HU226420B1

HU226420B1 - Process for controlling sialylation of proteins produced by mammalian cell culture

Info

Publication number: HU226420B1
Application number: HU9900920A
Authority: HU
Inventors: Tina Etcheverry; Werner Lesslauer; Wolfgang Richter; Thomas Ryll; Thomas Schreitmuller
Original assignee: Hoffmann La Roche; Genentech Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2008-12-29
Also published as: ES2324046T3; EP1609853A1; SI1609853T1; JP4348376B2; CA2220684A1; IS2614B; BR9609150A; SI1609853T2; EA199700364A1; AU6095296A; TW516962B; IL122398A0; MX9709452A; BG63213B1; ATE302266T1; AR011439A2; EP0832189B2; EP1609853B1; DE69635076T3; OA10753A

Description

A találmány tárgya eljárások emlőssejtek tenyészetében termelt glikoproteinek sziálsavtartalmának szabályozására, valamint eljárások emlőssejttenyészetekben termelt glikoproteinek sziálsavtartalmának növelésére és csökkentésére. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások tumornekrózisfaktor-receptor/immunglobulin (TNFR-lg) kimérák előállítására.

A rekombináns eljárásokkal előállított glikoproteinek glikozilációs módjainak különbözősége az utóbbi időben a tudományos érdeklődés középpontjába került, mivel olyan rekombináns proteineket állítottak elő, amelyek feltételezhetően profilaktikus és terápiás jelentőségűek. A glikoproteinek oligoszacharid-oldalláncai befolyásolják a protein funkcióját [Wittwer és Howard: Biochem. 29, 4175 (1990)], továbbá a glikoprotein részei közötti intramolekuláris kölcsönhatásokat, ami hozzájárul a glikoprotein háromdimenziós felületének kialakulásához [Hart: Curr. Op. Cell Bioi. 4, 1017 (1992); Goochee és munkatársai: Bio/Technology 9, 1347 (1991); Parekh: Curr: Op. Struct. Bioi. 1, 750 (1991)]. Az oligoszacharidok szerepet játszhatnak egy adott polipeptid bizonyos - specifikus celluláris szénhidrátreceptorokon alapuló - struktúrákhoz történő irányításában is [Bevilacqua és Nelson: J. Clin. Invest. 91, 379 (1993); Nelson és munkatársai: J. Clin. Invest. 91, 379 (1993); Nelson és munkatársai: J. Clin. Invest. 91, 1157 (1993); Norgard és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1068 (1993); Imái és munkatársai: Natúré 361, 555 (1993)]. A glikoproteinek oligoszacharld-oldalláncának terminális sziálsavkomponense befolyásolja a glikoprotein abszorpcióját, vérszérumban mért felezési idejét és a vérszérumból történő kitisztulását („clearance), valamint fizikai, kémiai és immunológiai sajátságait [Parekh: Curr. Op. Struct. Bioi. 1, 750 (1991); Varki: Glycobiology 3, 97 (1993); Paulson: TIBS 14, 272 (1989); Goochee és munkatársai: Biotechnology 9, 1347 (1991); Kobata és munkatársai: Eur. J. Biochem. 209, 483 (1992)]. A fentiek alapján lényeges a glikoproteinek - különösen a gyógyszerként alkalmazni kívánt glikoproteinek - sziálsavtartalmának fenntartása.

A kutatók nagy figyelmet tanúsítanak a rekombináns proteintermelés során lejátszódó glikozilációt befolyásoló tényezők iránt; ilyen tényező például a sejtek tenyésztésének módja (tapadósejtekkel vagy szuszpenzióban), a magzati borjúszérum alkalmazása a tápközegben, a tenyésztés során alkalmazott sejtsűrűség, oxigénellátottság, pH, továbbá a tisztítási eljárások stb. [Werner és Noé: Drug Rés. 43, 1134 (1993); Hayter és munkatársai: Biotech. and Bioeng. 39, 327 (1992); Norys és munkatársai: Biotech. and Bioeng. 43, 505 (1994); Borys és munkatársai: Bio/Technology 11, 720 (1993); Hearing és munkatársai: J. Cell Bioi. 108, 339 (1989); Goochee és munkatársai: in „Frontiers in Bioprocessing II”, 199-240. old., szerk.: Todd és munkatársai, American Chemical Society (1992); 5,096,816 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Chotigeat; Cytotech. 15, 217 (1994)]. Több kutatócsoport tanulmányozta a rekombináns proteinek előállítási folyamatának paramétereit, s különösen a tápközeg összetételének proteintermelődésre gyakorolt hatását [Park és munkatársai: Biotech. Bioeng. 40, 686 (1992); Cox és McClure: In Vitro 19, 1 (1983); Mizutani és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 187, 664 (1992); Le Gros és munkatársai: Lymph. Rés. 4(3), 221 (1985)].

Ismert, hogy az alkánkarbonsavak, így például a vajsav tápközeghez történő hozzáadása befolyásolja a rekombináns sejttenyészetben lévő idegen DNS átmeneti expresszióját [Prasad és Sinha: In Vitro 12, 125 (1976); 62-48935 és 55-150440 számú japán szabadalmi leírás; Klehr és munkatársai: Biochem. 31, 3222 (1992); Gorman és Howard: Nucleic Acid Rés. 11, 7631 (1983)]. A nátrium-butirát - különböző sejtvonalak és tápközeg-összetételek alkalmazása esetén többfajta hatást gyakorolt a génexpresszióra [D'Anna és munkatársai: Biochem. 19, 2656 (1980); Hagopian: Cell 12, 855 (1977)] és a proteintermelésre [Milhaud: J. Cell. Physiol. 104, 163 (1980); GB 2 122 207 A számú brit szabadalmi bejelentés], ami arra utal, hogy a butirát módosíthatja a génexpressziót, illetve gátolhatja bizonyos gének expresszióját [Yuan és munkatársai: J. Bioi. Chem. 3778 (1985)].

A 0 239 292 B1 számú európai szabadalmi leírásban eljárást tárnak fel proteinek - alkánsav vagy sója, így például vajsav jelenlétében történő - fokozott mennyiségű termelésére. Ebben a leírásban az adalék anyag megfelelő koncentrációjának meghatározásáról alig adnak útmutatást, s nem ismertetik az adalék proteinglikozilációra gyakorolt hatását. Mások leírták, hogy kis mennyiségű (0-1,5 mM) nátrium-butirát sejttenyésztö tápközeghez - sejtspecifikus termelékenység növelése céljából - történő hozzáadása egyidejűleg fokozza a termelődött rekombináns protein savas glikoalakjainak mennyiségét (ami a sziálsavtartalom növekedésének felel meg) [Chotigeat és munkatársai: Cytotech. 15, 217 (1994)]. Ez utóbbi szakcikk 3. ábrája arra mutat, hogy az életképes sejtek száma kb. 30%-kal csökken 1 mM nátrium-butirát, és kb. 50%-kal csökken 1,5 mM nátrium-butirát jelenlétében.

Több kutatócsoport vizsgálta az ozmolalitás sejtszaporodásra és polipeptidtermelésre gyakorolt hatását [Ozturk és Palsson: Biotech. and Bioeng. 37, 989 (1991); Stubblefield és munkatársai: Cancer Research 20, 1646 (1960); Garcia-Perez és munkatársai: Journal of Biological Chemlstry 264(28), 16815 (1989); Miner és munkatársai: Invasion Metastasis 1, 158 (1981); GB 2,251,249 számú brit szabadalmi leírás; EP 481 791 számú európai szabadalmi leírás; 5,151,359 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 4,724,206 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 5,122,469 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; és WO 89/04867 számú nemzetközi közzétételi irat]. A sejtek szaporítása és a polipeptidtermelés elősegítése céljából különböző ozmolalitási értékeket ajánlottak. A sejttenyésztő tápközeg ozmolalitása NaCI vagy aminosavak hozzáadásának hatására általában növekszik. A környezeti stresszhatások (így például a fokozott sókoncentráció), bizonyos esetekben, a sejttermékek megnövekedett mennyiségű termelődé2

HU 226 420 Β1 séhez vezetnek. Beszámoltak arról, hogy emlőssejttenyészetekben „oldott anyag stressz” hatására az emlőseredetű proteintermékek fokozott mértékű expressziója érhető el, például oly módon, hogy a tenyésztő tápközeghez sót, tejsavat vagy ammóniát adnak [WO 89/04867 számú nemzetközi közzétételi irat]. Az ilyen stresszhatások a szaporodásra általában gátlóhatásúak, azonban a sejtspecifikus termelékenység szempontjából kedvezőek.

Mások beszámoltak arról, hogy a glükózkoncentráció rekombináns sejttenyészetben befolyásolja a sejtszaporodást és/vagy a polipeptidtermelést [Park és munkatársai: Biotech. and Bioeng. 18, 161 (1991); 387 840 számú európai szabadalmi leírás; Reuvny és munkatársai: Journal of Immunological Methods 86, 53 (1986); Fine és munkatársai: In Vitro 12(10), 693 (1976); Dircks és munkatársai: Exp. Eye Rés. 44, 951 (1987); Mizutani és munkatársai: Biochemical and Biophysical Research Communications 187(2), 664 (1992); Sugiura: Biotech. and Bioeng. 39, 953 (1992); WO 88/01643 számú nemzetközi közzétételi irat; Gráf és munkatársai: DECHEMA Biotechnoi. Conf. 3, 615 (1989); JP 1-101882 számú japán szabadalmi bejelentés; 3,926,723 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; EO 87/00195 számú nemzetközi közzétételi irat; és Fleischaker: „Thesis”, Massachusetts Institute of Technology, 196-229. old. (1982)]. A felsorolt vizsgálatokban nem tanulmányozták a különböző paraméterek azon hatását, hogy milyen módon befolyásolják az érett protein sziálsavtartalmát, ami a glikoproteintermelésben egyenértékű a klinikai sikerrel.

A fentieknek megfelelően, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során olyan eljárások kifejlesztését tűztük ki célul, amelyek emlőssejttenyészetek által termelt glikoproteinek sziálsavtartalmának szabályozására alkalmasak.

Felismertük, hogy az emlőssejtek tenyésztését érintő bizonyos paraméterek befolyásolják a sejtspecifikus termelékenységet, valamint a termelődött proteinek glikoziláltságának mértékét és típusát. Közelebbről, felismertük, hogy a sejtspecifikus termelékenységet növelő bizonyos tényezők ellentétes hatást fejtenek ki a termelődött protein sziálsavtartalmára. Ilyenformán, az emlőssejttenyészetekben termelt glikoproteinek adott glikoalakjai koncentrációjának növelése céljából különböző sejttenyésztési eljárásokat fejlesztettünk ki.

A fentieknek megfelelően, a találmány tárgyát képezi egy eljárás emlőssejttenyészetben termelt glikoprotein sziálsavtartalmának szabályozására. A találmány e szempontja értelmében a sejttenyésztés termelési stádiumában a glikoprotein termelési sebességének változtatása az érett glikoprotein sziálsavtartalmának módosulását eredményezi. Közelebbről, a glikoprotein termelődés! stádiumában a sejtspecifikus termelékenység fokozása az érett protein sziálsavtartalmának csökkenéséhez vezet, s fordítva, a sejtspecifikus termelékenység csökkentése az érett protein sziálsavtartalmának növekedését eredményezi.

A találmány egyik speciális megvalósítási módja értelmében feltárunk egy eljárást emlős gazdasejt sejtspecifikus termelékenységének - emlőssejttenyészet termelési fázisa során a sejtspecifikus termelékenységet befolyásoló tényezők szabályozásával történő változtatására. A találmány szerinti megoldás egyik szempontja szerint az eljárás során a DNS-transzkripciót fokozó faktorok koncentrációját szabályozzuk. Egy másik megvalósítási mód szerint a sejtspecifikus termelékenységet a sejttenyészet ozmolalitásának bizonyos határok között tartásával szabályozzuk. A találmány szerinti megoldás értelmében az érett glikoprotein sziálsavtartalmának módosítása érdekében a fenti paraméterek bármelyikét szabályozhatjuk (önmagukban vagy kombinációban). A találmány egyik speciális megvalósítási módjában a DNS-transzkripciót fokozó faktorként vajsavat vagy sóját, például nátrium-butirátot alkalmazunk, körülbelül 0,1 mM és kb. 20 mM közötti koncentrációban. A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja szerint a sejttenyészet ozmolalitását körülbelül 250 mOsm és körülbelül 600 mOsm érték között tartjuk. A találmány egy további megvalósítási módjában a sejttenyészet hőmérsékletét 30 °C és 35 °C között tartjuk.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás emlőssejttenyészetben termelt érett glikoprotein sziálsavtartalmának növelésére, melynek során a termelési folyamat fentebb említett paramétereinek egyikének vagy mindegyikének (adott esetben más, ismert paraméterekkel együttes) szabályozásával kisebb sejtspecifikus termelékenységet tartunk fenn. A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módja értelmében a gazdasejtet körülbelül 0,1 mM és kb. 6 mM közötti koncentrációjú vajsav vagy vajsavsó jelenlétében - adott esetben a sejttenyészet ozmolalitásának kb. 300-450 mOsm értéken tartása mellett - tenyésztjük, ami fokozott sziálsavtartalmú protein termelődését eredményezi.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja értelmében feltárunk egy eljárást emlőssejttenyészetben termelt érett glikoprotein sziálsavtartalmának csökkentésére, melynek során fokozzuk a sejttenyészet sejtspecifikus termelékenységét. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a sejtspecifikus termelékenységet oly módon növeljük, hogy a sejttenyésztést a következő feltételek bármelyike mellett végezzük: gazdasejtet kb. 6 mM és kb. 12 mM koncentrációjú vajsav vagy vajsavsó jelenlétében; és a sejttenyészet ozmolalitásának körülbelül 450-600 mOsm értéken tartásával tenyésztjük.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy háromfázisos sejttenyésztési eljárás. A találmány e megvalósítási módja szerint feltárunk egy eljárást emlőssejttenyészet által termelt glikoprotein sziálsavtartalmának szabályozására, melynek során egy - szaporodási fázisában proteint expresszáló - gazdasejtet a sejtszaporodás maximális mértékű fokozódását biztosító ideig és feltételek mellett tenyésztünk. A találmány szerinti megoldás e szempontja értelmében a szaporodási fázist egy átmeneti fázis követi, melynek során kiválasztjuk és beállítjuk az érett glikoprotein kívánt sziálsavtartalmát biztosító sejttenyészeti paramétereket. Az átme3

HU 226 420 Β1 neti fázist a termelési fázis követi, melynek során fenntartjuk az átmeneti fázisban kiválasztott paramétereket, és a termelődött glikoproteint összegyűjtjük. A sejttenyészet termelési fázisa sejtspecifikus termelékenységének módosításával - melynek során az átmeneti fázisban a sejttenyészethez kb. 0,1 mM és kb. 20 mM közötti koncentrációban vajsavat vagy vajsavsót adunk, és a sejttenyészet ozmolalitását kb. 250 mOsm és kb. 600 mOsm közötti értéken tartjuk (s adott esetben e két paramétert egymással kombináljuk) - változó mennyiségű sziálsavat tartalmazó protein állítható el.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás az 1-es típusú szolúbilis tumornekrózisfaktor-receptor (TNFR1) és az immunglobulin-G₁ (IgG·,) alkotta kiméra protein (TNFRI-IgG^ sziálsavtartalmának szabályozására. Felismertük, hogy bizonyos termelési feltételek mellett olyan új TNFR1-lgG₁ glikoalakok állíthatók elő, amelyek vérből történő kitisztulása („clearance”) hosszabb időtartamú, miközben funkcionális aktivitásuk lényegében változatlan. A hosszú felezési idő egyszerű és nagy pirulákban adagolt beadást tesz lehetővé, s elősegíti a termelt glikoprotein in vivő hatékonyságát, miáltal kisebb dózisalakok alkalmazhatók.

A találmány szerinti megoldás e szempontja szerint fokozott mennyiségű szíálsavgyökőt tartalmazó TNFR1-lgG₁ glikoproteinmolekulát állítunk elő. ATNFR1-lgG₁ termelési fázisában a sejttenyészeti paramétereket úgy választjuk meg, hogy a kívánt sziálsavtartalmú molekulát kapjuk. Az egyik előnyös megvalósítási mód értelmében a termelési fázisban a nátrium-butirátot kb. 0,1 mM és kb. 6 mM közötti koncentrációban alkalmazzuk, és az ozmolalitást kb. 300-450 mOsm értéken tartjuk. A találmány egy még előnyösebb megvalósítási módjában a nátrium-butirátot kb. 1 mM koncentrációban alkalmazzuk, az ozmolalitást pedig kb. 350-400 mOsm értéken tartjuk.

A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.

Az 1a. és 1b. ábrán egy jellemző sejttenyészeti eljárás termelési fázisában a specifikus termelékenység kiszámítására alkalmazott eljárást mutatjuk be. A specifikus termelékenység az életképes sejtszám (életképes sejtnapok; lásd 1a. ábra), illetve az összetömörített sejttérfogat („packed cell volume”; PCV) függvényében fejezhető ki (lásd 1b. ábra). A specifikus termelékenységi rátát 90%-os konfidenciaintervallumban adjuk meg.

A 2a. ábrán az életképes sejtnapokra vonatkoztatott specifikus termelékenység és az összegyűjtött termék sziálsavtartalma közötti összefüggést, a 2b. ábrán pedig az összetömörített sejttérfogatra (PCV) vonatkoztatott specifikus termelékenység és az összegyűjtött termék sziálsavtartalma közötti összefüggést mutatjuk be. Az ábrákon kilenc különböző eljárás (A-l) eredményeit tüntetjük fel. Az adatpontok az I. táblázatban felsorolt, független termelési eljárásokat reprezentálják.

A találmány leírásában a szénhidrát-molekulákkal összefüggésben az oligoszacharidok általános nevezéktanát alkalmazzuk. Az e nevezéktant használó szénhidrátkémia áttekintését lásd Hubbard és Ivatt: Ann. Rév. Biochem. 50, 555 (1981). E nevezéktan értelmében például „Mán jelentése mannóz; „GIcNAc” jelentése 2-N-acetíl-glükóz-amin; „Gál” jelentése galaktóz; és „Glc” jelentése glükóz. A sziálsavak esetében a következő rövidítéseket alkalmazzuk: „NeuNAc” (5-Nacetil-neuraminsav) és „NeuNGc (5-glikolil-neuraminsav) [J. Bioi. Chem. 257, 3347 (1982); J. Bioi. Chem. 257, 3352 (1982)].

Az „ozmolalitás” kifejezés egy vizes oldatban oldott szilárd részecskék ozmotikus nyomását jelenti. Az ozmolalítást 1 kg oldatban oldott ozmotikusán aktív részecskék koncentrációjaként fejezzük ki (38 °C-on 1 mOsm/kg H₂O ozmózisnyomás-értéke 2533 Pa). Ezzel szemben az „ozmolaritás” kifejezés egy liter oldatban oldott szilárd részecskék számát jelenti. Ahogy itt használjuk, a „mOsm rövidítés jelentése „milliozmól/kg oldat”.

A találmány leírásában a „glikoprotein kifejezést általában olyan peptidekre és proteinekre alkalmazzuk, amelyek körülbelül tíznél több aminosavat, és legalább egy oligoszacharid-oldalláncot tartalmaznak. A glikoproteinek a gazdasejtre nézve lehetnek homológok, de előnyösen heterológok, vagyis az alkalmazott gazdasejtre nézve idegen eredetűek (ilyen például egy kínai hörcsög petefészeksejt által termelt emberi protein). A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése során előnyösen emlős glikoproteineket (vagyis eredetileg emlősorganizmusból származó glikoproteineket), előnyösebben közvetlenül a tenyésztő tápközegbe kiválasztódó glikoproteineket alkalmazunk. Az emlős glikoproteinek példái közé tartoznak a citokinek és receptoraik, valamint a citokineket és receptoraikat tartalmazó kiméra proteinek, melyek a következő molekulák valamelyikét tartalmazhatják; tumornekrózis-faktor-α és -β, ezek receptorai (TNFR-1; 417,563 számú európai szabadalmi leírás; TNFR-2, 417,014 számú európai szabadalmi leírás) és ezek származékai; renin; emberi és szarvasmarha-eredetű növekedési hormon; növekedési hormon „releasing” hormon; mellékpajzsmirigyhormon; pajzsmirigy-stimuláló hormon; lipoproteinek; alfa-1-antitripszin; inzulin A- és B-lánca; proinzulin; tüszőserkentő hormon; kalcitonin; luteinizáló hormon; glukagon; véralvadási faktorok, így a VIIIC- és IX-faktor, a szöveti faktor és a von Willebrand-faktor; véralvadást gátló faktorok, mint például a protein-C; szívpitvari natriuretikus faktor; tüdö-„surfactant”; plazminogénaktivátor, mint például az urokináz vagy az emberi vizelet vagy szöveti típusú plazminogénaktivátor (t-PA); bombezin; trombin; vérképzési növekedési faktor; ankephalináz; RANTES; humán makrofág gyulladási protein (ΜΙΡ-1-α); szérumalbumin, például az emberi szérumalbumin; a Müller-cső kifejlődését gátló anyag; relaxin A- és B-lánc; prorelaxin; egér gonadotropinnal asszociált peptid; mikrobiális protein, például béta-laktamáz; DN-áz; inhibin; aktivin; vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (VEGF); hormonok vagy növekedési fak4

HU 226 420 Β1 torok receptorai; integrin; protein-A vagy -D; rheumatoid faktorok; neurotrófiás faktor, mint például a csonteredetű neurotrófiás faktor (BDNF), a neurotrofin-3, -4, -5 vagy -6 (NT-3, NT-4, NT-5, NT-6) vagy idegi növekedési faktor, mint például az NGF-β; vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF); fibroblaszt növekedési faktor, például α-FGF és β-FGF; epidermális növekedési faktor (EGF); transzformáló növekedési faktor (TGF), mint például a TGF-α és TGF-β (TGF-βΙ, TGFβ2, TGF^3, TGF^4, TGF-βδ), az inzulinszerű növekedési faktor I és II (IGF-I és IGF-II) a des(1-3)-IGF-l (agyi IGF-I) és az inzulinszerű növekedési faktort kötő proteinek; CD-proteinek, mint például a CD-3, CD-4, CD-8 és CD-19; eritropoietin; oszteoinduktív faktorok; immuntoxinok; csontmorfogenetikus protein (BMP); interferon, például α-, β- és gamma-interferon; kolóniastimuláló faktorok (CSF-ek), mint például az M-CSF, GM-CSF és G-CSF; interleukinek (IL), mint például az IL-1 - IL—10; szuperoxid dizmutáz; T-sejt-receptorok; felületi membránproteinek; szuvasodást gyorsító faktorok; virális antigén, például a HÍV burokproteinjének egy része; „homing” receptorok; adresszinek; szabályozó proteinek; antitestek; kiméra proteinek, például immunadhezinek; valamint a fentebb említett polipeptidek fragmensei.

A „sejttenyésztő tápközeg” és „tenyésztő tápközeg kifejezésen emlőssejtek szaporítására alkalmazott tápoldatot értünk. Az ilyen tápoldatok a következő komponensek legalább egyikét tartalmazzák:

1. energiaforrás, rendszerint szénhidrát, például glükóz formájában;

2. az összes esszenciális aminosav, rendszerint a húsz alapaminosav plusz tisztein;

3. vitaminok és/vagy egyéb szerves vegyületek, melyekre kis koncentrációban van szükség;

4. szabad zsírsavak; és

5. nyomelemek, amelyek olyan szervetlen, illetve természetes elemek, amelyekre általában nagyon kis koncentrációban, rendszerint mikromoláris tartományban van szükség.

A tápoldatok adott esetben, kiegészítésként a következő komponensek közül egyet vagy többet is tartalmazhatnak:

1. hormonok és egyéb növekedési faktorok, például inzulin, transzferrin és epidermális növekedési faktor;

2. sók és pufferek, például kalcium, magnézium és foszfát;

3. nukleozidok és bázisok, például adenozin, timidin és hipoxantin; és

4. proteinek és szöveti hidrolizátumok.

Az „emlős gazdasejt”, „gazdasejt, „emlőssejt és hasonló kifejezéseken emlősökből származó sejtvonalakat értünk, amelyek - megfelelő tápanyagokat és növekedési faktorokat tartalmazó - egyrétegű tenyészetben vagy szuszpenziós tenyészetben képesek szaporodni és életben maradni. Az adott sejtvonal számára szükséges növekedési faktorok felesleges kísérletezés nélkül tapasztalati úton meghatározhatók, lásd például: „Mammalian Cell Culture”, szerk.: Mather, J. P., Planum Press, NY (1984); Barnes és Sato: Cell 22, 649 (1980). A sejtek rendszerint nagy mennyiségben képesek a szóban forgó glikoproteineket expresszálni és a tenyésztő tápközegbe kiválasztani. A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése során alkalmazható emlős gazdasejtek közé tartoznak a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek (DHFR^-) [Urlaub és Chasin: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)]; a dp12.CHO sejtek [307 247 számú európai szabadalmi leírás (1989. március 15.)], az SV40-vírussal transzformáit majomvese CV-1 sejtvonal [COS-7; ATCC CRL 1651); az emberi embrionális vesesejtvonal (293-as sejtek vagy szuszpenziós tenyészetben történő szaporítás céljára szubklónozott 293-as sejtek; Graham és munkatársai: J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]; az újszülött hörcsögből származó vesesejtek (BHK, ATCC CCL 10); egér „sertoli-sejtek [TM4; Mather: Bioi. Repród. 23, 243 (1980)]; majomvesesejtek (CV1, ATCC CCL70); afrikai zöldmajom vesesejtek (VERO-76, ATCC CRL-1587); emberi nyaki karcinómasejtek (HELA, ATCC CCL 2); kutyavesesejtek (MDCK, ATCC CCL 34); „buffalo” patkánymájsejtek (BRL3A, ATCC CRL 1442); emberi tüdősejtek (W138, ATCC CCL 75); emberi májsejtek (Hep G2, HB 8065); egéremlőtumorsejtek (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-sejtek [Mather és munkatársai: Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44 (1982)]; MRC5-sejtek; FS4-sejtek; és emberi hepatoma-sejtvonal (Hep G2).

Az előnyös gazdasejtek a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek/-DHFR [Urlaub és Chasin: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)] és a dp12.CHO sejtek [307 247 számú európai szabadalmi leírás (1989. március 15.)].

A találmány leírásában a „pepton” kifejezésen olyan tápközeg-kiegészítőt értünk, amely lényegében egy hidrolizált állati protein. E protein forrását vágóhídi melléktermékek, tisztított zselatin vagy növényi anyag képezheti, hidrolíziséhez általában savat, hőt vagy különböző enzimkészítményeket alkalmaznak. Az előnyösen alkalmazható peptonelegyek közé tartozik például a „Primatone RL” és a „Primatone HS, melyek kereskedelmi forgalomban beszerezhetők (Sheffield, Anglia).

A „sejtspecifikus termelékenység, „sejtspecifikus ráta” és hasonló kifejezéseken a termék expressziós sebességének specifikus (vagyis egy sejtre, egységnyi sejttömegre vagy sejttérfogatra vonatkoztatott) mértékét értjük. A sejtspecifikus termelékenységet például egy sejt által naponta termelt protein grammban megadott tömegeként fejezzük ki. A sejtspecifikus termelékenység integrálszámítással határozható meg, a következő képletek szerint:

dP/dt=q_pX;

P=q_pJ \ Xdt ahol „q_p” a sejtspecifikus termelékenységi állandó; „X” jelentése sejtszám-, sejttérfogat- vagy sejttömegegyenérték; „dP/dt a proteintermelés sebessége. A képletek szerint q_p-t az életképes sejtek integráljával (J 2 Xdt „életképes sejtnapok) szemben ábrázolt termékkoncentráció görbéjéből kapjuk. E képlet szerint, ha a termelődött glikoprotein mennyiségét az életképes

HU 226 420 Β1 sejtszám függvényében ábrázoljuk, a görbe meredeksége a sejtspecifikus rátának felel meg. Az életképes sejtek száma számos mérési eljárással, így például a biomassza, az oxigénfelvétel sebessége, a laktát dehidrogenáz (LDH), az összetömörített sejttérfogat és a turbiditás mérésével határozható meg.

Egy sejttenyészet „szaporodási fázisán” az exponenciális szaporodási fázist (lóg fázis) értjük, melynek során a sejtek általában gyorsan osztódnak. E fázis alatt a sejteket bizonyos ideig, rendszerint egy-négy napig - maximális sejtszaporodást lehetővé tevő körülmények között - tenyésztjük. Az adott gazdasejt szaporodási ciklusa elvárható mennyiségű kísérleti munkával meghatározható. A „maximális sejtszaporodást lehetővé tevő körülmények és hasonló kifejezéseken olyan tenyésztési feltételeket értünk, amelyek az adott sejtvonal számára - sejtnövekedés és -osztódás szempontjából - optimálisak. A szaporodási fázis során a sejteket a szükséges adalék anyagokat tartalmazó tápközegben általában 30-40 °C-on, nagy páratartalmú, kontrollált atmoszférában tenyésztjük, hogy az adott sejtvonal számára optimális sejtszaporodást érjünk el. A sejteket körülbelül 1-4 napig, rendszerint 2-3 napig tartjuk a szaporodási fázisban.

Egy sejttenyészet „átmeneti fázisa” kifejezésen azt az időszakot értjük, amely alatt a termelési fázishoz szükséges tenyésztési feltételeket beállítjuk. Az átmeneti fázis során a környezeti feltételeket (a sejttenyészet hőmérsékletét, a tápközeg ozmolalitását és hasonlókat) a szaporodási fázishoz szükséges értékekről a termelési fázishoz szükséges értékekre állítjuk át.

Egy sejttenyészet „termelési fázisa kifejezésen azt az időszakot értjük, amely alatt a sejtszaporodás görbéje platót ér el. E fázis során a logaritmusos sejtszaporodás befejeződik, és a proteintermelés válik elsődlegessé. A termelési fázis alatt a tápközeghez általában olyan adalékokat adunk, amelyek elősegítik a folyamatos proteintermelést és a kívánt glikoproteintermék termelődését.

Ahogy a találmány leírásában alkalmazzuk, az „expresszió kifejezésen egy gazdasejtben lejátszódó transzkripciós és transzlációs folyamatot értünk. Egy termékgén gazdasejtben lejátszódó expressziójának szintje a sejtben jelen lévő, megfelelő mRNS mennyisége alapján, illetve a termékgén által kódolt, és a sejtben termelődő protein mennyisége alapján határozható meg. Például a termékgénről átíródó mRNS mennyisége Northern-hibridizációval határozható meg [Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” pp. 7.3-7.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Egy termékgén által kódolt protein mennyisége a protein biológiai aktivitásának vizsgálatával, illetve az ilyen aktivitástól független vizsgálati eljárások alkalmazásával, például Western-blot-analízissel vagy a proteinnel reagálni képes antitestek alkalmazásával végzett radioimmunvizsgálattal határozható meg [Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual pp. 18.1-18.88, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].

Sejttenyésztési eljárások

Felismertük, hogy emlőssejttenyészetekben a glikoproteintermelés során a sejtspecifikus termelékenységet növelő bizonyos tényezők ellentétes hatást fejtenek ki a termelődött protein sziálsavtartalmára. Mivel azok a proteinek, amelyek egy komplex oligoszacharidstruktúrára vonatkoztatva egy vagy több sziálsavgyököt tartalmaznak, in vivő gyorsabban tisztulnak ki a vérkeringésből („clearance), az előállított glikoprotein kitisztulási sebessége a készítmény bruttó szializációja mértékének szabályozásával széles határok között változtatható. A találmány tárgyát eljárások képezik emlőssejttenyészetekben termelt glikoprotein sziálsavtartalmának szabályozására. Az itt leírt módszerek alkalmazásával meghatározhatók az emlőssejttenyészetek által termelt glikoproteinek kívánt sziálsavtartalmát biztosító pontos paraméterek.

A találmány szerinti eljárás értelmében emlős gazdasejtet kinyerhető glikoproteintermék előállítása céljából tenyésztünk. A glikoprotein bruttó sziálsavtartalmát a sejtspecifikus termelékenységet befolyásoló sejttenyésztési paraméterek szabályozásával változtatjuk. A sejtspecifikus termelékenységet befolyásoló tényezők szakember számára jól ismertek; ilyenek például, többek között, a DNS/RNS kópiaszámot befolyásoló tényezők, az RNS állapotát módosító (például az RNS-t stabilizáló) faktorok, a tápoldatban lévő tápanyagok és egyéb kiegészítő anyagok; a transzkripciót elősegítő anyagok koncentrációja, a tenyésztő tápközeg ozmolalitása, hőmérséklete és pH-ja stb. A találmány szerinti megoldás értelmében a felsorolt tényezők sejtspecifikus termelékenység fokozása céljából különkülön vagy egymással kombinálva végzett - szabályozása csökkent sziálsavtartalmú protein termelődését segíti elő, míg ugyanezen tényezők sejtspecifikus termelékenység céljából végzett beállítása megnövelt sziálsavtartalmú érett glikoprotein képeződését eredményezi.

A találmány szerinti megoldást az alábbiakban különböző - köztük számos jól ismert - sejttenyésztési eljárás és alapelv bemutatásán keresztül ismertetjük.

A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során az emlőssejteket egy kívánt glikoproteintermék előállítása céljából tenyésztjük. A glikoprotein előállításához alkalmas gazdasejt kiválasztása során lényeges szem előtt tartani, hogy a különféle gazdasejtek az expresszált proteinek transzlációját, transzláció utáni érési folyamatát, illetve módosítását (például glikozilációt, hasítást) érintő jellemző és specifikus mechanizmussal bírnak. A kívánt poszttranszlációs módosítások biztosítása érdekében megfelelő gazdasejteket kell kiválasztani. Más módon, a gazdasejtek úgy módosíthatók, hogy olyan génterméket expresszáljanak, amely a specifikus poszttranszlációs módosításnak megfelelő.

Közelebbről, a kívánt proteint expresszáló emlőssejtnek bizonyos enzimeket úgy kell expresszálniuk (vagy a sejteket az adott enzimek expresszáltatása érdekében úgy kell manipulálni), hogy a leírásban ismertetett, megfelelő körülmények között a kívánt posztt6

HU 226 420 Β1 ranszlációs módosítások in vívó bekövetkezzenek. A szóban forgó enzimek közé azok tartoznak, amelyek az N- és O-kötésű szénhidrátok [az N-kötött oligoszacharidokat illetően lásd Hubbard és Ivatt: Ann. Rév. Biochem. 50, 555 (1981)] proteinhez történő kapcsolásáért felelősek. Adott esetben, ilyen enzim például az oligoszacharil transzferáz, az α-glükozidáz I, az a-glükozidáz II, az ER a-(1,2)-mannozidáz, a Golgi a-mannodáz I, az N-acetil-glükózaminil transzferáz I, a Golgi α-mannodáz II, az N-acetil-glükózaminil transzferáz II, az a-(1,6)-fukozil transzferáz és a β-(1,4)-galaktozil transzferáz. Ezenfelül a gazdasejtek a megfelelő szialil transzferázt is expresszálják, amelynek funkciója, hogy a terminális sziálsavat specifikus helyzetben és specifikus kötéssel az oligoszacharidhoz kapcsolja. Adott esetben a gazdasejtet szialil transzferázt kódoló DNSsel végzett transzfekcióval úgy módosíthatjuk, hogy a megfelelő szialil transzferázt expresszálja.

A szialil transzferázok a terminális sziálsavgyököt a megfelelő oligoszacharidstruktúrához (például Gaipi-4GlcNAc-hez) kapcsolják. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös szialil transzferázok közé tartoznak - többek között - az N- és O-kötött oligoszacharidok komplex szializációját és elágazódását katalizáló szialil transzferázok.

A kívánt proteint expresszáló - és a kívánt szénhidrátokat specifikus pozícióban és kötéssel a proteinhez kapcsolni képes - emlőssejtek tenyésztésére számos tenyésztési feltétel alkalmazható, figyelembe véve az adott gazdasejt sajátságait. Az emlőssejtek számára előnyös tenyésztési feltételek jól ismertek [J. Immunoi. Methods 56, 221 (1983)], illetve szakember számára könnyen meghatározhatók [lásd például „Animál Cell Culture: A Practical Approach”, szerk.: Rickwood és Hames, 2. kiadás, Oxford University Press, New York (1992)], és az adott gazdasejtnek megfelelően módosíthatók.

A találmány szerinti emlőssejttenyészeteket a kiválasztott gazdasejt számára megfelelő tápközegben hozzuk létre. Tápoldatként kereskedelmi forgalomban beszerezhető tápközegek, mint például a Ham-féle F10 tápközeg (Sigma), a „Minimál Essential Médium” (MÉM; Sigma), az RPMI-1640 (Sigma) és a Dulbeccoféle módosított Eagle-tápközeg (DMEM; Sigma), továbbá a következő publikációkban ismertetett tápközegek bármelyike alkalmazható: Ham és Wallace: Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes és Sato: Anal. Biochem. 102, 2255 (1980); 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 5 122 469 és 4 560 655 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; illetve WO 90/03430 és WO 87/00195 számú nemzetközi közzétételi irat (a felsorolt források mindegyikét teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni). Az említett tápközegek mindegyike kiegészíthető (szükséges mértékben) hormonokkal és/vagy egyéb növekedési faktorokkal (például inzulinnal, transzferrinnel vagy epidermális növekedési faktorral), sókkal (például nátrium-kloriddal, kalciummal, magnéziummal és foszfáttal), pufferekkel (például HEPES-pufferrel), nukleozidokkal (például adenozinnal és tímidinnel), antibiotikumokkal (például

Gentamycin™-nel), nyomelemekkel (mikromoláris koncentrációtartományban szükséges szervetlen vegyületekkel), lipidekkel (linolsawal vagy egyéb zsírsavakkal), megfelelő hordozókkal, valamint glükózzal és azzal egyenértékű energiaforrással. A tápközegek megfelelő koncentrációban bármilyen más, szakember számára ismert kiegészítő anyaggal is kiegészíthetők.

A találmány szerinti megoldás egyik speciális megvalósítási módjában gazdasejtként CHO-sejtet, előnyösen dp12.CHO sejtet, tápközegként pedig DMEM/HAM F12 alapú tápközeget [a DMEM és HAM F12 tápközeg összetételét lásd: „American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas 6. kiadás, 346-349. old., (1989)], különösen előnyösen az 5 122 469 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltárt tápközeget alkalmazzuk. Az említett tápközegek bizonyos komponenseit (például aminosavak, sók, cukrok, vitaminok) módosított koncentrációban alkalmazzuk, illetve a tápközegekhez adott esetben glicint, hipoxantint és timidint, rekombináns humán inzulint, hidrolizált peptont (például „Primatone HS” vagy „Primatone RL; Sheffield, Anglia) vagy ezek megfelelőjét; sejtvédő anyagot, például „Pluronic F68”-at vagy azzal egyenértékű Pluronic poliolt; Gentamycint, illetve nyomelemeket adhatunk.

A találmány szerinti glikoproteineket a kívánt proteint expresszáló sejtek különféle sejttenyésztési feltételek mellett végzett szaporításával állítjuk elő. Például a találmány szerinti megoldás értelmében a proteinek nagy, illetve kis mennyiségben történő előállítására alkalmas sejttenyésztésí eljárások alkalmazhatók. Az ilyen eljárások közé tartozik, többek között, a fluid ágyas bioreaktorral, az üreges szálakat tartalmazó bioreaktorral, hengeres palacktenyészetben vagy kevert tartályos bioreaktor-rendszerben (az utóbbi két rendszerben mikrohordozókkal vagy azok nélkül) végzett eljárás, melyek szakaszos, rátáplálásos szakaszos, illetve folyamatos üzemmódban folytathatók.

Az egyik előnyös megvalósítási mód értelmében a találmány szerinti sejttenyésztést kevert tartályos bioreaktorban, rátáplálásos szakaszos üzemmódban hajtjuk végre. Az előnyös rátáplálásos szakaszos tenyésztés során az emlős gazdasejteket és a tenyésztő tápközeget a folyamat kezdetén egy tenyésztőedénybe tápláljuk, majd a tenyésztéshez szükséges tápanyagokat a tenyésztés során - folyamatosan vagy adagonként - a tenyészethez adjuk. Ebben az eljárásban a tenyésztés a sejteket és/vagy a terméket időszakonként összegyűjtjük, vagy más módon, a betakarítást csak a tenyésztés befejezése előtt végezzük el. A rátáplálásos szakaszos tenyésztést például félfolyamatos rátáplálásos szakaszos tenyésztésként is végezhetjük, melynek során időszakonként a teljes tenyészetet (sejteket és tápközeget) eltávolítjuk, és friss tápközeggel helyettesítjük. A rátáplálásos szakaszos tenyésztés különbözik az egyszerű szakaszos tenyésztéstől, ahol a sejttenyésztéshez szükséges valamennyi komponenst (beleértve a sejteket és a tápanyagokat) a tenyésztési folyamat kezdetén tápláljuk be a tenyésztőedénybe. A rátáplálásos szakaszos tenyésztés különbözik az át7

HU 226 420 Β1 áramoltatásos tenyésztéstől is, amennyiben a folyamat során a felülúszót nem távolítjuk el a tenyésztőedényből (az átáramoltatásos tenyésztés során a sejteket például szűréssel, betokozással, mikrohordozókhoz horgonyozva stb. - a tenyészetben tartjuk, és a tenyésztő tápközeget folyamatosan vagy szakaszosan tápláljuk a tenyésztőedénybe, illetve folyamatosan vagy szakaszosan eltávolítjuk abból).

Fentieken túlmenően, a tenyészetben lévő sejtek szaporítására bármilyen, az adott gazdasejthez, valamint az adott termelési tervhez alkalmas rendszer, illetve eljárás alkalmazható. Ennek megfelelően, a találmány leírásában egylépéses és többlépéses eljárásokat is feltárunk. Az egylépéses tenyésztés során a gazdasejteket a tenyésztő tápközegbe oltjuk, és a találmány szerinti eljárásokat a sejttenyészet egyetlen termelési fázisa során alkalmazzuk. A többlépéses tenyésztés során a sejteket több lépésben, illetve fázisban szaporíthatjuk. Például a sejteket egy első lépésben (szaporodási fázisban) szaporítjuk, melynek során a sejteket szaporodást és életben maradást elősegítő tápközegbe oltjuk, majd friss tápközeg adagolásával megfelelő ideig a szaporodási fázisban tartjuk.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a rátáplálásos szakaszos, illetve folyamatos tenyésztést a tenyészet szaporodási fázisban lévő sejtjei szaporodásának fokozása céljából alkalmazzuk. A szaporodási fázisban a sejteket a maximális mértékű szaporodásnak megfelelő feltételek között és időtartamban inkubáljuk. A tenyésztési feltételeket (hőmérséklet, pH, oldott oxigéntartalom) az adott gazdasejtnek megfelelően választjuk ki. A tenyészet pH-ját - sav (például CO₂) vagy bázis (például Na₂CO₃ vagy NaOH) alkalmazásával - 6,5 és 7,5 közötti értékre állítjuk be. Emlőssejtek (például CHO-sejtek) tenyésztésére 30-35 °C hőmérséklet és 5-90%-os oxigéntelítettség alkalmas.

A sejtek egy adott stádiumban termelési fázisban lévő sejttenyészet beoltására alkalmazhatók. Más módon, a termelési fázis, illetve lépés a beoltással, illetve a szaporodási fázissal folytonosan is megvalósítható.

A találmány szerinti megoldás értelmében a termelési fázis alatt szabályozzuk a sejttenyészeti körülményeket. Az emlős gazdasejtek sejtspecifikus termelékenységét befolyásoló tényezőket úgy szabályozzuk, hogy a kívánt sziálsavtartalmú glikoproteint kapjuk. Közelebbről, a sejtspecifikus termelékenységet fokozó faktorokat a sejttenyészet termelési fázisa során úgy szabályozzuk, hogy a termelődő glikoprotein a kívánt mennyiségű sziálsavat tartalmazza.

A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módja értelmében a sejttenyésztési eljárás termelési fázisa előtt egy átmeneti fázist iktatunk be, amelyben a tenyésztési paramétereket a szaporodási fázis értékeiről átállítjuk a termelési fázishoz szükséges értékekre.

A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módja szerint a sejttenyészetben egy transzkripciót elősegítő anyag (például vajsav) koncentrációját úgy állítjuk be, hogy ezáltal módosítsuk a sejtspecifikus termelékenységet, illetve az emlőssejt glikoproteintermékének sziálsavtartalmát. Az emlőseredetű proteinek transzkripcióját elősegítő anyagként előnyösen a vajsav sóját, előnyösebben nátrium-butirátot alkalmazunk.

A találmány szerinti megoldás értelmében a nátrium-butirát koncentrációját a sejtspecifikus termelékenység szabályozásához megfelelő módon állítjuk be. A sejteket 0,1 mM és 20 mM közötti (az adott gazdasejtnek megfelelően módosított) nátríum-butirát-koncentráció mellett tenyésztve a kívánt sziálsavtartalmú glikoprotein nyerhető. A kívánt sziálsavtartalmú glikoprotein előállítása céljából olyan nátrium-butirát-koncentrációt alkalmazunk, amely a leginkább elfogadható sziálsavtartalom mellett a lehető legnagyobb sejtspecifikus termelékenységet biztosítja. Ennek megfelelően, a találmány szerinti megoldás értelmében a kívánt sziálsavtartalom elérése céljából egy transzkripciót elősegítő anyag, például nátrium-butirát megfelelő koncentrációját alkalmazzuk.

Az érett glikoprotein sziálsavtartalmának növelése érdekében általában a transzkripciót elősegítő anyag kisebb koncentrációit alkalmazzuk. A kisebb koncentráció fokozott transzkripciót eredményez, de kisebb sejtspecifikus termelékenységet tart fenn, miközben a tenyészetben lévő gazdasejtek életképessége változatlan marad. Általában a transzkripciót elősegítő anyag (például nátrium-butirát) kb. 1,0 mM és kb. 8 mM közötti, előnyösen kb. 1,0 mM és 6,0 mM koncentrációját alkalmazzuk. A találmány szerinti megoldás egy speciális megvalósítási módjában kb. 6 mM koncentrációjú nátrium-butirátot alkalmazunk, míg egy másik megvalósítási módban a nátrium-butirát koncentrációja kb. 1 mM.

A találmány egy további megvalósítási módjában csökkentett mennyiségű sziálsavat tartalmazó glikoproteint állítunk elő. E megvalósítási mód szerint az emlőssejteket olyan feltételek mellett tenyésztjük, amelyek fokozzák a sejtspecifikus termelékenységet, vagyis a vajsav koncentrációját úgy választjuk meg, hogy fokozott sejtspecifikus termelékenységet érjünk el, s ezáltal a kívánt sziálsavtartalmú proteint kapjuk. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a vajsav vagy sója koncentrációját kb. 5 mM és 20 mM közötti értékre, előnyösen kb. 6 mM és 12 mM közötti értékre állítjuk be. Egy speciális megvalósítási módban a nátrium-butirátot kb. 12 mM koncentrációban alkalmazzuk.

A transzkripciót elősegítő anyag (például vajsav vagy sója) megfelelő koncentrációjának meghatározását illetően a 2a. és 2b. ábrára, illetve az I. táblázat adataira hivatkozunk. A találmány szerinti megoldás értelmében az alacsonyabb butirátkoncentráció általában kisebb sejtspecifikus termelékenységet eredményez. A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése során a nátrium-butirát koncentrációját az egyéb tenyésztési paraméterek (például termelési fázisban az ozmolalitás) figyelembevételével határozzuk meg. Ahogy fentebb említettük, az ozmolalitás befolyásolhatja a sejtspecifikus termelékenységet. A butirátsó koncentrációját úgy vá8

HU 226 420 Β1 lasztjuk meg, hogy a termelési fázis alatt a szükséges ozmolalitási érték változatlan maradjon.

Más emlőssejtek, illetve glikoproteinek esetében a sejtspecifikus termelékenység meghatározása érdekében tesztelőtenyészetek hozhatók létre, és a kapott sziálsavtartalom felhasználásával az adott gazdasejtnek megfelelő táblázat, illetve ábra készíthető (szem előtt tartva, hogy a sejtspecifikus termelékenység csökkenése a termelődött glikoprotein sziálsavtartalmának növekedését eredményezi).

A vajsavat vagy sóját (például nátrium-butirátot vagy egyéb alkalmas, transzkripciót elősegítő anyagot) a sejttenyészet termelési fázisának kezdetén adjuk a tenyészethez. A sejttenyésztési eljárásban a termelési fázis előtt előnyösen beiktatunk egy átmeneti fázist, amelyben a sejttenyésztési feltételeket a kívánt sejtspecifikus termelékenységnek, s ezáltal a kívánt sziálsavtartalomnak kedvező értékekre állítjuk át.

A vajsavat vagy sóját bármilyen ismert eljárással hozzáadhatjuk a tenyészethez. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a nátrium-butirátot - egyéb alkalmas tápanyagokkal együtt vagy azok nélkül - adagonként adjuk a rátáplálásos szakaszos tenyészethez.

A találmány szerinti megoldás értelmében az érett glikoprotein sziálsavtartalmának szabályozása céljából - a fentebb említett tényezőkön kívül - a sejttenyésztő közeg ozmolalitását is szabályozzuk. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az ozmolalitást - az érett protein sziálsavtartalmának szabályozása céljából - a sejtspecifikus termelékenységet befolyásoló egyéb faktoroktól függetlenül szabályozzuk, míg egy másik megvalósítási módban az ozmolalitást a sejtspecifikus termelékenységet befolyásoló egyéb faktorok szabályozása mellett szabályozzuk. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint az ozmolalitást és a vajsav koncentrációját egyaránt szabályozzuk.

A sejttenyésztő közeg ozmolalitását úgy szabályozzuk, hogy a sejtspecifikus termelékenység és a termelődő glikoprotein sziálsavtartalma között megfelelő egyensúlyt hozzunk létre. Általában a sejtspecifikus termelékenység az ozmolalitás növelésével növekszik. A kívánt sziálsavtartalmú protein termelődését elősegítő ozmolalitási érték kiválasztásakor szem előtt kell tartani, hogy az ozmolalitás növelése általában az adott protein termelődési sebességének fokozódását eredményezi. A termelődési sebesség csökkentése és az érett glikoprotein sziálsavtartalmának fokozása érdekében az ozmolalitást általában - az adott sejttípusnak megfelelően - alacsonyabb értéken tartjuk.

Emlőssejtek tenyésztése esetén a tenyésztő tápközeg ozmolalitását rendszerint kb. 290-330 mOsm értékre állítjuk be. Az ozmolalitás növelése a protein termelődési sebességének fokozódásához vezet. A proteintermeléshez olyan ozmolalitásértéket választunk ki, hogy a termelődési sebesség megfeleljen a kívánt termékprofilnak. A sziálsavtartalom növelése céljából a termelődési sebességet csökkentjük, az ozmolalitást pedig - a tenyésztett sejt sajátságainak figyelembevételével - alacsonyabb határértéken tartjuk. A fokozott sziálsavtartalom biztosításához az ozmolalitást kb.

250 mOsm és kb. 450 mOsm között, előnyösebben kb. 300 mOsm és kb. 450 mOsm között, még előnyösebben kb. 350 mM és kb. 400 mM között, legelőnyösebben kb. 400 mOsm értéken tartjuk.

Alacsonyabb sziálsavtartalom elérése céljából fokozott termelődési sebességet biztosító ozmolalitási értéket alkalmazunk. A találmány e megvalósítási módja szerint az ozmolalitást 350 mOsm és 600 mOsm között, előnyösen kb. 450 mOsm és kb. 550 mOsm között tartjuk.

Szakember számára kézenfekvő, hogy a tápközeg ozmolalitása a tenyésztőfolyadékban lévő ozmotikusán aktív részecskék koncentrációjától függ, és hogy az ozmolalitást a komplex emlőssejt-tenyészeti tápközeget alkotó számos változó befolyásolja. A tenyésztő tápközeg kiindulási ozmolalitását a tápközeg összetétele határozza meg. Az ozmolalitás ozmométerrel [például a Fischer Scientific (Pittsburgh, Pennsylvania) által „OSMETTE márkanéven forgalmazott készülékkel vagy a Precision Systems, Inc.-tői (Natick, MA) beszerezhető „Osmette model 2007 készülékkel] mérhető. Az ozmolalitás kívánt tartományon belül tartása érdekében a tenyésztő tápközeg különböző komponenseinek koncentrációját szabályozzuk.

A tenyésztő tápközeghez az ozmolalitás növelése érdekében - oldott anyagként - proteinek, peptidek, aminosavak, hidrolizált állati proteinek (például peptonok), nem metabolizált polimerek, vitaminok, ionok, sók, cukrok, metabolitok, szerves savak, lipidek és hasonlók adhatók. A találmány egyik megvalósítási módjában az ozmolalitást úgy szabályozzuk, hogy a rátáplálásos szakaszos tenyésztési eljárás során a sejttenyészethez - a tenyésztő tápközeg egyéb komponenseivel együtt - peptont adunk.

A találmány szerinti megoldás értelmében az ozmolalitást - pepton hozzáadása mellett - aminosavakat, különböző sókat (például nátrium-kloridot) tartalmazó alaptápoldat adagolásával állítjuk be. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a tenyésztő tápközeget például felesleges mennyiségben aminosavakat tartalmazó alaptápoldattal (például az 5 122 469 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett „Super” tápoldattal), glükózzal és peptonnal egészítjük ki.

A fentebb említett kívánt tartományon belüli ozmolalitás biztosítása céljából a tenyésztő tápközegben lévő egyéb alkotórészek koncentrációja is módosítható. A tenyésztés során az elsődleges energiaforrásként szolgáló glükóz koncentrációjának szakaszos vagy folyamatos szabályozásával a tápközeg ozmolalitása a meghatározott előnyös tartományon belül tartható. A glükózkoncentráció szabályozásával a sejtek számára adekvát szénforrást biztosítunk, ugyanakkor szabályozzuk a gazdasejtek tejsavtermelését. Ez azért előnyös, mivel korlátozza a tenyésztő tápközeg H-jának csökkenését (a pH-csökkenés semlegesítőszer - például bázis, így Na₂CO₃ vagy NaOH - hozzáadását tenné szükségessé, ami viszont az ozmolalitás növekedését eredményezné).

A tápközeghez az ozmolalitás fenntartása céljából annak függvényében adunk kiegészítő anyagokat,

HU 226 420 Β1 hogy a sejttenyésztéshez milyen rendszert alkalmazunk. A találmány egyik előnyös megvalósítási módjában a tenyésztést rátáplálásos szakaszos rendszerben végezzük, és a tápközeghez a sejttenyészet termelési fázisa során egy adagban adjuk hozzá a kiegészítő anyagokat. A tápközeg ezenkívül a fentebb leírtak szerint is kiegészíthető a termelési fázis során.

Más módon, a tenyésztő tápközegből időnként mintát vehetünk, és a mintavétel eredménye alapján a tenyésztő tápközeg ozmolalitását a tápoldat megfelelő módosításával állíthatjuk be.

A találmány szerinti eljárásokat a termelt protein kívánt mértékű szializációjának biztosítása céljából fejlesztettük ki. A szializáció mértékét - a fentebb leírt eljárási paramétereken kívül - olyan tényezők is befolyásolják, mint az oxigénellátottság és a glükózkoncentráció, továbbá a tenyészet sejtsűrűsége, a tenyésztés időtartama, valamint a tárolási körülmények (például a hőmérséklet). A találmány tárgykörébe tartozónak tekintjük azokat - az eddig ismertetetteken felüli - tenyésztési paraméterek is, amelyek a fokozott mértékű szializáció biztosítására leginkább alkalmasak.

A glikoprotein kinyerése a tenyészetből

A polipeptid termelési fázisa után a termelődött polipeptidet - jól ismert eljárások alkalmazásával - kinyerjük a tenyésztő tápközegből.

A szóban forgó polipeptidet előnyösen kiválasztott (szekretált) polipeptidként nyerjük ki a tápközegből, de a gazdasejt lizátumából is kinyerhető.

Első lépésként a tenyésztő tápközeget vagy a sejtlizátumot a szemcsés sejttörmelék eltávolítása érdekében centrifugáljuk. Ezt követően a polipeptidet elkülönítjük (tisztítjuk) a szennyező oldható proteinektől és polipeptidektől. Az alkalmas tisztítási eljárások közé tartozik az immunaffinitási vagy ioncserélő oszlopon végzett frakcionálás; az etanolos kicsapás; a reverz fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC); a szilikagélen vagy kationcserélő (például DEAE) oszlopon végzett kromatográfia; a kromatofokuszálás; az SDS-PAGE analízis; az ammónium-szulfátos kicsapás; a például Sephadex G-75 vagy protein-A Sepharose oszlopon végzett gélfiltráció. A tisztítás során a proteolitikus lebomlás gátlására proteázinhibitor - például fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) - is alkalmazható. Szakember számára kézenfekvő, hogy a szóban forgó polipeptid tisztítási eljárásaiban - a polipeptid sajátságainak rekombináns sejttenyészetben történő expresszió miatt bekövetkező változásainak megfelelően módosítások lehetnek szükségesek.

A találmány szerinti megoldás értelmében különösen előnyösek azok a tisztítási eljárások, amelyek a találmány szerinti szénhidrátokra szelektívek. A találmány szerinti eljárással előállítani kívánt glikoproteinek között a sziálsavtartalmú molekulák aránya például ioncserélő gélkromatográfiával vagy kation-, illetve anioncserélő gyanták alkalmazásával végzett nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (melynek során a savasabb frakciót gyűjtjük össze) növelhető.

A glikoprotein analízise

A találmány szerinti eljárásokkal előállított glikoprotein komplex szénhidrátrésze kívánt esetben - a szénhidrát-analízis hagyományos eljárásaival - könnyen vizsgálható. Ennek megfelelően, például a jól ismert lektinblottolás a terminális mannóz vagy egyéb cukrok, például galaktóz kimutatására alkalmas. Az egy, két, három vagy négy elágazódást („antennát”) tartalmazó oligoszacharidok sziálsavakkal történő terminációja úgy mutatható ki, hogy a proteinről - vízmentes hidrazin vagy enzimatikus eljárások alkalmazásával - felszabadítjuk a cukrokat, és az oligoszacharidokat ioncserélő vagy méretkizárásos kromatográfiával (vagy más ismert eljárással) frakcionáljuk. A glikoprotein izoelektromos pontjának - sziálsavak eltávolítása céljából végzett neuraminidázos kezelés előtti és utáni - mérése szintén alkalmazható; az izoelektromos pont neuraminidázos kezelés utáni növekedése a glikoproteinen sziálsavak jelenlétét jelzi.

A találmány szerinti szénhidrátstruktúrák az expresszálódott proteinen N- vagy O-kötésű szénhidrátokként vannak jelen. Az N- és O-kötésű szénhidrátok elsősorban központi („core”) struktúrájukban különböznek. Az N-kötésű glikoziláció azt jelenti, hogy a szénhidrátrész GIcNAc-n keresztül a peptidlánc egy aszparaginjához kapcsolódik. Az N-kötésű szénhidrátok mindegyike közös Mán 1 -6(Man 1 -3)Μβηβ 1 -4GlcNAc31 -46ΙοΝΑοβ-Κ központi struktúrát tartalmaz (amelyben „R jelentése az előállított protein aszparaginja). Az előállított protein aminosavszekvenciája aszparagin-X-szerin, aszparagin-Xtreonin és aszparagin-X-cisztein szakaszokat tartalmaz (amelyekben „X jelentése - a prolin kivételével - bármilyen aminosav). Az O-kötésű szénhidrátok közös központi struktúráját egy treonin vagy szerin hidroxilcsoportjához kapcsolódó GalNAc képezi. Az N- és O-kötésű szénhidrátok közül a komplex N- és O-kötésű szénhidrátok a legjelentősebbek. Az ilyen komplex szénhidrátok több elágazódó struktúrát tartalmaznak. Az egy, két, három és négy kiágazó struktúra a terminális sziálsavak kapcsolódása szempontjából lényeges. Az ilyen külső láncstruktúrák a találmány szerinti szénhidrátokat alkotó specifikus cukrok és kötések további kapcsolódási helyeit biztosítják.

Az így létrejövő szénhidrátok bármilyen ismert eljárással - köztük a leírásban ismertetett eljárásokkal vizsgálhatók. A glikoziláció vizsgálatára több eljárás ismert, melyek a találmány szerinti megoldásban is alkalmazhatók. Ezek a vizsgálati eljárások információkat nyújtanak a pepiidhez kapcsolódó oligoszacharid természetéről és összetételéről. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában a szénhidrátok vizsgálatára alkalmazható eljárások közé tartozik, többek között, a lektinkromatográfia; az impulzusos amperometrikus detektálással kombinált nagy teljesítményű anioncserélő kromatográfia (HPAEC-PAD), amelyben az oligoszacharidok töltésen alapuló elválasztására nagy pH-jú anioncserélő kromatográfiát alkalmazunk; a mágneses magrezonancia-spektroszkópia (NMR); a tömegspektrometria; a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC); a GPC; a monoszacharid-összeté10

HU 226 420 Β1 tel analízis; valamint az egymás utáni enzimatikus emésztés.

Ismeretesek az oligoszacharidok felszabadítására irányuló eljárások is; ezek közé tartoznak a következők:

(1) enzimatikus emésztés, amelyet peptid-N-glikozidáz

F/endo-p-galaktozidáz alkalmazásával végzünk;

(2) β-elimináció, melynek során - főleg O-kötésű struktúrák felszabadítására - erősen lúgos környezetet alkalmazunk; és (3) vízmentes hidrazin alkalmazásával végzett kémiai eljárások, melyekkel N- és O-kötésű oligoszacharidok szabadíthatok fel.

Az analízist az alábbi lépéseket követve végezhetjük:

1. A minta ioncserélt vízzel szembeni dializálása (a puffersók eltávolítása céljából), majd liofilizálása.

2. Az ép oligoszacharidláncok felszabadítása vízmentes hidrazinnal végzett kezeléssel.

3. Az ép oligoszacharidláncok vízmentes metanolos sósavval végzett kezelése (az egyes monoszacharidok O-metil-származékként történő felszabadítása céljából).

4. A primer aminocsoportok N-acetilálása.

5. Per-O-trimetil-szilil-metil-glikozidok előállítása.

6. A kapott származékok elválasztása CP-SIL8 oszlopon végzett kapilláris gáz-folyadék kromatográfiával.

7. Az egyes glikozidszármazékok azonosítása gázfolyadék kromatográfiával megállapított retenciós idejük és tömegspektrometriás analízisük alapján (ismert standardokkal összehasonlítva).

8. Az egyes származékok mennyiségi meghatározása belső standard (13-O-metil-D-glükóz) alkalmazásával végzett FID eljárással.

A neutrális és aminocukrok impulzusos amperometrikus detektálással kombinált nagy teljesítményű anioncserélő kromatográfiával („HPAEC-PAD Carbohydrate System, Dionex Corp.) határozhatók meg. Például a cukrokat 20 V/V%-os trifluor-ecetsavban 100 °C-on hat óra hosszat végzett hidrolízissel felszabadítjuk, majd a hidrolizátumokat liofilizálással vagy „Speed-Vac” (Savant Instruments) alkalmazásával szárítjuk. A visszamaradt anyagot 1%-os nátrium-acetát-trihidrát-oldatban feloldjuk, és HPLC-AS6 oszlopon Anumula és munkatársai eljárásával [Anal. Biochem. 195, 269 (1991)] analizáljuk.

A sziálsav mennyisége az előzőektől függetlenül, három példányban végrehajtott közvetlen kolorimetriás eljárással [Yao és munkatársai: Anal. Biochem. 179, 332 (1989)] határozható meg. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint tiobarbitursavat [TBA; Warren: J. Bioi. Chem. 238, 8 (1991)] alkalmazunk.

Más módon, a szénhidrátok analízisét immunbiot eljárással is végezhetjük. Ennek során a proteinhez kötődő szénhidrátok kereskedelmi forgalomban beszerezhető glikándetektáló rendszer (Boehringer) alkalmazásával mutathatók ki, amely Haselbeck és Hősei oxidatív immunbiot eljárásán alapul [Haselbeck és munkatársai: Glycoconjugate J. 7, 63 (1990)]. A kimutatáshoz a gyártó által előirt festési eljárást követjük, azzal a különbséggel, hogy a proteint nitro-cellulóz helyett poli(vinilidén-difluorid)-membránra másoljuk, és blokkolópufferként 5% szarvasmarha-szérumalbumint és 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó 10 mM Tris-puffert (pH=7,4) alkalmazunk. A detektálást alkalikus foszfátkonjugátummal kapcsolt antidigoxigenin antitestekkel (Boehringer), Tris-pufferelt fiziológiás sóoldatban 1:1000 hígításban - 100 mM nátrium-kloridot és 50 mM magnézium-kloridot tartalmazó 100 mM Trispufferben (pH=9,5) 0,03 m/V% 4-nitrokék-tetrazoliumklorid és 0,03 m/V% 5-bróm-4-klór-3-indolíl-foszfát (foszfatáz szubsztrátok) alkalmazásával - végezzük. A szénhidráttartalmú proteinsávok rendszerint 10-15 percen belül válnak láthatóvá.

A szénhidrátok peptid-N-glikozidáz F alkalmazásával is analizálhatók. Ezen eljárás szerint a visszamaradt anyagot 14 μΙ - 0,18% SDS-t, 18 mM β-merkaptoetanolt, 90 mM foszfátot és 3,6 mM EDTA-t tartalmazó - pufferben szuszpendáljuk, és 100 °C-on 3 percig melegítjük. A szuszpenzió szobahőmérsékletre történő hűtése után a mintát két egyenlő részre osztjuk. Az egyik részt nem vetjük alá további kezelésnek (ezt használjuk kontrollként). A második frakcióhoz kb. 1% koncentrációban NP-50 detergenst, majd 0,2 egység peptid-N-glikozidáz F-et (Boehringer) adunk. Mindkét mintát két óra hosszat 37 °C-on melegítjük, majd SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel analizáljuk.

Tumornekrózisfaktor-receptor/immunglobulin kimérák

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti eljárásokat tumomekrózisfaktor-receptor (TNFR)/immunglobulin (lg) kiméra proteinek előállítására alkalmazzuk. A kiméra proteinek e csoportjának - találmány szerinti megoldás szempontjából - különösen előnyös tagja a tumornekrózisfaktor-receptor szolúbilis 1-es típusa (TNFR1) és az immunglobulin-G-i által képzett kiméra. A TNFRI-lgGj kimérák számos TNF által közvetített vagy TNF-fel kapcsolatos betegség és rendellenesség kezelésére és diagnosztizálására alkalmasak. Ebben az összefüggésben a „kezelés kifejezésen profilaxist (megelőzést), szuppressziót (például egy tünetét) és a már létező állapot tényleges kezelését értjük. A tumornekrózis-faktorral összefüggő kóros állapotok közé tartozik, többek között, a Gram-negatív és Gram-pozitív bakteriémia, az endotoxikus sokk, az átültetett szövet kilökődése, a rheumatoid arthritis, a szisztémás lupus, a Crohn-féle betegség, valamint egyéb, TNF-fel kapcsolatos autoimmun és gyulladásos betegségek.

A TNFRI-lgGí készítmények általában olyan esetekben előnyösek, amelyekben a TNF elleni monoklonális antitestek hatásosnak bizonyultak. Állatmodellekben például a TNF-α elleni monoklonális antitestekről kimutatták, hogy megelőzésszerűen alkalmazva védőhatást biztosítanak [Tracey és munkatársai: Natúré 330, 662 (1987)]. Exley és munkatársai [Láncét 335, 1275 (1990)] leírták, hogy egy első fázisú klinikai vizsgálatban egy rekombináns humán TNF-α elleni egér monoklonális antitest súlyos szeptikus sokkban szenvedő embereknek történő adagolás során biztonságosnak bi11

HU 226 420 Β1 zonyult. A TNFR1-lgGi kiméra előnyösen alkalmazható rheumatoid arthritis és szeptikus sokk kezelésére.

A tumornekrózis-faktorral összefüggő betegség vagy rendellenesség egyik kezelési eljárásában egy ilyen kezelésre rászoruló páciensnek (előnyösen embernek) a TNFRI-IgG! készítmény gyógykezelési szempontból hatásos mennyiségét adjuk be.

A TNFRI-IgG! készítmény hatásos mennyisége páciensenként 0,01-100 mg, előnyösen 1-75 mg, legelőnyösebben kb. 10-50 mg.

A TNFR1-lgG! készítményt a beadás céljára megfelelő gyógyászati készítménnyé kell alakítani. Az ilyen készítmények jellemzően a TNFR1-lgG! gyógykezelési szempontból hatásos mennyiségét, valamint gyógyászati szempontból elfogadható oldószert vagy hordozót (például fiziológiás sóoldatot, puffereit fiziológiás sóoldatot, dextrózt vagy vizet) tartalmaznak. Az ilyen készítmények speciális stabilizálószereket is tartalmazhatnak, például cukrokat (mannózt vagy mannitolt), továbbá - injektálható készítmény esetén - helyi érzéstelenítést, például lidocaint.

A készítmények a TNFR1-lgG! mellett egy másik aktív hatóanyag, így például monoklonális antitest (például anti-TNF antitestek, Maci vagy LFA1 elleni antitestek), vagy a TNF-termelődéssel kapcsolatos egyéb faktorok (például IL—1 vagy IL—2 receptorok) stb. gyógykezelési szempontból hatás mennyiségét is tartalmazhatják.

Az egyszerű vagy kombinált terápia céljaira alkalmas gyógyászati készítmény előnyösen egy

TNFR1-lgG! készítményt tartalmaz, amelynek vérből történő kitisztulási ideje meg van hosszabbítva, miközben funkcionális aktivitása változatlan. Az ilyen meghosszabbított funkcionális felezési idő egyszerűsített, bolusdózisú beadást tesz lehetővé, s elősegíti az in vivő hatást. A gyógyászati készítményben előnyösen alkalmazható TNFR1-lgGi kimérák közé a találmány szerinti eljárással előállított TNFR1-lgG!-et tartalmazó készítmények tartoznak, mint például a következők:

(1) TNFR1-lgG! készítmények, amelyek egy vagy több sziálsavgyökkel lezárt láncú komplex oligoszacharidot tartalmaznak:

(2) TNFR1-lgG! készítmények, amelyek izoelektromos pont (pl) értéke - kromatofokuszálással végzett meghatározás alapján - 5,5 és 7,5 közötti tartományban van, és a pl-érték neuraminidázos kezelésre érzékeny;

(3) TNFR1-lgGi készítmények, amelyek egy mól proteinre számítva körülbelül 1-2 mól szabad N-acetilglükóz-amin-gyököt tartalmaznak;

(4) TNFR1-lgG! készítmények, amelyekben a sziálsav proteinhez viszonyított mólaránya kb. 4-7, előnyösen 5-6;

(5) TNFR1-lgG! készítmények, amelyekben a sziálsav N-acetil-glükóz-aminhoz viszonyított mólaránya kb. 0,35-0,5, előnyösebben kb. 0,4-0,45.

A találmány szerinti egyszerű vagy kombinált gyógyászati készítmények a hagyományos módok valamelyikével, például intravénás infúzióval vagy bolusinjekcióval adhatók be.

A találmányt az általános leírás után az alábbi kísérleti példákon keresztül ismertetjük részletesen. A példákat csupán szemléltetésként, s nem a találmány igényelt oltalmi körének korlátozása céljából írjuk le.

1. példa

A TNF-α és TNF-β biológiai hatásai specifikus receptorok révén érvényesülnek [Dembic és munkatársai: Cytokines 2, 231 (1990)]. Molekuláris klónozással két különböző típusú TNF-receptor (TNFR) létezését bizonyították; az 1. típus látszólagos molekulatömege 55 kD [Schall és munkatársai: Cell 61, 361 (1990)], a 2. típus molekulatömege pedig 75 kD [Smith és munkatársai: Science 248, 1019 (1990)]. Természetes állapotban mindkét típus egyaránt kötődik a TNF-a-hoz és a TNFβ-hoz [Loetscher és munkatársai: Cell 61, 351 (1990); Shall és munkatársai: Cell 61, 361 (1990); Kohno és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331 (1990)]. Természetes állapotban mindkét receptor extracelluláris része oldható TNF-kötő proteinként található [Kohno és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331 (1990)]. Előállítottak olyan TNF-agonistákat, amelyek különféle immunrendszeri és gyulladásos események során gátolják a TNF káros hatásait [Peppel és munkatársai: J. Exp. Med. 174, 1483 (1991); Ulich: Am. J. Path. 142, 1335 (1993); Hovard: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2335 (1993); Wooley: J. Immunoi. 151, 6602 (1993)]. Az egyik ilyen agonistában, melyet Werner és munkatársai írtak le [J. Cell Biochem. Abstracts, 20th annual meeting, 115. old.], az 55 kD-os 1. típusú emberi TNF-receptor a humán IgG! nehéz láncának kapocs- („hinge”) és Fc-régiójával kombinálódik.

Ebben a példában a TNFRI-lgGi kimérát kódoló cDNS-t tartalmazó vektorral transzfektált emlőssejtek tenyésztését írjuk le.

A) Sejtvonal

Az emlős gazdasejtvonalként alkalmazott kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonal a CHO-K1-sejtvonalból (ATCC CCL61 CHO-K1) származott. A CHO-K1 mutáns dihidrofolát reduktáz deficiens (DHFR^-) sejtvonalból [CHO-K1 DUX-B11 (DHFR-)] - melyet dr. L. Chasintól (Columbia University) kaptunk [Simonsen és Levinson: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2495 (1983); Urlaub és Chasin: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)] pre-pro-inzulint kódoló cDNS-t tartalmazó vektorral [Sures és munkatársai: Science 208, 57 (1980)] végzett transzfekcióval olyan sejtvonalat hoztunk létre, amelynek inzulinigénye kisebb. A kiválasztott klón (dp12.CHO) szaporodásához glicint, hipoxantint és timidint igényel, ami DHFR^- genotípusát igazolja [EP 307,247],

B) Szolúbilis TNFR1-ből és IgG^ből álló kiméra előállítása

A szolúbilis TNFR1-ből és IgGi-ből álló kimérát (a továbbiakban TNFR1-lgGi) az emberi TNFR1 extracelluláris doménjét kódoló gén és az IgG! nehéz láncának kapocsrégióját és C_H2- és C_H3-doménjét kódoló gén fúziójával hoztuk létre.

A humán TNFR1-et kódoló DNS-szekvenciát [Loetscher és munkatársai: Cell 61, 351 (1990)] a pRKTNF-R plazmidból [Schall és munkatársai: Cell 61, 361

HU 226 420 Β1 (1990)] állítottuk elő. E kiindulási plazmid előállítása céljából egy 2,1 kb-os méhlepény-eredetű cDNS-klónt [Schall és munkatársai, lásd fentebb] a pRK5 emlős expressziós vektorba [307 247 számú európai szabadalmi leírás, 1989. március 15.] inszertáltunk. Ez a DNS a Loetscher és munkatársai által leírt szekvencia 64. nukleotidjánál kezdődik, s a kezdő metionin 3'-irányban 118 bp távolságra található.

Az lgG_ret kódoló szekvencia forrása a pRKCD4₂F_c1 elnevezésű CD4-lgG expressziós plazmid [Capon és munkatársai: Natúré 337, 525 (1989); Byrn és munkatársai: Natúré 344, 667 (1990)] volt, amely egy hibrid polipeptidet kódol. Ez a hibrid polipeptid az érett humán CD4-protein 1-180. aminosavait (két N-terminálls CD4 variábilis dómén) emberi IgG-,szekvenciához kapcsolva tartalmazza, mely IgG-,szekvencia a 216. aszparagínsawal kezdődik [a 114. aminosavat a nehéz lánc konstans régió első aminosavának tekintve (Kábát és munkatársai: „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 4. kiadás, 1987), mivel ez az lgG₃ kapocsrégiójának - a nehéz lánc kapcsolódásában szerepet játszó risztéin utáni - első aminosava], és a 441. aminosawal végződik, miáltal magában foglalja az !gG₃ C_H2 és C_H3 Fc-doménjét.

ATNFRI-lgG-i előállítása céljából a pRK-TNF-R és pRKCD4₂F_c1 plazmidból restrikciós fragmenseket hasítottunk ki, s a kapott fragmenseket - deléciós mutagenezis alkalmazásával - úgy ligáltuk egymáshoz, hogy az érett TNFR 171. treoninja az IgG! nehéz láncának 216. aszparaginsava mellé kerüljön [Kábát és munkatársai, lásd fentebb]. Az így kapott pRKTNFRIgG plazmid a TNFR1-lgG₁ teljes hosszúságú kódolószekvenciáját tartalmazza.

C) Sejttenyésztés

A TNFR1-lgG-|-et kódoló gént transzfekcióval dp12.CHO sejtekbe vittük be. Ennek során a DNS emlőssejtekbe juttatására alkalmas kalcíum-foszfátos eljárást alkalmaztuk. A transzfekció után két nappal a sejteket tripszinnel kezeltük, majd szelektív táptalajra (glicinhipoxantin- és timidinmentes Ham-féle F-12:DMEM, 1:1 térfogatarányban +2% dializált szérum) szélesztettük. A szelektív táptalajról származó izolátumokat TNFR1-lgGi szekréciójára vizsgáltuk. A TNFR1-lgG_ret expresszáló kiónokat methotrexátban szaporítottuk, miáltal nagy mennyiségben expresszáló kiónokat kaptunk, melyeket szérummentes tápközegre helyeztünk. Ezeket a sejteket szelektív nyomás alatt tartottuk, majd az oltóanyagként szolgáló sejtek szaporítása céljából nem szelektív tápközegre vittük.

A TNFR1-lgG_ret termelő sejttenyészet létrehozása érdekében a fenti sejtpopulációt a methotrexátot tartalmazó tápközegről - sorozatos átoltással - egyre nagyobb térfogatú, methotrexát nélküli tápközeget tartal5 mazó edényekbe vittük át. Ehhez nem szelektív tápközegként a DMEM/HAM F-12 alapú készítményt (lásd például 5 122 469 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) alkalmaztuk, melyben bizonyos komponensek - például a glükóz, aminosavak, sók, cukrok, vitaminok, glicin, hipoxantin, rekombináns humán inzulin, hidrolizált pepton („Primatone HS” vagy „Primatone RL”), sejtvédő anyag (például „Pluronic F68”), Gentarnycin, lipidek és nyomelemek - koncentrációját módosítottuk.

A tenyészetek kémhatását szén-dioxid-gáz és/vagy Na₂CO₃ alkalmazásával pH=7,2±0,4 értékre állítottuk be. A szaporítási fázis során a tenyészetet kb. 37 °C-on inkubáltuk. Az oldott oxigén mennyiségét levegő és/vagy oxigén közvetlen buborékoltatásával

5%-os légtelítettség felett tartottuk.

Az oltóanyag szaporítási fázisa során a tenyészet ozmolalitását kb. 250 mOsm és 350 mOsm közötti értéken tartottuk.

Az egyes tenyészetek szaporítási fázisa után egy második (átmeneti) fázist iktattunk be, amelyben a tenyésztési paramétereket az optimális szaporodásnak megfelelő értékekről a termelésnek kedvező értékekre állítottuk át. Ennek megfelelően, az átmeneti fázis során a tenyészet hőmérsékletét - általában 30-35 °C-ra

- csökkentettük. A tenyészethez a megfelelő ozmolalitási érték eléréséig butirátsót adtunk. A termelési fázis során felhalmozódott terméket sziálsavtartalomra vizsgáltuk.

Egy jellemző termelési rendszerben hozzávetőleg

1,2*10®- szelektív fázisból származó - sejtet a szaporítási fázisban 300 mOsm kiindulási ozmolalitás mellett szaporítottunk. A szaporító tápközeget nyomelemekkel, rekombináns humán inzulinnal és hidrolizált peptonnal egészítettük ki, s a sejteket ilyen körülmények között két napig tenyésztettük. A harmadik nap elején a sejttenyészet hőmérsékletét csökkentettük, s ezzel egy időben (vagy ezután) nátrium-butirátot adagoltunk, majd a termelődésnek kedvező ozmolalitást különböző tápközegkomponensek hozzáadásával állítottuk be.

A sejteket a termelési feltételek mellett - szükség esetén különféle tápközegkomponensekkel táplálva 9-10 napig inkubáltuk.

Az I. táblázatban a különböző termelési eljárásokban alkalmazott termelési feltételeket ismertetjük.

/. táblázat

Eljárás	Butirátkoncentráció (mmol/l)	Ozmolalitás a termelési fázisban (mOsm/kg)	Sejtspecifikus termelékenység az 5. és 10. nap között (pg/dl)	A TNFRI-IgG! sziálsavtartalma a 10. napon (mol/mol)
A	1	360-420	0,6-1,5	6,4-7,2	N=4
B	1	480-510	1,7-2,2	6,0-6,3	N=3
C	6	460	4,8	4,7	N=1

HU 226 420 Β1

/. táblázat (folytatás)

Eljárás	Butirátkoncentráció (mmol/l)	Ozmolalitás a termelési fázisban (mOsm/kg)	Sejtspecifikus termelékenység az 5. és 10. nap között (pg/dl)	ATNFRI-IgG, sziálsavtartalma a 10. napon (mol/mol)
D	6	370-420	2,4-2,8	5,5-5,6	N=3
E	6	350-370	1,4-2,3	5,4-6,3	N=3
F	12	390	4,0	5,3	N=1
G	12	490-510	2,9-5,2	4,0-5,2	N=4
H	12	400-430	2,0-2,8	5,8-6,0	N=3
I	12	370-380	2,0-2,2	5,5-5,9	N=3

D) A TNFR1-lgG₁ kinyerése

A TNFR1-lgG1 kimérát immobilizált Staphylococcus aureus protein-A alkalmazásával végzett affinitási kromatográfiával [Capon és munkatársai: Natúré 337, 525 (1989)] 95%-os homogenitás eléréséig tisztítottuk.

E) Szénhidrát-analízis

A sziálsavtartalmat Warren eljárásával [J. Bioi. Chem. 234, 1971 (1959)] vizsgáltuk.

Eredmények

Az I. táblázatban felsorolt egyes tenyészetekben kapott sejtspecifikus termelékenységet az összegyűjtött termékek sziálsavtartalmával szemben grafikusan ábrázoltuk. Az eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be. A legnagyobb sziálsavtartalmat abban az esetben kaptuk, ha a termelési fázisban az ozmolalitást kb. 360 mOsm és 420 mOsm közötti értéken tartottuk, és kb. 1 mM butirátkoncentrációt alkalmaztunk. A sziálsavtartalom a termelési paraméterek szabályozásával széles tartományban változtatható.

2. példa

Ebben a példában a különböző készítmények vérplazmában mért farmakokinetikus felezési idejének és/vagy kitisztulási sebességének („clearance”) meghatározását írjuk le. A nagyobb sziálsavtartalmú készítmények általában nagyobb felezési időt és/vagy alacsonyabb kitisztulási időt mutatnak, mint a kisebb sziálsavtartalmú készítmények.

Tizenhét, 272-315 gramm testtömegű hím Sprague-DawIey-eredetű patkányt véletlenszerűen három - TNFR1-lgGi fúziós proteinnel kezelt - csoportba osztottunk be (csoportonként 5-6 patkány). Az állatoknak femoralis vénájukba helyezett kanülön keresztül a tesztelt anyag 5 mg/kg-os névleges dózisát adagoltuk. A tesztelt anyagok a következők: a kb. 6 mM butirátkoncentráció és kb. 400 mOsm ozmolalitás mellett (I. eljárás) termelt két TNFRI-lgGj készítmény, valamint egy harmadik, 12 mM butirátkoncentráció és kb. 500 mOsm mellett (II. eljárás) termelt TNFR1-lgG1 készítmény. A tesztelt anyagok beadása előtt, majd a beadás utáni 5. percben, illetve 2., 6., 10., 24., 34., 48., 56., 72., 96. és 120. órában 8,5%-os EDTA-ra két ml-es vérmintákat vettünk. A vérmintákat centrifugáltuk, a plazmát összegyűjtöttük, és a mintákban meghatároztuk a TNFR1IgGi fúziós protein koncentrációját.

A patkányok vérplazmájában a TNFR1-lgG-| mennyiségi meghatározását enzimkötött immunológiai és biológiai kötési vizsgálattal („enzyme-linked immunological and biological binding assay; ELIBA) végez20 tűk. Ez a vizsgálati eljárás a tormaperoxidázhoz (HRP) kapcsolt TNF-α (TNF-a-HRP) azon képességén alapul, hogy megköti a TNFR1-lgGi fúziós protein receptorrészét. A vizsgálati eljárásban mikrotitertálcák üregeire felvitt kecske antihumán IgGFc Fab-fragmenseit használtuk fel a TNFRI-lgG-t megkötésére (a molekula Fc-részével bekövetkező kölcsönhatás révén). Az üregekhez TNF-a-HRP-t adtunk, s hagytuk a megkötött TNFR1-lgG-| receptorrészéhez kapcsolódni. A TNFR1IgG-t mennyiségét a peroxidáz peroxid és orto-fenilén30 diamin (OPD) szubsztráttal lejátszódó reakciója által termelt szín mérése alapján határoztuk meg. A vizsgálati eljárás méréstartománya 0,003-0,02 mg/ml. A plazmamintákban az EDTA jelenléte nem befolyásolta a vizsgálat eredményét.

Valamennyi számítást az idő függvényében ábrázolt koncentráció alapján végeztük. A görbe alatti csonkított területet (AUCq_i2o) ^a trapézszabály alkalmazásával számítottuk, míg a tömeg szerint normalizált csonkított kitisztulást (CLo_i₂o/W) dózis/AUC₀_i2₀ ér40 tékként számítottuk.

Eredmények

A kitisztulási sebesség az alkalmazott tenyésztési eljárástól (I. vagy II. eljárás), illetve a termék sziálsavtartalmától függően változott. Az egyes állatok eseté45 ben meghatározott kitisztulási Időt, valamint az eredmények középértékét és szórását all. táblázatban mutatjuk be. Az I. eljárással lassabb (és ezáltal kedvezőbb) kitisztulási sebességet értünk el.

//. táblázat

A TNFR1-lgGi kitisztulási sebessége a 0-120 óra időtartamban végzett megfigyelés során (ml/óra/kg)

I. eljárás	I. eljárás	II. eljárás
2,12	2,08	2,144
2,03	2,31	2,99
1,63	2,20	2,61
1,89	2,22	3,27

HU 226 420 Β1 //. táblázat (folytatás)

	I. eljárás	I. eljárás	II. eljárás
	1,85	1,99	2,82
		1,66	3,42
Középérték	1,91	2,08	2,88
Szórás	0,02	0,23	0,45

3. példa

A TNFRI-IgG! monoszacharid-összetétele

Az 1. példában leírtak szerint előállított TNFR1lgG-ι monoszacharid-összetételének meghatározása alapján megállapítható, hogy a különböző eljárásokkal 15 előállított glikoproteintermékek sziálsavtartalma változó. A vérplazmából történő gyors kitisztulás nagyobb szabad GIcNAc-koncentrációt, az oligoszacharidláncokon pedig kisebb sziálsavtartalmat eredményez, ezáltal a protein kisebb mértékben képes reagálni a mán- 20 nóz- vagy galaktózreceptorokkal. Ezzel szemben az alacsony kitisztulási sebesség több terminális sziálsavgyököt eredményez.

A) A tesztelt anyagok előállítása

ATNFRI-lgG-ι fúziós proteint az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. Az I. eljárást - a termelési fázis alatt - 6 mM butirátkoncentráció és kb. 400 mOsm ozmolalitás alkalmazásával, míg a II. eljárást 12 mM butirátkoncentráció és kb. 500 mOsm ozmolalitás mellett végeztük.

B) Eredmények

Az ép neutrális és aminocukrok felszabadulását impulzusos amperometriás detektálással kombinált nagy pH-jú anioncserélő kromatografiával határoztuk meg.

Az analízist a következő lépések szerint végeztük:

1. A TNFRI-lgGj (hozzávetőleg 50 pg/ml) és a megfelelő vonatkoztatási minták puffercseréjét úgy valósítottuk meg, hogy a végső minta 1%-os ecetsavban legyen.

2. Hozzávetőleg 90 pg TNFRI-lgGj kimérát, valamint a vonatkoztatási anyagok mintáit alkoholfürdőben, szárazjégen lefagyasztottuk, majd a fagyasztott mintát egy éjszakán keresztül liofilizáltuk.

3. A liofilizált mintákat 500 μΙ trifluor-ecetsavban feloldottuk, majd 120 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk.

4. A savas hidrolízis után a TNFR1-lgG_ret és a vonatkoztatási mintákat lehűtöttük és szárazra pároltuk.

5. A mintákat vízben, hozzávetőleg 0,6 mg/ml végkoncentrációban újra feloldottuk.

6. A monoszacharidokat szobahőmérsékleten, nagy pH-η végzett - impulzusos amperometriás detektálással kombinált - anioncserélő kromatográfiával különítettük el, melynek során „Dionex CarboPac ΡΑΓ oszlopot (4*250 mm; Dionex Corp., Sunnyvale, CA) al10 kalmaztunk.

7. Az egyes monoszacharidok mennyiségi meghatározását a vonatkoztatási monoszacharidokkal történő összehasonlítás alapján végeztük.

C) Eredmények

A két készítményben lévő monoszacharidok relatív moláris mennyiségét a III. táblázatban mutatjuk be.

///. táblázat

A két eljárással kapott TNFRI-IgG! készítményben lévő monoszacharidok relatív anyagmennyisége

Monoszacharid	I. eljárás	II. eljárás
Fukóz	4,3±0,2	4,4
Galaktóz	6,5±0,0	4,7
Mannóz	12,2±0,6	12,5
N-Acetil-glükóz-amin	14,1±0,6	14,3
Sziálsav	4,9±0,3	3,7±0,3
N-Acetil-galaktóz-amin	0,5±0,1	0,3
Sziálsav/GIcNAc arány	0,35	0,26

A fenti eredmények azt bizonyítják, hogy a glikoprotein termelési fázisában alkalmazott paraméterek 35 befolyásolják az érett glikoprotein szénhidrát-összetételét. A nagyobb sziálsavtartalmú készítmények a vérszérumban rendszerint hosszabb felezési időt mutattak.

A IV. és V. táblázatban az I. és II. eljárás körülmé40 nyei között előállított TNFR1-lgG₁ kiméra készítmények oligoszacharid-oldalláncainak szénhidrát-összetételét mutatjuk be. Az V. táblázatban a kiméra molekula receptorrészén (az Fc glikozilációs hely kivételével) lévő szénhidrátokra vonatkozó adatok láthatók.

IV. táblázat

Monoszacharid	Eljárás száma
I.	I.	I.	I.	II.	II.
Sziálsav	5,8	5,8	5,7	5,8	3,7	3,5
Fukóz	4,0	4,0	3,6	4,1	4,4	4,3
GalNAc	0,3	0,2	0,2	0,4	0,3	0,4
GIcNAc	12,9	15,0	14,8	14,3	14,3	14,4
Gál	7,4	7,6	7,1	7,0	4,7	4,1
Mán	12,0	12,0	10,0	12,0	12,5	11,9
Sziálsav/GIcNAc arány	0,45	0,39	0,39	0,41	0,26	0,24

HU 226 420 Β1

V. táblázat

	Eljárás száma
II.	II.	I.	I.
Szabad GIcNAc (mol/mol)	3,18	3,2	1,11	1,32
Szabad Gál (mol/mol)	0,97	-0,08	1,45	-0,26
Gál antennák	4,47	4,72	6,45	6,24
Sziálsav/mol	3,5	4,8	5,00	6,5

A IV. és V. táblázatban bemutatott eredmények azt jelzik, hogy a TNFR1-lgG1 monoszacharid-összetétele a végükön sziálsavat tartalmazó egy, két vagy három elágazó lánccal („antennával”) rendelkező komplex oligoszacharidokra jellemző. Az adatokból látható, hogy az I. eljárással előállított TNFR1-lgG₁ lényegesen nagyobb arányban tartalmaz sziálsavat, ugyanakkor lényegesen kisebb arányú a szabad GIcNAc mennyisége. A protein móljaira vonatkoztatott sziálsavmennyiség azt jelzi, hogy az I. eljárásban előállított termék izoelektromos pontja alacsonyabb, minta II. eljárással kapott terméké. A II. táblázat eredményeivel összehasonlítva ezek az eredmények azt mutatják, hogy az I. eljárásban előállított termék vérplazmából történő lassabb kitisztulása összefüggésben áll a szabad GIcNAc kisebb mennyiségével, s általában a nagyobb sziálsavtartalommal.

A IV. és V. táblázatban látható adatok azt bizonyítják, hogy a TNFR1-lgG₁ készítmények egy vagy több sziálsavgyökkel lezárt láncú komplex oligoszacharidot tartalmaznak. Az előnyös TNFRI-lgGj készítmények a protein egy móljára számítva kb. 1-2 mól szabad N-acetil-glükóz-amin-gyököt tartalmazó TNFR1-lgG-| molekulákat tartalmaznak. A sziálsav proteinre vonatkoztatott mólaránya kb. 4-7. A TNFR1-lgG-| készítményekben a sziálsav:N-acetil-glükóz-amin mólarány 0,4-0,45.

4. példa

A nagy sziálsavtartalmú TNFR1-lgG-i készítmény izoelektromos pontja (pl) kisebb, mint a kevesebb sziálsavat tartalmazó készítményé.

A 2. példában leírt különböző készítményeket izoelektromos fokuszálásnak vetettük alá. A különböző pH-jú amfoter elektrolitokkal létrehozott pH-gradiens alkalmazásával végzett izoelektromos fokuszálás során a géleken a találmány szerinti eljárásokkal előállított készítmények glikoproteinjei izoelektromos pontjuknak megfelelően különülnek el. Kísérletünkben a készítmények vizsgálatát 10->4 pH-gradiens alkalmazásával végeztük.

A TNFR1-lgG₁ készítmények izoelektromos pontja - izoelektromos fokuszálással végzett meghatározás alapján - 5,5 és 7,5 közötti tartományba esett (e vizsgálati eljárásban a pl érzékeny a neuraminidázos kezelésre).

A leírásban említett hivatkozásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni.

Bár a találmány szerinti megoldást előnyös megvalósítási módjain keresztül szemléltettük, szakember 15 számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában különböző változtatások hajthatók végre anélkül, hogy eltérnénk a találmányi gondolattól. Az ilyen megoldások az igényelt oltalmi körön belül maradnak.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás egy emlőssejttenyészet által termelt gli25 koprotein oligoszacharid-oldalláncán lévő sziálsav mennyiségének szabályozására az emlős gazdasejtnek a tenyészet termelési fázisában való tenyésztése útján, azzal jellemezve, hogy (i) a sejttenyészethez 0,1 mM és 20 mM közötti

30 koncentrációban vajsavat vagy vajsavsót adunk, (ii) a sejttenyészet ozmolalitását 250 és 600 mOsm közötti értéken tartjuk, és (iii) a tenyészet hőmérsékletét 30 °C és 35 °C kö35 zött tartjuk, ahol a fenti (i)—(iii) paramétereket annak figyelembevételével választjuk meg, hogy a termelési fázisban a glikoprotein sziálsavtartalma és a sejtspecifikus termelékenység között fordított arány áll fenn.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoprotein oligoszacharid-oldalláncán lévő sziálsav mennyiségét akként növeljük, hogy a gazdasejtet 0,1 mM és 6 mM közötti koncentrációjú vajsav vagy vajsavsó jelenlétében és 300-450 mOsm ozmolalitásérték fenntartásával tenyésztve csökkentjük a sejttenyészet sejtspecifikus termelékenységét.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként CHO-sejtet alkalmazunk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vajsavsóként nátrium-butirátot alkalmazunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikoproteinként emlősglikoproteint állítunk elő.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikoproteinként tumornekrózisfaktor-receptor/immunglobulin kimérát állítunk elő.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként 1. típusú oldható tumomekrózisfaktor-receptorból és immunglobulin-G_rből álló kimérát (TNFRI-IgG^ kódoló cDNS-t hordozó vektorral transzfektált dp12.CHO sejteket alkalmazunk.

HU 226 420 Β1
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoprotein oligoszacharid-oldalláncán lévő sziálsav mennyiségét akként csökkentjük, hogy a gazdasejtet 6 mM és 12 mM közötti koncentrációjú vajsav vagy vajsavsó jelenlétében és 450-600 mOsm ozmolalitási érték fenntartásával tenyésztve fokozzuk a sejttenyészet sejtspecifikus termelékenységét.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként CHO-sejtet alkalmazunk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vajsavsóként nátrium-butirátot alkalmazunk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikoproteinként emlősglikoproteint állítunk elő.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikoproteinként tumornekrózisfaktor-receptor/immunglobulin kimérát állítunk elő.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként 1. típusú oldható tumomekrózisfaktor-receptorból és immunglobulin-G^ből álló kimérát (TNFR1-lgG1) kódoló cDNS-t hordozó vektorral transzfektált dp12.CHO sejteket alkalmazunk.
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás tumomekrózisfaktor-receptor/immunglobulin kiméra protein (TNFR1IgGt) előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) termelési fázisban TNFR-IG kimérát expresszáló emlős gazdasejtet tenyésztünk 30 °C-40 °C közötti hőmérsékleten maximális mértékű sejtszaporodást biztosító feltételek mellett és megfelelő időtartamban, (b) a gazdasejtet a termelési fázisban (i) 6 mM és 12 mM közötti koncentrációjú nátrium-butirát jelenlétében tenyésztjük, és (ii) a termelési fázisban a tenyészet ozmolalitását 450-600 mOsm értéken tartjuk.
15. Az 1. igénypont szerinti eljárás tumornekrózisfaktor-receptor/immunglobulin kiméra protein (TNFR1IgG-i) előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) termelési fázisban TNFT-IG·] kimérát expresszáló emlős gazdasejtet tenyésztünk 30 °C-40 °C közötti hőmérsékleten maximális mértékű sejtszaporodást biztosító feltételek mellett és megfelelő időtartamban, (b) a gazdasejtet a termelési fázisban (i) 1 mM és 6 mM közötti koncentrációjú nátrium-butirát jelenlétében tenyésztjük, és (ii) a termelési fázisban a tenyészet ozmolalitását 300-450 mOsm értéken tartjuk.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként CHO-sejtet alkalmazunk.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként dp112.CHO sejtet alkalmazunk.