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WO2016104717A1 - 肝細胞誘導方法 - Google Patents

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WO2016104717A1
WO2016104717A1 PCT/JP2015/086260 JP2015086260W WO2016104717A1 WO 2016104717 A1 WO2016104717 A1 WO 2016104717A1 JP 2015086260 W JP2015086260 W JP 2015086260W WO 2016104717 A1 WO2016104717 A1 WO 2016104717A1
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WO
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cell
stage
hepatocytes
medium
Prior art date
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PCT/JP2015/086260
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English (en)
French (fr)
Inventor
健二 長船
真希 小高
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
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Publication date
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    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.
  • liver transplantation is currently being performed as a radical treatment for these diseases. Since liver transplantation is highly invasive, safer hepatocyte transplantation has been proposed. However, since hepatocyte transplantation requires a large amount of cells at once, a shortage of donors is a problem.
  • Hepatic toxicity can be cited as the main cause leading to the discontinuation of the development of drug candidate compounds.
  • in vitro toxicity evaluation using human primary cultured hepatocytes has been conducted.
  • primary cultured hepatocytes are difficult to stably supply in a uniform lot, the problem is that test results are not stable.
  • hepatocytes for transplantation and drug discovery are produced using pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • An object of the present application is to provide a method for inducing differentiation of hepatocytes in vitro from hepatoblasts. Another object of the present application is to provide an in vitro method for inducing hepatoblasts from endoderm cells and then inducing differentiation of hepatocytes from hepatoblasts. More specifically, the present application provides an in vitro method for inducing endoderm cells from pluripotent stem cells, inducing hepatoblasts from endoderm cells, and further inducing hepatocyte differentiation from hepatoblasts. Let it be an issue.
  • the present inventors induced hepatoblasts by culturing endoderm cells in a medium containing dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as DMSO). It was found for the first time that differentiation into hepatocytes can be induced by culturing in a medium containing pregnenolone or an adrenergic agonist. The present invention has been completed based on such knowledge.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present invention has the following features: [1] A method for producing hepatocytes, comprising a step of culturing hepatoblasts in a medium containing pregnenolone or an adrenergic agent, wherein the hepatoblasts are AFP positive. [2] The method according to [1], wherein the adrenergic agent is a reagent selected from the group consisting of adrenaline, noradrenaline, ethylephrine, naphazoline, phenylephrine, methoxamine and middolin.
  • the hepatoblasts are cells produced by a method comprising a step of culturing endoderm cells in a medium containing DMSO, and the endoderm cells are SOX17-positive cells [1] to [3 ] The method of any one of these.
  • the endoderm cells are cells produced by a method comprising culturing pluripotent stem cells in a medium containing Activin A and a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • a method for producing hepatocytes from pluripotent stem cells comprising the following steps (i) to (iii): (I) culturing pluripotent stem cells in a medium containing Activin A and a GSK-3 ⁇ inhibitor; (Ii) a step of culturing the cells obtained in step (i) in a medium containing DMSO, and (iii) a drug selected from the group consisting of pregnenolone and an adrenergic agonist in cells obtained in step (ii) Culturing in a medium containing Said method.
  • adrenergic agent is a reagent selected from adrenaline, noradrenaline, ethylephrine, naphazoline, phenylephrine, methoxamine and middolin.
  • the adrenergic agent is a reagent selected from ethylephrine, phenylephrine and methoxamine.
  • Endoderm cells can be derived from pluripotent stem cells, and the method of the present invention can provide hepatocytes with stable properties. All the hepatocyte induction methods of the present invention are performed in vitro. The hepatocytes produced by the method of the present invention can be used for regenerative medicine for liver diseases such as liver failure, drug efficacy and safety evaluation, and the like.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram for inducing hepatocytes from human iPS cells.
  • FIG. 2A shows an image obtained by immunostaining cells induced with each drug (DMSO, HGF + oncostatin M, methoxamine hydrochloride and pregnenolone) with anti-albumin antibody in Stage 3.
  • FIG. 2B shows the results of measuring the albumin positive cell rate when induced with each drug (DMSO, HGF + oncostatin M, methoxamine hydrochloride and pregnenolone) in Stage 3.
  • FIG. 2A shows an image obtained by immunostaining cells induced with each drug (DMSO, HGF + oncostatin M, methoxamine hydrochloride and pregnenolone) with anti-albumin antibody in Stage 3.
  • FIG. 2B shows the results of measuring the albumin positive cell rate when induced with each drug (DMSO, HGF + oncostatin M, methoxamine hydrochloride and pregnenolone) in
  • FIG. 3 shows the results of measuring the mRNA expression level of albumin in cells induced with each drug (DMSO, HGF + Oncostatin M, methoxamine hydrochloride and pregnenolone) by q-PCR in Stage 3.
  • the value on the vertical axis represents a relative value when Day 0 is 1 in the fluorescence intensity corrected using the expression level of ⁇ -actin mRNA as an internal standard.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the albumin positive cell rate in cells induced with each drug (DMSO, ethylephrine, phenylephrine, methoxamine, HGF + oncostatin M) in Stage 3.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the mRNA expression level of albumin in cells induced with each drug (DMSO, ethylephrine, phenylephrine, methoxamine, HGF + oncostatin M) by q-PCR in Stage 3. Shown as a relative value with the first day of Stage IV2 taken as 1.
  • FIG. 6 shows the amount of albumin secretion in cells induced with each drug (medium (only (DMSO), ethylephrine, phenylephrine, methoxamine, HGF + oncostatin M) in Stage ⁇ 3.
  • HepG2 cells indicate the amount of albumin secreted from human liver cancer-derived cell lines.
  • FIG. 7 shows Panc1 (human pancreatic cancer-derived cell line), HepG2 (human liver cancer-derived cell line), cells derived from HGF + Oncostatin M in Stage 3 (HGF + OsM), or 1 ⁇ M methoxamine in Stage 3 5 shows the results of measuring the mRNA expression level of CYP1A1 by q-PCR when 100 ⁇ M omeprazole was added (+) or not added ( ⁇ ) to the cells induced in this manner.
  • the mRNA expression level of CYP1A1 is expressed as a relative value to the mRNA expression level of ⁇ -actin.
  • FIG. 8 shows cells induced with DMSO in HepG2, Stage 3 (DMSO), cells induced with HGF + Oncostatin M in Stage 3 (HGF + OsM), or induced with 1 ⁇ M methoxamine in Stage 3 1 mg / ml of ICG (Indocyanine green) added to cultured cells (methoxamine) and cultured for 1 hour, micrograph (upper figure), Oil of each cell (HepG2, DMSO, HGF + oncostatin M and methoxamine) A Red stained image (middle figure) and a PAS stained image (lower figure) are shown.
  • FIG. 1 shows cells induced with DMSO in HepG2, Stage 3 (DMSO), cells induced with HGF + Oncostatin M in Stage 3 (HGF + OsM), or induced with 1 ⁇ M methoxamine in Stage 3 1 mg / ml of ICG (Indocyanine green) added to cultured cells (methoxamine) and cultured for
  • FIG. 9A shows immunostained images obtained by staining cells induced with each drug (DMSO, HGF + oncostatin M, methoxamine and pregnenolone) with anti-CYP3A4 antibody in Stage 3.
  • FIG. 9B shows the results of q-PCR measurement of CYP3A4 mRNA expression level in cells induced with each drug (DMSO, HGF + oncostatin M, methoxamine and pregnenolone) in Stage 3.
  • the mRNA expression level of CYP3A4 is expressed as a relative value to the expression level in cells induced with DMSO.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the expression level of albumin mRNA by q-PCR in Stage 3 using methoxamine at various concentrations.
  • St2d6 shows the result of Stage 6 day 6
  • GFs shows the result of using HGF + Oncostatin M.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the mRNA expression levels of CYP1A1, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP2A19 and TAT in cells induced under each condition by q-PCR.
  • undiff indicates the result of iPS cells
  • D6 indicates the results of cells on differentiation induction day 6
  • D12 indicates the results of differentiation induction cells on day 12
  • D20 (-) indicates The results of differentiation-induced 20th day cells cultured without addition to Hepatocyte Culture Medium at Stage 3 are shown.
  • D20 GFs are the results of the differentiation of 20th day cells induced by addition of HGF + oncostatin M at Stage 3. The results are shown, and D20 Metho shows the results of cells on the 20th day induced to differentiate by adding methoxamine in StageSt3.
  • FIG. 12 shows the results of measuring the mRNA expression levels of CYP3A4, CYP1A2, and CYP2B6 in cells induced under each condition by q-PCR.
  • CYP3A4 shows the results with 40 ⁇ M rifampicin added (Rif (+)) or without (Rif ( ⁇ )), and CYP1A2 with 40 ⁇ M omeprazole added (Ome (+)) or without (Ome ( ⁇ )).
  • CYP2B6 shows the result of addition (Phe (+)) or no addition (Phe (-)) of 100 ⁇ M phenobarbital.
  • HepG2 shows the results in HepG2 cells
  • GFs shows the results of cells induced to differentiate by adding HGF + Oncostatin M at Stage 3
  • Metho differentiated by adding methoxamine at Stage 3 Results of induced cells are shown.
  • FIG. 13 shows the amount of albumin secretion in cells induced by the method of the present invention using each iPS cell line.
  • FIG. 14 shows the results of FACS after induction by the method of the present invention using iPS cells into which GFP was incorporated under the promoter of albumin.
  • FIG. 15 shows the amount of albumin secretion in cells induced by the method of the present invention using each iPS cell line.
  • DMSO shows the results of cells induced to differentiate by adding DMSO at Stage 3
  • GFs shows the results of cells induced to differentiate by adding HGF + Oncostatin M at Stage 3
  • (- ) Shows the results of cells induced to differentiate by adding only methoxamine at Stage 3
  • ⁇ 1 shows the results of cells induced to differentiate by adding methoxamine and doxazosin at Stage 3
  • ⁇ 2 shows the results of StageSt3 1 shows the results of cells induced to differentiate by adding methoxamine and yohimbine
  • ⁇ 1 shows the results of cells induced to differentiate by adding methoxamine and metoprolol at Stage 3
  • ⁇ 1 shows the results of methoxamine and The result of the cell which induced the differentiation by adding butoxamine is shown.
  • FIG. 16 shows the results of comparison of gene expression profiles of hepatocytes induced to differentiate from human iPS cells by RNA-sequencing analysis, and shows principal component analysis (PCA).
  • FIG. 17 shows the result of comparison of gene expression profiles of hepatocytes induced to differentiate from human iPS cells by RNA-sequencing analysis, and shows a heat map of liver marker gene expression.
  • FIG. 18 shows a schematic diagram for inducing hepatocytes from mouse ES cells.
  • FIG. 19 shows the expression of Tat, Cyp3a11, Cyp3a13 and ⁇ -actin in cells induced under each condition.
  • the present invention provides a method for producing hepatocytes, comprising a step of culturing hepatoblasts in a medium containing a drug selected from the group consisting of pregnenolone and adrenergic agonist.
  • hepatocytes are defined as cells expressing albumin mRNA.
  • hepatocytes may accumulate hepatic cells such as glycogen accumulation, low density lipoprotein (LDL) uptake, albumin secretion, ammonia metabolism and urea synthesis, cytochrome P450 activity, lipid metabolism, drug metabolism, etc. It may be defined as a cell characterized by any one or a combination of known functions. Determination of hepatocytes can be confirmed by the expression of a protein related to such a function.
  • the hepatocytes may be provided as a cell population containing other cell types, or may be a purified population. Preferably, the cell population contains 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more of hepatocytes.
  • a hepatoblast is a cell having the ability to differentiate into hepatocytes and bile duct epithelial cells, and is at least one marker selected from the group consisting of AFP, Dlk, E-cadherin, Liv2, CD13 and CD133 A cell that is positive for a gene. Preferably, it is an AFP positive cell.
  • hepatoblasts are cultured in a medium containing a drug selected from the group consisting of pregnenolone and adrenergic agonist.
  • the hepatoblast may be provided as a cell population containing other cell types, or may be a purified population.
  • the cell population includes 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100% hepatoblasts.
  • staining is performed using an antibody against a gene marker such as AFP, Dlk, E-cadherin, Liv2, CD13 or CD133, and the stained cells are analyzed using a flow cytometer (FACS) or magnetic cells.
  • FACS flow cytometer
  • the method of concentrating using a separation apparatus (MACS) is illustrated. More preferred is a method using an antibody against Dlk, E-cadherin, Liv2, CD13 or CD133.
  • a commercially available antibody can be appropriately used.
  • the adherent state is maintained and the culture medium containing the hepatoblasts is made from the group consisting of pregnenolone and adrenergic agonist.
  • the method of the present application can be performed by exchanging with a medium containing the selected drug. Further, when the culture of the cell population containing hepatoblasts is provided in a suspended state in the medium, the medium of the cell population culture containing the hepatoblasts was selected from the group consisting of pregnenolone and an adrenergic agonist.
  • the medium can be replaced with a drug-containing medium and cultured as it is under suspension culture conditions, or the cell culture containing the hepatoblasts is selected from the group consisting of pregnenolone and adrenergic agonist using a coated culture dish.
  • Adhesion culture may be performed in a medium containing the prepared drug.
  • the process for producing hepatocytes from hepatoblasts is performed by adhesion culture.
  • hepatoblasts When hepatoblasts are provided as a cell mass in which the cells adhere to each other, they may be cultured after being separated into a single cell state by substantially separating (or dissociating) by any method.
  • the separation method include mechanical separation and separation solution having protease activity and collagenase activity (for example, trypsin and collagenase-containing solution Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc) ) Or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • adhesion culture when producing hepatocytes from hepatoblasts, they may be cultured in a coated culture dish.
  • the coating agent include Matrigel (BD Biosciences), Synthemax (Corning), collagen, gelatin, laminin (preferably exemplified by laminin 111, 411, or 511), heparan sulfate proteoglycan, entactin, or fragments thereof and These combinations are mentioned.
  • culturing under floating conditions means culturing the cells in a non-adherent state with respect to a culture dish.
  • the culture under floating conditions is not particularly limited, but is not artificially treated (for example, coated with an extracellular matrix) for the purpose of improving the adhesion between hepatoblasts and the culture dish, or artificially
  • the treatment can be performed using a treatment that suppresses adhesion (for example, coating treatment with polyhydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA)).
  • the medium used in the process for producing hepatocytes from hepatoblasts according to the present invention can be prepared by appropriately adding a drug selected from the group consisting of pregnenolone and adrenergic agonist to a culture medium for culturing hepatocytes.
  • a culture medium for hepatocytes for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Lonza Inc.
  • HBM TM Basal medium HCM TM SingleQuots TM Kit, HMM TM Basal medium or HMM TM SingleQuots TM Kit, PromoCell's Hepatocyte Growth medium or Hepatocyte Maintenance medium, or Sigma-Aldrich Corp. of Hepatocyte medium and and mixtures of these media Is included.
  • basal media may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • FBS fetal bovine serum
  • serum-free for example, albumin, transferrin, KnockOut Serum Replacement (KSR) (serum replacement during ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid,
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid
  • serum replacements such as insulin, sodium selenite, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol may be included.
  • the medium also includes lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins (eg, nicotinamide, ascorbic acid), growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate,
  • lipids amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins (eg, nicotinamide, ascorbic acid), growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate,
  • vitamins eg, nicotinamide, ascorbic acid
  • growth factors antibiotics, antioxidants, pyruvate
  • antibiotics e.g, ascorbic acid
  • pregnenolone commercially available products such as Sigma-Aldrich can be used.
  • concentration of pregnenolone used in the present invention in the culture medium is 0.01 to 10 ⁇ M, preferably 0.05 to 5 ⁇ M, more preferably 0.1 to 2.5 ⁇ M.
  • an adrenergic agonist is a substance that can act by directly binding to an adrenergic receptor.
  • it is a substance that binds to at least the ⁇ 1 receptor, and examples thereof include an agent selected from the group consisting of adrenaline, noradrenaline, ethylephrine, naphazoline, phenylephrine, methoxamine and middolin.
  • a preferred adrenergic agent in the present invention is an agent selected from the group consisting of ethylephrine, phenylephrine, and methoxamine.
  • the concentration in the medium is 0.01 to 10 ⁇ M, preferably 0.05 to 5 ⁇ M, more preferably 0.1 to 2.5 ⁇ M.
  • the number of days in the step of producing hepatocytes from the hepatoblasts of the present invention has no upper limit because there is no particular effect on the production efficiency of hepatocytes by culturing for a long period of time. For example, 4 days or more, 5 days or more, 6 Day or more, 7 days or more, 8 days or more, 9 days or more, 10 days or more, 11 days or more, 12 days or more, 13 days or more, or 14 days or more. More preferably, it is 4 days or more and 12 days or less, and 8 days.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is preferably about 2-5%.
  • the hepatoblasts of the present invention may be those produced from endoderm cells.
  • a step of culturing endoderm cells in a medium containing dimethyl sulfoxide (DMSO) may be included.
  • an endoderm cell is a cell that differentiates into a cell that forms a tissue of an organ such as the digestive tract, lung, thyroid, pancreas, or liver, and a gene marker such as SOX17, FOXA2, or CXCR4 is expressed.
  • Cells are exemplified. More preferred are cells that are positive for SOX17.
  • the endoderm cells may be provided as a cell population containing other cell types, or may be a purified population. Preferably, it is a cell population containing 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100% endoderm cells.
  • a method of purifying endoderm cells staining with an antibody against a genetic marker such as SOX17, FOXA2, or CXCR4, and using a flow cytometer (FACS) or magnetic cell separator (MACS) for the stained cells
  • FACS flow cytometer
  • MCS magnetic cell separator
  • the method of concentrating is illustrated. More preferred is a method using an antibody against CXCR4.
  • an antibody against CXCR4 a commercially available antibody can be appropriately used.
  • the cell population containing the endoderm cells is provided attached to the culture dish, the adherence is maintained and the medium of the cell population containing the endoderm cells is replaced with one containing DMSO.
  • a process can be performed.
  • the medium of the cell population culture containing the endoderm cells is replaced with a medium containing DMSO and floated as it is.
  • Culture conditions may be used, or a cell population containing endoderm cells may be cultured in a culture medium containing DMSO using a coated culture dish.
  • culturing endoderm cells under floating conditions means culturing the cells in a non-adherent state with respect to the culture dish, and although not particularly limited, the adhesion between the endoderm cells and the culture dish is improved. That have not been artificially treated (for example, coating with an extracellular matrix, etc.) or artificially suppressed adhesion (for example, coating with polyhydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA)) Can be used.
  • artificially treated for example, coating with an extracellular matrix, etc.
  • poly-HEMA polyhydroxyethyl methacrylic acid
  • adhesion culture of endoderm cells means culturing endoderm cells using a coated culture dish.
  • the coating agent include Matrigel (BD Biosciences), Synthemax (Corning), collagen, gelatin, laminin (eg, laminin 111, 411 or 511, or a fragment thereof), heparan sulfate proteoglycan, or entactin, and combinations thereof. Matrigel, Synthemax or gelatin is preferable.
  • the endoderm cells When culturing endoderm cells, if the endoderm cells are provided as a cell mass in which the cells adhere to each other, they are cultured as a single cell by substantially separating (or dissociating) the cells by any method. Alternatively, the cells may be cultured in a cell mass in which cells adhere to each other. Examples of the separation method include mechanical separation and separation solution having protease activity and collagenase activity (for example, trypsin and collagenase-containing solution Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc) ) Or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • TM trypsin and collagenase-containing solution Accutase
  • TM Accutase
  • TM Accumax
  • the medium used in the culture process of the endoderm cells to hepatoblasts of the present invention can be prepared by appropriately adding DMSO to a basal medium used for animal cell culture.
  • the basal medium include IMDM medium, Medium ⁇ 199 medium, Eagle's MinimummEssential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, and Fischer's medium. Media and the like are included.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • FBS fetal bovine serum
  • serum-free medium for example, albumin, transferrin, KnockOut Serum Replacement (KSR) (serum substitute for ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid , Insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, and the like may include one or more serum replacements.
  • the basal medium includes lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and equivalents. One or more substances such as objects may also be included.
  • the basal medium is a medium containing KSR, L-glutamine, NEAA, 2-mercaptoethanol and antibiotics in DMEM medium.
  • DMSO a commercially available DMSO such as Sigma-Aldrich
  • concentration of DMSO used in this step in the medium is 0.01% to 10%, preferably 0.1% to 5%, more preferably 1%.
  • the number of days for producing hepatoblasts from the endoderm cells of the present invention has no upper limit because there is no particular effect on the production efficiency of hepatocytes by culturing for a long period of time, for example, 4 days or more, 5 days or more, Examples include 6 days or more, 7 days or more, 8 days or more, 9 days or more, 10 days or more. More preferably, it is 4 days or more and 7 days or less.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air. Performed, the CO 2 concentration is preferably about 2-5%.
  • endoderm cells may be produced from pluripotent stem cells.
  • methods for producing endoderm cells from pluripotent stem cells include, for example, a method for activating activin A and the Wnt signaling pathway, a method for activating the Wnt signaling pathway under adhesion culture conditions (WO2007 / 050043), Examples thereof include a method (WO2006 / 126574) for co-culture with feeder cells (for example, M15 cells).
  • a more preferred method for producing endoderm cells from pluripotent stem cells is a method comprising culturing pluripotent stem cells in a medium containing Activin A and a GSK-3 ⁇ inhibitor. More preferably, the method further comprises a step of culturing in a medium containing Activin A, a GSK-3 ⁇ inhibitor and a histone deacetylase (HDAC) inhibitor.
  • HDAC histone deacetylase
  • the method includes the following steps; (1) culturing pluripotent stem cells in a medium containing Activin A and a GSK-3 ⁇ inhibitor; (2) a step of culturing the cultured cell obtained in (1) in a medium containing Activin A, a GSK-3 ⁇ inhibitor and an HDAC inhibitor; and (3) culturing the cultured cell obtained in (2) to Activin A and A step of culturing in a medium containing a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • the present invention also provides a method for producing hepatocytes from pluripotent stem cells, comprising the steps described above. Specifically, it is a method for producing hepatocytes from pluripotent stem cells, comprising the following steps (i) to (iii): (I) culturing pluripotent stem cells in a medium containing Activin A and a GSK-3 ⁇ inhibitor; (Ii) a step of culturing the cells obtained in step (i) in a medium containing DMSO, and (iii) a drug selected from the group consisting of pregnenolone and an adrenergic agonist in cells obtained in step (ii) Culturing in a medium containing
  • the pluripotent stem cell in producing an endoderm cell from a pluripotent stem cell, is substantially separated (or dissociated) by any method, so that the state of a single cell or cell
  • the cells may be cultured in the state of a cell mass in which they are adhered to each other, and more preferably a method in which they are separated and cultured in a single cell state.
  • the separation method include mechanical separation and separation solution having protease activity and collagenase activity (for example, trypsin and collagenase-containing solution Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc) ) Or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • Pluripotent stem cells may be cultured by suspension culture, or may be adherently cultured using a coated culture dish. More preferred is adhesion culture.
  • the suspension culture of pluripotent stem cells refers to culturing cells in a non-adherent state on a culture dish, and is not particularly limited, but artificially improves the adhesion to the cells.
  • a material that has not been treated eg, coated with an extracellular matrix
  • that has been artificially inhibited from adhesion eg, coated with polyhydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA)
  • poly-HEMA polyhydroxyethyl methacrylic acid
  • adhesion culture means culturing in an artificially coated culture dish for the purpose of improving adhesion to cells.
  • the coating agent include Matrigel (BD Biosciences), Synthemax (Corning), collagen, gelatin, laminin (eg, laminin 111, 411 or 511, or a fragment thereof), heparan sulfate proteoglycan, or entactin, and combinations thereof. Matrigel, Synthemax or gelatin is preferable.
  • the medium used in the culturing process of the endoderm cells from the pluripotent stem cells of the present invention is prepared by appropriately adding Activin A, GSK-3 ⁇ inhibitor or HDAC inhibitor to the basal medium used for culturing animal cells.
  • the basal medium include IMDM medium, Medium ⁇ 199 medium, Eagle's MinimummEssential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, and Fischer's medium. Media and the like are included.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin, transferrin, KnockOutKSerum Replacement (KSR) (serum substitute for ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor
  • KSR KnockOutKSerum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • collagen precursor May contain one or more serum substitutes such as trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins It may also contain one or more substances such as, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • the basal medium is a medium comprising RPMI ⁇ 1640 medium with B27 supplement and antibiotics.
  • Activin® A includes Activin® A derived from humans and other animals, and functional modifications thereof, and for example, commercially available products such as R & D® systems can be used.
  • the concentration of Activin A in the medium used in this step is 1 ng / ml to 1000 ng / ml, preferably 10 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably 50 ng / ml to 200 ng / ml. More preferably, it is 90 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the function of GSK-3 ⁇ , for example, kinase activity.
  • BIO also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin 3'-oxime
  • SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl) -4- (1-methyl-1H-indol-3-yl) -1H-pyrrole-2,5 -Dione
  • GSK-3 ⁇ inhibitor VII (4-dibromoacetophenone
  • a phenyl ⁇ bromomethyl ketone compound L803-mts (also known as GSK-3 ⁇ peptide inhibitor), a cell membrane permeation type phosphorylated peptide; Myr-N -GKEAPPAPPQSpP-NH 2 ) and CHIR99021 with high selectivity (Nature (2008) 453: 519-523, which is hereby incorporated by reference).
  • a preferred GSK-3 ⁇ inhibitor used in this step includes CHIR99021.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in this step can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the GSK-3 ⁇ inhibitor to be used.
  • the concentration in the medium Is 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 3 ⁇ M.
  • HDAC inhibitors include, for example, valproate (VPA), trichostatin A, NaB, Vorinostat, NCC-149, NCH-47, NCH-51, MS-275, FK228, Apicidin, and MGCD-0103 Is mentioned. Those compounds commercially available from Sigma-Aldrich, etc. can be used. NaB is preferable. The concentration of NaB used in this step is 10 to 10 mM, preferably 100 to 1 mM, more preferably 0.3 to 0.5 mM.
  • the medium used for the step of culturing the first pluripotent stem cell in a medium containing ActivinActivA and a GSK-3 ⁇ inhibitor is A ROCK inhibitor may be included.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK).
  • ROCK Rho-kinase
  • Y-27632 eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000) ; Narumiya et al., Methods Enzymol.
  • Fasudil / HA1077 eg, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • H-1152 eg, Sasaki et al
  • Wf-536 eg, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52 (4): 319-324 (2003)
  • antisense nucleic acids against ROCK eg, siRNA
  • RNA interference-inducing nucleic acids eg, siRNA
  • dominant negative mutants eg, and expression vectors thereof.
  • Other known low-molecular compounds can also be used as ROCK inhibitors (for example, US Patent Application Publication Nos.
  • ROCK inhibitors may be used.
  • a preferred ROCK inhibitor used in this step includes Y-27632.
  • the concentration of the ROCK inhibitor used in this step can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the ROCK inhibitor used.
  • concentration of the ROCK inhibitor used in this step can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the ROCK inhibitor used.
  • Y-27632 is used as the ROCK inhibitor, 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 5 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • the literature described in this paragraph forms part of the present application by reference.
  • the number of days for the step of producing endoderm cells from the pluripotent stem cells of the present invention has no upper limit because there is no particular effect on the production efficiency of hepatocytes by culturing for a long period of time. For example, 4 days or more, 6 days or more 8 days or more, 10 days or more, 11 days or more, 12 days or more, 13 days or more, 14 days or more, 15 days or more, 16 days or more, 17 days or more, 18 days or more, 19 days or more, or 20 days or more Can be mentioned.
  • the step of culturing in a medium containing Activin A and GSK-3 ⁇ inhibitor is one day
  • “(2) culturing in a medium containing Activin A, GSK-3 ⁇ inhibitor and HDAC inhibitor” The “step to do” is 1 day to 3 days
  • “(3) the step of culturing in a medium containing Activin ⁇ ⁇ A and GSK-3 ⁇ inhibitor” is 2 days to 5 days.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and is cultured in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is preferably about 2-5%.
  • the pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into many cells existing in a living body and also has proliferative ability, and is a hepatocyte used in the present invention. Any cell that is induced is included.
  • pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, cloned embryo-derived embryonic stem (ntES) cells obtained by nuclear transfer, sperm stem cells (“GS cells”), embryonic Examples include germ cells (“EG cells”), induced pluripotent stem (iPS) cells, cultured fibroblasts and bone marrow stem cell-derived pluripotent cells (Muse cells).
  • pluripotent stem cells include ES cells and iPS cells such as human iPS cells.
  • IPS cell production methods are known in the art and can be produced by introducing reprogramming factors into any somatic cells.
  • the reprogramming factor is, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1, etc. genes or gene products are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination. Also good.
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells. , Passage cells, and established cell lines.
  • somatic cells include, for example, (1) neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, tissue stem cells such as dental pulp stem cells (somatic stem cells), (2) tissue progenitor cells, (3) lymphocytes, epithelium Cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, enterocytes, spleen cells, pancreatic cells (exocrine pancreas cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells Examples thereof include differentiated cells such as fat cells.
  • iPS cells used for the production of the stem cells have the same or substantially the same HLA genotype of the transplant destination individual from the viewpoint that rejection reaction does not occur. It is desirable to be produced using somatic cells.
  • “substantially the same” means that the HLA genotype matches the transplanted cells to such an extent that the immune response can be suppressed by the immunosuppressive agent. It is a somatic cell having an HLA type in which 3 loci of A, HLA-B and HLA-DR or 4 loci plus HLA-C are matched.
  • the liver disease therapeutic agent containing the hepatocyte obtained by the method mentioned above is provided.
  • the hepatocytes may be a cell population containing other cell types, or may be a population in which hepatocytes, for example, albumin positive cells are purified.
  • the cell population contains 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more of hepatocytes.
  • staining is performed using an antibody against albumin or a human hepatocyte-specific antibody K8216 (WO2003 / 080670, which is incorporated herein by reference).
  • the method of concentrating using a flow cytometer (FACS) and a magnetic cell separator (MACS) is illustrated.
  • the obtained hepatocytes are made into a sheet and affixed to the patient's liver, the obtained hepatocytes are suspended in physiological saline, etc.
  • Examples thereof include a method of direct transplantation, a method of three-dimensional culture on a scaffold composed of matrigel and the like, and transplanting the obtained hepatocyte mass.
  • the number of hepatocytes contained in the therapeutic agent for liver disease is not particularly limited as long as the graft can be engrafted after administration, and may be appropriately adjusted according to the size of the affected area or the size of the body. .
  • the metabolism of the test substance can be tested in vitro using hepatocytes prepared by the differentiation induction method of the present invention.
  • the hepatocytes used in the test may be a cell population containing other cell types, or a population in which hepatocytes, for example, albumin positive cells are purified. For example, a cell population containing 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more of hepatocytes.
  • the method for purifying hepatocytes used for testing in vitro uses a cell having a marker gene operably linked to the promoter of the albumin gene. It can also be performed by detecting a gene.
  • a “marker gene” is a protein that can be translated in a cell and function as an index, and is encoded by, for example, a fluorescent protein, a photoprotein, a protein that assists fluorescence, luminescence, or coloration, or a drug resistance gene. But not limited to these.
  • fluorescent proteins include blue fluorescent proteins such as Sirius, BFP, and EBFP; cyan fluorescent proteins such as mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan, and CFP; TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green (for example, hmAG1 ), Green fluorescent proteins such as ZsGreen, EmGFP, EGFP, GFP2, HyPer; yellow fluorescent proteins such as TagYFP, EYFP, Venus, YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, mBanana; KusabiraOrange (for example, hmKO2), mOrange Orange fluorescent proteins such as: TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, mStrawberry and other red fluorescent proteins; TurboFP602, mRFP1, JRed, KillerRed, mCh
  • the photoprotein can be exemplified by aequorin, but is not limited thereto.
  • proteins that assist fluorescence, luminescence, or coloration include, but are not limited to, enzymes that degrade fluorescence, luminescence, or color precursors such as luciferase, phosphatase, peroxidase, and ⁇ -lactamase.
  • the protein encoded by the drug resistance gene may be any protein that is resistant to the corresponding drug.
  • the drug resistance gene in the present invention includes, for example, an antibiotic resistance gene, but is not limited thereto.
  • antibiotic resistance genes include kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, gentamicin resistance gene, kanamycin resistance gene, tetracycline resistance gene, chloramphenicol resistance gene, etc. .
  • a cell having a marker gene operably linked to an albumin gene promoter is introduced into the cell according to a conventional method by introducing a vector operably linked to the above-described marker gene downstream of the albumin gene promoter region. It can produce by doing.
  • the vector may be simply introduced into a cell, or a marker gene may be incorporated into the albumin locus by homologous recombination.
  • the metabolic test of the test substance includes (i) a step of bringing the test substance into contact with the hepatocytes obtained by the method of the present invention, and (ii) a step of detecting a metabolite of the test substance.
  • the “contact” in step (i) can be performed by adding a test substance to a medium for culturing the hepatocytes produced according to the present invention.
  • the timing of addition of the test compound is not particularly limited. Therefore, after culturing is started in a medium not containing the test substance, the test substance may be added at a certain point in time, or may be started in a medium containing the test substance in advance.
  • the test substance includes, for example, existing components or candidate components such as pharmaceuticals and nutritional foods. By adding two or more kinds of test substances at the same time, the interaction or synergy between the test substances may be examined.
  • the test substance may be derived from a natural product or synthesized. In the latter case, an efficient assay system can be constructed using, for example, combinatorial synthesis techniques.
  • the period for contacting the test substance can be set arbitrarily.
  • the contact period is, for example, 10 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 1 day.
  • the contact may be performed in a plurality of times.
  • Examples of metabolism of a test substance include chemical modification of a test substance by hydrolysis of an ester, oxidation reaction (especially oxidation by cytochrome P450), reduction reaction, etc. This can be done by detection.
  • the expected metabolites are qualitatively or quantitatively measured using the culture solution obtained after step (i) as a sample.
  • the measurement method may be selected appropriately depending on the test substance and its predicted metabolite. For example, mass spectrometry, liquid chromatography, immunological techniques (for example, fluorescence immunoassay (FIA method), Enzyme immunoassay (EIA method)) can be employed.
  • the metabolic amount of the test substance can be evaluated according to the amount of the metabolite.
  • drug metabolizing enzymes for example, cytochrome, UGT
  • expression induction of drug metabolizing enzymes can be confirmed using the hepatocytes obtained in the present invention.
  • the expression of drug metabolizing enzymes can be assessed at the mRNA level or protein level. For example, when an increase in the mRNA level of a drug-metabolizing enzyme is observed, it can be determined that “the test substance is suspected of causing a drug interaction”.
  • the toxicity of the test substance can also be tested using hepatocytes prepared by the differentiation induction method of the present invention.
  • step (ii) the state of hepatocytes after contact with the test substance is examined, and the toxicity of the test substance is evaluated.
  • the state of hepatocytes can be grasped by measuring survival rate, observing cell morphology, measuring liver injury markers (GOT, GPT, etc.) in the culture medium, and the like. For example, when a decrease in the survival rate is recognized by contact with the test substance, it can be determined that “the test substance has liver toxicity”. Similarly, when abnormal cell morphology is observed due to contact with the test substance or when the amount of liver damage marker in the culture medium is increased, it can be determined that the test substance has hepatotoxicity. it can. A quantitative determination may be made according to the degree of decrease in the survival rate or the amount of the liver injury marker.
  • ALBUMINGFP human iPS cell line Human iPS cells (201B6, 648A1, 648B1, 604A1, 604B1, 604A3, 606A1, 606B1, and 610B1) were received from Professor Yamanaka of Kyoto University and cultured in a conventional manner (Takahashi K, et al Cell. 131: 861-72).
  • 201B6 was prepared by the method described in Cell. 131: 861-872, 2007, and 648A1, 648B1, 604A1, 604B1, 604A3, 606A1, 606B1, and 610B1 were obtained from Okita K, et al. Stem Cells. 31: 458- 466, 2013.
  • the literature described in this paragraph forms part of the present application by reference.
  • 201B6 Induction of albumin positive cells ⁇ Stage 1> 201B6 is added to Accutase (Innovative Cell Technologies, AT-104), separated into single cells, and seeded on a 24-well plate coated with Matrigel basement Membrance Matrix Growth Factor Reduced (BD) at 2 ⁇ 10 5 cells / well.
  • the cells were cultured in RPMI1640 supplemented with 1 ⁇ M CHIR99021 (Stemgent), 100 ng / ml ActivinA (R & D systems), 2% B27 (Invitrogen) and 0.5% PenStrep (Invitrogen) (Stage 1-1) (day1).
  • TM DMEM 1% DMSO, 20% KSR (Invitrogen), 1 mM L-glutamic acid, 1% NEAA (Invitrogen), 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol and 0.5% PenStrep added ( Invitrogen) medium was changed and cultured for 7 days. The resulting cells were stained with AFP antibody, and the content of AFP positive cells was examined. AFP positive cells (hepatoblasts) were 40% to 60%. A cell group containing was obtained (day 16).
  • HGF Hepatocyte Culture Medium
  • HGF + OsM Oncostatin M
  • the cell group obtained in Stage 3 was immunostained using an anti-albumin antibody (BETHYL, A80-229A) (FIG. 2).
  • the expression level of albumin mRNA was measured using quantitative PCR (FIG. 3).
  • the primers used were Forward: 5′-CGCTATTAGTTCGTTACACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and Reverse: 5′-TTTACAACATTTGCTGCCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 2).
  • the production efficiency of albumin-producing cells was analyzed by an in cell analyzer with the percentage of albumin positive cells as the percentage of albumin positive cells relative to the number of nuclear staining (DAPI) positive cells (FIG. 2B).
  • Stage 1 and Stage 2 culture days The yield of albumin-positive cells finally obtained is the same even when the culture period in Stage 1 NaB-containing medium (Stage 1-2) is 1 day. It was confirmed that the effect was obtained and that the same effect was obtained even when the period of culturing in the medium excluding NaB (Stage 1-3) was 2 days. Therefore, it was confirmed that Stage 1 can induce hepatocytes by performing in the range of 4 to 9 days.
  • albumin was obtained by adding any of ethylephrine, phenylephrine and methoxamine hydrochloride to the culture broth in Stage 3. It was shown that cells having the secretory ability of can be induced (FIG. 6).
  • hepatocytes can be efficiently obtained by using a low-molecular compound such as pregnenolone or an adrenergic receptor agonist in the process of producing hepatocytes from hepatoblasts.
  • Stage 1 was 6 days (Stage 1-1 was 1 day, Stage 1-2 was 2 days and Stage 1-3 was 3 days), and Stage 2 was 6 days.
  • the cell population obtained in Stage 2 was cultured in Hepatocyte Culture Medium (HCM SingleQuots Kit) supplemented with 20 ng / ml HGF and 20 ng / ml Oncostatin Oncostatin M (HGF + OsM) for 8 days.
  • HGF Hepatocyte Culture Medium
  • HCM SingleQuots Kit Hepatocyte Culture Medium
  • Panc1 human pancreatic cancer-derived cell line
  • HepG2 human liver cancer-derived cell line
  • the primers used were Forward: 5′-CCACCAAGAACTGCTTAGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and Reverse: 5′-CAGCTCCAAAGAGGTCCAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 4).
  • a value obtained by comparing the amount of CYP1A1 mRNA with the amount of ⁇ -actin mRNA was calculated as the relative expression level of CYP1A1, and the relative expression level in each cell is shown in FIG.
  • omeprazole induces the expression of CYP1A1 in HepG2 cells and cell populations obtained by adding HGF + OsM or methoxamine hydrochloride to the cell population obtained in Stage 2.
  • Hepatocytes induced from pluripotent stem cells using methoxamine cause CYP1A1 expression induction by omeprazole, suggesting that it can be used for studying drug-drug interactions.
  • Stage 1 for the above method is 6 days (Stage 1-1 for 1 day, Stage 1-2 for 2 days and Stage 1-3 for 3 days), Stage 2 for 6 days, and Stage 3 Hepatocyte culture medium (HCM SingleQuots Kit) supplemented with 20 ng / ml HGF and 20 ng / ml Oncostatin M (HGF + OsM), hepatocytes obtained for 8 days, 1 ⁇ M methoxamine in Stage 3 Cell population obtained by culturing for 8 days in Hepatocyte Culture Medium (HCM SingleQuots Kit) supplemented with hydrochloride or obtained by culturing for 8 days in Hepatocyte Culture Medium (HCM SingleQuots Kit) supplemented with DMSO at Stage 3 1 mg / ml ICG (Indocyanine Green) (Sigma) was added to the obtained cell population and HepG2, and after culturing for 1 hour, the uptake of ICG in each cell was observed.
  • HGF + OsM Oncostatin M
  • Stage 1 for the above method is 6 days (Stage 1-1 for 1 day, Stage 1-2 for 2 days and Stage 1-3 for 3 days), Stage 2 for 6 days, and Stage 3 Cell population obtained by culturing in Hepatocyte Culture Medium (HCM SingleQuots Kit) supplemented with 20 ng / ml HGF and 20 ng / ml Oncostatin M (HGF + OsM), 1 ⁇ M methoxamine in Stage 3
  • HGF Hepatocyte Culture Medium
  • HGF + OsM Oncostatin M
  • hepatic metabolism of the test substance can be determined using hepatocytes produced using the method of the present invention.
  • Stage 1 period of the method described above for 6 days (Stage 1-1 for 1 day, Stage 1-2 for 2 days and Stage 1-3 for 3 days), Stage 2 period for 6 days and Cell populations prepared at 0, 1 fM, 1 pM, 1 nM, 1 ⁇ M, 50 ⁇ M, and 100 ⁇ M concentrations of methoxamine hydrochloride added in Stage 3 under the condition of Stage 3 for 8 days
  • the expression level of albumin mRNA was measured using quantitative PCR (FIG. 10). As a result, it was confirmed that when methoxamine hydrochloride having a concentration of 1 fM or more was used, cells expressing albumin were obtained.
  • Stage 1 is 6 days (Stage 1-1 is 1 day, Stage 1-2 is 2 days and Stage 1-3 is 3 days), Stage 2 is 6 days and Stage 3 is Quantitative PCR was used to determine the expression levels of each drug-metabolizing enzyme (CYP1A1, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP2C19) and tyrosine aminotransferase (TAT) in cells obtained with 1 ⁇ M methoxamine hydrochloride under the condition of 8 days. (Fig. 11).
  • the primer sequences used are shown in Table 1 below. As a result, it was confirmed that the cell population produced using the method of the present invention expressed drug-metabolizing enzymes equivalent to those using HGF + OsM.
  • Stage 1 period of the above method for 6 days (Stage 1-1 for 1 day, Stage 1-2 for 2 days and Stage 1-3 for 3 days), Stage 2 for 6 days
  • the effect of each drug-metabolizing enzyme on drugs was examined using cells produced using conditions of 6 days for the period of 1 day and Stage 3.
  • 40 ⁇ M rifampyricin was added to cells on the 6th day during Stage 3, and the mRNA expression level of CYP3A4 was measured using quantitative PCR after 2 days.
  • 40 ⁇ M omeprazole was added, the mRNA expression level of CYP1A2 was measured, 100 ⁇ M phenobarbital was added, and the mRNA expression level of CYP2B6 was measured.
  • FIG. 12 it was confirmed that expression induction occurred by bringing each drug-metabolizing enzyme into contact with the corresponding drug in the cells obtained by the method of the present invention (FIG. 12). Therefore, it was suggested that drug interaction can be evaluated using the cells.
  • Stage 1 period of the above method is 6 days (Stage 1-1 for 1 day, Stage 1-2 for 2 days and Stage 1-3 for 3 days), Stage 2 period
  • Stage 2 period When the amount of albumin secreted was determined from 648A1, 648B1, 604A1, 604B1, 604A3, 606A1, 606B1, and 610B1 using the conditions of 6 days and Stage 3 for 8 days, any iPS cell It was confirmed that cells having a function of secreting at least 2 ⁇ g / ml per day can be produced from the strain (FIG. 13).
  • albumin reporter iPS cell a cell line expressing GFP was produced in cooperation with albumin expression (hereinafter referred to as albumin reporter iPS cell).
  • Albumin reporter iPS cells are treated for 6 days (Stage 1-1 for 1 day, Stage 1-2 for 2 days and Stage 1-3 for 3 days) and Stage 2 for 6 days. And using the condition of Stage 3 for 8 days, hepatocytes were induced, and the content of GFP positive cells was measured (FIG. 14). As a result, it was confirmed that 39.9% of the albumin-expressing cells were contained in the cell group after induction.
  • Stage 1 is 6 days (Stage 1-1 is 1 day, Stage 1-2 is 2 days and Stage 1-3 is 3 days), Stage 2 is 6 days and Stage 3 is In Stage 3, metoxamine and each adrenergic receptor blocker were added at Stage 3.
  • the adrenergic receptor blockers used were 10 ⁇ M doxazosin (Sigma) as an ⁇ 1 blocker, 10 ⁇ M yohimbine (Sigma) as an ⁇ 2 blocker, 10 ⁇ M metoprolol (Sigma) as a ⁇ 1 blocker, ⁇ 2 10 ⁇ M butoxamine (Sigma) was used as a blocking agent.
  • doxazosin Sigma
  • yohimbine Sigma
  • 10 ⁇ M metoprolol Sigma
  • ⁇ 2 10 ⁇ M butoxamine was used as a blocking agent.
  • albumin secretion decreased when doxazosin was added to methoxamine (FIG. 15). Therefore, when inducing hepatocytes from iPS cells, it was suggested that the induction efficiency can be increased by operating at least ⁇ 1.
  • FIG. 16 shows a principal component analysis (PCA)
  • FIG. 17 shows a heat map of liver marker gene expression. From these results, it was confirmed that the hepatocytes induced to differentiate with existing growth factors (HGF & OsM) and hepatocytes induced to differentiate with methoxamine had almost the same gene expression profile.
  • HGF & OsM growth factors
  • ES cells (D3 strain) were separated into single cells by adding 0.25% trypsin-EDTA (GIBCO). To remove feeder cells, inoculate a gelatin-coated plate, collect the supernatant containing ES cells and culture medium 10-20 minutes later, and then add Matrigel to 2.0 ⁇ 10 4 -8.0 ⁇ 10 4 cells / well A 24-well plate coated with basement Membrance Matrix Growth Factor Reduced (BD) was seeded.
  • BD basement Membrance Matrix Growth Factor Reduced
  • 0.5 mM NaB (Sigma) was added to the medium and cultured for 1 day (Stage 1-2) (day2).
  • the cells were cultured for a day (Stage ⁇ 1-3) (day 6).
  • Cells obtained by the above steps were stained with a Sox17 antibody, and the content of Sox17 positive cells was examined. As a result, a cell group containing 60% to 80% Sox17 positive cells (endoderm cells) was obtained.
  • the culture medium was changed to Knockout TM DMEM (Invitrogen) supplemented with, and cells were obtained by culturing for 6 days. The obtained cells were stained with an AFP antibody and the content of AFP positive cells was examined. As a result, a cell group containing 40% to 60% of AFP positive cells (hepatoblasts) was obtained (day 12).
  • ES cells Undifferentiated cells
  • Day 6 cells Day 6 cells (Stage 1 end), Day 12 cells (Stage 2 end), Stage 3 HGF + Oncostatin M (GFs), methoxamine, ethylephrine, phenylephrine Expression of tyrosine aminotransferase (Tat), drug metabolizing enzymes (Cyp3a11 and Cyp3a13), and ⁇ -actin in cells cultured for 8 days in a medium supplemented with pregnenolone (Day 20) and mature mouse hepatocytes was measured. The results are shown in FIG.
  • Stage 3 it was confirmed that the cell population induced by the addition of pregnenolone and the adrenergic agonists methoxamine, ethylephrine, and phenylephrine express the same drug-metabolizing enzymes as those using HGF + OsM. .
  • cells cultured for 8 days in a medium supplemented with methoxamine in Stage 3 were treated with cells cultured in the same manner in a medium supplemented with HGF + OsM in Stage 3 as a positive control and DMSO added as a negative control.
  • Immunostaining was performed with albumin antibody (Albumin) anti-Cyp3a4 antibody and anti-C / ebp ⁇ . The results are shown in FIG. In both cases, very similar expression was observed in the cell group using the medium supplemented with HGF + OsM and the cell group using the medium supplemented with methoxamine.
  • the present invention provides a method for inducing differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.
  • the hepatocytes produced by this method can be used for regenerative medicine for the treatment of liver diseases such as liver failure, pharmaceutical safety tests, drug metabolism tests and the like.

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Abstract

　肝芽細胞から肝細胞を製造する方法を提供する。　肝芽細胞をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地中で培養する工程を含む、肝芽細胞から肝細胞の製造方法を提供する。肝芽細胞は、内胚葉細胞をDMSOを含む培地中で培養することによって得ることができ、内胚葉細胞は多能性幹細胞を、Activin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地で培養ことによって得ることができる。従って、本発明の方法を用いることで、多能性幹細胞から肝細胞を製造する方法も合わせて提供し得る。

Description

肝細胞誘導方法
　本発明は、多能性幹細胞から肝細胞を分化誘導する方法に関する。
　肝硬変などの慢性肝不全、急性肝不全など肝不全が原因で毎年多くの患者が亡くなっている。これらの疾患の根治的治療法として現在肝移植が行われている。肝移植は侵襲性が高いことから、より安全性の高い肝細胞移植が提言されている。しかし、肝細胞移植は、一度に大量の細胞を必要とするため、ドナーの不足が問題となっている。
　医薬品候補化合物の開発中止に至る主要な原因として、「肝毒性」が挙げられることから、医薬品の開発において、ヒト初代培養肝細胞を用いたin vitroでの毒性評価が行われている。しかし、初代培養肝細胞は、均一ロットの安定供給が困難であるため、検査結果が安定しないことが問題となっている。
　そこで、移植や医薬品探索のための肝細胞を胚性幹細胞（ES細胞）または人工多能性幹細胞（iPS細胞）といった多能性幹細胞を用いて製造することが注目されている。これまで、多能性幹細胞から肝細胞を製造する方法として、多くの報告がされている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。報告されている方法において肝細胞へ効率よく成熟させるためには、HGFやオンコスタチンMと言ったタンパク質が用いられている。このようなタンパク質を用いることで、細胞誘導にかかるコストが高くなることや、タンパク質の製造ロット差による効率の違いが生じるなどの問題も散見する。
WO2001/081549
Takayama K, et al, Stem Cell Reports. 1:322-335, 2013. Kajiwara M, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 109: 12538-12543, 2012 Hay DC, et al, Stem Cells. 26: 894-902, 2008.　上記特許文献および非特許文献は引用により本願の一部を構成する。
　本願の課題は、肝芽細胞から肝細胞をインビトロで分化誘導する方法を提供することにある。本願はまた、内胚葉細胞から肝芽細胞を誘導し、次いで肝芽細胞から肝細胞を分化誘導するインビトロの方法を提供することを課題とする。より具体的に本願は多能性幹細胞から内胚葉細胞を誘導し、内胚葉細胞から肝芽細胞を誘導し、さらに肝芽細胞から肝細胞を分化誘導するインビトロで行われる方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、内胚葉細胞をジメチルスルホキシド(以下DMSO)を含む培地中で培養することで肝芽細胞を誘導し、当該肝芽細胞をプレグネノロンまたはアドレナリン作動薬を含む培地中で培養することにより、肝細胞へ分化誘導できることを初めて見出した。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。
　すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］肝芽細胞をプレグネノロンまたはアドレナリン作動薬を含む培地中で培養する工程を含み、当該肝芽細胞がAFP陽性である、肝細胞を製造する方法。
［２］前記アドレナリン作動薬が、アドレナリン、ノルアドレナリン、エチレフリン、ナファゾリン、フェニレフリン、メトキサミンおよびミドドリンから成る群より選択される試薬である、［１］に記載の方法。
［３］前記アドレナリン作動薬が、エチレフリン、フェニレフリンおよびメトキサミンから選択される試薬である、［２］に記載の方法。
［４］前記肝芽細胞が、内胚葉細胞をDMSOを含む培地中で培養する工程を含む方法で製造された細胞であり、当該内胚葉細胞がSOX17陽性細胞である、［１］から［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記内胚葉細胞が、多能性幹細胞を、Activin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む方法で製造された細胞である、［４］に記載の方法。
［６］前記多能性幹細胞から内胚葉細胞を製造する工程が、Activin A、GSK-3β阻害剤およびHDAC阻害剤を含む培地で培養する工程をさらに含む、［５］に記載の方法。
［７］前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021であり、前記HDAC阻害剤が、NaB（酪酸ナトリウム）である、［６］に記載の方法。
［８］前記多能性幹細胞がiPS細胞である、［５］から［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］前記iPS細胞がヒトiPS細胞である、［８］に記載の方法。
［１０］前記多能性幹細胞がES細胞である、［５］から［７］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］多能性幹細胞から肝細胞を製造する方法であって、以下の工程（i）から（iii）：
（i）多能性幹細胞を、Activin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地中で培養する工程、
（ii）工程（i）で得られた細胞をDMSOを含む培地中で培養する工程、および
（iii）工程（ii）で得られた細胞をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地中で培養する工程、
を含む、前記方法。
［１２］前記アドレナリン作動薬が、アドレナリン、ノルアドレナリン、エチレフリン、ナファゾリン、フェニレフリン、メトキサミンおよびミドドリンから選択される試薬である、［１１］に記載の方法。
［１３］前記アドレナリン作動薬が、エチレフリン、フェニレフリンおよびメトキサミンから選択される試薬である、［１２］に記載の方法。
［１４］前記工程（i）において、Activin A、GSK-3β阻害剤およびHDAC阻害剤を含む培地で培養する工程をさらに含む、［１３］に記載の方法。
［１５］前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021であり、前記HDAC阻害剤が、NaB（酪酸ナトリウム）である、［１４］に記載の方法。
［１６］前記多能性幹細胞がiPS細胞である、［１１］から［１５］のいずれか１項に記載の方法。
［１７］前記iPS細胞がヒトiPS細胞である、［１６］に記載の方法。
［１８］前記多能性幹細胞がES細胞である、［１１］から［１５］のいずれか１項に記載の方法。
［１９］［１］から［１７］のいずれか１項に記載の方法で製造された肝細胞と被検物質を接触させる工程を含む、被検物質の代謝産物を検出する方法。
［２０］［１］から［１７］のいずれか１項に記載の方法で製造された肝細胞と被検物質を接触させる工程を含む、被検物質の薬物代謝酵素の誘導を検出する方法。
　内胚葉細胞から肝細胞へ比較的低分子の化合物を用いて誘導することが可能となった。内胚葉細胞は多能性幹細胞より誘導することができ、本発明の方法によって安定した性質の肝細胞を提供することが可能となった。本発明の肝細胞誘導方法は全てインビトロで実施される。本発明の方法で製造された肝細胞は、肝不全等の肝疾患の再生医療や薬物の有効性や安全性評価等に使用され得る。
図１は、ヒトiPS細胞から肝細胞を誘導する模式図を示す。 図２Aは、Stage 3において各薬剤（DMSO、HGF+オンコスタチンM、メトキサミン塩酸塩およびプレグネノロン）を用いて誘導した細胞を抗アルブミン抗体で免疫染色した像を示す。図２Bは、Stage 3において各薬剤（DMSO、HGF+オンコスタチンM、メトキサミン塩酸塩およびプレグネノロン）を用いて誘導した場合のアルブミン陽性細胞率を測定した結果を示す。 図３は、Stage 3において各薬剤（DMSO、HGF+オンコスタチンM、メトキサミン塩酸塩およびプレグネノロン）を用いて誘導した細胞におけるアルブミンのmRNA発現量をq-PCRで測定した結果を示す。縦軸の値は、β-アクチンのmRNA発現量を内部標準として用いて補正した蛍光強度のうちDay 0を１とした場合の相対値を示す。 図４は、Stage 3において各薬剤（DMSO、エチレフリン、フェニレフリン、メトキサミン、HGF+オンコスタチンM）を用いて誘導した細胞でのアルブミン陽性細胞率を測定した結果を示す。 図５は、Stage 3において各薬剤（DMSO、エチレフリン、フェニレフリン、メトキサミン、HGF+オンコスタチンM）を用いて誘導した細胞におけるアルブミンのmRNA発現量をq-PCRで測定した結果を示す。Stage 2の６日目を１とした相対値で示す。 図６は、Stage 3において各薬剤（medium only(DMSO)、エチレフリン、フェニレフリン、メトキサミン、HGF+オンコスタチンM）を用いて誘導した細胞でのアルブミン分泌量を示す。図中、HepG2細胞は、ヒト肝癌由来細胞株からのアルブミン分泌量を示す。 図７は、Panc1（ヒト膵癌由来細胞株）、HepG2（ヒト肝癌由来細胞株）、Stage 3においてHGF+オンコスタチンMを用いて誘導した細胞（HGF+OsM）、またはStage 3において1μMのメトキサミンを用いて誘導した細胞に対して100μMのオメプラゾールを添加（+）または添加しなかった（-）場合におけるCYP1A1のmRNA発現量をq-PCRで測定した結果を示す。CYP1A1のmRNA発現量は、βアクチンのmRNA発現量に対する相対値で表す。 図８は、HepG2、Stage 3においてDMSOを用いて誘導した細胞（ＤＭＳＯ）、Stage 3においてHGF+オンコスタチンMを用いて誘導した細胞（HGF+OsM）、またはStage 3において1μMのメトキサミンを用いて誘導した細胞（メトキサミン）に対して1mg/mlのICG（Indocyanine green）を添加して1時間培養した後の顕微鏡像（上図）、各細胞（HepG2、DMSO、HGF+オンコスタチンMおよびメトキサミン）のOil Red染色像（中図）、およびPAS染色像（下図）を示す。 図９Ａは、Stage 3において各薬剤（DMSO、HGF+オンコスタチンM、メトキサミンおよびプレグネノロン）を用いて誘導した細胞を抗ＣＹＰ3Ａ４抗体により染色した免疫染色像を示す。図９Ｂは、Stage 3において各薬剤（DMSO、HGF+オンコスタチンM、メトキサミンおよびプレグネノロン）を用いて誘導した細胞におけるＣＹＰ3Ａ４のmRNA発現量をq-PCRで測定した結果を示す。ＣＹＰ3Ａ４のmRNA発現量は、DMSOを用いて誘導した細胞における発現量に対する相対値で表す。 図１０は、Stage 3において、各濃度のメトキサミンを用いた場合のアルブミンのmRNAの発現量をq-PCRで測定した結果を示す。図中、St2d6は、Stage 2の6日目の結果を示し、ＧＦｓは、HGF+オンコスタチンMを用いた結果を示す。 図１１は、各条件で誘導した細胞におけるＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ａ１９およびＴＡＴのmRNA発現量をq-PCRで測定した結果を示す。図中、undiffは、iPS細胞での結果を示し、D6は、分化誘導6日目の細胞の結果を示し、D12は、分化誘導12日目の細胞の結果を示し、D20（-）は、Stage 3にてHepatocyte Culture Mediumに無添加で培養した分化誘導20日目の細胞の結果を示し、D20 GFsは、Stage 3にてHGF+オンコスタチンMを添加して分化誘導した20日目の細胞の結果を示し、D20 Methoは、Stage 3にてメトキサミンを添加して分化誘導した20日目の細胞の結果を示す。 図１２は、各条件で誘導した細胞におけるＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６のmRNA発現量をq-PCRで測定した結果を示す。ＣＹＰ３Ａ４は、40μＭ リファンピシンを添加（Rif(+)）または無添加（Rif(-)）の結果を示し、ＣＹＰ１Ａ２は、40μＭ オメプラゾールを添加（Ome(+)）または無添加（Ome(-)）の結果を示し、ＣＹＰ２Ｂ６は、100μＭ フェノバルビタールを添加（Phe(+)）または無添加（Phe(-)）の結果を示す。図中、HepG2は、HepG2細胞における結果を示し、GFsは、Stage 3にてHGF+オンコスタチンMを添加して分化誘導した細胞の結果を示し、Methoは、Stage 3にてメトキサミンを添加して分化誘導した細胞の結果を示す。 図１３は、各iPS細胞株を用いて本発明の方法により誘導した細胞におけるアルブミン分泌量を示す。 図１４は、アルブミンのプロモーター下にGFPを組み込んだiPS細胞を用いて本発明の方法により誘導した後のFACSの結果を示す。図中、（+）は、GFP陽性細胞群を示し、（-）は、GFP陰性細胞群を示す。当該GFP陽性細胞の含有率は、39.9%である。 図１５は、各iPS細胞株を用いて本発明の方法により誘導した細胞におけるアルブミン分泌量を示す。図中、DMSOは、Stage 3にてDMSOを添加して分化誘導した細胞の結果を示し、GFsは、Stage 3にてHGF+オンコスタチンMを添加して分化誘導した細胞の結果を示し、（-）は、Stage 3にてメトキサミンのみを添加して分化誘導した細胞の結果を示し、α１は、Stage 3にてメトキサミンおよびドキサゾシンを添加して分化誘導した細胞の結果を示し、α２は、Stage 3にてメトキサミンおよびヨヒンビンを添加して分化誘導した細胞の結果を示し、β１は、Stage 3にてメトキサミンおよびメトプロロールを添加して分化誘導した細胞の結果を示し、β１は、Stage 3にてメトキサミンおよびブトキサミンを添加して分化誘導した細胞の結果を示す。 図１６は、ヒトiPS細胞から分化誘導した肝細胞について、RNA sequencing解析により遺伝子発現プロファイルの比較を行った結果であり、主成分分析（PCA）を示す。 図１７は、ヒトiPS細胞から分化誘導した肝細胞について、RNA sequencing解析により遺伝子発現プロファイルの比較を行った結果であり、肝臓マーカー遺伝子発現のヒートマップを示す。 図１８は、マウスES細胞から肝細胞を誘導する模式図を示す。 図１９は各条件で誘導した細胞におけるTat、Cyp3a11、Cyp3a13およびβアクチンの発現を示す。 図２０はStage 3で各薬剤（DMSO、HGF+オンコスタチンM（ＧＦｓ）、メトキサミン）を用いて誘導した細胞群を抗アルブミン抗体、抗Cyp3a4抗体、および抗C/ebpβ抗体で免疫染色した像を示す。
　本発明を以下に詳細に説明する。
　本発明では、肝芽細胞をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地中で培養する工程を含む、肝細胞を製造する方法を提供する。
　本発明の一態様において、肝細胞は、アルブミンのmRNAを発現している細胞と定義される。
　本発明の別の態様においては、肝細胞はグリコーゲンの蓄積、低比重リポタンパク質（LDL）の取り込み、アルブミンの分泌、アンモニア代謝と尿素合成、シトクロムP450活性、脂質代謝、薬物代謝などの肝細胞の機能として公知の機能のいずれかひとつ、あるいは複数の組み合わせによって特徴づけられる細胞と定義してもよい。肝細胞の判定は、かかる機能に係わるタンパク質の発現によって確認することができる。本発明において、肝細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、２０％以上、３０％以上、４０％以上または５０％以上の肝細胞が含まれる細胞集団である。
　本発明において、肝芽細胞とは、肝細胞および胆管上皮細胞へ分化する能力を有する細胞であり、AFP、Dlk、E-cadherin、Liv2、CD13およびCD133から成る群より選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が陽性である細胞である。好ましくは、AFP陽性の細胞である。
　本発明の方法において、肝芽細胞から肝細胞を製造するにあたり、肝芽細胞をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地中で培養する。
　本願の方法において、肝芽細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％の肝芽細胞が含まれた細胞集団である。肝芽細胞を純化する方法する方法として、AFP、Dlk、E-cadherin、Liv2、CD13またはCD133などの遺伝子マーカーに対する抗体を用いて染色し、染色された細胞をフローサイトメーター（FACS）や磁気細胞分離装置（MACS）を用いて濃縮する方法が例示される。より好ましくは、Dlk、E-cadherin、Liv2、CD13またはCD133に対する抗体を用いる方法である。Dlk、E-cadherin、Liv2、CD13またはCD133に対する抗体は、市販の抗体を適宜利用することができる。
　肝芽細胞を含む細胞集団の培養物が培養皿へ接着されている状態で提供される場合、接着状態を維持し、肝芽細胞を含む培養物の培地をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地と交換することによって、本願の方法を実施することができる。また、肝芽細胞を含む細胞集団の培養物が、培地中に浮遊状態で提供される場合、当該肝芽細胞を含む細胞集団培養物の培地をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地と交換して、そのまま浮遊培養条件で培養してもよく、あるいはコーティング処理した培養皿を用いて当該肝芽細胞を含む細胞集団培養物をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地中で接着培養しても良い。好ましくは、肝芽細胞から肝細胞の製造工程は接着培養で行う。
　肝芽細胞が細胞同士が接着した細胞塊として提供される場合には任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態に分離した後、培養しても良い。分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。
　肝芽細胞から肝細胞を製造するにあたり接着培養する場合、コーティング処理された培養皿にて培養しても良い。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン（好ましくは、ラミニン１１１、４１１または５１１が例示される）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはこれらの断片およびこれらの組み合わせが挙げられる。肝芽細胞を含む細胞集団が接着培養物として提供される場合、当該肝芽細胞が得られた条件を継続し、培地のみを交換することによって肝細胞の誘導を行うことが好ましい。
　本発明において、肝芽細胞から肝細胞を製造するにあたり浮遊条件で培養するとは、細胞を培養皿に対して非接着の状態で培養することである。浮遊条件の培養は特に限定はされないが、肝芽細胞と培養皿の接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
　本発明の肝芽細胞から肝細胞の製造工程に使用される培地は、肝細胞の培養用培地へプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を適宜添加して調製することができる。肝細胞の培養用培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Lonza社のHBMTM Basal Medium、HCMTM SingleQuotsTM Kit、HMMTM Basal MediumまたはHMMTM SingleQuotsTM Kit、PromoCell社のHepatocyte Growth MediumまたはHepatocyte Maintenance Medium、もしくはSigma-Aldrich社のHepatocyte Mediumおよびこれらの混合培地などが包含される。これらの基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。無血清の場合は必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。培地にはまた、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン類（例えば、ニコチンアミド、アスコルビン酸）、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、グルカゴン、ヒドロコルチゾン、EGF（Epidermal growth factor）、デキサメタゾン、およびこれらの同等物など１つ以上の物質も含有し得る。
　本発明において、プレグネノロンは、Sigma-Aldrich社等の市販されているものを使用することができる。本発明で用いるプレグネノロンの培地中の濃度は、0.01 μMから10 μM、好ましくは、0.05 μMから5 μM、より好ましくは、0.1 μMから2.5 μMである。
　本発明において、アドレナリン作動薬とは、アドレナリン受容体に直接結合して作用することができる物質である。好ましくは、少なくともα１受容体に結合する物質であり、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、エチレフリン、ナファゾリン、フェニレフリン、メトキサミンおよびミドドリンから成る群より選択される薬剤が挙げられる。本発明において好ましいアドレナリン作動薬は、エチレフリン、フェニレフリン、およびメトキサミンから成る群より選択される薬剤である。本発明で、エチレフリン、フェニレフリン、またはメトキサミンを用いる場合の培地中の濃度は、0.01 μMから10 μM、好ましくは、0.05 μMから5 μM、より好ましくは、0.1 μMから2.5 μMである。
　本発明の肝芽細胞から肝細胞を製造する工程の日数は、長期間培養することで肝細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上または１４日以上が挙げられる。より好ましくは、４日以上１２日以下であり、8日間である。
　本発明の肝芽細胞から肝細胞を製造する工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　本発明の肝芽細胞は、内胚葉細胞から製造されたものであって良い。内胚葉細胞から肝芽細胞を製造するにあたり、内胚葉細胞をジメチルスルホキシド（DMSO）を含む培地中で培養する工程を含み得る。
　本発明において、内胚葉細胞とは、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織を形成する細胞へと分化する細胞であり、SOX17、FOXA2またはCXCR4などの遺伝子マーカーが発現している細胞が例示される。より好ましくは、SOX17が陽性である細胞が挙げられる。
　本発明の方法において、内胚葉細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％の内胚葉細胞が含まれた細胞集団である。内胚葉細胞を純化する方法する方法として、SOX17、FOXA2またはCXCR4などの遺伝子マーカーに対する抗体を用いて染色し、染色された細胞をフローサイトメーター（FACS）や磁気細胞分離装置（MACS）を用いて濃縮する方法が例示される。より好ましくは、CXCR4に対する抗体を用いる方法である。CXCR4に対する抗体は、市販の抗体を適宜利用することができる。
　内胚葉細胞を含む細胞集団が培養皿へ接着されている状態で提供される場合、接着状態を維持し、内胚葉細胞を含む細胞集団の培地をDMSOを含有するものに交換することによって、本工程を実施することができる。また、内胚葉細胞を含む細胞集団の培養物が、培地中に浮遊状態で提供される場合、当該内胚葉細胞を含む細胞集団培養物の培地をDMSOを含有する培地と交換して、そのまま浮遊培養条件培養しても良く、あるいはコーティング処理した培養皿を用いて内胚葉細胞を含む細胞集団をDMSOを含有する培地中で接着培養しても良い。
　本発明において、内胚葉細胞を浮遊条件で培養するとは、細胞を培養皿に対して非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、内胚葉細胞と培養皿の接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
　本発明において、内胚葉細胞を接着培養するとは、コーティング処理された培養皿を用いて内胚葉細胞を培養することである。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン（例えば、ラミニン１１１、４１１または５１１、またはその断片）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは、マトリゲル、Synthemaxまたはゼラチンである。
　内胚葉細胞を培養するにあたり、内胚葉細胞が細胞同士が接着した細胞塊として提供される場合にはこれを任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態として培養してもよいし、または、細胞同士が接着した細胞塊の状態で培養しても良い。分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。
　本発明の内胚葉細胞から肝芽細胞の培養工程に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へDMSOを適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。無血清培地の場合は必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。また基礎培地には脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、DMEM培地に、KSR 、L-グルタミン、NEAA、2-メルカプトエタノールおよび抗生物質を含む培地である。
　本発明において、DMSOは、Sigma-Aldrich社等の市販されているものを使用することができる。本工程で用いるDMSOの培地中の濃度は、0.01%から10%、好ましくは、0.1%から5%、より好ましくは、1%である。
　本発明の内胚葉細胞から肝芽細胞を製造する工程の日数は、長期間培養することで肝細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上が挙げられる。より好ましくは、4日以上7日以下である。
　本発明の内胚葉細胞から肝芽細胞を製造する工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　本発明において、内胚葉細胞は、多能性幹細胞から製造されたものであってよい。多能性幹細胞から内胚葉細胞を製造する方法としては、例えば、アクチビンAおよびWntシグナル伝達経路を活性化する方法、接着培養条件下でWntシグナル伝達経路を活性化する方法（WO2007/050043）、支持細胞（例えば、M15細胞）と共培養する方法（WO2006/126574）などが例示される。本パラグラフに記載の文献は引用により本願の一部を構成する。
　より好ましい多能性幹細胞からの内胚葉細胞の製造方法は、多能性幹細胞をActivin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む方法である。さらに好ましくは、Activin A、GSK-3β阻害剤およびヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤を含む培地で培養する工程をさらに含む方法である。具体的には次の工程を含む方法である；
（１）多能性幹細胞をActivin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地で培養する工程；
（２）（１）で得られた培養細胞をActivin A、GSK-3β阻害剤およびHDAC阻害剤を含む培地で培養する工程；および
（３）（２）で得られた培養細胞をActivin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地で培養する工程。
　本発明はまた、上述した工程を含む、多能性幹細胞から肝細胞を製造する方法を提供する。詳細には、以下の（i）から（iii）の工程を含む、多能性幹細胞から肝細胞を製造する方法である；
（i）多能性幹細胞を、Activin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地中で培養する工程、
（ii）工程（i）で得られた細胞をDMSOを含む培地中で培養する工程、および
（iii）工程（ii）で得られた細胞をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地中で培養する工程。
　本発明の方法において、多能性幹細胞から内胚葉細胞を製造するにあたり、当該多能性幹細胞は、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態、または、細胞同士が接着した細胞塊の状態で培養してもよく、より好ましくは、単一細胞の状態に分離して培養する方法である。分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。
　多能性幹細胞は、浮遊培養により培養しても、あるいは、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。より好ましくは、接着培養である。
　本発明の方法において多能性幹細胞の浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
　本発明の方法において接着培養とは、細胞との接着性を向上させる目的で人工的にコーティング処理された培養皿にて培養することを意味する。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン（例えば、ラミニン１１１、４１１または５１１、またはその断片）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは、マトリゲル、Synthemaxまたはゼラチンである。
　本発明の多能性幹細胞から内胚葉細胞の培養工程に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へActivin A、GSK-3β阻害剤またはHDAC阻害剤を適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、RPMI 1640培地に、B27サプリメントおよび抗生物質を含む培地である。
　本発明において、Activin Aには、ヒトおよび他の動物由来のActivin A、ならびにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。本工程で用いる培地中のActivin Aの濃度は、1 ng/mlから1000 ng/ml、好ましくは、10 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、50 ng/mlから200 ng/mlである、より好ましくは、90 ng/mlから100 ng/mlである。
　本発明において、GSK-3β阻害剤は、GSK-3βの機能、例えば、キナーゼ活性を阻害できるものである限り特に限定されず、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021（Nature (2008) 453: 519-523、本文献は引用により本願の一部を構成する）が挙げられる。これらの化合物は、例えば、Stemgent、CalbiochemやBiomol社等から入手可能であり、また自ら作製してもよい。本工程で用いる好ましいGSK-3β阻害剤としては、CHIR99021が挙げられる。本工程で用いるGSK-3β阻害剤の濃度は、使用するGSK-3β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、GSK-3β阻害剤としてCHIR99021を用いる場合、培地中の濃度は0.01μMから100μM、好ましくは、0.1μMから10μM、さらに好ましくは、1μＭから3μMである。
　本発明において、HDAC阻害剤は、例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、NaB、Vorinostat、NCC-149、NCH-47、NCH-51、MS-275、FK228、Apicidin、およびMGCD-0103などが挙げられる。これらの化合物は、Sigma-Aldrich社等で市販されているものを使用することができる。好ましくは、NaBである。本工程で用いるNaBの濃度は、10 μMから10 mM、好ましくは、100 μMから1 mM、より好ましくは、0.3 mMから0.5 mMである。
　本発明において、塊状で提供される多能性幹細胞を単一細胞の状態に分離する場合、最初の多能性幹細胞をActivin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地で培養する工程に用いる培地はROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632が挙げられる。本工程で用いるROCK阻害剤の濃度は、使用するROCK阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合、0.1μMから100μM、好ましくは、1μMから50μM、さらに好ましくは、5μＭから20μMである。本パラグラフに記載の文献は引用により本願の一部を構成する。
　本発明の多能性幹細胞から内胚葉細胞を製造する工程の日数は、長期間培養することで肝細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、４日以上、６日以上、８日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上、１６日以上、１７日以上、１８日以上、１９日以上、または２０日以上が挙げられる。好ましくは、「（１）Activin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地で培養する工程」が1日であり、「（２）Activin A、GSK-3β阻害剤およびHDAC阻害剤を含む培地で培養する工程」が、１日以上３日以下であり、さらに「（３）Activin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地で培養する工程」が、２日以上５日以下である。
　本発明の多能性幹細胞から内胚葉細胞を製造する工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される肝細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。多能性幹細胞としては特にES細胞、iPS細胞、例えばヒトiPS細胞が例示される。
　iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。本パラグラフに記載の文献は引用により本願の一部を構成する。
　体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　また、得られる肝細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、当該幹細胞の製造に用いるiPS細胞は、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一または実質的に同一である体細胞を用いて製造されることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、移植先の個体とHLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの３遺伝子座またはHLA-Cを加えた４遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
　本発明では、上述した方法により得られた肝細胞を含む肝疾患治療剤を提供する。肝細胞としては、他の細胞種が含まれる細胞集団であってもよく、肝細胞、例えばアルブミン陽性細胞が純化された集団であってもよい。好ましくは、２０％以上、３０％以上、４０％以上または５０％以上の肝細胞が含まれる細胞集団である。肝細胞を純化する方法する方法として、アルブミンに対する抗体またはヒト肝細胞特異的抗体K8216 （WO2003/080670、本文献は引用により本願の一部を構成する）を用いて染色し、染色された細胞をフローサイトメーター（FACS）や磁気細胞分離装置（MACS）を用いて濃縮する方法が例示される。
　患者への治療剤の投与方法としては、例えば、得られた肝細胞をシート化して、患者の肝臓に貼付する方法、得られた肝細胞を生理食塩水等に懸濁させ、患者の肝臓に直接移植する方法、マトリゲル等から構成されたスキャフォールド上で三次元培養し、得られた肝細胞塊を移植する方法などが挙げられる。
　本発明において、肝疾患治療剤に含まれる肝細胞の細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製すればよい。
　本発明の分化誘導方法で調製した肝細胞を用いて被検物質の代謝についてin vitroで試験することができる。試験に用いる肝細胞としては、他の細胞種が含まれる細胞集団であってもよく、肝細胞、例えばアルブミン陽性細胞が純化された集団であってもよい。例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上または５０％以上の肝細胞が含まれる細胞集団である。in vitroで試験することに用いる肝細胞の純化の方法は、上述した抗体を用いて純化する方法に加えて、アルブミン遺伝子のプロモーターと機能的に連結したマーカー遺伝子を有する細胞を用いて、当該マーカー遺伝子を検出することによって行うこともできる。本発明において、「マーカー遺伝子」とは、細胞内で翻訳され指標として機能しうるタンパク質であり、例えば、蛍光タンパク質、発光タンパク質、蛍光、発光もしくは呈色を補助するタンパク質、薬剤耐性遺伝子によってコードされるタンパク質などが含まれるが、これらに限定さない。
　本発明において、蛍光タンパク質としては、Sirius、BFP、EBFPなどの青色蛍光タンパク質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光タンパク質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPerなどの緑色蛍光タンパク質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光タンパク質；KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光タンパク質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberryなどの赤色蛍光タンパク質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hdKeimaRed）、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、発光タンパク質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質として、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらに限定されない。
　本発明において、薬剤耐性遺伝子によってコードされるタンパク質は、対応する薬剤に対して抵抗性を有するタンパク質であれば何でもよい。本発明における薬剤耐性遺伝子は、例えば、抗生物質耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。
　本発明において、アルブミン遺伝子のプロモーターと機能的に連結したマーカー遺伝子を有する細胞は、例えば、上記のマーカー遺伝子をアルブミン遺伝子のプロモーター領域の下流に機能的に連結したベクターを常法に従って細胞内に導入することにより作製することができる。当該ベクターは、細胞に導入するだけでも良く、相同組換えによってアルブミン遺伝子座にマーカー遺伝子が組み込まれていても良い。
　当該被検物質の代謝試験は、（ｉ）本発明の方法で得られた肝細胞に被検物質を接触させる工程、および（ｉｉ）被検物質の代謝産物を検出する工程を含む。工程（ｉ）での「接触」とは、本発明によって製造された肝細胞を培養する培地に被検物質を添加することによって行われ得る。被験化合物の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被験物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。
　被検物質には、例えば、医薬品や栄養食品等の既存成分或いは候補成分などが包含される。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べてもよい。被検物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
　被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間～３日間、好ましくは１時間～１日間である。接触を複数回に分けて行うことにしてもよい。
　被検物質の代謝とは、エステルなどの加水分解、酸化反応（特にシトクロムP450による酸化）、還元反応などによる被験物質の化学修飾が例示され、このような代謝の有無は、例えば、代謝産物の検出によって行うことができる。好ましくは、工程（ｉ）の後得られた培養液をサンプルとして、予想される代謝産物を定性的又は定量的に測定する。測定方法は被検物質並びにその予測される代謝産物に応じて適切なものを選択すればよいが、例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等を採用可能である。
　典型的には、被検物質の代謝産物が検出されたとき、「被検物質が代謝された」と判定する。また、代謝産物の量に応じて被検物質の代謝量を評価することができる。
　この他にも、本発明で得られた肝細胞を用いて薬物代謝酵素（例えば、シトクロム、UGT）の発現誘導を確認することができる。薬物代謝酵素の発現はmRNAレベル又はタンパク質レベルで評価することができる。例えば、薬物代謝酵素のmRNAレベルに上昇を認めたとき、「被検物質は薬物相互作用を起こす疑いがある」と判定することができる。
　一方、本発明の分化誘導方法で調製した肝細胞を用いて被検物質の毒性を試験することもできる。当該方法では、（ｉ）本発明の方法で得られた肝細胞に被検物質を接触させる工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）後の肝細胞の状態を調べる工程を行う。工程（ｉ）は、前記被検物質の代謝と同様である。
　 工程（ｉｉ）では、被検物質を接触させた後の肝細胞の状態を調べ、被検物質の毒性を評価する。肝細胞の状態は、生存率の測定、細胞形態の観察、培養液中の肝障害マーカー（GOT、GPT等）の測定などによって把握することができる。例えば、被検物質の接触によって生存率の低下を認めたとき、「被検物質は肝毒性を有する」と判定することができる。また、被検物質の接触によって細胞形態の異常を認めたときや、培養液中の肝障害マーカーの量が上昇したときも同様に、「被検物質は肝毒性を有する」と判定することができる。生存率の低下の程度や肝障害マーカーの量に応じて定量的な判定を行ってもよい。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。
ALBUMINGFPヒトiPS細胞株
　ヒトiPS細胞（201B6、648A1、648B1、604A1、604B1、604A3、606A1、606B1および610B1）は、京都大学の山中教授より受領し、従来の方法で培養した（Takahashi K, et al. Cell. 131:861-72）。201B6は、Cell. 131:861-872, 2007に記載の方法で作製し、648A1、648B1、604A1、604B1、604A3、606A1、606B1および610B1は、Okita K, et al. Stem Cells. 31:458-466, 2013に記載の方法で製造された。本パラグラフに記載の文献は引用により本願の一部を構成する。
アルブミン陽性細胞の誘導
＜Stage 1＞
　201B6は、Accutase（Innovative Cell Technologies、AT-104）を加えて単一細胞へ分離し、2×105cells/wellでMatrigel basement Membrance Matrix Growth Factor Reduced（BD）をコートした24 wellプレートへ播種し、1μM CHIR99021（Stemgent）、100 ng/ml　ActivinA（R&D systems）、2% B27（Invitrogen）および0.5% PenStrep（Invitrogen）を添加したRPMI1640中で１日間培養した（Stage 1-1）（day1）。
　続いて、0.5 mM NaB（Sigma）を添加し、３日間培養した（Stage 1-2）（day4）。さらに、培地を除去し、1μM CHIR99021（Axon Medchem）、100 ng/ml　ActivinA（R&D systems）、2% B27（Invitrogen）および0.5% PenStrep（Invitrogen）を添加したRPMI1640中で５日間培養した（Stage 1-3）（day9）。以上の工程により得られた細胞をSOX17の抗体で染色し、SOX17陽性細胞の含有率を調べたところ、SOX17陽性細胞（内胚葉細胞）を70％から80％含む細胞群を得た。
＜Stage 2＞
　Stage 1の後、培地を除去し、１％DMSO、20％KSR（Invitrogen）、1 mM L-グルタミン酸、1% NEAA（Invitrogen）、0.1 mM βメルカプトエタノールおよび0.5% PenStrepを添加したKnockoutTM DMEM（Invitrogen）へ培地を交換し、7日間培養し、得られた細胞をAFPの抗体で染色し、AFP陽性細胞の含有率を調べたところ、AFP陽性細胞（肝芽細胞）を40％から60％含む細胞群を得た（day16）。
＜Stage 3＞
　Stage 2の後、培地を除去し、150 nMまたは1 μMのプレグネノロン（東京化成）またはメトキサミン塩酸塩（Sigma）を添加したHepatocyte Culture Medium （HCM SingleQuots Kit）（LONZA）へ培地を交換し、4日間、8日間または12日間培養した。このとき、対照として、1% DMSO、または20 ng/ml HGFおよび20 ng/ml オンコスタチンM（HGF+OsM）を添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）にて同様に細胞を培養した。
誘導アルブミン陽性細胞の評価
　Stage 3にて得られた細胞群を抗アルブミン抗体（BETHYL, A80-229A）を用いて免疫染色した（図２）。また、アルブミンのmRNAの発現量を定量PCRを用いて測定した（図３）。使用したプライマーは、Foward:5'-CGCTATTAGTTCGTTACACCA-3'（配列番号：１）およびReverse:5'-TTTACAACATTTGCTGCCCA-3' （配列番号：２）である。この結果、Stage 3において8日間培養した場合に最も効率よくアルブミンを発現する細胞が得られることが確認された。アルブミン産生細胞の製造効率は、核染色（DAPI）陽性の細胞数に対してアルブミン陽性細胞の割合をアルブミン陽性細胞率として、In cell analyzerで解析した（図２B）。
　Stage 3において、プレグネノロンの濃度は、150 nMおよび1 μMのいずれでも同様の結果であった。
Stage 1およびStage 2の培養日数の検討
　Stage 1のNaBを含有する培地中で培養する期間（Stage 1-2）を1日とした場合でも最終的に得られるアルブミン陽性細胞の収率として同様の効果が得られること、さらにNaBを除いた培地で培養する期間（Stage 1-3）を２日とした場合でも同様の効果が得られることが確認された。従って、Stage 1は、４日間から9日間の範囲において行うことで肝細胞の誘導が可能であることが確認された。
　さらに、Stage 2の培養期間を４日間とした場合でも7日間培養した場合と最終的に得られるアルブミン陽性細胞の収率としては同様の効果が得られることが確認された。
代替化合物の探索
　メトキサミン塩酸塩の代替物として、類似化合物（アドレナリン受容体作動薬、特にα受容体刺激作用を有する薬剤）の効果を検討した。上述のStage 3において、1 μMのエチレフリン、フェニレフリンまたはメトキサミン塩酸塩を添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）を用いて8日間培養し、アルブミン陽性細胞率およびアルブミンのmRNAの発現量を前記と同様の方法で測定したところ、エチレフリンおよびフェニレフリンは、共にメトキサミン塩酸塩と同等の効果を示すことが確認された（図４および５）。さらに、得られた細胞集団から培養液中へ分泌されたアルブミン量をELISA法を用いて測定したところ、Stage 3においてエチレフリン、フェニレフリンおよびメトキサミン塩酸塩のいずれかを培養液へ添加することで、アルブミンの分泌能を有する細胞が誘導できることが示された（図６）。
　以上の結果より、肝芽細胞から肝細胞を製造する工程において、プレグネノロンまたはアドレナリン受容体作動薬など低分子化合物を用いることで、効率よく肝細胞を得ることができることが示唆された。
誘導肝細胞の評価（薬物代謝酵素誘導反応）
　上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間とした。Stage 2にて得られた細胞集団を20 ng/ml HGFおよび20 ng/ml OncostatinオンコスタチンM（HGF+OsM）を添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた細胞集団、Stage 2にて得られた細胞集団を1 μMのメトキサミン塩酸塩を添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた細胞集団、Panc1（ヒト膵癌由来細胞株：理研バイオリソースセンター）およびHepG2（ヒト肝癌由来細胞株）を用いた。各細胞集団を、100 μＭのオメプラゾール（Sigma）を添加または添加しないHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で2日間培養した後、CYP1A1のmRNAの発現量を定量PCRにて測定した。使用したプライマーは、Foward:5'-CCACCAAGAACTGCTTAGCC-3'（配列番号：３）およびReverse:5'-CAGCTCCAAAGAGGTCCAAG-3' （配列番号：４）である。CYP1A1のmRNA量をβアクチンのmRNA量と比較した値をCYP1A1の相対発現量として算出し、各細胞での相対発現量を図７に示した。その結果、HepG2細胞、並びにStage 2にて得られた細胞集団をHGF+OsMまたはメトキサミン塩酸塩を添加して誘導した細胞集団では、オメプラゾールの添加によりCYP1A1の発現が誘導されることが確認された。メトキサミンを用いて多能性幹細胞より誘導した肝細胞は、オメプラゾールによるCYP1A1の発現誘導を引き起こすことから、医薬品の薬物相互作用の検討に用いることができることが示唆された。
誘導肝細胞の評価（肝機能評価）
　上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間、およびStage 3にて20 ng/ml HGFおよび20 ng/ml オンコスタチンM（HGF+OsM）を添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた肝細胞、Stage 3にて1 μMのメトキサミン塩酸塩を添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた細胞集団またはStage 3にてDMSOを添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた細胞集団およびHepG2へ、1 mg/ml ICG（インドシアニングリーン）（Sigma）を添加して、1時間培養した後、各細胞におけるICGの取り込みを観察したところ、HepG2、およびHGF+OsMまたはメトキサミン塩酸塩を添加して誘導した細胞では、細胞内へのICGの取り込みが確認された（図８上図）。従って、同細胞は、薬物代謝機能を有していることが示唆された。
　また、HGF+OsM、メトキサミン塩酸塩、またはDMSOを添加して誘導した細胞、およびHepG2を、Oil Redにより染色したところ、HepG2、HGF+OsMおよびメトキサミンにおいて、一部の細胞に脂肪滴の蓄積が観察された（図８中図）。
　さらに、HGF+OsM、メトキサミン塩酸塩、またはDMSOを添加して誘導した細胞集団、およびHepG2をPAS染色したところ、HepG2、HGF+OsMおよびメトキサミンにおいて、赤紫色に染色される細胞が多数観察された（図８下図）。従って、メトキサミン塩酸塩を添加して誘導した細胞は、グリコーゲンの蓄積能を有することが確認された。
誘導肝細胞の評価（薬物代謝酵素の発現評価）
　上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間、およびStage 3にて20 ng/ml HGFおよび20 ng/ml オンコスタチンM（HGF+OsM）を添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた細胞集団、Stage 3にて1 μMのメトキサミン塩酸塩を添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた細胞集団、Stage 3にて1 μMのプレグネノロンを添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた細胞集団、またはStage 3にてDMSOを添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）中で8日間培養して得られた細胞集団を、CYP3A4抗体（Proteintech Group）を用いて免疫染色（図９A）を行った。この結果、DMSO以外を用いて誘導された細胞集団では、CYP3A4を発現する細胞が確認された。同様に、これらの細胞集団におけるCYP3A4のmRNAの発現量を定量PCRで測定したところ、DMSO以外を用いて誘導された肝細胞では、CYP3A4が強く発現していることが確認された（図９B）。使用したプライマーは、Foward:5'-AAGACCCCTTTGTGGAAAAC-3'（配列番号：５）およびReverse:5'-CGAGGCGACTTTCTTTCATC-3' （配列番号：６）である。
　以上より、本発明の方法を用いて製造された肝細胞を用いて被検物質の肝代謝を判定することができることが示唆された。
メトキサミンの濃度の検討
　上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間およびStage 3の期間を8日間の条件において、Stage 3で添加するメトキサミン塩酸塩の濃度をそれぞれ、0 M、1 fM、1 pM、1 nM、1 μM、50 μM、100 μMで作製された細胞集団のアルブミンのmRNAの発現量を定量PCRを用いて測定した（図１０）。その結果、1 fM以上の濃度のメトキサミン塩酸塩を用いた場合、アルブミンを発現する細胞が得られることが確認された。
誘導肝細胞の評価（薬物代謝酵素の発現評価）
　上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間およびStage 3の期間を8日間の条件において、1 μMのメトキサミン塩酸塩を用いて得られた細胞における各薬物代謝酵素（CYP1A1、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A4、CYP2C19）およびチロシンアミノトランスフェラーゼ（TAT）の発現量を定量PCRを用いて測定した（図１１）。用いたprimerの配列は、以下表１に示す。その結果、本発明の方法を用いて作製された細胞集団は、HGF+OsMを用いた場合と同等の薬物代謝酵素等を発現していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
薬物相互作用の影響の評価
　上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間およびStage 3の期間を6日間の条件を用いて製造された細胞を用いて、各薬物代謝酵素の薬物による影響を検討した。詳細には、Stage 3の期間を6日間目の細胞へ40μM リファンピリシンを添加し、2日後にCYP3A4のmRNA発現量を定量PCRを用いて測定した。同様に、40μMオメプラゾールを添加し、CYP1A2のmRNA発現量を測定し、100μMフェノバルビタールを添加し、CYP2B6のmRNA発現量を測定した。その結果、本発明の方法により得られた細胞において各薬物代謝酵素が対応する薬物と接触させることで発現誘導が起きることが確認された（図１２）。従って、当該細胞を用いて薬物相互作用を評価することが可能であることが示唆された。
各iPS細胞株における肝細胞分化誘導
　上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間およびStage 3の期間を8日間の条件を用いて、648A1、648B1、604A1、604B1、604A3、606A1、606B1および610B1から誘導し、分泌されるアルブミン量を測定したところ、いずれのiPS細胞株からも少なくとも一日あたり2μg/mlを分泌する機能を有する細胞が製造できることが確認された（図１３）。
アルブミン陽性細胞の含有率の測定
　ヒトiPS細胞（201B6）のアルブミン遺伝子座の開始コドンの下流へGFP-polyAを連結するよう、常法に従って、相同組換えを行った。当該相同組換えにより、アルブミンの発現と連携してGFPを発現する細胞株を作製した（以下、アルブミンレポーターiPS細胞という）。アルブミンレポーターiPS細胞を、上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間およびStage 3の期間を8日間の条件を用いて、肝細胞を誘導し、GFP陽性細胞の含有率を測定した（図１４）。その結果、誘導後の細胞群において、アルブミン発現細胞は、39.9%含有されていることが確認された。
肝細胞誘導メカニズムの検討
　メトキサミンによる肝細胞誘導効率を上昇させるメカニズムを検討するため、各アドレナリン受容体の遮断薬を添加し、アルブミンの分泌量を検討した。上述した方法のStage 1の期間を6日間(Stage 1-1を1日間、Stage 1-2を2日間およびStage 1-3を3日間)、Stage 2の期間を6日間およびStage 3の期間を8日間の条件にて、Stage 3において、メトキサミンおよび各アドレナリン受容体の遮断薬を添加した。用いたアドレナリン受容体の遮断薬は、α１遮断薬として10μM ドキザソシン（Sigma）を使用し、α２遮断薬として10μM ヨヒンビン（Sigma）を使用し、β１遮断薬として10μM メトプロロール（Sigma）を使用し、β２遮断薬として10μM ブトキサミン（Sigma）を使用した。その結果、メトキサミンに対して、ドキザソシンを添加した場合において、アルブミン分泌量が低下した（図１５）。従って、iPS細胞から肝細胞を誘導するにあたり、少なくともα１作動することでその誘導効率を上昇させることができることが示唆された。
遺伝子発現プロファイル解析
　ヒトiPS細胞から分化誘導した肝細胞について、RNA sequencing解析により遺伝子発現プロファイルの比較を行った。図１６は主成分分析（PCA）を、図１７は肝臓マーカー遺伝子発現のヒートマップを示す。これらの結果より、既存の増殖因子(HGF&OsM)で分化誘導した肝細胞とメトキサミンで分化誘導した肝細胞は、遺伝子発現プロファイルがほぼ同じであることが確認された。
ES細胞から肝細胞の誘導
＜Stage 1＞
マウスES細胞(D3株)は、0.25%トリプシン-EDTA（GIBCO）を加えて単一細胞へ分離した。フィーダー細胞を除くため、ゼラチンコートしたプレートへ播種して10～20分後にES細胞と培養液とを含む上清を回収し、次いで2.0×104-8.0×104cells/wellとなるようMatrigel basement Membrance Matrix Growth Factor Reduced（BD）をコートした24 wellプレートへ播種した。1μM CHIR99021（Axon Medchem）、100 ng/ml　Activin A（R&D systems）、2% B27（Invitrogen）および0.5% PenStrep（Invitrogen）を添加したRPMI1640中で１日間培養した（Stage 1-1）（day1）。
続いて培地へ0.5 mM NaB（Sigma）を添加し、1日間培養した（Stage 1-2）（day2）。培地を除去し、0.5 mM NaB（Sigma）、1μM CHIR99021（Axon Medchem）、100 ng/ml　Activin A（R&D systems）、2% B27（Invitrogen）および0.5% PenStrep（Invitrogen）を添加したRPMI1640中で４日間培養した（Stage 1-3）（day６）。以上の工程により得られた細胞をSox17の抗体で染色し、Sox17陽性細胞の含有率を調べたところ、Sox17陽性細胞（内胚葉細胞）を60％から80％含む細胞群を得た。
＜Stage 2＞
　Stage 1の後、培地を除去し、１％DMSO、20％KSR（Invitrogen）、1 mM L-グルタミン酸、1% NEAA（Invitrogen）、0.1 mM βメルカプトエタノール、0.5 mM NaB（Sigma）および0.5% PenStrepを添加したKnockoutTMDMEM（Invitrogen）へ培地を交換し、6日間培養して細胞を得た。得られた細胞をAFPの抗体で染色し、AFP陽性細胞の含有率を調べたところ、AFP陽性細胞（肝芽細胞）を40％から60％含む細胞群を得た（day１２）。
＜Stage 3＞
　Stage 2の後、培地を除去し、1 μMのプレグネノロン（東京化成）、メトキサミン塩酸塩（Sigma）、エチレフリンまたはフェニレフリンを添加したHepatocyte Culture Medium （HCM SingleQuots Kit）（LONZA）へ培地を交換し、8日間培養した。このとき、対照として、1% DMSO、または20 ng/ml HGFおよび20 ng/mlオンコスタチンMを添加したHepatocyte Culture Medium（HCM SingleQuots Kit）にて同様に細胞を培養した。
誘導肝細胞の評価
　未分化細胞（ES細胞）、Day 6の細胞（Stage 1終了）、Day 12の細胞（Stage 2終了時）、Stage 3でHGF+オンコスタチンM(GFs)、メトキサミン、エチレフリン、フェニレフリン、プレグネノロンを添加した培地にて８日間培養した細胞（Day20）、および成熟マウス肝細胞のそれぞれにおけるチロシンアミノトランスフェラーゼ（Tat）、薬物代謝酵素（Cyp3a11およびCyp3a13）、およびβアクチンの発現を測定した。結果を図１９に示す。
　Stage 3においてプレグネノロン、アドレナリン作動薬であるメトキサミン、エチレフリン、フェニレフリンを添加して誘導された細胞集団は、HGF+OsMを用いた場合と同様の薬物代謝酵素等を発現していることが確認された。
　また、Stage 3においてメトキサミンを添加した培地を用いて８日間培養した細胞を、陽性コントロールとしてStage 3においてHGF+OsMを添加した培地、陰性コントロールとしてDMSOを添加した培地で同様に培養した細胞を抗アルブミン抗体（Albumin）抗Cyp3a4抗体、および抗C/ebpβで免疫染色した。結果を図２０に示す。いずれもHGF+OsMを添加した培地を用いた細胞群とメトキサミンを添加した培地を用いた細胞群で、非常によく似た発現が認められた。
　以上詳述したように、本発明は、多能性幹細胞から肝細胞を分化誘導する方法を提供する。これにより、本方法で製造された肝細胞は、肝不全等の肝臓疾患の治療のための再生医療や医薬品の安全性試験、薬物代謝検査などに使用され得る。

Claims (20)

  1. 肝芽細胞をプレグネノロンまたはアドレナリン作動薬を含む培地中で培養する工程を含み、当該肝芽細胞がAFP陽性である、肝細胞を製造する方法。
  2. 前記アドレナリン作動薬が、アドレナリン、ノルアドレナリン、エチレフリン、ナファゾリン、フェニレフリン、メトキサミンおよびミドドリンから成る群より選択される試薬である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アドレナリン作動薬が、エチレフリン、フェニレフリンおよびメトキサミンから選択される試薬である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記肝芽細胞が、内胚葉細胞をDMSOを含む培地中で培養する工程を含む方法で製造された細胞であり、当該内胚葉細胞がSOX17陽性細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記内胚葉細胞が、多能性幹細胞を、Activin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む方法で製造された細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記多能性幹細胞から内胚葉細胞を製造する工程が、Activin A、GSK-3β阻害剤およびHDAC阻害剤を含む培地で培養する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021であり、前記HDAC阻害剤が、NaB（酪酸ナトリウム）である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記iPS細胞がヒトiPS細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記多能性幹細胞がES細胞である、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
  11. 多能性幹細胞から肝細胞を製造する方法であって、以下の工程（i）から（iii）：
    （i）多能性幹細胞を、Activin AおよびGSK-3β阻害剤を含む培地中で培養する工程、
    （ii）工程（i）で得られた細胞をDMSOを含む培地中で培養する工程、および
    （iii）工程（ii）で得られた細胞をプレグネノロンおよびアドレナリン作動薬から成る群より選択された薬剤を含む培地中で培養する工程、
    を含む、前記方法。
  12. 前記アドレナリン作動薬が、アドレナリン、ノルアドレナリン、エチレフリン、ナファゾリン、フェニレフリン、メトキサミンおよびミドドリンから選択される試薬である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記アドレナリン作動薬が、エチレフリン、フェニレフリンおよびメトキサミンから選択される試薬である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記工程（i）において、Activin A、GSK-3β阻害剤およびHDAC阻害剤を含む培地で培養する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021であり、前記HDAC阻害剤が、NaB（酪酸ナトリウム）である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記iPS細胞がヒトiPS細胞である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記多能性幹細胞がES細胞である、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
  19. 請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法で製造された肝細胞と被検物質を接触させる工程を含む、被検物質の代謝産物を検出する方法。
  20. 請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法で製造された肝細胞と被検物質を接触させる工程を含む、被検物質の薬物代謝酵素の誘導を検出する方法。
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