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KR102007930B1 - 재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법 - Google Patents

재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법 Download PDF

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KR102007930B1 KR1020140195976A KR20140195976A KR102007930B1 KR 102007930 B1 KR102007930 B1 KR 102007930B1 KR 1020140195976 A KR1020140195976 A KR 1020140195976A KR 20140195976 A KR20140195976 A KR 20140195976A KR 102007930 B1 KR102007930 B1 KR 102007930B1
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Abstract

본 발명은 재조합 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 인슐린을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 당쇄 패턴을 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법 {A method for controlling glycosylation of recombinant glycoprotein}
본 발명은 재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법에 관한 것이다.
에타너셉트(Etanercept)는 인간 p75 TNF-α 수용체(TNFR, TNF-α receptor)의 리간드 결합 부분을 인간 IgGⅠ의 Fc 단편에 연결한 TNFR-Fc 융합 단백질로, 2002년에 암젠(Amgen)에 의해 엔브렐(Enbrel)이라는 상품명으로 출시되었다. 에타너셉트는 체내에서 세포 표면의 TNF-α 수용체와 TNF-α가 결합하는 것을 경쟁적으로 저해함으로써 TNF-α와 관계된 면역반응을 억제한다. 따라서 에타너셉트는 TNF-α 저해제로 류마티스 관절염, 건선, 강직성 척추염 등에 사용되고 있으며, 혈관염, 알츠하이머병 및 크론병에 적용하기 위한 임상 연구가 진행 중에 있다.
한편, 유전자재조합의약품은 유전자 조작기술을 이용하여 제조되는 펩타이드 또는 단백질 등을 유효성분으로 하는 의약품을 말한다. 생명공학기술을 이용하면 자연 상태에서 얻기 힘든 다량의 고순도 재조합단백질을 얻을 수 있는 장점이 있으나, 목적 단백질의 유전자가 외부로부터 숙주세포에 삽입되는 것이기 때문에 발현 구조체 자체는 불안정할 수 있다. 뿐만 아니라 인체가 아닌 미생물이나 동, 식물세포 등에서 발현시켜서 단백질을 생산하기 때문에 재조합단백질은 구조적, 물리화학적, 면역화학적, 생물학적 성질이나 특성 측면에서 천연형 단백질과 차이가 날 수 있다(권오석 외, FDC 법제연구 제5권 제1,2호, 13-21, 2010).
특히, 당단백질인 경우 숙주세포의 종류, 재조합체의 조작방법, 배양 조건에 따라 당질화(glycosylation) 여부와 당사슬의 구조나 형태가 달라질 수 있다. 즉 당단백질의 생산과정에서 당사슬 구조나 당사슬을 구성하는 성분당의 양의 차이 등에 따라 다양한 종류의 당사슬(glycoform)이 생성되어 생산조건의 차이에 따른 불균일성(heterogeneity)이 존재할 수 있게 된다. 당사슬 구조가 서로 다른 당단백질의 경우 생체 내 동태나 조직분포가 천연형과 다르거나, 천연형에 대하여 길항 작용을 하여 유해 반응을 일으키기도 하고 장기간 연속 투여 시 항원으로 작용하여 면역학적 문제를 일으킬 수도 있다.
이와 같이 당사슬은 약리효과와 체내동태에 영향을 미칠 수 있는 중요한 요소가 될 수 있으므로 당사슬 구조를 조절하는 것은 의약품용 재조합 당단백질 제품 개발 및 대량생산 기술 개발 분야에서 매우 중요하다.
이와 관련하여 선행문헌으로 한국공개특허 2011-0139292는 단백질 글리코실화의 제어 및 그와 관련된 조성물 및 방법에 대하여 기재하고 있고, 한국공개특허 2012-0134116은 치료 당단백질 상의 Ｎ-글리코실화 부위 점유를 증가시키는 방법에 대하여 기재하고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 재조합 당단백질의 당쇄화를 조절하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인슐린을 포함한 배지를 사용할 경우 재조합 당단백질의 당쇄 패턴을 조절할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 재조합 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 인슐린을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 당쇄 패턴(glycosylation pattern)을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 배양 배지에서 재조합 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배양하여 성장시키는 성장 단계; 및 (b) 상기 배지에 인슐린을 첨가하여 배양하여 당단백질을 생산하는 생산 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 당쇄 패턴을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 재조합 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 인슐린을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 당쇄 패턴(glycosylation pattern)을 조절하는 방법을 제공한다.
상기 당단백질(glycoprotein)은 당이 폴리펩티드의 특정한 아미노산과 결합한 단백질을 말하며, 상기 당은 예를 들어 1 또는 2 이상의 단당류가 연결된 당사슬로 이루어진 것을 의미할 수 있다. 일 예로 상기 당사슬은 당단백질에 여러 가지의 단당류가 연결된 올리고당으로, 푸코오즈, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오즈, 만노오즈, 시알산 등의 단당류, 글루코오즈, 자일로오즈, 만노오즈-6-인산, 또는 이의 분지된 형태 등을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 재조합 당단백질은 면역글로불린 융합 단백질인 것일 수 있다. 상기 면역글로불린은 면역글로불린(immunoglobulin; Ig)의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한 부분을 제외한, 중쇄 불변영역2(CH2), 중쇄불변영역(CH3) 및 힌지(hinge) 부분을 포함하는 면역글로불린의 일부분인 Fc를 포함하는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 재조합 당단백질은 TNFR-Fc 융합 단백질인 것일 수 있다.
상기 TNFR(tumor necrosis factor receptor)는 TNF-α에 결합하는 수용체 단백질을 의미한다. 상기 TNFR 단백질은 TNFRI(p55) 단백질 또는 TNFRII(p75) 단백질을 모두 포함하며, 바람직하게는 TNFRII 단백질이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 TNFRII는 TNFRSF1B(Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B)와 혼용될 수 있다. 상기 TNFRII 단백질은 4개의 도메인 및 막통과(transmembrane) 영역으로 나뉘며, 그 예로 235개의 아미노산으로 구성되어 있는 4개의 도메인 및 막 통과 영역을 포함하는 TNFRII 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TNFRI 단백질 및 TNFRII 단백질에 대한 정보는 미국 국립 보건원 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession number가 NP_001056 또는 P20333인 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 TNFR 단백질은 인체 내에 과발현되면 여러 질환을 일으키는 것으로 알려져 있는 TNF-α에 결합하는 활성을 지니므로, 이를 이용하여 자가면역질환과 같은 TNF-α에 의해 매개되는 질병의 치료에 이용할 수 있다. 이를 위하여 면역글로불린의 Fc 영역을 TNFR 단백질에 융합시켜 반감기를 증대시킨 융합 단백질의 형태로 제작하여 이용할 수 있다.
상기 TNFR(tumor necrosis factor receptor)-Fc 융합 단백질은 TNFR 단백질 전부 또는 일부분이 면역글로불린의 Fc 영역과 효소 작용에 의하여 연결되거나, 또는 유전자 조작을 통하여 상기 두 폴리펩타이드가 하나의 폴리펩타이드로 발현된 결과물을 의미한다. 상기 TNFR-Fc 융합 단백질은 TNFR 단백질과 면역글로불린의 Fc 영역이 직접 연결되거나 펩타이드 링커(peptide linker)를 통하여 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TNFR-Fc 융합 단백질의 비제한적인 예로 에타너셉트가 포함될 수 있다(US patent 7,915,225; 5,605,690; Re. 36,755).
상기 TNFR-Fc 융합 단백질은 TNFR 단백질의 전부 또는 일부분을 면역글로불린 Fc 영역과 융합하여 제작할 수 있으며, 그 예로 TNFRⅡ 단백질의 1번 내지 235번 아미노산 부위와 힌지(hinge) 부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 영역의 232개의 아미노산을 융합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 TNFR-Fc 융합 단백질은 발현하고자 하는 숙주세포에 따라 코돈 최적화(codon optimization)될 수 있으며, 그 예로 CHO 세포에 특이적으로 코돈 최적화된 TNFR-Fc 융합 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TNFR-Fc 융합 단백질은 상기 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 TNF-α에 결합하는 활성을 갖는 단백질이라면 모두 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 상기 TNFR-Fc 융합 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 Fc는 면역글로불린(immunoglobulin; Ig)의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한 부분을 제외한, 중쇄 불변영역2(CH2), 중쇄불변영역(CH3) 및 힌지(hinge) 부분을 포함하는 면역글로불린의 일부분을 의미한다. 또한, 본 발명의 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연형 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이며, 더욱 바람직하게는 IgG1 유래이나, 어떠한 서브클래스(즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로부터 얻어지든 무방하다.
상기 Fc 부위는 Fc 부위를 코딩하는 유전자를 재조합 벡터를 이용하여 유전공학적으로 제조하거나 정제된 폴리클로날 항체 또는 단일클로날 항체로부터 파파인, 펩신 등 적당한 단백질 절단 효소로 절단하여 얻어낼 수 있다.
상기 TNFR-Fc 융합 단백질은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주 세포에 도입하여 발현시킴으로써 수득할 수 있다. 본 발명에 대한 일 실시예에서는 TNFR-Fc 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로서 pCUCBin-mSig-TNFcept 벡터를 사용하였고, 이를 CHO 세포에 형질도입하고 TNFR-Fc 융합 단백질을 발현시켰다.
본 발명에서 상기 미생물은 숙주 세포 또는 형질전환체와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 비제한적인 예로, 동물 세포주, 식물 또는 효모 숙주일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 미생물로 CHO 세포(Chinese Hamster Ovarian ovary cell)를 사용하였으나, 상기 재조합 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 변이될 수 있는 한 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드는 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함시키는 방법은 당업계에서 사용되는 방법이라면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 일 예로, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 미생물 내에 포함될 수 있다. 다른 일 예로 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 발현 벡터에 의하여 변이시키는 방법을 사용할 수 있다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 상기 발현 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다.
상기 재조합 당단백질의 당쇄 패턴(glycosylation pattern)은 당단백질의 당질화(glycosylation)를 통해 나타나는 당사슬의 발현 양상을 의미한다. 예를 들어 단백질에 결합하는 당질화 유무, 당의 종류, 당질화 유형, 당의 함량, 몰비를 포함하는 단당류(성분당)의 조성, 당사슬의 위치, 서열을 포함하는 당사슬의 구조, 당질화 자리, 당질화 점유율, 당사슬의 수, 또는 구조별 상대 함량 등을 포함하는 것일 수 있다. 재조합 당단백질의 당쇄 패턴에 따라 생물활성이나 생체 내 안정성에 차이를 일으킬 수 있다.
본 발명에서 인슐린은 재조합 당단백질의 N-연결 당쇄화(N-linked glycosylation)를 조절하는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 N-연결 당쇄화는 N-당질화와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 일 예로, 상기 인슐린은 재조합 당단백질의 N-글리칸의 함량을 감소시키는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 N-글리칸은 N-당사슬과 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 당이 단백질의 아스파라긴 아미노산에 결합한 경우를 의미할 수 있다.
본 발명에서 인슐린은 재조합 당단백질의 O-연결 당쇄화(O-linked glycosylation)를 조절하는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 O-연결 당쇄화는 O-당질화와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 다른 일 예로, 상기 인슐린은 재조합 당단백질의 O-글리칸의 함량을 감소시키는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 O-글리칸은 O-당사슬과 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 당이 단백질의 세린이나 트레오닌 아미노산에 결합한 경우를 의미할 수 있다.
본 발명에서 인슐린은 재조합 당단백질의 N-연결 당쇄화 및 O-연결 당쇄화 를 조절하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 인슐린의 첨가가 당단백질의 당쇄 패턴에 영향을 주는 것으로 나타났다(표 2). 특히, 인슐린의 첨가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 변화하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 인슐린의 첨가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 감소하도록 조절할 수 있음을 확인하였다. 특히 당단백질을 생산할 수 있는 세포의 배양 단계 중, 생산 단계에서 인슐린의 첨가가 당쇄패턴 조절에 중요함을 확인하였다.
상기 인슐린의 농도는 전체 배지 부피에 대하여 0.0001 mg/L 내지 1g/L 인 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 인슐린의 농도 증가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 감소하도록 조절할 수 있음을 확인하였다(표 2).
상기 배지는 당업계에서 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 또는 숙주세포를 배양하기 위하여 사용되는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 일 예로 상기 배지는 글루탐산(L-Glutamine), 티미딘(Thymidine), 알라닌(Alanine), 아르기닌(Arginine, monohydrochloride), 아스파라기닌(Asparagine, monohydrate), 아스파르트산(Aspartic acid), 시스테인(Cysteine), 글라이신(Glycine), 히스티딘(Histidine), 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 라이신(Lysine, monohydrochloride), 메티오닌(Methionine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 프롤린(Proline), 세린(Serine), 트레오닌(Threonine), 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine, disodium salt, dehydrate), 발린(Valine) 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 일 예로, 상기 배지는 글루코스(Glucose), 탄산수소나트륨 (Sodium bicarbonate), 염화나트륨(Sodium chloride), 염화칼슘(Calcium chloride, ananhydrous), 황산제이구리(Cupric sulfate, pentahydrate), 질산(II)철(Ferric nitrate, nonahydrate), 황산(I)철(Ferrous sulfate, heptahydrate), 염화칼륨(Potassium chloride), 황산마그네슘 (Magnesium sulfate, ananhydrous), 염화마그네슘 (Magnesium chloride, ananhydrous), 인산나트륨(Sodium phosphate, monobasic 또는 dibasic, monohydrate), 황산아연(Zinc sulfate, heptahydrate), 히포크산틴(Hypoxanthine), 푸트레신 디하이드로클로라이드(Putrescine, dihydrochloride), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 비오틴(Biotin), 판토텐산칼슘(D-Calcium pantothenate), 염화콜린(Choline Chloride), 시아노코발라민(Cyanocobalamin), 폴산(Folic acid), 이노시톨(i-Inositol), 니코틴아미드(Nicotinamide), 피리독살(Pyridoxal, monohydrochloride), 피리독신(Pyridoxine, monohydrochloride), 리보플라빈(Riboflavin), 티아민(Thiamine, monohydrochloride), 글루코스(glucose, anhydrous), 염화칼륨(Potassium Chloride), 인산나트륨 (NaH2PO4·H2O), 탄산수소나트륨 (NaHCO3), HEPES(free acid), 덱스트란황산(Dextran Sulfate), 염화나트륨(Sodium Chloride), 아스코르브산(Ascorbic acid), D-비오틴(D-Biotin), 염화콜린(Choline Chloride), 폴산(Folic acid), Hypep 1510, 또는 그 중 2이상의 조합을 포함할 수 있다. 초기 종 배양 시 발현양 증가를 위하여 MTX를 추가로 포함할 수 있다.
상기 배양은 관류 배양(perfusion culture)일 수 있다. 상기 배양은 미생물 주위에 배양액을 흘리면서 배양하는 것을 의미할 수 있다. 관류 배양을 통하여 인슐린의 농도를 목적하는 당쇄 패턴에 따라 용이하게 조절할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 (a) 배양 배지에서 재조합 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배양하여 성장시키는 성장 단계; 및 (b) 상기 배지에 인슐린을 첨가하여 배양하여 당단백질을 생산하는 생산 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 당쇄 패턴을 조절하는 방법을 제공한다.
일 예로, 상기 재조합 당단백질은 면역글로불린 융합 단백질인 것일 수 있다. 다른 일 예로, 상기 재조합 당단백질은 TNFR-Fc 융합 단백질인 것일 수 있다. 이는 상기한 바와 같다.
상기 (a)단계인 성장 단계는 종 배양 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 (a)단계의 배지는 인슐린을 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 (b)단계는 목적하는 당쇄 패턴에 따라 인슐린 농도를 다르게 첨가하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 성장 단계에서 인슐린의 첨가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 변화하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 인슐린의 첨가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 감소하도록 조절할 수 있음을 확인하였다. 특히 당단백질을 생산할 수 있는 세포의 배양 단계 중, 생산 단계에서 인슐린의 첨가가 당쇄패턴 조절에 중요함을 확인하였다.
상기 인슐린의 농도는 전체 배지 부피에 대하여 0.0001mg/L 내지 1g/L 인 것일 수 있다. 인슐린의 농도 증가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 감소하도록 조절할 수 있음을 확인하였다(표 2).
인슐린은 재조합 당단백질의 N-연결 당쇄화(N-linked glycosylation) 및 O-연결 당쇄화(O-linked glycosylation)를 조절하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 인슐린은 재조합 당단백질의 N-글리칸의 함량을 감소시키는 것일 수 있다. 다른 일 예로, 상기 인슐린은 재조합 당단백질의 O-글리칸의 함량을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 당단백질의 당쇄 패턴 조절 방법은 재조합 당단백질의 활성, 폴딩, 분비, 안정성, 혈장 내 반감기 및 면역 반응 등을 조절할 수 있다. 특히, 성장 단계에서 인슐린의 첨가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 변화시킬 수 있으므로, 특히 당분자의 결합의 균일성이 중요한 의약품용 재조합 당단백질 생산에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pCUCBin-mSig-TNFcept 의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 세포 배양 시간(단위: 일)에 따른 생존 세포 수(단위 105 cells/ml) 및 생존율(%)을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 당단백질 생산용 세포주의 제조
1-1. 벡터의 제조
제한 효소(Restriction enzyme)의 처리, 플라스미드 DNA 의 정제, DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질전환 등과 같은 분자생물학에서 일반적으로 사용한 방법들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning(2판)에 소개된 방법들에 최소한의 변형을 가하여 실시하였다.
HUVEC 세포주에서 분리된 mRNA를 주형으로 한 cDNA 라이브러리를 이용하여 사람 p75 TNF 수용체 (TNFR) 유전자를 클로닝하고, 이를 Human IgG1의 Fc Region과 융합하여 TNFR-IgG1을 얻었다. 이를 이용하고 pTOP-BA-RL-pA vector (대한민국 공개특허 제10-2012-0059222호; 'CMVe'와 'CB', 그리고 'Beta-actin Intron'을 가지고 있음)를 주형으로 하여, 도 1의 개열지도와 같이 pCUCBin-mSig-TNFcept 벡터를 제조하였다.
1-2. 모세포 배양
CHO/dhfr- (CHO DXB11)을 모세포로 사용하였다. CHO/dhfr-는 Chinese Hamster의 난소세포로부터 분리된 후, 돌연변이를 통해 Dihydrofolate Reductase (DHFR) 유전자가 결핍된 세포이다.
1-3. 형질전환 및 생산용 세포주 선택
P75 TNF 수용체 (TNFR) 유전자가 포함된 상기 pCUCBin-mSig-TNFcept 벡터 와 CHO/dhfr- (CHO DXB11)를 이용하여 형질전환된 세포를 만들고 MTX 농도를 이용하여 유전자를 증폭시켰다. 이 중 기준에 만족하는 후보들을 고르고 단일 클론인지 평가한 후 생산용 세포주로 선택하였다. 그 후 상기 세포주를 유리병에 넣고 액체 질소에 보관하였다.
실시예 2. 당단백질 생산용 세포주의 배양 및 단백질의 회수
배양에 사용되는 배지는 배양 단계에 따라 다르게 사용하였다. Media X011SB (Merck Millipore, Cat. No. 102443) 5.8g/l 에 인슐린을 첨가한 기본 배지에, 종배양 단계(Seed Cultivation Phase)에서는 무수 글루코스(Sigma) 10g/l 및 L-Glutamine, Glycine, Serine(Sigma)을 각각 0.584 g/l 첨가한 배지(Media EC-SI)를 사용하였고, 성장 단계(Growth Phase)에서는 무수 글루코스 5g/l 및 L-Glutamine, Glycine, Serine을 각각 0.584 g/l 첨가한 배지(EC-GM)를 사용하였고, 생산 단계(Production Phase)에서는 무수 글루코스 15g/l 및 L-Glutamine, Glycine, Serine을 각각 0.584 g/l 첨가한 배지(EC-PM)를 사용하였다.
실시예 1에서 제조한 세포주가 담긴 유리병을 수조에서 재빨리 해동한 후, 10mL의 배지가 들어있는 Falcon Tube로 세포를 옮겼다. 그 후 원심분리하여 상등액을 1차로 제거하였다. 이를 Media EC-SI 10mL로 재현탁시킨 후 최종부피가 50mL이 되도록 Erlenmeyer Flask에 접종하고 5L CelliGen310 배양기를 이용하여 작업량(Working Volume) 기준으로 2L로 배양하였다. 5회의 종배양을 거쳐 세포수가 2 x 106 cells/mL에 도달하면 관류 배양을 통해 EC-GM 배지로 교환을 시작하였다. 세포수가 증가함에 따라 배지를 교환하는 속도를 증가시켜 세포가 잘 분화할 수 있도록 하였다. 세포수가 1.5 x 107 cells/mL에 도달하면 배지를 EC-PM 배지로 교환하여 성장단계에서 생산단계로 넘어가도록 하였다. 총 4회에 걸쳐서 회수를 진행하고, 회수된 단백질을 정제하였다. 결과값은 4회의 평균값으로 계산하였다.
실시예 3. 글리칸(glycan)의 함량 분석
3-1. O- glycan 함량 분석
실시예 2에서 정제된 시료는 25 mM Sodium Phosphate, pH 6.3 버퍼로 희석하여 1.0 mg/mL 농도로 100 μl이 되도록 준비하였다. 각 시료에 N-글리코시다아제 F(Glycosidase F; 1U/μl, Roche) 4 μl와 뉴라미니다아제(Neuraminidase; 1U/100 μl, Roche) 1 μl, 트립신(Trypsin; 1mg/mL, Promega) 2 μl를 첨가하여 37 ℃에서 18시간 동안 반응시키고 LC-MS 분석을 수행하였다.
상기 시료를 80 μl 주입하고, C18 RP 컬럼(4.6 mm x 250 mm, 5 μm, 300 Å; Vydac, Cat. No. 218TP54)을 사용하여 트립신 분해 펩티드(Tryptic Peptide)를 분석하였다. 이동상 A는 0.1% TFA in Water, 이동상 B는 0.1% TFA in 80% Cold ACN 을 이용하였고, Gradient 조건으로 150분 동안 분석하였다. UV 검출기(detector)를 이용하여 215 nm에서 펩타이드를 검출하였고, LC를 통과해 나온 물질은 질량분석기(Mass spectrometry; LTQ XL, Thermo)에 연결하여 MS 분석을 수행하여 O-glycopeptide의 상대면적비(Relative Area, %)를 계산하였다.
3-2. N- glycan 함량 분석
실시예 2에서 정제된 시료와 표준품(에타너셉트, Pfizer)를 각각 3.0mg/mL이 되도록 시료 희석액(25 mM Sodium Phosphate, pH 6.3 버퍼)으로 희석하여 준비하였다. 각 시료 100 μl 와 N-glycosidase F 용액 6 μl 를 혼합하여 37 ℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 용액에 에탄올 400 μl 를 첨가하고 볼텍싱하였다. 이를 원심분리한 후 상등액만을 취하여 Eppendorf Tube에 옮겨 담고, Speed-Vac Concentrator를 이용하여 용액을 완전히 건조시켰다. 건조시킨 시료에 2-AA 라벨링제를 10 μl 넣고 혼합하였다. 45 ℃에서 반응시킨 후 상온에서 식혔다.
일회용 배양 튜브 위에 GlycoClean S 카트리지(Cartridge)를 올려놓은 다음, 정제수, 30% 아세트산, 아세토니트릴(Acetonitrile)을 차례로 흘려주었다. 그 후 상기 식힌 시료를 카트리지의 막 중앙에 로딩한 후 아세토니트릴을 흘려주었다. N-glycan을 용출시키기 위하여 카트리지에 정제수를 가해 Eppendorf Tube에 모이도록 하였다. 결과물인 Glycan 수용액을 동결건조시켜 분석 전까지 보관하였다.
0.5mM 아세트산암모늄(pH 5.6)을 이동상 A로, 250mM 아세트산암모늄(pH5.6)을 이동상 B로 하여 HPLC 컬럼(AsahiPak NH2P-50 4E, 4.6x250 mm)에서 Gradient조건으로 130분 동안 분석하였다. 형광검출기를 이용하여 검출하였고, 결과 해석을 위하여 N-glycan의 말단에 존재하는 시알산(Sialic acid)의 개수 별로 피크들에 대한 면적의 합을 계산하였다. 시알산이 없을 경우 neutral, 1개(monosialyl)일 경우 -1 charge, 2개(disialyl)일 경우 -2 charge로 표시하였다.
실험예 1. 생산 단계에서 인슐린을 첨가하지 않은 배지로 세포주를 배양
상기 실시예 2의 생산 단계에서 인슐린을 제외하고는 동일한 배지로 세포주를 배양한 후, 배양 온도 별 N-glycan의 함량(%)과 O-glycopeptide의 상대 면적비 (%)를 분석하여 하기 표 1에 나타내었다.
배양온도
(생산단계)		 Harvest N-glycan -2 charge
(%, 평균)		 O-glycopeptide의
상대 면적비
(%, 평균)
30oC H1 12.5 56.13
H2
H3
H4
32oC H1 16.1 54.38
H2
H3
H4
실험예 2. 생산 단계에서 인슐린 첨가에 따른 당쇄패턴 변화 비교
상기 실시예 2의 생산 단계에서 인슐린의 첨가 여부에 따라 당단백질의 당쇄 패턴을 비교하여 하기 표 2에 나타내었다.
배양온도 배지 내
인슐린 농도		 Harvest N-glycan -2 charge
(%, 평균)		 O-glycopeptide의
상대 면적비
(%, 평균)
30oC 0mg/L H1 12.5 56.13
H2
H3
H4
0.003mg/L H1 10.4 54.68
H2
H3
H4
0.009mg/L H1 10.9 52.68
H2
H3
H4
0.03mg/L H1 9.7 49.5
H2
H3
H4
그 결과, 당단백질을 생산할 수 있는 세포의 배양 단계 중, 생산 단계에서 인슐린의 첨가가 당단백질의 당쇄 패턴에 영향을 주는 것으로 나타났다. 특히, 인슐린의 첨가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 변화하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 인슐린의 첨가에 따라 N-글리칸 또는/및 O-글리칸의 함량이 감소하도록 조절할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 재조합 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 인슐린을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 당쇄 패턴(glycosylation pattern)을 조절하는 방법으로서, 상기 인슐린은 재조합 당단백질의 N-글리칸 또는 O-글리칸의 함량을 감소시키는 것인, 방법으로서,
    상기 재조합 당단백질은 면역글로불린 융합 단백질이고;
    상기 인슐린의 농도는 전체 배지 부피에 대하여 0.0001mg/L 내지 1g/L 인 것인, 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 당단백질은 TNFR-Fc 융합 단백질인 것인, 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린은 재조합 당단백질의 N-연결 당쇄화(N-linked glycosylation) 및 O-연결 당쇄화(O-linked glycosylation)를 조절하는 것인, 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 관류 배양인 것인, 방법.
  9. (a) 배양 배지에서 재조합 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배양하여 성장시키는 성장 단계; 및
    (b) 상기 배지에 인슐린을 첨가하여 배양하여 당단백질을 생산하는 생산 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 당쇄 패턴을 조절하는 방법으로서,
    상기 인슐린은 재조합 당단백질의 N-글리칸 또는 O-글리칸의 함량을 감소키고;
    상기 재조합 당단백질은 면역글로불린 융합 단백질이고;
    상기 인슐린의 농도는 전체 배지 부피에 대하여 0.0001mg/L 내지 1g/L 인 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (b)단계는 목적하는 당쇄 패턴에 따라 인슐린 농도를 다르게 첨가하는 것인, 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제9항에 있어서,
    상기 재조합 당단백질은 TNFR-Fc 융합 단백질인 것인, 방법.
  14. 삭제
  15. 제9항에 있어서,
    상기 배양은 관류 배양인 것인, 방법.
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