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CN115803426A - 均一尺寸的细胞聚集体的大量制造方法 - Google Patents

均一尺寸的细胞聚集体的大量制造方法 Download PDF

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CN115803426A
CN115803426A CN202180038291.1A CN202180038291A CN115803426A CN 115803426 A CN115803426 A CN 115803426A CN 202180038291 A CN202180038291 A CN 202180038291A CN 115803426 A CN115803426 A CN 115803426A
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豊田太郎
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Original Assignee
Qianzhihe Treatment Co
Toyo Seikan Group Holdings Ltd
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Abstract

本发明目的在于提供一种能够简便且大量地制造尺寸基本均一的细胞聚集体的新方法。本发明提供了一种使用细胞培养袋制造细胞聚集体的方法，其中，所述细胞培养袋具有包括多个凹部的下表面，所述方法包括：(1)向所述细胞培养袋中加入细胞和培养基并进行搅拌，并在对所述细胞培养袋施加压力的同时进行培养的工序；以及(2)培养结束后对形成的细胞聚集体进行回收的工序。

Description

均一尺寸的细胞聚集体的大量制造方法
技术领域
本发明涉及一种用于简便且大量地制造尺寸基本均一的细胞聚集体的方法。
【背景技术】
近年来，在基因治疗和再生医疗等领域中，正在进行在人工环境下大量地培养目标细胞。例如，有使用形成有一个或多个凹部的板(一般称为“孔板”)，将细胞和培养基导入各个凹部内进行培养的方法。但是，在该方法中，由于凹部向大气开放，因此有混入异物的风险，另外，必须对每个凹部进行细胞和培养基的注入和回收，操作繁杂，大规模地大量培养对操作人员来说成为了很大的负担。
对此，开发并报告了使用在下表面形成有多个凹部的气体透过性袋状容器(也称为“袋”)封闭地进行大量培养的方法(例如，后述的专利文献3等)。根据该方法，与使用前述孔板的情况相比，具有改善密闭性、能够降低异物混入风险的优点。
另一方面，在使用了这样的袋的封闭培养中，由于不能调整进入各凹部内的细胞的数量和位置等，凹部间形成的培养物(更详细地说，细胞聚集体)的尺寸和数量等有时会产生偏差。所以，培养中，在限制凹部间的移动的基础上，需要进行剥离各凹部内的细胞并在适当的位置配置细胞等繁杂的操作，大规模地大量培养对操作人员来说成为了很大的负担。
因此，在该领域中，迫切需要能够简便且大量地制造基本均一的细胞培养物的封闭培养方法。
以往，作为使用气体透过性袋状容器的封闭培养方法，开发/报告了以下方法。
专利文献1中公开了一种粘附性细胞的培养方法，该方法包括：向具有成为细胞培养面的容器壁的袋状容器中加入粘附性细胞及培养基；以及通过按压该袋状容器使内压上升来抑制内容物的流动，以促进细胞粘附在细胞培养面上或抑制粘附的细胞剥离。
专利文献2中公开了一种细胞培养方法，该方法包括：将加入了细胞和培养基的柔性培养容器载置在载置面上；在通过对该柔性培养容器施加压力使与载置面接触的柔性培养容器的外表面变形并形成了多个凹部的状态下继续培养；以及在凹部内形成细胞聚集块后，通过释放对柔性培养容器的压力，使容器外表面上形成的凹部平坦化并进一步进行培养。专利文献2中记载了由于在培养中维持凹部可能不利于培养基的循环和气体的扩散，因此在培养中释放施加的压力而使凹部平坦化，另外，叙述了通过使凹部平坦化，能够扩大用于细胞培养的区域(面积)。
专利文献3中公开了使用在下表面形成有多个凹部的细胞培养袋的细胞聚集块(球状体)的培养方法，记载了在该方法中，为了在各凹部形成一个球状体，以及为了提高细胞的增殖/分化诱导效率，需要进行剥离粘附在凹部内表面的球状体的操作，在进行该剥离工序时，为了防止球状体在凹部间移动而闭塞上述多个凹部。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开第2016-86774号公报
专利文件2：WO 2016/208526
专利文献3：日本特开第2019-118319号公报
发明内容
发明要解决的问题
上述现有技术均未公开/暗示简便且大量地制造尺寸基本均一的细胞聚集体。
因此，本发明的目的在于提供一种能够简便且大量地制造尺寸基本均一的细胞聚集体的新方法。
用于解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过将细胞和培养基加入在下表面上包括多个凹部的气体透过性柔性细胞培养袋并在对该细胞培养袋施加压力的同时进行培养，在各凹部内形成尺寸基本均一的细胞聚集体。本发明人等还发现，培养结束后，形成的大量的细胞聚集体可以通过简便的操作从各凹部取出，并且可以简便地从细胞培养袋中回收。本发明基于这些新认知，包含以下发明。
[1]一种使用细胞培养袋制造细胞聚集体的方法，其中，
所述细胞培养袋具有上表面和下表面，并且在所述下表面上包括多个凹部，所述方法包括：
(1)向所述细胞培养袋中加入细胞和培养基并进行搅拌，并在从至少一个方向对所述细胞培养袋施加压力的同时进行培养的工序；以及
(2)培养结束后对形成的细胞聚集体进行回收的工序。
[2]根据[1]所述的方法，其中，对10万个～100万个细胞聚集体进行回收。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，回收的细胞聚集体具有基本均一的粒径。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，所述回收的细胞聚集体的70％及以上具有在细胞聚集体的粒径的中央值±10％以内的粒径。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，所述回收的细胞聚集体的70％及以上具有140μm～160μm的粒径。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，所述回收的细胞聚集体每个包含200个～2000个细胞。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中，所述细胞为冻融的细胞。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的方法，其中，所述细胞为胰岛素分泌细胞。
[8a]根据[8]所述的方法，其中，所述胰岛素分泌细胞为胰岛素产生细胞。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的方法，其中，使所述细胞培养袋上下翻转来对所述细胞聚集体进行回收。
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的方法，其中，向所述细胞培养袋中注入空气来对所述细胞聚集体进行回收。
[11]根据[1]至[10]中任一项所述的方法，其中，所述在从至少一个方向对所述细胞培养袋施加压力的同时进行培养的工序是在从所述细胞培养袋的上方、下方或上下两方施加压力的同时进行培养的工序。
[12]根据[11]所述的方法，其中，所述在从至少一个方向对所述细胞培养袋施加压力的同时进行培养的工序是在从所述细胞培养袋的上方施加压力的同时进行培养的工序。
[13]根据[1]至[12]中任一项所述的方法，其中，所述凹部的深度与直径之比为1:1.5～2.5。
[14]根据[1]至[13]中任一项所述的方法，其中，所述凹部为球冠状。
[15]根据[1]至[14]中任一项所述的方法，其中，所述凹部的间距为0.35mm～0.49mm。
[16]根据[1]至[15]中任一项所述的方法，其中，所述凹部的深度为150μm～220μm。
[17]根据[1]至[16]中任一项所述的方法，其中，所述细胞培养袋中的液深为1.5mm～6mm。
[18]根据[1]至[17]中任一项所述的方法，其中，以1×105～1×107个细胞/mL的量向所述细胞培养袋中加入细胞。
[19]根据[1]至[18]中任一项所述的方法，其中，以1×104～5×106个细胞/cm2的量向所述细胞培养袋中加入细胞。
[20]根据[1]至[19]中任一项所述的方法，其中，在所述细胞聚集体形成后追加培养基。
[21]根据[1]至[20]中任一项所述的方法，其中，所述下表面包括10万个～100万个凹部。
[22]根据[1]至[21]中任一项所述的方法，其中，以每下表面单位面积1个凹部/cm2～1000个凹部/cm2包括凹部。
[23]一种用于移植的细胞聚集体群，所述细胞聚集体群的70％及以上具有140μm～160μm的粒径。
[24]根据[23]所述的细胞聚集体群，包含10万个～100万个细胞聚集体。
[25]根据[23]或[24]所述的细胞聚集体群，包含胰岛素分泌细胞。
[25a]根据[25]所述的细胞聚集体群，其中，所述胰岛素分泌细胞为胰岛素产生细胞。
[26]一种细胞培养袋，所述细胞培养袋包含10万个～100万个具有基本均一的粒径的细胞聚集体。
[27]根据[26]所述的细胞培养袋，其中，所述细胞聚集体的70％及以上具有140μm～160μm的粒径。
[28]根据[26]或[27]所述的细胞培养袋，其中，所述细胞聚集体包含胰岛素分泌细胞。
[28a]根据[28]所述的细胞培养袋，其中，所述胰岛素分泌细胞为胰岛素产生细胞。
本说明书包含作为本申请优先权的基础的2020年5月28日申请的日本专利申请第2020-93447号的说明书和/或附图中所记载的内容。
本说明书中所引用的所有刊物、专利以及专利申请直接作为参考并入本说明书中。
发明的效果
根据本发明，可以提供一种能够简便且大量地制造尺寸基本均一的细胞聚集体的新方法。
附图说明
图1是示出了在本发明中可利用的细胞培养袋的一个例子的示意图，其中，(a)是立体图，(b)是透视立体图。
图2是示出了在本发明中可利用的细胞培养袋的另一个例子的示意图，其中，(a)是立体图，(b)是透视立体图。
图3(1)是示出了用于载置在本发明中可利用的细胞培养袋的载置台的一个例子的立体图；图3(2)是示出了通过将细胞培养袋载置在该载置台上夹在该载置台与按压部件之间并施加压力从而在细胞培养袋的下表面形成凹部的示意图。
图4是在本发明中可利用的培养装置的剖面示意图，其中，(a)是示出了包括形成有容纳细胞培养袋的凹部的开口部的载置面的例子；(b)是示出了载置面为平面的例子。
图5是在本发明中可利用的培养装置的另一个例子的立体图。
图6是根据本发明方法所制造的细胞聚集体的照片图。
图7是示出了由回收的胰岛素产生细胞所制造的细胞聚集体的直径分布的图。
图8是示出了由回收的人iPS细胞所制造的细胞聚集体的直径分布的图，其中，(A)表示在培养中不施加压力所制造的細胞聚集体(对照)；(B)表示在培养中施加压力所制造的細胞聚集体。
具体实施方式
1.细胞培养袋
在本发明中，“细胞培养袋”意指使用气体透过性柔性膜材料形成袋状的培养容器。细胞培养袋优选具有至少包括具备凹部的下表面的形状，进一步具有包括与下表面相对的上表面的形状。
“气体透过性”意指使气体通过柔性膜材料的性质，本发明中的细胞培养袋中优选在JIS K 7126的气体透过度试验方法中在试验温度37℃下测定的氧的透过度为5000mL/(m2 day/atm)及以上的柔性膜材料。
作为可用于细胞培养袋的柔性膜材料，例如可以举出聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酯、有机硅系弹性体、聚苯乙烯系弹性体、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等树脂膜，但不限于这些。它们可以以单层膜的形式使用，也可以层叠同种或异种材料以多层(例如，两层或三层)膜的形式使用。在将2片膜重叠热封形成细胞培养袋的情况下，考虑到热熔融性，优选具有作为密封剂层发挥功能的层的材料。例如，柔性膜材料可以具有从细胞培养袋内侧起由内层、基层、外层这3层组成的结构。基层和内层优选使用具备高气体透过性、热封性和透明性的材料构成。另外，内层除了上述特性之外，优选由具备低细胞毒性的材料构成。作为这样材料，例如可以适当地使用线性低密度聚乙烯(LLDPE，Linear Low Density Polyethylene)、极低密度聚乙烯(VLDPE，Very Low DensityPolyethylene/ULDPE，Ultra LowDensity Polyethylene)、低密度聚乙烯(LDPE，LowDensity Polyethylene)或它们的混合物等聚乙烯系树脂。外层为密度为0.886g/cm3～0.93g/cm3的聚乙烯系树脂较为适当。另外，外层也可以适当省略。此外，为了使细胞容易聚集在凹部的底部中央，成为细胞培养袋的内表面的表面(至少下表面的表面)，优选实施细胞的低粘附处理。作为细胞的低粘附处理，例如可以举出利用磷脂聚合物、聚乙烯醇衍生物、表面活性剂、白蛋白等进行涂覆。膜的厚度为50μm～300μm、优选80μm～160μm左右，细胞培养袋的上表面和下表面的厚度可以相同，也可以不同。
细胞培养袋的下表面所包括的凹部的数量可以根据细胞培养袋的尺寸、期望的细胞聚集体的数量来决定，例如可以从10个～100万个、100个～100万个、1000个～100万个、或1万个～100万个的范围内，优选从10万个～100万个、或30万个～100万个的范围内适当选择。
凹部的形状没有特别限定，优选在凹部的底部容易聚集细胞的形状。例如，作为凹部的形状，可以举出球冠状、凹陷成研钵状(圆锥状)的形状等。另外，为了使细胞容易聚集在凹部的底部，凹部的深度与直径之比优选为1:1～4，更优选为1:1.5～2.5，进一步优选为1:1.8～2.2。例如，在一个实施方式中，凹部的深度可设为100μm～1000μm，例如150μm～220μm、开口直径(直径)可设为300μm～1500μm，例如225μm～550μm。
凹部的排列作为蜂窝状，优选使凹部在下表面所占的占有面积尽可能大的蜂窝状，但也可以根据需要排列成格子状。相邻的凹部4的中心间隔(间距)可设为0.35mm～0.49mm、优选为0.38mm～0.45mm。或者，可以将相邻的凹部的轮廓之间的间隙设定为大于0mm小于等于1mm、优选为0.05mm～0.1mm。凹部可以设置为每下表面单位面积1个凹部/cm2～1000个凹部/cm2、例如30个凹部/cm2～800个凹部/cm2或60个凹部/cm2～700个凹部/cm2。
细胞培养袋的大小没有特别限定，例如可以为长10mm～1000mm，例如可以为长50mm～500mm、宽10mm～1000mm，例如可以为宽50mm～500mm。细胞培养袋的厚度没有特别限定，只要具有能够使对加入了培养基的细胞培养袋施加压力时的液深(与培养液接触的下表面膜平坦面(除去凹部的部位)的内表面到上表面膜内表面的距离)为1mm～20mm、优选为2mm～8mm左右的厚度即可。
细胞培养袋中，可以包括培养基或细胞等能够流通的管状部件(以下，有时将本部件称为“端口”)。端口可以由例如聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚乙烯系弹性体、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等热塑性树脂成形。
本发明中的“细胞培养袋”的形式可以参照以往公知的使用气体透过性柔性膜材料形成的袋状培养容器(专利第5344094号公报、WO 2016/208526号公报、日本特开第2016-86774号公报、日本特开第2019-118319号公报等)的形式。
图1中示出了本发明中的细胞培养袋的一个例子。细胞培养袋1具有包括袋主体2和端口3的袋状结构，该袋主体通过将构成上表面的上表面膜21与构成下表面的下表面膜22重叠并对周边部20进行密封而形成；在下表面膜22上，排列成蜂窝状的多个凹部4通过热压成形等成形技术形成并保持。构成上表面的上表面膜21能够通过形成为具有覆盖全部多个凹部4的上方的基本平坦的顶面部分21a和顶面部分21a周围的倾斜部分21b的鼓出形状，与下表面膜22密封而形成具有厚度的细胞培养袋，在将该袋充满培养基时或在对该袋施加压力时，能够抑制下表面膜22的周围抬起的变形。
图2中示出了本发明中的细胞培养袋的另一个例子。在细胞培养袋1’中，凹部不直接形成在下表面膜22’上，而是将细胞培养袋1’载置在载置台上后模仿与下表面膜22’相接的载置台的载置面的形状而形成。
细胞培养袋1’的载置台是具有用于载置细胞培养袋的平坦的载置面和用于在细胞培养袋的下表面形成凹部的凹陷的板状部件。载置台可以由金属或硬质树脂等形成，载置面的凹陷只要是被按压的细胞培养袋的下表面能够形成上述凹部的形状即可，也可以在载置面上设置对应的凹部和/或凸部而形成凹陷，或者也可以将适当配置在载置面上的贯通孔用作凹陷。
图3(1)中示出了在细胞培养袋1’上形成凹部的载置台5’的一个例子。载置台5’包括用于载置细胞培养袋1’的平坦的载置面5a’以及以贯通孔的形式用于在细胞培养袋1’的下表面形成凹部的凹陷5b’。如图3(2)所示，在将填充有细胞和规定培养液的细胞培养袋1’载置在载置台5’上后，通过用后述按压部件6和载置台5’夹紧该细胞培养袋1’并施加压力，下表面膜22’被按压在载置面5a上，一部分从凹陷5b’的部分突出，从而形成凹部4’。
2.培养装置
本发明中可以利用具有能够对填充有细胞和规定培养基的细胞培养袋施加压力的结构的培养装置。培养装置至少包括载置细胞培养袋的载置台和按压细胞培养袋的上表面的按压部件、支撑它们中的一者或两者上下运动的支撑机构以及将它们中的一者或两者向细胞培养袋按压的压力施加单元、以及经由细胞培养袋的端口进行细胞或培养基的注入、排出的送液单元。在通过按压部件的自重对细胞培养袋施加压力的情况下，也可以省略压力施加单元。作为送液单元，可以举出蠕动泵等泵或注射器等，但不限于这些。培养装置可以可携带地移动到孵化器内利用，或者也可以设置在孵化器内。
在本发明中，“施加压力”意指使填充有细胞和规定培养基的细胞培养袋中的液深均一。在未施加压力的、填充有细胞和规定培养基的细胞培养袋中，由于在柔性上表面膜和/或下表面膜上形成的“皱折”、“褶皱”、“弯曲”、“挠曲”等，液深较高的部分和较低的部分混在一起，液深不均一。通过“施加压力”，能够拉伸在该上表面膜和/或下表面膜上形成的“皱折”、“褶皱”、“弯曲”、“挠曲”等，从而能够使该细胞培养袋中的液深均一。“施加压力”工序可以通过将填充有细胞和规定培养基的细胞培养袋夹在载置台的上表面(载置面)与按压部件的下表面之间来进行。即，可以利用支撑机构和压力施加单元，通过将按压部件向细胞培养袋下压而从细胞培养袋上方施加压力来进行，和/或利用支撑机构和压力施加单元，通过将载置台向细胞培养袋上推而从细胞培养袋下方施加压力来进行。或者，省略压力施加，通过按压部件的自重对细胞培养袋施加压力。通过这些方法，至少能够拉伸在与按压部件的下表面接触的区域的上表面膜和/或下表面膜上形成的“皱折”、“褶皱”、“弯曲”、“挠曲”等，从而能够使细胞培养袋中的液深均一。
图4是示出了在本发明中可利用的培养装置的一个例子的剖面示意图。图4的培养装置100、100”具有将按压部件6从上方下压而对载置在载置台5上的细胞培养袋1施加压力的结构。
培养装置100、100”包括载置细胞培养袋1的载置台5、具有按压上表面膜21的顶面部分21a的底面6a的按压部件6、以及支撑按压部件6的支撑机构7。
另外，在图4中，省略从细胞培养袋1的端口3进行细胞或培养基的注入、排出的送液单元的图示。
载置台5具有水平载置细胞培养袋1的载置面5a。该载置面5a可以为平面(图4(b))，也可以形成有容纳在细胞培养袋1的下表面膜22上形成的多个凹部4的开口部5b(图4(a))。在存在开口部5b的情况下，载置面5a以非接触的方式将下表面膜22支撑在凹部4上，因此能够避免凹部4的压溃、变形，防止凹部4内的细胞流出，进一步地，提高了通过下表面膜22的气体透过性。开口部5b的形状并不限定于开口部，例如可以是凹部，也可以为金属网状，另外，不仅是容纳各个凹部4的形状，只要能够避免凹部4的压溃和变形，也可以是能够容纳多个凹部4的形状。
按压部件6是具有与细胞培养袋1的顶面部分21a搭配的平面形状的板状部件，具有平坦的底面6a。
支撑机构7由设置在载置面5上的框架71、从按压部件6的上表面的四角向上方延伸并可上下移动地贯通框架71的导销72、以及将按压部件6向下方下压的压力施加单元73构成。压力施加单元73将按压部件6向细胞培养袋1下压，对细胞培养袋1施加压力。施加的压力可以通过压力施加单元73对按压部件6下压的力或下压的高度进行调节来调整。压力施加单元73只要是能够将按压部件6以规定的力下压或下压到规定的高度的结构即可，可以具有由螺钉、弹簧、磁铁或它们的组合组成的结构。
图5是示出了在本发明中可利用的培养装置的另一个例子的立体图。图5的培养装置100’包括具备载置面5a的载置台5以及经由铰链9’与该载置台5连接的上盖8’，上盖8’构成为能够以铰链9’为轴开闭。上盖8’由具有与细胞培养袋1的顶面部分21a搭配的平坦的底面6a的按压部件6、从按压部件6的上表面的四角向上方延伸并可上下移动地贯通上盖8’的导销(未图示)、以及将按压部件6向细胞培养袋1下压的压力施加单元(未图示)构成。
在将细胞培养袋1收容在培养装置100’中时，首先，使上盖8’处于经由铰链9’打开的状态(图5的(a))，然后，在具有容纳多个凹部的开口部(未图示)的载置面5a上载置细胞培养袋1后，如图5的(b)所示关闭上盖8’并通过锁定机构10’维持。对细胞培养袋1的压力的施加可以通过压力施加单元将按压部件6向下方下压直到施加规定的压力来进行。
另外，上述图4和图5均示出了使用了细胞培养袋1的例子，但在使用细胞培养袋1’的情况下，只要利用作为载置台的载置台5’那样包括能够在细胞培养袋1’上形成凹部的载置面5a’的载置台即可，除此之外，可以分别使用具有与上述培养装置同样结构的培养装置。
3.细胞
在本发明中，用于制造细胞聚集体的细胞没有特别限定，例如可以举出多能干细胞或其分化诱导细胞、神经干细胞、肝细胞、角膜干细胞、胰岛细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、成肌细胞、软骨细胞、血管内皮细胞等。另外，也可以混合多个细胞并使用，形成作为类器官的细胞聚集体。
在本发明中，“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指胚胎干细胞(ES细胞)及潜在地具有与之相同的分化多能、即分化为生物体的各种组织(内胚层、中胚层、外胚层全部)的能力的细胞。作为具有与ES细胞同样的分化多能的细胞，可以举出“诱导性多能干细胞”(本说明书中，有时也称为“iPS细胞”)。优选地，在本发明中，多能干细胞是人类多能干细胞。“诱导性多能干细胞”是指通过将特定因子(核重编程因子)导入哺乳动物体细胞或未分化干细胞以对其重编程而得到的细胞。目前，“诱导性多能干细胞”有许多种类，除了山中等通过将Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc这四种因子导入小鼠成纤维细胞内，从而建立的iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.，Cell，(2006)126：663-676)之外，还可以使用将同样的四种因子导入人成纤维细胞内而建立的人细胞来源的iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.等人，Cell，(2007)131：861-872.)、在导入上述四种因子后，以Nanog的表达作为指标进行分选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita，K.，Ichisaka，T.和Yamanaka，S.(2007).Nature 313-317.)、通过不包括c-Myc的方法制作的iPS细胞(Nakagawa M，Yamanaka S.等人，NatureBiotechnology，(2008)101-106))、通过无病毒导入了六种因子而建立的iPS细胞(Okita K等人，Nat.Methods 2011May；8(5)：409-12，Okita K等人，Stem Cells.31(3)：458-66.)。另外，还可以使用Thomson等制作的、导入了OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28这四种因子而建立的诱导性多能干细胞(Yu J.,Thomson JA.等人，Science(2007)318：1917-1920.)、Daley等制作的诱导性多能干细胞(Park IH,Daley GQ.等人，Nature(2007)451：141-146)、樱田等制作的诱导性多能干细胞(日本特开第2008-307007号)等。此外，还可以使用已公开的所有论文(例如，Shi Y.，Ding S.等人，Cell Stem Cell，(2008)Vol3，Issue 5，568-574；、KimJB.，Scholer HR.等人，Nature，(2008)646-650；Huangfu D.，Melton，DA.等人，NatureBiotechnology，(2008)26，No 7，795-797)、或者专利(例如日本特开第2008-307007号、日本特开第2008-283972号、US 2008/2336610、US 2009/047263、WO 2007/069666、WO 2008/118220、WO2008/124133、WO 2008/151058、WO 2009/006930、WO 2009/006997、WO 2009/007852)中记载的该领域公知的诱导性多能干细胞中的任一种。
另外，上述多能干细胞的“分化诱导细胞”意指通过分化诱导多能干细胞而得到的规定表型或标记的表达而表征的细胞。“标记”意指“标记蛋白”、“标记基因”等通过规定的细胞型特异性表达的细胞抗原或其基因。优选地，标记为细胞表面标记，此时，可以实施生存细胞的浓缩、分离和/或检出。标记可以是阳性选择标记或阴性选择标记。
标记蛋白的检出可以利用使用了针对该标记蛋白的特异性抗体的免疫学测定(免疫染色、流式细胞术等)来进行。标记基因的检出可以利用该领域公知的核酸扩增方法和/或核酸检出方法(RT-PCR、微阵列、生物芯片等)来进行。例如，标记蛋白为“阳性”意指通过流式细胞术检出为阳性，“阴性”意指通过流式细胞术检测为检出限以下。另外，标记基因为“阳性”意指通过RT-PCR被检出，“阴性”意指通过RT-PCR检测为检出限以下。
作为在本发明中可利用的分化诱导细胞，例如可以举出由多能干细胞分化诱导得到的胰岛素分泌细胞。胰岛素分泌细胞包括胰岛素产生细胞和/或胰岛β细胞。
“胰岛素产生细胞”、“胰岛β细胞”是根据公知的方法(WO 2009/012428、WO 2016/021734、Stem Cell Research(2015)14、185-197)由多能干细胞分化诱导得到的细胞。胰岛素产生细胞是由胰岛素和NK6同源框1(NKX6.1)中的至少一种标记的表达进行表征的细胞。胰岛β细胞是比胰岛素产生细胞成熟的细胞，可由MAFA、UCN3和IAPP中的至少一种标记的表达进行表征。
在本发明中可利用的细胞可以是从生物体采集的细胞，也可以是培养细胞，还可以是将这些细胞冻融的细胞。细胞使用解离或分散的状态。
4.细胞的培养及细胞聚集体的回收
其特征在于，向细胞培养袋中加入细胞和培养基并进行搅拌，并在对该袋施加压力的状态下在该袋内进行培养。
培养基可以适当选择与使用的细胞对应的适合的培养基来利用。细胞及培养基使用蠕动泵等泵或注射器等送液单元从细胞培养袋所包括的端口投入，并搅拌。通过搅拌，在后面的工序中，能够使进入细胞培养袋下表面的各凹部的细胞的数量大致均等。搅拌可以在对细胞培养袋施加压力之前的任意时机进行一次或多次。例如，搅拌可以在将细胞培养袋载置在培养装置的载置台上之前或载置之后，或者在通过培养装置对细胞培养袋施加压力之前进行。搅拌可以通过人工或机械臂进行，和/或可以使用振动子(振动器)进行。
加入到细胞培养袋中的细胞的数量可以根据细胞培养袋的尺寸、细胞培养袋下表面的凹部的尺寸和数量、使用的细胞的种类、期望的细胞聚集体的尺寸等因素适当调整，没有特别限定，优选1×105个细胞/mL～1×107个细胞/mL、更优选5×105个细胞/mL～5×106个细胞/mL的范围，和/或1×104个细胞/cm2～5×106个细胞/cm2、更优选1×105个细胞/cm2～2×106个细胞/cm2的范围，可以是更优选的量。如果加入的细胞数超出了以上范围(太少或太多)，则可能不能以均一的尺寸大量地制造细胞聚集体。
加入到细胞培养袋中的培养基的量可以根据细胞培养袋的尺寸、加入到细胞培养袋中的细胞的数量、培养时间段、期望的细胞聚集体的尺寸等因素适当调整，没有特别限定，可以是对细胞培养袋施加压力时加入到细胞培养袋中培养基的液深(与培养液接触的下表面膜平坦面(除去凹部的部位)的内表面到上表面膜内表面的距离)优选为1mm～20mm左右、更优选为2mm～8mm左右的量。在细胞接种时，如果加入到细胞培养袋中的培养基较多，则液深变高，液深变高，相应地，细胞沉降需要更多的时间，在此期间由于热对流等而产生水平方向上的移动，有时不能以均一的浓度沉降，有时不能使进入各凹部的细胞的数量大致均等。在这种情况下，可以减少在细胞接种时加入的培养基的量，在细胞聚集体形成后追加培养基。
对细胞培养袋的压力的施加可以使用上述培养装置来进行，可以通过用载置细胞培养袋的载置台和面向细胞培养袋的顶面部分的按压部件夹紧细胞培养袋来进行。
通过培养装置对细胞培养袋施加的压力的大小，可以拉伸在面向按压部件的柔性上表面膜和/或下表面膜上形成的“皱折”、“褶皱”、“弯曲”、“挠曲”等，只要能够使细胞培养袋中的液深均一即可，可以根据细胞培养袋的大小和深度、细胞培养袋的材质、加入到细胞培养袋中的培养基的量等因素适当调节，没有特别限定，优选为从0.001kgf/cm2～0.1kgf/cm2、更优选为从0.002kgf/cm2～0.05kgf/cm2的范围选择的值。如果施加的压力的大小过小，则无法拉伸在上表面膜和/或下表面膜上形成的“皱折”、“褶皱”、“弯曲”、“挠曲”等，可能无法使细胞培养袋中的液深均一，因此，可能无法使最终得到的细胞聚集体的粒径基本均一。另一方面，如果施加的压力的大小过大，则有时会引起细胞培养袋的破损、影响细胞的生存/增殖。
细胞的培养在通过培养装置维持对细胞培养袋施加压力的状态下进行。由此，液深保持均一，由于液深的均一性，能够使进入凹部内的细胞数大致均等和/或使培养基成分大致均一。细胞进入凹部内后，在其中进行细胞的聚集，形成细胞聚集体。培养条件，根据使用的细胞，培养可以在调整到适当的温度(30℃～40℃，例如37℃)、CO2浓度(5％～10％，例如5％)、以及湿度(90％～95％，例如95％)的孵化器内进行。在使包括细胞培养袋的培养装置向孵化器内移动的情况下，也可以通过人工或机械臂进行。培养的时间段可以根据期望的细胞聚集体的尺寸、细胞的种类等因素适当决定，没有特别限定，例如为1天～10天、优选2天～7天。另外，根据需要，也可以进行培养基的交换。
接着，培养结束后，在释放施加的压力之后，对形成的细胞聚集体进行回收。形成的细胞聚集体的回收可以使用能够使细胞聚集体从凹部浮起在培养基中并取出的任意手段。作为这样手段，可以使用物理手段，使细胞培养袋上下翻转、对细胞培养袋施加振动、可以利用从细胞培养袋的外侧例如利用突起状的部件顶起凹部(日本特开2019-118319)、从载置面提起细胞培养袋使凹部平坦化(在凹部由载置面的凹陷形成的情况下)等手段。这些手段可以通过人工或机械臂进行，和/或可以使用振动子(振动器)进行。或者，也可以通过经由细胞培养袋的端口向细胞培养袋中注入空气或培养基或生理盐水等适当的缓冲液而产生的喷流，使细胞聚集体从凹部浮起并取出。浮在培养液中的细胞聚集体可以从细胞培养袋所包括的端口与培养基等一起回收。
5.细胞聚集体
根据本发明方法，可以简便且大量地制造具有基本均一的粒径的细胞聚集体。
所制造的细胞聚集体的数量可以基于细胞培养袋的下表面所包括的凹部的数量来调整，没有特别限定，优选为10万个～100万个或30万个～100万个。
“具有基本均一的粒径”意指所制造的细胞聚集体的70％及以上、优选80％及以上、更优选90％及以上、进一步优选95％及以上具有在细胞聚集体的粒径的中央值±10％以内、优选±5％以内的粒径。细胞聚集体的粒径及粒径分布的测定，例如可以通过使用利用显微镜观察的测量、动态光散射法、激光衍射法、离心沉降法、FFF法、电敏感区法等以往公知的方法中的一种来进行或将它们中的多种组合起来进行。
所制造的细胞聚集体的大小可以根据使用的细胞的种类和数量、细胞培养袋的尺寸、细胞培养袋下表面的凹部的尺寸和数量、培养时间段等因素而变化，例如，在一个实施方式中，所制造的细胞聚集体的70％及以上、优选80％及以上、更优选90％及以上、进一步优选95％及以上可以具有100μm～200μm、优选120μm～180μm、更优选140μm～160μm的粒径。当细胞聚集体的大小大于以上范围时，可能存在对细胞施加较大应力的情况或细胞凋亡的数量增加的情况，从而妨碍细胞聚集体的形成。
细胞聚集体中含有的细胞的数量可以根据使用的细胞的种类和数量、细胞培养袋的尺寸、细胞培养袋下表面的凹部的尺寸和数量、培养时间段等因素而变化，但每个细胞聚集体中含有的细胞的数量为200个～2000个左右。
所制造的细胞聚集体可移植到动物生物体内用于细胞移植治疗。所制造的细胞聚集体可直接或胶囊化或与生物降解性水凝胶一起凝胶化后移植到患部，因此，作为治疗疾病的细胞医药是有用的。
另外，所制造的细胞聚集体也可以作为前药使用。“前药”是指移植到生物体内后发生分化，转化为具有治疗疾病功能的细胞的细胞群。
此外，所制造的细胞聚集体也可以直接或与药理学上可容许的载体等混合作为药物组合物施用于治疗对象。
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
实施例1：使用胰岛素产生细胞制造细胞聚集体
1.胰岛素产生细胞的制备
胰岛素产生细胞按照以往公知的方法(WO 2009/012428、WO 2016/021734、StemCell Research(2015)14，185-197))，由人iPS细胞进行分化诱导来制备。
人iPS细胞使用了京都大学建立的Ff-I14s04株。
进行分化诱导时，首先将未分化的iPS细胞接种到生物反应器中。用EDTA溶液处理培养皿上维持的iPS细胞，使其解离直至成为单一细胞。接着，将分散在培养基中的iPS细胞，以每个生物反应器6×106个细胞的密度接种在其中，在37℃下进行悬浮搅拌培养。作为接种时的培养液，使用添加了10μM Y-27632的Stem FitAK03N培养基，培养1天形成细胞聚集块。
然后诱导iPS细胞向内胚层细胞的分化。用包含激活素A(10ng/mL)(PeproTech)、作为GSK3β抑制剂的CHIR99021(3μM)(AxonMedchem)、1％二甲亚砜(富士胶片和光纯药)、1％B-27(注册商标)(ThermoFisherScientific)、以及0.1％普朗尼克(注册商标)F68(Sigma)的杜氏改良Eagle培养基(Thermo Fisher Scientific)交换，培养1天，接着，使用包含激活素A(10ng/mL)(PeproTech)、1％二甲亚砜(富士胶片和光纯药)、不含胰岛素的B-27(注册商标)(Thermo Fisher Scientific)、以及0.1％普朗尼克F68(Sigma)的杜氏改良Eagle培养基培养2天。
然后根据以往公知的方法(WO 2009/012428、WO 2016/021734、Stem CellResearch(2015)14，185-197)、(NatureBiotechnology 2014；32:1121-1133)，实施由内胚层细胞向内分泌前体细胞的分化诱导。
接着，进行由内分泌前体细胞向胰岛素产生细胞的分化诱导。将内分泌前体细胞在包含1％B-27(注册商标)、L-抗坏血酸磷酸酯镁盐(58mg/L)(富士胶片和光纯药)、激活素受体样激酶5抑制剂II(10μM)(SantaCurz)、LDN-193189(100nM)(Medchemexpress)、三碘甲状腺氨酸(1μM)(Sigma)、RO4929097(1μM)(Selleck)、以及0.1％普朗尼克F68(Sigma)的Iscove改良Eagle培养基-option Zn++中培养4天，进一步在添加了PD-166866(1μM)(Sigma)的培养基中培养3天，得到胰岛素产生细胞。使用TrypLE(注册商标)Select(Thermo FisherScientific)将得到的胰岛素产生细胞分散为单一细胞。
2.细胞聚集体的制造
制作具有与图1所示的细胞培养袋同样结构的细胞培养袋作为细胞培养袋使用。即，由2片厚度100μm由聚乙烯构成的气体透过性柔性膜重叠并对周围进行熔接而成，具有包括端口的结构。细胞培养袋的下表面膜在700cm2的下表面包括4.5×105个深度150μm、直径350μm的凹部(以每下表面单位面积642个凹部/cm2包括凹部)，上表面膜具有以4mm的高度鼓出的鼓出形状。膜的内表面用磷脂聚合物进行细胞低粘附涂覆。
培养装置使用图5所示的培养装置。
在细胞培养袋中将包含以往公知的方法(Nature Biotechnology 2014；32:11121-1133))的分化因子(三碘甲状腺氨酸、激活素受体样激酶5抑制剂II、硫酸锌、肝素、N-乙酰半胱氨酸、Trolox、R428)、ROCK抑制剂(Y27632等)、成纤维细胞生长因子受体抑制剂(PD-166866等)等的培养基(MCDB131/20mM葡萄糖/碳酸氢钠/不含脂肪酸牛血清白蛋白/ITS-X/Glutamax/抗坏血酸/青霉素-链霉素))与上述制备的胰岛素产生细胞(1.25×106个细胞/mL)一起封入，关闭端口，将细胞培养袋倒置平放使得凹部在上，用双手从上方按住并交替按压，以对袋内进行搅拌。接着，搅拌后立即翻转细胞培养袋使凹部在下并载置在培养装置的载置台上，用按压部件从袋的上表面施加2kgf的压力。以这种形式，将培养装置转移到孵化器内，在37℃、5％CO2条件下培养4天。
培养结束后，从培养装置取出细胞培养袋翻过来，使在各凹部中形成的各细胞聚集体从凹部浮起到培养用培养基中。将注射器连接至端口，将细胞聚集体与培养用培养基一起从端口回收。细胞培养袋内残留的细胞聚集体很少，几乎所有的细胞聚集体都能够被回收。
回收的细胞聚集体的照片图示于图6。对于回收的细胞聚集体的细胞，对标记蛋白的表达进行了流式细胞术分析，结果显示含有41.6％的同时表达胰岛素和NKX6.1的细胞，确认了胰岛素产生细胞的制造。
将含有回收的细胞聚集体的培养用培养基全部转移到175cm2烧瓶中，用安装在相差显微镜上的照相机拍摄细胞聚集体，根据该图像测量各细胞聚集体的粒径。结果示于图7。
回收的细胞聚集体的70％及以上具有在细胞聚集体的粒径的中央值±10％以内的粒径，具有140μm～160μm的粒径。
根据该结果，确认了根据本发明方法，可以大量且简易地制造具有基本均一的粒径的细胞聚集体。
实施例2：使用iPS细胞制造细胞聚集体
1.iPS细胞的制备
人iPS细胞(1231A3株)根据京都大学iPS细胞研究所(CiRA)公开的方案进行继代培养，用TrypLE+EDTA剥离，悬浮在添加了1％ROCK抑制剂(Y27632)的StemFit培养基(味之素)中。
2.细胞聚集体的制造
制作具有与图1所示的细胞培养袋同样结构的细胞培养袋作为细胞培养袋使用。即，由2片厚度100μm由聚乙烯构成的气体透过性柔性膜重叠并对周围进行熔接而成，具有包括端口的结构。细胞培养袋的下表面膜在50cm2的下表面包括1.8×105个深度200μm、直径500μm的凹部(以每下表面单位面积360个凹部/cm2包括凹部)，上表面膜具有以4mm的高度鼓出的鼓出形状。膜的内表面用磷脂聚合物进行细胞低粘附涂覆。
在细胞培养袋中封入上述细胞悬浮液20mL(2.25×105个细胞/mL)，关闭端口，将细胞培养袋倒置平放使得凹部在上，用双手从上方按住并交替按压，以对袋内的悬浮液进行搅拌。接着，搅拌后立即翻转细胞培养袋使凹部在下并载置在培养装置的载置台上，用按压部件从袋的上表面施加2kgf的压力。另一方面，对于不施加压力的对照，除了不施加该2kgf的压力以外，同样地进行操作。以这种形式，将培养装置转移到孵化器内，在37℃、5％CO2条件下培养2天。
培养结束后，从培养装置取出细胞培养袋翻过来，使在各凹部中形成的各细胞聚集体从凹部浮起到培养用培养基中。将注射器连接至端口，从端口对包含细胞聚集体的培养用培养基进行回收。
将含有回收的细胞聚集体的培养用培养基全部转移到10cm培养皿中，用安装在相差显微镜上的照相机拍摄细胞聚集体，根据该图像测量各细胞聚集体的粒径。结果示于图8。
对回收的细胞聚集体的粒径的偏差进行比较，不施加压力进行培养所制造的细胞聚集体的粒径为粒径中心值的±10％左右，而施加压力的同时进行培养得到的细胞聚集体的粒径为粒径中心值的±5％左右。
根据该结果，确认了根据本发明方法，可以大量且简易地制造具有基本均一的粒径的细胞聚集体。
标号说明
1、1’ 细胞培养袋
2、2’ 袋主体
20、20’ 周边部
21、21’ 上表面膜
21a、21a’ 顶面部分
21b、21b’ 倾斜部分
22、22’ 下表面膜
3、3’ 端口
4、4’ 凹部
5、5’ 载置台
5a、5a’ 载置面
5b 开口部
5b’ 凹陷
6 按压部件
6a 底面
7 支撑机构
71 框架
72 导销
73 压力施加单元
8’ 上盖
9’ 铰链
10’ 锁定机构
100、100’、100” 培养装置
11 细胞聚集体

Claims (28)

1.一种使用细胞培养袋制造细胞聚集体的方法，其中，
所述细胞培养袋具有上表面和下表面，并且在所述下表面上包括多个凹部，所述方法包括：
(1)向所述细胞培养袋中加入细胞和培养基并进行搅拌，并在从至少一个方向对所述细胞培养袋施加压力的同时进行培养的工序；以及
(2)培养结束后对形成的细胞聚集体进行回收的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，对10万个～100万个细胞聚集体进行回收。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，回收的细胞聚集体具有基本均一的粒径。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述回收的细胞聚集体的70％及以上具有在细胞聚集体的粒径的中央值±10％以内的粒径。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述回收的细胞聚集体的70％及以上具有140μm～160μm的粒径。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述回收的细胞聚集体每个包含200个～2000个细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述细胞为冻融的细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述细胞为胰岛素分泌细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，使所述细胞培养袋上下翻转来对所述细胞聚集体进行回收。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，向所述细胞培养袋中注入空气来对所述细胞聚集体进行回收。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述在从至少一个方向对所述细胞培养袋施加压力的同时进行培养的工序是在从所述细胞培养袋的上方、下方或上下两方施加压力的同时进行培养的工序。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述在从至少一个方向对所述细胞培养袋施加压力的同时进行培养的工序是在从所述细胞培养袋的上方施加压力的同时进行培养的工序。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述凹部的深度与直径之比为1:1.5～2.5。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述凹部为球冠状。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述凹部的间距为0.35mm～0.49mm。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述凹部的深度为150μm～220μm。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述细胞培养袋中的液深为1.5mm～6mm。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，以1×105～1×107个细胞/mL的量向所述细胞培养袋中加入细胞。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，以1×104～5×106个细胞/cm2的量向所述细胞培养袋中加入细胞。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，在所述细胞聚集体形成后追加培养基。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述下表面包括10万个～100万个凹部。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，以每下表面单位面积1个凹部/cm2～1000个凹部/cm2包括凹部。
23.一种用于移植的细胞聚集体群，所述细胞聚集体群的70％及以上具有140μm～160μm的粒径。
24.根据权利要求23所述的细胞聚集体群，包含10万个～100万个细胞聚集体。
25.根据权利要求23或24所述的细胞聚集体群，包含胰岛素分泌细胞。
26.一种细胞培养袋，所述细胞培养袋包含10万个～100万个具有基本均一的粒径的细胞聚集体。
27.根据权利要求26所述的细胞培养袋，其中，所述细胞聚集体的70％及以上具有140μm～160μm的粒径。
28.根据权利要求26或27所述的细胞培养袋，其中，所述细胞聚集体包含胰岛素分泌细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111511898A (zh) * 2018-01-09 2020-08-07 东洋制罐集团控股株式会社 细胞培养方法及装置

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP1691603S (zh) * 2020-10-13 2021-08-02
USD1069159S1 (en) * 2020-10-13 2025-04-01 Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. Cell culture bag
USD1069158S1 (en) * 2020-10-13 2025-04-01 Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. Cell culture bag
CN114308177B (zh) * 2021-12-30 2023-02-10 昕慕(江苏)生物医药科技有限公司 一种细胞培养袋用细胞收获支架及使用方法
JP7264360B1 (ja) 2022-06-29 2023-04-25 ティシューバイネット株式会社 立体細胞構造体作製する培養バッグ

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016086774A (ja) * 2014-11-07 2016-05-23 株式会社フコク 接着性細胞の培養方法
CN107735491A (zh) * 2015-06-22 2018-02-23 东洋制罐集团控股株式会社 细胞培养方法、细胞培养用治具及细胞培养装置
JP2019118319A (ja) * 2018-01-09 2019-07-22 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE334609T1 (de) 2004-04-10 2006-08-15 Henkel Kgaa Lockenwickler
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
EP4223769A3 (en) 2005-12-13 2023-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
US7661738B2 (en) 2006-11-28 2010-02-16 Veritainer Corporation Radiation detection unit for mounting a radiation sensor to a container crane
EP3878949B1 (en) 2007-04-07 2025-06-04 Whitehead Institute for Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
CN101802172A (zh) 2007-05-30 2010-08-11 通用医疗公司 由体细胞产生多能细胞的方法
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
JP5098471B2 (ja) * 2007-07-06 2012-12-12 株式会社フコク 細胞培養用トレイ状容器並びに同容器への収容物の充填方法
US20100255580A1 (en) 2007-07-18 2010-10-07 Lifesccan, Inc. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells
EP2615161B1 (en) 2010-09-06 2019-12-25 Toyo Seikan Kaisha, Ltd. Cell culture container formed by a multilayer film
CN106795487B (zh) 2014-08-04 2021-11-19 武田药品工业株式会社 胰腺祖细胞的增殖方法
EP3081638A1 (en) * 2015-04-16 2016-10-19 Kyoto University Method for producing pseudo-islets
JP7035343B2 (ja) * 2017-06-15 2022-03-15 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP6975510B2 (ja) 2018-12-12 2021-12-01 大阪シーリング印刷株式会社 ヒートシール用フィルム

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016086774A (ja) * 2014-11-07 2016-05-23 株式会社フコク 接着性細胞の培養方法
CN107735491A (zh) * 2015-06-22 2018-02-23 东洋制罐集团控股株式会社 细胞培养方法、细胞培养用治具及细胞培养装置
JP2019118319A (ja) * 2018-01-09 2019-07-22 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
CN111511898A (zh) * 2018-01-09 2020-08-07 东洋制罐集团控股株式会社 细胞培养方法及装置

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111511898A (zh) * 2018-01-09 2020-08-07 东洋制罐集团控股株式会社 细胞培养方法及装置
CN111511898B (zh) * 2018-01-09 2024-01-02 东洋制罐集团控股株式会社 细胞培养方法及装置

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