HU226259B1

HU226259B1 - Structure-based designed herbicide resistant products

Info

Publication number: HU226259B1
Application number: HU9900852A
Authority: HU
Inventors: Genichi Kakefuda; Jae-Gyu Kwagh; Karl-Heinz Ott; Gerald W Stockton
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2008-07-28
Also published as: JP4469833B2; ATE342968T1; DE69636637D1; BR9604993A; WO1996033270A1; US6576455B1; ES2275275T3; EP0821729B1; CA2218526C; NO974803L; CZ331797A3; NZ307012A; PL322899A1; NO974803D0; JP2007159577A; HUP9900852A3; EP0821729A1; PL186091B1; HUP9900852A2; MX9708079A

Description

(54) Szerkezeti alapon tervezett herbicidrezisztens termékek (57) Kivonat

A találmány tárgya eljárás acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) szerkezeti alapon történő modellezésére és olyan variánsainak tervezésére, melyek rezisztensek imidazolinonokra és más herbicidekre. A találmány tárgyát képezik továbbá AHAS-t gátló herbicidekre rezisztens növények, herbicidrezisztens AHAS-variánsok, a variánsokat kódoló DNS, a variánsokat kifejező növények és gyomkezelési eljárások.

A találmány szerinti megoldás alkalmas herbicidrezisztens haszonnövények előállítására.

HU 226 259 Β1

A leírás terjedelme 52 oldal (ezen belül 26 lap ábra)

HU 226 259 Β1

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható herbicidrezisztens haszonnövények előállítására.

Az acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) az az enzim, amely katalizálja az első lépést az izoleucin, leucin és valin bioszintézisében baktériumokban, élesztőkben és növényekben. így például a kukoricából (Zea mays) származó érett AHAS mintegy 599 aminosavból álló fehérje, amely a kloroplasztban lokalizálódik (lásd az 1. ábrát). Az enzim tiamin pirofoszfátot (TPP) és flavin adenin dinukleotidot (FAD) használ kofaktorként, és piruvátot szubsztrátumként, hogy acetolaktátot képezzen. Ez az enzim katalizálja a piruvát és 2-ketobutirát kondenzációját, acetohidroxi-butirátot képezve. Az AHAS ismeretes acetolaktát szintetázként vagy acetolaktát piruvát Házként (karboxilezés) is, enzimológiai osztályozása szerint ez az EC 4.1.3.18.-ba tartozik. Az aktív enzim valószínűleg legalább egy homodimer. Ibdah és munkatársai [Protein Science, 3, 479 (1994)] egy összefoglalóban ismertetnek egy modellt az AHAS aktív helyéről.

Igen sokféle herbicid működik azon az alapon, hogy gátolja az AHAS enzim aktivitását, ezek között megemlítjük az imdazolinon vegyületeket, például az imazetapirt (imazethapyr) (PURSUIT - American Cyanamid Company-Wayne, New Jersey), a szulfonilkarmabid-alapú vegyületeket, például a szulfometuronmetilt (sulfometuron-methyl) (OUST - E. I. du Pont de Nemours és Company Wilmington, Delaware), triazolopirimidin szulfonamidokat [Broadstrike - Dow Elanco; lásd Gerwick és munkatársai: Pestic. Sci., 29, 357-364 (1990)], szulfamoil-karbamidokat [Rodaway és munkatársai: Mechanism of Salectively ofAc 322.140 in Paddy Rice, Wheat and Bariey (Az Ac 322.140 szelektivitásának mechanizmusa rizs-, búza- és árpaföldeken), Proceedings of the Brighton Corp Protection Conference-Weeds (1993)], pirimidiloxi-benzoesavakat [STABLE - Kumiai Chemical Industry Company; E. I. du Pont de Nemours and Company; lásd: The Pesticide Manual 10. kiadás, 888-889 oldal (szerkesztő: Clive Tomiin, kiadó: British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham, Surrey G49 7PH, Egyesült Királyság)], és szulfonil-karboxamidokat (Alvarado és munkatársai; 4.883.914 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). Az ilyen herbicidekkel kapcsolatban lásd még az alábbi irodalmi helyeket: Chaleff és munkatársai: Science, 224, 1443 (1984); LaRossa és munkatársai: J. Bioi. Chem., 259, 8753 (1984), Ray: Plánt Physiol., 75, 827 (1984); Shanerés munkatársai: Plánt Physiol., 76, 545 (1984). Ezek a herbicidek igen hatékonyak, ugyanakkor környezeti szempontból enyhék. Alkalmazásuk a mezőgazdaságban azonban korlátozott szelektivitásuk hiánya miatt, mivel a termények éppen úgy érzékenyek ezen herbicidek fitotoxikus hatására, mint a nemkívánatos gyomok.

Bedbrook és munkatársai (5.013.659; 5.141.870 és 5.378.824 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak) bemutatnak számos szulfonil-karbamid-rezisztens AHAS-variánst. Ezeket a variánsokat azonban vagy mutagenizált növényekből, magokból vagy sejtekből nyerték herbicidrezisztens mutánsok kiválasztásával, vagy ilyen mutánsokból származtak. Ez a megközelítés azonban kiszámíthatatlan, amennyiben ez (legalábbis kezdetben) inkább egy releváns mutáció véletlenszerű bevezetésén alapszik, mint egy ésszerűen tervezett megközelítésen, amely a célzott fehérje szerkezeti modelljén alapszik.

így továbbra is szükség van a szakterületen olyan eljárásokra és kompozíciókra, amelyek a termesztett növényekben széles szelektív spektrumát nyújtják a speciális herbicidrezisztenciának. A jelen találmány feltalálói rájöttek arra, hogy az AHAS szelektív herbicidrezisztens variáns formái és az ezeket tartalmazó növények elkészíthetők az AHAS szerkezeti alapon történő modellezésével a piruvát-oxidáz (POX) ellen, azonosítva egy herbicidkötő „zseb-et vagy zsebeket az AHAS modellen, és tervezve olyan speciális mutációkat, amelyek megváltoztatják a herbicid aktivitását a kötőzsebekhez. Ezeket a variánsokat és növényeket nem gátolják vagy nem pusztítják el egy vagy több osztályba tartozó herbicidek, és megfelelő AHAS enzimaktivitás marad vissza, hogy támogassa a hasznos növény növekedését.

Az alábbiakban röviden leírjuk a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábra egy 600 aminosavból álló szekvenciát mutat be, amely megfelel a kukoricából (Zea mays) származó acetohidroxisavszintetáz mintegy 599 tagból álló aminosavszekvenciájának. (A kukorica AHAS enzimjét alkalmazzuk példaként a növényi AHAS enzimekre). A szekvenciában nem található tranzit szekvencia, és a többlet glicin egy trombin hasítási helyből marad vissza. A Met53, Arg128 és Phe135 gyökök fel vannak tüntetve.

A 2. ábra a kukorica AHAS és a Lactobacillus planarumból származó piruvát-oxidáz (POX) szekvenciáinak egymás mellé állítását mutatja be.

A 3. ábra egy AHAS alapegység szekunder szerkezetének vázlatos bemutatása. A szabályos szekunder szerkezeti elemeket, az α-hélixeket és a β-rétegeket (sheet) körökkel, illetve ellipszisekkel ábrázoljuk, és az egy alegységben található három dómén mindegyikében külön-külön számozzuk. A hurkok és a csavarodások területeit fekete vonalak képviselik, az elemek hozzávetőleges kezdetét és végét képviselő számokkal. A kofaktor kötőhelyeket és az ismert mutációs helyeket nyolcszögek, illetve csillagok jelzik.

A 4. ábra a kukorica AHAS-nak a kötőzsebbe modellezett imazetapirhez (PURSUIT her2

HU 226 259 Β1

Igen sokféle herbicid működik azon az alapon, hogy gátolja az AHAS enzim aktivitását, ezek között megemlítjük az imdazolinon vegyületeket, például az imazetapirt (imazethapyr) (PURSUIT - American Cyanamid Company-Wayne, New Jersey), a szulfonil-karmabidalapú vegyületeket, például a szulfometuron-metilt (sulfometuron-methyl) (OUST - E. I. du Pont de Nemours és Company Wilmington, Delaware), triazolopirimidin szulfonamidokat [Broadstrike - Dow Elanco; lásd Gerwick és munkatársai: Pestic. Sci., 29, 357-364 (1990)], szulfamoil-karbamidokat [Rodaway és munkatársai: Mechanism of Selectively of Ac 322.140 in Paddy Rice, Wheat and Barley (Az Ac 322.140 szelektivitásának mechanizmusa rizs-, búza- és árpaföldeken), Proceedings of the Brighton Corp Protection Conference-Weeds (1993)], pirimidiloxi-benzoesavakat [STABLE - Kumiai Chemical Industry Company; E. I. du Pont de Nemours and Company; lásd: The Pesticide Manual 10. kiadás, 888-889 oldal (szerkesztő: Clive Tomiin, kiadó: British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham, Surrey G49 7PH, Egyesült Királyság)], és szulfonil-karboxamidokat (Alvarado és munkatársai; 4.883.914 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). Az ilyen herbicidekkel kapcsolatban lásd még az alábbi irodalmi helyeket: Chaleff és munkatársai: Science, 224, 1443 (1984); LaRossa és munkatársai: J. Bioi. Chem., 259, 8753 (1984), Ray: Plánt Physiol., 75, 827 (1984); Shaner és munkatársai: Plánt Physiol., 76, 545 (1984). Ezek a herbicidek igen hatékonyak, ugyanakkor környezeti szempontból enyhék. Alkalmazásuk a mezőgazdaságban azonban korlátozott szelektivitásuk hiánya miatt, mivel a termények éppen úgy érzékenyek ezen herbicidek fitotoxikus hatására, mint a nemkívánatos gyomok.

Az alábbiakban röviden leírjuk a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábra egy 600 aminosavból álló szekvenciát mutat be, amely megfelel a kukoricából (Zea mays) származó acetohidroxisavszintetáz mintegy 599 tagból álló aminosavszekvenciájának. (A kukorica AHAS enzimjét alkalmazzuk példaként a növényi AHAS enzimekre). A szekvenciában nem található tranzit szekvencia, és a többlet glicin egy trombin hasítási helyből marad vissza. A Met53, Arg 128 és Phe135 gyökök fel vannak tüntetve.

A 4. ábra a kukorica AHAS-nak a kötőzsebbe modellezett imazetapirhez (PURSUIT herbicid) szolgáló aktív helye számítógéppel kialakított modelljének bemutatása.

HU 226 259 Β1

Az 5. ábra a különböző növényfajtákból származó AHAS aminosavszekvenciák közti homológia bemutatása. A pAC751 az a maize als 2 AHAS izoenzim, amely a pAC751 E. coli expressziós vektorból fejeződik ki, ez látható az 1. ábrában; Maizeals2 a maisé als 2 AHAS izoenzim; Maizealsl a maize als 1 AHAS izoenzim; Tobacl egy dohány izoenzim, a tobacco AHAS SuRA izoenzim; Tobac2 a tobacco AHAS SuRB izoenzim; az Athcsr12 az Arabidopsis thaliana Csr 1.2 AHAS-gén; Bnaal3 a káposztafélék közé tartozó Brassica napus AHAS lll izoenzimje; és a Bnaal2 a Brassica napus AHAS II izoenzimje.

A pAC751 és a Maizeals2 azonos gének azzal az eltéréssel, hogy a Maizeals2 a tranzit szekvencia kezdeténél indul, míg a pAC751 a vélt érett N-terminális helynél indul, egy további glicinnel az N-terminálisnál, a pGEX-2T expressziós vektorban levő trombin felismerő szekvencia miatt. Az N-terminális glicin ennél a helynél nem természetes aminosav.

Az AHAS-fehérjék aminosavszekvenciáinak egymás mellé állítását a PILEUP alakította ki. (GCG Package - Genetics Coputer Group, Inc., - University Research Park - Madison, Wisconsin). A konszenzus szekvenciát a PRETTY GCG Packageval alakítottuk ki.

A 6. ábra egy fehérjére festett SDS (nátrium-dodecil-szulfát) poliakrilamid gél fénykép illusztrációja, amely bemutatja a kukorica AHAS tisztítását. A csíkok balról jobbra az alábbiakat tartalmazzák: A: molekulatömeg markerek; B: nyers E. co//-sejtkivonat; C: glutation-agaróz affinitással tisztított készítmény; D: az affinitással tisztított készítmény trombinos emésztése; E: második passzálás glutation-agaróz oszlopon, és szefakril (Sephacryl S-100) gélszűrés.

A 7. ábra a vad típusú és mutáns AHAS-fehérjék enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményeit mutatja be grafikusan imazetapir (PURSUIT herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a 100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.

A 8. ábra a vad típusú és mutáns AHAS-fehérjék enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményeit mutatja be grafikusan szulfometuron-metil (OUST herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a

100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.

A 9. ábra a vad típusú Arabidopsis AHAS-fehérje és a Met124lle Arabidopsis AHAS-fehérje mutáns enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményeit mutatja be grafikusan imazetapir (PURSUIT herbicid) és szulfometuron-metil (OUST herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a 100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.

A 10. ábra a vad típusú Arabidopsis AHAS-fehérje és a Met124His Arabidopsis AHAS-fehérje mutáns enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményét mutatja be grafikusan imazetapir (PURSUIT herbicid) és szulfometuron-metil (OUST herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a 100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.

A 11. ábra a vad típusú Arabidopsis AHAS-fehérje és az Arg199Glu Arabidopsis AHAS-fehérje mutáns enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményeit mutatja be grafikusan imazetapir (PURSUIT herbicid) és szulfometuron-metil (OUST herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a 100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.

A 12. ábra a növények transzformálásához használt DNS-vektor vázlatos bemutatása. Ez a DNS-vektor tartalmazza az nptll gént (amely a kanamicinrezisztenciát kódolja) a 35S promoter szabályozása alatt, és az AHAS-gént (vad típusát vagy variánst) az Arabidopsis AHAS promoter szabályozása alatt.

A 13. ábra olyan fénykép, amely a Met124lle vagy Arg199Glu mutánsokat tartalmazó Arabidopsis AHAS-génekkel transzformált, vagy nem transzformált kontroll dohánynövények gyökérfejlődését mutatja be. A növényeket 18 napon át növesztjük a 0,25 pmol/l imazetapirt tartalmazó tápközegbe való átviteltől számítva.

A 14. ábra olyan fénykép, amely a Met124lle, Met124His vagy Arg199Glu mutánsokat tartalmazó Arabidopsis AHAS-génekkel transzformált vagy nem transzformált kontrolldohánynövényeket mutatja be, amelyek előzőleg kétszer be voltak permetezve imazetapirral 100 g/ha mennyiségben.

A 15. ábra olyan fénykép, amely a CL 299.263 herbicid (imazamox) jelenlétében végrehaj3

HU 226 259 Β1 tott csírázási vizsgálatok eredményeit mutatja be; ezeket olyan primer dohánynövény transzformánsokból aratott magokon hajtottuk végre, amelyeket a Met124lle, Met124His vagy Arg199Glu mutációt tartalmazó Arabidopsis AHASgénnel transzformáltuk.

A jelen találmány szerkezeti alapon modellezett eljárást nyújt herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjék előállítására. Az eljárás magában foglalja (a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését piruvát-oxidáz templáttal vagy ennek AHAS-t modellező ekvivalensével, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;

(b) egy vagy több herbicid modellezését a háromdimenziós szerkezetbe, hogy lokalizáljunk egy herbicidkötő zsebet a cél AHAS-fehérjében;

(c) legalább egy aminosav célpont kiválasztását valamely mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, ahol a mutáció megváltoztatja legalább egy herbicid affinitását a kötőzsebhez;

(d) a cél AHAS-fehérje kódoló DNS mutálását, hogy egy mutált DNS-t állítsunk elő, amely a mutációt tartalmazó AHAS-variánst kódolja, ahol mutáció lehet például legalább egy eltérő aminosav az adott pozíciónál; és (e) a mutált DNS kifejezését egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között a mutációt, például az adott pozíciónál eltérő aminosavat vagy aminosavakat tartalmazó AHAS-variáns termelődik.

Az eljárás továbbá magában foglalhatja:

(f) egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS kifejezését párhuzamosan egy második sejtben;

(g) a sejtekből a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék tisztítását;

(h) a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék vizsgálatát katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy piruvát és a 2-ketobutirát kondenzálásában acetohidroxi-butiráttá a herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (i) a (c)-(h) lépések ismétlését, ahol az (e) lépés AHAS-variánsát kódoló DNS-t használjuk úgy, mint az AHAS-t kódoló DNS-t a (c) lépésben, amíg az első olyan herbicid rezisztens AHASvariáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) legalább egy herbicid távollétében (a) katalitikus aktivitással egyedül is, amely elegendő egy sejt életképességének fenntartására, amelyben ez kifejeződik, vagy (b) katalitikus aktivitással bármely herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjével kombinálva, amely szintén e sejtben fejeződik ki, és amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje, ahol az aktivitás elegendő egy olyan sejt életképességének felmutatására, amelyben kifejeződik;

ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (ii) katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy herbicidre, mint a vad típusú

AHAS-é.

A találmány szolgáltat egy másik szerkezeti alapú modellezési eljárást is herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjék előállítására. Ez az eljárás magában foglalja:

(a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését egy első AHAS templáttal, amely az 1. ábra szekvenciájával bíró polipeptidből származik, vagy ennek funkcionális ekvivalensén, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;

(d) a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS mutálását, hogy egy mutált DNS-t állítsunk elő, amely az adott pozíciónál levő mutációt tartalmazó AHAS-variánst kódolja; és (e) a mutált DNS kifejezését egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között az adott pozíciónál levő mutációt tartalmazó AHAS-variáns termelődik.

Az eljárás továbbá magában foglalhatja:

(g) a sejtekből a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék tisztítását;

(h) a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék vizsgálatát katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy piruvát és a 2-ketobutirát kondenzálásában acetohidroxi-butiráttá a herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (i) a (c)-(h) lépések ismétlését, ahol az (e) lépés AHAS-variánsát kódoló DNS-t használjuk úgy, mint az AHAS-t kódoló DNS-t a (c) lépésben, amíg az első olyan herbicid rezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) legalább egy herbicid távollétében (a) katalitikus aktivitással egyedül is, amely elegendő egy sejt életképességének fenntartására, amelyben ez kifejeződik, vagy (b) katalitikus aktivitással bármely herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjével kombinálva, amely szintén e sejtben fejeződik ki, és amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje, ahol az aktivitás elegendő egy olyan sejt életképességének felmutatására, amelyben kifejeződik;

ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és

HU 226 259 Β1 (ii) katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy herbicidre, mint a vad típusú AHAS-é.

Egy további kiviteli módban az eljárás magában foglalja:

(a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését egy első AHAS templáttal, amely rendelkezik egy azonosított herbicidkötő zsebbel és szekvenciája az 1. ábra szekvenciájának felel meg, vagy ennek funkcionális ekvivalense, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;

(b) legalább egy aminosav célpont kiválasztását valamely mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, ahol a mutáció megváltoztatja legalább egy herbicid affinitását a kötőzsebhez;

(c) a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS mutálását, hogy egy mutált DNS-t állítsunk elő, amely az adott pozíciónál levő mutációt tartalmazó AHAS-variánst kódolja; és (d) a mutált DNS kifejezését egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között az adott pozíciónál levő mutációt tartalmazó AHAS-variáns termelődik.

Az eljárás továbbá magában foglalja (e) egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS kifejezését párhuzamosan egy második sejtben;

(f) a sejtekből a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjók tisztítását;

(g) a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék vizsgálatát katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy piruvát és a 2-ketobutirát kondenzálásában acetohidroxi-butiráttá a herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (h) a (b)—(g) lépések ismétlését, ahol a (d) lépés AHAS-variánsát kódoló DNS-t használjuk úgy, mint az AHAS-t kódoló DNS-t a (b) lépésben, amíg az első olyan herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) legalább egy herbicid távollétében (a) katalitikus aktivitással egyedül is, amely elegendő egy sejt életképességének fenntartására, amelyben ez kifejeződik, vagy (b) katalitikus aktivitással bármely herblcidrezisztens AHAS-variáns fehérjével kombinálva, amely szintén e sejtben fejeződik ki, és amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje, ahol az aktivitás elegendő egy olyan sejt életképességének felmutatására, amelyben kifejeződik;

ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást Igényel; és (ii) katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy herbicidre, mint a vad típusú AHAS-é.

A fenti eljárásnak előnyös kiviteli módjaiban a katalitikus aktivitás a herbicid távollétében legalább mintegy 5%-a és legelőnyösebben több, mint mintegy 20%-a a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának. Amikor a herbicid egy imidazolinon herbicid, a herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérje előnyösen rendelkezik:

(i) katalitikus aktivitással a herbicid távollétében, amely több, mint a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának mintegy 20%-a;

(ii) katalitikus aktivitással, amely viszonylag ellenállóbb az imidazolinon herbicidek jelenlétére a vad típusú AHAS-hoz hasonlítva; és (iii) katalitikus aktivitással, amely viszonylag érzékenyebb szulfonil-karbamid herbicidek jelenlétére az imidazolinon herblcidhez hasonlítva.

A jelen találmány továbbá acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) variáns fehérjét kódoló izolált DNS-eket nyújt; a variáns fehérjék olyan AHAS-fehérjét tartalmaznak, amely módosítva van (i) legalább egy eltérő aminosavgyök behelyettesítésével az 1. ábra szekvenciájának valamely aminosavgyökénél, amely gyök az alábbi csoport valamelyik gyöke:

P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, S469, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574, H575, V576, L577, P578, M579, I580, P581, G583, G584, továbbá az előzőek bármelyikének funkcionális ekvivalensei, és az előzőek bármelyikének bármilyen kombinációja;

(ii) maximum 5 aminosavgyök kiiktatásával az

1. ábra szekvenciájának legalább egy aminosavgyöke előtt vagy maximum 5 aminosavgyök kiiktatásával az 1. ábra szekvenciájának legalább egy aminosavgyöke után, amely gyök az alábbi csoportok valamelyik gyöke:

P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, S469, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574,

HU 226 259 Β1

H575, V576, L577, P578, M579, I580, P581, G583, G584, továbbá az előzőek bármelyikének funkcionális ekvivalensei, és az előzőek bármelyikének bármilyen kombinációja;

(iii) legalább egy aminosavgyök vagy funkcionális ekvivalense kialakításával az 1. ábra szekvenciájának Q124 és H150 gyökei között;

(iv) legalább egy aminosavgyök vagy funkcionális ekvivalense hozzáadásával az 1. ábra szekvenciájának Q124 és H150 gyökei között;

(v) legalább egy aminosavgyök vagy funkcionális ekvivalense kiiktatásával az 1. ábra szekvenciájának G300 és D324 gyökei között;

(vi) legalább egy aminosavgyök vagy funkcionális ekvivalense hozzáadásával az 1. ábra szekvenciájának G300 és D324 gyökei között; vagy (vii) az előzőek bármelyikének kombinációjával. Ebben a számozási rendszerben a #2 gyök felel meg az érett fehérje vélt aminoterminálisának, azaz ez egy kloroplaszt célzó peptid eltávolítása utáni helyzet.

A fenti módosítások arra irányulnak, hogy megváltoztassuk a herbicidek, elsősorban az imidazollnonalapú herbicidek azon képességét, hogy gátolják a fehérje enzimaktivitását. Egy előnyös kiviteli módban az izolált DNS az AHAS-nak herbicidrezisztens variánsát kódolja. A találmány biztosítja az ezen AHAS-variánsokat kódoló DNS-t tartalmazó DNS-vektorokat, a variáns AHAS-fehérjéket magukat, és a sejteket, amelyek vagy in vivő, vagy sejttenyészetben nőnek, és kifejezik az AHAS-variánsokat vagy tartalmazzák ezeket a vektorokat.

Egy másik szempontja szerint a jelen találmány eljárást nyújt herbicidrezisztencia kialakítására sejtben vagy sejtekben és különösen növényi sejtben vagy sejtekben, például valamely magban. Egy AHAS-gént, előnyösen az Arabidopsis thaliana AHAS-génjét úgy mutáljuk, hogy megváltozik egy adott herbicidnek az a képessége, hogy az AHAS enzimaktivitást gátolja. A mutáns gént valamely kompatibilis expressziós vektorba klónozzuk és a gént valamely herbicidérzékeny sejtbe transzformáljuk olyan körülmények között, amelyben ez megfelelő szinten kifejeződik, hogy herbicidrezisztenciát alakítson ki a sejtben.

Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy eljárás gyomok visszaszorítására, amely szerint egy találmány szerinti herbicidrezisztens AHAS-gént hordozó haszonnövényeket tartalmazó termőföldet egy herbicidnek a gyom leküzdésére hatásos mennyiségével kezelünk.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy szerkezeti alapú modellezési eljárás egy első herbicid előállítására, amely gátolja az AHAS-aktlvitást. Az eljárás magában foglalja:

(a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését piruvát-oxidáz templáttal vagy ennek AHAS-t modellező funkcionális ekvivalensével, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;

(b) egy AHAS gátló aktivitással bíró második herbicid modellezését a háromdimenziós szerkezetbe, hogy a cél AHAS-fehérjében egy herbicidkötő zseb elhelyezkedését, szerkezetét vagy ezek kombinációját származtassuk; és (c) egy nem peptid jellegű első herbicid tervezését, amely kölcsönhatásban van a kötőzseb AHASaktivitást gátló hatékony részével és előnyösen kötődik is ahhoz, ahol az első herbicid olyan hatékonyan gátolja az AHAS-aktivitást, hogy elpusztítsa valamely olyan sejt életképességét, amely az életképességhez AHAS-aktivitást igényel.

A találmány tárgya egy másik szerkezeti alapon való modellezési eljárás is egy első herbicid előállítására, amely gátolja az AHAS-aktivitást. Az eljárás magában foglalja:

(a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését első AHAS templáttal, amely az 1. ábra szekvenciájával bíró polipeptidből származik, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;

Bármelyik eljárásban az az előnyös, ha az első herbicid tartalmaz legalább egy olyan funkcionális csoportot, amely kölcsönhatásban van a kötőzseb valamely funkcionális csoportjával.

A találmány felöleli az AHAS enzim és az AHAS-t gátló herbicidek módosított változatainak ésszerű tervezését vagy szerkezeti alapon való molekuláris modellezését. Ezek a módosított enzimek (AHAS-variáns fehérjék) ellenállók a herbicidek tevékenységére. A jelen találmány felöleli azokat a DNS-eket is, amelyek ezeket a variánsokat kódolják, a vektorokat, amelyek magukban foglalják ezeket a DNS-eket, az AHAS-variáns fehérjéket és azokat a sejteket, amelyek kifejezik ezeket a variánsokat. Ezenkívül a találmány eljárásokat nyújt herbicidrezisztencia kialakítására növényekben ezeket a variánsokat kifejezve, és gyomirtási eljárásokat nyújt. A jelen találmány szerinti DNS-eket és az AHAS-variánsokat olyan tanulmányok során fejlesztettük ki, amelyek az AHAS szerkezetének molekuláris modellezésén alapulnak.

AHAS-variánsok és AHAS gátló herbicidek ésszerű, szerkezeti alapon történő tervezése Az AHAS jelen találmány szerinti herbicidrezisztens variánsai használhatók herbicidrezisztencia átvitelére növényekbe, és tervezhetők a POX modellel, az AHAS modellel, vagy ezek funkcionális ekvivalenseivel, ilye6

HU 226 259 Β1 nek például a transzketolázok, karboligázok, piruvát dekarboxiláz, fehérjék, amelyek kofaktorként FAD-hoz és/vagy TPP-hez kötődnek, vagy bármilyen fehétje, amelynek szerkezeti vonásai hasonlóak a POX-hoz és/vagy AHAS-hoz; tervezhetők továbbá valamely AHAS modellel, például az 1. ábra szekvenciája bíró modellel, vagy egy 1. ábra szekvenciájának funkcionális ekvivalensének megfelelő modellel, ideértve egy korábbi modellből modellezett variánst is. Az alkalmazható fehérjék közt lehet bármely fehérje, amelyben a fentebb felsorolt molekulához viszonyítva Ca-szenükben a szórás négyzetes középértéke kevesebb mint 3,5 angström. Az AHAS-ra irányuló herbicideket hasonlóképpen lehet modellezni ezekből a templátokból kiindulva. Az AHAS aminosavszekvencia funkcionális ekvivalense egy olyan szekvencia, amelynek jelentős, azaz 60-70% homológiája van elsősorban a megőrzött területekben, például egy vélt kötőzsebben. A homológra mértéke egyszerű egymás alá rendezéssel határozható meg, amely a szakterületen ismert programokon alapszik, ilyenek például a GCG által szolgáltatott GAP és PILEUP. A homológia azonos aminosavakat vagy konzervatív helyettesítéseket jelent. Egy adott aminosavgyök funkcionális ekvivalense az 1. ábra AHAS-fehérjéjében egy másik AHAS-fehérje aminosavgyöke, amely, amikor a szakterületen ismert valamely programmal, például a GCG által szolgáltatott GAP vagy PILEUP programmal egymás alá rendezik az 1. ábra szekvenciájával, azonos helyen van, mint az

1. ábra aminosavgyöke.

A racionális tervezési lépések tipikusan magukban foglalják:

(1) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését egy POX gerinccel vagy szerkezettel, vagy egy AHAS gerinccel vagy szerkezettel; (2) adott esetben, és ha az AHAS gerincnek van azonosított herbicidkötő zsebe, egy vagy több herbicid modellezése a háromdimenziós szerkezetbe, hogy lokalizáljunk egy herbicidkötő zsebet a cél fehérjében; (3) egy mutáció kiválasztását a modellre alapozva; (4) helyspecifikus mutagenezist; és (5) a variánsok kifejezését és tisztítását. A további lépések között találjuk az enzimes tulajdonságok mérését (6) és az alkalmas variánsok értékelését összehasonlítva a vad típusú AHAS tulajdonságaival. A későbbiekben minden lépést külön-külön megtárgyalunk.

1. Molekuláris modellezés A molekuláris modellezési (és elsősorban a fehérje homológia modellezési) technikák egy adott fehérje szerkezetének és aktivitásának megértéséhez szolgálhatnak. Egy fehérje szerkezeti modellje közvetlenül meghatározható kísérleti adatokból, például röntgensugár krisztallográfiából, közvetve pedig homológiamodellezésből vagy hasonlókból, illetve ezek kombinációiból [lásd White és munkatársai: Annu. Rév. Biophys. Biomol. Struct. 23, 349 (1994)]. Az AHAS háromdimenziós szerkezetének helyes értelmezése alapot szolgáltat egy ésszerű munkamenet kifejlesztéséhez az AHAS-on belül adott aminosavgyökök mutációjához, amelyek herbicidrezisztenciát adnak át a polipeptidnek.

A Zea mays (kukorica) AHAS szerkezetének molekuláris modellezése, templátként a Lactobacillus plantarumból származó rokon piruvát-oxidáz ismert röntgensugár kristályszerkezetét alkalmazva, az AHAS szerkezet háromdimenziós szerkezetét szolgáltatja, amely alkalmas herbicidrezisztens AHAS-variánsok vagy AHAS-t gátló herbicidek tervezéséhez. Ez a modellezési munkamenet kihasználja annak a ténynek az előnyeit, hogy az AHAS és a POX osztoznak egy sor biokémiai jellemzőben és valószínűleg egy közös ősgénből származnak [Chang és munkatársai: J. Bacteriol. 170, 3937 (1988)].

Az AHAS-ban levő fajtaközi homológia nagy mértéke miatt az itt leírt modellezett AHAS vagy funkcionális ekvivalensei szintén alkalmazhatók templátként az AHAS-variáns fehérjék tervezéshez.

Az alábbiakban részletesen is leírjuk egy modell levezetését az interaktív molekuláris grafikát és egymás alá rendezést alkalmazva. A háromdimenziós AHAS szerkezet, amelyet ez a munkamenet eredményez, felbecsüli az enzim aktív helyének és az inhibitorok, például herbicidek (ideértve az imidazolinon herbicideket, de nemcsak ezekre korlátozva) hozzávetőleges térbeli szerveződését. A modellt azután finomítjuk és újra értékeljük olyan biokémiai tanulmányokra alapozva, amelyeket a későbbiekben szintén leírunk.

A fehérje homológia modellezése a fehérje primer szekvenciájának egymás alá rendezését igényli egy tanulmány során egy olyan második fehérjével, amelynek kristályszerkezete ismert. A piruvát-oxidázt (POX) választjuk az AHAS homológia modellezéséhez, mivel a POX és az AHAS osztoznak egy sor biokémiai jellemzőben. így például az AHAS és a POX az enzim reakciómechanizmus számos szempontjában közösek, valamint a kofaktor- és fémigényekben is. Mindkét enzimben tiamin pirofoszfát (TPP), flavin adenin dinukleotid (FAD) és kétértékű kation szükséges az enzimaktivitáshoz. A FAD közvetít egy redox reakciót a katalízis során a POX-ba, de valószínűleg csak szerkezeti funkciója van az AHAS-ban, amely bizonyára csak csökevényes maradéka az AHAS evolúciójának a POX-ból. Mindkét enzim hasznosít piruvátot mint szubsztrátumot és képez hidroxi-etil-tiamin pirofoszfátot, mint stabil köztes reakcióterméket [Schloss J. V. és munkatársai, in: Biosynthesis of branched Chain amino acids, szerkesztők: Barak Z. J. M; Chipman D. M. és Schloss J. V.; kiadó: VCH Publishers, Weinheim, Németország (1990)].

Ezenkívül az AHAS-aktivitás jelen van a kiméra POX-AHAS-fehérjében, amelyek tartalmazzák a POX N-terminális felét és az AHAS C-terminális felét, és a POX maga is mutat kismértékű AHAS-aktivitást. Az AHAS és a POX hasonló tulajdonságokat mutat oldatban is. [Risse B, és munkatársai: Protein Sci. 1: 1699 és 1710, (1992); Singh Β. K. és Schmitt G. K., FEBS Letters, 258, 113 (1989); Singh Β. K. és munkatársai, in: Prospects fór Amino Acid Biosynthesis Inhibitors in Crop Protection and Pharmaceutical Chemistry (Az aminosav bioszíntézis inhibitorainak távlatai a növényvédelemben és a gyógyszerkémiában), szerkesz7

HU 226 259 Β1 tők: Lopping L. G. és munkatársai, BCPC Monograph, 87. oldal (1989)]. Növekvő fehérjekoncentrációval mind a POX, mind az AHAS lépésről lépésre átalakuláson megy át monomerekből dimerekké és tetramerekké. A FAD-koncentráció növelése szintén indukálja az alapegységek összeállásának magasabb fokozatait. Mindkét fehérje tetramer formája a legstabilabb a melegítésre és a kémiai denaturálásra.

A Lactobacillus plantarumból való POX kristályszerkezetét Muller és munkatársai tárták fel [Science 259, 965 (1993)]. A jelen találmány feltalálói arra jöttek rá, hogy részben az AHAS és a POX közötti fizikai, biokémiai és genetikai homológja mértékére alapozva, a POX röntgensugár kristályszerkezete használható kiindulási pontként az AHAS szerkezet homológia modellezéséhez.

Az AHAS és a L. plantarum POX szekvenciái azonban nem elég hasonlók egy teljesen számítógépesített egymás alá rendezéshez. Összességében az aminosavaknak csak 20%-a azonos, míg a gyökök mintegy 50%-a azonos osztályba tartozik (például savanyú, bázisos, aromás stb.). Ha azonban a szekvenciát a hidrofil és hidrofób gyök osztályozás szempontjai szerint hasonlítjuk össze, a 600 aminosavból több mint 500 összeillik. Az AHAS szekunder szekvencia számításai [Holley és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 152 (1989)] erős hasonlóságot tárnak föl a POX tényleges szekunder szerkezetével. A gyökök közel 70%-ánál a számított alapján vélt AHAS szekunder szerkezet illeszkedik a POX szekunder szerkezetéhez.

A POX monomerek három doménből állnak, mindegyiknek van egy központi, párhuzamos β-rétege áthidalásokkal, amelyek α-hélixekből és hosszú huzalakból állnak [Muller és munkatársai: Science 259, 965 (1993)]. A lapok topológiája eltér a domének között, például az első és harmadik dómén között a szálak β-réteghez a 2-1-3-4-6-5 szekvenciában vannak összeillesztve, míg a másik dómén β-rétegében a szekvencia olvasata 3-2-1-4-5-6.

A számítógéppel kialakított egymás alá rendezés a szekunder szerkezeti számításon és a szekvenciahomológián alapul. A hagyományos páronkénti szekvencia egymás alá rendezést alkalmazzuk, amelyet Needleman és Wunch, írt le [J. Mól. Bioi. 48, 443 (1970)]. Két szekvenciát állítunk sorba, hogy legjobban határozzuk meg az egymás alá rendezési pontszámot. Az egymás alá rendezési pontszám (homológia-pontszám) a pontszámok összege az egymás alá rendezett gyökök mindegyik párjából, és egy fakultatív büntetés beszámításával hézagok kialakulásáért az egymás alá rendezés során. A gyökök egy párjának egymás alá rendezésénél kapott pontszám egy táblázatba foglalt egész, számú érték. A homológiapontszám-fendszer a gyökök egy adott párja közötti eltérés gyakoriságának megfigyelésén alapul [Dayhoff Μ. O., Schwartz R. M. és Orcutt B. C: „Atlas of Protein Sequence and Structure” (A fehérjeszekvencia és -szerkezet atlasza), 5. kötet 3. melléklete, 345-362. oldal (1978)].

A egymás alá rendezést tovább finomítjuk a hézagok újra elhelyezésével úgy, hogy a folyamatos szabályos szekunder szerkezetek megőrződjenek. A valószínű egymás alá rendezési sémák értékelésével kialakított aminosavhelyettesitéseket összehasonlítjuk egy interaktív molekuláris grafika segítségével. Az egymás alá rendezésnek azt a módját választjuk, amely a legkonzervatívabb helyettesítésekkel számol, tekintetbe véve egy adott helyen belül az aminosavak adott funkcionalitását. A végső egymás alá rendezést mind a POX-ra, min az AHAS-ra a 2. ábrában mutatjuk be. A gyökök megőrzött csoportjait azonosítjuk, különösen a TPP kötőhelyeket és a FAD kötőhely részeit. A egymás alá rendezés nagy hasonlóságot tár fel az AHAS és a POX között az első doménben, a második dómén legtöbb részében, és a harmadik dómén mintegy felében. A legtöbb terület, amely csak szerény mértékben állítható sorba és különbözőképpen hajtogatódhat a POX-ban és az AHAS-ban, vélhetően a fehérje felületénél van és nem érintett a kofaktor vagy az inhibitor kötésben. A mutációs helyek kiszámítását jelentősen nem befolyásolják a kis eltolódások a egymás alá rendezésben.

A TPP kötő gyökök legtöbbje nagymértékben megőrzött a POX és az AHAS között (például P48-G49G50). Bizonyos esetekben azok a gyökök, amelyek közel vannak a TPP-hez, különböznek a POX és az AHAS között, de egy olyan területen belül maradnak, amely nagymértékben megőrzött, (például 90-110 gyökök). Másrészt viszont a FAD kötő helyek kevésbé megőrzöttnek tűnnek. Bár bizonyos FAD kötőhelyek erősen megőrzöttek (például D325-I326-D327-P328), mások határozottan eltérnek az AHAS és a POX között (így például az 278 és 285 helyek közti hurokban a gyökök nem homológok). Egy részletesebb elemzés feltárja, hogy legalább néhány kevésbé megőrzött érintkezési helynél a kölcsönhatásokat inkább közvetíti a polipeptid gerince, mint az oldalláncok. Ennek megfelelően a megőrzés csak a polipeptid hajtogatáshoz szükséges, és nem szükséges az aminosavszekvenciához (így például a 258-263 gyökök gerince köti meg a FAD ribitol láncát.) Az adenin egyik felét és az izoalloxazinnak a kötőhelyei világosan különböznek.

Miután egymás alá rendeztük a primer szerkezetet, homológia modellt építsünk fel olyan módon, hogy az AHAS aminosavszekvenciát hozzárendezzük a POX templát szerkezethez. Hiányzó koordinátákat építünk fel lépésenként az aminosavgyökök templátjait használva, hogy kiegészítsük a meg nem határozott oldalláncokat. Adatbankkutatást és a molekula kis részeinek energiaminimalizálását használjuk fel, hogy elvégezzük a meg nem határozott hurokterületek konformációinak meghatározását. A TPP és FAD kofaktorokat bemodellezzük kötőzsebeikbe. Ezt a modellt azután alávetjük egy teljes, 5000 ciklusos energiaminimalizálásnak. Minden számítógépes modellezést a Silicon Graphics Co.-tól beszerzett IRIS Indigó Elán R4000 Workstation munkaállomással hajtunk végre. Az interaktív molekula modellezést és energiaminimalizálást a Molecular Simulations Inc.-től beszerzett Quanta/CHARMm 4.0 program alkalmazásával végezzük. Ennek a lépésnek során a konformáció stabil,

HU 226 259 Β1 jelezve, hogy erősen ellenzett kölcsönhatások, például közeli van dér Waals-kapcsolatok, nem fordulnak elő. Az eredményeket vázlatosan a 3. ábrán mutatjuk be.

A kiszámított AHAS szerkezet jellemzői

A fentebb leírt modellezett AHAS szerkezet áttekintése feltárja, hogy a fehérjék többsége olyan gerinccel hajtogatódik, amely energetikailag ésszerű, ahol a legtöbb hidrofil oldallánc hozzáférhető az oldószer számára. A β-rétegek felülete sima és hozzáigazodik a keresztezés! (cross-over) területekhez, amelyek hozzájuk vannak rögzítve.

Dimer AHAS-hoz alakítunk ki modellt az energiaminimalizált monomer AHAS koordinátáinak megduplázásával és a két kópiát ráhelyezve két POX alapegységre a Ca koordináták párjait alkalmazva, amint ezt meghatároztuk az egymás alá rendezési munkamenetben. Az AHAS-polipeptid lánca három hasonlóan hajtogatott doménba hajtogatódik, amelyek egy hatszálú párhuzamos β-réteg-magból állnak, amelyet hosszú „hurkok” és α-hélixek vesznek körül. Két alegység úgy van összeillesztve, hogy egy alegység első doménje szoros szomszédságban van a másik alapegység 2. és 3. kofaktorkötő doménjaival. Egy oldószerrel töltött tér marad az alapegységek között ennél a helynél. Ez a zseb, amelyet a három dómén összeérése határoz meg, a szubsztrátum javasolt belépési helye. Ez a javasolt kötőhelye a herbicideknek is.

A kötőzseb belső felületét a kofaktorok írják körül. A TPP tiazolja a zseb fenekén helyezkedik le. A 3. dómén a zseb belső felületéhez egy rövid α-hélixszel járul, amely tengelyét a TPP pirofoszfát felé irányítja, dipólusmomentumával kompenzálva a foszfáttöltéseket. Ez a kritikus hélix, amely a G498-cal kezdődik, egy „forduló” (tűm) gyökkel szoros kapcsolatban a TPP-vel, és amely az F507-tel végződik, három ismert restrikciós helyet tartalmaz a szulfonil-karbamid-rezisztenciához: a V500-at, W503-at és F507-et (lásd az 5.013.659; 5.141.870 és 5.378.824 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentéseket). Az 1. doménben a P48-S52-nél meghatározott hurok (a 2. β-szál és a 2. α-hélix között) szembenéz a W503-mal, ez olyan mutáció, amelyben a rezisztencia adódik át imidazolinonokra. Az Y47 és G50 közti gyökök szintén kapcsolatban vannak a TPP-vel. Ez a hurok szomszédos a P184-Q189-cel, egy másik fordulóval, amely összekapcsolja az 1. dómén β-rétegének utolsó szálát egy olyan β-szállal, amely kapcsolódik a

2. doménhez. A zseben belül, bejáratához közel van az 1. doménnek egy olyan területe, amely kölcsönhatásban van a 2. dómén komplementer megnyúlásával (stretch). Az 1. dómén 125-129 és 133-137 gyökei és a 2. dómén 304-313 gyökei a zseb felületénél vannak. A T96-G100 közti területet tartalmazó forduló a 125-129 hurok és a TPP között van. A 3. dómén további megnyúlása és a 2. dómén két területe, amelyek betöltik a kötőzsebet, a zseb ellenkező sarkánál vannak. A 3. dómén 572, 575, 582 és 583 gyökei határozzák meg a zseb felszínét az egyik oldalon. A zseb felülete belsejének megmaradó részét a FAD és egy hurok, az L278-G282 határozza meg, amely összeköttetésben van a FAD izoalloxazingyűrűjével.

Az AHAS-fehérje szerkezeti modelljeit alkalmazhatjuk herbicidek vagy AHAS inhibitorok ésszerű tervezéséhez is.

2. Herbicidek modellezése kötőhelyekbe

Az imazetapirt, a PURSUIT-ban levő aktív imidazolinont helyezzük el javasolt kötőhelyébe, az interaktív molekuláris grafikát (4. ábra) és a fentebb leírt szoftvert alkalmazva (4. ábra). A K185-öt választjuk „horgonyként, hogy kölcsönhatásba lépjen a karboxilcsoporttal. Az imidazolinon NH-CO egységét úgy helyezzük át, hogy hidrogénkötéseket képezzen G50 és A51 közé. Ez az imazetapir metil szubsztituensét a kis α-hélix gerincén levő V500-hoz közel helyezi el. Az izopropilcsoport valószínűleg a 125-135 gyökök - amelyek hozzájárulnak a belső zseb felületéhez - területében levő aminosavak hidrofób gyökeihez kötődik. A piridingyűrű a legvalószínűbben „szendvicseként helyezkedik el az A134 vagy F135, F507 és W503 között. A W503 kölcsönhatásban van az imidazolinon gyűrű rendszerrel is.

Hasonló módon, a szulfonil-karbamid herbicidet olyan helybe modellezzük, amely részben átfedi a leírt imidazolinon kötőhelyet. A szulfonil-karbamid és imidazolinon kötőhelyek átfedése egybevág a versengő kötési kísérletekkel és az elfogadott mutáns adatokkal, amelyek azt mutatják, hogy azonos mutáció kukoricákon (W503L) rezisztenciát biztosít mindkét herbicidre. Ezekben a modellekben az ismert mutációs helyek, amelyek szulfonil-karbamid-rezisztenciát adnak át, azaz a G50, A51, K185, V500, W503 és F507, szoros kapcsolatban vannak a megkötött herbicidekkel. A P126 és A51 szükségesek helyén megtartani a K185 oldalláncot, ezáltal egy hidrofób nyílást alakítva ki. Az S582, amely speciális imidazolinon szekvenciahely, távol van a kötőterülettől és abban a területben helyezkedik el, ahol a homológia nagyon szegényes, így várható változás a hajtogatódásban. A FAD kötőhelyeknek kétségtelenül kicsiny a homológiája az AHAS és a POX között ezen a területen; az S582 olyan gyök, amely rezisztenciát biztosít kukoricában, és ez az S582 és szomszéd gyökei szoros kapcsolatban állnak az aktív hely zsebbel. Az valószínűsíthető, hogy a FAD és a hurokterület, amely magában foglalja a 278 és 285 közti gyököket, enyhén elmozdul a harmadik doménből (lefelé a 4. ábrában); valószínűsíthető továbbá, hogy az S582-t tartalmazó hurok behajtogatódik a 499 és 507 helyek közt levő hélix és a 278 és 285 helyek közt levő hurok közt kialakult térbe. A D305, egy másik ismert rezisztenciahely, közel van a FAD-hoz és megváltoztatja a kölcsönhatást az 1. és 2. domének között. Az M280 valószínűleg érintett a 498 és 507 közti helyeknél levő hélix elhelyezésében, vagy közvetlenül érintett az inhibitorkötésben. Az M280 és a D305 közvetlenül is érintett lehet az inhibitorkötésben, ha az 1. és 2. domének enyhén közelednek egymáshoz.

3. A mutációk kiválasztása

Meghatározzuk azokat a speciális aminosavgyököket, amelyek az AHAS primer szekvenciájába mutációk bevezetéséhez alkalmas helyek. Ezeket az aminosa9

HU 226 259 Β1 vakat olyan helyekre alapozva választjuk ki, amely helyeken amennyiben az aminosavgyök módosul, ennek eredménye változás (azaz csökkenés) lesz egy herbicid affinitásában a kötőzsebhez. Nem szükséges, hogy a mutációs hely a kötőzsebben helyezkedjék el, mivel a zseben kívül levő aminosavgyökök maguk is megváltoztathatják a zseb töltését vagy konfigurációját. A mutációhoz szolgáló célhelyek kiválasztását molekuláris modellek alkalmazásával érjük el, amint fentebb leírtuk. így például a fenti modell szerint a 128. helynél levő arginin (az 1. ábrában R128-cal jelölve, az aminosavakhoz az egybetűs kódot alkalmazva) a szubsztrátum- és herbicidkötő zseb bejáratához közel helyezkedik el és a konformációs szabadság nagy mértékével bír, amely lehetővé teheti számára, hogy részt vegyen 1 a töltött herbicidek transzportjában a kötözsebbe. Ennélfogva ezt a gyököt helyettesítjük alaninnal, hogy eltávolítsuk mind töltését, mind hosszú hidrofób oldalláncát. (Az így létrejövő mutációt R128A-nak nevezzük).

A mutációk tartalmazhatnak egyszerű helyettesíté- 2 seket, amelyek helyettesítik a vad típusú szekvenciát bármely más aminosawal. Egy másik megoldás szerint a mutációk tartalmazhatnak egy vagy több, előnyösen maximum 5 aminosav kiiktatást vagy hozzáadást egy adott helynél. A hozzáadott szekvencia tartalmaz- 2 hat olyan szekvenciát, amelyről ismert, hogy valamely másik fehérjében létezik, vagy tartalmazhat teljesen szintetikus szekvenciát is. Ezenkívül egynél több mutáció és/vagy egy mutációtípusnál több is bevezethető egy egyedi polipeptidbe. 3

4. Helyspecifikus mutagenezis

Az AHAS-t kódoló DNS-t lehet úgy manipulálni, hogy bejuttatjuk a kívánt mutációkat. A mütagenezist olyan eljárások alkalmazásával hajtjuk végre, amelyek a szakterületen szabványosak; ilyenek vannak leírva 3 például az alábbi irodalmi helyen: Higuchi R.: Recombinant PCR; in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, szerkesztők: Innis és munkatársai; kiadó: Academic Press, 177-183. oldal (1990).

5. A variánsok kifejezése és tisztítása 4

A mutált vagy variáns AHAS szekvenciát valamely

DNS expressziós vektorba klónozzuk (lásd például a

3. példát) és kifejezzük megfelelő sejtben, például E. coliban. Az AHAS-t kódoló DNS-t előnyösen hozzákapcsoljuk valamely transzkripciós szabályozóelemhez, és a variáns AHAS-t egy fúziós fehérje részeként fejezzük ki például glutation-S-transzferázzal együtt, hogy megkönnyítsük a tisztítást (lásd a későbbi 3. példát). A variáns AHAS-t azután tisztítjuk affinitáskromatográfia alkalmazásával vagy más, a szakterületen ismert alkalmas eljárással. Egy AHAS-polipeptid „tisztítás-a az AHAS-polipeptid izolálására vonatkozik olyan formában, amely lehetővé teszi enzimaktivitásának mérését anélkül, hogy a sejtnek, amelyben a polipeptid kifejeződött további, komponensei erre befolyást gyakorolnának.

6. Az enzim tulajdonságainak mérése A tisztított AHAS-variáns mérhető az alábbi három tulajdonság közül egyre vagy többre:

(a) fajlagos vagy katalitikus aktivitás piruvát átalakításához acetolaktáttá (kifejezve, mint egység/mg tiszta AHAS, ahol az aktivitás egységét úgy határozzuk meg, mint 1 pmol termelt acetolaktát/óra), vagy piruvát és 2-ketobutirát kondenzációjához (kifejezve, mint egység/mg tiszta AHAS, ahol az aktivitás egységét úgy határozzuk meg, mint 1 pmol termelt acetohidroxi-butirát/óra);

(b) a herbicid, mint például imidazolinon által kiváltott gátlás szintje (kifejezve IC_5{j-ként; ez az a koncentráció, amelynél az enzim aktivitásának 50%-a gátlódik); és (c) a rezisztencia szelektivitása a kiválasztott herbicidre az egyéb herbicidekkel szemben. A szelektivitási indexet úgy határozzuk meg, mint a mutáns védő rezisztenciáját imidazolinonokra a vad típusú enzimre vonatkoztatva, osztva az azonos mutáns védő rezisztenciájával más herbicidekre, szintén a vad típusra vonatkoztatva. A védő rezisztenciát egy herbicidre, a vad típusú enzimre vonatkoztatva úgy fejezzük ki, mint a variáns IC₅₀-értéke osztva a vad típus IC₅₀-értékével. A szelektivitási indexet (S. I.) a következő egyenlet képviseli:

A variáns IC₅₀-értéke herbicid A-ra/ a vad típus IC₅₀-értéke herbicid A-ra a variáns IC₅o-értéke herbicid B-re/ a vad típus IC₅₀-értéke herbicid B-re

A megfelelő vizsgálati eljárások között ezen meghatározások kivitelezésére találjuk a később, a 4. példában részletesebben leírt eljárásokat, de a lehetőségek nemcsak ezekre korlátozódnak.

7a. A megfelelő variánsok értékelése

A variáns AHAS-polipeptidek enzimes tulajdonságait összehasonlítjuk a vad típusú AHAS-éval. Előnyösen egy adott mutáció olyan AHAS-variáns fehérjét eredményez, amely megőrzi az in vitro enzimaktivitást a piruvát vagy a piruvát és acetolaktát irányában, vagyis a piruvát átalakításában acetolaktáttá vagy a piruvát és 2-ketobutirát kondenzációjában acetohidroxibutirát képződésével (és így várhatóan megőrzi biológiai aktivitását in vivő is), ugyanakkor olyan katalitikus aktivitást mutat, amely viszonylag rezisztensebb a ki50 választott herbicidre vagy herbicidekre, mint a vad típusú AHAS-é. A variáns AHAS előnyösen mutat:

(i) legalább egy herbicid hiányában (a) katalitikus aktivitást egyedül is, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartásához, amelyben ez kifejeződött;

vagy (b) katalitikus aktivitást kombinálva bármely herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjével, amely szintén a sejtben fejeződik ki, és amely lehet azonos vagy különböző, mint az

HU 226 259 Β1 előző AHAS-variáns fehérje, ahol a katalitikus aktivitás elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben ezek kifejeződtek; ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel;

(ii) katalitikus aktivitást, amely rezisztensebb legalább egy herbicidre, mint a vad típusú AHAS-é, és amely viszonylag rezisztensebb a herbicid(ek)re, mint a vad típusú AHAS-é.

Ennél fogva a speciális AHAS-variáns tehénének nem szükséges rendelkeznie a teljes katalitikus aktivitással, amely szükséges a sejt életképességének fenntartására, csak bizonyos katalitikus aktivitással kell rendelkeznie olyan mennyiségben, amely egyedül vagy kombinálva ugyanazon AHAS-variáns további másolatainak katalitikus aktivitásával és/vagy más AHAS-variáns fehérje vagy fehérjék katalitikus aktivitásával elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amely életképességéhez AHAS-aktivitást igényel, (gy például a katalitikus aktivitás megnövelhető a minimálisan elfogadható szintekre egy variáns kódoló gén többszörös másolatainak bevezetésével a sejtbe, vagy egy olyan gén bevezetésével, amely magában foglal többletként egy viszonylag erős promotert, hogy fokozza a variáns termelését.

Az „ellenállóbb vagy „rezisztensebb” kifejezés azt jelenti, hogy a variáns katalitikus aktivitása a herbicid(ek) által kisebb mértékben csökken, ha egyáltalán csökken, mint ahogyan a vad típusú AHAS katalitikus aktivitás csökken a herbicid(ek) által. Előnyösen az ellenállóbb variáns AHAS megőriz elegendő katalitikus aktivitást, hogy fenntartsa a sejt, növény vagy organizmus életképességét, miközben azonos herbicid(ek) azonos koncentrációjánál a vad típusú AHAS nem őriz meg elegendő katalitikus aktivitást, hogy fenntartsa a sejt, növény vagy organizmus életképességét.

A katalitikus aktivitás herbicid(ek) távollétében előnyösen legalább 5%-a, legelőnyösebben több, mint 20%-a a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának herbicid(ek) távollétében. A legelőnyösebb AHAS-variánsok ellenállóbbak az imidazolinon herbicidre, mint más herbicidekre, például szulfonil-karbamid-alapú herbicidekre, bár bizonyos alkalmazásoknál a szelektivitás sem nem szükséges, sem nem előnyös.

Imidazoiinonrezisztens AHAS-variánsok esetében előnyös, ha az AHAS-variáns fehérje rendelkezik:

(i) katalitikus aktivitással, amely az említett herbicid távollétében több, mint 20%-a az említett vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának;

(ii) katalitikus aktivitással, amely viszonylag ellenállóbb imidazolinon herbicidek jelenlétére a vad típusú AHAS-sal összehasonlítva; és (iii) katalitikus aktivitással, amely viszonylag érzékenyebb szulfonil-karbamid herbicidek jelenlétére az imidazolinon herbicidekkel összehasonlítva. A legelőnyösebb herbicidrezisztens AHAS-variánsok mintegy 20 egység/mg minimális fajlagos aktivitást mutatnak, minimális gátlást mutatnak vagy egyáltalán nem mutatnak gátlást imidazolinonokra, és szelektivitási indexük mintegy 1,3-tól 3000-ig terjed más herbicidekre vonatkoztatva.

A nélkül, hogy ragaszkodnánk bármiféle elmélethez, úgy hisszük, hogy ennek a módszernek a rendszeres és megismételt alkalmazása vad típusú vagy más cél AHAS-fehérjére olyan AHAS-variánsok kialakítását eredményezi, amelyek rendelkeznek a magas enzimaktivitás kívánt tulajdonságaival, amint ezt a korábbiakban elmagyaráztuk, és rezisztenciával a herbicidek egy vagy több osztályára. így például egy vad típusú AHAS szekvencia mutációja egy adott helyen egy adott aminosavra olyan mutánst eredményezhet, amely magasfokú herbicidrezisztenciát mutat, miközben jelentős veszteséget mutat az enzimaktivitásban a piruvát vagy a piruvát és a 2-ketobutirát irányában. A fenti eljárásnak egy második alkalmazásában a kiindulási vagy cél AHAS-polipeptid azután ez a variáns lehet (a vad típusú AHAS helyett). Az ésszerű tervezés azután magában foglalja más aminosavak helyettesítését az eredetileg mutált helynél és/vagy aminosavak kiiktatását vagy hozzátételét kiválasztott pontoknál vagy tartományoknál abban a reményben, hogy a herbicidrezisztencia megőrződik, míg az enzimaktivitás magasabb szintje fennmarad.

Herbicidrezisztens AHAS-fehérjék szerkezeti alapon történő ésszerű tervezése számos előnyt nyújt a hagyományos megközelítésekhez viszonyítva, amelyek véletlenszerű mutagenezisre és kiválasztásra alapozódnak. Így például amikor egy adott aminosav helyettesítése egy másikkal több, mint egy nukleotid helyettesítését igényli a kodonon belül, a valószínűség ennek véletlenszerű előfordulására olyan kicsiny, hogy gyakorlatilag kivihetetlen. Ezzel ellentétben a nukleotidszekvenciában egy kodonon belül még kettős és hármas változások is könnyen bevezethetők, amikor ezeket egy ésszerű tervezési megközelítés sugallja, (gy például egy ésszerűen tervezett mutáció annak érdekében, hogy szelektív imidazolinonrezisztencia adódjék át, változást igényel argininből glutamáttá. Az arginint a CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG kódolják, míg a glutamátokat a GAA és GAG kódolják. Mivel az arginin kodonok egyike sem kezdődik GA-val, ez a mutáció a szomszédos nukleotidok kettős helyettesítését igényli, amely oly ritkán történik meg a véletlenszerű mutagenezis alkalmazásával, hogy el nem várható és meg nem ismételhető a siker bármiféle reményében. Bár a mutációs gyakoriságot lehet növelni a véletlenszerű mutagenezis során, a változások a nukleotidszekvenciában az előfordulás azonos valószínűségével mennek végbe az AHAS-gén mentén a mutációk egy előzetes helyre irányítottságának hiányában. Ez megnöveli egy olyan irreleváns mutáció nyerésének esélyét, amely befolyásolhatja az enzimaktivitást. Hasonlóképpen ritka az esély arra véletlenszerű mutagenezist alkalmazva, hogy egy többszörös aminosavhelyettesítéses, -kiiktatásos, vagy helyettesítéses/kiiktatásos mutációt találunk, amely herbicidrezisztenciát biztosít, miközben a katalitikus aktivitás fennmarad. A kiiktatásos mutációk, amelyek herbicidrezisztenciát adnak át, szintén valószínűtlenek egy véletlenszerű

HU 226 259 Β1 mutagenezises megközelítést alkalmazva. A kiiktatásoknak nagyon kis területre kellene korlátozódnia és triplettekben kellene előfordulnia, hogy fennmaradjon az AHAS leolvasókeret abból a célból, hogy fennmaradjon az enzimaktivitás.

Egy ésszerű, szerkezeti alapon történő megközelítéssel azonban kettős aminosavhelyettesítéses és/vagy -kiiktatásos mutációk viszonylag könnyen kivitelezhetők és pontosan célozhatok. Ezenkívül a véletlen mutagenezisben alkalmazott különböző mutagének a mutációk speciális típusait alakítják ki. Így például a nátrium-azid növényekben ponthelyettesítéses mutációkat alakít ki, míg a besugárzása kiiktatások (deléciók) kialakításának irányában hat. Következésképpen két mutagenezis munkamenetet kellene alkalmazni, hogy a helyettesítés/kiiktatás többszörös kombinációját kapjuk meg.

Végül a jelen szerkezeti alapon működő eljárás herbicidrezisztens AHAS-variánsok ésszerű tervezéséhez lehetővé teszi herbicidrezisztens mutációk ismétlődő javítását, ez pedig olyan lépés, amelyet véletlenszerű mutagenezist nem tesz lehetővé. Egy véletlenszerű mutagenezissel kialakított mutációs hely azonosítása a herbicidrezisztenciához nagyon csekély mértékű megjósolható értéket szolgáltat, ha egyáltalán szolgáltat a további, a mutánsok jellemzőiben való javítások irányításához. A jelen szerkezeti alapon működő megközelítés viszont lehetővé teszi a bevezetendő javításokat a szerkezeti modellben levő aminosavpozíció elhelyezkedésére, környezetére és funkciójára alapozva.

Az ismétlődő javítási eljárás ugyancsak lehetővé teszi az AHAS három fő tulajdonságának, a rezisztencia szintjének, a rezisztencia szelektivitásának és a katalitikus hatékonyságának egymástól független manipulálhatóságát. így például kompenzáló mutációkat lehet tervezni előre kiszámítható módon. Ha egy adott mutációnak káros hatása van egy enzim aktivitására, egy második, kompenzáló mutációt lehet alkalmazni az aktivitás helyreállítására, fgy például egy változást a nettó töltésben egy doménen belül, amikor egy töltött gyököt vezetünk be vagy vesztünk el valamely mutáció miatt, kompenzálhatunk egy második mutáció bevezetésével. A második helyen az enzimaktívitás helyreállítása céljából bevezetendő, kiiktatandó vagy helyettesítendő pozíció kiszámítása a szerkezet-funkció kapcsolat ismeretét igényli, ez pedig egy modellből, például az itt leírt modellből származik.

7b. Nem peptid herbicidek vagy AHAS inhibitorok tervezése

Egy olyan kémiai egységet, amely illeszkedik a célfehérje aktív helyére vagy kötődik bármely pozícióban, ahol ez gátolhat aktivitást, a szakterületen ismert eljárásokkal tervezhetünk, például számítógépes tervezési programokkal, amelyek egy receptorhellyel speciálisan kölcsönhatásba lépő vegyületek tervezésében nyújthatnak segítséget.

Az ilyen programokra példa lehet a LUDI program [Biosym Technologies, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok; lásd még Lám és munkatársai: Science 263, 380 (1994); Thompson és munkatársai: J. Med. Chem. 37, 3100 (1994)].

A kötőzsebek és különösen azok az aminosavgyökök, amelyeket azonosítottak azzal a tulajdonságukkal kapcsolatban, hogy érintettek az inhibitorkötésben, alkalmasak „horgony” pontokként az inhibitor tervezésénél.

A helyspecifikus herbicidek tervezése előnyös azoknak a gyomfajtáknak a szabályozásában, amelyek spontán fejlesztenek ki herbicidrezisztenciát a földeken, elsősorban az AHAS-génben levő mutációk miatt.

Herbicidrezisztens AHAS-variánsok: DNS-ek, vektorok és polipeptidek

A jelen találmány magában foglalja a herbicidrezisztens AHAS-polipeptid variánsokat kódoló izolált DNS-molekulákat is. A jelen találmány szerinti AHASpolipeptideket kódoló gének származhatnak bármely fajtából, de elsősorban valamely növényfajtából, és a herbicidrezisztenciát átvivő mutációkat be lehet vezetni ekvivalens pozícióknál ezen AHAS-gének bármelyikén belül. Egy adott kodon pozíció ekvivalenciája különböző AHAS-génekben függvénye mind a primer aminosavszekvencia és fehérje megőrzésének, mind a hasonló háromdimenziós szerkezet megőrzésének. így például az 5. ábra bemutatja a szekvenciahomológia nagy mértékét különböző növényfajtákból származó AHAS-polipeptidek között.

A kiviteli módok egyik sorozatában ezek az AHAS DNS-ek egy AHAS-polipeptid és előnyösen az 1. ábra kukorica AHAS-polipeptidje variánsait kódolják, amelyben a polipeptid helyettesítéssel vagy kiiktatással módosul az 1. ábra egy vagy több alábbi aminosava előtt vagy után:

P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129,1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259,

T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279,

H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303,

D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312,

A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320,

E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, 0418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440,

A441, M442, G443, D467, G468, S469, L471, N473,

L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501,

Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511,

R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574,

H575, V576, L577, P578, M579, I580, P581, G583,

G584, továbbá az előzőek bármelyikének funkcionális ekvivalensei; az 1. ábra Q124 és D324 közti beiktatásai vagy kiiktatásai vagy ezek funkcionális ekvivalensei; és a fentiek bármelyikének bármely kombinációja.

A mutációk, akár az 1. ábra polipeptidjébe, akár más növényi AHAS-génekben ekvivalens pozíciókba vezetjük be ezeket, olyan változásokat tartalmazhatnak a DNS-szekvenciában, amelyek eredményezik egy vagy több aminosav egyszerű helyettesítését, vagy legfeljebb 5 aminosav kiiktatását a fenti listákon szereplő helyek bármelyike előtt vagy után.

Egy másik eljárás szerint a mutációk olyan változásokat tartalmazhatnak a DNS-szekvenciában, amely

HU 226 259 Β1 szerint egy vagy több aminosav van hozzáadva vagy kiiktatva keretben a fenti pozícióknál. A hozzáadások előnyösen mintegy 3 és mintegy 30 nukleotid közti számú nukleotidot, és a kiiktatások szintén mintegy 3 és mintegy 30 közti számú nukleotidot tartalmaznak. Ezenkívül egy egyedi mutáns peptid tartalmazhat több, mint egy hasonló, vagy különböző mutációt.

A jelen találmány magában foglal DNS és megfelelő RNS szekvenciákat, valamint szensz és antiszensz szekvenciákat. Az AHAS-polipeptideket kódoló nuk- 10 leinsavszekvenciák természetben előforduló AHAS szabályozó szekvenciákkal vannak szegélyezve, vagy társulva lehetnek heterológ szekvenciákkal, ideértve a promotereket, fokozókat, válaszelemeket, szignálszekvenciákat, poliadenilezési szekvenciákat, intronokat,

5’- és 3’-végi nemkódoló régiókat, és hasonlókat. Ezenkívül a nukleinsavat lehet azért is módosítani, hogy megváltozzék a stabilitás, oldhatóság, kötési affinitás és fajlagosság. így például variáns AHAS-kódoló szekvenciák szelektíven metilezhetők. A jelen talál- 20 mány szerinti nukleinsavszekvenciák módosíthatók valamely jelzéssel is, amely képes kimutatható jel nyújtására akár közvetlenül, akár közvetetten. Az ilyen jelzésekre példák lehetnek a radioizotópok, fluoreszcens molekulák, biotin és hasonlók.

A találmány vektorokat is nyújt, amely AHAS-variánsokat kódoló nukleinsavakat tartalmaz. Nagy számú vektort, ideértve a plazmidokat és a gomba vektorokat, írtak már le kifejezéshez sokféle eukarióta és prokarióta gazdaszervezetben. A vektorok előnyösen 30 magukban foglalhatnak valamely promotert is, amely működőképesen kapcsolódik az AHAS-t kódoló részhez. A kódolt AHAS-t bármilyen alkalmas vektor és gazdasejt alkalmazásával ki lehet fejezni bármely olyan eljárást használva, amelyet itt leírunk vagy idézünk, vagy amely egyébként jól ismert azok számára, akik a szakterületen járatosak. A megfelelő vektorokra példák lehetnek - anélkül, hogy eljárásunk csak ezekre 5 korlátozódna - a pBIN-alapú vektorok, a pBluescript vektorok és a pGEM vektorok.

A jelen találmány továbbá magában foglalja mind a herbicidrezisztens AHAS-polipeptid variánsokat, mind ezek peptidfragmentumát. Amint fentebb megmagyaráztuk, az AHAS-polipeptid variánsok származhatnak az 1. ábrákon bemutatott kukoricapolipeptidekből, vagy bármely növényi vagy mikrobiológiai eredetű AHAS-polipeptidből, előnyösen növényi AHAS-polipeptidből. A polipeptidek tovább módosíthatók például foszforilezéssel, 15 szulfátozással, acilezéssel, gllkozilezéssel, vagy más fehérjemódosításokkal. A polipeptideket izolálhatjuk növényekből, vagy heterológ organizmusokból vagy sejtekből (ideértve, de nemcsak ezekre korlátozva, a bakteriális, élesztő-, rovar-, növényi és emlőssejteket), amelyekbe egy AHAS-polipeptid variánst kódoló gént bevezettünk és kifejeztünk. Ezenkívül az AHAS-polipeptidek módosíthatók közvetlenül valamely jelzéssel is, amely képes kimutatható jel nyújtására akár közvetlenül, akár közvetve. Az ilyen jelzésekre példák lehetnek a radioizo25 topok, fluoreszcens vegyületek és hasonlók.

Kémiai anyagokra rezisztens növények, és AHASvaríáns géneket tartalmazó növények A jelen találmány magában foglal transzgenikus sejteket, ideértve, de nemcsak ezekre korlátozva, a magvakat, organizmusokat és növényeket, amelyekbe herbicidrezisztens AHAS-variánsokat kódoló géneket vezettünk be. A megfelelő befogadó növényekre nem korlátozó jellegű példákat mutat be az 1. táblázat.

1. táblázat Befogadó növények

Közönséges név	Család	Latin név
Kukorica	Gramineae	Zea mays
Kukorica, fog alakú	Gramineae	Zea mays dentiformis
Kukorica, kavics alakú	Gramineae	Zea mays vulgáris
Kukorica, pattogatni való	Gramineae	Zea mays microsperma
Kukorica, lágy	Gramineae	Zea mays amylacea
Kukorica, édes	Gramineae	Zea mays amyleasaccharata
Kukorica, édes	Gramineae	Zea mays saccharate
Kukorica, viaszos	Gramineae	Zea mays ceratina
Búza, dinkel	Pooideae	Triticum spelta
Búza, durum	Pooideae	Triticum durum
Búza, angol	Pooideae	Triticum turgidum
Búza, nagy tönköly	Pooideae	Triticum spelta
Búza, lengyel	Pooideae	Triticum polonium
Búza, poulard	Pooideae	Triticum turgidum
Búza, egyszemes	Pooideae	Triticum monococcum
Búza, kis tönköly	Pooideae	Triticum monococcum

HU 226 259 Β1

1. táblázat (folytatás)

Közönséges név	Család	Latin név
Búza, lágy	Poóideae	Triticum aestivum
Rizs	Gramineae	Oryza sativa
Rizs, amerikai vad	Gramineae	Zizania aquatica
Rizs, ausztrál	Gramineae	Oriza australiensis
Rizs, indiai	Gramineae	Zizania aquatica
Rizs, vörös	Gramineae	Oryza glaberrima
Rizs, tuscarora	Gramineae	Zizania aquatica
Rizs, nyugat-afrikai	Gramineae	Oriza glaberrima
Árpa	Pooideae	Hordeum vulgare
Árpa, abesszin közbenső, más néven szabálytalan	Pooideae	Hordeum írregulare
Árpa, őszi kétsoros	Pooideae	Hordeum spontaneum
Árpa, csupasz	Pooideae	Hordeum trifurcatum
Árpa, egyiptomi	Pooideae	Hordeum trifurcatum
Árpa, négysoros	Pooideae	Hordeum vulgare polystichon
Árpa, hatsoros	Pooideae	Hordeum vulgare hexastichon
Árpa, kétsoros	Pooideae	Hordeum distichon
Gyapot, abroma	Dicotyledoneae	Abroma augusta
Gyapot, közép-amerikai	Malvaceae	Gossypium hirsutum
Gyapot, ázsiai fás, vagy indiai fás	Maívaceae	Gossypium arboreum
Gyapot, brazil, vagy vese alakú, vagy pernambuco	Malvaceae	Gossypium barbadense brasiliense
Gyapot, levantei	Malvaceae	Gossypium herbaceum
Gyapot, hosszú selymes, vagy hosszú fürtös, vagy tengeri sziget	Malvaceae	Gossypium barbadense
Gyapot, mexikói, vagy rövid fürtös	Malvaceae	Gossypium hirsutum
Szójabab, szója	Leguminosae	Glycine max
Cukorrépa	Chenopodiaceae	Béta vulgáris altissima
Cukornád	Fásszárúak	Arenga pinnata
Paradicsom	Solanaceae	Lycopersicon esculentum
Paradicsom, cseresznyepiros	Solanaceae	Lycopersicon esculentum cerasiforme
Paradicsom, közönséges	Solanaceae	Lycopersicon esculentum commune
Paradicsom, ríbizliszerű	Solanaceae	Lycopersicon pimpinellifolium
Paradicsom, héjas	Solanaceae	Physalis ixocarpa
Paradicsom, foltos	Solanaceae	Solanum incanum
Paradicsom, körte alakú	Solanaceae	Lycopersicon esculentum pyriforme
Paradicsom, fás	Solanaceae	Cyphomandra betacea
Burgonya	Solanaceae	Solanum tuberosum
Burgonya, spanyol vagy édes burgonya	Convolvulaceae	Ipomea batatas
Rozs, közönséges	Pooideae	Secale cereale
Rozs, hegyi	Pooideae	Secale montanum
Paprika, harang alakú	Solanaceae	Capsicum annuum grossum
Paprika, madár, vagy cayenne vagy guinea	Solanaceae	Capsicum annuum minimum
Paprika, sapka alakú	Solanaceae	Capsicum sinense

HU 226 259 Β1

1. táblázat (folytatás)

Közönséges név	Család	Latin név
Paprika, bikaorr, vagy édes	Solanaceae	Capsicum annuum grossum
Paprika, cseresznye	Solanaceae	Capsicum annuum cerasiforme
Paprika, fürtös vagy vörös fürtös	Solanaceae	Capsicum annuum fasciculatum
Paprika, kúpos	Solanaceae	Capsicum annuum conoides
Paprika, kecske vagy sarkantyú	Solanaceae	Capsicum frutescens
Paprika, hosszú	Solanaceae	Capsicum frutescens longum
Paprika, diszvörös vagy ráncos	Solanaceae	Capsicum annuum abbreviatum
Paprika, tabasco vörös	Solanaceae	Capsicum annuum conoides
Saláta, kerti	Compositae	Lactuca sativa
Saláta, spárgaszerű vagy zellerszerű	Compositae	Lactuca sativa asparagina
Saláta, kék	Compositae	Lactuca perennis
Saláta, kék vagy cikóriaszerű	Compositae	Lactuca pulchella
Saláta, káposztaszerű vagy fejes	Compositae	Lactuca sativa capitata
Saláta, kötöző, vagy hosszúlevelű vagy romaine	Compositae	Lactuca sativa longifolia
Saláta, ráncos vagy fodros vagy vágott vagy leveles	Compositae	Lactuca sativa crispa
Zeller	Umbelliferae	Apium graveolens
Zeller, halvány, vagy kerti	Umbelliferae	Apium graveolens dulce
Zeller, gyökeres, vagy répagyökerű	Umbelliferae	Apium graveolens rapaceum
Padlizsán, kerti	Solanaceae	Solanum melongena
Cirok	Sorghum	Minden terményfajta
Lucerna	Leguminosae	Medicago sativum
Sárgarépa	Umbelliferae	Daucus carota sativa
Bab, futó	Leguminosae	Phaseolus vulgáris vulgáris
Bab	Leguminosae	Phaseolus aureus
Bab, brazil széles	Leguminosae	Canavalia ensiformis
Bab, széles	Leguminosae	Vicia faba
Bab, közönséges, vagy francia, vagy fehér, vagy vese	Leguminosae	Phaseolus vulgáris
Bab, egyiptomi	Leguminosae	Dolíchos lablab
Bab, hosszú, vagy Yardos	Leguminosae	Vigna sesquipedalis
Bab, szárnyas	Leguminosae	Psophocarpus tetragonolobus
Zab, közönséges, vagy szegélyező, vagy fás	Avena	Sativa
Zab, fekete, vagy sörtés, vagy félszeg	Avena	Strigosa
Zab, sörtés	Avena
Borsó, kerti, vagy zöld, vagy hántolnivaló	Leguminosae	Pisum sativum sativum
Borsó, feketeszemű	Leguminosae	Vigna sinensis
Borsó, ehető héjú	Leguminosae	Pisum sativum axiphium
Borsó, szürke	Leguminosae	Pisum sativum speciosum
Borsó, szárnyas	Leguminosae	Tetragonolobus purpureus
Borsó, ráncos	Leguminosae	Pisum sativum medullare
Napraforgó	Compositae	Helianthus annuus
Tök, őszi, vagy téli	Dicotyledoneae	Cucurbita maxima

HU 226 259 Β1

1. táblázat (folytatás)

Közönséges név	Család	Latin név
Tök, cserjés vagy nyári	Dicotyledoneae	Cucurbita pepo melopepo
Tök, süveg alakú	Dicotyledoneae	Cucurbita maxima turbaniformis
Uborka	Dicotyledoneae	Cucumis sativus
Uborka, afrikai vagy keserű	Dicotyledoneae	Momordica charantia
Uborka, fecskendőszerű, vagy vad	Dicotyledoneae	Ecballium elaterium
Uborka,vad	Dicotyledoneae	Cucumis anguria
Nyárfa, kaliforniai	Fásszárúak	Populus trichocarpa
Nyárfa, európai fekete		Populus nigra
Nyárfa, szürke		Populus canescens
Nyárfa, Lombardy		Populus italica
Nyárfa, ezüstlevelű, vagy fehér		Populus alba
Nyárfa, nyugati balzsam		Populus trichocarpa
Dohány	Solanaceae	Nicotiana
Arabidopsis thaliana	Curciferae	Arabidopsis thaliana
Pázsitfű	Lolium
Pázsitfű	Agrostis
	További pázsitfű családok
Lóhere	Leguminosae

Az AHAS-polipeptid variánsok kifejezése transzgenikus növényekben magas szintű rezisztenciát biztosít herbicidekre, ideértve, de nemcsak ezekre korlátozva, az imidazolinon herbicideket, mint például az imazetapirt (PURSUIT), lehetővé téve ezeknek a herbicideknek az alkalmazását a transzgenikus növények termesztése során.

Idegen géneknek növényekbe való bevezetésére szolgáló eljárások ismeretesek a szakterületen. Nem korlátozó jellegű példák lehetnek az ilyen eljárásokra az Agrobacteriummal történő fertőzés, a részecskebombázás, a protoplasztok polietilénglikolos (PEG) kezelése, a protoplasztok elektroporációja, a mikroinjektálás, a makroinjektálás, a gyökérsaij-injektálás, a pollentömlő út, a száraz mag átitatás, a lézerperforálás és az elektroforézis. Ezeket az eljárásokat például az alábbi irodalmi helyeken ismertetik: Jenes B. és munkatársai, és Ritchie S. W. és munkatársai: In: Transgenic Plats, 1. kötet, „Engineering and Utilization”; szerkesztők: Kung S.-D. és Wu R.; kiadó Academic Press, Inc. Harcourt Brace Jovanovich (1993); és Mannonen és munkatársai; Critical Reviews in Biotechnology, 14, 287-310 (1994).

Egy előnyös kiviteli módban az egy AHAS-variánst kódoló DNS-t olyan DNS-vektorba klónozzuk, amely valamely antibiotikumrezisztencia markergént tartalmaz, és a rekombináns AHAS DNS-t tartalmazó plazmidot egy Ti plazmidot tartalmazó Agrobacterium tumefaciensbe vezetjük be. Ezt a „biner vektor rendszerit például az alábbi irodalmi helyeken ismertetik: 4.490.838 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, és An és munkatársai: Plánt Mól.

Bioi. Manual A3, 1-19 (1988). A transzformált Agrobacteriumot azután együtt tenyésztjük a befogadó növényekből származó levéllemezekkel, hogy lehetővé tegyük a növénysejtek fertőzését és transzformálását. A transzformált növénysejteket azután regeneráló tápközegben tenyésztjük, amely a sarjak kialakulását segítik elő, először a megfelelő antibiotikum jelenlétében, hogy kiválasszuk a transzformált sejteket, majd a herbicid jelenlétében. A herbicidrezisztens AHAS-t kódoló DNS-sel sikeresen transzformált növénysejtekben a sarjak képződése megtörténik a herbicidek olyan szintjeinek jelenlétében is, amelyek a nem transzformált sejtekből való sarjképzést gátolják. Miután meggyőződtünk az AHAS-variáns DNS jelenlétéről például polimeráz-láncreakció (PCR) elemzés alkalmazásával, a transzformált növényeket megvizsgáljuk azon képességükre, hogy ellenállnak a herbiciddel történő permetezésnek és azon képességükre, hogy magjuk kicsírázik, gyökerük beindul és burjánzik a herbicid jelenlétében.

Egyéb alkalmazások

A jelen találmány eljárásait és anyagait alkalmazhatjuk herbicidrezisztens AHAS-variánsok szerkezeti alapon történő ésszerű tervezésére, amely variánsok beépíthetők növényekbe, hogy szelektív herbicidrezisztenciát adjanak át ezeknek. Az AHAS köztes variánsai (például olyan variánsok, amelyek az optimálisnál kisebb fajlagos aktivitást, de nagy rezisztenciát és szelektivitást mutatnak, vagy fordítva) használhatók mint templátok második generációs AHAS-variánsok tervezéséhez, amelyek megőrzik a megfelelő fajlagos aktivitást, nagy rezisztenciát és szelektivitást.

HU 226 259 Β1

Herbicidrezisztens AHAS-géneket transzformálhatunk terményfajtákba egyedi vagy többszörös másolatban, hogy herbicidrezisztenciát adjanak át. A herbicidekre csökkentett érzékenységű terményfajták kialakítására való genetikai mérnöki beavatkozással képesek vagyunk:

(1) megnövelni a fajlagosan hatásos és környezetileg enyhe herbicidek, mint például az imidazolinon herbicidek alkalmazási spektrumát és rugalmasságát;

(2) fokozni ezeknek a herbicideknek a kereskedelmi értékét;

(3) csökkenteni a gyomok elterjedését a földeken a herbicidek hatékony alkalmazásával a herbicidekre rezisztens terményfajtákhoz, és ezáltal megfelelően növelni az aratás hozamát;

(4) növelni a herbicidrezisztens növények magjainak eladását;

(5) növelni a rezisztenciát a korábbi ültetéskor alkalmazott herbicidek átviteléből származó terménykárosodás ellen;

(6) csökkenteni az érzékenységet a kedvezőtlen éghajlati körülmények miatt a kukorica jellemzőiben bekövetkező változásokra; és (7) növelni a tűrőképességet az egyenetlenül vagy rosszul alkalmazott herbicidekre.

Igy például transzgenikus AHAS-fehéije variánst tartalmazó növényeket termeszthetünk. A növényt kezelhetjük gyomirtáshoz hatékony mennyiségű herbiciddel, amelyre az AHAS-variáns transzgenikus növény rezisztens, ezzel gyomszabályozást érünk el a tenyészetben a nélkül, hogy károsan befolyásolnák a termeszteni szándékolt növényt.

A fentebb leírt DNS-vektorokat, amelyek herbicidrezisztens AHAS-variánsokat kódolnak, tovább hasznosíthatjuk úgy, hogy az AHAS-variáns kifejezése szelektálható markert nyújtson a sejtek vektorral való transzformálásánál. A befogadónak szánt sejtek lehetnek tenyészetben vagy in situ, és az AHAS-variáns géneket használhatjuk egyedül vagy más szelektálható markerekkel kombinálva. Az egyetlen követelmény az, hogy a befogadó sejt érzékeny legyen a rokon herbicid citotoxikus hatására. Ennek a kiviteli módnak előnye a viszonylag alacsony költség és a például imidazolinonalapú herbicidek toxicitásának hiánya, és ez alkalmazható bármely olyan rendszerben, amely DNS által közvetített transzformációt igényel.

Az alábbi példák azt a célt szolgálják, hogy részletesebben bemutassák a jelen találmányt, de nem korlátozó jelleggel.

1. példa Herbicidrezisztens AHAS-variánsok tervezése

A fentebb részletesen leírt modell javasolt herbicidkötő helyéhez közel elhelyezkedő gyököket választunk ki mutagenezishez abból a célból, hogy tervezzünk egy aktív AHAS-polipeptidet csökkentett herbicidkötő kapacitással. A zseb felületénél minden helyet megvizsgálunk a zsebben levő további gyökökkel, valamint kofaktorokkal és herbicidekkel potenciálisan kialakuló kölcsönhatások szempontjából, igy például a pozitívan töltött gyök(ök)től elvárható, hogy interferálnak a kötő helyen belül levő töltéseloszlással, ez pedig csökkenést eredményez a negatívan töltött herbicidek kötésének affinitásában.

Három gyököt azonosítottunk, mint leghasznosabb célpontokat a mutagenezishez:

(1) Az F135-ösről úgy véljük, hogy kölcsönhatásban van mind a FAD izoalloxazingyűrűjével, mind a herbicid aromás csoportjával. A töltöttebb gyökök zsebbe való bejuttatásának stratégiájával összhangban ezt a gyököt argininre cseréljük.

(2) Az M53 érinti a 498-507 hélixet. Ez a hélix ismert herbicidrezisztencia mutációs helyeket tartalmaz és be van vonva a TPP kötésbe. Ezenkívül a glutaminsavhelyettesítésről az 53. helyen úgy véljük, hogy támogat egy kölcsönhatást K185-tel, csökkentve a K185 affinitását az imazetapir karboxilátcsoportjához.

(3) Az R128 a zseb bejáratához közel helyezkedik el, ahol véleményünk szerint érintett a töltött herbicidek kezdeti transzportjában a kötőzsebbe. Ezt a gyököt alaninra változtatjuk, hogy eltávolítsuk mind töltését, mind hosszú hidrofób oldalláncát.

2. példa Az AHAS helyspecifikus mutagenezise herbicidrezisztens variánsok előállítására Az Arabidopsis AHAS-gént azonos leolvasási fázisban beiktatjuk a glutation S-transzferáz gén kódoló régiójának 3’-végéhez a pGEX-2T vektorban (Pharmacia). A vektor konstrukciója ezen a módon fenntartja a hat aminosavas trombin felismerő szekvenciát a kifejezett glutation-S-transzferáz (GST)/AHAS fúziós fehérje kapcsolásánál. A kifejezett fúziós fehérje trombinos emésztése olyan AHAS-fehéijét eredményez, amelynek N-terminális kiindulási helye a tranzit peptid végénél van egy vélt tranzit peptid feldolgozó helynél, egy maradék N-terminális glicinnel, amely a trombin felismerő helyből származik. A hasított AHAS-fehéije végső aminoterminálisa Gly-Ser-Ser-lle-Ser szekvenciából áll. Ebben a vektorban helyspecifikus mutációkat vezetünk be az AHAS-génbe.

A helyspecifikus mutagenezist Higuchi PCR-eljárása szerint hajtjuk végre [Recombinanat PCR. In: Innis M. A. és munkatársai: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, kiadó: Academic Press, San Diego, 177-183. oldal (1990)]. Két PCR-terméket, melyek mindegyike átfedi a mutációs helyet, amplifikálunk. A mutációt az átfedő régió láncindítói hordozzák. Az átfedő, PCR-rel amplifikált fragmenseket egyesítjük, denaturáljuk, és hagyjuk egymással újra összeforradni, így alakítva ki két lehetséges heteroduplex terméket rejtett 3'-végekkel. A rejtett 3’-végeket Taq DNS-polimerázzal meghosszabbítjuk olyan fragmentumot előállítva, amely a két átfedő PCR-termék összesítése, és amely tartalmazza a kívánt mutációt. Ennek a fragmentumnak az ezt követő újra amplifikálása kizárólag a két „külső” primer jelenlétében a teljes hosszúságú termék feldúsulását eredményezi. A mutációt tartalmazó terméket azután újra bejuttatjuk az Arabidopsis AHASgénbe a pGEX-2T vektorban.

HU 226 259 Β1

3. példa AHAS-variánsok expressziója és tisztítása

A. Eljárások

A kukorica vad típusú AHAS-gént (a vektor elnevezése pAC751), az Arabidopsis Ser653Asn mutánst, vagy az Arabidopsis lle401Phe mutánst tartalmazó pGEX-2T vektorral transzformált E. coli (DH5a) sejteket növesztjük egy éjszakán át LB-tápközegben, amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz. Az E. coli égy éjszakán át nőtt tenyészetét 1:10 arányban hígítjuk 1 liter LB tápközeggel, amely 50 pg/ml ampicillint és 0,1% (térfogat/térfogat) A típusú habgátlót is tartalmaz. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk rázatás közben, amíg az OD₆₀₀ eléri a mintegy 0,8 értéket. Izopropil-tio-galaktózt (IPTG) adunk hozzá 1 mmol/liter végső koncentrációig, és a tenyészetet további 3 órán át inkubáljuk.

A sejteket centrifugálással nyerjük ki 8.670*g-nél 10 percig JA-10 rotorban, és újraszuszpendáljuk az eredeti tenyésztési térfogat 1/100-ában MTPBS-ben (16 mmol/l Na₂HPO₄,4 mmol/l NaH₂HPO₄,150 mmol/l NaCI, pH=7,3). Triton Χ-100-at és lizozimot adunk hozzá 1% (térfogat/térfogat), illetve 100 pg/ml koncentrációban. A sejteket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át, lehűtjük 4 °C hőmérsékletre jégen, és ultrahangos keveréssel lizáljuk 10 másodpercig egy mikrocsúcs szondával ellátott Branson Sonifier Cell Disrupter típusú ultrahangos sejtzúzó berendezés 7. szintjével. A sejtmentes extraktumot 35.000*g-nél centrifugáljuk 10 percen át 4 °C hőmérsékleten. A felülúszót dekantáljuk és a centrifugálási lépést megismételjük.

A kifejezett fúziós fehérjék tisztítását Smith és Johnson módosított eljárásával hajtjuk végre [Gene 67, 31-40 (1988)]. A felülúszót szobahőmérsékletre melegítjük és átengedjük egy glutation-agaróz-gyöngyöket (kénkötés, Sigma) tartalmazó 2 ml-es oszlopon, amelyet előzőleg MTPBS-sel egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot ezt követően MTPBS-sel mossuk szobahőmérsékleten, amíg az eluátum A₂₈₀-értéke egyezik az MTPBS hasonló értékével. A fúziós fehérjét azután olyan oldat alkalmazásával eluáljuk, amely 5 mmol/l redukált glutationt tartalmaz 50 mmol/l trisz.HCI-ben (pH=8,0). Az eluált fúziós fehérjét mintegy 30 NIH egység trombinnal kezeljük és dializáljuk 50 mmol/l citrátot (pH=6,5) és 150 mmol/l NaCI-t tartalmazó oldattal szemben.

A fúziós fehérjét egy éjszakán át emésztjük szobahőmérsékleten. Az emésztett mintákat dializáljuk MTPBS-sel szemben és kétszer átengedjük egy glutation-agaróz oszlopon, amelyet MGPBS-sel egyensúlyoztunk ki, így távolítjuk el a felszabadult glutation transzferáz fehérjét. A fehérje frakciót, amely nem kötődött az oszlophoz, összegyűjtjük és YM10 szűrőn (Amicon) végzett ultraszűréssel koncentráljuk. A koncentrált mintákat ráterheljük egy 1,5*95 cm-es Sephacryl S-100 gélszűrő oszlopra, amelyet gélszűrő pufferral (50 mmol/l HEPES, 150 mmol/l NaCI, pH=7,0) egyensúlyoztunk ki. 2 ml-es frakciókat gyűjtünk 0,14 mmol/l/perc átfolyási sebességnél. Az enzim stabilitását az enzim tárolásával vizsgáljuk 4 °C hőmérsékleten gélszűrő pufferban 0,02% nátrium-azid hozzáadásával és 2 mmol/l tiamin-pirofoszfát és

100 pmol/l flavin-adenin-dinukleotid (FAD) jelenlétében vagy távollétében.

B. Eredmények

A GST génnel - a géntől 3’-irányban és azonos leolvasási fázisban - fuzionált vad típusú AHAS-gént tartalmazó pAC751 plazmiddal transzformált E. coli egy 91 kD-s fehérjét fejez ki, amikor IPGT-vel indukáljuk. A 91 kD-s fehérje a GST/AHAS fúziós fehérje számított molekulatömegét (26 kD és 65 kD összege) mutatja. Amikor a DH5a/pAC751 sejtmentes extraktumát keresztülbocsátjuk egy glutation agaróz affinitás gélen, mossuk és eluáljuk szabad glutationnal, olyan készítmény keletkezik, amely a 91 kD-s fehérjében dús (6. ábra, C vonal). A hat aminosavas trombin felismerő hely, amelyet a GST és AHAS találkozásához alkottunk meg, sikeresen lehasadt trombinnal (6. ábra, D vonal). A hasított fúziós fehérje készítmény a várt 26 kD-s GST fehérjéből és a 65 kD-s kukorica AHASfehérjéből áll. A kukorica AHAS-t homogenitásig tisztítjuk egy második átbocsátással a glutation-agaróz oszlopon, hogy affinitás segítségével kivonjuk a GST-t, és egy végső Sephacryl S-100 gélszűrési lépésnek alávetéssel, hogy eltüntessük a trombint (6. ábra, E vonal). A 65 kD-s fehérjét Western foltképzéssel ismerjük fel olyan monoklonális antitest segítségével, amelyet egy kukorica AHAS-peptid ellen alakítottunk ki.

A tisztított, vad típusú kukorica AHAS-t elemezzük elektroporlasztásos tömegspektroszkópiával, és úgy határozzuk meg, hogy ennek molekulatömege 64.996 dalton (részletes adatokat nem mutatunk be). A jósolt tömeg, ahogyan számítottuk a pGEX-2T vektorba beiktatott gén következtetett szekvenciájából, 65.058. A 0,096% eltérés az empirikusan meghatározott és a jósolt tömeg között a tömegspektrométer hangolási szóródásán belül van. A két tömegmeghatározás szoros közelsége azt sugallja, hogy nincsenek tévesen beépített nukleotidok az expressziós vektor megalkotása során, és a fehérje olyan transzláció utáni módosulásai nem jelennek meg, amelyek nagy változásokat okozhatnának a molekulatömegben. Ezenkívül a hamis csúcsok hiánya a tisztított készítményben is azt jelzi, hogy a minta mentes a szennyeződéstől.

4. példa Az AHAS-variánsok enzimes tulajdonságai

Az E. coliban termelt vad típusú és variáns AHAS enzimes tulajdonságait Singh és munkatársai módosított eljárásával mérjük [Anal. Biochem 171, 173-179 (1988)] a következőképpen:

1*AHAS vizsgálópuffert [50 mmol/l HEPES, pH=7,0, 100 mmol/liter piruvát, 10 mmol/l MgCI₂, 1 mmol/liter tiamin pirofoszfát (TPP)] és 50 pmol/l flavin adenin dinukleotidot (FAD) tartalmazó reakciókeveréket kapunk vagy egy 2*vizsgálópufferban levő enzim hígításával, vagy koncentrált enzim hozzáadásával 1 *AHAS vizsgálópufferhez. Minden imazetapirt tartalmazó és ezekhez tartozó kontroll vizsgáló összeállítás tartalmaz végső koncentrációjában 5% DMSO-t (dimetil-szulfoxid), mivel a vizsgálókeverékhez az imazetapirt 50% DMSO-s oldatban adjuk hozzá. A vizsgálato18

HU 226 259 Β1 kát 250 μΙ végső térfogatban végezzük 37 °C hőmérsékleten, mikrotitrálólemezeken. Miután a reakciót hagytuk végbemenni 60 percen át, kaliometriásan mérjük az acetolaktát felgyülemlését, ahogyan ezt Singh és munkatársai leírják [Anal. Biochem. 171, 173-179 (1988)].

A pAC751-ből a 3. példában leírtak szerint kifejezett és tisztított kukorica AHAS aktív a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában. A teljes AHAS-aktivitás függ a FAD és TPP kofaktorok jelenlététől a vizsgáló tápközegben. Aktivitás nem mutatható ki, amikor csupán FAD-ot adunk hozzá a vizsgálóközeghez. A tisztított enzim aktivitása csupán TPP-vel vagy kofaktorok nélkül kevesebb mint 1%-a annak az aktivitásnak, amely TPP és FAD együttes jelenlétében mutatkozik. Normálisan a nyers növényi extraktumban levő AHAS nagyon labilis, különösen a szubsztrátum és a kofaktorok távollétében. Ezzel ellentétben a bakteriális kifejező rendszerből tisztított AHAS nem mutat veszteséget a katalitikus aktivitásban, amikor 1 hónapon át tároljuk 4 °C hőmérsékleten olyan oldatban, amely 50 mmol/l HEPES-t, pH=7,0, 150 mmol/l NaCI-t és 0,02% NaN₃-at tartalmaz, és ez érvényes FAD és TPP jelenlétében és távollétében egyaránt. Ezenkívül bomlástermék nem látható ezekből a tárolt készítményekből, amikor felbontjuk SDS-PAGE gélen.

A vad típusú és az M124E, R199A és F206R variánsok fajlagos aktivitásait a 2. táblázatban mutatjuk be. Amint ezt az 5. ábra egymás alá rendezéséből meghatározzuk, az Arabidopsis AHAS-ban levő M124E mutáció a kukorica M53E mutáció ekvivalense, az Arabidopsisban levő R199 mutáció a kukorica R128A mutáció ekvivalense, és az Arabidopsisban levő F206R mutáció a kukorica F135R mutáció ekvivalense. A kukorica AHAS szerkezeti modellben tervezett mutációkat felhasználjuk, hogy azonosítsuk az ekvivalens aminosavakat a kétszikű Arabidopsis AHAS-génben, és ezeket beépítjük az Arabidopsis AHAS-génbe és vizsgáljuk benne. Az ésszerűen tervezett herbicid mutációk ezen transzlációja és beépítése a kétszikű Arabidopsis AHAS-génbe megkönnyítheti a herbicidrezisztencia értékelését valamely kétszikű fajtában.

2. táblázat Fajlagos aktivitás

	Fajlagos aktivitás	% katalitikus aktivitás a vad típuséhoz hasonlítva
Vad típus	99,8	100
Met124Glu	9,15	9,16
Arg199Ala	86,3	86,5
Phe206Arg	5,07	5,1

A R199A mutáció magas szintű katalitikus aktivitást tart fenn (2. táblázat), ugyanakkor a rezisztencia jelentős szintjét mutatja imazetapirra (7. ábra). Megjegyzésre méltó, hogy ez a variáns teljes érzékenységet őriz meg szulfonil-karbamidokra (8. ábra). így ez a variáns teljesíti a nagyfokú fajlagos aktivitás és szelektív herbicidrezisztencia követelményeit. Ezzel ellentétben az M124E helyettesítés csaknem teljes rezisztenciát mutat imazetapirra (7. ábra), de meglehetősen csökkent katalitikus aktivitást is mutat (2. táblázat). Az imidazolinonrezisztenciára vonatkoztatva ez a variáns nagyobb érzékenységet mutat szulfonil-karbamidra (8. ábra), azt sugallva, hogy ez a gyök jelölt egy olyan mutáció megalkotására, amely szelektív rezisztenciát ad. Egy aminosav helyettesítése glutaminsavtól eltérő aminosawal segíthet megtartani a katalitikus aktivitást. Az F206R helyettesítés hasonló eredményeket alakít ki az M124E variánsnál észleltekhez, de hiányzik benne a szelektivitás a rezisztenciában.

5. példa Az AHAS herblcidrezlsztens variáns ismételt javítása az ésszerű tervezési megközelítés alkalmazásával

A 124 gyök cseréje az AHAS-ban Met-ről Glu-ra, amint a 4. példában leírjuk, imidazolinonrezisztenciát biztosít, de csökkenti az enzimaktivitást is a vad típusúnál mért érték 9,2%-ára. A kukorica AHAS szerkezet fent leírt modellje azt sugallja, hogy a Met53 (amely ekvivalens az Arabidopsis Met124 gyökével) kölcsönhatásban van egy sor hidrofób gyökkel az α-hélix első felületén, amely egy külön alegységből származik, de szoros közelségben van a Met53-hoz. fgy a hidrofób kölcsönhatás Met53 és a hélixen levő gyökök között stabilizálja mind az alegység/alegység társulást, mind az aktív hely konformációját. Úgy véljük, hogy a hidrofób Met gyök helyettesítésre egy töltött glutamát gyökkel nagy valószínűséggel destabilizálja az alegységek közti hidrofób kölcsönhatást, ez pedig a katalitikus aktivitás elvesztését eredményezi.

Erre a szerkezet/funkció elemzésre alapozva az eredeti Arabidopsis Met124Glu (amely ekvivalens a kukorica Met53Glu-val) mutáns enzim aktivitását azután ismételten javítjuk egy további hidrofób aminosav (Ile) helyettesítésével ennél a pozíciónál. Az Ile oldallánc hidrofób természete az aktivitás helyreállítását eredményezi a vad típusú szintekre (fajlagos aktivitás 102, amely ekvivalens a vad típusú aktivitás 102%-ával), de az Ile oldallánc nagyobb tömege még képes fenntartani az imidazolinonrezisztencia jelentős szintjét (9. ábra).

Összehasonlításként egy hisztidin gyök helyettesítése ennél a pozíciónál olyan AHAS-variánst eredményez, amely 42,5 fajlagos aktivitási értéket mutat, amely a vad típusú aktivitás 42,6%-ával ekvivalens. Ez a mutáns ugyanakkor nagymértékű rezisztenciát mutat PURSUIT-ra (10. ábra).

6. példa Az AHAS herblcidrezlsztens variáns ismétlődő javítása egy ésszerű tervezési megközelítés alkalmazásával

Az ismétlődő finomításra a jelen találmány szerinti eljárást alkalmazva egy másik példa lehet az Arg128Ala variáns. A kukorica AHAS szerkezeti modellje azt sugallja, hogy az Arg 128 gyök, amely a herbicidkötő zseb peremén helyezkedik el, részt vesz a töltött szubsztrá19

HU 226 259 Β1 tumok és herbicidek beléptetésében a herbicidkötő zsebbe és az aktív helyre. Az Arg 128 gyök távol van a TPP-nek attól a felétől, amely a kiindulási piruvátmolekulát köti az AHAS reakciómechanizmusában, ez magyarázza meg, miért van az Arabidopsis Arg199 (amely ekvivalens a kukorica Arg128-cal) helyettesítésének alaninra oly csekély hatása az enzim katalitikus aktivitására. A szerkezeti modell továbbá azt jelzi, hogy egy radikálisabb cserét lehetne végezni ennél a pozíciónál, hogy megemeljük a rezisztencia szintjét, miközben fenntartjuk a katalitikus aktivitás magas szintjét. Ezen az alapon a mutáció ismételt javítását végezzük el, hogy helyettesítsük a pozitívan töltött arginin gyököt egy negatívan töltött glutamát gyökre. Az így mutált enzim a rezisztencia javított szintjeivel bír PURSUIT-ra, miközben megtartja magas szintű aktivitását (fajlagos aktivitása 114, ez a vad típusú aktivitás 114%-ával ekvivalens).

7. példa A különböző fajtákból származó AHAS-ok felcserélhetósége a herbicidrezisztens ÁHASvariánsok szerkezeti alapon történő ésszerű tervezésében te AHAS háromdimenziós szerkezetének szerkezeti modelljét valamely egyszikű AHAS szekvenciával, például kukoricából származó szekvenciával építjük fel, amint a korábbiakban leírtuk. Abból a célból, hogy mutációkat vezessünk be valamely kétszikű fajtából, például Arabidopsisból származó AHAS-ba, az egyszikű és kétszikű fajtákból származó AHAS-ok szekvenciáit egymás alá rendezzük a GAP és PILEUP programokat alkalmazva (Genetics Computer Group, 575 Sequence Drive, Madison, Wisconsin 53711). A számítógéppel kialakított egymás alá rendezésből meghatározzuk az ekvivalens pozíciókat. A mutációkat azután bejuttatjuk a kétszikű AHAS-génbe, ahogyan ezt fentebb leírtuk. A mutáns AHAS-fehérje E. coliban való kifejezése és biokémiai tulajdonságainak (azaz fajlagos aktivitásának és herbicidekre való rezisztenciájának) felbecslése után a mutáns gént bejuttatjuk valamely kétszikű növénybe a növénytranszformálási eljárások valamelyikével, ahogyan ezt a korábbiakban leírtuk.

8. példa Herbicidrezisztens növények előállítása ésszerűen tervezett AHAS-génekkel való transzformálással

DNS-konstrukciók

E. coli expressziós vektorokban található, ésszerűen tervezett AHAS-variáns géneket alkalmazunk DNS restrikciós fragmensek forrásaként, hogy helyettesítsük az ekvivalens restrikciós fragmenst egy Arabidopsis AHAS-génben. Ez a gén egy 5,5 kb-os genomikus fragmentumban van jelen, amely tartalmazza még az Arabidopsis AHAS promotert, az Arabidopsis AHAS terminációs szekvenciát és az 5’- és 3’-végi szegélyező DNS-eket. Miután a DNS-szekvenciaelemzést a mutációs helyek körül elvégeztük, hogy igazoljuk a kívánt mutáció jelenlétét, a teljes 5,5 kb-s fragmentumot mindegyik plazmidból beiktatjuk egy pBIN-alapú növényi transzformációs vektorba (Mogen, Leiden, Hollandia). A növényi transzformációs vektor tartalmazza a neomicin foszfotranszferáz II (nptll) kanamicin rezisztencia gént, amelyet a 35S karfiol-mozaikvírus promoter hajt meg. A végső vektor konstrukciót a 12. ábrában mutatjuk be. Az Arabidopsis AHAS-géneket, amelyek Met124lle, Met124His és Arg199Glu mutációkkal bírnak (ezek az 1. ábrában bemutatott AHAS szekvenciában Met53lle, Met53His és Arg128Glu mutációknak felelnek meg), pJK002-nek, pJK003-nak, illetve pJK004nek nevezzük el.

Ezen vektorok mindegyikét Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsbe transzformáljuk (R&D Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) az An és munkatársai által leírt transzformációs eljárással [Plánt Mól. Bioi. Manual A3, 1-19 (1988)].

Növénytranszformálás

A Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 levéllemez transzformálását úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt Horsch és munkatársai leírták [Science 227, 1229-1231 (1985)], de némi módosítással. A steril körülmények között növesztett növényekből levéllemezeket vágunk ki és együtt tenyésztjük fejjel lefelé Murashinge Skoog tápközegben (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) 2-3 napon át 25 °C hőmérsékleten sötétben a pJK002, pJK003 vagy pJK004 plazmidokat tartalmazó Agrobacterium tumefaciens törzsekkel. A lemezeket szárazra itatjuk és átvisszük a B5-vitaminokat tartalmazó regeneráló Murashige Skoog tápközegbe, amely tartalmaz 1 mg/l benzil-adenint, 0,1 mg/l 1-naftil-ecetsavat, 100 mg/l kanamicint és 500 mg/l cefotaximot (mind a Sigma termékei).

A transzformánsokat kezdetben a transzformációs vektorban jelen levő nptll-gén által kiváltott kanamicinrezisztencia segítségével választjuk ki. A levéllemezekből származó saijakat kimetsszük és friss Murashige Skoog hormonmentes tápközegre helyezzük, amely cefotaximot és kanamicint tartalmaz.

In vivő herbicidrezisztencia

Kanamicinrezisztens dohánysarjakat viszünk át olyan tápközegre, amely 0,25 pmol/liter imazetapirt tartalmaz. Az imidazolinon herbicid ezen koncentrációjánál a nem transzformált dohánysarjak (amelyek endogén vad típusú AHAS-t tartalmaznak) nem képesek elindítani a gyökér képződését. Ezzel ellentétben gyökérbeindulás és -növekedés figyelhető meg a mutáns AHAS-gének mindegyikével transzformált dohánysarjakból. A Met124lle és Arg199Glu mutáns génekkel transzformált sarjakból kifejlődött gyökereket mutat be a 13. ábra a vad típusú növénnyel együtt. Ezenkívül a Met124lle vagy Arg199Glu mutáns génekkel transzformált növények ellenállók a kétszeres permetezésre is az imazetapirral történt szántóföldi kezelésre (100 g/hektár) is. A gyökérnövekedés kialakulásai a transzformált növényekben a nem transzformáit növényekkel szemben herbicid jelenlétében, valamint a viselkedésük herbicides permetezés után azt sugallja, hogy az ésszerűen tervezett herbicidrezisztencia gének kifejezése herbicidrezisztenciát biztosit in vivő.

HU 226 259 Β1

Az ésszerűen tervezett gének kimutatása herbicidrezisztens dohányban.

Genomikus DNS-t izolálunk az AHAS-sal transzformáit dohánynövényekből, és az Arabidopsis AHAS-variáns gén jelenlétét PCR-elemzéssel igazoljuk. Az Arabidopsis AHAS-gén és a két dohány AHAS-gén közti különbségeket használjuk ki, hogy olyan PCR-primereket tervezzünk, amelyek csak az Arabidopsis gént terjesztik ki egy dohány genomikus DNS háttérben. Az ésszerűen tervezett herbicidrezisztencia géneket kimutatjuk, ahogyan ezt a megfelelő méretű DNS-fragmentum kiterjesztése bemutatja, a herbicidrezisztens növények legtöbbjében. PCR szignál nem mutatható ki a nem transzformált dohány növényekben.

Transzformált AHAS-gének szegregációja

Abból a célból, hogy megfigyeljük az ésszerűen tervezett AHAS-gének szegregációját transzformált növényekben, csírázási vizsgálatokat hajtunk végre. Magokat helyezünk hormonmentes Murashige-Skoog tápközegbe, amely 2,5 pmol/ml PURSUIT-ot és 100 pmol/liter kanamicint is tartalmaz. Az így létrejövő palántákat vizuálisan értékeljük a herbicidre való rezisztenciára vagy fogékonyságra.

Mivel a dohánynövények diploidok, az várható, hogy az önbeporzó növények utódai rezisztens:fogékony 3:1 arányban szegregálódnak, tükrözve 1 homozigóta palánta (a rezisztens AHAS-génre), 2 heterozigóta palánta (a rezisztens AHAS-génre) és 1 olyan palánta jelenlétét, amelyben nincs rezisztens AHAS-gén.

Az eredmények azt jelzik, hogy a rezisztens AHASgének a várt 3:1 arányban szegregálódnak, alátámasztva azt a következtetést, hogy a herbicidrezisztenciát az ésszerűen tervezett AHAS-génnek egy egyedi, domináns kópiája adja át.

Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a herbicidrezisztens AHAS-gének ésszerű tervezését lehet alkalmazni olyan növények előállításához, amelyek herbicidrezisztens növekedést mutatnak in vivő.

9. példa Különböző herbicidekre keresztrezisztens növények előállítása ésszerűen tervezett AHASgénekkel való transzformálással

Dohánynövényeket, amelyeket ésszerűen tervezett AHAS-génekkel transzformáltunk, amint ezt a 8. példában leírjuk, megvizsgáljuk keresztrezisztenciára is egy másik herbicidre, a CL 299.263-ra (amely imazamox néven is ismert). Csírázási vizsgálatokat hajtunk végre a Met124lle, Met124His és Arg199Glu Arabidopsis AHAS-variáns géneket tartalmazó primer transzformánsokból aratott magokon 2,5 pmol/l CL 299.263 jelenlétében vagy távollétében (15. ábra). A herbicidnek ez a koncentrációja a vad típusú dohánynövények súlyos elsatnyulását és kifakulását okozza. A Met124His AHAS-génnel transzformált dohánynövények mutatják a rezisztencia legmagasabb szintjét (15. ábra). Az Arg199Glu transzformánsok a rezisztencia közbenső szintjét mutatják, míg a Met124lle kicsiny rezisztenciát mutat (15. ábra).

Minden fentebb idézett szabadalmi leírást, bejelentést, cikket és egyéb publikációt és vizsgálati eljárást teljes terjedelmében a kitanítás részeként kell figyelembe venni.

A fenti részletes leírás fényében a jelen találmánynak több változata is felvetődhet azok számára, akik a szakterületen járatosak. Az ilyen nyilvánvaló változatok az itt következő igénypontok oltalmi körén belül vannak.

Claims

1. Szerkezeti információk alkalmazásán alapuló eljárás imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) variáns fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy cél AHAS-fehérjét piruvát-oxidáz templáttal egymás alá rendezünk, ily módon származtatva a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;

(b) a háromdimenziós szerkezetbe egy vagy több imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidet modellezünk, lokalizálva ily módon egy imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicideket megkötő zsebet a cél AHAS-fehérjében;

(c) kiválasztunk egy aminosavpozíció-célpontot egy olyan mutációhoz az említett cél AHAS-fehérjében, amely megváltoztatja legalább egy imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicid affinitását a kötőzsebhez;

(d) mutáljuk a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS-t, miáltal olyan mutált DNS-t állítunk elő, amely a mutációt a célpozícióban tartalmazó AHAS-variánst kódol; és (e) kifejezzük a mutált DNS-t egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között a mutációt a célpozícióban tartalmazó AHAS-variáns termelődik.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (f) kifejezünk továbbá egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS-t párhuzamosan egy második sejtben;

(g) a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjéket a sejtekből tisztítjuk;

(h) megvizsgáljuk a vad típusú és a variáns AHASfehérjéket katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy a piruvát és a 2-ketobutirát acetohidroxi-butiráttá történő kondenzálásában, az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid nélkül és annak jelenlétében; és (i) a (c)—(h) lépéseket addig ismételjük - a (c) lépésben AHAS-t kódoló DNS-ként az (e) lépésben szerinti variánst kódoló DNS-t használva - amíg olyan imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítunk, amely rendelkezik (i) az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében (a) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt élet21

HU 226 259 Β1 képességének fenntartására, amelyben kifejeződik; vagy (b) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő - imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHASvariáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik;

ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (ii) olyan katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a katalitikus aktivitás imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében több, mint 20%-a a vad típusú AHAS imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében mérhető katalitikus aktivitásának.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy herbicidként imidazolinon herbicidet alkalmazunk, és a herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérje katalitikus aktivitása (i) a herbicid távollétében nagyobb, mint a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának 20%-a;

(ii) ellenállóbb az imidazolinon herbicidek jelenlétére a vad típusú AHAS-hoz hasonlítva; és (iii) érzékenyebb szulfonilurea herbicidek jelenlétére, mint Imidazolinon herbicidek jelenlétére.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cél AHAS-fehérjeként Arabidopsis thalianából származó AHAS-fehérjét alkalmazunk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első sejtként E. coli-sejtet alkalmazunk.

7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első és második sejtként E. co//-sejteket alkalmazunk.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cél AHAS-fehérjeként egy, az 1. azonosító számú (SEQ ID NO: 1) szekvenciával bíró fehérjét vagy más növényi eredetű AHAS-fehérje szekvenciájával bíró AHAS-fehérjét alkalmazunk.

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutációként az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) F135, M53 és R128 aminosavainak legalább egyikét egy olyan eltérő aminosavra cseréljük, amely eltérő aminosav megegyezik egy másik növényi eredetű AHAS-fehérje szekvenciájában az egymás alá rendezéskor az előbbiek bármelyikének megfelelő pozícióba kerülő aminosawal, vagy az ilyen mutációk bármelyikeinek bármilyen kombinációját hajtjuk végre.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő helyettesítések bármelyikét hajtjuk végre: Met53Trp, Met53Glu, Met53lle, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, vagy ezek bármelyikeinek bármely kombinációját.

11. Szerkezeti információk alkalmazásán alapuló eljárás imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy cél AHAS-fehérjét egymás alá rendezünk egy, az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) szerinti szekvenciával vagy egy másik növényi eredetű AHAS-fehérje aminosavszekvenciájából származó első AHAS templáttal, ily módon származtatva a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;

(b) egy vagy több imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicidet modellezünk a háromdimenziós szerkezetbe, miáltal imidazolinonvagy szulfonilureaalapú herbicidet kötő zsebet lokalizálunk a cél AHAS-fehérjében;

(c) kiválasztunk egy aminosavpozíció-célpontot egy olyan mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, amely megváltoztatja legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid affinitását a kötőzsebhez;

(d) mutáljuk a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS-t, és így olyan mutált DNS-t állítunk elő, amely a mutációt az említett helynél tartalmazó AHAS-variánst kódolja; és (e) kifejezzük a mutált DNS-t egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között a mutációt az említett helynél tartalmazó említett AHAS-variáns termelődik.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (f) kifejezünk továbbá egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS-t párhuzamosan egy második sejtben;

(g) tisztítjuk a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjéket a sejtekből;

(h) megvizsgáljuk a vad típusú és a variáns AHASfehérjéket katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy a piruvát és a 2-ketobutirát acetohidroxi-butiráttá történő kondenzálásában, az említett legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (I) addig ismételjük a (c)-(h) lépéseket - a (c) lépésben AHAS-t kódoló DNS-ként az (e) lépés szerinti variánst kódoló DNS-t használva - amíg az első olyan herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében (a) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik; vagy (b) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő - imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első

HU 226 259 Β1

AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik;

ahol az említett sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (ii) olyan katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.

13. Szerkezeti információk alkalmazásán alapú eljárás imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy cél AHAS-fehérjét egymás alá rendezünk egy azonosított herbicidkötő zsebbel bíró és az 1. azonosító számú (SEQ ID NO: 1) szerinti szekvenciával bíró első AHAS templáttal, ily módon származtatva a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;

(b) kiválasztunk egy aminosavpozícló-célpontot egy olyan mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, amely megváltoztatja legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid affinitását a kötőzsebhez;

(c) mutáljuk a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS-t, miáltal mutált DNS-t állítunk elő, amely a mutációt az említett helyen tartalmazó AHAS-variánst kódolja; és (d) kifejezzük a mutált DNS-t egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között a mutációt az említett helynél tartalmazó említett AHAS-variáns termelődik.

14. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (e) kifejezünk továbbá egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS-t párhuzamosan egy második sejtben;

(f) tisztítjuk a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjéket a sejtekből;

(g) megvizsgáljuk a vad típusú és a variáns AHASfehérjéket katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy a piruvát és a 2-ketobutirát acetohidroxi-butiráttá történő kondenzálásában, az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (h) addig ismételjük a (b)-(g) lépéseket - a (b) lépésben AHAS-t kódoló DNS-ként a (d) lépés szerinti variánst kódoló DNS-t használva - amíg az első olyan herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében (a) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik; vagy (b) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő - imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik;

ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (ii) katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.

15. A 12. vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjét azonosítunk, melynek katalitikus aktivitása az említett legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében több, mint 20%-a a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy herbicidként imidazolinonalapú herbicidet alkalmazunk és az első herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjeként alkalmazott fehérje katalitikus aktivitása (i) a herbicid távollétében, mint a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának 20%-a;

(ii) viszonylag ellenállóbb az imidazolinonalapú herbicidek jelenlétére a vad típusú AHAS-hoz hasonlítva; és (iii) viszonylag érzékenyebb szulfonilureaalapú herbicidek jelenlétére az imidazolinonalapú herbicidekhez hasonlítva.

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cél AHAS-fehérjeként Arabidopsis thalianából származó fehérjét alkalmazunk.

18. A 11. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első sejtként E. co//-sejtet alkalmazunk.

19. A 12. vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első és második sejtként E. coli sejteket alkalmazunk.

20. A 11. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutációként az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) F135, M53 és R128 aminosavainak legalább egyikét egy olyan eltérő aminosavra cseréljük, amely eltérő aminosav megegyezik egy másik növényi eredetű AHAS-fehérje szekvenciájában az egymás alá rendezéskor az előbbiek bármelyikének megfelelő pozícióba kerülő aminosawal, vagy az ilyen mutációk bármelyikeinek bármilyen kombinációját hajtjuk végre.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő helyettesítések bármelyikét hajtjuk végre: Met53Trp, Met53Glu, Met53lle, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, vagy ezek bármelyikének kombinációját.

22. Izolált DNS, amely olyan acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) variáns fehérjét kódol, amelyben az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) M53, R128 és F135 aminosavainak legalább egyike más aminosawal van helyettesítve, vagy az ilyen szubsztitúciók bármely kombinációját tartalmazza.

HU 226 259 Β1

23. A 22. igénypont szerinti DNS, amely olyan AHAS-fehérjét kódol, melyben a végrehajtott módosítás megváltoztatta valamely imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidnek azt a képességét, hogy gátolja a fehérje enzimaktivitását.

24. A 23. igénypont szerinti DNS, amely AHAS-fehérjeként Arabidopsis thalianából származó fehérjét kódol.

25. A 24. igénypont szerinti DNS, amely olyan AHAS-fehérjét kódol, melyben a végrehajtott helyettesítés a következők bármelyike: Met53Trp, Met53Glu, Met53lle, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg vagy ezek bármelyikének kombinációja.

26. A 37. igénypont szerinti DNS, amely olyan AHAS-fehérjét kódol, amely rendelkezik:

(a) a legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú AHAS-gátló herbicid távollétében (i) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik; vagy (ii) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik;

ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (b) olyan katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.

27. A 22. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az AHAS-variáns a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának több mint 20%-ával rendelkezik.

28. A 39. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az AHAS-variáns rezisztensebb imidazolinonalapú herbicidekkel szemben, mint szulfonilureaalapú herblcidekkel szemben.

29. DNS-vektor, amely 22. igénypont szerinti DNSszekvenciát tartalmaz működőképesen összekapcsolva egy transzkripciós szabályozóelemmel.

30. Sejt, amely egy AHAS-t kódoló, 29. igénypont szerinti DNS-vektorból származó DNS-szekvenciát tartalmaz, amely sejt baktérium-, gomba-, növényi, rovarvagy emlőssejt.

31. A 30. igénypont szerinti sejt, amely növényi sejt.

32. Mag, amely 31. igénypont szerinti sejtet tartalmaz.

33. Variáns AHAS-fehérje, amelyet 22. igénypont szerinti DNS által kódol.

34. Variáns AHAS-fehérje, amelyben az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) M53, R128 és F135 aminosavainak legalább egyike egy eltérő aminosawal van helyettesítve, amely eltérő aminosav megegyezik egy másik növényi eredetű AHAS-fehérje szekvenciájában az egymás alá rendezéskor az előbbiek bármelyikének megfelelő pozícióba kerülő aminosawal, vagy az ilyen szubsztitúciók bármely kombinációját tartalmazza.

35. A 46. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amelyben a végrehajtott módosítás megváltoztatta egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicidnek azt a képességét, hogy gátolja a fehérje enzimaktivitását.

36. A 35. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amely Arabidopsis thalianából származik.

37. A 33. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amelyben a végrehajtott helyettesítés: Met53Trp, Met53Glu, Met53lle, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg vagy ezek bármelyikének kombinációja.

38. A 33. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amely rendelkezik:

(a) a legalább egy AHAS-gátló imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében (i) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben ez kifejeződik; vagy (ii) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik; ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (b) olyan katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.

39. A 33. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amely a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának több mint 20%-ával rendelkezik.

40. Eljárás herbicidrezisztencia kialakítására egy sejtben, azzal jellemezve, hogy (a) 22. igénypont szerinti DNS-t kompatibilis expressziós vektorba klónozunk; és (b) a DNS-t a sejtbe transzformáljuk a gén megfelelő mértékű expressziójára alkalmas körülmények között, és így a sejtben imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicidekkel szemben rezisztenciát alakítunk ki.

41. Sejt, amely a 40. igénypont szerinti eljárással lett előállítva.

42. Növény, amely 41. igénypont szerinti sejtet tartalmaz.

43. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t alkalmazunk, amelyben a mutált gén eltérő aminosavat kódol az 53., 128. vagy 135. pozíciók legalább egyikében vagy ezek kombinációjában.

44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t alkalmazunk, amely Arabidopsis thaliana AHAS-gént tartalmaz.

45. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtet transzformálunk.

HU 226 259 Β1

46. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy magban található sejtet transzformálunk.

47. Eljárás gyomok visszaszorítására termőföldön, azzal jellemezve, hogy a termőföldet - melyen 42. igénypont szerinti imidazolinon- és/vagy szulfonil- 5 ureaalapú herbicidekre rezisztens növényeket termesztünk - az imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbiciddel kezeljük.

48. Eljárás gyomok visszaszorítására termőföldön, azzal jellemezve, hogy a termőföldet - melyen 42. 10 igénypont szerinti imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens növényeket termesztünk

- az imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidet tartalmazó gyomirtó készítménnyel kezeljük.

49. Sejt, amely 22. igénypont szerinti DNS-sel van transzformálva, és amelyben a DNS a sejtben olyan mértékben expresszálódik, hogy imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekkel szemben rezisztenciát biztosít a sejtnek.

50. Növény, amely 23. igénypont szerinti DNS-sel van transzformálva, és amelyben a DNS olyan mértékben expresszálódik, hogy imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekkel szemben rezisztenciát biztosít a növénynek.