og den prosentvise fordeling av indivi-duelle proteinbånd ble beregnet med LKB 2400 "Gelscan" XL software. Oksidasjonskinetikken ble overvåket ved HPSEC.

For å optimalisere syntesen av dimeren ble ytterligere oksidasjonsforsøk utført i nærvær av GSH/GSSG + Gdn-HCl og GSH/GSSG + tioredoksin. (Pigiet V.P. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1986; 83:7643-7647).

Oksidasjonen av Apo AI-M ble utført i lukkede rør i nærvær av variable konsentrasjoner av redusert/oksidert glutation (GSH/GSSG) . Reaksjonsutbyttet av dimeren var avhengig både av proteinkonsentrasjon (fig. 1, tabell 1) og GSH/GSSG-konsentrasjon/forhold (figur 2, tabell 1). Ved økning av proteinkonsentrasjonen fra 8,9 uM til 53,6 uM ble prosenten av Apo AI-M/Apo AI-M økt med 26-51% (fig. 1, tabell 1). En reduksjon i GSH/GSSG-molarforholdet fra 1/2 til 1/16 resulterte i en 43% reduksjon av utbytte; på den annen side var en stigning i GSH/GSSG-konsentrasjonen, med et konstant GSH/GSSG-molarforhold, assosiert med en opp til 42% økning i Apo AI-M/Apo AI-M-dannelse (fig. 2, tabell 1). Både reaksjonstemperaturen og

nærvær av et proteindenatureringsmiddel (Gdn-HCl) påvirket ikke graden av Apo AI-M/Apo AI-M-dannelse. En signifikant dan-

neise av Apo AI-M/Apo AI-M ble også oppnådd ved inkubering av Apo AI-M med GSH/GSSG i nærvær av 0,2 mM tioredoksin (tabell 1) .

Kinetikken ved oksidasjonsreaksjonen ble overvåket ved analytisk HPSEC. Det dimere og monomere Apo AI-M ga dis-tinkte topper med retensjonstider på 10,8 og 12,7 minutter. AI-M/AI-M-syntesen (GSH/GSSG 2 mM/4 mM, Al-M-konsentrasjon 8,9 uM) var tilnærmet fullført etter 3 timer; en forlengelse av inkubasjonen opp til 24 timer økte ikke AI-M/AI-M-dannelsen (fig. 3) ytterligere.

Reaksjonsbetingelser: Buffer: Tris-HCl 25 mM, pH 9,0

Temperatur: 25-C

Tid: 24 timer

Eksempel 3

Rekombinant produksjon av Apo AI- M/ Apo AI- M

a) Konstruksjon av ekspresjonsvektoren pKP644:

Den replikative form av bakteriofag Ml3mpl8 inneholdende det cDNA som koder for apolipoprotein ai-m (Snarpe CR. et al., Nucleic Acids Research, vol. 12, nr. 9, s. 3917, 1984 og Cheung M.C. et al., Biochem. Biophys. Acta 960, s. 73-82, 1988) ble oppsluttet med restriksjonsenzymet BamHI og renset ved lavgeleringstemperatur- (LGT) agarosegelelektroforese. 822 bp-fragmentet svarende til Apo AI-M-genet, ble skåret ut og ligert til plasmidet pUC9 som på forhånd var oppsluttet med BamHI og behandlet med kalvetarm-fosfodiesterase.

Ligeringsblandingen ble anvendt for å omdanne kompetent E. colt JM83, og hvite kolonier ble tatt opp fra agarplater inneholdende Ampicillin, X-Gal og IPTG. Plasmid-DNA ble fremstilt og renset på "QuiaGene"-kolonner (QuiaGene Inc., 9259 Eton Ave., Chatsworth, CA 91311, USA) i henhold til fabrikantens anbefalinger. Det avledede plasmid, angitt: som pUC/Apo AI-M, ble oppsluttet med EcoRI og Ncol. En aliguot av oppslutningsblandingen ble analysert ved agaroseelektroforese for å bekrefte den korrekte orientering. En annen aliquot ble anvendt for å ligere den syntetiske linker "AApo AI-Eco" (fig. 4) til 5'-enden av Apo AI-M-genet for å danne genet AApo AI bestående av 724 bp. AApo AI-M-sekvensen danner et Asp-Pro-sete ved N-enden av det kodede protein som letter spaltning med maursyre. Kompetent E. coli JM83 ble omdannet med ligeringsblandingen, og det avledede plasmid (angitt som pUC/AApo AI-M) ble isolert på "QuiaGene"-kolonner som ovenfor.

Plasmidet pUC/AApo AI-M og ekspresjonsvektoren pEZZ ble oppsluttet med EcoRI og BamHI, renset ved LGT-agaroseelektroforese, og 799 bp-fragmentet av pUC/AApo AI-M ble ligert til 2763 bp-fragmentet pf pEZZ. Ligeringsblandingen ble anvendt for å omdanne kompetent E. coli RV308, og plasmid-DNA ble fremstilt som ovenfor angitt.

For forsøksprosedyrene, se Sambrook J., Fritsch E.F. og Maniatis T. (19B9), Molecular Clonings; A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Det avledede plasmid ble angitt som pKP64 (fig. 5).

b) Ekspresjon av det fusjonerte protein ZZ-AApo AI-M:

40 ml av en kultur av E. coli RV308/pKP644 som har

stått over natten, dyrket ved 30° i LB med 50 mg/ml kanaraycin, ble inokulert i 2 x 500 ml minimalt medium A (Curr. Meth. i Mol. Biol.) med tilsetning av 0,2 g/l kasaminosyrer, 1 mM

MgS04, 0,25% glukose og 50 mg/ml kanamycin. Kulturen ble inkubert ved 37"C i 24 timer under kraftig risting.

c) Første rensing av Apo AI-M:

1,0 liter av en E. coli-kultur (RV308/pKP644) inneholdende det beskrevne plasmid, ble sentrifugert, og de pel-letiserte celler ble resuspendert i 30 ml 1 x TS (25 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA) og 6 M Gdn-HCl g ble homogenisert ved en enkel passasje gjennom en French Press (SLM Instruments Inc.) ved et arbeidstrykk på 70,31 kg/cm<2>. Den resulterende suspensjon ble inkubert ved romtemperatur med forsiktig, risting i 1 time og ble sentrifugert. Supernatanten ble deretter fortynnet til en sluttkonsentrasjon av Gdn-HCl på 1 M (dvs.

seks ganger) og fylt på en kolonne av 15 ml "Sepharose Fast-Flow" IgG ekvilibrert med 1 x TS. Etter fylling ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolumer av 1 x TS etterfulgt av 20 mM ammoniumacetat, pH 5,4, inntil pH på eluatet nådde 5,4. Det bundne materiale ble eluert med 25 ml 0,2 M HAc, og absorban-sen ved 280 nm (A2eo) ble overvåket. Utbyttet fra en 1-liters kultur var 1,9 mg basert på A280-verdien.

d) Spaltning av fusjonsproteinet:

Eluatet ble oppdelt i aliguoter, lyofilisert og resuspendert i hhv. 75%, 50% og 25% maursyre. Løsningene ble inkubert ved 37°C i 28 timer og ble deretter lyofilisert for å fjerne maursyren. Spaltningsproduktene ble utprøvet under anvendelse av SDS-PAGE etterfulgt av en Western-analyse. Tilnærmet 5 mg totalt protein ble fylt på SDS-PAGE-gelgradient 8-25% under ikke-reduserende betingelser. Prøvene ble kjørt in duplo. Én gel ble beiset med Coomassie, og én ble anvendt for Western-analyse. Resultatene er vist i fig. 6. Ett av spaltningsproduktene vandrer med det rensede, naturlige Apo AI og gir opphav til et signal i Western-analysen. Western-analyse ble utført under anvendelse av polyklonale antistoffer konju-gert med pepperrotperoksidase (The Binding site Ltd.,

Cambridge, England) og ble visualisert under anvendelse av standardprosedyrer.

Figur 6 viser analysen av de resulterende proteiner etter spaltning av fusjonsproteinet. Panel A; Coomassie-beiset SDS-PAGE-gel (8-25%). Spor 1: 25% maursyre; spor 2: 50% maursyre; spor 3; 75% maursyre; spor 4: renset, naturlig Apo AI (Sigma) og spor 5: LMV-markør (Pharmacia). Panel B: Western-analyse av en duplikatgel. Spor 1: renset, naturlig Apo AI (Sigma); spor 2: 75% maursyre; spor 3: 50% maursyre og spor 4: 25% maursyre. Nærvær av et bånd ved den doble molekyl vekt av Apo AI-M på Western-analysen viste at dimerene av Apo AI-M var til stede.

Eksempel 4

Fremstilling av Apo AI- M i bioreaktorer

Konstruksjon av vektorer for direkte sekresjon av Apo AI- M til det perlplasmlske rom og vekstmedlum.

Stammer og vektorer. Escherichla coli K12-stammene som ble anvendt, var HB101 F", hsd S20( rB~, mB~) supE44. HB101

F", hsd S20( rB~, mB~), supE44, ar al 4, I", galK2, lacYl, proA2, rspL20. xyl- 5, mtl- 1. recA13, rB", mB", ncrA( + ), mcrB(-) (Boyer et al., 1969, J. Mol. Biol. 41:459-472), DH5a F-, F80DlacZDMl5, D( lacZYA- argF) U169. recAI, endfll, gyrÆ, I", thi- i, hsdR17, ( r^, m^) r supE44, relAI, (BRL, USA). RV308 DlacX74, galOP::IS2(gal0P308), strA, I'. (Maurer et al.1980. J. Mol.

Biol. 139:147-161) og BC50 xyl- 7, ara- 14, T4-R, I". Stammene HB101 og DH5a ble anvendt for subkloning av DNA-fragmenter. Plasmidet pUC9 (Vieira et al., 1982. Gene 19:259-68) ble anvendt for subkloning av et 821 bp Barn HI-fragment av en cDNA-kopi av humant Apo AI erholdt fra S. Sidoli (Milano). Nukleo-tidsekvensen av humant Apo AI-cDNA kan erholdes fra GenBank under aksesjonsnr. X02162. (Seilhammer et al. 1984. DNA 3:309-317). Denne vektor ble betegnet som pKP575. Også et 856 bp Eco RI- Pst I-fragment av humant Apo ai-m DNA (cDNA-kopi fra S. Sidoli) ble subklonet i plasmidet pUC9. Dette derivat ble betegnet som pKP576. Plasmidene pKP683 og pKP764 er derivater av plasmidene pTrc 99 (Amann et al. 1988. Gene 69:301-15) og et pUC-derivat med transposon- (Tn903) avledet kanamycinresis-tensmarkør fra pUC4-K (Vieira et al., 1982, Gene 19:259-268 og Oka et al., 1981. J. Mol. Biol. 147:217) og transkripsjonster-minatorene (T1T2) av bakteriofagen fd, fra pUEX2 (Bressan et al., 1987. Nucleid Acid. Res. 15:10056).

Anvendte metoder. Bakteriestammene ble dyrket i Luria Bertani-medium (LB) eller gjærtryptonmedium (2 x YT) med ampicillin (Ap) 50 ug/ml eller kanamycin (Km) 70 rø/ml for fremstilling av plasmid-DNA og for ekspresjonsanalyse i liten skala (Sambrook et al., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Tryptoseblodagarbase (Difco, USA), supplert med Ap 50 ug/m eller Km 70 ug/ml, ble anvendt for dyrking av celler på agarplater. Rekombinante DNA-teknikker ble utført i henhold til (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Restriksjonsendonukleaser og T4 DNA-ligase ble erholdt fra Boehringer Mannheim (Tyskland), New England Biolabs (Beverly, USA) eller Pharmacia (Uppsala, Sverige). Isopropyl-b-D-galaktosid (IPTG) ble erholdt fra Sigma (USA). Lavgelering og smeltetemperaturagarose (NuSieve GTG, FMC Bioproducts, USA) ble anvendt for å isolere DNA-fragmenter. PCR-forsterkninger ble utført under anvendelse av DNA-termalsyklisatoren og Taq DNA-polymerasen fra Perkin-Elmer/Cetus Instruments (Norwalk, USA). Oligonukleotidlinkere og primere ble syntetisert på en "Pharmacia-LKB Gene Assembler Plus" fra Pharmacia (Uppsala, Sverige) under anvendelse av fosfittriestermetoden på fast fase. Nukleotidsekvensbestemmelsen ble utført på en Applied Biosystem 373A DNA-sekvensator under anvendelse av "Taq DyeDeoxy" Terminator Cycle Sequencing Kit fra Applied Biosystem (USA).

Anvendt DNA-dataprogram. Macintosh-programmet "PlasmidARTIST" (versjon 1.2) (Clontech, USA) ble anvendt for å tegne plasmidkartene, og "GCG Sequence Analysis Software Package" (Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin, USA) ble anvendt for å håndtere DNA-sekvenser på digitale VAX-

datamaskiner.

Konstruksjon, ekspresjon og sekresjon av Apo AI- M i bakterier. Målet med vektorkonstruksjonene var å oppnå et produksjonssekresjonssystem for Apo AI-M i E. colt med et meget høyt nivå av Apo AI-M utskilt i vekstmediet. To oligo-nukleotider ble syntetisert for fusjonering av Apo AI og Apo AI-M-cDNA-kopiene til DNA-fragmenter som koder for bakterielle slgnalsekvenser. 14 bp Eco RI og Nco I - fragmentet og 40 bp Nco I-fragmentet av pKP575 ble erstattet med et syntetisk 37 bp Eco RI Nco I-fragment i et plasmid betegnet pKP580. Bbs I-spaltningssetet i dette syntetiske DNA-fragment gir det samme spaltningssete som Mlu I som letter kloning av forskjellige fragmenter som koder for bakterielle slgnalsekvenser. Plasmidet pKP631 ble konstruert ved å erstatte et 702 bp Nco I - Dra III-fragment av pKP575 (Apo AI) med et 702 bp Nco I - Dra III-fragment av pKP576 (Apo AI-M). Fra plasmidet pKP631 ble et 820 bp Bbs I - Hind III-fragment isolert og innskutt ved Mlu I og Hind III av en plasmidvektor som ble betegnet pKP682. Denne vektor inneholder en tac-promoter (Ptac), et derivat av en ompA-signalsekvens, to transkripsjonsterminatorer og en kana-myclnresistensmarkør. Et 1501 bp Nru I - Nru I-fragment ble isolert fra pKP682 og innskutt i en lignende vektor, men med Ptac erstattet med Ptrc-promoteren. Denne ekspresjonsvektor ble betegnet pKP683. Plasmidet pKP764 ble konstruert ved å erstatte 88 bp Dra III - Hind III av pKP683 med et 14 bp syntetisk DNA-fragment inneholdende sterkere translasjonstermin-atorer og ødeleggelse av Dra III-setet ved innføring av et A ved enden av Dra III som henger over 3'-enden. Transformering av E. coll-stammer ble utført som beskrevet i (Sambrook et al., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press). De anvendte plasmidkonstruksjoner for ekspresjonsforsøk overfor produksjon av Apo AI-M ble analysert under anvendelse av restriksjonsen-zymkartlegging, og det strukturelle gen av Apo AI-M ble be- ■ kreftet ved nukleotldsekvensbestemmelse. E. coll-stammene med de egnede plasmider anvendt for vekst i bioreaktorer, ble fremstilt som følger. Celler ble dyrket over natten i LB eller

2xYT supplert med Km 1 rlstekolber ved 30°C. Etter sentrifu-gering ble cellen resuspendert 1 1/2 volum av dypfryst lager-medlum 1 henhold til Gergen et al., 1979. Nucleic Acld Res. 7:2115. Allquoter ble utlevert 1 1 ml kryoampuller og lagret ved -75°C inntil de ble anvendt.

tekstmedium for cellevekst i bioreaktorer. Medium A: 16 g/l trypton (Difco, USA), 8 g/l gjærekstrakt (Difco, USA),

5 g/l NaCl og 0,05 g/l kanamycin. Medium B: 2,5 g/l (NH4)2S04, 3 g/l KH2P04, 2 g/l K2HP04, 0,5 g/l Na3-sitrat, 5 g/l gjærekstrakt (Difco, USA). Etter sterilisering ble mediet supplert med: 10 g/l startglukose, 0,05 g/l kanamycin, 1 g/l MgS04 x 7 H20 og 0,07 g/l tiaminhydroklorid. En sporelementløsning (1 ml/l) og en vitaminløsning (0,65 ml/l) ble tilsatt. Sporele-mentløsningen inneholdt: 27 g/l FeCl3 x 6 H20, 4 g/l ZnS04 x 7 H20, 7 g/l CoCl2 x 6 H20. 7 g/l Na2Mo04 x 2 H20, 8 g/l CuS04 x 5 H20, 2 g/l H3B03, 5 g/l MnS04 x 4 H20, 11 g/l CaCl2 x 2 H20 og 50 ml/l HC1. Vitaminløsningen inneholdt: 0,5 g/l kalsiumpanto-tenat, 0,5 g/l cholinklorid, 0,5 g/l folsyre, 1 g/l inositol, 0,5 g/l nikotinamid, 0,5 g/l pyridoksinhydroklorid, 0,05 g/l riboflavin og 0,5 g/l tiaminhydroklorid. Adekanol (0,2 ml/l) ble anvendt som antiskumningsmiddel. Om nødvendig, ble ytterligere tilsetninger av antiskumningsmiddel foretatt under dyrkningen.

Dyrkning av RV308/ pKP683 i en bioreaktor på 3,5 liter.

Dypfryst lagerkultur ble anvendt for å inokulere 500 ml medium A og ble prekultivert i 2-liters Erlenmeyerkolber med sideplater ved 30°C i 8-10 timer. Et inokulumvolum svarende til 10% av bioreaktorens arbeidsvolum, ble overført til bioreaktoren. Dyrkningen ble utført i en bioreaktor på 3,5 liter (Belach AB, Sverige) med et arbeidsvolum på 2,5 liter. Temperaturen var 30"C under vekstfasen før induksjon og ble deretter hevet til 37<6>C. pH ble opprettholdt ved 7,0 med en løsning av 25% ammoniakk. Gjennomluftningsgraden ble holdt ved 1 wm, og den oppløste oksygenspenning (D.O.T.) ble holdt ved 30% ved justering av kompressorhastigheten. Etter at startglu-kosen var forbrukt, ble en glukosefdret sats startet idet sys-ternet ble holdt ved glukosebegrensnlng ved tilføring av en 60% løsning av glukose. Den første fdringshastighet, 0,04 g/min., ble holdt i 3 timer og ble deretter gradvis økt til 0,4 g/min. i løpet av 3 timer. Cellevekst ble overvåket ved å følge den optiske densitet (OD). Konsentrasjonen av Apo AI-M i supernatanten ble bestemt ved radioimmunobestemmelse (apolipoprotein AI RIA 100-sett, art. nr. 109152-01. Kabi Pharmacia, Sverige). Etter 16 timers dyrkning, ved en OD på 58, ble pro-teinsyntese fremkalt ved tilsetning av 0,5 mM IPTG, og temperaturen ble økt til 37"C. 4 timer etter Induksjonen var konsentrasjonen av Apo AI-M 2,3 g/l, og etter ytterligere 2 timer var konsentrasjonen 2,5 g/l.

Dyrkning av BC50/ pKP764 i en bioreaktor på 3,5 liter. Dyrkningen ble utført som beskrevet ovenfor, bortsett fra at ikke noe kanamycin ble tilsatt til bioreaktormediet. Etter 15 timer, ved en OD på 60, ble IPTG tilsatt, og temperaturen ble hevet. 10 timer senere var konsentrasjonen av Apo AI-M i supernatanten 3,7 g/l, og 22 timer etter induksjon var konsentrasjonen 4,4 g/l.

Dyrkning av BC50/ pKP764 i en bioreaktor på 300 liter.

En bioreaktor på 300 liter (Chemoferm AB, Sverige) med et arbeidsvolum på 180 liter ble anvendt. Inokulumet ble

fremstilt som beskrevet ovenfor for vekst av RV308/pKP683 1 en bioreaktor på 3,5 liter, bortsett fra at prekultiveringstiden i ristekolber var 14 timer. Inokulumet ble overført til en 50 liters forkulturbioreaktor med et arbeidsvolum på 18 liter. Mediet anvendt i ristekolbene så vel som i bioreaktoren, var medium A. Forkulturbioreaktormediet ble supplert med 5 g/l glukose, og temperaturen var 30°C. pH og gjennomluftning var som beskrevet ovenfor for vekst av RV308/pKP683 i en bioreaktor på 3',5 liter, og D.O.T. var aldri under 30%. Når kulturen nådde en OD på 4, ble innholdet av forkulturbioreaktoren over-ført til bioreaktoren på 300 liter. I denne bioreaktor var temperatur, pH og gjennomluftning av mediet som beskrevet ovenfor for vekst av RV308/pKP683 i en bioreaktor på 3,5 liter. Før induksjon ble D.O.T. holdt ved eller over 30% ved

økning av kompressorhastigheten opp til dens maksimum og deretter økning av lufttrykket. Etter induksjon ble lufttrykket økt til 2 bar, noe som resulterte i en D.O.T. på 15-20%. Etter 16 timers dyrkning i bioreaktoren da kulturen hadde en OD på

51, ble IPTG tilsatt, og temperaturen ble økt til 37°C.

Konsentrasjonen av Apo AI-M som monomer og dimer var 1,3 g/l, 5 timer etter induksjon og under den etterfølgende time, og mens bioreaktoren ble avkjølt, ble konsentrasjonen av Apo AI-M økt til 1,5 g/l.

Enhver tilstedeværende monomer ble omdannet til dimer og renset i henhold til konvensjonelle metoder.

Eksempel 5

Karakterisering av Apo AI- M/ Apo AI- M fra plasma

Det rensede Apo AI-M/Apo AI-M fra eksempel 1 ga et enkelt bånd i overbelastede, ikke-reduserte SDS-PAGE-geler. I analytisk SDS-PAGE var den tilsynelatende molekylvekt av proteinet som forventet, 56 kD. Apo AI-M/Apo AI-M utviste et komplekst, isoformt mønster kjennetegnet ved nærvær av minst 6 forskjellige proteinbånd i 5,3-5,6 pl-området, i ikke-reduserte, denaturerte IEF-geler.

Apo AI-M/Apo AI-M- (1,1 mg/ml) UV-spekteret viste et typisk absorbansmaksimum ved 280 nm, med en skulder ved 290,2 nm (fig. 7). Det beregnede protein E (1 cm, 1%) ved 280 nm var 16,9. For å evaluere eksponeringen av tyrosinrester i Apo AI-M/Apo AI-M ble en andre-derivativ analyse av UV-spektre utført som beskrevet av Ragone R. et al., Determination of ty r os ine exposure in proteins by second-derivative spectroscopy, Biochemistry 1984; 23:1871-1875. Andre-derivative UV-spektre utviste typisk to minima sentrert rundt 283 og 290,5 nm, og to maksima rundt 287 og 295 nm (fig. 8-10). De relative grader av tyrosineksponering (alfa) beregnet for naturlig Apo AI-M/Apo AI-M og Apo-AI-M/Apo AI-M + DMPC var hhv. 0,75 og 0,49 (tabell 2).

Både Apo AI-M/Apo AI-M (0,1 mg/ml) eksiterings- og emisjonsfluorescensspektrene ble nedtegnet. Eksiteringsbølge-lengdemaksimumet for tryptofanylrester i Apo AI-M/Apo AI-M var ved 280 nm og ble ikke forandret etter assosiasjon med DMPC. Emisjonsspekteret (eksitering ved 280 nm) viste et 344 nm bøl-gelengdemaksimum (figur 11); og assosiasjonen med DMPC fremkalte en skiftning mot det blå av dette maksimum (338 nm) assosiert med en 24% økning i fluorescensintensitet ved maksi-mumet (fig. 11).

Apo AI-M/Apo AI-M far-UV CD-spektret var karakterisert ved typiske minima ved 208 nm og 222 nm og et maksimum rundt 195 nm (fig. 12). Alfa-spiralinnholdet økte signifikant med økende proteinkonsentrasJoner fra 0,1 mg/ml til 1,1 mg/ml (fig. 12, tabell 2). Assosiasjonen av Apo AI-M/Apo AI-M (0,1 mg/ml) med DMPC fremkalte en ytterligere økning i protein-alfa-spiralstruktur (fig. 12, tabell 2).

Metoder for karakterisering av produktet

Inkubering med fosfolipider

Oppveide mengder av dimyristoylfosfatidylcholin (DMPC) ble oppløst i etanol, og løsningsmidlet ble fordampet under N2; ethvert gjenværende løsningsmiddel ble fjernet under vakuum i 2 timer. Dispersjoner av DMPC i 20 mM fosfatbuffer, pH 7,4, ble blandet med Apo AI-M/Apo AI-M (0,1 mg/ml, slutte-lig) til et 100:1 DMPC/Apo AI-M/Apo AI-M-molarforhold.

Spektroskop!

Apo AI-M/Apo AI-M-løsninger ble dialysert mot 20 mM fosfatbuffer, pH 7,4, og ble fortynnet med den samme buffer til den ønskede proteinkonsentrasjon.

Normale og andre-derivative UV-spektre av Apo AI-M/Apo AI-M og Apo AI-M/Apo AI-M + DMPC-løsninger ble nedtegnet med "Jasco Uvidec-610"- og "Perkin Eimer Lambda-2"-spektro-metere ved 25°C under anvendelse av en 1 cm kvartscelie. Topo-grafisk lokalisering av tyrosinrester ble undersøkt i henhold til ligningen ifølge Ragone et al. (Ragone R., Colonna G., Balestrieri C, Servillo L., Irace G., Determination of ty ro-sine exposure in proteins by second-derivative speetroscopy. Biochemistry 1984; 23:1871-1875):

hvor alfa er graden av tyrosineksponering overfor løsningsmid-let, rn og ru er de derivative toppforhold (a/b) for naturlig og ufoldet (i 6 M Gdn-HCl) Apo AI-M/Apo AI-M, og ra er det andre derivative toppforhold av en løsning inneholdende fritt

tyrosin og tryptofan blandet i det samme molarforhold som 1 Apo AI-M/Apo AI-M.

Egen- fluorescensspektra for Apo AI-M/Apo AI-M og Apo AI-M/Apo AI-M + DMPC-løsninger ble nedtegnet på et "Jasco FP-550"-spektrofluorometer ved 25"C.

Sirkulær dikrolsme- (CD) spektre for Apo AI-M/Apo Al-M og Apo AI-M/Apo AI-M + DMPC-løsninger ble nedtegnet med et "Jasco J500A"-spektropolarimeter ved 25°C. Midlere rest-ellipseverdier [THEYA] ble uttrykt i grader x cm<2> x dmol<*1> og ble beregnet ved ligningen: hvori [THEYA] er den observerte elliptisitet i grader, 106 er den midlere restmolekylvekt av proteinet, 1 er banelengde i cm, og c er proteinkonsentrasjonen i g/ml. Den prosentvise alfa-heliks ble beregnet under anvendelse av.ligningen: ;(Greenfield N., Fasman G.D., Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry 1969; 8:4108-4116). ;Elektroforese ;Analytisk isoelektrisk fokusering og SDS-PAGE ble utført som beskrevet tidligere (Franceschini G., Sirtori M., Gianfranceschi G., Sirtori CR. Relation between the HDL apo-proteins and AI isoproteins in subjects vrith the AI-M abnor-mality. Metabolism 1981; 30:502-509). ;Isoelektrisk fokusering ble utført i 10% akrylamidgeler inneholdende 6 M urea og 4% amfoliner (pH 4-6). Etter fokusering over natten ble gelene fiksert og beiset med "Coomassie Brilliant Blue R-250" i eddiksyre/isopropylalkohol. Det isoelektrlske punkt (pl) av ethvert ukjent proteinbånd ble beregnet ved nedtegning av pl for kjente proteiner (standarder fra Bio-Rad og apo-HDL) mot den respektive vandringsdistanse. ;For SDS- PAGE ble 14% akrylamidgeler inneholdende 0,1% SDS, anvendt. Gelene ble behandlet som beskrevet, og molekyl-vekten av ukjente proteiner ble beregnet fra kurven av logMW av proteinstandarder (KABI-Pharmacia) vs vandringsdistanse. ;Størrelses- eksklusjonskromatoqrafi med høy ytelse ;Analytiske HPSEC-separasjoner ble utført under anvendelse av en Jasco-væskekromatograf utstyrt med en 10 um TSK-G3000 SW-kolonne (7,5 x 300 mm). HPSEC-kolonnen ble ekvilibrert og eluert med 0,1 M fosfatbuffer, 0,1 M NaCl, pH 7,2, inneholdende 8 M urea. Proteiner ble eluert ved en strømnings-hastighet på 0,5 ml/min., og avlesninger ble foretatt ved 220 nm. Topparealene ble integrert under anvendelse av en HP-3390-integrator. ;Eksempel 6 ;Fremstilling av rHDL- partikler inneholdende Apo I. A<p>o AI- M eller Apo AI- M/ Apo AI- M ;Rekonstituerte lipoproteinpartikler med høy densitet (rHDL) ble fremstilt under anvendelse av teknikken presentert av Nichols A.V. et al., Biochim. Biophys. Acta 750:353-364(1983) og Matz CE. et al., J. Biol. Chem. 257:4535-4541 ;(1982). Rekombinant Apo AI-M-dimer (fra eksempel 4) og normalt Apo AI, renset fra humanplasma, ble oppløst i 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,01% EDTA, 0,006% NaN3, pH 8,0 (buffer A), inneholdende 4 M Gdn-HCl til en konsentrasjon på 6 mg/ml. For sammenligning ble disulfidbindingen i noe av Apo AI-M/Apo AI-M redusert ved tilsetning av 20 mM DTT til buffer A + Gdn-HCl. Proteinene ble dialysert grundig mot buffer A og fortynnet til 5,2 mg/ml med den samme buffer. ;Fosfolipider, enten eggfosfatidylcholin (EPC) eller palmitoyloleylfosfatidylcholin (POPC) ble oppløst i CHC13, ble tørket under N2 og holdt under vakuum over natten. Natrium-cholat ble tilsatt til et cholat/PC-forhold på 0,55 (vekt/vekt); blandingen ble omrørt kraftig i 3 minutter ved romtemperatur og inkubert ved 4° i 2 timer. Proteinet ble der- ;etter tilsatt til et PC/protein-vektforhold på 2,17 (POPC) ;eller 2,47 (EPC), og blandingen ble ororørt i 3 minutter ved romtemperatur og inkubert ved 4°C over natten. Etter dialyse mot buffer A i 5 dager ble blandingen sentrifugert ved 11.000 opm pr. minutt i 5 minutter i en "Beckman Microfuge", og supematanten ble oppsamlet. ;rHDL ble separert ved ikke-denaturerende polyakryl-amingradientgelelektroforese (GGE), og partikkelstørrelsen ble bestemt som tidligere beskrevet av Nichols A.V. et al. i Meth. Enzymol. 128:417-431 (1986). ;Alle de testede apolipoproteiner assosierte tilnærmet fullstendig med lipider etter den beskrevne prosedyre som vist ved den meget lille topp av lipidfritt apolipoprotein på GGE-geler. Gjenvinningen av proteinet i rHDL varierte mellom 68% ;til 100% i 10 forskjellige preparater. ;GGE-profiler av rekonstituerte HDL-partikler er vist ;i figur 13. HDL rekonstituert med Apo AI og EPC, ga en hoved-topp på GGE med en diameter på 9,6 nm; mindre komponenter, både av større og mindre størrelse, var også påvisbare. rHDL inneholdende EPC og Apo AI-M/Apo AI-M, besto av to hovedkomponenter (diameter: 8,6 og 12,9 nm) og to mindre komponenter (diameter 7,9 og 10,8 nm) (fig. 13); den samme partikkelstør-relse ble erholdt når Apo AI-M/Apo AI-M ble rekonstituert med POPC. Alle tre apolipoproteiner var praktisk talt fullstendig inkorporert i stabile Upid-proteinkomplekser med forskjellige rHDL-partikkelstørrelser, fordeling og sammensetning. I særdeleshet besto rHDL fremstilt med rekombinant Apo AI-M/Apo AI- ;M av to hovedkomponenter hvor den større er én som er unik blant familien av Apo AI-holdig rHDL. ;Biologisk evaluering av Apo AI- M/ Apo AI- M ;Eksempel 7 ;Kinetisk atferd av A<p>o AI- M- dimer mot Apo AI- monomer i normale resipienter ;Dimerer utviser forlenget vedvarenhet i sirkulasjonen, noe som er blitt vist i humane, kinetiske studier nedenfor. ;De friske frivillige personer mottok i.v. <125>1-merket ;Apo AI-M eller Apo AI-M/Apo AI-M. Som vist i tabell 3, ble plasma Bt1/2 (h) beregnet i henhold til to forskjellige model-ler, så vel som den fraksjonelle, katabolske grad (FCR). Begge disse bekrefter en markert redusert katabolisme av dimeren vs monomeren. Den meget langsomme katabolisme av Apo AI-M/Apo AI-M indikerer at disse molekyler kan svekke lipoproteinomdann-else og muligens virke som en effektiv forløper for Apo AI-M. Ved injeksjon av Apo AI-M/Apo AI-M kan det på denne måte for-utsis at dimeren kan forbli i plasma i en forlenget tidsperi-ode og således direkte interagere med lipoproteinmetabolismen og det fibrinolytiske system. ;Effekt av Apo AI- M/ Apo AI- M på det fibrinolytiske system Introduksjon ;Det fibrinolytiske system er hovedforsvaret mot fib-rinavsetning på karveggene og spiller som sådant en viktig rolle blant mekanismene som forhindrer trombose. Enzymet som er ansvarlig for lyse av fibrin, er plasmin. Plasmin dannes fra det inaktive forløperplasminogen ved virkningen av spesifikke aktivatorer (vevsplasminogenaktivator, t-PA og urokinase, uPA). Både aktiveringsprosessen og virkningen av plasmin reguleres av spesifikke inhibitorer - plasminogenaktivatorin-hibitor 1 (PAI) og alfa 2 - antiplasmin. Skjema for det fIbrinolytiske system er presentert nedenfor. ;Målet med foreliggende undersøkelse i eksemplene 7-9 var å finne ut hvordan Apo AI-M-dimeren påvirker det humane, f ibrinolytiske system. Både autoaktivering av plasminogen og dets aktivering med uPA og t-PA ble studert i nærvær og fravær av Apo AI-M/Apo AI-M. Humant Apo AI isolert fra plasma, ble anvendt som kontroll (Sigma produkt nr. A 9284). Aktiveringen av det fibrinolytiske system ble målt ved hjelp av kromogene substrater. Disse substrater inneholder en kromofor gruppe av paranitroanilin som kan spaltes fra substratmolekylet ved virkningen av plasmin. Det frie p-NA har en intens gulfarge som lett kan følges ved 405 nm bølgelengde. Mengden av frigitt p-NA er direkte proporsjonal med mengden av dannet, enzymatisk aktivitet. Alle målingene ble erholdt under anvendelse av "THERMOmax" mikroplateleser regulert av "SOFTmax" program, versjon 2.01 fra Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA. ;Satser anvendt i disse studier, ble fremstilt rekombinant i henhold til eksempel 4. Rensing innbefattet ionebyt-ting, hydrofob interaksjon og gelfiltreringskromatografier etterfulgt av ultrafiltrering og frysetørking - alle konvensjonelle, biokjemiske metoder. Alle de undersøkte satser inneholdt >90% av dimer form, som indikert ved reversfase-HPLC. Konsentrasjonen ble bestemt under anvendelse av Kabl Pharmacia apolipoprotein AI RIA 100-utprøvning. Tre preparater, A, B og C, ble undersøkt. ;Eksempel 8 ;Autoaktlverina av plasminooen i nærvær av Apo AI- M/ Apo AI- M oa Apo AI ;Glu-plasminogen (94 ug/ml sluttkonsentrasjon) ble inkubert i 3 timer ved 37<*>C i 0,1 mol/liter Tris-buffer, pH 7,6. Plasmindannelse ble fulgt med det S-2251 kromogene substrat (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA) erholdt fra Chromogenix AB, Molndal, Sverige. Det ble anvendt til 0,6 mmol/liter sluttkonsentrasjon. Plasminogener tilført i disse bestemmelser, ble erholdt fra Chromogenix AB eller fra IMCO Inc., Stockholm, Sverige.

Satser av Apo AI-M/Apo AI-M (sluttkonsentrasjon 3,9-75 ug/ml) ble testet i denne bestemmelse, og mengde dannet plasmin i deres nærvær ble sammenlignet med plasminmengden dannet i nærvær av Apo AI (125 ug/ral sluttkonsentrasjon) og med plasminmengden dannet i fravær av enhver tilsetning (kontroll) (tabell 4).

Det ble overraskende funnet at Apo AI-M/Apo AI-M kan øke plasminogenaktiveringen i fravær av enhver plasminogenak-tivator. Plasma-avledet Apo AI påvirket på ingen måte plas-minogenmolekylet.

Den observerte aktivitet kan tilskrives Apo AI-M/Apo AI-M. På basis av disse data kan det imidlertid ikke utelukkes at Apo AI-M/Apo AI-M var forurenset av noen proteolytiske enzym(er) som kunne aktivere plasminogen. Forsøk ble utført for å utelukke denne mulighet.

Alle Apo AI-M/Apo Al-M-preparater anvendt i fibrinolytiske bestemmelser, ble testet med kromogene substrater S-2251 (H-D-val-L-Leu-L-Lys-pNA), følsomme overfor plasminlign-ende aktivitet og S-2288 (H-D-lle-Pro-Arg-pNA), følsomme overfor Arg-spesifikke proteaser. Substratene ble erholdt fra Chromogenix AB. Sluttkonsentrasjonen av Apo AI-M/Apo AI-M i bestemmelsene var identisk med den som ble anvendt i de f ibrinolytiske bestemmelser og kunne således variere mellom forskjellige satser.

Utprøvning: 25 ul Apo AI-M/Apo AI-M, sluttkonsentrasjon 60-70 rø/ml

150 ul 0,1 mol/liter Tris-buffer, pH 7,8

50 pl S-2251, 0,6 mmol/liter

eller S-2228, 1,0 mmol/liter

Prøve inneholdende bare buffer og substrat, ble anvendt som kontroll for ikke-spesifikk substrathydrolyse. Alle prøver ble bestemt in duplo. Mikrotiterplatene ble inkubert ved 37"C, og absorbans ble avlest med times intervaller.

I en annen forsøksserie ble Apo AI-M/Apo AI-M behandlet med en Irreversibel inhibitor av serinproteaser - diiso-propylfluorfosfat, DFP (Sigma produkt nr. D 0789). Sluttkonsentrasjon av Apo AI-M/Apo AI-M i 0,2 mol/liter KHC03-, pH 7,6, buffer var tilnærmet 75 ug/ml. DFP, 123 mmol/liter sluttkonsentrasjon, ble tilsatt til denne løsning. Etter 4 timer ble inkuberingsprøven dialysert over natten mot to forand-ringer av karbonatbuffer.

Aktivitetsbestemmelse under anvendelse av de samme betingelser som beskrevet tidligere, ble utført på DFP-behandlet Apo AI-M/Apo AI-M og på ubehandlet Apo AI-M/Apo AI-M. Etter en tre-timers inkubering med plasminogen og S-2251 var OD ved 405 nm 0,209 for prøver inneholdende DFP-behandlet Apo AI-M/Apo AI-M, 0,234 for prøver inneholdende ubehandlet Apo AI-M/Apo AI-M og 0,030 for prøver med bare plasminogen.

Det kan således konkluderes med at den observerte, plasminogenaktiverende effekt er direkte forbundet med nærvær av Apo AI-M/Apo AI-M og skyldes ikke noen potensielle, proteolytiske forurensninger.

Eksempel 9

Effekt av Apo AI- M/ Apo AI- M på aktivering av plasminogen med plasminoaenaktivatorer t- PA oa uPA

Urokinase (uPA) og vevsplasminogenaktivator (t-PA) omdanner begge plasminogen til plasmin ved proteolytisk spaltning av en enkelt peptidbinding Arg 560-Val 561 i plasminogen-molekylet. Mens tokjedet urokinase kan aktivere plasminogen direkte, krever t-PA nærvær av fibrin for sin optimale aktivering av plasminogen. Nærvær av katalytiske mengder fibrin,

som sammen med t-PA og plasminogen danner et ternært kompleks, vil øke den enzymatiske virkningsgrad av t-PA tilnærmet 600 ganger.

Aktiveringen av plasminogen med t-PA ble studert

under anvendelse av kommersielt tilgjengelig sett "Spectrolyse" (fibrin) t-PA/PAI fra Biopool AB, Umeå, Sverige.

I denne utprøvning ble plasminogen inkubert med t-PA

i nærvær av kromogent substrat D-But-CHT-Lys-pNA og desAA-fibrinogen (fibrinmonomer) som virker som en aktiverings-stimulator. Dannet plasmin spalter substrat og frigir fritt pNA.

Apo AI-M/Apo AI-M ble tilsatt til dette system og sammenlignet med Apo AI-preparat fra Sigma. Effekten av begge apolipoproteiner ble testet i systemet både i nærvær og i fravær av fibrin.

Eksempel på utprøvningssystem:

25 pl "Spectrolyse"-buffer

25 pl Apo-preparat eller buffer

20 pl t-PA (= 1,7 IU/ml sluttkonsentrasjon)

150 pl "Spectrolyse" PAR-reagens (= blanding av plasminogen og substrat)

10 pl Desa fib (= fibrinmonomer) eller 10 pl buffer

Prøver ble inkubert på mikrotiterplate ved 37"C i 3 timer.

En signifikant stimulering av plasminogenaktivering ble observert med Apo AI-M/Apo AI-M, både i nærvar og i fravær av fibrin. Apo AI stimulerte aktivering i en mindre grad i nærvær av fibrin. I fravær av fibrin var stimuleringen av Apo AI-M/Apo AI-M meget uttalt sammenlignet med den meget lille stimulering av Apo AI.

Apo AI-M/Apo AI-M hadde også en signifikant, potensierende effekt når plasminogen ble aktivert med uPA. Urokinase anvendt i disse bestemmelser, var et høymolekylært preparat erholdt fra Calbiochem. Urokinase {2,5 iu/ml sluttkonsentrasjon) ble blandet med plasminogen (94 ug/ml sluttkonsentrasjon) og kromogent substrat S-2251 (0,6 mmol/liter sluttkonsentrasjon). Til denne prøve ble det tilsatt Apo AI-M/Apo AI-M til 75 eller 62 ug/ml sluttkonsentrasjon. Reaksjonen ble utført i 0,1 mol/liter Tris-buffer, pH 7,6.

I likhet med t-PA ble en kraftig stimulering av plas-mindannelsen av urokinase observert når Apo AI-M/Apo AI-M ble tilsatt til utprøvningen (tabell 7).

Denne potensierende effekt på fibrinolyse vedvarte også når Apo AI-M/Apo AI-M ble fremstilt i farmasøytisk preparat sammen med en bærer. Som en potensiell bærer ble liposomer 'bestående av fosfatidylcholin, PC, (12 mg/ml) anvendt. Konsentrasjon av Apo AI-M/Apo AI-M (sats C) i liposomer var 3,6 mg/ml.

Aktivering av plasminogen (94 ug/ml sluttkonsentrasjon) med uPA (2,5 IU/ml sluttkonsentrasjon) ble testet i nærvær av Apo AI-M/Apo AI-M-fylte liposomer og sammenlignet med aktivering utført i nærvær av proteinfrie liposomer. Prøvene ble inkubert i 4 timer ved 37"C med S-2251, og plasmindannelse fulgte kontinuerlig.

Nærvær av liposomer alene stimulerte plasminogenaktivering tilnærmet to ganger. Tilsetning av Apo AI-M/Apo AI-M til liposomer økte denne effekt fem ganger - i sammenligning med prøve inneholdende bare urokinaseaktivator.

Eksempel 10

Effekt av Apo AI- M/ åpo AI- M på omdannelse av enkeltkjedet urokinase til tokledet urokinase

Enkeltkjedet urokinase (scuPA) er en forløper for tokjedet urokinase (uPA). I motsetning til uPA har scuPA bare meget lav amidolytisk aktivitet mot små, syntetiske substrater. Den amidolytiske aktivitet er maksimalt 0,4% av aktiviteten av uPA. Til tross for å være et proenzym har imidlertid scuPA evnen til å aktivere plasminogen til plasmin. I blandingene av plasminogen og scuPA er en sekvens på tre reaksjoner blitt foreslått å være involvert i aktiveringen av plasminogen til plasmin:

Sekvensen av reaksjoner som førte til omdannelsen av scuPA til uPA i nærvær av plasminogen, ble studert. Urokinase-aktivitet ble påvist ved hjelp av det urokinasespesifikke. kromogene substrat S-2444 (pyro-Glu-Gly-Arg-pNA, Chromogenix AB). Satser av Apo AI-M/Apo AI-M og Apo AI ble tilsatt til systemet, og graden av dannet uPA-aktivitet ble sammenlignet med aktiviteten erholdt i prøvene uten apolipoproteintilset-ning. Den enkeltkjedede urokinase som ble anvendt i disse ut-prøvninger, var et rekombinant produkt erholdt fra Grunenthal GmbH, Aachen, Tyskland (produksjonsnr. 0088808).

25 pl Apo eller buffer

75 pl 0,05 mol/liter Tris, pH 7,6, innehold-

ende 0,1 mol/liter NaCl og 0,02% "Tween" 80.

25 pl scuPA, 454 pmol/liter sluttkonsentrasjon

50 pl S-2444, 1 mmol/liter sluttkonsentrasjon

25 pl plasminogen, 52,1 nmol/liter sluttkonsentrasjon

Prøvene ble inkubert ved 37"C i 90 minutter. Økningen i optisk densitet som måler mengden av dannet uPA, ble nedtegnet kontinuerlig i løpet av de siste 30 minutter av inkuber-ingen.

Omdannelse av scuPA til uPA i nærvær av plasminogen ble stimulert av Apo AI-M/Apo AI-M, mens Apo AI isolert fra plasma, ikke hadde noen signifikant effekt i dette system.

De observerte effekter av Apo AI-M/Apo AI-M på de fibrinolytiske utprøvninger anvendt i disse studier, ble økt sammenlignet med effektene som ses med Apo Al isolert fra plasma. Apo AI-M/Apo AI-M har en kraftig kapasitet til å sti-mulere den fibrinolytiske aktivitet som er overlegen i forhold til Apo AI. Det er sannsynlig at denne forøkte effekt av Apo AI-M/Apo AI-M overfor Apo Al også vil bli funnet ln vivo.

Claims (14)

1. Dimerpreparat, karakterisert ved at det omfatter Apolipoprotein-AI-Milano, heretter kalt Apo-AI-M, med en renhet på minst 90 %.

2. Dimerpreparat, karakterisert ved at det omfatter Apolipoprotein -AI-Milano ifølge krav 1, med en renhet på minst 98%.

3. Dimerpreparat, karakterisert ved at det omfatter Apolipoprotein -AI-Milano ifølge krav 1, som er blitt avledet fra plasma.

4 . Dimerpreparat, karakterisert ved at det omfatter Apolipoprotein -AI-Milano ifølge krav 1, som er blitt fremstilt rekombinant.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter dimeren ifølge krav 1 sammen med en bærer.

6. Farmakologisk preparat, karakteriserisert ved at det omfatter den rensede dimer ifølge krav 1 sammen med en eller flere av de følgende forbindelser; liposomer, et stabiliseringsmiddel, lipidsenkende middel, lipidstabiliserende midler, eller fosfolipider eventuelt med en bærer.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av dimeren ifølge krav 1, karakterisert veda) fremstilling av Apolipoprotein AI-Milano ved rekombinant teknologi som intracellulært fusjonsprotein i E. coli, avspaltning av Apolipoprotein AI-Milano med maursyre og deretter omdannelse av enhver tilstedeværende monomer til dimeren, eller b) fremstilling av Apolipoprotein AI-Milano ved rekombinant teknologi hvori Apolipoprotein AI-Milano, monomer og dimer utskilles i det bakterielle kulturmedium i et ekspres-jonssystem i E. coli og at enhver tilstedeværende monomer deretter omdannes tii dimeren, eller c) oppsamling av plasma fra Apolipoprotein AI-Milano-bærere, isolering av HDL-apolipoproteiner og separering av dimeren ved anvendelse av kromatografi i flere trinn, eller d) oppsamling av plasma fra Apolipoprotein AI-Milano-bærere, rensing av monomeren og deretter omdannelse til dimeren og rensing av dimeren til en hovedsakelig ren form.

8. Anvendelse av dimeren ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament omfattende dimeren for behandling av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer.

9. Anvendelse av dimeren ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament omfattende dimeren, som virker som et prolegemiddel for monomeren, for behandling av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer.

10. Anvendelse ifølge krav 8 eller 9 for forhindring og behandling av kardiosirkulerende hovedlidelser slik som myokardialt infarkt, ustabil angina, akutte, perifere, vaskulære okklusjoner og restenose etter koronar angioplasti.

11. Anvendelse ifølge krav 8 eller 9 for behandling av kroniske, arterielle tilstander.

12. Anvendelse ifølge krav 8 eller 9 for forhindring og behandling av trombose.

13 . Anvendelse ifølge krav 12 for stimulering av fibrinolyse.

14. Anvendelse ifølge krav 8 eller 9 hvori medikamentet også inneholder lipidnedsettende midler.