JP7785351B2

JP7785351B2 - 心筋細胞の精製方法

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Publication number: JP7785351B2
Application number: JP2022508445A
Authority: JP
Inventors: 善紀吉田; 礼田中; 幸造渡邉; 滋近藤; 誠之西本
Original assignee: Orizuru Therapeutics Inc
Current assignee: Orizuru Therapeutics Inc
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2025-12-15
Anticipated expiration: 2041-03-18
Also published as: EP4123016A4; CN115427552A; US20230212519A1; EP4123016A1; WO2021187602A1; JPWO2021187602A1

Description

本発明は、心筋細胞の製造方法および精製方法に関し、より詳細には、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いた心筋細胞の製造方法および精製方法に関する。

（発明の背景）
近年、心筋梗塞の発生率は減少してきてはいるものの、心筋梗塞を含む心疾患は世界中で依然として主な死亡原因である。重症心不全患者においては、心臓移植が現在唯一の治療法であるが、心臓移植はドナー不足という問題を抱えている。そこで、心筋細胞を用いた細胞治療が、心疾患を改善させる治療法として注目されてきている。また、心筋細胞を用いたインビトロでの薬効評価試験、あるいは薬剤安全性試験の確立にも着目されている。そのため、細胞治療やインビトロでの試験に用いることのできる均一な心筋細胞の安定的な供給が求められている。

均一な心筋細胞を安定的に提供する方法の１つとして、幹細胞または心筋前駆細胞から、心筋細胞を分化誘導する方法が挙げられ、効率的な心筋細胞への分化誘導法を確立するために、様々な努力がなされている。かかる分化誘導法として、ＥＧＦＲ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養させることで、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導を促進する方法（特許文献１）、人工多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導した後、該心筋細胞とＮｅｕｒｅｇｕｌｉｎ１のアンタゴニストまたはＥｒｂＢのアンタゴニストとを接触させることで、心筋細胞を成熟させる方法（特許文献２）、筋芽細胞などの未分化前駆細胞と脱アセチル化酵素阻害剤とを接触させることで、該未分化前駆細胞の分化誘導を促進する方法（特許文献３）、心筋前駆細胞などの成体の前駆細胞と、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤とを接触させることで、該前駆細胞の分化誘導を促進する方法（特許文献４）などが報告されている。また、幹細胞からの分化誘導過程を経ない方法についても報告されており、例えば、特許文献５には、線維芽細胞などの体細胞から、ダイレクトリプログラミングにより、心筋前駆細胞または心筋細胞を製造する方法が開示されている。

国際公開第2014/136519号米国公開第2010/0183565号国際公開第2003/033678号国際公開第2009/073618号国際公開第2015/038704号

本発明は、上記従来の方法とは異なる手段により、純度が高い心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法を提供することを課題とする。また、心筋細胞を含む細胞集団から、高純度で心筋細胞を精製する方法を提供することも課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、未分化細胞から心筋細胞への分化誘導を促進するのではなく、既に心筋細胞が含まれている細胞集団に、心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制する化合物、あるいは心筋細胞以外の細胞の数を減らす化合物を添加することで、該細胞集団中の心筋細胞の割合を増加させること、即ち心筋細胞を精製することができるのではないかとの着想を得た。そこで、まず、ｉＰＳ細胞と、ｉＰＳ細胞から分化誘導させた心筋細胞にそれぞれ化合物ライブラリーを添加することで、ｉＰＳ細胞の数を顕著に減らすが、心筋細胞に対しては影響が低い化合物をスクリーニングした。その結果、複数種類のＨＤＡＣ阻害剤が心筋細胞の純化作用を有する化合物の候補として挙がってきた。次に、該候補化合物を用いて、心筋細胞を含む胚様体を接触させたところ、首尾よく心筋細胞を純化できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
（１）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを含む細胞集団に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を接触させる工程、および
（２）該細胞集団を培養する工程、
を含む、方法。
［２］前記工程（１）の細胞集団とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との接触が、多能性幹細胞の分化誘導開始から７日目以降に行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記阻害剤が、クラスＩヒストン脱アセチル化酵素に対する阻害剤である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記阻害剤が、ＦＫ２２８、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡおよびＰａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］未分化細胞が混入する心筋細胞を含む細胞集団に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を接触させる工程を含む、該細胞集団から該未分化細胞を除去または低減する方法。
［７］前記未分化細胞が多能性幹細胞である、［６］に記載の方法。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の方法により得られた、心筋細胞を含む細胞集団。
［９］［８］に記載の細胞集団を含有してなる、細胞移植療法剤。
［１０］心筋細胞を精製する方法であって、
（１）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを含む細胞集団に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を接触させる工程、および
（２）該細胞集団を培養する工程、
を含む、方法。

本発明によれば、心筋細胞を高純度で含む細胞集団が提供される。かかる細胞集団は、心疾患に対する細胞移植療法に好適に用いることができる。また、心筋細胞を含む細胞集団から、高純度で心筋細胞を精製する方法、並びに心筋細胞を含む細胞集団から、心筋細胞以外の細胞（即ち、非心筋細胞）を減少させる方法も提供される。

試験例１の化合物スクリーニングにおける、未分化ｉＰＳ細胞（心筋レポーターｉＰＳ細胞株）と同ｉＰＳ細胞由来精製心筋細胞のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤処置後の細胞内ＡＴＰレベルを示す。試験例２におけるｉＰＳ細胞と同ｉＰＳ細胞由来心筋細胞のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤処置後の細胞内ＡＴＰレベルを示す。試験例３におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤処置後のＣｉＲＡ臨床用ｉＰＳ細胞由来心筋細胞のフローサイトメーター解析によるサルコメアα－アクチニン陽性細胞率を示す。試験例４における、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤処置後のｉＰＳ細胞由来心筋細胞のフローサイトメーター解析によるサルコメアα－アクチニン陽性細胞率を示す。試験例５における、化合物処理後の非心筋細胞率を示す（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞、ＳＭＣ：平滑筋様細胞、ＥＣ：内皮様細胞）。

（発明の詳細な説明）
１．心筋細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明は、心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法（以下、「本発明の製法」ともいう）を提供する。本発明の製法は、（１）心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを含む細胞集団に、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤を接触させる工程、および（２）該細胞集団を培養する工程、を含む。

本明細書において、「心筋細胞」とは、サルコメアα－アクチニン（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ α－Ａｃｔｉｎｉｎ）、心筋トロポニンＴおよびトロポニンIタイプ１（ＴＮＮＩ１）の内の少なくとも１つが陽性である細胞を意味し、好ましくは、サルコメアα－アクチニン陽性細胞である。また、典型的には、自己拍動能を有する心筋の細胞である。「心筋細胞以外の細胞」とは心筋細胞に該当しない細胞であり、具体的には、例えば、平滑筋細胞、内皮細胞、幹細胞（例：多能性幹細胞）、心筋前駆細胞などが挙げられる。

本明細書において、「陽性」とは、タンパク質または遺伝子が当該分野で公知の少なくともいずれかの手法による検出可能量で発現していることを意味する。タンパク質の検出は、抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質（例えば転写因子またはそのサブユニットなど）の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。遺伝子の検出は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、バイオチップ（例：マイクロアレイ）、ＲＮＡｓｅｑ等の核酸増幅方法および／または核酸検出方法を利用して行うことができる。タンパク質又は遺伝子の発現は、一般的な手法で判断することができ、例えばフローサイトメトリーを利用する場合には、タンパク質の発現が陰性の対照群での発現量と比較して、相対的に発現量が高い場合に、タンパク質が検出可能で発現していると判断できる。

本明細書において、「陰性」とは、タンパク質または遺伝子の発現量が、上記のような公知手法の全てあるいはいずれかによる検出下限値未満であることを意味する。タンパク質または遺伝子の発現の検出下限値は、各手法により異なり得るが、一般的な手法で判断できる。

本明細書において、「細胞集団」とは、同じ種類または異なる種類の２以上の細胞からなる集団を意味する。「細胞集団」は、同じ種類または異なる種類の細胞の一塊（mass）をも意味する。前記工程（１）で用いる心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを含む細胞集団は、多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養することにより製造することができる。従って、本発明の製法は、前記工程（１）の前に、工程（０）多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する工程、を含んでいてもよい。

本発明に用いる多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒＥｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ：ｎｔＥＳ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｇｅｒｍＬｉｎｅｓｔｅｍｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｓｔｒｅｓｓｅｎｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌ）が挙げられるが、好ましくはｉＰＳ細胞(より好ましくはヒトｉＰＳ細胞)である。上記多能性幹細胞がES細胞またはヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。上記多能性幹細胞は哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒト）由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。従って、本発明で用いる多能性幹細胞として最も好ましくは、ヒトｉＰＳ細胞である。

「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。人工多能性幹細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のHｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、ＮｉＰＳ－Ｂ２株、京都大学の２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、再生医療用ｉＰＳ細胞ストック等が挙げられる。

本明細書において、「体細胞」とは、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）を意味する。体細胞としては、特に限定されないが、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全な若しくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。

ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ＥＳ細胞は、マウスで1981年に発見され（M.J. Evans and M.H. Kaufman（1981）, Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（J.A. Thomson et al.（1998）,Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al.（1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A. Thomson et al.（1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall（1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えば、USP5,843,780; Thomson JA, et al.（1995）, Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848；Thomson JA, et al.（1998）, Science. 282:1145-1147； Suemori H. et al.（2006）, Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； Ueno M. et al.（2006）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； Suemori H. et al.（2001）, Dev. Dyn., 222:273-279; Kawasaki H. et al.（2002）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585； Klimanskaya I. et al.（2006）, Nature. 444:481-485などに記載されている。或いは、ＥＳ細胞は、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて樹立することもできるし（Chung Y. et al. (2008), Cell Stem Cell 2: 113-117）、発生停止した胚を用いて樹立することもできる（Zhang X. et al. (2006), Stem Cells 24: 2669-2676.）。「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ウィスコンシン大学、ＮＩＨ、理研、京都大学、国立成育医療研究センターおよびＣｅｌｌａｒｔｉｓ社などが樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえば、ヒトＥＳ細胞株としては、ＥＳＩＢｉｏ社が分譲するＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈが分譲するＨ１株、Ｈ９株等、理研が分譲するＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。

ｎｔＥＳ細胞（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒＥＳ細胞）は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Wakayama T. et al.（2001）, Science, 292:740-743; S. Wakayama et al.（2005）, Biol. Reprod., 72:932-936; Byrne J. et al.（2007）, Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒＥＳ）細胞である。ｎｔＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Cibelli J.B. et al.（1998）, Nature Biotechnol., 16:642-646）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（2008）, 実験医学, 26巻, 5号（増刊）, 47～52頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。

ｍＧＳ細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Kanatsu-Shinohara M. et al.（2003）Biol. Reprod., 69:612-616; Shinohara K. et al.（2004）, Cell, 119:1001-1012）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（2008）, 実験医学, 26巻, 5号（増刊）, 41～46頁, 羊土社（東京、日本））。

EG細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞である。ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立し得る（Matsui Y. et al.（1992）, Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al.（1992）, Nature, 359:550-551）。

Ｍｕｓｅ細胞は、生体に内在する非腫瘍性の多能性幹細胞であり、例えば、WO 2011/007900に記載された方法にて製造することができる。詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞がＭｕｓｅ細胞であり、ＳＳＥＡ－３およびＣＤ１０５が陽性である。

前記工程（０）は、多能性幹細胞を心筋細胞へと分化誘導できる限り特に制限されないが、例えば、多能性幹細胞を、心筋細胞分化用培地中で培養することで、心筋細胞へと分化誘導することができる。本発明の一態様において、前記工程（０）は、（０－１）多能性幹細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導する工程、および（０－２）該中胚葉系細胞を心筋細胞へと分化誘導する工程を含み得る。本明細書において、「心筋細胞分化用培地」とは、サイトカインなどの心筋細胞への分化誘導を促進する因子（以下、「心筋細胞分化誘導因子」と称することがある。）および基礎培地を含む培地を意味する。上記心筋細胞分化誘導促進因子には、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導過程における中間細胞（例えば、中胚葉系細胞など）への分化誘導に必要な因子も包含されるものとする。

本発明で用いる基礎培地としては、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（例：ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎ、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ）（味の素社）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＥＣＭ（ＰｒｉｍａｔｅＥＳＣｅｌｌＭｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（グラスゴー最小必須培地：ＧｌａｓｇｏｗＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地：Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、１９９培地、イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、フィッシャー培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓｍｅｄｉｕｍ）、およびこれらの混合培地などが包含される。

基礎培地には、ＲＯＣＫ阻害剤（例：Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、ＳＲ３６７７、ＧＳＫ２６９９６２、Ｈ－１１５２、Ｗｆ－５３６等）、血清（例：ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト血清、ウマ血清等）若しくは血清代替物、インスリン、各種ビタミン（例：ビタミンＣ類（例：アスコルビン酸））、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸等の各種アミノ酸、２－メルカプトエタノール、チオグリセロール（例：α－モノチオグリセロール（ＭＴＧ））、各種サイトカイン、幹細胞因子（ＳＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ））、アクチビンなど）、各種ホルモン、各種増殖因子（白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ－β等）、各種細胞外マトリックス、各種細胞接着分子、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン等の抗生物質、フェノールレッド等のｐＨ指示薬などを適宜添加することができる。血清代替物として、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、ＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＩＴＳ－サプリメントおよびこれらの混合物などが包含される。

本発明においてビタミンＣ類とは、Ｌ－アスコルビン酸およびその誘導体を意味し、Ｌ－アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンＣとなるものを意味する。本発明に用いるアスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンＣ（例：アスコルビン酸－２リン酸）、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンＣエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビルおよびアスコルビン酸－２リン酸－６パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンＣ（例：Ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であり、例えば、リン酸－Ｌ－アスコルビン酸Ｎａまたはリン酸－Ｌ－アスコルビン酸Ｍｇなどのリン酸－Ｌ－アスコルビン酸塩が挙げられる。

人工多能性幹細胞または胚様体の培養は、接着培養または浮遊培養であってもよい。接着培養の場合、細胞外基質成分でコーティングした培養容器を用いて行ってもよく、またフィーダー細胞と共培養してもよい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、例えば、線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＳＴＯ）など）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線など）照射や抗がん剤（マイトマイシンＣなど）処理などで不活化されていることが好ましい。細胞外基質成分としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261, 2011）、ゼラチン、コラーゲン、エラスチンなどの繊維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などのグルコサミノグリカンやプロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどの細胞接着性タンパク質などが挙げられる。

培養温度の条件は、特に制限されないが、例えば、３７℃～４２℃程度、３７℃～３９℃程度が好ましい。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明において低酸素条件とは、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％またはそれら以下の酸素濃度が例示される。

浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）または非イオン性の界面活性ポリオール（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７等）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことができる。また、例えば、シングルユースバイオリアクター（株式会社バイオット）、シングルユースバイオリアクター（サーモフィッシャー）、シングルユースバイオリアクター（ザルトリウス・ステディウム）、シングルユースバイオリアクター（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）などの撹拌翼を備える培養器を用いて、浮遊培養を行ってもよい。用いる培養器の種類および撹拌速度は、培養される細胞の種類に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。撹拌速度の例として、例えば、０～１００ｒｐｍ、２０～８０ｒｐｍ、または４５～６５ｒｐｍが挙げられるが、これらに限定されない。

また、浮遊培養の際には、胚様体（ＥＢ）を形成させて培養することが好ましい。従って、前記工程（０）には、多能性幹細胞から胚様体を形成させる工程を含んでいてもよい。かかる工程においては、コロニーを形成した多能性幹細胞を解離して単細胞にしたのちに胚様体を形成させることが好ましい。多能性幹細胞を解離させる工程においては、互いに接着して集団を形成している細胞を個々の細胞に解離（分離）させる。多能性幹細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）およびＡｃｃｕｍａｘ（商標）など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（特に好ましくは、Ａｃｃｕｍａｘ（商標））を用いて多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。上記工程で用いる培地は、チオグリセロール、L-グルタミンおよび／またはアスコルビン酸を含むことが好ましい。

上記工程（０－１）で用いる心筋細胞分化誘導因子としては、Ｗｎｔシグナル活性化物質、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦが挙げられ、これらは単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。本発明の一態様において、アクチビンＡ、ＢＭＰ４およびｂＦＧＦの組み合わせが用いられる。また、上記工程（０－１）で用いる培地は、チオグリセロール、L-グルタミンおよび／またはアスコルビン酸を含むことが好ましい。

本明細書において、「Ｗｎｔシグナル活性化剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、例えば、Ｗｎｔタンパク質、ＧＳＫ３β阻害剤（例：ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９９０２１等）などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。Ｗｎｔシグナル活性化剤を用いる場合に、培地中でのその濃度は特に限定はされない。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、培地中での最終濃度１００ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～１０μＭで使用することが好ましい。

アクチビンＡを用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬが例示される。

ＢＭＰ４を用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬが例示される。

ｂＦＧＦを用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬが例示される。

上記工程（０－１）の期間としては、中胚葉系細胞が得られる限り特に限定されないが、１２時間以上（例：１日間、２日間またはそれ以上）が好ましく、６日間以下（例：５日間、４日間、３日間またはそれ以下)が挙げられる。また、中胚葉系細胞が得られたか否かをモニタリングしてもよく、この場合には、中胚葉マーカー遺伝子の発現により決定することができる。中胚葉マーカー遺伝子としては、例えば、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬなどが挙げられる。

上記工程（０－２）で用いる心筋細胞分化誘導因子としては、例えば、Ｗｎｔ阻害剤、ＶＥＧＦが挙げられ、これらは単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。また、上記工程（０－２）で用いる培地は、チオグリセロール、L-グルタミンおよび／またはアスコルビン酸を含むことが好ましい。

本明細書において、「Ｗｎｔ阻害剤」とは、Ｗｎｔの受容体への結合からβカテニンの蓄積へと続くシグナル伝達を阻害する物質を意味し、受容体であるFrizzledファミリーへの結合を阻害する物質であっても、βカテニンの分解を促進する物質であってもよい。Ｗｎｔ阻害剤としては、例えば、ＤＫＫ１タンパク質（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１２２４２）、スクレロスチン（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２５２３７）、ＩＷＲ－１（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＩＷＰ－２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＮＵ－７４６５４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびこれらの誘導体などが挙げられる。中でも、ＩＷＰ－３またはＩＷＰ－４が好ましい。Ｗｎｔ阻害剤は、１種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。

Ｗｎｔ阻害剤を用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎＭ～５０μＭが好ましく、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。より好ましくは、1μMである。

ＶＥＧＦを用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１～１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬが例示される。

上記工程（０－２）では、さらに、心筋細胞分化誘導因子として、ＢＭＰ阻害剤および／またはＴＧＦβ阻害剤を基本培地に添加しても良い。本明細書において、「ＢＭＰ阻害剤」としては、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）およびその誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II#60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904、ＬＤＮ－１９３１８９（４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）などが挙げられる。中でも、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎが好ましい。ＢＭＰ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤は、１種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。

ＢＭＰ阻害剤を用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎＭ～５０μＭが好ましく、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。

本明細書において、ＴＧＦβ阻害剤とは、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質を意味し、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質であっても、ＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質であってもよい。ＴＧＦβ阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（ＬｉｌｌｙＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ－８３－０１（ＷＯ２００９１４６４０８）およびこれらの誘導体などが挙げられる。中でも、SB431542が好ましい。

ＴＧＦβ阻害剤を用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎＭ～５０μＭが好ましく、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、５．２μＭ、５．４μＭ、５．６μＭ、５．８μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。

上記工程（０－２）の期間としては、心筋細胞が得られる限り特に限定されないが、１日間以上（例：1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間またはそれ以上）が挙げられる。また、長期間培養することにより心筋細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、典型的には、40日間以下である。また、心筋細胞が得られたか否かをモニタリングしてもよく、この場合には、拍動心筋細胞の数、心筋細胞マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。

また、前記工程（０）は、さらに、工程（０－３）ＶＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦの存在下、または非存在下で、工程（０－２）で得られた心筋細胞を培養する工程を含んでいてもよい。本工程で用いる培地は、チオグリセロール、L-グルタミンおよび／またはアスコルビン酸を含むことが好ましい。また、本工程で用いる培地は、心筋成熟化化合物（例：Ｎ－（１，１－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－１－ベンゾチオフェン－５－イル）－２－（４－｛５－［１－オキソ－５－（ピペリジン－１－イル）－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－イソインドール－２－イル］－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル｝フェノキシ）アセトアミド）および／またはマルチキナーゼ阻害剤（例：２－（４－｛３－［３－（２－アミノ－２－フェニルエトキシ）－４－シアノフェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－６－イル｝－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ－（２－メトキシエチル)アセトアミド）を含んでいてもよい。

工程（０－３）でＶＥＧＦを用いる場合、培地中でのその濃度としては、１～１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬが例示される。

工程（０－３）でｂＦＧＦを用いる場合、培地中でのその濃度としては、１～１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬが例示される。より好ましくは、５ｎｇ／ｍＬである。

上記工程（０－３）の期間としては、特に制限されないが、１日間以上（例：１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、またはそれ以上）が挙げられる。また、長期間培養することにより心筋細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、典型的には６０日以下である。上記工程（０－３）を行うことで、心筋細胞への分化効率が向上し得る。

また、上記工程（０－２）または工程（０－３）を行う前に、上述と同様の方法により、胚様体を解離させてもよい。

上記で具体的に説明した方法はあくまで例示であり、上記方法に限定されるものではない。例えば、マウス由来の支持細胞であるＥＮＤ２細胞と多能性幹細胞を共培養する方法（Mummery, C., et al., Circulation. 107(21), 2733-40 (2003)）、胚様体を、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２、インスリンと血清とを用いて培養することで、心筋細胞を誘導する方法（Paul, W B., et al., PLoSone. 6(4), e18293 (2011).）などが挙げられる。また、接着培養でサイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法(Lian X, et al.、Proc Natl Acad Sci U S A.、 2012 July 3;109(27):E1848-57)、接着培養と、浮遊培養とを併用し、サイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法(Minami I, et al.、Cell Rep.、 2012 Nov 29;2(5):1448-60)などを用いてもよい。

上記のようにして得られた心筋細胞を含む細胞集団に、ＨＤＡＣ阻害剤を接触させ、次いで該細胞集団を培養することで、ＨＤＡＣ阻害剤を接触させる前の細胞集団と比較して、心筋細胞の純度が高い細胞集団を製造することができる。即ち、ＨＤＡＣ阻害剤を用いて、心筋細胞を精製することができる。従って、本発明の別の態様において、（１’）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを含む細胞集団に、ＨＤＡＣ阻害剤を接触させる工程、および（２’）該細胞集団を培養する工程を含む、心筋細胞を精製する方法（以下、「本発明の精製方法」ともいう。）が提供される。また、さらに別の態様において、上記工程（１’）および（２’）を含む、心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを含む細胞集団から心筋細胞以外の細胞を減少させる方法（以下、「本発明の非心筋細胞の減少方法」ともいう。）も提供される。

本明細書において、心筋細胞を精製するとは、ＨＤＡＣ阻害剤により、心筋細胞以外の細胞の細胞数（「細胞数」は、生細胞数を意味する。以下同様。）の減少割合が心筋細胞の減少割合を上回ること、あるいは心筋細胞以外の細胞の増殖が阻害されて、心筋細胞以外の細胞の増殖割合を心筋細胞の増殖割合が上回ることで、細胞集団中の心筋細胞の割合（細胞集団中の心筋細胞数／細胞集団中の全細胞数）が増加することを意味する。従って、心筋細胞の精製における心筋細胞の割合の増加は、心筋前駆細胞から心筋細胞への分化誘導促進または心筋前駆細胞から心筋細胞以外の細胞への分化誘導阻害による、心筋細胞の割合の増加とは区別される。

下述の実施例で示す通り、ＨＤＡＣ阻害剤処理により、多能性幹細胞数の減少割合が、心筋細胞数の減少割合よりも高いこと、さらにはＨＤＡＣ阻害剤処理により、細胞集団中の心筋細胞の割合が増加することが示された。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＨＤＡＣ阻害剤による細胞数の減少は、ＨＤＡＣ阻害剤により細胞のアポトーシスが誘導された結果であると推測される。そして、ＨＤＡＣ阻害剤により、細胞集団中に含まれる、多能性幹細胞などの未分化細胞の割合が低減すること、または該細胞集団から未分化細胞が除去されることにより、細胞集団中の心筋細胞の割合が増加したものと推測される。従って、本発明の別の態様において、（Ｉ）未分化細胞が混入する心筋細胞を含む細胞集団に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を接触させる工程、および（ＩＩ）該細胞集団を培養する工程を含む、該細胞集団から該未分化細胞を除去または低減する方法（以下、「本発明の未分化細胞除去方法」ともいう。）が提供される。

本明細書において、「未分化細胞」とは、分化能、即ち、多能性（pluripotency）、多能性（multipotency）、寡能性（oligopotency）または単能性（unipotency）、を保持する細胞を意味し、未分化細胞には、具体的には、上述の多能性幹細胞、分化能を有する中胚葉系細胞、心筋前駆細胞などが含まれる。

前記工程（１）、（１’）および（Ｉ）において、心筋細胞を含む細胞集団と、ＨＤＡＣ阻害剤とを接触させる期間は特に限定されないが、例えば、１時間以上（例：２時間、３時間、５時間、１２時間、１日間、２日間、３日間またはそれ以上）であることが好ましい。また、長期間培養することにより心筋細胞または心筋前駆細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、典型的には、６０日間以下（例：５０日間、４０日間、３０日間、２０日間、１４日間、１３日間、１２日間、１１日間またはそれ以下）であることが好ましい。心筋細胞を含む細胞集団と、ＨＤＡＣ阻害剤との接触は、該細胞集団を含む培地中にＨＤＡＣ阻害剤を添加することにより行ってもよく、また、あらかじめＨＤＡＣ阻害剤を添加した培地に、該細胞集団を播種することにより行ってもよい。ＨＤＡＣ阻害剤を接触させるタイミングも、細胞集団に心筋細胞が含まれるタイミングであれば特に限定されないが、例えば、上記工程（０－２）または（０－３）で接触させることが好ましく、多能性幹細胞の分化誘導開始日を基準にすれば、分化誘導開始から７日目以降に行うことが好ましい。

本発明に用いるＨＤＡＣ阻害剤により阻害されるＨＤＡＣとしては、クラスＩのＨＤＡＣ（例：ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８）、クラスＩＩのＨＤＡＣ（例：ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０）、クラスＩＩＩのＨＤＡＣ（例：ＳｉｒＴ１、ＳｉｒＴ２、ＳｉｒＴ３、ＳｉｒＴ４、ＳｉｒＴ５、ＳｉｒＴ６、ＳｉｒＴ７）、クラスＩＶのＨＤＡＣ（例：ＨＤＡＣ１１）のいずれであってもよいが、好ましくはクラスＩまたはＩＩのＨＤＡＣであり、より好ましくはクラスＩのＨＤＡＣ、特にＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２に対する阻害剤である。本明細書において、クラスＩのＨＤＡＣに対する阻害剤は、クラスＩのＨＤＡＣに対する阻害活性を有していれば、他の活性、例えば、クラスＩ以外のクラスのＨＤＡＣに対する阻害活性など、を有していてもよく、またクラスＩのＨＤＡＣに特異的な阻害活性を有していてもよい。他のクラスのＨＤＡＣに対する阻害剤についても、同様である。

本発明に用いるＨＤＡＣ１に対する阻害剤としては、例えば、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ、ＣＩ９９４（Ｔａｃｅｄｉｎａｌｉｎｅ）、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＣＩ－２４７８１（Ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ（ＦＫ２２８，Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｒｅｓｍｉｎｏｓｔａｔ、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ（ＭＧＣＤ０１０３）、ＣＡＹ１０６０３、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ（ＭＳ－２７５）、４ＳＣ－２０２、ＨＰＯＢ、ＰＣＩ－３４０５１、ＴｕｂａｓｔａｔｉｎＡＨＣｌなどが挙げられる。

ＨＤＡＣ２に対する阻害剤としては、例えば、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＣＵＤＣ－１０１、ＰＣＩ－２４７８１（Ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ（ＦＫ２２８，Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ（ＭＧＣＤ０１０３）、４ＳＣ－２０２、ＨＰＯＢなどが挙げられる。

ＨＤＡＣ３に対する阻害剤としては、例えば、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ、ＲＧＦＰ９６６、ＣＵＤＣ－９０７、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、ＰＣＩ－２４７８１（Ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、ＣＵＤＣ－１０１、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、Ｒｅｓｍｉｎｏｓｔａｔ、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）、４ＳＣ－２０２、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ（ＭＧＣＤ０１０３）、ＨＰＯＢ、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ（ＭＳ－２７５）、Ｄｒｏｘｉｎｏｓｔａｔなどが挙げられる。

ＨＤＡＣ４に対する阻害剤としては、例えば、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ、Ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＬＭＫ－２３５、ＣＵＤＣ－１０１、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、ＴＭＰ２６９、ＣＵＤＣ－９０７、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）などが挙げられる。

ＨＤＡＣ５に対する阻害剤としては、例えば、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＬＭＫ－２３５、ＣＵＤＣ－１０１、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、ＴＭＰ２６９、ＣＵＤＣ－９０７、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）などが挙げられる。

ＨＤＡＣ６に対する阻害剤としては、例えば、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ、ＣＡＹ１０６０３、Ｔｕｂａｃｉｎ、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）、ＮｅｘｔｕｒａｓｔａｔＡ、ＴｕｂａｓｔａｔｉｎＡＨＣｌ、ＴｕｂａｓｔａｔｉｎＡ、ＨＰＯＢ、ＣＵＤＣ－１０１、ＰＣＩ－２４７８１（Ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、ＣＵＤＣ－９０７、Ｒｅｓｍｉｎｏｓｔａｔ、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、Ｄｒｏｘｉｎｏｓｔａｔ、ＰＣＩ－３４０５１などが挙げられる。

ＨＤＡＣ７に対する阻害剤としては、例えば、ＴＭＰ２６９、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、ＣＵＤＣ－１０１、ＣＵＤＣ－９０７、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）などが挙げられる。

ＨＤＡＣ８に対する阻害剤としては、例えば、ＰＣＩ－３４０５１、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＣＵＤＣ－１０１、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＣＩ－２４７８１（Ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、ＴｕｂａｓｔａｔｉｎＡＨＣｌ、Ｄｒｏｘｉｎｏｓｔａｔ、ＨＰＯＢなどが挙げられる。

ＨＤＡＣ９に対する阻害剤としては、例えば、ＴＭＰ２６９、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＣＵＤＣ－１０１、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、ＣＵＤＣ－９０７などが挙げられる。

ＨＤＡＣ１０に対する阻害剤としては、例えば、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＣＩ－２４７８１（Ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、ＣＵＤＣ－１０１、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、ＨＰＯＢ、ＰＣＩ－３４０５１などが挙げられる。

ＨＤＡＣ１１に対する阻害剤としては、例えば、Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＣＵＤＣ－９０７、Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ（ＳＢ９３９）、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ（ＭＧＣＤ０１０３）などが挙げられる。

クラスＩＩＩのＨＤＡＣに対する阻害剤としては、Ｓｉｒｔｉｎｏｌ、ＳｉｒＲｅａｌ２、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（ＶｉｔａｍｉｎＢ３）、Ｓｅｌｉｓｉｓｔａｔ（ＥＸ５２７）、Ｔｈｉｏｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｓａｌｅｒｍｉｄｅ、ＯＳＳ＿１２８１６７、ＡＫ７、３－ＴＹＰ、Ｔｅｎｏｖｉｎ－１、Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ（ＡＣＹ－１２１５）、Ｉｎａｕｈｚｉｎなどが挙げられる。

また、非選択的ＨＤＡＣ阻害剤を用いてもよく、該阻害剤としては、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ（ＳＡＨＡ）、Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ（ＬＢＨ５８９）、Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ（ＰＸＤ１０１）などが挙げられる。中でも、ＦＫ２２８、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡまたはＰａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔが好ましい。ＨＤＡＣ阻害剤は、１種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。

ＨＤＡＣ阻害剤の培地中での濃度としては、当業者であれば適宜選択できるが、例えば、０．１ｎＭ～１０μＭが好ましく、具体的には、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭが挙げられる。また、化合物の種類によっても適宜濃度を変更することもでき、例えば、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡを用いる場合には、０．１μＭ～１０μＭが好ましく、Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔを用いる場合には、０．１～３μＭが好ましく、ＦＫ２２８を用いる場合には、１ｎＭ～１μＭが好ましく、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔを用いる場合には、０．１μＭ～１０μＭが好ましいが、これらの濃度に限定されない。

前記工程（２）、（２’）および（ＩＩ）における細胞集団の培養方法は、上記（０－３）と同様である。培養期間も同様であり、少なくとも細胞集団とＨＤＡＣ阻害剤とを接触をしている間培養を続ければよい。

２．心筋細胞を含む細胞集団
本発明はまた、本発明の製法、精製方法、非心筋細胞の減少方法または未分化細胞除去方法により得られた、心筋細胞を含む細胞集団（以下、「本発明の細胞集団」ともいう）を提供する。上述の通り、本発明の細胞集団は、高い純度で心筋細胞を含む。高い純度とは、細胞集団中の心筋細胞の割合（細胞集団中の心筋細胞数／細胞集団中の全細胞数）が、具体的には、８０％以上（例：８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の高純度で含むことを意味する。当然のことながら、上記心筋細胞の割合は、上記細胞集団と、間葉系幹細胞などの他の細胞または細胞集団とを混合して用いる場合には、他の細胞または細胞集団を混合する前の割合を指す。好ましい態様において、本発明の細胞集団は、多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する従来の方法で得られる細胞集団よりも、高い割合で心筋細胞を含む。かかる細胞集団は、セルソーティングなどによりさらに精製してもよく、このように精製された細胞集団もまた、「本発明の細胞集団」に包含されるものとする。

３．細胞移植療法剤
本発明はまた、本発明の細胞集団を含有してなる、細胞移植療法剤（以下、「本発明の細胞移植療法剤」ともいう）を提供する。本発明の細胞移植療法剤は、自家移植に用いてもよく、他家移植に用いてもよい。また、他の薬剤、例えば免疫抑制剤、と併用してもよい。上述の通り、本発明の細胞集団は、高純度で心筋細胞を含むため、本発明の細胞集団は、細胞移植療法剤の原料として用いることに適しており、本発明の細胞集団または本発明の細胞移植療法剤は、心疾患の治療または予防に有用である。従って、本発明の細胞集団または細胞移植療法剤の有効量を治療または予防の対象とする哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）に投与または移植する、心疾患の治療または予防方法も本発明に包含される。治療または予防の対象とする心疾患としては、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、拡張型心筋症などの疾患または障害による欠損などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の細胞集団を、細胞移植療法剤に用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞から樹立したｉＰＳ細胞に由来する細胞を含む細胞集団を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－ＤＲの３遺伝子座或いはＨＬＡ－Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。また、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。

本発明の細胞集団は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の細胞移植療法剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。本発明の移植療法剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、上記水性液に細胞約１×１０⁶～約１×１０⁸個／ｍＬとなるように、心筋細胞を含む細胞集団を懸濁させればよい。また、生着を促すような足場材と共に投与され得る。ここで足場材とは、コラーゲンなどの生体由来の成分やこれに代替するポリ乳酸などの合成ポリマーが例示されるが、これらに限定されない。

あるいは、心疾患の治療は、得られた心筋細胞をシート化して、患者の心臓に貼付することによって行われてもよい。心筋シートを投与する場合、所望の部分を覆うように配置することによって達成される。ここで、所望の部分を覆うように配置することは、当該分野において周知技術を用いて行うことができる。配置に際し、所望の部分が大きい場合は、組織を取り巻くように配置してもよい。また、投与は、所望の効果を得るため、同部分へ数回の配置を行うこともできる。数回の配置を行う場合、所望の細胞が組織へ生着し、血管新生を行うために十分な時間をおいて行うことが望ましい。このような心疾患の治療の機序は、心筋シートの生着により生じる効果であってもよく、あるいは細胞の生着によらない間接的な作用（例えば、誘引物質を分泌することによるレシピエント由来細胞の損傷部位への動員による効果）であってもよい。心疾患の治療において、心筋シートを用いる場合には、心筋細胞に加えて、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞足場材料（スキャホールド）を含んでいてもよい。あるいは、心筋細胞の他に、任意の細胞種（複数も可）を含んでいることも可能である。心疾患の治療に用いられる心筋細胞の細胞数は、投与される心筋シートが心疾患の治療において効果を発揮するような量であれば特に限定されるものではなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製することができる。

さらに別の実施形態では、本発明の細胞集団は、心疾患の治療のための薬剤スクーニングや薬剤の心毒性評価に利用することもできる。例えば、本発明の細胞集団に試験薬剤を投与し、心筋細胞の応答を調べることにより、試験薬剤の効果や毒性の評価を行うことができる。

本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されない。

試験例１．心筋細胞に対する純化作用を有する化合物のスクリーニング
心筋細胞と非心筋細胞の増殖性の違いから、細胞増殖や細胞周期をターゲットとした化合物に対する感受性に違いがあるものと仮定し、研究用ｉＰＳ細胞株を用いて、心筋細胞に対する純化作用を有する化合物のスクリーニングを実施した。

＜ｉＰＳ細胞株＞
心筋細胞の成熟化を検出するため、ＴＮＮＩ１の遺伝子座にEmGFP（配列番号１）、TNNI3の遺伝子座にｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号２）のレポータータンパク質の配列を挿入したダブルノックインのヒトｉＰＳ細胞株（レポーターｉＰＳ細胞株）を作製した。上記レポーターｉＰＳ細胞株の維持培養は従来法で行った(Okita K, et al. Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)。なお、前記ヒトｉＰＳ細胞は、ＣＴＬ社より購入したＰＢＭＣ（ＬＰ＿１６７，ＳａｍｐｌｅＩＤ：２０１３０３１８）を用いて、エピソーマルベクター（搭載遺伝子；ＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４，ＳＯＸ２，Ｌ－ＭＹＣ，ＬＩＮ２８，ｍｏｕｓｅｐ５３ＤＤ）により樹立されたものである(参考文献；Okita K, et al. Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)。

＜心筋細胞への分化誘導＞
心筋細胞への分化誘導は論文（Miki et al, Cell Stem Cell. 2015 Jun 4;16. doi: 10.1016/j.stem.2015.04.005.）に記載の方法に準じて６ウェルプレートで行った。簡潔に説明すれば、心筋細胞への分化誘導は、レポーターｉＰＳ細胞株を０．５ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳで１／２に希釈したＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズ）で４～５分処理後、セルスクレーパー（ＩＷＡＫＩ）で細胞を剥離し、ピペッティングによりシングルセルへと解離した。１，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により培地を除去し、得られた細胞を、６ウェルプレート１ウェルあたり２×１０⁶個播種して、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地に１％Ｌ－グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール４×１０^-4Ｍ、１０μＭＹ－２７６３２、２ｎｇ／ｍＬＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）および０．５％ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌを添加した培地１．５ｍＬ／ウェルで、３７℃、５％酸素条件下にて培養して、胚様体を形成させた（０日目）。
翌日（１日目）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地に１％Ｌ－グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール４×１０^-4Ｍ、２ｎｇ／ｍＬＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）アクチビンＡ１２ｎｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦ５ｎｇ／ｍＬ、ＢＭＰ４１８ｎｇ／ｍＬを加えた培地を各ウェルに１．５ｍＬ添加し、３７℃、５％酸素条件にてさらに2日間培養した。
続いて（３日目）、６ウェルプレートを傾けて静置して胚様体を沈降させ、培地の８０～９０％除去した後、各ウェルにＩＭＤＭを１．５ｍＬ添加した。再びウェルプレートを傾けて静置して胚様体を沈降させ、培地の８０～９０％除去した後、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地に１％Ｌ－グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール４×１０^-4Ｍ、１０ｎｇ／ｍＬＶＥＧＦ、１μＭＩＷＰ－３、０．６μＭＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよび５．４μＭＳＢ４３１５４２を添加した培地中で、３７℃、５％酸素条件下で、３日間培養した。
続いて（６日目）、６ウェルプレートを傾けて静置して胚様体を沈降させ、培地の８０～９０％除去した後、１％Ｌ－グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール４×１０^-4Ｍおよび５ｎｇ／ｍＬＶＥＧＦを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地を添加した。１０日間、３７℃、５％酸素条件下で培養した。この間、２～３日に１度同じ条件の培地に交換した。１０日目以降は３７℃、２１％酸素条件下で培養した。

＜胚様体のシングルセル化および化合物のスクリーニング＞
分化開始後22日目、胚様体の入った６ウェルプレートを傾け、胚様体をウェルの端に沈降するまで1～2分静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。その後、2ｍＬのＰＢＳを加えて上記と同様に傾けて１～２分静置し、胚様体を吸わないようにＰＢＳをアスピレートした。ＰａｐａｉｎＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いてＥＢをシングルセル化し、遠心に供した（７０ｇ、６分）、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで懸濁後、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性の細胞を分取した。遠心分離後、上清を除去し、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地を基本とした心筋分化培地（Ｓｔｅｍｐｒｏ３４にアスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、トランスフェリン１５０ｍｇ／ｍＬ、モノチオグリセロール４×１０^-4Ｍ、ＶＥＧＦ５ｎｇ／ｍｌを混合したもの）１００ｍＬに再懸濁した。再懸濁した細胞を、あらかじめフィブロネクチンでコートしたＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－３８４ｐｌａｔｅＵｌｔｒａＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ上に細胞２．０×１０³個／ウェルにて播種した。該培養により得られた細胞集団を、以下では心筋細胞と称する。
また、ｉＰＳ細胞株を０．５×ＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズ、０．５ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳで１／２希釈）で４～５分処理後、セルスクレーパー（ＩＷＡＫＩ）で細胞を剥離し、ピペッティングによりシングルセルへと解離した。遠心分離（１，０００ｒｐｍ，５分）により培地を除去し、Ｙ－２７６３２１０μＭを添加したＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２培地に再懸濁し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ）でコートしたＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－３８４ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ（パーキンエルマー／６０５７３００）上に細胞２．０×１０³個／ウェルにて播種した。
心筋細胞およびシングルセル化したｉＰＳ細胞について、播種２日後に評価化合物を添加し、２日間培養した。化合物処置４８時間後に、生細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（パーキンエルマー）を用いて細胞内ＡＴＰレベルを測定することで評価した。スクリーニングの結果、心筋細胞の生細胞数（ＡＴＰレベル）に比べｉＰＳ細胞の生細胞数（ＡＴＰレベル）を顕著に低下させた化合物（ＨＤＡＣ阻害剤）の結果を図１で示す。図１では、ｉＰＳ細胞、心筋細胞それぞれのＤＭＳＯコントロールのＡＴＰレベルを１００％としたときの相対値として表した（ｎ＝２）。

試験例２．臨床用ｉＰＳ細胞株における純化作用の検証
次に、試験例１のスクリーニングで見出したＨＤＡＣ阻害薬が、臨床用ｉＰＳ細胞株由来心筋細胞に対しても純化作用をもつのか否かをＡＴＰアッセイにて確認した。

＜ｉＰＳ細胞株＞
ＣｉＲＡで作製された臨床用ｉＰＳ細胞株を使用した。ｉＰＳ細胞株の維持培養は従来法に準じて行った(Okita K, et al. Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)。

＜心筋細胞への分化誘導＞
心筋細胞への分化誘導は、上記試験例１の＜心筋細胞への分化誘導＞で記載の方法と同様に行った。

＜胚様体のシングルセル化および化合物のスクリーニング＞
２０日目、胚様体の入った１０ｃｍディッシュを傾け、胚様体が沈降するまで静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。ディッシュ１枚あたり３ｍＬのＩＭＤＭにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ１００μｇ／ｍＬを加えた溶液を添加し、３７℃、通常酸素条件下で１時間静置した。１時間後、ｔｕｂｅを静置して胚様体を沈降するまで１～２分静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。ディッシュ１枚あたり２ｍＬのＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬを添加した溶液を添加し、３７℃、通常酸素条件下で１５分静置した。その後、ディッシュ１枚あたり２ｍＬのＩＭＤＭにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬを添加した培地を加え、ピペッティングにより単一の細胞（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ）とした後、遠心分離に供した（１００ｇ，４℃、５分）。遠心分離後、上清を除去し、Ｉ３培地（試験例１と同様の心筋分化培地）で懸濁後、フィブロネクチンコートした９６ウェルプレートに細胞２ｘ１０⁴個／ウェルの播種密度で播種した。該培養により得られた細胞集団を、以下では心筋細胞と称する。このとき、一部細胞を固定し、抗サルコメアα－アクチニン抗体で染色し、フローサイトメーターでサルコメアα－アクチニンの発現解析を行った。その結果、サルコメアα－アクチニン陽性率は９９．４％だった。
また、１０ｃｍディッシュで培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ５ｍＬで洗浄後、Ａｃｃｕｔａｓｅ５ｍＬを添加し、３７℃、通常酸素条件下で７分静置した。７分後、ピペッティングにより細胞を剥離し、単一の細胞（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ）とした後、遠心分離に供した（１，０００ｒｐｍ、５分）。遠心分離後、上清を除去し、Ｙ－２７６３２１０μＭを添加した未分化維持培地に懸濁後、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ）でコートした９６ウェルプレートに５ｘ１０³個／ウェルの播種密度で播種した。
心筋細胞およびシングルセル化したｉＰＳ細胞について、播種翌日、培地を除去し、化合物（０．１ｎＭ～１０μＭ）あるいはＤＭＳＯ（０．１％）を希釈した新しい培地１００μＬを添加した。翌日、上清を除去しＰＢＳで洗浄後、ＡＴＰｌｉｔｅ１ｓｔｅｐＡＴＰ検出システム（パーキンエルマー）により細胞内ＡＴＰを測定した。結果を図２で示す（ｎ＝４の平均値±標準偏差）。化合物処置による細胞内ＡＴＰレベルへの影響について、ｉＰＳ細胞、心筋細胞それぞれのＤＭＳＯ処置細胞を１００％としたときの相対値で表した。

上記試験例１および２の結果より、ｉＰＳ細胞の細胞株の種類に関わらず、HDAC阻害剤処置により未分化ｉＰＳ細胞の生細胞数は顕著に減少するが、ｉＰＳ細胞から分化させた心筋細胞では、生細胞数の減少は低いことが示された。

試験例３．心筋細胞と非心筋細胞とが混在する胚葉体におけるＨＤＡＣ阻害剤の効果の検証１
本発明者らは、上記結果より、ＨＤＡＣ阻害剤を用いることで、心筋細胞と、ｉＰＳ細胞などの非心筋細胞とが混在する胚様体において、心筋細胞を純化できるのではないかと考えた。そこで、以下の手順により、HDAC阻害剤の胚様体における効果を検証した。

＜胚様体への化合物処理、胚様体のシングルセル化および細胞のソーティング＞
２０日目の胚様体を遠沈管に回収し、胚様体が沈降するまで静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。新しいＩ３培地（試験例１と同様の心筋分化培地）に交換し、胚様体が各ウェルに同程度量入るよう、３ｍＬ／ウェルの培地量で６ウェルプレートに分けた。その後、表１に記載の評価化合物（１ｎＭ～１０μＭ）あるいはＤＭＳＯ（０．１％）を添加した。各化合物の各添加濃度（培地中での終濃度）を表１に示した。その後、３７℃、通常酸素条件下で３日間培養した。化合物添加３日後に、６ウェルプレートを静置して胚様体を沈ませ、広径チップをつけたピペットマンで胚様体を１．５ｍＬチューブに回収した。５００ｇで１分遠心した。上清を除去し、チューブ１本あたり５００μＬのＩＭＤＭにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ１００μｇ／ｍＬを加えた溶液を添加し、３７℃、通常酸素条件下で１時間静置した。１時間後、チューブを５００ｇで１分遠心し、胚様体を吸わないように上清を除去した。その後、チューブあたり５００μＬのＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬとなるように添加した溶液を添加し、３７℃、通常酸素条件下で１５分静置した。その後、ピペッティングにより単一の細胞（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ）とした後、チューブあたり５００μＬのＩＭＤＭにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬを添加した培地を加えて転倒混和し、遠心分離に供した（７００ｇ、５分）。遠心分離後、上清を除去し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＦｉｘａｔｉｏｎ／ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）に再懸濁して室温で１５分静置し、固定した。固定した細胞を抗サルコメアα－アクチニン抗体で染色し、フローサイトメーターでサルコメアα－アクチニンの発現解析を行った。結果を図３に示す（ＤＭＳＯ処置細胞のみｎ＝３の平均値±標準偏差、化合物処置細胞ｎ＝１）。

試験例４．心筋細胞と非心筋細胞とが混在する胚葉体におけるHDAC阻害剤の効果の検証２
次に、試験例３と同じ細胞株で同様の検証を行い、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔでも心筋細胞率が向上すること、より低濃度のＦＫ２２８でも心筋細胞率が向上することを確認した。

＜胚様体への化合物処理、胚様体のシングルセル化および細胞のソーティング＞
20日目の胚様体を遠沈管に回収し、胚様体が沈降するまで静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。新しいI3培地（試験例１と同様の心筋分化培地）に交換し、胚様体が各ウェルに同程度量入るよう、3ｍＬ／ウェルの培地量で６ウェルプレートに分けた。その後、評価化合物（１ｎＭ～１０μＭ）あるいはＤＭＳＯ（０．１％）を添加した。各化合物の濃度（培地中での終濃度）を表２に示した。その後、３７℃、通常酸素条件下で４日間培養した。化合物添加４日後に、６ウェルプレートを静置して胚様体を沈ませ、広径チップをつけたピペットマンで胚様体を１．５ｍＬチューブに回収した。５００ｇで１分遠心した。上清を除去し、チューブ１本あたり５００μＬのＩＭＤＭにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ１００μｇ／ｍＬを加えた溶液を添加し、３７℃、通常酸素条件下で１時間静置した。１時間後、チューブを５００ｇで１分遠心し、胚様体を吸わないように上清を除去した。その後、チューブあたり５００ｕＬのＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬを添加した溶液を添加し、３７℃、通常酸素条件下で１５分静置した。その後、ピペッティングにより単一の細胞（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ）とした後、チューブあたり５００μＬのＩＭＤＭにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬを添加した培地を加えて転倒混和し、遠心分離に供した（７００ｇ、５分）。遠心分離後、上清を除去し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＦｉｘａｔｉｏｎ／ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）に再懸濁して室温で１５分静置し、固定した。固定した細胞を抗サルコメアα－アクチニン抗体で染色し、フローサイトメーターでサルコメアα－アクチニンの発現解析を行うことでサルコメアα－アクチニン陽性細胞率を測定した。結果を図４に示す（ＤＭＳＯ処置細胞のみｎ＝３の平均値（標準偏差）、化合物処置細胞ｎ＝１）。

試験例５．心筋細胞と非心筋細胞とが混在する胚葉体におけるHDAC阻害剤の効果の検証３
次に、試験例３と同じ細胞株で検証を行い、ＦＫ－２２８処置により非心筋細胞率が低下することを確認した。

＜胚様体への化合物処理、胚様体のシングルセル化＞
２１日目の胚様体を遠沈管に回収し、胚様体が沈降するまで静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。新しいＩ３培地（試験例１と同様の心筋分化培地）に交換し、胚様体が各ウェルに同程度量入るよう、３ｍＬ／ウェルの培地量で６ウェルプレートに分け、ＦＫ－２２８（０．１ｎＭ、１ｎＭ）あるいはＤＭＳＯ（０．１％）を添加した。その後、３７℃、通常酸素条件下で３日間培養した。化合物添加３日後に、６ウェルプレートを静置して胚様体を沈ませ、広径チップをつけたピペットマンで胚様体を１．５ｍＬチューブに回収した。５００ｇで１分遠心した。上清を除去し、チューブ１本あたり１ｍＬのＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉａ）にＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ１００μｇ／ｍＬを加えた溶液３ｍＬを各チューブに添加し、３７℃、通常酸素条件下で１時間静置した。１時間後、チューブを５００ｇで１分間遠心し、胚様体を吸わないように上清を除去した。ＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）にＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬを添加した溶液５００μＬを各チューブに添加し、３７℃、通常酸素条件下で１０分間静置した。静置後、ピペッティングにより単一の細胞（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ）とし、ＩＭＤＭにＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬを添加した培地５００μＬを各チューブに加えて転倒混和することで、シングルセル懸濁液を調製した。

上記のシングルセル懸濁液を、４００ｇで３分間遠心後、上清を除去し、Ｂａｍｂａｎｋｅｒに懸濁し、－８０℃で凍結保存した。凍結保存した細胞を、３７℃の温浴につけて融解し、４００ｇで５分間遠心後、上清を除去した。細胞ペレットをタッピング後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを加え、３００ｇで１分間遠心し、上清を除去した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでＡＰＣＦｉｒｅ７５０標識抗ＣＤ３２６抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４９ａ抗体、ＢＶ６０５標識抗ＣＤ３１抗体、ＤＡＰＩを用いて染色した。ＤＡＰＩ陽性の死細胞を除去した上で、各細胞の各蛍光色素のシグナル量を測定することで、細胞集団の分離と各細胞集団の割合を測定した。

ｉＰＳ細胞株から心筋に分化誘導した心筋細胞は、これらの３つの表面マーカーの発現の違いにより、ＣＤ３２６陽性細胞（内胚葉系譜細胞）、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陽性細胞（血管内皮様細胞）、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陰性ＣＤ４９ａ陽性細胞（平滑筋様細胞）、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陰性ＣＤ４９ａ陰性細胞の主に４つの細胞集団に分離された。

結果を図５に示す（ＤＭＳＯ処置細胞のみｎ＝３の平均値（標準偏差）、化合物処置細胞ｎ＝１）。

以上より、ＨＤＡＣ阻害により、胚様体中の心筋細胞を純化できることが示された。

本発明により、心筋細胞を高純度で含む細胞集団が提供される。かかる細胞集団は、心疾患に対する細胞移植療法や心疾患の治療剤のスクリーニングに好適に用いることができるため、有用である。

本出願は、日本で出願された特願２０２０－０５０２６９（出願日：２０２０年３月１９日）及び特願２０２０－１４５０９７（出願日：２０２０年８月２８日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

ヒト心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
（１）ヒト多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを含む細胞集団に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を接触させる工程、および
（２）該細胞集団を培養する工程、
を含む、方法。
前記工程（１）の細胞集団とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との接触が、ヒト多能性幹細胞の分化誘導開始から７日目以降に行われる、請求項１に記載の方法。
前記阻害剤が、クラスＩヒストン脱アセチル化酵素に対する阻害剤である、請求項１または２に記載の方法。
前記阻害剤が、ＦＫ２２８、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡおよびＰａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記ヒト多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
ヒト心筋細胞を精製する方法であって、
（１）ヒト多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを含む細胞集団に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を接触させる工程、および
（２）該細胞集団を培養する工程、
を含む、方法。