CN121079327A - 用于降低抗体粘度的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了鉴定相对于亲本抗原结合多肽（例如，抗体、其抗原结合片段或抗体构建体）具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、其抗原结合片段或基于抗体的构建体的变体）的方法。还提供了通过所述方法所产生的抗原结合多肽变体。进一步提供了相关的文库和筛选此类文库的方法。还提供了鉴定抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体中的影响所述抗体、所述抗原结合片段或所述抗体构建体的所述粘度的一个或多个氨基酸的方法。还提供了具有经降低的粘度的示例性抗体可变结构域。

Description

用于降低抗体粘度的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求 2023 年 5 月 12 日提交的美国临时专利申请号 63/466,219 和2023 年 10 月 3 日提交的美国临时专利申请号 63/587,649 的优先权和权益，其各自的内容特此以全文引用方式并入本文中。

技术领域

本申请涉及降低抗体组合物的粘度的方法，以及通过该方法产生的抗体。

序列表

电子序列表（146392066640seqlist.xml；大小：22,642 个字节；以及创建日期：2024 年 5 月 8 日）的内容以全文引用方式并入本文中。

背景技术

在过去三十年中，美国食品药物管理局 (US FDA) 已经批准了大约 125 种生物药物，包括基于抗体的治疗剂，例如，单克隆抗体 (mAb)、抗体药物缀合物和 Fc 融合蛋白。大多数基于抗体的治疗剂经静脉内 (IV) 施用。然而，IV 施用通常需要前往医疗机构，并且通常与较长的施用时间、较高的医疗成本和较低的患者依从性相关联。替代性途径，即皮下施用，愈来愈多地用于慢性病患者，因为患者一生中可能需要频繁给予生物药物。目前，大约 30% 已经批准的抗体治疗剂通过皮下注射给予。参见，例如，Carter 和 Rajpal(2022) Cell, 185(15): P2789-2805。皮下注射有时可由患者使用即用型递送装置自行施用，这有利于舒适性和隐私。此类装置中含有的基于抗体的治疗剂的浓缩溶液可提供注射之间的更长间隔的额外益处，这可通过最大限度地减少医院或诊所就诊次数并提高患者对治疗方案的依从性和坚持性来降低健康照护成本。

开发包含基于抗体的治疗剂的调配物以用于皮下施用是关键的考虑因素。可经皮下注射的药物的体积通常为 1 至 2 mL，但也可达到 3 mL 的体积。如此低的体积需要例如以通常 ≥150 mg/mL 的浓度调配基于抗体的治疗剂以递送所需的剂量。然而，在一些情况下，此类高度浓缩的溶液可表现出高粘度，导致开发基于抗体的治疗剂作为适用于皮下施用的药物时的复杂性。高粘度调配物可增加注射时间，并且可导致注射部位疼痛，对患者依从性产生不利影响。此外，高粘度调配物在基于抗体的治疗剂的制造期间也有困难。

尽管已广泛研究了影响高浓度抗体溶液的粘度的因素，但预测抗体、其抗原结合片段或基于抗体的构建体的粘度仍是挑战。本领域需要的是预测并降低组合物的粘度的经改进的方法，该组合物包括高浓度的基于抗体的治疗剂，包含抗体、其抗原结合片段和基于抗体的构建体。

发明内容

在一些实施例中，提供一种鉴定相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体的方法，其包括：(a) 鉴定该亲本抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向(SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸；(c) 测量该抗原结合多肽变体的粘度；以及 (d) 鉴定相对于亲本多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的一个或多个野生型氨基酸是表面暴露的。在一些实施例中，一个或多个野生型氨基酸为芳香族氨基酸，并且一个或多个芳香族氨基酸经带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸取代。在一些实施例中，一个或多个芳香族氨基酸选自由以下项组成的组：W、Y 和 F。在一些实施例中，带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸选自由 A、I、L、V、D、E、H、K、R、N、Q、S 和 T 组成的组。在一些实施例中，一个或多个野生型氨基酸具有较小侧链，并且其中具有较小链的一个或多个氨基酸经带电氨基酸取代。在一些实施例中，具有较小侧链的一个或多个野生型氨基酸选自由以下项组成的组：A、I、L、V、N、Q、S、G、P、C、M 或T。在一些实施例中，带电氨基酸选自由以下项组成的组：R、K、H、D 和 E。

在一些实施例中，高 SAP 值为 2 或更大，诸如 2.3 或更大。在一些实施例中，高SASA 比率为 0.5 或更大。在一些实施例中，高 SASA 比率为 0.25 或更大。在一些实施例中，抗原结合多肽变体的粘度经由动态光散射 (DLS) 来评定。在一些实施例中，抗原结合多肽变体的粘度经由锥板流变测定来测量。在一些实施例中，抗原结合多肽变体的粘度是在高浓度下测量的。在一些实施例中，高浓度介于约 50 mg/ml 与 300 mg/ml 之间。

在一些实施例中，亲本抗原结合多肽为抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体，该抗体或抗体构建体包含 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一者或多者，并且在该一个或多个 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一个或多个野生型氨基酸经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽为抗体。在一些实施例中，抗体为治疗性抗体。在一些实施例中，抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，抗体为单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施例中，抗体包含人 IgG Fc 区。在一些实施例中，人 IgG 恒定区为IgG1、IgG2 或 IgG4 Fc 区。在一些实施例中，亲本多肽为抗体的抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合片段为 Fab、F(ab')2、三特异性 Fab₃、scFv、单价 IgG、双链抗体、三链抗体、scFv-Vc、微抗体、V_HH、V-NAR、hcIgG 或 IgNAR。在一些实施例中，亲本多肽为抗体构建体。在一些实施例中，抗体构建体为 CrossMab、双重作用 Fab (DAF)、DVD-IgG 或杵臼双特异性抗体。

在一些实施例中，本文所提供的方法包括使抗原结合多肽变体经历至少一个亲和力成熟步骤的步骤。在一些实施例中，抗原结合多肽变体中的经引入以替换具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸的一个或多个经取代的氨基酸在亲和力成熟期间未经随机化。在一些实施例中，提供一种通过本文所述的方法所产生的多肽变体。

在一些实施例中，提供一种包括多个抗原结合多肽变体的文库，其中至少一个变体包含相对于亲本抗原结合多肽的一个或多个氨基酸取代，其中相对于亲本抗原结合多肽的该一个或多个氨基酸取代将经鉴定为具有高 SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸替换为相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸。在一些实施例中，多个包括至少 1,000 个独特变体。在一些实施例中，多个抗原结合变体为多个抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体。

本文还提供一种预测抗原结合多肽中的影响该抗原结合多肽的粘度的一个或多个氨基酸的方法，该方法包括：鉴定抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸，其中具有高 SAP 值和/或高SASA 比率的该一个或多个氨基酸经预测会影响该抗原结合多肽的粘度。本文还提供一种预测抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体中的影响该抗体、抗原结合片段或抗体构建体的粘度的一个或多个氨基酸的方法，其中该抗体、该抗原结合片段或该抗体构建体包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一者或多者，该方法包括：鉴定在该 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一者或多者中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸位置，其中具有 SAP 值和高 SASA 比率的该一个或多个氨基酸位置经预测会影响该抗体、该抗原结合片段或该抗体构建体的粘度。

在一些实施例中，提供一种 SEQ ID NO:3 至 17 或 19 至 22 中任一者中所示的抗体重链可变结构域 (V_H)。在一些实施例中，提供一种抗体，其包含 SEQ ID NO:3 至17 或 19 至 22 中任一者中所示的重链可变结构域 (V_H) 和 SEQ ID NO:2 中所示的轻链可变结构域 (V_L)。

应理解，可将本文所述的各种实施例的一种、一些或全部特性组合以形成本发明的其他实施例。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的这些和其他实施例通过下文的实施方式进一步描述。

附图说明

图1 提供为了测量包含 SEQ ID NO:1 中所示的 V_H 和 SEQ ID NO:2 中所示的V_L 的抗 GCGR IgG1 抗体的丙氨酸取代变体的粘度所进行的实验的结果。参见，Tilegenova 等人(2020) mAbs, 12(1): 1692764。

图2 提供包含 SEQ ID NO:1 中所示的 V_H 和 SEQ ID NO:2 中所示的 V_L 抗GCGR Fab 片段的表面静电势图（左）以及该 Fab 的空间聚集倾向 (SAP)（右）。左侧，表面电荷斑块基于通过自适应泊松-玻尔兹曼求解器 (APBS) 在源自分子动力学 (MD) 轨迹的平均结构上所计算的静电势图进行分析。右侧，圆圈指示与四个 CDR 重叠的大疏水性斑块。此表示是针对跨全部表示 MD 轨迹的每个原子所计算的经平均的 SAP 值。

图3 显示 6 个 CDR，包括具有对于抗 GCGR Fab 具有高 SAP 值（例如，具有 ≥2、诸如 2.3 或更大的 SAP 值）的多个（但不是全部）残基的 4 个 CDR（L3、H1、H2 和 H3），其 SAP 显示于图2。

图4 显示抗 GCGR Fab 的 CDR 中的在实例 1A 中经取代的芳香族氨基酸残基。

图5 显示靶向具有高 SAP 分数的芳香族残基的抗 GCGR IgG1 变体的粘度分析。具体地，为具有高 SAP 分数的 10 个亲本芳香族残基中的各者引入单独的丙氨酸突变。这些单一突变体以及阴性对照突变体 (VH Y79A) 的粘度在 25.0℃、20 mM 组氨酸乙酸盐、pH 5.5 中通过流变仪以 180 mg/mL 的浓度进行测量（柱形图，左轴）。还显示所选择的位点的 SAP 分数（右轴）。此外，测试了将两个粘度降低突变组合的三个双突变体以评估任何附加效应。亲本抗 GCGR 抗体的粘度以虚线显示作为参考。

图6 显示图5 所示的相对于亲本 IgG1 抗体的单一取代变体 IgG1 抗体的粘度与每个原始野生型氨基酸的 SAP 值的比较。

图7 显示将高 SAP 分数和高 SASA 比率组合的抗 GCGR 粘度热点位点的选择。计算 SAP 分数和 SASA 比率，并针对彼此为抗 GCGR Fab 片段中的全部位点进行绘图。虚线指示用于高 SASA 比率 (0.25) 和高 SAP 分数 (2.3) 的截止值。选择具有高 SASA 比率和高 SAP 分数（右上象限）两者的位点进行突变分析，以评估它们对高粘度的作用。此外，还包括高 SASA 比率和低 SAP 区（左上象限中的经标记的残基）以及低 SASA 比率和高 SAP 区（右下象限中的经标记的残基）中的代表性位点，以提供更多综合分析。

图8 显示示例性抗 GCGR IgG1 抗体变体的 DLS 相互作用参数 (k_D, ml/g) 和粘度 (η, cP) 的图。两组测量结果之间的 Pearson 相关效率经计算为 -0.73。黑色粗实线表示 Pearson 线性回归拟合。DLS 相互作用参数在 2 至 10 mg/mL 之间进行测量。粘度在 180 mg/mL 进行测量。

图9 提供报告对约 200 种抗 GCGR IgG1 变体的 DLS 相互作用参数进行筛选的表。显示的是在 25.0℃、20 mM 组氨酸乙酸盐、pH 5.5 中测量的 DLS 相互作用参数。具有极低扩散系数的变体经突出显示（灰色），指示它们在溶液中的多分散行为。使用 (P) 来突出显示亲本残基。具有表达或纯化问题或展现出显著聚集的突变体也经突出显示（黑色）。

图10 显示图9 中所测试的各抗 GCGR IgG1 抗体变体的 DLS 相互作用参数(k_D, ml/g) 和各变体的解离常数 (K_D, M) 的图。抗 GCGR 突变体对 GCGR 胞外结构域的K_D 通过 SPR 确定。相互作用参数 >12 mL/g 且结合亲和力在亲本抗体的 5 倍以内的变体在左上象限中注明。亲本抗体还使用标记来突出显示。

具体实施方式

概述

本文提供鉴定相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体（例如，抗体、其抗原结合片段和基于抗体的构建体）的方法。还提供通过这些方法产生的抗原结合多肽变体（例如，抗体、其抗原结合片段和基于抗体的构建体)。本文还描述包括多个具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体的文库。此外，本申请提供预测抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体中的影响抗体、抗原结合片段或抗体构建体的粘度的一个或多个氨基酸的方法。

本申请基于申请人的意外发现，即抗原结合多肽（例如，抗体、其抗原结合片段或基于抗体的构建体）中的影响粘度的关键氨基酸的特征在于，具有高空间聚集倾向 (SAP)值（例如，≥ 2、诸如 2.3 或更大的 SAP 值）和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率（例如，≥ 0.25、例如 ≥ 0.5 的 SASA 比率）。申请人还意外地发现，将亲本抗原结合多肽中的已被鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个氨基酸用具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸进行取代，产生具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体。发明人还意外地发现，在动态光散射 (DLS) 相互作用参数与粘度之间存在强烈的负相关性，突显了使用 DLS 作为独立的预测性测定或来补充早期药物发现中的其他活性测定的潜力。DLS 筛选方法需要比某些其他粘度测定（诸如锥板流变测定）更少的蛋白质含量。此外，DLS筛选方法可单独使用或与结合测定联合使用，以鉴定具有所期望粘度和/或目标结合亲和力的结合蛋白，以进一步实现结合蛋白（诸如抗体）的治疗性开发。

因此，在一些方面，本文提供一种鉴定相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体的方法，该方法包括：(a) 鉴定该亲本抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸；和(c) 鉴定相对于亲本多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体。在一些实施例中，该方法进一步包括诸如通过测量来确定抗原结合多肽变体的粘度。

在某些方面，本文提供一种鉴定相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体的方法，该方法包括：(a) 鉴定该亲本抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸；(c) 诸如通过测量来确定抗原结合多肽变体的粘度；和(d) 鉴定相对于亲本多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体。

如本文所述，在一些实施例中，这些方法的方面可使用一个或多个处理器（例如，使用计算机）来进行。因此，在一些实施例中，多肽和多肽序列（例如，抗原结合多肽变体）可指基于上下文的各种形式，诸如分子结构或表示序列的数据。

除非本文另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。Singleton, 等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY, 第 3D 版, John Wiley and Sons, New York (2006) 向技术人员提供本发明中所使用的许多术语的通用词典之一。尽管类似或等效于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试中，但优选的方法和材料于本文中描述。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则核酸以 5' 至 3' 定向从左至右书写；氨基酸序列分别从左到右按氨基到羧基定向书写。关于本领域的定义和术语，实务工作者特别要参考 Sambrook 等人, 1989 和 Ausubel FM 等人,1993。应理解，本发明并不限于所述的特定方法、方案和试剂，因为这些是可变的。

数字范围包括定义范围的数字。

除非另有说明，否则核酸以 5' 至 3' 定向从左至右书写；氨基酸序列分别从左到右按氨基到羧基定向书写。

本文所提供的标题并非对各个方面或实施例的限制，可以通过引用整个说明书来获得各个方面或实施例。因此，通过参考整个说明书，下面定义的术语被更全面地定义。

定义

在详细描述实施例之前，应理解，本公开不限于特定组合物或生物系统，其可理所当然有所变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且不旨在作为限制性的。

如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，对“分子”的提及任选地包括两个或更多此类分子的组合等。

如本文所用，术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括（且描述）涉及该值或参数本身的实施例。

应理解，本公开的方面和实施例包括“包含”方面和实施例、“由”方面和实施例“组成”和“基本上由”方面和实施例“组成”。

如本文所用，术语“抗体”以最广泛的含义使用并且具体地涵盖完整抗体（例如，全长抗体）、抗体片段（包括但不限于 Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、双链抗体、scFv、scFv-Fc、单结构域抗体、单重链抗体和单轻链抗体）、单克隆抗体和多克隆抗体，只要它们展现出所期望的生物活性（例如，抗原决定基结合）。“抗体”（或“Ab”）和“免疫球蛋白”（或“Ig”）具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体对特定抗原展现出结合特异性，但免疫球蛋白包括缺乏抗原特异性的抗体和其他抗体样分子两者。后一类多肽例如由淋巴系统以低含量产生并且由骨髓瘤以高含量产生。

作为参考框架，如本文所用，免疫球蛋白将指免疫球蛋白 G (IgG) 的结构。然而，本领域技术人员将理解/认识到任何免疫球蛋白类别的抗体都可用于本文所述得发明性方法。为了清楚起见，IgG 分子含有一对重链 (HC) 和一对轻链 (LC)。每条 LC 具有一个可变结构域 (V_L) 和一个恒定结构域 (C_L)，而每条 HC 具有一个可变结构域 (V_H) 和三个恒定结构域（C_H1、C_H2 和 C_H3）。C_H1 结构域和 C_H2 结构域通过铰链区连接。该结构在本领域中是已知的。

简而言之，基本的 4 链抗体单元为由两条轻 (L) 链和两条重 (H) 链组成的异四聚体糖蛋白（IgM 抗体由基本的异四聚体单元中的 5 个单元连同称为 J 链的额外的多肽构成，并且因此含有 10 个抗原结合位点，而经分泌的 IgA 抗体可聚合以形成包含 2至 5 个基本的 4 链单元连同 J 链的多价组合体）。在 IgG 情况下，4 链单元通常为约150,000 道尔顿。每条 L 链通过一个共价二硫键连接至 H 链，而两条 H 链则根据 H 链的同种型通过一个或多个二硫键相互连接。每条 H 链和 L 链还具有规则间隔的链内二硫键。每条 H 链在 N 末端都具有一可变结构域 (V_H)，然后对于每条 α 和 γ 链具有三个恒定结构域 (C_H)，并且对于 µ 和 ε 同种型具有四个 C_H 结构域。每条 L 链在 N 末端都具有一可变结构域 (V_L)，然后在其另一末端具有一恒定结构域 (C_L)。V_L 与 V_H 对准，并且C_L 与重链的第一恒定结构域 (C_H1) 对准。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。V_H 和 V_L 的配对一起形成单一抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和特性，参见，例如，Basic and Clinical Immunology, 第 8 版, Daniel P. Stites,Abba I. Terr 和 Tristram G. Parslow (编), Appleton & Lange, Norwalk, CT,1994, 第 71 页和第 6 章。

来源于任何脊椎动物的 L 链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种明显不同的类型中的一种，这两种类型分别称为卡帕 (κ) 和兰姆达 (λ)。免疫球蛋白基于其重链恒定结构域 (CH) 的氨基酸序列，可以配属为不同的类别或同种型。存在以下五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM，其分别具有命名为 α、δ、γ、ε 和 µ 的重链。基于C_H 序列和功能的相对微小差异，γ 和 α 类进一步分为子类，例如，人类表达下列子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和 IgA2。

如本文所用，术语“经分离的”抗体可指基本上不含其他细胞物质的抗体。在一个实施例中，经分离的抗体基本上不含来自同一物种的其他蛋白质。在另一实施例中，经分离的抗体由来自不同物种的细胞表达并且基本上不含来自不同物种的其他蛋白质。在一些实施例中，“经分离的”抗体为已被鉴别并且自其天然环境的组分分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分为会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。通过使用本领域已知的蛋白质纯化技术进行分离，可使抗体基本上不含天然相关组分（或与用于产生抗体的细胞表达系统相关联的组分）。在一些实施例中，抗体将经纯化 (1) 至通过 Lowry 方法所确定的抗体重量计大于 75%，并且最优按重量计大于 80%、90%、95% 或 99%，或 (2) 至通过 SDS -PAGE 在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或（优选地）银染色的同构型。经分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

如本文所用，术语“抗原决定基”意指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定基决定簇通常由分子的化学活性表面组诸如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定三维结构特征和特定电荷特征。

如本文所用，术语“天然抗体和免疫球蛋白”通常为约 150,000 道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同轻 (L) 链和两个相同重 (H) 链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接（也称为“VH/VL 对”），而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间，二硫键数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一末端具有可变结构域 (VH)，其后是多个恒定结构域。每条轻链在一末端 (VL) 具有可变结构域，在另一末端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信，特定氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成界面。参见，例如，Chothia 等人, J. Mol. Biol., 186:651 (1985)；Novotny 和Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:4592 (1985)。

如本文所用，术语“可变”是指如下事实：可变结构域的某些部分在抗体中在序列方面广泛地不同，并且用于各特定抗体对于其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非在抗体的可变结构域中均匀分布。其集中在轻链和重链可变结构域两者中的三个称作互补决定区 (CDR) 或高变区的区段中。可变结构域中经高度保留的部分称为骨架 (FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个 FR 区，主要采用 β-折迭构型，通过三个 CDR 连接，其形成连接 β-折叠结构的环并在一些情况下形成 β-折叠结构的一部分。各链中的CDR 通过 FR 区紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的 CDR 一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成。参见，例如，Kabat 等人, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第五版, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出各种效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。感兴趣的可变区序列包括本文别处所详细描述的 CD47 抗体的人源化可变区序列。

术语“高变区 (HVR)”或“互补决定区 (CDR)”可指 VH 和 VL 结构域的亚区，其特征在于经增强的序列变异性和/或形成经限定的环。这些包括 VH 结构域中的三个 CDR（H1、H2 和 H3）和 VL 结构域中的三个 CDR（L1、L2 和 L3）。H3 据信对于赋予精细结合特异性至关重要，其中 L3 和 H3 显示出最高水平的多样性。参见 Johnson 和 Wu, 于Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, 编, Human Press, Totowa, N.J.,2003) 中。

许多 CDR/HVR 描述是已知的。Kabat 互补决定区 (CDR) 是基于序列变异性的，并且是最常用的（Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)）。相反地，Chothia 是指结构环的位置（Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。AbM HVR 表示 Kabat HVR 和 Chothia 结构环之间的折衷，并且被牛津分子公司 (Oxford Molecular) 的 AbM 抗体建模软件采用。“接触”HVR 基于可用的复杂晶体结构的分析结果。来自这些 HVR/CDR 中的每一者的残基如下所示。“骨架”或“FR”残基是除 HVR/CDR 残基以外的那些可变结构域残基。

“经扩展的HVR 也称为：VL 中的 24 至 36 或 24 至 34 (L1)、46 至 56 或 50至 56 (L2) 和 89 至 97 或 89 至 96 (L3)，以及 VH 中的 26 至 35 (H1)、50 至 65或 49 至 65 (H2) 和 93 至 102、94 至 102 或 95 至 102 (H3)（Kabat 编号）。

“根据 Kabat 编号”可指 Kabat等人（同上文）中用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。实际线性氨基酸序列可含有较少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的 FR 或 HVR 的缩短或插入。可通过将抗体序列与“标准”Kabat 编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的 Kabat 编号。通常，当提及可变结构域中的残基（大约轻链的残基 1 至 107 和重链的残基 1 至 113）时，使用 Kabat 编号，而当提及重链恒定区中的残基时，通常使用 EU 编号系统或索引（例如，如在 Kabat 中的 EU索引，根据 EU IgG1 编号）。

如本文所用，“单克隆”抗体是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，例如基本上相同但允许少量的背景突变和/或修饰。“单克隆”表示抗体基本上同质的特征，并且不需要通过任何特定方法产生抗体。在一些实施例中，单克隆抗体通过其 HVR、VH 和/或 VL 序列和/或结合特性来选择，例如选自克隆池（例如，重组、融合瘤或噬菌体来源的）。单克隆抗体可经工程化以包含一个或多个突变，例如，以影响抗体的结合亲和力或其他特性、产生人源化或嵌合抗体、改善抗体产生和/或同构型、工程化多特异性抗体，其所得抗体本质上仍被视为单克隆的。单克隆抗体的群体可与多克隆抗体区分开来，因为群体中的个别单克隆抗体识别相同的抗原位点。用于生产单克隆抗体的多种技术是已知的；参见，例如，融合瘤方法（例如，Köhler 和 Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo 等人,Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)，Harlow 等人, Antibodies: A LaboratoryManual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第 2 版 1988)；Hammerling 等人，于: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y.,1981) 中、重组 DNA 方法（参见，例如，美国专利号 4,816,567）、噬菌体展示技术（参见，例如，Clackson 等人, Nature,352: 624-628 (1991)；Marks 等人, J. Mol. Biol. 222：581-597 (1992)；Sidhu 等人, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee 等人, J.Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；和 Lee 等人, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)，以及用于在具有部分或全部人类免疫球蛋白基因座或编码人类免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人类或人样抗体的技术（参见，例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551(1993)；Jakobovits 等人, Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann 等人, Year inImmunol. 7:33 (1993)；美国专利号 5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和 5,661,016；Marks 等人, Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg 等人, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等人, Nature Biotechnol. 14：845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol.14：826 (1996)；以及 Lonberg 和 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13：65-93 (1995) 中所述。

如本文所用，术语“Fc 区”通常是指包含免疫球蛋白重链的 C 末端多肽序列的二聚体复合物，其中 C 末端多肽序列为可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体而获得的序列。Fc区可包含天然或变体 Fc 序列。尽管免疫球蛋白重链的 Fc 序列的边界可变，但人 IgG 重链 Fc 序列包含约位置 Cys226 或从约位置 Pro230 到 Fc 序列的羧基末端。除非本文另有说明，否则 Fc 区或恒定区中氨基酸残基的编号根据 EU 编号系统、也称为 EU 索引，如Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）所述。免疫球蛋白的 Fc 序列通常包含两个恒定结构域（C_H2 结构域和 C_H3 结构域），并且任选地包含C_H4 结构域。本文中，“Fc 多肽”意指构成 Fc 区的多肽中的一者，例如单体 Fc。Fc 多肽可获自任何合适的免疫球蛋白，诸如人 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 亚型、IgA、IgE、IgD 或IgM。Fc 多肽可以获自小鼠，例如，小鼠 IgG2a。Fc 区包含通过二硫键连接在一起的两条 H链的羧基末端部。抗体的效应子功能由 Fc 区中的序列决定，该区也为由某些类型的细胞上存在的 Fc 受体 (FcR) 识别的部分。在一些实施例中，Fc 多肽包含部分或全部野生型铰链序列（通常在其 N 末端处）。在一些实施例中，Fc 多肽不包含功能性或野生型铰链序列。

如本文所用，“Fc 组分”是指 Fc 区的铰链区、C_H2 结构域或 C_H3 结构域。

在某些实施例中，Fc 区包含 IgG Fc 区，优选地源自野生型人 IgG Fc 区。在某些实施例中，Fc 区源自于“野生型”小鼠 IgG，诸如小鼠 IgG2a。“野生型”人 IgG Fc 或“野生型”小鼠 IgG Fc 分别意指在人类群体或小鼠群体中天然存在的氨基酸序列。当然，正如Fc 序列在个体之间可能略有不同一样，可对野生型序列进行一种或多种改变，并且仍然在本发明的范围内。例如，Fc 区可含有改变、诸如糖基化位点中的突变或包含非天然氨基酸。

“嵌合”抗体可指具有来自特定同种型、类别或生物体的重链和/或轻链的一部分以及来自另一同种型、类别或生物体的另一部分的抗体。在一些实施例中，可变区将来自一个来源或生物体，而恒定区将来自另一来源或生物体。

“人源化抗体”可指主要具有人类序列和最少量的非人类（例如，小鼠或鸡）序列的抗体。在一些实施例中，人源化抗体具有来自移植到人类受体抗体骨架 (FR) 上的源自非人类（例如，小鼠或鸡）生物体的抗体的一个或多个 HVR 序列（具有感兴趣的结合特异性）。在一些实施例中，非人类残基经进一步移植到人类框架上（不存在于源抗体或受体抗体中），例如以改善抗体特性。总体上，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的 FR 为人类免疫球蛋白序列的 FR。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区 (Fc) 的至少一部分，该免疫球蛋白通常为人类免疫球蛋白。参见Jones 等人, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann 等人, Nature 332:323-329(1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。

“人抗体”可指具有以下氨基酸序列的抗体：对应于由人类所产生和/或已使用制造如本文所公开的人类抗体的技术中的任一者所制造的抗体的氨基酸序列。可以使用本领域已知的各种技术产生人类抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom 和 Winter, J. Mol.Biol., 227:381 (1991)；Marks 等人, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)；人类单克隆抗体的制备，如 Cole 等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, 第 77 页 (1985)；Boerner 等人, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991) 中所述；以及通过将抗原施用转基因动物，该转基因动物已经修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体，但其内源性基因座已被禁用，例如，经免疫化的异种基因小鼠（参见，例如，美国专利号6,075,181 和 6,150,584，关于 XENOMOUSE^TM 技术）或具有人类免疫球蛋白序列的鸡（参见，例如，WO2012162422、WO2011019844 和 WO2013059159）。

免疫球蛋白主要分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM，并且这些类别中的若干者可进一步分成子类（同种型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为 α、δ、ε、γ 和 μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

如本文所用，术语“抗体片段”及其全部文法变体被定义为包含完整抗体的抗原结合位点或可变区的该完整抗体的一部分，在某些情况下，其不含完整抗体的 Fc 区的恒定重链结构域（即，CH2、CH3 和/或 CH4（取决于抗体同种型））。抗体片段的实例包括 Fab、Fab、Fab'-SH、F(ab')₂ 和 Fv 片段；双链抗体；任何以下抗体片段，其为具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的多肽（在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”），包括但不限于：(1) 单链 Fv (scFv) 分子；(2) 仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或该单链多肽的含有轻链可变结构域的三个 CDR 而不具有相关联的重链部分的片段；和 (3) 仅含有一个重链可变区的单链多肽，或该单链多肽的含有重链可变区而不具有相关联的轻链部分的三个 CDR 的片段；和由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一条或多条重链的抗体片段中，重链可含有存在于完整抗体的非 Fc 区中的任何恒定结构域序列（例如，IgG 同种型中的 CH1），和/或可含有存在于完整抗体中的任何铰链区序列，和/或可含有融合至铰链区序列或重链恒定结构域序列、或位于这些序列中的亮氨酸拉链序列。

木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生的 F(ab')2 片段具有两个抗原结合位点并且仍能够与抗原交联。“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链 Fv 物种中，该区由一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体紧密、非共价缔合而成。在单链 Fv 物种 (scFv) 中，一个重链和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，以使得轻链和重链可缔合成类似于双链 Fv 物种中的结构的“二聚体”结构。在此构型中，各可变结构域的三个 CDR 相互作用以限定 VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个 CDR 共同地赋予抗体以抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域（或仅包含三个对抗原具有特异性的 CDR 的 Fv 的一半）也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。参见，例如，Plückthun, 于 ThePharmacology of Monoclonal Antibodies 第 113 卷 (Rosenburg 和 Moore 编,Springer-Verlag, New York, 第 269-315 页, 1994) 中。

Fab 片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域 (CH₁)。Fab' 片段与 Fab 片段的不同之处在于，在重链 CH₁ 结构域的羧基末端处添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH 是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的 Fab' 的命名。F(ab')₂ 抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对 Fab' 片段而产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

如本文所用，术语“单克隆抗体” (mAb) 是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，构成该群体的个别抗体为相同的，但可能少量存在的自然发生的突变除外。单克隆抗体对单个抗原位点具有高特异性。各 mAb 针对抗原上的单一决定簇。除其特异性以外，单克隆抗体的优势在于其可由融合瘤培养物合成，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可在永生化 B 细胞或其融合瘤中制备，或者可通过重组 DNA 方法制备。

单克隆抗体包括通过剪接 CD47 抗体的可变（包括高变）结构域与恒定结构域（例如，“人源化”抗体）、或轻链与重链、或来自一个物种的链与来自另一物种的链、或与异源蛋白质的融合物（无论其来源物种或免疫球蛋白类别或亚类名称如何）以及抗体片段（例如，Fab、F(ab')₂ 和 Fv）来产生的杂交和重组抗体，只要它们展现出所期望的生物活性即可。

本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体（免疫球蛋白），其中，重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们展现出所期望的生物活性即可。

“结合感兴趣的抗原”的抗体（诸如单特异性或多特异性抗体）为以足够的亲和力结合抗原（例如，蛋白质），使得该抗体可用作靶向蛋白质或表达该蛋白质的细胞或组织的诊断剂和/或治疗剂，并且不与其他蛋白质显著交叉反应。在此类实施例中，抗体与“非靶”蛋白质的结合程度将小于该抗体与其特定靶蛋白质的结合的约 10%，如通过荧光活化细胞分选 (FACS) 分析或放射免疫沉淀 (RIA) 或 ELISA 所确定。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“与其特异性结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽标靶上的抗原决定基，意指结合可测量地不同于非特异性相互作用（例如，非特异性相互作用可与牛血清白蛋白或酪蛋白结合）。例如，可通过确定分子的结合与对照分子的结合相比来测量特异性结合。例如，可通过与类似于靶标的对照分子（过量的无标记靶标）竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合受到过量无标记靶标的竞争性抑制，则表明存在特异性结合。如本文所用，术语“特异性结合”或“与其特异地结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽标靶上的抗原决定基可例如通过对于标靶具有至少以下 K_D 的分子来展现：至少约 200 nM、替代性地至少约 150 nM、替代性地至少约 100 nM、替代性地至少约 60 nM、替代性地至少约 50 nM、替代性地至少约 40 nM、替代性地至少约 30 nM、替代性地至少约20 nM、替代性地至少约 10 nM、替代性地至少约 8 nM、替代性地至少约 6 nM、替代性地至少约 4 nM、替代性地至少约 2 nM、替代性地至少约 1 nM或更大亲和力。在一个实施例中，术语“特异性结合”是指以下结合，其中多特异性抗体与特定多肽或特定多肽上的抗原决定基结合基本上不与任何其他多肽或多肽抗原决定基结合。

除非另有指示，否则实例中提及的商业上可获得的试剂都根据制造商的说明来使用。在下列实例和整个说明书中通过 ATCC 登录号鉴定的那些细胞的来源为美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)。除非另有说明，否则本发明使用重组 DNA 技术的标准程序，诸如上文和下列教科书中所描述：Sambrook 等人,同上文；Ausubel 等人, Current Protocols in Molecular Biology (Green PublishingAssociates and Wiley Interscience, NY, 1989)；Innis 等人, PCR Protocols: AGuide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., NY, 1990)；Harlow 等人,Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, 1988)；Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984 )；Freshney, Animal Cell Culture, 1987；Coligan 等人, Current Protocols inImmunology, 1991。

本文中所引的全部参考文献，包括专利申请和公开特此以全文引用方式并入。

鉴定相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体的方法

在一些实施例中，提供一种鉴定相对于亲本抗原结合多肽（例如，抗体、其抗原结合片段或抗体构建体）具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体）的方法，该方法包括：(a) 鉴定该亲本抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的该一个或多个野生型氨基酸；(c)测量抗原结合多肽变体的粘度；和 (d) 鉴定抗原结合多肽变体相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度。在一些实施例中，该方法包括 (a) 鉴定亲本抗原结合多肽中的具有高SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸。在一些实施例中，该方法包括步骤(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和较低 SASA 比率的氨基酸取代经鉴定为具有高 SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸。在一些实施例中，该方法包括在步骤 (b) 后且在步骤 (c) 之前确定抗原结合多肽变体中的一个或多个经取代的氨基酸的 SAP 值和/或 SASA 比率。

在一些实施例中，提供一种降低抗原结合多肽（例如，抗体、其抗原结合片段或抗体构建体）的粘度的方法，该方法包括：(a) 鉴定该抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向(SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸，以产生抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体）；(c) 测量抗原结合多肽变体的粘度；(d) 鉴定抗原结合多肽变体相对于野生型抗原结合多肽具有经降低的粘度，从而降低抗原结合多肽的粘度。在一些实施例中，该方法包括 (a) 鉴定抗原结合多肽中的具有高SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸。在一些实施例中，该方法包括含步骤(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和较低 SASA 比率的氨基酸取代经鉴定为具有高 SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸，以产生抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体）。

在本文所述的方法中任一者的一些实施例中，术语“亲本抗原结合多肽”和“抗原结合多肽”可互换使用。

在一些实施例中，抗原结合多肽（诸如亲本抗原结合多肽）中的经鉴定为具有高SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸是表面暴露的氨基酸。在一些实施例中，表面暴露的氨基酸通过抗原结合多肽的结构建模（诸如计算建模）和/或通过研究抗原结合多肽的经解析的结构（诸如经解析的晶体结构）来鉴定。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸具有大侧链。在一些实施例中，“大侧链”是指具有大于约 189 Å 的体积、例如介于约 189 Å与约 228 Å 之间的体积的氨基酸侧链。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸具有大疏水性侧链。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸为芳香族氨基酸。在一些实施例中，芳香族氨基酸选自由以下项组成的组：W、Y 和 F。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的具有大侧链或大疏水性侧链的一个或多个野生型氨基酸经带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸取代。在一些实施例中，“较小侧链”是指具有小于约 174 Å 的体积的氨基酸侧链。在一些实施例中，带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸选自由 A、I、L、V、D、E、H、K、R、N、Q、S 和 T 组成的组。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个芳香族氨基酸经带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸取代。在一些实施例中，带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸选自由 A、I、L、V、D、E、H、K、R、N、Q、S 和 T组成的组。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸具有较小侧链。在一些实施例中，具有较小侧链的一个或多个氨基酸选自由以下项组成的组：A、I、L、V、N、Q、S、G、P、C、M 或 T。在一些实施例中，具有较小侧链的一个或多个氨基酸经带电氨基酸取代。在一些实施例中，带电氨基酸选自由以下项组成的组：R、K、H、D 和 E。在一些实施例中，带电氨基酸选自由以下项组成的组：R、K 和 H。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸经 R、K 和 H 取代。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸中的一者经 H 取代，例如，以产生包含单一组氨酸取代的抗原结合多肽变体。在一些实施例中，组氨酸取代为抗原结合多肽变体中的唯一氨基酸取代。在一些实施例中，组氨酸取代为已被引入抗原结合多肽变体中以相对于亲本抗原结合多肽降低抗原结合多肽变体的粘度的唯一氨基酸取代。

在一些实施例中，提供一种鉴定相对于亲本抗原结合多肽（例如，抗体、其抗原结合片段或抗体构建体）具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体）的方法，该方法包括：(a) 鉴定该亲本抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的选自由 W、Y和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸；(c) 测量抗原结合多肽变体的粘度；和 (d) 鉴定抗原结合多肽变体相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度。在一些实施例中，该方法包括 (a) 鉴定亲本抗原结合多肽中的具有高 SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸。在一些实施例中，该方法包括步骤 (b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和较低 SASA 比率的氨基酸取代经鉴定为具有高 SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸。在一些实施例中，该方法包括在步骤 (b) 后且在步骤 (c) 之前确定抗原结合多肽变体中的一个或多个经取代的氨基酸的 SAP 值和/或 SASA 比率。在一些实施例中，提供一种降低抗原结合多肽（例如，抗体、其抗原结合片段或抗体构建体）的粘度的方法，该方法包括：(a)鉴定该抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA)比率的选自由 W、Y 和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸，以产生抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体）；(c) 测量抗原结合多肽变体的粘度；(d) 鉴定抗原结合多肽变体相对于野生型抗原结合多肽具有经降低的粘度，从而降低抗原结合多肽的粘度。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的选自由 W、Y 和 F组成的组的一个或多个野生型氨基酸经带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸取代。在一些实施例中，带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸选自由 A、I、L、V、D、E、H、K、R、N、Q、S 和 T组成的组。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA比率的一个或多个野生型氨基酸经 R、K 和 H 取代。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸中的一者经 H 取代，例如，以产生包含单一组氨酸取代的抗原结合多肽变体。在一些实施例中，组氨酸取代为抗原结合多肽变体中的唯一氨基酸取代。在一些实施例中，组氨酸取代为已被引入抗原结合多肽变体中以相对于亲本抗原结合多肽降低抗原结合多肽变体的粘度的唯一氨基酸取代。

在一些实施例中，提供一种鉴定相对于亲本抗原结合多肽（例如，抗体、其抗原结合片段或抗体构建体）具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体）的方法，该方法包括：(a) 鉴定该亲本抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的选自由 W、Y和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以 (i) Y 或 F（其中野生型氨基酸为W）、(ii) Y 或 W（其中野生型氨基酸为 F）和/或 (iii) F 或 W（其中野生型氨基酸为 Y），取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸；(c) 测量抗原结合多肽变体的粘度；和 (d) 鉴定抗原结合多肽变体相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度。在一些实施例中，该方法包括 (a) 鉴定亲本抗原结合多肽中的具有高 SAP值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸。在一些实施例中，该方法包括步骤 (b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和较低 SASA 比率的氨基酸取代经鉴定为具有高SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸。在一些实施例中，该方法包括在步骤(b) 后且在步骤 (c) 之前确定抗原结合多肽变体中的一个或多个经取代的氨基酸的 SAP值和/或 SASA 比率。在一些实施例中，提供一种降低抗原结合多肽（例如，抗体、其抗原结合片段或抗体构建体）的粘度的方法，该方法包括：(a) 鉴定该抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的选自由 W、Y 和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以 (i) Y 或 F（其中野生型氨基酸为 W）、(ii) Y 或W（其中野生型氨基酸为 F）和/或 (iii) F 或 W（其中野生型氨基酸为 Y），取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸，以产生抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体）；(c) 测量抗原结合多肽变体的粘度；(d) 鉴定抗原结合多肽变体相对于野生型抗原结合多肽具有经降低的粘度，从而降低抗原结合多肽的粘度。

SAP 向抗原结合多肽表面上的特定斑块给予有效动态暴露的疏水性。SAP 针对以抗原结合多肽中的每个原子为中心的球形区域计算。这向每一个原子给予独特 SAP 值。针对氨基酸残基的 SAP通过对其全部组成原子的 SAP 进行平均而获得。关于 SAP 和计算SAP 值的其他细节提供于例如，Chennamsetti等人(2009) PNAS USA,106 (29): 11937-11942；Lauer等人(2012) J Pharm Sci, 101(1): 102-115 中；和其他地方。在一些实施例中，考虑到抗体分子在溶液中的柔性，使用分子动力学模拟来制备 SAP 的经平均的模型。参见，例如，R. Salomon-Ferrer, D.A. Case, R.C. Walker.(2013) “An overview ofthe Amber biomolecular simulation package.”WIREs Comput. Mol. Sci. 3, 198-210；和 D.A. Case, T.E. Cheatham, III, T. Darden, H. Gohlke, R. Luo, K.M.Merz, Jr., A. Onufriev, C. Simmerling, B. Wang 和 R. Woods.(2005)“The Amberbiomolecular simulation programs.”J. Computat. Chem. 26, 1668-1688。示例性分子动力学工具描述于例如 D.A. Case, H.M. Aktulga, K. Belfon, I.Y. Ben-Shalom,J.T. Berryman, S.R. Brozell, D.S. Cerutti, T.E. Cheatham, III, G.A. Cisneros,V.W.D. Cruzeiro, T.A. Darden, N. Forouzesh, G. Giambaşu, T. Giese, M.K.Gilson, H. Gohlke, A.W. Goetz, J. Harris, S. Izadi, S.A. Izmailov, K.Kasavajhala, M.C. Kaymak, E. King, A. Kovalenko, T. Kurtzman, T.S. Lee, P.Li, C. Lin, J. Liu, T. Luchko, R. Luo, M. Machado, V. Man, M. Manathunga,K.M. Merz, Y. Miao, O. Mikhailovskii, G. Monard, H. Nguyen, K.A. O’Hearn, A.Onufriev, F. Pan, S. Pantano, R. Qi, A. Rahnamoun, D.R. Roe, A. Roitberg, C.Sagui, S. Schott-Verdugo, A. Shajan, J. Shen, C.L. Simmerling, N.R.Skrynnikov, J. Smith, J. Swails, R.C. Walker, J. Wang, J. Wang, H. Wei, X.Wu, Y. Wu, Y. Xiong, Y. Xue, D.M. York, S. Zhao, Q. Zhu, 和 P.A. Kollman(2023), Amber 2023, University of California, San Francisco；C.Tian, K.Kasavajhala, K. A. A. Belfon, L. Raguette, H. Huang, A. N. Migues J. Bickel,Y. Wang, J. Pincay, Q. Wu 和 C. Simmerling.(2019) “ff19SB: Amino-Acid-Specific Protein Backbone Parameters Trained against Quantum Mechanics EnergySurfaces in Solution.”J. Chem. Theory Comput.16, 528-552；以及 R. Salomon-Ferrer, A.W. Goetz, D. Poole; S. Le Grand, 和 R.C. Walker.(2013) “Routinemicrosecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs.2.Explicitsolvent Particle Mesh Ewald.”J. Chem. Theory Comput.9, 3878-3888。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SAP 值的一个或多个野生型氨基酸的 SAP 值为 ≥ 2，诸如约 2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 或大于 8.0 中的任一者，包括其间的任何值。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的一个或多个野生型氨基酸的 SAP 值基于具有 2.3 或更大 SAP 值而经鉴定为具有高 SAP 值。

SASA 比率通常通过涉及球形探针（其近似于水分子）在全原子蛋白质模型周围的计算机仿真旋转的方法来计算。本领域已知有多种方法用于计算可溶性蛋白质在其折叠和未折叠状态下的 SASA 比率。参见，例如，Ali等人(2014) Current Protein and PeptideScience, 15(5):456-76。在一些实施例中，亲本抗原结合蛋白中的野生型氨基酸的 SASA比率根据 ssbio(dot)readthedocs(dot)io/en/latest/instructions/msms(dot)html 以及 Lee 和 Richards (1971) JMB 55(3): 379-400, IN3-IN4 中所述的方法计算。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽中的经鉴定为具有高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸的 SASA 比率为 ≥ 0.25，诸如 0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 或大于1.0，包括其间的任何值。在一些实施例中，高 SASA 比率为 0.25 或更大。在一些实施例中，高 SASA 比率为 0.5 或更大。

如本文别处所讨论，在一些实施例中，通过以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP值和/或较低 SASA 比率的氨基酸取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸所产生的抗原结合多肽变体的粘度经测量，例如，以确认抗原结合多肽变体的粘度是否低于亲本抗原结合多肽的粘度。在一些实施例中，抗原结合多肽变体的粘度经由动态光散射 (DLS) 测量（诸如间接测量）。如实例中所讨论，DLS 相互作用参数（(k_D，ml/克）可与粘度 (η, cP) 相关。在一些实施例中，抗原结合多肽变体的粘度经由DLS 在介于约 1 mg/ml 与约 10 mg/ml 之间（例如，约 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 或 10.0 mg/ml 中的任一者，包括其间的任何值）的浓度下测量。在一些实施例中，抗原结合多肽变体的粘度经由锥板流变测定来测量。参见，例如，Lang 等人(2020)Appl Sci, 10(1), 172 和 Zhang 等人(2017) CurrOpin in Chem Eng,16: 48-55。在一些实施例中，抗原结合多肽变体的粘度经由锥板流变测定例如在高浓度下测量。在一些实施例中，高浓度为介于约 50 mg/ml 与约 300 mg/ml之间，诸如约 50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290 或 300 mg/ml 中的任一者，包括其间的任何值。

在一些实施例中，亲本抗原结合多肽为抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体，其中该抗体、其片段或抗体构建体包含 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一者或多者，其中在一个或多个 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一个或多个野生型氨基酸经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率。在一些实施例中，在一个或多个 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一个或多个野生型氨基酸经鉴定为具有高 SAP 值和高 SASA 比率。在一些实施例中，在一个或多个CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸经具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸取代（例如，如上所述）以产生抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体。在一些实施例中，亲本抗体、其抗原结合片段或抗体构建体中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸具有大侧链。在一些实施例中，经鉴定为具有高SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸具有大疏水性侧链。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸为芳香族氨基酸。在一些实施例中，芳香族氨基酸选自由以下项组成的组：W、Y 和 F。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的具有大侧链或大疏水性侧链的一个或多个野生型氨基酸经带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸取代。在一些实施例中，带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸选自由 A、I、L、V、D、E、H、K、R、N、Q、S 和 T 组成的组。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个芳香族氨基酸经带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸取代。在一些实施例中，带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸选自由 A、I、L、V、D、E、H、K、R、N、Q、S 和 T 组成的组。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸具有较小侧链。在一些实施例中，具有较小侧链的一个或多个氨基酸选自由以下项组成的组：A、I、L、V、N、Q、S、G、P、C、M 或 T。在一些实施例中，具有较小侧链的一个或多个氨基酸经带电氨基酸取代。在一些实施例中，带电氨基酸选自由以下项组成的组：R、K、H、D 和 E。在一些实施例中，带电氨基酸选自由以下项组成的组：R、K 和 H。在一些实施例中，亲本抗体、其抗原结合片段或抗体构建体中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸经 R、K 和 H 取代。在一些实施例中，亲本抗体、其抗原结合片段或抗体构建体中的经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸中的一者经 H 取代，例如，以产生包含单一组氨酸取代的抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体。在一些实施例中，组氨酸取代为抗体变体、其片段或抗体构建体变体中的唯一氨基酸取代。在一些实施例中，组氨酸取代为已被引入抗体变体、其片段或抗体构建体变体中以相对于亲本抗体降低该抗体变体、其片段或抗体构建体变体的粘度的唯一氨基酸取代。

在一些实施例中，该方法包括：(a) 鉴定在亲本抗体、其抗原结合片段或抗体构建体的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一者或多者中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的选自由 W、Y 和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于等野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸，以产生抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体；(c) 测量该变体的粘度；和 (d) 鉴定抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体相对于亲本抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体具有经降低的粘度。在一些实施例中，该方法包括 (a) 鉴定亲本抗体、其抗原结合片段或抗体构建体的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3中的一者或多者中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的选自由 W、Y 和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸。在一些实施例中，该方法包括步骤 (b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和较低 SASA 比率的氨基酸取代经鉴定为具有高 SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸，以产生抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体。在一些实施例中，该方法包括在步骤 (b) 后且在步骤 (c) 之前确定抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体中的一个或多个经取代的氨基酸的SAP 值和/或 SASA 比率。

在一些实施例中，提供一种降低抗体、其抗原结合片段或抗体构建体的粘度的方法（或一种鉴定具有经降低的粘度的抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体的方法），该方法包括：(a) 鉴定该抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的选自由 W、Y 和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸，以产生抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体；(c) 测量抗体变体或抗体构建体的变体的粘度；(d) 鉴定变体相对于野生型抗体、其抗原结合片段或抗体构建体具有经降低的粘度，从而降低抗体、其抗原结合片段或抗体构建体的粘度。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP值和/或高 SASA 比率的选自由 W、Y 和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸经带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸取代。在一些实施例中，带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸选自由 A、I、L、V、D、E、H、K、R、N、Q、S 和 T 组成的组。在一些实施例中，经鉴定为具有高SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸经 R、K 和 H 取代。在一些实施例中，经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸中的一者经 H 取代，例如，以产生包含单一组氨酸取代的抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体。在一些实施例中，组氨酸取代为变体中的唯一氨基酸取代。在一些实施例中，组氨酸取代为已被引入抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体中以相对于亲本抗体降低变体的粘度的唯一氨基酸取代。

在一些实施例中，提供一种降低抗体、其抗原结合片段或抗体构建体的粘度的方法（或一种鉴定具有经降低的粘度的抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体的方法），该方法包括：(a) 鉴定该抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的选自由 W、Y 和 F 组成的组的一个或多个野生型氨基酸；(b) 以 (i) Y 或 F（其中野生型氨基酸为 W）、(ii) Y 或 W（其中野生型氨基酸为 F）和/或 (iii) F 或 W（其中野生型氨基酸为 Y），取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA比率的一个或多个野生型氨基酸，以产生抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体的变体；(c) 测量抗体变体或抗体构建体的变体的粘度；(d) 鉴定变体相对于野生型抗体、其抗原结合片段或抗体构建体具有经降低的粘度，从而降低抗体、其抗原结合片段或抗体构建体的粘度。

在一些实施例中，亲本抗原结合多肽为抗体。在一些实施例中，抗体为治疗性抗体。在一些实施例中，抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，抗体为全长抗体。在一些实施例中，抗体为单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施例中，亲本抗原结合多肽为包含人 IgG Fc 区或其部分（诸如 CH2 和/或 CH3 结构域）的抗体、其抗原结合片段或抗体构建体。在一些实施例中，人 IgG 恒定区为 IgG1、IgG2 或IgG4 恒定区。

在一些实施例中，亲本抗原结合多肽为抗体构建体（诸如基于抗体的构建体），例如，多特异性抗体构建体。可用于本文所述的方法的示例性抗体构建体包括但不限于CrossMab、双作用 Fab (“DAF”)（例如二合一 DAF 和四合一 DAF）、DutaMab、DT-IgG、杵臼(“KIH”) 双特异性抗体（例如，共同轻链 KIH 双特异性抗体和包含两条不同轻链的 KIH双特异性抗体）、SEEDbodies、TrioMab、Dock 和 Lock 双特异性构建体、DVD-IgG、IgG(H)-scFv，scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L, H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、scGv4-Ig、Zybodies 和 DVI-IgG（诸如，四合一 DVI-IgG）。这些和其他多特异性抗体构建体更详细地描述于例如，Spiess等人(2015)Mol Immunol,67(2 Pt A):95-106；Labrijn 等人(2019) Nat Revs Drug Discovery,18:585–608；和其他地方中。

在一些实施例中，亲本抗原结合多肽为抗体的抗原结合片段或包含抗体的抗原结合片段的构建体。示例性抗原结合片段和包含此类片段的构建体包括但不限于例如，Fab、Fab₂（诸如单特异性和双特异性 Fab₂）、F(ab')₂（诸如单特异性和双特异性 F(ab')₂）、三特异性 Fab₃、scFv、单价 IgG、单臂抗体、双链抗体、三链抗体、scFv-Vc、微抗体、V_HH、V-NAR、hcIgG、IgNAR、纳米抗体、纳米抗体-HSA、双特异性 T 细胞接合剂 (BiTE)、双重亲和力重新靶向分子 (DART)、串联双链抗体 (TandAbs)、scDiabodies、scDiabody-CH3、双链抗体-CH3、三重体、微抗体、微体、TriBi 微体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-VL-scFv、F(ab')₂、-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、胞内抗体等。这些和其他抗原结合片段以及包含此类片段的构建体进一步详细描述于例如，Spiess等人(2015) Mol Immunol,67(2 Pt A):95-106；Labrijn 等人(2019) Nat Revs Drug Discovery,18: 585–608；和其他地方中。

在一些实施例中，抗原结合多肽（例如，抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体）在用于本文所述的方法之前（例如，在用具有较低 SAP 和/或较低 SASA 比率的氨基酸取代具有高 SAP 和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸之前）经历至少一个亲和力成熟步骤（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或多于 10 个亲和力成熟步骤）。在一些实施例中，通过本文所述的方法所产生的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体）例如在用具有较低 SAP 和/或较低 SASA 比率的氨基酸取代具有高 SAP 和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸之后经历至少一个亲和力成熟步骤（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或多于 10 个亲和力成熟步骤）。关于亲和力成熟的细节在本文别处提供。在一些实施例中，抗原结合多肽变体中的经取代的氨基酸（即，经引入变体中以替换具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸的具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸）在亲和力成熟步骤期间固定（诸如未经随机化或未经进一步取代）。在一些实施例中，抗原结合多肽变体中的一个或多个氨基酸（例如，除了替换具有高SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸的具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸之外）经随机化以产生经随机化的变体的文库。在一些实施例中，经替换以改善抗原结合多肽变体对其标靶的亲和力的经随机化的变体中的一个或多个氨基酸位于抗原结合多肽变体的接触标靶（例如，靶配体或靶抗原）的位点处或附近。然后筛选经随机化的变体的文库，以鉴定那些对标靶具有所期望亲和力的变体。

因此，在某些实施例中，亲和力成熟包括以下步骤：对通过本文所述的方法所获得的抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和/或 CDR-L3 在一个或多个位置处进行诱变或随机化，以产生经随机化的变体的文库；使经随机化的变体的该文库与标靶（例如，靶配体或靶抗原）接触；检测该标靶与一种或多种经随机化的变体的结合；以及获得特异性结合该标靶的一种或多种经随机化的变体。在一些实施例中，由此所鉴定的经随机化的变体称为“亲和力成熟的变体”。在一些实施例中，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体中的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和/或 CDR-L3 中的经引入以替换具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸的具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的一个或多个氨基酸经固定且未经靶向以进行进一步随机化（例如，未经进一步诱变）。用于诱变抗体（或其片段抗原结合片段）的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和/或 CDR-L3 的方法为本领域已知的，并且它们在本文别处讨论。关于文库和库筛选的细节在本文别处提供。

在某些实施例中，本文所述的方法进一步包括确定在至少一轮亲和力成熟之后所获得的抗原结合多肽变体的核酸序列的步骤。在某些实施例中，本文所述的方法进一步包括产生经随机化的变体（例如，经随机化的抗体变体、经随机化的抗体变体的抗原结合片段或经随机化的抗体构建体变体）的步骤。在一些实施例中，产生经随机化的变体（例如，经随机化的抗体变体、经随机化的抗体变体的抗原结合片段或经随机化的抗体构建体变体）的方法为制造规模的生产过程（诸如发酵过程）。

在一些实施例中，本文提供一种根据本文所述的方法所产生的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体）。在一些实施例中，提供一种组合物，其包含浓度介于约 20 mg/ml 与 500 mg/ml 之间（诸如介于约 30 mg/ml 与约400 mg/ml 之间、介于约 40 mg/ml 与约 350 mg/ml 之间或介于约 50 mg/ml 与约 300mg/ml 之间）的根据本文所述的方法所产生的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体）。

下面提供根据本文所述的方法所产生的抗 GCGR 抗体的示例性 VH 结构域变体的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文提供一种亲和力成熟的抗原结合多肽变体（例如，亲和力成熟的抗体变体、亲和力成熟的抗体变体的抗原结合片段或亲和力成熟的抗体构建体变体），例如，其在根据本文所述的方法所产生的抗原结合多肽变体的亲和力成熟之后获得。在一些实施例中，提供一种组合物，其包含浓度介于约 20 mg/ml 与 500 mg/ml 之间（诸如介于约 30 mg/ml 与约 400 mg/ml 之间、介于约 40 mg/ml 与约 350 mg/ml 之间或介于约50 mg/ml 与约 300 mg/ml 之间）的亲和力成熟的抗原结合多肽变体（例如，亲和力成熟的抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或亲和力成熟的抗体构建体变体）。

使用动态光散射 (DLS) 相互作用参数的方法

在某些方面，本文提供包括使用动态光散射 (DLS) 相互作用参数来评定抗原结合多肽的粘度的方法。如本文所述，发明人发现针对抗原结合多肽（诸如本文所述的抗原结合多肽变体）所测量的 DLS 相互作用参数与粘度之间存在强线性相关性。在一些实施例中，使用 DLS 相互作用参数来评定粘度的方法被配置为能够对多种抗原结合多肽（例如，至少约 100 种抗原结合多肽，诸如至少约 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 1,000 种抗原结合多肽）进行中等通量筛选。

在一些实施例中，该方法包括测量包含抗原结合多肽（诸如抗原结合多肽变体）的组合物的 DLS 相互作用参数。在一些实施例中，测量包含抗原结合多肽的组合物的 DLS相互作用参数包括使该组合物经历 DLS 技术，其中该组合物包含介于约 0.1 mg/ml 与约100 mg/ml 之间、诸如介于约 2 mg/ml 与 10 mg/ml 之间的抗原结合多肽，以使用下列方程式测量各相互作用参数：

其中 D = 平移扩散系数；D₀ 为自扩散系数（在零浓度下的 D 值）；c = 蛋白质浓度；并且 k_D = 相互作用参数。变体的 k_D 值愈正，变体的自相互作用愈弱。相反，变体的 k_D值愈负，变体的自相互作用愈强。参见，例如，Sorret等人(2016) Biophysical Journal,111: 1831–1842.用于测量 DLS 的技术为本领域已知的并且包括例如涉及多角度仪器的固定角度的技术。此外，有许多用于分析 DLS 数据的技术，例如，CUMULANT、CONTIN 和CORENN。例如，于 2023 年 9 月 1 日访问的 <https://lsinstruments.ch/en/theory/dynamic-light-scattering-dls/introduction>，其特此以全文引用方式并入本文。

在一些实施例中，该方法包括将所测量的抗原结合多肽的 DLS 相互作用参数与标准曲线和/或参考进行比较，以基于该 DLS 相互作用参数确定该抗原结合多肽的粘度。在一些实施例中，标准曲线和/或参考包括其他多肽（诸如抗原结合多肽的变体）的已知粘度和 DLS 相互作用参数。

在本文所提供的某些方面，用于评定抗原结合多肽的粘度的方法进一步与测定（诸如结合测定、活性测定或功效测定）配对以评定抗原结合多肽，例如，评定抗原结合多肽与靶抗原的亲和力。因此，本文所教示的此类方法能够评估抗原结合多肽的粘度和所期望属性（例如，针对靶抗原的结合亲和力、活性或功效），其例如可帮助治疗药物开发以鉴定具有所期望特性（诸如低粘度和高结合亲和力）的有用抗原结合多肽。用于测量抗原结合多肽的结合亲和力的技术为本领域已知的并且包括涉及表面等离子体共振 (SPR) 和生物层干涉 (BLI) 的技术。例如，Regenmortel & Azimzadeh, J Immunoassay, 21, 2000，其特此以全文引用方式并入本文。用于执行活性和功效测定的技术为本领域已知的并且包括基于动物模型和细胞的测定。例如，Jiang & Mire-Sluis, Biosimilars, 2018，其特此以全文引用方式并入本文。

在某些方面，本文提供包括以下的方法：(a) 基于如本文所述的 SAP 值和/或SASA 比率（例如，基于具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的变体）对抗原结合多肽进行诱变；(b) 使用 DLS 来鉴定具有如本文所述的所期望粘度（诸如低粘度或低于诱变所基于的亲本抗原结合多肽的粘度）的一种或多种突变体。在一些实施例中，该方法进一步包括执行一种或多种额外的测定以评定突变型抗原结合多肽的特征，诸如结合测定、活性测定或功效测定。例如，在一些实施例中，此类方法可用于鉴定相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度和所期望（诸如更高）结合亲和力或活性的抗原结合多肽变体。

预测抗原结合多肽中的影响粘度的氨基酸的方法

在一些实施例中，提供一种预测抗原结合多肽中的影响该抗原结合多肽的粘度的一个或多个氨基酸的方法。在一些实施例中，该方法包括：鉴定抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸，其中具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸经预测会影响该抗原结合多肽的粘度。在一些实施例中，该方法包括：鉴定抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸，其中具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸经预测会影响该抗原结合多肽的粘度。

在一些实施例中，本文提供一种预测抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体中的影响该抗体、抗原结合片段或抗体构建体的粘度的一个或多个氨基酸的方法，其中该抗体、该抗原结合片段或该抗体构建体包含 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3 中的一者或多者，该方法包括：鉴定在该 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和 CDR-L3 中的一者或多者中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积(SASA) 比率的一个或多个氨基酸位置，其中具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的该一个或多个氨基酸位置经预测会影响该抗体、该抗原结合片段或该抗体构建体的粘度。在一些实施例中，该方法包括：鉴定在该 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一者或多者中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸位置，其中具有高空间聚集倾向 (SAP)值和高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的该一个或多个氨基酸位置经预测会影响该抗体、该抗原结合片段或该抗体构建体的粘度。

在一些实施例中，抗体为治疗性抗体。在一些实施例中，抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，抗体为单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施例中，抗体为全长抗体。在一些实施例中，抗体包含人 IgG Fc 区或其部分，诸如CH2 和/或 CH3 结构域。在一些实施例中，人 IgG 恒定区为 IgG1、IgG2 或 IgG4 恒定区。在一些实施例中，抗体片段为 Fab、F(ab')2、三特异性 Fab₃、scFv、单价 IgG、双链抗体、三链抗体、scFv-Vc、微抗体、V_HH、V-NAR、hcIgG 或 IgNAR。可与此方法一起使用的其他示例性抗体片段包括但不限于本文别处详细描述的那些。在一些实施例中，抗体构建体为例如CrossMab、双重作用 Fab (DAF)、DVD-IgG 或杵臼双特异性抗体。可与此方法一起使用的其他示例性抗体构建体包括但不限于本文别处详细描述的那些。

文库和文库筛选

在一些实施例中，本文提供一种包括多个抗原结合多肽变体的文库，其中该文库中的至少一个变体包含相对于亲本抗原结合多肽的一个或多个氨基酸取代，其中相对于亲本抗原结合多肽的该一个或多个氨基酸取代将经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸替换为相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低SASA 比率的氨基酸。在一些实施例中，该文库中的各变体包含相对于亲本抗原结合多肽的一个或多个氨基酸取代，其中相对于亲本抗原结合多肽的该一个或多个氨基酸取代将经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸替换为相较于野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸。在一些实施例中，该文库经筛选以鉴定相较于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体。在一些实施例中，该文库经筛选以鉴定相较于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度以及相较于亲本抗原结合多肽的亲和力具有相当的、至少一样高的或改善的对标靶（例如，靶配体或靶抗原）的亲和力的抗原结合多肽变体。在一些实施例中，与亲本抗原结合多肽对标靶的亲和力“相当”的对标靶的亲和力为在亲本抗原结合多肽对标靶的亲和力的 5 倍以内（诸如约 4.5倍、4.0 倍、3.5 倍、3.0 倍、2.5 倍、2.0 倍、1.5 倍或小于 1.5 倍中的任一者，包括其间的任何值）的亲和力。

在一些实施例中，文库为多肽文库（诸如多个抗原结合多肽变体，例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体）。在一些实施例中，多肽文库为多肽展示文库。此类多肽展示文库可经筛选以选择和/或进化具有用于多种用途（包括但不限于治疗性、预防性、兽医、诊断性、试剂或材料应用）的所期望特性的抗原结合多肽变体。在某些实施例中，该文库为核酸文库，其中各核酸（或一组核酸）编码不同的抗原结合多肽变体。在一些实施例中，该文库为多个宿主细胞（例如，原核或真核宿主细胞），各宿主细胞包含（并且例如表达）不同的核酸（或一组核酸），其中各不同的核酸（或一组核酸）编码不同的抗原结合多肽变体。

在某些实施例中，本文所述的文库中的多个抗原结合多肽变体包括至少 2、3、4、5、10、30、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000、25000、50000、75000、100000、250000、500000、750000、1000000、2500000、5000000、7500000、10000000或多于 10000000个抗原结合多肽变体（诸如独特抗原结合多肽变体），包括其间的任何值。在某些实施例中，抗原结合多肽变体的文库具有以下的序列多样性：约 2、约 5、约 10、约 50、约 100、约250、约 500、约 750、约 10³、约 10⁴、约 10⁵、约 10⁶、约 10⁷、约 10⁸、约 10⁹、约 10¹⁰、约10¹¹、约 10¹²、约 10¹³、约 10¹⁴或多于约 10¹⁴（诸如约 10¹⁵ 或约 10¹⁶），包括其间的任何值。

在某些实施例中，该文库经由基因工程产生。先前已描述了用于诱变和后续文库构建的多种方法（连同用于筛选或选择的适当方法）。此类诱变方法包括但不限于例如易错PCR、环改组、或寡核苷酸定向诱变、随机核苷酸插入或重组之前的其他方法。关于这些方法的进一步细节描述于以下文献中，例如，Abou-Nadler等人(2010) Bioengineered Bugs 1,337-340；Firth等人(2005) Bioinformatics 21, 3314-3315；Cirino等人(2003) MethodsMol Biol 231, 3-9；Pirakitikulr (2010) Protein Sci 19, 2336-2346；Steffens等人(2007) J. Biomol Tech 18, 147-149；等等。据此，在某些实施例中，提供经由基因工程技术所产生的多特异性抗原结合蛋白文库。

在某些实施例中，该文库经由体外翻译产生。简而言之，体外翻译需要将多肽编码序列克隆到含有启动子的载体中，通过以 RNA 聚合酶转录经克隆的序列来产生 mRNA，并且例如使用无细胞提取物通过体外翻译该 mRNA 来合成该多肽。可简单地通过改变经克隆的多肽编码序列来产生所期望抗原结合多肽变体。许多 mRNA 可在麦芽萃取物或兔网织红细胞裂解物中有效翻译。关于体外翻译的更多细节描述于以下文献中，例如，Hope等人(1985) Cell 43, 177-188；Hope等人(1986) Cell 46, 885-894；Hope等人(1987) EMBOJ. 6, 2781-2784；Hope等人(1988) Nature 333, 635-640；和 Melton等人(1984)Nucl.Acids Res.12, 7057-7070。

据此，在一些实施例中提供编码本文所述的多肽展示文库的多个核酸分子。本文还提供与该多个核酸分子可操作地连接的表达载体。还提供一种通过提供编码本文所述的多个抗原结合结构域的多个核酸并表达该核酸来制备本文所提供的文库的方法。

在某些实施例中，本文所提供的文库经由化学合成产生。固相和液相肽合成的方法为本领域中已知的并且详细描述于下列文献中：例如，Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis, A Practical Approach, (W. C. Chan, P. D. White 编), OxfordUniversity Press, 2000；Solid Phase Synthesis, A Practical Guide, (S. F.Kates, F Albericio 编), Marcel Dekker, 2000；P. Seneci, Solid-Phase Synthesisand Combinatorial Technologies, John Wiley & Sons, 2000；Synthesis of Peptidesand Peptidomimetics (M. Goodman, 主编, A. Felix, L. Moroder, C. Tmiolo 编),Thieme, 2002；N. L. Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, 2005；Methods in Molecular Biology, 298, Peptide Synthesis and Applications, (J.Howl 编) Humana Press, 2005；和 Amino Acids, Peptides and Proteins in OrganicChemistry, 第 3 卷, Building Blocks, Catalysts and Coupling Chemistry, (A. B.Hughs, 编)Wiley-VCH, 2011。据此，在某些实施例中，提供一种经由化学合成技术所产生的多特异性抗原结合蛋白质文库。

在某些实施例中，本文所提供的文库为展示文库。在某些实施例中，展示文库为噬菌体展示文库、噬菌粒展示文库、病毒展示文库、细菌展示文库、酵母展示文库、λgt11 文库、CIS 展示文库和体外区室化文库或核糖体展示文库。制备和筛选此类展示文库的方法为本领域技术人员所已知的并且描述于以下文献中：例如，Molek等人(2011)Molecules16, 857-887；Boder 等人, (1997) Nat Biotechnol 15, 553-557；Scott等人(1990)Science 249, 386-390；Brisette等人(2007) Methods Mol Biol 383, 203-213；Kenrick等人(2010) Protein Eng Des Sel 23, 9-17；Freudl等人(1986) J Mol Biol 188,491-494；Getz等人(2012) Methods Enzymol 503, 75-97；Smith等人(2014) Curr DrugDiscov Technol 11, 48-55；Hanes,等人(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94,4937-4942；Lipovsek 等人, (2004) J Imm Methods 290, 51-67；Ullman等人(2011) Brief.Funct. Genomics, 10, 125–134；Odegrip等人(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101,2806-2810；和 Miller等人(2006) Nat Methods 3, 561-570。

在某些实施例中，本文所提供的文库为例如通过 Szostak 等人、US 6258558、US6261804、US 5643768 和 US 5658754 中所述的技术所产生的 RNA-蛋白质融合文库。在某些实施例中，本文所提供的文库为 DNA-蛋白质文库，如例如 US 6416950 所述。

筛选方法

在一些实施例中，本文所述的文库经筛选以鉴定相较于亲本抗原结合多肽（例如，亲本抗体、亲本抗体的抗原结合片段或亲本抗体构建体）具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体）。在一些实施例中，本文所提供的文库可经筛选以鉴定具有低粘度（例如，相较于亲本抗原结合蛋白经降低的粘度）和/或相较于亲本抗原结合多肽（例如，亲本抗体、亲本抗体的抗原结合片段或亲本抗体构建体）对靶抗原的亲和力具有相当的、至少一样高的或改善的对靶抗原的亲和力的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体）。

在某些实施例中，对文库进行筛选包括以下步骤：在允许感兴趣的标靶与该文库中的特异性结合该标靶的抗原结合多肽变体结合的条件下接触本文所述的文库；检测该标靶与特异性结合该标靶的抗原结合多肽变体的结合（例如，检测包含该标靶和特异性结合该标靶的该抗原结合多肽变体的复合物）；以及获得特异性结合该标靶的抗原结合多肽变体。在一些实施例中，该方法进一步包括测量由此（例如，根据本文所述的方法）获得的抗原结合多肽变体的粘度，以鉴定具有低粘度（例如，小于约 50 cP、小于约 20 cP或小于约10cP 的粘度，当在高浓度下诸如在 180 mg/mL 下、20 mM 组氨酸乙酸盐、pH 5.5、25℃ 测量时）或相较于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体。

在一些实施例中，对文库进行筛选进一步包括使经由文库筛选所鉴定的抗原结合多肽变体或通过使用本文的方法所获得的抗原结合多肽变体经历至少一个亲和力成熟步骤（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或多于 10 个亲和力成熟步骤）。在一些实施例中，抗原结合多肽经历至少一个亲和力成熟步骤（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或多于 10 个亲和力成熟步骤）以获得亲和力成熟的抗原结合多肽变体，并且该亲和力成熟的抗原结合多肽变体用于本文所述的方法中或本文所述的文库或文库筛选中。亲和力成熟是一种过程，通过该过程，通过本文所提供的方法或通过筛选本文所提供的文库所产生的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体）经历针对增加的对标靶（例如，靶配体或靶抗原）的亲和力进行选择的方案（参见，Wu等人(1998) Proc Natl AcadSci USA.95, 6037-42）。关于抗体的亲和力成熟的细节还详述于以下文献中：例如，Merchant等人(2013) Proc Natl Acad Sci U S A. 110(32): E2987-96；Julian等人(2017)Scientific Reports.7：45259；Tiller等人(2017)Front.Immunol.8：986；Koenig等人(2017) Proc Natl Acad Sci U S A.114(4): E486-E495；Yamashita等人(2019)Structure.27, 519–527；Payandeh等人(2019)J Cell Biochem.120：940-950；Richter等人(2019)mAbs.11(1): 166-177；和 Cisneros等人(2019)Mol. Syst. Des. Eng. 4: 737-746 的延续。

在一些实施例中，抗原结合多肽变体中的经取代的氨基酸（即，经引入变体中以替换具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸的具有较低 SAP 值和/或较低 SASA比率的氨基酸）在亲和力成熟步骤期间固定（诸如未经随机化或未经进一步取代）。在一些实施例中，抗原结合多肽变体中的一个或多个氨基酸（例如，除了替换具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸的具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸之外）经随机化以产生经随机化的变体的文库。在一些实施例中，经随机化的变体中的一个或多个氨基酸经替换以改善抗原结合多肽变体对其标靶的亲和力。在一些实施例中，经替换以改善抗原结合多肽变体对其标靶的亲和力的经随机化的变体中的一个或多个氨基酸位于抗原结合多肽变体的接触标靶（例如，靶配体或靶抗原）的位点处或附近。然后筛选经随机化的变体的文库，以鉴定那些对标靶具有所期望亲和力的变体。在一些实施例中，在亲和力成熟之后所获得的变体被称为“亲和力成熟的变体”。

在一些实施例中，其中抗原结合多肽为通过使用本文的方法所获得的抗体、其抗原结合片段、或抗体构建体、或前述任一者的变体，在亲和力成熟期间经随机化的一个或多个氨基酸在 V_H 和/或 V_L 中。在一些实施例中，在亲和力成熟期间经随机化的一个或多个氨基酸在 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和/或 CDR-L3 中。因此，在某些实施例中，本文所述的方法包括（诸如进一步包括）以下步骤：对通过本文所述的方法所获得的抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体的 V_H 和/或 V_L（例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和/或 CDR-L3）在一个或多个位置处进行诱变或随机化，以产生经随机化的变体的文库；使经随机化的变体的该文库与标靶（例如，靶配体或靶抗原）接触；检测该标靶与一种或多种经随机化的变体的结合；以及获得特异性结合该标靶的一种或多种经随机化的变体。在一些实施例中，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和/或 CDR-L3 中的经引入至变体中以替换具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸的具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的一个或多个氨基酸是经固定的（例如，未经靶向以进行进一步随机化或诱变）。在一些实施例中，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体中的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和/或 CDR-L3 中的经引入至变体中以替换具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率的野生型氨基酸的具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的一个或多个氨基酸是未经固定的（例如，经靶向以进行进一步随机化或诱变）。在某些实施例中，亲和力成熟的抗体变体、其抗原结合片段或亲和力成熟的抗体构建体变体包含至少一个或至少两个先前未随机化的经随机化的 CDR。在一些实施例中，在两轮或更多轮亲和力成熟之后获得的亲和力成熟的抗体变体、其抗原结合片段或亲和力成熟的抗体构建体变体低粘度（例如，相较于亲本抗体、片段或构建体的较低粘度）和/或以至少与在一轮亲和力成熟之后获得的亲和力成熟的抗体变体、其抗原结合片段或亲和力成熟的抗体构建体变体的亲和力一样高的亲和力结合感兴趣的标靶。在一些实施例中，已经历两轮或更多轮亲和力成熟的亲和力成熟的抗体变体、其抗原结合片段或亲和力成熟的抗体构建体变体与亲本抗体、其抗原结合片段或亲本抗体构建体相比具有较低粘度并且以与亲本抗体、其抗原结合片段或亲本抗体构建体用于结合感兴趣的标靶的亲和力相当的、至少一样高的或改善的亲和力结合感兴趣的标靶。

在一些实施例中，该方法进一步包括例如根据本文所述的方法测量亲和力成熟的抗原结合多肽变体（即，在至少一个亲和力成熟步骤之后获得的变体）的粘度，以鉴定具有对感兴趣的标靶的高亲和力（诸如相较于亲本抗原结合多肽对该标靶的亲和力相当的、至少一样高的或改善的对感兴趣的标靶的亲和力）和低粘度（诸如相较于亲本抗原结合多肽经降低的粘度）的亲和力成熟的抗原结合多肽。在一些实施例中，低粘度是指当在高浓度下诸如在 180 mg/mL 下、20 mM 组氨酸乙酸盐、pH 5.5、25℃ 测量时，小于约 50 cP、小于约20 cP 或小于约 10cP 的粘度。

在一些实施例中，对亲和力成熟的变体进行进一步表征。例如，在一些实施例中，进一步表征包括 (a) 鉴定亲和力成熟的变体中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸；(b) 以相较于与亲本亲和力成熟的变体具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有高 SAP 值和/或高SASA 比率的氨基酸，以产生经取代的亲和力成熟的变体；(c) 测量经取代的亲和力成熟的变体的粘度；(d) 鉴定经取代的亲和力成熟的变体相对于亲本亲和力成熟的变体具有经降低的粘度。在一些实施例中，例如根据本文别处所述的方法，测量经取代的亲和力成熟的变体对其标靶的亲和力。在一些实施例中，经取代的亲和力成熟的变体具有低粘度（诸如相较于亲本抗原结合多肽经降低的粘度）和对感兴趣的标靶的高亲和力（诸如相较于亲本亲和力成熟的变体对感兴趣的标靶的亲和力相当的、至少一样高的或改善的对感兴趣的标靶的亲和力）。在一些实施例中，经取代的亲和力成熟的变体经历一个或多个额外的亲和力成熟步骤（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或多于 10 个额外的亲和力成熟步骤）。

诱变抗原结合多肽（例如，通过筛选本文的文库或通过使用本文所述的方法获得的抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体的 V_H 和/或 V_L 中的一者或多者或 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和/或 CDR-L3 中的一者或多者）是本领域中已知的，并且可包括例如随机诱变、CDR 步移诱变或顺序和平行优化、通过基于结构的合理设计的诱变、位点特异性诱变、基于酶的诱变、基于化学的诱变、以及用于合成抗体基因生产的基因合成方法。参见，例如，Yang 等人, 1995, CDR Walking Mutagenesis for theAffinity Mutation of a Potent Human Anti-HIV-1 Antibody into the PicomolarRange, J. Mol.Biol.254:392-40，和 Lim 等人, 2019, Review: Cognizance ofMolecular Methods for the Generation of Mutagenic Phage Display AntibodyLibraries for Affinity Maturation, Int. J. Mol. Sci, 20:1861，两者的内容均以全文引用方式并入本文。

可通过本领域已知的任何技术来筛选本文所述的抗原结合多肽变体的文库，以进化出特异性结合靶配体的新的或改善的结合蛋白。在某些实施例中，靶配体固定在固体支持物（诸如柱树脂或微量滴定板孔）上，并且靶配体与候选多特异性抗原结合蛋白的文库（诸如本文所述的任何文库）接触。选择技术可为，例如，噬菌体展示 (Smith (1985)Science 228, 1315-1317)、mRNA 展示（Wilson等人(2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3750-3755）、细菌展示（Georgiou,等人(1997) Nat Biotechnol 15:29-34.）、酵母展示（Boder 和 Wittrup (1997) Nat. Biotechnol.15:553-5577）或核糖体展示（Hanes 和 Plückthun (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94:4937–4942 和 WO2008/068637）。

在某些实施例中，抗原结合结构域多肽变体的文库为噬菌体展示文库。在某些实施例中，提供一种展示本文所述的抗原结合结构域变体的噬菌体颗粒。在某些实施例中，提供一种展示本文所述的抗原结合结构域变体的噬菌体颗粒，其能够与靶配体结合。

噬菌体展示是一种技术，通过该技术，多个多特异性抗原结合蛋白变体作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面上（Smith, G. P. (1985) Science, 228:1315-7；Scott, J. K. 和 Smith, G. P. (1990) Science 249: 386；Sergeeva, A.,等人(2006)Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1622-54)。噬菌体展示的实用性在于以下事实，经选择性随机化的蛋白质变体（或经随机克隆的 cDNA）的大文库可快速有效地分类，以找到以高亲和力与靶分子结合的那些序列。

肽（Cwirla, S. E.等人(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）或蛋白质（Lowman, H. B.等人(1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson, T.等人(1991)Nature, 352: 624；Marks, J.D.等人(1991), J. Mol. Biol., 222:581；Kang, A. S.等人(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）文库在噬菌体上的展示已用于筛选数百万种多肽或寡肽，从而寻找具有特异性结合特性的多肽或寡肽（Smith, G. P. (1991)Current Opin. Biotechnol., 2:668；Wu等人(1998) Proc Natl Acad Sci USA. May 95,6037-42）。多价噬菌体展示方法已用于通过与丝状噬菌体的基因 III 或基因 VIII 融合来展示小随机肽和小蛋白质。（Wells 和 Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol.,3:355-362 (1992)，以及其中所引用的参考文献。）在单价噬菌体展示中，蛋白质或肽文库与基因III 或其部分融合，并在野生型基因 III 蛋白质的存在下以低量表达，使得噬菌体颗粒展示一个拷贝或不展示融合蛋白。相对于多价噬菌体，亲合力效应降低，因此分选基于内在配体亲和力，并且使用噬菌粒载体，这简化了 DNA 操纵。（Lowman 和 Wells, Methods: Acompanion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991)。）

分选抗原结合多肽变体的噬菌体文库需要大量变体的构建和繁殖、使用靶配体进行亲和纯化的程序、以及评估结合富集结果的方法（参见例如，US 5223409、US 5403484、US5571689 和 US 5663143）。

大多数噬菌体展示方法使用丝状噬菌体（诸如 M13 噬菌体）。人字型噬菌体展示系统（参见 WO1995/34683、US 5627024）、T4 噬菌体展示系统（Ren等人(1998) Gene 215:439；Zhu等人(1998) Cancer Research, 58:3209-3214；Jiang 等人, (1997) Infection& Immunity, 65:4770-4777；Ren等人(1997) Gene, 195:303-311；Ren (1996) ProteinSci., 5:1833；Efimov等人(1995) Virus Genes, 10:173）和 T7 噬菌体展示系统 （Smith和 Scott (1993) Methods in Enzymology, 217: 228-257；US.5766905）也是已知的。

现在已开发了基本噬菌体展示概念的许多其他改善和变化。这些改善增强了展示系统的针对与选定靶分子结合来对肽文库进行筛选并且展示功能性蛋白质的能力，并且有可能针对所期望特性对这些蛋白质进行筛选。已开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置 (WO 1998/14277)，并且噬菌体展示文库已被用于分析和控制双分子相互作用（WO1998/20169；WO 1998/20159）和受限螺旋肽的特性 (WO 1998/20036)。WO 1997/35196 描述一种分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库与其中配体将与靶分子结合的一种溶液和其中亲和配体将不与靶分子结合的第二溶液接触，以选择性地分离结合配体。WO1997/46251 描述一种用经亲和纯化的抗体对随机噬菌体展示文库进行生物淘选，并且然后分离结合噬菌体，随后使用微板孔进行微淘选过程以分离高亲和力结合噬菌体的方法。此类方法可应用于本文所公开的抗原结合多肽变体的文库。使用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 蛋白 A 作为亲和标签也已有报道（Li等人(1998) MolBiotech. 9:187）。WO 1997/47314 描述底物扣除文库使用组合文库来区分酶特异性的用途，该组合文库可为噬菌体展示文库。选择特异性结合蛋白的另外的方法描述于 US5498538、US 5432018 和 WO 1998/15833 中。产生肽文库和筛选这些文等库的方法还公开于 US 5723286、US 5432018、US 5580717、US 5427908、US 5498530、US 5770434、US5734018、US 5698426、US 5763192 和 US 5723323 中。

可通过本领域已知的各种测定来表征使用通过筛选本文所述的文库或通过使用本文所述的方法所产生的抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体或前述任一者的亲和力成熟的变体的物理/化学特性和生物功能。此类测定包括但不限于 N 末端测序、氨基酸分析、非变性尺寸排阻高压液相色谱法 (HPLC)、质谱分析、离子交换色谱法和木瓜蛋白酶消化。在一些实施例中，例如使用本领域已知的和/或本文别处所述的方法来测量抗体变体、其抗原结合片段、抗体构建体变体或前述任一者的亲和力成熟的变体的粘度。

在某些实施例中，分析通过筛选本文所述的文库或使用本文所述的方法所获得的抗体变体、其抗原结合片段、或抗体构建体变体或前述任一者的亲和力成熟的变体的生物活性。在一些实施例中，测试抗体变体、其抗原结合片段或抗体构建体变体的抗原结合活性。本领域已知并且可用于本文的抗原结合测定包括但不限于，使用诸如西方墨点法、放射免疫测定、ELISA（酶联免疫吸附测定）、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定和蛋白 A 免疫测定等技术的任何直接或竞争性结合测定。

抗原结合多肽变体的产生和纯化

在一些实施例中，该方法进一步包括产生亲和力成熟的抗原结合多肽变体（例如，抗体变体、抗体变体的抗原结合片段或抗体构建体变体）。在一些实施例中，产生亲和力成熟的变体（例如，亲和力成熟的抗体变体、亲和力成熟的抗体变体的抗原结合片段或亲和力成熟的抗体构建体变体）的方法为制造规模的生产过程（诸如发酵过程）。通过筛选本文的文库、通过使用本文的方法、或通过筛选文库或使用本文所述的方法所获得的变体的亲和力成熟而获得的抗原结合多肽变体可通过本领域已知的任何手段来产生。下文描述用于抗原结合多肽变体产生的示例性技术；然而，这些示例性技术仅出于说明性目的而提供，并非旨在进行限制。

通过筛选本文的文库、通过使用本文的方法、或通过对筛选文库或使用本文所述的方法所获得的变体进行亲和力成熟而获得的抗原结合多肽变体可使用重组方法来产生。为了重组产生抗原结合多肽变体，分离编码抗原结合多肽变体的核酸并将其插入至可复制载体中以用于进一步克隆（DNA 的扩增）或用于表达。编码抗原结合多肽变体的 DNA 可使用常规程序（例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）轻易地分离并测序。许多载体可用。载体组分通常包括但不限于下列中的一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个选择标记基因、增强子组件、启动子和转录终止序列。

通过筛选本文的文库、通过使用本文的方法、或通过筛选文库或使用本文所述的方法所获得的变体进行亲和力成熟而获得的抗原结合多肽变体可重组地产生为与异源多肽（例如，在成熟蛋白质或多肽的 N 末端具有特定切割位点的信号序列或其他多肽）的融合多肽。所选的异源信号序列可为由宿主细胞识别并加工（例如，由信号肽酶切割）的信号序列。对于不识别并加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列经选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp 或热稳定肠毒素 II 前导序列的原核信号序列取代。对于酵母分泌，天然信号序列可经例如酵母转化酶前导序列、因子前导序列（包括酵母菌属(Saccharomyces) 和克鲁维酵母菌属 (Kluyveromyces) α-因子前导序列）或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌 (C. albicans) 葡糖淀粉酶前导序列等取代。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列（例如，单纯疱疹 gD 信号）可用。

表达载体和克隆载体两者均含有一种核酸序列，该核酸序列使该载体能够在一种或多种所选的宿主细胞中复制，例如以允许该载体独立于宿主染色体 DNA 来进行复制。该序列可包括复制起点或自主复制序列。用于多种细菌、酵母和病毒的此类序列是众所周知的。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分（可使用 SV40 起点，因为它包含早期启动子）。

表达和克隆载体可含有选择基因或选择性标记。通常的选择基因编码以下蛋白质：(a) 赋予对抗生素或其他毒素（例如，氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素）的抗性，(b) 补充营养缺陷型缺陷，或 (c) 提供无法从复杂培养基中获得的关键营养素。显性选择的实例使用药物新霉素、麦考酚酸和潮霉素。适用于哺乳动物细胞的选择标记的另一实例为那些能够鉴定胜任摄取抗原结合多肽变体编码核酸的细胞者，诸如 DHFR、谷氨酰胺合成酶 (GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白 I 和 II，优选地为灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，通过在含有氨甲喋呤（Mtx，DHFR 的竞争性拮抗剂）的培养基中培养转化体来鉴定用 DHFR 基因转化的内源性 DHFR 活性缺陷的中华仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系。

可替代地，可以通过在含有用于选择性标记物的选择剂（诸如氨基糖苷类抗生素，例如，卡那霉素、新霉素或 G418）的培养基中进行细胞生长，来选择用编码目标抗体、野生型 DHFR 基因和另一种选择性标记物诸如氨基糖苷 3'-磷酸转移酶 (APH) 的 DNA 序列转化或共转化的宿主细胞（特别是包含内源 DHFR 的野生型宿主）。

表达和克隆载体通常含有由宿主生物体识别并与编码抗原结合多肽变体的核酸可操作地连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括 phoA 启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸 (trp) 启动子系统以及杂合启动子诸如 tac 启动子。然而，其他已知的细菌启动子也适用。真核生物的启动子序列是已知的。酵母启动子为本领域已知的并且可包括受生长条件调节的诱导型启动子/增强子。实际上，所有真核基因具有富含 AT 的区域，位于转录起始位点上游约 25 个至 30 个碱基的位置。实例包括但不限于 3-磷酸甘油酸激酶或其他糖类分解酶的启动子，诸如烯醇酶、3-磷酸甘油醛去氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。从哺乳动物宿主细胞中的载体进行抗原结合多肽变体转录可例如通过从病毒基因组获得的启动子来控制。SV40 病毒的早期和晚期启动子可方便地以 SV40 限制性片段的形式获得，其中也包含 SV40 病毒的复制起点。人类巨细胞病毒的立即早期启动子可以以 HindIII E 限制性片段方便地获得。可替代地，劳斯肉瘤病毒 (Rous Sarcoma Virus) 长末端重复序列可用作启动子。

编码抗原结合多肽变体的 DNA 的转录通常通过将增强子序列插入至载体中而增加，该抗原结合多肽变体通过筛选本文的文库、通过使用本文的方法、或通过使通过筛选本文的文库或使用本文的方法所获得的变体经历通过高等真核生物进行的亲和力成熟而获得。现在从哺乳动物基因中已知许多增强子序列（球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白和胰岛素）。然而，通常，将使用来自真核细胞病毒的增强子。

真核宿主细胞（酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或其他多细胞生物的有核细胞）中使用的表达载体还将含有终止转录和稳定 mRNA 所需的序列。

用于在本文的载体中克隆或表达 DNA 的合适宿主细胞是上述原核生物、酵母或更高等的真核细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属 (Escherichia)（例如大肠杆菌 (E. coli)）、肠杆菌属 (Enterobacter)、欧文氏菌属 (Erwinia)、克雷伯氏菌属 (Klebsiella)、变形杆菌属 (Proteus)、沙门氏菌属 (Salmonella)（例如，鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonellatyphimurium)）、沙雷氏菌属 (Serratia)（例如，粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescans)）和志贺氏菌 (Shigella) 等。除原核生物之外，真核微生物（诸如丝状真菌或酵母）也为抗原结合多肽变体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) 或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的酵母。可选择其中糖基化途径已被“人源化”的某些真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗原结合多肽变体。参见，例如，Li 等人,Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍（唇形科 (Leninaceae)）、苜蓿（蒺藜苜蓿 (M. truncatula)）和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。

用于表达糖基化抗原结合多肽变体的合适的宿主细胞还来源于多细胞生物（无脊椎动物和脊椎动物）。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株和变体以及来自宿主的相应的允许昆虫宿主细胞，这些宿主诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)（毛虫）、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)（蚊）、白纹伊蚊 (Aedesalbopictus)（蚊）、黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)（果蝇）和家蚕 (Bombyx mori)。

脊椎动物细胞可以用作宿主，并且脊椎动物细胞在培养（组织培养）中的繁殖已成为常规过程。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例为由 SV40 转化的猴肾 CV1 细胞系(COS-7, ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞经亚克隆以用于在悬浮培养物种生长的 293 或293 细胞，Graham 等人, J. Gen Virol.36:59 (1977)）；幼仓鼠肾细胞 (BHK, ATCC CCL10)；小鼠赛托利 (sertoli) 细胞（TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251 (1980)）；猴肾细胞 (CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞 (VERO-76, ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA, ATCC CCL 2)；犬肾细胞 (MDCK, ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞 (BRL 3A, ATCCCRL 1442)；人肺细胞 (W138, ATCC CCL 75)；人肝细胞 (Hep G2, HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤 (MMT 060562, ATCC CCL51)；TRI 细胞（Mather 等人, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)）；MRC 5 细胞；FS4 细胞；和人类肝癌细胞系 (Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞，包括 DHFR^- CHO 细胞（Urlaub 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；和骨髓瘤细胞系，诸如 NS0 和 Sp2/0。对于某些适用于抗体生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki 和 Wu,Methods in Molecular Biology, 第 248 卷 (B. K. C. Lo, 编, Humana Press,Totowa, N.J., 2003), 第 255-268 页。在一些实施例中，宿主细胞为 CHO-K1 细胞。CHO-K1 细胞系为 CHO 细胞系的亚克隆（参见，例如，www(dot)phe-culturecollections(dot)org(dot)uk/media/128263/chok1-cell-line-profile(dot)pdf 和 web(dot)expasy(dot)org/cellosaurus/CVCL_0214。

宿主细胞可在多种培养基中培养。市售培养基诸如 Ham's F10 (Sigma)、基本必需培养基 ((MEM), (Sigma)、RPMI-1640 (Sigma) 和 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基((DMEM), Sigma) 适用于培养宿主细胞。此外，Ham 等人, Meth. Enz. 58:44 (1979)，Barnes 等人, Anal. Biochem. 102:255 (1980)，美国专利号 4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或 5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利再授权30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。这些介质中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子（诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如 HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如 GENTAMYCIN^TM药物）、微量元素（定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物）和葡萄糖或等效能源。也能以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件，诸如温度、pH 等，为那些先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，对本领域技术人员而言将是显而易见的。

当使用重组技术时，抗原结合多肽变体可在细胞内、周质空间中产生或直接分泌到培养基。如果抗原结合多肽变体在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片（宿主细胞或裂解的片段）。Carter 等人, Bio/Technology 10:163-167 (1992) 描述一种分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。

从细胞制备的抗原结合多肽变体组合物可使用例如羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱进行纯化，其中亲和色谱为通常优选的纯化步骤中的一者。在一些实施例中，根据本文的方法所获得的抗原结合多肽变体包含抗原决定基标签（例如，经由可裂解的接头与抗原结合多肽变体附接的标签）以促进纯化。示例性抗原决定基标签包括但不限于例如，例如 6x His（也称为 His 标签或六聚组氨酸标签）、FLAG、HA、Myc、V5、GFP（绿色荧光蛋白，例如增强型绿色荧光蛋白或 EGFP）、GST（谷胱甘肽-S-转移酶）、β-GAL（β-半乳糖苷酶）、荧光素酶、MBP（麦芽糖结合蛋白）、RFP（红色荧光蛋白）和 VSV-G（水疱性口炎病毒糖蛋白）。

收获或回收和纯化抗体

在相关方面，产生根据本文所述的方法所获得的抗原结合多肽变体包括在允许表达经修饰的抗原结合多肽变体的条件下培养上述宿主细胞并回收（诸如收获）该抗原结合多肽变体。在某些实施例中，产生根据本文所述的方法所制备的抗原结合多肽变体进一步包括纯化经回收的抗原结合多肽变体以获得基本上均质的制备物，例如用于进一步测定和用途。

根据本文所述的方法所制备的抗原结合多肽变体可在细胞内产生，或直接分泌到培养基中。如果此类抗原结合多肽变体在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片（宿主细胞或经溶解的片段）。在根据本文所述的方法所制备的抗原结合多肽变体分泌到培养基中的情况下，来自此类表达系统的上清液通常首先使用市售蛋白质浓度过滤器（例如 Amicon 或 Millipore Pellicon 超滤装置）进行浓缩。蛋白酶抑制剂诸如PMSF 可以包含在前述任何步骤中以抑制蛋白水解作用并且抗生素可以包含在内以防止外来污染物的生长。

可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法来获得根据本文所述的方法从细胞制备的抗原结合多肽变体的基本上均质的制备物。下列程序为合适纯化程序的示例：在免疫亲和柱或离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、反相 HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂诸如 DEAE 上进行的色谱、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如 Sephadex G-75 进行的凝胶过滤。

另外或替代性地，使用本文所述的方法所制备的经修饰的抗原结合多肽变体可使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱为优选的纯化技术。

在某些方面，其中抗原结合多肽变体包含人 IgG 区或其部分，将源自如上所述的细胞培养基的制备物施加至蛋白 A 固定化的固相上，以允许该抗原结合多肽变体与蛋白A 特异性结合。然后洗涤固相以去除与该固相非特异性结合的污染物。通过洗脱到含有离液剂或温和去污剂的溶液中，从固相回收抗原结合多肽变体。示例性离液剂和温和去污剂包括但不限于盐酸胍、尿素、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS（十二烷基硫酸钠）、Tween、Triton 和 NP-40，此等全部为商业上可获得的。

蛋白 A 作为亲和配体的适用性取决于抗原结合多肽变体中存在的任何免疫球蛋白 Fc 结构域的物种和同种型。蛋白 A 可用于纯化基于人、或 重链的抗体（Lindmark 等人, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)）。建议将蛋白 G 用于全部小鼠同种型和人（Guss 等人, EMBO J. 5:15671575 (1986)）。亲和配体所附接的基质大多是琼脂糖，但也可以使用其他基质。机械稳定的基质，诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)，具有比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。当经修饰的抗原结合多肽变体包含 C_H3结构域时， 树脂 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) 可用于纯化。根据待回收的抗原结合多肽变体，也可使用用于蛋白质纯化的其他技术（诸如离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、反相 HPLC、硅胶柱色谱法、肝素 上进行的色谱、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上进行的色谱、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀）。

在任何初步纯化步骤之后，可使用 pH 介于约 2.5-4.5 之间的洗脱缓冲液对包含抗原结合多肽变体和污染物的混合物进行低 pH 疏水相互作用色谱，优选地在低盐浓度（例如，从约 0-0.25 M 盐）下进行。经修饰的抗原结合多肽变体的产生可替代性地或另外地（除前述特定方法中任一者外）包括透析包含该多肽的混合物的溶液。

具有经降低的粘度的示例性抗体可变结构域

在一些实施例中，提供使用本文所述的方法所产生的抗体可变结构域变体。在一些实施例中，抗体可变结构域变体为 SEQ ID NO:1 中所示的抗体重链可变结构域 (V_H)的变体。在一些实施例中，V_H 变体包含 SEQ ID NO:3 至 17 或 19 至 22 中任一者所示的氨基酸序列。SEQ ID No:1 和 3 至 17 和 19 至 22 的氨基酸序列提供于下。可变结构域遵循 Kabat 的编号方案进行编号。

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDWYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIKDWYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS V99K (SEQ ID NO:3)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDFYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aF (SEQ ID NO:4)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDVYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aV (SEQ ID NO:5)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDLYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aL (SEQ ID NO:6)

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EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDWRDYFKGFDYWGQGTLVTVSS Y100bR (SEQ ID NO:17)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDHYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aH (SEQ ID NO:19)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDKYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aK (SEQ ID NO:20)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDRYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aR (SEQ ID NO:21)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDWHDYFKGFDYWGQGTLVTVSS Y100bH (SEQ ID NO:22)

在一些实施例中，提供一种抗体，其包含 SEQ ID NO: 3 至 17 或 19 至 22 中任一者所示的 V_H 和 SEQ ID NO:2 中所示的抗体轻链可变结构域 (V_L)。在一些实施例中，提供一种抗体，其包含 SEQ ID NO: 3 至 17 或 19 至 22 中任一者所示的 V_H 和 SEQID NO:18 中所示的抗体轻链可变结构域 (V_L)。

如实例中所示，相较于包含 SEQ ID NO:1 中所示的 V_H 和 SEQ ID NO:2 中所示的 V_L 的抗体，包含SEQ ID NO: 3 至 17 或 19 至 22 中任一者所示的 V_H 和 SEQ IDNO:2 或 18 中所示的 V_L 的抗体展现出较低粘度。可变结构域遵循 Kabat 的编号方案进行编号。SEQ ID NO:2 的氨基酸序列提供于下：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYGSYLYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:2).

在一些实施例中，抗体可变结构域变体为 SEQ ID NO:2 中所示的抗体轻链可变结构域 (V_L) 的变体。在一些实施例中，V_L 变体包含 SEQ ID NO:18 中任一者所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:18 的氨基酸序列提供于下。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYGSKLYTFGQGTKVEIK Y94K (SEQ ID NO:18)

如实例中所示，相较于包含 SEQ ID NO:2 中所示的 V_L 的抗体，包含 SEQ IDNO:18 中所示的 V_L 的抗体展现出较低粘度。在一些实施例中，提供一种抗体，其包含 SEQID NO:18 中所示的抗体轻链可变结构域 (V_L) 和 SEQ ID NO:1、3 至 17 或 19 至 22中任一者所示的 V_H。

本说明书中所引用的全部出版物和专利申请均以引用方式并入本文，如同各个别出版物或专利申请被具体地且单独地指示为以引用方式并入一般。

实例

提出下列实例以向那些具有本领域技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人所认为的发明的范围，也不旨在表示以下实验为全部或唯一进行的实验。已尽力确保所用数字（例如数量、温度等）的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有指示，否则份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压力或接近大气压力。

实例 1A：抗胰高血糖素受体 (GCGR) 抗体的可变结构域的深度突变分析

下列实验使用设定为示例性抗体的包含 SEQ ID NO:1 中所示的 V_H 结构域和SEQ ID NO:2 中所示的 V_L 结构域的抗 GCGR（G 蛋白偶联的胰高血糖素受体）IgG1 抗体进行，该抗体在高浓度下展现出经升高的粘度。SEQ ID NO:1 和 2 提供于下。关于该抗GCGR 抗体的进一步细节提供于 WO 2013/059531 中，其内容以全文引用方式并入本文。

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDWYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYGSYLYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:2)

抗体的 CDR 通常富含有助于抗原结合亲和力的芳香族残基（Traxlmayr等人(2016) J Biol Chem, 291:22496–508）。在先前的研究（参见Tilegenova 等人(2020)mAbs, 12(1): 1692764）中，抗 GCGR IgG1 的可变区内的 16 个芳香族残基突变为丙氨酸，以研究芳香族残基在该抗体的高粘度中的可能作用。16 种突变体中有十二种的表达量足以用于进一步研究。参见图1。粘度在 pH 5.5 的 20 mM 组氨酸乙酸盐缓冲液中在 180mg/mL 终浓度下测量。已鉴定出可显著降低粘度（降低约 2 至约 8 倍）的七种不同丙氨酸变体。参见图1。该结果表明，芳香族氨基酸残基普遍参与构成由浓抗体溶液所展现出的高粘度的原因的分子间相互作用。此七种变体中的两者，即 V_L Y55A和 Y91A，还保留对 GCGR的抗原结合亲和力，此为潜在抗体临床候选者的所期望属性。参见表 1。抗原结合亲和力（K_D 值）经由表面等离子体共振进行评定。

表 1

*相对于亲本抗体，抗体变体展现出 >2 倍的经降低的粘度，并且保留在亲本抗体的 2 倍内的 K_D。

如图1 中所示，并非全部丙氨酸取代变体均展现出经降低的粘度，表明其他类型的分子间相互作用也可能导致高粘度。为了研究此类分子相互作用，对抗 GCGR Fab 的晶体结构进行解析（2.7Å 分辨率），并且进行表面分析以定位 Fab 上的带电荷和/或疏水性斑块。简而言之，通过自适应泊松-玻尔兹曼求解器（APBS，参见，例如，www(dot)cgl(dot)ucsf(dot)edu/chimera/docs/ContributedSoftware/apbs/apbs(dot)html 和 Baker 等人(2001) PNAS USA,98(18): 10037-10041）来计算 Fab 的静电势图。参见图2，左侧。还确定 Fab 的空间聚集倾向 (SAP)，例如，如 Chennamsetty 等人(2009) PNAS USA, 106(29): 11937-11942 和Lauer 等人(2012) J Pharm Sci, 101(1): 102-115 中所述。参见图2，右侧。考虑到溶液中抗体分子的柔性，并入分子动力学 (MD) 模拟以制备关于 SAP 的经平均的模型。参见，例如，R. Salomon-Ferrer, D.A. Case, R.C. Walker.(2013) “Anoverview of the Amber biomolecular simulation package.”WIREs Comput. Mol.Sci. 3, 198-210；和 D.A. Case, T.E. Cheatham, III, T. Darden, H. Gohlke, R.Luo, K.M. Merz, Jr., A. Onufriev, C. Simmerling, B. Wang 和 R. Woods.(2005)“The Amber biomolecular simulation programs.”J. Computat. Chem. 26, 1668-1688。鉴定出抗 GCGR Fab 上的疏水性斑块（图2 中圈出的部分，右侧）。此外，在抗 GCGRFab 的 CDR 内鉴定出四个高 SAP 区（例如，具有 ≥ 2、诸如 2.3 或更大的 SAP 值）。参见图3。在所示例的 6 个 CDR 中，4 个 CDR（L3、H1、H2 和 H3）具有多个（但不是全部）SAP值 >2 的残基。

申请人假设，破坏 CDR 内的疏水性斑块会降低粘度。为了测试该假设，产生了取代变体，其中 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3 和 CDR-L3 中的疏水性斑块中的一个或多个芳香族残基经丙氨酸替换。图4 显示抗 GCGR Fab 的 CDR 中的经取代的芳香族残基。

图5 显示 V_H 和 V_L 中的单一取代以及 VH 中的双取代在 180 mg/ml IgG1、20mM 组氨酸乙酸盐、pH 5.5、25℃ 下对粘度的影响。图5 中所示的单一取代变体 IgG1 抗体相对于亲本 IgG1 抗体的粘度与在各位置处的原始野生型芳香族残基的 SAP 值的比较显示于图6。与Tilegenova 等人(2020) mAbs, 12(1): 1692764 中所报道的结果一致，并非全部丙氨酸取代均减少粘度。例如，Y31A 取代相对于亲本抗体降低变体的粘度，而与 Y31A取代相邻的 Y30A 取代相对于亲本抗体不降低变体的粘度。类似地，Y100bA 取代相对于亲本抗体降低变体的粘度，而与 Y100bA 取代相邻的 Y100dA 取代则不。此类结果表明单独的 SAP 值不足以预测影响粘度的关键残基。

接下来，计算经鉴定为具有高 SAP 值（例如，SAP 值 ≥ 2，诸如 2.3 或更大）的各氨基酸的溶剂可及表面积 (SASA) 比率，例如，如 ssbio(www)readthedocs(dot)io/en/latest/instructions/msms(dot)html 处所述。简而言之，SASA 比率通过将氨基酸侧链的表面可及面积除以该侧链的总表面积来计算。图7 显示抗 GCGR IgG1 抗体的 CDR 中的某些氨基酸位置的 SASA 比率，包括那些具有 SAP 值 ≥ 2 的残基。图7 中的虚线指示用于高 SASA 比率 (0.25) 和高 SAP 分数 (2.3) 的截止值。抗 GCGR 抗体的 VH 结构域中的具有高 SAP 值和高 SASA 的氨基酸，诸如 Y31、Y100b、Y53 和 Y100a，预计在该抗体的粘度中发挥重要作用，并且预计在经取代时在减轻粘度中发挥作用。此外，还包括高 SASA 比率和低 SAP 区（左上象限中的经标记的残基）以及低 SASA 比率和高 SAP 区（右下象限中的经标记的残基）中的代表性位点，以提供更多综合分析。图7 中如未经标记的圆圈所示的其他氨基酸位置预计不会影响粘度，例如，当突变为丙氨酸时。

然后，申请人构建了约 200 个抗体单一突变型抗体变体，其中 CDR 中的经确定为具有高 SAP 值（例如，≥ 2，诸如 2.3 或更大）和高 SASA 比率（例如，≥ 0.25 或 ≥0.5）的氨基酸被取代。（未构建 Gly、Pro、Cys 和 Met 取代变体。）首先经由动态光散射(DLS) 在介于约 2 mg/ml 与约 10 mg/ml 之间的浓度下筛选抗体变体，以使用以下方程式测量各变体的相互作用参数：

其中 D = 平移扩散系数；D₀ 为自扩散系数（在零浓度下的 D 值）；c = 蛋白质浓度；并且 k_D = 相互作用参数。变体的 k_D 值愈正，变体的自相互作用愈弱。相反，变体的 k_D值愈负，变体的自相互作用愈强。参见，例如，Sorret等人(2016) Biophysical Journal,111: 1831–1842。

图9 提供显示抗 GCGR IgG1 抗体的某些替换氨基酸对 DLS 相互作用参数 (ml/g) 的影响的表格。显示的是在 25.0℃、20 mM 组氨酸乙酸盐、pH 5.5 中测量的 DLS 相互作用参数。具有极低扩散系数的变体经突出显示（灰色），指示它们在溶液中的多分散行为。使用 (P) 来突出显示亲本残基。具有表达或纯化问题或展现出显著聚集的突变体也经突出显示（黑色）。评定来自该 DLS 研究的抗 GCGR IgG₁ 变体的子集（图 9）在高浓度下的粘度。具体地，选择了约 30 个变体，跨越与亲本抗体 (8 mL/g) 相当的、高于或低于亲本抗体的广泛的相互作用参数值（0 至 26 mL/g）。这些变体代表多种替换氨基酸类型：脂肪族、芳香族、带正电荷和不带电荷极性。本研究另外规划了具有负 DLS 相互作用参数的变体，但由于自旋浓缩过程期间的沉淀而流失，并且因此被排除在粘度测量之外。另外包括图 5中的约 10 个单一丙氨酸取代变体。图8 显示这些示例性抗 GCGR IgG1 抗体变体的 DLS相互作用参数 (k_D, ml/g) 和粘度 (η, cP) 的图。该图表明，在 DLS 相互作用参数与抗GCGR 抗体变体的粘度之间存在相关性。低于野生型值的 DLS 相互作用参数值与较高的粘度相关，而高于野生型值的 DLS 相互作用参数值与较低的粘度相关。

图10 显示图9 中所测试的各抗 GCGR IgG1 抗体变体的 DLS 相互作用参数(k_D, ml/g) 和各变体的解离常数 (K_D, M) 的图。一些变体，即包含含有 W100aF、Y30H、W100aV、W100aL、Y100bK、Y100bH、Y100bR 或 Y100bQ 取代的 VH 结构域和 SEQ ID NO:2所示的 VL 结构域或 Y94K 的 VL 结构域取代，显示经增加的 DLS 相互作用参数，该参数对抗原结合亲和力的影响很小（例如，结合亲和力相较于亲本减少了少于 5 倍)。参见图10的左上象限。

表 2 中提供图10 的左上象限的变异体的额外具体信息。

表 2.本文所提供的某些变体的表征数据。

针对亲本和变体测试了多个额外的参数。具体地，使用治疗性抗体分析仪 (TAP)执行计算可开发性分析。针对 VH W100aL 变体鉴定的琥珀色 TAP 标志用于表面疏水性。还显示 Fv 片段的经计算的等电点、来自杆状病毒 ELISA 的多特异性、以及使用NetMHCIIpan-4.0 EL 预测的免疫原性 T 细胞抗原决定基。人性分数根据 OASi 百分位数进行确定。结果提供于表 3A 和 3B 中。具体地，表 3A 至 3B提供本文所述的经测试的抗GCGR IgG1 抗体变体的表征数据。所显示的实验数据包括动态光散射相互作用参数 (kD)、通过表面等离子体共振所测量的抗原结合动力学（kon、koff 和 KD）、通过分析性尺寸排阻色谱法所确定的 IgG1 单体百分比、以及通过锥板流变测定在 180 mg/mL IgG1 下于25.0℃ 在 20 mM 组氨酸乙酸盐 (pH 5.5) 中所测量的粘度。所显示的计算数据包括 TAP分数和标志、等电点和 SAP 值。nd，未检测到结合；nm，未测量。

Y100bV、W100aF、S56R、Y100bA、Y100bH、Y30H、W100aV、W100aL、Y100bK、W100aA、S54R、V99K、Y31H 的 VH 结构域的氨基酸序列显示如下：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIKDWYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS V99K (SEQ ID NO:3)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDFYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aF (SEQ ID NO:4)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDVYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aV (SEQ ID NO:5)

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EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDAYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aA (SEQ ID NO:7)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDWVDYFKGFDYWGQGTLVTVSS Y100bV (SEQ ID NO:8)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDWADYFKGFDYWGQGTLVTVSS Y100bA (SEQ ID NO:9)

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基于本文所提供的信息，其他经测试的氨基酸序列还包括在本申请、例如图9 中，包括：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDHYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aH (SEQ ID NO:19)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDKYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aK (SEQ ID NO:20)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDRYDYFKGFDYWGQGTLVTVSS W100aR (SEQ ID NO:21)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYYNYIHWVRQAPGKGLEWVAEFSPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAAIVDWHDYFKGFDYWGQGTLVTVSS Y100bH (SEQ ID NO:22)

实例 1A 的总结

包含 SEQ ID NO:1 中所示的 VH 和 SEQ ID NO:2 中所示的 VL 结构域的抗GCGR Fab 的结构解析至 2.7Å 分辨率

对 VH 和 VL 结构域进行广泛突变分析，以探讨疏水性斑块对于自我相互作用的作用。申请人发现，影响粘度的关键残基的特征在于 SAP 值 ≥ 2 并且 SASA 比率 ≥0.5。

申请人发现，以带电荷或极性残基取代 SAP 值 ≥ 2 并且 SASA 比率 ≥ 0.5的残基，增加了所得变体的 DLS 相互作用参数。此类变体可能表现出经降低的粘度。

申请人还鉴定了 SEQ ID NO:1 中的既降低粘度又维持抗原结合亲和力的突变。

实例 1B：确定被发现相对于亲本抗 GCGR 抗体展现出经增加的相互作用参数(k_D) 的抗胰高血糖素受体 (GCGR) 抗体变体的粘度

在实例 1A 中所讨论的被发现相对于亲本抗 GCGR IgG1 抗体展现出经增加的相互作用参数 (k_D) 的抗 GCGR IgG1 抗体变体的粘度经由流变测定法（例如，如 Lang 等人(2020)Appl Sci, 10(1), 172 和 Zhang 等人(2017) Curr Opin in Chem Eng,16: 48-55；以及 Sharma等人(2011) Soft Matter 10.1039/c0sm01312a 中所述）在 < 180 mg/ml的浓度下进行分析。

本发明已就本发明人发现或提出的特定实施例进行描述，以包括用于本发明的实践的优选模式。本领域技术人员应理解，就本公开而言，可对所示例的特定实施例进行多种修改和改变，而不背离本发明的预期范围。例如，由于密码子冗余，可在不影响蛋白质序列的情况下对基础 DNA 序列进行改变。此外，出于生物功能等效性考虑，可在不影响生物作用种类或量的情况下对蛋白质结构做出改变。全部此类修改均旨在包括在随附权利要求的范围内。

Claims (39)

1.一种鉴定相对于亲本抗原结合多肽具有经降低的粘度的抗原结合多肽变体的方法，其包括：

(a)鉴定所述亲本抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个野生型氨基酸；

(b)以相较于所述野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸，取代经鉴定为具有所述高 SAP 值和/或所述高 SASA 比率的所述一个或多个野生型氨基酸；

(c)测量所述抗原结合多肽变体的粘度；以及

(d)鉴定相对于亲本多肽具有经降低的粘度的所述抗原结合多肽变体。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其中在所述亲本抗原结合多肽中的所述一个或多个野生型氨基酸是表面暴露的。

3.根据权利要求 1 或 2 所述的方法，其中所述一个或多个野生型氨基酸为芳香族氨基酸，并且其中所述一个或多个芳香族氨基酸经带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸取代。

4.根据权利要求 3 所述的方法，其中一个或多个芳香族氨基酸选自由以下项组成的组：W、Y 和 F。

5.根据权利要求 3 或 4 所述的方法，其中所述带电氨基酸或具有较小侧链的氨基酸选自由 A、I、L、V、D、E、H、K、R、N、Q、S 和 T 组成的组。

6.根据权利要求 1 至 5 中任一项所述的方法，其中所述一个或多个野生型氨基酸具有较小侧链，并且其中具有较小链的所述一个或多个氨基酸经带电氨基酸取代。

7.根据权利要求 6 所述的方法，其中具有较小侧链的所述一个或多个野生型氨基酸选自由以下项组成的组：A、I、L、V、N、Q、S、G、P、C、M 或 T。

8.根据权利要求 6 或 7 所述的方法，其中所述带电氨基酸选自由以下项组成的组：R、K、H、D 和 E。

9.根据权利要求 1 至 8 中任一项所述的方法，其中所述高 SAP 值为 2 或更大。

10.根据权利要求 9 所述的方法，其中所述高 SAP 值为 2.3 或更大。

11.根据权利要求 1 至 10 中任一项所述的方法，其中所述高 SASA 比率为 0.25 或更大。

12.根据权利要求 1 至 11 中任一项所述的方法，其中所述高 SASA 比率为 0.5 或更大。

13.根据权利要求 1 至 12 中任一项所述的方法，其中所述抗原结合多肽变体的所述粘度经由动态光散射 (DLS) 来评定。

14.根据权利要求 1 至 13 中任一项所述的方法，其中所述抗原结合多肽变体的所述粘度经由锥板流变测定来测量。

15.根据权利要求 14 所述的方法，其中所述抗原结合多肽变体的所述粘度是在高浓度下测量的。

16.根据权利要求 15 所述的方法，其中所述高浓度介于约 50 mg/ml 与 300 mg/ml之间。

17.根据权利要求 1 至 16 中任一项所述的方法，

其中所述亲本抗原结合多肽为抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体，

其中所述抗体或抗体构建体包含 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3中的一者或多者，并且

其中在一个或多个 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一个或多个野生型氨基酸经鉴定为具有高 SAP 值和/或高 SASA 比率。

18.根据权利要求 17 所述的方法，其中所述亲本抗原结合多肽为抗体。

19.根据权利要求 17 或 18 所述的方法，其中所述抗体为治疗性抗体。

20.根据权利要求 17 至 19 中任一项所述的方法，其中所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

21.根据权利要求 17 至 20 中任一项所述的方法，其中所述抗体为单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。

22.根据权利要求 17 至 21 中任一项所述的方法，其中所述抗体包含人 IgG Fc 区。

23.根据权利要求 22 所述的方法，其中人 IgG 恒定区为 IgG1、IgG2 或 IgG4 Fc区。

24.根据权利要求 17 所述的方法，其中所述亲本多肽为抗体的抗原结合片段。

25.根据权利要求 24 所述的方法，其中所述抗原结合片段为 Fab、F(ab')2、三特异性Fab₃、scFv、单价 IgG、双链抗体、三链抗体、scFv-Vc、微抗体、V_HH、V-NAR、hcIgG 或 IgNAR。

26.根据权利要求 17 所述的方法，其中所述亲本多肽为抗体构建体。

27.根据权利要求 26 所述的方法，其中所述抗体构建体为 CrossMab、双重作用 Fab(DAF)、DVD-IgG 或杵臼双特异性抗体。

28.根据权利要求 1 至 27 中任一项所述的方法，其进一步包括使所述抗原结合多肽变体经历至少一个亲和力成熟步骤的步骤。

29.根据权利要求 28 所述的方法，其中在所述抗原结合多肽变体中的经取代的氨基酸在亲和力成熟期间未经随机化。

30.一种多肽变体，其通过根据权利要求 1 至 29 中任一项所述的方法产生。

31.一种包括多个抗原结合多肽变体的文库，

其中至少一个变体包含相对于亲本抗原结合多肽的一个或多个氨基酸取代，

其中相对于所述亲本抗原结合多肽的所述一个或多个氨基酸取代将经鉴定为具有高SAP 值和高 SASA 比率的一个或多个野生型氨基酸替换为相较于所述野生型氨基酸具有较低 SAP 值和/或较低 SASA 比率的氨基酸。

32.根据权利要求 31 所述的文库，其中所述多个包括至少 1,000 个独特变体。

33.根据权利要求 31 或 32 所述的文库，其中所述多个抗原结合变体为多个抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体。

34.一种预测抗原结合多肽中的影响所述抗原结合多肽的粘度的一个或多个氨基酸的方法，所述方法包括：

鉴定在所述抗原结合多肽中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的一个或多个氨基酸，

其中具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和/或高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的所述一个或多个氨基酸经预测会影响所述抗原结合多肽的粘度。

35.一种预测抗体、抗体的抗原结合片段或抗体构建体中的影响所述抗体、所述抗原结合片段或所述抗体构建体的粘度的一个或多个氨基酸的方法，其中所述抗体、所述抗原结合片段或所述抗体构建体包含 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 中的一者或多者，所述方法包括：

鉴定在所述 CDR-H1、所述 CDR-H2、所述 CDR-H3、所述 CDR-L1、所述 CDR-L2 和所述CDR-L3 中的所述一者或多者中的具有高空间聚集倾向 (SAP) 值和高溶剂可及表面积(SASA) 比率的一个或多个氨基酸位置，

其中具有所述高空间聚集倾向 (SAP) 值和所述高溶剂可及表面积 (SASA) 比率的所述一个或多个氨基酸位置经预测会影响所述抗体、所述抗原结合片段或所述抗体构建体的粘度。

36.一种 SEQ ID NO: 3 至 17 或 19 至 22 中任一者中所示的抗体重链可变结构域(V_H)。

37.一种抗体，其包含 SEQ ID NO: 3 至 17 或 19 至 22 中任一者中所示的重链可变结构域 (V_H) 和 SEQ ID NO: 2 或 18 中所示的轻链可变结构域 (V_L)。

38.一种抗体，其包含 SEQ ID NO: 18 中所示的轻链可变结构域 (V_L)。

39.一种抗体，其包含 SEQ ID NO: 18 中所示的轻链可变结构域 (V_L) 和 SEQ ID NO:1、3 至 17 或 19 至 22 中任一者中所示的重链可变结构域 (V_H)。