BG98036A

BG98036A - Димер на молекулен вариант на аполипопротеин и метод за получаването му

Info

Publication number: BG98036A
Application number: BG98036A
Authority: BG
Inventors: Cesare Cirtori; Guido Franceschini; Lars Abrahmsen; Erik Holmgren; Mats Lake; Bjoern Nilsson; Joanna Chmielewska; Peter Lind
Original assignee: Esperion Therapeutics Inc.
Priority date: 1991-12-13
Filing date: 1993-08-11
Publication date: 1994-05-27
Also published as: MX9207224A; EE03058B1; AU3175593A; DE69233092T2; FI115771B; SE9103701D0; NO315076B1; ZA928989B; HU9302344D0; SK86893A3; HU217203B; WO1993012143A1; NO932866D0; BR9205640A; CA2103996C; PL172544B1; SG47453A1; AU703283B2; RO115636B1; US5876968A

Abstract

1. Димер на аполипопротеин АI-Milano.18 претенции

Description

I · · «·

Μ· *_;u.i‘ .Л ·. «d-ThU ..4iX\ U'iii x HA АЛилйниШЧЯЖ!

; Вд *5/ч titbit/ ‘ιΑ.λΑ*ίώίϋ ,,3 ; изобретението се отнася да проктячести чист дкмер из ааслипопротеин А1-иилино (Арс Ах-и/ Аре Ах--) и до /арздезтлчен състав съдърлак този дннер. То съдо тако се отнася де дзтод за получаването чрез рекогдбииаитаа техника, калта и чрез изолиране от ллезма. драда тът аоме да се използва за лечение на атеросклероза и жрдисваскулзрнл зеболявания и като -орадллрезка със заОавско дежззне на А ре Ах--.

иа база епидемиологични и προ^ъл^ятелпл изследвания, иногокретне е бела нотвьрдене връзката иемду повишените нива на серушшя жлестеосболяваипя (С1Ц). „ри това.

роя и развиваното на коронарни сърдечни определянето на комплексни механизми на холеетеролен транспорт в д;юз лаоа, позволи откровеното на протеини кря ощхгдшше на риска от коридорно сърдечно заеоддва-ю.

тактически има четири грзвни дикрулнроди диропротешшг .ллаьшкроцд (С-), с много плътност (Vx,U), с жлко плътност (^U) и с голяма плътност (яд!) липопротеини. жкато 0- представляват краткотраен предат на чревната мастна абезрбоя, то липопротеишт с илогс • · • · ·· ···· :с8<05>£*юй’л за холес* · · · · · • · · · · · ниска плътност и особено тези с ниско ’йлйиост • * · • · · ··· ·· тсролното предвижване в тъкахте» включително например в артериалните стени· разлика от тях» ляпопротеините с висока плътност са свърза на директно с отстраняването на холестерола от периферните тъкани» ката го връщат обратно тш в черния дроб илп ж други липопротеини» чрез шханизж известен като '’реверсивен холестсролен транспорт* (BCTJ Задтната” роля ва липопрстеините с вксока плътност е потвърдена от лногобрснни изследвания ( например /1/ и /2/)· Нрп тези проучва лия» пи вишните нива на липопротеини с ниска плътност» и в по-далда степен тези с много ниска плътност» изглежда че са свързани о увеличен кардиоваскуларен риск» до да то високи нива на липопротеини с високс плътност изглежда да притежават кардиоваскуларна защитна функция. Защитната роля на лииопротеините с висока плътност е силно подкрепена от изследвания на живо» като е показано че иафузия от липопротеини с висока плътност в зайци може да възпрепятства образуването на предизвикани от холестерол артериални поражения /5/ и/или да ги надали /4/.

β последно време интересът при изследването на защитния,жехани зъи или на защитните механизми на липопротеините с висока плътност е фокусерав върху анолипопротеин АХ (Аро АХ)» главния компонент на липоиротеините е висока плътност. Зисоки нива в плазмата на Аро АХ са свъ; зани с нададен риск ой коронарно сърдечно заболяване и наличие на коронарни увреждания /5/.

плазменият Apo А1 е една единствена полипептидна верига съдържаща 243 аминокиселини» чиято първична последователност е известна /б/. Аро АХ е синтезиран като 267 ашшокиоелинен източник з клетката, цре-про-апелипотротеинът co получава чрез JM-торшнално отцепване първо вътрешноклетъчно кадете се загубват It аминокиселини и след тева чрез по-нататъшно отцепване на б аминокиселини в плазмата или в лимбите» благодарение на активността на олеци«ични протеаза.

Смята се, че главното структурно изискване кж Аро АХ молекулаτα е присъствието на повтарящ:? се еднйрцй· отшчш: :ίέ: аЗнекиселини, • · · ··· · · · предполагащи се чо съществуват в амуняатичва холйковидна” (спираловидна) конбормация /7/. Тази структура дава въ&югност за главните бис логични активности на Аро Ах» т.е. свързващата ллпидите и лецитин холестерол аш трапсферазна активност (хСЛТ).

..pyro наскоро описано сводетво на Apo А1 е антивирусната цу активност. Това е докладвано благодарение на ^пин влтро” изследвания и сс проявява кактоущамовс на лервесния вирус Д/» така и срещу човешки идунодЕФицптен вирус» HXV» Д/. Тази активност изглеада се проявява чрез взаимодействие меаду амфшштните спираловиден части на Аро АХ и обвиващите вирусите глюкопротеини.

:1зследвания ”ин витро” показват че комплекси на Аро Ах и лецитин могат да предизвикат изтичане на свободен холестерол от културални артериални гладкоьускулпи клетки Ди/. άο този механизъм липопротеи1Ш с висока плътност могат също така да намалят пролиферирането на тезл клетки ДХ/, напоследък» вкарването чрез инфузия на Аро АХ или на липоароте ин? с висока плътност в оиятда хивотаи показва, че се получават значителни биологични изменения» както и намаляване степента и сериознос· та на атеросклеротични, увреждания, След първоначалните доклада на ύοциеко и ώβο /12/, едимън и съавтори /3/ и /4/ откриха» че те могат значително да намалят степента на атеросклеротични увреждания (-45 %) и съдържанието им на хорестеролон естер (-5L.5 %) в зайци хранени с / холестерол» при ин&узиране на линопретеин с зисока плътност (сН.ОбЗ · х.325 г/мг). Те също така откриха» че при преливане (инфузия) на лижшротеин с висока плътност,се постига близко до 50 i’U-но намаляване а установени увредения·

Зъзшшю бе също така да се показа /13/» че инфувии на липопротешш с висока, плътност могат значителни да променят липопротеиновия състав в плазмата на Затанайб зайци о онаследене хилерхслестеролемия» която развява.ранни артериални увреждала, П|я ·№<·. 4W^SW ⁸ ядаопро• · · · · · ··· тсани с висока плътност нсгат псвечо от да’ удвоят съотношението между защитните динапротеини с висока плътност и аторогенните липопротеини о ниска плътност.

Способността на липопротениите с висока плътност да предотвратяват артериални забелязания в животински подали е по-нататък стимулирани от наблюдението, че Аро АХ може да прояви фибринолитична активност ^яин витро /14/. Ронебергер /15/ демонстрира че екстракти Аро А1 може да увеличи фибринолизата в кучета-зайчари и в /иномологични шймуни. Подобна активност може да се отбележи ”ин витро® върху човешка плазма. Този автор е имал възможността да потвърди намаляването на отлагането на липиди и образуването на артериални плаки в животни третирани с Аро АХ.

Аполипопротеин АХ-иилзно (Аро А1-<) е първия описан молекулен вариант на човешки Аро А1 /16/. Тел се характеризира чрез заместването на Apr 173 с Цис /17/. шутентнинт апопротеин се предава като аутосоаален дошнантеи белег като са идентифицирани 8 генерации от носители /1<. /.

Статусът на индивида носител на Аро AX-fe се характеризира със значително понижаване на нивото на липопротеини с висока плътност· При все това, засегнатите субекти очевидно не показват повишен риск по отношение яа артериално заболяване{ наистина, при изследване на генеалогичното родословие изглежда, че тези субекти могат да бъдат защитени” от атеросклероза.

Механизъмът на възможния защитен е/ект на Аро АХ-W в носителя изглежда да е свързан с модификация на структурата на мутантния апсл.шопретеин, със загубата на една алфа-спирала и увеличена експозиция на хидрофобните остатъци /19/. Загубата на плътната стегната структура на многобройните алфа-спирали вода до псвишена гъвкавост на молекулата, което вода до по-лесно свързване с липиди в сравнение с • · нормалния Ai* Нещо повече, апол№опройин^лиаид л^мпелксите са по ··· ··· · · ,, , , _{е β}· чувствителни към денатуриране, с което навеждат на мисълта, че в случая на мутант, разнасянето на липиди е овце подобрено*

Лечебното използване на аполипопротеин Аро АМ «утаят е понастоядад ограничено поради липса еа метод даващ възможност за получаване на тези аполипопротеини в достатъчно количество и в подходяща Форма.

друга много специфична характеристика на Аро Ai-й е способността \

ау да образува дашри със самия себе си и комплекси е Аро All, и в двата случая поради наличието на Цис остатък* Лт изследвания на кръвни Фракции съдържащи смес от аполипопротеини, ида индикации, които показват, че присъствието на димери и комплекси в кръвообращението ложе да баде причина за увеличения елиминиращ полу-живот на същите в носителите, което напоследък е описано при клинични изследвания /20/.

Аро А1-й димери (Аро AMi/Apo Al-действат като инхибиращи фактори при интерконвероията на липопротеини с висока плътност *ин витро* /21/.

По-ранни изследвания на смеси съдържащи димера са били на основа на Аро АМ>, отделен от естествено кръв на хора, с Аро АМ, поради което е могъл да бъде получен само в малки количества.

Голямо е затруднението при получаването на Apo А1 и по-специално на Аро АМ при фракциониране аа плазма./22/. Изолирането и производството не може да бъде голяномащабно, тъй като са /достъпни само малки количества от суровината* Нещо повече, съществуват няколко риска свързани с продуктите при дакционирането на плазмата, като например заразяването №. От съществено значение е тези рискове да се избегнат.

Правени са опити за получаване на човешки Аро А1 чрез рекомбинантна ДНК технология. В /23/ е описано получаването на Аро AI от Е. coll, методът описва хинерен полипептид при който Аро А1 частта е кондензирана към Н-терминални аминокиселини» остатъци на бета-галактозадаза или към един или повече loG-свързващи домена на протеин А, .

или към про-последователиостта аа човешки Арр ··· · · * ·· · · · · . ·

Експресията на Аро АХ и Ара АХ-й в даиове на дрожди и използване на получените компоненти при лечението не атеросклероза и кардиоваоку ларни заболявания е описано в /24/. Гените кодиращи Аро АХ и Аро AI-M иаат ДЕК последователности кодираща секреция позната за дрождите и щхщесиращи сигнали свързани в горната част към гена за зрялите про теишь Използвана е шдиуицирана й₽-алфа-1-зодеща последователност в която последните остатъци са HieOXySerLeuAspLyeArg.

Сега, изненадващо бе открито, че пречистения димер Аро АХ-й/Аро Al-й има удължен плазмен полуживот в сравнение е мономере Аро АХ-М. Освен това, той има значително подобрено фибринолизно стимулиращо качество в сравнение с нормалния Аро АХ, например притежава способността директно да активира шшзшшоген (нещо което нормалния Аро А| не притежава), наблюдение което може да бъде биологически важно, а също така има способността да действа като про-лекарство за Аро A1-U.

Той образува също така образува реконституирани частички липопротеин с висока плътност (НДХ) с уникален размер, който не е намерен в частички рекомбинантни на липопротеин с висока чистота, съдържащи Аро-АХ-й или Аро АХ. _t

Настоящето изобретение се отнася до значително чисти димери от адолипопротеин АХ-^шшно, по-нататък наречен Аро АХ-»/Аро АХ-У, с чистота най-малко 90 Д, за предпочитане поне 98 %, които са за първи път изолирани и охарактеризирани от плазма и които също така са били произведени чрез рекомбинантни методи. Изобретението се отнася също така до фармацевтични състави съдържащи Аро АХ-Е/дро АХ-й, евентуално .заедно със стабилизиращо средство, например стабилизиращо липидно съединение като фосфолипид и/или носител.

Фармацевтичните състави могат също така да съдържат средство по шьавацо липидите и/или друго лекарство, известно при лечението на атеросклероза или кардиоваскуларни заболявания, като например хепарин, хеперинови фракции и хепаринови фрагм^.т^Цийй, йр©Ябтва: понижаващи лиш дите.

Аполипопротеин Аро АХ-М може да е© получи чрез

а) произвеждане ва аполипопротеик АХ-шилано чрез рекомбинантна техш логия като вътреаноклетъчен слят протеин в Е. coll , отцепване на аполипопротеин АХ-^илано с мравчена киселина и след това превръщане на всички налични моноади в дамери или

б) произвеждане на аполипопротеин АХ-Ьилаао чрез рекомбинантна техш легия при която Аполипопротеин Ai-иилано, мономер и дим©р₉ е прикрит ι бактериалната културална среда в експресивна система в Е. col' и след това всеки наличен мономер се привръща в димер

I и пречиставен на дамере до практически чиста форма.

Съгласно а),Аро А1-м се произвежда като слят (сплавен) протеин вътреаноклетъчао в бактерията. Сплавящият партньор представлява модифициран XpG свързващ домен от протеин А и има местоположение за отцеп· $1;

ване за мравчената киселина между сплавящия партньор и Аро А1-_м.. След лизирането на бактерията, сплавения протеин се пречиства върху имобилизиран XpG и се отцепва с мравчена киселина. Присъствието на Аро AX-i и на димера се показва чрез техниката на Вестерн на попиван© или върхф г _Ό гелна електрофореза.

В пример 3 е показано, ч© преработен Аро АХ-М може да се получи в рекомбинантна Е. coXi и се че образуват дамери. Използването на мравчена киселина обаче дава продукт съкратен с две аминокиселини в неговия ХХ-терминал. Това съкращение не се смята че променя активност* та на Аро АХ-й молекулата.

Системата съгласно б) е показана в пример 4 и при нея се образу ва цялостна и точна молекула.

Димерът на Аро AX-i съгласно претенциите мода също така да се получи

с) чрез събиране на плазма от носители на аполипопротеин АХ-йилано, изолиране не гЩЬ аполипопротеините, от:^зкнб^:на^;домейе^:чрез хроматографиране, например чрез Сефакрил хроматография в няколко етапа или

д) чрез събиране на плазма от носители на аполипопротеин А1-М, пречистване на мономера и след това превръщането му в дамер и пречистване на димера до практически чиста форма.

Важно е при разделяното в с) то да се извърши в няколко етапа и за предпочитане на дълга колона, като например 500 сантиметрова.

Ако има наличен мономер, той всякога трябва да ое превърне в домерна форма, както е показано в примерите по-долу.

Изобретението включва метода за лечение на атеросклероза и корда даокуларни заболявания и използването на димера за приготвянето на лекарствени средства. Димерът може също така да действа като про лека] ство на мономера при лечението на атеросклероза и кардиоваскуларни заболявания.

Лекарственото средство може да се използва за лечението на атеросклероза и кардиоваскуларни заболявания и за предпазване и лечение на главните болестни състояния на кръвообращението на сърцето като инфаркт на миокарда, непостоянна ангина, акутни периферни васкуларни оклузии и рестенози след коронарни ангиоиластии.

Когато оо лекуват хронични артериални състояния, сс лекуват както коронарните, така също и периферните артерии, които се характери зи· рит с оклузивни плаки· Но начало, доверите ще се използват за инфузш о цел да предизвикат отстраняване на мазнината от плаките или евентуално съвместно с установено лечение на атеросклероза и кардиоваскуларни заболявания, например при използването на хепарин, хепаринови фракции и хепар-лнови фрагменти и/или лекарствени средства намаляващи нивото на атерогенните липопротеини в кръвообращението.

Лекарственото средство съдържащо димере може да се използва профилактично и при лечението на тромбози при различни клинични условия й за стимулиране на фибринслизета.

- 9 в Apo AI-й дидара име въз висока |тс$е:*1 •^йЧви^а^йатни • · · · ♦ · ·· · · ·· ·· структури и се очаква даера да притежава противовирусен ефект.

Сага за първи път, при използването на настоящето изобретение, стана възможно произвеждането на димера в практически чиста форма, повече от 90 % и дори повече от 98 % и също така да се покаже, че този продукт има изненадващо по-добър ефект върху биологичните системи в сравнение с Apo AI, което е показано в нашите примери 7-10 по-долу.

Приложени са следните фигури:

На Фигури 1 и 2 е показано зависимостта на добива от % на протеиновата концентрация,пример 2 б)

Фигура 3 илюстрира кинетиката на образуване на Аро Αΐ-ί«/Αρο ίί-ώ в продължение на 24 часа, пример 1 62)

Фигура 4 илюстрира синтетично свързване, пример 3 а)

Фигура 5 илюстрира плазмид, пример 3 0) ч-игура 6 илюстрира Востерн анализ след отцепването на сплавения протеин, пример 3 д)

Фигура 7 илюстрира У В спектър на Аро ΑΙ-ι/Αρο Al-М, пример 5

Фигури 8-10 илюстрират вторични деривативни спектри, пример 5

Фигура 11 илюстрира флуорисцентна спектроскопия, пример 5

Фигура 12 илюстрира СД спектроскопия, пример 5 ч-игура 13 илюстрира гНф! съдържащ Аро А1, Аро Al-М и Аро А1-щ/ Аро Ai-fel, пример 6.

ОПИТНА ЧАСТ

ДРЛМШ? 1 Изолиране на дикер от плазма

а) Получавана на аполипопротеини

Кръвни проби се събират и закрепят върху Tiag-BATK (1 мг/мл) от различни носители на аполипопротеин Аро AI-U и плазмата се получава при центрофугиране при ниски обороти при 4°С. Плазмените липопротеини с висока плътност (1Щ, cl » 1.063 - 1.21 г/ьш) се изолират чрез по- ίο следващо ултрацентрофугиране (Havel 4j.j гф4_:£й»,. i>?egd®n jii. Th© ··· ··· ·· ·· ·· t· distribution and chemical composition of ultrecentrifugally separated lipoproteins in human sari®· J·Clin. Invest» 1955» 34: 1345 - 1354) в ^екканова X.5-50B ултрацентрофуга, снабдена c 50.2 Т« ротор. След 4S часа ултрацентрофугиране при 40 000 оборота в минута при 4° С, горната фракция съдържаща НДК се разрежда е съотношение 1:1 о 0.15 « натриев хлорид, с 0.01 % двунатриева сол на етилекдиаминтетраоцетната киселина (Nag-WK), с разтвор на калиег бромид (pH 7.4, Ц а 1.21 г/мл) и отново се центрофугира при 40 000 об/ шш при 4°С в продължение на 48 часа. Липопротеините с висока плътност (НД1) се даализират изчерпателно срещу 5 Ш NH^HCOj, 0.01 % fUgiMCi pH 7.4, лиофилизират се и се освобождават от липидате с даетмлетер/ етилов алкохол (3:1 обем/обен). Концентрацията на протеините се и»дерва било чрез анализ на аминокиселините или по метода на Лоури и съавтори (Lowry OH, liosenbrough KJ, Parr AL. Randall RJ.Protein aeaeux ment with the Polia phenol reagent. J.Biol. Chea. 1951 j 193» 265-275).

б) Изолиране на Apo Αΐ-Φ/Αρο Al-L

За изолирането на Apo А1-ш/Аро Al-й, lUL.зпслипопротеините от пример 1 а) се разтварят в 0.1 й трис-НС1, 0.04 % 0.01 % л * *

JMaNj, pH 7.4, съдържащ 6 й гуанидин НС1 (Gda-Htl). Аполипопротеините се нанасят върху Сефакрил 5-300 Hi колона (2.6 х 300 см) еквллибрирана с 0.1 М трио-HCi, 0.04 % Hag-MTK, O.ul % NaHj, ρΗ 7.4, съдържащ 4 й гуанидин хидрохлорид. Аполипопротениите се елуират със същия буфер, със скорост на протичане 1.5 мл/мин като се събират фракции от по 10 мл. Събраните фракции съдържащи Аро Ах—ί./Αρο Ах-... сс концентрират под вакуум и се нанасят на същата колона.

Фракциите съдържащи чистия Аро А1-й/Аро Al-й се събират, даализират се срещу 5 ш Ш^НСОр 0.01 % Hag-SATK, pH 7.4, лиофилизират се и се съхраняват при -20° С а 0.1 й трис-НСх, 0.04 % H^KATK, 0.01 % rlaMp pH 7.4, съдържащ 3 ώ гуанидин хидрохлорид. Чистотата на Аро А1«й./Аро ΑΙ-й е над 98 %, както това се установява чрев високоефектив изключваща размерите хроматография (НЙЕС^ и Ь^тшйшдадамид гелна • · · ··· ·· · · ·· ·· електрофореза (1д5- PAGE) при не-редуцираци условия.

. По този метод ое изолира чист димер на Аро А1-&; от плазма на носители.

A&iJEP 2 Пречистване на мономера от плазма и превръщането му след това в димер

а) Пречистване на Apo А1-И

За пречистването на Аро А1-,> мономера, НД1 липопротеините от при· мер 1 а) се разтварят в 0.1 й трис-KCl, 0.04 % Ш^ЕДТК, 0.01 % llailj, pH 7.4, съдържащ 6 U гуанидин монохидрохлорид и 1 % 2-юеркаптоетанол. След 4 часа инКубиране при 37° С, редуцираните апо-НДЬ с© нанасят върху Сефакрил 5-200 колана (2.6 х 150 см) еквилибрирана с 0.x ю трио-HCl, 0.04 % llag-EOT, 0.01 % Г1аГЦ, pH 7.4, съдържащ 4 ι.. гуанидин монохадрохлорид и 0.1 % 2-меркаптоетанол. Анолипопротеините се елуират със същия буфер при ниски скорост на протичане от около 1.0 мл/мин. Събират се фракции от по 5 мл. Събраните фракции отговарящи на apo Al t аро ΑΙ-k се даалияират срещу 5 мУ НН^НСОр 0.01 % Па₂-ЕДТК, pH 7.4 и се лиофилиаират. Аполипопрстеините се разтварят в 0.1 М трис-HCl, 0.04 % 1Ча₂-щДТК, 0.01 % riaiij, pH 7.4, съдържащ 6 « гуанидин хидрохлорид и 1 % 2-меркаптсетанол. След 4 часа инкубирене при 25° С 2-меркаптоетанолът се отстранява чрез Сефадекс $ 25 хроматографиране и аполипопрстеините веднага се нанасят върху Трипропил-Серароз колона (1 х 10 см) еквилибрирана с 1.1 У трио-ИС1, 0.04 % Mag-EOT, 0.01 % MaMp рй 7.4, съдържащ 4 м гуанидин хидрохлорид. След рециклиране в продължение на една нощ при ниска скорост на протичане (0.15 мл/мин), нормалния Аро А1 се елуира с 0.1 й трис-aCl, 0.04 % На₂-ЕДТК, 0.01 % llalij, рй 7.4, съдържащ 4 М гуанидин монохидрохлорид. След това апо-Ах-м ое елуира със същия буфер съдържащ 4 .. гуанидин хидрохлорид и 1 % 2-меркаптоетанол. Фракциите съдържащи Аро Al-й се събират, диализират се срещу 5 им HH^HCOj, 0.01 % Па₂ЕДТК, pH ?,4, лиофилизират ое и се сйракявй яр£г20Я 0<в 0,1 « град ··· ··· ·· ·· ·· · *

НС1, 0.04 % Ш^-ЕДТК, 0.01 % jSiaHj_t pH 7.4, съдържащ 3 & гуанидахидрохлорид и 0,1 % 2-мсркаптоетанол. Чистотата на Аро Αΐ-й е над 98 /, както това co установява чрез НР^ЕС,..Д>РАСЕ и изоелектрично уокуоиран®.

б) Аро А1-У/Аро А1-.·.·. синтеза

Разтворима Apo Ai-щ се диализират срещу 25 шд трис-HCI буфер, pH 9.0. Редуцираният Аро Al-м се разрежда до желаната крайна концентрация (3.6 - 53.6 икУ) с 25 мМ трис-HCl буфер съдържащ редуциран глутатион (6) И) (1-4 мМ) и дреинкубиран при 25° С 5 минути. Окисляването се инициира чрез прибавяне на окислен глутатион (S^G) (0.1 10.0 м1А) и поставен в плътно затворени епруветки при овцата температура в продължение на 24 часа, окислението се отчита чрез 5Дь -PASS (вж по-горе). След наноянето и отнемането на петната, гола се сканира с Ш Ултроонан ХХлазарен плътнометер и процентното разпределение на отделните/протеинови линии се изчисляват с Ш 2400 Гелскан XL софтуер. Кинетиката на окисление се отчита чрез НР5ЕС.

С оглед оптимизиране на оинтезата на дашериото допълнително окисление, провеждат се експерименти в присъствието на G0E/G&5G- + гуанидин менохидрохлорид + тиоредуксин(Piglet VP et al., Proc.

Katl. Acad. ScbUSA 19Вб> 83i 7643 - 7647).

Окислението на Apo Al-»., се извършва в затворени епруветки, в присъствието на различни концентрации редуциран/окислен глутатион

Добивът на димер при реакцията зависи както от концентрацията на протеина (фигура 1, таблица 1), така и otgsii/gssg концентрация/своеиевение (фигура 2, таблица 1). Нрл увеличаване концентрацията не протеина от 8.9 мк.·.· на 53.6 hkL, процента на Аро А1-М/Аро АхД се увеличава с 26 % - 51. % (Фигура 1, таблица 1). Намаляването hsgsh/ gssg соларното съотношение от 1/2 на 1/16 води до 43 %-но редуци*райе на добива. От друга страна увеличаването hqgsh/gsijG концен· — 13 — • ···· · · , •грацията. при постоянно моларно сьотноиение ·ί#φ*/4^8..:. ·* ое свързва • · · · · · ·· ·· φ ф φ ф q до 42 %-не увеличение на образуването на Апо Al-i«/Apo АХ—(фигура

2, таблица 1). Канта температурата при провеждането на реакцията, таке и присъствието на протеиновия денатурант (гуанидин моновдрохлорид) не повлияват степента на образуване на Аро Αϊ-2/Αρο АХ-й. Значително образуване на Ара АХ-2/Аро ΑΙ-ώ се постига чрез инкубиране на Аро АХ-2 (PSH/ossa ₃ присъствието на 0.2 тиоредуксин (таблица 1).

Кинетиката на окислителната реакция се проследява чрез аналитичен KPSiSC. Димерният и меномеран ало АХ-й дават отделни ликове с време на задъркане 1υ·8 и съответно 12.7 минути. Сиктезата на Al-2/Al-u ( ssh/ 3SSG 2мй/4 А1-»« концентрация 8.9 ιού) почти приключва след 5 часаа удължаване на иакубирането 24 чаиа не увеличава образуването на А1-УД1-2 (ф.шура 3).

Т А Б л Л ц A 1 .:.

окисляване на Аро А1-М

Протеин	GSH	GSSG	добив	забележка
мкМ		мй	%
	—.....- -...............-.......	.........—.....-.............................-.......	-.................-.......-.......	—..............-......—------------------------.....—.................-......-
з.е	1.0	0.1	34.8	тиоредоксин 0.2 нй
8.9	1.0	2.0	9.1
8.9	1.0	2.0	9.9	4°С
8.9	1.0	4.0	7.2
8.9	1.0	4.0	?.?	4°С
8.9	1.0	8.0	6.6
8.9	1.0	16.0	5.2
8.9	2.0	4.0	19.6
8.9	4.0	8.0	18.7
8.9	5.0	10.0	23.9
8.9	1.0	2.0	9.8	гуанмдия-хидрохлсрид 4М
17.9	2.0'	4.0	23,3
17.9	4.0	8.0	25.5
17.9	5.0	10.0	27,5
35.7	2.0	4.0	25.9
35.7	4.0	8.0	27.7
35.7	5.0	10.0	27.9
53.6	2.0	4.0	25.4
S3. 6	4.0	8.0	30.4
53.6	5.0	10.0	36.1
Условия на	реакцията:	Буфер: трио-НС! 25 ш:, pH 9.0 температура: 25° С времетраене: 24 часа

• · ·· ·· ······

ПРЖ.Е? 3 Рекомбинантно получаване на Ai-*i ·’ • · · ··· ··· ··· ··· ·· ·· ·· · ·

а) К нструкция на експресиращия вектор рДР644:

Репликативната форма на бактериофага й13мр18, съдържащ сДИК кодирането за Аполяпо протеин Ai-м (Sharp· C.R. et al_M Nuoleio Acid· ileseareh. Vol 12. Ko 9, p 3917. 1984 and Cheung K.C. et al·. Bloch··. Mophys.Acta 96C, pp 73-82, 1988) co разгражда c рестриктираш ензим BawHI и се пречиства чрез ниско желираща температура (1СТ) агарозна гелна електрофореза. 822 Ьр фрагдента, отговарящ на Аро Ai-К гена, се изрязват и се лигират към плазмид рфС9, предварително разграден с 8амН1 и третиран с фосфодиестераза от телешки вътрешности.

Датиращата смес се използва за трансформиране на компетентните Е. colt ц 4’83 и бяли колонии се отделят от агарови понички съдържащи /ишицилин, Х-гал и ЮТ. Плазмид-ДНК се приготвя и се пречиства върху QuiaGene колонии. (QuiaGene Inc. 9259 Etta cv·.. Chateworth.Cal.

91311 USA) съгласно указанията на производителя.

Полученият плазвд, де номиниран рЦС/Аро ΑΙ-М, се разгражда с Ecoil и Ticol. Част от разградената смес се анализира чрез агарозна електрофореза за да се потвърди правилната ориентация.

Друга аликвотно част се използва за лигиране на синтетичния лиакер Δ АроАХЕсо^!‘ (фигура 4) към 5«-края на Аро А1-& гена с оглед да се получи гена & άροϊιΐ, състоящ се от 724 Ьр. ЛАро AI-М последователността генерира А>р-Рго местоположение при N-терминала на кодирания протеин което улеснява отцепването чрез мравчена киселина. Компетентни L. соД □ .ТЗ се трансформират с лигиращата смес и получения плазмид (означен рцС/^Аро Al-fa) се изолира върху QuiaGen· колен:

както по-горе.

Плазвдът рЦСД Аро ΑΙ-te и експресиращия вектор pE.rZ- се разграждат с ЕсоК и BAall, пречистват се чрез 1СТ агарозна електрофореза и 799 Ьр фрагмента на р ЦС/д Аро Al-Е се лигирв към 2763 Ьр фраг мента на ρΒ?ζ· й ига «йонната смес се йпйзрг· М Щшоформира кон** · ♦ · · · · ··· потентния Е. coi; IV308 и плазмида се приготвя както по-горе.

За експерименталните методики виж _{3anbrook J<t} j*itech з.г. and Eaniatis Т. (1989) Eolecular Clonings; Л laboratory Manual, 2nd edit. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Π, Y.

Полученият плазмид се наименойа рКР644 (фигура 5).

б) Експресиране па-сплавен протеин £Ζ*α**Ρ° АМ мл от престояла една нощ еттура на К. col 5 М^г308/рКР644, израсла при 30° в LB с 50 мг/мл Аанамицин, се инокулира в 2 х 500 жл минимална среда А ( curr.Meth.in г₀1^^^ибавяие на 0.2 г/ж Еазаминови киселини, 1 м/ магнезиев сулфат, 0.25 % глюкоза и 50 мгДл Канамицин. Културата се янкубира при 37° в продължение на 24 часа при енер гично разклащане.

с) Първоначално пречистване на Аро АМ:

1.0 л от Е. coϋ култура (Ш08/рЖ44), съдържаща описания плаз щад, се цетрофугира и утаените клетки се суспендират отново в 30 мл 1 х Т.5 (25 м/ трие ПС1, 0.2 л натриев хлорид, 1 мМ ЕДТК) и 6 У гуанидан хадрехлорвд и се хомогенизират чрез еднократно пропускане през френска преса (_31й instrument® ша)^с Работно налягане 1000 фунт/инч². получената суспензия се инкубира при стайна температура и леко разклащане в продължение на 1 час и се центрофугира. Горната течност слс това се разрежда до крайна концентрация на гуанидин хидрохлорида 1 Ιί (т.е. шест пъти) и се зарежда върху колона 15 мл _Sepharose pastriow¹? еоилибрирана с 1 х Т> След зареждането, колоната се промива с 5 колонни обема 1 х Т$ последвано от 20 м.» амониев ацетат рМ 5.4 докато pH на елуата стане 5.4. Свързаният продукт се елуира с 25 мл 0.2 и оцетна киселина и абсорбанта се отчита при 280 ни (^a£8q)· Добивът от 1 л култура е 1.9 мг на базата на А^-стойността.

д) Отцепване на сплавения протеин жлуата се разделя иа равни части, лиофилизира се и се суспендира

- 1?

• · ·· » · ······ отново в 75 50 % и стлтветно 25 ^ка ‘правченачкиейлина· Разтвори• · · · · · · · · — ······ ·· · · ···· тз се инкубират при 57^и в продължение ка 28 часа след което се лиофи лизират за да се отстрани мравчената киселина, продуктите на отцепва нето оо анализират като се използва BLS-uas» последвано от Вестерн йхшлизи. Приблизително 5 кг общ протеин се зарежда върху sds-paob гел градаент 6 - 25 / при ие-редуциращи условия· Пробиете се правят в две повторения. Вджо тел се оцветява с создаде1<· а другият се използва за Вастеря анализ. Резултатите оа показони на фигура 6· · единият от продуктите на отцепваното кгагрира с пречистения природен Аро А1 и дева възможност за възникването на сигнал при Веетерн анализа. Вестерновият анализ си извършва при използването на лоликлоналим антитела коаюгираии с пероксидаза на арки (The Binding ait· Ltd; емн ь-ridg·· England) и. визуализиран при използването па стандартни методики.

Не фигура 6 са показани анализите ка получените протеини след разцепването не сплавения протеин. Панел Aj Gooaesele оцветен SOS -bags гел (8 - 25 %). йпица 1:25 / мравчена киселина» ивица 2:50 % мравчена киселина, ивица 3:75 % мравчена киселина, ивица Мпречистен природен Аро AI (Сит) и ивица 5: ил маркер (Фармация). Панел В: вестерн анализ на дублирания гол. Авицо 1: пречистен природен Аро AI (Ситна)! ивица 2: 75 % мравчена киселина, ивица 3: 50 % мравчена км* селина и ивица 4: 25 %-не мравчена киселина· Наличието пе лента на даенноте молекулно тегло на Аро А1-».· дра.восторловия анализ показва, че има наличие на димер на Аро А1-2.

HMulP 4 Получавано на Аро в биереактори

Конструкция не вектори за директно .отдаляне на Аро А1*й в пермплазштото пространство к растителна среда

..дьаве и вектори. <шкйлзваните д&аове аа accheriehia coll, К12 с.а НВ101 ?“· bed S20(rB*t ай) eupB44_t Ш31р1 F**, bed 320(гВ“, иВ“)» eupS44, ara14_t l*_t galK2, lacvt_t proA2, repL20, xyl-5, ntl-1, reeAtJ, Гд-, ^аз~» иаеТА(Ч·), асгЗ(-) (Воуез? et al._t 1969. J. Eol. Biol. 411 459* • · · ·

- 10 472) ♦ DH5a F, ?8ОВ1ао2Ш15, D(laoZYA4r^)’UUb;“r«ckj^ e»<Al, «У»А» 3 Г. tixi-1, hsdRl7,(j?_k-, m_kf), su₽B44, relAl, (BBL USA). TO08 DlacX74₍gal0P::IS2(gal0P308), atrA, I*· (L-aurer et al., 1980· J· Mol· Biol· 139: 147-161) u BC50 xyl-7, ara-14, T4-R, 1*· дашовете HB 101 и 5a се използват за субклоккране на ДНК фрагменти· Алазмидът ₽^ис9 (vieiro et al., 19 82. aim .19:250-68) сс използва за субкловиране на 821 , ..1 фрагмент на едно оДНК копие на човешки дро Ах, получен от С.Сидоли (шилено). Цуклеотидната последователност на човешки Apo А1 сДШС може дч се получи от Генбанк под опитен номер W.1G2. (Seilhaaaar et al., 1984.dna 3:309-31 Трозл вектор е означен рКР575. Също един фрагмент 856 Ьр co ll-Pat I от човешки Apo ΑΙ-М ДБК, сДШ( копие получено от С. Си допи), се субклонира в плазшдв р UC9. Това производно се означава i

рЕР57б. Плазмидите рКР683 и p!CP764 са производни на плазшдате рТгс 9: (лтаип et al·,1988.Gene. 69:301-15) и едно pUC производно с транспозон (Тп903) получен данвшцин резистентен маркер от рц С4-К (VI·!» et al., 1982. Sene. 19:259-268 u Oka et nl., 1981. J.Hol.Biol. 147: 217) и транскрибираните тершшатори (T1T2) от бантериофага , от рЦ££2, (Breesen st al·, 1987> Kuoleic Aeid. Bee. 15:10056).

Използвани методики. Бактериалните домове растат в среда на Лу* риа Бертани (1В) или дровдна триптонена среда (2 х УТ) с ашшцилми (Ар) 50 мкг/мл или канамицип (Км) 70 мкг/мл за получаването на плаз* нид ДНЯ и за малки експресивни анализи (nambrook et al., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Триптозен Кръвен arap Като 00Н0В8 (Дифко, САЩ), допълнен с Ар 50 шат/тдл или 73 мкгДш, се използва, за.растеж па клотки върху агарни папичкн. използва се рекомбинантна ЛШ Техника съгласно (Saeibrook et al., 1969. Cold spring Harbor

Laboratory press). Рестриктивне ендонухпеазс и Тй ДНК се получава от фирмена Бъорингер Банхайм (Германия), Боза Англия Бзолабсраторям (ьеверли, САЩ) юга от Фармация (Упсала, Швеция). Изопроппл«4Ь-^т'-гадоспв, ГХГ \жо предо ктс, vA. J’ee използва дактсзид (XPTG) ос получаж ща се игрова (до е те jo да ое

топя· желйреле на ΜΖ доогжнтп. 2С2 ,; жжлч^идата ос лрещстздят като .

сс дададова ,_и·..» sc реален цинлер и Tag доА пежшораза от лержж-иллер/ .дотус хдотрваентс (норвуон СМ).

Р.

илигснуклсотидни жлшри и примери се синтезират на дардацля-M3

Зее© Aoaeabler plus от оркацля (Упсала, ^веция) като сс използва ._;оори триостерния датед върху твърда _Ааза. опредалянстс на пуклеотад-юта последователност се извършва върху applied xioeyctea 3734 ^к sequencer , като co исиоизва Tuq pyeBeoxy^¹· Terminator Cycle

Sequencing Aid OS Applies Biosyetea (U:,>A).

използвани дан кошштернй програми, преградата на дохинтош плазшдажбт (вариант 1.2) (Миятех, СА·,) qg използва за шлюртаване ί аоМаа».

на плазми дните аорти и jcg Sequence Analysis software \Хсдатикс даьшютър Рруп, яж, .дадисън ./исконзън СА_М) сс използва за подавано на жда последователности на „лигптален VAX ковлютъри. конструкция, експресия и отделяне на Аре Ах-ш в вахтерин. целта на дактедоштс данструкцил е да се получа предуцираца секретзраца систеда за Аро ίά-ь в в. ooh с много високо ниво на Аро А1.·> секретиране в растителната среда.

Синтезирани са два слигонуклеотида за спояване на Аро Ах и Аро Ах-„. сДШС копия към дШ< ..рагданти кодиращи бактериални сигнална последователности. рагжнтът 14 Ьр Асо tx и neo X и фрагмента 40 op хЧсс 1 на рЖ75 ое за менят със синтетичен .доагдант 37 Ьр ьсо Ж1 ϊΰοο х в шдазмидв означен рАИШО. _;..ястсто но отцепване иег X в сивтетичния доШ .„рагмент дава същото отцепвана мяотс какте да·.·, х, което улеснява клонз ранете на различни ц-рагленти кодиращи бактериални сигнални последователности. Ализхадът рММН е конструиран щхз овдастване на Арогмсита 702 Ьр Мое х - га χΐχ на p;U575 (Аро ?и) с ..рагмента 702 ор аЧсо х - ‘-а Ш не р^57б (Лро АХ—:). От пдезмида рДР631 сдап 320 — iu.i cp 30.. X-Hind Ш vparmiiT oe • · · · ·· ····«· изолирИ и’Ь& Ьйй&ЬлЬи 1 и Mad * · · ···♦ ·* · · · -*♦*<** • •е ··· ·· ·« ·· ·· а-ι но шшзаидеп вектор колтс сс означава pXRS82. Този вектор съдьрно един * ас-пройотор (Р‘ ас), едно производно на една о-.рА сигнално последователност, два транскрибиращи тержпатора и един капамиции резистентен маркер. Един 1501 ор Мги X - Nf.. X фраг=кунт се изолира от рА?682 и се вмъква в по-малък вектор, като Вас е заместен от Вгс прешотор. Експресивният вектор е означен ρ»ύ?683· лШазмздът рЖС4 се конструира чрез заместване на 88 op гга ш - Hind хи на рШ83 с 1 14 Ьр синтетичен ДЖ фрагмент, съдържащ по-силни транслиращи тершшатори и разрушавайки ore хи местоположението чрез въвеждане на А в края не Dre хи недвнсваЯкй 3* края. Трансформирането аа щамовете нс Е соХ* се извършва какте е описано в (senbrook et al., 1989. cold Spring Harbor Laboratory Press). «шззменгте конструкции, взпелгзаи за експросивни опити и за получаване на Аро Al-м се анализират като се използва рестриктивио ензимно картиране и структурния ген на Арс АХ-г. се потвърждава чрез нуклеотидио определяне на последователността -«. col'· щамове с подходящи плазмиди, използвани за растеж в блореактври, се получават както следва: /«четките се оставят да растат една нощ в LB или 2ЮГТ в които е добавено канамицин в колби при клатене и тешюратура 30° 0. След като се центрофугират, клетките се отново суспендират в 1/2 обем дълбоко замразена хранителна среда за лагеруване, съгласно Герган и съавтори, 1979. nucleic Acid не®. 7ι 2115. вавни части се длепергират в 1 мл епруветки за дълбоко замразяване и се съхраняват при -75° С до употребата им.

Хранителни среди за растеж на клетки в биоректори. Среда А: 16 г/л триптон (Дифкс САД), 8 п/л екстракт от дрожди (дифко, СМ), 5 г/л нетриез хлорид и 0.05 г/л канамнцнн. Среда в: 2.5 г/л (Ш^)^ г Од , 3 г/л , 2 г/л KgHPC^ , 0.5 г-л мау-цитрат, 5 г/л екстракт от дрожди (Дж/ко, САч). След стерилизация,към средата се добавят: 1и г/л «№’циална глюкоза, 0.05 г/л канашщиа, 1 г/л магнезиев сулфат със се* дам молекули кристална вода и 0.07 г/з:

— ii — iipalCWHT co разтвор на миклоелешнти (1 жа/а.) и разтвор на витамини (0.65 мл/л) Разтворът на миклоелешнти съдържа: 27 г/л PeCijX6ii₂0, 4 г/л 2 пф 0^ х 7 iigQ, 7 г/л CoCig х 6 HgU, 7 г/л На^Ои^ х 2 HgO, 8 г/л С« - х 5 й₂0, 2 Г/л HjBOp 5 Г/л «па 0₄ х л HgO, 11 г/л CaClg х 2 iigO и 50 мл/л НС1. Разтворът на витамини съдържа: 0.5 г/л калциев пантотенат, 0.5 г/л холин хлорид, 0.5 г/л фолиева киселина, 1 г/л инозитол, 0.5 г/л никотинамид, и.5 г/л пиридоксин хидрсхлорид, о,05 г/л рибофлавин и 0.5 г/л тиамин хидрохлорид. .што противоненещо средство се използва лдеканол. при необходимост, през време но култивирането се прибавят допълнителни количества противопенещо средство.

Култивиране на ДУЗив/рлРоьз в биореакпор от 5.5 л. Дълбоко замразена култура от хранилището се използва за инокулиране на 500 мл среда А и се прекултивира в 2 литрова преградена ерленмайерова колба при 30° С в продължение на Ь - 1и часа, обемът на инокулума съответства на 10 % от работния обем на биореактира и се прехвърля в сшореактора. Култивирането се извършва в биореактор от 3.5 литра (^елах кп швеция) имец работен обем от 2.5 литра. Температурата е 30° С през време на фазата на растеж преди въвеждането и след това се повишава на 57° 0. pH се поддържа при 7.0 с разтвор на 25 >-ен амоняк. Скорост· та на аериране се поддържа при 1 оои и напрежението на разтворения кислород (д.и.Т.) се поддържа на 50 % при нагласяне скоростта на турбинната бъркалка. След като началната глюиоза се изконсумира, ое въвежда в действие захранващ дозатор за глюкоза за подхранване не системата с определено количество глюкоза като се подава 60 %-ен разтвор на глюкоза. Началното количество на захранване от 0.04 г/мин ое поддържа в продължение на 3 часа и след това постепенно се повишава до U.4 г/мин в продължение на 3 часа. Растежа на клетките се проследява чрез оптическата плътност (01 )· Концентрацията на Аро Αχ-ж в суперна тантната течност се определя чрез радиоишуноспити (Аролипопротеин А1

ЖА 100 kit ♦ «2 109152-01. Каби Фармаодя»*:Швед^? След*1Й часа култ*.·*«·* ·· · вирне, при оптична плътност 58, пройИпАЯатб*синтеза се започва чрез прибавяне на 0.5 мМ I2TC и тодаеретурата се повишава до 37° С. Четири часа след прибавянето, концентрацията на Apo Al—и е 2.3 г/л и след ниви 2 Часа концентрацията е 2.5 г/л.

Култивиране на зС5б/рК2764 в биореактор от 3.5 литра.

Култивирането се извършва както е описано по-горе» с изключение на това, че не се прибавя канамицин към средата в биореактора. След 15 часа, при оптическа плътност 60, се прибавя 1РШ и температурата сс повишава. 10 часа по-късно концентрацията на Аро Αι-.ν. в течността е 3.7 г/л, е 22 часа след прибавянето, концентрацията е 4.4 г/л.

Култивиране на ВС50/рКР764 в биореактор от 300 литра

Използва се биореактор от 300 л (Хемоферм An, квеция) с работен обем 180 л. йноаулумът се получава както е описано по-горе за растежа на 173о8/рКР683 в биореактор от 3.5 литра с изключение на това, че времето за прекултоиране в клатачни колби е 14 часа. Инокулумът се прехвърля в 50 литров зародишен биореактор с работен обем 18 л. Средата използвана както в клатачните колби, така и в биореактора е среда А. Средата в зародишния биореактор се допълва с 5 г/л глюкоза и температурата е 30° С. pH и аерирането е същото» както описаното за растеж на IV308/pKP683 в биореактора от 3.5 л и д.О.х. не е никога под 30 %. Когато културата достигне оптична плътност 4, съдържанието на зародишния биореактор се прехвърля в биореактора от 300 л. в този биореактор температурата, pH и аерирането на средата са съдите каквито сз описани по-горе за растежа на ВЗОЕ/ркЖйЗ в биореактор от 3.5 л. Преда индуцирането, Д.О.Т. се държи на или над 30 % чрез увеличаване скоростта на турбинната бъркалка до нейния максимум и след това увеличаване налягането на въздуха. След индукцията» въздушното налягане сс повишава до 2 ьара в резултат на което се получава Д.О.Т. от 15 20 %. След 16 часа култивиране в биореактора» когато културата ими

- 3 • ·· ·· ······ оптическа плътност 51, прибавя се 1РТ0?';и ice·повишава на • * »··« · · · ·········· ····

37° С.

Концентрацията на Аро А1-4 като мономер и димер е 1.3 г/л, 5 часа след прибавянето и през следващия час, докато биореактора се охлажда, концентрацията на Аро Al-й се повища®1а 1.5 г/л.

Всяки наличен мономер може да се превърне в даер и да се пречисти съгласно известните методи.

йВШР 5 Охарактеризиран© на Apo А1-м/Аро AI-а от плазма

Пречистеният Аро А1-м/Аро Al-К от пример 1 дава единична ивица в пренато варен, не-редуциран ос -PAGE гели. в аналитичния sds-pags паното молекулно тегло на протеина е,както се очаква, 56 Аро А1-К /Аро Al-й показва комплексна изофорнна структура, характеризираща се е присъствието на най-малко 6 различни протеинови връзки в 5.3 - 5.6 ₽1 обхват, в нередуцирани, дрнатурирани Ш гели.

Ултравиолетовият спектър на Аро Αΐ-&/Λρο Ai-м (1.1 мг/ил) показва типичен абсорбционен максимум при 280 им, с рамо при 290.2 нм (фагура 7). Изчисленият протеин Ь (1 см, 1 Φ) πρ.ι 280 им а 16.9. За оценяване на тиро^иновите остатъци в Аро /и —л../Apc А1-2, провежда се втори-прсизводек анализ на ултравиолетовия спектър, както е описан от aagone K.et al., Determination of iyrosine exposure in proteins by second-derivative spectroscopy. Biochemistry 1984; 23ι 1871 - 1875. аторият-производен ултравиолетов спектър показва типични два минимум центрирани около 283 и 290.5 нм, и два максимума около 287 и 295 нм (игури 8-10). Релативната степен на тирозиновата експозиция (алфа) изчислена за природен Аро А1-»/Аро Al-а и Аро Ai-2/Apo Al—*.ι + ДМРС _tса 0.75 и съответно 0.49 (таблица 2).

Таблица 2 :

• ·· ··· ·· · · · · ·'

Характеристики на Αρο Ai-й/Дро Α1-И протеин

Аро АХ-щ/АрО АХ—Ц Аро АХ-й/АрО AI-i +

молекулно тегло (к )	56.0
изоелектрична точка	5.3 - 5.6¹
УВ спектроокопия:
0 (1 см, 1 2)	16.9²
тирозинова експозиция (алфа)	0.75²	0Л9²
Флуоресцентна спектроскопия:
1ХХС дължина на вълната шке (шх)	280	280
Ец дължина на вълната меко (нм)	344	338
СД спектроскспия
елфа-хеликс %	52.2³ г:о (4	66.1³

¹ поне 6 изоформи в денатурирани ISP гола висока стойност означава увеличена тирозинова експозиция ³ концентрация на протеин: 0.1 мг/мл * концентрация на протеин: 1.1 мг/мл

Отчехени са и двата флуоресцентни спектъра на Аро AX-M/Apo AI-M този на възбуждане и на излъчване, максималната дължина на вълната не възбуждане на триптофанилови остатъци в Аро ΑΙ-Π/Αρο А1-м е при 280 ни и не се променя при свързване о ДйРС. Емисионният спектър (възбуждане при 280 нм) показва дължина на вълната 344 ни за максимума (фиг. 11); свързването с дас предизвиква едно преместване към синьото на този максимум (338 нм)« свързано о 24 %-но увеличение на ^оргсцент25 ния интензитет при иаксимуша (фигура Ц)| · :

·.·„··· · · ·· *· ··

СД спектъра на Аро А1-УДпо Al-м сс характеризира е типични мини нуш при 208 ни и 222 нм и един максимум около 195 им (фигура 12)· Съдържанието на алфа-хеликс се увеличава значително при увеличаване концентрацията на протеин от 0.1 мг/мл на 1.1 мг/мл (фигура 12, таблица 2). Свързването на Аро Αί-ώ/Αρο А1-й (0.1 мг/мл) с ДЖ предизвиква по-нататъшно повишаване на протеин алфа-хеличната структура (фигура 12, таблица 2).

ЬьТад ЗА ОХАШ^ЕРЙЗЙРАНК НА падда йнкубиране с фосдолипвди

Претеглени количества от дамиристоилфссфатидалхолин (ДОС) се разтварят в етанол и разтворителя се изпарява под азот, като всякакви остатъчни количества от разтворителя се отстраняват под вакуум в продължение на 2 часа. Дисперсии от ДЖ в 20 мМ фосфатен буфер, рИ 7.4, се смесват с Аро Ах-йДро А1-й (0.1 шгДл крайно) при едно 100:1 дЖ/Аро А1-йДро Αι-Е моларно съотношение.

Снектроскопия

Разтвори на Аро А1-о/Аро Al-и се анализират срещу 20 мй фосфатен буфер, pH 7.4 и се разреждат със съция буфер до желаната концентрация на протеин.

Hop?® лен и втори-ароизводан /В спектър на Аро А1-йДро А1-а и на Apo А1- ./Аро Al—U + Ж разтвори се отчита с Джаско Увидекс-610 и Леркин iimep ламбда-2 спектрометри при 25° С, при използването as 1 см кварцова клетка. 4зеледването на топографското разположение на тиу резинови остатъци се извършва съгласно уравнението нава^оие et al.,

Detowaiaatlon of tyroeioe exposure la proteins by aeooad—derivative spectroscopy. Biochemistry 1984i 23t 1871 · 1875, алфа « (г_п-^_а)/(Гц-г_а) в което алфа е степента иа тлрозинова експозиция към разтворителя, г_п и г. са производните пикови съотнсйев|1я· (а/йг_;за’-^йрдая и неразгънат (в 6 М гуанида хидрохлорид) Аро Ai-u/Apo Al-fe респективно, г_асавторизвпроизводни пикови съотношения на разтвор съдържащ свобода! тирозин и триптофан смесени в същото моларно съотношение както това в Аро Ах-ЩДро А1-А*

Вътрешните флуоресцентни спектри па Apo А1-й/Аро АХ-L и на Аро АХ-йДро Al-Ш + Д1ЛРС разтвори се отчитат на Жаско ГР-550 спектрофлу(· орсметер при 25° С.

Циркулярни дихроизшш спектри ва Аро Αΐ-^/Αρο Al-м и на Аро АМ /Аро Al-М t ДЦРС разтвори се отчита с Ддаско XJ500A спектрополариметър при 25° С. Среда остатъчни елиптични стойности /ТНШ/ се изразяват в градуси х ci^ х бйол“^ и се изчисляват по уравнението:

ДНЕУА/ =

ДгША/ х 106

X X X 0 в което ДНЕУА/ е наблюдаваната елиптичност в градуси,

106 е средното остатъчно молекулно тегло на протеина

I е дължината на контура в см о е концентрацията на протеин в г/нл.

Процента алфа-хеликс се изчислява при използване на уравнението:

Ж^/₂₀₈ нм * ⁴⁰⁰⁰ % алфа-хеликс я

33000 - 4000 (Greenfield В, Gasman G*B· Computed circular dichroism spectra for th· emluation of protein conformation· Biochemistry 1969| 8i 4108-4116)4

Електрофореза

Аналитичното изоелектрично фокусиране и sos-ms вс провежда както ао-раво беше описано (mnooschlnl α·, sirtorl м·, Gianfraacesch

G., Sirtori 0·Π, Halation between th· HDB apoprotoin· and Al iaoproteins in subjects with ths AI-M abnormality. Metabolism 19811 30s 50227

509). ’ .’зоелоктрични фокусиране се извърпва в 10 φ-ен акрилакиден гол, ♦

съдържащ 6 й карбамид иИ (pH 4 - 6), След една нощ оокуслране, голът се фиксира и оцветява с .Сумасиново брилянтно синьо В250 в оцетна жсл-ша/изспршюов алкохол. Лзоолектричната tow (pl) на всички неизвестни протеинови ивици ое изчислява чрез нанасяне на р! на известни протеини (стандарти от Аио-Ред и апо-ЩЦ) графично но отношение на респективното миграционно разстояние.

За sds-page⁰⁰ използват 14 //-ни акриламидни телове съдържащи 0,1 / Гелът се третира както е описано и молекулното тегло на неизвестните протеини се изчислява от площта на 1о^ на протеинова те стандарти (ίίΑΒΙ-оармация) до отношение на миграционната дистанция*

Високоефективна хроматография

Аналитичните Н&8С разделяния ое извършват като се използва

Ддаско течен хроматограф, снабден е 10 шш Т6К - 0 3000 с W колона *

(7.5 х Зои мм). UiSBC колоната е еквилибрирана и олупрана с 0.1 ύ ,· фосфатен буфер, 0.1 ш натриев хборид, рй 7.2, съдържащ 8 М карбазд. Протеините се елуират със скорост на протичане на елуента 0.5 о/мин н отчитанията се правят при 220 нш. Площите на пиковете се интегрират при използване на iiP-3390 иптегратор.

IIBLSP 6 Получаване на гйД1 частички съдържащи Apo Al, Apo А1-М или Аро АМ/Аро А1-»

Реконституираии жастички от липопротеини с висока плътност (гНД1) се получават при използване на техниката представена от Nichols a.v, et @1·, Biochia. Biophye. Acta 750i 353 - 364 (1983) u 'Jtti C.B. st al., J. Biol. Chea. 257I 4535 - 4541 (1982).

Рсксшбинантен Apo Al-й дидар (от пример 4) и нормален Apo А1, пречистен от човешка плазма, се разтварят в 10 мм трис-ИСх, 0.15 м натриев хлорид· θ·θ* / МПС» 0.006 % liallp pH 8.0 (буфер А), съдържащ 4 й гуанидин хидрохлорид в концентрация от 6 мг/ма. За сравнение,

- 2ε даеулфидната връзва в някой от Аро А1-^/А’|ю.Я·*?de, равуцйра чрез •·· ··· ·· «· ·« ·· прибавяне на 20 мМ ДТТ към бубер А <· гуашда хидрохдорид. Протеини те ое дализират екстензивно срещу буфер А и разреждат до 5.2 мг/мл със същия буфер.

лик (Ж) или палмитоилолеилФосфолипиди· или яйчен фасфатидалхо фосфатидияхолин (ЮРС) се разтварят в хлороформ· сушат ое под азое и се държат една нощ под вакуум. Прибавя се натриев холат при съотношение на холат/РС 0.55 (т/т). Сместа се бърка енергично 3 минути при стайна температура и се инкубира при 4“С два часа. След това се прибавя протеин в тегловно съотношение РС/протеин 2.17 (PQPC) или 2.47 (Ж) и сместа се бърка три минути при стайна температура и ©е инкубира при 4° С една нощ. След диализа срещу буфер 0 в продължение на 5 даи_е сместа се центрофугира при 11 ОСЮ об/мин в продължение на 5 минути на Бекнанова шкрофуга и ое събира горната течност.

гШИ се отделят чрез неденатурираща нолиакриламин градаентна гел електрофореза (GGS) и размерите на частичките сс определят както

ПО-горе е описано от Mehole a. v. et al·, Heth. ЕаяуиоХ. 128 t 417431 (1986).

Всички изпитани аполидопротеини почти цялостно се свързват с липида след описаната процедура, както се демонстрира чрез много ма»I кия нмк на свободен от линиди аполиподротеин върху ШЖ телите. Възстановяването на протеин в гНДЬ варира между 68 % до 100 $ в 10 различни препарата.

GGE профили на реконституирани ПД1. частички са показани на фигура 13. НДХ реконституиран с А|о АХ и Ж дава голям пик върху SCE, с диаметър от 9.6 нм; по-малки компоненти· както о по-голями, така и с по-малки размери, също се откриват* гНДХ съдържащ Ж и Аро AX-L/ Аро АХ-й се състои от два голями (диаметър: 8.6 и 12.9 нм) и два помалки, (диаметър 7.9 и 10.8 нм) компоненти (фигура 13). Същият размер на частичките се получава когато Аро Al-L/Λρο Ах-н е реконституиран

С ЮРС. : : · : \ ·«>·» ··♦* « · · · · · ·· · · ·· ·*

Всичките три аполипопротеина са почти цялостно инкорпорирани з стабилни лшшд-претеип комплекси с различни размери на частичките н гНД1, о различно разпределение и състав. По-специално, гПДЬ направен с рскомбиаант Аро А1-п./Лро А1-м, се състои от два главни компонента, по-голяшя е уникален в семейството на Аро АХ-садържзш гНДХ..

ЕКОЛОГИЧНО ОЦЕНЯВАНЕ НА Аро AI-M/Apo AI-M

ПРЛЖГ 7 Кинетично отнасяне на Аро Al-й дамер по отношение аа

Аро АХ-Дономер в норьшш! реципиенти

Димерите проявяват удължена персиотентност в кръвообращението, което се показва при човешки кинетични изледаания по-долу.

Здравите доброволци получават е . ν. ^Х-белязан Аро Al-i или Аро АХ-й/Аро Al-i. Както е показано на таблица 3, плазмата βϊ^βΜ* изчислено съгласно два различни модела, както и фракционната катаболитична скорост (РС2). Ά двата показателя потвържават значително намален катаболизш на дамера в сравнение е мономера.

много бавния катаболизъм иа Аро АХ-ш/Аро АХ-м означава че тези молекули могат да отслабват липопротеииовата конверсия и възможно действат катб ефективен източник за Аро AI-u. По този начин, чрез и&кектирането на Аро АХ-м/Аро Al-Е, може да се твърда, че дамера може да остане в плазмата за удължен период от време, като по този начин директно взаимодейства о липопротеиновия метаболизъм и фибринолитячаата система.

Таблица 3 :

• · · ··« · · ·· * · · ·

Кинетично отнасяне на Аро А1-К/Аро Ал-й но отношение Аро Ai-й в нормални реципиенти (п»2)

Аро Al-й Аро А1-ш/А₽0

		AI-M
’юноекспононциален	& 1/2	16.07	52.04
начин на работа	(ч)
	Й1Т	23.19	75.09
	(ч)
виеиспоненциален	1/2	22.61	70.29
начин на работа	(ч)
		28.97	89.16
	(и)
	РС1	2.3- % на	1.1 % на
	(ч)	час	час

Ефект на Аро Al-i.i/Apo Al-й върху фибринолитичната система

Въведение дабриножичната система е главната защитна сила срещу отлагането на фибрин върху стените на кръвоносните съдове и като такава играе важна ролу между механизмите които предпазват от тромбоза.

Ензимът» отговорен за лизирането на Фибрина»е плазмин. Плазшнът се образува от неактивния източник плазминоген чрез въздействието на специфични активатори (тъкаиен плазминогенен активатор» t-PA и урокиназа» и?А). Както процеса на активиране» така и действието на плаз мин се регулира от специфични инхибитори - плазминоген активатор инхи битор 1 (PAI) и съответно алфа 2 - антиплазмин. Схемата на уибр;шолитичната система е дадена по-долу:

ЦдА&ЖПОГШ! .:. .:. ·..··..·

АКТИВАТОРИ i----- _ш

Ш8ШН0ГЕН-------> ' ЙЖШ

I--алфа₂ АШПЛАЗШШ

ФйЬРИН--* ГДР

ГДР « фибрин деградиращ продукт

Целта на настоящето изобретение в примерите 7 - 9 е да открие κοι Аро Al-М димера въздейства върху човешката фибринолитична система. Както автоактивирането на плазминоген, така и неговото активиране от м РА и ι-PA се изследват в присъствието и в отсъствието на Аро Ai-i, Аро <1-й. Човешки Аро А1, изолиран от плазма, сг използва като контрола (Сигаа продукт о ’й 9284).

Активирането на фибринолитичната система се измерва с помощта на хромогенни субстанции. Тези субстрати съдържат една хрошфорна група от паранитроанмлин, която може да се отцепи от субстратната молркула под въздействието на плазмин..свободният ларанитроанилин (р-NA) има интензивно жълт цвят, който леоно може да се проследи при 405 нм дължина на вълната. Количеството на освободения ларанитроанилин е право пропорционално на количеството проявена ензимна активност. Всички измервания се извършват при използването на ТШЖО мака, отчитащо устройство, контролирано чрез Софтмакс програмен вариант 2.01, проиводотво на молекулярни устройства, менло Парк, Калифорния, САЩ.

Дробите използвани при тези изследвания са произведени рекомбинантно, в съответствие на пример 4. Пречистването се извършва чрез йонообмен, хидрофобно взаимодействие и гел шилтруваща хроматография.

последвано от ултрафилтруване и сушена ч$зз. всичко това • · ···· · е · са обичайни биохимични методи. Зсички проби които се’изследват, съдържат > 90 % от даерната форма, както това се потвърждава от реверсивна фазова високоефективна течна хроматография. Концентрацията се определя при използването на Каби Фармация аполипопротеин Al 2IA 100 количествен анализ.

Три препарата, А, В и С се изследват.

ίϊώΙΡ 8 Автоактивираие на плазминоген в присъствието на

Аро .U-4./Apo Al-Й и НС Аро А1

Глу-плазминоген (94 шег/мл крайни концентрация) се инкубира в продължение иа три часа при 37° С в 0.1 мол/л трие буфер рй 7.6. Образуването на плазмин се проследява с 3 -2151 хрешогенен субстрат (H-S-Val-b-leur-l-lys-ρΜΑ), получа от Хромогеникс АЬ, жьолндал, Швеция. Използва се като 0.6 ммол/л крайна концентрация.' използваните πρι тези опити плазшшегени се получават от Хромогеникс АЬ или от I1C0, Стокхолм, Швеция.

Партидите от Аро А1-У/Аро Al-К (крайна концентрация 3.9 - 75 шег, мл) се изпитват при този опит като се измерва количеството на плазмин получено в тяхно присъствие в сравнение с· количеството шшзмин получено в присъствието на Ape А1 (125 шег/вд крайна концентрация) и с количеството плазмин получено при отсъствието на всякакви добавки (контрола) (тафшца 4).

С изненада се установява, че Аро А1-.../Аро Al-к може да ускори активирането на плазминоген в отсъствие па каквито и да са активатори на илазмино1*ен. Аокучен от плазма Аро-А1 по никакъв начин не повлиява плвзмнногеновата шлекула.

- 53 Таблица 4 J. Z -J

Спонтанно предизвиквани на илазшнна активност в плазминсген. йрект на Аро АХ-й/Аро A1-U и на Аро АХ. Плазмиина активност изразена като ОД при

405 нм

Проба	Аро крайна концентр. шд?/мл	ОД 405 нм
-.....-......·'- ................................................ .	.....-...................................................· ·· --------------------———	.....--------------------------------—.......
Контрола	0	0.052
+ Аро АХ	125	0.049
+ Аро АХ-й/Аро АХ-Й
А	75	0.288
В	31.3	0.325
В	15.6	0.153
В	7.8	0.104
в	3.9	0.067

Получената активност може да се препие на Аро АХ- /Аро АХ-й.

При все това, на основа на тези данни, не може да се изключи, че Аро АХ-й/Аро Αι-й не с заразен о някакъв притеолитичен ензим или ензими, което да активира плазшшогена. Провеждат се опити за да се изключи тази възможност.

Всички Аро AX-L/Apo Al-κ. препарати, използвани при фибринолитичните количествени измервания, ое изпитват с хрсмсгенни субстрати 5-2251 (Н-^-УаХ-Хг1еи-Х.-Ш-Р^)» чувствителен към плазминоподобна към аг^-спе цифична протеаза. Субстратите се получават- от Хромоганикс Ах>. Крайната концентрации. на Аро АХ-м/Аро АХ-й при определенията е идентична на тази използвана при фибринолитичните опити и тава може да варира при отделните партиди.

активност и 5-2288 (Н-х-ХХе-Рго-Аго-рШ), чувствителен

опит:

• · ·· ·· ······ 25 ш Аро А1-М/Аро AI-М крайна· койцакТ$&цНя· 60_;- 70 мкг/ал .····· · · · · · · ·· 150 мкл 0.1 мол/л трие буфер pH 7,8 50 мкл 5 -2251 0.6 ьшола/л или S -2288 1.0 шюла/л

Като контрола за неочаквана субстратна хидролиза ое използват проби съдържащи само буфер и субстрат. Всички проби се правят в две повторения.

микротитърви плочки ое инкубират при 57° С и ббеорбцията ое отчита в интервал от един час.

1вблица 5

Амидолитичка активност на две партиди

Аро А1-д/Аро Al-й (А и В) след 4 часа инкубиране при 37° С (ОД при 405 нм)

АрО Ai-m/ApO А1-М

Субстрат

2251	А	0.023	0.022
	В	0.022	0.022
2288	А	0.037	0,034
	В	0.037

В друга серия от експерименти, Аро АХ-л/Аро АХ-й се третира с необратим инхибитор на оеринова протеаза - даизопропил флуорфосфат ДГР, (продукт на Сигма с Ш Д 0789). Крайната концентрация на Аро ΑΙΑ Дро Al-А в 0.2 мола/л KHCOj, pil 7.6 буфер е приблизително 75 мкг/мл« ДРР, 123 ммола/л крайна концентрация, се прибавя кш този разтвор. След 4 часа инкубираната проба се диализира една нощ cpei^ две премета в карсопатния буфер.

Определянето на активността, при използване на същите условия кзквито са описани по-горе, се извършва на третиран с Д?В Аро AI-i/Apc

АХ-wi к на нетретиран Аро AX-u/Apo-Al-c:. die^’mytfwpaHe’a продължение • · · · · · · · · на три часа с плазминоген и з -2251, 6Д при 4’05 ’ни β”ϋ.209 за пробите съдържащи третиран с ДРР Аро А1—U/Аро Αχ-ύ, 0.234 за пробите съдържащи нетретиран Аро Ах-м/Аро Ах-ь и 0.030 за пробите само с плазминоген

Така може да се направи заключението, че наблюдавания плазминогсн активиращ е.ект е директно свързан с присъствието на Аро АХ-ш/Аро Αχ-k и не се дължи на каквито и да е потенциални протеолитични замръг сители.

1ВЖР 9 Ефект на Аро АХ-У/Аро ΑΙ-й върху активацията на плазминоген с плазшшсгенки активатори t-PA и чРА.

Урокиназа (цРА) и тъканен клазминогеиен активатор (t -?А) и два· та превръщат плазминоген в плазмин чрез протеолитичнс отцепване на една единстзаае пептидна връзка Дго 560-VaI 561 в плазминогенната молекула. докатс двуверижнат8 урокиназа може да активира плазминоген да ректно, t-PA изисква присъствието на фибрин за оптималното си активиране на плазминоген. Присъствието на каталитични количества от фибрин, който заедно е ^«РА и плазминоген образува третичен комплекс, ще увеличи ензимната ефективност на -РА прлбризително 600 кратно.

Активирането на плазжноген о t-PA се изследва при използване на търговски достъпни комплект Спектролизе® (фибрин) t-PA/PAl от Биопул АБ, Умеа, Швеция.

При този опит плазминоген се инкубира с _г-ГА в присъствието на хромогекен субстрат 2:-в,..',г-СНТ-1у₃-рБхА и десАА фибриноген (Фибрин шномер), който действа като активиращ стимулатор. Генерираният плазшш разцепва субстрата при което освобождава свободен рРХА.

Към тази система се прибавя Аро АХ-щ/Аро Ах-&. и се сравнява с Аро АХ препарати ст Ситна. Зфекта от двата липопротеина_хсе изпитва в системата както в присъствие, така и в отсъствие на фибрин.

Пример от опитната систоаа:

Mici Cneesролизе буфер мкл Аро препарат или буфер : : · : : \ ‘ “··..’ нкл _t-РА («1.7 АЕ/мл крайна концентрация)

150 мкл Спектролизе РАЙ реактив («смес от плазминоген и субстрат 10 мкл Дева фиб (фибрин но номер) или 10 мкл буфер

Пробите се инкубират върху жкротитърпи плочки при 37° С в продължение на три часа.

Таблица 6

Ефект на Аро А1-й/Аро АМ и Аро Ах върху плазшгаогенната активация чрез t-PA в присъствието и отсъствието на фибрин. Резултатите се изразени като ОД, 3 часа след инкубиране при 37° С при 405 нм

Проба	Аро крайна концентрации ккг/кл	ОД 405 нм + фибрин	ОД 405 нм - фибрин
——.........-....................	........ -......................-	................-................ —-.......-	..................................
t- РА контрола	0	0.656	0.048
1 Аро AI	54	1.050	0.066
♦ Аро АМ/Аро AI-M А	65	1.665	0.446
3	54	2.366	3.225

Значително стимулиране на шшзшшогенната активация ое наблюдава с Аро АМ/Аро А1-2, както в присъствие,нтака и в отсъствие на фибринApe AI стимулира активацията в по-малка стопен в присъствието на фибрин. 3 отсъствието на фибрин стимулирането на Ара АМ/Аро АМ е много ясно изразено в сравнение е много малкото стимулиране на Аро AI.

Аро АМ/Аро АМ кш също така значително усилващ ефект когато плазниногенът е активиран с иРА. Използваната. при тези опити урокиназа има високо мелекулно тегло, препарат получен от Калбиохем.

Уроки.шза (2.5 ΠΕ/мл кранне концентрация) се смесва с плазиино- 37 ген (94 мкг/ια крайна концентрация) и‘^рсцагрн&а”?убеб.^аТ_: ,'-2251 ······ ·· »· · · · · «* (0,6 шола/л крайна концентрация), Към тази проба ее прибавя Аро А1/Аро Al-М при 75 или 62 шсг/шх крайна концентрация. Реакцията ее про· вежда в 9,1 нол/л трие буфер при рК 7,6,

Подобно на .-Рд» наблюдава се силно стимулиране образуването на шшгмлн чрез урскиназа, когато към опита се прибави Аро Al-U/Apo AI-M (таблица 7),

Ъблица 7

Ефект на Аро Αι-ь/Аро ΑΙ-u върху алазминогенната активация чрез иГА. Резултатите са изразени като ОД след 4 часа инкубиране при 57° 0 при 405 ш

Дроба	про иж-Х/Аро A*-h кр?йпа концентрация ОД 405 нм мкг/нл
мРА контрола	и 0.325

т Аро ΑΙ-ϊ/Αρο ΑΙ-ί

А	75 1.263
.:5	62 а,868

Този усилващ ^ибриноливата ефект се получава ow така когато

Аро А1Ч./Ари Al-ж е ^орпулиран във фармацевтичен състав заедно с носител. Като потеицналки наситили се използват лилозоми състоящи се от фссфатидалхслик, ГС, (12 мг/мл). Концентрацията на Аро А1-н/Аро АХ-М (партида С) в лжад^те е 3.6 мгДл.

Активирането на шк

кк&шоген <54 жгДл крада концентрация) с

u-’A (2,5 iln/wa крада кмицектрация) се изпитва в присъствието на липозоми с Аро А1-а/Аро Αι-^ и активирането получено в присъствие на свобода от протеин липозоми. Дробите се инкубирет в продължение на четнрн часа при 57° 0 с 6-да! й образуването на плазмин се непрекъс38 нато проследява. : :

Таблица 8 ......... ' ” ’

Активиране на плазминоген чрез _ЧРА. Ефект на Аро Ai-й/Аро АХ-и, партида 0, в л.тпозоми. Резултатите са изразени като

Од при а05 ш?

Проба	ОД 405 '
цРА + плазминоген	0.221
t Аро AX-i/ApO АХ-Й 75 мкг-мл в
липозоми, 250 шг-мл PC	1.084
t липозода свободни от протеин,
250 мкг/мл PC	0.499

Присъствието само на липозоми стицулира активирането на плазминеген приблизително два пъти. При прибавянето на Аро АХ—ii/Apo АХ-М към липозомите се увеличава ефекта петкратно в сравнение с пробите, съдържащи само урокиназен активатор.

ШШмВР 10 Ефокт на Аро АХ-й/Аро Al-М при превръщането на едноверижна урокиназа в двуверижна урокиназа.

Урокиназа с единична верига ( _ь с_чРА) е източник на Двуверижаа G РА) урокиназа. За разлика от двуверижната, едноверижната урокиназа има само много ниска амидолитнчна активност спрямо малки синтетични субстрати. Амидолитичната активност е най-много 0.4 % от активността на двуверижната. При все това, едноверижната урокиназа, въпреки че е проензим, има способността да активира плазаоген до плазшн. в смесите на плазшшоген и едноверина урокиназа, предложена е последователност от три реакции свързани с активирането на плазминоген до плазмин

1) едноверижна урокиназа + шшзминоген --едно верижна урокиназа + плазмин

2) плазмин + едно верижна урокиназа • · · · : де&змкнга .дауверижна уро·· ·* · · · · ' кина за

3)· двувермз у ро кина за t плазминогек двуверижна урокиназа + плазмин

Ние изследваме последователността на реакциите водещи до превръщането на едно верижната в двуверижна урокиназа в присъствието на плазминоген. Урокиназпата активност се проследява с помощта на урокиназен специфичен хромогенен субстрат h-2444 (impo-Gl-CXy-Aro-pNA, Хромогенен АЗ). нриби от Afo А1-щ/Арс Ах-fe и Аро Ах се прибавят кш системата и количеството на получената ц£А активност се сравнява с активно отта, рибната получен шсл мкл рад шсл палучена от пробите без прибавяне па апелипопротеин. ъдновеурокиназа, използвана при тези опити, е рекошбинантен продукт от Грюнентал оОД, Аахеа, хармония (ώ 0088808).

Аро или буфер

0.05 иола/л трие pH 7.6, съдържащ 0.1 мол/л натриев хлои 0.02 % Твеен 80 одаверижна урокиназа, 454 рмол/л крайна концентрация шсл $-2444, 1 ммол-л крайна концентрация шсл плазшшоген, 52.1 нмол/лкршШа концентрация

Пробите се ннкубират при 37° С в продължение на 90 минути. Увеличаването на оптичната плътност, количественото измерване на получената двуверижнь урокиназа, се отчитат непрекъснато през последните 30 минути на ишеуоироне.

Таблица 9 афект на Аро А^/Аро А1-м при превръщането на едноверижна в двувсрижна урокинеза. гезулаатито са изразени като мОД/шин при 405 нм

4ϋ

Проба • · » · · · · · ·

Аро крайна ко*Ше^Й’да^:..^: ’ -.ЙД/мин

ИКГ/Ш1

0.073 едноверивна урокиназа 0

+ плазминоген	0	13.2
+ АрО АХ	62	11.8
ф Аро АХ-М/Аро АХ-И В	62	20.0
А	75	24.0

Превръщането ва едноверижна урокчназа в двуверижка в присъствие на плазминогон се стимулира от Аро Al-L-/Apc АХ-2, докато Αρο АХ, изолгран от плазма, няаа значим ефект в тази система.

Наблюдаваните ефекти иа Аро W-r/Apo U-L фибрииолитичните опити използвани при тези проучвания са по-бързи в сравнение с ефектите наблюдавани с Аро АХ, изолиран от плазда. Αρο А1-й/Аро АХ-М има голям капацитет да стимулира Фибрмнолитичнато активност, която о подобра от тази па Аро АХ. -Аероятно о, този ускорен ефект аа Аро АМ/ Аро АХ-h в сравнение с Аро АХ да се пл-върди и на живо.

Claims

Патенж претенции

1. Дозрът :ш Аполипопротеин - АХ-.илано в практически чиста gopiia.

2. Димерът из адолиполротеяй -AI-L.anaiio съгласно претенция 1, с чистота поне 9С за предпочитане поне 98 р.

3. Джзрът но алипопротоин -АХ-олано, съгласно претенция 1, който е получен от плазма.

4. Динерът па алолипопротеин -AI-сшшо, съгласно протензия 1, който е получен рекомбишштно.

5. 'Аардаиетчен състав съдържащ дпмера сдавено претенция 1, заедно с носител. : · ··:: :···:. :

... »· · ·· ·· ·· · ·

6. Фармакологичен състав съдържащ даера съгласно претенция 1, заедно със стабилизиращо средство, евентуално с носител.

7. Фармакологичен състав съгласно претенции 5 до 6, заедно о средство понижаващо липидите л носител.

8. Фармакологичен състав съгласно претенция 5, съдържащ дамера заедно със тво стабилизиращо ливадите, евентуално с понижаващо

л.шилите ж евентуално с носител.

9. Фармакологичен състав съгласно претенция 5, заедно с фосфолипад, евентуално със средство понижаващо ливадите и евентуално о носител.

10. йбтод за получаване на димера съгласно претенция 1, характеризкращ се с това, че

а) Аполипопротеин А1-шадано се получава чрез рекомбинантна технилогия като жремноклетъчен ошшвен протеин в соХ’ , отцепване на анилипопротеин Αι-шлано с мравчена киселина и след това всеки наличег превръщане мономер is дамер ж

0) получаване на аполипоиротеин А1-ьизшно чрез рекомбинантна технология при конто Аполинонротоин Ал-_1:;ушно, мономер и димер се сек· ретлрат в бактериалната културална среда в експресивна система на £· соД и след това всенн наличен мономер ое превръща в даер или

в) чрез събиране на шшзма от адодипопротеин А1-илслаао носители, изилиране на анолнаонротеините о висока плътност и разделяне на дамора чрез използва ие на хроматограуия в няколко етапа или

д) чрез свсйроис на плазма от аполинопротеин АйнХилано носители, пречистване на ьономера и ел«д това превръщането му в димер.

а пречистваните на димера в практически чиста уерма.

xl.

Използване на динара съгласно претенция 1 при приготовляване на лекарства съдърнащи динара за лечение на атеросклероза и кардаоваскуларни заиолнзания.

12. Използване на даера съгласно п^тегпц.ъгХ.пр.; .изготвянето на лекарства съдържащи димера, действащ като нро-лекерстзо зе мономера_е при лечението на атеросклероза и кардиоваскуларии забелязания.

13. Кзполовацо на дамора съгласно претенции 11 или 12 за предна» зане л лечение на главните асрдлозаскуларни страдания като инфаркт на кокарда, юстабилна ангина, акутни периферни оклузии и рестенози след коронарна ангкопластия.

14. /зползваис на докера съгласно претенции 12 или 12 за лечение па хронични артериални ежтояиля.

15. Използване на долара съгласно претенции 11 или 12 за предпазване и лечение на тромбози.

16. Използване на допера съгласно претенция 1> за стимулиране на Фибринелмзата.

17. Използване ж дамера съгласим претенции 1* лли 12 при което лекарството съдържа също средство понижаващо липидите. _{

1С. дотод за лечение на атеросклероза и кардяоваскуларни заболяванкя, характеризиращ сс о това, че ое прилага димера съгласно претенция 1 в лечебно активно количество· евентуално с прибавен носител, със стабилизиращ) липидите съединение н/нли средство понижаващо’ливадите в лечебно активно количество.