CN102839157A

CN102839157A - 稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用

Info

Publication number: CN102839157A
Application number: CN2012103744921A
Authority: CN
Inventors: 刘秀梵; 孙庆; 张文俊; 王晓泉; 胡顺林
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2012-12-26

Abstract

本发明提供一种MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1细胞系及其构建方法，具体涉及将编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和将编码β1-4GalT1基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1基因的MDCK细胞系MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1，该细胞系可用于禽流感病毒疫苗株的大规模细胞化培养和生产。

Description

稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及工程细胞系MDCK-hST3GalIV-β4GalT1及其构建方法，所构建细胞系可用于禽流感疫苗株的大规模细胞化生产。

背景技术

流感病毒表面的血凝素(HA)通过与宿主细胞表面的唾液酸寡糖受体结合从而起始病毒感染宿主细胞，禽源和马源流感病毒偏嗜结合α2,3-唾液酸寡糖受体(Neu5Acα2,3Gal)，而人源和猪源流感病毒偏嗜结合α2,6-唾液酸寡糖受体(Neu5Acα2,6Gal)。因此，细胞表面唾液酸受体的类型及丰度，影响流感病毒对不同宿主的适应性。不同的唾液酸受体对流感病毒在宿主细胞中感染、复制和扩散产生重要的影响。

目前获得批准生产的是鸡胚来源的灭活疫苗。哺乳动物细胞生产的疫苗在动物模型中表现出较好的保护性作用，当前Madin-Darby犬肾上皮细胞系（MDCK）被认为是培养A型和B型流感病毒最适合的细胞系。

传统的流感病毒疫苗是依靠鸡胚生产的，病毒经过培养增殖、浓缩、灭活、进一步纯化，配制、无菌灌装，最后检测和放行。除了研发使用高产重组毒株作为A型流感的种毒，基本生产工艺在过去的60年几乎没什么变化。不仅成本代价高，而且鸡胚的残留物质还可能引起过敏反应，此外，当面临高致病流感病毒导致的全球大流行时，传统的鸡胚生产方法可能不足以满足全球疫苗市场的需求。因此，研究机构和疫苗公司正在合作开发新的生产技术，以达到省时高效的目的。为了获得流感疫苗生产的替代方法，疫苗公司已经尝试了许多新的途径。组织培养的细胞系作为鸡胚生产方式的一种补充或替代方法，已经引起了人们的重视。细胞生产系统主要具有以下优势：1)可以应用许多在鸡胚生产系统中得到临床验证的基本方法(如全病毒的生产、多步裂解、纯度更高的流感抗原或减毒活疫苗)，同时，缩短鸡胚生产的供应时间，稳定产品供应链；2)可以应用更加先进可控的种毒生产系统，由于生产用细胞特征的高度一致性，降低了引入外源性污染的风险；3)提供了一种更加高效、稳定、可重复的疫苗生产方式，使用一种规格可变且封闭的生物反应器，可以在任意时间起始反应，并可以根据需要延长生产周期；4)提高了部分禽流感毒株生产疫苗的能力。除了上述优点，以哺乳动物细胞生产疫苗至少具有一种理论上的优点：在鸡胚中进行的流感病毒的分离和复制通常会产生特定表型的选择，而这种选择往往不同于正确的人类分离株。相反，在细胞中进行的流感病毒的分离复制不会产生这种传代依赖性的表型选择。从而有利于表达天然构象的血凝素抗原，优化抗体的特异性。Madin-Darby犬肾上皮细胞系(MDCK)来源于一只成年猎犬的肾脏组织。关于MDCK细胞来源的季节性流感疫苗的临床试验结果表明，MDCK细胞来源的病毒经过连续传代之后，可以保持抗原的稳定性，此类疫苗的安全性和免疫原性与鸡胚来源的疫苗相当。

人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)能将唾液酸(Neu5Ac)转移到糖蛋白的末端的2型糖链(Galβ1-4GlcNAc)，或者1型糖链(Galβ1-3GlcNAc)上的半乳糖(Gal)，Neu5Ac和末端的Gal之间连键是α2-3。hST3GalIV优先作用于2型糖链(Galβ1-4GlcNAc)，其次才是1型糖链(Galβ1-3GlcNAc)。

人源β1-4半乳糖基转移酶1(UDP-半乳糖：N-乙酰氨基葡萄糖基β1-4半乳糖基转移酶，简称为β1-4GalT1，EC2.4.1.38)，是一组Ⅱ型膜结合糖蛋白，能把半乳糖基(Gal)转移到糖链的N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)上，Gal与GlcNAc之间的连键是β1-4。

发明内容

本研究首次建立了提高禽流感病毒α2,3-唾液酸丰度的MDCK细胞系--MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞。通过稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1，可以增强β1-4GalT1催化半乳糖与N-乙酰葡萄糖以β1-4连键连接的效力，hST3GalIV催化唾液酸与半乳糖以α2-3连键连接的效力，从而提高MDCK细胞表面α2,3-唾液酸丰度。该稳定表达细胞系细胞表面α2,3-唾液酸显著高于母本MDCK细胞系，与母本MDCK细胞系相比，禽流感病毒的分离株和疫苗候选株在MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系上形成更大的噬斑，生长滴度更高。

稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系建立之后，更适合禽流感病毒的生长，无论是病毒滴度还是噬斑形成能力都要更高，也证明了禽流感病毒对α2,3-唾液酸的偏嗜性，不仅为研究α2,3-唾液酸受体提供了方便的工具，对于实时监测禽流感病毒进行受体结合特性、检测禽流感病毒变异株的出现、发现受体结合特性发生变化的禽流感毒株具有广泛的应用价值。此外，MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系在抗禽流感病毒药物、疫苗株筛选以及细胞培养疫苗的生产方面都展示出较好的应用前景。

本发明稳定表达人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)和β1-4半乳糖转移酶(β1-4GalT1)的MDCK细胞系，是MDCK-hST3GalIV-β4GalT1；保藏号为：CGMCC No.5967。所述的MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系同时含有编码hST3GalIV的基因和编码β1-4GalT1的基因。所述编码hST3GalIV的基因序列如SEQ ID No:1所显示，其所编码的hST3GalIV的氨基酸序列如SEQ IDNo:3所显示；所述编码β1-4GalT1的基因序列如SEQ ID No:2所显示，其所编码的β1-4GalT1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所显示。所述编码hST3GalIV基因序列和β1-4GalT1基因序列来自于人。

本发明的另一个方面，提供构建MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系的方法，所述方法包括将hST3GalIV和β1-4GalT1的基因重组到MDCK细胞的基因组中。

所述MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系的构建方法，是将带有编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和带有编码β1-4GalT1基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1基因的细胞系MDCK-hST3GalIV-β4GalT1。

在本发明的另一个方面中，提供一种提高禽流感病毒生长滴度的方法，该方法包括，将H5N1亚型或H9N2亚型禽流感病毒株接种于本发明构建的MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系中，病毒在所述细胞系上的培养条件为35℃、5%CO2。毒株在MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系中生长滴度的提高，为禽流感疫苗的细胞化生产提供了有利条件。

更具体地说，在本发明的一个实施方案中，将编码hST3GalIV基因的真核表达载体和β1-4GalT1基因的真核表达载体转染到MDCK细胞系中，构建稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系，本发明中一株表达hST3GalIV和β1-4GalT1的Madin-Darby犬肾细胞系MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞克隆株于2012年4月10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.5967。

经实验表明，所述MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞中α2,3-唾液酸受体含量显著高于母本MDCK细胞，禽流感病毒在本发明MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系上繁殖的能力显著高于母本MDCK细胞和MDCK-hST3GalIV，禽流感病毒在MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞上测定的滴度均高于在母本MDCK细胞和MDCK-hST3GalIV细胞上的滴度。使用MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系可用于提高禽流感病毒产量并且避免了鸡胚来源灭活疫苗中鸡胚的残留物带来的副反应效应，可用于具有α2,3-唾液酸受体能力的病毒疫苗株的大规模细胞化培养和生产。

附图说明

图1:不同G418浓度下MDCK细胞生存曲线

横坐标：时间(天数)

纵坐标：细胞存活率(%)

选择在10~14天内把细胞全部杀死的浓度作为G418的筛选浓度，即0.8mg/mL。

图2:MDCK与MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞RT-PCR鉴定结果

(A)ST3GalIV基因的电泳结果，1：MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞，2：母本MDCK细胞，M：200bp Marker；

(B)β1-4GalT1基因的电泳结果，1：MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞，2：母本MDCK细胞，M：200bp Marker。

图3:流式细胞术检测不同MDCK细胞表面α2,3-唾液酸受体与特异性凝集素MAA的结合。

(A)MDCK细胞空白对照；MDCK细胞与MAA结合；MDCK-ST细胞与MAA结合；MDCK-STGT细胞与MAA结合；

(B)不同MDCK细胞表面α2,3-唾液酸受体与MAA的结合3次检测果平均值的比较。

(*)表示与MDCK-MAA组相比具有显著差异(p<0.05)；

(**)表示与MDCK MAA和MDCK-ST MAA组相比均具有显著差异(p<0.05)。

注：

MDCK-ST代表MDCK-ST3GalV细胞系；

MDCK-STGT代表MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系。

图4:禽流感病毒在MDCK细胞、MDCK-ST3GalV细胞和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞上的繁殖曲线。

(A)LH5N1在三种细胞上的繁殖曲线；

(B)LR38/H5N1在三种细胞上的繁殖曲线；

(C)F/H9N2在三种细胞上的繁殖曲线。

注：

M代表MDCK细胞系；

ST代表MDCK-ST3GalV细胞系；

STGT代表MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系。

图5:不同禽流感病毒毒株在母本MDCK细胞、MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞上的感染滴度(TCID50)。

(*)表示MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞与母本MDCK细胞测定结果相比具有显著差异(p<0.05)；

(**)表示MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞与母本MDCK细胞和MDCK-ST3GalV细胞相比均具有显著差异(p<0.05)。

注：

MDCK-ST3代表MDCK-ST3GalIV细胞；

MDCK-STGT2代表MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞。

图6:禽流感病毒在在母本MDCK细胞、MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞上的PFU测定。

(**)表示MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞与母本MDCK细胞和MDCK-ST3GalIV细胞相比均具有显著差异(p<0.05)。

注：

MDCK-ST代表MDCK-ST3GalIV细胞；

MDCK-STGT代表MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞。

具体实施方式

下文将参考实施例和附图详细说明本发明，所述实施仅仅旨在举例说明本发明，而非限制本发明的范围，本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1MDCK-hST3GalIV细胞系和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系的构建

1.材料与方法

1.1试剂与仪器

含人源ST3GalIV和β1-4GalT1开放阅读框的真核表达质粒购自Genecopoeia公司(货号：EX-C0523-M02和EX-C0234-M02)；DMEM培养基和无血清Opti-MEM购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Hyclone公司；质粒小量提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit购自Qiagen公司；RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；

HD转染试剂、购自Roche公司；G418(40mg/mL)溶液购自上海生工生物工程有限公司。

MDCK细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

普通倒置显微镜和荧光倒置显微镜为Leica产品；分光光度计为NanoDrop公司ND1000；凝胶成像系统为基因公司产品。

1.2引物设计

用于扩增人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)的引物：

3G4F：5’-ATGGTCAGCAAGTCCCGCTGGAAG-3’（SEQ ID No:5）

3G4R：5’-TCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’（SEQ ID No:6）

用于扩增人源β1-4半乳糖转移酶1(β1-4GalT1)的引物：

B4G1F：5’-ATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAG-3’（SEQ ID No:7）

B4G1R：5’-CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’（SEQ ID No:8）。

1.3确定筛选培养基中合适的G418浓度

MDCK细胞接种48孔细胞培养板待长至80-90%丰度时加入含不同浓度的geneticin（G418）培养基：0、0.1、0.4、0.6、0.8、1、1.5和2mg/mL，置37℃、5%CO2培养箱培养，每天观察并记录细胞生长情况。培养14天后绘制细胞生长曲线确定G418的筛选浓度。

1.4 HD转染MDCK细胞及抗性细胞克隆的筛选

接种约2×10^-5MDCK细胞至6孔细胞板，细胞密度至80%～90%时可用于转染。将

HD转染试剂及质粒溶液平衡到室温，在离心管内准备以下混合液：将编码β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV基因序列的真核表达质粒hST3GAL4和编码β1,4-半乳糖转移酶1基因序列的真核表达质粒β1-4GalT1（均购自Genecopoeia公司）各1μg加入100μL无血清Opti-MEM培养基中，混匀之后，再添5μL

HD转染试剂至上述混合液中，充分混匀之后，室温孵育15分钟，同时用无血清Opti-MEM培养基洗涤两次。将上述复合物覆盖于细胞表面，补加无血清Opti-MEM培养基至总体积为2mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时后移除培养物，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。36小时后用胰酶消化细胞，按1:10的比例传代至48孔细胞板中，继续用含0.8mg/mL G418的10%胎牛血清DMEM培养基为筛选培养基培养，每孔200μL，每3天换一次筛选培养基，G418持续筛选10-14天后，可见有抗性细胞生长。不进行质粒转染的细胞组作为阴性对照，细胞在含有G418的培养液中培养至死亡。选择生长状态良好的抗性细胞集落，继续用于单克隆细胞筛选：用含0.8mg/mL G418的筛选培养基将细胞密度稀释至1个/100μL，铺于96孔细胞板中50μL，每孔补加50μL筛选培养基。持续筛选10天后选择表达水平最高的克隆再次按有限稀释法进行单克隆筛选，以确保筛选出单克隆抗性细胞。筛选出的细胞依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板中扩大培养并冻存于液氮中。

1.5RT-PCR鉴定

筛选出的细胞株和母本MDCK细胞分别在6孔细胞培养板中，每株细胞铺一个孔，以2.5mL含10%胎牛血清的DMEM培养基贴壁培养。待细胞长至90-100%汇合度时，收集细胞，PBS洗涤两次，加入1mL0.25%胰酶，37℃消化5分钟，加入1mL10%DMEM吹打，将吹匀的细胞悬液转移到离心管内离心1000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入PBS吹匀，转移至1.5mL离心管内，2000rpm离心5分钟，弃去上清液，并吸干PBS，加入1mL Trizol，混匀，冰上放置10分钟。加入200μL预冷氯仿，震荡15秒，室温放置2分钟；4℃12000rpm离心10分钟；吸取上层水相约500μL至1.5mL离心管，加入500μL预冷异丙醇，混匀，-20℃放置15分钟；4℃12000rpm离心10分钟；弃去上清液，加入1mL75%预冷乙醇洗涤沉淀；4℃12000rpm离心3分钟；弃去上清液，加入1mL预冷无水乙醇再次洗涤沉淀；4℃12000rpm离心3分钟；吸尽液体，室温10分钟晾干沉淀；加入50μL ddH₂O溶解RNA。以上试验所有的枪头、离心管、ddH₂O和75%预冷乙醇均用DEPC处理并且高压，全程戴手套进行实验。

取2μL溶解的RNA，以分光光度计ND1000检测RNA浓度和A260/A280。提出的总RNA按如下体系反转录形成cDNA，步骤如下：首先加入提取的总RNA溶液22μL、Oligo dT3μL，吹匀之后，置于70℃金属浴作用5分钟后置冰浴上，再加入下列试剂：RNA酶抑制剂2μL、5×缓冲液8μL、M-MuLV反转录酶1μL和dNTP Mix4μL，总反应体积为40μL，置于37℃水浴孵育2~3小时，然后开始RT-PCR反应，使其反转录成cDNA。

以反转录成的cDNA为模板，以3G4F和3G4R为引物通过PCR反应扩增人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)基因；B4G1F和B4G1R为引物扩增β1-4半乳糖转移酶1(β1-4GalT1)基因。PCR反应循环参数：94℃预变性3分钟；94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，共30个循环。配制1%的琼脂糖凝胶，并以EB染色，每孔加入10μLPCR产物，在100V电压下进行电泳，凝胶成像系统检测电泳结果。PCR产物经胶回收试剂盒回收之后，送上海生工生物工程有限公司去测序。

2.结果

2.1培养基G418工作浓度的确定

我们选择10-14天内能够全部杀死MDCK细胞的G418浓度作为筛选浓度。根据细胞生长曲线(图1)，G418浓度在0.8~1.0mg/mL之间时，细胞在10～14天内全部死亡。因此，我们选择0.8mg/mL为本实验中压力筛选培养基中G418的浓度。

2.2RT-PCR鉴定结果

由RT-PCR结果(图2)可见，一株筛选的细胞株扩增出1002bp的条带,条带单一而且清晰，与目的基因(hST3GalIV)大小一致；另一株筛选的细胞株可扩增出两个条带1002bp的条带和1197bp的条带，分别与目的基因(hST3GalIV和β1-4GalT1)大小一致。而对照组中母本MDCK细胞未见到有扩增的条带。说明我们已经将目的条带已经整合到MDCK细胞中。将这两株MDCK细胞按照常规方法扩增冻存。我们分将只扩增一条基因的MDCK细胞定名为MDCK-ST3GalIV细胞，而扩增出两条基因的MDCK细胞定名为MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞。

2.3目的细胞的筛选

正常MDCK细胞转染质粒之后，使用含有0.8mg/mL G418和10%胎牛血清的DMEM培养基进行筛选，获得具有抗性的细胞克隆。在含有G418的培养基中，未转染的细胞死亡。将获得的抗性细胞混合克隆用G418进行有限稀释、鉴定选择之后得到单克隆抗性细胞株。

本发明中，我们对构建好的MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞进行RT-PCR鉴定，同时可在无G418压力筛选下，持续传代细胞株，结果表明外源基因可稳定表达至少10代以上。这些鉴定结果表明，所得到的MDCK-ST3GalIV细胞单克隆细胞株中，ST3GalIV基因开放阅读框序列cDNA已经整合到MDCK细胞基因组中，能够随着MDCK细胞系传代而稳定持续地转录和表达；MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞中，人源ST3GalIV和人源β1-4GalT1基因开放阅读框序列cDNA已经整合到MDCK细胞基因组中，能够随着MDCK细胞系传代而稳定持续地转录和表达。

本发明首次成功构建一株稳定表达人源ST3GalIV基因的MDCK-ST3GalIV细胞系和一株稳定表达人源ST3GalIV和人源β1-4GalT1的MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系，以期提高细胞表面的α2,3-唾液酸丰度。MDCK-hST3GalIV-β4GalT1稳定细胞系的建立，不仅为禽流感病毒α2,3-唾液酸倾向性研究提供重要的研究工具，对于禽流感病毒受体结合特异性变异株监测、抗禽流感病毒药物筛选、中和抗体的测定以及大规模生产细胞培养禽流感病毒疫苗的生产应用，具有广泛的应用前景。

实施例2流式细胞仪检测细胞表面α2,3-唾液酸的表达

1材料与方法

1.1试剂与仪器

地高辛标记糖鉴别试剂盒(DIG Glycan Differentiation Kit)和Anti-Digoxigenin-Fluorescein(Anti-DIG FITC)购自Roche公司；流式细胞仪FACSAria为美国BD公司产品。

1.2流式细胞检测细胞表面唾液酸的表达

母本MDCK与转染MDCK细胞分别铺于6孔细胞板各3个孔。细胞长至90%丰度时(约1.5×10⁶个细胞/孔)，胰酶消化，再加入少量10%DMEM，分别收集每孔细胞至EP管中，1400rpm离心8分钟，收集细胞沉淀。以PBS重悬洗涤两次，再用Buffer I(50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、1mM MgCl₂、1mM MnCl₂、1mM CaCl₂，pH7.5)洗一次。用配置好的封闭稀释液【封闭稀释液的配制：10倍稀释封闭液于TBS(0.05M Tris-HCl、0.15M NaCl，pH7.5)】均匀重悬细胞沉淀，在冰上封闭1小时。之后按上述方法重复洗涤步骤，再分别用一抗DIG标记的MAA处理细胞，同时设一组空白对照，即不加一抗。一抗处理的方法为：加4μL MAA于30μL Buffer I中均匀重悬细胞沉淀，冰浴1小时。重复洗涤步骤，再加入二抗，即1μL Anti-DIG FITC于30μl Buffer I中均匀重悬细胞沉淀，冰浴1小时，最后PBS洗涤3次用于流式细胞仪检测。

2.结果

为了检测α2,3-唾液酸受体在母本MDCK细胞、MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞上的含量，我们使用地高辛(DIG)标记的α2,3-唾液酸特异性凝集素，朝鲜槐凝集素(MAA)作为一抗，FITC标记的抗DIG抗体作为二抗。朝鲜槐凝集素(MAA)能特异性地结合SAα-2,3Gal。检测结果显示，MDCK-ST3GalIV细胞中α2,3-唾液酸受体的含量显著高于母本MDCK细胞，而MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞中α2,3-唾液酸受体的含量均显著高于母本MDCK细胞和MDCK-ST3GalIV细胞(图3)。荧光强度道数区峰图也显示，与母本MDCK细胞相比，MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞的道数区均向右偏移，MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞的偏移量更多(图3)。实验结果表明，ST3GalV基因在MDCK-hST3GalIV细胞中稳定表达，提高了细胞表面α2,3-唾液酸受体的丰度，而人源ST3GalV基因与β1-4GalT1基因在MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞中共表达（图3），进一步提高了其表面的α2,3-唾液酸受体丰度。

实施例3TCID₅₀的测定以及病毒噬斑的测定

1材料与方法

1.1毒株与试剂

H5N1:野毒株A/Mallard/Huadong/lk/2005(L株)由扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病实验室保存(Zhang W J,Xue T,Wu X W，Zhang P H,Zhao G,Peng D X,Hu S L,Wang X Q,Liu X W，Liu W B,Liu X F.Increase in viral yield in eggs andMDCK cells of reassortant H5N1vaccine candidate viruses caused by insertion of 38amino acids into the NA stalk.Vaccine,2011,29:8032-8041.)申请人承诺自申请日起向公众提供20年。

LR38(H5N1)疫苗候选株:为扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病实验室利用反向遗传学技术构建的重组弱毒株(Zhang W J,Xue T,Wu X W，Zhang P H,Zhao G,Peng D X,Hu S L,Wang X Q,Liu X W，Liu W B,Liu X F.Increase in viral yield ineggs and MDCK cells of reassortant H5N1vaccine candidate viruses caused byinsertion of 38amino acids into the NA stalk.Vaccine,2011,29:8032-8041.)，HA和NA基因来源于野毒株A/Mallard/Huadong/lk/2005.申请人承诺自申请日起向公众提供20年。

H9N2:野毒株A/Chicken/Shanghai/F/98(F株)由扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病实验室保存（Shi Huoying,Liu XiuFan,ZhangXiaorong,et al.Generation of an attenuated H5N1avian influenza virusvaccine with all eightgenes from avian viruses,Vaccine,25:7379-7384.）申请人承诺自申请日起向公众提供20年。

TPCK修饰的胰蛋白酶购自Sigma公司。

1.2TCID₅₀的测定

母本MDCK、MDCK-ST3GalIV和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞分别铺于96孔板，待细胞密度至90%时用无血清DMEM洗两遍，洗去死细胞以及残留的血清，然后接种病毒。在冰浴的离心管中用无血清DMEM将病毒液作10倍梯度稀释，从10^-1~10^-10。同时在病毒稀释液中加入TPCK修饰的胰蛋白酶，使其终浓度为1μg/mL。将病毒稀释液接种到96孔板中，每一稀释度接种8个孔，100μL/孔，然后置于35℃、5%CO₂培养箱吸附1小时，每隔20分钟就晃匀一次。吸附1小时之后，吸弃接种的病毒稀释液，加入无血清DMEM，每孔200μL，同时也加入TPCK修饰的胰蛋白酶，使其终浓度为1μg/mL。H5N1亚型野毒株培养48小时、H5N1亚型重组弱毒株和H9N2亚型野毒株培养72小时之后分别吸取上清50μL至96孔血凝板中，加入等体积1%鸡红细胞悬液，30分钟后观察每孔的血凝结果，以血凝活性的有无代表细胞病变的有无，按Reed-Muench法计算出半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose，TCID₅₀)结果。

1.3病毒噬斑

母本MDCK细胞、MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞分别铺于6孔细胞培养板上，待细胞密度至90%时，弃去生长液，用无血清DMEM洗两遍，洗去死细胞以及残留的血清，然后接种病毒。以无血清DMEM稀释病毒贮存液(10^-1～10^-8)，加入终浓度1μg/mL TPCK修饰的胰蛋白酶，每个稀释度接种3个孔，轻轻晃动6孔细胞培养板，使加入的病毒稀释液均匀铺于细胞表面上，置于35℃、5%CO₂培养箱吸附1小时。吸附1小时之后，吸弃接种的病毒稀释液，以无血清DMEM洗两遍；加入第一层覆盖液(1.6%琼脂：2倍2%DMEM=1：1)，混匀之后铺于细胞表面使之完全覆盖，H5N1亚型重组弱毒株和H9N2亚型野毒株凝胶液中添加终浓度1μg/mL TPCK修饰的胰蛋白酶，1.5mL/孔，凝固之后，将细胞培养板倒置，置于35℃、5%CO₂培养箱培养。48~72小时之后取出细胞培养板，加入第二层覆盖液(16%琼脂：2倍2%DMEM：1‰中性红=9：9：2)，每孔1.5mL，凝固之后，将细胞培养板倒置，置于35℃、5%CO₂培养箱培养。24~48小时之后取出细胞培养板，计数空斑，以噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)表示病毒的感染滴度。

2.结果

2.1TCID₅₀测定结果

为了检测提高表面α2,3-唾液酸的MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞是否更适合禽流感病毒的增殖，我们选择在H5N1亚型和H9N2亚型毒株中选择几株测定TCID₅₀(图5)。实验结果表明，不论是H5N1亚型还是H9N2亚型毒株在MDCK-hST3GalW-β4GalT1细胞上测定的滴度均高于在母本MDCK细胞和MDCK-hST3GalIV细胞上的滴度(p<0.05)，初步说明我们构建的MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系因为表面的α2,3-唾液酸丰度提高而比母本MDCK细胞和MDCK-hST3GalIV细胞更适合禽流感病毒的增殖。

2.2病毒噬斑

实验结果表明，三株禽流感病毒在母本MDCK细胞、MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞上均能形成噬斑，但在MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞上比另两种细胞形成的噬斑个体更大，相同病毒稀释度的孔，出现噬斑的数量更多，时间也更早。PFU测定的结果显示，同种病毒在MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞上测定的结果最高(图6)。病毒噬斑实验结果进一步表明我们构建的MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系更适合禽流感病毒的增殖。

TCID50和噬斑形成试验的结果均表明，共表达人源ST3GalIV和β1-4GalT1基因的MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞对禽流感病毒的敏感性显著高于母本MDCK细胞系和单表达hST3GalIV的MDCK-hST3GalIV细胞系，MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系更适合禽流感病毒的增殖。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

atggtcagca agtcccgctg gaagctcctg gccatgttgg ctctggtcct ggtcgtcatg 60

gtgtggtatt ccatctcccg ggaagacagg tacatcgagc ttttttattt tcccatccca 120

gagaagaagg agccgtgcct ccagggtgag gcagagagca aggcctctaa gctctttggc 180

aactactccc gggatcagcc catcttcctg cggcttgagg attatttctg ggtcaagacg 240

ccatctgctt acgagctgcc ctatgggacc aaggggagtg aggatctgct cctccgggtg 300

ctagccatca ccagctcctc catccccaag aacatccaga gcctcaggtg ccgccgctgt 360

gtggtcgtgg ggaacgggca ccggctgcgg aacagctcac tgggagatgc catcaacaag 420

tacgatgtgg tcatcagatt gaacaatgcc ccagtggctg gctatgaggg tgacgtgggc 480

tccaagacca ccatgcgtct cttctaccct gaatctgccc acttcgaccc caaagtagaa 540

aacaacccag acacactcct cgtcctggta gctttcaagg caatggactt ccactggatt 600

gagaccatcc tgagtgataa gaagcgggtg cgaaagggtt tctggaaaca gcctcccctc 660

atctgggatg tcaatcctaa acagattcgg attctcaacc ccttcttcat ggagattgca 720

gctgacaaac tgctgagcct gccaatgcaa cagccacgga agattaagca gaagcccacc 780

acgggcctgt tggccatcac gctggccctc cacctctgtg acttggtgca cattgccggc 840

tttggctacc cagacgccta caacaagaag cagaccattc actactatga gcagatcacg 900

ctcaagtcca tggcggggtc aggccataat gtctcccaag aggccctggc cattaagcgg 960

atgctggaga tgggagctat caagaacctc acgtccttct ga 1002

<210> 2

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人

<400> 2

atgaggcttc gggagccgct cctgagccgg agcgccgcga tgccaggcgc gtccctacag 60

cgggcctgcc gcctgctcgt ggccgtctgc gctctgcacc ttggcgtcac cctcgtttac 120

tacctggctg gccgcgacct gagccgcctg ccccaactgg tcggagtctc cacaccgctg 180

cagggcgggt cgaacagtgc cgccgccatc gggcagtcct ccggggacct ccggaccgga 240

ggggcccggc cgccgcctcc tctaggcgcc tcctcccagc cgcgcccggg tggcgactcc 300

agcccagtcg tggattctgg ccctggcccc gctagcaact tgacctcggt cccagtgccc 360

cacaccaccg cactgtcgct gcccgcctgc cctgaggagt ccccgctgct tgtgggcccc 420

atgctgattg agtttaacat gcctgtggac ctggagctcg tggcaaagca gaacccaaat 480

gtgaagatgg gcggccgcta tgcccccagg gactgcgtct ctcctcacaa ggtggccatc 540

atcattccat tccgcaaccg gcaggagcac ctcaagtact ggctatatta tttgcaccca 600

gtcctgcagc gccagcagct ggactatggc atctatgtta tcaaccaggc gggagacact 660

atattcaatc gtgctaagct cctcaatgtt ggctttcaag aagccttgaa ggactatgac 720

tacacctgct ttgtgtttag tgacgtggac ctcattccaa tgaatgatca taatgcgtac 780

aggtgttttt cacagccacg gcacatttcc gttgcaatgg ataagtttgg attcagccta 840

ccttatgttc agtattttgg aggtgtctct gcttcaagta aacaacagtt tctaaccatc 900

aatggatttc ctaataatta ttggggctgg ggaggagaag atgatgacat ttttaacaga 960

ttagttttta gaggcatgtc tatatctcgc ccaaatgctg tggtcgggac gtgtcgcatg 1020

atccgccact caagagacaa gaaaaatgaa cccaatcctc agaggtttga ccgaattgca 1080

cacacaaagg agacaatgct ctctgatggt ttgaactcac tcacctacca ggtgctggat 1140

gtacagagat acccattgta tacccaaatc acagtggaca tcgggacacc gagctag 1197

<210> 3

<211> 333

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Met Val Ser Lys Ser Arg Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val

1 5 10 15

Leu Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg Tyr Ile

20 25 30

Glu Leu Phe Tyr Phe Pro Ile Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln

35 40 45

Gly Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg

50 55 60

Asp Gln Pro Ile Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr

65 70 75 80

Pro Ser Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu

85 90 95

Leu Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile

100 105 110

Gln Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg

115 120 125

Leu Arg Asn Ser Ser Leu Gly Asp Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val

130 135 140

Ile Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly

145 150 155 160

Ser Lys Thr Thr Met Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp

165 170 175

Pro Lys Val Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe

180 185 190

Lys Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys

195 200 205

Arg Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val

210 215 220

Asn Pro Lys Gln Ile Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala

225 230 235 240

Ala Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys

245 250 255

Gln Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu

260 265 270

Cys Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn

275 280 285

Lys Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met

290 295 300

Ala Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg

305 310 315 320

Met Leu Glu Met Gly Ala Ile Lys Asn Leu Thr Ser Phe

325 330

<210> 4

<211> 398

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Arg Ser Ala Ala Met Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu

20 25 30

His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser

35 40 45

Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Asp Leu Arg Thr Gly

65 70 75 80

Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln Pro Arg Pro

85 90 95

Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser

100 105 110

Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro

115 120 125

Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile Glu

130 135 140

Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln Asn Pro Asn

145 150 155 160

Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His

165 170 175

Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys

180 185 190

Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln Leu Asp

195 200 205

Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn Arg

210 215 220

Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp

225 230 235 240

Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp

245 250 255

His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val Ala

260 265 270

Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr Phe Gly Gly

275 280 285

Val Ser Ala Ser Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro

290 295 300

Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg

305 310 315 320

Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly

325 330 335

Thr Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn

340 345 350

Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser

355 360 365

Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val Gln Arg Tyr

370 375 380

Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser

385 390 395

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtcagca agtcccgctg gaag 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagaaggac gtgaggttct tg 22

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgaggcttc gggagccgct cctgag 26

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctagctcggt gtcccgatgt ccac 24

Claims

1.一种稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系，是MDCK-hST3GalIV-β4GalT1，其含有hST3GalIV和β1-4GalT1基因序列；所述hST3GalIV的基因序列如SEQ ID No: 1所示，所述β1-4GalT1的基因序列如SEQ ID No: 3所示；所述细胞系的保藏号是CGMCC No. 5967。

2.权利要求1所述的稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系的构建方法，其特征在于，是将带有编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和带有编码β1-4GalT1基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1基因的细胞系MDCK-hST3GalIV-β4GalT1。

3.根据权利要求2所述MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤：

1）MDCK细胞的转染及抗性细胞克隆的筛选

转染： MDCK细胞密度在6孔板至80%～90%密度时用于转染；将编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和编码β1-4GalT1基因序列的真核表达质粒各1μg质粒于100 μL无血清Opti-MEM培养基中，混匀后添加5 μL FuGENE^®HD转染试剂，充分混匀之后室温孵育15分；将上述复合物覆盖于细胞表面，补加无血清Opti-MEM培养基至总体积为2 mL，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24小时后移除培养物，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养；

抗性细胞克隆的筛选：转染后36小时后用胰酶消化细胞，按1:10 的比例传代至48孔细胞板中，继续用含0.8 mg/mL G418的10%胎牛血清DMEM培养基为筛选培养基培养，每孔200 μL，每3天换一次筛选培养基，G418持续筛选10-14天后，可见有抗性细胞生长；选择生长状态良好的抗性细胞集落，继续用于单克隆细胞筛选：用含0.8 mg/mL G418的筛选培养基将细胞密度稀释至1个/100 μL，铺于96孔细胞板中50 μL，每孔补加50 μL筛选培养基；持续筛选10天后选择表达水平最高的克隆再次按有限稀释法进行单克隆筛选，以确保筛选出单克隆抗性细胞；选出的细胞依次于96孔、24孔和 6孔细胞培养板中扩大培养并冻存于液氮中；

2）MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系的鉴定

提取上述所获具有抗性细胞的RNA，并反转录形成cDNA，以反转录成的cDNA为模板，用PCR方法分别通过PCR反应扩增人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV基因和β1-4半乳糖转移酶1基因；扩增结果表明MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系已成功构建，

3G4F：5’- ATGGTCAGCAAGTCCCGCTGGAAG-3’

3G4R：5’-TCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’

用于扩增人源β1-4半乳糖转移酶1(β1-4GalT1)的引物：

B4G1F：5’- ATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAG-3’

B4G1R：5’- CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’。

4.权利要求1所述MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1细胞系用于提高禽流感病毒分离株的生长滴度以及噬斑形成能力。

5.权利要求1所述MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1细胞系在生产疫苗中的应用。