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JP2010233578A - 増加したＦｃレセプター結合親和性およびエフェクター機能を有する抗体を作製するための融合構築物およびその使用 - Google Patents

増加したＦｃレセプター結合親和性およびエフェクター機能を有する抗体を作製するための融合構築物およびその使用 Download PDF

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JP2010233578A
JP2010233578A JP2010132494A JP2010132494A JP2010233578A JP 2010233578 A JP2010233578 A JP 2010233578A JP 2010132494 A JP2010132494 A JP 2010132494A JP 2010132494 A JP2010132494 A JP 2010132494A JP 2010233578 A JP2010233578 A JP 2010233578A
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JP
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antibody
polypeptide
cells
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
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JP2010132494A
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Pablo Umana
ウマナ パブロ
Peter Bruenker
ブルエンカー ピーター
Claudia Ferrara
フェラーラ クラウディア
Tobias Suter
スーター トビアス
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Roche Glycart AG
Original Assignee
Roche Glycart AG
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Abstract

【課題】Ｆｃレセプター結合親和性およびエフェクター機能が増加した抗体を提供する。
【解決手段】本発明は、タンパク質のグリコシル化操作分野に関する。より詳細には、本発明は、触媒活性を有する核酸分子（融合構築物が含まれる）、治療特性が改良されたポリペプチド（Ｆｃレセプター結合およびエフェクター機能が増加した抗体が含まれる）を作製するための宿主細胞のグリコシル化操作におけるその使用に関する。本発明は、広義には、宿主細胞によって産生された１つまたは複数のポリペプチドのグリコシル化プロフィールを変化させるための宿主細胞の糖操作に関する。本発明の方法を使用して、Ｆｃ領域中のグリコシル化が改変されて（フコシル化の減少が含まれる）グリコシル化の改変の結果としてエフェクター機能および／またはＦｃレセプター結合が増加した治療抗体を産生することができる。
【選択図】図２４

Description

（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、タンパク質のグリコシル化操作分野に関する。より詳細には、本発明は、触媒活性を有する核酸分子（融合構築物が含まれる）、治療特性が改良されたポリペプチド（Ｆｃレセプター結合およびエフェクター機能が増加した抗体が含まれる）を作製するための宿主細胞のグリコシル化操作におけるその使用に関する。
（背景技術）
糖タンパク質は、ヒト、他の真核生物、およびいくつかの原核生物における多数の不可欠な機能（触媒、シグナル伝達、細胞−細胞伝達、ならびに分子の認識および結合が含まれる）を媒介する。これらは、真核生物における非サイトゾルタンパク質の大部分を構成する。（Ｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７（１９９３））。多数の糖タンパク質が治療目的のために活用されており、この２０年間で、天然に存在する分泌糖タンパク質の組換え形態はバイオ産業の主要製品であった。例には、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、治療モノクローナル抗体（治療ｍＡｂ）、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）が含まれる。（Ｃｕｍｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−１３０（１９９１）。
オリゴ糖成分は、治療糖タンパク質の有効性に関連する性質（生理学的安定性、プロテアーゼ攻撃耐性、免疫系との相互作用、薬物動態学、および特定の生物活性が含まれる）に有意に影響を与えることができる。このような性質は、オリゴ糖の有無だけでなく、特定の構造にも依存し得る。オリゴ糖の構造と糖タンパク質機能とをいくらか一般化し得る。例えば、一定のオリゴ糖構造が特定の炭水化物結合タンパク質との相互作用を介して血流からの糖タンパク質の迅速なクリアランスを媒介する一方で、他のオリゴ糖が抗体に結合して望ましくない免疫反応を誘発し得る（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。
哺乳動物細胞は、ヒト適用のためのほとんどの適合可能形態でタンパク質をグリコシル化する能力のために、治療糖タンパク質産生のための好ましい宿主である。（Ｃｕｍｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−３０（１９９１）；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。細菌はタンパク質をほとんどグリコシル化せず、酵母細胞、糸状菌細胞、昆虫細胞、および植物細胞などの同様の他の一般的な宿主型では、血流からの迅速なクリアランス、望ましくない免疫相互作用、およびいくつかの特定の場合での生物活性の減少に関連するグリコシル化パターンが得られる。哺乳動物細胞のうち、この２０年間でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が最も一般的に使用されている。適切なグリコシル化パターンが得られることに加えて、これらの細胞により、遺伝的に安定で高産生量のクローン細胞株が一貫して得られる。これらを無血清培地を使用した単純なバイオリアクター中で高密度に培養して安全且つ再生可能なバイオプロセスを開発することができる。他の一般的に使用される動物細胞には、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０−およびＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞が含まれる。より最近では、トランスジェニック動物由来の産生も試験されている。（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。
全抗体は、各イソ型がタンパク質のアセンブリ、分泌、または機能活性に様々に影響を与えるＮ結合炭水化物構造の異なるアレイを有する重鎖定常領域中の保存された位置に炭水化物構造を含む。（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７））。結合したＮ結合炭水化物の構造はプロセシングの程度に依存して非常に変化し、高マンノース、多分岐、および二触覚型（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）複合オリゴ糖が含まれ得る。（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７））。典型的には、特定のグリコシル化部位に結合したコアオリゴ糖構造の異種プロセシングが存在し、それによりモノクローナル抗体でさえも複数の糖形態として存在する。同様に、細胞株間で抗体グリコシル化が非常に異なり、異なる培養条件下で成長した所与の細胞株についても少し異なることが示されている。（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（８）：８１３−２２（１９９５））。
ＣＤ２０陽性Ｂ細胞、低悪性度または濾胞性非ホジキン病治療のためのリツキシマブ（リツキサン（商標）；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、進行性乳癌治療のためのトラツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ，）（Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ａ．−Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６６−７３（１９９９）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−１８（１９９９））、再発性急性骨髄性白血病治療のためのゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標），Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病治療のためのアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（商標），Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）が食品医薬品局で承認されているように、非抱合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は有用な癌治療薬であり得る。これらの製品の成功は、その有効性だけでなく、その卓越した安全性プロフィールによる（Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ａ．−Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６６−７３（１９９９）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−１８（１９９９））。これらの薬物の成果にもかかわらず、現在、非抱合ｍＡｂ療法によって典型的に付与されるものよりも高い特異的抗体活性を得ることに大きな関心が寄せられている。
効力を大きく増加させる一方で単純な製造プロセスを維持し、且つ有意な望ましくない副作用を潜在的に回避するための１つの方法は、そのオリゴ糖成分の操作によってｍＡｂの天然の細胞媒介性エフェクター機能を増強することである（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。ＩｇＧ１型抗体（癌免疫療法で最も一般的に使用されている抗体）は、各ＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７に保存Ｎ結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合二触覚型オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格と広範に接触し、その存在は抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するのに不可欠である（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２（１９９５）；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８）；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３２（１９９７））。
本発明者らは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）（二分オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ）の過剰発現によって、操作されたＣＨＯ細胞によって産生された抗神経芽細胞腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のインビトロでのＡＤＣＣ活性が有意に増加することを以前に示した（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９），国際公開番号ＷＯ ９９／５４３４２（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。抗体ｃｈＣＥ７は、腫瘍親和性および特異性が高いがＧｎＴＩＩＩ酵素を欠く標準的な産業用細胞株で産生された場合に効力が低すぎて臨床的に有用ではない非抱合ｍＡｂの大きなクラスに属する（Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。この研究は、ＧｎＴＩＩＩを発現するように抗体産生細胞を操作することによって天然に存在する抗体で見出されるレベルよりもＡＤＣＣを非常に増加することができる、定常領域（Ｆｃ）結合二分オリゴ糖（二分非フコシル化オリゴ糖が含まれる）の比率も増加させることができることを最初に示した。
多数の研究結果により、Ｆｃレセプター依存性機構は、腫瘍に対する細胞傷害性抗体作用に実質的にに寄与することが示唆され、腫瘍に対する最適な抗体が活性化Ｆｃレセプターおよび最小には阻害パートナーＦｃγＲＩＩＢと優先的に結合することを示す（Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（４）：４４３−４４６（２０００）；Ｋａｌｅｒｇｉｓ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５（１２）：１６５３−１６５９（Ｊｕｎｅ ２００２）。例えば、少なくとも１つの研究結果により、特にＦｃγＲＩＩＩａレセプターが抗体療法の有効性に強く関連することが示唆される（Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９９（３）：７５４−７５７（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００２））。この研究は、ＦｃγＲＩＩＩａにホモ接合性を示す患者はヘテロ接合性患者よりもリツキシマブに対する応答が良好であることを示した。著者は、優れた応答はリンパ腫細胞に対するより良好なＡＤＣＣ活性が得られるＦｃγＲＩＩＩａへの抗体のより良好なインビボ結合に起因すると結論づけた。（Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９９（３）：７５４−７５７（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００２））。
ＡＤＣＣに加えて、首尾の良い抗癌モノクローナル抗体は、細胞シグナル伝達カスケードの活性化または成長因子へのアクセスの遮断によって標的細胞の生存、増殖、または死滅を調節するＦｃ依存性直接シグナル伝達機構をしばしば誘導する。（Ｓｅｌｅｎｋｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１２４−１３０（２００２））。例えば、リツキシマブでのＣＤ２０＋Ｂ細胞の治療により、補体媒介溶解およびアポトーシスのＭａｂ誘導性誘導ならびにＡＤＣＣを誘導することが示されている。（Ｓｅｌｅｎｋｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１２４−１３０（２００２））。さらに、リンパ腫細胞のリツキシマブ誘導性アポトーシスにより、細胞を死滅させるだけでなく抗原提示樹状細胞（ＤＣ）によってリンパ腫細胞由来のペプチドのプロモーターの取り込みおよび交差提示を促進し、ＤＣの成熟を誘導し、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を産生する。
（発明の要旨）
Ｆｃレセプター結合親和性およびエフェクター機能が増加した抗体の驚異的な治療潜在性の認識により、本発明者らは、抗体のＦｃ領域のグリコシル化プロフィールの操作を含むこのような抗体の産生方法を開発した。
本発明は、広義には、宿主細胞によって産生された１つまたは複数のポリペプチドのグリコシル化プロフィールを変化させるための宿主細胞の糖操作に関する。本発明の方法を使用して、Ｆｃ領域中のグリコシル化が改変されて（フコシル化の減少が含まれる）グリコシル化の改変の結果としてエフェクター機能および／またはＦｃレセプター結合が増加した治療抗体を産生することができる。本発明の糖操作は、患者の腫瘍の治療上の処置で特に有用である。１つの実施形態では、ＧｎＴＩＩＩ触媒活性またはＧａｌＴ触媒活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸分子を発現するために本発明の宿主細胞を糖操作する。好ましい実施形態では、融合構築物は、ヒトＭａｎＩＩ触媒活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子および／またはＧｍＴＩＩ触媒活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子と同時発現する。さらに別の実施形態では、ＭａｎＩＩ触媒活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の発現が増加するように糖操作された宿主細胞によって本発明の糖操作ポリペプチドを産生する。
したがって、１つの態様では、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、融合ペプチドをコードする配列を含む単離核酸に関する。１つの実施形態では、融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含む。さらなる実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）の局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（「ＧｎＴＩＩ」）の局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。好ましい実施形態では、単離核酸配列は、図２４または図２５に記載のヌクレオチド配列を含む。別の好ましい実施形態では、単離核酸配列は、図２４または図２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。さらに別の好ましい実施形態では、単離核酸配列は、図２４または図２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
別の態様では、本発明は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、融合ペプチドをコードする配列を含む単離核酸に関する。１つの実施形態では、融合ポリペプチドは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む。さらなる実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）の局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（「ＧｎＴＩＩ」）の局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、融合ペプチドをコードする配列を含む単離核酸を含む発現ベクターに関する。１つの実施形態では、発現ベクターは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドをコードし、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、融合ペプチドをコードする配列を含む単離核酸を含む発現ベクターに関する。１つの実施形態では、発現ベクターは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドをコードし、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、上記発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
別の態様では、本発明は、全抗体分子、Ｆｃ領域を含む抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖を修飾するのに十分な量のβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主に関する。１つの実施形態では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインならびにマンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、全抗体分子、Ｆｃ領域を含む抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖を修飾するのに十分な量のβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主に関する。１つの実施形態では、ＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインならびにマンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。
好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩまたはβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩあるいはガラクトシルトランスフェラーゼに由来する。
別の態様では、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、融合ポリペプチドに関する。１つの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含む。別の実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、融合ポリペプチドに関する。１つの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む。別の実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。
好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩまたはβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）あるいはガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）に由来する。
別の態様では、本発明は、融合ポリペプチドをコードする核酸を発現させる条件下で培地中にて本発明の宿主細胞を培養する工程と、得られた培養物から融合ポリペプチドを回収する工程とを含む、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドの産生方法に関する。１つの実施形態では、融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含む。好ましくは、融合ポリペプチドは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、融合ポリペプチドをコードする核酸を発現させる条件下で培地中にて本発明の宿主細胞を培養する工程と、得られた培養物から融合ポリペプチドを回収する工程とを含む、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する融合ポリペプチドの産生方法に関する。１つの実施形態では、融合ポリペプチドは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む。好ましくは、融合ポリペプチドは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。
好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、またはガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）に由来する。
さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つの本発明の核酸または発現ベクターを宿主細胞に移入する工程を含む、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのグリコシル化プロフィールを改変する方法に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ＩｇＧまたはポリペプチドのＦｃ領域を含むそのフラグメントである。特に好ましい実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧ１またはポリペプチドのＦｃ領域を含むそのフラグメントである。あるいは、ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質である。
別の態様では、本発明は、（ａ）全抗体分子、Ｆｃ領域を含む抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量で前記融合ポリペプチドが発現することと、（ｂ）前記ポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でポリペプチドを産生する方法に関する。好ましくは、融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩまたはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）の触媒ドメインを含み、且つマンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインをさらに含む。好ましい実施形態では、宿主細胞によって産生されたポリペプチドは、改変の結果としてエフェクター機能および／またはＦｃレセプター結合が増加する。特に好ましい実施形態では、エフェクター機能の増加によってＦｃ媒介性細胞傷害性、ＮＫ細胞への結合、マクロファージへの結合、単球への結合、多形核細胞への結合、直接シグナル伝達誘導アポトーシス、樹状結合成熟、および／またはＴ細胞プライミングが増加し、Ｆｃレセプター結合の増加によってＦｃγＲＩＩＩＡなどのＦｃ活性化レセプターへの結合が増加する。好ましくは、エフェクター機能および／またはＦｃレセプター結合が増加したポリペプチドは、抗体、抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質であり、Ｆｃ領域中の非フコシル化オリゴ糖の比率が増加する。
別の実施形態では、本発明は、抗体、Ｆｃ領域を含む抗体フラグメント、または本発明の免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドを含む薬学的組成物および癌などの腫瘍または他の障害の治療における薬学的組成物の使用に関する。１つの実施形態では、治療は、治療有効量のこのような薬学的組成物の必要とする患者（例えば、ヒト）への投与によるＢ細胞枯渇である。
なおさらなる態様では、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクター、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含み、ゴルジ局在化ドメインは、ＭａｎＩＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、ＭａｎＩの局在化ドメイン、およびα−１，６−コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。１つの実施形態では、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする発現ベクターをさらに含む。融合ポリペプチド、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチド、およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子は、それぞれ異なる発現ベクターまたは同一の発現ベクター中に存在し得る。
さらなる態様では、本発明は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクター、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含み、ゴルジ局在化ドメインは、ＭａｎＩＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、ＭａｎＩの局在化ドメイン、およびα−１，６−コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。１つの実施形態では、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする発現ベクターをさらに含む。融合ポリペプチド、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチド、およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子は、それぞれ異なる発現ベクターまたは同一の発現ベクター中に存在し得る。
さらなる態様では、本発明は、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する。
さらなる態様では、本発明は、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する。
さらなる態様では、本発明は、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する。
さらなる態様では、本発明は、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量で前記融合ポリペプチドが発現することと、前記ポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でポリペプチドを産生する方法に関する。
別の態様では、本発明は、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量で前記融合ポリペプチドが発現することと、前記ポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でポリペプチドを産生する方法に関する。
さらなる態様では、全抗体分子、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体フラグメントからなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でＧａｌＴをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、ＧａｌＴまたはＭａｎＩＩの一方または両方の発現レベルが前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分であることと、前記ポリペプチドのＦｃ媒介性細胞傷害性が改変の結果として増加することと、前記Ｆｃ媒介性細胞傷害性が増加したポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でＦｃ媒介性細胞傷害性が増加したポリペプチドを産生する方法。
別の態様では、本発明は、（ａ）全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でα−マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量で前記α−マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドが発現することと、（ｂ）前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主細胞中でポリペプチドを産生する方法に関する。
別の態様では、本発明は、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量でα−マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドが発現する、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でα−マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞に関する。
さらに別の態様では、本発明は、特に、このような宿主細胞によって産生されたポリペプチド、特に改変オリゴ糖の結果としてエフェクター機能および／またはＦｃレセプター結合が増加した抗体に関する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
融合ポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸であって、該融合ポリペプチドが、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、そして、ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、核酸。
（項目２）
項目１に記載の単離された核酸であって、上記融合ポリペプチドが、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩまたはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む、核酸。
（項目３）
項目２に記載の単離された核酸であって、上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである、核酸。
（項目４）
項目３に記載の単離された核酸であって、図２４および配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有する、核酸。
（項目５）
項目２に記載の単離された核酸であって、上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、核酸。
（項目６）
項目５に記載の単離された核酸であって、図２５および配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する、核酸。
（項目７）
項目２に記載の単離された核酸であって、上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、核酸。
（項目８）
項目２に記載の単離された核酸であって、上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、核酸。
（項目９）
項目２に記載の単離された核酸であって、上記ゴルジ局在化ドメインが、α１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、核酸。
（項目１０）
項目３に記載の単離された核酸であって、図２４および配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
（項目１１）
項目５に記載の単離された核酸であって、図２５および配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
（項目１２）
項目３に記載の単離された核酸であって、ハイブリダイゼーションプローブに対してストリンジェントな条件下で、図２４および配列番号１４に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列を含む、核酸。
（項目１３）
項目５に記載の単離された核酸であって、ハイブリダイゼーションプローブに対してストリンジェントな条件下で、図２５および配列番号１２に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列を含む、核酸。
（項目１４）
項目３に記載の単離された核酸であって、図２４および配列番号１４に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８０％同一である配列を含む、核酸。
（項目１５）
項目５に記載の単離された核酸であって、図２５および配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８０％同一である配列を含む、核酸。
（項目１６）
項目３に記載の単離された核酸であって、図２４および配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
（項目１７）
項目５に記載の単離された核酸であって、図２５および配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
（項目１８）
項目３に記載の単離された核酸であって、保存的アミノ酸置換基を有する、図２４および配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
（項目１９）
項目５に記載の単離された核酸であって、保存的アミノ酸置換基を有する、図２５および配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
（項目２０）
項目１〜１９のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
（項目２１）
β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、そして、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、融合ポリペプチド。
（項目２２）
項目２１に記載の融合ポリペプチドであって、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩまたはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む、融合ポリペプチド。
（項目２３）
項目２１に記載の融合ポリペプチドであって、上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである、融合ポリペプチド。
（項目２４）
項目２１に記載の融合ポリペプチドであって、上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、融合ポリペプチド。
（項目２５）
項目２１に記載の融合ポリペプチドであって、上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、融合ポリペプチド。
（項目２６）
項目２１に記載の融合ポリペプチドであって、上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、融合ポリペプチド。
（項目２７）
項目２１に記載の融合ポリペプチドであって、上記ゴルジ局在化ドメインが、α１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、融合ポリペプチド。
（項目２８）
項目２０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目２９）
β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する融合ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該融合ポリペプチドをコードする上記核酸の発現を可能にする条件下で、培地で、項目２８に記載の宿主細胞を培養する工程、および生じた培養物から該融合ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
（項目３０）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのグリコシル化プロフィールを改変するための方法であって、項目１〜１９のいずれか１項に記載の核酸を、該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
（項目３１）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのグリコシル化プロフィールを改変するための方法であって、項目２０に記載の発現ベクターを、該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
（項目３２）
上記ポリペプチドが、ＩｇＧまたはそのフラグメントである、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
上記ポリペプチドが、ＩｇＧ１またはそのフラグメントである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記ポリペプチドが、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖を改変するのに十分な量の、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞であって、該ポリペプチドが、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質からなる群より選択される、宿主細胞。
（項目３６）
上記宿主細胞により産生された上記ポリペプチドが、ＩｇＧまたはそのフラグメントである、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目３７）
上記宿主細胞により産生された上記ポリペプチドが、ＩｇＧ１またはそのフラグメントである、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目３８）
上記宿主細胞により産生された上記ポリペプチドが、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質である、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目３９）
上記宿主細胞により産生された上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したＦｃレセプター結合親和性を示す、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目４０）
上記宿主細胞により産生された上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したエフェクター機能を示す、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目４１）
上記融合ポリペプチドが、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩまたはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目４２）
上記融合ポリペプチドが、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインをさらに含む、項目４１に記載の宿主細胞。
（項目４３）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４４）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４５）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４６）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４７）
上記ゴルジ局在化ドメインが、α１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４８）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＦｃ媒介性細胞傷害性である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目４９）
上記増加したエフェクター機能が、ＮＫ細胞に対する増加した結合である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５０）
上記増加したエフェクター機能が、マクロファージに対する増加した結合である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５１）
上記増加したエフェクター機能が、多形核細胞に対する増加した結合である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５２）
上記増加したエフェクター機能が、単球に対する増加した結合である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５３）
上記増加したエフェクター機能が、増加した、直接シグナル伝達に誘導されたアポトーシスである、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５４）
上記増加したエフェクター機能が、増加した樹状細胞成熟である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５５）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＴ細胞プライミングである、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５６）
上記Ｆｃレセプターが、Ｆｃγ活性化レセプターである、項目３９に記載の宿主細胞。
（項目５７）
上記Ｆｃレセプターが、ＦｃγＲＩＩＩＡレセプターである、項目３９に記載の宿主細胞。
（項目５８）
上記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞である、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目５９）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、抗ＣＤ２０抗体である、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目６０）
上記抗ＣＤ２０抗体が、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８である、項目５９に記載の宿主細胞。
（項目６１）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０である、項目３５に記載の宿主細胞。
（項目６２）
項目３５に記載の宿主細胞であって、抗体分子および抗体フラグメントまたは免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも一つの切断された核酸をさらに含む、宿主細胞。
（項目６３）
項目３５に記載の宿主細胞であって、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する融合ポリペプチドをコードする上記少なくとも一つの核酸が、構成的プロモーターエレメントに作動可能に連結される、宿主細胞。
（項目６４）
項目６２に記載の宿主細胞であって、上記少なくとも一つの切断された核酸が、抗ＣＤ２０抗体、キメラ抗ヒト神経芽腫モノクローナル抗体ｃｈＣＥ７、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０、キメラ抗ヒト結腸癌、肺癌および乳癌モノクローナル抗体ＩＮＧ−１、ヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体３６２２Ｗ９４、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体Ａ３３、ＧＤ３ガングリオシドに対して指向された抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４、キメラ抗ヒト扁平上皮癌モノクローナル抗体ＳＦ−２５、抗ヒトＥＧＦＲ抗体、抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗ヒトＰＳＭＡ抗体、抗ヒトＰＳＣＡ抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗ヒトＣＤ３０抗体、抗ヒトＣＤ３３抗体、抗ヒトＣＤ３８抗体、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ４５抗体、抗ヒトＣＤ５２抗体、抗ヒトＣＤ１３８抗体、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ改変抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体、抗ヒトＣＥＡ抗体、抗ヒトＭＵＣ１抗体、抗ヒトＭＵＣ１コアタンパク質抗体、抗ヒト異所性グリコシル化ＭＵＣ１抗体、ＥＤ−Ｂドメインを含むヒトフィブロネクチン改変体に対する抗体、または抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体をコードする、宿主細胞。
（項目６５）
宿主細胞中で、ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、以下：
ａ β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を、免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む全抗体分子、抗体フラグメントおよび融合タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドの産生を可能にする条件下で、培養する工程であって、該融合ポリペプチドが、該宿主細胞によって産生された該ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖を改変するのに十分な量で発現される、工程；ならびに
ｂ 該ポリペプチドを単離する、工程
を包含する、方法。
（項目６６）
上記融合ポリペプチドが、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩまたはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
上記融合ポリペプチドが、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインをさらに含む、項目６５に記載の方法。
（項目６８）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、項目６７に記載の方法。
（項目７２）
上記ゴルジ局在化ドメインが、α１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、項目６７に記載の方法。
（項目７３）
上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したエフェクター機能を有する、項目６５に記載の方法。
（項目７４）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＦｃ媒介性細胞傷害性である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
上記増加したエフェクター機能が、ＮＫ細胞に対する増加した結合である、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
上記増加したエフェクター機能が、マクロファージに対する増加した結合である、項目７３に記載の方法。
（項目７７）
上記増加したエフェクター機能が、単球に対する増加した結合である、項目７３に記載の方法。
（項目７８）
上記増加したエフェクター機能が、多形核細胞に対する増加した結合である、項目７３に記載の方法。
（項目７９）
上記増加したエフェクター機能が、直接シグナル伝達に誘導されたアポトーシスである、項目７３に記載の方法。
（項目８０）
上記増加したエフェクター機能が、増加した樹状細胞成熟である、項目７３に記載の方法。
（項目８１）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＴ細胞プライミングである、項目７３に記載の方法。
（項目８２）
上記宿主細胞により産生された上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したＦｃレセプター結合親和性を示す、項目６５に記載の方法。
（項目８３）
上記Ｆｃレセプターが、Ｆｃ活性化レセプターである、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
上記Ｆｃレセプターが、ＦｃγＲＩＩＩＡレセプターである、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、該ポリペプチドのＦｃ領域における増加した割合の二分されたオリゴ糖を有する、項目６５に記載の方法。
（項目８６）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、該ポリペプチドのＦｃ領域における増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有する、項目６５に記載の方法。
（項目８７）
上記非フコシル化オリゴ糖がハイブリッドである、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
上記非フコシル化オリゴ糖が複合体である、項目８６に記載の方法。
（項目８９）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、該ポリペプチドのＦｃ領域における増加した割合の二分された非フコシル化オリゴ糖を有する、項目６５に記載の方法。
（項目９０）
上記二分された非フコシル化オリゴ糖がハイブリッドである、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
上記二分された非フコシル化オリゴ糖が複合体である、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも２０％が、二分され、非フコシル化される、項目８９に記載の方法。
（項目９３）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも２５％が、二分され、非フコシル化される、項目８９に記載の方法。
（項目９４）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも３０％が、二分され、非フコシル化される、項目８９に記載の方法。
（項目９５）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも３５％が、二分され、非フコシル化される、項目８９に記載の方法。
（項目９６）
項目６５〜９６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、増加したエフェクター機能を有するように操作された、抗体。
（項目９７）
項目６５〜９６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、増加したＦｃレセプター結合親和性を有するように操作された、抗体。
（項目９８）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＦｃ媒介性細胞傷害性である、項目９７に記載の抗体。
（項目９９）
上記増加したエフェクター機能が、ＮＫ細胞に対する増加した結合である、項目９７に記載の抗体。
（項目１００）
上記増加したエフェクター機能が、マクロファージに対する増加した結合である、項目９７に記載の抗体。
（項目１０１）
上記増加したエフェクター機能が、単球に対する増加した結合である、項目９７に記載の抗体。
（項目１０２）
上記増加したエフェクター機能が、多形核細胞に対する増加した結合である、項目９７に記載の抗体。
（項目１０３）
上記増加したエフェクター機能が、直接シグナル伝達に誘導されたアポトーシスである、項目９７に記載の抗体。
（項目１０４）
上記増加したエフェクター機能が、増加した樹状細胞成熟である、項目９７に記載の抗体。
（項目１０５）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＴ細胞プライミングである、項目９７に記載の抗体。
（項目１０６）
上記Ｆｃレセプターが、Ｆｃ活性化レセプターである、項目９８に記載の抗体。
（項目１０７）
上記Ｆｃレセプターが、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターである、項目９８に記載の抗体。
（項目１０８）
Ｆｃ領域を含み、項目６５〜９６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、増加したエフェクター機能を有するように操作された、抗体フラグメント。
（項目１０９）
免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含み、項目６５〜９６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、増加したエフェクター機能を有するように操作された、融合タンパク質。
（項目１１０）
Ｆｃ領域を含み、項目６５〜９６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、増加したＦｃレセプター結合親和性を有するように操作された、抗体フラグメント。
（項目１１１）
免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含み、項目６５〜９６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、増加したＦｃレセプター結合親和性を有するように操作された、融合タンパク質。
（項目１１２）
項目９７〜１０８のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（項目１１３）
項目１０９または１１１に記載の抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（項目１１４）
項目１１０または１１２に記載の融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（項目１１５）
処置の必要な患者に、治療的に有効量の項目１１３〜１１５のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、癌の処置のための方法。
（項目１１６）
Ｂ細胞枯渇に基づく疾患処置のための改良された方法であって、該方法は、治療的に有効量の抗体を、それを必要とするヒト被験体に投与する工程を包含し、該改良は、項目６５〜９６のいずれか１項に記載の方法により産生された抗体の治療的に有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目１１７）
上記抗体が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、項目１１７に記載の改良された方法。
（項目１１８）
上記抗ＣＤ２０抗体が、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８である、項目１１８に記載の改良された方法。
（項目１１９）
融合ポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸であって、ここで、該融合ポリペプチドは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、そして、ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、核酸。
（項目１２０）
上記融合ポリペプチドが、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む、項目１１９に記載の単離された核酸。
（項目１２１）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである、項目２に記載の単離された核酸。
（項目１２２）
項目１１９〜１２１のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
（項目１２３）
β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、そして、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、融合ポリペプチド。
（項目１２４）
β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む、項目１２３に記載の融合ポリペプチド。
（項目１２５）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである、項目１２４に記載の融合ポリペプチド。
（項目１２６）
項目１２２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目１２７）
β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する融合ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該融合ポリペプチドをコードする上記核酸の発現を可能にする条件下で、培地で、項目１２６に記載の宿主細胞を培養する工程、および生じた培養物から該融合ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
（項目１２８）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのグリコシル化プロフィールを改変するための方法であって、項目１１９〜１２１のいずれか１項に記載の核酸を、該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
（項目１２９）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのグリコシル化プロフィールを改変するための方法であって、項目１２２に記載の発現ベクターを、該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
（項目１３０）
宿主細胞であって、以下：
（ａ）融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターであって、該融合ポリペプチドが、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）活性を有し、ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、発現ベクター；および
（ｂ）ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターであって、該ポリペプチドが、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する、発現ベクター
を含む、宿主細胞。
（項目１３１）
項目１３０に記載の宿主細胞であって、上記融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子およびマンノシダーゼ活性ＩＩを有する上記ポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１３２）
項目１３０に記載の宿主細胞であって、上記融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＭａｎＩＩ活性を有する上記ポリペプチドをコードする上記核酸分子が、別々の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１３３）
上記融合ポリペプチドが、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１３４）
上記ゴルジ局在化ドメインが、ＭａｎＩＩの局在化ドメインである、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１３５）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１３６）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１３７）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１３８）
上記ゴルジ局在化ドメインが、α１，６−Ｎコアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１３９）
上記宿主細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる群より選択される、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１４０）
上記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞およびハイブリドーマ細胞からなる群より選択される、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１４１）
項目１３０に記載の宿主細胞であって、ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターをさらに含み、ここで、該ポリペプチドが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）活性を有する、宿主細胞。
（項目１４２）
項目１４１に記載の宿主細胞であって、ここで、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１４３）
項目１４１に記載の宿主細胞であって、ここで、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が、それぞれ別々の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１４４）
項目１４１に記載の宿主細胞であって、ここで、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子が一つの発現ベクター上に存在し、そして、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１４５）
項目１４１に記載の宿主細胞であって、ここで、ＭａｎＩＩをコードする上記核酸分子が一つの発現ベクター上に存在し、そして、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１４６）
項目１４１に記載の宿主細胞であって、ここで、上記ＧｎＴ ＩＩをコードする上記核酸分子が一つの発現ベクター上に存在し、そして、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１４７）
宿主細胞であって、以下：
（ａ）融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターであって、該融合ポリペプチドが、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性を有し、そしてゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む、発現ベクター；および
（ｂ）ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターであって、該ポリペプチドが、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する、発現ベクター
を含む、宿主細胞。
（項目１４８）
項目１４７に記載の宿主細胞であって、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子およびマンノシダーゼ活性ＩＩを有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１４９）
項目１４７に記載の宿主細胞であって、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、別々の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１５０）
上記融合ポリペプチドが、ＧａｌＴの触媒ドメインを含む、項目１４７に記載の宿主細胞。
（項目１５１）
上記ゴルジ局在化ドメインが、ＭａｎＩＩの局在化ドメインである、項目１４７に記載の宿主細胞。
（項目１５２）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、項目１４７に記載の宿主細胞。
（項目１５３）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、項目１４７に記載の宿主細胞。
（項目１５４）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、項目１４７に記載の宿主細胞。
（項目１５５）
上記ゴルジ局在化ドメインが、α１，６−Ｎコアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、項目１４７に記載の宿主細胞。
（項目１５６）
上記宿主細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる群より選択される、項目１４７に記載の宿主細胞。
（項目１５７）
上記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞およびハイブリドーマ細胞からなる群より選択される、項目１４７に記載の宿主細胞。
（項目１５８）
項目１４７に記載の宿主細胞であって、ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターをさらに含み、ここで、該ポリペプチドが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）活性を有する、宿主細胞。
（項目１５９）
項目１５８に記載の宿主細胞であって、ここで、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１６０）
項目１５８に記載の宿主細胞であって、ここで、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、それぞれ別々の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１６１）
項目１５８に記載の宿主細胞であって、ここで、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子が一つの発現ベクター上に存在し、そして、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１６２）
項目１５８に記載の宿主細胞であって、ここで、ＭａｎＩＩをコードする上記核酸分子が一つの発現ベクター上に存在し、そして、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１６３）
項目１５８に記載の宿主細胞であって、ここで、上記ＧｎＴ ＩＩをコードする上記核酸分子が一つの発現ベクター上に存在し、そして、融合ポリペプチドをコードする上記核酸分子およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸分子が、同一の発現ベクター上に存在する、宿主細胞。
（項目１６４）
上記融合ポリペプチドが、ＧａｌＴの触媒ドメインを含む、項目１５８に記載の宿主細胞。
（項目１６５）
上記ゴルジ局在化ドメインが、ＭａｎＩＩの局在化ドメインである、項目１５８に記載の宿主細胞。
（項目１６６）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、項目１５８に記載の宿主細胞。
（項目１６７）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、項目１５８に記載の宿主細胞。
（項目１６８）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、項目１５８に記載の宿主細胞。
（項目１６９）
上記ゴルジ局在化ドメインが、α１，６−コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、項目１５８に記載の宿主細胞。
（項目１７０）
上記宿主細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる群より選択される、項目１５８に記載の宿主細胞。
（項目１７１）
上記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞およびハイブリドーマ細胞からなる群より選択される、項目１５９に記載の宿主細胞。
（項目１７２）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖を改変するのに十分な量の、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞であって、該宿主細胞により産生される該ポリペプチドが、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合
タンパク質からなる群より選択される、宿主細胞。
（項目１７３）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖を改変するのに十分な量の、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸、ＭａｎＩＩを有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞であって、該宿主細胞により産生される該ポリペプチドが、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質からなる群より選択される、宿主細胞。
（項目１７４）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖を改変するのに十分な量の、ＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞であって、該宿主細胞により産生される該ポリペプチドが、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質からなる群より選択される、宿主細胞。
（項目１７５）
宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖を改変するのに十分な量の、ＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸、ＭａｎＩＩを有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞であって、該宿主細胞により産生される該ポリペプチドが、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質からなる群より選択される、宿主細胞。
（項目１７６）
上記宿主細胞により産生された上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したＦｃレセプター結合親和性を示す、項目１７２〜１７５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目１７７）
上記宿主細胞により産生された上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したエフェクター機能を示す、項目１７２〜１７５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目１７８）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＦｃ媒介性細胞傷害性である、項目１７７に記載の宿主細胞。
（項目１７９）
上記増加したエフェクター機能が、ＮＫ細胞に対する増加した結合である、項目１７７に記載の宿主細胞。
（項目１８０）
上記増加したエフェクター機能が、マクロファージに対する増加した結合である、項目１７７に記載の宿主細胞。
（項目１８１）
上記増加したエフェクター機能が、多形核細胞に対する増加した結合である、項目１７７に記載の宿主細胞。
（項目１８２）
上記増加したエフェクター機能が、単球に対する増加した結合である、項目１７７に記載の宿主細胞。
（項目１８３）
上記増加したエフェクター機能が、増加した、直接シグナル伝達に誘導されたアポトーシスである、項目１７７に記載の宿主細胞。
（項目１８４）
上記増加したエフェクター機能が、増加した樹状細胞成熟である、項目１７７に記載の宿主細胞。
（項目１８５）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＴ細胞プライミングである、項目１７７に記載の宿主細胞。
（項目１８６）
宿主細胞中で、ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドの産生を可能にする条件下で、培養する工程であって、該融合ポリペプチドが、該宿主細胞によって産生された該ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖を改変するのに十分な量で発現される、工程；ならびに
ｂ．該ポリペプチドを単離する、工程
を包含する、方法。
（項目１８７）
上記宿主細胞が、ＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するようにさらに操作される、項目１８６に記載の方法。
（項目１８８）
上記融合ポリペプチドが、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む、項目１８６または１８７に記載の方法。
（項目１８９）
上記融合ポリペプチドが、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインをさらに含む、項目１８８に記載の方法。
（項目１９０）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、項目１８９に記載の方法。
（項目１９２）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、項目１８９に記載の方法。
（項目１９３）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、項目１８９に記載の方法。
（項目１９４）
上記ゴルジ局在化ドメインが、α１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、項目１８９に記載の方法。
（項目１９５）
上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したエフェクター機能を有する、項目１８６に記載の方法。
（項目１９６）
宿主細胞中で、ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．ＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドの産生を可能にする条件下で、培養する工程であって、該融合ポリペプチドが、該宿主細胞によって産生された該ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖を改変するのに十分な量で発現される、工程；ならびに
ｂ．該ポリペプチドを単離する、工程
を包含する、方法。
（項目１９７）
上記宿主細胞が、ＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するようにさらに操作される、項目１９７に記載の方法。
（項目１９８）
上記融合ポリペプチドが、ＧａｌＴの触媒ドメインを含む、項目１９６または１９７に記載の方法。
（項目１９９）
上記融合ポリペプチドが、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインをさらに含む、項目１９８に記載の方法。
（項目２００）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである、項目１９９に記載の方法。
（項目２０１）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在化ドメインである、項目１９９に記載の方法。
（項目２０２）
上記ゴルジ局在化ドメインが、マンノシダーゼＩの局在化ドメインである、項目１９９に記載の方法。
（項目２０３）
上記ゴルジ局在化ドメインが、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメインである、項目１９９に記載の方法。
（項目２０４）
上記ゴルジ局在化ドメインが、α１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、項目１９９に記載の方法。
（項目２０５）
上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したエフェクター機能を有する、項目１９９に記載の方法。
（項目２０６）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、該ポリペプチドのＦｃ領域における増加した割合の二分された非フコシル化オリゴ糖を有する、項目１８６または１９６に記載の方法。
（項目２０７）
上記二分された非フコシル化オリゴ糖がハイブリッドである、項目２０６に記載の方法。
（項目２０８）
上記二分された非フコシル化オリゴ糖が複合体である、項目２０６に記載の方法。
（項目２０９）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも２０％が、二分され、非フコシル化される、項目２０６に記載の方法。
（項目２１０）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも２５％が、二分され、非フコシル化される、項目２０６に記載の方法。
（項目２１１）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも３０％が、二分され、非フコシル化される、項目２０６に記載の方法。
（項目２１２）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも３５％が、二分され、非フコシル化される、項目２０６に記載の方法。
（項目２１３）
項目１９６〜２１２のいずれか１項に記載の方法によって産生された、増加したエフェクター機能を有するように操作された、抗体。
（項目２１４）
項目２１３に記載される抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物。
（項目２１５）
処置の必要な患者に、治療的に有効量の項目２１４に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、癌の処置のための方法。
（項目２１６）
宿主細胞中で、増加したＦｃ媒介性細胞傷害性を有するポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．ＧａｌＴをコードする少なくとも一つの核酸およびＭａｎＩＩをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を、全抗体分子、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択されるポリペプチドの産生を可能にする条件下で培養する工程であって、ここで、ＧａｌＴまたはＭａｎＩＩのいずれか一つまたは両方の発現レベルが、該宿主細胞によって産生された該ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖を改変するのに十分であり、そして、該ポリペプチドが、該改変の結果として増加したＦｃ媒介性細胞傷害性を有する、工程；ならびに
ｂ．増加したＦｃ媒介性細胞傷害性を有する該ポリペプチドを単離する、工程
を包含する、方法。
（項目２１７）
工程（ａ）において、上記宿主細胞が、全抗体をコードする核酸を少なくとも一つ含む、項目２１６に記載の方法。
（項目２１８）
工程（ａ）において、上記宿主細胞が、抗体フラグメントをコードする核酸を少なくとも一つ含む、項目２１６に記載の方法。
（項目２１９）
上記ＧａｌＴの発現レベルが、増加したＦｃ媒介性細胞傷害性を有する免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体分子または抗体フラグメントを産生する、項目２１６に記載の方法。
（項目２２０）
上記宿主細胞が、ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸を少なくとも一つさらに含み、該ＧｎＴＩＩＩが、該宿主細胞によって産生される該ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖を改変するために十分な量で発現され、そして、該ポリペプチドが、該改変の結果として増加したＦｃ媒介性細胞傷害性を有する、項目２１６に記載の方法。
（項目２２１）
ＧａｌＴ、ＭａｎＩＩまたはＧｎＴＩＩＩの一つ以上の発現レベルが、上記ポリペプチドのＦｃ領域における二分されたオリゴ糖を形成するのに十分である、項目２１６または２２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２２）
上記Ｆｃ領域における全オリゴ糖に対する該Ｆｃ領域における二分されたオリゴ糖の割合が、少なくとも４５％である、項目２２１に記載の方法。
（項目２２３）
上記二分されたオリゴ糖が、複合体である、項目２２１に記載の方法。
（項目２２４）
上記二分されたオリゴ糖が、ハイブリッドである、項目２２１に記載の方法。
（項目２２５）
上記宿主細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる群より選択される、項目２１６または２２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２６）
上記宿主細胞が、植物細胞である、項目２２５に記載の方法。
（項目２２７）
上記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞およびハイブリドーマ細胞からなる群より選択される、項目２１６または２２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２８）
宿主細胞中で、ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．α−マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を、免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む、全抗体分子、抗体フラグメントおよび融合タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドの産生を可能にする条件下で、培養する工程であって、α−マンノシダーゼＩＩ活性を有する該ポリペプチドが、該宿主細胞によって産生された該ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖を改変するのに十分な量で発現される、工程；ならびに
ｂ．該宿主細胞によって産生された該ポリペプチドを単離する、工程
を包含する、方法。
（項目２２９）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したエフェクター機能を有する、項目２２８に記載の方法。
（項目２３０）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＦｃ媒介性細胞傷害性である、項目２２９に記載の方法。
（項目２３１）
上記増加したエフェクター機能が、ＮＫ細胞に対する増加した結合である、項目２２９に記載の方法。
（項目２３２）
上記増加したエフェクター機能が、マクロファージに対する増加した結合である、項目２２９に記載の方法。
（項目２３３）
上記増加したエフェクター機能が、多形核細胞に対する増加した結合である、項目２２９に記載の方法。
（項目２３４）
上記増加したエフェクター機能が、単球に対する増加した結合である、項目２２９に記載の方法。
（項目２３５）
上記増加したエフェクター機能が、増加した、直接シグナル伝達に誘導されたアポトーシスである、項目２２９に記載の方法。
（項目２３６）
上記増加したエフェクター機能が、増加した樹状細胞成熟である、項目２２９に記載の方法。
（項目２３７）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＴ細胞プライミングである、項目２２９に記載の方法。
（項目２３８）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、上記改変の結果として増加したＦｃレセプター結合を示す、項目２２８に記載の方法。
（項目２３９）
上記Ｆｃレセプターが、Ｆｃγ活性化レセプターである、項目２３８に記載の方法。
（項目２４０）
上記Ｆｃレセプターが、ＦｃγＲＩＩＩＡレセプターである、項目２３８に記載の方法。
（項目２４１）
上記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞である、項目２２８に記載の方法。
（項目２４２）
上記宿主細胞によって産生される上記ポリペプチドが、抗ＣＤ２０抗体である、項目２２８に記載の方法。
（項目２４３）
上記抗ＣＤ２０抗体が、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８である、項目２２８に記載の方法。
（項目２４４）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０である、項目２２８に記載の方法。
（項目２４５）
項目２２８に記載の方法であって、上記宿主細胞が、抗体分子および抗体フラグメントまたは免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも一つの切断された核酸をさらに含む、方法。
（項目２４６）
項目２４５に記載の方法であって、上記少なくとも一つの切断された核酸が、抗ＣＤ２０抗体、キメラ抗ヒト神経芽腫モノクローナル抗体ｃｈＣＥ７、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０、キメラ抗ヒト結腸癌、肺癌および乳癌モノクローナル抗体ＩＮＧ−１、ヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体３６２２Ｗ９４、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体Ａ３３、ＧＤ３ガングリオシドに対して指向された抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４、キメラ抗ヒト扁平上皮癌モノクローナル抗体ＳＦ−２５、抗ヒトＥＧＦＲ抗体、抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗ヒトＰＳＭＡ抗体、抗ヒトＰＳＣＡ抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗ヒトＣＤ３０抗体、抗ヒトＣＤ３３抗体、抗ヒトＣＤ３８抗体、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ４５抗体、抗ヒトＣＤ５２抗体、抗ヒトＣＤ１３８抗体、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ改変抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体、抗ヒトＣＥＡ抗体、抗ヒトＭＵＣ１抗体、抗ヒトＭＵＣ１コアタンパク質抗体、抗ヒト異所性グリコシル化ＭＵＣ１抗体、ＥＤ−Ｂドメインを含むヒトフィブロネクチン改変体に対する抗体、抗ヒトＴＡＧ−７２抗体または抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体をコードする、方法。
（項目２４７）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、該ポリペプチドのＦｃ領域における増加した割合の二分されたオリゴ糖を有する、項目２２８に記載の方法。
（項目２４８）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、該ポリペプチドのＦｃ領域における増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有する、項目２２８に記載の方法。
（項目２４９）
上記非フコシル化オリゴ糖が、ハイブリッドである、項目２４８に記載の方法。
（項目２５０）
上記非フコシル化オリゴ糖が、複合体である、項目２４８に記載の方法。
（項目２５１）
上記宿主細胞によって産生された上記ポリペプチドが、該ポリペプチドのＦｃ領域における増加した割合の二分された非フコシル化オリゴ糖を有する、項目２２８に記載の方法。
（項目２５２）
上記二分された非フコシル化オリゴ糖がハイブリッドである、項目２５１に記載の方法。
（項目２５３）
上記二分された非フコシル化オリゴ糖が複合体である、項目２５１に記載の方法。
（項目２５４）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも２０％が、非フコシル化される、項目２４８に記載の方法。
（項目２５５）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも２５％が、非フコシル化される、項目２４８に記載の方法。
（項目２５６）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも３０％が、非フコシル化される、項目２４８に記載の方法。
（項目２５７）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも３５％が、非フコシル化される、項目２４８に記載の方法。
（項目２５８）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも４０％が、非フコシル化される、項目２４８に記載の方法。
（項目２５９）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも４５％が、非フコシル化される、項目２４８に記載の方法。
（項目２６０）
上記ポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも４８％が、非フコシル化される、項目２４８に記載の方法。
（項目２６１）
項目２２８に記載の方法によって産生された、増加したエフェクター機能を有するように操作された、抗体。
（項目２６２）
項目２２８に記載の方法によって産生された、増加したＦｃレセプター結合親和性を有するように操作された、抗体。
（項目２６３）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＦｃ媒介性細胞傷害性である、項目２６１に記載の抗体。
（項目２６４）
上記増加したエフェクター機能が、ＮＫ細胞に対する増加した結合である、項目２６１に記載の抗体。
（項目２６５）
上記増加したエフェクター機能が、マクロファージに対する増加した結合である、項目２６１に記載の抗体。
（項目２６６）
上記増加したエフェクター機能が、単球に対する増加した結合である、項目２６１に記載の抗体。
（項目２６７）
上記増加したエフェクター機能が、多形核細胞に対する増加した結合である、項目２６１に記載の抗体。
（項目２６８）
上記増加したエフェクター機能が、直接シグナル伝達に誘導されたアポトーシスである、項目２６１に記載の抗体。
（項目２６９）
上記増加したエフェクター機能が、増加した樹状細胞成熟である、項目２６１に記載の抗体。
（項目２７０）
上記増加したエフェクター機能が、増加したＴ細胞プライミングである、項目２６１に記載の抗体。
（項目２７１）
上記Ｆｃレセプターが、Ｆｃ活性化レセプターである、項目２６２に記載の抗体。
（項目２７２）
上記Ｆｃレセプターが、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターである、項目２６２に記載の抗体。
（項目２７３）
Ｆｃ領域を含み、項目２２８に記載の方法によって産生された、増加したエフェクター機能を有するように操作された、抗体フラグメント。
（項目２７４）
免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含み、項目２２８に記載の方法によって産生された、増加したエフェクター機能を有するように操作された、融合タンパク質。
（項目２７５）
Ｆｃ領域を含み、項目２２８に記載の方法によって産生された、増加したＦｃレセプター結合親和性を有するように操作された、抗体フラグメント。
（項目２７６）
免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含み、項目２２８に記載の方法によって産生された、増加したＦｃレセプター結合親和性を有するように操作された、融合タンパク質。
（項目２７７）
項目２６１〜２７２のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（項目２７８）
項目２７３または２７５に記載の抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（項目２７９）
項目２７４または２７６に記載の融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（項目２８０）
処置の必要な患者に、治療的に有効量の項目２７７〜２７９のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、腫瘍の処置のための方法。
（項目２８１）
Ｂ細胞枯渇に基づく疾患処置のための改良された方法であって、該方法は、治療的に有効量の抗体を、それを必要とするヒト被験体に投与する工程を包含し、該改良は、項目２２８に記載の方法により産生された抗体の治療的に有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２８２）
上記抗体が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、項目２８１に記載の改良された方法。
（項目２８３）
上記核酸分子が、配列番号１７を含む、項目２２８に記載の方法。
（項目２８４）
上記α−マンノシダーゼＩＩを有するポリペプチドが、配列番号１８を含む、項目２２８に記載の方法。
（項目２８５）
配列番号１９を含む、項目１２１に記載の単離された核酸分子。
（項目２８６）
配列番号２０を含む、項目１２５に記載の融合ポリペプチド。
ＢＨＫで産生された組換え非改変（非糖操作）抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞を、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５０２でトランスフェクトした。実施例１の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。 野生型（「ｗｔ」）ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸を使用して操作したＢＨＫで産生された組換え糖操作抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞を、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５０２およびＧｎＴＩＩＩ発現ベクターｐＥＴＲ１１６６で同時トランスフェクトした。実施例１の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。 ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチド（「Ｇ１−ＧｎＴＩＩＩ」）をコードする核酸を使用して操作し、ＧｎＴＩ−ゴルジ局在化ドメインを介して局在化したＢＨＫで産生された組換え糖操作抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞を、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５０２およびＧｎＴＩＩＩ発現ベクターｐＥＴＲ１４２５で同時トランスフェクトした。実施例１の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。 ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチド（「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」）をコードする核酸を使用して操作し、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）−ゴルジ局在化ドメインを介して局在化したＢＨＫで産生された組換え糖操作抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞を、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５０２およびＧｎＴＩＩＩ発現ベクターｐＥＴＲ１５０６で同時トランスフェクトした。実施例１の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。 ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞で産生された組換え非改変（非糖操作）抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞を、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０でトランスフェクトした。実施例１の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。 ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチド（「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」）をコードする核酸を使用して操作し、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）−ゴルジ局在化ドメインを介して局在化したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡで産生された組換え糖操作抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞を、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０およびＧｎＴＩＩＩ発現ベクターｐＥＴＲ１５１９で同時トランスフェクトした。実施例１の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。 ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチド（「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」）をコードする核酸を使用して操作し、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）−ゴルジ局在化ドメインを介して局在化したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡで産生された組換え糖操作抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞を、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０およびＧｎＴＩＩＩ発現ベクターｐＥＴＲ１５１９で同時トランスフェクトした。実施例１の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。（ａ）さらなる酵素処理を行わないＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のオリゴ糖プロフィール。（ｂ）ＥｎｄｏＨでさらに消化したＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のオリゴ糖プロフィール。 （ａ）オリゴ糖のＥｎｄｏＨ触媒消化の略図。ＥｎｄｏＨはハイブリッド（および二分ハイブリッド）を消化することができるが、複合体や複合体二分オリゴ糖を消化することができない。（ｂ）複合体型オリゴ糖とハイブリッド型オリゴ糖との区別によって、Ｅｎｄｏ−Ｈ処理により最初にＰＮＧアーゼＦ処理から得たＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ比と同一のオリゴ糖ピークに構造を割り当てることが可能である。 非改変組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体に対する「Ｇ１−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）。両抗体をＢＨＫ細胞中で産生した。糖操作抗体の産生およびグリコシル化プロフィールを図３に示し、非改変抗体のそれを図１に示す。標的細胞（Ｔ）は、ＳＫＷ６．４ヒトリンパ芽球様細胞であった。エフェクター細胞（Ｅ）は、新たに単離したヒトＰＢＭＣであった。最大放出（抗体の代わりに界面活性剤を使用）および自発的放出（抗体の代わりに培養培地を使用）コントロールと比較した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出によって細胞傷害性を測定する４時間インキュベーションＡＤＣＣアッセイで２５：１のＥ：Ｔ比を使用した。アッセイの詳細を、実施例１の材料と方法に記載する。 非改変組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）。両抗体をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生した。糖操作抗体の産生およびグリコシル化プロフィールを図６に示し、非改変抗体のそれを図５に示す。標的細胞（Ｔ）は、ＳＫＷ６．４ヒトリンパ芽球様細胞であった。エフェクター細胞（Ｅ）は、新たに単離したヒトＰＢＭＣであった。最大放出（抗体の代わりに界面活性剤を使用）および自発的放出（抗体の代わりに培養培地を使用）コントロールと比較した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出によって細胞傷害性を測定する４時間インキュベーションＡＤＣＣアッセイで２５：１のＥ：Ｔ比を使用した。アッセイの詳細を、実施例１の材料と方法に記載する。 「ｗｔ−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）。両抗体をＢＨＫ細胞中で産生した。Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ糖操作抗体の産生およびグリコシル化プロフィールを図４に示し、ｗｔ−ＧｎＴＩＩＩ糖操作抗体のそれを図２に示す。標的細胞（Ｔ）は、ＳＫＷ６．４ヒトリンパ芽球様細胞であった。エフェクター細胞（Ｅ）は、新たに単離したヒトＰＢＭＣであった。最大放出（抗体の代わりに界面活性剤を使用）および自発的放出（抗体の代わりに培養培地を使用）コントロールと比較した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）によって細胞傷害性を測定する４時間インキュベーションＡＤＣＣアッセイで２５：１のＥ：Ｔ比を使用した。アッセイの詳細を、実施例１の材料と方法に記載する。 ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａレセプターへの非改変組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の結合。両組換え抗体をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ中に産生した。糖操作抗体の産生および糖操作抗体プロフィールを図６に示し、非改変抗体のそれを図５に示す。実施例１の材料と方法に記載のように結合アッセイを行った。その表面上にＦｃγＲＩＩＩａレセプターを発現するヒトＮＫ細胞を、ＦｃγＲＩＩｃを産生することが知られていない遺伝子型（すなわち、ＦｃγＲＩＩｃコード配列内にインフレームで終止コドンを含む遺伝子変異型についてホモ接合性を示す）のドナーから単離した。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体フラグメントを使用したＦＡＣＳによって測定された幾何平均蛍光強度は、ＮＫ細胞に結合した組換え抗体量と共に増加する。このアッセイで検出された結合は、競合ＦｃγＲＩＩＩａ特異的抗体フラグメントの使用によって証明されるように、ＦｃγＲＩＩＩａ特異的である。 漸増濃度の競合抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体フラグメントの存在下でのＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａレセプターへの非改変組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の結合。両組換え抗体をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ中に産生した。糖操作抗体の産生および糖操作抗体プロフィールを図６に示し、非改変抗体のそれを図５に示す。実施例１の材料と方法に従うが、精製ＮＫ細胞と組換え抗体（常に最終濃度３μｇ／ｍｌ）ならびに漸増濃度および種々の濃度（グラフを参照のこと）の競合３Ｇ８−Ｆａｂ２抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体フラグメントと同時インキュベートした結合アッセイを行った。その表面上にＦｃγＲＩＩＩａレセプターを発現するヒトＮＫ細胞を、ＦｃγＲＩＩｃを産生することが知られていない遺伝子型（すなわち、ＦｃγＲＩＩｃコード配列内にインフレームで終止コドンを含む遺伝子変異型についてホモ接合性を示す）のドナーから単離した。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体フラグメントを使用したＦＡＣＳによって測定された幾何平均蛍光強度は、ＮＫ細胞に結合した組換え抗体量と共に増加する。 フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ＋イソ型を認識し、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞で産生された組換えＩｇＧ１「Ｌ１９」抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。（ａ）抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５４６でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生された非改変抗体。（ｂ）抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５４６およびＧｎＴＩＩＩ発現ベクターｐＥＴ１５１９で同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生されたＭ２−ＧｎＴＩＩＩ糖操作抗体。両抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィおよびその後のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液を交換したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００マトリクス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるサイズ排除クロマトグラフィ工程によって培養培地から精製した。実施例１の材料と方法に記載のように、オリゴ糖を調製し、分析した。 Ｒａｊｉヒトリンパ腫細胞上のＦｃγＲＩＩｂレセプターへの非改変組換え抗ＥＤ−Ｂ＋フィブロネクチンＩｇＧ１抗体に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＥＤ−Ｂ＋フィブロネクチンＩｇＧ１抗体の結合。両抗体をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ中に産生した。糖操作抗体の産生およびグリコシル化プロフィールを図１４ｂに示し、非改変抗体のそれを図１４ａに示す。実施例１の材料と方法に記載のように結合アッセイを行った。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体フラグメントを使用したＦＡＣＳによって測定された幾何平均蛍光強度は、ＲａｊｉＢ細胞リンパ腫細胞に結合した組換え抗体量と共に増加する。 異なるドナー由来のＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａレセプターへの非改変組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の結合に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の結合。両抗体をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ中に産生した。糖操作抗体の産生およびグリコシル化プロフィールを図６に示し、非改変抗体のそれを図５に示す。実施例１の材料と方法に記載のように結合アッセイを行った。その表面上にＦｃγＲＩＩＩａレセプターを発現するヒトＮＫ細胞を、ＦｃγＲＩＩｃを産生することが知られていない遺伝子型（すなわち、ＦｃγＲＩＩｃコード配列内にインフレームで終止コドンを含む遺伝子変異型についてホモ接合性を示す）のドナーから単離した。２つのドナーを、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターの１５８Ｖ−「高親和性」変異型についてホモ接合性として遺伝子型を特定した。他の２つのドナーを、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターの１５８Ｖ−「高親和性」変異型および１５８Ｆ−「低親和性」変異型についてヘテロ接合性の１５８Ｖ／Ｆとして遺伝子型を特定した。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体フラグメントを使用したＦＡＣＳによって測定された幾何平均蛍光強度は、ＮＫ細胞に結合した組換え抗体量と共に増加する。このアッセイで検出された結合は、競合ＦｃγＲＩＩＩａ特異的抗体フラグメントの使用によって証明されるように、ＦｃγＲＩＩＩａ特異的である。 （ａ）ＢＨＫ−１５０２−２８（野生型）および（ｂ）クローンＢＨＫ−１５０２−２８−１１（Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ−糖操作）安定性キメラ抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体産生細胞株の短縮ＣＤ４（ｔＣＤ４）発現のＦＡＣＳ分析。ｔＣＤ４の発現を、ｐＥＴＲ１５３７ ＧｎＴＩＩＩ発現ベクター中でのＩＲＥＳエレメントを介してＭ２−ＧｎＴＩＩＩ発現に作動可能に連結し、それによりＧｎＴＩＩＩ発現のための直接マーカーとして使用する。平均および幾何平均蛍光強度は、糖操作細胞株についてはそれぞれ２７．６および１９．９であり、野生型細胞株については４．７および４．１であった。 ＢＨＫ−１５０２−２８−１１細胞株によって産生されたＭ２−ＧｎＴＩＩＩ糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞株、抗体精製、ならびにオリゴ糖の調製および分析を、実施例１の材料と方法に記載する。 ＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖およびＥｎｄｏＨでのさらなる消化による、ＢＨＫ−１５０２−２８−１１細胞株によって産生されたＭ２−ＧｎＴＩＩＩ糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。細胞株、抗体精製、ならびにオリゴ糖の調製および分析を、実施例１の材料と方法に記載する。 ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａレセプターへの安定な細胞株によって産生された非改変組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の結合。糖操作抗体の産生およびグリコシル化プロフィールを図１８および図１９に示す。実施例１の材料と方法に記載のように結合アッセイを行った。その表面上にＦｃγＲＩＩＩａレセプターを発現するヒトＮＫ細胞を、ＦｃγＲＩＩｃを産生することが知られていない遺伝子型（すなわち、ＦｃγＲＩＩｃコード配列内にインフレームで終止コドンを含む遺伝子変異型についてホモ接合性を示す）のドナーから単離した。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体フラグメントを使用したＦＡＣＳによって測定された幾何平均蛍光強度は、ＮＫ細胞に結合した組換え抗体量と共に増加する。このアッセイで検出された結合は、競合ＦｃγＲＩＩＩａ特異的抗体フラグメントの使用によって証明されるように、ＦｃγＲＩＩＩａ特異的である（図１３を参照のこと）。 非改変組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体の補体媒介溶解（ＣＭＬ）。両抗体をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生した。糖操作抗体の産生および糖操作抗体プロフィールを図６に示し、非改変抗体のそれを図５に示す。標的細胞（Ｔ）は、ＳＫＷ６．４ヒトリンパ芽球様細胞であった。アッセイのためにヒト補体を使用した。ＬＤＨ放出によって溶解を測定した。アッセイの詳細を、実施例１の材料と方法に記載する。 ヒト上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）を認識し、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞で産生された組換えＩｇＧ１「Ｃ２２５」抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。（ａ）抗体発現ベクターｐＵＲＳＩ２８でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生された非改変抗体。（ｂ）抗体発現ベクターｐＥＴＲＵＲＳＩ２８およびＧｎＴＩＩＩ発現ベクターｐＥＴ１５１９で同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生されたＭ２−ＧｎＴＩＩＩ糖操作抗体。両抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィおよびその後のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液を交換したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００マトリクス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるサイズ排除クロマトグラフィ工程によって培養培地から精製した。実施例１の材料と方法に記載のように、オリゴ糖を調製し、分析した。 非改変組換え抗ＥＧＦＲキメラＩｇＧ１「Ｃ２２５」抗体に対する「Ｍ２−ＧｎＴＩＩＩ」糖操作組換え抗ＥＧＦＲキメラＩｇＧ１「Ｃ２２５」抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）。両抗体をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生した。糖操作抗体の産生およびグリコシル化プロフィールを図２２ｂに示し、非改変抗体のそれを図２２ａに示す。標的細胞（Ｔ）は、Ａ４３１ヒト扁平上皮癌細胞（ＥＣＡＣＣ番号８５０９０４０２）であった。エフェクター細胞（Ｅ）は、新たに単離したヒトＰＢＭＣであった。最大放出（抗体の代わりに界面活性剤を使用）および自発的放出（抗体の代わりに培養培地を使用）コントロールと比較した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出によって細胞傷害性を測定する４時間インキュベーションＡＤＣＣアッセイで２５：１のＥ：Ｔ比を使用した。アッセイの詳細を、実施例１の材料と方法に記載する。 本発明のマンノシダーゼＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列。 本発明のＧｎＴ−Ｉ−ＧｎＴ−ＩＩＩ融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列。 抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞で産生された非改変組換えＣ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（「Ｃｗｔ」）由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。実施例５の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。 抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０および融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現ベクター（ｐＥＴＲ１５１９）で同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡで産生された組換え糖操作抗Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（「Ｃｂｒｔ」）由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。実施例５の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。（Ａ）さらなる酵素処理を行わないＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のオリゴ糖プロフィール。 抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０および融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現ベクター（ｐＥＴＲ１５１９）で同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡで産生された組換え糖操作抗Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（「Ｃｂｒｔ」）由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。実施例５の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。（Ｂ）ＥｎｄｏＨでさらに消化したＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のオリゴ糖プロフィール。 抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現ベクター（ｐＥＴＲ１５１９）、およびマンノシダーゼＩＩポリペプチド発現ベクター（ｐＣＬＦ９）で同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡで産生された組換え糖操作抗Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（「Ｃｍ」）由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。実施例５の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。（Ａ）さらなる酵素処理を行わないＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のオリゴ糖プロフィール。 抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現ベクター（ｐＥＴＲ１５１９）、およびマンノシダーゼＩＩポリペプチド発現ベクター（ｐＣＬＦ９）で同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡで産生された組換え糖操作抗Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（「Ｃｍ」）由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。実施例５の材料と方法に記載のように、培養培地から抗体を精製し、オリゴ糖を調製し、分析した。（Ｂ）ＥｎｄｏＨでさらに消化したＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のオリゴ糖プロフィール。 ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインがＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介して局在化され、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩコード核酸がそれ自体（抗体Ｃｂｒｔ）に発現するか、ＭａｎＩＩ（Ｃｍ）をコードする核酸と共に抗体産生細胞中で同時発現する、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中での発現によって糖操作されたキメラ抗ＣＤ２０抗体によって媒介された抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）。Ｃｗは、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中に産生された非改変組換えＣ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（「Ｃｗｔ」）である。アッセイの詳細を、実施例１の材料と方法に記載する。 ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインがＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介して局在化され、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩコード核酸がそれ自体（抗体Ｃｂｒｔ）に発現するか、ＭａｎＩＩ（Ｃｍ）をコードする核酸と共に抗体産生細胞中で同時発現する、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中での発現によって糖操作されたキメラ抗ＣＤ２０抗体のＦｃγＲＩＩＩａレセプター結合。Ｃｗは、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中に産生された非改変組換えＣ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（「Ｃｗｔ」）である。実施例１の材料と方法に記載のように結合アッセイを行った。その表面上にＦｃγＲＩＩＩａレセプターを発現するヒトＮＫ細胞を、ＦｃγＲＩＩｃを産生することが知られていない遺伝子型（すなわち、ＦｃγＲＩＩｃコード配列内にインフレームで終止コドンを含む遺伝子変異型についてホモ接合性を示す）のドナーから単離した。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体フラグメントを使用したＦＡＣＳによって測定された幾何平均蛍光強度は、ＮＫ細胞に結合した組換え抗体量と共に増加する。このアッセイで検出された結合は、競合ＦｃγＲＩＩＩａ特異的抗体フラグメントの使用によって証明されるように、ＦｃγＲＩＩＩａ特異的である（図１３を参照のこと）。 ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインがＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介して局在化され、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩコード核酸がそれ自体（抗体Ｃｂｒｔ）に発現するか、ＭａｎＩＩ（Ｃｍ）をコードする核酸と共に抗体産生細胞中で同時発現する、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中での発現によって糖操作されたキメラ抗ＣＤ２０抗体の補体媒介性細胞傷害性。Ｃｗは、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中に産生された非改変組換えＣ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（「Ｃｗｔ」）である。 発現ベクターｐＣＬＦ９（Ａ）。 発現ベクターｐＥＴＲ１８４２（Ｂ）。 発現ベクターｐＥＴＲ１８４３（Ｃ）。 融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴ（Ａ）の発現ベクター。 融合タンパク質ＧａｌＴ（Ｂ）の発現ベクター。 α−マンノシダーゼＩＩの存在下で産生された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のオリゴ糖プロフィールおよび抗体のＦｃ部分に結合することが見出された構造の相対的比率。 融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴの存在下で産生された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のオリゴ糖プロフィールおよび抗体のＦｃ部分に結合することが見出された構造の相対的比率。ＰＮＧアーゼＦ（Ａ）消化後のオリゴ糖プロフィール。 融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴの存在下で産生された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のオリゴ糖プロフィールおよび抗体のＦｃ部分に結合することが見出された構造の相対的比率。ＥｎｄｏＨ（Ｂ）消化後のオリゴ糖プロフィール。 α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）の存在下で産生された抗体は、野生型抗体よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡレセプターに結合する。 糖操作キメラ抗ＣＤ２０によって媒介された抗体依存性細胞傷害性。
（発明の詳細な説明）
以下で定義しない限り、当該分野で一般的に使用されている用語を本明細書中で使用する。
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、全抗体分子（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多特異性（二重特異性）抗体が含まれる）ならびにＦｃ領域を有する抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質を含むことを意図する。ヒト化抗体およびキメラ抗体も含まれる。
本明細書中で使用される、用語「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域をいうことを意図する。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界がわずかに変化するが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を、通常、Ｃｙ２２６位のアミノ酸残基からカルボキシル末端までにわたると定義する。
本明細書中で使用される、用語「免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な対立遺伝子変異型および置換、付加、または欠失により変化しているが免疫グロブリンのエフェクター機能を媒介する能力（抗体依存性細胞傷害性）は実質的に減少していない変異型を含むことを意図する。例えば、１つまたは複数のアミノ酸を、生物機能を実質的に喪失することなく免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失することができる。このような変異型を、活性への影響を最小にするための当該分野で公知の一般規則にしたがって選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１０（１９９０）を参照のこと）。
本明細書中で使用される、「β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有する」融合ポリペプチドは、Ｎ結合オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合マンノシドへのβ−１−４結合中のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒することができる融合ポリペプチドをいう。これには、用量に依存するか依存しない特定の生物アッセイで測定したところ、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）にしたがってβ−１，４−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１４４）としても公知のβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性に類似するが同一である必要はない酵素活性を示す融合ポリペプチドが含まれる。用量依存性である場合、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ用量依存性と同一である必要はないが、むしろβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩと比較して所与の活性における用量依存性が実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩと比較して、より高い活性または多くとも約２５倍未満の活性、好ましくは多くとも約１０倍未満の活性、最も好ましくは多くとも約３倍未満の活性を示す）。
本明細書中で使用される、「β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する」または「ＧａｌＴ活性を有する」融合ポリペプチドは、Ｎ結合オリゴ糖中で見出される非還元末端ＧｌｃＮＡｃへのＵＤＰガラクトース由来のガラクトースの付加を触媒することができる融合ポリペプチドをいう。これには、用量に依存するか依存しない特定の生物アッセイで測定したところ、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）にしたがってＵＤＰ−Ｇａｌ：ＧｌｃＮＡｃ β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．３８）としても公知のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性に類似するが同一である必要はない酵素活性を示す融合ポリペプチドが含まれる。用量依存性である場合、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ用量依存性と同一である必要はないが、むしろβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと比較した所与の活性における用量依存性が実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩと比較して、多くとも約２５倍未満の活性、好ましくは多くとも約１０倍未満の活性、最も好ましくは多くとも約３倍未満の活性を示す）。
例えば、本発明の基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチドあたり５個までの点変異を含み得ること以外はポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が基準配列と同一であることを意図する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、基準配列中の５％までのヌクレオチドが欠失するか別のヌクレオチドと置換することができるか、基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数を基準配列に挿入することができる。クエリー配列は、図２４または図２５のいずれかに示す全配列であり得る。
特定の問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかを、従来の公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。大域的配列アラインメントとも呼ばれるクエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間の総合的な最良の適合の好ましい決定方法を、Ｂｒｕｔｌａｇｅｔａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントでは、クエリー配列および対象配列は共にＤＮＡ配列である。ＵをＴに交換することによってＲＮＡ配列を比較することができる。大域的配列アラインメントの結果を、同一率で示す。同一率を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントで使用された好ましいパラメーターは以下である：行列＝ユニタリ、ｋ組＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝３０、無作為化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（いずれも短い）。
内部欠失のためではなく、５’または３’欠失のために対象配列がクエリー配列よりも短い場合、結果を得るために手動で修正しなければならない。これは、同一率を計算する場合にＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’短縮を考慮しないからである。クエリー配列と比較して５’または３’末端が短縮された対象配列のために、クエリー配列の全塩基の比率としての適合／アラインメントしない対象配列の５’および３’であるクエリー配列の塩基数の計算によって同一率を修正する。ヌクレオチドが適合／アラインメントされているかどうかを、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定する。次いで、同一率からこの比率を引き、最終的な同一率スコアに到達するために特定のパラメーターを使用した上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算する。この修正スコアは、本発明の目的のために使用されるものである。同一率スコアを手動で調整するために、クエリー配列と適合／アラインメントしないＦＡＳＴＤＢアラインメントによって表示された対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみを計算する。
例えば、同一率を決定するために、９０塩基の対象配列を１００塩基のクエリー配列とアラインメントする。対象配列の５’末端が欠失するので、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端から最初の１０塩基の適合／アラインメントを示さない。１０個の非対合塩基は配列の１０％を示すので（適合しない５’末端および３’末端の塩基数／クエリー配列中の全塩基数）、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算した同一率スコアから１０％を引く。残りの９０塩基が完全に適合する場合、最終同一率は９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列を、１００塩基のクエリー配列と比較する。今回は、欠失は内部欠失であり、クエリーと適合／アラインメントしない対象配列の５’または３’上に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一率を手動で修正しない。再度、クエリー配列と適合／アラインメントしない対象配列の５’および３’の塩基のみを手動で修正する。本発明の目的のために、他の手動の修正を行わない。
例えば、本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あたり５個までの変化を含み得ること以外は対象ポリヌクレオチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であることを意図する。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中の５％までのアミノ酸残基が挿入、欠失、するか別のアミノ酸と置換することができる。基準配列のこれらの変化は、基準アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシル末端、これらの末端の間のどこかで起こるか、基準配列中の各残基間に散在するか、基準配列内の１つまたは複数の隣接基中で起こり得る。
特定の問題として、任意の特定のポリペプチドが基準ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかを、従来の公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。大域的配列アラインメントとも呼ばれるクエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間の総合的な最良の適合の好ましい決定方法を、Ｂｒｕｔｌａｇｅｔａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントでは、クエリー配列および対象配列は共にヌクレオチド配列であるか、共にアミノ酸配列である。大域的配列アラインメントの結果を、同一率で示す。ＦＡＳＴＤＢアラインメントで使用された好ましいパラメーターは以下である：行列＝ＰＡＭ ０、ｋ組＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、無作為化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（いずれも短い）。
内部欠失のためではないので、Ｎ末端またはＣ末端欠失のために対象配列がクエリー配列よりも短い場合、結果を得るために手動で修正しなければならない。これは、大域的同一率を計算する場合にＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列のＮ末端およびＣ末端短縮を考慮しないからである。クエリー配列と比較してＮ末端およびＣ末端が短縮された対象配列のために、クエリー配列の全塩基の比率としての対応する対象残基と適合／アラインメントしない対象配列のＮ末端およびＣ末端であるクエリー配列の塩基数の計算によって同一率を修正する。残基が適合／アラインメントされているかどうかを、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定する。次いで、同一率からこの比率を引き、最終的な同一率スコアに到達するために特定のパラメーターを使用した上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算する。この最終同一率スコアは、本発明の目的のために使用されるものである。クエリー配列と適合／アラインメントしない対象配列のＮ末端およびＣ末端に対する塩基のみ（すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側のクエリー残基の位置のみ）を同一率スコアを手動で調整するために考慮する。
例えば、同一率を決定するために、９０アミノ酸残基の対象配列を１００残基のクエリー配列とアラインメントする。対象配列のＮ末端が欠失するので、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端から最初の１０塩基の適合／アラインメントを示さない。１０個の非対合残基は配列の１０％を示すので（適合しないＮ末端およびＣ末端の残基数／クエリー配列中の全塩基数）、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算した同一率スコアから１０％を引く。残りの９０残基が完全に適合する場合、最終同一率は９０％である。別の例では、９０残基の対象配列を、１００残基のクエリー配列と比較する。今回は、クエリーと適合／アラインメントしない対象配列のＮ末端またはＣ末端上に塩基が存在しないように、欠失は内部欠失である。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一率を手動で修正しない。再度、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで示したクエリー配列と適合／アラインメントしない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の塩基の位置のみを手動で修正する。本発明の目的のために、他の手動の修正を行わない。
本明細書中で使用される、本発明の核酸と「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する」核酸は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中における４２℃での一晩のインキュベーションおよびその後の約６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄でハイブリッド形成するポリヌクレオチドをいう。
本明細書中で使用される、用語「ゴルジ局在化ドメイン」は、ゴルジ複合体内への固定を担うゴルジ常在ポリペプチド（Ｇｏｌｇｉ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）のアミノ酸配列をいう。一般に、局在化ドメインは、酵素のアミノ末端「テール」を含む。
本明細書中で使用される、用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列であるＦｃ領域またはアミノ酸配列変異型であるＦｃ領域）に寄与することができる生物活性をいう。抗体エフェクター機能の例には、Ｆｃレセプター結合親和性、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面レセプターの下方制御などが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される、用語「操作」、「操作した」、「操作すること」、および「グリコシル化操作」は、天然に存在するポリペプチドまたはそのフラグメントのグリコシル化パターンの任意の操作を含むと見なされる。グリコシル化操作には、細胞のグリコシル化機構の代謝操作（細胞中に発現する糖タンパク質のグリコシル化を変化させるためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作が含まれる）が含まれる。さらに、グリコシル化操作には、グリコシル化に対する変異および細胞環境の効果が含まれる。
本明細書中で使用される、用語「宿主細胞」は、目的のタンパク質、タンパク質フラグメント、またはそのペプチド（抗体、抗体フラグメント、および融合タンパク質が含まれる）の改変糖形態を生成するように操作することができる細胞系の任意の型を対象とする。典型的には、宿主細胞を、至適レベルのＧｎＴＩＩＩを発現するように操作した。宿主細胞には、例として、培養細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞などの哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞など）が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、または培養植物組織もしくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。
本明細書中で使用される、用語「Ｆｃ媒介性細胞傷害」には、抗体依存性細胞傷害性およびヒトＦｃ領域を含む可溶性Ｆｃ融合タンパク質によって媒介される細胞傷害性が含まれる。これは「ヒト免疫エフェクター細胞」によって「抗体標的化細胞」を溶解する免疫機構である。
「ヒト免疫エフェクター細胞」は、抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域に結合してエフェクター機能を果たすその表面上にＦｃレセプターを表示する白血球集団である。このような集団には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。
「抗体標的化細胞」は、抗体またはＦｃ融合タンパク質によって結合した細胞である。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、タンパク質部分のＮ末端を介してＦｃ領域に細胞をターゲティングするために結合する。
本明細書中で使用される、用語「Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加」を、上記定義のＦｃ媒介性細胞傷害性機構によって標的細胞周囲の培地中の所与の濃度の抗体もしくはＦｃ融合タンパク質が所与の時間で溶解する「抗体標的化細胞」数の増加および／またはＦｃ媒介性細胞傷害性機構によって所与の時間所与の「抗体標的化細胞」数の溶解に必要な標的細胞周囲の培地中の抗体もしくはＦｃ融合タンパク質濃度の減少のいずれかと定義する。Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加は、当業者に公知の同一の標準的な産生、精製、処方、および保存方法を使用した同一の宿主細胞型によって産生されるが、本明細書中に記載の方法によってグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞によって産生されない同一の抗体またはＦｃ融合タンパク質によって媒介される細胞傷害性に比例する。
「抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増加した抗体」は、当業者に公知の任意の適切な方法によって決定したところ、ＡＤＣＣが増加した抗体を意味する。１つの許容されているインビトロＡＤＣＣアッセイは以下である。
１）このアッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが公知の標的細胞を使用する；
２）このアッセイは、エフェクター細胞として無作為に選択した健常なドナーの血液から単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）このアッセイは、以下のプロトコールにしたがって実施する：
ｉ）標準的な密度遠心分離手順を使用してＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で５×１０６細胞／ｍｌに懸濁する；
ｉｉ）標準的な組織培養法によって標的細胞を成長させ、９０％を超える生存度の指数成長期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培養培地で洗浄し、１００μＣｉの５１Ｃｒで標識、細胞培養培地で２回洗浄し、１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地中に懸濁する；
ｉｉｉ）１００μｌの上記最終標的細胞懸濁液を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を、細胞培養培地中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで連続希釈し、５０μｌの得られた抗体溶液を、９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に添加し、上記全濃度範囲を対象とする三連の種々の抗体濃度で試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールのために、標識標的細胞を含むプレート中の３つのさらなるウェルに、抗体溶液の代わりに５０μｌの２％（Ｖ／Ｖ）非イオン性界面活性剤水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を加える（上記のｉｖ）；
ｖｉ）自発的放出（ＳＲ）コントロールのために、標識標的細胞を含むプレート中の３つのさらなるウェルに、抗体溶液の代わりに５０μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地を加える（上記のｉｖ）；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０×ｇで１分間遠心分離し、４℃で１時間インキュベートする；
ｖｉｉｉ）２５：１のエフェクター：標的細胞比が得られるように５０μｌのＰＢＭＣ上清（上記ｉ）を各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２大気下にて３７℃で４時間インキュベートする；
ｉｘ）各ウェル由来の無細胞上清を回収し、ガンマカウンターを使用して実験的に放出された放射能（ＥＲ）を定量する；
ｘ）式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００（式中、ＥＲは抗体濃度について定量した平均放射能であり（上記ｉｘを参照のこと）、ＭＲはＭＲコントロールについて定量した平均放射能であり（上記ｖを参照のこと）、ＳＲはＳＲコントロールについて定量した平均放射能である（上記ｖｉを参照のこと））にしたがって、各抗体濃度について特異的溶解の比率を計算する；
４）「ＡＤＣＣの増加」は、上記試験抗体濃度範囲内で認められた特異的溶解の最大比率の増加および／または上記試験抗体濃度範囲内で認められた特異的溶解の最大比率の半分を達成するのに必要な抗体濃度の減少のいずれかと定義する。ＡＤＣＣの増加は、当業者に公知の同一の標準的な産生、精製、処方、および保存方法を使用した同一の宿主細胞型によって産生されるが、グリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩを過剰発現するように操作された宿主細胞によって産生されない同一の抗体によって媒介される上記アッセイを使用して測定したＡＤＣＣに比例する。
本明細書中で使用される、用語「抗ＣＤ２０抗体」は、典型的には、一般にＣＤ２０と呼ばれるヒトＢリンパ球限定分化抗原Ｂｐ３５と命名された３５，０００ダルトンの細胞表面非グリコシル化リンタンパク質を特異的に認識する抗体を意味することを意図する。
本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む新規の融合ポリペプチドを発現するための操作抗体産生細胞によってＦｃレセプター結合親和性およびエフェクター機能が増加した抗体が得られるという発見に基づく。あるいは、抗体産生細胞をα−マンノシダーゼＩＩ触媒活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の発現が増加するように操作することによって、エフェクター機能および／またはＦｃレセプター結合が増加した抗体を得ることができる。好ましい実施形態では、ＧｎＴＩＩＩまたはＧａｌＴ活性を有する融合構築物は、ＭａｎＩＩまたはＧｎＴＩＩをコードする核酸分子と同時発現する。
したがって、１つの実施形態では、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸に関する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドはβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含み、ゴルジ局在化ドメインはマンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである。さらなる実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、ＧａｌＴの局在化ドメインである。
好ましくは、単離核酸は、図２４および配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を有する。別の好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含み、ゴルジ局在化ドメインはβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎｔＩ）の局在化ドメインである。好ましくは、核酸は、図２５および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有する。あるいは、別のゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを使用することができる。別の好ましい実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態では、本発明は、図２４および配列番号１５または図２５および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸に関する。本発明はまた、図２４および配列番号１４または図２５および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列とハイブリッド形成プローブにストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する配列を含む単離核酸を含む。本発明は、さらに、図２４および配列番号１４または図２５および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含む単離核酸に関する。別の実施形態では、本発明は、図２４および配列番号１５または図２５および配列番号１３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸に関する。本発明はまた、保存的アミノ酸置換を行った図２４および配列番号１５または図２５および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸を含む。
別の実施形態では、本発明は、上記などの本発明の単離核酸を含む発現ベクターに関する。
さらなる実施形態では、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドに関する。好ましい実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含む。特に好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、マンノシダーゼＩＩまたはβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）のゴルジ局在化ドメインをさらに含む。別の実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。本発明の融合ポリペプチドを、融合ポリペプチドをコードする核酸を発現させる条件下で培地中にて本発明の宿主細胞を培養し、得られた培養物から融合ポリペプチドを回収することによって調製することができる。
本発明は、さらに、の本発明の核酸または発現ベクターを宿主細胞に移入する工程を含む、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのグリコシル化プロフィールを改変する方法に関する。好ましくは、改変ポリペプチドは、ＩｇＧまたはＦｃ領域を含むそのフラグメントである。最も好ましくは、ポリペプチドは、ＩｇＧ１またはＦｃ領域を含むそのフラグメントである。別の好ましい実施形態では、改変ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質である。
本発明は、さらに、本発明の核酸および発現ベクターを含む宿主細胞に関する。１つの実施形態では、本発明は、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、宿主細胞によって産生されたポリペプチドは、ＩｇＧまたはそのフラグメントである。最も好ましくは、宿主細胞によって産生されたポリペプチドは、ＩｇＧ１またはそのフラグメントである。あるいは、宿主細胞によって産生されたポリペプチドは、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）のＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質である。
本発明の宿主細胞によって産生された改変ポリペプチドは、改変の結果としてＦｃレセプター結合親和性および／またはエフェクター機能の増加を示す。好ましくは、Ｆｃレセプター結合親和性の増加によってＦｃγＲＩＩＩａレセプターなどのＦｃγ活性化レセプターへの結合が増加する。エフェクター機能の増加は、好ましくは、１つまたは複数の以下の増加である：抗体依存性細胞傷害性の増加、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの増加、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞（ＰＭＮ）への結合の増加、単球への結合の増加、標的結合抗体の交差の増加、直接シグナル伝達誘導アポトーシスの増加、樹状細胞成熟の増加、およびＴ細胞プライミングの増加。
特に好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞であり、宿主細胞によって産生されるポリペプチドはＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８などの抗ＣＤ２０抗体である。別の好ましい実施形態では、宿主細胞はキメラ抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｃ２２５である。
本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸を含むことに加えて、本発明の宿主細胞は、抗体分子、機能的Ｆｃ領域を保持する抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つの切断核酸をさらに含み得る。好ましい実施形態では、少なくとも１つの切断核酸は、抗ＣＤ２０抗体、キメラ抗ヒト神経芽細胞腫モノクローナル抗体ｃｈＣＥ７、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０、キメラ抗ヒト結腸癌、肺癌、および乳癌モノクローナル抗体ＩＮＧ−１、ヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体３６２２Ｗ９４、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体Ａ３３、ＧＤ３ガングリオシドに指向する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４、キメラ抗ヒト扁平上皮癌モノクローナル抗体ＳＦ−２５、抗ヒトＥＧＦＲ抗体、抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗ヒトＰＳＭＡ抗体、抗ヒトＰＳＣＡ抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗ヒトＣＤ３０抗体、抗ＴＡＧ７２抗体、抗高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）抗体、抗ＧＤ３ガングリオシド抗体、抗ＧＤ２ガングリオシド抗体、抗ＧＭ２ガングリオシド抗体、抗ヒトガングリオシド抗体、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＬｅＹ抗体、抗ムチン抗体、抗ＭＵＣ１８抗体、抗ヒトＣＤ３３抗体、抗ヒトＣＤ３８抗体、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ４５抗体、抗ヒトＣＤ５２抗体、抗ヒトＣＤ１３８抗体、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ変異抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体、抗ヒトＣＥＡ抗体、抗ヒトＭＵＣ１抗体、抗ヒトＭＵＣ１コアタンパク質抗体、抗ヒト異所性グリコシル化ＭＵＣ１抗体、ＥＤ−Ｂドメインを含むヒトフィブロネクチン変異型に対する抗体、または抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体をコードする。
本発明はまた、（ａ）全抗体分子、機能的Ｆｃ領域を保持する抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＴ」）活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量でＧｎＴＩＩＩ活性またはＧａｌＴ活性を有する前記融合ポリペプチドが発現することと、（ｂ）前記ポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でポリペプチドを産生する方法に関する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含む。特に好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、さらに、ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩまたはβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）の局在化ドメインである。あるいは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在化ドメイン、およびα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。本発明の方法によって産生されたポリペプチドは、Ｆｃレセプター結合親和性および／またはエフェクター機能が増加した。好ましくは、エフェクター機能の増加は、１つまたは複数の以下である：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞傷害性の増加が含まれる）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接シグナル伝達誘導アポトーシスの増加、標的結合抗体の交差の増加、樹状細胞成熟の増加、またはＴ細胞プライミングの増加。Ｆｃレセプター結合親和性の増加は、好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩａなどのＦｃ活性化レセプターへの結合の増加である。
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドのＦｃ領域中の二分オリゴ糖の比率が増加した本発明の方法によって産生されたポリペプチドに関する。さらに別の実施形態では、本発明の方法によって産生されたポリペプチドは、改変の結果としてＦｃ領域中の非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型または複合体型であり得る。特に好ましい実施形態では、宿主細胞および本発明の方法によって産生されたポリペプチドは、Ｆｃ領域中の二分非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した。二分非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合体のいずれかであり得る。詳細には、本発明の方法を使用して、ポリペプチドのＦｃ領域中の少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％のオリゴ糖が非フコシル化されたポリペプチドを産生することができる。本発明の方法を使用して、ポリペプチドのＦｃ領域中の少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９００％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％のオリゴ糖が二分ポリペプチドを産生することもできる。なおさらに、本発明の方法を使用して、ポリペプチドのＦｃ領域中の少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９００％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％のオリゴ糖が二分および非フコシル化されたポリペプチドを産生することもできる。本発明の方法を使用して、ポリペプチドのＦｃ領域中の少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％のオリゴ糖が二分および非フコシル化されたハイブリッドであるポリペプチドを産生することもできる。
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって産生されたエフェクター機能および／またはＦｃレセプター結合親和性が増加するように操作された抗体に関する。好ましくは、エフェクター機能の増加は、１つまたは複数の以下である：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞傷害性の増加が含まれる）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接シグナル伝達誘導アポトーシスの増加、標的結合抗体の交差の増加、樹状細胞成熟の増加、またはＴ細胞プライミングの増加。好ましい実施形態では、Ｆｃレセプター結合親和性の増加は、Ｆｃ活性化レセプター（最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａ）への結合の増加である。本発明は、さらに、Ｆｃ領域を含む抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合ポリペプチドに関する。このような抗体フラグメントおよび融合タンパク質は、Ｆｃレセプター結合親和性および／またはエフェクター機能が増加する。
本発明は、さらに、抗体、Ｆｃ領域を保持する抗体フラグメント、および本発明の免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を有する融合タンパク質ならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物に関する。
本発明は、さらに、癌治療方法におけるこのような薬学的組成物の使用に関する。詳細には、本発明は、治療有効量の本発明の薬学的組成物を投与する工程を含む、癌治療方法に関する。
本発明はまた、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターおよびマンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドをコードする核酸分子およびマンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子は同一または個別の発現ベクターに存在する。別の好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む。さらに好ましい実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、ＭａｎＩＩ、β$（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、β（
１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩ、またはα−１，６−コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである。さらに好ましい実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される。好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞からなる群から選択される。
本発明は、さらに、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクター、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクター、およびβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドをコードする核酸分子、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子は同一または個別の発現ベクターに存在する。融合ポリペプチドをコードする核酸分子が１つの発現ベクターに存在し、且つ、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が同一の発現ベクターに存在することも好ましい。ＭａｎＩＩ活性をコードする核酸分子が１つの発現ベクターに存在し、且つ融合ポリペプチドをコードする核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が同一の発現ベクターに存在することも好ましい。別の実施形態では、ＧｎＴＩＩが１つの発現ベクターに存在し、融合ポリペプチドをコードする核酸分子およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が同一の発現ベクターに存在する。
さらなる態様では、本発明は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクター、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドをコードする核酸分子およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子は同一の発現ベクターまたは個別の発現ベクターに存在する。好ましくは、融合ポリペプチドは、ＧａｌＴの触媒ドメインを含む。さらなる実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、ＭａｎＩＩ、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩ、またはα−１，６−コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである。好ましい実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞からなる群から選択される。好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞である。
さらなる態様では、本発明は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性を有し、且つゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクター、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクター、およびβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、各核酸は同一の発現ベクターに存在する。個別の実施形態では、各核酸分子は個別のベクターに存在する。本発明は、さらに、融合ポリペプチドをコードする核酸分子が１つの発現ベクターに存在し、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が同一の発現ベクターに存在することを提供する。本発明はまた、ＭａｎＩＩをコードする核酸分子が１つの発現ベクターに存在し、融合ポリペプチドをコードする核酸分子およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が同一の発現ベクターに存在することを提供する。本発明はまた、ＧｎＴＩＩをコードする核酸分子が１つの発現ベクターに存在し、融合ポリペプチドをコードする核酸分子およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が同一の発現ベクターに存在することを提供する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドはＧａｌＴの触媒ドメインを含む。さらに好ましい実施形態では、ゴルジ局在化ドメインは、ＭａｎＩＩ、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩ、またはα−１，６−コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである。
本発明は、さらに、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する。
本発明はまた、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する。
本発明は、さらに、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する
。
個別の実施形態では、本発明はまた、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択される、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量でＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、ＭａｎＩＩを有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃレセプター結合親和性が改変の結果として増加する。さらに好ましい実施形態では、宿主細胞によって産生されたポリペプチドのエフェクター機能が改変の結果として増加する。好ましくは、エフェクター機能の増加は、１つまたは複数のＦｃ媒介性細胞傷害性の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞への結合の増加、単球への結合の増加、直接シグナル伝達誘導アポトーシスの増加、樹状細胞成熟の増加、および／またはＴ細胞プライミングの増加である。
さらなる実施形態では、本発明は、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量で前記融合ポリペプチドが発現することと、前記ポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でポリペプチドを産生する方法に関する。好ましくは、ＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように宿主細胞をさらに操作する。さらに好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む。さらに好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、さらに、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ、β$（１，
２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、マンノシダーゼＩ、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、またはα−１，６−コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである。好ましくは、上記改変の結果としてポリペプチドのエフェクター機能が増加した。
本発明は、さらに、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量で前記融合ポリペプチドが発現することと、前記ポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でポリペプチドを産生する方法に関する。さらなる実施形態では、ＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように宿主細胞をさらに操作する。好ましくは、融合ポリペプチドは、ＧａｌＴの触媒ドメインを含む。融合ポリペプチドは、さらに、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含むことも好ましい。好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、マンノシダーゼＩ、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、またはα−１，６−コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである。好ましくは、上記改変の結果としてポリペプチドのエフェクター機能が増加した。詳細には、好ましい実施形態では、宿主細胞によって産生されたポリペプチドは、ポリペプチドのＦｃ領域中の二分非フコシル化オリゴ糖の比率が増加する。好ましくは、二分非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。さらにより好ましくは、二分非フコシル化オリゴ糖は複合体である。好ましい実施形態では、ポリペプチドのＦｃ領域中の少なくとも約１０％から９５％までのオリゴ糖が二分され、且つ非フコシル化されている。本発明の糖操作ポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が二分化され、且つ非フコシル化されていることが特に好ましい。
さらに好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法によって操作された抗体のエフェクター機能が増加したことを提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、さらに、本発明の方法にしたがって操作した抗体を含む薬学的組成物を提供する。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含む。
本発明は、さらに、治療有効量の本発明の薬学的組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、癌性腫瘍の治療方法を提供する。
本発明は、さらに、全抗体分子、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体フラグメントからなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でＧａｌＴをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、ＧａｌＴまたはＭａｎＩＩの一方または両方の発現レベルが前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分であることと、前記ポリペプチドのＦｃ媒介性細胞傷害性が改変の結果として増加することと、前記Ｆｃ媒介性細胞傷害性が増加したポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でＦｃ媒介性細胞傷害性が増加したポリペプチドを産生する方法に関する。さらに好ましい実施形態では、ＧａｌＴの発現レベルによって、Ｆｃ媒介性細胞傷害性が増加した免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体分子または抗体フラグメントが産生される。
本発明は、さらに、全抗体分子、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体フラグメントからなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でＧａｌＴをコードする少なくとも１つの核酸およびＭａｎＩＩをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、ＧａｌＴまたはＭａｎＩＩの一方または両方の発現レベルが前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分であることと、前記ポリペプチドのＦｃ媒介性細胞傷害性が改変の結果として増加することと、前記Ｆｃ媒介性細胞傷害性が増加したポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主中でＦｃ媒介性細胞傷害性が増加したポリペプチドを産生する方法に関する。好ましい実施形態では、上記宿主細胞は、さらに、ＧｎＴＩＩＩが宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖の改変に十分な量で発現し、ポリペプチドのＦｃ媒介性細胞傷害性が改変の結果として増加する、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸を含む。好ましくは、１つまたは複数のＧａｌＴ、ＭａｎＩＩ、またはＧｎＴＩＩＩの発現レベルは、ポリペプチドのＦｃ領域中の二分オリゴ糖の形成に十分である。さらにより好ましくは、Ｆｃ領域中の全オリゴ糖に対するＦｃ領域中の二分オリゴ糖の比率は、少なくとも約２５％、３５％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である。好ましくは、Ｆｃ領域中の全オリゴ糖に対するＦｃ領域中の二分オリゴ糖の比率は、少なくとも約４５％である。好ましい実施形態では、二分オリゴ糖は複合体またはハイブリッドである。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞である。さらにより好ましくは、宿主細胞は植物細胞である。
別の態様では、本発明は、
ａ．全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを産生させる条件下でα−マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドのＦｃ領域中のオリゴ糖改変に十分な量で前記α−マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドが発現することと、
ｂ．前記宿主細胞によって産生されたポリペプチドを単離する工程とを含む、宿主細胞中でポリペプチドを産生する方法に関する。
本発明はまた、改変オリゴ糖の結果としてエフェクター機能および／またはＦｃレセプター結合が増加したポリペプチド（特に、抗体）ならびに障害（特に、腫瘍）を治療するための治療組成物におけるその使用に関する。
（グリコシル化パターンの改変が望ましいタンパク質をコードする核酸の同定および作製）
本発明は、Ｆｃレセプター、好ましくはＦｃ活性化レセプターの結合親和性および／またはエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性が含まれる）が増加した抗体、Ｆｃ領域を含む抗体フラグメント、およびＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質の糖形態の産生のための宿主細胞系の作製および使用方法を提供する。グリコシル化パターンの改変が望ましい潜在的な治癒的価値を有する抗体の標的エピトープの同定および作製ならびにそのそれぞれのコードする核酸配列は、本発明の範囲内である。
当該分野で公知の種々の手順を、目的の標的エピトープに対する抗体の産生のために使用することができる。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、全ヒト抗体、単鎖抗体、ならびにＦａｂフラグメント、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨ、ＩｇＧ発現ライブラリーによって産生されたフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば、診断薬または治療薬として有用であり得る。治療薬として、中和抗体（すなわち、リガンド、基質、またはアダプター分子と結合を競合する抗体）が特に好ましい。
抗体産生のために、種々の動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれるが、これらに限定されない）を、目的の標的タンパク質での注射によって免役化する。関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって、ポリクローナル抗体を動物中で惹起することができる。宿主動物種に依存して、種々のアジュバント（フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、サポニン、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない）を使用して、免疫応答を増加させることができる。例えば、１００ｇまたは５ｇのタンパク質または抱合体（それぞれウサギまたはマウス用）と３体積のフロイント完全アジュバントとの組合わせおよび溶液の複数の部位への皮内注射によって、動物を、抗原、免疫原性抱合体、または誘導体に対して免役化する。１ヶ月後、動物を、複数の部位への皮下注射によって最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは抱合体を含むフロイントアジュバントで追加免疫を行う。７〜１４日後、動物を採血し、抗体力価について血清をアッセイする。力価がプラトーになるまで追加免疫を行う。好ましくは、動物を、同一の抗原の抱合体であるが、異なるタンパク質と抱合し、そして／または異なる架橋試薬によって追加免疫を行う。抱合体を、タンパク質融合物として組換え細胞培養物中で作製することもできる。
培養における連続細胞株によって抗体分子が産生される任意の技術を使用して、目的の標的に対するモノクローナル抗体を調製することができる。これらには、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−３０（１９８３）、およびＥＢＶ─ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７−９６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５））が含まれるが、これらに限定されない。さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子を含む適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子のスプライシングによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３１４：４５２−５４（１９８５）を使用することができる。これらの技術を使用して、他の哺乳動物の抗体分子から構成されるキメラ抗体も産生することができる。あるいは、単鎖抗体の産生についての技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、所望の特異性を有する単鎖抗体を産生するように適合させることができる。本発明は、さらに、本発明の方法にしたがって糖操作したヒト化抗体に関する。ヒト化抗体の作製技術は、例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，１８０，３２０号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。
目的の標的タンパク質の特定の結合部位を含む抗体フラグメントを、公知の技術によって作製することができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって作製することができるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、目的の標的タンパク質に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速且つ容易に同定するためのＦａｂ発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−８１（１９８９））。
一旦グリコシル化パターンの改変が望ましい抗体または抗体フラグメントが同定されると、当該分野で周知の技術を使用して、コード核酸配列を同定および単離する。
（ａ．グリコシル化パターンが変化したタンパク質の産生のための細胞株の作製）
本発明は、グリコシル化パターンが改変されたタンパク質の作製のための宿主細胞発現系を提供する。特に、本発明は、治癒的価値が改良されたタンパク質の糖形態の作製のための宿主細胞系を提供する。したがって、１つの態様では、本発明は、例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを発現するように選択または操作された宿主細胞発現系を提供する。詳細には、このような宿主細胞発現系を、構成性または調節されたプロモーター系に作動可能に連結されたこのような融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含むように操作することができる。
１つの特定の実施形態では、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作した宿主細胞を提供する。１つの態様では、宿主細胞を、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子で操作する。
一般に、本発明の宿主細胞株を操作するためのバックグラウンドとして任意の培養細胞株型を使用することができる。好ましい実施形態では、本発明の操作宿主細胞を作製するためのバックグラウンド細胞株として、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞を使用する。（Ｍａ，Ｊ．Ｋ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
４：７９４−８０５（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００３）および本明細書中に引用した参考文献（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
本発明は、本明細書中に定義されるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを発現する任意の操作宿主細胞を含むことを意図する。
β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする１つまたはいくつかの核酸を、構成性プロモーターまたは調節発現系の調節下で発現することができる。適切な調節発現系には、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃスイッチ発現系、糖質コルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系、およびメタロチオネイン金属誘導性発現系が含まれるが、これらに限定されない。β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするいくつかの異なる核酸は宿主系内に含まる場合、そのうちのいくつかは構成性プロモーターの調節下で発現することができる一方で、他は調節プロモーターの調節下で発現する。最大発現レベルは、細胞成長率に有意な悪影響を与えない安定な融合ポリペプチドの可能な最大レベルと見なされ、日常的な実験を使用して決定する。当該分野で一般的に知られている方法（ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドに特異的な抗体またはＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドに融合したペプチドタグに特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に特異的な核酸プローブまたはＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドに融合したペプチドタグをコードする核酸に特異的な核酸プローブを使用したノーザンブロット分析、またはＧｎＴＩＩＩ活性の測定が含まれる）によって発現レベルを決定する。あるいは、ＧｎＴＩＩＩの生合成生成物（例えば、Ｅ４−ＰＨＡレクチン）に結合するレクチンを使用することができる。あるいは、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で操作した細胞によって産生された抗体によって媒介されるＦｃレセプター結合の増加またはエフェクター機能の増加を測定する機能アッセイを使用することができる。さらに、核酸を、レポーター遺伝子に作動可能に連結することができる；β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドの発現レベルを、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルの測定によって決定する。レポーター遺伝子は、融合ポリペプチドをコードする核酸と共に１つのｍＲＮＡ分子として転写することができる；配列内リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）またはキャップ依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかによってその各コード配列を連結することができる。レポーター遺伝子を、１つのポリペプチド鎖が形成されるように、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸とともに翻訳することができる。融合ポリペプチドをコードする核酸およびレポーター遺伝子がＲＮＡ分子に転写されるように本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸を１つのプロモーターの調節下でレポーター遺伝子に作動可能に連結するか、２つの個別の伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子にスプライシングすることができる；得られたｍＲＮＡのうちの一方がレポータータンパク質に翻訳され、他方が融合ポリペプチドに翻訳される。
β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするいくつかの異なる核酸が発現する場合、これらが１つまたはいくつかのｍＲＮＡ分子として転写されるような方法で配列することができる。これらが１つのｍＲＮＡ分子として転写される場合、配列内リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）またはキャップ依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかによってその各コード配列を連結することができる。これらを１つのプロモーターからＲＮＡ分子に転写するか、いくつかの異なる伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子にスプライシングし、その各コードされた融合ポリペプチドに翻訳することができる。
他の実施形態では、本発明は、Ｆｃレセプター結合親和性（特に、Ｆｃ活性化レセプターへの結合）およびエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性が含まれる）が増加した治療抗体作製のための宿主細胞発現系を提供する。一般に、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸と共に変化した糖形態の産生が望ましい抗体をコードする核酸を発現するように宿主細胞発現系を操作および／または選択した。１つの実施形態では、このような融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸で宿主細胞系をトランスフェクトする。典型的には、本発明の融合ポリペプチドを安定に発現するクローンを同定および単離するためにトランスフェクトした細胞を選択する。
本発明の宿主細胞株を操作するためのバックグラウンドとして任意の培養細胞株型を使用することができる。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞を使用することができる。典型的には、このような細胞株を、全抗体分子、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトランスフェクトした核酸をさらに含むように操作する。典型的には、このような抗体産生細胞株は、２０〜１２０ｐｇ／（細胞／日）の範囲での高い特異的産生性で抗体を産生および分泌するクローンに由来する。別の実施形態では、本発明の操作宿主細胞を作製するためのバックグラウンド細胞株として目的の特定の抗体を発現するハイブリドーマ細胞株を使用する。
１つの実施形態では、抗体、抗体フラグメント、またはＦｃ融合ポリペプチドをコードする核酸を抗体発現ベクターにクローン化し、宿主細胞にトランスフェクトし、特異的抗体産生性が高く且つ安定な細胞クローンを選択およびスクリーニングする。このような選択クローンを、例えば、（ａ）β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する融合ポリペプチド、（ｂ）β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性を有する融合ポリペプチド、（ｃ）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチド、（ｄ）ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドおよびＭａｎＩＩ活性を有するさらなるポリペプチド、または（ｅ）ＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドおよびＭａｎＩＩ活性を有するさらなるポリペプチドをコードする核酸を含む糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターでトランスフェクトする。次いで、特異的抗体産生性が高くなるレベルでの抗体コード遺伝子の安定な発現およびＦｃ領域グリコシル化パターンを改変する（二分されていても二分されていなくてもよく、さらに複合体型またはハイブリッド型のいずれかであってよく、且つＦｃレセプター結合の増加（特にＦｃ−ＦｃγＲＩＩＩ結合親和性の増加）およびＦｃレセプター媒介エフェクター機能（Ｆｃ媒介性細胞傷害性が含まれるが、これらに限定されない）の増加に関連する非フコシル化オリゴ糖画分の増加が含まれる）発現レベルでの糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の安定な発現のためにクローンを選択およびスクリーニングする。選択およびスクリーニング法を以下に記載する。
別の実施形態では、２つの上記トランスフェクション（すなわち、抗体発現ベクターでのトランスフェクションおよび糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターでのトランスフェクション）の順序は逆である（すなわち、宿主細胞を糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターで最初にトランスフェクトし、その後抗体発現ベクターでトランスフェクトする）。このようなアプローチでは、第１のトランスフェクション由来のクローンを、以下にさらに記載の任意の方法または抗体発現ベクターでのこのようなクローンの複製物の一過性トランスフェクションおよびその後のＦｃ領域のグリコシル化パターンの改変およびＦｃレセプター（ＦｃγＲＩＩＩが含まれる）の結合親和性の増加およびＦｃレセプター媒介性エフェクター機能（Ｆｃ依存性細胞傷害性が含まれる）を増加させるレベルでグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の安定な発現レベルを有するクローンを同定するための以下にさらに記載したスクリーニング法の適用によって、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の適切な安定発現レベルについてスクリーニングすることができる。
さらなる実施形態では、抗体コード遺伝子およびグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を、１つのトランスフェクション工程において１つの発現ベクターまたは個別のベクターのいずれかで共にトランスフェクトする。
典型的には、宿主細胞系中の少なくとも１つの核酸は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性またはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするか、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする。
本発明の融合ポリペプチドをコードする１つまたはいくつかの核酸を、構成性プロモーターまたは調節発現系の調節下で発現することができる。適切な調節発現系には、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃスイッチ発現系、糖質コルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系、およびメタロチオネイン金属誘導性発現系が含まれるが、これらに限定されない。β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするいくつかの異なる核酸は宿主系内に含まれ、そのうちのいくつかは構成性プロモーターの調節下で発現することができる一方で、他は調節プロモーターの調節下で発現する。最大発現レベルは、細胞成長率に有意な悪影響を与えない安定な融合ポリペプチドの可能な最大レベルと見なされ、日常的な実験を使用して決定する。当該分野で一般的に知られている方法（例えば、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドまたはＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドに融合したペプチドタグに特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析、例えば、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に特異的な核酸プローブまたはＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドに融合したペプチドタグをコードする核酸に特異的な核酸プローブを使用したノーザンブロット分析、またはＧｎＴＩＩＩ活性の測定が含まれる）によって発現レベルを決定する。あるいは、ＧｎＴＩＩＩの生合成生成物（例えば、Ｅ４−ＰＨＡレクチン）に結合するレクチンを使用することができる。あるいは、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で操作した細胞によって産生された抗体によって媒介されるＦｃレセプター結合の増加またはエフェクター機能の増加を測定する機能アッセイを使用することができる。さらに、核酸を、レポーター遺伝子に作動可能に連結することができる；本発明の融合ポリペプチドの発現レベルを、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルの測定によって決定する。レポーター遺伝子は、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸と共に１つのｍＲＮＡ分子として転写することができる；配列内リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）またはキャップ依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかによってその各コード配列を連結することができる。レポーター遺伝子を、１つのポリペプチド鎖が形成されるように、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸とともに翻訳することができる。本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸およびレポーター遺伝子がＲＮＡ分子に転写されるように融合タンパク質をコードする核酸を１つのプロモーターの調節下でレポーター遺伝子に作動可能に連結するか２つの個別の伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子にスプライシングすることができる；得られたｍＲＮＡのうちの一方がレポータータンパク質に翻訳され、他方が融合ポリペプチドに翻訳される。
β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするいくつかの異なる核酸が発現する場合、これらが１つまたはいくつかのｍＲＮＡ分子として転写されるような方法で配列することができる。これらを１つのｍＲＮＡ分子として転写する場合、配列内リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）またはキャップ依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかによってその各コード配列を連結することができる。これらを１つのプロモーターからＲＮＡ分子に転写するか、いくつかの異なる伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子にスプライシングし、その各コードされた融合ポリペプチドに翻訳することができる。
（ｉ．発現系）
当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳調節シグナルと共に目的のタンパク質のコード配列およびβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドのコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載の技術を参照のこと。
種々の宿主発現ベクター系を使用して、目的のタンパク質のコード配列および本発明の融合ポリペプチドのコード配列を発現することができる。好ましくは、哺乳動物細胞を、目的のタンパク質のコード配列および融合ポリペプチドのコード配列を含む組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞系として使用する。最も好ましくは、宿主細胞系としてＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞を使用する。発現系および選択方法のいくつかの例は、以下の参考文献およびそれに含まれる参考文献に記載されている：Ｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎ．７１（４）：２６６−７３（２０００−２００１），Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（８）：８７０−８０（１９９８），ｉｎ Ａｎｄｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１７−１２３（２００２），Ｃｈａｄｄ ａｎｄ Ｃｈａｍｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１８８−１９４（２００１），ａｎｄ Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：４５０−４５４（２００１）。別の実施形態では、他の真核生物宿主細胞系（目的のタンパク質のコード配列および本発明の融合ポリペプチドのコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母細胞；目的のタンパク質のコード配列および本発明の融合ポリペプチドのコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；目的のタンパク質のコード配列および本発明の融合ポリペプチドのコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させたか組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または二重微小染色体中で安定に増幅するか（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）、不安定に増幅する目的のタンパク質をコードするＤＮＡおよび本発明の融合ポリペプチドのコード配列の複数のコピーを含むように操作された細胞株を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系（例えば、マウス細胞株）が含まれる）を意図することができる。
本発明の方法のために、典型的に結果の再現性が高く、且つ大量産生（すなわち、細胞株中での本発明の糖操作抗体の大規模産生）により適合可能でもあるので、一般に一過性発現よりも安定な発現が好ましい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞を、適切な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって調節された各コード核酸で形質転換することができる。外来ＤＮＡの移入後、操作細胞を富化培地中で１〜２日間成長させ、その後選択培地と交換することができる。組換えプラスミド中の選択マーカーによって選択耐性が付与され、プラスミドがその染色体に安定に組み込まれた細胞を選択し、クローン化して細胞株に拡大することができる増殖巣を形成するように成長させる。
多数の選択系（それぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞で使用することができる単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２６（１９６２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））が含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。また、メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５６７（１９８９）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；マイコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；およびハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ３０：１４７（１９８４）の選択基準として代謝拮抗物質耐性を使用することができる。最近、さらなる選択遺伝子が記載されている（すなわち、細胞がトリプトファンの代わりインドールを使用するｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用するｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８０４７（１９８８））；グルタミン合成酵素系；およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）ＤＦＭＯ（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．（１９８７）））。
（ｉｉ．改変グリコシル化パターンを有するタンパク質を発現するトランスファクタントまたは形質転換体の同定）
コード配列を含み、且つ生物活性遺伝子産物を発現する宿主細胞を、少なくとも４つの以下の一般的アプローチによって同定することができる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無、（ｃ）宿主細胞中の各ｍＲＮＡ転写物の発現によって測定した転写レベルのアッセイ、（ｄ）免疫アッセイまたはその生物活性によって測定した遺伝子産物の検出。
第１のアプローチでは、発現ベクター中に挿入した目的のタンパク質のコード配列および本発明の融合ポリペプチドのコード配列の存在を、各コード配列またはその一部もしくは誘導体と相同なヌクレオチド配列を含むプローブを使用したＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成によって検出することができる。
第２のアプローチでは、一定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセート耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉鎖体形成など）の有無に基づいて、組換え発現ベクター／宿主系を同定および選択することができる。例えば、目的のタンパク質のコード配列および本発明の融合ポリペプチドのコード配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入し、マーカー遺伝子機能の非存在によって各コード配列を含む組換え体で同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子を、コード配列の発現を調節するために使用した同一または異なるプロモーターの調節下でコード配列内に縦列に置くことができる。誘導または選択に応答したマーカーの発現は、目的のタンパク質のコード配列および融合ポリペプチドのコード配列の発現を示す。
第３のアプローチでは、目的のタンパク質のコード配列および本発明の融合ポリペプチドのコード配列の転写活性を、ハイブリッド形成アッセイによってアッセイすることができる。例えば、ＲＮＡを単離し、目的のタンパク質のコード配列および本発明の融合ポリペプチドのコード配列またはその特定の部分と相同なプローブを使用したノーザンブロットによって分析することができる。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出し、このようなプローブとのハイブリッド形成についてアッセイすることができる。
第４のアプローチでは、目的のタンパク質およびβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有し、且つ異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドのコード配列のタンパク質産物の発現を、免疫学的にアッセイすることができる（例えば、ウェスタンブロット、放射免疫沈降、酵素結合免疫アッセイなどの免疫アッセイなど）。しかし、発現系の成功についての最終的な試験は、生物活性遺伝子産物の検出を含む。
（ｂ．グリコシル化パターンが変化したタンパク質およびタンパク質フラグメントの作製および使用）
（ｉ．エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性が含まれる）が増加した抗体の作製および使用）
好ましい実施形態では、本発明は、Ｆｃレセプター結合および／またはエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性が含まれる）が増加した抗体および抗体フラグメントの糖形態を提供する。
最近、いくつかの癌型の治療のための非抱合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験で有望な結果が得られた。Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：２２３−２５（１９９７）；Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７）。非抱合キメラＩｇＧ１は、低悪性度または濾胞性非ホジキンリンパ腫について承認されており（Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：２２３−２５（１９９７））、充実性乳癌をターゲティングする別の非抱合ｍＡｂであるヒト化ＩｇＧ１も第３相臨床試験で有望な結果を示している（Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ１８：１２７（１９９７））。これら２つのｍＡｂの抗原は、その各腫瘍細胞で高度に発現し、抗体は、インビトロおよびインビボでエフェクター細胞によって強力な腫瘍破壊を媒介する。対照的に、優れた腫瘍特異性を有する多数の他の非抱合ｍＡｂは、臨床的に有用であるのに十分な有効性でエフェクター機能を誘発することができない。Ｆｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ８０：３１７−３３（１９９７）；Ｓｕｒｆｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９：１８４−９１（１９９６）。いくつかのこれらの弱いｍＡｂのために、付加サイトカイン療法が現在試験されている。サイトカインの付加により、循環リンパ球の活性および数の増加によって抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激することができる。Ｆｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ８０：３１７−３３（１９９７）；Ｓｕｒｆｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９：１８４−９１（１９９６）。ＡＤＣＣ（抗体標的化細胞への溶解攻撃）は、抗体の定常領域（Ｆｃ）への白血球レセプターの結合時に誘発される。Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７）。
異なるが、相補的な非抱合ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増加させるためのアプローチは、抗体のＦｃ領域を操作することである。タンパク質操作研究により、ＦｃγＲがＩｇＧＣＨ２ドメインの低ヒンジ領域と相互作用することが示されている。Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６）。しかし、ＦｃγＲ結合は、ＣＨ２領域中の保存Ａｓｎ２９７で共有結合したオリゴ糖の存在も必要である。オリゴ糖およびポリペプチドの両方が相互作用部位に直接寄与するか、活性ＣＨ２ポリペプチド高次構造の維持にオリゴ糖が必要であることが示唆されているＬｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６）；Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３１（１９９７）。したがって、オリゴ糖構造の改変を、相互作用の親和性を増加させる手段として探索することができる。
ＩｇＧ分子は、そのＦｃ領域中に２つのＮ結合オリゴ糖（各重鎖に１つ）を保有する。任意の糖タンパク質として、抗体は、同一のポリペプチド骨格を共有するがグリコシル化部位に結合したオリゴ糖が異なる糖形態集団として産生される。血清ＩｇＧのＦｃ領域中に通常見出されるオリゴ糖は、低レベルの末端シアル酸および二分Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有し、且つ異なる程度で末端ガラクトシル化およびコアフコシル化された二触覚型の複合体である（Ｗｏｒｍａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１３０−３８（１９９７）。いくつかの研究により、ＦｃγＲ結合に必要な最小炭水化物構造がオリゴ糖コア内に存在することが示唆される。Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６）。
非抱合治療ｍＡｂの産生のために、産業および研究において使用したマウスまたはハムスター由来の細胞株は、通常必要なオリゴ糖決定基がＦｃ部位に結合する。しかし、これらの細胞株中に発現したＩｇＧは、血清ＩｇＧ中に少量で見出される二分ＧｌｃＮＡｃを欠く。Ｌｉｆｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５）。対照的に、ラット骨髄腫産生ヒト化ＩｇＧ１（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）がいくつかの糖形態の二分ＧｌｃＮＡｃを保有することが最近認められた。Ｌｉｆｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５）。ラット細胞由来抗体は、標準的な細胞株で産生されたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体と類似するインビトロＡＤＣＣ活性に到達するが、抗体濃度は有意に低い。
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗原は、通常、リンパ腫細胞上に高レベルで存在し、このキメラｍＡｂは二分ＧｌｃＮＡｃの非存在下でＡＤＣＣ活性が高い。Ｌｉｆｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５）。Ｎ結合グリコシル化経路では、酵素β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）によって二分ＧｌｃＮＡｃが付加される。Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６４：１６３−８１（１９８６）。
以前の研究では、非常に調節された様式で異なるレベルのクローン化ＧｎＴＩＩＩ遺伝子酵素を発現するように予め操作した１つの抗体産生ＣＨＯ細胞株を使用した。（Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。このアプローチにより、改変抗体のＧｎＴＩＩＩ活性発現とＡＤＣＣ活性発現との間の厳格な相関が最初に確立された。
Ｆｃレセプター結合親和性およびエフェクター機能が増加した本発明のさらなる抗体には、本発明の方法によって産生された抗ヒト神経芽細胞腫モノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）、本発明の方法によって産生されたキメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体（ｃｈＧ２５０）、本発明の方法によって産生されたヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（例えば、トラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ））、本発明の方法によって産生されたキメラ抗ヒト結腸癌、肺癌、および乳癌モノクローナル抗体（ＩＮＧ−１）、本発明の方法によって産生されたヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体（３６２２Ｗ９４）、本発明の方法によって産生されたヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）、本発明の方法によって産生されたＧＤ３ガングリオシドに指向する抗ヒト黒色腫抗体（Ｒ２４）、本発明の方法によって産生されたキメラ抗ヒト扁平上皮癌モノクローナル抗体（ＳＦ−２５）、本発明の方法によって産生された抗ヒト小細胞肺癌モノクローナル抗体（ＢＥＣ２、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト非ホジキンリンパ腫モノクローナル抗体（Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ， Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ））、本発明の方法によって調製された抗ヒト扁平上皮細胞頭頸部癌モノクローナル抗体（Ｃ２２５，ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、本発明の方法によって調製された抗ヒト直腸結腸癌モノクローナル抗体（Ｐａｎｏｒｅｘ（エドレコロマブ）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト卵巣癌モノクローナル抗体（Ｔｈｅｒａｇｙｎ，Ａｎｔｉｓｏｍａ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト急性骨髄性白血病モノクローナル抗体（ＳｍａｒｔＭ１９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｋａｎｅｂｏ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト悪性神経膠腫モノクローナル抗体（Ｃｏｔａｒａ，Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、本発明の方法によって産生された抗ヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫モノクローナル抗体（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８，ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト充実性腫瘍モノクローナル抗体（ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト結腸直腸癌モノクローナル抗体（Ｉｏｄｉｎｅ１３１−ＭＮ−１４，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト卵巣癌、腎臓癌、乳癌、および前立腺癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−２１０，Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト結腸直腸癌および膵臓癌モノクローナル抗体（ＴＴＭＡ，Ｐｈａｒｍａｃｉｅ＆Ｕｐｊｏｈｎ）、本発明の方法によって産生された抗ヒトＴＡＧ−７２発現癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−２２０，Ｍｅｄａｒｅｘ）、本発明の方法によって産生された抗ヒトＥＧＦｒ発現癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−４４７）、本発明の方法によって産生された抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、本発明の方法によって産生された抗ヒト乳癌、肺癌、前立腺癌、および膵臓癌および悪性黒色腫モノクローナル抗体（ＢｒｅｖａＲｅｘ，ＡｌｔａＲｅｘ）、ならびに本発明の方法によって産生された抗ヒト急性骨髄性白血病モノクローナル抗体（モノクローナル抗体抱合体、Ｉｍｍｕｎｅｘ）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質に関する。
（ｉｉ．Ｆｃ媒介性細胞傷害性を促進する免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質の作製および使用）
上記考察のように、本発明は、治療抗体のＦｃレセプター結合親和性および／またはエフェクター機能を増加させる方法に関する。このような抗体のＦｃ領域のグリコシル化パターンの操作、特に、例えば、このような抗体のＦｃ領域に結合するオリゴ糖を改変するＧｎＴＩＩＩ活性、ＧａｌＴ活性、またはＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドを産生するための抗体産生細胞の操作によってこれを行う。グリコシル化操作によって誘発された変化がＦｃ領域のみに影響を与え、それによりＡＤＣＣ機構に関与するエフェクター細胞の表面上のＦｃレセプターとのその相互作用に影響を与えるので、治療抗体だけでなく免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を保有する任意の分子によって媒介される望ましくない細胞に対するＦｃ媒介性細胞傷害性を増加するためにこのストラテジーを適用することができる。現在開示されている方法を提供することができるＦｃ含有分子には、（ａ）Ｆｃ領域のＮ末端に融合したターゲティングタンパク質ドメインから作製された溶解性融合タンパク質（Ｃｈａｍｏｖ ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：５２（１９９６））および（ｂ）Ｆｃ領域のＮ末端に融合した原形質膜に局在化するＩＩ型膜貫通ドメインから作製された原形質膜固定融合タンパク質（Ｓｔａｂｉｌａ，Ｐ．Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１３５７（１９９８））が含まれるが、これらに限定されない。
可溶性融合タンパク質の場合（ａ）、ターゲティングドメインは、すなわち、治療抗体と類似の様式で癌細胞などの望ましくない細胞への融合タンパク質の結合を指示する。したがって、これらの分子によって媒介されるエフェクター機能（Ｆｃ媒介性細胞傷害活性が含まれる）を増強する現在開示の方法の適用は、治療抗体に適用した方法と同一である。
膜固定融合タンパク質の場合（ｂ）、体内の望ましくない細胞は融合タンパク質をコードする遺伝子を発現しなければならない。遺伝子治療アプローチ（すなわち、望ましくない細胞に融合タンパク質コード遺伝子を発現させるプラスミドベクターまたはウイルスベクターでの細胞のインビボトランスフェクション）またはその表面上で融合タンパク質を発現するように遺伝子操作した細胞の体内への移植によって、これを行うことができる。ポリマーカプセル内の後者の細胞は体内に正常に移植され、これらはＦｃ媒介性細胞傷害機構によって破壊することができない（カプセル化細胞療法）。しかし、カプセルデバイスが機能しなくなり、回避細胞が望ましくなくなる場合、Ｆｃ媒介性細胞傷害性によってこれらを排除することができる。Ｓｔａｂｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１３５７（１９９８）。この場合、適切もしくは最大発現レベルの本発明の融合ポリペプチドを指示するさらなる遺伝子発現カセットの遺伝子治療ベクターへの組み込みまたは適切もしくは最大発現レベルの本発明の融合ポリペプチドを発現するように移植される細胞を操作することのいずれかによって本発明で開示の方法を適用する。
（本発明の方法によって産生された抗体、抗体フラグメント、および融合ポリペプチドの治療への適用）
本発明の抗体（すなわち、抗体、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質）のみを使用して、インビボで腫瘍細胞を標的および死滅させることができる。ヒト癌を治療するための適切な治療薬と組み合わせて抗体を使用することもできる。例えば、抗体を、化学療法、放射線療法などの標準的または従来の治療方法と組み合わせて使用することができるか、治療薬を癌部位に送達するための薬物または毒素およびリンホカインもしくは腫瘍阻害成長因子と抱合するか結合することができる。
このような治療薬の抗体との抱合技術は周知である（例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｃｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと）。
あるいは、糖操作抗体を、高エネルギー照射（例えば、腫瘍部位に局在化した場合にいくつかの細胞の直径を減少させる＜１３１＞Ｉなどの放射性同位体）と組み合わせることができる（例えば、Ｏｒｄｅｒ，”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）を参照のこと）。さらに別の実施形態によれば、Ｓｅｇａｌに付与された米国特許第４，６７６，９８０号に記載のように、本発明の抗体を第２の抗体と抱合して腫瘍細胞治療のための抗体ヘテロ抱合体を形成することができる。
本発明の抗体のさらに他の治療への適用には、例えば、組換えＤＮＡ技術によるプロドラッグを細胞傷害薬に変換することができる酵素への抱合または結合および腫瘍部位でプロドラッグを細胞傷害薬に変換するためのプロドラッグと組み合わせた抗体−酵素抱合体の使用が含まれる（例えば、Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４８４２−４６（１９８８）；”Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ インビトロ ａｎｄ インビボ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｅｓ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ Ｍｉｔｏｃｙｃｉｎ Ｃ ａｎｄ Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：５７８９−５７９２（１９８９）；ａｎｄ Ｓｅｎｔｅｒ，”Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｂｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：１８８−１９３（１９９０）を参照のこと）。
本発明の抗体のさらに別の治療上の使用は、補体の存在下または抗体−薬物もしくは抗体−毒素抱合体の一部として癌患者の骨髄から腫瘍細胞を除去するための使用を含む。このアプローチによれば、患者に戻した抗体および骨髄での治療によって自己骨髄をｅｘ ｖｉｖｏで浄化することができる（例えば、Ｒａｍｓａｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｐｕｒｇｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８（２）：８１−８８（１９８８）を参照のこと）。
さらに、所望のモノクローナル抗体の抗原結合領域の特異性を含む本発明のキメラ抗体、組換え免疫毒素、および他の組換え構築物を治療に使用することができる。例えば、本発明の単鎖免疫毒素を使用して、インビボでヒト癌を治療することができる。
同様に、抗腫瘍活性を有する第２のタンパク質（例えば、リンホカインまたはオンコスタチン）の少なくとも機能活性部分に結合した本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を使用して、インビボでヒト癌を治療することができる。さらに、当該分野で公知の組換え技術を使用して、抗体の一方の結合特異性が腫瘍関連抗原に指向する一方で、抗体の他方の結合特異性が腫瘍関連抗原以外の分子に指向する二重特異性抗体を構築することができる。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその等価物に特異的に結合する抗原を発現する腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法を提供する。この方法は、本発明の糖操作抗体またはこれを含む免疫抱合体（例えば、免疫毒素）を腫瘍細胞と反応させる工程を含む。これらの腫瘍細胞は、ヒト癌に由来し得る。
さらに、本発明は、インビボでの癌腫（例えば、ヒト癌）の治療方法を提供する。この方法は、治療有効量の少なくとも１つの本発明の糖操作抗体またはこれを含む免疫抱合体（例えば、免疫毒素）を含む組成物を被験体に投与する工程を含む。
さらなる態様では、本発明は、治療有効量の免疫学的に活性な抗体を必要とするヒト被験体に投与する工程と、改良が本発明の方法によって調製された治療有効量のＡＤＣＣが増加した抗体を投与する工程を含む、Ｂ細胞枯渇に基づく病原性自己抗体の全部または一部によって産生された自己免疫疾患治療の改良方法に関する。好ましい実施形態では、抗体は抗ＣＤ２０抗体である。自己免疫疾患または障害の例には、免疫媒介性血小板減少症（急性特発性血小板減少性紫斑および慢性特発性血小板減少性紫斑など）、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺症候群、ヘノッホ・シェーンライン紫斑、レンサ球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多形性紅疹、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血管性血管炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、線維性胞隔炎（乾癬および皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）が含まれる）などの炎症性反応；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎など）に関連する奏功；呼吸急迫症候群（成人呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）が含まれる）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；湿疹、喘息、およびＴ細胞の浸潤および慢性炎症性反応を含む他の病態などのアレルギー性病態；アテローム性動脈硬化症；白血球接着不全症；リウマチ様関節炎；全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；真性糖尿病（例えば、１型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）；多発性硬化症；レーノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；結核、類肉腫症、多発性筋炎、肉芽腫症、および血管炎で典型的に見出されるサイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球漏出に関与する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（寒冷グロブリン血症またはクームス陽性貧血が含まれるが、これらに限定されない）；重症筋無力症；抗原−抗体複合体媒介疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート・イートン筋無力症候群；類天疱瘡性水疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多発性内分泌症；ライター病；スティッフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；または自己免疫性血小板減少症などが含まれるが、これらに限定されない。本発明のこの態様では、本発明の抗体を使用して、長期間正常なＢ細胞の血液を枯渇させる。
本発明の実施によれば、被験体は、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコ、およびトリ被験体であり得る。他の温血動物も本発明に含まれる。
本発明はまた、癌を罹患した被験体の治療方法を提供する。被験体は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリであり得る。癌を、乳癌、膀胱癌、網膜芽細胞腫、卵巣乳頭状嚢腺腫、ウィルムス腫瘍、または小細胞肺癌と同定することができ、一般に、細胞表面上に腫瘍関連抗原を有する細胞群と特徴づける。この方法は、癌死滅量の細胞傷害薬に結合した腫瘍標的化抗体を被験体に投与する工程を含む。一般に、結合した抗体が細胞表面上のその標的と結合する条件下で腫瘍標的化抗体を細胞傷害薬と結合させる。その標的への結合により、腫瘍標的化抗体は、このようにして結合した細胞を直接または間接的に死滅させるか死滅に寄与するように作用し、それにより被験体を治療する。
哺乳動物腫瘍細胞を十分な濃度の本発明の糖操作抗体または哺乳動物腫瘍細胞の増殖を阻害するために本発明の糖操作抗体を含む免疫抱合体と接触させる工程を含む、哺乳動物腫瘍細胞の増殖を阻害する方法も提供する。
本発明は、さらに、ヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法、被験体の腫瘍の治療方法、および被験体の増殖型疾患の治療方法を提供する。これらの方法は、被験体に有効量の本発明の組成物投与する工程を含む。
したがって、本発明は、ヒト癌を治療するための薬学的組成物、組み合わせ、および方法を含むことが明らかである。例えば、本発明は、薬学的有効量の本発明の抗体および薬学的に許容可能なキャリアを含むヒト癌治療様の薬学的組成物を含む。
組成物は、非改変で治療薬（例えば、薬物、毒素、酵素、または二次抗体）と抱合しているか組み合わせ形態（例えば、キメラ抗体、キメラ抗体のフラグメント、二重特異性抗体）の抗体または抗体フラグメントを含み得る。組成物は、さらに、癌治療のための他の抗体または抱合体（例えば、抗体カクテル）を含み得る。
本発明の抗体、抗体抱合体、および免疫毒素組成物を、従来の投与様式（静脈内、腹腔内、経口、リンパ管内、または腫瘍への直接投与が含まれるが、これらに限定されない）を使用して投与することができる。静脈内投与が好ましい。
本発明の組成物は、種々の投薬形態（液体の溶液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、座剤、高分子マイクロカプセルまたは微小小胞、リポソーム、および注射用または注入用溶液が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。好ましい形態は、投与様式および治療への適用に依存する。
本発明の組成物はまた、好ましくは、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、および塩または硫酸プロタミンなどの電解質などの当該分野で公知の従来の薬学的に許容可能なキャリアおよびアジュバントを含む。
本発明の組成物の最も有効な投与様式および投薬計画は、疾患の重症度および経過、患者の健康状態および治療に対する奏功、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。したがって、各患者に対して組成物の投薬量を漸増すべきである。それにもかからず、本発明の組成物の有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇから約２０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
本明細書中に記載の分子は、種々の投薬形態（液体の溶液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、座剤、高分子マイクロカプセルまたは微小小胞、リポソーム、および注射用または注入用溶液が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。好ましい形態は、投与様式および治療への適用に依存する。
本発明の分子の最も有効な投与様式および投薬計画は、治療すべき腫瘍の位置、癌の重症度および経過、患者の健康状態および治療に対する奏功、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。したがって、各患者に対して分子の投薬量を漸増すべきである。
表面積についてのｍｇ／ｋｇを基本とした種々のサイズおよび種の動物とヒトの相互関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，Ｒｅｐ．５０（４）：２１９−２４４（１９６６）に記載されている。腫瘍細胞成長阻害および応答の阻害を至適化するために投薬計画を調整することができ、例えば、１日を基本として用量を分割するか状況に応じて比例的に減少させることができる（例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与するか、特定の治療状況に応じて比例的に減少させることができる）。
治療に必要な本発明の組成物の用量を、投与計画を至適化しながらさらに減少させることができることが明らかである。
本発明の実施によれば、薬学的キャリアは液体キャリアであり得る。液体キャリアはリン脂質であり得る。さらに、液体キャリアは脂肪酸であり得る。また、脂質キャリアは界面活性剤であり得る。本明細書中で使用される、界面活性剤は、液体の表面張力を変化させる（一般に、低下させる）任意の物質である。
本発明の１つの例では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり得る。非イオン性界面活性剤の例には、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても公知）、Ｂｒｉｊ、およびＴｒｉｔｏｎ（例えば、ＴｒｉｔｏＷＲ−１３３９およびＴｒｉｔｏｎＡ−２０）が含まれるが、これらに限定されない。
あるいは、界面活性剤はイオン性界面活性剤であり得る。イオン性界面活性剤の例には、臭化アルキルトリメチルアンモニウムが含まれるが、これらに限定されない。
さらに、本発明によれば、脂質キャリアはリポソームであり得る。本願で使用される、「リポソーム」は、任意の本発明の分子またはその組み合せを含む任意の膜結合小胞である。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるように以下の調製物および例を示す。しかし、本発明は、例示の実施形態によってその範囲が制限されず、本発明の１つの態様の例示のみを意図し、機能的に等価な方法は本発明の範囲内である。実際、本明細書中に記載の実施形態に加えて、上記説明および添付の図面から本発明の種々の実施形態が当業者に明らかである。このような修正形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
（実施例１）
（材料と方法）
（１．抗体発現ベクターの構築）
（抗ＣＤ２０抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５０２）
Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５０２は、４つの独立した個別の発現カセット（１つはＣ２Ｂ８抗体軽鎖であり、１つはＣ２Ｂ８抗体重鎖であり、１つはネオマイシン耐性遺伝子であり、１つはマウスｄｈｆｒ遺伝子である）からなる。全遺伝子は、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）プロモーターの調節下にあり、ウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナル由来の合成コンセンサスポリアデニル化シグナルを含む。
抗ＣＤ２０抗体Ｃ２Ｂ８の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域をコードするＣＤＮＡを、ＰＣＲを使用して１工程プロセスにおいて１組の重複一本鎖オリゴヌクレオチドから構築した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：５００−５０３（１９９７））。Ｃ２Ｂ８のＶＬおよびＶＨ領域をコードする元の配列を、公開国際特許出願（国際公開番号ＷＯ９４／１１０２６）から入手した。構築したＶＬおおびＶＨのｃＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）にサブクローン化して、ｐＢｌｕｅ−Ｃ２Ｂ８ＶＨおよびｐＢｌｕｅ−Ｃ２Ｂ８ＶＬプラスミドを得て、配列決定した。
Ｃ２Ｂ８の可変鎖を、５’末端にＡｓｃＩ制限部位および可変領域と定常領域との連結部に適切な制限部位を移入するプライマーを使用して、定常領域対応するｐＢｌｕｅ−Ｃ２Ｂ８ＶＨおよびｐＢｌｕｅ−Ｃ２Ｂ８ＶＬプラスミドから増幅した（軽鎖についてはＢｓｉＷＩ、重鎖についてはＮｈｅＩ）。５’末端および３’末端に適切な制限部位を移入するプライマーを使用して、ＩｇＧＩ定常領域をヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（Ｑｕｉｃｋｃｌｏｎｅ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅した（定常軽鎖についてはＢｓｉＷＩおよびＢａｍＨＩ、定常重鎖についてはＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ）。
正確なＤＮＡ配列の確認後、Ｃ２Ｂ８抗体の軽鎖および重鎖を、それぞれＭＰＳＶプロモーターおよびポリアデニル化シグナルと組み合わせた。第１の工程では、以下の２つの異なる発現ベクターを構築した：一方はＣ２Ｂ８軽鎖（ｐＥＴＲ１３１５）であり、他方はＣ２Ｂ８重鎖（ｐＥＴＲ１３１６）である。第２の工程では、ネオマイシン耐性発現カセット（Ｔｎ５トランスポゾンに由来に最小ＭＰＳＶプロモーターの調節下にあるネオマイシン耐性遺伝子）をベクターｐＥＴＲ１３１５に移入してプラスミドｐＥＴＲ１４８１を得た。ＭＰＳＶプロモーターの調節下にあるｄｈｆｒ遺伝子発現カセットをベクターｐＥＴＲ１３１６に挿入してプラスミドｐＥＴＲ１３２８を得た。最後の工程では、両発現モジュール（Ｃ２Ｂ８−軽鎖＋ｎｅｏおよびＣ２Ｂ８−重鎖＋ｄｈｆｒ）を１つのベクターに組み合わせてプラスミドｐＥＴＲ１５０２を得た。
（抗ＣＤ２０抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５２０）
ｐＥＴＲ１５２０は、エピソームベクター複製およびエプスタイン・バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ）産生細胞中での維持のためにＣ２Ｂ８抗ＣＤ２０抗体発現ベクターをエプスタイン・バーウイルス（ｏｒｉＰ）由来の複製起点と組み合わせる。Ｃ２Ｂ８発現ベクターｐＥＴＲ１５２０の構築のために、ｐＥＴＲ１４１６のＣ２Ｂ８発現モジュールをＨｉｎＤＩＩＩフラグメントとしてｏｒｉＰ含有ベクターｐＥＴＲ１５０７に挿入した。ベクターｐＥＴＲ１４１６は、このプラスミド中でネオマイシン耐性遺伝子が最小ＭＰＳＶプロモーターの代わりに全長ＭＰＳＶプロモーターの調節下にあること以外はｐＥＴＲ１５０２に類似する。
（抗フィブロネクチン抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５４６）
このベクターは、Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０抗体の可変重鎖および軽鎖コード領域が抗体Ｌ１９（フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインを認識するヒト抗体）の各コード領域に置換されていること以外はベクターｐＥＴＲ１５２０と同一である。Ｌ１９抗体の可変領域の配列に基づいた合成オリゴヌクレオチドを使用した重複伸長ＰＣＲ法によって可変領域コードＤＮＡフラグメントを合成した（Ｐｉｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３４）：２１７６９−７６（１９９８））。
（抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃ２２５）発現ベクターｐＵＲＳＩ２８）
このベクターは、Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０抗体の可変重鎖および軽鎖コード領域が抗体Ｃ２２５（ヒト上皮成長因子レセプターを認識するキメラ抗体）の各コード領域に置換されていること以外はｐＥＴＲ１５２０と同一である。Ｃ２２５抗体の可変領域の配列に基づいた合成オリゴヌクレオチドを使用した重複伸長ＰＣＲ法によって可変領域コードＤＮＡフラグメントを合成した（配列を、国際公開番号ＷＯ９６／４０２１０の公開特許出願で見出すことができる（重鎖および軽鎖については特許出願のそれぞれ図１６および１７））。
（２．ＧｎＴＩＩＩ融合発現ベクターの構築）
（ｐＥＴＲ１１６６（ＧｎＴＩＩＩの構成性発現のためのベクター））
ＧｎＴＩＩＩ発現ベクターｐＥＴＲ１１６６の構築のために、ＰＣＲによってラット腎臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からラットＧｎＴＩＩＩを増幅した。ウェスタンブロットによるＧｎＴＩＩＩのその後の従来の検出のために、遺伝子の終止コドンのすぐ上流にＣ末端ｃ−ｍｙｃ−エピトープタグを付加した（アミノ酸配列：ＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）。ＧｎＴＩＩＩの正確な配列の確認後、ＭＰＳＶプロモーターの調節下で遺伝子を挿入し、合成ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルを付加した。最終ＧｎＴＩＩＩ発現ベクターは、選択のための個別のピューロマイシン耐性カセット、ＭＰＳＶの調節下でのピューロマイシン耐性遺伝子、および合成ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルも含んでいた。
（ｐＥＴＲ１４２５：ＧｎＴＩＩＩの最初の７６アミノ酸のヒトＧｎＴＩの最初の１０２アミノ酸への置換）
その後の重複ＰＣＲ反応によって、このハイブリッドグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を構築した。１つの反応では、プライマーＧＡＢ−１７９およびＧＡＢ−１８０を使用してヒトＧｎＴＩのステム領域を増幅した。このＰＣＲ反応中に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列およびＡｓｃＩ制限部位も５’末端に移入した。得られたＰＣＲフラグメントは、２２９位から始まるＧｎＴＩＩＩと２３ｂｐ重複する。第２のＰＣＲ反応では、プライマーＧＡＢ−１７７およびＧＡＢ−１７８を使用して２２９位から３８０位までのＧｎＴＩＩＩ領域を増幅し、３’末端に固有のＢｓｔＸＩ部位を有し、５’末端のＧｎＴＩステム領域と２２ｂｐ重複したＰＣＲフラグメントを作製した。両ＰＣＲフラグメントを精製し、第３のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した（プライマーＧＡＢ−１７９およびＧＡＢ−１７８）。得られたフラグメントを精製し、ＡｓｃＩで消化し、ベクターｐＥＴＲ１００１（ＡｓｃＩおよびＳｍａＩで切断）にライゲーションしてプラスミドｐＥＴＲ１４０４を得た。挿入配列を組み合わせた後、ＭＰＳＶプロモーターエレメントをＡｓｃＩ（部分消化）／ＰｍｅＩフラグメントとしてｐＥＴＲ１４０４に付加してプラスミドｐＥＴＲ１４２３を得た。ｐＥＴＲ１１６６由来のＳｐｈＩ／ＢｓｔＸＩフラグメント（元のラットＧｎＴＩＩＩ遺伝子を保有する発現ベクター）を、ｐＥＴＲ１４２３の対応フラグメントと置換して、ＭＰＳＶプロモーターの調節下でのＧｎＴＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合および選択のためのピューロマイシン耐性カセットを含むｐＥＴＲ１４２５を得た。
（プライマー配列：）
Figure 2010233578
（ｐＥＴＲ１５０６：ＧｎＴＩＩＩの７６Ｎ末端アミノ酸のヒトマンノシダーゼＩＩの最初の１００アミノ酸への置換）
ｐＥＴＲ１４２５の構築と同様に、ｐＥＴＲ１５０６を構築した。テンプレートとしてベクターｐＢｌｕｅ−ｍａｎを用いたプライマーＧＡＢ−２５２およびＧＡＢ−２５３を使用してヒトマンノシダーゼＩＩのステム領域を増幅した。このＰＣＲ中に、ＦｓｅＩ部位およびＫｏｚａｋコンセンサス配列を５’末端に移入した。得られたＰＣＲフラグメントは、２２９位から始まるＧｎＴＩＩＩと２３ｂｐ重複する。第２のＰＣＲ反応では、プライマーＧＡＢ−２５４およびＧＡＢ−２５５を使用してＧｎＴＩＩＩ遺伝子の一部（２２９位〜４６０位）を増幅した。このＰＣＲ反応によって、５’末端にマンノシダーゼＩＩ遺伝子および３’末端に固有のＳｔｕＩ部位を有する４３ｂｐ重複したフラグメントが作製された。両フラグメントを精製し、プライマーＧＡＢ−２５２およびＧＡＢ−２５５と共に第３のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。得られたフラグメントをｐＩＣ１９Ｈに挿入して、ベクターｐＥＴＲ１４８４を得た。正確な挿入配列を確認後、ベクターｐＥＴＲ１２１７７（ＦｓｅＩ／ＢａｍＨＩ）中のｐＥＴＲ１１６６由来のＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩフラグメントでのｐＥＴＲ１４８４のＦｓｅＩ／ＳｔｕＩフラグメントのライゲーションによって完全な融合遺伝子を構築した。得られたプラスミド（ｐＥＴＲ１５００）は、ＭＰＳＶの調節下でハイブリッドｍａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ遺伝子（配列番号１４）を含んでいた。哺乳動物細胞中でのプラスミドの選択のために、ｐＥＴＲ１１６６由来のＳｐｅＩフラグメントとしてピューロマイシン耐性カセットを挿入してプラスミドｐＥＴＲ１５０６を得た。
（プライマー配列：）
Figure 2010233578
（ｐＥＴＲ１５１９：ハイブリッドｍａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合遺伝子とエプスタイン・バーウイルス由来の複製起源ｏｒｉＰとの組み合わせ）
プライマーＧＡＢ−２６１およびＧＡＢ−２６２を使用して、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からｏｒｉＰを含む２ｋｂフラグメントを増幅した。このＰＣＲ反応中、フラグメントの両末端にＳｓｐＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を移入した。配列決定のために、ｏｒｉＰフラグメントをベクターｐＩＣ１９Ｈに挿入した。正確な配列を確認した後、ＳｓｐＩフラグメントとしてｏｒｉＰをベクターｐＥＴＲ１００１（ＢｓｍＢＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用して５’重複末端を充填した）に挿入した。得られたプラスミドをｐＥＴＲ１５０７と命名した。ｐＥＴＲ１５１０由来のＳｐｈＩ／ＮｒｕＩ ｍａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ発現カセットを、同一の制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＥＴＲ１５０７に挿入してｐＥＴＲ１５１９を得た。
（プライマー配列：）
Figure 2010233578
（ｐＥＴＲ１５３７：ハイブリッドｍａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合遺伝子と短縮ＣＤ４細胞表面マーカー遺伝子との組み合わせ）
短縮ＣＤ４細胞表面マーカー遺伝子のさらなる発現のためにｐＥＴＲ１５０６発現ベクターを改変した。簡単に述べれば、ｍａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物の終止コドンの下流、ポリオウイルスＩＲＥＳエレメント、その後の短縮ヒトＣＤ４タンパク質をコードするｃＤＮＡ（分泌のためのヒトＣＤ４リーダー配列およびその後に膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含む）の挿入によって、ハイブリッドｍａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合遺伝子発現カセットをモノシストロン性発現カセットからバイシストロン性発現カセットに変換した。
（３．ＧｎＴＩＩＩ融合および抗体発現ベクターでの哺乳動物細胞のトランスフェクション）
（ＢＨＫ細胞のトランスフェクション）
エレクトロポレーションの２４時間前に、指数関数的に成長している細胞（生存率９０〜９５％）を、適当な数のＴ７５フラスコに０．９×１０６細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養培地として、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足したＩｎｖｉｔｒｕｓ（ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。エレクトロポレーション前に細胞を計数した。遠心分離（２００×ｇで５分間）によって８×１０６細胞を回収し、上清を破棄した。細胞を８００μｌＩｎｖｉｔｒｕｓ中に再懸濁し、既に８μｇ環状プラスミドＤＮＡを含む滅菌エレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍギャップ）に移し、室温で５分間インキュベートした。Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して以下の条件で細胞にエレクトロポレーションを行った：４００Ｖ、９６０μＦのパルスを３０秒間隔で２回。エレクトロポレーション後、直ちに細胞を５ｍｌの増殖培地（Ｉｎｖｉｔｒｕｓ／２０％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳ／１．２５％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ）を含むＴ２５フラスコに移し、５％ＣＯ２−大気インキュベーター中３７℃でインキュベートした。非改変（非糖操作）抗体の産生のために、細胞を抗体発現ベクターのみでトランスフェクトした。糖操作抗体の産生のために、細胞を、２つのプラスミド（一方は抗体発現用であり、他方は融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド（配列番号１５）発現用）をそれぞれ３：１の比で同時トランスフェクトした。
（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション）
指数関数的に成長しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ培養培地を使用したＴフラスコ中で接着単層培養物として細胞を成長させ、５０％と８０％との間のコンフルエントに到達した場合にトランスフェクトした。Ｔ７５フラスコのトランスフェクションのために、トランスフェクションの２４時間前にＦＣＳ（最終１０％Ｖ／Ｖ）、２５０μｇ／ｍｌネオマイシンを補足した１４ｍｌＤＭＥＭ培養培地中に８００万個の細胞を播種し、細胞を、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに置いた。トランスフェクトすべき各Ｔ７５フラスコのために、４７μｇの全プラスミドベクターＤＮＡと２３５μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液との混合および最終体積４６９μｌの水の添加によって、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２、および水を含む溶液を調製した。この溶液に、４６９μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を添加し、直ちに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。上清を２％ＦＣＳで補足した１２ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ７５を添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で約１７〜２０時間インキュベートし、その後培地を１２ｍＭ ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。非改変（非糖操作）抗体の産生のために、細胞を抗体発現ベクターのみでトランスフェクトした。糖操作抗体の産生のために、細胞を、２つのプラスミド（一方は抗体発現用であり、他方は融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用）をそれぞれ４：１の比で同時トランスフェクトした。トランスフェクションから５日後に、上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後４０００ｒｐｍで１０分間第２の遠心分離を行い、４℃に保持した。
（組換え抗ＣＤ２０抗体を発現する安定な哺乳動物細胞株の作製）
ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ２１−１３ｃ）を、エレクトロポレーションによってネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを含むｐＥＴＲ１５０２ Ｃ２Ｂ８抗体発現ベクターでトランスフェクトした。ネオマイシン耐性クローンを、ｐＥＴＲ１５０２ベクターＤＮＡを染色体に組み込んだ１組のクローンを得るために最初に選択した。次いで、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して組換え抗体産生についてクローンをスクリーニングした。簡単に述べれば、２４時間のエレクトロポレーション後、生存細胞を計数し、ｐＥＹＦＰ発現ベクターを用いて行った並行コントロールエレクトロポレーションによる蛍光細胞の計数によってトランスフェクション効率を決定した。１０％ＦＣＳおよび１ｍｇ／ｍｌのネオマイシンを含むＩｎｖｉｔｒｕｓ選択培地で細胞を希釈した。通常８つの９６ウェルプレートに、異なる濃度の生きたトランスフェクション細胞（１×１０３、５×１０２、および１×１０２細胞／ウェル）を播種し、クローンを同定することができるまで３７℃でインキュベートした。一旦クローンがほぼコンフルエントまで成長すると、ＥＬＩＳＡによって抗体産生のため上清を分析した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを最初に２４ウェルに拡大し、その後６ウェルプレートに拡大し、その後Ｔ２５フラスコに拡大した。Ｔ２５フラスコでの５日間の成長後、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して最終抗体力価を決定した。このエレクトロポレーションおよび選択手順を使用して、上記培養条件下で１３μｇ／ｍｌの抗体を産生したＣ２Ｂ８抗ＣＤ２０抗体発現ＢＨＫ細胞クローン（ＢＨＫ−１５０２−２８）を単離した。
（組換え抗ＣＤ２０抗体およびＧｎＴＩＩＩ融合物を発現する安定な哺乳動物細胞株の作製）
クローンＢＨＫ−１５０２−２８、構成性発現抗ＣＤ２０モノクローナル抗体遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子を、エレクトロポレーションによってｐＥＴＲ１５３７発現ベクターでトランスフェクトした。ｐＥＴＲ１５３７は、ＭａｎＩＩ−ＧｎｔＩＩＩ遺伝子およびヒトＣＤ４の短縮形態の構成性発現のためのベクターであり、後者はＩＲＥＳ依存性で発現する。ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットも含む。ｐＥＴＲ１５３７ベクターＤＮＡを染色体に組み込んだ１組のクローンを得るためにピューロマイシン耐性クローンを最初に選択した。次いで、バイシストロン性ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ＋ｔＣＤ４遺伝子発現単位の発現レベルについてのマーカーとして作用する短縮ＣＤ４（ｔＣＤ４）の表面発現についてクローンをスクリーニングした。選択したクローンの組換え抗体産生をＥＬＩＳＡアッセイを使用して検証した。
簡単に述べれば、ｐＥＴＲ１５３７ベクターＤＮＡをＸｍｎＩで線状化した。ＥＹＦＰ発現ベクターでのコントロールトランスフェクションを並行して行った。２４時間後、全細胞に対するＥＹＦＰを発現する細胞の計数によってトランスフェクション効率を決定した。全細胞の５８％がＥＹＦＰを発現した。細胞生存率は９１％であった。トランスフェクションから１日後に、ｐＥＴＲ１５３７またはｐＥＹＦＰでトランスフェクトした細胞を、１００倍、５００倍、１０００倍、および５０００倍に連続希釈し、最終体積が０．２ｍｌの選択培地（Ｉｎｖｉｔｒｕｓ、１０％ＦＣＳ、２０μｇ／ｍｌピューロマイシン、１ｍｇ／ｍｌネオマイシン）を含む９６ウェルプレートに播種した。２週間後にクローンを視覚化した。これらを拡大し、短縮ＣＤ４（ｔＣＤ４）発現および抗体発現についてスクリーニングした。
ｔＣＤ４発現レベルのスクリーニングのために、約５００，０００個の細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５μｌのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と氷上で２０分間インキュベートした。２回の洗浄後、細胞を０．５ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳを使用して分析した（図１７Ａ〜Ｂ）。ｔＣＤ４の発現レベルの良好なクローンを単離した（ＢＨＫ−１５０２−２８−１１）。Ｔ２５フラスコでの５日間の成長後、ＥＬＩＳＡで決定したところ、約１７μｇ／ｍｌの最終体積で抗ＣＤ２０抗体が産生された。
（４．非改変抗体および糖操作抗体の産生および精製）
（培養培地の回収）
抗体発現ベクターでトランスフェクトしたか抗体発現ベクターおよびＧｎＴＩＩＩ融合発現ベクターで同時トランスフェクトしたＢＨＫ細胞の場合、トランスフェクションから９６時間のトランスフェクション細胞の培養後に培養上清を回収した。生産性の拡大に依存して、同一のベクターについていくつかのエレクトロポレーション（１０〜１５）を行った。
抗体発現ベクターでトランスフェクトしたか抗体発現ベクターおよびＧｎＴＩＩＩ融合発現ベクターで同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合、トランスフェクションから１６時間後に培養培地を新鮮な培養培地と置換し、その後トランスフェクトした細胞をさらに１２０時間培養した後に培地を回収した。
安定なＢＨＫ−１５０２−２８−１１細胞株のために、培養物を５００，０００細胞／ｍｌで播種し、細胞密度が１．７×１０６生細胞／ｍｌであり、且つ細胞生存率が６９％になった培養４日後に上清を回収した。
（抗体精製）
２つの連続クロマトグラフィ工程を使用して、培養上清からモノクローナル抗体を精製した。第１の工程は、ウシＩｇＧとヒトＩｇＧを有効に分離するｐＨ勾配溶離を使用したプロテインＡクロマトグラフィから構成された。これの後にサンプル緩衝液をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に交換する陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行った。
（５．オリゴ糖分析）
ＰＮＧアーゼＦ消化によってオリゴ糖をＰＶＤＦ膜上に固定されているか溶液中の抗体から酵素的に放出させた。
放出されたオリゴ糖を含む得られた消化物溶液を、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析のために直接調製するか、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析のためのサンプル調製前にＥｎｄｏＨグリコシダーゼでさらに消化した。
（ＰＶＤＦ膜固定抗体のためのオリゴ糖放出方法）
ＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて作製した９６ウェルプレートのウェルを１００μｌメタノールで湿らせ、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ｖａｃｕｕｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に適用した吸引を使用してＰＶＤＦ膜から液体を吸引した。ＰＶＤＦ膜を３００μｌの水で３回洗浄した。次いで、ウェルを、５０μｌＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６））で洗浄した。３０〜４０μｇの抗体を、１０μｌ ＲＣＭ緩衝液を含むウェルにロードした。ウェル中の液体を、吸引によって膜から取り出し、その後膜を５０μｌＲＣＭ緩衝液で２回洗浄した。５０μｌの０．１Ｍジチオスレイトールを含むＲＣＭの添加および３７℃で１時間のインキュベーションによってジスルフィド架橋を還元した。
還元後、吸引によってウェルからジチオスレイトール溶液を除去した。ウェルを３００μｌの水で３回洗浄し、５０μｌの０．１Ｍヨード酢酸を含むＲＣＭ緩衝液の添加および暗所の室温で３０分間のインキュベーションによってシステイン残基をカルボキシルメチル化した。
カルボキシルメチル化後、ウェルを吸引し、その後３００μｌの水で３回洗浄した。エンドグリコシダーゼの吸着を防止するために、１００μｌの１％ポリビニルピロリドン３６０水溶液の室温で１時間のインキュベーションによってＰＶＤＦ膜をブロッキングした。次いで、穏やかな吸引およびその後の３００μｌの水での３回の洗浄によってブロッキング試薬を除去した。
任意の潜在的な荷電モノサッカリド残基を除去するための２．５ｍＵペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（組換えＮ−グリコシダーゼ、ＧＬＹＫＯ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）および０．１ｍＵシアリダーゼ（ＧＬＹＫＯ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を含む全体積が２５μｌの２０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．０）の添加によってＮ結合オリゴ糖を放出させた。３７℃で３時間消化した。
（溶液中の抗体のオリゴ糖放出方法）
４０μｇと５０μｇとの間の抗体を、最終体積が２５μｌの２．５ｍＵのＰＮＧアーゼＦ（Ｇｌｙｋｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む２ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）と混合し、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。
（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ中性オリゴ糖ピークへのハイブリッド二分オリゴ糖の割り当てのためのＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のエンドグリコシダーゼＨ消化の使用）
その後ＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖をエンドグリコシダーゼＨ（ＥＣ３．２．１．９６）で消化した。ＥｎｄｏＨ消化のために、１５ｍＵのＥｎｄｏＨ（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＰＮＧアーゼＦ消化物（上記方法の抗体溶液）に添加して最終体積を３０μｌとし、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。ＥｎｄｏＨは、Ｎ結合オリゴ糖のキトビオースコアのＮ−アセチルグルコサミン残基間を切断する。この酵素は、オリゴマンノースのみおよびほとんどのハイブリッド型グリカンを消化するのに対して、複合型オリゴは加水分解されない。
（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ用サンプル調製）
放出オリゴ糖を含む酵素消化物を、最終濃度１５０ｍＭの酢酸の添加後に室内でさらに３時間インキュベートし、その後にｍｉｃｒｏ−ｂｉｏ−ｓｐｉｎクロマトグラフィカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にパッケージングした０．６ｍｌの陽イオン交換樹脂（ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂、水素形態、１００〜２００メッシュ、ＢｉｏＲａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を通過させて陽イオンおよびタンパク質を除去した。１μｌの得られたサンプルを、ステンレススチール製の標的プレートにアプライし、プレート上で１μｌのｓＤＨＢマトリクスと混合した。２ｍｇの２，５−ジヒドロキシ安息香酸および０．１ｍｇの５−メトキシサリチル酸を含む１ｍｌのエタノール／１０ｍＭ塩化ナトリウム１：１水溶液（ｖ／ｖ）の溶解によってｓＤＨＢマトリクスを調製した。サンプルを乾燥させ、０．２μｌエタノールをアプライし、最後にサンプルを大気下で再結晶させた。
（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）
質量スペクトルを獲得するために使用したＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ質量分析計は、Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。リニアモード（ｌｉｎｅａｒ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）、２０ｋＶでの加速、および８０ｎｓの遅延を使用してこの装置を操作した。イオンの質量数決定にオリゴ糖標準を使用した外部較正を使用した。最終スペクトルを得るために、２００回のレーザーショット由来のスペクトルをまとめた。
（６．ＰＢＭＣの調製）
製造者の説明書に本質的にしたがってＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８，ＵＳＡ）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。簡単に述べれば、ヘパリン処理シリンジを使用して血中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の比率を増加させるために１分間全力疾走するように指示したボランティアから静脈血を採取した。血液をＣａやＭｇを含まないＰＢＳで０．７５〜１．３倍に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に重層した。勾配を破壊することなく４００×ｇにて室温（ＲＴ）で３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含む境界相を回収し、ＰＢＳ（２つの勾配由来の細胞あたり５０ｍｌ）で洗浄し、ＲＴにおける３００×ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。ＰＢＳでのペレットの再懸濁後、ＰＢＭＣを計数し、ＲＴにおける２００×ｇで１０分間の遠心分離によって２回洗浄した。次いで、その後の手順のために細胞を適切な培地に再懸濁した。
（７．ＮＫ細胞の単離）
ＣＤ１６およびＣＤ５６陽性細胞に結合しない磁性ビーズを使用した負の選択手順を適用してＰＢＭＣからヒトＮＫ細胞を単離した（ＭＡＣＳ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ，５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，ＧＥＲ）。ＰＢＭＣを氷冷ＭＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳおよび２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で１回洗浄し、ＦＣＳおよびＭＡＣＳ緩衝液の１：１混合物に２０Ｍｉｏ細胞
／ｍｌで再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、１０００万個の細胞あたり８０μｌの１０％ＦＣＳを含むＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次いで、１０００万個の細胞あたり２０μｌハプテン−抗体溶液を添加した。チューブを繰り返し回転させながら４℃で１０分間細胞をインキュベートした。少なくとも１０倍の標識体積（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）でＭＡＣＳ緩衝液での２回の洗浄後、１０％ＦＣＳを含むＭＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、１０００万個の細胞あたり８０μｌおよび２０μｌの抗ハプテン−マイクロビーズを添加した。チューブを繰り返し回転させながら４℃で１５分間細胞をインキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝液での１回の洗浄後、５００μｌＭＡＣＳ緩衝液中に１億個までの細胞を再懸濁し、ＭＩＮＩ−ＭＡＣＳマグネット中に置き、３ｍｌＭＡＣＳ緩衝液で平衡化したＬＳ ＭＡＣＳカラムにロードした。カラムを、３×３ｍｌ ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。通過画分中の細胞を回収し、その後ＮＫ細胞として使用した。ＣＤ５６発現によって決定された純度は、８８〜９５％であった。
（８．ＡＤＣＣアッセイ）
エフェクター細胞としてＰＢＭＣまたはＮＫを上記のように調製した。ＰＢＭＣ細胞およびＮＫ細胞のエフェクター：標的比はそれぞれ２５：１および１０：１であった。丸底９６ウェルプレートのウェルあたり５０μｌを添加するために、適切な濃度のＡＩＭ−Ｖ培地中にエフェクター細胞を調製した。Ｃ２Ｂ８抗体の標的細胞は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで成長させたＳＫＷ６．４またはＮａｍａｌｗａＢリンパ腫細胞であった。標的細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、マイクロウェルあたり１００μｌに３０，０００個の細胞を添加するためにｍｌあたり３０万個の細胞をＡＩＭ−Ｖ中に再懸濁した。抗体をＡＩＭ−Ｖで希釈し、５０μｌを予めプレートした標的細胞に添加し、ＲＴで１０分間標的に結合させた。次いで、エフェクター細胞を添加し、プレートを５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下にて３７℃で４時間インキュベートした。細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した損傷細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出の測定によって標的細胞の死滅を評価した。４時間のインキュベーション後、プレートを８００×ｇで遠心分離した。各ウェル由来の１００μｌの上清を、新しい透明な平底９６ウェルプレートに移した。ウェルあたり１００μｌのキットの呈色基質緩衝液を添加した。呈色反応物のＶｍａｘ値を、ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ９４０８９，ＵＳＡ）を使用した少なくとも１０分間の４９０ｎｍのＥＬＩＳＡリーダーで決定した。標的細胞およびエフェクター細胞のみを含むが抗体を含まないウェルからの自発的ＬＤＨ放出を測定した。標的細胞および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを含むウェル由来の最大放出を決定した。特異的抗体媒介死滅率を以下のように計算した：（ｘ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）＊１００（式中、ｘは特異的抗体濃度でのＶｍａｘの平均であり、ＳＲは自発的放出のＶｍａｘの平均であり、ＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である）。
（９．ＮＫ細胞へのＦｃγＲＩＩＩＡの結合）
新たに単離したＮＫ細胞を、２００×ｇで５分間遠心分離し、ＮＫ細胞関連ＩｇＧを除去するために室温での３×１０５細胞／ｍｌの５分間インキュベーションによって０．０９％（ｗｔ／ｖｏｌ）乳酸溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ３．９））で予め処理した（Ｄｅ Ｈａａｓ Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２９４８（１９９６））。
ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウムで細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ、０．１５ ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム中での濃度を２×１０６細胞に調整した。５×１０５細胞を、０、０．１、０．３、１、３、１０μｇ／ｍｌの抗体変異型と４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、２００倍希釈のフルオレセインイソチオシアネート抱合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）および５μｌ／５×１０５細胞の抗ヒトＣＤ５６−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）との４℃で３０分間のインキュベーションによって抗体結合を検出した。（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−２６７４０（２００２））。
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）においてＣＤ５６＋細胞についての結合抗体変異型を参照した蛍光強度を決定した。
（１０．Ｒａｊｉリンパ腫細胞へのＦｃγＲＩＩｂの結合）
ＲａｊｉＢ細胞ヒトリンパ腫細胞を、ＰＢＳ（０．３Ｍｉｏ細胞／ｍｌの濃度）にて３７℃で２０分間洗浄した。次いで、細胞を、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３中に２２２万細胞／ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳチューブあたり１８０μｌを添加した。１０倍希釈（０、０．１、０．３、１、３、１０、３０μｇ／ｍｌ）のＬ１９非改変およびＬ１９糖操作モノクローナル抗体をＲａｊｉ細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした（最終細胞濃度は２００万個の細胞／ｍｌ）。２回の洗浄後、２００倍希釈のフルオレセインイソチオシアネート抱合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。１回の洗浄後、細胞を、０．５ｍｌＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において生細胞についての結合抗体変異型を参照した蛍光強度を決定した。
（１１．補体依存性細胞傷害性アッセイ）
標的細胞を計数し、ＰＢＳで洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１００万細胞／ｍｌに再懸濁した。平底９６ウェルプレート中のウェルあたり５０μｌの細胞をプレートした。ＡＩＭ−Ｖ中に抗体希釈物を調製し、細胞に５０μｌを添加した。室温で１０分間抗体を細胞に結合させた。ヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ）を新たに解凍し、ＡＩＭ−Ｖで３倍に希釈し、ウェルに５０μｌを添加した。製造者が説明するようにウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を調製し、ＡＩＭ−Ｖで３倍に希釈し、ウェルに５０μｌを添加した。コントロールとして、アッセイへの添加前に補体供給源を５６℃で３０分間加熱した。
アッセイプレートを、３７℃で２時間インキュベートした。ＬＤＨ放出の測定によって標的細胞の死滅を評価した。簡単に述べれば、３００×ｇで３分間プレート遠心分離した。ウェルあたり５０μｌの上清新規の９６ウェルプレートに移し、細胞傷害性キット（Ｒｏｃｈｅ）由来の５０μｌのアッセイ試薬を添加した。ＥＬＩＳＡリーダーでの速度の測定によって、上清中のＬＤＨ濃度に対応するＶｍａｘを決定した。１％ＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００の存在下での細胞のインキュベーションによって最大放出を決定した。
（結果と考察）
抗体遺伝子発現のためのベクターおよびＧｎＴＩＩＩ活性を有する種々のポリペプチドをコードする遺伝子の発現のためのベクターでの哺乳動物細胞培養物の同時トランスフェクションによって、抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（リツキシマブとしても公知のＣ２Ｂ８キメラ抗体）の糖操作バージョンを産生した。抗体遺伝子発現のためのベクターのみでの哺乳動物細胞のトランスフェクションによって同一の抗体の非改変（非糖操作）バージョンを産生した。トランスフェクション細胞を培養物中で少なくとも３日間保持し、分泌された組換え抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって培養培地から精製した。ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、このようなポリペプチドを産生しない細胞と比較して、細胞生存率、細胞成長、または抗体産生に対していかなる有意な効果もなかった。
次いで、精製抗体をそのグリコシル化パターンについて分析した。これらの抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＡｓｎ２９７残基のみに結合したＮ結合オリゴ糖を有する。ＰＮＧアーゼＦ消化によってオリゴ糖を抗体から酵素的に除去し、その後ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。この技術を使用して、全ての元のＦｃ−オリゴ糖集団内の異なるオリゴ糖腫の画分を決定することが可能であり、スペクトル中の異なるピークに構造を割り当てることも可能である（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。
図１は、ＢＨＫ細胞で産生された組換えＣ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体由来の中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳプロフィールを示す。これらの細胞を、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１５０２でトランスフェクトした。図２〜４は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で操作したＢＨＫ細胞によって産生された同一の抗体についての対応するプロフィールを示す。図２のプロフィールは、ベクターｐＥＴＲ１１６６から発現した野生型ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸の使用に起因する。図３のプロフィールは、ＧｎＴＩＩＩのＣ末端触媒ドメインに融合したＧｎＴＩの局在化ドメインをＮ末端に含む融合ポリペプチドをコードする核酸の使用に起因する。この融合遺伝子をベクターｐＥＴＲ１４２５から発現した。図４のプロフィールは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインに融合したゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）の局在化ドメインをＮ末端に含む融合ポリペプチドをコードする核酸の使用に起因する。この融合遺伝子をベクターｐＥＴＲ１５０６から発現した。
非改変抗体は、ｍ／ｚ比が１４８５、１６４８、および１８１０のピークはそれぞれ０、１つ、および２つのガラクトース残基を有する二触覚型のコアフコシル化複合オリゴ糖と一致する典型的なオリゴ糖プロフィール（図１）を有する。ＣＨＯおよびマウス骨髄腫細胞などの他の標準的な哺乳動物の産業用細胞株で産生された非操作ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域オリゴ糖について類似のプロフィールが見出されている（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２（１９９５））。野生型ＧｎＴＩＩＩの発現による抗体産生細胞の操作によって主に二分コアフコシル化複合二触覚型オリゴ糖が得られ（図２）、ｍ／ｚ比が１６８９、１８５１、および２０１４のピークは、非改変抗体中で見出された非二分フコシル化オリゴ糖ピークの二分化対照物である。ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインがＧｎＴＩゴルジ局在化ドメインによって局在化された、ＧｎＴＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸の発現による抗体産生細胞の操作により、主に二分複合二触覚型オリゴ糖が得られる（図３におけるｍ／ｚでのピークが１６８９および１８５１であることに留意のこと）。しかし、野生型ＧｎＴＩＩＩと比較して、ＧｎＴＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物の使用により、二分非フコシル化構造および二分ハイブリッド構造が増加する（図２と図３との間の全てと比較したｍ／ｚが１６６４、１８１０、１８２６、および１９７３のピークの比率）。一旦オリゴ糖がＧｎＴＩＩＩ触媒反応を介して付加した二分ＧｌｃＮＡｃで改変されると、これら３つの他の酵素はもはや二分オリゴ糖を改変することができないので、二分非フコシル化構造および二分ハイブリッド構造の合成は、組換えＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインと、（ｉ）内因性コアα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、（ｉｉ）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）、および（ｉｉｉ）ＧｎＴＩＩとの間のＧｎＴＩ改変オリゴ糖基質の競合に起因する。したがって、ＧｎＴＩＩはＮ結合オリゴ糖生合成経路中のＭａｎＩＩの下流で作用するので、二分ＧｌｃＮＡｃの付加によるＭａｎＩＩの遮断作用によってもＧｎＴＩＩが有効に遮断される。ｍ／ｚが１６６４および１８２６のピークは非フコシル化されるのに対して、ｍ／ｚが１８１０および１９７３のピークはフコシル化されている。ハイブリッドと複合オリゴ糖とを区別することができるＥｎｄｏＨグリコシダーゼ消化を使用して（図８Ａ）、これらのピークの増加がＦｃ結合二分非フコシル化オリゴ糖および二分ハイブリッドオリゴ糖の比率の増加に起因することを確認した（以下を参照のこと）。
ここで使用した他のＧｎＴＩＩＩ活性コード核酸と対照的に、ＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介してＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインが局在しているＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸（配列番号１４）の発現による抗体産生細胞の操作によって、主に二分非フコシル化ハイブリッド構造および二分ハイブリッド構造が得られる（図４のｍ／ｚ１６６４ １８１０、１８２６、および１９７３のピークに留意のこと）。したがって、野生型ＧｎＴＩＩＩおよびＧｎＴＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物（配列番号１２および１３）と比較して、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物は、Ｆｃ結合二分非フコシル化ハイブリッドオリゴ糖および二分ハイブリッドオリゴ糖の合成でより有効であった（図２、３、４における全ピークと１６６４および１８１０のｍ／ｚのピークの比率を比較のこと）。野生型ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴ−ＧｎＴＩＩＩ融合物、およびＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物をコードする核酸の発現由来の二分非フコシル化Ｆｃ−オリゴ糖の比率は、それぞれ４％、１３％、および３３％であった。非改変（非操作）抗体では二分オリゴ糖は検出されなかった。
抗体産生細胞中のＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合構築物の発現の増加によって、二分非フコシル化オリゴ糖の比率が増加する。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中でのエピソーム複製のためのＯｒｉＰを含むベクター（ｐＥＴＲ１５１９）からのＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ構築物の発現によってこれを証明した。この発現系は、高レベルで発現することが公知であり、ベクターｐＥＴＲ１５２０由来の抗体遺伝子発現のためにも使用した。この系で高レベルで発現した精製非改変（非糖操作）抗体由来のオリゴ糖プロフィールを図５に示し、これは、０、１つ、および２つのガラクトース残基を有する非二分フコシル化オリゴ糖ピークを有する典型的なオリゴ糖プロフィールを再度示す（例えば、ＢＨＫ細胞で発現された非改変抗体の類似のオリゴ糖プロフィールまたはＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞でのより高いレベルのプロフィールを示す図１および図５と比較のこと）。この系でより高いレベルで発現したＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物をコードする核酸での抗体産生細胞の操作によって、Ｆｃ−オリゴ糖の大部分が二分され非フコシル化されている抗体が産生された（ｍ／ｚが１６６４および１８２６の二分非フコシル化ハイブリッドオリゴ糖ピークで全オリゴ糖の９０％以上を構成する図６を参照のこと）。
上記のように、エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用して、ＭＡＬＤＩプロフィールで認められた異なるオリゴ糖への二分非フコシル化および二分ハイブリッド構造の割り当てを確認した。ＧｎＴＩＩＩ（Ｍ２）過剰発現によって糖操作されたＨＥＫ２９３細胞によって産生された抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体由来のＰＮＧアーゼＦおよびＰＮＧアーゼＦ＋ＥｎｄｏＨ消化グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ中性オリゴ糖プロフィールを図７に示す。ｍ／ｚ １６６４のピークを、２つの異なるグリカン（すなわち、非フコシル化ハイブリッド二分型または非フコシル化複合体非二分型）に割り当てることができる。異なる構造は同一のモノサッカリド組成のために同一のｍ／ｚ比を示す（図８Ｂ）。
エンドグリコシダーゼＨでのＰＮＧアーゼＦ放出グリカンの消化により、主ピークがｍ／ｚ １６６４から１４６０にシフトした新規の構造が得られる（図７Ｂ）。この相違は、ＧｌｃＮＡｃ残基の質量に対応する。上記のように、ＥｎｄｏＨは、複合体型オリゴ糖を切断することができない。したがって、エンドグリコシダーゼＨ消化後に、ｍ／ｚ １６６４の主ピークを、非フコシル化ハイブリッド二分型に割り当てることができる。
他のピークを、複合体またはハイブリッド二分グリカンに割り当てることができる。ＥｎｄｏＨ消化後にピークは消滅するので、ｍ／ｚ １８１０に構造をフコシル化ハイブリッド二分型に割り当てることができる。ｍ／ｚ １８１０ピークから１つのＧｌｃＮＡｃおよび１つのフコース（コアα−１，６フコシル化還元末端ＧｌｃＮＡｃ残基由来）を差し引いてｍ／ｚ １４６０の構造が得られる。ＥｎｄｏＨ消化によるｍ／ｚ １５０２のピークの消滅（ＧｌｃＮＡｃ残基の消滅）およびｍ／ｚ １２９８のピークの出現は、１５０２ピークを非フコシル化ハイブリッド二分型に割り当てることができることを示す。ＥｎｄｏＨ消化後のｍ／ｚ １６４７のピークの消滅は、このピークがフコシル化ハイブリッド二分構造であることを示す。１つのＧｌｃＮＡｃおよび１つのフコース残基の除去により、ｍ／ｚ １２９８の構造が得られる。ｍ／ｚ １８２６のピーク（非フコシル化ハイブリッド二分型）を、ＥｎｄｏＨによって消化した。これにより、ｍ／ｚ １６２２の構造が得られた。ＥｎｄｏＨ消化後のｍ／ｚ １０５３のピークを、ＥｎｄｏＨによって消化された高マンノース型（１２５７ｍ／ｚ）に割り当てることができる。予想どおり、ｍ／ｚ １６８９のピーク（複合二分型）はＥｎｄｏＨ消化の影響をうけなかった。合成では、表１で得られたデータから、８８％のオリゴ糖構造が二分ＧｌｃＮＡｃを有し、その６０％が非フコシル化ハイブリッド二分構造、２２％がフコシル化ハイブリッド二分構造、６％がフコシル化複合体二分オリゴ糖構造であると結論づけた。
（表１：オリゴ糖の指定）
Figure 2010233578
質量平衡（モル画分を％で示す）
ａ）ｍ／ｚ １５０２および１６４７のピーク：７＋７％＝１４％（予想）両ピークのＥｎｄｏＨ消化によりｍ／ｚ １２９８が得られる（ＥｎｄｏＨ後に１３％得られた）。
ｂ）ｍ／ｚ １６６４および１８１０のピーク：４９＋１３％＝６２％。ＥｎｄｏＨによりｍ／ｚ１４６０が得られる（６０％得られた）。
ｃ）ｍ／ｚ １８２６および１９７２のピーク：４＋３％＝７％。ＥｎｄｏＨによりｍ／ｚ １６２２が得られる（７％）。
まとめ、構造の全相対的比率
二分ＧｌｃＮＡｃ含有率：８８％
非フコシル化ハイブリッド二分型：６０％
フコシル化ハイブリッド二分型：２２％
フコシル化複合体二分型：６％
上記データ（図１〜６）は、ＧｎＴＩＩＩ発現レベルおよびＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインをゴルジにターゲティングするために使用する特定の局在化ドメインが共に組換えＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインと内因性コアα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、（ＭａｎＩＩ）、およびＧｎＴＩＩ酵素の間のＧｎＴＩ改変オリゴ糖基質の競合に影響を与えることを示す。ＧｎＴＩＩＩ発現が高いほど、この競合において、より高レベルの二分ハイブリッドおよび二分非フコシル化オリゴ糖ならびに二分複合体および二分フコシル化オリゴ糖レベルの同時減少を支持する。このことは、野生型ＧｎＴＩＩＩについて以前にも留意されていた（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。さらに、類似の全二分オリゴ糖レベルが得られるにもかかわらず、ＧｎＴＩまたはＭａｎＩＩ局在化ドメインを介したＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインの局在により、野生型ＧｎＴＩＩＩと比較して、内因性コアα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、ＭａｎＩＩ、およびＧｎＴＩＩ酵素とＧｎＴＩ改変オリゴ糖基質をより有効に競合する。
野生型ＧｎＴＩＩＩと比較して、二分ハイブリッドおよび二分非フコシル化オリゴ糖の合成についてのＧｎＴＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合のより高い有効性を、ＧｎＴＩＩＩと比較したＧｎＴＩの糖タンパク質基質輸送のシスからトランスへの方向へのより早期のゴルジ分布によって説明することができる。ＧｎＴＩおよびＭａｎＩＩの優れたゴルジ分布は、定量的免疫電子顕微鏡法によって以前に決定されていた（Ｒａｂｏｕｉｌｌｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８：１６１７−２７（１９９５））。両酵素はトランス側の槽と比較して中央でより高いレベルでゴルジに沿って同時分布しており、主にゴルジ層板の中央およびトランス側の槽に局在している。コアα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩおよび野生型ＧｎＴＩＩＩの優れた定量的空間分布は依然として決定されていない。しかし、ＧｎＴＩおよびＭａｎＩＩが共にゴルジ小区画に沿った同一の空間的分布を有するので、上記は何故二分ハイブリッドおよび二分非フコシル化オリゴ糖合成についてＭｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物がＧｎＴＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物よりも有効なのかを説明していない。
より高いＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合効率は、中央およびトランス側のゴルジ槽の物理的小区画内の比較的組織化された機能的グリコシル化反応小区画の存在を示す。いわゆる「中央ゴルジグリコシル化酵素」であるＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、およびＭａｎＩＩは、高分子量複合体としてゴルジ中に存在すると考えられる。しかし、局在化ドメインによりこれらの酵素がこれらの複合体の一部を形成する場合、これはＧＴＩ−およびＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物と同一である。ここで使用した全ＧｎＴＩＩＩ構築物によってＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩＩ反応の両方により大部分のオリゴ糖が改変されるので、組換えＧｎＴＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物の発現により、Ｆｃ−オリゴ糖合成に有意な任意の範囲に内因性野生型ＧｎＴＩ酵素を置換しなかった。
本発明者らのデータは、ＭａｎＩＩ局在化ドメインによって、内因性ＧｎＴＩの触媒ドメインと組換えＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合物との間でより優れた機能的対合が起こることを示す。拡散と比較して第１の反応生成物の第２の触媒部位への移行を支持する方法での生合成経路におけるその後の反応を触媒する酵素の組織化対合は、解糖およびポリケチド生合成などの他の生合成経路で起こることが公知である。ＧｎＴＩおよびＭａｎＩＩは、少なくともこれらの酵素のうちの１つが小胞体に再局在化する場合に「同族（ｋｉｎ）オリゴマー」を形成することが報告されている（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯＪ．１３（３）５６２−７４（１９９４））。これら２つの酵素の各ステム領域中の一対の荷電アミノ酸残基は、この同族認識に重要であることが見出された。ＧｎＴＩ中の残基は、ＭａｎＩＩ中の残基と反対の電荷であった。本発明者らは、Ｎ結合オリゴ糖生合成経路のこの部分に関与する他のゴルジグリコシル化酵素（すなわち、コアα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＭａｎＩＩの場合のように相補的電荷の代わりのＧｎＴＩと同一の電荷）、ＭａｎＩ、およびＧｎＴＩＩ）のステム領域の等価な位置に類似の残基を同定した。本発明者らは、これらの残基が種間で保存されていることも同定した。これらの残基は酵素によって形成された高分子量複合体への組み込みまたはゴルジ局在化に不可欠でないことが示唆されるにもかかわらず（Ｏｐａｔ，Ａ．Ｓ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１６）：１１８３６−４５（２００））、残基はオリゴ糖生合成時の触媒ドメインのより優れた対合に関与することが可能である。このような対合は不可逆である必要はないが、酵素間の一過性の動的相互作用によって媒介することができる。ステム領域または触媒領域のいずれかでの対合のさらなる決定要因が存在し得る。しかし、ＭａｎＩＩの触媒ドメイン由来の特異的ＧｎＴｉ−ＭａｎＩＩ対合への任意の寄与は、ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインを保有する組換え融合物で失われる。
図９〜１１は、異なる局在化ドメインを介してゴルジに局在化するＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の抗体産生細胞中での過剰発現に起因する抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加を示す。ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つＧｎＴＩゴルジ局在化ドメインを介してゴルジに局在化した組換えポリペプチド発現に起因するＡＤＣＣの増加を図９に示す。図９のＡＤＣＣアッセイのために使用したコントロール抗体のオリゴ糖プロフィールを図１に示す。図９のＡＤＣＣアッセイのために使用した糖操作抗体のオリゴ糖プロフィールを図３に示す。ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つグリコシダーゼ、ＭａｎＩＩ、ゴルジ局在化ドメインを介してゴルジに局在化した組換えポリペプチド発現由来のＡＤＣＣの増加を図１０に示す。図１０のＡＤＣＣアッセイのために使用したコントロール抗体のオリゴ糖プロフィールを図５に示す。図１０のＡＤＣＣアッセイのために使用した糖操作抗体のオリゴ糖プロフィールを図６に示す。
図１１は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介してゴルジに局在化した組換えポリペプチドの発現によってＧｎＴＩＩＩゴルジ局在化ドメインを有する野生型ＧｎＴＩＩＩポリペプチドの使用と比較してＡＤＣＣ活性が増加することを示す。野生型ＧｎＴＩＩＩの発現によって糖操作され、図１１のＡＤＣＣアッセイのために使用した抗体のオリゴ糖プロフィールを図２に示す。ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つＭａｎＩＩ局在化ドメインを介してゴルジに局在化し、図１１のＡＤＣＣアッセイのために使用した融合ポリペプチドの発現によって糖操作抗体のオリゴ糖プロフィールを図４に示す。これらのデータはまた、二分オリゴ糖（二分ハイブリッドおよび二分非フコシル化オリゴ糖が含まれる）を有する抗体が、複合体、フコシル化、非二分オリゴ糖を有する抗体と比較してＡＤＣＣ活性が増加することを示す。図１０のＡＤＣＣアッセイで使用したより活性の高い抗体の全ての二分オリゴ糖が二分非フコシル化ハイブリッドオリゴ糖であることに留意すべきである。前に記載のように、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つＭａｎＩＩ局在化ドメインを介してゴルジに局在化された融合ポリペプチドの使用によって、非フコシル化二分オリゴ糖がより有効に合成され、図１１は、これらの二分非フコシル化オリゴ糖レベルが増加した抗体がより低いレベルのこれらのオリゴ糖を有する抗体と比較してＡＤＣＣ中でより活性が高いことを示す。ＡＤＣＣ活性の増加は、Ｆｃ関連オリゴ糖集団内のこの二分非フコシル化オリゴ糖画分の増加と相関し、この画分が１５〜２０％を超えて存在する場合に非常に増加する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＡＤＣＣの重要なメディエーターであることが公知である。これらの細胞は、その表面にＣＤ１６ａとしても公知の活性化ＦｃγレセプターＩＩＩＡを有する。ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩＡレセプターへの標的細胞結合抗体のＦｃ領域の結合は、ＮＫ細胞上のこれらのレセプターの架橋およびその後のＡＤＣＣの誘導に不可欠である。したがって、本明細書中に記載の方法によって産生された抗体のＦｃレセプター（特に、ヒト免疫エフェクター細胞がこれらを表示する天然の形態のレセプター）への結合を評価することが重要である。図１２は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸の抗体産生細胞中での発現によって産生された糖操作抗体のヒト活性化ＦｃレセプターＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合親和性が増加したことを示す。ＡＤＣＣアッセイについて上記のように、これらの抗体は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドの抗体産生細胞中の発現に起因する二分非フコシル化オリゴ糖レベルが増加した。このアッセイで使用したＮＫ細胞は、そのＮＫ細胞上でＦｃγＲＩＩｃレセプターを発現しない遺伝子型のドナーに由来していた（Ｍｅｔｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５８（１−２）：８５−９５（２００１））。したがって、これらの細胞表面上のＦｃレセプターのみが活性化ＦｃγＲＩＩＩＡレセプターである。図１３は、結合アッセイがこのレセプターに対する特異的結合親和性を測定することを示す。ＦｃγＲＩＩＩ特異的遮断抗体フラグメント（３Ｇ８ Ｆａｂ２−フラグメント）との競合によってこれを示す。
抗腫瘍抗体療法の結果に対する増強されたＦｃ−ＦｃＲ相互作用の影響についての有力な証拠は、リツキシマブを投与したリンパ腫患者で見出された有効性とホモ接合性高親和性ＦｃγＲＩＩＩＡレセプター遺伝子型との間の相互作用に由来する（Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９９（３）：７５４−８（２００２））。これは、非常に増強された客観的応答速度および分子応答比率の増加が相関することが見出された１つのパラメーターであった。ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｆｃ相互作用の増加による有効性の増加は、種々の免疫細胞型（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、および樹状細胞が含まれる）によって果たされた機能に由来し得る。ＮＫ細胞、マクロファージ、および単球上での活性化ＦｃγＲＩＩＩＡレセプターの架橋により、ＡＤＣＣによる腫瘍細胞の溶解し（インビボでの主なＦｃＲ依存性死滅機構と広く考えられている）（Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９（１ Ｓｕｐｐｌ．２）：２−９（２００２），Ａｍｉｇｏｒｅｎａ Ｓ．，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５（１）：Ｆ１−３（２００２））、抗体依存性細胞食作用（Ｈａｚｅｎｂｏｓ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（６）：３０２６−３２（１９９８），Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｈｅａｒｄ，Ｃ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．４０（１）：２５−３５（２００１））、および腫瘍細胞近傍でのサイトカイン放出（Ｃａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３０１６−３０２５（２００１））が行われ得る。次いで、これらのサイトカインによって、腫瘍細胞に対する直接細胞傷害効果、酸素および栄養素の喪失によって腫瘍成長を阻害する抗血管形成効果、ならびに腫瘍細胞に対する活性Ｔ細胞媒介免疫応答の一部としての腫瘍抗原提示の増強を得ることができる。樹状細胞はＴ細胞への抗原提示に不可欠であり、その表面上（例えば、ＡＤＣＣを介したインビボで最初に攻撃される抗体結合死滅腫瘍細胞由来）へのＦｃγＲＩＩＩＡの架橋によって、樹状細胞の成熟、抗原取り込み、Ｔ細胞への提示、および細胞傷害性Ｔ細胞の交差プライミング（その後の抗腫瘍免疫の活性化に潜在的に非常に有効な機構）を増強することができる（Ａｍｉｇｏｒｅｎａ Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５（１）：Ｆ１−３（２００２），Ｋａｌｅｒｇｉｓ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５（１２）：１６５３−１６５９（２００２），Ｓｅｌｅｎｋｏ，Ｎ．ｅ．ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１２４−１３０（２００２））。免疫エフェクター細胞上のＦｃレセプターによる標的細胞結合抗体の架橋によって、例えば、標的−抗原分子の抗体媒介性架橋によって誘導されるアポトーシスを介して標的細胞の直接死滅を増加させることもできる（Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｈｅａｒｄ，Ｃ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．４０（１）：２５−３５（２００１），Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０１（３）：１０４５−１０５２（２００３））。これら全ての免疫エフェクター細胞のうち、ＮＫ細胞は単独でその表面上に活性化ＦｃγＲを有する。他の細胞型では、活性化ＦｃγＲＩＩＩＩは、阻害ＦｃγＲＩＩｂレセプターと共存し、抗腫瘍エフェクター機能の誘導は、阻害シグナルの活性化の正の均衡に起因する。
図１５は、Ｆｃレセプター結合の増加が阻害ＦｃγＲＩＩｂと比較して活性化レセプターに選択性を示すことを示す。上記で説明するように、このような選択性は、ＮＫ細胞以外の免疫細胞によって果たされるエフェクター機能に重要である。さらに、本明細書中に記載の方法を使用したＦｃ抗体領域の糖操作による結合の増加は、標準的な非改変抗体（図１６）を投与したホモ接合性高親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子型患者／ドナーで自然に見出され、且つ抗癌抗体の有効性の増加に既に関連している結合の増加よりも遥かに高い（Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９９（３）：７５４−８（２００２））。
活性化ＦｃγＲＩＩＩＢレセプターの結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＩＡの結合ドメインとほぼ同一である。したがって、上記データは、本明細書中に記載の糖操作抗体により、多形核（ＰＭＮ）細胞などのＦｃγＲＩＩＩＢを提示するエフェクター細胞によって媒介されるエフェクター機能（有毒生成物の放出および食作用が含まれる）を増加させることができることも示す（Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｈｅａｒｄ，Ｃ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ
Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．４０（１）：２５−３５（２００１），Ｄａｅｒｏｎ，ＦＭ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−３４（１９９７），Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｂｏｌｌａｎｄ Ｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５−９０（２００１））。
図１８は、懸濁液中で成長したＢＨＫ細胞から産生され、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する組換え抗体および融合ポリペプチドの両方の構成性高レベル発現のために操作された且つ抗ＣＤ２０抗体のオリゴ糖プロフィールを示す。オリゴ糖プロフィールは、融合ＧｎＴＩＩＩで操作した細胞由来の抗体の二分非フコシル化および二分ハイブリッドオリゴ糖レベルの増加を示す（表２も参照のこと）。これらの構造は、非糖操作ＢＨＫ細胞によって産生された非糖操作抗体では見出されない（図１を参照のこと）。ＧｎＴＩＩＩ融合物を発現する操作細胞は、懸濁液での正常な成長および良好な抗体産生性を示した。
安定なＢＨＫ−１５０２−２８−１１細胞株によって産生された糖操作モノクローナル抗体のオリゴ糖の相対的比率を表２に示す。
（表２）
Figure 2010233578
二分型の合計：８８．６％（４＋５＋６＋７＋８＋９＋１０＋１１＋１２）
非フコシル化二分型の合計：３７．８％（４＋５＋７＋９）
フコシル化二分型の合計：５０．８％（６＋８＋１０＋１１＋１２）
複合体二分型：１７％（６＋７＋１０＋１２）
ハイブリッド二分型：７１．６％（４＋５＋８＋９＋１１）
オリゴ糖分析は、構造の８８．６％が二分ＧｌｃＮＡｃ残基を有し、５０．８％がフコシル化型であり、３７．８％が非フコシル化型であることを示した。エンドグリコシダーゼＨでのＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖の消化は、得られたピークのほとんどがハイブリッド二分型であることを示した（図１９）。図２０は、ヒトＮＫ細胞上の活性化ＦｃレセプターＦｃγＲＩＩＩＡへのＢＨＫ−１５０２−２８−１１細胞株によって産生された糖操作抗体の結合親和性の増加を示す。懸濁液中で成長し、且つ抗体遺伝子および融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチドの両方を構成性に安定に発現する細胞株は、治療抗体の大量産生に理想的である。標準的な細胞操作方法を使用して、抗体遺伝子を含む細胞株への融合ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の移入、融合ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を含む細胞株（「前糖操作産生細胞株」）への抗体遺伝子の移入、または抗体およびＧｎＴＩＩＩ融合遺伝子の同時移入のいずれかによって糖操作を行うことができる。
ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つＭａｎＩＩ局在化ドメインを介してゴルジに局在化した融合ポリペプチドをコードする核酸の高レベル発現のために操作した細胞で産生されたＣＤ２０抗体も補体媒介性溶解（ＣＭＬ）（免疫エフェクター細胞上のＦｃレセプターに依存しない異なるエフェクター機能）について試験した。この糖操作抗体のオリゴ糖の大部分は、二分ハイブリッド非フコシル化型であった。非改変抗体と比較して、この抗ＣＤ２０抗体のＣＭＬ活性は減少した（図２１）。いくつかの適用のために、ＡＤＣＣが増加しているがＣＭＬが減少している抗体は、例えば、ＣＭＬによって媒介される腫瘍部位の血管中の脈管炎などの副作用を減少させるのに望ましい。抗ＣＤ２０抗体療法について他の有意なＣＭＬ媒介性副作用が認められている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｌｋ Ｌ．Ｅ．ｅｔ
ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５（４）：８０７−１１（２００１）。しかし、上記のオリゴ糖プロフィールは、二分ハイブリッド非フコシル化オリゴ糖の中間レベル（１５％超）が得られる中間の発現レベルでＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドを発現するが、糖操作抗体のＦｃオリゴ糖集団内に有意な複合オリゴ糖画分を有するように抗体産生細胞を操作することも可能であることも示す。このような複合オリゴ糖は、正常な減少していないＣＭＬレベルに関連する。したがって、データは、非操作抗体と比較して非常に類似したＣＭＬ活性レベルを維持する方法でＡＤＣＣが増加した抗体を産生することができることを示す。
ヒト上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）を認識するセツキシマブとしても公知の第２のキメラＩｇＧ１抗体Ｃ２２５を、本明細書中に記載の方法によって糖操作した。図２２は、非改変抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５およびこの抗体の糖操作バージョンのオリゴ糖プロフィールを示す。後者を、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つＭａｎＩＩ局在化ドメインを介してゴルジに局在化した融合ポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞中で産生した。図２３は、この糖操作に起因する抗ＥＧＦＲ抗体のＡＤＣＣの増加を示す。本明細書中に記載の方法によって産生し、ＡＤＣＣおよび活性化Ｆｃレセプターへの結合親和性が増加した糖操作抗体は、これらの抗体の対応する非改変（非糖操作）バージョンと比較してこれらの療法の有効性を増加させるはずであるので、癌および自己免疫疾患の抗体療法の有望な分子である。さらに、非改変抗体と比較して糖操作抗体の治療用量を減少させることが可能なはずであり、これは抗体産生の経済状況に肯定的な影響を与える。
（実施例２）
（慢性移植片対宿主病患者の免疫媒介性血小板減少症の治療）
慢性移植片対宿主病における自己免疫性血小板減少症は、慢性疾患を引き起こすＢ細胞調節異常の例である。慢性移植片対宿主病を有する被験体における免疫媒介性血小板減少症を治療するために、記載のように、本発明の方法によって調製し、且つＡＤＣＣが増加した抗ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体を被験体に投与する（Ｒａｔａｎａｔｈａｒａｔｈｏｒｏｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３３（４）：２７５−７９（２０００）（その内容全体が本明細書中で参考として援用される））。詳細には、抗体（３７５ｍｇ／ｍ２）を被験体に４週間毎週注入する。抗体療法により、末梢血中のＢ細胞が顕著に枯渇し、血小板関連抗体レベルが減少する。
（実施例３）
（重症免疫媒介性赤芽球癆および溶血性貧血の治療）
免疫媒介性後天性赤芽球癆（ＰＲＣＡ）は、他の自己免疫減少に頻繁に関連する稀な障害である。被験体の免疫媒介性後天性赤芽球癆を治療するために、記載のように、本発明の方法によって調製し、且つＡＤＣＣが増加した抗ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体を被験体に投与する（Ｚｅｃｃａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２：３９９５−９７（１９９７）（その内容全体が本明細書中で参考として援用される））。詳細には、ＰＲＣＡおよび自己免疫性溶血性貧血の被験体に、毎週抗体（３７５ｍｇ／ｍ２）を投与する。抗体療法後、静脈内免疫グロブリンを使用した代替治療を開始した。この治療によってＢ細胞が顕著に枯渇し、ヘモグロビンレベルの増加によって網状赤血球数が有意に増加する。
（実施例４）
（材料と方法）
（１．ＧａｌＴ融合発現ベクターの構築）
（ＧａｌＴの構成性発現用ベクター）
ＧａｌＴ発現ベクターの構築のために、ＰＣＲによってＧａｌＴ ｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅する。ウェスタンブロットによるＧａｌＴのその後の従来の検出のために、遺伝子の終止コドンのすぐ上流にＣ末端ｃ−ｍｙｃ−エピトープタグを付加した（アミノ酸配列：ＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）。ＧａｌＴの正確な配列の確認後、ＭＰＳＶプロモーターの調節下で遺伝子を挿入し、合成ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルを付加した。最終ＧａｌＴ発現ベクターは、選択のための個別のピューロマイシン耐性カセット、ＭＰＳＶプロモーターの調節下でのピューロマイシン耐性遺伝子、および合成ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルも含んでいた。
（ＧａｌＴの局在化ドメインをコードするアミノ酸のヒトＧｎＴＩの局在化ドメインをコードするアミノ酸への置換）
例えば、重複ＰＣＲ反応によってハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を構築し、ＭＰＳＶプロモーターの調節下でＧｎＴＩ−ＧａｌＴ融合物および選択用のピューロマイシン耐性カセットを含むプラスミドを得る。
（ＧａｌＴの局在化ドメインをコードするアミノ酸のヒトマンノシダーゼＩＩの局在化ドメインをコードするアミノ酸への置換）
ＧａｌＴ発現ベクターを構築する。得られたプラスミドは、ＭＰＳＶプロモーターの調節下でハイブリッドｍａｎＩＩ−ＧａｌＴ遺伝子を含む。
（ハイブリッドｍａｎＩＩ−ＧａｌＴ融合遺伝子とエプスタイン・バーウイルス由来の複製起点ｏｒｉＰとの組み合わせ）
実施例１に記載のように、ｏｒｉＰを有するＤＮＡフラグメントを上記のハイブリッドＭａｎＩＩ−ＧａｌＴ発現ベクターにサブクローン化する。
（ハイブリッドｍａｎＩＩ−ＧａｌＴ融合遺伝子と短縮ＣＤ４細胞表面マーカー遺伝子との組み合わせ）
短縮ＣＤ４細胞表面マーカー遺伝子のさらなる発現のために、発現ベクターを改変する。簡単に述べれば、ｍａｎＩＩ−ＧａｌＴ融合物の終止コドンの下流、ポリオウイルスＩＲＥＳエレメント、その後の短縮ヒトＣＤ４タンパク質をコードするｃＤＮＡ（分泌のためのヒトＣＤ４リーダー配列およびその後に膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含む）の挿入によって、ハイブリッドｍａｎＩＩ−ＧａｌＴ融合遺伝子発現カセットを、モノシストロン性発現カセットからバイシストロン性発現カセットに変換した。
（３．ＧａｌＴ融合および抗体発現ベクターでの哺乳動物細胞のトランスフェクション）
（ＢＨＫ細胞のトランスフェクション）
実施例１に記載のように、指数関数的に成長している細胞（生存率９０〜９５％）を培養し、回収し、その後トランスフェクトする。糖操作抗体の産生のために、細胞を、２つのプラスミド（一方は抗体発現用であり、他方は融合ＧａｌＴポリペプチド発現用）をそれぞれ３：１の比で同時トランスフェクトした。
（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション）
実施例１に記載のように、指数関数的に成長しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクトする。糖操作抗体の産生のために、細胞を、２つのプラスミド（一方は抗体発現用であり、他方は融合ＧａｌＴポリペプチド発現用）をそれぞれ４：１の比で同時トランスフェクトした。トランスフェクションから５日後に、上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後４０００ｒｐｍで１０分間第２の遠心分離を行い、４℃に保持した。
（組換え抗ＣＤ２０抗体およびＧａｌＴ融合物を発現する安定な哺乳動物細胞株の作製）
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を構成性に発現するクローンＢＨＫ−１５０２−２８をエレクトロポレーションにより発現ベクターでトランスフェクトした。ベクターによってＭａｎＩＩ−ＧａｌＴ遺伝子およびヒトＣＤ４の短縮形態が構成性に発現し、後者はＩＲＥＳ依存性に発現する。ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットも含む。ベクターＤＮＡを染色体に組み込んだ１組のクローンを得るためにピューロマイシン耐性クローンを最初に選択した。次いで、バイシストロン性ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴ＋ｔＣＤ４遺伝子発現単位の発現レベルについてのマーカーとして作用する短縮ＣＤ４（ｔＣＤ４）の表面発現についてクローンをスクリーニングした。選択したクローンの組換え抗体産生をＥＬＩＳＡアッセイを使用して検証した。
実施例１に記載のように、トランスフェクションおよびその後のｔＣＤ４発現レベルのスクリーニングを行う。
（４．非改変抗体および糖操作抗体の産生および精製）
抗体発現ベクターでトランスフェクトしたか抗体発現ベクターおよびＧａｌＴ融合発現ベクターで同時トランスフェクトしたＢＨＫ細胞の場合、トランスフェクションから９６時間のトランスフェクション細胞の培養後に培養上清を回収した。生産性の拡大に依存して、同一のベクターについていくつかのエレクトロポレーション（１０〜１５）を行った。
抗体発現ベクターでトランスフェクトしたか抗体発現ベクターおよびＧａｌＴ融合発現ベクターで同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合、トランスフェクションからおよそ１６時間後に培養培地を新鮮な培養培地と置換し、その後トランスフェクトした細胞をさらに１２０時間培養した後に培地を回収した。
安定なＢＨＫ−１５０２−２８−１１細胞株のために、培養物を５００，０００細胞／ｍｌで播種し、培養４日後に上清を回収した。
（抗体精製）
実施例１に記載のように、２つの連続クロマトグラフィ工程（プロテインＡクロマトグラフィおよび陽イオン交換クロマトグラフィ）を使用して、培養上清からモノクローナル抗体を精製した。
（５．オリゴ糖分析）
ＰＮＧアーゼＦ消化によってオリゴ糖をＰＶＤＦ膜上に固定されているか溶液中の抗体から酵素的に放出させた。
放出されたオリゴ糖を含む得られた消化物溶液を、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析のために直接調製するか、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析のためのサンプル調製前にＥｎｄｏＨグリコシダーゼでさらに消化した。ＰＶＤＦ膜固定抗体のためのオリゴ糖放出方法および溶液中の抗体のためのオリゴ糖放出方法を、実施例１に記載のように行う。
（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ中性オリゴ糖ピークへのハイブリッドガラクトシル化オリゴ糖構造の割り当てのためのＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のエンドグリコシダーゼＨ消化の使用）
実施例１に記載のように、その後ＰＮＧアーゼ放出オリゴ糖をエンドグリコシダーゼＨ（ＥＣ３．２．１．９６）で消化する。
（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）
実施例１に記載のように、放出オリゴ糖を含む酵素消化物を含むサンプルを調製し、その後ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析計を運転する。
（６．細胞の調製および単離）
製造者の説明書および実施例１に記載のプロトコールに本質的にしたがってＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８ ＵＳＡ）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製する。
実施例１に記載のように、負の選択手順を適用してＰＢＭＣからヒトＮＫ細胞を単離する。
（８．ＡＤＣＣアッセイ）
エフェクター細胞としてＰＢＭＣまたはＮＫを上記のように調製し、実施例１に記載の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイで細胞傷害性を媒介する能力についてアッセイする。
（９．ＮＫ細胞へのＦｃγＲＩＩＩＡの結合およびＲａｊｉリンパ腫細胞へのＦｃγＲＩＩｂの結合）
実施例１に記載のように、新たに単離したＮＫ細胞へのＦｃγＲＩＩＩＡの結合およびＲａｊｉリンパ腫細胞へのＦｃγＲＩＩｂの結合を決定する。
（１０．補体依存性細胞傷害性アッセイ）
実施例１に記載の方法にしたがって、抗体希釈物を使用して補体依存性細胞傷害性アッセイを行う。
（結果と考察）
ポリペプチドを産生しない細胞と比較した、細胞生存度、細胞成長、または抗体産生に対するＧａｌＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現の影響を証明するために、アッセイを行う。
実施例１に記載のようにＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによってそのグリコシル化パターンについて精製抗体を分析する。この技術を使用して、全ての元のＦｃ−オリゴ糖集団内の異なるオリゴ糖種の画分を決定することが可能であり、スペクトル中の異なるピークに構造を割り当てることも可能である（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。
非改変抗体のオリゴ糖プロフィールを決定する。詳細には、野生型ＧａｌＴの発現による抗体産生細胞の操作によって、主にガラクトシル化されたコアフコシル化複合体二触覚型オリゴ糖が得られるかどうかを決定する。ＧｌａＴ触媒ドメインがＧｎＴＩゴルジ局在化ドメインを介して局在化したＧａｎＴＩ−ＧａｌＴ融合ポリペプチドの発現による抗体産生細胞の操作によって野生型ＧａｌＴと比較して主にガラクトシル化複合二触覚性オリゴ糖が得られるかどうかも決定する。ガラクトシル化非フコシル化構造およびガラクトシル化ハイブリッド構造が合成される場合、これらはＧａｌＴと他のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼとの間の競合に起因し得る。一旦オリゴ糖がＧａｌＴ触媒反応を介して付加されたガラクトースで改変されると、α１，６−コアフコシルトランスフェラーゼ、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）、およびＧｎＴＩＩはもはやガラクトシル化オリゴ糖を改変することができないと予想される。
ハイブリッドと複合オリゴ糖を区別することができるＥｎｄｏＨグリコシダーゼ消化を使用して、Ｆｃ結合ガラクトシル化非フコシル化およびガラクトシル化ハイブリッドおよびガラクトシル化ハイブリッドオリゴ糖の比率を評価する。
ＧａｌＴ触媒ドメインがＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介して局在化されたＭａｎＩＩ−ＧａｌＴ融合ポリペプチドをコードする核酸の発現による抗体産生細胞の操作によって主にガラクトシル化非フコシル化およびガラクトシル化ハイブリッドが得られるかどうかを決定するために試験を行う。詳細には、野生型ＧａｌＴおよびＧｎＴＩ−ＧａｌＴ融合物と比較して、ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴ融合物がＦｃガラクトシル化非フコシル化およびガラクトシル化ハイブリッドオリゴ糖の合成でより有効であるかを決定する。
上記のように、エンドガラクトシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用して、ＭＡＬＤＩプロフィールで見出された異なるオリゴ糖ピークへのガラクトシル化非フコシル化およびガラクトシル化ハイブリッド構造の割り当てを確認するためにエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用する。ガラクトース残基を有するオリゴ糖ガラクトース残基のうち、非フコシル化ハイブリッド構造、フコシル化ハイブリッド、よびフコシル化複合オリゴ糖構造である構造の比率を決定する。
組換えＧａｌＴ触媒ドメインと内因性コアα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、ＭａｎＩＩ、およびＧｎＴＩＩ酵素との間のＧｎＴＩ改変オリゴ糖基質の競合に対するＧａｌＴ触媒ドメインをターゲティングするために使用するＧａｌＴ発現レベルおよび特定の局在化ドメインの影響を決定する。異なる局在化ドメインを介してゴルジに局在化したＧａｌＴ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の抗体産生細胞中での過剰発現に起因する抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）レベルを決定する。
ＧａｌＴ活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸の抗体産生細胞中での発現によって産生された糖操作抗体のヒト活性化ＦｃレセプターＦｃγＲＩＩＩＡまたは阻害ＦｃγＲＩＩｂへの結合親和性が増加したかどうかも決定する。
ＧａｌＴ構築物は、内因性コアα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を阻害し、抗体のＦｃ領域を糖操作し、結果的にＡＤＣＣが増加する。
懸濁液中で成長させ、且つＧａｌＴ活性を有する組換え抗体および融合ポリペプチドの両方を構成性に高レベルで発現するように操作したＢＨＫ細胞から産生された抗ＣＤ２０抗体のオリゴ糖プロフィールを決定する。安定なＢＨＫ−１５０２−２８−１１細胞株によって産生された糖操作モノクローナル抗体のオリゴ糖の相対的比率も決定する。
（実施例５）
（材料と方法）
（１．ＭａｎＩＩおよびＧｎＴＩ発現ベクターの構築）
ＭａｎＩＩ発現ベクターの構築のために、発現ベクタープラスミドのＭＰＳＶプロモーターの下流且つ合成ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルの上流にヒトマンノシダーゼＩＩｃＤＮＡ（配列番号１７）をサブクローン化した。ＧｎＴＩＩ発現のために、ヒトＣＭＶプロモーター／エンハンサーの下流且つウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの上流にサブクローン化したヒトＧｎＴＩＩ ｃＤＮＡと共に発現ベクタープラスミドを使用する。
（発現ベクターとエプスタイン・バーウイルス由来の複製起点ｏｒｉＰとの組み合わせ）
実施例１に記載のように、ｏｒｉＰを有するＤＮＡフラグメントを上記のＭａｎＩＩ発現ベクターにサブクローン化してＭａｎＩＩ発現ベクターｐＣＬＦ９を得た。実施例１に記載のように、ｏｒｉＰを有するＤＮＡフラグメントを上記のＧｎＴＩＩ発現ベクターにサブクローン化してＧｎＴＩＩ発現ベクターｐＧｎＴＩＩを得た。
（２．ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション）
実施例１に記載のように、指数関数的に成長しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクトした。非改変抗体「Ｃｗｔ」の産生のために、細胞を抗体発現ベクター（ｐＥＴＲ１５２０）でトランスフェクトした。糖操作抗体「Ｃｂｒｔ」の産生のために、細胞を、２つのプラスミド（一方は抗体発現（ｐＥＴＲ１５２０）および他方は融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現（ｐＥＴＲ１５１９））を４：１の比で同時トランスフェクトした。糖操作抗体「Ｃｍ」の産生のために、細胞を、３つのプラスミド（抗体発現（ｐＥＴＲ１５２０）、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現（ｐＥＴＲ１５１９）、およびマンノシダーゼＩＩ発現（ｐＣＬＦ９））を３：１：１の比で同時トランスフェクトした。糖操作抗体「Ｃｍｇ」の産生のために、細胞を４つのプラスミド（抗体発現（ｐＥＴＲ１５２０）、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現（ｐＥＴＲ１５１９）、マンノシダーゼＩＩ発現（ｐＣＬＦ９）、およびＧｎＴＩＩ発現（ｐＧｎＴＩＩ））を４：０．３３：０．３３：０．３３の比で同時トランスフェクトした。
（３．非改変抗体および糖操作抗体の産生および精製）
上記トランスフェクション細胞の培養培地を、トランスフェクションから約１６時間後に新鮮な培養培地と置換し、トランスフェクション細胞のさらに１２０時間の培養後にその後培地を回収した。回収した上清を、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、４０００ｒｐｍで１０分間第２の遠心分離を行い、４℃で保持した。
（抗体の精製）
実施例１に記載のように、２つの連続クロマトグラフィ工程（プロテインＡクロマトグラフィおよび陽イオン交換クロマトグラフィ）を使用して、培養上清からモノクローナル抗体を精製した。抗体ｃｗｔ７、ｃｂｒｔ５、およびｃｍ１のために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびリン酸緩衝化生理食塩水を使用したさらなるサイズ排除クロマトグラフィ工程を陽イオン交換工程後に加え、単量体抗体ピークを回収した。
（４．オリゴ糖分析）
実施例１に記載のように、ＰＮＧアーゼＦ消化によって溶液中で抗体からオリゴ糖が酵素的に放出された。
（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ中性オリゴ糖ピークへのハイブリッド二分オリゴ糖構造の割り当てのためのＰＮＧアーゼＦ放出オリゴ糖のエンドグリコシダーゼＨ消化の使用）
次いで、実施例１に記載のように、ＰＮＧアーゼ放出オリゴ糖をエンドグリコシダーゼＨ（ＥＣ ３．２．１．９６）で消化した。
（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）
実施例１に記載のように、放出オリゴ糖を含む酵素消化物を含むサンプルを調製し、その後ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析計を運転する。
（５．細胞の調製および単離）
製造者の説明書および実施例１に記載のプロトコールに本質的にしたがってＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８ ＵＳＡ）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製する。
（６．ＮＫ細胞の単離）
実施例１に記載の負の選択手順を適用して、ＰＢＭＣからヒトＮＫ細胞を単離した。
（７．ＡＤＣＣアッセイ）
エフェクター細胞としてＰＢＭＣを上記のように調製し、実施例１に記載の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイで細胞傷害性を媒介する能力についてアッセイする。
（８．ＮＫ細胞へのＦｃγＲＩＩＩＡの結合）
実施例１に記載のように、新たに単離したＮＫ細胞へのＦｃγＲＩＩＩＡの結合およびＦｃγＲＩＩｂの結合を決定する。
（９．補体依存性細胞傷害性アッセイ）
ヒト補体供給源の調製について以下のように修正した実施例１に記載の方法にしたがって、抗体希釈物を使用して補体依存性細胞傷害性アッセイを行う。簡単に述べれば、健常なボランティアの血液から正常ヒト血清（ＮＨＳ）を調製した。血液を１時間凝血させ、１２００ｇで２０分間遠心分離した。無細胞上清血清を等分し、８０℃で停止させた。２０％の最終アッセイ体積でＮＨＳを使用した。
（結果と考察）
抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体（リツキシマブとも呼ばれるＣ２Ｂ８キメラ抗体）の糖操作バージョンを、抗体遺伝子の発現ベクターおよびＧｎＴＩＩＩ活性およびマンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現ベクターでの哺乳動物細胞の同時トランスフェクションによって産生した。さらなる糖操作抗体バージョンを、抗体遺伝子発現用ベクターおよびＧｎＩＩＩ活性、マンノシダーゼＩＩ活性、およびＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現用ベクターでの哺乳動物細胞の同時トランスフェクション培養物によっても作製する。糖操作抗体「Ｃｂｒｔ」のために、細胞を、２つのプラスミド（抗体発現（ｐＥＴＲ１５２０）、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現（ｐＥＴＲ１５１９））で同時トランスフェクトした。糖操作抗体「Ｃｍ」のために、細胞を、３つのプラスミド（抗体発現（ｐＥＴＲ１５２０）、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現（ｐＥＴＲ１５１９）、およびマンノシダーゼＩＩ発現（ｐＣＬＦ９））で同時トランスフェクトした。糖操作抗体「Ｃｍｇ」のために、細胞を４つのプラスミド（抗体発現（ｐＥＴＲ１５２０）、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現（ｐＥＴＲ１５１９）、マンノシダーゼＩＩ発現（ｐＣＬＦ９）、およびＧｎＴＩＩ発現（ｐＧｎＴＩＩ））で同時トランスフェクトした。同一抗体の非改変（非糖操作）バージョン「Ｃｗｔ」を、抗体遺伝子発現用ベクターのみでの哺乳動物細胞のトランスフェクションによって産生した。トランスフェクション細胞を、培地中で５日間保持し、分泌された組換え抗体を培養培地から精製した。ＧｎＴＩＩＩおよびＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、このようなグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはグリコシダーゼポリペプチドを産生しない細胞と比較して、細胞生存度、細胞成長、または抗体産生に対して任意の有意な効果がなかった。
精製抗体をそのグリコシル化パターンについて分析した。これらの抗体は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７残基のみに結合するＮ結合オリゴ糖を有する。ＰＮＧアーゼＦ消化によってオリゴ糖を抗体から酵素的に除去し、その後ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。この技術を使用して、全ての元のＦｃ−オリゴ糖集団内の異なるオリゴ糖種の画分を決定することが可能であり、スペクトル中の異なるピークに構造を割り当てることも可能である（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。
図２６は、非改変組換えＣ２Ｂ８抗ＣＤ２０キメラＩｇＧ１抗体Ｃｗｔ由来の中性オリゴ糖ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳプロフィールを示す。実施例１（図５）に記載の非改変抗体に関して、Ｃｗｔは典型的なオリゴ糖プロフィールを有し、ｍ／ｚ比が１４８５、１６４８、および１８１０のピークは、０、１つ、および２つのガラクトース残基を有する二触覚型コアフコシル化複合オリゴ糖と一致する。ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインがＭａｎＩＩ
ゴルジ局在化ドメインを介して局在化されたＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸の発現による抗体産生細胞の操作によって、Ｆｃ−オリゴ糖の大部分が二分非フコシル化ハイブリッドである抗体（Ｃｂｒｔ）が産生された（図２７を参照のこと）。実施例１に記載するように、エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用して、ＭＡＬＤＩプロフィールで認められた異なるオリゴ糖ピークへの二分非フコシル化構造および二分ハイブリッド構造の割り当てを確認した。
ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインがＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介して局在化されたＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸およびＭａｎＩＩをコードする核酸の同時発現による抗体産生細胞の操作によって、Ｆｃ−オリゴ糖の大部分が二分非フコシル化複合体である抗体（Ｃｍ）が産生された（図２８を参照のこと）。ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインがＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介して局在化されたＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸およびＧｎＴＩＩをコードする核酸の同時発現による抗体産生細胞の操作によって、二分非フコシル化複合体画分が抗体Ｃｍの画分よりなお一層高いＦｃ結合オリゴ糖を含む、Ｆｃ−オリゴ糖の大部分が二分非フコシル化複合体である抗体（Ｃｍｇ）が産生される。
図２９は、ＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインがＭａｎＩＩゴルジ局在化ドメインを介して局在化され、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩコード核酸がそれ自体（抗体Ｃｂｒｔ）上で発現されるか抗体産生細胞中でＭａｎＩＩ（Ｃｍ）をコードする核酸ともに同時発現する、ＭａｎＩＩ−ＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドをコードする核酸の抗体産生細胞中での発現に起因する抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加を示すデータを示す。したがって、糖操作抗体のＦｃ領域中のハイブリッド型または複合体型のいずれかの二分非フコシル化オリゴ糖レベルの増加によってＡＤＣＣ活性が増加する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＡＤＣＣの重要なメディエーターであることが公知である。これらの細胞は、その表面にＣＤ１６ａとしても公知の活性化ＦｃγレセプターＩＩＩＡを有する。ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩＡレセプターへの標的細胞結合抗体のＦｃ領域の結合は、ＮＫ細胞上のこれらのレセプターの架橋およびその後のＡＤＣＣの誘導に不可欠である。したがって、本明細書中に記載の方法によって産生された抗体のＦｃレセプター（特に、ヒト免疫エフェクター細胞がこれらを表示する天然の形態のレセプター）への結合を評価することが重要である。図３０は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つそれ自体（抗体Ｃｂｒｔ）上で発現するかＭａｎＩＩ（Ｃｍ）をコードする核酸と共に抗体産生細胞中で同時発現する融合ポリペプチドをコードする核酸の抗体産生細胞中での発現によって産生された糖操作抗体のヒト活性化ＦｃレセプターＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合親和性が増加したことを示す。ＡＤＣＣアッセイについて上記のように、これらの抗体は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドの抗体産生細胞中の発現に起因する二分非フコシル化オリゴ糖レベルが増加した。
したがって、糖操作抗体のＦｃ領域中のハイブリッド型または複合体型のいずれかの二分非フコシル化オリゴ糖レベルの増加によってＡＤＣＣ活性が増加する。このアッセイで使用したＮＫ細胞は、そのＮＫ細胞上でＦｃγＲＩＩｃレセプターを発現しない遺伝子型のドナーに由来していた（Ｍｅｔｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５８（１−２）：８５−９５（２００１））。したがって、これらの細胞表面上のＦｃレセプターのみが活性化ＦｃγＲＩＩＩＡレセプターである。
活性化ＦｃγＲＩＩＩＢレセプターの結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＩＡの結合ドメインとほぼ同一である。したがって、上記データは、本明細書中に記載の糖操作抗体により、多形核（ＰＭＮ）細胞などのＦｃγＲＩＩＩＢを提示するエフェクター細胞によって媒介されるエフェクター機能（有毒生成物の放出および食作用が含まれる）を増加させることができることも示す（Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｈｅａｒｄ，Ｃ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ
Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．４０（１）：２５−３５（２００１），Ｄａｅｒｏｎ，ＦＭ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−３４（１９９７），Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｂｏｌｌａｎｄ Ｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５−９０（２００１））。
ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、且つＭａｎＩＩ局在化ドメインを介してゴルジに局在化した融合ポリペプチドをコードする核酸の発現のために操作した細胞で産生されたＣＤ２０抗体（Ｃｂｒｔ）も補体媒介性溶解（ＣＭＬ）（免疫エフェクター細胞上のＦｃレセプターに依存しない異なるエフェクター機能）について試験した。この糖操作抗体のオリゴ糖の大部分は、二分ハイブリッド非フコシル化型であった。非改変抗体Ｃｗｔと比較して、Ｃｂｒｔ抗体のＣＭＬ活性は減少した（図３１）。いくつかの適用のために、ＡＤＣＣが増加しているがＣＭＬが減少している抗体は、例えば、ＣＭＬによって媒介される腫瘍部位の血管中の脈管炎などの副作用を減少させるのに望ましい。抗ＣＤ２０抗体療法について他の有意なＣＭＬ媒介性副作用が認められている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｌｋ Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５（４）：８０７−１１（２００１）。しかし、抗体Ｃｍの場合、改変抗体と比較してＡＤＣＣ活性およびＦｃγＲＩＩＩ結合が増加しているが、ＣＭＬ活性が有意に減少している糖操作抗体を産生することが可能である（図３１）。このような抗体は、標的細胞の最大に排除するために高ＡＤＣＣおよび抗補体活性化とＣＭＬ活性の両方が必要な適用に望ましい。上記のオリゴ糖プロフィールは、ＭａｎＩＩ（抗体Ｃｍ）をコードする核酸またはＭａｎＩＩをコードする核酸およびＧｎＴＩＩ（抗体Ｃｍｇ）をコードする核酸と共にＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチドを同時発現することによってＦｃ結合オリゴ糖の大部分がハイブリッド型の代わりに二分非フコシル化複合体型である抗体を産生するように細胞を操作することが可能であることを示す。糖操作抗体はＡＤＣＣ活性およびＦｃγＲＩＩＩ結合親和性が増加し、この増加は二分非フコシル化オリゴ糖レベルの増加と相関する一方で、複合体オリゴ糖画分としてのこのＣＭＬ活性の増加はハイブリッドオリゴ糖画分と比較して増加する。
この例および前の例は、融合ポリペプチドがゴルジ複合体に局在化し、内因性フコシルトランスフェラーゼとＧｎＴＩ触媒反応を介して予め改変されたオリゴ糖レセプターを競合する触媒ドメインを有する、融合ポリペプチドコード核酸の発現を記載している。このような操作宿主細胞によって産生された組換え糖タンパク質は、非フコシル化オリゴ糖レベルが増加している。この例は、このような宿主細胞中でのＭａｎＩＩおよび／またはＧｎＴＩＩをコードする核酸の上記融合ポリペプチドコード核酸との同時発現によりハイブリッドオリゴ糖に代わる複合体への生合成の流れ（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｆｌｕｘ）が増加し、それによりＭａｎＩＩおよび／またはＧｎＴＩＩコード核酸を同時発現しない細胞中で産生された糖タンパク質と比較して非フコシル化複合体オリゴ糖レベルが増加した糖タンパク質が合成されることを示す。
（実施例６）
（α−マンノシダーゼの過剰発現）
（分子クローニング）
（ヒトα−マンノシダーゼＩＩ）
ＭＰＳＶプロモーターの調節下でのヒトα−マンノシダーゼＩＩ（「ｈＭａｎＩＩ」）（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１１４）をコードする核酸（配列番号１７）を、ＯｒｉＰエレメントを含む発現ベクター中でクローン化した。得られた発現ベクターｐＣＬＦ９を図３２Ａに示す。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードする発現ベクターは、それぞれ、ｐＥＴＲ１８４２およびｐＥＴＲ１８４３であった（図３２Ｂおよび３２Ｃ）。
（融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴ）
ｈＭａｎＩＩ ＣＴＳおよびヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン（Ｍ２２９２１、アミノ酸１２６〜３９７）からなる融合タンパク質（配列番号２０）を下記のように構築した。ＰＣＲによってｐＥＴＲ１４８４からｈＭａｎＩＩ ＣＴＳ領域を増幅した（ＣＦ３３，ＧＡＢ２５２）。ＧａｌＴの触媒ドメイン（アミノ酸１２６〜３９７）を、ＣＦ３１およびＣＦ３５を使用してｐＢｌｕｅＧａｌＴから増幅した。ｈＭａｎＩＩ ＣＴＳをＧａｌＴの触媒ドメインと組み合わせて、ＭＰＳＶプロモーターによって調節される融合タンパク質を得た（ｐＣＬＦ２４）。全ＧａｌＴ遺伝子をｐＢｌｕｅＧａｌＴから得た。ＧａｌＴをコードする遺伝子を配列決定した（配列番号１６）。
Figure 2010233578
ＧａｌＴの５’をＣＦ３２／ＣＦ３８を用いて増幅し、ＦｓｅＩ制限部位を遺伝子の前に付加した。配列決定によって配列を正確に見出し、ｐＣＬＦ２４中でＦｓｅＩ／ＤｒａＩＩＩ消化と交換した（ｐＣＬＦ２６）。ＯｒｉＰをｐＣＬＦ２４およびｐＣＬＦ２６に付加してそれぞれｐＣＬＦ２５およびｐＣＬＦ２７を作製した（図３３Ａおよび３３Ｂ）。
（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中でのα−マンノシダーゼおよびＭａｎＩＩ−ＧａｌＴの発現）
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、リン酸カルシウム法でトランスフェクトした。簡単に述べれば、Ｔ１５０のトランスフェクションのために、トランスフェクションの２４時間前に１５００万個の細胞を２８ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、２５０μｇ／ｍｌネオマイシンに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
トランスフェクトすべき各Ｔ１５０フラスコについて、９４μｇ全プラスミドベクターＤＮＡおよび４６９μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液の混合ならびに最終体積９３８μｌへの水の添加によってＤＮＡおよびＣａＣｌ２を含む水溶液を調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を添加し、直ちに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を２％ＦＣＳを補足した２４ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５０に添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で約１７〜２０時間インキュベートし、培地を３０ｍｌ ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳと置換した。
コアフコシルトランスフェラーゼ競合に対するα−マンノシダーゼＩＩの効果を試験するために、細胞を、それぞれ２：２：１の比のｐＥＴＲ１８４２、ｐＥＴＲ１８４３、およびｐＣＬＦ９でトランスフェクトした。融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴのために、細胞を、それぞれ２：２：１の比のｐＥＴＲ１８４２、ｐＥＴＲ１８４３、およびｐＣＬＦ２５でトランスフェクトした。トランスフェクションから５日後、上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後４０００ｒｐｍで１０分間第２の遠心分離を行い、濾過し、４℃で保持した。
（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の精製）
血清中に存在するウシ抗体からモノクローナル抗体を分離するための２工程クロマトグラフィ（第１のプロテインＡクロマトグラフィおよびその後のサンプルの緩衝液をＰＢＳに交換するための陽イオン交換クロマトグラフィを含む）によって、３０ｍｌの上清からモノクローナル抗体を精製した。
（オリゴ糖分析）
（ＰＮＧアーゼＦ消化）
モノクローナル抗体サンプル（５０μｇ）を、０．１ｍＵ／μｌのＮ−グリコシダーゼＦ（組換え体、Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とインキュベートした。２ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中にて３７℃で３時間消化した。次いで、放出された中性オリゴ糖を、１５０ｍＭ酢酸中にて室温で３時間インキュベートした。次いで、サンプルを、ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏ−ｓｐｉｎクロマトグラフィカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）にパッケージングした０．６ｍｌの陽イオン交換樹脂（ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂、水素形態、１００〜２００メッシュ、ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で脱塩した。
（ＥｎｄｏＨ消化）
ＰＮＧアーゼ放出オリゴ糖を、酢酸処理前にエンドグリコシダーゼＨ（ＥＣ３．２．１．９６，ＲＯＣＨＥ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（Ｎ結合オリゴ糖のキトビオースコアのＮ−アセチルグルコサミン残基間を切断する酵素）で消化した。この酵素は、オリゴマンノースおよびほとんどのハイブリッド型グリカンを消化するのに対して、複合型オリゴは加水分解されない。
オリゴ糖を、０．２ｍＵ／μｌエンドグリコシダーゼＨを含む２ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）で消化した。３７℃で３時間消化する。オリゴ糖を１５０ｍＭ酢酸中にて室温で３時間インキュベートし、その後にｍｉｃｒｏ−ｂｉｏ−ｓｐｉｎクロマトグラフィカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にパッケージングした０．６ｍｌの陽イオン交換樹脂（ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂、水素形態、１００〜２００メッシュ、ＢｉｏＲａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で脱塩した。
（マトリクスおよびサンプルの調製）
２ｍｇの２，５−ジヒドロキシ安息香酸＋０．１ｍｇの５−メトキシサリチル酸を含む１ｍｌのエタノール／１０ｍＭ塩化ナトリウムの１：１水溶液（ｖ／ｖ）の溶解によって２，５−ジヒドロキシ安息香酸マトリクス（ｓＤＨＢ）を調製した。１μｌのサンプルをステンレススチール製の標的にアプライし、１μｌのｓＤＨＢマトリクスを混合した。サンプルを風乾し、０．２μｌエタノールをアプライした。
（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ分析）
質量スペクトルを獲得するために使用したＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ質量分析計は、ディレイドエクストラクションを備えたＶｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。分析計はレフレクターモードで運転した。陽イオンを、７５ｎｓ遅延後に２０ｋＶに加速した。４０ショットの５つのスペクトル（２００ショット）を組み合わせて最終スペクトルを得た。イオンの質量数決定にオリゴ糖標準を使用した外部較正を使用した。
（オリゴ糖プロフィール）
ＭａｎＩＩの存在下で産生された抗ＣＤ２０抗体のオリゴ糖プロフィールを図３４に示す。抗体のＦｃ部分への結合が見出されたオリゴ糖は複合体構造であり、その４８％がコアフコースを欠く。α−マンノシダーゼＩＩはコアフコシルトランスフェラーゼと競合し、４８％の非フコシル化オリゴ糖構造が得られる。α−マンノシダーゼＩＩの非存在下では、抗体のＦｃ部分のオリゴ糖は、フコシル化構造のみから構成される（野生型抗体）。
融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴの存在下で産生された抗ＣＤ２０抗体のオリゴ糖プロフィールを、図３５Ａ〜Ｂに示す。α−マンノシダーゼＩＩに関して、融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴの場合でも、非フコシル化オリゴ糖構造が増加する。高非フコシル化構造率は、高マンノース構造にある（ｍ／ｚが１２５６、１４１９、および１５８１）。この６７％の非フコシル化糖に加えて、さらに３０％のハイブリッド非フコシル化構造が見出された（ｍ／ｚ１６２２）。したがって、融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴの存在下で産生されたサンプルは、ほぼ１００％の非フコシル化構造を示す。
（α−マンノシダーゼＩＩまたは融合タンパク質ＭａｎＩＩ−ＧａｌＴの存在下で産生された抗体の生物活性）
コアフコシルトランスフェラーゼの競合におけるα−マンノシダーゼＩＩ作用およびＭａｎＩＩ−ＧａｌＴ酵素作用の効果を決定するために、関連する生物学的アッセイを行った。インビトロ抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および操作ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−１７０８−３７）の表面上に発現するＣＤ１６レセプターへの結合についてサンプルを試験した。
（ＣＨＯ−１７０８−３７上のＩｇＧ結合）
細胞株ＣＨＯ−１７０８−３７は、その表面上にＦｃγＲＩＩＩＡレセプター（ＣＤ１６）およびＦｃγＲＩレセプターのγ鎖を発現した。ＦｃγＲＩＩＩＡレセプター（ＣＤ１６）の発現を、３Ｇ８−ＦＩＴＣモノクローナル抗体を使用したＦＡＣＳ分析によって評価した（図３６）。１Ｍｉｏ／ｍｌのＣＨＯ−１７０８−３７細胞を、三連の異なる濃度（１０、３、１、０．３、０．１μｇ／ｍｌ）の異なる抗体変異型を含む０．１％ＢＳＡを補足したＰＢＳ中でインキュベートした。細胞を４℃で３０分間インキュベートし、その後０．１％ＢＳＡを補足したＰＢＳで洗浄した。２００倍希釈のフルオレセインイソチオシアネート抱合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）との４℃で３０分間のインキュベーションによって抗体結合を検出した。生細胞をゲーティングしたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において結合抗体変異型を参照した蛍光強度を決定した。
結合アッセイ実験において以下の抗体変異型が含まれた。
Ｃｗｔ８（野生型Ｉ）
ＭａｎＩＩ（α−マンノシダーゼＩＩ）
α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）の存在下で産生された抗体は、野生型抗体よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡレセプターに結合する。
（インビトロ抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ））
製造者の説明書に本質的にしたがってＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８ ＵＳＡ）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。簡単に述べれば、ヘパリン処理シリンジを使用して血中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の比率を増加させるために１分間全力疾走するように指示したボランティアから静脈血を採取した。血液をＣａやＭｇを含まないＰＢＳで０．７５〜１．３倍に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に重層した。勾配を破壊することなく４００×ｇにて室温（ＲＴ）で３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含む境界相を回収し、ＰＢＳ（２つの勾配由来の細胞あたり５０ｍｌ）で洗浄し、ＲＴにおける３００×ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。ＰＢＳでのペレットの再懸濁後、ＰＢＭＣを計数し、ＲＴにおける２００×ｇで１０分間の遠心分離によって２回洗浄した。次いで、その後の手順のために細胞を適切な培地に再懸濁した。
Ｒａｊｉ標的細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ中に１Ｍｉｏ／ｍｌで再懸濁した。これらに、１００倍希釈のカルセインを添加し、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、ＡＩＭ−Ｖ中に０．３Ｍｉｏ／ｍｌで再懸濁した。この細胞懸濁液のうち、１００μｌを、丸底９６ウェルプレートのウェルに添加した。抗体をＡＩＭ−Ｖで希釈し、５０μｌを予めプレートした標的細胞に添加し、室温で１０分間標的に結合させた。上記のようにエフェクター細胞としてのＰＢＭＣを調製した。エフェクター：標的比は２５：１であった。エフェクター細胞を１５Ｍｉｏ／ｍｌでＡＩＭ−Ｖ培地中に調製し、ウェルあたり５０μｌを添加した。プレートを５％ＣＯ２を含む加湿大気中にて３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのホウ酸溶液を添加した。ホウ酸溶液での溶解後に倍地中に放出されたカルセインの測定によって標的細胞の死滅を評価した（図３７）。
標的およびエフェクター細胞のみを含み、且つ抗体を含まないウェル由来の自発的放出を測定した。標的細胞および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを含むウェル由来の最大放出を決定した。特異的抗体媒介死滅率を以下のように計算した：（ｘ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）＊１００（式中、ｘは特異的抗体濃度でのＶｍａｘの平均であり、ＳＲは自発的放出のＶｍａｘの平均であり、ＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である）。
（実施例７）
（乾癬を治療するための糖操作抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の使用）
本発明の方法で産生された糖操作抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体でヒト乾癬患者を治療することができる。特に、患者に糖操作抗体を４００ｍｇ／ｍ２の負荷量で毎週注入する。２５０ｍｇ／ｍ２の維持量、完全に奏功するまで毎週投与する。
（実施例８）
（転移性前立腺癌、転移性乳癌、転移性結腸直腸癌、および悪性度ＩＩＩｂまたはＩＶの非小細胞肺癌の治療における糖操作抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体の使用）
ＲｈｕＭａｂ２Ｃ４は、ＥｒｂＢ２に指向する全長ヒト化モノクローナル抗体（ＣＨＯ細胞中で産生）である。ＲｈｕＭａｂ ２Ｃ４は、ＥｒｂＢ２の他のＥｒｂＢファミリーメンバー辺の結合を遮断し、それによりＥｒｂＢ経路を介した細胞内シグナル伝達を阻害する。ＲｈｕＭＡｂ ２Ｃ４は、ＥｒｂＢ２過剰発現腫瘍の成長だけでなくＥｒｂＢリガンド依存性シグナル伝達を必要とする腫瘍成長を遮断する。
本発明の方法によって作製されたＲｈｕＭＡｂ ２Ｃ４の糖操作形態を、耐ホルモン性（アンドロゲン依存性）前立腺癌、転移性乳癌患者、転移性結腸直腸癌患者、および悪性度ＩＩＩｂまたはＩＶの非小細胞肺癌患者治療のための単一の薬剤として使用することができる。詳細には、糖操作ＲｈｕＭＡｂ ２Ｃ４を、疾患の進行が停止するまで、毎週２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇを毎週または３週間毎に静脈内（ＩＶ）投与する。抗体を、複数回投与用液体処方物（２０ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の濃度で２０ｍＬ）として供給する。
特に上記説明および実施例以外の方法で本発明を実施することができることが明らかである。上記教示に照らして本発明の多数の修正形態および変形形態が可能であるので、これらは添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
本明細書中に引用した全刊行物（特許、特許出願、論文、実験マニュアル、書籍、または他の書類が含まれる）の全開示は、本明細書中で参考として援用される。

Claims (1)

  1. 明細書中に記載の発明。
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