PT971946E - Selecção de proteínas utilizando fusões arn-proteína - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Selecção de proteínas utilizando fusões ARN-proteína"

Antecedentes da invenção A presente invenção refere-se a métodos de selecção de proteínas A invenção foi realizada com apoio governamental com os subsídios F32 GM17776-01 e F32 GM17776-02. O governo detém alguns direitos sobre a invenção.

Existem actualmente métodos para o isolamento de moléculas de ARN e ADN com base nas suas funções. Por exemplo, as experiências de Ellington e Szostak (Nature 346:818 (1990); e Nature 355:850 (1992)) e Tuerk e Gold (Science 249:505 (1990); e J. Mol. Biol 222:739 (1991)) demonstraram que se podem isolar moléculas de ácido nucleico muito raras (i.e., menos de 1 em 1013) com propriedades desejadas, a partir de conjuntos de moléculas complexos, por ciclos repetidos de selecção e amplificação. Estes métodos têm vantagens em relação às selecções genéticas tradicionais, na medida em que (i) se podem pesquisar conjuntos candidatos muito grandes (>1015), (ii) a viabilidade do hospedeiro e as condições in vivo não são uma preocupação e (iii) as selecções podem ser realizadas mesmo se não existir uma pesquisa genética in vivo. Além disso, a EP0962527A descreve uma molécula que atribui um genótipo e um fenótipo e suas utilizações. O poder da selecção in vitro foi demonstrado definindo novas sequências de ARN e ADN com funções de ligação a proteína muito específicas (veja-se, por exemplo, Tuerk e Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et ai., J. Mol. Biol 222:739 (1991); Oliphant et ai., Mol. Cell Biol. 9:2944 (1989); Blackwell et al., Science 250:1104 (1990); Pollock e Treisman, Nuc. Acids Res. 18:6197 (1990); Thiesen e Bach, Nuc. Acids Res. 18:3203 (1990); Bartel et al., Cell 57:529 (1991); Stormo e Yoshioka, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5699 (1991); e Bock et al., Nature 355:564 (1992)), funções de ligação a moléculas pequenas (Ellington e Szostak, Nature 346:818 (1990); Ellington e Szostak, Nature 355:850 (1992)), e funções catalíticas (Green et al., Nature 347:406 (1990); Robertson e Joyce, Nature 344:467 (1990); Beaudry e 2 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Joyce, Science 257:635 (1992); Bartel e Szostak, Science 261:1411 (1993); Lorsch e Szostak, Nature 371:31-36 (1994);

Cuenoud e Szostak, Nature 375:611-614 (1995); Chapman e

Szostak, Chemistry and Biology 2:325-333 (1995); e Lohse e

Szostak, Nature 381:442-444 (1996)). Não foi demonstrado um esquema semelhante para a selecção e amplificação de proteínas.

Sumário da invenção 0 objectivo da presente invenção é permitir aplicar os princípios de selecção in vitro e evolução in vitro a proteínas. A invenção facilita o isolamento de proteínas com propriedades desejadas, a partir de conjuntos grandes de sequências de aminoácidos parcial ou totalmente aleatórias. Adicionalmente, a invenção resolve o problema de recuperar e amplificar a informação da sequência de proteína ligando de forma covalente a sequência codificante de ARNm à molécula de proteína.

Em geral, o método da invenção consiste num protocolo de transcrição/tradução in vitro ou in situ que produz proteína ligada de forma covalente à extremidade 3' do seu próprio ARNm, i.e., uma fusão ARN-proteína. Isto é conseguido pela síntese e tradução in vitro ou in situ de uma molécula de ARNm com um aceitador peptídico ligado na sua extremidade 3' . Um aceitador peptídico preferido é a puromicina, um análogo de nucleósido que se adiciona ao terminal C de uma cadeia de péptido crescente e termina a tradução. Numa concepção preferida, inclui-se uma sequência de ADN entre o final da mensagem e o aceitador peptídico, que é concebido de modo a fazer com que o ribossoma faça uma pausa no final do quadro de leitura aberta, proporcionando um tempo adicional para que o aceitador peptídico (por exemplo, puromicina) aceite a cadeia de péptido nascente, antes da hidrólise da ligação peptidil-ARNt.

Se desejado, a fusão ARN-proteína resultante permite ciclos repetidos de selecção e amplificação, pois a informação da sequência de proteína pode ser recuperada por transcrição inversa e amplificação (por exemplo, por amplificação por PCR, bem como qualquer outra técnica de amplificação, incluindo 3 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ técnicas de amplificação baseadas em ARN, tais como 3SR ou TSA). O ácido nucleico amplificado pode então ser transcrito, modificado e traduzido in vitro ou in situ para produzir fusões ARNm-proteína para o ciclo de selecção seguinte. A capacidade de realizar múltiplos ciclos de selecção e amplificação, permite o enriquecimento e isolamento de moléculas muito raras, e.g. uma molécula desejada a partir de um conjunto de 1015 membros. Isto por sua vez, permite o isolamento de proteínas novas ou melhoradas que reconhecem especificamente, praticamente qualquer alvo ou que catalisam reacções químicas desejadas.

Deste modo, num primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para a selecção de uma proteína desejada, envolvendo os passos de: (a) proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, em que cada uma inclui uma sequência de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata e em que cada uma está ligada de forma covalente a um aceitador peptídico na extremidade 3' da sequência codificante de proteína candidata; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de proteína candidatas para produzir uma população de fusões ARN-proteína candidatas; e (c) seleccionar uma fusão ARN-proteína desejada, seleccionando desse modo a proteína desejada.

Num aspecto relacionado, a invenção refere-se a um método para a selecção de uma molécula de ADN que codifica para uma proteína desejada, envolvendo os passos de (a) proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, em que cada uma inclui uma sequência de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidatas e em que cada uma está ligada de forma covalente a um aceitador peptídico na extremidade 3' da sequência codificante de proteína candidata; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequência codificantes de proteína candidata para produzir uma população de fusões ARN-proteína candidatas; (c) seleccionar uma fusão ARN-proteína desejada; e (d) produzir a partir da porção de ARN da fusão, uma molécula de ADN que codifica para a proteína desejada. 4 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Noutro aspecto relacionado, a invenção refere-se a um método para a selecção de uma proteína com uma função alterada em relação à proteína de referência, envolvendo os passos de (a) produzir uma população de moléculas de ARN candidatas a partir de uma população de moldes de ADN, em que os moldes de ADN candidatos têm, cada um, uma sequência codificante de proteína candidata que difere da sequência codificante de proteína de referência, em que as moléculas de ARN compreendem, cada uma, uma sequência de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente à sequência codificante de proteína candidata e estão, cada uma, ligadas de forma covalente a um aceitador peptídico na extremidade 3'; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências de proteína candidatas para produzir uma população de fusões ARN-proteína candidatas; e (c) seleccionar uma fusão ARN-proteína com uma função alterada, seleccionado desse modo a proteína com a função alterada.

Ainda noutro aspecto relacionado, a invenção refere-se a um método para a selecção de uma molécula de ADN que codifica para uma proteína com uma função alterada em relação a uma proteína de referência, envolvendo os passos de: (a) produzir uma população de moléculas de ARN candidatas a partir de uma população de moldes de ADN candidatos, em que os moldes de ADN candidatos têm, cada um, uma sequência codificante de proteína candidata que difere da sequência codificante de proteína de referência, as moléculas de ARN compreendem, cada uma, uma sequência de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente à sequência codificante de proteína candidata e em que cada uma está ligada de forma covalente a um aceitador peptídico na extremidade 3' ; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de proteína candidatas, para produzir uma população de fusões ARN-proteína; (c) seleccionar uma fusão ARN-proteína com uma função alterada e (d) produzir a partir da porção de ARN da fusão, uma molécula de ADN que codifica para a proteína com a função alterada.

Ainda noutro aspecto relacionado, a invenção refere-se a um método para a selecção de um ARN desejado, envolvendo os passos de: (a) proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, em que cada uma inclui uma sequência de iniciação 5 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata e em que cada uma está ligada de forma covalente a um aceitador peptídico na extremidade 3' da sequência codificante de proteína candidata; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de proteína candidatas, para produzir uma população de fusões ARN-proteína candidatas; e (c) seleccionar uma fusão ARN-proteína desejada, seleccionado desse modo o ARN desejado.

Em concretizações preferidas dos métodos acima, o aceitador peptídico é puromicina; cada uma das moléculas de ARN candidatas inclui ainda uma sequência de pausa, ou inclui também um ADN ou sequência análoga de ADN, ligada de forma covalente à extremidade 3' do ARN; a população de moléculas de ARN candidatas inclui pelo menos 109, de preferência pelo menos IO10, mais preferencialmente, pelo menos ΙΟ11, 1012, ou 1013, e muito preferencialmente, pelo menos 1014 moléculas de ARN diferentes; a reacção de tradução in vitro é realizada num lisado preparado a partir de uma célula eucariota ou uma sua porção (e é, por exemplo, realizada num lisado de reticulócitos, ou lisado de gérmen de trigo); a reacção de tradução in vitro é realizada num extracto preparado a partir de uma célula procariota (por exemplo, E. coli) ou uma sua porção; o passo de selecção envolve a ligação da proteína desejada a um parceiro de ligação imobilizado, o passo de selecção envolve testar uma actividade funcional da proteína desejada; a molécula de ADN é amplificada; o método envolve também repetir os passos dos métodos de selecção acima; o método envolve também fazer a transcrição de uma molécula de ARN a partir da molécula de ADN e repetir os passos (a) a (d) ; após o passo de tradução in vitro, o método envolve também um passo de incubação realizado na presença de Mg2+ 50-100 mM; e a fusão ARN-proteína inclui também um ácido nucleico ou sequência análoga de ácido nucleico posicionado próximo do aceitador peptídico, o que aumenta a flexibilidade.

Noutros aspectos relacionados, a invenção refere-se a uma fusão ARN-proteína seleccionada por qualquer um dos métodos da invenção; um ácido ribonucleico ligado de forma covalente através de uma ligação amida a uma sequência de aminoácidos, em que a sequência de aminoácidos é codificada pelo ácido ribonucleico; e um ácido ribonucleico que inclui uma sequência 6 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente a uma sequência codificante de proteina candidata, estando o ácido ribonucleico ligado operativamente a um aceitador peptidico (por exemplo, puromicina) na extremidade 3' da sequência codificante da proteina candidata.

Num segundo aspecto, a invenção refere-se a um método para a selecção de uma proteina desejada ou ARN desejado, através do enriquecimento de um conjunto de sequências. Este método envolve os passos de: (a) proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, em que cada uma inclui uma sequência de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata e em que cada uma está ligada de forma covalente a um aceitador peptidico na extremidade 3' da sequência codificante de proteína candidata; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de proteína candidatas, para produzir uma população de fusões ARN-proteína candidatas; (c) contactar a população de fusões ARN-proteína com um parceiro de ligação específico, ou para a porção de ARN, ou para a porção de proteína da fusão ARN-proteína, sob condições que separam substancialmente os complexos de fusão, parceiro de ligação-ARN-proteína dos membros não ligados da população; (d) libertar as fusões ARN-proteína ligadas dos complexos; e (e) contactar a população de fusões ARN-proteína do passo (d) com um parceiro de ligação específico para a porção de proteína da fusão ARN-proteína desejada, sob condições que separam substancialmente o complexo, parceiro de ligação-ARN-proteína dos membros não ligados da referida população, seleccionado desse modo a proteína desejada e o ARN desejado.

Em concretizações preferidas, o método envolve também repetir os passos (a) a (e) . Além disso, para estes passos repetidos, podem-se utilizar os mesmos, ou outros parceiros de ligação, em qualquer ordem, para o enriquecimento selectivo da fusão ARN-proteína desejada. Noutra concretização preferida, o passo (d) envolve a utilização de um parceiro de ligação (por exemplo, um anticorpo monoclonal) específico para a porção de proteína da fusão desejada. Este passo é preferencialmente realizado após transcrição inversa da porção de ARN da fusão, para produzir um ADN que codifica para a proteina desejada. Se desejado, este ADN pode ser isolado e/ou amplificado por PCR. 7 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Esta técnica de enriquecimento pode ser utilizada para seleccionar uma proteína desejada, ou pode ser utilizada para seleccionar uma proteína com uma função alterada em relação a uma proteína de referência.

Noutras concretizações preferidas dos métodos de enriquecimento, o aceitador peptídico é puromicina; cada uma das moléculas de ARN candidatas inclui também uma sequência de pausa ou inclui também um ADN ou sequência análoga de ADN ligada de forma covalente à extremidade 3' do ARN; a população de moléculas de ARN candidatas inclui pelo menos 109, de preferência pelo menos IO10, mais preferencialmente, pelo menos ΙΟ11, 1012, ou 1013, e muito preferencialmente, pelo menos 1014 moléculas de ARN diferentes; a reacção de tradução in vitro é realizada num lisado preparado a partir de uma célula eucariota ou uma sua porção (e é, por exemplo, realizada num lisado de reticulócitos ou lisado de gérmen de trigo); a reacção de tradução in vitro é realizada num extracto preparado a partir de uma célula procariota ou sua porção (por exemplo, E. coli); a molécula de ADN é amplificada; pelo menos um dos parceiros de ligação está imobilizado num suporte sólido; após o passo de tradução in vitro, o método envolve ainda um passo de incubação realizado na presença de Mg2+ 50-100 mM; e a fusão ARN-proteína inclui também um ácido nucleico ou sequência análoga de ácido nucleico posicionada próximo do aceitador peptídico, o que aumenta a flexibilidade.

Num aspecto relacionado, a invenção refere-se a kits para realizar qualquer dos métodos de selecção descritos aqui.

Num terceiro e último aspecto, a invenção refere-se a um microchip que inclui uma série de ácidos nucleicos de cadeia simples imobilizados, estando os ácidos nucleicos hibridados com fusões ARN-proteína. De preferência, o componente proteico das fusões ARN-proteína é codificado pelo ARN.

Tal como aqui utilizado, o termo "população" significa mais do que uma molécula (por exemplo, mais do que um ARN, ADN ou molécula de fusão ARN-proteína). Uma vez que os métodos da invenção facilitam selecções que começam, se desejado, com números elevados de moléculas candidatas, uma "população" de acordo com a invenção significa de preferência mais do que 8 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ ΙΟ9 moléculas, de preferência mais do que ΙΟ11, 1012, ou 1013 moléculas e muito preferencialmente mais do que 1013 moléculas. O termo "seleccionar" significa separar substancialmente uma molécula de outras moléculas numa população. Tal como aqui utilizado, um passo de "seleccionar" proporciona um enriquecimento de pelo menos 2 vezes, de preferência de 30 vezes, mais preferencialmente de 100 vezes e muito preferencialmente de 1000 vezes de uma molécula desejada, em relação a moléculas indesejadas numa população, após o passo de selecção. Tal como aqui indicado, um passo de selecção pode ser repetido um número qualquer de vezes e podem-se combinar diferentes tipos de passos de selecção numa determinada abordagem. O termo "proteína" significa quaisquer dois ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente ou modificados, ligados por uma ou mais ligações peptídicas. "Proteína" e "péptido" são utilizados indiferentemente. O termo "ARN" significa uma sequência de dois ou mais ribonucleótidos que ocorrem naturalmente ou modificados, ligados de forma covalente. Um exemplo de um ARN modificado incluído neste termo é ARN fosforotioato. O termo "sequência de iniciação da tradução" significa qualquer sequência que é capaz de proporcionar um local de entrada de ribossoma funcional. Em sistemas bacterianos, esta região é por vezes designada por sequência de Shine-Dalgarno. O termo "codão de iniciação" significa três bases que sinalizam o início de uma sequência codificante de proteína. Geralmente, estas bases são AUG (ou ATG); no entanto, qualquer outro tripleto de bases capaz de ser utilizado desta maneira pode ser um substituto. O termo "ligado de forma covalente" a um aceitador peptídico significa que o aceitador peptídico está ligado a uma "sequência codificante de proteína", ou directamente através de uma ligação covalente, ou indirectamente através de 9 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ outra sequência ligada de forma covalente (por exemplo, ADN correspondente a um local de pausa). O termo "aceitador peptídico" significa qualquer molécula capaz de ser adicionada ao terminal C de uma cadeia de proteína crescente pela actividade catalítica da função peptidiltransferase do ribossoma. Tipicamente, estas moléculas contêm (i) um nucleótido ou porção tipo nucleótido (por exemplo, adenosina ou um análogo de adenosina (a dimetilação na posição amino N-6 é aceitável)), (ii) um aminoácido ou porção do tipo aminoácido (por exemplo, qualquer um dos 20 D-ou L-aminoácidos, ou qualquer seu análogo de aminoácido (por exemplo, O-metiltirosina ou qualquer dos análogos descritos por Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301, 1991) e (iii) uma ligação entre os dois (por exemplo uma ligação éster, amida ou cetona na posição 3' ou, menos preferencialmente, na posição 2'); de preferência, esta ligação não perturba de forma significativa a curvatura do anel da conformação natural do ribonucleótido. Os aceitadores peptídicos podem também possuir um nucleófilo que pode ser, sem limitação, um grupo amino, um grupo hidroxilo, ou um grupo sulfidrilo. Além disso, os aceitadores peptídicos podem ser compostos por mimetizações de nucleótidos, mimetizações de aminoácidos ou mimetizações da estrutura combinada nucleótido-aminoácido.

Por aceitador peptídico posicionado na "extremidade 3’" de uma sequência codificante de proteína pretende dizer-se que a molécula de aceitador peptídico está posicionada após o codão final dessa sequência codificante de proteína. Este termo inclui, sem limitação, uma molécula de aceitador peptídico que está posicionada precisamente na extremidade 3' da sequência codificante de proteína, bem como uma que está separada do codão final por uma sequência codificante ou não codificante interveniente (por exemplo, uma sequência que corresponde a um local de pausa). Este termo também inclui construções em que as sequências codificantes ou não codificantes estão a seguir (isto é estão 3' em relação a) à molécula de aceitador peptídico. Adicionalmente, este termo inclui, sem limitação, uma molécula de aceitador peptídico que está ligada de forma covalente (ou directa, ou indirectamente através da sequência de ácido nucleico interveniente) à sequência codificante de proteína, bem como uma que está 10 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ ligada à sequência codificante de proteína por algum meio não covalente, por exemplo por hibridação utilizando uma segunda sequência de ácido nucleico que se liga a, ou próximo da extremidade 3' da sequência codificante de proteína e que está, ela própria, ligada a uma molécula de aceitador peptídico. O termo "função alterada" significa qualquer alteração qualitativa ou quantitativa na função de uma molécula. O termo "sequência de pausa" significa uma sequência de ácido nucleico que faz atrasar ou parar a velocidade de tradução de um ribossoma. O termo "parceiro de ligação", tal como aqui utilizado, significa qualquer molécula que tem uma afinidade especifica, covalente ou não covalente, para uma porção de uma fusão ARN-proteína desejada. Exemplos de parceiros de ligação incluem, sem limitação, membros de pares antigénio/anticorpo, pares proteína/inibidor, pares receptor/ligando (por exemplo pares receptor de superfície celular/ligando, tais como pares receptor de hormona/hormona peptídica), pares enzima/substrato (por exemplo, pares quinase/substrato), pares lectina/hidrato de carbono, agregados de proteínas oligoméricos ou hetero-oligoméricos, pares proteína de ligação a ADN/local de ligação a ADN, pares ARN/proteína e dúplices, heterodúplices ou cadeias ligadas de ácido nucleico, bem como qualquer molécula que seja capaz de formar uma ou mais ligações covalentes ou não covalentes (por exemplo ligações dissulfureto) com qualquer porção de uma fusão ARN/proteína. Os parceiros de ligação incluem, sem limitação, qualquer dos "motivos de selecção" apresentados na Figura 2. O termo "suporte sólido" significa, sem limitação, qualquer coluna (ou material de coluna), conta, tubo de ensaio, placa de microtítulo, partícula sólida (por exemplo agarose ou Sepharose), microchip (por exemplo um chip de silício, vidro de silício ou ouro), ou membrana (por exemplo, a membrana de um lipossoma ou vesícula) ao qual se pode ligar um complexo de afinidade, ou directamente, ou indirectamente (por exemplo através de outros intermediários parceiros de ligação, tais como outros anticorpos ou proteína A), ou em que 11 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ um complexo de afinidade pode ser incorporado (por exemplo através de um receptor ou canal). A invenção aqui reivindicada proporciona várias vantagens significativas. Para começar, é o primeiro exemplo deste tipo de esquema para a selecção e amplificação de proteínas. Esta técnica ultrapassa o impasse criado pela necessidade de recuperar sequências de nucleótidos correspondentes a proteínas isoladas, desejadas (uma vez que apenas os ácidos nucleicos podem ser replicados). Em particular, muitos métodos anteriores que permitiam o isolamento de proteínas a partir de conjuntos parcial ou totalmente aleatórios, faziam-no através de um passo in vivo. Os métodos deste tipo incluem tecnologia de anticorpos monoclonais (Milstein, Sei. Amer. 243:66 (1980); e Schultz et ai., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)), apresentação em fagos (Smith, Science 228:1315 (1985); Parmley e Smith, Gene 73:305 (1988); e McCafferty et al.r Nature 348:552 (1990)), fusões péptido-repressor lac (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:1865 (1992)), e selecções genéticas clássicas. Ao contrário da técnica presente, cada um destes métodos baseia-se numa ligação topológica entre a proteína e o ácido nucleico, de modo que a informação da proteína é retida e pode ser recuperada na forma de ácido nucleico que pode ser lido.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona vantagens em relação ao método de tradução bloqueada (Tuerk e Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et al., J. Mol. Biol 222:739 (1991); Korman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:1844-1848 (1982); Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:9022-9026 (1994); Mattheakis et al., Meth. Enzymol. 267:195 (1996); e Hanes e Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4937 (1997)), uma técnica em que a selecção é quanto a alguma propriedade de uma cadeia de proteína nascente que está ainda complexada com o ribossoma e o seu ARNm. Ao contrário da técnica de tradução bloqueada, o presente método não se baseia na manutenção da integridade de um complexo ternário ARNm:ribossoma:cadeia nascente, um complexo que é muito frágil e portanto limitativo em relação aos tipos de selecções que são tecnicamente possíveis. 12 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ Ο presente método também proporciona vantagens em relação à abordagem de síntese ramificada proposta por Brenner e Lerner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5381-5383 (1992)) em que se geram fusões de ADN-péptido e a informação genética é teoricamente recuperada após um ciclo de selecção. Ao contrário da abordagem de síntese ramificada, o presente método não requer a regeneração de um péptido a partir de uma porção de ADN de uma fusão (que, na abordagem de síntese ramificada é normalmente conseguido por ciclos individuais de síntese química). Deste modo, o presente método permite ciclos repetidos de selecção utilizando populações de moléculas candidatas. Além disso, ao contrário da técnica de síntese ramificada, que se limita geralmente à selecção de sequências relativamente curtas, o presente método é aplicável à selecção de moléculas de proteína de comprimento considerável.

Ainda noutra vantagem, a presente técnica de selecção e evolução dirigida pode utilizar bibliotecas de sequências candidatas muito grandes e complexas. Pelo contrário, os métodos de selecção de proteínas existentes que se baseiam num passo in vivo, são tipicamente limitados a bibliotecas relativamente pequenas, de complexidade algo limitada. Esta vantagem é particularmente importante quando se seleccionam sequências de proteína funcionais, considerando, por exemplo, que existem 1013 sequências possíveis para um péptido de apenas 10 aminoácidos de comprimento. Em técnicas genéticas clássicas, abordagens de fusão do repressor lac e métodos de apresentação em fagos, as complexidades máximas têm geralmente uma magnitude inferior a 1013 membros. Um tamanho de biblioteca grande também proporciona uma vantagem para aplicações de evolução dirigida, na medida em que o espaço da sequência pode ser explorado numa maior profundidade em torno de qualquer sequência de partida particular. A presente técnica também difere das abordagens anteriores na medida em que o passo de selecção é independente do contexto. Em muitos outros esquemas de selecção, o contexto em que, por exemplo, uma proteína expressa está presente pode influenciar profundamente a natureza da biblioteca produzida. Por exemplo, uma proteína expressa pode não ser expressa de forma adequada num sistema particular, ou pode não ser apresentada de forma adequada (por exemplo na superfície de 13 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ uma partícula de fago). Alternativamente, a expressão de uma proteína pode efectivamente interferir com um ou mais passos críticos num ciclo de selecção, e.g., viabilidade ou infecciosidade do fago, ou ligação do repressor lac. Estes problemas podem resultar na perda de moléculas funcionais ou em limitações da natureza dos procedimentos de selecção que podem ser aplicados.

Por fim, o presente método é vantajoso pois proporciona um controlo sobre o repertório de proteínas que podem ser testadas. Nalgumas técnicas (por exemplo, selecção de anticorpos) existe pouco ou nenhum controlo em relação à natureza do conjunto de partida. Ainda noutras técnicas (por exemplo, fusões lac e apresentação em fagos), o conjunto candidato deverá ser expresso no contexto de uma proteína de fusão. Pelo contrário, as construções de fusão ARN-proteina proporcionam um controlo sobre a natureza dos conjuntos candidatos disponíveis para pesquisa. Além disso, o tamanho do conjunto candidato tem o potencial de ser tão elevado quanto o de conjuntos de ARN ou ADN (~1015 membros), sendo apenas limitado pelo tamanho da reacção de tradução in vitro realizada. E a constituição do conjunto candidato depende completamente da concepção experimental; as regiões aleatórias podem ser pesquisadas isoladamente ou no contexto de uma proteína de fusão desejada e a maioria, se não todas, as sequências possíveis podem ser expressas em conjuntos candidatos de fusões ARN-proteína.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada seguinte e das reivindicações.

Descrição detalhada

As Figuras serão primeiro descritas resumidamente. Breve descrição das Figuras

As FIGURAS 1A-1C são representações esquemáticas de passos envolvidos na produção de fusões ARN-proteína. A Figura IA ilustra uma construção de ADN amostra para a geração de uma porção de ARN de uma fusão. A Figura 1B ilustra a 14 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ geração de um conjugado ARN/puromicina. A Figura 1C ilustra a geração de uma fusão ARN-proteina. A FIGURA 2 é uma representação esquemática de um protocolo de selecção generalizado de acordo com a invenção. A FIGURA 3 é uma representação esquemática de um protocolo de síntese para moldes de tradução mínimos contendo 3' puromicina. 0 passo (A) mostra a adição de grupos protectores aos grupos funcionais reactivos em puromicina (5'-OH e NH2) ; na forma modificada, estes grupos estão adequadamente protegidos para utilização na síntese de oligonucleótidos baseada em fosforamidito. A puromicina protegida foi ligada a vidro de poro controlado (CPG) de amino-hexilo, através do grupo 2'OH, utilizando o protocolo convencional para ligação de ADN através do seu 3'OH (Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)). No passo (B) sintetizou-se um molde de tradução mínimo (designado por "43-P") que continha 43 nucleótidos, utilizando química de ADN e ARN convencional (Millipore, Bedford, MA) , desprotegeu-se utilizando NH4OH e TBAF, e purificou-se em gel. 0 molde continha 13 bases de ARN na extremidade 5', seguidas de 29 bases de ADN ligadas à puromicina 3' na sua extremidade 5'-OH. A sequência de ARN continha (i) uma sequência de consenso de Shine-Dalgarno complementar a cinco bases de ARNr 16S (Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982);

Shine e Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71:1342-1346 (1974); e Steitz e Jakes, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:4734-4738 (1975) ) , (ii) um espaçador de cinco bases, e (iii) um único codão de iniciação AUG. A sequência de ADN era dA27dCdCP, em que "P" é puromicina. A Figura 4 é uma representação esquemática de um método preferido para a preparação de puromicina ligada a CPG, protegida. A FIGURA 5 é uma representação esquemática que mostra modos possíveis de incorporação de metionina num molde da invenção. Como se pode ver na reacção (A), o molde liga-se ao ribossoma permitindo a formação do complexo de iniciação 70S. 0 ARNt de Fmet liga-se ao local P e ocorre o emparelhamento de 15 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

bases com ο molde. A puromicina na extremidade 3' do molde entra no local A de um modo intramolecular e forma uma ligação amida com a N-f ormilmetionina através de um centro de peptidiltransferase, desacilando desse modo o ARNt. A extracção da reacção com fenol/clorofórmio origina o molde com metionina ligada de forma covalente. Na reacção (B) é mostrada uma reacção intermolecular indesejada do molde com puromicina contendo oligonucleótidos. Como anteriormente, o molde mínimo estimula a formação do ribossoma 70S contendo ARNt de fmet ligado ao local P. Isto é seguido de entrada de um segundo molde em trans, para se obter uma metionina ligada de forma covalente.

As FIGURAS 6A-6H são fotografias que mostram a incorporação de 35S metionina (35S met) em moldes de tradução. A Figura 6A demonstra a dependência da reacção do magnésio (Mg2+) . A Figura 6B demonstra a estabilidade de base do produto; a alteração na mobilidade apresentada nesta figura corresponde a uma perda da sequência de ARN 5' de 43-P (também designada por "molde Met") para produzir a porção ADN-puromicina, designada por 30-P. A retenção do marcador após tratamento com base era consistente com a formação de uma ligação peptídica entre 35S metionina e a 3' puromicina do molde. A Figura 6C demonstra a inibição da formação de produto na presença de inibidores de peptidiltransferase. A Figura 6D demonstra a dependência da incorporação de 35S numa sequência codificante molde. A Figura 6E demonstra a dependência da incorporação de 35S metionina no comprimento do molde de ADN. A Figura 6F ilustra a formação de produto cis versus trans, utilizando os moldes 43-P e 25-P. A Figura 6G ilustra a formação de produto cis versus trans utilizando os moldes 43-P e 13-P. A Figura 6H ilustra a formação de produto cis versus trans utilizando os moldes 43-P e 30-P num sistema de lisado de reticulócito.

As FIGURAS 7A-7C são ilustrações esquemáticas de construções para testar a formação e selecção de fusões de péptido. A Figura 7A mostra LP77 ("produto ligado," "77" nucleótidos de comprimento) (também designado por, "molde myc curto") (SEQ ID N0:1). Esta sequência contém o marcador epitópico de anticorpo monoclonal de c-myc EQKLISEEDL (SEQ ID NO:2) (Evan et ai., Mol. Cell Biol. 5:3610-3616 16 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ (1985)) flanqueado por um codão de iniciação 5' e um ligante 3'. A região 5' contém uma sequência Shine-Dalgarno bacteriana idêntica à de 43-P. A sequência codificante foi optimizada para tradução em sistemas bacterianos. Em particular, as 5'UTR de 43-P e LP77 continham uma sequência de Shine-Dalgarno complementar a cinco bases de ARNr 16S (Steitz e Jakes, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:4734-4738 (1975)) e espaçadas de modo semelhante às sequências de proteína ribossómicas (Stormo et al, Nucleic Acids Res. 10:2971-2996 (1982)). A Figura 7B mostra LP154 (produto ligado, 154 nucleótidos de comprimento) (também designado por "molde myc longo") (SEQ ID N0:3). Esta sequência contém o código para gerar o péptido utilizado para isolar o anticorpo de c-myc. A extremidade 5' contém uma versão truncada da sequência a montante de TMV (designada por "TE). Esta 5'UTR continha uma sequência de 22 nucleótidos derivada da 5'UTR de TMV que inclui duas repetições directas ACAAAUUAC (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 16:883 (1988)). A Figura 7C mostra o conjunto #1 (SEQ ID NO:4), um exemplo de sequência a ser utilizada para a selecção de péptidos. Os sete aminoácidos finais do péptido myc original foram incluídos no molde para servir como região constante 3' necessária para amplificação do molde por PCR. Sabe-se que esta sequência não faz parte do epítopo de ligação ao anticorpo. A FIGURA 8 é uma fotografia que mostra a síntese de fusões ARN-proteína utilizando os moldes 43-P, LP77 e LP154 e sistemas de tradução de reticulócito ("Retic") e gérmen de trigo ("Trigo"). A metade esquerda da figura ilustra a incorporação de 35S metionina em cada um dos três moldes. A metade direita da figura ilustra os produtos resultantes após tratamento com ARNase A de cada um dos três moldes, para remover a região codificante de ARN; são apresentadas fusões ADN-proteína marcadas com 35S metionina. A porção de ADN de cada uma era idêntica ao oligo 30-P. Assim, as diferenças na mobilidade eram proporcionais ao comprimento das regiões codificantes, o que é consistente com a existência de proteínas de diferentes tamanhos em cada caso. A FIGURA 9 é uma fotografia que demonstra a sensibilidade à protease de uma fusão ARN-proteína sintetizada a partir de LP154 e analisada por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. A pista 1 contém 30-0 marcado com 32P. As pistas 17 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

2-4, 5-7 e 8-10 contêm moldes de tradução marcados com 35S recuperados de reacções de lisados de reticulócitos, quer sem tratamento, com tratamento com ARNase A, ou com tratamento com ARNase A e proteinase K, respectivamente. A FIGURA 10 é uma fotografia que mostra os resultados de reacções de imunoprecipitação, utilizando a proteína epítopo de myc de 33 aminoácidos traduzida in vitro. As pistas 1 e 2 mostram os produtos de tradução da proteína epítopo de myc e moldes de β-globina, respectivamente. As pistas 3-5 mostram os resultados de imunoprecipitação do péptido epítopo de myc utilizando um anticorpo monoclonal de c-myc e tampões de lavagem PBS, DB e PBSTDS, respectivamente. As pistas 6-8 mostram as mesmas reacções de imunoprecipitação, mas utilizando o produto de tradução de β-globina. A FIGURA 11 é uma fotografia que demonstra a imunoprecipitação de uma fusão ARN-proteína a partir de uma reacção de tradução in vitro. São indicadas as picomoles de molde utilizadas na reacção. As pistas 1-4 mostram ARN124 (a porção de ARN da fusão LP154) e as pistas 5-7 mostram a fusão ARN-proteína LP154. Após imunoprecipitação utilizando um anticorpo monoclonal de c-myc e proteína G Sepharose, as amostras foram tratadas com ARNase A e polinucleótido-quinase de T4, em seguida foram carregadas num gel de poliacrilamida com ureia, desnaturante, para visualizar a fusão. Nas pistas 1-4 com amostras que ou não contêm nenhum molde, ou contêm apenas a porção de ARN do molde myc longo (ARN124), não se observou nenhuma fusão. Nas pistas 5-7 eram claramente visualizadas as bandas que correspondem à fusão. A posição do 30-P marcado com 32P é indicada e a quantidade de molde inicial é indicada no topo da figura. A FIGURA 12 é um gráfico que mostra uma quantificação de material de fusão obtido de uma reacção de tradução in vitro. A intensidade das bandas de fusão mostradas nas pistas 5-7 da Figura 11 e a banda 30-P (isolada de um modo semelhante em dT25, não apresentado) foram quantificadas em placas de phosphorlmager e representadas graficamente como uma função da concentração de LP154 de entrada. O 30-P modificado recuperado (eixo dos y da esquerda) era linearmente proporcional ao molde inicial (eixo dos x), enquanto que a fusão ligante-péptido 18 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ (eixo dos γ da direita) era constante. A partir desta análise, calculou-se que se formaram ~1012 fusões por ml de amostra de reacção de tradução. A FIGURA 13 é uma representação esquemática de tiopropil-Sepharose e dT2s agarose e a capacidade destes substratos interagirem com as fusões ARN-proteina da invenção. A FIGURA 14 é uma fotografia que mostra os resultados do isolamento sequencial de fusões da invenção. A pista 1 contém 30-P marcado com 32P. As pistas 2 e 3 mostram o LP154 isolado a partir de reacções de tradução e tratado com ARNase A. Na pista 2, o LP154 foi isolado sequencialmente, utilizando tiopropil-Sepharose seguido de dT25 agarose. A pista 3 mostra o isolamento utilizando apenas dT2s agarose. Os resultados indicaram que o produto continha um tiol livre, provavelmente a penúltima cisteina na sequência codificante do epítopo myc.

As FIGURAS 15A e 15B são fotografias que mostram a formação de produtos de fusão utilizando moldes de β-globina, tal como testado por SDS-tricina-PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida). A Figura 15A mostra a incorporação de 35S, ou não utilizando molde (pista 1) , ou utilizando molde syn-β-globina (pistas 2-4), ou um molde ΙιΡ-β-globina (pistas 5-7). A Figura 15B (pistas marcadas como na Fig. 15A) mostra material marcado com 35S isolado por cromatografia de afinidade de oligonucleótidos. Nenhum material foi isolado na ausência de uma cauda 30-P (pistas 2-4).

As FIGURAS 16A-16C são diagramas e fotografias que ilustram o enriquecimento de ADNcd de myc versus conjunto de ADNcd por selecção in vitro. A Figura 16A é um esquema do protocolo de selecção. Quatro misturas dos moldes myc e do conjunto foram traduzidas in vitro e isoladas em agarose dT25 seguido de TP Sepharose para purificar as fusões de molde dos moldes não modificados. As fusões ARNm-péptido foram então transcritas inversamente para suprimir qualquer estrutura secundária ou terciária presente nos moldes. Removeram-se alíquotas de cada mistura quer antes (Figura 16B), quer depois (Figura 16C) da selecção por afinidade, amplificou-se por PCR na presença de um iniciador marcado e digeriu-se com uma enzima de restrição que clivou apenas o ADN de myc. As 19 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ misturas de moldes de entrada eram myc puro (pista 1) ou myc:conjunto a 1:20, 1:200 ou 1:2000 (pistas 2-4). O material não seleccionado desviava-se das razões de entrada devido à tradução preferencial e transcrição inversa do molde de myc. O enriquecimento do molde de myc durante o passo selectivo foi calculado a partir da alteração na razão conjunto:myc antes e após selecção. A FIGURA 17 é uma fotografia que ilustra a tradução de moldes de ARN de myc. Utilizaram-se os ligantes seguintes: pistas 1-4, dA27dCdCP; pistas 5-8, dA27rCrCP; e pistas 9-12, dA2iC9C9C9dAdCdCP. Em cada pista, a concentração de molde de ARN era de 600 nM, e utilizou-se 35S-Met para marcação. As condições reaccionais eram como se segue: pistas 1, 5, e 9, 30°C durante 1 hora; pistas 2, 6, e 10, 30°C durante 2 horas; pista 3, 7, e 11, 30°C durante 1 hora, -20°C durante 16 horas; e pistas 4, 8, e 12, 30°C durante 1 hora, -20°C durante 16 horas com Mg2+ 50 mM. Nesta Figura, "A" representa péptido livre, e "B" representa fusão ARNm-péptido. A FIGURA 18 é uma fotografia que ilustra a tradução de moldes de ARN de myc marcados com 32P. O ligante utilizado era dA2iC9C9C9dAdCdCP. A tradução foi realizada a 30 °C durante 90 minutos e as incubações foram realizadas a -20°C durante 2 dias, sem Mg2+ adicional. As concentrações de moldes de ARNm eram 400 nM (pista 3), 200 nM (pista 4), 100 nM (pista 5), e 100 nM (pista 6) . A pista 1 mostra a fusão ARNm-péptido marcada com 35S-Met. A pista 2 mostra ARNm marcado com 32P. Na pista 6, a reacção foi realizada na presença de análogo protector 0,5 mM. A FIGURA 19 é uma fotografia que ilustra a tradução do molde de ARN de myc utilizando lisado obtido da Ambion (pista 1), Novagen (pista 2) e Amersham (pista 3). O ligante utilizado era dA27dCdCP. A concentração do molde era 600 nM e utilizou-se 35S-Met para marcação. As traduções foram realizadas a 30°C durante 1 hora e as incubações foram realizadas a -20°C durante a noite, na presença de Mg2+ 50 mM.

Descreve-se aqui um método geral para a selecção de proteínas com funções desejadas, utilizando fusões em que estas proteínas estão ligadas de forma covalente aos seus 20 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ próprios ARN mensageiros. Estas fusões ARN-proteína são sintetizadas por tradução in vitro ou in vivo de conjuntos de ARNm contendo um aceitador peptídico ligado às suas extremidades 3' (Figura 1B) . Numa concretização preferida, após leitura do quadro de leitura aberta da mensagem, o ribossoma pausa quando alcança o local de pausa concebido e a porção aceitadora ocupa o local A ribossómico e aceita a cadeia de péptido nascente do peptidil-ARNt no local P para produzir a fusão ARN-proteína (Figura 1C). A ligação covalente entre a proteína e o ARN (na forma de uma ligação amida entre a extremidade 3' do ARNm e o terminal C da proteína que codifica) permite que a informação genética na proteína seja recuperada e amplificada (e.g. por PCR) após selecção por transcrição inversa do ARN. Uma vez gerada a fusão, a selecção ou enriquecimento é realizado com base nas propriedades da fusão ARNm-proteína ou, alternativamente, pode-se realizar transcrição inversa utilizando o molde de ARNm, enquanto este está ligado à proteína, para evitar qualquer efeito do ARN de cadeia simples na selecção. Quando se utiliza a construção ARNm-proteína, as fusões seleccionadas podem ser testadas para determinar qual a porção (a proteína, o ARN ou ambos) que proporciona a função desejada.

Numa concretização preferida, a puromicina (que se assemelha a tirosiladenosina) actua como aceitador para ligar o péptido crescente ao seu ARNm. A puromicina é um antibiótico que actua terminando o alongamento do péptido. Como mimético de aminoacilo-ARNt ele actua como um inibidor universal da síntese de proteína ligando o local A, aceitando a cadeia peptídica crescente e saindo do ribossoma (a uma Kd = 10-4 M) (Traut e Monro, J. Mol. Biol. 10:63 (1964); Smith et al. , J. Mol. Biol. 13:617 (1965)). Uma das características mais atractivas da puromicina é o facto de ela formar uma ligação amida estável com a cadeia peptidica crescente, permitindo assim fusões mais estáveis do que os aceitadores potenciais que formam ligações éster instáveis. Em particular, a molécula de peptidil-puromicina contém uma ligação amida estável entre o pétido e a porção de O-metiltirosina da puromicina. A O-metilt irosina, por sua vez, está ligada por uma ligação amida estável ao grupo 3'-amino da porção de adenosina modificada da puromicina. 21 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Outras escolhas adequadas para aceitadores incluem estruturas do tipo ARNt na extremidade 3' do ARNm, bem como outros componentes que actuam de um modo semelhante à puromicina. Estes compostos incluem, sem limitação, qualquer composto que possui um aminoácido ligado a uma adenina ou um composto do tipo adenina, tal como os nucleótidos de aminoácido fenilalaniladenosina (A-Phe), tirosiladenosina (A-Tyr), e alaniladenosina (A-Ala), bem como estruturas ligadas a amida, tais como fenilalanil-3'-desoxi-3'- aminoadenosina, alanil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina e tirosil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina; em qualquer destes compostos, pode-se utilizar qualquer dos L-aminoácidos que ocorrem naturalmente, ou os seus análogos. Adicionalmente, também se pode utilizar na invenção um conjugado de estrutura 3' , tipo ARNt-puromicina combinado.

Na Figura 2 apresenta-se um esquema de selecção preferido de acordo com a invenção. Os passos envolvidos nesta selecção são geralmente realizados como se segue.

Passo 1. Preparação do molde de ADN. Como um passo para a produção de fusões ARN-proteína da invenção, a porção de ARN da fusão é sintetizada. Isto pode ser conseguido por síntese química de ARN directa ou, mais usualmente, é realizado por transcrição de um molde de ADN de cadeia dupla adequado.

Estes moldes de ADN podem ser criados por qualquer técnica convencional (incluindo qualquer técnica de tecnologia de ADN recombinante, síntese química ou ambos). Em princípio, pode-se utilizar para este fim qualquer método que permita a produção de um ou mais moldes contendo uma sequência conhecida, aleatória, modificada aleatoriamente ou submetida a mutagénese. Numa abordagem particular, um oligonucleótido (por exemplo contendo bases aleatórias) é sintetizado e amplificado (por exemplo por PCR), antes da transcrição. Também se pode utilizar síntese química para produzir uma cassete aleatória que é então inserida no meio de uma sequência codificante de uma proteína conhecida (veja-se, por exemplo, capítulo 8.2, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons e Greene Publishing Company, 1994) . Esta última abordagem produz uma densidade elevada de mutações em torno de um local de interesse específico na proteína. 22 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Uma alternativa à modificação aleatória total de uma sequência molde de ADN é a modificação aleatória parcial, e um conjunto sintetizado deste modo é geralmente designado por conjunto "dopado". Um exemplo desta técnica, realizada numa sequência de ARN é descrito, por exemplo, por Ekland et al. (Nucl. Acids Research 23:3231 (1995)). A modificação aleatória parcial pode ser realizada quimicamente desviando as reacções de síntese de um modo tal que cada mistura de reacção de adição de bases contém um excesso de uma base e pequenas quantidades de cada um das outras; controlando cuidadosamente as concentrações das bases, pode-se conseguir uma frequência de mutação desejada, por esta abordagem. Os conjuntos parcialmente modificados aleatoriamente podem também ser gerados utilizando técnicas de PCR propensas a erro, por exemplo, como descrito em Beaudry e Joyce (Science 257:635 (1992)) e Bartel e Szostak (Science 261:1411 (1993)).

Estão também disponíveis vários métodos para produzir uma construção de ADN começando com uma sequência conhecida e criando um conjunto de ADN alterado por mutagénese. Exemplos destas técnicas estão descritos em Ausubel et al. (supra, capítulo 8) e Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, capítulo 15, Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, 2a ed. (1989)). As sequências aleatórias podem também ser produzidas pela técnica de "vaivém" descrita em Stemmer (Nature 370: 389 (1994)).

Para optimizar um esquema de selecção da invenção, as sequências e estruturas nas extremidades 5' e 3' de um molde também podem ser alteradas. De preferência, isto é realizado em duas selecções separadas, cada uma envolvendo a inserção de domínios aleatórios no molde, próximo da extremidade adequada, seguido de selecção. Estas selecções podem servir (i) para maximizar a quantidade de fusão realizada (e assim para maximizar a complexidade de uma biblioteca), ou (ii) para proporcionar sequências de tradução optimizadas. Além disso, o método por der aplicado em geral, combinado com PCR mutagénica, para optimização de moldes de tradução tanto nas regiões codificantes, como não codificantes. 23 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Passo 2. Produção de ARN. Como referido acima, a porção de ARN de uma fusão ARN-proteina pode ser sintetizada quimicamente utilizando técnicas convencionais de síntese de oligonucleótidos. Alternativamente e em particular quando se utilizam sequências de ARN maiores, a porção de ARN é produzida por transcrição in vitro de um molde de ADN. Numa abordagem preferida, utiliza-se polimerase de T7 para produzir enzimaticamente a cadeia de ARN. Outras polimerases de ARN adequadas para esta utilização incluem, sem limitação, as polimerases de ARN de SP6, T3 e E. coli (descritas, por exemplo, em Ausubel et al. (supra, capítulo 3). Adicionalmente, o ARN sintetizado pode ser total ou parcialmente ARN modificado. Num exemplo particular, pode-se produzir ARN fosforotioato (por exemplo, por transcrição de T7) utilizando ribonucleótidos modificados e técnicas convencionais. Este ARN modificado tem a vantagem de ser estável a nucleases.

Passo 3. Ligação de puromicina ao molde. Em seguida, a puromicina (ou qualquer outro aceitador peptídico adequado) é ligada de forma covalente à sequência molde. Este passo pode ser realizado utilizando ARN-ligase de T4 para ligar a puromicina directamente à sequência de ARN ou, de preferência, a puromicina pode ser ligada por meio de uma "tira" de ADN utilizando ADN-ligase de T4 ou qualquer outra enzima que é capaz de ligar duas sequências de nucleótidos uma à outra (veja-se Figura 1B) (veja-se também, por exemplo, Ausubel et al., supra, capítulo 3, secções 14 e 15). As ARNt-sintetases também podem ser utilizadas para ligar compostos tipo puromicina a ARN. Por exemplo, a fenilalanil-ARNt-sintetase liga a fenilalanina a moléculas de fenilalanil-ARNt contendo um grupo amino 3', produzindo moléculas de ARN com extremidades 3' do tipo puromicina (Fraser e Rich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70:2671 (1973)). Outros aceitadores peptídicos que podem ser utilizados incluem, sem limitação, qualquer composto que possui um aminoácido ligado a uma adenina ou um composto do tipo adenina, tais como os nucleótidos de aminoácidos, fenilalaniladenosina (A-Phe), tirosiladenosina (A-Tyr), e alaniladenosina (A-Ala), bem como estruturas ligadas a amida, tais como fenilalanil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina, alanil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina e tirosil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina; em qualquer destes compostos, 24 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ pode-se utilizar qualquer dos L-aminoácido que ocorrem naturalmente, ou os seus análogos. Estão descritos vários aceitadores peptídicos, por exemplo, em Krayevsky e Kukhanova, Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 23:1 (1979) .

Passo 4. Produção e recuperação de fusões ARN-proteína. Para produzir fusões ARN-proteína pode-se utilizar qualquer sistema de tradução in vitro ou in situ. Como se mostra a seguir, preferem-se os sistemas eucarióticos e dois sistemas particularmente preferidos incluem os sistemas de lisado de gérmen de trigo e de reticulócitos. Em princípio, no entanto, qualquer sistema de tradução que permita a formação de uma fusão ARN-proteína e que não degrade significativamente a porção de ARN da fusão é útil na invenção. Além disso, para reduzir a degradação do ARN em qualquer destes sistemas, podem-se incluir na mistura de reacção de tradução, oligonucleótidos de sentido inverso que bloqueiam a degradação; estes oligonucleótidos hibridam especificamente com e cobrem sequências na porção de ARN da molécula que desencadeia a degradação (veja-se, por exemplo, Hanes e Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sei USA 94:4937 (1997)).

Como referido acima, qualquer número de sistemas de tradução eucarióticos está disponível para utilização na presente invenção. Estes incluem, sem limitação, lisados de levedura, ascites, células de tumor (Leibowitz et al., Meth. Enzymol. 194:536 (1991)), e ovos de oócito de Xenopus. Sistemas de tradução in vitro úteis de sistemas bacterianos incluem, sem limitação, os descritos em Zubay (Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973)); Chen e Zubay (Meth. Enzymol. 101:44 (1983)); e Ellman (Meth. Enzymol. 202:301 (1991)).

Adicionalmente, as reacções de tradução podem ser realizadas in situ. Num exemplo particular, a tradução pode ser realizada injectando ARNm em ovos de Xenopus, utilizando técnicas convencionais.

Uma vez produzidas, as fusões ARN-proteína podem ser recuperadas da mistura de reacção de tradução por qualquer técnica convencional de purificação de proteína ou ARN. Tipicamente, utilizam-se técnicas de purificação de proteína. 25 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Como se mostra a seguir, por exemplo, a purificação de uma fusão pode ser facilitada pela utilização de reagentes cromatográf icos adeguados, tais como dT25-agarose ou tiopropil-Sepharose. A purificação, no entanto, pode envolver também, ou alternativamente, a purificação baseada na porção de ARN da fusão; técnicas para esta purificação estão descritas, por exemplo, em Ausubel et al. (supra, capitulo 4).

Passo 5. Selecção da fusão ARN-proteína desejada. A selecção de uma fusão ARN-proteina desejada pode ser conseguida por gualquer meio disponível para separar ou isolar selectivamente uma fusão desejada a partir de uma população de fusões candidatas. Exemplos de técnicas de isolamento incluem, sem limitação, ligação selectiva, por exemplo, a um parceiro de ligação que está imobilizado directa ou indirectamente numa coluna, pérola, membrana ou outro suporte sólido e imunoprecipitação utilizando um anticorpo específico para a porção de proteína da fusão. A primeira destas técnicas utiliza um motivo de selecção imobilizado que pode consistir de qualquer tipo de molécula com a qual se pode estabelecer ligação. Uma lista de moléculas de motivo de selecção possíveis é apresentada na Figura 2. A selecção também pode basear-se na utilização de moléculas de substrato ligadas a um marcador de afinidade (por exemplo, substrato-biotina) que reagem com uma molécula candidata, ou por qualquer outro tipo de interacção com uma molécula de fusão. Adicionalmente, as proteínas podem ser seleccionadas com base na sua actividade catalítica, de um modo análogo ao descrito por Bartel e Szostak para o isolamento de enzimas de ARN (supra); de acordo com essa técnica particular, as moléculas desejadas são seleccionadas com base na sua capacidade para ligar uma molécula alvo a elas próprias e as moléculas funcionais são então isoladas com base na presença desse alvo. Os esquemas de selecção para isolar proteínas catalíticas novas ou melhoradas utilizando esta mesma abordagem ou qualquer outra selecção funcional são proporcionados pela presente invenção.

Além disso, como aqui descrito, a selecção de uma fusão ARN-proteína desejada (ou a sua cópia de ADN) pode ser facilitada por enriquecimento dessa fusão num conjunto de moléculas candidatas. Para realizar este enriquecimento óptimo, uma população de fusões ARN-proteína candidatas é 26 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ contactada com um parceiro de ligação (por exemplo, um dos parceiros de ligação acima descritos) que é especifico, ou para a porção de ARN, ou para a porção de proteína da fusão, sob condições que separam substancialmente o complexo de fusão de parceiro de ligação de membros não ligados na amostra. Este passo pode ser repetido e a técnica inclui de preferência pelo menos dois passos de enriquecimento sequenciais, um em que as fusões são seleccionadas utilizando um parceiro de ligação específico para a porção de ARN e outro em que as fusões são seleccionadas utilizando um parceiro de ligação específico para a porção de proteína. Adicionalmente, quando se repetem passos de enriquecimento direccionados para a mesma porção da fusão (por exemplo, a porção de proteína), utilizam-se de preferência diferentes parceiros de ligação. Num exemplo particular aqui descrito, uma população de moléculas é enriquecida nas fusões desejadas utilizando primeiro um parceiro de ligação específico para a porção de ARN da fusão e em seguida, em dois passos sequenciais, utilizando dois parceiros de ligação diferentes, sendo ambos específicos para a porção de proteína da fusão. Mais uma vez, estes complexos podem ser separados dos componentes da amostra por qualquer técnica de separação convencional, incluindo, sem limitação, cromatografia de afinidade em coluna, centrifugação ou imunoprecipitação.

Além disso, a eluição de uma fusão ARN-proteína de um complexo de enriquecimento (ou selecção) pode ser realizada de várias formas. Por exemplo, como aqui descrito, pode-se utilizar um passo de eluição química desnaturante ou não específico para isolar uma fusão ARN-proteína desejada. Este passo facilita a libertação de componentes complexos uns dos outros, ou de um suporte sólido associado, de um modo relativamente não específico, degradando ligações não covalentes entre os componentes e/ou entre os componentes e o suporte sólido. Como descrito aqui, um exemplo de reagente de eluição química desnaturante ou não específico é H0Ac/H20 a 4%. Outros exemplos de reagentes de eluição química desnaturantes ou não específicos incluem guanidina, ureia, concentração elevada de sal, detergente ou qualquer outro meio pelo qual se podem remover em geral aductos não covalentes. Alternativamente, pode-se utilizar uma abordagem de eluição química específica em que se explora um químico que origina a 27 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ libertação específica de uma molécula de fusão. Num exemplo particular, se o ramo ligante de uma proteína de fusão desejada contém uma ou mais ligações dissulfureto, podem-se eluir aptâmeros de fusão ligados por adição, por exemplo, de DTT, resultando na redução da ligação dissulfureto e libertação do alvo ligado.

Alternativamente, a eluição pode ser realizada rompendo especificamente complexos de afinidade; estas técnicas libertam selectivamente componentes complexos por adição de um excesso de um membro do complexo. Por exemplo, numa selecção de ligação de ATP, a eluição é realizada por adição de excesso de ATP à mistura de incubação. Por fim, pode-se realizar um passo de eluição enzimática. Por esta abordagem, uma molécula ligada cliva ela própria, ou uma protease adicionada exogenamente (ou outra enzima hidrolítica adequada) e liberta ou o alvo, ou a enzima. Num exemplo particular, pode-se incluir um local alvo de protease em qualquer dos componentes do complexo e as moléculas ligadas podem ser eluídas por adição da protease. Alternativamente, numa selecção catalítica, a eluição pode ser utilizada como um passo de selecção para isolar moléculas capazes de se libertar (por exemplo clivando) a elas próprias de um suporte sólido.

Passo 6. Produção de uma cópia de ADN da sequência de ARN utilizando transcriptase inversa Se desejado, uma cópia de ADN de uma sequência de fusão de ARN seleccionada é facilmente disponibilizada por transcrição inversa dessa sequência de ARN, utilizando qualquer técnica convencional (por exemplo, utilizando transcriptase inversa Superscript). Este passo pode ser realizado antes do passo de selecção ou enriquecimento (por exemplo, como descrito na Figura 16), ou após esse passo. Alternativamente, o processo de transcrição inversa pode ser realizado antes do isolamento da fusão a partir da mistura de tradução in vitro ou in situ.

Em seguida, o molde de ADN é amplificado, quer como sequência de cadeia dupla parcial, quer de tamanho total. De preferência, neste passo, produzem-se moldes de ADN de tamanho total, utilizando oligonucleótidos adequados e amplificação por PCR. 28 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Estes passos e os reagentes e técnicas para realizar estes passos são agora descritos em detalhe, utilizando exemplos particulares. Estes exemplos são proporcionados para fins de ilustração da invenção e não deverão ser entendidos como limitativos.

PRODUÇÃO DE MOLDES PARA FUSÕES ARN-PROTEÍNA

Como se pode ver nas Figuras IA e 2, o esquema de selecção da presente invenção utiliza de preferência moldes de ADN de cadeia dupla que incluem um número de elementos de concepção. 0 primeiro destes elementos é um promotor a ser utilizado em conjunção com uma polimerase de ARN desejada para síntese de ARNm. Como se pode ver na Figura IA e descrito aqui, o promotor T7 é preferido, embora se possa utilizar qualquer promotor capaz de dirigir a síntese de um ADN de cadeia dupla, linear. 0 segundo elemento do molde apresentado na Figura IA é designado por região 5' não traduzida (ou 5'UTR) e corresponde ao ARN a montante do local de iniciação da tradução. Na Figura IA é apresentada uma 5'UTR preferida (designada por "TE") que é um mutante de eliminação da região 5' não traduzida do vírus de mosaico de tabaco e, em particular, corresponde às bases directamente 5' do início da tradução TMV; a sequência desta UTR é como se segue: rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA (sendo os primeiros 3 nucleótidos G inseridos para aumentar a transcrição) (SEQ ID N0:5). Pode-se utilizar qualquer outra 5' UTR adequada (veja-se, por exemplo, Kozak, Microbiol. Rev. 47:1 (1983)). 0 terceiro elemento apresentado na Figura IA é o local de início da tradução. Em geral, este é um codão AUG. No entanto, há exemplos em que se utilizam codões além do AUG em sequências codificantes que ocorrem naturalmente e estes codões também podem ser utilizados no esquema de selecção da invenção. 0 quarto elemento na Figura IA é o quadro de leitura aberta da proteína (designada por ORF) que codifica para a sequência de proteína. Este quadro de leitura aberta pode codificar para qualquer sequência de proteína que ocorre 29 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ naturalmente, aleatória, modificada aleatoriamente, submetida a mutagénese ou totalmente sintética. O quinto elemento apresentado na Figura IA é a região constante 3' . Esta sequência facilita a amplificação por PCR das sequências do conjunto e a ligação do oligonucleótido contendo puromicina ao ARNm. Se desejado, esta região pode também incluir um local de pausa, uma sequência que faz com que o ribossoma pause, permitindo assim um tempo adicional para que uma porção aceitadora (por exemplo puromicina) aceite uma cadeia de péptido nascente do peptidil-ARNt; este local de pausa é discutido em mais detalhe a seguir.

Para desenvolver a presente metodologia, produziram-se inicialmente fusões ARN-proteina utilizando moldes de ARNm altamente simplificados contendo 1-2 codões. Esta abordagem foi seguida por dois motivos. Primeiro, os moldes deste tamanho podiam ser construídos facilmente por síntese química. Segundo um pequeno quadro de leitura aberta permitiu determinar facilmente características críticas da reacção, incluindo eficiência de ligação, heterogeneidade terminal, dependência do molde e precisão da tradução.

Concepção da construção. Utilizou-se uma construção básica para produzir fusões ARN-proteina de teste. A molécula consistia de um ARNm contendo uma sequência de Shine-Dalgarno (SD) para iniciação da tradução, que continha uma eliminação de 3 bases da sequência de SD da proteína ribossómica LI e que era complementar a 5 bases do ARNr 16S (i.e., rGrGrA rGrGrA rCrGrA rA) (SEQ ID NO: 6) (Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982); Shine e Dalgarno, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 71:1342-1346 (1974); e Steitz e Jakes, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 72:4734-4738 (1975)), (ii) um codão de iniciação AUG, (iii) um ligante de ADN para actuar como local de pausa (i.e., 5'-(dA)27), (iv) dCdC-3', e (v) uma puromicina 3' (P). A sequência poli dA foi escolhida pois é conhecido que é um fraco molde de ARNt no local A (Morgan et al., J. Mol. Biol. 26:477-497 (1967); Ricker e Kaji, Nucleic Acid Research 19:6573-6578 (1991)) e foi concebida para actuar como um bom local de pausa. O tamanho do ligante oligo dA foi escolhido para abranger a distância de -60-70 Á entre o local de descodificação e o centro de transferência de peptidilo do 30 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ ribossoma. Ο dCdCP mimetizava a extremidade CCA de um ARNt e foi concebido para facilitar a ligação da puromicina ao local A do ribossoma. Síntese química do molde mínimo 43-P. Para sintetizar a construção 43-P (apresentada na Figura 3) , a puromicina foi primeiro ligada a um suporte sólido de um modo tal que fosse compatível com a química de síntese de oligonucleótidos de fosforamidito, convencional. O protocolo de síntese para este oligo está delineado esquematicamente na Figura 3 e está descrito em maior detalhe a seguir. Para ligar a puromicina a um suporte sólido de vidro de poro controlado (CPG) , o grupo amino foi protegido com um grupo trifluoroacetilo, como descrito no folheto do utilizador #49 da Applied Biosystems para o sintetizador de ADN modelo 380 (1988) . Em seguida, a protecção do 5'OH foi realizada utilizando uma abordagem DMT-C1 convencional (Gait, Oligonucleotide Synthesis a practical Approach The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)), e a ligação a amino-hexilo CPG através do 2'-OH foi efectuada exactamente do mesmo modo que o 3'-OH seria utilizado para ligação de um desoxinucleósido (veja-se Fig. 3 e Gait, supra, p. 47). A puromicina protegida ligada a 5' DMT-CPG- era então adequada para alongamento da cadeia com monómeros de fosforamidito. A síntese do oligo prosseguiu na direcção 3' -> 5', pela ordem: (i) 3' puromicina, (ii) pdCpdC, (iii) ~27 unidades de dA como um ligante, (iv) AUG, e (v) a sequência de Shine-Dalgarno. A sequência da construção 43-P é apresentada a seguir. Síntese de CPG-puromicina. A síntese de CPG-puromicina protegida seguiu a via geral utilizada para desoxinucleósidos, como descrito anteriormente (Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)). As principais diferenças incluíam a selecção de um grupo bloqueador de N adequado, ligação no 2'-OH ao suporte sólido, e reacção de ligação ao suporte sólido. No caso da última, a reacção foi realizada a concentrações muito baixas de nucleótido activado, dado que este material era significativamente mais valioso que o suporte sólido. O rendimento resultante (—20 pmol/g suporte) era bastante satisfatório, considerando as condições de reacção diluída. 31 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ Síntese_de_N-trifluoroacetilpuromicina. 2 67 mg (0,490 mmol) de puromicina*HCl foram primeiro convertidas na forma de base livre dissolvendo em água, adicionando tampão carbonato pH 11 e extraindo (3X) em clorofórmio. A fase orgânica foi evaporada até à secura e pesada (242 mg, 0,513 mmol). A base livre foi então dissolvida em 11 ml piridina seca e 11 ml de acetonitrilo seco e adicionaram-se, com agitação, 139 μΐ (2,0 mmol) de trietilamina (TEA) e 139 μΐ (1,0 mmol) de anidrido trifluoroacético (TFAA) . O TFAA foi então adicionado à solução turva em alíguotas de 20 μΐ, até não permanecer nenhum material de partida, tal como determinado por cromatografia em camada fina (tlc) (93:7, Clorofórmio/MeOH) (um total de 280 μΐ) . Deixou-se a reacção prosseguir durante 1 hora. Nesta altura, foram reveladas duas bandas por cromatografia em camada fina, ambas de mobilidade mais elevada do que o material de partida. O processamento da reacção com NH4OH e água reduziu o produto a uma única banda. Por cromatografia em sílica (93:7 ClorofÓrmio/MeOH) obtiveram-se 293 mg (0,515 mmol) do produto, N-TFA-Pur. O produto desta reacção é apresentado esquematicamente na Figura 4. Síntese de N-trifluoroacetil-5'-DMT-puromicina. O produto da reacção acima foi dividido em alíquotas e co-evaporado 2X com piridina seca, para remover a água. Prepararam-se vários tubos para testar múltiplas condições de reacção. Numa reacção em pequena escala, dissolveram-se 27,4 mg (48,2 pmol) de N-TFA-Pur em 480 μΐ de piridina contendo 0,05 eq de DMAP e 1,4 eq de TEA. A esta mistura, adicionaram-se 20,6 mg de cloreto de tritilo (60 μιτιοί) e deixou-se a reacção prosseguir até estar completa, com agitação. A reacção foi parada por adição de um volume igual de água (aproximadamente 500 μΐ) à solução. Uma vez que esta reacção parecia ser bem sucedida, fez-se uma versão em grande escala. Em particular, dissolveram-se 2 62 mg (0,4 67 mmol) de N-TFA-Pur em 2,4 ml de piridina, seguido de adição de 1,4 eq de TEA, 0,05 eq de DMAP e 1,2 eq de cloreto de tritilo. Após aproximadamente duas horas, adicionaram-se mais 50 mg (0,3 eq) de dimetoxitritilo*Cl (DMT*C1) e deixou-se a reacção prosseguir por mais 20 minutos. A reacção foi parada por adição de 3 ml de água e co-evaporada 3X com CH3CN. A reacção foi purificada 32 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ por Clorofórmio/MeOH a 95:5 numa coluna de 100 ml de sílica (seca) com 2 mm de diâmetro. Devido a purificação incompleta, correu-se uma segunda coluna idêntica com Clorofórmio/MeOH a 97,5:2,5. O rendimento total era de 325 mg ou 0,373 mmol (ou um rendimento de 72%) . O produto desta reacção é apresentado esquematicamente na Figura 4. Síntese_de_N-trif luoroacetil-5' -DMT-2' -succinil-

puromicina. Numa reacção em pequena escala combinaram-se 32 mg (37 pmol) do produto sintetizado acima com 1,2 eq de DMAP dissolvido em 350 μΐ de piridina. A esta solução adicionaram-se 1,2 equivalentes de anidrido succínico em 44 μΐ de CH3CN seco e deixou-se a agitar durante a noite. A cromatografia em camada fina revelou pouca quantidade de material de partida remanescente. Numa reacção em grande escala, combinaram-se 292 mg (336 μιτιοί) do produto anterior com 1,2 eq de DMAP em 3 ml de piridina. A este, adicionaram-se 403 μΐ de anidrido succínico 1M em CH3CN seco e deixou-se a mistura a agitar durante a noite. A cromatografia em camada fina revelou mais uma vez pouca quantidade de material de partida remanescente. As duas reacções foram combinadas e adicionaram-se mais 0,2 eq de DMAP e succinato. O produto foi co-evaporado com tolueno IX e seco até uma espuma amarela em vácuo elevado. Adicionou-se CH2CI2 (20 ml) e esta solução foi extraída duas vezes com 15 ml de ácido acético a 10% arrefecido em gelo e em seguida duas vezes com água pura. O produto foi seco, redissolvido em 2 ml de CH2CI2 e precipitado por adição de 50 ml de hexano, com agitação. O produto foi então agitado num vórtex e centrifugado a 600 rpm durante 10 minutos na centrífuga clínica. A maioria do eluente foi removida e o resto do produto foi seco, primeiro sob baixo vácuo, em seguida sob alto vácuo, num exsicador. O rendimento desta reacção era de aproximadamente 260 pmol para um rendimento faseado de -70%. Síntese_de_N-trif luoroacetil-5' -DMT-2' succinil-CPG- puromicina. O produto do passo anterior foi em seguida dissolvido com 1 ml de dioxano seguido de 0,2 ml de dioxano/0,2 ml de piridina. A esta solução, adicionaram-se 40 mg de p-nitrofenol e 140 mg de diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) e deixou-se a reacção prosseguir durante 2 horas. A ciclo-hexilureia insolúvel produzida pela reacção foi removida 33 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ por centrifugação e a solução de produto foi adicionada a 5 g de vidro de poro controlado (CPG) de amino-hexilo, suspensa em 22 ml de DMF seca e agitada durante a noite. A resina foi então lavada com DMF, metanol, e éter e seca. A resina resultante foi testada revelando conter 22,6 pmol de tritilo por g, o que está bem dentro da gama aceitável para este tipo de suporte. 0 suporte foi então protegido por incubação com 15 ml de piridina, 1 ml de anidrido acético e 60 mg de DMAP, durante 30 minutos. O material de coluna resultante produziu um teste de ninidrina negativo (sem cor) ao contrário dos resultados obtidos antes do bloqueio, em que o material produziu uma reacção de cor azul escura. O produto desta reacção é apresentado esquematicamente na Figura 4. Síntese de conjugado ARNm-puromicina. Como discutido acima, pode-se utilizar um oligo com ligante puromicina em qualquer um de dois modos para gerar um conjugado ARNm-puromicina que actua como um molde de tradução. Para fases de leitura extremamente curtas, o oligo de puromicina é tipicamente alongado quimicamente com monómeros de ARN ou ADN, para criar um molde totalmente sintético. Quando se pretendem quadros de leitura aberta maiores, o oligo de ARN ou ADN é geralmente ligado à extremidade 3' de um ARNm utilizando uma tira de ADN e ADN-ligase de T4, como descrito por Moore e Sharp (Science 256:992 (1992)).

TRADUÇÃO IN VITRO E TESTE DE FUSÕES ARN-PROTEÍNA

Os moldes produzidos acima foram traduzidos in vitro utilizando sistemas de tradução in vitro, quer bacterianos, quer eucarióticos, como se segue.

Tradução in vitro de moldes mínimos. Adicionou-se 43-P e conjugados ARN-puromicina relacionados a vários sistemas de tradução in vitro diferentes, incluindo: (i) o sistema S30 derivado de E.coli MRE600 (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen e Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, in Transcription and

Translation: A Practical Approach, B.D. Hammes, S.J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) pp. 179-209; e Ellman et al.,

Methods Enzymol. 202:301 (1991)) preparado como descrito por

Ellman et al. (Methods Enzymol. 202:301 (1991)); (ii) a 34 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ fracção ribossómica derivada da mesma estirpe, preparada como descrito por Kudlicki et al. (Anal. Chem. 206:389 (1992)); e (iii) o sistema S30 derivado de E. coli BL21, preparado como descrito por Lesley et al. (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)). Em cada caso, a pré-mistura utilizada era a de Lesley et al. (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)), e as incubações tinham uma duração de 30 minutos.

Teste da natureza da fusão. O molde 43-P foi primeiro testado utilizando extractos de tradução S30 de E. coli. A Figura 5 (reacção "A") mostra a reacção intramolecular desejada (cis) em que o 43-P se liga ao ribossoma e actua ao mesmo tempo como um molde para, e um aceitador de fMet. A incorporação de 35S-metionina e a sua posição no molde foram primeiro testadas e os resultados são apresentados nas Figuras 6A e 6B. Após extracção da mistura de reacção de tradução in vitro com fenol/clorofórmio e análise dos produtos por SDS-PAGE, surgiu uma banda marcada com 35S com a mesma mobilidade que o molde 43-P. A quantidade deste material sintetizado era dependente da concentração de Mg2+ (Figura 6A). A concentração óptima de Mg2+ parecia ser entre 9 e 18 mM, o que era semelhante ao óptimo para tradução neste sistema (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen e Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, in Transcription and Translation: A Practical Approach, B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) pp. 179-209; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991); Kudlicki et al., Anal. Chem. 206:389 (1992); e Lesley et al., J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)). Adicionalmente, o marcador incorporado era estável a tratamento com NH4OH (Figura 6B) , indicando que o marcador estava localizado na metade 3' da molécula (a porção de ADN estável a base) e estava ligado por uma ligação estável a base, como esperado para uma ligação amida entre puromicina e fMet.

Dependência do ribossoma e do molde. Para demonstrar que a reacção observada acima ocorreu no ribossoma, testaram-se os efeitos de inibidores específicos da função peptidiltransferase do ribossoma (Figura 6C) e analisou-se o efeito de alterar a sequência que codifica para metionina (Figura 6D) . A Figura 6C demonstra claramente que a reacção era fortemente inibida pelos inibidores de 35 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ peptidiltransferase, virginiamicina, gougerotina e cloranfenicol (Monro e Vazquez, J. Mol. Biol. 28:161-165 (1967); e Vazquez e Monro, Biochemica et Biophysical Acta 142:155-173 (1967)). A Figura 6D mostra que a alteração de uma única base no molde de A para C eliminou a incorporação de 35S metionina a Mg2+ 9 mM e diminuiu-a bastante a 18 mM (o que é consistente com o facto de níveis elevados de Mg2+ levarem a erros de leitura da mensagem). Estas experiências demonstraram que a reacção ocorreu no ribossoma de um modo dependente do molde.

Tamanho do ligante. Também se testou a dependência da reacção no tamanho do ligante (Figura 6E) . 0 molde original foi concebido de modo a que o ligante abrangesse a distância desde o local descodificante (ocupado pelo AUG do molde) até ao local aceitador (ocupado pela porção de puromicina), uma distância que tinha aproximadamente o mesmo tamanho que a distância entre a laçada do anticodão e a haste aceitadora num ARNt, ou cerca de 60-70 Â. O primeiro ligante testado tinha 30 nucleótidos de comprimento, com base num mínimo de 3,4 Â por base (> 102 Â) . Na gama entre 30 e 21 nucleótidos (n = 27 -18; comprimento > 102 - 71 Â), observou-se pouca alteração na eficiência da reacção. Deste modo, o tamanho do ligante pode ser variado. Apesar de um ligante entre 21 e 30 nucleótidos representar um comprimento preferido, também se podem utilizar na invenção ligantes mais curtos que 80 nucleótidos e, de preferência, mais curtos que 45 nucleótidos.

Reacções intramoleculares versus intermoleculares. Por fim, testámos se a reacção ocorria de um modo intramolecular (Figure 5, Reacção "A") como desejado, ou intermolecularmente (Figura 5, Reacção "B"). Isto foi testado adicionando oligonucleótidos com 3' puromicina, mas sem sequência de ligação ao ribossoma (i.e., moldes 25-P, 13-P, e 30-P) às reacções de tradução contendo o molde 43-P (Figuras 6F, 6G, e 6H) . Se a reacção ocorreu por um mecanismo intermolecular, os oligos mais curtos também estarão marcados. Como se pode ver nas Figuras 6F-H, havia pouca incorporação de 35S metionina nos três oligos mais curtos, indicando que a reacção ocorreu essencialmente de um modo intramolecular. As sequências de 25-P (SEQ ID NO:10), 13-P (SEQ ID NO:9), e 30-P (SEQ ID N0:8) são apresentadas a seguir. 36 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Lisado de reticulócitos. A figura 6H mostra que a 35S-metionina pode ser incorporada no molde 43-P utilizando um lisado de reticulócitos de coelho (ver a seguir) para tradução in vitro, além dos lisados de E. coli utilizados acima. Esta reacção ocorreu essencialmente num mecanismo intramolecular, como desejado.

SÍNTESE E TESTE DE FUSÕES CONTENDO UM MARCADOR EPITÓPICO DE C-MYC

Também se produziram exemplos de fusões que continham, na porção de proteina, o marcador epitópico para o anticorpo monoclonal de c-myc 9E10 (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610 (1985)).

Concepção dos moldes. Foram concebidos três moldes iniciais de marcador epitópico (i.e., LP77, LP154, e conjunto #1) e estes são apresentados nas Figuras 7A-C. Os dois primeiros moldes continham a sequência de marcador epitópico de c-myc EQKLISEEDL (SEQ ID NO:2), e o terceiro molde era a concepção utilizada na síntese de um conjunto de selecção aleatório. O LP77 codificava para uma sequência de 12 aminoácidos, com os codões optimizados para tradução bacteriana. O LP154 e seus derivados continham uma sequência de ARNm de 33 aminoácidos em que os codões foram optimizados para tradução eucariótica. A sequência de aminoácidos codificada de MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO:7) correspondia ao péptido original utilizado para isolar o anticorpo 9E10. O conjunto #1 continha 27 codões de NNG/C (para produzir péptidos aleatórios) seguidos de uma sequência que corresponde aos últimos sete aminoácidos do péptido myc (que não faziam parte da sequência de epítopo de myc) . Estas sequências são apresentadas a seguir.

Sistemas de tradução in vitro de reticulócitos versus gérmen de trigo. Os moldes 43-P, LP77, e LP154 foram testados quer em sistemas de tradução de extractos de reticulócitos de coelho, quer de gérmen de trigo (Promega, Boehringer Mannheim) (Figura 8). As traduções foram realizadas a 30°C durante 60 minutos. Os moldes foram isolados utilizando dT25 agarose a 4°C. Os moldes foram eluídos da agarose utilizando NaOH 15 mM, 37 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ EDTA 1 mM, neutralizados com tampão NaOAc/HOAc, precipitados imediatamente com etanol (2,5 - 3 vol), lavados (com etanol a 100%), e secos num concentrador Speedvac. A Figura 8 mostra que a 35S metionina foi incorporada em todos os três moldes, em ambos os sistemas de gérmen de trigo e reticulócitos. Observou-se menos degradação do molde nas reacções de fusão do sistema de reticulócitos e, deste modo, este sistema é preferido para a produção de fusões ARN-proteina. Adicionalmente, em geral os sistemas eucarióticos são preferidos em relação aos sistemas bacterianos. Uma vez que as células eucarióticas tendem a conter níveis mais baixos de nucleases, os tempo de vida do ARNm são geralmente 10-100 vezes maiores nestas células do que em células bacterianas. Em experiências utilizando um sistema de tradução de E. coli particular, não se observou a produção de fusões utilizando um molde que codifica para o epítopo de c-myc; a marcação do molde em vários locais demonstrou que isso era provavelmente devido a degradação de ambas as porções de ARN e ADN do molde.

Para analisar a porção de péptido destas fusões, as amostras foram tratadas com ARNase para remover as sequências codificantes. Após este tratamento, o produto 43-P correu com uma mobilidade quase idêntica à do oligo 30-P marcado com 32P, o que é consistente com a adição de um péptido muito pequeno (talvez apenas metionina) a 30-P. Para LP77, a remoção da sequência codificante produziu um produto com uma mobilidade menor do que a do oligo 30-P, consistente com a noção de que um péptido de 12 aminoácidos foi adicionado à puromicina. Por fim, para o LP154, a remoção da sequência codificante produziu um produto de mobilidade ainda mais baixa, consistente com uma sequência de 33 aminoácidos ligada ao oligo 30-P. Não se observou nenhum oligo na pista de reticulócitos tratados com ARNase devido a um erro na carga. Na Figura 9, pode ver-se que a mobilidade deste produto é igual à do produto gerado no extracto de gérmen de trigo. Em resumo, estes resultados indicam que produtos resistentes a ARNase foram adicionados às extremidades dos oligos 30-P, que os tamanhos dos produtos eram proporcionais ao tamanho das sequências codificantes e que os produtos eram bastante homogéneos em tamanho.

Adicionalmente, embora ambos os sistemas tenham produzido 38 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ produtos de fusão semelhantes, o sistema de reticulócitos parecia ser superior devido a uma maior estabilidade do molde.

Sensibilidade a ARNase A e proteinase K. Na Figura 9, a sensibilidade a ARNase A e proteinase K foram testadas utilizando a fusão LP154. Como se pode ver nas pistas 2-4, a incorporação de 35S-metionina foi demonstrada para o molde LP154. Quando este produto foi tratado com ARNase A, a mobilidade da fusão diminuiu, mas era ainda significativamente mais elevada do que a do oligonucleótido 30-P marcado com 32P, consistente com a adição de um péptido de 33 aminoácidos à extremidade 3' . Quando este material também foi tratado com proteinase K, o sinal de 35S desapareceu completamente, mais uma vez consistente com a noção de que o marcador estava presente num péptido na extremidade 3' do fragmento 30-P. Obtiveram-se resultados semelhantes em experiências equivalentes, utilizando as fusões 43-P e LP77.

Para confirmar que a marcação do molde por 35S Met era uma consequência da tradução e, mais especificamente, que resultava da actividade de peptidiltransferase do ribossoma, analisou-se o efeito de vários inibidores na reacção de marcação. Os inibidores específicos de peptidiltransferase eucariótica, anisomicina, gougerotina e esparsomicina (Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, New York), pp. 312 (1979)), bem como os inibidores de translocação ciclo-heximida e emetina (Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, New York), pp. 312 (1979)) diminuíram todos a formação da fusão ARN-péptido em -95%, utilizando o molde de myc longo e um extracto de tradução de lisado de reticulócitos.

Experiências de imunoprecipitação. Numa experiência concebida para ilustrar a eficácia da imunoprecipitação de uma fusão ARNm-péptido, fez-se uma tentativa para imunoprecipitar um péptido c-myc isolado, produzido por tradução in vitro. A Figura 10 mostra os resultados destas experiências testadas num gel de péptidos de SDS PAGE. As pistas 1 e 2 mostram o material marcado de reacções de tradução contendo ou ARN124 (a porção de ARN de LP154) ou ARNm de β-globina. As pistas 3-8 mostram a imunoprecipitação destas amostras da reacção, utilizando o anticorpo monoclonal de c-myc 9E10, sob várias 39 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ condições tampão diferentes (descrito a seguir). As pistas 3-5 mostram que o péptido derivado de ARN124 foi eficazmente imunoprecipitado, sendo o melhor caso a pista 4, em que se isolou -83% das contagens totais precipitáveis com TCA. As pistas 6-8 mostram pouca proteína β-globina, indicando uma purificação >100 vezes. Estes resultados indicaram que o péptido codificado por ARN124 (e por LP154) pode ser isolado quantitativamente por este protocolo de imunoprecipitação.

Imunoprecipitação da fusão. Em seguida testámos a capacidade de imunoprecipitar um produto ARN-péptido quimérico, utilizando uma reacção de tradução de LP154 e o anticorpo monoclonal de c-myc 9E10 (Figura 11). Os produtos de tradução de uma reacção de reticulócitos foram isolados por imunoprecipitação (como aqui descrito) e tratados com 1 yg de ARNase A à temperatura ambiente, durante 30 minutos, para remover a sequência codificante. Isto produziu um 5'OH que foi marcado com 32P com polinucleótido-quinase de T4 e testado por PAGE desnaturante. A Figura 11 mostra que foi isolado um produto com uma mobilidade semelhante à observada para a fusão do epítopo de c-myc com 30-P gerada por tratamento da fusão LP154 com ARNase (ver acima) , mas não foi produzido nenhum produto correspondente quando apenas a porção de ARN do molde (ARN124) foi traduzida. Na Figura 12, a quantidade de proteínas de fusão isoladas foi determinada e representada graficamente contra a quantidade de 30-P não modificado (não apresentado nesta Figura). A quantificação da razão entre ligante não modificado e fusão ligante-péptido myc mostra que 0,2-0,7% da mensagem de entrada foram convertidos no produto de fusão. Uma fracção maior do ARN de entrada foi convertida em produto de fusão na presença de uma razão ribossoma/molde mais elevada; na gama de concentrações de ARNm de entrada que foram testadas, produziram-se aproximadamente 0,8-1,0 x 1012 moléculas de fusão por ml de extracto de tradução.

Adicionalmente, os nossos resultados indicaram que os péptidos ligados às espécies de ARN eram codificados por esse ARNm, i.e., o péptido nascente não foi transferido para a puromicina de outro ARNm. Não se observou nenhuma indicação de transferência cruzada quando um ligante (30-P) foi co-incubado com o molde de myc longo nos extractos de tradução, em razões tão elevadas quanto 20:1, nem a presença de ligante livre 40 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ diminuiu significativamente a quantidade de fusão myc longa produzida. De modo semelhante, a co-tradução dos moldes curto e longo, 43-P e LP154, produziu apenas os produtos de fusão observados quando os moldes foram traduzidos isolados e não se observou nenhum produto de mobilidade intermédia, como seria de esperar para uma fusão do molde curto com o péptido myc longo. Ambos estes resultados sugeriram que a formação da fusão ocorreu essencialmente entre um péptido nascente e ARNm ligado ao mesmo ribossoma.

Isolamento sequencial. Como posterior confirmação da natureza do produto do molde LP154 traduzido, analisámos o comportamento deste produto em dois tipos diferentes de meios cromatográficos. A tiopropil (TP)-Sepharose permite o isolamento de um produto que contém uma cisteina livre (por exemplo, o produto LP154 que tem um resíduo de cisteina adjacente ao terminal C) (Figura 13) . De igual modo, a dT25 agarose permite o isolamento de moldes que contêm uma sequência poli dA (por exemplo 30-P) (Figura 13). A Figura 14 mostra que o isolamento sequencial em TP-Sepharose seguido de dT25 agarose produziu o mesmo produto que o isolamento em dT25 agarose isolado. O facto de o produto de tradução in vitro conter quer uma característica poli-A, quer um tiol livre, era uma forte indicação de que o produto de tradução era a fusão ARN-proteína desejada.

Os resultados acima são consistentes com a capacidade de sintetizar fusões ARNm-péptido e de as recuperar intactas de extractos de tradução in vitro. As porções ou fusões de péptido assim sintetizadas pareciam ter as sequências pretendidas, como demonstrado por imunoprecipitação e isolamento utilizando técnicas cromatográficas adequadas. De acordo com os resultados apresentados acima, as reacções são intramoleculares e ocorrem de um modo dependente do molde. Por fim, mesmo com uma modificação do molde inferior a 1%, o presente sistema facilita selecções baseadas em complexidades de candidatos de cerca de 1013 moléculas.

Selecção da recuperação do epítopo de c-myc. Para seleccionar epitopos de c-myc adicionais, é produzida uma biblioteca grande de moldes de tradução (por exemplo, 1015 membros), contendo uma região modificada aleatoriamente 41 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ (veja-se Figura 17C e a seguir). Esta biblioteca é utilizada para produzir ~1012 - 1013 fusões (como aqui descrito) que são tratadas com o anticorpo anti-c-myc (por exemplo por imunoprecipitação ou utilizando um anticorpo imobilizado numa coluna ou outro suporte sólido) para se obter um enriquecimento em moldes que codificam para c-myc, em ciclos repetidos de selecção in vitro.

Modelos para formação de fusões. Sem estar cingido a nenhuma teoria particular, propomos um modelo para o mecanismo de formação de uma fusão, em que a tradução se inicia normalmente e o alongamento prossegue até ao fim do quadro de leitura aberta. Quando o ribossoma atinge a porção de ADN do molde, a tradução bloqueia. Nesta altura, o complexo pode seguir dois destinos: dissociação do péptido nascente ou transferência do péptido nascente para a puromicina na extremidade 3' do molde. A eficiência da reacção de transferência é provavelmente controlada por vários factores que influenciam a estabilidade do complexo de tradução bloqueado e a entrada do residuo 3'-puromicina no local A do centro de peptidiltransferase. Após a reacção de transferência, a fusão ARNm-péptido provavelmente permanece complexada com o ribossoma, uma vez que os factores de libertação conhecidos não podem hidrolisar a ligação amida estável entre os domínios de ARN e péptido.

Quer o modelo clássico para alongamento (Watson, Buli. Soc. Chim. Biol. 46:1399 (1964)) e o modelo dos estados intermédios (Moazed e Noller, Nature 342:142 (1989)) requerem que o local A esteja vazio para a entrada de puromicina no centro de peptidiltransferase. Para que a puromicina entre no local A vazio, o ligante deve ou fazer uma laçada em torno do exterior do ribossoma, ou passar directamente do local descodificante através do local A, para o centro da peptidiltransferase. Os dados aqui descritos não distinguem claramente entre estas alternativas, pois o ligante mais curto testado (21 nt) é ainda suficientemente grande passar em torno do exterior do ribossoma. Nalguns modelos da estrutura do ribossoma (Frank et al., Nature 376:441 (1995)), o ARNm passa através de um canal que se estende de cada lado do local descodificante, caso em que seria necessário retirar o ligante 42 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ do canal para permitir que a puromicina atingisse o centro de peptidiltransferase através do local A. A transferência do péptido nascente para a puromicina parece ser lenta em relação ao processo de alongamento, como demonstrado pela homogeneidade e comprimento do péptido ligado ao ligante. Se a puromicina competisse efectivamente com os aminoacil-ARNt durante o alongamento, seria de esperar que as fusões ligante-péptido presentes nos produtos de fusão tivessem um tamanho heterogéneo. Além disso, não parecia que o ribossoma lia na região ligante, tal como indicado pela semelhança de mobilidades em gel entre a fusão Met-molde e o ligante não modificado. 0 dA3n deverá codificar para (lisina)n que iria certamente diminuir a mobilidade do ligante. A baixa velocidade de remoção do ARNm poderá explicar a baixa velocidade de formação da fusão em relação à velocidade de translocação. Resultados preliminares sugerem que a quantidade de produto de fusão formado aumenta acentuadamente após uma incubação pós-tradução prolongada, a baixa temperatura, talvez devido ao maior tempo disponível para transferência do péptido nascente para a puromicina.

MATERIAIS E MÉTODOS DETALHADOS

Descrevem-se a seguir materiais e métodos detalhados, em relação à tradução in vitro e teste de fusões ARN-proteína, incluindo fusões com um marcador epitópico de c-myc.

Sequências. Utilizaram-se vários oligonucleótidos acima para a produção de fusões ARN-proteína. Estes oligonucleótidos têm as seguintes sequências.

NOME SEQUÊNCIA

3CLP 5'AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA. CCP (SEQ ID NO: 8) 13-P 5’AAA .AAA AAA ACC P (SEQ ID NO: 9)

2S-P 5'CGC GGT TTT TAT TXT TXT TTT TCC P (SEQ TD Nu 10) 43 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

43-Ρ 5’rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArArU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACC P (SEQ ÍD NO: 11) 43-P (CUG) 5’rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACC P (SEQ ID NO: 12)

40'P 5'.rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACC P (SEQ ID NO: 13) 37-P 5'rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACC P (SEQ ID NO: 14) 34-P 5'rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA ACC P (SEQ ID NO; 15)

31 -P 5-‘rGrGrA. rGrGrA rCrGrA rArCrtJ rGAA AAA AAA AAA AAA ACC P (SEQ ID NO: 16) LP77 5'rGrGrG rArGrG rArCrG rArArA rUrGrG rArArC r.ArGrA rArArC rUrGrA rllrCrU rCrUrG rArArG rArArC rArCrC rUrGrA rArC AAA AAA AA A AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP (SEQ ID NO: 1}

LJPÍ54 5’rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA rArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGr Ar A rGrÁrÀ rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU AAA λΑΑΑ AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP !IIíI!|no: 3) iiiiiiiiii

LP160 5' 5’rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC r ArArU rUrArC rA rArUrG rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP (SEQ ID NO: 17) 44 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Todos os oligonucleótidos estão representados na direcção 5' para 3' . As bases de ribonucleótido são indicadas pela letra minúscula "r" antes da designação do nucleótido; P é puromicina; rN indica guantidades iguais de rA, rG, rC e rU; rS indica guantidades iguais de rG e rC; e todas as outras designações de bases indicam oligonucleótidos de ADN.

Produtos químicos. A Puromicina HC1, vidro de poro controlado de alquilamina de cadeia longa, gougerotina, cloranfenicol, virginiamicina, DMAP, cloreto de dimetiltritilo e anidrido acético foram obtidos da Sigma Chemical (St. Louis, MO). A piridina, dimetilformamida, tolueno, anidrido succínico e para-nitrofenol foram obtidos da Fluka Chemical (Ronkonkoma, NY) . 0 ARNm de β-globina foi obtido da Novagen (Madison, WI) . 0 ARN de TMV foi obtido da Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) .

Enzimas. A proteinase K foi obtida da Promega (Madison, WI). A ARNase isenta de ADNase foi produzida ou pelo protocolo de Sambrook et al. {supra), ou adquirida da Boehringer Mannheim. A polimerase de T7 foi produzida pelo protocolo publicado de Grodberg e Dunn (J. Bacteriol. 170:1245 (1988)) com as modificações de Zawadzki e Gross (Nucl. Acids Res. 19:1948 (1991)). A ADN-ligase de T4 foi obtida da New England Biolabs (Beverly, MA).

Quantificação da incorporação de marcador radioactivo. Para bandas de geles radioactivos, a quantidade de marcador radioactivo (35S ou 32P) presente em cada banda foi determinada por quantificação, ou num analisador de manchas Betagen 603 (Betagen, Waltham, MA), ou utilizando placas de phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . Para amostras líquidas e sólidas, a quantidade de marcador radioactivo (35S ou 32P) presente foi determinada por contagem de cintilação (Beckman, Columbia, MD).

Imagens de gel. Obtiveram-se imagens de geles por autorradiografia (utilizando película Kodak XAR), ou utilizando placas de phosphorlmager (Molecular Dynamics). Síntese de CPG puromicina. A seguir descrevem-se protocolos detalhados para a síntese de CPG-puromicina. 45 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Reacções enzimáticas. Em geral, a preparação de ácidos nucleicos para reacções de quinase, transcrição, PCR e tradução utilizando extractos de E. coli foi a mesma. Cada protocolo preparativo começou com extracção utilizando um volume igual de fenol/clorofórmio a 1:1, seguido de centrifugação e isolamento da fase aquosa. Adicionou-se acetato de sódio (pH 5,2) e espermidina a uma concentração final de 300 mM e 1 mM, respectivamente e a amostra foi precipitada por adição de 3 volumes de etanol a 100% e incubação a -70°C, durante 20 minutos. As amostras foram centrifugadas a >12.000 g, o sobrenadante foi removido e os sedimentos foram lavados com um excesso de etanol a 95%, a 0°C. Os sedimentos resultantes foram então secos sob vácuo e ressuspensos.

Oligonucleótidos. Todos os ADN e ARN sintéticos foram sintetizados num sintetizador Millipore Expedite utilizando química convencional para cada, como fornecido pelo fabricante (Milligen, Bedford, MA). Os oligonucleótidos contendo 3' puromicina foram sintetizados utilizando colunas de CPG puromicina empacotadas com 30-50 mg de suporte sólido ( — 20 ymol puromicina/grama) . Os oligonucleótidos contendo uma 3' biotina foram sintetizados utilizando 1 pmol de colunas bioteg CPG da Glen Research (Sterling, VA) . Os oligonucleótidos contendo uma 5' biotina foram sintetizadas por adição de bioteg fosforamidito (Glen Research) como base 5'. Os oligonucleótidos a ser ligados nas extremidades 3' das moléculas de ARN foram, ou quimicamente fosforilados na extremidade 5' (utilizando o reagente de fosforilação química da Glen Research) antes de desprotecção, ou fosforilados enzimaticamente utilizando ATP e polinucleótido-quinase de T4 (New England Biolabs) após desprotecção. As amostras contendo apenas ADN (e 3'-puromicina ou 3'-biotina) foram desprotegidas por adição de NH4OH a 25% seguido de incubação durante 12 horas a 55°C. As amostras contendo monómeros de ARN (e.g., 43-P) foram desprotegidas por adição de etanol (25% (v/v)) à solução de NH4OH e incubação durante 12 horas a 55°C. O 2' OH foi desprotegido utilizando TBAF 1M em THF (Sigma) durante 48 horas à temperatura ambiente. O TBAF foi removido utilizando uma coluna NAP-25 Sephadex (Pharmacia, Piscataway, NJ) . 46 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

As amostras de ADN e ARN desprotegidas foram então purificadas utilizando PAGE desnaturante, seguido ou de impregnação ou electro-eluição do gel, utilizando Elutrap (Schleicher e Schuell, Keene, NH) e dessalinização utilizando ou uma coluna NAP-25 Sephadex, ou precipitação com etanol, como descrito acima.

Construção de ADN de myc. Construíram-se dois moldes de ADN contendo o marcador epitópico de c-myc. O primeiro molde foi construído a partir de uma combinação dos oligonucleótidos 64.27 (5'-GTT CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3') (SEQ ID NO: 18) e 18.109 (5' -TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3' ) (SEQ ID NO: 19). A transcrição utilizando este molde produziu ARN 47.1 que codificava para o péptido MEQKLISEEDLN (SEQ ID NO:20). A ligação de ARN 47.1 a 30-P originou LP77, apresentado na Figura 7A. O segundo molde foi construído primeiro como um oligonucleótido simples de 99 bases de comprimento, tendo a designação RWR 99.6 e a sequência 5'AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TTC CAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC TTC AGA GAT CAG TTT CTG TTC TTC AGC CAT-3 (SEQ ID NO:21). Os moldes de transcrição de cadeia dupla contendo esta sequência foram construídos por PCR com os oligos RWR 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3')

(SEQ ID NO:22) e RWR 63.26 (5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-3' ) (SEQ ID NO:23) de acordo com protocolos publicados (Ausubel et al., supra, capítulo 15). A transcrição utilizando este molde produziu um ARN designado por ARN124 que codificava para o péptido MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO:24). Este péptido continha a sequência utilizada para produzir o

anticorpo monoclonal 9E10 quando conjugado com uma proteína transportadora (Oncogene Science Technical Bulletin). O ARN124 tinha 124 nucleótidos de comprimento e a ligação de ARN124 a 30-P produziu LP154 apresentado na Figura 7B. A sequência de ARN124 é como se segue (SEQ ID NO:32): 5'-rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArA rGrArC

rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG

rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU-3' 47 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Construção do conjunto modificado aleatoriamente. O conjunto modificado aleatoriamente foi construído como um oligonucleótido simples de 130 bases de comprimento, designado por RWR130.1. Começando na extremidade 3', a sequência era 3' CCCTGTTAATGATAAATGTTAATGTTAC (NNS)27 GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5' (SEQ ID NO:25). N designa uma posição aleatória e esta sequência foi produzida de acordo com o protocolo sintetizador convencional. S designa uma mistura igual de bases dG e dC. Fez-se PCR com os oligonucleótidos 42.108 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA) (SEQ ID NO: 26) e 21.103 (5 ' -AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG) (SEQ ID NO:27). A transcrição deste molde produziu um ARN designado por conjunto 130.1. A ligação do conjunto 130.1 a 30-P originou o conjunto #1 (também designado por LP 160) apresentado na Figura 7C.

Fizeram-se sete ciclos de PCR de acordo com protocolos publicados (Ausubel et al., supra) com as seguintes excepções: (i) a concentração inicial de RWR130.1 era 30 nanomolar, (ii) cada iniciador foi utilizado a uma concentração de 1,5 μΜ, (iii) a concentração de dNTP era de 400 μΜ para cada base e (iv) a polimerase de Taq (Boehringer Mannheim) foi utilizada a 5 unidades por 100 μΐ. O produto de cadeia dupla foi purificado em PAGE desnaturante e isolado por electro-eluição. A quantidade de ADN foi determinada quer por absorvância no UV a 2 60 nm, quer por comparação de fluorescência de brometo de etídio com padrões conhecidos. Síntese enzimática de ARN. As reacções de transcrição de ADN de PCR de cadeia dupla e oligonucleótidos sintéticos foram realizadas como descrito anteriormente (Milligan e Uhlenbeck, Meth. Enzymol. 180:51 (1989)). O ARN de tamanho total foi purificado por PAGE desnaturante, electroeluído e dessalinizado como descrito acima. A concentração de ARN do conjunto foi estimada utilizando um coeficiente de extinção de 1300 D.O./pmol; ARN124, 1250 D.O./pmol; ARN 47.1, 480 D.O./pmol. A transcrição a partir do ADN do conjunto de cadeia dupla produziu ~90 nanomoles de ARN do conjunto. Síntese enzimática de conjugados ARN-puromicina. A ligação das sequências de myc e de ARN mensageiro do conjunto ao oligonucleótido contendo puromicina foi realizada 48 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ utilizando uma tira de ADN, designada por 19.35 (5'-TTT TTT TTT TAG CGC AAG A) (SEQ ID NO:28) utilizando um procedimento análogo ao descrito por Moore e Sharp (Science 250:992 (1992)). A reacção consistia de ARNm, tira e oligonucleótido de puromicina (30-P, dA27dCdCP) numa razão molar de 0,8:0,9:1,0 e 1-2,5 unidades de ADN-ligase por picomole de ARNm do conjunto. As reacções foram realizadas durante 1 hora, à temperatura ambiente. Para a construção das fusões de ARN do conjunto, a concentração de ARNm era de ~6, 6 pmolar. Após ligação, o conjugado ARN-puromicina foi preparado como descrito acima para reacções enzimáticas. O precipitado foi ressuspenso e purificaram-se fusões de tamanho total em PAGE desnaturante e isolaram-se por electro-eluição, como descrito acima. A concentração de ARN do conjunto foi estimada utilizando um coeficiente de extinção de 1650 D.O./pmol e o molde myc 1600 D.O./pmol. Deste modo, produziram-se 2,5 nanomoles de conjugado.

Preparação de dT25 estreptavidina-agarose. Incubou—se dT25 contendo uma 3'-biotina (sintetizada em colunas bioteg fosforamidito (Glen Research) ) a 1-10 μΜ com uma lama de estreptavidina-agarose (agarose a 50% em volume, Pierce, Rockford, IL) durante 1 hora à temperatura ambiente, em TE (Tris Cloreto 10 mM pH 8,2, 1 mM EDTA) e lavou-se. A capacidade de ligação da agarose foi então estimada opticamente através do desaparecimento de biotina-dT25 da solução e/ou por titulação da resina com quantidades conhecidas de oligonucleótido complementar.

Reacções de tradução utilizando extractos derivados de E. coli e ribossomas. Em geral, as reacções de tradução foram realizadas com kits adquiridos comercialmente (por exemplo, extracto de E. coli S30 para moldes lineares, Promega, Madison, WI) . No entanto, a E. coli MRE600 (obtida da ATCC, Rockville, MD) também foi utilizada para produzir extractos de S30, preparados de acordo com protocolos publicados (por exemplo, Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301 (1991)), bem como uma fracção ribossómica preparada como descrito por Kudlicki et al. (Anal. Biochem. 206:389 (1992)). A reacção padrão foi realizada num volume de 50 μΐ com 20-40 μΟί de 35S-metionina como marcador. A mistura reaccional consistia de extracto a 30% v/v, MgCl2 9-18 mM, pré-mistura a 40% menos 49 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ metionina (Promega) ν/ν, e 5 μΜ de molde (e.g., 43-P). Para experiências de co-incubação, os oligos 13-P e 25-P foram adicionados a uma concentração de 5 μΜ. Para experiências utilizando ribossomas, adicionaram-se 3 μΐ de solução de ribossomas por reacção, em vez do lisado. Todas as reacções foram incubadas a 37°C durante 30 minutos. Os moldes foram purificados como descrito acima sob reacções enzimáticas.

Reacções de tradução de gérmen de trigo. As reacções de tradução na Figura 8 foram realizadas utilizando kits que não possuem metionina adquiridos comercialmente (Promega), de acordo com as recomendações do fabricante. As concentrações de molde eram 4 μΜ para 43-P e 0,8 μΜ para LP77 e LP154. As reacções foram realizadas a 25 °C com 30 μΟί de 35S metionina, num volume total de 25 μΐ.

Reacções de tradução de reticulócitos. As reacções de tradução foram realizadas com kits adquiridos comercialmente (Novagen, Madison, WI), ou utilizando extracto preparado de acordo com protocolos publicados (Jackson e Hunt, Meth. Enzymol. 96:50 (1983)). Obteve-se sangue rico em reticulócitos da Pel-Freez Biologicals (Rogers, AK). Em ambos os casos, as condições de reacção eram as recomendadas para utilização com lisado Red Nova (Novagen) . As reacções consistiam de KC1 100 mM, MgOAc 0,5 mM, DTT 2 mM, HEPES 20 mM pH 7,6, fosfato de creatina 8 mM, 25 μΜ em cada aminoácido (com a excepção de metionina quando se utilizou 35S Met), e lisado a 40% v/v. A incubação foi realizada a 30°C durante 1 hora. As concentrações de molde dependiam da experiência, mas em geral variavam de 50 nM a 1 μΜ, com a excepção de 43-P (Figura 6H) que era 4 μΜ.

Para se obter o conjunto modificado aleatório, fizeram-se 10 ml de reacção de tradução a uma concentração de molde de ~0,1 μΜ (1,25 nanomoles de molde). Adicionalmente, incluiu-se molde marcado com 32P na reacção para permitir a determinação da quantidade de material presente em cada passo do procedimento de purificação e selecção. Após tradução a 30°C durante uma hora, a reacção foi arrefecida em gelo durante 30-60 minutos. 50 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Isolamento da fusão com dT25 estreptavidina-agarose. Após incubação, a reacção de tradução foi diluída aproximadamente 150 vezes em tampão de isolamento (NaCl 1,0 M, Tris cloreto 0,1 M pH 8,2, EDTA 10 mM, DTT 1 mM) contendo um excesso molar de mais de 10X de dT25-biotina-estreptavidina-agarose cuja concentração de dT2s era de ~10 μΜ (volume de lama igual ou superior ao volume de lisado) e incubou-se com agitação a 4°C, durante uma hora. A agarose foi então removida da mistura, ou por filtração (filtros ultrafree MC Millipore), ou centrifugação e lavada com tampão de isolamento frio 2-4 vezes. O molde foi então libertado da dT2s estreptavidina-agarose por lavagem repetida com aliquotas de 50-100 μΐ de NaOH 15 mM, EDTA 1 mM. O eluente foi imediatamente neutralizado em NaOAc 3M pH 5,2, espermidina 10 mM e foi precipitado com etanol. Para a reacção do conjunto, a radioactividade total recuperada indicou que se recuperaram aproximadamente 50-70% do molde inicial.

Isolamento da fusão com tiopropil-Sepharose. As fusões contendo cisteina podem ser purificadas utilizando tiopropil-Sepharose 6B como na Figura 13 (Pharmacia) . Nas experiências aqui descritas o isolamento foi realizado, ou directamente a partir da reacção de tradução, ou após isolamento inicial da fusão (e.g., com estreptavidina-agarose). Para amostras purificadas directamente, utilizou-se uma razão de 1:10 (v/v) entre lisado e Sepharose. Para o conjunto, utilizaram-se 0,5 ml de lama de Sepharose para isolar todo o material de fusão a partir de 5 ml da mistura reaccional. As amostras foram diluídas numa lama de tiopropil-Sepharose a 50:50 (v/v) em IX TE 8,2 (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,2) contando ARNase isenta de ADNase (Boehringer Mannheim) e incubou-se com rotação durante 1-2 horas a 4°C, para permitir uma reacção completa. O líquido em excesso foi removido e a Sepharose foi lavada repetidamente com tampão de isolamento contendo DTT 20 mM e recuperada por centrifugação ou filtração. As fusões foram eluídas da Sepharose utilizando uma solução de ditiotreitol (DTT) 25-30 mM em Tris-cloreto 10 mM pH 8,2, EDTA 1 mM. A fusão foi então concentrada por uma combinação de evaporação sob vácuo elevado e precipitação com etanol, como descrito acima. Para a reacção do conjunto, a radioactividade total recuperada indicou que aproximadamente 1% do molde foi convertido em fusão. 51 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Para algumas aplicações, ο dT25 foi adicionado a este eluato e submetido a rotação durante 1 hora, a 4°C. A agarose foi lavada três vezes com tampão de isolamento frio, isolada por filtração e o material ligado foi eluido como acima. Adicionou-se ARNt transportador e o produto de fusão foi precipitado com etanol. A amostra foi ressuspensa em TE pH 8,2 contendo ARNase A isenta de ADNase para remover a porção de ARN do molde.

Reacções de imunoprecipitação. As imunoprecipitações de péptidos das reacções de tradução (Figura 10) foram realizadas misturando 4 μΐ de reacção de tradução de reticulócitos, 2 μΐ de soro de ratinho normal e 20 μΐ de Proteína G + A-agarose (Calbiochem, La Jolla, CA) com 200 μΐ, ou de PBS (Na2HP04 58 mM, NaH2P04 17 mM, NaCl 68 mM) , tampão de diluição (Tris cloreto 10 mM pH 8,2, NaCl 140 mM, Triton X-100 a 1% v/v), ou PBSTDS (PBS + Triton X-100 a 1%, desoxicolato a 0,5% SDS a 0,1%). As amostras foram em seguida submetidas a rotação durante 1 hora a 4°C, seguido de centrifugação a 2500 rpm durante 15 minutos. O eluente foi removido e adicionaram-se 10 μΐ de anticorpo monoclonal de c-myc 9E10 (Calbiochem, La Jolla, CA) e 15 μΐ de Proteína G + A-agarose e submetido a rotação durante 2 horas a 4°C. As amostras foram então lavadas com volumes de 1 ml, ou de PBS, tampão de diluição, ou PBSTDS. Adicionaram-se à mistura 40 μΐ de tampão de gel de carga (Calbiochem Product Bulletin) e carregaram-se 20 μΐ num PAGE desnaturante, como descrito por Schagger e von Jagow (Anal. Biochem. 166:368 (1987)).

As imunoprecipitações de fusões (como apresentado na Figura 11) foram realizadas misturando 8 μΐ de reacção de tradução de reticulócitos com 300 μΐ de tampão de diluição (Tris cloreto 10 mM pH 8,2, NaCl 140 mM, Triton X-100 a 1% v/v), 15 μΐ de proteína G-Sepharose (Sigma) e 10 μΐ (1 pg) de anticorpo de c-myc 9E10 (Calbiochem), seguido de rotação durante várias horas, a 4°C. Após isolamento, as amostras foram lavadas, tratadas com ARNase A isenta de ADNase, marcadas com polinucleótido-guinase e 32P gama ATP e separadas por PAGE com ureia desnaturante (Figura 11). 52 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Transcrição inversa do conjunto de fusão. Fizeram-se reacções de transcrição inversa de acordo com a recomendação do fabricante para Superscript II, excepto que o molde, água e iniciador foram incubados a 7 0°C durante apenas dois minutos (Gibco BRL, Grand Island, NY). Para monitorizar o alongamento, incluiram-se 50 pCi de alfa 32P dCTP nalgumas reacções; noutras reacções, a transcrição inversa foi monitorizada utilizando iniciadores marcados com 32P 5' que foram preparados utilizando 32P α-ATP (New England Nuclear, Boston, MA) e polinucleótido-quinase de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA).

Preparação de Proteína G- e anticorpo-Sepharose. Lavaram-se duas alíquotas de 50 μΐ de lama de Proteína G-Sepharose (50% de sólido por volume) (Sigma) com tampão de diluição (Tris-cloreto 10 mM pH 8,2, NaCl 140 mM, NaN3 a 0,025%, Triton X-100 a 1% v/v) e isolou-se por centrifugação. A primeira alíquota foi reservada para utilização como uma pré-coluna, antes da matriz de selecção. Após ressuspensão da segunda alíquota em tampão de diluição, adicionaram-se 40 pg de anticorpo monoclonal de c-myc AB-1 (Oncogene Science) e a reacção foi incubada durante a noite a 4°C, com rotação. O anticorpo-Sepharose foi então purificado por centrifugação durante 15 minutos a 1500-2500 rpm numa microcentrífuga e lavado 1-2 vezes com tampão de diluição.

Selecção. Após isolamento da fusão e síntese da cadeia complementar, toda a reacção de transcriptase inversa foi utilizada directamente no processo de selecção. São aqui delineados dois protocolos. Para o primeiro ciclo, a reacção de transcriptase inversa foi adicionada directamente ao anticorpo-Sepharose preparado como descrito acima e incubou-se durante 2 horas. Para os ciclos subsequentes, a reacção é incubada ~2 horas com proteína G-Sepharose lavada, antes da coluna de anticorpo, para diminuir o número de ligantes que interagem com a proteína G, em vez do anticorpo imobilizado.

Para eluir o conjunto da matriz, podem utilizar-se várias abordagens. A primeira é lavar a matriz de selecção com ácido acético a 4%. Este procedimento liberta o péptido da matriz. Alternativamente, pode-se utilizar uma lavagem mais rigorosa 53 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ (e.g.r utilizando ureia ou outro desnaturante) em vez de, ou em adição à abordagem do ácido acético. PCR de fusões seleccionadas. As moléculas seleccionadas são amplificadas por PCR utilizando protocolo convencionais como descrito acima para construção do conjunto.

SÍNTESE E TESTE DE FUSÕES DE BETA-GLOBINA

Para sintetizar uma construção de fusão de β-globina, produziu-se ADNc de β-globina a partir de 2,5 pg de ARNm de globina por transcrição inversa com 200 pmol de iniciador 18.155 (5' GTG GTA TTT GTG AGC CAG) (SEQ ID NO:29) e transcriptase inversa Superscript (Gibco BRL) de acordo com o protocolo do fabricante. A sequência de iniciador era complementar aos 18 nucleótidos de β-globina 5' em relação ao codão de terminação. Para adicionar um promotor de T7 removeram-se 20 μΐ da reacção de transcrição inversa e submeteram-se a 6 ciclos de PCR com iniciadores 18.155 e 40.54 (5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C) (SEQ ID NO:30). O ARNm de "syn^-globina" foi então produzido por transcrição runoff de T7 de acordo com Milligan e Uhlenbeck (Methods Enzymol. 180:51 (1989)) e o gel de ARN foi purificado, electroeluído e dessalinizado como aqui descrito. Produziu-se então "LP^-globina" a partir da construção syn-β-globina por ligação dessa construção a 30-P, de acordo com o método de Moore e Sharp (Science 256:992 (1992)) utilizando o iniciador 20.262 (5' TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G) (SEQ ID NO: 31) como tira. O produto da reacção de ligação foi em seguida purificado em gel, electroeluído e dessalinizado como acima. A concentração do produto final foi determinada por absorvância a 260 nm.

Estes moldes de β-globina foram então traduzidos in vitro como descrito na Tabela 1, num volume total de 25 μΐ cada. Adicionou-se Mg2+ de uma solução mãe a 25 mM. Todas as reacções foram incubadas a 30°C durante uma hora e colocadas a -20 °C durante a noite. Os CPM precipitáveis com dT2s foram então determinados duas vezes utilizando 6 μΐ de lisado e fez-se a sua média menos o ruído de fundo. 54 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ TABELA 1

Reacções de tradução com moldes de Beta-Globina

Reacção Molde Mg2+ 35 S-Met CPM de TCA CPM de dT (mM) (pl) (2 pl) (6 pl) 1 — 1,0 2,0 (20 pCi) 3312 0 2 2, 5 pg syn-p-globina 0,5 2,0 (20 pCi) 33860 36 3 2, 5 pg syn-p-globina 1,0 2,0 (20 pCi) 22470 82 4 2, 5 pg syn-p-globina 2,0 2,0 (20 pCi) 15696 86 5 2, 5 pg LP-p-globina 0,5 2,0 (20 pCi) 32712 218 6 2, 5 pg LP-p-globina 1,0 2,0 (20 pCi) 24226 402 7 2, 5 pg LP-p-globina 2,0 2,0 (20 pCi) 15074 270

Para preparar as amostras para análise em gel, misturaram-se 6 μΐ de cada reacção de tradução com 1000 μΐ de tampão de isolamento (NaCl 1 M, Tris-Cl 100 mM pH 8,2, EDTA 10 mM, DTT 0,1 mM), ARNase A 1 μΐ (isenta de ADNase, Boehringer Mannheim) e 20 μΐ de dT25 estreptavidina-agarose 20 μΜ. As amostras foram incubadas a 4°C durante uma hora, com rotação. Removeu-se o excesso de tampão de isolamento e as amostras foram adicionadas a um filtro MC Millipore para remover qualquer tampão de isolamento remanescente. As amostras foram em seguida lavadas quatro vezes com 50 μΐ de H20 e duas vezes com 50 μΐ de NaOH 15 mM, EDTA 1 mM. A amostra foi neutralizada (300 μΐ) com 100 μΐ de TE pH 6,8 (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM), adicionou-se 1 μΐ de ARNase A 1 mg/ml (como acima) e as amostras foram incubadas a 37°C. Adicionaram-se então 10 μΐ de 2X tampão de carga com SDS (Tris-Cl 125 mM pH 6,8, SDS a 2%, β-mercaptoetanol a 2% glicerol a 20%, azul de bromofenol a 0,001%) e a amostra foi liofilizada até à secura e ressuspensa em 20 μΐ de H20 e β-mercaptoetanol a 1%. As amostras foram então carregadas num gel resolvente de péptidos, como descrito por Schagger e von Jagow (Analytical Biochemistry 166:368 (1987)) e visualizado por autorradiografia. 55 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Os resultados destas experiências são apresentados nas Figuras 15A e 15B. Como indicado na Figura 15A, incorporou-se 35S-metionina na porção de proteína das fusões syn^-globina e LP-p-globina. A proteína era heterogénea, mas uma banda forte exibia a mobilidade esperada para o ARNm de β-globina. Além disso como se pode ver na Figura 15B, após isolamento de dT2s e digestão com ARNase A, não permaneceu nenhum material marcado com 35S nas pistas de syn^-globina (Figura 15B, pistas 2-4). Pelo contrário, nas pistas de LP-p-globina, observou-se um produto marcado com 35S de tamanho homogéneo.

Estes resultados indicaram que, como acima, foi isolado um produto de fusão por cromatografia de afinidade de oligonucleótidos, apenas quando o molde continha uma 3'-puromicina. Isto foi confirmado por contagem de cintilação (veja-se Tabela 1) . É esperado que o material obtido contenha o ligante 30-P fundido com alguma porção da β-globina. 0 produto de fusão parecia ter um tamanho bastante homogéneo, como avaliado por análise em gel. No entanto, uma vez que o produto exibia uma mobilidade muito semelhante à β-globina natural (Figuras 15A e 15B, pistas de controlo), era difícil determinar o tamanho preciso da porção de proteína do produto de fusão.

OPTIMIZAÇÃO ADICIONAL DA FORMAÇÃO DA FUSÃO ARN-PROTEÍNA

Verificou-se que alguns factores aumentam ainda mais a eficiência de formação de fusões ARN-péptido. A formação da fusão, i.e., a transferência da cadeia de péptido nascente a partir do seu ARNt para a porção de puromicina na extremidade 3' do ARNm, é uma reacção lenta que se segue à tradução inicial, relativamente rápida, do quadro de leitura aberta, para produzir o péptido nascente. A extensão da formação da fusão pode ser substancialmente potenciada por uma incubação pós-tradução em condições de Mg2+ elevado (de preferência, numa gama de 50-100 mM) e/ou utilizando um ligante mais flexível entre o ARNm e a porção de puromicina. Adicionalmente, incubações longas (12-48 horas) a temperaturas baixas (de preferência, -20°C) também resultam em maiores rendimentos de fusões com menos degradação de ARNm do que a que ocorre durante a incubação a 30°C. Combinando estes 56 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ factores, podem-se converter até 40% do ARNm de entrada em produtos de fusão ARNm-péptido, como se mostra a seguir. Síntese_de_conjugados_ARNm-puromicina . Nestas experiências de optimização, ligaram-se oligonucleótidos ligantes contendo puromicina às extremidades 3' de ARNm utilizando ADN-ligase de bacteriófago T4, na presença de tiras de ADN complementares, de um modo geral como descrito acima. Uma vez que a ADN-ligase de T4 prefere um emparelhamento de bases preciso, próximo da junção de ligação e os produtos de transcrição runoff com polimerase de ARN de T7, T3, ou SP6 são muitas vezes heterogéneos nas suas extremidades 3' (Nucleic Acids Research 15:8783 (1987)), apenas os ARN que contêm o nucleótido de terminal' correcto foram ligados eficazmente. Quando se utilizou uma tira de ADN convencional, aproximadamente 40% dos produtos de transcrição runoff foram ligados ao oligo de puromicina. A quantidade de produto de ligação aumentou utilizando ARN em excesso, mas não aumentou utilizando oligonucleótido de puromicina em excesso. Sem estar cingido a uma teoria particular, parecia que o factor limitante para a ligação era a quantidade de ARN que era totalmente complementar à região correspondente da tira de ADN.

Para permitir a ligação dos transcritos que terminam com um nucleótido extra não existente no molde, no terminal 3' (designados por "produtos N+l"), utilizou-se uma mistura da tira de ADN convencional com uma nova tira de ADN contendo uma base aleatória adicional na junção da ligação. A eficiência da ligação aumentou para mais de 70% para um exemplo de molde de ARN de myc (isto é, ARN124) na presença desta tira de ADN mista.

Além desta abordagem de tira de ADN modificada, a eficiência da formação do conjugado ARNm-puromicina também foi optimizada tendo em conta os seguintes três factores. Primeiro, utilizaram-se ou conceberam-se preferencialmente ARNm que não possuíam terminais 3' com qualquer estrutura secundária estável, significativa que pudesse interferir com a fusão a um oligonucleótido tira. Além disso, porque uma concentração elevada de sal provocou por vezes a falha da reacção de ligação, incluiu-se de preferência uma 57 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ dessalinização profunda dos oligonucleótidos utilizando colunas NAP-25, como um passo no procedimento. Por fim, porque a reacção de ligação era relativamente rápida e estava geralmente completa no espaço de 40 minutos à temperatura ambiente, não se utilizaram em geral períodos de incubação significativamente mais longos e muitas vezes resultava na degradação desnecessária do ARN.

Utilizando as condições acima, sintetizaram-se conjugados ARNm-puromicina como se segue. A ligação da sequência de ARN de myc (ARN124) ao oligonucleótido contendo puromicina foi realizada utilizando, ou uma tira de ADN convencional (e.g., 5i-ttttttttttaGCGCAAGA) ou uma tira contendo uma base aleatória (N) na junção da ligação (e.g., 5i-ttttttttttnaGCGCAAGA). As reacções consistiam de ARNm, a tira de ADN, e o oligonucleótido de puromicina numa razão molar de 1,0 : 1,5-2,0 : 1,0. A mistura destes componentes foi primeiro aquecida a 94°C durante 1 minuto e em seguida arrefecida em gelo, durante 15 minutos. As reacções de ligação foram realizadas durante uma hora à temperatura ambiente em Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA a 25 yg/ml, oligo de puromicina 15 μΜ, ARNm 15 μΜ, tira de ADN 22,5-30 μΜ, inibidor ARNsina (Promega) a 1 U/μΙ, e 1,6 unidades de ADN-ligase de T4 por picomole de oligo de puromicina. Após incubação, adicionou-se EDTA a uma concentração final de 30 mM, e as misturas reaccionais foram extraídas com fenol/clorofórmio. Os conjugados de tamanho total foram purificados por PAGE desnaturante e isolados por electro-eluição.

Condições gerais de tradução de reticulócitos. Além de melhorar a síntese do conjugado ARNm-puromicina, as reacções de tradução foram também optimizadas como se segue. As reacções foram realizadas em lisados de reticulócito de coelho de diferentes fontes comerciais (Novagen, Madison, WI; Amersham, Arlington Heights, IL; Boehringer Mannheim,

Indianapolis, IN; Ambion, Austin, TX; e Promega, Madison, WI). Uma mistura reaccional típica (volume final de 25 μΐ) consistia de HEPES 20 mM pH 7,6, DTT 2 mM, fosfato de creatina 8 mM, KC1 100 mM, Mg(OAc) 2 0,75 mM, ATP 1 mM, GTP 0,2 mM, 25 μΜ de cada aminoácido (metionina 0,7 μΜ quando se utiliza 35S-Met) , ARNsina a 1 U/μΙ e lisado a 60% (v/v) . A 58 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ concentração final de molde era na gama de 50 nM a 800 nM. Para cada incubação, todos os componentes, excepto o lisado, foram misturados cuidadosamente em gelo e o lisado congelado foi descongelado imediatamente antes de ser utilizado. Após adição do lisado, a mistura reaccional foi bem misturada, pipetando cuidadosamente, e incubada a 30°C para iniciar a tradução. As concentrações óptimas de Mg2+ e K+ variavam nas gamas de 0,25 mM - 2 mM e 75 mM - 200 mM, respectivamente, para diferentes ARNm e eram determinadas de preferência em experiências preliminares. Em particular para ARNm fracamente traduzidos, as concentrações de hemina, fosfato de creatina, ARNt e aminoácidos também foram por vezes optimizadas. O cloreto de potássio era geralmente preferido em relação ao acetato de potássio para reacções de fusão, mas uma mistura de KC1 e KOAc por vezes produzia melhores resultados.

Após tradução a 30°C durante 30 a 90 minutos, a reacção foi arrefecida em gelo durante 40 minutos e adicionou-se Mg2+. A concentração final de Mg2+ adicionado neste passo também foi optimizada para diferentes moldes de ARNm, mas era geralmente na gama de 50 mM a 100 mM (utilizando-se preferencialmente 50 mM para conjuntos de moldes mistos). A mistura resultante foi incubada a -20°C durante 16 a 48 horas. Para visualizar os produtos de fusão marcados, misturaram-se 2 μΐ de mistura reaccional com 4 μΐ de tampão de carga e a mistura foi aguecida a 75°C durante 3 minutos. A mistura resultante foi então carregada num gel de SDS-poliacrilamida com glicina a 6% (para moldes marcados com 32P) ou um gel de SDS-poliacrilamida com tricina a 8% (para moldes marcados com 35S-Met) . Como alternativa a esta abordagem, os produtos de fusão também podem ser isolados utilizando dT2s estreptavidina-agarose ou tiopropil-Sepharose (ou ambas) , de um modo geral como agui descrito.

Para remover a porção de ARN do conjugado ARN-ligante-puromicina-péptido para análise subsequente por SDS-PAGE, adicionou-se uma quantidade adequada de EDTA após incubação pós-tradução e a mistura reaccional foi dessalinizada utilizando uma coluna microcon-10 (ou microcon-30).

Misturaram-se 2 μΐ da mistura resultante (aproximadamente 25 μΐ no total) com 18 μΐ de tampão de ARNase H (Tris-HCl 30 mM, pH 7,8, (NH4)2S04 30 mM, MgCl2 8 mM, β-mercaptoetanol 59 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ 1,5 mM, e uma quantidade adequada de tira de ADN complementar) e a mistura foi incubada a 4°C durante 45 minutos. Adicionou-se então ARNase H e a digestão foi realizada a 37°C durante 20 minutos.

Qualidade do oligo de puromicina. A qualidade do oligonucleótido de puromicina também era importante para a produção eficaz de produtos de fusão. O acoplamento de 5'-DMT-2'-succinil-N-trifluoroacetilpuromicina com CPG não era tão eficaz quanto o acoplamento dos nucleótidos convencionais. Assim, a reacção de acoplamento foi cuidadosamente monitorizada para evitar a formação de CPG com uma concentração demasiado baixa de puromicina acoplada e os grupos amino não reagidos no CPG foram totalmente neutralizados para evitar a síntese subsequente de oligonucleótidos que não possuem uma puromicina no terminal 3' . Também era importante evitar a utilização de CPG contendo partículas de malha muito fina, uma vez que estas seriam capazes de causar problemas de entupimento de válvulas durante os passos seguintes de síntese de oligonucleótidos automatizada.

Adicionalmente, a puromicina sintetizada foi preferencialmente testada antes de uma utilização em grande escala, para assegurar a presença de puromicina na extremidade 3'. Nas nossas experiências, não era detectada nenhuma fusão se a puromicina fosse substituída com uma desoxiadenosina contendo um grupo amino primário na extremidade 3'. Para testar a presença de grupos 3'-hidroxilo (i.e., a síntese indesejada de oligos que não possuem uma puromicina no terminal 3') , a puromicina pode ser primeiro marcada radioactivamente (e.g., por fosforilação 5') e em seguida utilizada como um iniciador para alongamento com desoxinucleotidiltransferase terminal. Na presença de uma porção de puromicina de terminal 3', não se deverá observar nenhum produto de alongamento.

Evolução no tempo da tradução e incubação pós-tradução. A reacção de tradução era relativamente rápida e estava geralmente completa no espaço de 25 minutos, a 30°C. A reacção de fusão, no entanto, era mais lenta. Quando se utilizou um ligante convencional (dA27dCdCP) a 30 °C, a síntese da fusão 60 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ atingiu ο seu nível máximo em mais 45 minutos. A incubação pós-tradução pôde ser realizada a temperaturas baixas, por exemplo, temperatura ambiente, 0°C, ou -20°C. Observou-se menos degradação do molde de ARNm a -20 °C, e os melhores resultados de fusão foram obtidos após incubação a -20°C, durante 2 dias.

Efeito da concentração de Mg2+. Uma concentração elevada de Mg2+ na incubação pós-tradução estimulou bastante a formação da fusão. Por exemplo, para o molde de ARN de myc descrito acima, observou-se uma estimulação de 3-4 vezes da formação da fusão utilizando um ligante convencional (dA27dCdCP) na presença de Mg2+ 50 mM durante a incubação de 16 horas a -20°C (Figura 17, comparar pistas 3 e 4). De igual modo, também se observou uma formação de fusão eficiente utilizando uma incubação pós-tradução na presença de uma concentração de Mg2+ de 50-100 mM quando as reacçôes foram realizadas à temperatura ambiente, durante 30-45 minutos.

Comprimento e sequência do ligante. A dependência da reacção de fusão no comprimento do ligante também foi analisada. Na gama entre 21 e 30 nucleótidos (n=18-27), observou-se pouca alteração na eficiência da reacção de fusão (como descrito acima). Ligantes mais curtos (e.g., com 13 nucleótidos de comprimento) resultaram numa menor fusão. Além disso, embora ligantes particulares de comprimento maior (isto é, de 45 nucleótidos e 54 nucleótidos) também tenham resultado em eficiências de fusão de certo modo menores, continua a ser provável que ligantes ainda maiores também possam ser utilizados para optimizar a eficiência da reacção de fusão.

Em relação à sequência do ligante, a substituição de resíduos de desoxirribonucleótido próximo da extremidade 3' com resíduos de ribonucleótido não alterou significativamente a eficiência da fusão. A sequência dCdCP (ou rCrCP) na extremidade 3' do ligante era, no entanto, importante para a formação da fusão. A substituição de dCdCP com dUdUP reduziu significativamente a eficiência da formação da fusão.

Flexibilidade do ligante. A dependência da reacção de fusão na flexibilidade do ligante também foi testada. Nestas experiências, determinou-se que a eficiência da fusão era 61 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ baixa se a rigidez do ligante fosse aumentada por fusão com um oligonucleótido complementar próximo da extremidade 3'. De igual modo, quando se utilizou um ligante mais flexível (por exemplo, dA2iC9C9C9dAdCdCP, em que C9 representa HO(CH2CH20) 3P02) , a eficiência da fusão era significativamente melhorada. Em comparação com o ligante convencional (dA27dCdCP) , a utilização de um ligante mais flexível (dA^CgCgCgdAdCdCP) melhorou a eficiência de fusão para ARN124 em mais de 4 vezes (Figura 17, comparar pistas 1 e 9) . Adicionalmente, ao contrário do molde com o ligante convencional, cuja fusão pós-tradução prosseguiu fracamente na ausência de uma concentração elevada de Mg2+ (Figura 17, pista 3 e 4), o molde com o ligante flexível não necessitava de Mg2+ elevado para produzir um bom rendimento de produto de fusão numa incubação pós-tradução prolongada, a -20°C (Figura 17, comparar pistas 11 e 12) . Este ligante era, portanto, muito útil se não se desejassem adições pós-tradução de concentrações elevadas de Mg2+. Adicionalmente, o ligante flexível também produziu rendimentos de fusão óptimos, na presença de Mg2+ elevado.

Quantificação da eficiência de fusão. A eficiência de fusão pode ser expressa quer como a fracção de péptido traduzido convertido em produto de fusão, quer como a fracção de molde inicial convertida em produto de fusão. Para determinar a fracção de péptido traduzido convertido em produto de fusão, utilizou-se marcação com 35S-Met do péptido traduzido. Nestas experiências, quando se utilizou um ligante dA27dCdCP ou dA27rCrCP, cerca de 3,5% do péptido traduzido foram fundidos com o seu ARNm após uma incubação de tradução de 1 hora, a 30°C. Este valor aumentou para 12% após incubação durante a noite a -20°C. Quando a incubação pós-tradução foi realizada na presença de uma concentração elevada de Mg2+, mais do que 50% do péptido traduzido foram fundidos com o molde.

Para um molde com um ligante flexível, aproximadamente 25% do péptido traduzido foram fundidos com o molde após 1 hora de tradução a 30°C. Este valor aumentou para mais de 50% após incubação durante a noite a -20°C e para mais de 75%, se a incubação pós-tradução fosse realizada na presença de Mg2+ 50 mM. 62 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Para determinar a percentagem do molde de entrada convertido em produto de fusão, as traduções foram realizadas utilizando molde de ARNm-ligante marcado com 32P. Quando se utilizou o ligante flexível e se realizou a incubação pós-tradução a -20°C sem adição de Mg2+, cerca de 20%, 40%, 40%, 35%, e 20% do molde inicial foram convertidos na fusão ARNm-péptido quando a concentração do molde de ARN de entrada era de 800, 400, 200, 100, e 50 nM, respectivamente (Figura 18) . Obtiveram-se resultados semelhantes quando a incubação pós-tradução foi realizada na presença de Mg2+ 50 mM. Obtiveram-se os melhores utilizando lisados obtidos da Novagen, Amersham, ou Ambion (Figura 19) .

As diferenças de mobilidade entre os ARNm e fusões ARNm-péptido, tal como medidas por SDS-PAGE, podem ser muito pequenas se o molde de ARNm for longo. Nestes casos, o molde pode ser marcado na extremidade 5' do ligante com 32P. A porção de ARN longa pode ser então digerida com ARNase H na presença de uma tira de ADN complementar, após tradução/incubação e a eficiência da fusão pode ser determinada por quantificação da razão entre ligante não modificado e fusão ligante-péptido. Em comparação com a digestão com ARNase A, que produz 3'-P e 5'-OH, esta abordagem tem a vantagem de o 32P na extremidade 5' do ligante não ser removido.

Fusão intramolecular versus intermolecular durante a incubação pós-tradução. Além das experiências acima, testámos se a reacção de fusão que ocorria a -20°C na presença de Mg2+ era de natureza intra- ou intermolecular. Fez-se a co-incubação de ligante livre (dA27dCdCP ou dA2iC9C9C9dAdCdCP, em que C9 e -O (CH2CH20) 3P02-) com um molde contendo um ligante de ADN, mas sem puromicina na extremidade 3', sob as condições de incubação durante a tradução e pós-tradução descritas acima. Nestas experiências, não se incorporou nenhuma quantidade detectável (isto é menos que 2% do nível normal) de 35S-Met no produto ligante-péptido, sugerindo que a fusão pós-tradução ocorreu essencialmente entre o péptido nascente e o ARNm ligado ao mesmo ribossoma. 63 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Resultados da optimização. Como ilustrado acima, utilizando o ligante flexível e/ou realizando a incubação pós-tradução na presença de uma concentração elevada de Mg2+, as eficiências de fusão aumentaram para aproximadamente 40% do ARNm de entrada. Estes resultados indicaram que podiam ser produzidas tanto quanto 1014 moléculas da fusão ARNm-péptido por ml de mistura reaccional in vitro, produzindo conjugados de fusões ARNm-péptido de complexidade muito elevada, para utilização em experiências de selecção in vitro.

ENRIQUECIMENTO SELECTIVO DE FUSÕES ARN-PROTEÍNA

Demonstrámos a possibilidade de utilizar fusões ARN-péptido em experiências de selecção e evolução, por enriquecimento de uma fusão ARN-péptido particular a partir de um conjunto complexo de fusões de sequências aleatórias com base no péptido codificado. Em particular, preparámos uma série de misturas em que uma pequena quantidade de sequência conhecida (neste caso, o molde myc longo, LP154) foi combinada com alguma quantidade do conjunto de sequências aleatórias (isto é, LP 160). Estas misturas foram traduzidas e os produtos de fusão ARN-péptido seleccionados por cromatografia de afinidade de oligonucleótido e dissulfureto, como aqui descrito. As fusões myc-molde foram selectivamente imunoprecipitadas com anticorpo monoclonal anti-myc (Figura 16A). Para medir o enriquecimento obtido neste passo selectivo, amplificaram-se por PCR alíquotas da mistura de fusões ADNc/ARNm-péptido, de antes e depois da imunoprecipitação, na presença de um iniciador marcado radioactivamente. O ADN amplificado foi digerido com uma endonuclease de restrição que cortou a sequência do molde de myc, mas não o conjunto (Figuras 16B e 16C) . A quantificação da razão entre ADN cortado e não cortado indicou que a sequência de myc estava enriquecida em 20-40 vezes em relação à biblioteca aleatória, por imunoprecipitação.

Estas experiências foram realizadas como se segue.

Reacções de tradução. As reacções de tradução foram realizadas de um modo geral como descrito acima. Especificamente, as reacções foram realizadas a 30°C durante uma hora, de acordo com as especificações do fabricante 64 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ (Novagen) e congeladas durante a noite a -20°C. Fizeram-se duas versões de seis amostras, uma contendo 35S metionina e uma contendo metionina fria, adicionada a uma concentração final de 52 μΜ. As reacções 1-6 continham as quantidades de moldes descritas na Tabela 2. Todos os números na Tabela 2 representam picomoles de molde por 25 μΐ de mistura reaccional. TABELA 2

Razões de moldes utilizadas na selecção dopada

Reacção LP154 LP160 2 5 3 120 4 0,1 20 5 0,01 20 6 --- 20

Preparação_de_dT25_estreptavidina-agarose . A estreptavidina-agarose (Pierce) foi lavada três vezes com TE 8,2 (Tris-Cl 10 mM pH 8,2, EDTA 1 mM) e ressuspensa como uma lama a 1:1 (v/v) em TE 8,2. Adicionou-se em seguida 3'-biotinil-T25 sintetizado utilizando Bioteg CPG (Glen Research) na concentração final desejada (geralmente 10 ou 20 μΜ) e a incubação foi realizada com agitação durante 1 hora. A dT25 estreptavidina-agarose foi então lavada três vezes com TE 8,2 e armazenada a 4°C, até ser utilizada.

Purificação de moldes a partir de reacções de tradução. Para purificar moldes a partir de reacções de tradução, removeram-se 25 μΐ de cada reacção e adicionaram-se a 7,5 ml de tampão de isolamento (NaCl 1 M, Tris-Cl 100 mM pH 8,2, EDTA 10 mM, DTT 0,1 mM) e 125 μΐ de dT25 estreptavidina-agarose 20 μΜ. Esta solução foi incubada a 4°C durante uma hora, com rotação. Os tubos foram centrifugados e removeu-se o eluente. Adicionou-se 1 ml de tampão de isolamento, a lama foi ressuspensa e as misturas foram transferidas para tubos de microcentrifuga de 1,5 ml. As amostras foram em seguida lavadas quatro vezes com aliquotas de 1 ml de tampão de isolamento arrefecido em gelo. As amostras de quente e frio de reacções idênticas foram então combinadas numa unidade de 65 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ filtros de filtro MC Millipore e eluídas da dT25-agarose por lavagem com 2 volumes de 100 μΐ de H20, DTT 0,1 mM e 2 volumes de NaOH 15 mM, EDTA 1 mM. A este eluente adicionaram-se 40 μΐ de uma lama a 50% de tiopropil-Sepharose (Pharmacia) lavada e a incubação foi realizada a 4°C com rotação durante 1 hora. As amostras foram em seguida lavadas com três volumes de 1 ml de TE 8,2 e removeu-se o eluente. Adicionou-se ao sólido 1 μΐ de DTT 1 M (volume total de aproximadamente 20-30 μΐ) , e a amostra foi incubada durante várias horas, removida e lavada quatro vezes com 20 μΐ de H20 (volume total de 90 μΐ) . O eluente continha tiopiridona 2,5 mM, tal como avaliado por absorvância no UV. Precipitaram-se 50 μΐ desta amostra com etanol adicionando 6 μΐ de NaOAc 3 M pH 5,2, espermina 10 mM, 1 μΐ de glicogénio (10 mg/ml, Boehringer Mannheim) , e 170 μΐ de EtOH a 100%, incubando durante 30 minutos a -70°C e centrifugando durante 30 minutos a 13.000 rpm numa microcentrifuga.

Reacções de transcriptase inversa. Realizaram-se reacções de transcriptase inversa quer nas amostras precipitadas com etanol, quer nas amostras de eluente tiopiridona como se segue. Para as amostras precipitadas com etanol, 30 μΐ de molde ressuspenso, H20 até 48 μΐ, e 200 picomoles de iniciador 21.103 (SEQ ID NO:22) foram hibridados a 70°C, durante 5 minutos e arrefeceu-se em gelo. A esta amostra adicionaram-se 16 μΐ de tampão de primeira cadeia (Tris-Cl 250 mM pH 8,3, KC1 375 mM, e MgCl2 15 mM; disponível da Gibco BRL, Grand Island, Nova Iorque), adicionaram-se 8 μΐ de DTT 100 mM e 4 μΐ de NTP 10 mM e equilibrou-se a 42°C e adicionaram-se 4 μΐ de transcriptase inversa Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, Nova Iorque). Adicionou-se H20 (13 μΐ) ao eluente de TP Sepharose (35 μΐ) e as reacções foram realizadas como acima. Após incubação durante 1 hora, combinaram-se as amostras de números iguais (volume total de 160 μΐ) . Reservaram-se 10 μΐ de amostra para a PCR de cada amostra não seleccionada e reservaram-se 150 μΐ de amostra para imunoprecipitação.

Imunoprecipitação. Para realizar imunoprecipitações, adicionaram-se 170 μΐ da reacção de transcrição inversa a 1 ml de tampão de diluição (Tris-Cl 10 mM, pH 8,2, NaCl 140 mM, 66 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Triton X-100 a 1% ν/ν) e 20 μΐ de conjugado Proteína G/A (Calbiochem, La Jolla, CA), e fez-se uma pré-clarificação por incubação a 4°C com rotação, durante 1 hora. O eluente foi removido e adicionaram-se 20 μΐ de conjugado G/A e 20 μΐ de anticorpo monoclonal (2 pg, 12 picomoles) e a amostra foi incubada com rotação durante duas horas a 4°C. O conjugado foi precipitado por microcentrifugação a 2500 rpm durante 5 minutos, o eluente foi removido e o conjugado foi lavado três vezes com alíquotas de 1 ml de tampão de diluição arrefecido em gelo. A amostra foi em seguia lavada com 1 ml Tris-Cl 10 mM, pH 8,2, NaCl 100 mM arrefecido em gelo. Os fragmentos ligados foram removidos utilizando 3 volumes de HOAc a 4% congelado e as amostras foram liofilizadas até à secura. PCR de amostras seleccionadas e não seleccionadas. Realizaram-se reacções de PCR adicionando 20 μΐ de NH4OH concentrado a 10 μΐ do material não seleccionado e à totalidade do material seleccionado e incubou-se durante 5 minutos cada, a 55°C, 70°C e 90°C para destruir qualquer ARN presente na amostra. As amostras foram então evaporadas até à secura utilizando um Speedvac. Adicionaram-se a cada amostra 200 μΐ de mistura de PCR (1 μΜ de iniciadores 21.103 e 42.108, dNTP 200 μΜ em tampão de PCR mais Mg2+ (Boehringer Mannheim) , e 2 μΐ de polimerase Taq (Boehringer Mannheim)). Fizeram-se 16 ciclos de PCR na amostra não seleccionada número 2 e fizeram-se 19 ciclos em todas as outras amostras.

As amostras foram em seguida amplificadas na presença de iniciador 21.103 marcado com 32P em 5', de acordo com a Tabela 3 e purificadas duas vezes individualmente, utilizando kits de purificação de PCR directa Wizard (Promega) para remover todo o iniciador e fragmentos mais curtos. 67 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ TABELA 3

Amplificação de amostras de PCR seleccionadas e não seleccionadas

Amostra Tipo Volume Ciclos 1 Não seleccionado 20 μΐ 5 2 Não seleccionado 5 μΐ 4 3 Não seleccionado 20 μΐ 5 4 Não seleccionado 20 μΐ 5 5 Não seleccionado 20 μΐ 5 6 Não seleccionado 20 μΐ 5 1 Seleccionado 20 μΐ 5 2 Seleccionado 5 μΐ 4 3 Seleccionado 20 μΐ 5 4 Seleccionado 20 μΐ 7 5 Seleccionado 20 μΐ 7 6 Seleccionado 20 μΐ 7

Digestões com enzimas de restrição. Adicionou-se em quantidades iguais ADN marcado com 32P preparado a partir de cada uma das reacções de PCR acima (por cpm de amostra) a reacções de digestão com enzimas de restrição de acordo com a Tabela 4. O volume total de cada reacção era de 25 μΐ. Adicionaram-se 0,5 μΐ de Alwnl (5 unidades, New England Biolabs) a cada reacção. As amostras foram incubadas a 37°C durante 1 hora e a enzima foi inactivada pelo calor, por uma incubação de 20 minutos a 65°C. As amostras foram em seguida misturadas com 10 μΐ de tampão de carga desnaturante (1 ml formamida ultrapura (USB), 20 μΐ de EDTA 0,5 M e 20 μΐ de NaOH 1 M), aquecidas a 90°C durante 1 minuto, arrefecidas e carregadas num gel de poliacrilamida desnaturante a 12%, contendo ureia 8M. Após electroforese, o gel foi fixado com HOAc a 10% (v/v), MeOH a 10% (v/v), H20. 68 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ TABELA 4 condiçoes de digestão com enzimas de restrição w/ Alwnl Amostra Tipo Volume de ADN Volume adicionado i à reacção total 1 Não seleccionado 20 μΐ 25 μΐ 2 Não seleccionado 4 μΐ 25 μΐ 3 Não seleccionado 20 μΐ 25 μΐ 4 Não seleccionado 20 μΐ 25 μΐ 5 Não seleccionado 4 μΐ 25 μΐ 6 Não seleccionado 20 μΐ 25 μΐ 1 Seleccionado 20 μΐ 25 μΐ 2 Seleccionado 8 μΐ 25 μΐ 3 Seleccionado 12 μΐ 25 μΐ 4 Seleccionado 12 μΐ 25 μΐ 5 Seleccionado 20 μΐ 25 μΐ 6 Seleccionado 20 μΐ 25 μΐ

Quantificação da digestão. A quantidade de ADN de myc versus conjunto presente numa amostra foi quantificada utilizando um phosphorlmager (Molecular Dynamics). A quantidade de material presente em cada banda foi determinada como o volume integrado de rectângulos idênticos desenhados em torno das bandas do gel. Os cpm totais presentes em cada banda foram calculados como volume menos o ruído de fundo. Utilizaram-se três valores de ruído de fundo: (1) uma média de quadrados idênticos fora da área onde ocorreram as contagens no gel; (2) os cpm presentes na pista do conjunto não seleccionado em que a banda de myc deverá aparecer (não aparece nenhuma banda nesta posição no gel); e (3) um valor normalizado que reproduzia o valor mais próximo dos incrementos de 10 vezes de molde, entre pistas não seleccionadas. As pistas 2, 3 e 4 das Figuras 16B e 16C mostram o enriquecimento da sequência alvo versus o conjunto. O enriquecimento demonstrável na pista 3 (não seleccionado/seleccionado) originou os valores mais elevados (17, 43 e 27 vezes utilizando os métodos 1-3, respectivamente) devido à optimização da razão entre sinal e ruído para esta amostra. Estes resultados estão resumidos na Tabela 5. 69 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ TABELA 5

Enriquecimento de molde versus conjunto de myc Método Pista 2 (20) Pista 3 (200) Pista 4 (2000 1 7,0 16,6 5,7 2 10,4 43 39 3 8,7 27 10,2

Num segundo conjunto de experiências, estes mesmos produtos de PCR foram purificados uma vez utilizando kits de purificação de PCR directa Wizard e as digestões foram quantificadas pelo método (2) acima. Nestas experiências obtiveram-se resultados semelhantes; enriquecimentos de 10,7, 38 e 12 vezes, respectivamente, foram medidos para amostras equivalentes às das pistas 2, 3 e 4 acima.

UTILIZAÇÃO DE SISTEMAS DE SELECÇÃO DE PROTEÍNA

Os sistemas de selecção da presente invenção têm aplicações comerciais em qualquer área em que a tecnologia de proteínas é utilizada para resolver problemas terapêuticos, de diagnóstico ou industriais. Esta tecnologia de selecção é útil para melhorar ou alterar proteínas existentes, bem como para o isolamento de novas proteínas com funções desejadas. Estas proteínas podem ser sequências que ocorrem naturalmente, podem ser formas alteradas de sequências que ocorrem naturalmente, ou podem ser sequências parcial ou totalmente sintéticas.

Isolamento de novos reagentes de ligação. Numa aplicação particular a tecnologia de fusão ARN-proteína aqui descrita é útil para o isolamento de proteínas com propriedades de ligação específica (por exemplo, ligação do ligando). As proteínas que exibem interacções de ligação altamente específicas podem ser utilizadas como reagentes de reconhecimento que não anticorpos, permitindo que a tecnologia de fusão ARN-proteína contorne a tecnologia tradicional de anticorpos monoclonais. Os reagentes do tipo anticorpo isolados por este método podem ser utilizados em qualquer área em que se utilizam anticorpos tradicionais, incluindo aplicações de diagnóstico e terapêuticas. 70 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ

Melhoria de anticorpos humanos. A presente invenção pode também ser utilizada para melhorar anticorpos humanos ou humanizados para o tratamento de qualquer uma de várias doenças. Nesta aplicação, desenvolvem-se bibliotecas de anticorpos e faz-se a sua pesquisa in vitro, eliminando a necessidade de técnicas como fusão celular ou apresentação em fagos. Numa aplicação importante, a invenção é útil para melhorar bibliotecas de anticorpo de cadeia simples (Ward et al., Nature 341:544 (1989); e Goulot et al., J. Mol. Biol. 213:617 (1990)). Para esta aplicação, a região variável pode ser construída, ou a partir de uma fonte humana (para minimizar possíveis reacções imunitárias adversas do receptor), ou pode conter uma cassete totalmente aleatória (para maximizar a complexidade da biblioteca). Para pesquisar moléculas de anticorpo melhoradas, testa-se um conjunto de moléculas candidatas quanto à ligação a uma molécula alvo (por exemplo, um antigénio imobilizado como se mostra na Figura 2). Níveis de rigor mais elevados são então aplicados ao passo de ligação à medida que a selecção progride de um ciclo para o próximo. Para aumentar o rigor, as condições tais como o número de passos de lavagem, concentração de competidor em excesso, condições tampão, duração do tempo de reacção de ligação e escolha da matriz de imobilização, são alteradas.

Os anticorpos de cadeia simples podem ser utilizados, ou directamente para terapia, ou indirectamente para conceber anticorpos convencionais. Estes anticorpos têm várias aplicações potenciais, incluindo o isolamento de anticorpos anti-auto-imunes, supressão imunitária e o desenvolvimento de vacinas para doenças virais, tais como a SIDA.

Isolamento de catalisadores novos. A presente invenção pode também ser utilizada para seleccionar novas proteínas catalíticas. A selecção e evolução in vitro têm sido utilizadas anteriormente para o isolamento de novos ARN e ADN catalíticos e, na presente invenção, são utilizadas para o isolamento de novas proteínas enzimas. Num exemplo particular desta abordagem, um catalisador pode ser isolado indirectamente seleccionando para ligação a um análogo químico do estado de transição do catalisador. Noutro exemplo particular, o isolamento directo pode ser realizado seleccionado para a formação de ligações covalentes com um 71 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ substrato (por exemplo, utilizando um substrato ligado a um marcador de afinidade) ou por clivagem (por exemplo, seleccionado para a capacidade de quebrar uma ligação especifica e libertar assim membros catalíticos de uma biblioteca a partir de um suporte sólido).

Esta abordagem para o isolamento de novos catalisadores tem pelo menos duas vantagens importantes em relação à tecnologia de anticorpos catalíticos (revisto em Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)). Primeiro, na tecnologia de anticorpos catalíticos, o conjunto inicial limita-se geralmente ao enrolamento da imunoglobulina; pelo contrário, a biblioteca de fusões ARN-proteína de partida pode ser completamente aleatória ou pode consistir, sem limitação, de variantes de estruturas enzimáticas conhecidas ou estruturas base de proteína. Além disso, o isolamento de anticorpos catalíticos baseia-se geralmente numa selecção inicial para a ligação a análogos de reacção do estado de transição, seguido de pesquisa laboriosa de anticorpos activos; mais uma vez, pelo contrário, a selecção directa para a catálise é possível utilizando uma abordagem de biblioteca de fusão ARN-proteína, como anteriormente demonstrado utilizando bibliotecas de ARN. Numa abordagem alternativa para isolar proteínas enzimas, podem-se combinar as abordagens de análogo de estado de transição e de selecção directa.

As enzimas obtidas por este método têm bastante valor. Por exemplo, existe actualmente uma necessidade premente de catalisadores industriais novos e eficazes que permitam o desenvolvimento de processos químicos melhorados. Uma vantagem principal da invenção é que as selecções podem ser realizadas em condições arbitrárias e não se limitam, por exemplo, a condições in vivo. A invenção facilita assim o isolamento de novas enzimas ou variantes melhoradas de enzimas existentes que podem realizar transformações altamente específicas (e desse modo minimizar a formação de produtos secundários indesejados) , funcionando ao mesmo tempo em meios ambiente pré-determinados, por exemplo, meios ambiente de temperatura, pressão ou concentração de solvente elevada.

Interacção armadilha in vitro. A tecnologia de fusão ARN-proteína também é útil para pesquisar bibliotecas de ADNc e 72 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ clonar genes novos com base em interacções proteína-proteína. Por este método, constrói-se uma biblioteca de ADNc a partir de uma fonte desejada (por exemplo, pelo método de Ausubel et al., supra, capítulo 5). A cada um dos ADNc candidatos liga-se (por exemplo, utilizando as técnicas descritas acima para a produção de LP77, LP154 e LP160) um aceitador peptídico (por exemplo, tal como uma cauda de puromicina). Produzem-se então fusões ARN-proteína como aqui descrito e a capacidade destas fusões (ou versões melhoradas das fusões) interagirem com moléculas particulares é em seguida testada como descrito acima. Se desejado, podem evitar-se neste processo codões de terminação e regiões 3' UTR, quer (i) adicionando ARNt supressor para permitir a leitura das regiões de terminação, (ii) removendo o factor de libertação da reacção de tradução por imunoprecipitação, (iii) uma combinação de (i) e (ii) , ou (iv) removendo os codões de terminação e 3' UTR das sequências de ADN.

0 facto do passo de interacção ocorrer in vitro permite o controlo cuidadoso do rigor da reacção, utilizando condições de competidor não específico, temperatura e iónicas. A alteração de moléculas pequenas normais com análogos não hidrolisáveis (e.g., ATP versus ATPgS) proporciona selecções que discriminam entre diferentes confórmeros da mesma molécula. Esta abordagem é útil quer para a clonagem, quer identificação funcional de muitas proteínas, uma vez que a sequência de ARN do parceiro de ligação seleccionado está ligada de forma covalente e pode, portanto, ser facilmente isolada. Adicionalmente, a técnica é útil para identificar funções e interacções dos -50-100.000 genes humanos cujas sequências estão actualmente a ser determinadas pelo projecto do genoma humano.

UTILIZAÇÃO DE FUSÕES ARN-PROTEÍNA NUM FORMATO DE MICROCHIP

Os "chips de ADN" consistem em séries espacialmente definidas de oligonucleótidos imobilizados ou fragmentos de ADNc ou ADN genómico clonados e têm aplicações, tais como as rápidas sequenciação e determinação do perfil de transcritos. Hibridando uma mistura de fusões ARN-proteína (por exemplo, produzidas a partir de um conjunto de ADN ou ARN celular) com um chip de ADN deste tipo, é possível produzir um "chip de 73 ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ apresentação de proteína," em que cada ponto correspondente a uma sequência imobilizada é capaz de hibridar com a sua sequência de ARN correspondente no conjunto de fusões ARN-proteína. Por esta abordagem, a proteína correspondente é imobilizada de um modo espacialmente definido devido à sua ligação com o seu próprio ARNm e os chips contendo conjuntos de sequências de ADN apresentam o conjunto correspondente de proteínas. Alternativamente, os fragmentos de péptido destas proteínas podem ser apresentados se a biblioteca de fusão for gerada a partir de fragmentos de ADNc ou ADN genómico menores.

Estas apresentações ordenadas de proteínas e péptidos têm muitas utilizações. Por exemplo, representam ferramentas poderosas para a identificação de interacções proteína-proteína anteriormente desconhecidas. Num formato específico, uma sonda de proteína é marcada de forma detectável (por exemplo, com um corante fluorescente) e a proteína marcada é incubada com um chip de apresentação de proteína. Por esta abordagem, a identidade das proteínas que são capazes de se ligar à proteína sonda é determinada a partir da localização dos pontos no chip, que ficam marcados devido à ligação da sonda. Outra aplicação é a determinação rápida de proteínas que são quimicamente modificadas através da acção de enzimas modificadoras (por exemplo, proteína-quinases, aciltransferases e metiltransferases). Incubando o chip de apresentação de proteína com a enzima de interesse e um substrato marcado radioactivamente, seguido de lavagem e autorradiografia, a localização e, portanto, a identidade das proteínas que são substratos para a enzima modificadora podem ser facilmente determinadas. Além disso, a utilização desta abordagem com apresentações ordenadas de péptidos pequenos permite também a localização destes locais de modificação. A tecnologia de apresentação de proteínas pode ser realizada utilizando séries de ácidos nucleicos (incluindo ARN, mas de preferência ADN) imobilizados num suporte sólido adequado. Os suportes sólidos exemplo podem ser feitos de materiais como o vidro (e.g., placas de vidro), silício ou vidro de silício (e.g., microchips) , ou ouro (e.g., placas de ouro) . Os métodos para ligar ácidos nucleicos a regiões precisas nestas superfícies sólidas, e.g., métodos fotolitográficos, são bem conhecidos na arte e podem ser ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ 74 utilizados para produzir suportes sólidos (tais como chips de ADN) para utilização na invenção. Exemplos de métodos para este fim incluem, sem limitação Schena et al., Science 270:467-470 (1995); Kozal et al., Nature Medicine 2:753-759 (1996); Cheng et al., Nucleic Acids Research 24:380-385 (1996); Lipshutz et al., BioTechniques 19:442-447 (1995);

Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5022-5026 (1994);

Fodor et al., Nature 364:555-556 (1993); Pirrung et al.,

Patente U.S. No. 5.143.854; e Fodor et al., WO 92/10092.

Lisboa, ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ 1/5

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a selecçao de uma molécula de proteína ARN ou ADN desejada, compreendendo os passos de: a) proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, em que cada uma compreende uma sequência de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata e em que cada uma está ligada de forma covalente a um aceitador peptídico na extremidade 3' da referida sequência codificante de proteína candidata; b) traduzir in vitro ou in situ a referida sequência codificante de proteína candidata para produzir uma população de fusões ARN-proteína candidatas; e c) seleccionar uma fusão ARN-proteína desejada, seleccionando desse modo a referida proteína desejada ou o referido ARN desejado; ou produzir a partir da referida molécula de ARN da referida fusão, uma molécula de ADN que codifica para a referida proteína desejada, seleccionando desse modo a referida molécula de ADN desejada. 2. Método para a selecção de uma proteína com uma função alterada, ou uma molécula de ADN que codifica para uma proteína com uma função alterada, em relação a uma proteína de referência, compreendendo os passos de: a) produzir uma população de moléculas de ARN candidatas a partir de uma população de moldes de ADN candidatos, em que os referidos moldes de ADN candidatos têm, cada um, uma sequência codificante de proteína candidata que difere da referida sequência codificante de proteína de referência, em que as referidas moléculas de ARN compreendem, cada uma, uma sequência de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente à referida sequência codificante da proteína candidata e estando cada uma ligada de forma covalente a um aceitador peptídico na extremidade 3'; b) traduzir in vitro ou in situ as referidas sequências codificantes de proteína candidatas para produzir uma população de fusões ARN-proteína candidatas; e ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ 2/5 c) seleccionar uma fusão ARN-proteína com uma função alterada, seleccionando desse modo a referida proteína com a referida função alterada; ou produzir a partir da referida molécula de ARN da referida fusão uma molécula de ADN que codifica para a proteína desejada, seleccionando desse modo a referida molécula de ADN desejada. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida proteína desejada ou o referido ARN desejado no passo (c) é seleccionado contactando a referida população de fusões ARN-proteína com um parceiro de ligação específico para a porção de ARN ou para a porção de proteína da referida fusão ARN-proteína, sob condições que separam substancialmente o referido complexo de fusão parceiro de ligação-ARN-proteína de membros não ligados da referida população; libertando as referidas fusões ARN-proteína ligadas do referido complexo; e contactando a referida população de fusões ARN-proteína do passo (c) com um parceiro de ligação específico para a porção de proteína da referida fusão ARN-proteína desejada, sob condições que separam substancialmente o referido complexo de fusão parceiro de ligação-ARN-proteína de membros não ligados da referida população, seleccionando desse modo a proteína desejada ou o ARN desejado. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o referido método compreende ainda repetir os passos (a) a (c) da reivindicação 1. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o referido aceitador peptídico é puromicina. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que cada uma das referidas moléculas de ARN candidatas compreende também uma sequência de pausa, ou compreende também um ADN ou uma sequência análoga de ADN ligada de forma covalente à extremidade 3' da referida molécula de ARN. ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ 3/5 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a referida população de moléculas de ARN candidatas compreende pelo menos 1013 moléculas de ARN diferentes. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a referida reacção de tradução in vitro é realizada num lisado preparado a partir de uma célula eucariota ou uma sua porção. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a referida reacção de tradução in vitro é realizada num lisado de reticulócitos ou num lisado de qérmen de triqo. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, em que a referida reacção de tradução in vitro é realizada num lisado preparado a partir de uma célula bacteriana ou uma sua porção. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o referido passo de selecção compreende a liqação da referida proteína desejada a um parceiro de liqação imobilizado. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o referido passo de selecção compreende o ensaio quanto a uma actividade funcional da referida proteína desejada. 13. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que a referida molécula de ADN é amplificada. 14. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o referido método compreende ainda repetir os passos (a) a (c) . 15. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o referido método compreende também fazer a transcrição de uma molécula de ARN a partir da referida molécula de ADN e repetir os passos (a) a (c). ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ 4/5 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o referido ARN está ligado de forma covalente através de uma ligação amida à referida proteína, na referida fusão ARN-proteína. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o referido ARN está ligado de forma covalente à referida proteína na referida fusão ARN-proteína, sendo a referida ligação covalente resistente a clivagem por um ribossoma. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que após o passo de tradução in vitro se faz uma incubação na presença de Mg2+ 50-100 mM. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a referida fusão ARN-proteína compreende também um ácido nucleico ou uma sequência análoga de ácido nucleico posicionada próximo do referido aceitador peptídico, o que aumenta a flexibilidade. 20. Fusão ARN-proteína seleccionada por qualquer dos métodos de acordo com as reivindicações 1-4. 21. Molécula compreendendo um ácido ribonucleico ligado de forma covalente, através de uma ligação amida, a uma proteína. 22. Molécula de acordo com a reivindicação 21, em que a referida proteína é codificada pelo referido ácido ribonucleico. 23. Molécula de acordo com a reivindicação 21, em que o referido ácido ribonucleico é um ARN mensageiro. 24. Molécula compreendendo um ácido ribonucleico ligado de forma covalente a uma proteína, sendo a referida proteína totalmente codificada pelo referido ácido ribonucleico. 25. Molécula de acordo com a reivindicação 24, em que o referido ácido ribonucleico é ARN mensageiro. ΕΡ Ο 971 946 /ΡΤ 5/5 26. Molécula compreendendo um ácido ribonucleico ligado de forma covalente a uma proteína, sendo a referida ligação covalente resistente a clivagem por um ribossoma. 27. Molécula de acordo com a reivindicação 26, em que o referido ácido ribonucleico é ARN mensageiro. 28. Ácido ribonucleico compreendendo uma sequência de iniciação da tradução e um codão de iniciação ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata, estando o referido ácido ribonucleico ligado de forma covalente a um aceitador peptídico na extremidade 3' da referida sequência codificante de proteína candidata.

Lisboa,