JP5098028B2 - 核初期化因子 - Google Patents

Description

本発明は、分化した体細胞を初期化して誘導多能性幹細胞を誘導する作用を有する核初期化因子に関するものである。

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）はヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期にわたって培養することができるという特徴を有している。この性質を利用してヒトＥＳ細胞はパーキンソン病、若年性糖尿病、白血病など多くの疾患に対する細胞移植療法の資源として期待されている。しかしながら、ＥＳ細胞の移植は臓器移植と同様に拒絶反応を惹起してしまうという問題がある。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては倫理的見地から反対意見も多い。患者自身の分化体細胞を利用して脱分化を誘導し、ＥＳ細胞に近い多能性や増殖能を有する細胞（この細胞を本明細書において「誘導多能性幹細胞」（ｉＰＳ細胞）と言うが、「胚性幹細胞様細胞」又は「ＥＳ様細胞」と呼ばれる場合もある）を樹立することができれば、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として利用できるものと期待される。
体細胞核を初期化する方法として、例えば、体細胞の核を卵子に移植し作製したクローン胚からＥＳ細胞を樹立する技術が報告されている（Ｗ．Ｓ．Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，ｐｐ．１６６９−７４，２００４；Ｗ．Ｓ．Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０８，ｐｐ．１７７７−８３，２００５：ただし、これらの論文はいずれも捏造されたものであることが判明し、後日取り下げられた）。しかしながら、この技術はＥＳ細胞を樹立する目的のためだけにクローン胚を作製することから、不妊治療で生じる余剰胚を用いる通常のＥＳ細胞に比して倫理的問題がかえって大きい。また、体細胞とＥＳ細胞とを融合させることにより体細胞核を初期化する技術が報告されている（Ｍ．Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１１，ｐｐ．１５５３−１５５８，２００１；Ｃ．Ａ．Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，ｐｐ．１３６９−７３，２００５）。しかしながら、この方法においても結局ヒトＥＳ細胞を用いることになり倫理的問題の解決とはならないという問題がある。さらに、ヒトに発生した生殖細胞腫瘍由来細胞株の抽出液と分化細胞とを反応させることにより細胞核を初期化する技術が報告されている（Ｃ．Ｋ．Ｔａｒａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１６，ｐｐ．５７１９−３５，２００５）。この方法は抽出液中のどの成分が初期化を誘導しているかが全く不明であり、技術の確実性や安全性に問題がある。
一方、分化した体細胞を初期化して誘導多能性幹細胞を誘導する作用を有する核初期化因子をスクリーニングする方法が提案されている（国際公開ＷＯ ２００５／８０５９８）。この方法はＥＣＡＴ遺伝子（ＥＳ細胞で特異的に発現する遺伝子群：ＥＳ ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と被検物質とを接触させ、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べて該細胞を出現させた被検物質を体細胞の核初期化因子の候補として選択する工程を含んでいる。また、この刊行物の実施例６などには体細胞を初期化する方法が示されている。しかしながら、上記刊行物には、核初期化因子を実際に同定したとの報告はない。
国際公開ＷＯ ２００５／８０５９８

本発明の課題は核初期化因子を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、卵子、胚やＥＳ細胞を利用せずに分化細胞の初期化を誘導し、ＥＳ細胞と同様な多能性や増殖能を有する誘導多能性幹細胞を簡便かつ再現性よく樹立するための手段を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行い、国際公開ＷＯ ２００５／８０５９８に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を用いて核初期化因子の同定を試みた。その結果、核初期化に関連する遺伝子として２４種類の候補遺伝子を見出し、それらのうち３種類の遺伝子が核初期化に必須の遺伝子であることを確認した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明により、体細胞の核初期化因子であって、下記の３種類の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＭｙｃファミリー遺伝子の各遺伝子産物を含む因子が提供される。この発明の好ましい態様によれば、下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの各遺伝子産物を含む上記の因子が提供される。
また、別の好ましい態様によれば、下記の遺伝子：Ｓｏｘファミリー遺伝子の遺伝子産物をさらに含む上記の因子も提供され、より好ましい態様としてＳｏｘ２の遺伝子産物を含む上記の因子が提供される。
さらに別の好ましい態様によれば、Ｍｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物とともに、あるいはＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物に換えてサイトカインを含む上記の因子が提供され、より好ましい態様としてサイトカインがｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）及び／又はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）である上記の因子が提供される。
特に好ましい態様によれば、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子の各遺伝子産物に加えて、ＴＥＲＴ遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、及びＴＥＲＴ遺伝子の各遺伝子産物に加えて、下記の遺伝子：ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、及びＢｍｉ１からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子の遺伝子産物を含む因子が提供される。
これらの因子に加えて、下記の群：Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、及びβ−ｃａｔｅｎｉｎからなる群から選ばれる１種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む上記の因子が提供される。
また、上記発明の別の好ましい態様によれば、下記の群：ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌｌ４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、及びＧｒｂ２からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む上記の因子も提供される。
別の観点からは、本発明により、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法であって、体細胞に上記の核初期化因子を接触させる工程を含む方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、体細胞の培養物中に上記の核初期化因子を添加する工程を含む上記の方法；体細胞に上記の核初期化因子をコードする遺伝子を導入する工程を含む上記の方法；上記の核初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも１種以上含む組換えベクターを用いて体細胞に該遺伝子を導入する工程を含む上記の方法；及び体細胞として患者から採取した体細胞を用いる上記の方法が提供される。
さらに別の観点からは、本発明により、上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞が提供される。また、上記の誘導多能性幹細胞から分化誘導された体細胞も本発明により提供される。
さらに本発明により、幹細胞療法であって、患者から分離採取した体細胞を用いて上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞を分化誘導して得られる体細胞を該患者に移植する工程を含む療法が提供される。
さらに本発明により、上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞を分化誘導して得られる各種細胞を用いて、化合物、薬剤、毒物などの生理作用や毒性を評価する方法が提供される。
また、本発明により、細胞の分化能及び／又は増殖能を改善する方法であって、細胞に対して上記の核初期化因子を接触させる工程を含む方法、並びに上記方法により得られた細胞及び上記方法により得られた細胞から分化誘導された体細胞が提供される。
本発明により提供された核初期化因子を用いることにより、胚やＥＳ細胞を利用せずに簡便かつ再現性よく分化細胞核の初期化を誘導することができ、ＥＳ細胞と同様の分化及び多能性や増殖能を有する未分化細胞である誘導多能性幹細胞を樹立することができる。例えば、本発明の核初期化因子を用いて患者自身の体細胞から高い増殖能及び分化多能性を有する誘導多能性幹細胞を作製することができ、この細胞を分化させることにより得られる細胞（例えば心筋細胞、インスリン産生細胞、又は神経細胞など）は、心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病や脊髄損傷など多用な疾患に対する幹細胞移植療法に利用することができ、ヒト胚を用いる倫理的問題や移植後の拒絶反応を回避できるので極めて有用である。また誘導多能性幹細胞を分化させてできる各種細胞（例えば心筋細胞、肝細胞など）は化合物、薬剤、毒物などの薬効や毒性を評価するためのシステムとして極めて有用である。

図１は、Ｆｂｘ１５遺伝子にβｇｅｏをノックインしたマウスの胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いた初期化因子のスクリーニング方法を示した図である。
図２は、表４に示す２４遺伝子の導入により得られたｉＰＳ細胞の形態を示した写真である。対照として分化細胞（ＭＥＦ）及び正常な胚性幹細胞（ＥＳ）の形態も示した。
図３は、ｉＰＳ細胞におけるマーカー遺伝子の発現を示した図である。ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、及びＭＥＦ細胞から抽出したトータルＲＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した。
図４は、ｉＰＳ細胞におけるＤＮＡメチル化状態を示した図である。ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、及びＭＥＦ細胞から抽出したゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理し、目的ＤＮＡをＰＣＲ増幅後、プラスミドに挿入した。各遺伝子ごとに１０クローンのプラスミドを単離し、シークエンスを決定した。メチル化ＣｐＧは黒丸で、非メチル化ＣｐＧは白丸で示した。
図５は、２４遺伝子群、及び２４遺伝子群から１遺伝子ずつ除外した２３遺伝子群の導入により得られたＧ４１８耐性細胞のコロニー数を示した図である。グラフ下側はＧ４１８選択後１週間で得られたコロニー数を示し、グラフ上側は３週間で得られたクローン数を示す。四角で囲んだ遺伝子（遺伝子の番号は表１に示したものと同一である）を除外した場合、コロニーは全く得られないか、３週間後に少数のみ認められた。
図６は、１０遺伝子群、及び１０遺伝子群から１遺伝子ずつ除外した９遺伝子群の導入により得られたＧ４１８耐性細胞のコロニー数を示した図である。＃１４、＃１５、又は＃２０の各遺伝子を除外した場合にはコロニーは一つも得られなかった。＃２２の遺伝子を除外した場合には少数のＧ４１８耐性コロニーが得られたが、細胞は分化した形態を示しており明らかにｉＰＳ細胞とは異なっていた。
図７は、１０遺伝子群、４遺伝子群、３遺伝子群、又は２遺伝子群によるＧ４１８耐性コロニー（初期化コロニー）の出現数を示した図である。各コロニーの代表的な形態を大きさを示す。
図８は、ＭＥＦ由来のｉＰＳ細胞をヌードマウス皮下に移植し形成された腫瘍をヘマトキシリンエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色した結果を示した写真である。二胚葉系の各種組織への分化が認められる。
図９は、成体皮膚線維芽細胞に由来するｉＰＳ細胞をマウス胚盤胞に移植し、偽妊娠マウスの子宮に移植することにより作製した胎児を示した写真である。上図、左側の胎児において、ｉＰＳ細胞に由来する細胞（緑色蛍光を発する）が、全身に分布していることがわかる。下図では、同胎児の心臓、肝臓、脊髄のほぼすべての細胞がＧＦＰ陽性であり、ｉＰＳ細胞に由来することがわかる。
図１０は、ＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果を示した写真である。図中、Ｓｏｘ２ ｍｉｎｕｓはＭＥＦに３遺伝子を導入し樹立されたｉＰＳ細胞を、４ＥＣＡＴはＭＥＦに４遺伝子を導入し樹立したｉＰＳ細胞を、１０ＥＣＡＴはＭＥＦに１０遺伝子を導入し樹立したｉＰＳ細胞を、１０ＥＣＡＴ Ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔは、皮膚線維芽細胞に１０遺伝子を導入し樹立したｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞はマウスＥＳ細胞を、そしてＭＥＦは遺伝子導入を行っていないＭＥＦ細胞を示す。その下の番号はクローン番号を示す。
図１１は、ＭＥＦからのｉＰＳ細胞樹立におけるｂＦＧＦの効果を示した図である。通常のフィーダー細胞（ＳＴＯ細胞）（左）及びｂＦＧＦ発現ベクターを導入したＳＴＯ細胞（右）上で培養したＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}マウス由来のＭＥＦに、４因子（上段）又はｃ−Ｍｙｃ以外の３因子（下段）をレトロウイルスにて導入した。２週間、Ｇ４１８による選択を行い、クリスタルブルーで染色後、写真撮影を行った。数字はコロニー数を表す。
図１２は、Ｎａｎｏｇ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏマウスを用いた実験について説明した図である。Ａ．マウスＮａｎｏｇ遺伝子を中央に含む大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）を単離し、Ｎａｎｏｇのコーディング領域の上流にＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏカセットをリコンビニアリングにより挿入した。Ｂ．改変ＢＡＣからトランスジェニックマウスを作製した。ＧＦＰの発現は胚盤胞の内部細胞塊や、生殖腺に限局して認められた。
図１３は、Ｎａｎｏｇ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏマウスを用いた実験について説明した図である。Ｎａｎｏｇ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏマウスの胎児（受精後１３．５日）から、頭部、内臓、及び生殖腺を除去し、ＭＥＦを樹立した。セルソーターによる解析の結果、Ｎａｎｏｇ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏマウス由来のＭＥＦ（Ｎａｎｏｇ）においても、Ｆｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}マウス由来のＭＥＦ（Ｆｂｘ１５）や野生型マウス由来のＭＥＦ（Ｗｉｌｄ）と同様に、ＧＦＰ陽性細胞はほとんど存在しなかった。
図１４は、Ｎａｎｏｇ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏマウスＭＥＦ（左）及びＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}マウスＭＥＦ（右）から樹立したｉＰＳ細胞の写真である。それぞれピューロマイシン及びＧ４１８で選択した。
図１５は、ｉＰＳ細胞の増殖の結果を示した図である。ＥＳ細胞、Ｎａｎｏｇ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏマウスＭＥＦ（左）由来のｉＰＳ細胞（Ｎａｎｏｇ ｉＰＳ）及びＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}マウスＭＥＦ由来のＩＰＳ細胞（Ｆｂｘ ｉＰＳ）をそれぞれ１０万個ずつ２４ウェルプレートにまき、３日ごとに継代し、細胞数を測定した結果を示した。数字は倍加時間の平均を表す。
図１６は、ｉＰＳ細胞の遺伝子発現を示した図である。ＭＥＦ、ＥＳ細胞、Ｎａｎｏｇ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏマウスＭＥＦ（左）由来のｉＰＳ細胞（Ｎａｎｏｇ ｉＰＳ）及びＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}マウスＭＥＦ由来のｉＰＳ細胞（Ｆｂｘ ｉＰＳ）におけるマーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにて解析した。下の数字は、継代数を表す。
図１７は、Ｎａｎｏｇ ｉＰＳ細胞からの奇形腫形成を示した図である。１００万個のＥＳ細胞又はＮａｎｏｇ ｉＰＳ細胞をヌードマウスの背部に皮下注射し、３週間後にできた腫瘍の外観（左）及び組織像（右、Ｈ＆Ｅ染色）を示す。
図１８は、Ｎａｎｏｇ ｉＰＳ細胞からのキメラマウスの作成を示した図である。Ｎａｎｏｇ ｉＰＳ細胞（クローンＮＰＭＦ４ＥＫ−２４、継代数６）を胚盤胞に移植し、誕生したキメラマウス。９０個の移植胚から４匹のキメラマウスが誕生した。
図１９は、Ｎａｎｏｇ ｉＰＳ細胞からのジャームライントランスミッションを示した図である。図１８に示すキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスの交配により誕生したマウスをゲノムＤＮＡをＰＣＲ解析したところ、すべてのマウスにおいてＯｃｔ３／４とＫｌｆ４のトランスジーンが存在していたことから、ジャームライントランスミッションが確認された。
図２０は、ｉＰＳ細胞からの神経細胞分化誘導を示した図である。皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させた神経細胞（上、βＩＩＩチュブリン陽性）、オリゴデンドロサイト（左、０４陽性）、アストロサイト（右、ＧＦＡＰ陽性）を示す。
図２１は、薬剤選択を用いないｉＰＳ細胞の樹立について説明した図である。ＭＥＦを１０ｃｍディッシュあたり１万から１０万個まき、４因子をレトロウイルスで導入した。コントロール（Ｍｏｃｋ）ではコロニーは生じなかったが（左）、４因子を導入したディッシュでは扁平な形質転換コロニーに加えて、盛り上がったｉＰＳ細胞に類似したコロニーが得られた（中央）。これらを継代培養すると、ｉＰＳ細胞に類似した細胞が得られた（右）。
図２２は、薬剤選択無しで樹立した細胞の遺伝子発現を示した図である。図２１に示す樹立した細胞からＲＮＡを抽出し、ＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにて解析した。
図２３は、ヒト線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞様細胞を示した図である。ヒト胎児由来線維芽細胞に４因子のヒト相同遺伝子をレトロウイルスで導入し、得られたコロニー（左）、及び２回継代後の細胞（右）を示す。
図２４は、ヒト成体皮膚線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の樹立を示した図である。マウスレトロウイルス受容体をレンチウイルスで感染させたヒト成体皮膚線維芽細胞に、左段に示した因子をレトロウイルスで導入した。写真はウイルス感染後８日目の位相差像（対物ｘ１０）を示す。

本発明の核初期化因子は、下記の３種類の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＭｙｃファミリー遺伝子の各遺伝子産物を含むことを特徴としており、好ましい態様では、上記の３種の遺伝子に加えてＳｏｘファミリー遺伝子の遺伝子産物を含むことを特徴としている。
本発明の核初期化因子を確認する手段としては、例えば、国際公開ＷＯ ２００５／８０５９８に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を利用することができる。上記刊行物の全ての開示を参照により本明細書の開示に含める。当業者は上記刊行物を参照することにより核初期化因子をスクリーニングし、本発明の初期化因子の存在及び作用を確認することができる。
例えば、初期化現象を容易に観察する実験系としてＦｂｘ１５遺伝子座にβｇｅｏ（ベータガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子）をノックインしたマウスを利用することができる。その詳細を本明細書の実施例に示した。マウスＦｂｘ１５遺伝子はＥＳ細胞や初期胚などの分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。マウスＦｂｘ１５遺伝子にβｇｅｏをノックインし、Ｆｂｘ１５の機能を欠失したホモ変異マウスでは、通常、分化多能性や発生を含めて異常な表現型は観察されない。このマウスにおいては、βｇｅｏがＦｂｘ１５遺伝子のエンハンサーやプロモーターにより発現制御されており、分化した体細胞ではβｇｅｏは発現せず、Ｇ４１８に感受性を示す。一方、βｇｅｏをノックインしたホモ変異ＥＳ細胞は極めて高濃度（１２ｍｇ／ｍｌ以上）のＧ４１８に耐性を示す。この現象を利用し、体細胞の初期化を可視化する実験系を構築することができる。
上記実験系を利用して、まずβｇｅｏをノックインしたホモ変異マウスの胎児（受精後１３．５日）から線維芽細胞（Ｆｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦ）を単離することができる。ＭＥＦはＦｂｘ１５遺伝子を発現しないため、βｇｅｏも発現せず、Ｇ４１８に感受性を示す。ところが、このＭＥＦと遺伝子操作を加えていないＥＳ細胞（やはりＧ４１８に感受性を示す）を融合させると、ＭＥＦの核が初期化する結果、βｇｅｏが発現してＧ４１８耐性となる。従って、この実験系を利用することにより、初期化現象をＧ４１８耐性に置き換えて可視化できる。
上記の実験系を用いて核初期化因子を選択することができる。核初期化因子に関連する遺伝子の候補として、ＥＳ細胞で特異的な発現を示す遺伝子及びＥＳ細胞の分化多能性維持における重要な役割が示唆される遺伝子を複数選択し、それらの候補遺伝子が単独で、あるいは適宜組み合わせることにより核初期を惹起するか否かを確認することができる。例えば、選択された１次候補遺伝子を全て組み合わせることにより分化細胞をＥＳ細胞に近い状態に初期化誘導できることを確認した後、その組み合わせのなかから１個ずつの遺伝子を除いた組み合わせを用意して同様の作用を確認し、その遺伝子が存在しない場合に初期化誘導能が減弱し、あるいは初期化誘導能が失われる２次候補遺伝子を選択することができる。そのようにして選択された２次候補遺伝子について同様のステップを繰り返すことにより、必須の核初期化遺伝子の組み合わせを選択することができ、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＭｙｃファミリー遺伝子の３種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせが核初期化因子として作用することを確認することができ、さらにこれらの３種類の遺伝子の遺伝子産物に加えてＳｏｘファミリー遺伝子の遺伝子産物を組み合わせが核初期化因子として極めて優れた性質を有することを確認することができる。核初期化因子の選択方法の具体例は本明細書の実施例に具体的に示されており、当業者は上記の一般的説明及び実施例の具体的説明を参照することにより、これら３種の遺伝子の組み合わせが体細胞の初期化を誘導すること、及びこれら３種の遺伝子産物の組み合わせが核初期化に必須であることを容易に確認することができる。
本発明により提供される核初期化因子は、少なくともＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物の組合せを含み、例えばＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの３種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む。Ｏｃｔファミリー遺伝子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｏｃｔ１Ａ、及びＯｃｔ６などを挙げることができる。Ｏｃｔ３／４はＰＯＵファミリーに属する転写因子であり、未分化マーカーとして報告されている（Ｋ．Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６０，ｐｐ４６１−７２，１９９０）。また、Ｏｃｔ３／４は多能性維持に関与しているとの報告もある（Ｊ．Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９５，ｐｐ３７９−９１，１９９８）。Ｋｌｆファミリー遺伝子としては、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５などを挙げることができる。Ｋｌｆ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ−４）は腫瘍抑制因子として報告されている（Ａ．Ｍ．Ｇｈａｌｅｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ９２−６，２００５）。Ｍｙｃファミリー遺伝子としては、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、及びＬ−Ｍｙｃなどを挙げることができる。ｃ−Ｍｙｃは細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子であり（Ｓ．Ａｄｈｉｋａｒｙ，Ｍ．Ｅｉｌｅｒｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ６３５−４５，２００５）、多能性維持に関与しているとの報告がある（Ｐ．Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３２，ｐｐ８８５−９６，２００５）。Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ以外の各ファミリー遺伝子のＮＣＢＩアセッション番号は以下のとおりである。
これらの遺伝子はいずれもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において上記遺伝子産物を利用するためには、任意の哺乳類動物由来（例えばマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることが可能である。また、野生型の遺伝子産物のほか、数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は欠失した変異遺伝子産物であって、野生型の遺伝子産物と同様の機能を有する遺伝子産物も利用可能である。例えば、ｃ−Ｍｙｃの遺伝子産物としては野生型のほか安定型（Ｔ５８Ａ）などを用いてもよい。他の遺伝子産物についても同様である。
本発明の核初期化因子は、上記の３種の遺伝子産物のほか、他の遺伝子産物を含むことができる。そのような遺伝子産物として、Ｓｏｘファミリー遺伝子の遺伝子産物を挙げることができる。Ｓｏｘファミリー遺伝子としては、例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、及びＳｏｘ１８、好ましくはＳｏｘ２を挙げることができる。少なくともＯｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４）、Ｍｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ−Ｍｙｃ）、及びＳｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２）の４種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む核初期化因子は初期化の効率の観点から本発明の好ましい態様であり、特に万能性の獲得のためにＳｏｘファミリー遺伝子の遺伝子産物を組み合わせることが好ましい場合がある。Ｓｏｘ２は初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子である（Ａ．Ａ．Ａｖｉｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１７，ｐｐ１２６−４０，２００３）。Ｓｏｘ２以外のＳｏｘファミリー遺伝子のＮＣＢＩアセッション番号は以下のとおりである。
また、Ｍｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物はサイトカインで置き換えることができる場合がある。サイトカインとしては、例えば、ＳＣＦ又はｂＦＧＦなどが好ましいが、これらに限定されることはない。
さらに好ましい態様として、上記の３種類の遺伝子産物、好ましくは上記の４種類の遺伝子産物に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をあげることができる。たとえば、ＴＥＲＴ遺伝子の遺伝子産物を含む因子と、下記の遺伝子：ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、及びＢｍｉ１からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子の遺伝子産物を含む因子を、組み合わせることを挙げることができる。ＴＥＲＴはＤＮＡ複製時における染色体末端テロメア構造維持のために必須であり、ヒトでは幹細胞や腫瘍細胞では発現するが、多くの体細胞においては発現が認められない（Ｉ．Ｈｏｒｉｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２，ｐｐ１８４３７−４４２，２００５）。ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、またはＢｍｉ１は、Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎと組み合わせることにより、ヒト体細胞の不死化をもたらすことが報告されている（Ｓ．Ａｋｉｍｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２３，ｐｐ１４２３−１４３３，２００５；Ｐ．Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，ｐｐ４０４−４１４，２０００）。これらの因子は、特にヒト細胞からｉＰＳ細胞を誘導する場合において極めて有用である。ＴＥＲＴおよびＢｍｉ１遺伝子のＮＣＢＩアセッション番号は以下のとおりである。
さらに、下記の群：Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、及びβ−ｃａｔｅｎｉｎからなる群から選ばれる遺伝子のうちの１種又は２種以上の遺伝子産物を組み合わせてもよい。初期化の効率の観点から特に好ましい態様として、Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、及びβ−ｃａｔｅｎｉｎの遺伝子産物を上記４種類の遺伝子産物と組み合わせた合計１０種類の遺伝子産物を含む核初期化因子を挙げることができる。Ｆｂｘ１５（Ｙ．Ｔｏｋｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２３，ｐｐ２６９９−７０８，２００３）、Ｎａｎｏｇ（Ｋ．Ｍｉｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３，ｐｐ６３１−４２，２００３）、ＥＲａｓ（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｎａｔｕｒｅ，４２３，ｐｐ５４１−５，２００３）、及びＥＣＡＴ１５−２（Ａ．Ｂｏｒｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３０，ｐｐ１６７３−８０，２００３）はＥＳ細胞特異的発現遺伝子であり、Ｔｃｌ１はＡｋｔの活性化に関与しており（Ａ．Ｂｏｒｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３０，ｐｐ１６７３−８０，２００３）、β−ｃａｔｅｎｉｎはＷｎｔシグナル伝達経路の重要な構成因子であり、多能性維持に関与しているとの報告もある（Ｎ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１０，ｐｐ５５−６３，２００４）。
さらに、本発明の核初期化因子は、例えば、下記の群：ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌｌ４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、及びＧｒｂ２からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子の遺伝子産物を含んでいてもよい。ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、及びＥＣＡＴ１５−１はＥＳ細胞特異的発現遺伝子であり（Ｋ．Ｍｉｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３，ｐｐ６３１−４２，２００３）、Ｄｎｍｔ３ＬはＤＮＡメチル化酵素関連因子であり、Ｓｏｘ１５は初期発生過程で発現し転写因子をコードする一群の遺伝子である（Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８０，ｐｐ２４３７１−９，２００５）。Ｆｔｈｌ１７はＦｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ １７をコードしており（Ａ．ｃｏｌＬｏｒｉｏｔ，Ｔ．Ｂｏｏｎ，Ｃ．Ｄｅ Ｓｍｅｔ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０５，ｐｐ３７１−６，２００３）、Ｓａｌｌ４は胚性幹細胞で高発現するＺｎフィンガータンパク質をコードしており（Ｊ．Ｋｏｈｌｈａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，９８，ｐｐ２７４−７，２００２）、Ｒｅｘ１はＯｃｔ３／４の下流にある転写因子をコードしている（Ｅ．Ｂｅｎ−Ｓｈｕｓｈａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．Ｇｕｄａｓ，Ｙ．Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１８，ｐｐ１８６６−７８，１９９８）。ＵＴＦ１はＯｃｔ３／４の下流に位置する転写補助因子であり、これを抑制するとＥＳ細胞の増殖を抑制するとの報告がある（Ａ．Ｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１７，ｐｐ２０１９−３２，１９９８）。Ｓｔａｔ３は細胞増殖・分化のシグナル因子であり、Ｓｔａｔ３の活性化によりＬＩＦが働き、多能性維持に重要な役割を果たしている（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｔ．Ｂｕｒｄｏｎ，Ｉ．Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１２，ｐｐ２０４８−６０，１９９８）。Ｇｒｂ２は細胞膜に存在するさまざまな成長因子受容体とＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードとの間を仲介するタンパク質をコードしている（Ａ．Ｍ．Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９５，ｐｐ７９３−８０３，１９９８）。
もっとも、本発明の核初期化因子に含むことができる遺伝子産物は上記に具体的に説明した遺伝子の遺伝子産物に限定されることはない。本発明の核初期化因子には、核初期化因子として機能することができる他の遺伝子産物のほか、分化、発生、又は増殖などに関係する因子あるいはその他の生理活性を有する因子を１又は２以上含むことができ、そのような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。核初期化因子として機能することができる他の遺伝子産物は、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの３種の遺伝子のうち１種又は２種のみを発現させた体細胞を用い、この細胞に対して核初期化を誘導することができる遺伝子産物をスクリーニングすることによって特定することができる。本発明により、新たな核初期化因子のスクリーニング方法として上記のスクリーニング方法も提供される。
また、本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物は、例えば上記遺伝子から産生されるタンパク質自体のほか、該タンパク質とその他のタンパク質又はペプチドなどとの融合遺伝子産物の形態であってもよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質やヒスチジンタグなどのペプチドとの融合遺伝子産物を用いることもできる。また、ＨＩＶウイルスに由来するＴＡＴペプチドとの融合タンパク質を調製して用いることにより、細胞膜からの核初期化因子の細胞内取り込みを促進させることができ、遺伝子導入などの煩雑な操作を回避して、融合タンパク質を培地に添加するだけで初期化を誘導することが可能になる。このような融合遺伝子産物の調製方法は当業者によく知られているので、当業者は目的に応じて適宜の融合遺伝子産物を容易に設計して調製することが可能である。
本発明の核初期化因子を用いて体細胞の核を初期化して誘導多能性幹細胞を得ることができる。本明細書において「誘導多能性幹細胞」とはＥＳ細胞に近い性質を有する細胞のことであり、より具体的には、未分化細胞であって多能性及び増殖能を有する細胞を包含するが、この用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を調製する方法については国際公開ＷＯ２００５／８０５９８に説明されており（上記公報においてはＥＳ様細胞という用語が用いられている）、誘導多能性幹細胞の分離手段についても具体的に説明されている。従って、当業者は上記刊行物を参照することにより、本発明の核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を容易に調製することが可能である。
本発明の核初期化因子を用いて体細胞から誘導多能性幹細胞を調製する方法は特に限定されず、体細胞及び誘導多能性幹細胞が増殖可能な環境において核初期化因子が体細胞と接触可能であれば、いかなる方法を採用してもよい。例えば、本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物を培地中に添加してもよく、あるいは本発明の核初期化因子を発現可能な遺伝子を含むベクターを用いて該遺伝子を体細胞に導入するなどの手段を採用してもよい。このようなベクターを用いる場合には、ベクターに２種以上の遺伝子を組み込んでそれぞれの遺伝子産物を体細胞において同時に発現させてもよい。初期化すべき体細胞において本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物の１種又は２種以上がすでに発現されている場合には、本発明の核初期化因子から該遺伝子産物を除くこともできるが、このような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。
本発明の核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を調製するにあたり、初期化すべき体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成熟した体細胞を用いてもよい。誘導多能性幹細胞を疾病の治療に用いる場合には、患者から分離した体細胞を用いることが望ましく、例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞などを用いることができる。本発明の方法により培地中に出現した誘導多能性幹細胞を選択する方法も特に限定されず、例えば、マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子などを用いて薬剤耐性を指標として誘導多能性幹細胞を分離するなどの周知の手段を適宜採用できる。ＥＳ細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地又はその性質を維持することができない培地は当業界で種々知られており、適宜の培地を組み合わせて用いることにより、誘導多能性幹細胞を効率よく分離することができる。分離された誘導多能性幹細胞の分化能及び増殖能はＥＳ細胞について汎用されている確認手段を利用することにより当業者が容易に確認可能である。
本発明の方法により調製される誘導多能性幹細胞の用途は特に限定されず、ＥＳ細胞を利用して行われているあらゆる試験・研究やＥＳ細胞を用いた疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた誘導多能性幹細胞をレチノイン酸、ＥＧＦなどの増殖因子、又はグルココルチコイドなどで処理することにより、所望の分化細胞（例えば神経細胞、心筋細胞、血球細胞など）を誘導することができ、そのようにして得られた分化細胞を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。もっとも、本発明の誘導多能性幹細胞の用途は上記の特定の態様に限定されることはない。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：初期化因子の選択
初期化因子を同定するためには初期化現象を容易に観察する実験系が必要である。実験系としてＦｂｘ１５遺伝子座にβｇｅｏ（ベータガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子）をノックインしたマウスを利用した。マウスＦｂｘ１５遺伝子はＥＳ細胞や初期胚といった分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。しかしマウスＦｂｘ１５遺伝子にβｇｅｏをノックインし、Ｆｂｘ１５の機能を欠失したホモ変異マウスにおいては、分化多能性や発生を含めて異常な表現型は観察されなかった。このマウスにおいては、βｇｅｏがＦｂｘ１５遺伝子のエンハンサーやプロモーターにより発現制御される。すなわち、分化した体細胞ではβｇｅｏは発現せず、Ｇ４１８に感受性を示す。一方、βｇｅｏをノックインしたホモ変異ＥＳ細胞は極めて高濃度（１２ｍｇ／ｍｌ以上）のＧ４１８に耐性を示す。この現象を利用し、体細胞の初期化を可視化する実験系を構築した。
上記実験系において、まずβｇｅｏをノックインしたホモ変異マウスの胎児（受精後１３．５日）から線維芽細胞（Ｆｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦ）を単離した。ＭＥＦはＦｂｘ１５遺伝子を発現しないため、βｇｅｏも発現せず、Ｇ４１８に感受性を示す。一方、このＭＥＦと遺伝子操作を加えていないＥＳ細胞（やはりＧ４１８に感受性を示す）を融合させると、ＭＥＦの核が初期化する結果、βｇｅｏが発現してＧ４１８耐性となる。すなわち、この実験系により初期化現象をＧ４１８耐性に置き換えて可視化できる（国際公開ＷＯ ２００５／８０５９８）。上記実験系を用いて初期化因子の探索を行ない（図１）、初期化因子の候補としてＥＳ細胞で特異的な発現を示す遺伝子、及びＥＳ細胞の分化多能性維持における重要な役割が示唆される遺伝子を合計２４種類選択した。これらの遺伝子を下記の表４及び表５に示す。なお＃２１のβ−ｃａｔｅｎｉｎ及び＃２２のｃ−Ｍｙｃに関しては活性型の変異体（ｃａｔｅｎｉｎ：Ｓ３３Ｙ，ｃ−Ｍｙｃ：Ｔ５８Ａ）を用いた。
これらの遺伝子のｃＤＮＡをレトロウイルスベクターｐＭＸ−ｇｗにＧａｔｅｗａｙテクノロジーにより挿入した。まず２４遺伝子を一つずつＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦに感染させ、その後、ＥＳ細胞培養条件でＧ４１８選択を行った。しかしＧ４１８耐性コロニーは一つも得られなかった。次に、全２４遺伝子のレトロウイルスを同時にＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦに感染させた。ＥＳ細胞培養条件でＧ４１８選択を行ったところ、複数の薬剤耐性コロニーが得られた。これらのコロニーを単離し培養を継続した。これらの細胞は長期間にわたって培養が可能であり、またＥＳ細胞に類似した形態を示すことが分かった（図２）。図中、ｉＰＳ細胞は誘導多能性幹細胞（ＥＳ様細胞、ＥＳ−ｌｉｋｅ細胞、ＥＳＬ細胞とも呼ぶ）、ＥＳは胚性幹細胞を示し、ＭＥＦは分化細胞（胎児線維芽細胞）を示す。
マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討したが、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４などの未分化マーカーが発現していた（図３）。Ｎａｎｏｇの発現はＥＳ細胞に近いが、Ｏｃｔ３／４の発現はＥＳ細胞より低いことがわかった。また、ＤＮＡメチル化状態をバイサルファイトシークエンス法で確認したが、Ｎａｎｏｇ遺伝子やＦｂｘ１５遺伝子はＭＥＦにおいて高メチル化状態にあるが、ｉＰＳ細胞においては脱メチル化されていることがわかった（図４）。インプリンティング遺伝子であるＩＧＦ２遺伝子はＭＥＦとｉＰＳ細胞の両者で約５０％がメチル化されていた。Ｆｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦを採取した受精後１３．５日の始原生殖細胞においてはインプリンティング記憶が消去されＩＧＦ２遺伝子はほぼ完全に脱メチル化されていることが知られているので、ｉＰＳ細胞はＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦに混入していた始原生殖細胞に由来するものではないと結論された。以上の結果より、２４種類の因子の組み合わせにより、分化細胞（ＭＥＦ）をＥＳ細胞に近い状態に初期化誘導できることが示された。
次に、２４種類の遺伝子の全てが初期化のために必要であるか否かを検討した。１遺伝子ずつ除外した２３遺伝子をＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦに感染させた。その結果、１０遺伝子については、それを除外した時に、コロニーの形成が阻害されることがわかった（図５：遺伝子の番号は表４に示した遺伝子の番号に対応しており、＃３、＃４、＃５、＃１１、＃１４、＃１５、＃１８、＃２０、＃２１、及び＃２２の１０種類の遺伝子である）。これらの１０遺伝子を同時にＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦに感染させたところ、２４遺伝子を同時に感染させた場合に比して有意に効率よくＧ４１８耐性コロニーが得られた。
さらに、この１０遺伝子から１遺伝子ずつ除外した９遺伝子をＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦに感染させた。その結果、４種の遺伝子（＃１４、＃１５、＃２０、又は＃２２）をそれぞれ除外した場合にはＧ４１８耐性のｉＰＳ細胞コロニーが形成されないことがわかった（図６）。従って、１０遺伝子のうち、これら４種の遺伝子が初期化誘導にとって特に重要な役割を果たすことが示唆された。
例２：４種類の遺伝子群の組合せによる初期化誘導
１０種類の遺伝子群のなかで特に重要性が示唆された４遺伝子により体細胞の初期化の誘導が可能であるか否かを検討した。Ｆｂｘ１５遺伝子にβｇｅｏをノックインしたＭＥＦ細胞に上記１０種類の遺伝子の組み合わせ、上記４種類の遺伝子の組み合わせ、上記４種類のうち３種類のみの遺伝子の組み合わせ、及び上記４種類のうち２種類のみの遺伝子の組み合わせを用いて、これらの遺伝子群をレトロウイルスにより体細胞に導入した。その結果、４種類の遺伝子を導入した場合には１６０個のＧ４１８耐性コロニーが得られた。この結果は、１０種類の遺伝子を導入した場合の結果（１７９コロニー）とほぼ同数であったが、４遺伝子導入の場合には１０遺伝子導入の場合に比べてコロニーが小さかった。また、これらのコロニーを継代培養した場合、ｉＰＳ細胞の形態を示したコロニーは１０遺伝子導入の場合に１２クローン中９クローンであったのに対して、４遺伝子導入の場合には１２クローン中７クローンと若干少ない傾向にあった。４遺伝子としては、マウス由来のもの、ヒト由来のもの、どちらでもほぼ同じ数のｉＰＳ細胞が得られた。
上記４遺伝子の中から選択された３遺伝子を導入した場合、ある組合せ（＃１４、＃１５及び＃２０）では３６個の扁平なコロニーが得られたが、継代培養してもｉＰＳ細胞は観察されなかった。別の組合せ（＃１４、＃２０、及び＃２２）では５４個の小さいコロニーが得られた。これらのうち、比較的大きいコロニーを６つ継代培養したところ、６クローンのすべてでＥＳ細胞に類似した細胞が得られた。しかしながら、ＥＳ細胞に比べると細胞同士や培養シャーレへの接着が弱いと思われた。また細胞増殖の速度も４遺伝子を導入した場合に比べて遅かった。また４遺伝子中の3遺伝子の他の２通りの組み合わせではそれぞれ１つずつコロニーが形成されたが、継代培養しても細胞の増殖は認められなかった。４遺伝子のなかから選択された２遺伝子の組み合わせ（６通り）では、いずれの場合にもＧ４１８耐性コロニーが１つも形成されなかった。以上の結果を図７に示す。
また、図１０にはＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果を示した。方法の詳細は以下のとおりである。Ｆｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦに３遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２ ｍｉｎｕｓと表記）、４遺伝子（３遺伝子にＳｏｘ２を加えたもの、４ＥＣＡＴと表記）、１０遺伝子（４遺伝子に表４の＃３、＃４、＃５、＃１１、＃１８、＃２１を加えたもの、１０ＥＣＡＴと表記）を導入し樹立したｉＰＳ細胞、Ｆｂｘ１５遺伝子にβｇｅｏをノックインした成体マウスの尾部皮膚より樹立した線維芽細胞に１０遺伝子を導入して樹立したｉＰＳ細胞（１０ＥＣＡＴ Ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔと表記）、マウスＥＳ細胞及び遺伝子導入していないＭＥＦ細胞よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、ＤＮａｓｅＩ処理によりゲノムＤＮＡの混入を除去した。逆転写反応によりＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作成し、ＰＣＲによりＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現を検討した。なおＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓに関しては導入したレトロウイルスからではなく、内在性遺伝子からの転写産物のみを増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマー配列を表６に示す。
この図に示された結果から、３遺伝子を導入した場合、ＥＲａｓやＦｇｆ４は効率よく発現誘導されるが、多能性維持に必須の因子であるＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇの誘導は起こらないか、おこっても非常に弱いことがわかった。一方、４遺伝子を導入した場合、Ｏｃｔ３／４とＮａｎｏｇが比較的強く誘導されているクローンが調べた４クローン中で１クローン（＃７）が存在した。さらに１０遺伝子を導入した場合は、調べた５クローン中、３クローンにおいて、Ｏｃｔ３／４とＮａｎｏｇの強い誘導が認められた。
これらの結果から、初期化のためには少なくとも３遺伝子の組合せ（＃１４、＃２０、及び＃２２）が必須であり、それらの３種の遺伝子を含む４遺伝子群及び１０遺伝子群では遺伝子の数を増やすにつれて初期化の効率が上昇することが明らかとなった。
例３：初期化した細胞の多分化能の解析
樹立したｉＰＳ細胞の分化多能性を評価するため、２４因子、１０因子、および４因子で樹立されたｉＰＳ細胞をヌードマウスの皮下に移植した。その結果、ＥＳ細胞と同様の大きさの腫瘍が全例で形成された。組織学的に見ると腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、軟骨組織、神経組織、筋肉組織、脂肪組織、および腸管様組織（図８）が認められたことから、ｉＰＳ細胞の多能性が証明された。一方、３因子で樹立した細胞をヌードマウスに移植すると腫瘍は形成されたが、組織学的には未分化細胞からのみ形成されていた。したがって、分化多能性の誘導のためには、Ｓｏｘファミリーが必須であることがわかった。
例４：成体マウスの尾部に由来する線維芽細胞の初期化
マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）で同定した４因子をＦｂｘ１５遺伝子にβｇｅｏをノックインし、さらに全身で緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を発現する成体マウスの尾部に由来する線維芽細胞に導入した。その後、フィーダー細胞上でＥＳ細胞培養条件と同様の条件で培養してＧ４１８による選択を行った。薬剤選択開始後約２週間で複数のｉＰＳ細胞コロニーが得られた。これらの細胞をヌードマウスの皮下に移植すると三胚葉系の様々な組織からなる奇形腫を形成した。また成体皮膚線維芽細胞に由来するｉＰＳ細胞を胚盤胞に移植し、偽妊娠マウスの子宮に移植したところ、受精後１３．５日目の胚において、全身でＧＦＰ陽性細胞の分布しているものが認められた（図９）。これはｉＰＳ細胞が多能性を有しており、マウス胚発生に寄与できることを示している。この結果は、同定した因子群が胎児期の体細胞だけではなく成熟したマウスの体細胞に対しても初期化を誘導する能力のあることを示している。成体皮膚由来の細胞で初期化誘導できることは実用上極めて重要である。
例５
ｉＰＳ細胞樹立におけるサイトカインの影響を検討した。フィーダー細胞（ＳＴＯ細胞）に塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）又は幹細胞因子（ＳＣＦ）の発現ベクター（ｐＭＸレトロウイルスベクター）を導入し、これらのサイトカインを恒常的に発現する細胞を樹立した。Ｆｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}マウス由来ＭＥＦ（５０万個／１００ｍｍディッシュ）をこれらのＳＴＯ細胞上で培養し、４因子を導入後Ｇ４１８による選択を行ったところ、通常のＳＴＯ細胞上で培養した時と比べて、コロニー形成数がｂＦＧＦ（図１１）、ＳＣＦ（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）を産生するＳＴＯ細胞上では２０倍以上上昇した。またｃ−Ｍｙｃ以外の３因子を導入しても通常のＳＴＯ細胞上ではｉＰＳ細胞コロニーは生成されなかったが、ｂＦＧＦ（図１１）、ＳＣＦ（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）を産生するＳＴＯ細胞上では、コロニーの形成が認められた。これらの結果から、サイトカインの刺激により、ＭＥＦからのｉＰＳ細胞の樹立効率が上昇すること、及びｃ−Ｍｙｃに換えてサイトカインを用いることにより核初期化が可能になることが明らかとなった。
例６
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２遺伝子にはすべてファミリー遺伝子（表１及び２）が存在する。そこで４遺伝子に換えてファミリー遺伝子によってもｉＰＳ細胞が樹立できるかを検討した。表７に２回の実験の結果を合わせたものを示す。Ｓｏｘファミリーについては、Ｓｏｘ１はＧ４１８耐性コロニー数及びｉＰＳ細胞樹立効率とともにＳｏｘ２と同程度であった。Ｓｏｘ３はＧ４１８耐性コロニー数はＳｏｘ２の１０分の１程度であったが、ひろったコロニーからのｉＰＳ細胞樹立効率はＳｏｘ２よりむしろ高かった。Ｓｏｘ１５はＧ４１８耐性コロニー数及びｉＰＳ細胞樹立効率とともにＳｏｘ２より低かった。Ｓｏｘ１７はＧ４１８耐性コロニーはＳｏｘ２と同程度であったが、ｉＰＳ細胞樹立効率は低かった。Ｋｌｆファミリーについては、Ｋｌｆ２はＫｌｆ４より少ないＧ４１８耐性コロニーが生じたが、ｉＰＳ細胞の樹立効率は同程度であった。Ｍｙｃファミリーについては、まず野生型のｃ−ＭｙｃがＴ５８Ａ変異体とＧ４１８耐性コロニー数、ｉＰＳ細胞樹立効率の両者において同程度であることを確認した。さらにＮ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃ（ともに野生型）は、ともにｃ−ＭｙｃとＧ４１８耐性コロニー数、ｉＰＳ細胞樹立効率の両者において同程度であった。
例７
Ｆｂｘ１５−βｇｅｏ以外のレポーターでｉＰＳ細胞が樹立できるかを検討した。まずＮａｎｏｇ遺伝子を中央部に含む大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）を単離し、大腸菌内の組み換えにより、ＧＦＰ遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子をノックインした（図１２Ａ）。ついで同改変ＢＡＣをＥＳ細胞に導入し、未分化状態特異的にＧＦＰ陽性となることを確認した（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。ついで同ＥＳ細胞のマウス胚盤胞に移植することによりキメラマウスを経てトランスジェニックマウスを作出した。このマウスにおいてはＧＦＰ陽性細胞は胚盤胞の内部細胞塊や受精後１３．５日胚の生殖腺において特異的に認められた（図１２Ｂ）。受精後１３．５日胚（ＤＢＡ、１２９及びＣ５７ＢＬ／６マウスの雑種）から生殖腺を除去し、ＭＥＦを単離した。フローサイトメトリーにより、単離したＭＥＦはＧＦＰ陰性であることを確認した（図１３）。このＭＥＦに４因子をレトロウイルスで導入し、ピューロマイシンによる選択を行ったところ、複数の耐性コロニーが得られた。その中の約１０〜２０％のみがＧＦＰ陽性であった。ＧＦＰ陽性コロニーを継代培養するとＥＳ細胞に類似した形態（図１４）や増殖（図１５）を示した。また遺伝子発現を見るとＦｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}のＭＥＦからＧ４１８選択により単離したｉＰＳ細胞より、さらにＥＳ細胞に近い発現パターンであることがわかった（図１６）。この細胞をヌードマウスに移植すると奇形腫が形成されたことからｉＰＳ細胞であることが確認された（図１７）。さらにＮａｎｏｇ−ＧＦＰ選択によるｉＰＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に移植することによりキメラマウスが誕生した（図１８）。さらにこのキメラマウス同士を交配させることによりジャームライントランスミッションが確認された（図１９）。このＮａｎｏｇ−ＧＦＰ選択により樹立されたよりＥＳ細胞に近いｉＰＳ細胞においては、レトロウイルスからの４因子の発現はほぼ完全にサイレンシングを受けており、内在性のＯｃｔ３／４やＳｏｘ２により自己複製が維持されていることが示唆された。
例８
１０ｃｍコンフルエントのｉＰＳ細胞を、トリプシン処理し、ＥＳ細胞用培地に懸濁した（ＳＴＯ細胞は懸濁後１０〜２０分ゼラチンコートしたディッシュに接着させることによって除去した）。２×１０^６の細胞を、ＨＥＭＡ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）でコーティングした大腸菌培養用ディッシュで４日間浮遊培養し、Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ（ＥＢ）を形成させた（ｄａｙ１−４）。ＥＢ形成４日目（ｄａｙ４）に、ＥＢを全量１０ｃｍ組織培養用ディッシュに移しＥＳ細胞用培地で２４時間培養して接着させた。２４時間後（ｄａｙ５）にＩＴＳ／ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ含有培地に交換した。７日間培養し（２日毎に培地交換を行う）、ｎｅｓｔｉｎ陽性細胞を選択した（無血清下で培養すると、他の系譜の細胞がある程度死んでいく）（ｄａｙ５−１２）。次にＡ２Ｂ５陽性細胞の誘導を行った。７日後（ｄａｙ１２）にトリプシン処理して細胞をばらばらにし、残存するＥＢは除去した。１×１０^５個の細胞をｐｏｌｙ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ／ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎがコーティングされている２４ウェルプレートに撒き、Ｎ２／ｂＦＧＦ含有培地で四日間培養した（二日毎に培地交換（ｄａｙ１２−１６）。四日後（ｄａｙ１６）にＮ２／ｂＦＧＦ／ＥＧＦ含有培地へ交換し、四日間培養した（二日毎に培地交換）（ｄａｙ１６−２０）。四日後（ｄａｙ２０）にＮ２／ｂＦＧＦ／ＰＤＧＦ含有培地に交換して、四日間培養した（二日毎に培地交換）（ｄａｙ２０−２４）。この期間（ｄａｙ１２−２４）に細胞が増えすぎてコンフルエントになった場合は随時継代し、１〜２×１０^５個の細胞を撒いた。（継代時期によって数は変更する）。四日後（ｄａｙ２４）にＮ２／Ｔ３培地に交換して、７日間培養し（ｄａｙ２４−３１）し、２日毎に培地交換を行った。ｄａｙ３１に固定し、免疫染色した。その結果、ｉＰＳ細胞から、βＩＩＩチュブリン陽性の神経細胞、０４陽性のオリゴデンドロサイト、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイトへの分化が確認された（図２０）。
例９
Ｆｂｘ１５−βｇｅｏノックインマウス以外の任意のマウス体細胞からｉＰＳ細胞を樹立するために、薬剤選択を用いない樹立方法を開発した。１０ｃｍディッシュ（ＳＴＯフィーダー細胞上）にマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を、これまでより少数（１万、５万又は１０万個）培養し、レトロウイルスによりコントロールＤＮＡ又は４因子を導入した。ＥＳ細胞培地にて２週間培養（Ｇ４１８選択無し）行ったところ、コントロールＤＮＡを導入したディッシュではコロニー形成が認められなかったが、４因子を導入したディッシュにおいては形質転換したと思われる扁平なコロニー加えて、複数のコンパクトなコロニーが形成された（図２１）。これらから２４コロニーをピックアップし培養を続けたところ、ＥＳ細胞様の形態が認められた。その遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにて検討したところ、７クローンにおいてＥＳ細胞マーカーであるＥｓｇ１の発現が認められた。またクローン４においてはＮａｎｏｇ、ＥＲａｓ、ＧＤＦ３、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２などの多くのＥＳ細胞マーカーの誘導が認められたことからｉＰＳ細胞であると考えられた（図２２）。以上の結果より、ｉＰＳ細胞樹立にはＦｂｘ１５−βｇｅｏノックインなどを用いた薬剤選択は必須でなく、任意のマウス由来体細胞からｉＰＳ細胞を樹立できることが示された。本技術により疾患モデルマウスの体細胞からもｉＰＳ細胞が樹立できる可能性が示された。
例１０
ｉＰＳ細胞を誘導する細胞として、線維芽細胞以外の細胞である、肝細胞及び胃粘膜細胞を検討した。Ｆｂｘ１５^{βｇｅｏ／βｇｅｏ}マウスの肝臓から肝細胞を還流により単離した。この肝細胞に４因子をレトロウイルスで投与し、Ｇ４１８による選択を行ったところ複数のｉＰＳ細胞コロニーが得られた。ＤＮＡマイクロアレーによる遺伝子発現パターン解析の結果、肝臓由来のｉＰＳ細胞は皮膚線維芽細胞や胎児線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞より、さらにＥＳ細胞に類似していることが明らかとなった。胃粘膜細胞からも、肝細胞からと同様にｉＰＳ細胞が得られた。
例１１
ＰＤ９８０５９はＭＡＰキナーゼの阻害薬であり、多くの分化細胞においては増殖を抑制するが、ＥＳ細胞においては、未分化状態維持と増殖を促進することが知られている。そこでｉＰＳ細胞樹立におけるＰＤ９８０５９の効果を検討した。Ｎａｎｏｇ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏの選択マーカーをもつマウスから樹立したＭＥＦに４因子をレトロウイルスで投与し、ピューロマイシンによる選択を行った。ＰＤ９８０５９を投与しない場合、得られたｉＰＳ細胞コロニーの中で、ＧＦＰ陽性の割合は８％であった。一方、ＰＤ９８０５９（最終濃度２５μＭ）をレトロウイルス感染の翌日から持続的に投与した群では、得られたコロニーの４５％がＧＦＰ陽性であった。これはＰＤ９８０５９がＧＦＰ陽性の、よりＥＳ細胞に近いｉＰＳ細胞の増殖を促進するが、ＧＦＰ陰性のｉＰＳ細胞や、分化細胞の増殖は抑制するためであると考えられた。このことからＰＤ９８０５９は、よりＥＳ細胞に近いｉＰＳ細胞の樹立や、薬剤選択を用いないｉＰＳ細胞の樹立に利用できることが示された。
例１２
胎児由来のＨｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＨＤＦ）にマウスエコトロピックウイルスレセプターであるｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ ７（Ｓｌｃ７ａ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７５１３）をレンチウイルスで発現させた細胞に、マウスＯｃｔ３／４遺伝子プロモーター下流に赤色蛍光蛋白質遺伝子を、およびＰＧＫプロモーター下流にハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドをヌクレオフェクションで導入した。ハイグロマイシンによる選択を行い、安定発現株を樹立した。８０００００個の細胞をマイトマイシン処理したＳＴＯ細胞の上にまき、翌日レトロウイルスによりＯｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ（いずれもヒト由来）を導入した。３週間後に得られたコロニー（図２３左）を２４個拾い、ＳＴＯ細胞を播種した２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移して培養した。２週間後に増えてきた１クローンをＳＴＯ細胞を播種した６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに継代して培養した結果、ＥＳ細胞に形態上において類似した細胞が得られ（図２３右）、ｉＰＳ細胞であることが示唆された。培地は常にマウスＥＳ細胞用培地を用いた。
例１３
ヒト成体皮膚線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）にレンチウイルスでＳｌｃ７ａ１（マウスレトロウイルス受容体）を導入した細胞を８０００００個のフィーダー細胞（マイトマイシン処理ＳＴＯ細胞）上にまき、以下の組み合わせでレトロウイルスにより遺伝子を導入した。
１．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴ，ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ
２．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ６
３．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ７
４．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７
５．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴ，Ｂｍｉ１
（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴはヒト由来、Ｂｍｉ１はマウス由来）
マウスＥＳ細胞の培養条件下で、薬剤選択無しで培養を続けたところ、１の組み合わせで因子を導入したディッシュにおいて、ウイルス感染８日後において、ｉＰＳ細胞と思われるコロニーが出現した（図２４）。他の組み合わせ（２から５）においても、１の組み合わせの場合ほどは明瞭ではないが、ｉＰＳ細胞様のコロニーが出現した。４因子のみを導入しても、全くコロニーは出現しなかった。

本発明により提供された核初期化因子を用いることにより、胚やＥＳ細胞を利用せずに簡便かつ再現性よく分化細胞核の初期化を誘導することができ、ＥＳ細胞と同様の分化及び多能性や増殖能を有する未分化細胞である誘導多能性幹細胞を樹立することができる。
［配列表］

Claims (5)

1. 下記の（１）、（２）、（３）および（４）の遺伝子：
   （１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、
   （２）Ｋｌｆ２遺伝子およびKｌｆ４遺伝子から選択される遺伝子、
   （３）ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、Ｎ−Ｍｙｃ遺伝子、Ｌ−Ｍｙｃ遺伝子およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子の変異体であるＴ５８Ａ遺伝子から選択される遺伝子、および
   （４）Ｓｏｘ１遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｓｏｘ３遺伝子、Ｓｏｘ１５遺伝子およびＳｏｘ１７遺伝子から選択される遺伝子、
   を体細胞に導入する工程を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法であって、初期化される体細胞において前記遺伝子のいずれかが発現している場合には、該遺伝子は導入する遺伝子から除かれていてもよい、前記製造方法（ただし、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を体細胞に導入する場合を除く）。
2. 下記の（１）、（２）および（３）の遺伝子：
   （１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、
   （２）Ｋｌｆ２遺伝子およびＫｌｆ４遺伝子から選択される遺伝子、および
   （３）Ｓｏｘ１遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｓｏｘ３遺伝子、Ｓｏｘ１５遺伝子およびＳｏｘ１７遺伝子から選択される遺伝子、
   が導入された体細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下で培養する工程を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法であって、初期化される体細胞において前記遺伝子のいずれかが発現している場合には、該遺伝子は導入されていなくてもよい、前記製造方法（ただし、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子が導入された体細胞は前記体細胞から除かれる）。
3. 下記の工程（１）および（２）：
   （１）請求項１記載の製造方法により誘導多能性幹細胞を得る工程、及び
   （２）上記工程（１）で得られた誘導多能性幹細胞を分化誘導する工程、
   を含む、体細胞の製造方法。
4. 下記の工程（１）および（２）：
   （１）請求項２記載の製造方法により誘導多能性幹細胞を得る工程、及び
   （２）上記工程（１）で得られた誘導多能性幹細胞を分化誘導する工程、
   を含む、体細胞の製造方法。
5. 体細胞がヒト細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。