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MX2009000044A - Etiqueta de acido nucleico detectable. - Google Patents

Etiqueta de acido nucleico detectable.

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MX2009000044A
MX2009000044A MX2009000044A MX2009000044A MX2009000044A MX 2009000044 A MX2009000044 A MX 2009000044A MX 2009000044 A MX2009000044 A MX 2009000044A MX 2009000044 A MX2009000044 A MX 2009000044A MX 2009000044 A MX2009000044 A MX 2009000044A
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MX
Mexico
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nucleic acid
protein
interest
fusion protein
oligomer
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Application number
MX2009000044A
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English (en)
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Pietro Ciceri
Jeremy Hunt
Mike Morrison
Daniel Treiber
Lisa M Wodicka
Jean-Michael A Lelias
Original Assignee
Ambit Bios Corp
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Publication date
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Abstract

En la presente se proveen etiquetas de ácidos nucleicos que se ligan a, o son capaces de ligarse a, una proteína de interés. En particular, las etiquetas de ácidos nucleicos son oligonucleótidos que comprenden una función de reportero y una función de etiquetas de proteínas. También en la presente se proveen composiciones de etiquetas de ácidos nucleicos, equipos y métodos para usarlas.

Description

ETIQUETA DE ÁCIDO NUCLEICO DETECTABLE CAMPO El tema principal provisto en la presente se refiere a etiquetas de ácidos nucleicos que se ligan a, o son capaces de ligarse a, una proteina de interés. En particular, el presente tema principal provisto en la presente se refiere a oligonucleótidos que comprenden una función de reportero y una función para etiquetar proteínas. También se proveen en la presente composiciones de etiquetas de ácidos nucleicos, equipos y métodos para el uso de las mismas.
ANTECEDENTES Las técnicas tradicionales para cuantificar y detectar la presencia de proteínas incluyen electroforesis de gel, técnica o análisis Western Blot, análisis inmunoabsorbente basado en ELISA y microanálisis de proteínas. Cada uno de estos métodos son complicados y poco sensibles al uso de alto paso. Estos métodos tradicionales también sufren de limitaciones en sensibilidad y especificidad de detección. En la presente se provee una etiqueta de ácidos nucleicos y un método nuevo, altamente sensible y selectivo de detección de proteínas usando las etiquetas de ácidos nucleicos.
SUMARIO En la presente se provee una etiqueta de ácidos nucleicos que se ligan a, o son capaces de, ligarse a una proteina, la cual permite que la proteina sea detectada con un alto grado de sensibilidad. En una modalidad, la etiqueta de ácidos nucleicos es un oligonucléotido que tiene una función de reportero y una función de etiquetar proteínas. En una modalidad, el oligonucléotido (oligómero) es un oligonucléotido, el cual comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia de amplificación de RCP (un amplicón) que puede reconocerse por una sonda de RCP y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, la cual forma ligaduras covalentemente, forma ligaduras no covalentemente, forma complejos o de alguna otra manera se une (v.gr., se une a o puede unirse a) una proteína de interés. En ciertas modalidades, el amplicón es una secuencia de amplificación de RCP generada aleatoriamente, no presente en la naturaleza. En una modalidad, la primera secuencia de ácidos nucleicos y/o segunda secuencia de ácidos nucleicos no es endógena a un organismo vivo. En otras modalidades, la primera secuencia de ácidos nucleicos y/o segunda secuencia de ácidos nucleicos es endógena a un organismo vivo. En ciertas modalidades, la primera secuencia de ácidos nucleicos y la segunda secuencia de ácidos nucleicos son heterólogas. Como se usa en la presente, si dos secuencias de ácidos nucleicos son "heterólogas" , se entiende que la primera y segunda secuencias de ácidos nucleicos normalmente no se encuentran juntas. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los primero y segundo ácidos nucleicos no codifican la misma proteina y/o no se derivan del mismo organismo. En algunas modalidades, la primera secuencia es una secuencia presente en la naturaleza y la segunda secuencia es una secuencia presente en la naturaleza, en donde las primera y segunda secuencias difieren. En modalidades especificas, la primera secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos, tal como una secuencia de ácidos nucleicos sintética y/o generada aleatoriamente, tal como una secuencia no presente en la naturaleza (v.gr., una que es divergente de cualquier secuencia presente en la naturaleza). En ciertas modalidades, la primera secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos, tal como una secuencia de ácidos nucleicos sintéticos y (o generados aleatoriamente, por ejemplo, que no se encuentra en la proteina de interés, proteina de fusión, motivo de interacción de ácidos nucleicos, y/o vectores usados en un análisis de tamizado provisto en la presente. En algunas modalidades, la primera secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos, tal como una secuencia de ácidos nucleicos sintética y/o generada aleatoriamente, es decir, no presente en el Conoma humano, de manera que cuando la etiqueta de ácidos nucleicos se va a utilizar en un análisis de cinasa provisto en la presente (o cualquier otra secuencia de nucleótidos usada en el análisis dado) . Esta modalidad asegura, por ejemplo, que los iniciadores usados para amplificación de RCP de subsecuencia no reacciona cruzadamente o se aplica mal a una segunda secuencia de ADN y/o a cualquier otra secuencia de ADN (v.gr., presente en la naturaleza), dicha dosis siendo usada en un análisis dado. En ciertas modalidades, cada patrón de RCP es diferente de los toros de manera que no hay ¿oportunidad de que los iniciadores reaccionen cruzadamente entre los patrones, tal como cuando se usan en los análisis múltiples provistos en la presente . En otra modalidad, el oligonucleótido comprenden una primera secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de amplificación de RCP y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia blanco para y se une a un motivo de interacción de ácidos nucleicos. En un ejemplo, la secuencia blanco es una secuencia de reconocimiento para la proteina de unión de ADN presente en la naturaleza o sintética. En modalidades especificas, la primera secuencia de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de amplificación de RCP es separada y diferente del segundo ácido nucleico que comprende el motivo de interacción de ácidos nucleicos. En dichas modalidades, la etiqueta de ácidos nucleicos puede unirse o de alguna manera ligarse a una proteina de interés que tiene un componente de unión de ADN que reconoce específicamente la etiqueta de ácidos nucleicos. La etiqueta de ácidos nucleicos entonces puede detectarse y/o cuantificarse usando, v.gr., RCP cuantitativo (RCPc) . La detección de etiqueta de ácidos nucleicos por RCPc tiene la ventaja de no solo ser un método de detección cuantitativa confiable sino también un método de detección altamente sensible y altamente selectivo. Debido a la naturaleza altamente sensible del método de detección de RCPc, este método permite la detección de cantidades muy pequeñas de la proteina blanco y reduce la necesidad de componentes de análisis escasos y costosos, tal como las proteínas recombinantes . Debido a la naturaleza altamente específica del método de detección de RCPc, RCPc también permite la detección de secuencias de ADN específicas en mezclas heterogéneas complejas y hace obvia la necesidad de cualquier clase de pasos de purificación normalmente realizados para muestras de proteínas para mejorar o incrementar la detección de proteínas. La etiqueta de ácidos nucleicos provista en la presente también puede marcarse, tal como mediante radiomarcado, marcado por fluorescencia o biotinilado. En ciertas modalidades, en la presente se provee un olígomero de ácidos nucleicos que se une a inmotivo que interactúa con ácidos nucleicos, en donde el oligómero de ácidos nucleicos comprende (a) una primera secuencia de ácidos nucleicos radiomarcada , marcada fluorescentemente o biotinilada, y (b) una segunda secuencia de ácidos nucleicos que une el motivo de interacción de ácidos nucleicos. En otras modalidades, en la prevete se provee un oligómero de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se une a un motivo de interacción de ácidos nucleicos, en dónde el oligómero se radiomarca, se marca fluorescentemente o biotinila. Las etiquetas marcadas, tal como etiquetas radiomarcadas o marcadas fluorescentemente, por ejemplo, se pueden usar para detectar la presencia o localmente de una proteína de interés en formación de imágenes celulares o en análisis de visualización . Las etiquetas marcadas, tales como etiquetas marcadas fluorescentemente, también, por ejemplo, se pueden usar en análisis de almacenamiento para separar una o más proteínas de interés en muestras individuales. Las etiquetas marcadas, tales como etiquetas biotiniladas , también permite, por ejemplo, la detección de la proteína de interés por métodos inmunológicos o la purificación de la proteína marcada de interés por cromatografía de afinidad. En ciertas modalidades cuando la etiqueta de ácidos nucleicos de marca, la etiqueta de ácidos nucleicos puede no o comprender una secuencia de amplificación de RCP.
También en la presente se provee una proteína de interés, la cual se liga o de alguna manera forma complejos con una etiqueta de ácidos nucleicos o capaz de ligarse o de alguna manera forman complejos con la etiqueta de ácidos nucleicos y que por lo tanto se puede detectar cuando, por ejemplo, su función, actividad o presencia se estudia o monitorea. En un ejemplo, la proteína de interés es una proteína quimérica fusionada con un motivo de interacción de ácidos nucleicos. En un ejemplo, el motivo de interacción de ácidos nucleicos es un dominio de unión de ADN. Dicha proteína de interés puede etiquetarse por un ácido nucleico que tiene una secuencia blanco que puede reconocerse por un dominio de unión de ADN. La proteína quimérica puede ser una secuencia de nucleótidos expresada generada por mutación aleatoria, una secuencia de nucleótidos expresada que contiene secuencias sintetizadas sistemáticamente, un ADNc expresado o una combinación de dos o más de esta posibilidades. La proteína de interés se puede clonar y luego expresarse en una célula huésped apropiada tal como una célula huésped bacteriana, de insectos, mamíferos o plantas. En cierta modalidades, la célula huésped da a la proteína el beneficio de cualquier modificación post-traslacional que puede ser importante para su estructura tridimensional y función (v.gr., glicosilación o prenilación de la protejan de interés en una célula huésped humana) .
También se provee en la presente un método para detectar la unión entre una proteina de interés y una segunda molécula, usando una etiqueta de ácidos nucleicos para marcar y detectar la proteina. En ciertas modalidades, el método comprende tamizar un banco de compuestos de prueba para su capacidad de unirse a una proteina de interés, en donde la unión se identifica por la detección de la etiqueta de ácidos nucleicos. En otras modalidades, el método comprende análisis de unión de competencia para tamizar y determinar la identidad de uno o más compuestos de prueba, que encuentran competitivamente una proteina de interés en presencia de un ligando de referencia inmovilizado (o "carnada") que se conoce que se une a la proteina de interés. Dicho análisis de unión competitivo permite la identificación de compuestos alternativos que se unen a la proteina de interés además de (o preferiblemente al) ligando de referencia conocido. También se provee en la presente un método para comprender tamizar un compuesto de prueba contra un panel de proteínas de interés para la capacidad del compuesto de prueba para unirse a una o más proteínas en el panel y/o para generar un perfil de especificidad de unión para dicho compuesto. Cuando se lleva a cabo el tamizado contra un panel de proteínas, en algunas modalidades, el tamizado se realiza en un formato multiplexado, tal como por pruebas simultáneas de la actividad de un compuesto de prueba contra una muestra combinada que contiene múltiples proteínas de interés y/o en el paso de detección usando múltiples etiquetas de ácidos nucleicos que son cada una únicas para una proteína específica de interés. También se provee en la presente un equipo que comprende uno o más de los siguientes elementos: una etiqueta de ácidos nucleicos detectable, una proteína capaz de ser "etiquetada" por la etiqueta de ácidos nucleicos, u ligando de referencia inmovilizado que se une a la proteína de interés, y un par de iniciador de RCP capaz de iniciar la amplificación de la etiqueta de ácidos nucleicos. Dicho equipo se puede usar para identificar moléculas que se unen al ligando de referencia inmovilizado y/o que compite con el ligando inmovilizado para unirse a la proteína de interés. Alternativamente, el equipo puede usarse como una herramienta de diagnóstico para detectar en un espécimen dado la presencia de una molécula que se une al ligando de referencia inmovilizado .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es un diagrama esquemático que describe un análisis de unión competitivo usando una etiqueta de ácidos nucleicos que contiene una secuencia de ADN amplificable de RCP.
La Fig. 2 provee una curva de unión con Kds calculados para interacción de p38 con inhibidores de cinasa conocidos BIRB-796, SB202190 y VX-745. SB202190 se utilizó como ligando de referencia inmovilizado y la etiqueta de ácidos nucleicos fue una fusión que comprende una secuencia de ADN blanco GAL4 y una secuencia de ADN amplificable de RCP. La Fig. 3 provee una curva de unión con Kds calculados para interacción de p38 con inhibidores de cinasa conocidos BIRB-796, SB202190 y VX-745. Se utilizó SB202190 como carnada inmovilizada y la etiqueta de ácidos nucleicos usada fue una fusión que comprende una secuencia de ADN blanco de NF-?? y una secuela de ADN amplificable de RCP. La Fig. 4 provee una curva de unión con Kds calculadas para interacción de BRAF con cuatro compuestos propietarios internos. Tres de los compuestos A, B y C son inhibidores de cinasa y uno de los compuestos que no es un inhibidor de cinasa, sirvió como control negativo. La interacción se detectó usando una etiqueta de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ADN blanco de GAL4 y una secuencia de ADN amplificable de RCP. La Fig. 5 provee una curva de unión con Kds calculados para interacción de BRAF con cuatro compuestos de propiedad interna. Tres de los compuestos, A, B y C son inhibidores de cinasa y uno de los compuestos que no es un inhibidor de cinasa, servidos como control negativo. La interacción se detectó usando una etiqueta de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ADN blanco de NF-KB y una secuencia de ADN amplificable de RCP. Las Figs . 6A-6B muestran curvas de unión con Kds calculados para interacciones entre las dos formas de Abl (activo e inactivo) con (A) VX-680 o imatinib (B) . La interacción se detectó usando una etiqueta de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ADN blanco de NF-KB y una secuencia de ADN amplificable por RCP.
DESCRIPCION DETALLADA Las siguientes modalidades provistas en la presente son ilustrativas y no son limitaciones. Los métodos descritos en la presente tienen un rango de aplicaciones, todos los cuales se basan en la capacidad de detectar, cuantificar, o aislar una proteina de interés que se etiqueta por un ácido nucleico detectable. Las composiciones y métodos provistos en la presente se pueden usar para marcar proteínas in Vitro y/o in vivo. En algunas modalidades, se provee en la presente un oligómero de ácidos nucleicos (etiqueta) que se una a un motivo de interacción de ácidos nucleicos, en donde el oligómero de ácidos nucleicos comprende (a) una primera secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia de amplificación de RCP, y (b) una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se une al motivo de interacción de ácidos nucleicos, en donde la primera secuencia de ácidos nucleicos es heterologa a la segunda secuencia de ácidos nucleicos. En una modalidad, la longitud del oligómero de ácidos nucleicos es entre aproximadamente 50 y alrededor de 100, de aproximadamente 50 y alrededor de 200, aproximadamente 50 y alrededor de 300, aproximadamente 50 y alrededor de 400, aproximadamente 50 y alrededor de 500, de aproximadamente 100 y alrededor de 200, aproximadamente 100 y alrededor de 300, aproximadamente 100 y alrededor de 400, aproximadamente 100 alrededor de 500, aproximadamente 200 y alrededor de 300, aproximadamente 200 y alrededor de 400, aproximadamente 200 alrededor de 500, aproximadamente 300 y alrededor de 400, aproximadamente 300 alrededor de 500, o aproximadamente 400 y alrededor de 500 nucleótidos de longitud. Como se usa en la presente, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de 20%, preferiblemente dentro de 10%, y más preferiblemente dentro de 5% (o 1% o menos) de un valor o rango dado. En algunas modalidades, la etiqueta de ácidos nucleicos tiene una función de reportero y una función de etiqueta de proteínas. Como se usa en la presente, una función de "reportero" con referencia a una etiqueta de ácidos nucleicos es la capacidad de visualizar o de alguna manera detectar o cuantificar. En ciertas modalidades, la función de reportero de una etiqueta de ácidos nucleicos proviene del radiomarcado, marcado fluorescente o biotinilación de la etiqueta de ácidos nucleicos. Como se usa en la presente, una "etiqueta de ácidos nucleicos" es un polinucleótido, v.gr., un oligómero, que se une o es capaz de unirse a una proteina de interés, tal como una fusión de proteina (v.gr., una cinasa) que comprende un dominio de unión de polinucleótidos heterólogos (también llamadao un motivo de interacción de polinucleótidos en la presente) , tal como un dominio de unión de ADN (v.gr., NFKB) . La etiqueta de ácidos nucleicos puede ser un ADN de una sola hebra o dolé hebra, ARN de una sola hebra o doble hebra, híbrido de ADN-ARN, híbrido de aRN-ARN, o sus derivados nativos o sintéticos, análogos y fragmentos de los mismos. En algunas modalidades, la etiqueta de ácidos nucleicos es ADN y la etiqueta de función de reportero puede introducirse al ADN, por ejemplo, por cualquier reacción enzimática normal, tal como traslación de muestras, o marcación terminal, con 32P, 125I o trifosfatos de desoxiribonucleótidos marcados con biotina (DNTPs) , o la etiqueta puede introducirse como un agente de intercalación. Hay muchos grupos fluorescentes que están comercialmente disponibles y se pueden usar para marcar la etiqueta de ácidos nucleicos. Algunos ejemplos de etiquetas fluorescentes se pueden usar para marcar la etiqueta de ácidos nucleicos son isotiocianato de fluoresceina, rodamina y cumarina y sus derivados comerciales tales como Texas Red® y Alexa Fluor®. En ciertas modalidades, la etiqueta de ácidos nucleicos se forma en complejos con, se liga covalentemente con o se liga no covalentemente con una proteina o polipéptido detectable, por ejemplo, por una ligadura covalente. Las fusiones de proteínas de ácidos nucleicos pueden producirse por cualquier método, por ejemplo, por el método de Roberts y Szostak (Patentes de E.U.A. Nos. 6,258,558 y 6,261,804; O 98/31700; Roberts & Szostak (1997) Proc. Nat. Acad. Sci . EUA (1997) 94:12297-12302) usando un aceptor de péptidos, tal como puromicina, como un agente de unión covalente. En resumen, dicho método ilustrativo comprende un protocolo de transcripción/traslación in vito o in situ que genera proteínas ligadas covalentemente al extremo 3' de su propio ARNm, es decir, una fusión de proteínas de ARN . Esto se logra por la síntesis y traslación in vito o in situ de una molécula de ARNm con un aceptor de péptidos unida a su extremo 3'. En las modalidades específicas, el aceptor de péptidos es puromicina, un análogo de nucleósido que agrega la terminación C de la cadena de péptidos creciente y termina la traslación. En una modalidad, una secuencia de ADN se incluye entre el extremo del mensaje y el aceptor de péptidos que se dispersa para ocasionar que el ribosoma se detenga en el extremo del marco de lectura abierto, proporcionando tiempo adicional para el aceptor de péptidos (por ejemplo, uromicina) para aceptor que la cadena de péptidos naciente antes de la hidrólisis de peptidilo-ARNt . Como se usa en la presente, un "aceptor de péptidos" es cualquier molécula capaz de agrearse a la terminación C de la cadena de proteínas creciente por la actividad catalítica de la función de peptidil transferasa ribosomal. En ciertas modalidades, dichas moléculas contienen (I) un nucleótido o porción similar a nucleótidos (v.gr., adenosina o un análogo de adenosina (di-metilación en la posición amino N-6 es aceptable)), (ii) una porción de aminoácidos o similar a aminoácidos (por ejemplo, cualquiera de los 20 aminoácidos D o L o cualquier análogo de aminoácidos de los mismos (por ejemplo, 0-metil tirosina o cualquiera de los análogos descritos por Ellman y otros, (1991) Meth. Enzymol. 202:301), y (iii) una ligadura entre los dos (v.gr., un ester, amida, o ligadura de cetona en la posición 3' ó 2'); preferiblemente, esta ligadura no perturba significativamente el fruncido del anillo de la conformación de ribonucleótidos natural. Los aceptores de péptidos también pueden tener un nucleofilo, el cual sin limitación, puede ser un grupo amino, un grupo hidroxilo, o un guro sulfohidrilo . Además, los aceptores de péptidos pueden estar compuestos de imitaciones de nucleótidos, imitaciones de aminoácidos, o imitaciones de la estructura de nucleótidos-aminoácidos combinada. Por un aceptor de péptidos que se colocan en el "extremo 3'" de una secuencia de codificación de proteínas se entiende que la molécula aceptora de péptidos se coloca después del codón final de la secuencia de codificación de proteínas. Este término incluye, sin limitación, una molécula aceptora de péptidos que se coloca precisamente en el extremo 3' de la secuencia de codificación de proteínas así como una que se separa del codón final interviniendo la secuencia de codificación y sin codificación (por ejemplo, una secuencia que corresponde a un sitio de pausa) . Este término también incluye construcciones en las cuales las secuencias de codificación o sin codificación siguen (es decir son 3') a la molécula aceptora de péptidos. Además, este término abarca, sin limitación, una molécula aceptora de péptidos que se une covalentemente (ya sea directa o indirectamente a través de la secuencia de ácidos nucleicos de intervención) a la secuencia de codificación de proteínas, así como a una que se una a la secuencia de codificación de proteínas por algunos medios no covalentes, por ejemplo, a través de la hibridización usando una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se une en o cerca del extremo 3' de la secuencia de codificación de proteínas y que se une por sí misma a una molécula aceptora de péptidos. Además de las fusiones de ARN-proteína unidas covalentemente, cualquier otro ácido nucleico amplificable por RCP, único (por ejemplo, ARN, ADN, PNA, o cualquier otro ácido nucleico que incluye dos o más ribonucleótidos o desoxirribonucleotidos unidos covalentemente, presentes en la naturaleza o modificados) pueden acoplarse covalentemente o no covalentemente a una proteína o polipéptido detectable. Las porciones de proteínas de las fusiones normalmente se componen de residuos de aminoácidos presentes en la naturaleza, por también pueden incluir análogos o derivados de aminoácidos, unidos por las uniones de péptido o peptoide. En otras modalidades, la función de reportero de una etiqueta de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos que puede amplificarse por RCP (también denominada en la presente como un "amplicón"). La secuencia amplificable se hibridiza o puede hibridizarse a un iniciador de RCP en una forma específica para secuencias. En ciertas modalidades, la etiqueta de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de amplicones, por ejemplo, dos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más amplicones. En algunas modalidades, la pluralidad de amplicones son repeticiones aleatorias de un solo amplicón. En ciertas modalidades, el amplicón es amplificable por RCP cuantitativo que permite la cuantificación de la proteina etiquetada por dicho espacio de ácidos nucleicos. En un método de amplificación especifico, la amplificación de la secuencia de RCP incluye la combinación del ácido nucleico que contiene el patrón de amplificación de RCP, iniciador de RCP y sonda de RCPc en una mezcla de reacción de RCP normal (generalmente, una mezcla que tiene una concentración final de 10 mM Tris-HCl (pH 8.3 a 25°C), 1-4 mM MgCl2, 0.1-1 mM dNTP) , y tratar primero la muestra bajo condiciones de inicio en Caliente (por ejemplo, calentando a 95°C durante 5 minutos) para reducir al mínimo el recocido o imprimación alterada no específicos, seguido por un paso de desnaturalización (por ejemplo, 95°C durante 45 segundos), seguido por un paso de recocido (55°C durante 1 minuto), y seguido por un paso de extensión (72°C durante 1 minuto) , con hasta cuarenta ciclos de los pasos consecutivos de desnaturalización, recocido y extensión, para completar la amplificación de la señal de RCPc. Como se usa en la presente, una función de "etiquetado de proteínas" con referencia a una etiqueta de ácidos nucleicos es la capacidad de etiquetar y unir, formar complejos o de alguna manera unirse (v.gr., covalente o no covalentemente) a un motivo de interacción de ácidos nucleicos, tal como una proteína de fusión que comprende (a) una proteína de interés (v.gr., una cinasa) y (b) un motivo de interacción de polinucleótidos heterólogos, tal como una proteína de unión de ADN (v.gr., NFKB) , que comprende una secuencia de reconocimiento de ácidos nucleicos. El motivo de interacción de ácidos nucleicos de la proteína de fusión se une a un oligómero de ácidos nucleicos descrito en alguna parte en la presente. En una modalidad, la secuencia de ADN blanco es un sitio de factor de transcripción que puede reconocerse por el dominio de unión de ADN de un factor de transcripción. Por ejemplo, la etiqueta de ácidos nucleicos puede contener secuencias de ADN blanco reconocidas por dominio de unión de ADN de los factores de transcripción tales como NF-KB, represor de ero, represor de lac, GAL4, GCN4, Lex-A, Opaque-2 y TGAla. En una modalidad, el sitio de unión de factor de transcripción es una secuencia presente en la naturaleza o tipo silvestre. En otra modalidad, el sitio de unión del factor de transcripción es una secuencia consensual que abarca secuencias tipo silvestre y opcionalmente , secuencias mutantes. En aún otra modalidad, el sitio de unión de factor de transcripción es una secuencia sintética o tratada genéticamente capaz de formar un complejo con una proteína de unión de ADN modificado o sintético, presente en la naturaleza. En aún otra modalidad, la secuencia de ADN blanco se caracteriza por tener secuencias palindromicas reconocidas usualmente por dimeros de proteínas. La secuencia blanco para Gal4 o LexA son dos ejemplos. En aún otra modalidad, el sitio de unión del factor de transcripción se caracteriza por tener runa región rica en GC tal como el sitio blanco para el factor de transcripción SP1. En otra modalidad, el sitio de unión del factor de transcripción se caracteriza por tener una vida media compleja de proteina de ADN de más de una, dos, tres, cuatro, cinco o seis horas con su proteina de unión de ADN asociada. Una proteina de fusión provista en la presente que comprende una proteina de interés y un motivo de interacción de ácidos nucleicos, tal como una proteina de unión de ADN, por lo tanto, puede "etiquetarse" por el oligómero de ácidos nucleicos proviso en la presente, a través de, por ejemplo, una formación de complejo de proteina de ADN. En ciertas modalidades, la proteina de fusión que comprende un motivo de interacción de ácidos nucleicos y una proteina de interés se deriva del mismo organismo, tal como un ser humano. En una modalidad particular, la etiqueta de ácidos nucleicos comprenden un amplicón ligado a una secuencia de ADN blanco específicamente reconocible por una proteína de unión de ADN (v.gr., NFKB, represor ero, GAL4, GCN4, LexA, Opaque-2 y TGAla) . En otra modalidad, la etiqueta de ácidos nucleicos comprende un amplicón ligado a una secuencia de ADN similar para el domino de unión de ADN del factor de transcripción. Las secuencias de ADN similares para dichos dominios de unión de ADN se conocen en a materia, y las secuencias ilustrativas se proveen en la Tabla 1. En otras modalidades, una función de etiquetado de proteínas de una etiqueta de ácidos nucleicos es una secuencia de ARNi blanco reconocida por la enzima de metabilización de ADN tal como metiltransferasa , alquiltransferasa y/o glicosidasa. Estas enzimas pueden interactuar con bases de ADN modificadas químicamente y crear un enlace covalente entre un aminoácido de la proteína y la secuencia de ADN de la etiqueta de ácidos nucleicos. Por ejemplo, si la fusión de proteínas contuvo un fragmento funcional de 06-alquilguanina-ADN alquiltransferasa (AGT) , la función de alquiltransferasa puede usarse para transferir la etiqueta de ácidos nucleicos unida ya sea a un 06-alquilguanina o un 06-bencilguanína a la proteína de fusión de AGT para crear una ligadura covalente entre la etiqueta de ácidos nucleicos y la proteína de fusión para formar un complejo de ácidos nucleicos-proteína (Véase, v.gr. Solicitud de PCT No. O 02/083937) . El OGT puede usarse para marcar, y opcionalmente manipular y/o detectar subsiguientemente una proteína de interés en un sistema en el cual se pone contacto una fusión de la proteína y AGT con un sust marcado de manera que el AGT transfiere la etiqueta sustrato a la fusión de AGT, permitiendo así que la fusión AGT-proteína marcada sea manipulada y/o detectada en virtud de la etiqueta transferida. La parte de la etiqueta del sustrato puede elegirse por los expertos en la materia dependiendo de la aplicación para la cual se pretende la proteina de fusión. Los ejemplos no inclusivos de las etiquetas incluyen: (1) una sonda espectroscópica tal como un fluoroforo, un cromóforo, una sonda magnética o un reactivo de contraste; (2) una molécula marcada radiactivamente; (3) una molécula que es una parte de un par de unión especifico el cual puede unirse específicamente a un coadjuntor. Dichos pares de unión específicos son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, biotina, que puede unirse a avidita o estreptavidina; (4) una molécula que se sospecha que interactúa con otras biomoléculas ; (5) un banco de moléculas que se sospecha que inactúan con otras Biomoléculas; (6) una molécula que puede entrelazarse a otras Biomoléculas como se conoce por los expertos en la materia (véase, v.br., Nadeau y otros (2002) en Protein-Protein Interactions : a molecular cloning manual; Ed. E Golemix, Cold Spring Harbor Laboratory Press; págs. 75-92); (7) Una molécula que puede generar radicales hidroxilo por exposición a H2C>2 y ascorbato tal como un metal-quelato atado (véase, v.gr., Hori y otros (2002) en Protein-Protein interactions: a molecular cloning manual; Ed. E Golemis, Cold Spring Harbor Laboratory press; págs. 288-311) (8) una molécula que puede generar radicales reactivos por irradiación con luz tal como verde de malaquita (véase, v.gr, Jay y otros 81999) Biochim. Biophys. Acta M39-48); (9) una molécula unida covalentemente a un soporte sólido, en donde el soporte puede ser un portaobjetos de vidrio, una placa de microtitulación o cualquier polímero conocido en general por los expertos en la materia; (10) un ácido nucleico o un derivado del mismo capaz de someterse a el emparejamiento de bases con su hebra complementaria; (11) un lípido u otra molécula hidrofóbica con propiedades de inserción de membrana; (12) una biomolécula con propiedades enzimáticas, químicas o físicas deseables; o (13) una molécula que tiene una combinación de cualquiera de las propiedades listadas antes. Como se usa en la presente, una "proteína de interés" puede ser cualquier polipéptido concebible o proteína que pueda ser de interés, tal como para el estudio o caracterización de alguna manera. En algunas modalidades, la proteína de interés es una transferasa, oxidorreductasa, hidrolasa, ligasa, isomerasa o liasa. En una modalidad, la proteína de interés es un polipéptido o proteína humana. En ciertas modalidades, la proteína de interés es una transferasa que tiene actividades de transferasa, tal como una aciltransferasa, glicosiltransferasa, amidotransferasa o azufretransferasa . En otra modalidad, la proteína de interés es una hidrolasa, peptidasa, proteasa o fosfatasa.
En ciertas modalidades, la cinasa es una cinasa de lipidos, tal como una cinasa de lipidos de la familia P13K (v.gr., mTOR) . En las modalidades especificas, la proteina de interés es una proteina cinasa (véase, v.gr. Manning (2002) Science 298:1912). En modalidades especificas la proteina de interés es una tirosina cinasa, o una serina/treonina cinasa. En algunas modalidades, la proteina de interés es una tirosina cinasa no receptora para seres humanos, por ejemplo, una tirosina cinasa no receptora que es un miembro de familias ABL, ACK, CSK, MATK, FAK, PYK2, FES, FRK, JAK, SCC-A, SCR-B, TEC y/o SYK. En otras modalidades, la proteina de interés es un receptor de tirosina cinasa humana, por ejemplo, una tirosina cinasa receptora que es miembro de familias ALK, AXL, DDR, EGER, EPH, FGFR, INSR, MET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR, ROS, RYK, TIE, TFK, VEGFR, AATYK, y/o SuRTKIO 6. En algunas modalidades, una proteína de interés es una proteína de transmembranas, tal como una proteína de hélice de transmembrana 7, tal como un receptor acoplado con proteína G (GPCR) . Una proteína de interés también puede ser una proteína de canal de iones de transmembrana, y en ciertas modalidades, una proteína de canal de iones de compuerta de ligandos. En otras modalidades, una proteína de interés es una proteína de receptor de hormonas nuclear, tal como un receptor de hormonas de esferoides clásica y/o un receptor en la clase huérfana de receptores de hormonas nuclear. En aún otras modalidades, una proteína de interés es una molécula o factor de señalamiento extracelular , tal como una citoquinas (v.gr., un inferieron y/o una interleucina) , factor de crecimiento y/o hormona (v.gr., insulina, glucagon o prostaglandinas ) . En ciertas modalidades, una proteína de interés es una proteína implicada en cascadas de señal intracelular , tal como una enzima o cofactor implicado en señalamiento de fosfatidinil-inositol, cA P, o generación de cGMP. En algunas modalidades, una proteína de interés es un anticuerpo, fragmento variable de cadena pequeña (UscFv) , antígeno o epitope. La proteína de interés, en algunas modalidades, puede ser la expresión de una secuencia de nucleótidos generada por mutación aleatoria, la expresión de una secuencia de nucleótidos conteniendo secuencias sintetizadas sistemáticamente, o puede ser un ADNc expresado. En un ejemplo la proteína de interés siendo estudiada o caracterizada se deriva de un banco de ADNc humano (es decir, una proteína humana) . En ciertas modalidades, la proteína de interés es una fusión quimérica entre una proteína de interés y una proteína de unión de ARNi heteróloga. En dichas fusiones quiméricas, por lo menos dos secuencias de genes que representan cada mitad de la quimera se pueden fusionar en el marco, clonarse en el vector apropiado y expresarse en una célula huésped de selección. En ciertas modalidades, la proteína de interés es 5' del dominio de unión de nucleótidos (v.gr., proteína de unión de ADN) . En otras modalidades, la proteína de interés es 3' del dominio de unión de nucleótidos (v.gr., proteína de unión de ADN) . En modalidades específicas, la proteína de interés y/o el dominio de unión de nucleótidos (v.gr, proteína de unión de ADN), retiene la actividad respectiva de la proteína de tipo silvestre. La proteína de interés, incluyendo fusiones quiméricas, pueden expresarse en cualquiera de una variedad de células huéspedes, incluyendo células huéspedes de bacterias, insectos, mamíferos o plantas. Cuando la proteína de interés se expresa en la célula huésped eucariótica apropiada, puede exhibir modificación eucariótica post-traslacional que esta presente en proteína nativa y por lo tanto se espera que tenga la estructura y función de una proteína nativa. Alternativamente, la proteína de interés de alguna manera puede ligarse sintéticamente (v.gr., usando un entrelazador de polipéptidos ) al dominio de unión de nucleótidos. También se provee en la presente un banco de proteínas de fusión, que comprenden una pluralidad de proteínas de fusión provistas en la presente, en donde por lo menos dos o más de las proteínas de fusión difieren unas de otras. En ciertas modalidades, en la presente se provee un bando de oligómeros, comprendiendo una pluralidad de oligómeros provistos en la presente, en donde por lo menos dos o más de los oligómeros difieren entre ellos. También en la presente se provee un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión provista en la presente. Adicionalmente, en la presente se provee una célula huésped que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión provista en la presente. En ciertas modalidades, la célula huésped es una célula huésped de bacteria, insecto, mamífero o planta. En ciertas modalidades, en la presente también se provee un análisis funcional que estudia la actividad de la proteína de interés. En algunas modalidades, la actividad de una proteína de interés se evalúa usando una etiqueta de ácidos nucleicos, tal como detectando la presencia de la etiqueta de ácidos nucleicos. Dicho análisis funcional puede usarse para estudiar los efectos de los compuestos de prueba como inhibidores, agonistas, antagonistas o más generalmente, como moduladores, de actividad de proteína. La proteína de interés puede ser parte de una quimera comprendida de (a) un motivo de interacción de ácidos nucleicos y (b) la proteína que es estudiada o caracterizada (la porción de la proteína que es la "proteína de interés-2 real) . En una modalidad de la invención, el motivo de reconocimiento de ácidos nucleicos puede ser una proteina de unión de ADN. Los motivos ilustrativos se muestran en la Tabla 1. La proteina de unión de ADN puede incluir el dominio de unión ADN de factores de transcripción, incluyendo activadores y represores transcripcionales . Ejemplos de dominios de unión de ADN adecuados incluyen NF-KB (eucarióticos ) , represores de ero (bacteriófago ?) , represor de lac (levadura), GAL4 (levadura), GCN4 (levadura), Lex-A (E. coli) , Opaque-2 (maíz) y TGAla (tabaco). La adecuabilidad del dominio de unión de ADN también puede depender de los tiempos de asociación de un dominio de unión de ADN particular que también puede depender de los tiempos de asociación de un dominio de unión de ADN particular a su secuencia blanco. Por ejemplo, NF-?? se considera que forma una fuerte asociación con su secuencia de ADN blanco, con una vida media de disociación de más de 4 horas. (Véase Speight y otros (2001) Chem. Bil. 8:851-965). Los dominios de unión de ADN adecuados también incluyen dominios de unión de ADN sintéticos construidos combinando diferentes piezas de motivos de unión de ADN presentes en la naturaleza y/o tratados con ADN, tal como dedos de zinc sintéticos, cremalleras de leucina, hélices con alas, hélice-bucle-hélice, homeodominio y dominio de POU . La proteina quimérica puede ser "etiquetada" mediante le reconocimiento del domino de unión de ADN a cierta secuencia de reconocimiento de unión de la etiqueta de ácidos nucleicos. En otra modalidad de la invención, el motivo de reconocimiento de ácidos nucleicos puede ser de longitud completa, longitud parcial o un fragmento funcional de una enzima de metabolización de ADN ya mencionada antes, tal como ADN ligasas, enzimas de reparación de ADN, enzimas de restricción o metiltransferasas de ADN. Tabla 1: Etiqueta de Acidos Nucleicos Ilustrativos, Dominio de Unión y Secuencias de Motivo de Reconocimiento de Dominio de Unión Etiquetas de ácidos TTGTGAATTGCTGACCGTAGATGTCAACTTTGACCATCAGACAACGTT nucleicos para unión de NF- TCTCCATTCCAATATGCGAGAATCCTAGGGAATTCCCCTAGATCGCA KB TG (SEC 10 NO:l); la secuencia de amplicón es la secuencia que precede la región no subrayada, la secuencia de reconocimiento de NFKB es la región subrayada. CGGCGTAAAAACGAATACCATGTCTCTCATCGCTCGACTCATTCTTTC CAAAATTTCGCGGAACCAGGGGGAATTCCCCTAGATCGCATG (SEC ID NO: 2); la secuencia e amplicón es la secuencia que precede la región subrayada, la secuencia de reconocimiento de NFKB es la región subrayada AAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATt-AGTACAATGTGCT AAGGATCACCAGCAATATTCCAAAGGGAATTCCCCTAGATGGCATG (SEC ID NO: 3) ; la secuencia de amplicón es la secuencia que precede la región subrayada, la secuencia de reconocimiento de NFKB es la región subrayada Etiqueta de ácidos nucleicos C¾TGCGAC-AGCG¾GTTACGTCCAGAAGGACAACATCTTTGACATCG para unión de GAL4 CCTCTTGAATTGCTG<¾CCAAGGGCTACTGCCGGAGTACTGTCCTCC GCTAGATCGCATG (SEC ID NO: 4); la secuencia de amplicón es la secuencia que precede la región subrayada, la secuencia de reconocimiento de GAL4 es la región subrayada. Domino de unión de ADN de ^GPYLQIL£QPKQRGFRFRWCEGPSHGGLPGASSEMaSYPQVKI NF-KB OSlWGPAKVIVQLVTNGKNIHIiiMSLVGKHCEDGICTVTAGPKDWG FANLSILHVTKKKVFETILEAR^ RQLGDREKELlRQAAIQDTKFJDLSWRIi^ VSDMYDS APNASNLKIVRiDRTAGCVrGGEEIYLIj^ EEEENGGVWEGFGDFSPTOVHRQFAIVE TPKYKDINITKPASVFVQLRR KSDLETSEPKPFLYYPEIKDKEEVD (SEC 10 NO:5) Dominio de unión de ADN de ^fLI£SIEQACDICRLKKLKCSKEKPK^ GAL4 RAHLTEVESRLERLEQLFLLlFPREDI ^ILKMOSLQOIKALLTGLFVQDN VNKCAWDRIASWTC^LTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVS (SEC 10 NO: 6) Secuencia de Reconocimiento GGGAATTCCC (SEC 10 NO: 7) de NF-KB Secuencia de reconocimiento GGGAAATTCCC (SEC 10 NO: 8) de NF-KB Secuencia de reconocimiento GGGACTTTCC (SEC 10 NO: 9) de NF-KB Secuencia consensual de NF- GGGRNNYVCC (SEC ID NO: 10) (R=purina; V-pirimidina) (N = KB cualquier aminoácido) Secuencia de reconocimiento CGGAGTACTGTCCTCCG (SEC 10 NO: 11) de NF-KB Secuencia consensual de NF- CGGNNNNNNNNNNNCCG (SEC ID NO: 12) (N - cualquier B aminoácido) Secuencia consensual de HGGARNYYCC (SEC ID NO: 13) (H=A, C o T; R- RelA</c-Rel purina; Y=pirimidina ) Secuencia de reconocimiento TCTATCACCGCGGGTGATAAA (SEC ID NO: 14) de represor de Cro Secuencia de reconocimiento GAATTGTGAGCGCTCACAATT (SEC ID NO: 15) de represor de Lac Secuencia de reconocimiento AGTGACTCAT (SEC ID NO: 16) de GCN4 Secuencia de reconocimiento TGTCATTCCACGTAGATGAAAA (SEC ID NO: 17) de Cpaque-2 Secuencia de reconocimiento TCCACGTAGA (SEQ ID NO: 18) de Cpaque-2 Secuencia de reconocimiento CTGTATATATATACAG (SEC ID NO: 19) de Lex-A Secuencia de reconocimiento GACGTC (SEC ID NO: 20) de TGA-la Secuencia de reconocimiento GCGTGGGCGT (SEC ID NO: 21) de EGR-1 o Zif 268 Los métodos in vitro provistos en la presente incluyen el uso de una etiqueta de ácidos nucleicos para visualizar una o mas proteínas para le estudio de localización subcelular de las proteínas marcadas, para el estudio de organelos marcados, para monitorear el movimiento de proteínas marcadas incluyendo traslocación, internalización o secreción de proteínas, y/o para le monitoreo de perfiles de expresión espacial y temporal de proteínas marcadas. Otros métodos provistos en la presente comprenden el uso de una etiqueta de ácidos nucleicos para detectar, cuantificar y/o clasificar proteína marcada usando citometría de flujo. En dicha aplicación, la etiqueta de ácidos nucleicos puede, en ciertas modalidades, ser marcada fluorescentemente para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). En aún otros métodos provistos en la presente, una etiqueta de ácidos nucleicos es biotinilada, lo cual permite la detección de la proteina de interés por métodos inmunológicos . Alternativamente, la purificación de la proteina marcada de interés puede ser logrado por cromatografía de afinidad. En otros métodos provistos en la presente, una etiqueta de ácidos nucleicos se inmoviliza en una disposición. Dicha disposición puede usarse en ciertas modalidades para crear una disposición de proteínas dirigible, tal como para un análisis de perfil de expresión de proteínas. En una modalidad, en la presente se provee un método para identificar una proteína de interés que se une a un ligando, comprendiendo (i) poner en contacto al ligando con una proteína de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteína de interés, y (b) un segundo dominio que comprende un motivo de interacción con ácidos nucleicos, en donde la proteína de interés y el motivo de interacción con ácidos nucleicos difiere una de la otra (v.gr., proteínas diferentes del mismo organismo o diferentes proteínas de diferentes organismos); (ii) agregar un oligómero de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se unen al motivo de interacción de ácidos nucleicos de la proteína de fusión; (iii) remover el oligómero de ácidos nucleicos no unidos y/o proteína de fusión no unida; y (iv) detectar si el oligómero de ácidos nucleicos se une a la proteína de fusión; por lo que la detección de oligómeros de ácidos nucleicos indica que la proteína de interés se une al ligando. Los métodos y análisis provistos en la presente pueden practicarse en cualquier orden. Por ejemplo, en ciertas modalidades la etiqueta de ácidos nucleicos se pone en contacto con la proteína de fusión antes, durante (v.gr., simultáneamente) , o después del contacto de la proteína de fusión con el ligando de referencia. En ciertas modalidades de los métodos provistos en la presente, el oligómero de ácidos nucleicos se pon ene contacto con el motivo de interacción con ácidos nucleicos bajo condiciones en las cuales el motivo de interacción con ácidos nucleicos se une al oligómero. En otra modalidad, en la presente se provee un método para identificar un compuesto de prueba que se une a una proteína de interés, comprendiendo (i) en presencia y ausencia del compuesto de prueba, el contacto con un ligando de referencia inmovilizado, el cual se une a la proteína de interés, con una proteina de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteina de interés, y (b) un segundo dominio que comprenden un motivo de interacción conocidos nucleicos, en donde la proteina de interés y el motivo de interacción con ácidos nucleicos difieren uno del otro; (ii) agregar un oligómero de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que se une al motivo de interacción de ácidos nucleicos de la proteina de fusión; (iii) remover el oligómero de ácidos nucleicos no unidos y/o la proteina de fusión no unida; y (iv) detectar si el oligómero de ácidos nucleicos se une a la proteina de fusión; en donde una reducción en la cantidad de proteina de fusión unida al ligando de referencia inmovilizada en presencia del compuesto de prueba comparado con la ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba se une a la proteina de interés. En algunas modalidades, en la presente se provee un método para identificar un compuesto de prueba que se une a una proteina de interés, el método comprendiendo: (i) pone r en contacto una proteina de fusión a un oligómero bajo condiciones en donde la proteina de fusión se une a dicho oligómero detectable, en donde la proteina de fusión que comprende dicha proteina de interés se fusiona a un motivo de interacción de ácidos nucleicos, y en donde el oligómero detectable comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se une al motivo de interacción de ácidos nucleicos, (ii) poner en contacto la mezcla en el paso (i), con un ligando de referencia inmovilizado capaz de unirse a la proteina de interés, en presencia y ausencia del compuesto de prueba, (iii) remover el oligomero no unido y/o proteina de fusión no unida; (iv) cuantificar la proteina de fusión única al ligando de referencia inmovilizado detectando el oligomero de ácidos nucleicos; en donde una reducción en la cantidad de proteina de fusión unida a la carnada inmovilizada en presencia del compuesto comparado con la ausencia del compuesto indica que el compuesto de prueba se une a la proteina de interés. En otra modalidad, en la presente se provee un método para identificar un compuesto de prueba que se une a una proteina de interés, el método comprendiendo (i) poner en contacto una proteina de fusión a un oligomero bajo condiciones en donde dicha proteina de fusión se une al oligomero, en donde la proteina de fusión comprende la proteina de interés fusionada a un motivo de interacción de ácidos nucleicos y en donde el oligomero comprenden una secuencia de amplificación de RCP y una secuencia de ácidos nucleicos que se une al motivo de interacción de ácidos nucleicos, (ii) poner en contacto a la mezcla en el paso (i) a un ligando de referencia inmovilizado capaz de unirse a la proteina de interés, en presencia y ausencia del compuesto de prueba; (iii) remover el oligómero no unido y/o proteina de fusión no unida; (iv) detectar o cuantificar la proteína de fusión unida al ligando de referencia inmovilizado por RCPc; en donde una reducción en la cantidad de proteína de fusión unida a la carnada inmovilizada en presencia del compuesto comparado con la ausencia del compuesto indica que el compuesto de prueba se une a la proteína de interés. En modalidades especificas, una etiqueta de ácidos nucleicos se emplean en un análisis de tamizado para identificar a partir de un gran número de ligandos candidatos (o "compuestos de prueba"), los ligandos que se unirán competitivamente a la proteína de interés, en presencia de enligando de referencia de competencia que se conoce que se une a la proteína de interés. Los compuestos de pruebas candidatas pueden incluir uno o más compuestos químicos orgánicos, compuestos químicos inorgánicos, ácidos nucleicos sintéticos, ácidos nucleicos naturales, polipéptidos sintéticos, polipéptidos naturales, fragmentos de péptidos y/o proteínas. Así mismos, el ligando de referencia de competencia pueden ser compuestos químicos orgánicos, compuestos químicos inorgánicos, ácidos nucleicos sintéticos, ácidos nucleicos naturales, polipéptidos sintéticos, polipéptidos naturales, fragmentos de péptidos y/o proteínas. Por ejemplo, en una pantalla para un compuesto farmacéutico, uno o más compuestos de prueba, que pueden estar libres en la solución, se evalúan para una capacidad de competir con un ligando de referencia inmovilizado o "carnada" para unirse a una proteina de interés. En ciertas modalidades, el ligando de referencia inmovilizado es un compuesto farmacéutico. En modalidades especificas, las carnadas pueden seleccionarse con base en su promiscuidad en lugar de la interacción selectiva con una pluralidad de proteínas de interés. En algunas modalidades, las carnadas se seleccionan de manera que la carnada se une a dos, tres, cuatro, cinco, diez, quince, veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o más proteínas de interés, al igual que cuando se usa la carnada contra un panel o banco que comprende una pluralidad de proteínas de interés. En una modalidad, el tamiz es para un inhibidor de cinasa (u otro modulador) . La referencia inmovilizada puede ser cualquier inhibidor conocido u otro aglutinante de una cinasa. En modalidades, en las cuales se crean los análisis de unión competitivos para un panel de cinasas, las carnadas pueden seleccionarse con base en su promiscuidad en lugar de en la interacción selectiva con múltiples cinasas. Las carnadas ilustrativas que tienen perfiles de promiscuidad se conocen, tales como SB202190, estaurosporina , purvalanol B, SU5402, mesilato de imatinib, SU6668, Iressa y PD-173955. Las técnicas para inmovilizar dichos compuestos de referencia som conocidos, véase, v.gr., Publicación de E.U.A. No. 20050153371 (v.gr., Ejemplo 11). Como se usa en la presente, un "soporte sólido", sin limitación, es cualquier columna (o material de columna) , cabeza, tubo de prueba, placa de microtitulacion, partícula sólida (por ejemplo, perlas magnéticas, agarosa o sefarosa) , microcircuito (por ejemplo, vidrio, fibra de vidrio, látex, silicón, vidrio de silicón, o microcircuito dorado), o membrana (por ejemplo, la membrana de un liposoma o vesícula) , un material de plástico (por ejemplo, poliestireno o cloruro de polivinilo, o microcircuito sensor (por ejemplo, los usados con un sistema BIAcore) al cual se le puede unir un ligando, tal como un ligando de referencia, ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de otros intermediarios asociados de unión tal como otros anticuerpos o Proteína A) , o en el cual un ligando, tal como un liando de referencia, puede embeberse (por ejemplo, a través de un receptor o canal) . El ligando de referencia (carnada) puede capturarse usando cualquier procedimiento normal, por ejemplo, por biotinilizaciono el ligando de referencia, seguido por la captura de ligando de referencia biotinilada usando estreptavidina inmovilizada (por ejemplo, estreptavidina inmovilizada en perlas magnéticas o unacolumna) . Las proteínas de interés que se unen al ligando de referencia (y etiquetas de ácidos nucleicos, los cuales se unen a las proteínas de interés) permanecerán unidos al soporte sólido, mientras que los reactivos de unión no unidos (proteínas de interés y/o etiquetas de ácidos nucleicos) se lavan. Después de la captura de la proteína unida de interés, una etiqueta de ácidos nucleicos que tiene unido un blanco en la muestra (v.gr., o proteína de interés de un panel de proteínas de interés) se detecta simplemente llevando a cabo una reacción de RCP usando iniciadores que se hibridizan a la porción de amplicón de la etiqueta de ácidos nucleicos. En ciertas modalidades, la reacción de RCP se lleva a cabo usando métodos cuantitativos normales (por ejemplo, usando Taq Man por Perkin-Elmer) . En algunas modalidades, la proteína múltiple de complejos de etiqueta de ácidos nucleicos de interés se retienen por el soporte sólido, en cuyo caso los miembros individuales de la combinación aislada puede identificarse tal como a través de la amplificación de cada etiqueta de ácidos nucleicos única, que es específica para una proteína particular de interés, v.gr., en un panel. En una modalidad, el ligando de referencia inmovilizado se une al sitio de unión de ATP de una cinasa, y un tamiz permite la identificación de compuestos que se unen competitivamente al sitio de unión de ATP de la cinasa. En otra modalidad, la referencia inmovilizada se une a un sitio que comprende el sitio de unión de ATP y un sitio adyacente a o que se une al sitio de unión de ATP. Dicha "carnada" de referencia puede usarse para determinar si un compuesto de prueba se une en una forma competitivita con ATP o no competitiva con ATP, tal como llevando a cabo un análisis de unión competitivo en presencia o ausencia de ATP y determinando el efecto de ATP en la Kd aparente del compuesto de prueba de la cinasa. En la situación en donde el compuesto de prueba se une a la cinasa unida con ATP en una forma cooperativa, un compuesto de prueba que es competitiva con ATP exhibirá un cambio ascendente en Kd aparente en presencia de ATP, mientras que un compuesto de prueba que no es competitivo con ATP no mostrará cambio en Kd aparente, en la situación en donde el compuesto de prueba y ATP se une cooperativamente, un cambio descendente en Kd aparente en presencia de ATP. En otras modalidades, en la presente se provee un método para identificar un compuesto de prueba que se une a una proteina de interés que tiene un sitio de unión de ATP, en donde el compuesto de prueba es un aglutinante no competitivo con ATP a la proteina de interés, el método comprendiendo (a) en (i) la presencia y ausencia del compuesto de prueba, y (ii) en presencia y ausencia de ATP exógeno; poniendo en contacto un ligando de referencia inmovilizado, el cual se une a la proteina de interés, con una proteina de fusión que comprende un primer dominio que comprenden la proteina de interés, y un segundo dominio que comprende inmotivo de interacción de ácidos nucleicos, en donde la proteina de interés y el motivo de interacción de ácidos nucleicos difieren entre ellos; (b) agregar un oligómero de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se une al motivo de interacción de ácidos nucleicos de la proteina de fusión; (c) remover el oligómero de ácidos nucleicos no unidos y/o proteina de fusión no unida; y (c) detectar si el oligómero de ácidos nucleicos se une a la proteina de fusión; en donde (i) una reducción en la cantidad de proteina de fusión unida al ligando de referencia inmovilizada en presencia del compuesto de prueba y ausencia de ATP, comparado con la ausencia del compuesto de prueba y ausencia de ATP, indica que el compuesto de prueba se una a la proteina de interés, y en donde (ii) un incremento en la cantidad del oligómero de ácidos nucleicos unido a la proteina de fusión en presencia del compuesto de prueba y presencia de ATP, comparado con la presencia del compuesto de prueba y la ausencia de ATP, indique que el compuesto de prueba es un aglutinante no competitivo con ATP a la proteina de interés. En una modalidad, se provee en la presente un método para identificar un compuesto de prueba que se une a una proteina de interés en una forma no competitiva con ATP, el método comprendiendo (i) poner en contacto a una proteina de fusión con un oligómero detectable bajo condiciones en donde la proteina de fusión se une al oligómero, dicha proteina de fusión comprendiendo (a) un primer dominio que comprende la proteina de interés y (b) un segundo dominio que comprende un motivo de interacción de ácidos nucleicos y el oligómero comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos que se une al motivo de interacción de ácidos nucleicos; (ii) poner en contacto la mezcla en el paso (i) a un ligando de referencia inmovilizado, en presencia de varias concentraciones del compuesto de prueba y en ausencia del compuesto de prueba, en donde el ligando de referencia inmovilizado se une a la proteina de fusión en el sitio de unión de ATP y a una región (v.gr., fuera del sitio de unión de ATP) adyacente o conjuntamente con el sitio de unión de ATP, (iii) remover el oligómero de ácidos nucleicos no unidos y/o proteina de fusión no unida; y (iv) cuantificar la cantidad de proteina de fusión unida al ligando de referencia inmovilizado detectando el oligómero en cada concentración del compuesto de prueba (v.gr., para obtener una curva de unión) ; (v) determinar la concentración del compuesto de pura en el cual la cantidad de proteina de interés unida al ligando inmovilizado es del 50% de la cantidad de proteina de interés unida al ligando inmovilizado en ausencia del compuesto en donde la concentración es la Kd del compuesto de prueba; y (vi) repetir los pasos (i) - (v) en donde la mezcla en el paso (ii) además se ponen en contacto con ATP; en donde el compuesto de prueba se une a la proteina de fusión en una forma no competitivita con ATP cuando la Kd calculada en presencia y ausencia de ATP permanece sin cambio cuando la Kd calculada en presencia de ATP es menor a la Kd calculada en ausencia de ATP. En ciertas modaldiades, el oligómero de ácidos nucleicos comprenden un amplicón y la detección además comprende RCPc. En aún otra modalidad, la referencia inmovilizada se une a un sitio que es adyacente a, o que se une al sitio de unión de ATP y que opcionalmente se traslapa con el sitio de unión de ATP. Dicho sitio de unión además puede abarcar el sitio de unión del sustrato o puede estar fuera del sitio de unión del sustrato. Si una molécula de referencia se une a la cinasa en un sitio que abarca el sitio de ión del sustrato, tal como una "carnada" de referencia se puede usar para determinar si un compuesto de prueba se une a la cinasa en una forma competitiva con el sustrato o no competitiva con el sustrato, llevando a cabo un análisis de unión competitivo en presencia o ausencia del sustrato y determinando el efecto del sustrato sobre la Kd aparente del compuesto de prueba con la cinasa. Un compuesto de prueba que es competitiva con el sustito exhibirá un cambio ascendente en la Kd aparente en presencia del sustrato, mientras que un compuesto de prueba que no es competitiva con el sustrato no Mostar cambios en la Kd aparente o, cuando el compuesto de prueba y el sustrato se unen en cooperación, un cambio descendente en la Kd aparente en presencia del sustito. Un compuesto de prueba puede operarse a través de dicho análisis de unión competitivo en un tamiz secundario, cuando el compuesto de prueba se ha determinado que es una molécula no competitiva con ATP del análisis descrito en la presente. En ciertas modalidades, la concentración del compuesto de prueba requerido para desplazar la proteina de interés del ligando de referencia inmovilizada o "carnada" es una medición de su afinidad a la proteina de interés. Si la proteina de Itnez contiene un dominio de unión de ADN, la cantidad de proteina de interés retenedla en soporte sólido puede detectarse por una etiqueta de ácidos nucleicos que contiene una secuencia capaz de formar un complejo con el dominio de unión de ADN (como una fusión con la proteina de interés). La etiqueta de ácidos nucleicos puede ser detectable por una marcación fluorescente de radio marcado o amplificación de una secuencia de amplificación de RCP como se describió antes. Por lo tanto, en la presente se provee un método para identificar un compuesto que se une a una proteina de interés (v.gr., una fusión quimérica), que comprenden poner en contacto una proteina de interés a un ligando de referencia "carnada" inmovilizada en el soporte sólido en presencia y ausencia de por lo menos una molécula de prueba candidato en solución, titulando la cantidad de proteina de interés retenida por el soporte con concentraciones crecientes de la molécula de prueba iniciando a una concentración de cero, agregando a la mezcla una etiqueta de ácidos nucleicos detectable para marcar la proteina de interés y determinar la cantidad de proteina inmovilizada de interés para cada concentración de compuesto de prueba. Una reducción en la cantidad de proteina de unión de interés en presencia de la molécula de prueba comparado con la ausencia de la molécula de prueba identifica la molécula de prueba como unión a la proteina de interés. En un "tamiz de avance", los números grandes de los compuestos de prueba pueden ser tamizados rápidamente para identificar cual se unirá a una proteina de interés. La afinidad con la cual la molécula competidora alternativa se unen a la proteina también puede preseleccionarse ajusfando la concentración del compuesto de prueba. Si se desea afinidad superior, las concentraciones inferiores del candidato se ofrecen y tienen éxito al descargar la proteina de interés de un ligando de referencia inmovilizado se requiere a estas concentraciones inferiores. El ligando de referencia puede ser una molécula blanco que se ha identificado o se conoce que se une a una proteina particular de interés. Este ligando de referencia puede inmovilizarse al soporte sólido usando cualquier método convencional como se describe en la presente. El ligando de referencia inmovilizado puede ponerse en contacto con una o una pluralidad de proteínas de interés a la cual se sabe que se une el ligando de referencia. En ciertas modalidades, esta interacción se prueba en una muestra la cual contiene por lo menos un compuesto de prueba y una muestra que no contiene compuesto de prueba. La etiqueta de ácidos nucleicos detectable provista en la presente se puede usar entonces para determinar la cantidad de proteína unida al ligando de referencia inmovilizado en presencia y ausencia del compuesto de prueba. Los compuestos de prueba de unión exitosa disminuirán la cantidad de proteína de interés unida al ligando de referencia comparado con la ausencia del compuesto de prueba. Este enfoque ofrece la capacidad de tamizar grandes números de compuestos de prueba rápidamente llevando a cabo las reacciones de competencia iniciales que suministran los compuestos de prueba en combinaciones. El número de candidatos en cada combinación es arbitrario pero puede ser de 2, 5, 10, 50, o aún más. Si la combinación o no es exitosa para disminuir la cantidad de proteína de unión de interés, ningún miembro de la combinación necesita probarse más. Si la combinación es exitosa, los compuestos de prueba individuales presentes en la combinación pueden probarse, o las combinaciones de tamaño intermedio de los usados originalmente pueden emplearse. Por ejemplo, si la combinación incivil contiene 50 compuestos de prueba, la prueba puede continuar con 5 combinaciones conteniendo cada una 10 de los 50 compuestos de prueba. Únicamente las combinaciones exitosas son subdivididas además para ciclos subsiguientes de prueba. El tamiz de unión de competencia se describe en mayor detalle en, v.gr., Fabial y otros (2005) Nature Biotechnology 23(3), 329-336 y Publicación de E.U.A. Nos. 2003/0186221; 2004/0009470, y 2005-0009099; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. En otro método provisto en la presente, la disociación constante de la molécula de prueba puede determinarse cuando se cumplen ciertas condiciones de análisis: En primer lugar, la concentración de la proteina de interés se mantiene lo suficientemente baja de manera que la concentración de proteina es menor a la Kd de la molécula de prueba para la proteina de interés, y en segundo lugar, la concentración del ligando de referencia inmovilizado es menor a la Kd del ligando de referencia para la proteina de interés ( ref) . Para cumplir con la primer condición, la concentración de la proteina de interés en el análisis se mantiene muy bajo, normalmente menor a 0.1 nM. Cuando se espera que un compuesto de prueba sea un aglutinante muy hermético de la proteina de interés, la proteina de interés se diluye a una concentración inferior. No hay exceso de proteina en el experimento de unión y la concentración de proteina se mantiene a una concentración inferior a la Kd de la molécula de prueba para la proteina de interés. La segunda condición deberá cumplirse debido a que la Kd aparente para el compuesto de prueba será afectada por la Kd del ligando de referencia para la proteina de interés (Kref) únicamente cuando la concentración del ligando de referencia inmovilizado es mayor a Kref. Para cumplir con la segunda condición, el análisis de unión de competencia se opera usando una concentración del ligando de referencia inmovilizado que cae en el rango de 0.3 nM - 300 nM, que está en el rango general de Kref (es decir, la Kd de la molécula de referencia a la proteina de interés) . Cuando se cumplen estas condiciones, la unión competitiva puede describirse por la ecuación: f/f0 = Kcomp/(KCOmp + [comp]) cuando f es la fracción de proteina de interés unida al ligado de referencia inmovilizado en presencia de la molécula de prueba de competencia en solución; f0 es la fracción unida en ausencia de la molécula de prueba disuelta; Kcomp es la constante de disociación en equilibrio (Kd) para la interacción entre la proteina de interés y la molécula de prueba de competencia en solución; y en donde [comp.] es la concentración de la molécula de prueba de competencia en solución. El número de proteina de Itnez unida al ligando de referencia como una función de la concentración de la molécula de prueba puede graficarse en una gráfica y la Kd calcularse ajustando la curva a la ecuación de unión al ligando de referencia como una función de la concentración de la molécula de prueba puede graficarse en una gráfica y la Kd calculada ajustando la curva a la ecuación de unión f/fo = (L + (H-L) ) x (Kcomp/ (Kcomp+ [comp. ] ) ) , en dond eL es la linea de base inferior, H es la linea de base superior, Kcomp la constante de unión para la interacción centre la molécula de prueba y la proteina de interés, y [comp] la concentración de la molécula de prueba. A competencia de 50% la fracción de proteina de unión en presencia de la molécula de prueba es una mitad a aquella den ausencia de la molécula de prueba, o f/fo = 1/2 y Kcomp es igual a [comp.]. Un método para determinar el valor de Kd de un compuesto de prueba para una proteina de interés, que comprende (i) en presencia de concentraciones variables y ausencia del compuesto de prueba, en contacto con un ligando de referencia inmovilizado, el cual se une a la proteina de interés, con una proteina de fusión que componed (a) un primer dominio que comprende la proteina de interés, y (b) un segundo dominio que comprende un motivo de interacción de ácidos nucleicos, en donde la proteina de interés y el motivo de interacción de ácidos nucleicos difieren entre ellas; (ii) agregar un oligómero de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que se une al motivo de interacción de ácidos nucleicos de la proteina de fusión ; (iii) remover el oligómero de ácidos nucleicos no unidos y/o proteina de fusión no unida; y (iv) obtener una curva de unión competitiva detectando o de alguna manera cuantificando el oligómero de ácidos nucleicos que se une a la proteina de fusión retenida en el soporte sólido en cada una de las concentraciones variables y ausencia del compuesto de prueba; por lo que el valor de K¿ del compuesto de prueba para la proteina de interés es la concentración a la cual la proteina del ligando de referencia inmovilizado de interés en presencia del compuesto de prueba es del 50% de proteina de interés retenido en ausencia del compuesto de prueba. Usando los análisis de tamizado provistos en la presente, un compuesto de prueba puede probarse contra un panel de proteínas de interés para generar un perfil de Kd del compuesto de prueba para dicho panel particular. El perfil de Kd es útil para determinar si un compuesto tiene o no una especificidad blanco, un aspecto que puede ser útil cuando un blanco pertenece a una familia de proteínas que ocuparte, como un ejemplo, sitios de unión de sustrato similares, en donde hay un mayor potencial para reactividad cruzada del compuesto. Cualquiera de los análisis de tamizado descritos en la presente puede operar en cualquier formato solo o múltiple. En un formato múltiple ilustrativo, se tamiza un compuesto de prueba y se prueba para sus propiedades de unión contra múltiples proteínas de un panel de proteínas de interés simultáneamente. Cuando las múltiples proteínas de interés se están analizando simultáneamente o secuencialmente, las etiquetas de ácidos nucleicos únicas para cada proteína de interés (v.gr., diferentes ampliaciones) pueden usarse para distinguir las diferentes proteínas. Por ejemplo cuando la etiqueta de ácidos nucleicos contiene un marcador de amplificación de RCP, el marcador de amplificación de RCP puede ser único para la protejan particular de interés que será detectada. Cada proteína por lo tanto, puede etiquetarse por una etiqueta de ácido que comprende una secuencia blanco de ADN y un marcador de amplificación de RCP que son cada uno únicos para la protejan de interés. En este formato particular, debido a que cada etiqueta de ácidos nucleicos se une únicamente a una proteína específica, las proteínas de interés pueden combinarse ya sea en el paso de unión de competencia y/o combinarse en el paso de elución después de que se ha llevado a cabo el paso de unión de competencia individualmente para cada proteína. Las fracciones de la combinación entonces pueden analizarse para la interacción de proteínas individual al compuesto de prueba . Alternativamente, si las proteínas de interés que se están analizando juntas en el formato multiplexado están comprendidas de la misma proteina de interacción de ácidos nucleicos (v.gr., NFKB) , las etiquetas de ácidos nucleicos pueden contener la misma secuencia blanco de ADN, pero los únicos reporteros, tales como únicos marcadores de amplificación de RCP se pueden usar para distinguir las diferentes proteínas de interés. En esta modalidad alternativa, una proteína de interaccón de ácidos nucleicos que tienen una lata afinidad para su ADN análogos y/o se puede seleccionar una vida media larga del complejo de proteína-ADN . En una modalidad, se selecciona NF-?? para su alta afinidad a su ADN análogo (véase Tabla 1) y su complejo de vida media larga de 4-40 horas. En dicha modalidad, la proteína de fusión quimérica de interés puede comprender la proteína de interés y el dominio de unión de ADN de NF-??. En esta modalidad alternativa del formato múltiple, el paso de unión de competencia puede llevarse a cabo "precargando" primero cada proteína de fusión con una etiqueta de ácidos nucleicos que contiene un amplicón único para cada proteína de fusión y que opera la unión de competencia en un formato múltiple combinando, v.gr., dos "cinasas "precargadas" o hasta seis (o más) proteínas de fusión "precargadas" en un recipiente común. En ciertas modalidades, se provee en la presente un método para identificar simultáneamente un compuesto de prueba que se una a do so más proteínas de interés, comprendiendo (i) en presencia y ausencia del compuesto de prueba de interés, con dos o más proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión comprende independientemente (a) un primer dominio que comprenden solo una de las dos o mas proteínas de interés, y (b) un segundo dominio que comprenden un motivo de interacción de ácidos nucleicos, en donde la proteína de interés y el motivo de interacción de ácidos nucleicos difieren entre ellas; (ii) adicionar dos o mas oligómeros de ácidos nucleicos, en donde cada uno de los dos o más oligómeros de ácidos nucleicos componed a secuencia de ácidos nucleicos que se une independientemente al motivo de interacción de ácidos nucleicos de una o mas de las proteínas de fusión; (iii) remover el oligómero de ácidos nucleicos no unidos y/o proteína de fusión no unida; y (iv) detectar o de alguna manera cuantificar cada uno de los dos o más oligómeros de ácidos nucleicos; en donde una reducción en la cantidad de dos o más proteínas de fusión unidas al ligando de referencia inmovilizada en presencia del compuesto de prueba comparado con la ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba se une a las dos o más proteínas respectivas de interés. Un método para determinar simultáneamente el valor de Kd de un compuesto de prueba para dos o más proteínas de interés, comprendiendo (i) en presencia de concentraciones variables y ausencia del compuesto de prueba poniéndose en contacto con un ligando de referencia inmovilizado, el cual se une a cada uno de dos o más proteínas de interés, con dos o mas proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión comprende independientemente (a) un primer dominio que comprende solo una de las dos o más proteínas de interés, y (b) un segundo dominio que comprenden un motivo de interacción de ácidos nucleicos, en donde la proteína de interés y el motivo e interacción de ácidos nucleicos difiere entre ellos, (ii) adicionar dos o más oligómeros de ácidos nucleicos, en donde cada uno de los dos o más oligómeros de ácidos nucleicos comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que se une independiente el motivo de interacción de ácidos nucleicos unidamente de dos o más proteínas de fusión retenidas en el soporte sólido en cada una de las concentraciones variables y ausencia del compuesto de prueba; por lo que el valor de Kd del compuesto de prueba para cada una de las dos o más proteínas de interés es la concentración a la cual cada una de las dos o más proteínas de interés retenidas por el ligando de referencia inmovilizada en presencia del compuesto de prueba es del 50% de las dos o más proteínas respectivas de interés retenidas en la ausencia del compuesto de prueba. En otra modalidad, una etiqueta de ácidos nucleicos de señuelo pueden agregarse al recipiente común antes de que se lleve a cabo el paso de unión. El señuelo puede ser una etiqueta de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ADN blanco (v.gr., una secuencia de ADN de NFKB análoga) reconocida por la proteína de interaccón de ácidos nucleicos comunes (v.gr., NFKB) , pero que carece de cualquier clase de función de reportero. Si la función de reportero usada en esta modalidad alternativa es de amplificación de RCPc, el señuelo puede ser un señuelo "silencioso de RCPc" que carece de cualquier clase de secuencia de amplificación de RCP y por lo tanto no produce cualquier señal en el paso de RCPc. Dicho señuelo puede ser agregado en el caso en donde la proteína de interacción de ácidos nucleicos se une inversamente a su ADN análogo, como en el caso en donde la proteína de interacción de ácidos nucleicos es el dominio de unión de ADN de un factor de transcripción. El propósito de dicho señuelo podría ser reducir la combinación de señal que puede resultar del intercambio de las etiquetas de ácidos nucleicos entre diferentes proteínas de fusión, incrementando la probabilidad de que cualquier intercambio entre las etiquetas pueden implicar una etiqueta de señuelo "silencioso" en lugar de un intercambio entre dos etiquetas y que cualquier intercambio puede reducir por lo tanto la señal de unión para una proteína particular en lugar de su combinación. En ciertas modalidades del análisis múltiple, la seña de unión se lee individualmente para cada proteína de interés (v.gr., una cinasa) por la toma alícuota de los eluatos del análisis de unión en recipientes individuales y analizando cada alícuota por RCPc. Alternativamente, la señal de unión se puede determinar en un formato múltiplexado tomando alícuotas de las muestras de cada análisis de unión de manera que cada muestra se analiza para dos o tres o más diferentes señales en la misma muestra, por ejemplo, por RCPc múltiplexado. En otra modalidad del formato múltiplexado, la multiplexión puede ocurrir solo en el paso de lectura, en donde se mide la señal de unión. En dicha modalidad, el paso de unión de competencia se opera individualmente para cada proteína de interés, y luego combinarse en el paso de elución, en donde cada fracción de la combinación puede analizarse para interacción de proteína individual al compuesto de prueba. El panel de proteínas probadas en el formato múltiple puede o no pertenecer a la misma familia de las proteínas. En una modalidad, el panel de proteínas comprende cinasas, tales como cinasas de la familia de tirosina cinasa del receptor. En otra modalidad del formato múltiple, los compuestos de prueba múltiples se prueban simultáneamente con una proteína de interés, para determinar el grado al cual los compuestos de prueba compiten con el ligando de referencia para la unión de la proteína de interés. La multiplexión de esta manera permite el tamizado rápido de bancos de compuestos de prueba grandes. Únicamente ciertas combinaciones de compuestos de prueba que exhiben el rango deseado de unión de competencia necesitan examinarse además para identificar el compuesto especifico que tiene la afinidad de unión deseada a la proteina de interés. Un perfil de Kd de un compuesto de prueba y/o proteina de interés puede introducirse enana base de datos u otra forma tabular para facilidad de uso y análisis subsiguientes. En un formato de datos, las identidades de los compuestos de prueba tamizados se exhiben en hileras de una tabla, las identidades de las proteínas de interés se exhiben en columnas y cada ceda de la tabla contienen los valores de constantes de disociasen de cada proteína para cada compuesto de prueba. Cada hilera de la tabla representa por lo tanto un perfil de especificidad de un compuesto de prueba que exhibe unión selectiva sobre los compuestos de prueba que exhiben la unión promiscua a proteínas múltiples. Los métodos de agrupación basados en computadora también se pueden usar para representar los datos en tal manera que el perfil de unión de cada molécula de prueba y cada proteína de interés puede referirse una a la otra. En un ejemplo de la representación agrupada de los datos, las proteínas que tienden a unir las mismas moléculas de prueba se colocan cerca una de la otra, mientras que las proteínas que tienden a unir diferentes moléculas de prueba se colocan separadas. Una indicación del lugar en donde el compuestos de prueba se unen en un mapa de grupos provee la vista adicional que puede ser valiosa para las predicciones de formación para la relación de actividad de la estructura de una familia de compuestos. Los análisis de tamizado provistos en la presente permiten numerosas ventajas sobre otros formatos de tamizado. Por ejemplo, el compuesto de prueba tamizado no necesita inmovilizarse o modificarse químicamente de ninguna manera y por lo tanto es inmediatamente disponible para su aumento, multiplexión y tamizado de paso alto, permitiendo que las moléculas de prueba sean probadas rápida y ampliamente. Además, dado que el análisis de unión competitivos utiliza métodos de detección altamente sensibles (v.gr., RCPc) , requiere menos cantidad de materiales escasos y costoso tales como proteínas recombinantes . Las técnicas de amplificación de señales tales como RCP permite que el análisis de tamizado sea operado usando cantidades traza de proteína blanco. Las cantidades picomolares bajas de proteínas por lo tanto puede detectarse con precisión por RCP cuantitativo y mediciones de Kd se pueden hacer en el rango picomolar. El uso de métodos de detección no solo sensibles sino altamente selectivos tal como RCPc también elimina el problema potencial de interferencia de proteínas no específica y vuelve innecesarios los pasos de purificación de proteínas y otros tipos de manipulación realizaos normalmente a las muestras de proteínas que se analizan usando técnicas más tradicionales. La presente invención por lo tanto provee un método de tamizado rápido, eficiente y de alto volumen que solo requiere pequeñas cantidades de materiales celulares y proteínas, y por estas razones, es un tamizado efectivo en cotos alternativo a análisis basados en células. También en la presente se provee un equipo para tamizar moléculas candidatas o compuestos de prueba que se unen competitivamente a la proteína de interés en presencia de un ligando de referencia de competencia que se conoce para unirse a la proteína de interés. Tal como un equipo que puede comprender un ligando de referencia (o "carnada"), que opcionalmente se inmoviliza en un soporte sólido o un contenedor, tal como un pozo en una placa de múltiples pozos; una etiqueta de ácidos nucleicos detectables ; y una proteína de interés capa de "etiquetarse" por la etiqueta de ácidos nucleicos. En donde la etiqueta de ácidos nucleicos se puede detectar por RCPc, el equipo adicionalmente puede incluir un iniciador de RCP capaz de reconocer una secuencia de iniciación de RCP en la etiqueta de ácidos nucleicos. Tal como un equipo se puede usar para llevar a cabo el análisis de tamizado de unión competitiva como se describió antes. En otra modalidad, el equipo se puede usar para detectar la presencia de una molécula (tal como una proteína de interés) que se une directamente al ligando de referencia o "carnada". En una modalidad más especifica, de manera que un equipo puede ser un equipo de diagnóstico para probar muestras biológicas para la presencia en cierta molécula, ya sea un compuesto químico, péptido o proteína. En un ejemplo, el equipo comprende una molécula de carnada inmovilizada a una superficie sólida; una proteína de interés capaz de etiquetarse por la etiqueta de ácidos nucleicos; y una etiqueta de ácidos nucleicos detectables. El equipo puede comprender además opcionalmente un iniciador de RCP capaz de reconocer una secuencia de iniciación de RCP en la etiqueta de ácidos nucleicos para permitir la amplificación de RCPc. En dicho quipo, la molécula de carnada está presente a una concentración optimizada de manera que la presencia de una molécula, tal como un péptido, proteína o un compuesto químico, que se une a la molécula de carnada, puede detectarse por la reducción en señal debido a la reducción de unión de la proteína de interés que puede unirse también a la molécula de carnada. En una modalidad particular, la proteína detectable es un anticuerpo capaz de etiquetarse por la etiqueta de ácidos nucleicos. En una modalidad más especifica, la proteína detectable es un anticuerpo fusionado con un dominio de unión de ADN capaz de formar un complejo con una etiqueta de ácidos nucleicos. Dicho equipo de diagnostico puede usarse a las muestras biológicas de prueba tal como sangre, saliva, orina, semen u otros específicos, para la presencia de marcadores de antigenos con el fin de determinar o confirmar la presencia de ciertos marcadores biológicos para determinar, por ejemplo, el estado enfermo de un paciente. La prueba de diagnóstico también se pueden usar para detectar la presencia de hormonas nativas o sintéticas o compuestos químicos en una muestra biológica. En otra modalidad, el equipo de diagnóstico se puede usar para probar muestras ambientales para la presencia de una molécula química o biológica, en ciertos casos derivada de un patógeno, que se une al ligando de referencia o "carnada". Se pretende que los siguientes ejemplos sirven como ilustraciones de la invención y no se deberán tomar como limitación de la invención.
EJEMPLOS A práctica del sistema y métodos provistos en la prevete, emplea, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, análisis genéticos, ADN recombinante, química orgánica, bioquímica, RCP, síntesis y modificación de oligonucleótidos, hibridización de ácidos nucleicos, y campos relacionados dentro de la experiencia de la técnica. Estas técnicas se describieron en las referencias citadas en la presente y se explican completamente en la literatura. Véase, v.gr, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons (1987 and annual updates through present) ; Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed. ) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) Genome Analysis: A Laboratory Manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Construcción de Vector de Expresión In Vitro de Mamíferos Temporal Los elementos genéticos listados más adelante se clonaron en la estructura de la base de un plásmido bacteriano genérico pGEM por síntesis de genes seguido por digestión de restricción y ligadura subsiguiente usando técnicas de bilogía molecular normales. Listados del extremo 5' al extremo 3', son: - La región de incrementador/promotor de CMV (citomegalovirus ) para permitir expresión constitutiva fuerte en muchos tipos de células, - un intrón quimérico compuesto del primer intrón del gen ß-globina humano y el intrón que está entre el líder y el cuerpo de una región variable de cadena gruesa de genes de inmunoglobulina (los estudios de transfección han demostrado que la presencia de un intrón que flanquea un inserto de ADNc frecuentemente incrementa el nivel de expresión de genes), - El dominio de unión de ADN de la levadura GAL4 o los activadores transcripcionales de NF-?? humanos (véase Tabla 1) fusionada en el marco con la secuencia de reconocimiento de proteasa de TEV (Virus fuerte de Tabaco) seguido ro una región de clonación múltiple con varios sitios de restricción únicos, La señal de poliadenilación tardía de SV40 (Virus de Simio 40) para estabilidad y traslación incrementada de ARNm, - El origen de PMBl de replicación para propagación en E. coli, y - El gen de resistencia a ampicilina (AmpR) para la selección/propagación en E. coli.
Clonación de Cinasas Las secuencias de cinasas humanas p38o¡ (Banco de Genes No. NP_620581.1) y BRAF (Banco de Genes No. NP-004324.1) se fusionaron en el marco con dominio de unión de ADN (GAL4 o NF-??; Véase Tabla 1) se clonaron por digestión de restricción seguido por ligadura usando protocolos de clonación moleculares normales. La secuencia de los clones se verificó por secuenciación de ABI.
Expresión Temporal In Vitro y Prepración de extracto de Proteínas La expresión in Vitro temporal en células 293 de riñon embriónico humano (HEK) se llevaron a cabo usando Lipofectamine® (Invitrogen) y ADN de plásmido verificado por secuencias obtenido usando equipos de purificación de plásmidos Quiagen normales. Las transíecciones se llevaron a cabo durante 24 horas a 37 °C usando 80% de células confluentes en placas Petri de 10 cm de diámetro. Las extracciones de proteínas se llevaron a cabo a 4°C usando solución reguladora de extracción M-PER (Pierce) conteniendo 150 mM NaCl, 10 mM DTT y mezcla de antiproteasa Complete™ (Roche) . Las células se lisan directamente en la placa después de un lavado de PBS frío y los desechos celulares se removieron por centrifugación. Las concentraciones de proteínas se estimaron por análisis de dosis de proteínas Bradford (Bio-Rad) . Los extractos se tomaron en alícuotas, se congelaron en nitrógeno líquido y ase almacenaron a -80°C hasta su uso. El nivel y calidad de expresión de cada construcción de ADN se analizaron por análisis SDS- PAGE/Western Blot usando anticuerpos que surgen contra GAL4 y NF-?? (Santa Cruz Biotechnology) .
Construcción de etiquetas de ácidos nucleicos Se generaron secuencias aleatorias y se usaron para diseñar la secuencia de amplicón usando el software Primer Express® (ABI) . La secuencia de amplicón fue el BLAST investigado contra el cinoma humano, el genoma de fagos T7, y contra otras secuencias de amplicones y se seleccionó con base en menos similitud a las secuencias en la búsqueda de BLAST. La secuencia de amplicón seleccionada se envió a ABI y el iniciador apropiado y sonda fluorescente de RCPc se preparó por ABI. La secuencia de amplicón se modificó además por la adición de sitios de reconocimiento de GAL4 o NF-KB, para crear la etiqueta de ácidos nucleicos completa. El oligonucleótido se clonó en el plásmido bacteriano y la etiqueta se replicó usando RCP.
Análisis de Unión Competitiva Las resinas de afinidad para los análisis de unión competitivos se prepararon de la siguiente manera. Dynabeads™ M280 (Streptavidina (Dynal #602.10)) se resuspendieron por agitación y centrifugación y las perlas se suspendieron en 10 mg/ml con 0.4 mg que serán usados por pozo de análisis. Las perlas se lavaron tres veces y se resuspendieron en IX PBS/0.05% Tween 20 (PBST) a 10 mg/ml y se distribuyó en tubos de 2 mi. Se conocen técnicas para la preparación de ligandos de referencia biotiniladas, véase, por ejemplo, Publicación de E.U.A. No. 20050153371. La porción de referencia biotinilada se agregó a los tubos a una relación molar de 0.025-0.25:1 (ligando de referencia : capacidad de unión de biotina) , se mezclaron e incubaron en el rotador durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las perlas luego se bloquearon con biotina en exceso (relación molar capacidad de unión de biotina a biotina 2:1) y se lavó con solución reguladora de bloqueo (SeaBlock (Pierce), 1% BSA, 0.05 % Tween 20, 1 mM DTT) para remover ligandos no unidos y reducir la unión de proteina no especiita. Las placas de poliestireno se bloquearon con 200 µ? SBTB (Pierce #37527 Seablock/1% BSA, 0.05% Tween 20) por pozo. La solución de perlas del paso previo se agregaron a las palcas de poliestireno a 12.5 uL de perlas por pozo sin remoción de SBTB. Las palcas se agitaron brevemente a 700 rpm (lavado 1), seguido por formación de pellas, decantando, y otro lavado con agitación con SBTB (lavado 2), seguido por un tercer lavado en donde las perlas se agitaron por lo menos durante 15 minutos en SBTB. Los compuestos de prueba se prepararon como lOOOx reservasen DMSO y se diluyeron rápidamente en el ambiente acuoso (1% DMSO final) . DMSO (concentración final a 1%) se agregó a análisis de control que carece de un compuesto de prueba . Los extractos de proteina se descongelaron lentamente en hielo y se diluyeron con lx solución reguladora de unión (20% SeaBlock, 0.17 x PBS, 0.05% Tween 20, 6 mM DTT) . Las reacciones de unión se ensamblaron en las placas de poliestireno que contienen perlas por combinación del extracto de proteina diluido y 1 µ? de una molécula de prueba en DMSO que tiene una concentración final de 2 nM a 30 µ , en 1 x Solución reguladora de unión que contiene 10 nM de la etiqueta de ácidos nucleicos (un oligonucleótido de ADN quimérico que abarca la secuencia blanco unida por GAL4 o NF-KB y una unidad de amplificación (Amplicón) para detección de RCP cuantitativa). Las placas de análisis se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora, y las perlas de afinidad se lavaron cuatro veces con solución reguladora de lavados (lx PBS, 0.05% Tween 20, 1 MM DTT) para remover proteínas no unidas. Después del lavado final, las perlas se resuspendieron en Solución Reguladora de Elución (lx PBS, 0.05% Tween 20, y 2 µ? de ligando de afinidad no biotinilado) y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. La cantidad de cinasa en los eluato se midió por RCP cuantitativa. Alternativamente, la reacción de unión se puede llevar a cabo en ausencia de la etiqueta de ácidos nucleicos que se puede agregar después al paso de lavado para remover las proteínas no unidas.
Análisis de unión Competitivas con cinasa MAP p38 Los aspectos del análisis de unión competitivos de la proteína p38 en células HEK293 y un ligando inmovilizado que se une al sitio de unión de ATP p38. Para producir la proteína p38, la región de codificación para p38a se fusiono en el marco con el dominio de unión de ADN de GAL4 o NF-?? y se clonó en el vector de expresión como se describió antes usando protocolos de clonación normales. SB202190, un compuesto conocido para unirse al sitio de unión de ATP p38 con alta afinidad, se utilizó como el ligando de referencia inmovilizado. Un entrelazador flexible biotinilado se unión a SB202190 en una posición que no podría interferir con el sitio de unión p38. SB202190 luego se inmovilizó en perlas magnéticas revestidas con estreptavidina vía su entrelazador biotinilado . Se probaron tres compuestos para su capacidad de competir con la interacción entre p38 y SB202190 : SB201290 inmovilizado (no modificado y se cubre en solución) , BIRB-796 y VX-745. Para determinar la afinidad de las interacciones, la cantidad de p38 unido al soporte sólido se cuantificó como una función de concentración del compuesto de prueba. Kd.s para los tres compuestos se muestran en las Figuras 2 y 3.
Análisis de unión competitivo con BRAF cinasa Para producir la proteina de BRAF cinasa, la región de codificación para BRAF se fusionó en el marco con el dominio de unión de ADN de GAL 4 o NF-?? (véase Tabla 1), clonado en el vector de expresión descrito antes y luego se expresó en células HEK293. PD-173955, un compuesto que se sabe que se une al sitio de unión de ATP de BRAF con alta afinidad, se utilizó como el ligando de referencia inmovilizado. El compuesto ligado se produjo usando la misma estrategia usada para crear la carnada SB202190. Cuatro compuestos de prueba de propiedad se probaron para su capacidad de competir con la interacción entre BRAF y el ligando de referencia inmovilizado. Uno de los cuatro compuestos se relaciona químicamente a los otros tres pero no se une al ligando de referencia, y se usó como un control negativo. Para determinar la afinidad de las interacciones, la cantidad de BRAF unido al soporte sólido se cuantificó como una función de concentración del compuesto de prueba. Los Kds para los cuatro compuestos se muestran en las Figuras 4 y 5.
Análisis de unión competitivo con un panel de cinasas La siguiente Tabla 2 muestra relaciones de señal a antecedente para análisis de unión competitivos operados por un panel de cinasas, en donde cada sinasa se preparó como una proteína de fusión con un dominio de unión de ADN de NFKB. Cada cinasa se probó usando su carnada análoga (ligando de referencia) , en presencia o ausencia de un coctail de compuestos de prueba de competencia potenciales en solución que comprenden arios inhibidores de cinasa competitivos de ATP, usando el protocolo descrito antes. Una relación de señal a antecedente de 30:1 se considera aceptable y una relación de 100:1 se prefiere.
Tabla 2 Cinasa Relación de señal a antecedente (x:l) ARAF1 90 BMPR1B 535 BMPR2 93470 CDC2L1 <10 CDK7 117 DDR2 69 IRAK3 10933 MAP2K2 5827 MAP3K10 7162 AP3K9 187077 MYLK 36637 SHARK 53 FLT3 1307 ZAP70 2192 AURAK 4469 CSHK2A1 291 P38-gamma 3361 VEGFR2 129975 ANKK1 (SgK288) 50 RPS6KA4 960 SNARK 370 MAPKAPK5 1100 MAP2K3 90 MAP2K1 14000 MAP2K4 780 GSK3B 1300 LATS2 290 PIK3CA 240 PIK3CA (E545K) 260 PRKCE 50 MYLK 270 ???-e 80 Análisis de Unión Competitivo Multiplexado El análisis de unión competitivo se multiplexó de nte manera: la región de unión de ADN de NF-?? para su ADN análogo y su vida media de complejo de proteina-ADN larga de 4-40 horas. El análisis de unión de competencia implicó preparar la perla de ligando agregando la carnada de ligando de referencia biotinilada a las perlas a un rango de relación molar de 0.0025-0.25:1 y se procesó en la forma descrita antes. La preparación del extracto de proteínas implicó una dilución de dos pasos. En el primer paso de dilución, cada material de extracto de proteína se diluyó 100 veces con IXPBS/O.05% Tween 20/0.1% BAS&10 mM DTT a temperatura ambiente en presencia de 10µ? de una etiqueta de ácidos nucleicos quiméricos únicos y 200 yg/ml de ADN de esperma de salmón. El segundo paso de dilución fue el paso de multiplexión en donde diferentes extractos diluidos se combinaron y diluyeron otras 100 veces en IX PBS/0.05% Tween 20/0.1% BSA/10 mM DTT en presencia de 1 µ? de ADN de señuelo "silencioso de RCPc", de manera que la dilución final dio un material diluido 10,000 veces conteniendo 0.1-1 nM de cada uno de la etiqueta de ácidos nucleicos quiméricos para cada proteína de fusión de cinasa. En la situación en donde una cinasa que genera una señal de análisis fuerte se multiplexó con otra cinasa que genera una señal de análisis más débil, el primer paso de dilución para la cinasa de señalamiento fuerte contuvo 100 nM, en lugar de 10 nM, de etiqueta de ácidos nucleicos, con el fin de reducir la probabilidad de la etiqueta asociada con la cinasa de señalamiento intercambiando a una cinasa de señalamiento fuerte en el paso en donde se combinaron diferentes extractos de ciansa. El paso de análisis de unión competitivo subsiguiente se operó en la forma descrita antes. En el paso de lectura en donde la cantidad de unión se determinó por RCPq, el eluato del análisis de unión se tomó en alícuotas en diferentes muestras, y cada muestra se leyó en un formato doble. Alternativamente, la muestra puede ser un formato de tres partes usando una lectura de tres colores. En un ejemplo, las perlas se usaron como carnada con estaurosporina que se biotiniló a través en entrelazador de PEG en la forma descrita en la Publicación de E.U.A. No. 2005015337. Tres ciansas, PRKCE, ROCK2 y ZAP70, cada una fusionada en el marco al dominio de unión de ADN de NF- ?, se clonaron y expresaron en células HEK293. El extracto de proteínas de cada fusión de cinasa se diluyó primero en solución reguladora conteniendo la etiqueta de ácidos nucleicos de 10 nM ecepto por la muestra que contiene la proteína de fusión de ZP70, que se diluyó en solución reguladora conteniendo 10 nm de etiqueta de ácidos nucleicos, dado que los experimentos previsto mostraron que la proteína de fusión de ZAP70 generó una señal más fuerte comparada con las proteínas de fusión de PRDKCE y ROCK2. El extracto diluido se diluyó además en presencia de ADN de señuelo "silencioso de RCPc", y luego se combinó con el compuesto de prueba y las perlas de ligandos para el análisis de unión competitivo. El eluato de proteínas obtenido del experimento de unían se tomó en alícuota en dos muestras, y cada muestra se analizó usando la lectura de dos colores de RCPc.
Análisis de Unión Competitivo con Conformaciones de cinasa Activas e Inactivas La forma inactiva de la cinasa de Abll se preparó lisando las células HEK293 expresando la proteína de fusión de Abll en solución reguladora lx M-PER (Pierce # 78501) que tiene 150 mM NaCl, 25X EDTA-libre COMPLETE (Roche # 11873 5809 001) y 10 mM DTT. El extracto de proteína se transfirió a u n tubo de RCP y se incubó en un termociclizador a 30°C durante 45 minutos para permitir que las fosfatasas endógenas en el extracto celular desfosforile la proteína de abll, incrementando así la reacción de proteína en el estado inactivo (no fosforilado) . La forma activa de la cinasa de Abll se preparó incubando primero durante 2 horas inmediatamente antes del paso de lisis celular/extracción de proteínas, las células HEK293 transíectadas por Abll en los siguientes inhibidores de fosfatasa: ya sea 2 mM de ortovandato de sodio (Calbiochem #567540) o lx Inhibidor de Fosfatasa Grupo II (Calbiochem #524625) . Las células se lisaron en solución reguladora M-PER (Pierce # 78501) teniendo 150 mM NaCl, 25X EDTA-libre COMPLETE (Roche # 11873 580 001), 10 m DDT y lx Coctail Inhibidor de Fosfatasa Grupo II (Calbiochem #524625) . Las formas activas e inactivas de Abll se usaron en un análisis de unión competitivo llevado a cabo en la forma descrita antes, usando perlas unidas a B de Purvalanol como la carnada inmovilizada. Uno de los compuestos probados contra las formas activas e inactivas de la cinasa fue VX-680, que es un compuesto conocido en la literatura que será capaz de unirse a la forma activa de Abl (Young y otros (2006) Cáncer Res 66(2): 1007-1014). El segundo compuesto elegido para probarse contra las conformaciones de cinasa activas/inactivas fue imatinib (ST1571) que es un compuestos que inhibe las uniones preferenciales para la conformación inactiva de Abll (Schindler, T. y otros. Science (2000) 289:1938-1942, Liu y otros. Nature Chemical Biology (1006) 2 (7 ) : 358-364 ) . Los valore sde Kd para VX-680 y imatinib para las formas fosforiladas activas y no fosforiladas inactivas de Bbl se muestran en la Figura 6A. La Figura 6A muestra que la Kd para BX-680 a Abl permanece sin cambio entre la cinasa Abl fosforilada y no fosforilada. Estos datos proveen confirmación para el primer tiempo en que el compuesto puede unirse a Abl en la conformación inactiva. Por contraste, la Figura 6 muestra que la Kd para imatinib es inferior en la forma no fosforilada de Abl comparado con la forma fosforilada, que indica que el compuesto se une preferiblemente a la forma inactiva.
Análisis de Unión Competitivo para identificar inhibidores de cinasa competitivos sin ATP Los ligandos de referencia usados como carnada en los análisis de unión competitivos descritos en la presente son generalmente más largos que la propia molécula de aTP. Estos ligandos de referncia por lo tanto se unen a más de un sitio de unión de ATP, y se describen más precisamente como unión al sitio activo, lo cual incluye el sitio de unión de ATP canónico y las regiones adyacentes, tales como el sitio de unión del sustrato y la hendidura de inter-dominio . Estos ligándoos de referncia por lo tanto tienen la capacidad de desplazar no solo los aglutinantes en el sitio de unión de ATP, por también los aglutinantes que se unen adyacentes al sitio de ATP, incluyendo aquellos que se unen al sitio de eunón del sustrato. En un experimento deseado para confirmar la naturaleza competitiva sin ATP de la unión de BMS-345541 a ???ß, un compuesto previamente identificado como unión al sitio activo de ???ß, se bitoiniló y utilizó como carnada de referncia. BMS-345541 se mostró previamente por múltiples análisis de inhibición para unirse a un sitio en una forma que no fue mutuamente exclusiva con ADP/ATP, y que por lo tanto se determinó que es un aglutinante competitivo sin ATP (Burke y otros J of Biol Chem (2003) 278 (3) : 1450-1456) . El experimento de unión con cinasa de ???ß se llevó a cabo en la forma ya descrita, pero además, 20 mM de MgCl2 y ATP a una concentración calculada por ser diez veces la Kd de ATP para ???ß se agregó a la mezcla de reacción en la actividad de unión de medición de análisis en presencia de ATP. Un experimento paralelo con cinasa de ???ß se opero usando una molécula competitiva de ATP conocida, estaurosporina, como un control competitivo de ATP. Los resultados del experimento de unión competitivo se muestran en la Tabla 3. Los resultados muestran que mientras que el aglutinante competitivo de ATP de estaurosporina exhibe un cambio ascendente en Kd en presencia de ATP, BMS-345541 exhibe valores de Kd que no se afectan por ATP, lo cual confirma que la molécula es un aglutinante competitivo sin ATP clásico. En un segundo experimento, diseñado para confirmar la naturaleza competitiva sin ATP (véase, v.gr., Ohren y otros Nature Structural & Molécula Biology (2004) 11 ( 12 ): 1192-1197 ) . El experimento de unión de cinasa MEK1 se llevó a cabo en la forma descrita antes, excepto que en el paso de reacción de unión, 20 mM de MgCl2 y ATP a una concentración calculada por ser diez veces la Kd de ATP para MEK1, se agregó a la mezcla de reacción para la actividad de unión de medición de análisis en presencia de ATP.
Similarmente, la reacción de unión para el análisis de unión de cinasa MEK2 contuvo, además de la mezcla de análisis de unión normal de 20 mM de MgCl2 y ATP a una concentración calculada por ser diez veces la Kd de ATP para MEK 2. La estarosporina, un aglutinante competitivo de ATP conocido, también se probo en ambos análisis de MEK para dar un control competitivo de ATP. Los resultados del análisis de unión competitivos en presencia y ausencia de ATP se mostraron en las Tablas 4 y 5. Los resultados muestran una disminución notoria en la Kd aparente de PD184352 a MEK 1/2 como se puede expresar para el incremento marcado en la Kd aparente de estaurosporina a MEK1/2 como se puede esperar para un compuesto que es competitivo de ATP. El hecho de que ATP tiene el efecto de disminuir la Kd apronte en lugar de no tener efecto en la Kd aparente como fue el caso para BMS-345541, sugiere que PD184352 se une preferiblemente a MEK unido a ATP comparado con MEK no unido, y por lo tanto es un aglutinante competitivo sin ATP que coopera con ATP.
Tabla 3: Análisis de Unión Competitiva de ???ß en presencia y ausencia de ATP Compuesto Kd (nM) ATP no Kd (nM) ATP presente presente Estaurosporina 40 282 BMS-345541 138 123 Tabla 4: Análisis de Unión Competitiva de MEKl en presencia y ausencia de ATP Compuesto Kd (nM) ATP no Kd (nM) ATP presente presente Estaurosporina 33 151 PD184352 804 4 Tabla 5: Análisis de Unión Competitiva de MEK2 en presencia y ausencia de ATP Compuesto Kd (nM) ATP no Kd (nM) ATP presente presente Estaurosporina 24 99 PD184352 849 8 Clonación de proteína de fusión de hAGT Un vector de expresión de mamíferos que codifica una alquiltransferasa de ADN de 06-alquilguanina (hAGT) se construyó usando procedimientos de clonación moleculares normales. Los elementos genéticos en el vector de clonación comprendido, del extremo 5' al extremo 3', un CMV mejorador/promotor, la secuencia que codifica la alquiltransferasa de ADL de 06-alguilguanina fusionada en le marco con la secuencia de reconocimiento de proteasa de TEV, seguido por una cinasa de p38a de longitud completa seguido por una secuencia que codifica la etiqueta de epítope de Hall. La proteína de fusión de hAGT se expresó en células HEK293 in Vitro. Una etiqueta de ácidos nucleicos que pueden construirse ligando la secuencia de maleimida de polietilenglicol con 06-bencilguanina (Vovalys) que comprende el marcador de amplificación de RCP. El sustrato etiquetado conocidos nucleicos puede reconocerse por la proteína de fusión de hAGT que transferirá la etiqueta de ácidos nucleicos para ser unido covalentemente a la proteína de fusión . Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se incorporan aquí por referncia al mismo grado que cada publicación o solicitud de patente individual indicada especifica e individualmente para ser incorporada por referncia.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. - Un oligómero de acido nucleico que une un compuesto, en donde el oligómero de acido nucleico comprende: (a) una primer secuencia de acido nucleico que es una secuencia de amplificación PCR y (b) una segunda secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción de acido nucleico, en donde la primer secuencia de acido nucleico es heterologa a la segunda secuencia de acido nucleico. 2. - El oligómero de la reivindicación 1, en donde el acido nucleico es ADN. 3. - El oligómero de la reivindicación 2, en donde el ADN es un ADN de doble hebra. 4. - El oligómero de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el motivo de interacción de ácidos nucleicos es un dominio de unión de ADN. 5. - El oligómero de la reivindicación 4, en donde el dominio de unión de ADN es un dominio de unión NF-B de ADN, dominio de unión de ADN ero represor, dominio de unión de ADN lac represor, dominio de unión de ADN GAL4 , dominio de unión de ADN GCN4, dominio de unión de ADN Lex-A, dominio de unión de ADN Opaque-2 ó dominio de unión de ADN TGAla. 6. - El oligómero de la reivindicación 4, en donde la segunda secuencia de acido nucleico comprende la secuencia representada en SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 ó SEC ID NO: 21. 7. - El oligómero de la reivindicación 4, en donde la segunda secuencia de acido nucleico comprende la secuencia representada en SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12 ó SEC ID NO: 13. 8. - El oligómero de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 7, en donde el oligómero es entre 50 y 500 nucleótidos de longitud. 9. - El oligómero de la reivindicación 1, en donde el acido nucleico que interactúa con el compuesto es una proteina de fusión, en donde la proteina de fusión comprende (a) un primer dominio que comprende una proteina de interés y (b) un segundo dominio que comprende el compuesto de interacción con el acido nucleico. 10. - Un oligómero de acido nucleico comprende una secuencia de acido nucleico que une un compuesto que interactúa con un acido nucleico, en donde el oligómero es una etiqueta radioactiva, fluorescentemente etiquetado ó biotinilado . 11. - El oligómero de la reivindicación 10, en donde el compuesto que interactúa con un acido nucleico no es radioetiquetado, etiquetado fluorescentemente ó biotinilado. 12. - El oligomero de la reivindicación 9, en donde la proteina de interés es una proteina de transmembrana, una proteina de canal de iones de transmembrana, una proteina de canal de iones abierto de ligando, proteina receptora de hormona nuclear, molécula de señal extracelular ó factor, citoquina, factor de crecimiento, hormona, enzima, anticuerpo ó fragmento variable de cadena pequeña (scFv) . 13. - El oligomero de cualquiera de la reivindicación 9, en donde la proteina de interés es una quinasa en la conformación activa o inactiva. 14. - El oligomero de la reivindicación 13, en donde la quinasa es una quinasa humana. 15. - El oligomero de la reivindicación 13, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina no receptora. 16. - El oligomero de la reivindicación 15, en donde la quinasa de tirosina no receptora es un miembro de ABL, ACK, CSK, MATK, FAK, PYK2, FES, FRK, JAK, SRC-A, SRC-B, TEC ó de la familia SYK de quinasas de tirosina. 17. - El oligomero de la reivindicación 13, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina receptora. 18. - El oligomero de la reivindicación 17, en donde la quinasa de tirosina receptora es un miembro de ALK, AXL, DDR, EGFR, EPH, FGFR, INSR, ET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR, ROS, RYK, TIE, TRK, VEGFR, AATYK ó familia de SuRTK ó quinasas de tirosina. 19. - Un oligómero de acido nucleico comprende la secuencia de nucleótido representada en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 ó SEC ID NO: 4. 20. - Una proteina de fusión comprende: (a) un primer dominio que comprende una proteina de interés, y (b) un segundo dominio que comprende un compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteina de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difiere de cada uno y en donde el compuesto de interacción con el acido nucleico que une al oligómero del acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 19. 21. - La proteina de fusión de la reivindicación 20, en donde el compuesto de interacción con el acido nucleico es un dominio de unión del ADN . 22. - La proteina de fusión de la reivindicación 21, en donde el dominio de unión del ADN es un dominio de unión de ADN NF-B, dominio de unión de ADN ero represor, dominio de unión de ADN lac represor, dominio de unión de ADN GAL4, dominio de unión de ADN GCN4, dominio de unión de ADN Lex-A, dominio de unión de ADN Opaque-2 ó dominio de unión de ADN TGAla. 23. - La proteina de fusión de la reivindicación 20, en donde el segundo dominio comprende la secuencia de aminoácido representado en SEC ID NO: 5 ó SEC ID NO: 6. 24. - La proteina de fusión de la reivindicación 20, en donde la proteina de interés es una proteina de transmembrana, una proteina de canal de iones de transmembrana, una proteina de canal de iones abierto de ligando, proteina receptora de hormona nuclear, molécula de señal extracelular ó factor, citoquina, factor de crecimiento, hormona, enzima, anticuerpo ó fragmento variable de cadena pequeña (scFv) . 25. - La proteina de fusión de la reivindicación 20, en donde la proteina de interés es una quinasa en la conformación activa o inactiva. 26.- La proteina de fusión de la reivindicación 25, en donde la quinasa es una quinasa humana. 27. - La proteina de fusión de la reivindicación 26, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina no receptora. 28. - La proteina de fusión de la reivindicación 27, en donde la quinasa de tirosina no receptora es un miembro de ABL, ACK, CSK, ATK, FAK, PYK2, FES, FRK, JAK, SRC-A, SRC-B, TEC ó de la familia SYK de quinasas de tirosina. 29. - La proteina de fusión de la reivindicación 25, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina receptora. 30. - La proteína de fusión de la reivindicación 29, en donde la quinasa de tirosina receptora es un miembro de ALK, AXL, DDR, EGFR, EPH, FGFR, INSR, MET, MUSK, PDGFR, PTK7 , RET, ROR, ROS, RYK, TIE, TRK, VEGFR, AATYK ó familia de SuRTK106 ó quinasas de tirosina. 31. - La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones de la 20 a 30, en donde la proteína de fusión es formada en complejos, enlazada covalentemente ó no covalentemente con el oligómero de acido nucleico. 32. - Una librería de proteína de fusión, comprende una pluralidad de proteínas de fusión de cualquiera de las reivindicaciones de la 20 a 33, en donde por lo menos dos o más de las proteínas de fusión difieren una de la otra. 33. - Una librería de oligómeros, comprende una pluralidad de oligómeros de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 19, en donde por lo menos dos o más de los oligómeros difieren uno del otro. 34. - Un acido nucleico codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones de la 20 a 31. 35. - Un vector comprende el acido nucleico de la reivindicación 34. 36. - Una célula huésped comprende el vector de la reivindicación 35. 37. - La célula huésped de la reivindicación 36, en donde la célula huésped es una bacteria, insecto, mamífero ó una célula huésped de una planta. 38. - Un método para identificar una proteína de interés que une a un ligando, comprende: contactar el ligando, el cual es inmovilizado en un soporte fijo, con una proteína de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteína de interés y (b) un segundo dominio que comprende un compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteína de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difieren una de la otra; añadir un oligómero de acido nucleico comprende una secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico de la proteína de fusión; remover el oligómero de acido nucleico sin unión y/o la proteína de fusión sin unión; y detectar si el oligómero de acido nucleico es unido a la proteína de fusión; en donde la detección de la unión del oligómero de acido nucleico indica si la proteína de interés se une al ligando . 39. - Un método de identificar un compuesto de prueba que une a una proteína de interés, comprende: en la presencia y ausencia de un compuesto de prueba, contactar un ligando de referencia inmovilizado, el cual une la proteina de interés, con una proteina de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteina de interés y (b) un segundo dominio que comprende un compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteína de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difiere uno del otro; añadir un oligómero de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico de la proteína de fusión; remover el oligómero de acido nucleico sin unir y/o la proteína de fusión sin unir; y detectar si el oligómero de acido nucleico es unido a la proteína de fusión; en donde una reducción en la cantidad de la proteína de fusión unida a el ligando de referencia inmovilizado en la presencia de un compuesto de prueba como fue comparada a la ausencia del compuesto de prueba que indica si el compuesto de prueba se une a la proteína de interés . 40.- Un método de identificar un compuesto de prueba que une a la proteína de interés que tiene un sitio de unión de ATP, en donde el compuesto de prueba es un agente de unión competitivo sin ATP a la proteína de interés, el método comprende : en (i) la presencia y ausencia de un compuesto de prueba y (ii) en la presencia y ausencia de ATP exogenoso; contactar un ligando de referencia inmovilizado, el cual une la proteína de interés, con una proteína de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteína de interés y (b) un segundo dominio que comprende el compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteína de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difiere uno del otro; añadir un oligómero de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico de la proteína de fusión; remover el oligómero de acido nucleico sin unir y/o la proteína de fusión sin unir; y detectar si el oligómero de acido nucleico es unido a la proteína de fusión; en donde (i) una reducción en la cantidad de proteína de fusión unida al ligando de referencia inmovilizado en la presencia de un compuesto de prueba y de la ausencia de ATP, como fue comparado a la ausencia del compuesto de prueba y en la ausencia de ATP, indica si el compuesto de prueba se une a la proteína de interés y en donde (ii) un incremento en la cantidad del oligómero de acido nucleico unido a la proteina de fusión en la presencia de un compuesto de prueba y en la presencia de ATP, como se comparo a la presencia de un compuesto de prueba y en la ausencia de ATP, indica que el compuesto de prueba es un agente de unión competitivo sin ATP a la proteina de interés. 41.- Un método de determinar el valor Kd de un compuesto de prueba para una proteina de interés, que comprende : en la presencia de concentraciones variantes y ausencia del compuesto de prueba, contactando un ligando de referencia inmovilizado, el cual une la proteina de interés, con una proteina de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteina de interés y (b) un segundo dominio que comprende un compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteina de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difieren uno del otro; añadir un oligómero de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico de la proteina de fusión; remover el oligómero de acido nucleico sin unir y/o la proteina de fusión sin unir; y obtener una curva de unión competitiva detectando o si no cuantificando el oligómero de acido nucleico que es unido a la proteina de fusión retenida en el soporte solido a cada una de las concentraciones variables y en la ausencia de un compuesto prueba; en donde el valor Kd del compuesto de prueba para la proteina del interés es la concentración en el cual la proteina de interés retenida por el ligando de referencia inmovilizado en la presencia de un compuesto de prueba es 50% de proteina de interés retenida en la ausencia del compuesto de prueba. 42. - El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a 41, en donde el oligómero de acido nucleico comprende (a) una primera secuencia de acido nucleico que es una secuencia de amplificación PCR y(b) una segunda secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción de acido nucleico, en donde la primer secuencia de acido nucleico es heteróloga a la segunda secuencia de acido nucleico. 43. - El método de la reivindicación 42, además comprende un PCR que amplifica el oligómero de acido nucleico que es unido a la proteina de fusión. 44. - El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a 41, en donde el oligómero de acido nucleico es radioetiquetado, etiquetado fluorescentemente o biotinilado. 45.- Un método de identificar simultáneamente un compuesto de prueba que une a dos o más proteínas de interés comprende : en la presencia y ausencia de un compuesto de prueba, contactar un ligando de referencia inmovilizado, el cual une cada uno de dos o más proteínas de interés, con dos o más proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión independientemente comprende (a) un primer dominio que comprende solo uno de dos o más proteínas de interés y (b) un segundo dominio que comprende un compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteína de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difiere uno del otro; añadir dos o más oligómeros de acido nucleico, en donde cada uno de dos o más oligómeros de acido nucleico comprende una secuencia de acido nucleico que independientemente une el compuesto de interacción con el acido nucleico de solo uno de dos o más proteínas de fusión; remover el oligómero de acido nucleico sin unir y/o de la proteína de fusión sin unir; y detectar o cuantificar cada uno de los dos o mas oligómeros de acido nucleico; en donde una reducción en la cantidad de dos o más proteínas de fusión unida al ligando de referencia inmovilizada en la presencia del compuesto de prueba como se comparo a la ausencia del compuesto de prueba que indica si el compuesto de prueba une las dos o mas proteínas de interés respectivas . 46.- Un método de determinar simultáneamente el valor Kd del compuesto de prueba para dos o más proteínas de interés que comprende: en presencia de concentraciones variantes y ausencia del compuesto de prueba, contactando un ligando de referencia inmovilizado, el cual une la proteína de interés, con una proteína de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteína de interés y (b) un segundo dominio que comprende un compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteína de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difieren uno del otro; añadir un oligómero de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico de la proteína de fusión; remover el oligómero de acido nucleico sin unir y/o la proteína de fusión sin unir; y obtener una curva de unión competitiva detectando o si no cuantificando el oligómero de acido nucleico que es unido a la proteína de fusión retenida en el soporte solido a cada una de las concentraciones variables y en la ausencia de un compuesto prueba; en donde el valor Kd del compuesto de prueba para la proteína del interés es la concentración en el cual la proteína de interés retenida por el ligando de referencia inmovilizado en la presencia de un compuesto de prueba es 50% de proteína de interés retenida en la ausencia del compuesto de prueba. 47. - El método de la reivindicación 45 o 46, en donde cada uno de dos o más oligómeros de acido nucleico independientemente comprende (a) una primer secuencia de acido nucleico que es una secuencia de amplificación PCR y (b) una segunda secuencia de acido nucleico que une a solo uno de dos o más proteínas de fusión, en donde la primer secuencia de acido nucleico es heteróloga a la segunda secuencia de acido nucleico y en donde cada uno de las primeras secuencias de acido nucleico de dos o más oligómeros de ácidos nucleicos difieren uno del otro. 48. - El método de la reivindicación 47, además comprende un PCR que amplifica los oligómeros de acido nucleico . 49. - El método de la reivindicación 45 o 46, en donde el oligómero de acido nucleico es radioetiquetado, etiquetado fluorescentemente o biotinilado. 50. - El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a 49, en donde los ligamentos de referencia son inmovilizados en un plato de multipocillos . 51. - El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a 50, en donde la proteina de interés es una proteina de transmembrana, una proteina de canal de ion de transmembrana, una proteina de canal de ion abierto de ligando, proteina receptora de hormona nuclear, molécula de señal extracelular ó factor, citoquina, factor de crecimiento, hormona, enzima, anticuerpo ó fragmento variable de cadena pequeña (scFv). 52. - El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a 50, en donde la proteina de interés es una quinasa. en la conformación activa o inactiva. 53. - El oligómero de la reivindicación 13, en donde la quinasa es una quinasa humana. 54. - El oligómero de la reivindicación 13, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina no receptora. 55. - El oligómero de la reivindicación 15, en donde la quinasa de tirosina no receptora es un miembro de ABL, ACK, CSK, MATK, FAK, PYK2 , FES, FRK, JAK, SRC-A, SRC-B, TEC Ó de la familia SYK de quinasas de tirosina. 56. - El oligómero de la reivindicación 13, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina receptora. 57. - El método de la reivindicación 56, en donde la quinasa de tirosina receptora es un miembro de en donde la quinasa de tirosina receptora es un miembro de ALK, AXL, DDR, EGFR, EPH, FGFR, INSR, MET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR, ROS, RYK, TIE, TRK, VEGFR, AATYK ó familia de SuRTK106 o quinasas de tirosina. 58.- El método de la reivindicación 52, en donde la quinasa es una quinasa de treonina cerina. 59.- El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a 58, en donde el compuesto de interacción con el acido nucleico es un dominio de unión de ADN. 60.- El método de la reivindicación 59, en donde el dominio de unión del ADN es un dominio de unión de ADN NF-B, dominio de unión de ADN ero represor, dominio de unión de ADN lac represor, dominio de unión de ADN GAL4, dominio de unión de ADN GCN4, dominio de unión de ADN Lex-A, dominio de unión de ADN Opaque-2 ó dominio de unión de ADN TGAla. 61.- El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a 60, en donde el ligando de referencia es staurosporina SB202190 purvalanol B, SU5402, mesilato imatinib, SU6668, Iressa o PD-173955. 62.- Un método de la reivindicación 41, en donde dicha proteina de fusión es una proteínas de fusión de un panel de proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión en el panel comprenden una proteína de interés que difiere y en donde se repite el método cede un perfil Kd para el compuesto de prueba contra cada proteína de interés en el panel. 63. - El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a 62, en donde la proteina de fusión fue producida por expresión de un acido nucleico que codifica la proteina de fusión en una bacteria, insecto, mamífero o una planta huésped de planta. 64. - El método de la reivindicación 63, en donde la célula huésped es una célula huésped de un mamífero. 65. - Un equipo para identificar un compuesto de prueba que se une a una proteína de interés que comprende: (a) una proteína de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteína de interés y (b) un segundo dominio que comprende un compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteína de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difieren uno del otro; (b) un ligando de referencia, el cual se une a la proteína de interés; y (c) un oligómero de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico de la proteína de fusión. 66. - El equipo de la reivindicación 65, en donde el oligómero de acido nucleico comprende (a) una primer secuencia de acido nucleico que es una secuencia de amplificación PCR y (b) una segunda secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la primer secuencia de acido nucleico es heteróloga a la segunda secuencia de acido nucleico. 67. - El equipo de la reivindicación 66, además comprende un par de iniciadores PCR, los cuales hibridizan a la secuencia de amplificación PCR. 68. - El equipo de la reivindicación 65, en donde el oligómero de acido nucleico es radioetiquetado, etiquetado fluorescentemente ó biotinilado. 69. - Un equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a 68, en donde el ligando de referencia es unido al soporte solido. 70. - Un equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a 69, en donde la proteína de fusión es una proteína de fusión de un panel de proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión en el panel comprende una proteína de interés que difiere. 71. - El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a 70, en donde la proteína de interés es una proteína de transmembrana, una proteína de canal de iones de transmembrana, una proteína de canal de iones abierto de ligando, proteína receptora de hormona nuclear, molécula de señal extracelular ó factor, citoquina, factor de crecimiento, hormona, enzima, anticuerpo ó fragmento variable de cadena pequeña (scFv) . 72. - El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a 71, en donde la proteina de interés es quinasa en la conformación activa o inactiva. 73. - El equipo de la reivindicación 72, en donde la quinasa es una quinasa humana. 74. - El equipo de la reivindicación 72, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina no receptora. 75. - El equipo de la reivindicación 74, en donde la quinasa de tirosina no receptora es un miembro de ABL, ACK, CSK, MATK, FAK, PYK2, FES, FRK, JAK, SRC-A, SRC-B, TEC ó de la familia SYK de quinasas de tirosina. 76. - El equipo de la reivindicación 72, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina receptora. 77. - El equipo de la reivindicación 76, en donde la quinasa de tirosina receptora es un miembro de en donde la quinasa de tirosina receptora es un miembro de ALK, AXL, DDR, EGFR, EPH, FGFR, INSR, MET, USK, PDGFR, PTK7, RET, ROR, ROS, RYK, TIE, TRK, VEGFR, AATYK ó familia de SuRTK106 ó quinasas de tirosina. 78. - El equipo de la reivindicación 72, en donde la quinasa es una quinasa de treonina cerina. 79. - El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a 78, en donde el compuesto de interacción con el acido nucleico es un dominio de unión de ADN. 80. - El equipo de la reivindicación 79, en donde el dominio de unión del ADN es un dominio de unión de ADN NF-B, dominio de unión de ADN ero represor, dominio de unión de ADN lac represor, dominio de unión de ADN GAL4, dominio de unión de ADN GCN4 , dominio de unión de ADN Lex-A, dominio de unión de ADN Opaque-2 ó dominio de unión de ADN TGAla. 81. - El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a 80, en donde el ligando de referencia es staurosporina SB202190 purvalanol B, SU5402, mesilato imatinib, SU6668, Iressa o PD-173955. 82. - El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a 81, en donde la proteina de fusión fue producida por expresión de un acido nucleico que codifica la proteina de fusión en una bacteria, insecto, mamífero o una planta huésped de planta. 83. - El equipo de la reivindicación 82, en donde la célula huésped es una célula huésped de un mamífero. 84. - Un equipo para identificar un compuesto de prueba que se une a una proteína de interés que comprende: clonar y expresar una proteína de fusión que comprende (a) un primer dominio que comprende la proteína de interés y (b) un segundo dominio que comprende un compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la proteína de interés y el compuesto de interacción con el acido nucleico difieren uno del otro; sintetizar un oligómero de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico de la proteina de fusión. 85. - El proceso de la reivindicación 84, que además comprende inmovilizar a un soporte sólido, un ligando de referencia que une a la proteina de interés. 86. - El proceso de la reivindicación 84 u 85, en donde el oligómero de acido nucleico comprende (a) una primer secuencia de acido nucleico que es una secuencia de amplificación PCR y (b) una segunda secuencia de acido nucleico que une el compuesto de interacción con el acido nucleico, en donde la primer secuencia de acido nucleico es heteróloga a la segunda secuencia de acido nucleico. 87. - El proceso de la reivindicación 86, además comprende un par de iniciadores PCR, los cuales hibridizan a la secuencia de amplificación PCR. 88. - El proceso de la reivindicación 84 u 85, en donde el oligómero de acido nucleico es radioetiquetado, etiquetado fluorescentemente o biotinilado. 89. - Un proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 84 a 89, en donde la proteina de fusión es una proteina de fusión de un panel de proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión en el panel comprende una proteína de interés que difiere. 90. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 84 a 89, en donde la proteina de interés es una proteina de transmembrana, una proteina de canal de iones de transmembrana, una proteina de canal de iones abierto de ligando, proteina receptora de hormona nuclear, molécula de señal extracelular ó factor, citoquina, factor de crecimiento, hormona, enzima, anticuerpo ó fragmento variable de cadena pequeña (scFv). 91. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 84 a 90, en donde la proteina de interés es una quinasa en la conformación activa o inactiva. 92. - El proceso de la reivindicación 91, en donde la quinasa es una quinasa de humano. 93. - El proceso de la reivindicación 91, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina no receptora. 94. - El proceso de la reivindicación 93, en donde la quinasa de tirosina no receptora es un miembro de ABL, ACK, CSK, MATK, FAK, PYK2, FES, FRK, JAK, SRC-A, SRC-B, TEC ó de la familia SYK de quinasas de tirosina. 95. - El proceso de la reivindicación 91, en donde la quinasa es una quinasa de tirosina receptora. 96. - El proceso de la reivindicación 95, en donde la quinasa de tirosina receptora es un miembro de en donde la quinasa de tirosina receptora es un miembro de ALK, AXL, DDR, EGFR, EPH, FGFR, INSR, MET, USK, PDGFR, PTK7 , RET, ROR, ROS, RYK, TIE, TRK, VEGFR, AATYK ó familia de SuRTKl06 o quinasas de tirosina. 97. - El proceso de la reivindicación 91, en donde la quinasa es una quinasa de treonina cerina. 98. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 84 a 97, en donde el compuesto de interacción con el acido nucleico es un dominio de unión de ADN. 99. - El proceso de la reivindicación 98, en donde el dominio de unión del ADN es un dominio de unión de ADN NF-B, dominio de unión de ADN ero represor, dominio de unión de represor de ADN lac, dominio de unión de ADN GAL4, dominio de unión de ADN GCN4, dominio de unión de ADN Lex-A, dominio de unión de ADN Opaque-2 ó dominio de unión dADN TGAla. 100. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 85 a 99, en donde el ligando de referencia es staurosporina SB202190 purvalanol B, SU5402, mesilato imatinib, SU6668, Iressa o PD-173955. 101. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 84 a 101, en donde la proteina de fusión fue producida por expresión de un acido nucleico que codifica la proteina de fusión en una bacteria, insecto, mamífero o una planta huésped de planta. 102. - El proceso de la reivindicación 101, en donde la célula huésped es una célula huésped de un mamífero.
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