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ES2425738T3 - Proteínas de fusión de la albúmina - Google Patents

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ES2425738T3
ES2425738T3 ES02799966T ES02799966T ES2425738T3 ES 2425738 T3 ES2425738 T3 ES 2425738T3 ES 02799966 T ES02799966 T ES 02799966T ES 02799966 T ES02799966 T ES 02799966T ES 2425738 T3 ES2425738 T3 ES 2425738T3
Authority
ES
Spain
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fusion protein
albumin fusion
albumin
protein
glp
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES02799966T
Other languages
English (en)
Inventor
Craig A. Rosen
William A. Haseltine
Steven M. Ruben
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Albumedix Ltd
Human Genome Sciences Inc
Original Assignee
Novozymes Biopharma UK Ltd
Human Genome Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27586544&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2425738(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
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Anticipated expiration legal-status Critical
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Abstract

Una proteína de fusión de la albúmina que comprende dos o más polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem, enla que (i) dichos polipéptidos GLP-1 se seleccionan de (a) GLP-1 de tipo silvestre; (b) GLP-1 (9-36); (c) GLP-1 (7-36); (d) GLP-1 (7-36(A8G)); (e) GLP-1 (7-36(A8S)); y (f) otros fragmentos de GLP-1 y/o variantes de GLP-1 que tienen actividad de GLP-1, fusionados aalbúmina, que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1038, un fragmento dealbúmina, o variante de albúmina de la misma, (ii) dicho fragmento de albúmina o variante de albúmina aumenta la semivida plasmática en suero de lospolipéptidos GLP-1 y (iii) dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.

Description

Proteínas de fusión de la albúmina
Antecedentes de la invención
La invención se refiere, en general, a una proteína de fusión de la albúmina que comprende dos o más polipéptidos 5 de GLP-1 orientados en tándem, en la que
(i) dichos polipéptidos GLP-1 se seleccionan de
(a)
un GLP-1 silvestre
(b)
GLP-1 (9-36);
(c)
GLP-1 (7-36);
10 (d) GLP-1 (7-36(A8G));
(e)
GLP-1 (7-36(A8S)); y
(f)
otros fragmentos de GLP-1 y/o GLP-1, variantes que tienen actividad de GLP-1;
condensados con albúmina, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1038, un fragmento de albúmina, o variante de albúmina de la misma.
15 (ii) dicho fragmento de albúmina o variante de albúmina aumenta la semivida plasmática en suero de los polipéptidos GLP-1 y
(iii) dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.
La invención abarca polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina terapéuticas y proteínas de fusión de albúmina terapéuticas.
20 La seroalbúmina humana (HSA o HA), una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura (como se muestra en la Figura 1 ((SEC ID Nº 1038)), es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica de suero y también funciona como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. En la actualidad, la HA para uso clínico se produce mediante extracción de sangre humana. La producción de HA recombinante (rHA) en microorganismos se ha divulgado en los documentos EP 330 451 y EP 361 991.
25 Las proteínas terapéuticas en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante, tales como interferones y hormonas de crecimiento, normalmente son moléculas lábiles que exhiben semividas cortas, en particular cuando se formulan en soluciones acuosas. La inestabilidad en estas moléculas cuando se formulan para administración dicta que muchas de las moléculas se deben liofilizar y refrigerar en todo momento durante el almacenamiento, de modo que hace que las moléculas sean difíciles de transportar y/o almacenar. Los problemas
30 de almacenamiento son particularmente agudos cuando las formulaciones farmacéuticas se deben almacenar y dispensar fuera del entorno hospitalario.
El documento WO 00/69911 divulga el péptido similar a la hormoma peptídica insulinotrópica glucagón (GLP-1) que se ha unido covalentemente a la albúmina, con el fin de incrementar la semivida del GLP-1. El documento WO 01/79258 divulga múltiples copias de un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende albúmina
35 y una proteína terapéutica con el fin de estabilizar y prolongar la semivida de la proteína terapéutica. Estos polinucleótidos se han integrado en el genoma.
Se han propuesto pocas soluciones prácticas a los problemas de almacenamiento de las moléculas proteicas lábiles. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de formulaciones de larga duración estabilizadas de moléculas terapéuticas proteináceas que se dispensan fácilmente, preferentemente con una sencilla formulación que requiere
40 una mínima manipulación posterior a la conservación.
Sumario de la invención
1. Una proteína de fusión de la albúmina que comprende dos o más polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem, en la que
(i) dichos polipéptidos GLP-1 se seleccionan de
2 5
(a)
GLP-1 silvestre;
(b)
Gap-1 (9-36);
(c)
GLP-1 (7-36);
(d)
GLP-1 (7-36(A8G));
(e)
OLP-1 (7-36(A8S)); y
(f)
otros fragmentos de GLP-1 y/o variantes de GLP-1, que tienen actividad de GLP-1;
condensados con albúmina, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1038, un fragmento de albúmina, o variante de albúmina de la misma,
(ii) dicho fragmento de albúmina o variante de albúmina aumenta la semivida plasmática en suero de los polipéptidos GLP-1 y
(iii) dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.
2.
Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la albúmina de la invención.
3.
Un vector que comprende el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la albúmina de la invención.
4.
Un procedimiento para producir una proteína de fusión de albúmina, que comprende
(a)
transformar una célula huésped que comprende al menos un vector que comprende el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la albúmina de la invención;
(b)
cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de la albúmina; y
(c)
aislar la proteína de fusión de la albúmina.
5.
Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la albúmina de la invención.
6.
La proteína albúmina de la invención para usar como medicamento.
7.
La proteína de fusión de la albúmina de la invención para usar en el tratamiento de la hiperglucemia, la diabetes, la diabetes insípida, la diabetes mellitus; la diabetes de tipo 1, la diabetes de tipo 2; la resistencia a la insulina; la deficiencia de insulina, la hiperlipidemia, la hipercetonemia, la diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI), la diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI), la obesidad, la retinopatía, las úlceras, la supresión del peso corporal, la supresión del apetito, el síndrome X, trastornos metabólicos, inmunitarios y vasculares asociadas a la diabetes y trastornos cardiovasculares.
8.
El uso de la proteína de fusión de la albúmina de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hiperglucemia, la diabetes, la diabetes insípida, la diabetes mellitus; la diabetes de tipo 1, la diabetes de tipo 2; la resistencia a la insulina; la deficiencia de insulina, la hiperlipidemia, la hipercetonemia, la diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI), la diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI), la obesidad, la retinopatía, las úlceras, la supresión del peso corporal, la supresión del apetito, el síndrome X, trastornos metabólicos, inmunitarios y vasculares asociadas a la diabetes y trastornos cardiovasculares.
En un aspecto preferido de la invención, las proteínas de fusión de la albúmina incluyen, entre otras, aquellas construcciones de GLP-1 codificadas por los polinucleótidos descritos en la Tabla 2.
La divulgación también abarca formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de la albúmina de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas formulaciones pueden estar en un kit
o contenedor. Dicho kit o contenedor puede estar envasado con instrucciones pertenecientes a la semivida prolongada de la proteína terapéutica. Dichas formulaciones se pueden usar en el tratamiento, prevención, mejora o diagnóstico de una enfermedad o síntomas de enfermedades en un paciente, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, que comprende la etapa de administrar la formulación farmacéutica al paciente.
En otras realizaciones, la presente divulgación abarca procedimientos de prevención, creación o alivio de una enfermedad o trastorno. La presente invención abarca un procedimiento de tratar una enfermedad o trastorno indicado en la columna “Indicación preferida: Y” de la Tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora una proteína de fusión de la albúmina de la invención que comprende GLP-1 o una porción correspondiente a un fragmento de GLP-1 o variante del mismo divulgado en a columna de
“Proteína terapéutica: X" (en el GLP-1 del presente caso) de la Tabla 1 (en la misma fila que la enfermedad o trastorno que se va a tratar se indica en la columna "Indicación preferida: Y" de la Tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.
En una realización, una proteína de fusión de la albúmina de acuerdo con la invención tiene una semivida 5 prolongada.
En una segunda realización, una proteína de fusión de la albúmina de acuerdo con la invención es más estable que la correspondiente molécula de GLP-1 sin condensar descrita en la Tabla 1.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A-D muestra la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la albúmina humana (SEC ID Nº 1038) 10 y un polinucleótido que la codifica (SEC ID Nº 1037).
La Figura 2 muestra el mapa de restricción del vector de clonación pPPC0005 depositado en la ATCC como PTA3278.
La Figura 3 muestra el mapa de restricción del vector de expresión en levaduras S. cerevisiae pSAC35 (Sleep y col., BioTechnology 8:42 (1990)).
15 La Figura 4 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina con EPO codificadas por el ADN comprendido en las construcciones ID Nº (en lo sucesivo en el presente documento CID) 1966 y 1981 y EPO humana recombinante sobre la proliferación de células RF-1 (véanse los Ejemplos 8 y 9). Las células se lavaron 3X para eliminar el GM-CSF y se sembraron a 10.000 células/pocillo durante 72 horas en presencia de diluciones por 3 de la proteína CID 1966 o la proteína CID 1981. Las concentraciones usadas se calcularon basándose en el peso de
20 la Epo solo, no de la HSA más la Epo. La EPO humana recombinante (rhEpo) se usó como control positivo y se diluyó en serie 3 veces a partir de 100 ng/ml a 0,01 ng/ml. Las células se expusieron a 0,5 mCi/pocillo de timidina-3H durante 18 horas adicionales. (0) rhEpo; (T) HSA-Epo 1981; (e) Epo-HSA 1966.
La Figura 5 es un análisis de la respuesta a la dosis y muestra el efecto de varias dosis de EPO humana recombinante y de las proteínas de fusión de albúmina y EPO codificadas por el ADN comprendido en las CID 1966 25 y 1981 en el cambio porcentual en el hematocrito desde el día 0 al día 7 (véanse los Ejemplos 8 y 9). Ratones DBA/2NHsd hembra de 48 semanas de edad se dividieron en 12 grupos de 4 animales cada uno. La Epo recombinante humana (rhEpo) se administró por vía subcutánea a 0,5, 1,5, 4,5 y 12 μg/kg los días 0, 2, 4 y 6. Las proteínas de fusión de albúmina y Epo fabricadas a partir de las construcciones CID 1966 y CID 1981 se administraron por vía subcutánea a 2, 6, 18 y 54 μg/kg los días 0, 2, 4 y 6. Las dosis más altas de las proteínas de
30 fusión de albúmina y Epo permiten una comparación equimolar aproximada con la Epo humana recombinante (obsérvese que el peso de las fusiones es aproximadamente 4,35 veces el peso de la Epo no glicosilada). Los días o y 7 del experimento, se extrajo sangre de los animales de la vena de la cola y el hematocrito se determinó mediante centrifugación. (_) rhEpo; (o) CID 1981; (.) CID 1966.
La Figura 6A muestra el efecto de varias administraciones subcutáneas de las proteínas de fusión de albúmina y
35 EPO codificadas por el ADN comprendido en las CID 1966 y 1997, respectivamente, sobre el cambio porcentual en el hematocrito desde el día 0 al día 8 (véanse los Ejemplos 8 y 10). *, p<0,005 en comparación con rhEpo determinado mediante análisis no paramétricos de Mann-Whitney (n=6).
La Figura 6B muestra el efecto de administraciones subcutáneas de las proteínas de fusión de albúmina y EPO codificadas por el ADN comprendido en las CID 1997 y 1966 sobre el cambio porcentual en el hematocrito desde el
40 día 0 al día 14 (véanse los Ejemplos 8 y 10). *, p<0,005 en comparación con rhEpo determinado mediante análisis no paramétricos de Mann-Whitney (n=6); **, p<0,05 en comparación con rhEpo determinado mediante análisis no paramétrico de Mann-Whitney (n=6).
La Figura 7 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina y EPO codificadas por el ADN comprendido en las CID 1981 y 1997, respectivamente, sobre la proliferación de las células TF-1 (véanse los 45 Ejemplos 9 y 10). Las células se lavaron 3X para eliminar el GM-CSF y se sembraron a 10.000 células/pocillo durante 72 horas en presencia de diluciones por 3 de las proteínas de fusión de albúmina y Epo codificadas por las CU 1981 o 1997. Se usaron cantidades equimolares de rhEpo como control positivo (4,35 veces menos proteína añadida dado que el peso de la Epo no glicosilada es 20 kd, mientras que el de las proteínas de fusión de albúmina y Epo es de 87 kd). Las células se expusieron a 0,5 μCi/pocillo de timidina-3H durante 24 horas adicionales. (_)
50 rhEpo estándar; (A) CID 1981 (CHO); (o) CID 1997 (NSO).
La Figura 8 muestra el efecto de varias dosis de EPO recombinante humana (rhEpo) y la proteína de fusión de albúmina y EPO codificada por el ADN comprendido en la construcción 1997 (CID 1997) sobre el cambio porcentual en el hematocrito desde el día 0 al día 8 (véase el Ejemplo 10). (.) = rhEpo, (0) = CID 1997.
La Figura 9 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina con IL2 codificadas por el
ADN comprendido en la CID 1812 (véase el Ejemplo 15) sobre la proliferación de CTLL-2. Se sembraron 1x104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en un volumen final de 200 ul de medio completo que contiene la cantidad indicada de la proteína de fusión de albúmina e IL2 (CD 1812). Todas las muestras se realizaron por triplicado. Las células se incubaron durante 40 horas a 37 ºC, después se añadieron 20 ul de azul Alamar y las células se 5 incubaron durante 8 horas. Se usó una absorbancia a 530/590 como medida de proliferación. CE50 = 0,386 ± 0,021.
(L) = CID 1812.
La Figura 10 muestra el efecto de la proteína de fusión de albúmina con IL2 codificada por el ADN comprendido en la CID 1812 sobre el crecimiento tumoral RENCA el día 21 (véase el Ejemplo 15). En ratones BALB/c (n=10) se inyectaron por vía s.c. (en la parte central del flanco) 105 células RENCA. 10 días después, los ratones recibieron 2 10 ciclos (del día 10 al día 14 y los días 17-21) de inyecciones diarias (CD) de rIL2 (0,9 mg/kg), proteína de fusión de albúmina e IL2 (proteína CID 1812; 0,6 mg/kg), o PBS (placebo) o inyecciones en días alternos (EDA) de la proteína CID 1812 (0,6 mg/kg). El volumen tumoral se determinó el día 21 tras la inoculación de RENCA. Los datos se presentan en análisis de dispersión (Cada punto representa un único animal). El valor medio de cara grupo se representa por una línea horizontal. *, p=0,0035 entre el placebo control y la proteína CID 1812. El número entre
15 paréntesis indica el número de ratones vivos sobre el número total de ratones por grupo. (o) = Placebo; (e) = IL2; (L) = proteína CID 1812 (QD); (0) = proteína CID 1812 (EDA).
La Figura 11 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina y GCSF codificadas por el ADN comprendido en las CID 1642 y 1643, sobre la proliferación de las células NFS-60 (véanse los Ejemplos 19 y 20). (_) = CID 1642; (A) = CID 1643; (0) = HSA.
20 La Figura 12 muestra el efecto del GCSF humano recombinante (Neupogen) y la proteína de fusión de albúmina y GCSF sobre el recuento total de glóbulos blancos (véase el Ejemplo 19). El recuento total de glóbulos blancos (103 células/ul) cada día se presenta como la media ± SEM. La proteína de fusión de albúmina y GCSF se administró s.c. a 25 o 100 ug/kg cada 4 días x 4 (C4D) o a 100 ug/kg cada 7 días x 2 (C7D). Los datos de los días 8 y 9 para la proteína de fusión de albúmina y GCSF a 100 ug/kg C7 se presentan como los días 9 y 10, respectivamente, para
25 facilitar la comparación con otros grupos. Los controles fueron vehículo de solución salina administrado s.c. cada 4 días x 4 (vehículo C4D) o Neupogen administrado s.c. diariamente x 14 (Neupogen 5 ug/kg CD). El periodo de tratamiento se considera los días 1-14 y el periodo de recuperación los días 15-28.
La Figura 13 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina e IFNb codificadas por el ADN comprendido en las CID 2011 y 2053, sobre la actividad SEAP en las células indicadoras ISRE-SEAP/293F
30 (véase el Ejemplo 25). Las proteínas se diluyeron en serie de 5e-7 a le-14 g/ml en DMEM/10 % de FBS y se usan para tratar las células indicadoras ISRE-SEAP/293F. Tras 24 horas se extrajeron los sobrenadantes de las células indicadoras y se analizó su actividad SEAP. La proteína de fusión de albúmina e IFNb se purificó a partir de tres clones estables. 293F/#2011, CHO/#2011 y NSO/#2053. IFNb derivado de mamífero, Avonex, procedían de Biogen y se comunicó que tenían una actividad específica de 2,0e5 UI/ug.
35 La Figura 14 ilustra los niveles en equilibrio del ARNm de insulina en células INS-1 (832/13) después del tratamiento con GLP-1 o la proteína de fusión de albúmina y GLP-1 codificada por la construcción 3070 (proteína CID 3070). Tanto el GLP-1 como la proteína CID 3070 estimulan la transcripción del gen de la insulina en células INS-1. La primera barra (negra) representa las células sin tratar. Las barras 2-4 (blancas) representan las células tratadas con las concentraciones indicadas de GLP-1. Las barras 5-7 (grises) representan las células tratadas con las
40 concentraciones indicadas de la proteína CID 3070.
La Figura 15 compara la actividad antiproliferativa de la proteína de fusión de albúmina e IFN codificada por CID 3165 (proteína Cm 3165) y el IFNa recombinante (rIFNa) sobre las células de melanoma Hs294T. Las células se cultivaron con concentraciones variables de proteína CID 3165 o rIFNa y la proliferación se midió mediante incorporación de BrdU tras 3 días de cultivo. La proteína CID 3165 produjo una inhibición mensurable de la
45 proliferación celular a concentraciones por encima de 10 ng/ml, alcanzando una inhibición del 50 % a aproximadamente 200 ng/ml. (_) = proteína CID 3165, (0) = rIFNa.
La Figura 16 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina e IFNa sobre la actividad SEA en las células indicadoras ISRE-SEAP/293F. Se analizó una preparación de IFNa condensado cadena arriba de la albúmina (0), así como dos preparaciones diferentes de IFNa condensado cadena abajo de la albúmina (.) y
50 (_).
La Figura 17 muestra el efecto del tiempo y la dosis de la proteína de fusión de albúmina e IFNa codificada por el ADN comprendido en la construcción 2249 (proteína CID 2249) sobre el nivel del ARNm de OAS (p41) en monos tratados (véase el Ejemplo 31). Por punto de tiempo: Primera barra= vehículo control, 2ª barra= 30 ug/kg de proteína CID 2249 el día 1 i.v., tercera barra = 30 ug/kg de proteína CID 2249 el día 1 s.c., 4ª barra = 300 ug/kg de proteína
55 CID 2249 el día 1 s.c., 5ª barra = 40 ug/kg de IFNa recombinante los días 1, 3 y 5 s.c.
La Figura 18 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina codificadas por el ADN comprendido en las construcciones 2250 y 2276, sobre la captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 (véanse los
5 5
Ejemplos 33 y 35). .
La Figura 19 muestra el efecto de varias proteínas de fusión de albúmina y GCSF, incluidas las codificadas por las CID #1643 y #2702 (L-171, véase el Ejemplo 114) sobre la proliferación de células NFS. La línea discontinua horizontal indica el nivel mínimo de detección.
Descripción detallada
Definiciones
Las definiciones siguientes se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados en esta memoria.
Como se usa en el presente documento, “polinucleótido” hace referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones, dicha proteína de fusión comprende o, como alternativa consiste en, al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) unida en el marco a al menos dos proteínas terapéuticas X orientadas en tándem (o fragmento o variante de las mismas ) (de modo que “proteína terapéutica X” significa en el presente documento GLP-1), una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende, o, como alternativa que consiste en, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº Y (es decir, las construcciones de GLP-1, como se describe en la columna 6 de la Tabla 2) o un fragmento o variante de la misma; una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende, o, como alternativa que consiste en, una de las secuencias mostradas en la SEC ID Nº X que codifica una proteína de fusión de la invención; una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende, o, como alternativa que consiste en, una de dichas secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº Z que codifican una proteína de fusión de la invención; una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención generada como se describe en la Tabla 2 o en los ejemplos; una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos contenida en una construcción de fusión de albúmina de la invención descrita en la Tabla 2, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos contenida en una construcción de fusión de albúmina de la invención depositada en la ATCC (como se describe en la Tabla 3).
Como se usa en el presente documento, “construcción de fusión de albúmina" hace referencia a una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente, que opcionalmente comprende además, por ejemplo, uno o más de los elementos siguientes: (1) un vector de autorreplicación funcional (incluido, entre otros, un vector lanzadera, un vector de expresión, un vector de integración y/o un sistema de replicación), (2) una región para el inicio de la transcripción (p. ej., una región promotora, tal como, por ejemplo, un promotor regulable o inducible, un promotor constitutivo), (3) una región para la terminación de la transcripción, (4) una secuencia líder y (5) un marcador seleccionable. El polinucleótido que codifica la proteína terapéutica y la proteína albúmina, una vez parte de la construcción de fusión de albúmina, puede, cada uno, denominarse “porción”, “región” o “resto” de la construcción de fusión de albúmina.
La presente invención se refiere, en general, a polinucleótidos como se ha definido anteriormente; y las proteínas de fusión de albúmina codificadas por dichos polinucleótidos y como se define en las reivindicaciones. Como se usa en el presente documento, “proteína de fusión de alúmina” se refiere a una proteína formada mediante la fusión de al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) con al menos dos moléculas orientadas en tándem de una proteína terapéutica (o fragmento o variante de la misma) (de modo que la “proteína terapéutica” significa en el presente documento "GLP-1"). Una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende las al menos dos moléculas orientadas en tándem de la proteína terapéutica (o fragmento o variante de la misma) y al menos un fragmento o variante de la albúmina sérica humana, que se asocian entre sí mediante fusión genética (es decir, la proteína de fusión de albúmina se genera mediante traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica toda o una porción de una proteína terapéutica está unido en el marco con un polinucleótido que codifica toda o una parte de la albúmina). La proteína terapéutica y la proteína albúmina, una vez que forman parte de la construcción de fusión de albúmina, pueden, cada una, denominarse “porción”, “región” o “resto” de la proteína de fusión de albúmina (p. ej., una “porción de la proteína terapéutica” o una “porción de la proteína albúmina”). En una realización altamente preferida, una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende las al menos dos moléculas orientadas en tándem de la proteína terapéutica X o fragmento o variante de la misma (incluida, entre otras, una forma madura de la proteína terapéutica X) y al menos una molécula de albúmina o fragmento o variante de la misma (incluida, entre otras, una forma madura de la albúmina).
En una realización preferida adicional, una proteína de fusión de albúmina de la invención es procesada por una célula huésped y secretada al medio de cultivo que la rodea. El procesamiento de la proteína de fusión de albúmina naciente que se produce en las vías secretoras del huésped usadas para la expresión pueden incluir, entre otros, escisión del péptido señal, formación de enlaces disulfuro, plegamiento adecuado, adición y procesamiento de hidratos de carbono (tales como, por ejemplo, glucosilación unida a N y O), escisiones proteolíticas específicas y ensamblaje en proteínas multiméricas. Una proteína de fusión de albúmina de la invención está, preferentemente, en
forma procesada. En una realización más preferida, la "forma procesada de una proteína de fusión de albúmina" hace referencia a un producto de la proteína de fusión de albúmina que ha sufrido escisión del péptido señal en Nterminal, en el presente documento también se denomina "proteína de fusión de albúmina madura".
En varios casos, un clon representativo que contiene una construcción de fusión de albúmina de la invención se
5 depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (en el presente documento denominada "ATCC®"). Además, es posible recuperar una construcción de fusión de albúmina dada del depósito mediante técnicas conocidas en la materia y se describen en otros lugares del presente documento. La ATCC® se encuentra en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. Los depósitos en la ATCC® se han hecho bajo los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de
10 procedimiento de patente.
En una realización, la proteína de fusión de albúmina de la invención comprende dos o más fragmentos orientados en tándem biológicamente activos y/o terapéuticamente activos de la proteína terapéutica como se ha definido anteriormente y una proteína de albúmina en suero. En otras realizaciones, la proteína de fusión de albúmina de la invención comprende o, como alternativa, consiste en, dos o más moléculas orientadas en tándem de una variante
15 biológicamente activa de la proteína terapéutica y una proteína de albúmina en suero. En realizaciones preferidas, el componente de proteína albúmina en suero de la proteína de fusión de albúmina es la porción madura de la seroalbúmina. La invención abarca además polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión de albúmina.
En una realización preferida adicional, la porción de la proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina de la invención es el dominio soluble extracelular de la proteína terapéutica. En una realización alternativa, la porción de
20 la proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es la forma activa de de la proteína terapéutica. La invención abarca además polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión de albúmina.
Proteínas terapéuticas
Como se ha indicado anteriormente, un polinucleótido de la invención codifica una proteína que comprende, o, como alternativa, que consiste en, al menos dos fragmentos o variantes orientadas en tándem de la proteína terapéutica
25 como se ha definido anteriormente y al menos un fragmento o variante de la seroalbúmina humana, que se asocian entre sí, preferentemente mediante fusión genética.
Una realización adicional incluye un polinucleótido que codifica una proteína que comprende, o, como alternativa, que consiste en, al menos dos fragmentos o variantes orientadas en tándem de la proteína terapéutica como se ha definido anteriormente y al menos un fragmento o variante de la seroalbúmina humana, que están unidos entre sí
30 mediante conjugación química.
Como se usa en el presente documento, “proteína terapéutica” hace referencia a polipéptidos de GLP-1 seleccionados de GLP-1 silvestre, fragmentos de GLP-1, y variantes de GLP-1 que tienen actividad de GLP-1 cuando están presentes en la proteína de fusión de albúmina de la invención.
Con un polipéptido que muestra una “actividad terapéutica” o una proteína que es “terapéuticamente activa” se
35 quiere decir un polipéptido que posee una o más actividades biológicas y/o terapéuticas asociadas con la proteína terapéutica descrita en el presente documento o, por otro lado, conocida en la técnica. Como ejemplo no limitante, una “proteína terapéutica” es una proteína que es útil para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, afección o trastorno. Como ejemplo no limitante, una “proteína terapéutica” puede ser una que se une específicamente a un tipo de célula concreta (normal (p. ej., linfocitos) o anormal (p. ej., células de cáncer)) y, por tanto, se puede usar
40 para dirigir un compuesto (fármaco o agente citotóxico) a dicho tipo de célula específicamente.
Las porciones de “proteína terapéutica” comprendidas por la proteína de fusión de albúmina de la invención son GLP-1 o fragmentos de GLP-1 o variantes de GLP-1.
En otro ejemplo no limitante, la “proteína terapéutica” es una proteína GLP-1 que tiene una actividad biológica y, en concreto, una actividad biológica que es útil para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad. Una lista no incluyente
45 de actividades biológicas que puede poseer la proteína terapéutica incluye:
Una o más de las actividades biológicas descritas en las “Actividades biológicas” más adelante y/o como se divulga para la proteína terapéutica dada en la Tabla 1 (columna 2).
Como se usa en el presente documento, “actividad terapéutica" o "actividad" puede hacer referencia a una actividad cuyo efecto es consistente con un desenlace terapéutico deseable en seres humanos o a los efectos deseados en
50 mamíferos no humanos o en otras especies u organismos. La actividad terapéutica se puede medir in vivo o in vitro. Por ejemplo, se puede analizar un efecto deseable en un cultivo celular.
Dichos ensayos de cultivo celular o in vitro normalmente están disponibles para muchas proteínas terapéuticas como se describe en la técnica. Ejemplos de ensayos incluyen, entre otros, los descritos en el presente documento en la sección Ejemplos o en la columna “Ejemplo de ensayo de actividad” (columna 3) de la tabla 1.
Las proteínas terapéuticas correspondientes a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, tales como proteínas de superficie celular y secretoras, a menudo se modifican mediante la unión de uno o más grupos de oligosacáridos. La modificación, denominada glucosilación, puede afectar espectacularmente a las propiedades físicas de las proteínas y puede ser importante en la estabilidad, secreción y 5 localización de proteínas. La glucosilación se produce en localizaciones específicas en la estructura del polipéptido. Normalmente hay dos tipos principales de glucosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a O, que están unidos a residuos de serina o treonina; y glucosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a N que están unidos a residuos de asparagina en una secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. Normalmente, el ácido N-acetilneuramínico (también conocido como ácido siálico) es el residuo
10 terminal de los oligosacáridos unidos a N y unidos a O. Variables tales como la estructura de la proteína y el tipo celular influyen sobre el número y la naturaleza de las unidades de carbohidrato dentro de las cadenas en diferentes sitios de glucosilación. Los isómeros de glucosilación también son habituales en el mismo sitio dentro de un tipo celular dado.
La célula huésped en la que se expresan puede modificar las proteínas terapéuticas correspondientes a la porción
15 de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, así como análogos y variantes de la misma, de un modo tal que la glucosilación en uno o más sitios se altera como resultado de manipulación(es) de su secuencia de ácidos nucleicos, o se pueden modificar debido a otras condiciones de su expresión. Por ejemplo, se pueden producir los isómeros de glucosilación anulando o introduciendo sitios de glucosilación, por ejemplo mediante sustitución o deleción de residuos de aminoácidos, tal como la sustitución de glutamina por asparagina, o
20 se pueden producir proteínas recombinantes no glucosiladas mediante la expresión de proteínas en células huésped que no las glucosila, por ejemplo en E. coli o en levaduras con glucosilación deficiente. Estos abordajes se describen más detalladamente más adelante y se conocen en la técnica.
La proteína terapéutica, divulgada en la tabla 1, y sus secuencias de ácido nucleico y aminoácidos son bien conocidas en la técnica y están disponibles en las bases de datos públicas, tales como las bases de datos de 25 servicios de abstraes químicos (p. ej., el registro CAS), GenBank, y bases de datos con suscripción como GenSeq
(p. ej., Derwent). Ejemplos de secuencias de nucleótidos de la proteína terapéutica que se puede usar para derivar un polinucleótido de la invención se muestran en la columna 7, “SEC ID Nº X" de la tabla 2. Las secuencias mostradas como SEC ID Nº X pueden ser una secuencia de polinucleótidos silvestre que codifica una proteína terapéutica dada (p. ej., de longitud larga o madura) o, en algunos casos, la secuencia puede ser una variante de 30 dicha secuencia de polinucleótidos silvestre (p. ej., un polinucleótido que codifica la proteína terapéutica silvestre en la que la secuencia de ADN de dicho polinucleótido se ha optimizado, por ejemplo para la expresión en una especie concreta; o un polinucleótido que codifica una variante de la proteína terapéutica silvestre (es decir, un mutante dirigido a sitio; una variante alélica)). Está dentro de la capacidad del experto en la técnica usar la secuencia mostrada como SEC ID Nº X para derivar la construcción descrita en la misma fila. Por ejemplo, si la SEC ID Nº X
35 corresponde a una proteína de longitud larga, pero solo una porción de dicha proteína se usa para generar la CID específica, entra dentro de la experiencia en la técnica usar técnicas de biología molecular, tales como PCR, para amplificar el fragmento específico y clonarlo en el vector adecuado.
La tabla 1 proporciona la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención o una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido de la invención. La primera columna “Proteína 40 terapéutica X” divulga la molécula de proteína terapéutica a la que le puede seguir entre paréntesis nombres científicos y de marcas de proteínas que comprenden o, como alternativa, consisten en, la molécula de proteína terapéutica o un fragmento o variante de la misma. La “proteína terapéutica X” como se usa en el presente documento, puede hacer referencia a una molécula proteína terapéutica individual o a todo el grupo de proteínas terapéuticas asociadas con una molécula proteína terapéutica dada divulgada en esta columna. La columna de
45 “actividad biológica” (columna 2) describe las actividades biológicas asociadas con la molécula proteína terapéutica. La columna 3, “Ejemplo de ensayo de actividad” proporciona referencias que describen ensayos que se pueden usar para analizar la actividad terapéutica y/o biológica de la proteína terapéutica X o una proteína de fusión de albúmina que comprende una porción de la proteína terapéutica X (o un fragmento de la misma).
La cuarta columna, “Indicación preferida: Y”, describe enfermedades, trastornos y/o afecciones que se pueden tratar,
50 prevenir, diagnosticar y/o mejorar mediante la proteína terapéutica X o una proteína de fusión de albúmina que comprende la porción de la proteína terapéutica X (o un fragmento de la misma). La columna “la construcción” (columna 5) proporciona un enlace a un ejemplo de construcción de fusión de la albúmina divulgado en la tabla 2 que codifica una proteína de fusión de albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en la porción de la proteína terapéutica X (o un fragmento de la misma) de referencia.
8 Tabla 1
Proteína terapéutica: X
Actividad biológica Ejemplo de ensayo de actividad Indicación preferida: Y ID de la construcción Proteína terapéutica: Z
Similar al glucagón
Estimula la síntesis La actividad GLP1 se puede Hiperglucemia; Diabetes 2448, 2455, Véase la Tabla 2,
Diabetes Insipidus; 2456, 2457,
Péptido 1 (GLP1;
Y liberación de Analizar in Vitro Diabetes mellitus; 2803, 2804, SEC ID Nº Z
insulinotropina)
insulina; usando un ensayo para una
potencia la
de captación de Diabetes de tipo 1 2900, 2904, construcción
sensibilidad de los tejidos
glucosa-[3-H]. (J Biol Chem 1999 Diabetes de tipo 2 2945, 2964, concreta
adiposo, muscular y hepático a la
Oct 22; 274(43):3086430873). Resistencia a la insulina; 2982, 3070, 2802, 3027,
insulina;
Deficiencia de
estimula la captación de
insulina; 3028, 3045,
glucosa; ralentiza el
Hiperlipidemia; 3046, 3069,
proceso
Hipercetonemia; 3071, 3072,
digestivo; suprime el
Diabetes mellitus no 3085, 3086,
apetito; bloquea la secreción de
insulino dependiente (DMNID); 3087, 3140,
glucagón. Diabetes mellitus insulino dependiente (DMID); Hipoglucemia, infecciones, retinopatía y/o úlceras; Trastornos metabólicos; Trastornos inmunitarios; Obesidad; Trastornos vasculares; Supresión del peso corporal; Supresión del apetito; Síndrome X. 3309
9 Tabla 2
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
197
2448 pSAC35:GLP-1(7-36).HSA Los aminoácidos H98 a R127 del preproglucagón (SEC ID Nº 630) (en lo sucesivo en el presente documento, el dominio específico se denominará "GLP-1(7-36)") se fusionan cadena arriba de la HAS madura y cadena abajo de la secuencia líder HSA/kex2. pSAC35 414 198 630 988 989 HSA/kex2
199
2455 pSAC35:HSA.GLP-1(736) GLP-1(7-36) se fusiona cadena abajo de la HSA madura y la secuencia líder HSA/kex2. pSAC35 416 200 632 992 993 HSA/kex2
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
200
2456 pSAC35:GLP-1(7-36 (A8G)) .HSA Los aminoácidos H98 a R127 del preproglucagón (SEC ID Nº 633) (también "GLP-1(7-36)") están mutados en el aminoácido 99 de la SEC ID Nº 633 para sustituir la alanina por una glicina. Este particular mutante de GLP-1 se denominará en lo sucesivo en el presente documento “GLP-1(736(A8G))" y corresponde a la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1808. GLP-1(736(A8G)) se fusiona cadena arriba de la HSA madura y cadena abajo de la secuencia líder HSA/kex2. pSAC35 417 201 633 994 995 HSA/kex2
201
2457 pSAC35:HSA.GLP-1 (7-36 (A8G)) GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808) se fusiona cadena abajo de la HSA madura y la secuencia líder HSA/kex2. pSAC35 418 202 634 996 997 HSA/kex2
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
276
2802 pSAC35:GLP-1(7-36 (A8G)). IP2.HSA GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808) se fusiona cadena abajo de la secuencia líder HSA/kex2 y cadena arriba del péptido 2 intermedio del péptido proglucagón y cadena arriba de la HSA madura. pScNHSA 1559 1391 1727 HSA/kex2
277
2803 pSAC35:GLP-1(736(A8G)) x2.HSA GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808) se repite en tándem y se fusiona cadena abajo de la secuencia líder HSA/kex2 y cadena arriba de la HSA madura. pScCHSA 1231 1216 1246 1261 1262 HSA/kex2
278
2804 pSAC35:coGLP-1(7-36 (A8G)) x2.HSA GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808) se repite en tándem y se fusiona cadena abajo de la secuencia líder HSA/kex2 y cadena arriba de la HSA madura. pScCHSA 1232 1217 1247 1263 1264 HSA/kex2
312
2900 pSAC:GLP-1(7-36) x2.HSA GLP-1(736(A8G)) se repite en tándem y después se fusiona cadena abajo de la secuencia líder HSA/kex2 y cadena arriba de la HSA madura. pScCHSA 1233 1218 1248 1265 1266 HSA/kex2
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
316
2904 pSAC35:GLP-1(9-36). GLP-1(7-36).HSA Los Aminoácidos E100 a R127 del preproglucagón (SEC ID Nº 1249) (en lo sucesivo en el presente documento, este mutante concreto se denomina GLP1(7-36) se fusionan cadena abajo de la secuencia señal HSA/kex2 y cadena arriba de GLP-1(7-36) y la HSA madura. pScCHSA 1234 1219 1249 1267 1268 HSA/kex2
326
2945 pSAC35:GLP-1(7- Los pScCHSA 1235 1220 1250 1269 1270 HSA/kex2
36(A8S)) . GLP-1(7-
Aminoácidos
36).HSA H98 a R127 del preproglucagón (SEC ID Nº 1250) se mutan en la posición 99 desde alanina a serina (en lo sucesivo en el presente documento, este mutante concreto se denomina GLP-1(7-36(A8S)), que se fusionan cadena abajo de la secuencia señal HSA/kex2 y cadena arriba de GLP-1(7-36) y la HSA madura.
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
329
2964 pSAC35:GLP-1(7-36) x2.HSA GLP-1(7-36) se repite en tándem como dímero y se fusiona cadena abajo de la secuencia líder HSA/kex2 y cadena arriba de la HSA madura. pSAC35 1236 1221 1251 1271 1272 HSA/kex2
332
2982 pSAC35:GLP-1(7-36 A8G).GLP-1(7-36).HSA GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808) se fusiona cadena abajo de la secuencia señal HSA/kex2 y cadena arriba del GLP-1(736) y la HSA madura. pScCHSA 1237 1222 1252 1273 1274 HSA/kex2
336
3027 pSAC35:INV.GLP-1(736 (A8G)x2.HSA Péptido señal de invertasa seguido de GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808), repetido en tándem como dímero, seguido de la HSA madura. pSAC35 1607 1439 1775 2004 2005 invertasa
337
3028 pSAC35:INV.GLP-1(736 (A8G)).GLP-1(7-36).HSA Péptido señal de invertasa seguido de GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808), después GLP-1(7-36(A8G)) y después la HSA madura. pSAC35 1608 1440 1776 2006 2007 invertasa
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
338
3045 pSAC35:DeltaKex.GLP- La secuencia pSAC35 1609 1440 1776 2008 2009 Últimos seis
1(7-36 A8G)x2.HSA
señal HSA/kex2 menos los últimos seis aminoácidos de HSA/kex2
aminoácidos de la líder se fusiona con el GLP-1(7
36(A8G)) (SEC ID Nº 1808), que se repite en tándem
como dímero, seguido de la HSA madura.
339
3046 pSAC35:Delta La secuencia pSAC35 1610 1440 1776 2010 2011 Últimos seis
Kex.GLP.1(7-36A8G).GLP-1(7-36).HSA
señal HSA/kex2 menos los últimos seis aminoácidos de HSA/kex2
aminoácidos de la líder se fusiona con el GLP-1(7
36(A8G)) (SEC ID Nº 1808), GLP-1(7-36) y la HSA
madura.
349
3066 pSAC35:CKB-1d8.GLP- Péptido señal pScCHSA 1620 1452 1788 2030 2031 invertasa
1(7-36).HSA
de invertasa seguido de los aminoácidos G28-N93 de
CK�1 de longitud completa (SEC ID Nº 1788),
seguido de GLP-1(7-36), seguido de la HSA madura.
350
3069 pSAC35:INU.GLP-1(7-36(A8G)x2.HSA La secuencia señal de la inulinasa se pSAC35 1621 1453 1789 2032 2033 inulinasa
fusiona con GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808),
que se repite en tándem como dímero, seguido de la
HSA madura.
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
351
3070 pSAC35:KT.GLP-1(7-36(A8G))x2.HSA GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808) se repite en tándem como dímero y se fusiona cadena arriba de la HSA madura y cadena debajo de la secuencia señal de la toxina asesina. pSAC35 1280 1281 1282 1283 1284 Toxina asesina
352
3071 pSAC35:MAF.GLP-1(7-36(A8G))x2.HSA La secuencia señal del factor de apareamiento de levaduras a1 (en lo sucesivo en el presente documento MFa-1) se fusiona con las copias repetidas en tándem de GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808), que se fusionan con la HSA madura. pSAC35 1622 1454 1790 2034 2035 MFa-1
353
3072 pSAC35:AP.GLP-1(7-36(A8G))x2.HSA La secuencia señal de la fosfatasa ácida se fusiona con las copias repetidas en tándem de GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808), que se fusionan con la HSA madura. pSAC35 1623 1455 1791 2036 2037 Fosfatasa ácida
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
354
3085 pSAC35:MAF.GLP-1(736(A8G)).GLP-1(7-36).HSA La secuencia señal del factor de apareamiento de levaduras a1 (en lo sucesivo en el presente documento MFa-1) se fusiona con GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808), GLP-1(7-36) y HSA madura. pSAC35 1624 1456 1792 2038 2039 MFa-1
355
3086 pSAC35:INU.GLP-1(736(A8G)).GLP.1(7-36).HSA La secuencia señal de la inulinasa se fusiona con GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808), GLP-1(7-36) y HSA madura. pSAC35 1625 1457 1793 2040 2041 inulinasa
356
3087 pSAC35:AP.GLP-1(736(A8G)).GLP-1(7-36).HSA La secuencia señal de la fosfatasa alcalina se fusiona con GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808), GLP-1(7-36) y HSA madura. pSAC35 1626 1458 1794 2042 2043 Fosfatasa ácida
370
3140 pSAC35:GLP1(mut)DA HK.HSA GLP-1(736(A8G)) (SEC ID Nº 1808) se une a la HSA madura mediante un ligador de 16 aminoácidos derivado del extremo N de la HSA. Se usa la secuencia señal HSA/kex2. pSAC35 1640 1472 1808 2064 2065 HSA/kex2
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº X SEC ID Nº Z SEC ID Nº A SEC ID Nº B Secuencia líder
416
3309 pSAC:KT.GLP-1(736(A8G))x2.MSA.E25-A608 Secuencia líder de la toxina asesina, seguida de GLP-1(736(A8G), seguida de la seroalbúmina de ratón madura. pSAC35 2170 2160 2180 2194 2195 Toxina asesina
La tabla 2 proporciona una lista no exhaustiva de polinucleótidos de la invención que comprende o, como alternativa que consiste en, moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de albúmina. La primera columna, “Nº de fusión” da un número de fusión a cada polinucleótido. La columna 2, “ID de la construcción” proporciona un 5 identificador numérico único para cada polinucleótido de la invención. Las ID de las construcciones se pueden usar para identificar polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina que comprenden o, como alternativa que consisten en, una porción de la proteína terapéutica correspondiente a la proteína terapéutica: X indicada en la fila correspondiente de la tabla 1, en la qe dicha ID de construcción se indica en la columna 5. La columna "Nombre de la construcción" (columna 3) proporciona el nombre de una construcción o polinucleótido de fusión de albúmina
10 dada.
La cuarta columna de la tabla 2, “Descripción”, proporciona una descripción general de una construcción de fusión de albúmina y la quinta columna, “Vector de expresión”, indica el vector en el cual se clonó un polinucleótido que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina dada. En la técnica se conocen vectores y están disponibles comercialmente o se describen en otros 15 lugares. Por ejemplo, como se describe en los Ejemplos, un “casete de expresión” que comprende o, como alternativa que consiste en, uno o más de (1) un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina dada, (2) una secuencia líder, (3) una región promotora y (4) un terminador de la transcripción, se puede ensamblar en un vector de clonación conveniente y, después, pasarse a un vector alternativo, tal como, por ejemplo, un vector de expresión que incluye, por ejemplo, un vector de expresión de levadura o un vector de expresión de mamífero. En 20 una realización, para la expresión en S. cervisiae, un casete de expresión que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina se clona en pSAC35. En otra realización, para la expresión en células CHO, un casete de expresión que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina se clona en pC4. En una realización adicional, un polinucleótido que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de
25 ácido nucleico que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina se clona en pC4:HSA. En otra realización más, para la expresión en células NS0 , un casete de expresión que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina se clona en pEE12. El experto en la técnica conocerá otros vectores de clonación y/o de expresión útiles.
La columna 6, “SEC ID Nº Y”, proporciona la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína de
30 fusión de albúmina de la invención. En la mayoría de los casos, la SEC ID Nº Y muestra la forma no procesada de la proteína de fusión de albúmina codificada, en otras palabras la SEC ID Nº Y muestra la secuencia señal, en la porción de HSA, y una porción terapéutica, todo ello codificado por la construcción concreta. Específicamente contemplado en la presente invención están todos los polinucleótidos que codifican la SEC ID Nº Y. Cuando estos polinucleótidos se usan para expresar la proteína codificada de una célula, la secreción natural de la célula y las
35 etapas de procesamiento producen una proteína que carece de la secuencia señal indicada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2. La secuencia de aminoácidos específica de la secuencia señal indicada se muestra más adelante en la memoria o es bien conocida en la técnica. Por tanto, la mayoría de las realizaciones preferidas de la presente invención incluye la proteína de fusión de albúmina producida por una célula (que carecería de la secuencia líder mostrada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2). Asimismo, los más preferidos son polipéptidos que comprenden la
40 SEC Nº Y sin la secuencia líder específica indicada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2. También se prefieren las composiciones que comprenden estas dos realizaciones preferidas, incluyendo las composiciones farmacéuticas. Además, está bien dentro de la capacidad del experto en la técnica sustituir la secuencia señal indicada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2 con una secuencia señal diferente, tales como las descritas más adelante en la memoria para facilitar la secreción de la proteína de fusión de albúmina procesada.
45 La séptima columna, “SEC ID Nº X", proporciona la secuencia de ácido nucleico parental a partir de la cual se puede derivar un polinucleótido que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina dada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico parental a partir de la cual se puede derivar un polinucleótido que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia génica silvestre que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia génica silvestre que codifica la proteína terapéutica que se muestra en la tabla 1. En una realización alternativa, la secuencia de ácido nucleico parental a partir de la cual se puede derivar un polinucleótido que codifica
5 la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina comprende una variante o derivado de una secuencia génica silvestre que codifica la proteína terapéutica mostrada en la tabla 1, tal como, por ejemplo, una variante optimizada por codón sintético de una secuencia génica silvestre que codifica la proteína terapéutica.
La octava columna, “SEC ID Nº Z", proporciona una traducción predicha de la secuencia de ácido nucleico parental (SEC ID Nº X). Esta secuencia parental puede ser una proteína parental de longitud completa usada para derivar la 10 construcción concreta, la porción madura de una proteína parental, una variante o fragmento de una proteína silvestre, o una secuencia artificial que se puede usar para crear la construcción descrita. Un experto en la técnica puede usar esta secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº Z para determinar qué residuos de aminoácidos de una proteína de fusión de albúmina codificada por una construcción dada se proporcionan mediante la proteína terapéutica. Además, está dentro de la capacidad del experto en la técnica usar la secuencia mostrada
15 como SEC ID Nº Z para derivar la construcción descrita en la misma fila. Por ejemplo, si la SEC ID Nº Z corresponde a una proteína de longitud completa, pero solo una porción de dicha proteína se usa para generar la CID específica, está dentro de la experiencia en la técnica usar técnicas de biología molecular, tales como PCR, para amplificar el fragmento específico y clonarlo en el vector adecuado.
Los cebadores para amplificación proporcionados en las columnas 9 y 10, “SEC ID Nº A" y “SEC ID Nº B",
20 respectivamente, son ejemplos de cebadores usados para generar un polinucleótido que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina dada. En una realización de la divulgación, se usan cebadores oligonucleotídicos que tienen las secuencias mostradas en las columnas 9 y/o 10 (SEC ID Nº A y/o B) para amplificar mediante PCR un polinucleótido que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina usando una
25 molécula de ácido nucleico que comprende o, como alternativa que consiste en, la secuencia de nucleótidos proporcionada en la columna 7 ( SEC ID Nº X) de la correspondiente fila como molde de ADN. Los procedimientos de PCR están bien establecidos en la técnica. Los expertos en la técnica podrían prever fácilmente las secuencias de cebadores útiles adicionales.
En una realización alternativa se pueden usar cebadores oligonucleotídicos en reacciones de PCR solapantes para 30 generar mutaciones dentro de una secuencia de ADN molde. En la técnica se conocen procedimientos de PCR.
Como se muestra en la tabla 3, en la presente solicitud, en la ATCC® se han depositado ciertas construcciones de fusión de albúmina.
Tabla 3
ID de la construcción
Nombre de la construcción Nº de depósito en la ATCC/Fecha
3070
pSAC35:KT.GLP-1(7-36(A8G))x2.HSA PTA-4671, 16 de sept. de 2002
35 Es posible recuperar una construcción de fusión de albúmina dada del depósito mediante técnicas conocidas en la materia y se describen en otros lugares del presente documento (véase el ejemplo 40). La ATCC® se encuentra en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. Los depósitos en la ATCC se han hecho bajo los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patente.
40 Se describe un “casete de expresión” que comprende o, como alternativa que consiste en, uno o más de (1) un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina dada, (2) una secuencia líder, (3) una región promotora y (4) un terminador de la transcripción se puede mover o “subclonar” de un vector a otro. Los fragmentos que se van a subclonar se pueden generar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, amplificación por PCR (p. ej., usando cebadores oligonucleotídicos que tienen la secuencia mostrada en la
45 SEC ID Nº A o B) y/o digestión mediante enzimas de restricción.
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden tener una actividad terapéutica y/o actividad biológica correspondiente a la actividad terapéutica y/o actividad biológica de la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina indicada en la fila correspondiente de la tabla 1. En realizaciones preferidas adicionales, las porciones de proteína
50 terapéuticamente activas de las proteínas de fusión de albúmina son fragmentos o variantes de la proteína codificada por la secuencia mostrada en la columna de la SEC ID Nº X de la tabla 2 y tienen la actividad terapéutica y/o la actividad biológica de la proteína terapéutica correspondiente.
Proteínas de fusión de albúmina no humanas de hormona de crecimiento.
En una realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden una o más proteínas de seroalbúmina de una especie animal no humana, fusionadas en tándem y en el marco bien en el extremo N o el extremo C con una o más proteínas de hormona de crecimiento de la misma especie animal no humana. Las 5 proteínas de seroalbúmina y de hormona de crecimiento no humanas son bien conocidas en la técnica y están disponibles en las bases de datos públicas. Por ejemplo, la tabla 4 presenta números de acceso correspondientes a secuencias de seroalbúmina no humana (columna 2) y secuencias de hormona de crecimiento no humana (columna 3) que se encuentran en GenBank. En una realización preferida, una proteína de seroalbúmina de una especie animal no humana indicada en la Tabla 4 se fusiona con una proteína de hormona de crecimiento de la misma
10 especie animal no humana.
En una realización específica, la proteína de fusión de albúmina de la invención comprende una o más proteínas de seroalbúmina de Bos taurus indicadas en la tabla 4, columna 2, fusionadas en tándem y en el marco bien en el extremo N bien en el extremo C con una o más proteínas de hormona de crecimiento de Bos taurus indicadas en la tabla 4, columna 3.
15 Las proteínas de fusión que comprenden fragmentos o variantes de seroalbúmina no humana, tales como, por ejemplo, la forma madura de la seroalbúmina, también están abarcadas dentro de la invención. Las proteínas de fusión que comprenden fragmentos o variantes de proteínas de la hormona de crecimiento no humana, tales como, por ejemplo, la forma madura de la hormona de crecimiento, también están abarcadas dentro de la invención. Preferentemente, los fragmentos y variantes de la hormona de crecimiento no humana conservan la actividad de la
20 hormona de crecimiento.
Los polinucleótidos de la invención comprenden o, como alternativa consisten en, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de albúmina no humana descrita anteriormente. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden comprender o, como alternativa consistir en, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína seroalbúmina de una especie animal no humana indicada en la tabla 4, columna 1 (tal como,
25 por ejemplo, las secuencias de referencia de seroalbúmina no humana indicadas en la tabla 4, columna 2) fusionadas en tándem o en el marco en 5’ o en 3’ con un polinucleótido que comprende, o, como alternativa consiste en, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína de hormona de crecimiento de la correspondiente especie animal no humana (por ejemplo, las secuencias de referencia de la hormona de crecimiento indicadas en la tabla 4, columna 3).
30 Las proteínas de fusión de albúmina no humanas descritas anteriormente están abarcadas dentro de la invención, como lo son las células huésped y vectores que contienen estos polinucleótidos. En una realización, una proteína de fusión de albúmina no humana codificada por un polinucleótido como se ha descrito anteriormente tiene una semivida prolongada. En una realización adicional, una proteína de fusión de albúmina no humana codificada por un polinucleótido descrito anteriormente tiene una semivida en suero más prolongada y/o una actividad más
35 estabilizada en solución (o en una composición farmacéutica) in vitro y/o in vivo que la correspondiente molécula de hormona de crecimiento sin fusionar.
La presente invención también abarca procedimientos de prevenir, tratar o mejorar una enfermedad o trastorno en una especie animal no humana. En ciertas realizaciones, la presente invención abarca un procedimiento de tratar una enfermedad o trastorno veterinario que comprende administrar a una especie animal no humana en la que se 40 desea dicho tratamiento, prevención o mejora una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprende una porción de la hormona de crecimiento correspondiente a una proteína de la hormona de crecimiento (o fragmento o variante de la misma) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno. Enfermedades y/o trastornos veterinarios que se pueden tratar, prevenir o mejorar incluyen trastornos de crecimiento (tales como, por ejemplo, enanismo hipofisario), inflamación de la espinilla, obesidad, dermatosis respondedora a la
45 hormona de crecimiento, miocardiopatía dilatada, trastornos de alimentación, trastornos de la reproducción y trastornos endocrinos.
También se pueden usar proteínas de fusión de albúmina no humanas de la invención para estimular la cicatrización de heridas en la piel, lesiones corneanas, fracturas óseas y lesiones de las articulaciones, tendones o ligamentos.
Las proteínas de fusión de albúmina no humanas de la invención también se pueden usar para aumentar la 50 producción de la leche en animales lactantes. En una realización preferida, el animal lactante es una vaca lechera.
Las proteínas de fusión de albúmina no humanas de la invención también se pueden usar para mejorar la afección corporal en animales envejecidos.
Las proteínas de fusión de albúmina no humanas de la invención también se pueden usar para aumentar la fertilidad, las tasas de gestación y el éxito reproductor en animales domesticados.
55 Las proteínas de fusión de albúmina no humanas de la invención también se pueden usar para mejorar la proporción carne magra:grasa en animales criados para consumo, así como para mejorar el apetito e incrementar el tamaño corporal y la tasa de crecimiento.
Tabla 4
Especie no humana
Secuencia(s) de referencia de seroalbúmina no humana: Nº de acceso de las proteínas en GenBank Secuencia(s) de referencia de hormona de crecimiento no humana: Nº de acceso de las proteínas en GenBank
Bos taurus
ABBOS, CAA76847, P02769, CAA41735, 229552, AAA51411 STBO, BAA06379, A29864, AAF28806, AAF28805, AAF28804, P01246, AAF03132, AAC63901, AAB92549, A36506, I45901, JC1316, CAA23445, CAA00787, CAA00598, AAA30547, AAA30546, AAA30545, AAA30544, AAA30543, AAA30542
Sus scrofa
P08835, CAA30970, AAA30988 STPG, PC1017, AAB29947, AAB84359, I46585,
I46584, PC1063, A01516, AAB17619, 226829,
225740, CAA37411, CAA00592, AAA73478,
AAA73477, CAA00356, AAA31046, AAA31045,
AAA31044, AA30543
Equus caballus
ABHOS, AAG40944, P35747, CAA52194 STHO, P01245, AAD25992, 227704, AAA21027
Ovis aries
ABSHS, P14639, CAA34903 STSH, AAB24467, AAC48679, 228487, 223932, CAA34098, CAA31063, CAA00828, AAA31527
Salmo salar
ABONS2, ABONS2, CAA36643, CAA43187 STONC, P07064, Q07221, P48096, P10814,
P10607, I51186, S03709, JS0179, A23154,
S06489, CAA42431, AAB29165, AAB24612,
Q91221, Q91222, CAA43942, CAA32481,
738042, 224555, CAA00427, AAA50757,
AAA49558, AAA49555, AAA49553, AAA49401,
AAA49406, AAA49403, AAA49402
Gallus gallus
ABCHS, P19121, CAA43098 BAB62262, BAB69037, AAK95643, A60509, AAG01029, BAA01365, P08998, 226895, CAA31127, CAA35619, AAA48780
Felis catus
P49064, S57632, CAA59279, JC4660 JC4632, P46404, AAC00073, AAA96142, AAA67294
Canis familiaris
P49822, S29749, CAB64867, CAA76841, AAB30434 P33711, I46145, AAF89582, AAF21502, AAD43366, S35790, AAB34229, CAA80601
Fragmentos y variantes de polipéptidos y polinucleótidos
Fragmentos
5 Aunque la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N de una proteína tenga como resultado la modificación
o la pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína terapéutica, la proteína albúmina y/o la proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden seguir conservando otras actividades terapéuticas y/o actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas, capacidad para multimerizar, capacidad para unirse a un ligando). Por ejemplo, generalmente se conservará la capacidad de los polipéptidos con deleciones en el extremo N para inducir 10 y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completas o maduras de los polipéptidos cuando se eliminan del extremo N menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo. Si un polipéptido concreto que carece de residuos en el extremo N de un polipéptido completo conserva dichas actividades inmunológicas o no se puede determinar fácilmente mediante procedimientos de rutina descritos en el presente documento y, por otro lado, se conoce en la técnica. No es improbable que una luteína con un gran número de residuos de aminoácidos en el
15 extremo N delecionados puede conservar algunas actividades biológicas o inmunogénicas. De hecho, los péptidos compuestos por tan pocos como seis residuos de aminoácidos pueden provocar, a menudo, una respuesta inmunitaria.
De acuerdo con esto, los fragmentos de la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención incluyen la proteína de longitud completa así como polipéptidos que tienen uno o más residuos delecionados del extremo amino de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia (es decir, la proteína terapéutica a la que se hace referencia en la tabla 1, o una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de la fusión de albúmina descrita en la tabla 2). En concreto, las deleciones en el extremo N se pueden describir mediante
5 la fórmula general m a q, en la que q es un número entero que representa el número total de residuos de aminoácidos en un polipéptido de referencia (p. ej., la proteína terapéutica a la que se hace referencia en la tabla 1 o una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención o una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 2) y m se define como cualquier número entero que varía de 2 a q menos 6. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención.
Además, los fragmentos de polipéptidos de seroalbúmina correspondientes a una porción de proteína albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención incluyen la proteína de longitud completa así como polipéptidos que tienen uno o más residuos delecionados del extremo amino de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia (es decir, seroalbúmina o una porción de seroalbúmina de una proteína de fusión de albúmina codificada
15 por un polinucleótido o construcción de la fusión de albúmina descrita en la tabla 2). En realizaciones preferidas, las deleciones en el extremo N se pueden describir mediante la fórmula general m a 585, en la que 585 es un número entero que representa el número total de residuos de aminoácidos en seroalbúmina humana madura (SEC ID Nº 1038) y m se define como cualquier número entero que varía de 2 a 579. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención. En realizaciones adicionales, las deleciones en el extremo N se pueden describir mediante la fórmula general m a 609, en la que 609 es un número entero que representa el número total de residuos de aminoácidos en seroalbúmina humana de longitud completa (SEC ID Nº 1094) y m se define como cualquier número entero que varía de 2 a 603. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención.
Además, los fragmentos de proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen la proteína de fusión de
25 albúmina de longitud completa así como polipéptidos que tienen uno o más residuos delecionados del extremo amino de la proteína de fusión de albúmina (p. ej., una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de la fusión de albúmina descrita en la tabla 2 o una proteína de fusión de albúmina que tiene la secuencia de aminoácidos divulgada en la columna 6 de la tabla 2). En concreto, las deleciones en el extremo N se pueden describir mediante la fórmula general m a q, en la que q es un número entero que representa el número total de residuos de aminoácidos en la proteína de fusión de albúmina y m se define como cualquier número entero que varía de 2 a q menos 6. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención.
También como se ha mencionado anteriormente, aunque la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C de un polipéptido de referencia (p. ej., la proteína terapéutica, la proteína seroalbúmina o la proteína de
35 fusión de albúmina de la invención) tenga como resultado la modificación o la pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, se pueden seguir conservando otras actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas, capacidad para multimerizar, capacidad para unirse a un ligando) y/o actividades terapéuticas. Por ejemplo, generalmente se conservará la capacidad de los polipéptidos con deleciones en el extremo C para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completas o maduras del polipéptido cuando se eliminan del extremo C menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo o maduro. Si un polipéptido concreto que carece de los residuos en el extremo N y/o el extremo C de un polipéptido de referencia conserva la actividad terapéutica o no se puede determinar mediante procedimientos de rutina descritos en el presente documento y/o de otro modo conocidos en la técnica.
La presente divulgación proporciona además polipéptidos que tienen uno o más residuos delecionados del extremo
45 carboxi de la secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., la proteína terapéutica a la que se hace referencia en la tabla 1, o una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de la fusión de albúmina descrita en la tabla 2). En concreto, las deleciones en el extremo C se pueden describir mediante la fórmula general 1 a n, en la que n es cualquier un número entero que varía de 6 a q menos 1 y en la que q es un número entero que representa el número total de residuos de aminoácidos en un polipéptido de referencia (p. ej., la proteína terapéutica a la que se hace referencia en la tabla 1 o una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 2). Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención.
55 Además, la presente divulgación proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos delecionados del extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos de una proteína albúmina correspondiente a una porción de proteína albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., seroalbúmina o una porción de proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 2). En concreto, las deleciones en el extremo C se pueden describir mediante la fórmula general I a n, en la que n es cualquier número entero que varía de 6 a 584, en la que 584 es el número entero que representa el número total de residuos de aminoácidos en seroalbúmina humana madura (SEC ID Nº 1038) menos uno. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención. En concreto, las deleciones en el extremo C se pueden describir mediante la fórmula general 1 a n, en la que n es cualquier número entero que varía de 6 a 608, en la que 608 es el número entero que representa el número total de residuos de aminoácidos en seroalbúmina (SEC ID Nº 1094) menos uno. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención.
Además, la presente divulgación proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos delecionados del extremo
5 carboxi de una proteína de fusión de albúmina de la invención. En concreto, las deleciones en el extremo C se pueden describir mediante la fórmula general 1 a n, en la que n es cualquier número entero que varía de 6 a q menos 1 y en la que q es el número entero que representa el número total de residuos de aminoácidos en una proteína de fusión de albúmina de la invención. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención.
10 Además, cualquiera de las deleciones en los extremos N o C descritas anteriormente se puede combinar para producir un polipéptido de referencia delecionado en los extremos N y C. La divulgación también proporciona polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos delecionados de los extremos tanto amino como carboxilo, que se pueden describir en general como que tienen residuos de m a n de un polipéptido de referencia (p. ej., la proteína terapéutica a la que se hace referencia en la tabla 1 o una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión
15 de albúmina de la invención o una porción de proteína terapéutica codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 2 o seroalbúmina (p. ej., SEC ID Nº 1038) o una porción de proteína albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención o una porción de proteína albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 2 o una proteína de fusión de albúmina o una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina de la
20 invención) en la que n y m son números enteros como se ha descrito anteriormente. También se divulgan polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.
La presente divulgación también está dirigida a proteínas que contienen polipéptidos con una identidad de al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con una secuencia polipeptídica de referencia (p. ej., la proteína terapéutica a la que se hace referencia en la tabla 1 o una porción de proteína terapéutica de una proteína 25 de fusión de albúmina de la invención o una porción de proteína terapéutica codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 2 o seroalbúmina (p. ej., SEC ID Nº 1038) o una porción de proteína albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención o una porción de proteína albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 2 o una proteína de fusión de albúmina o una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de
30 albúmina de la invención) establecidas en el presente documento, o fragmentos de las mismas. La divulgación está dirigida a proteínas que comprenden polipéptidos con una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con polipéptidos de referencia que tienen la secuencia de aminoácidos de las deleciones en los extremos N y C como se ha descrito anteriormente. También se divulgan polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.
35 Los fragmentos de polipéptidos preferidos son fragmentos que comprenden o, como alternativa, que consisten en, una secuencia de aminoácidos que muestra una actividad terapéutica y/o actividad funcional (p. ej., actividad biológica) de la secuencia de polipéptidos de la proteína terapéutica o de la proteína seroalbúmina de la cual la secuencia de aminoácidos es un fragmento.
Otros fragmentos polipeptídicos preferidos son fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente
40 activos son los que exhiben una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido de la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una actividad deseada mejorada o una actividad indeseable disminuida.
Variantes
“Variante” se refiere a un polinucleótido o ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico o polipéptido pero que
45 conserva las propiedades esenciales del mismo. En general, las variantes son muy similares y, en muchas regiones, idénticas al ácido nucleico o polipéptido de referencia.
Como se usa en el presente documento, “variante” se refiere a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, la porción albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención o la proteína de fusión de albúmina de la invención que difieren en la secuencia de la proteína terapéutica (p. ej., véase 50 la columna “terapéutica” de la tabla 1), la proteína albúmina y/o la proteína de fusión de albúmina, respectivamente, pero que conserva al menos una propiedad funcional y/o terapéutica de la misma como se describe en otro lugar del presente documento o, de otro modo, se conoce en la técnica. Generalmente, las variantes son, en general, muy similares y, en muchas regiones, idénticas a la secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina, proteína albúmina correspondiente a una
55 porción de proteína albúmina de una proteína de fusión de albúmina y/o los ácidos nucleicos de la proteína de fusión de albúmina que codifican estas variantes también entran dentro de la invención.
La presente divulgación también está dirigida a proteínas que comprenden o, como alternativa, consisten en, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o
100 % con, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., la secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica X divulgada en la tabla 1 que es GLP-1; o la secuencia de aminoácidos de la porción de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión 5 de albúmina descrita en la tabla 1 o 2, o fragmentos o variantes de las mismas), proteínas de albúmina correspondientes a una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., la secuencia de aminoácidos de una porción de proteína albúmina de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en las tablas 1 y 2; la secuencia de aminoácidos mostrad en la SEC ID Nº 1038; o fragmentos o variantes de las mismas) y/o proteínas de fusión de albúmina. También se proporcionan fragmentos de estos polipéptidos (p. ej., los fragmentos descritos en el presente documento). También se describen polipéptidos codificados por un polinucleótido que hibrida con la complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención en condiciones de hibridación rigurosas (p. ej., hibridación con ADN unido a un filtro en 6x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC/0,1 % de SDS a aproximadamente 50-65 ºC)
15 en condiciones altamente rigurosas (p. ej., hibridación con ADN unido a un filtro en 6X SSC/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en 0,1X SSC/0,2 % de SDS a aproximadamente 68 ºC) o cualquier otra condición de hibridación rigurosas conocidas para los expertos en la técnica, véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. y col., eds. 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., New York, en las páginas 6.3.1 - 6.3.6 y 2 10.3). Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención.
Por polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un, por ejemplo, 95 % “idéntica” a una secuencia de aminoácidos de consulta se quiere decir que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto es idéntica a la secuencia problema a excepción de que la secuencia polipeptídica sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para
25 obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica con una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta un 5 % de los residuos de aminoácidos en la secuencia sujeto se pueden insertar, delecionar o sustituir con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier punto entre dichas posiciones terminales entremezcladas individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como materia práctica, si cualquier polipéptido concreto tienen una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de albúmina de la invención o un fragmento de la misma (tal como una porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina o una porción de albúmina de la proteína de fusión de albúmina) se puede determinar convencionalmente
35 usando programas informáticos conocidos. Un procedimiento preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominado alineación de la secuencia global, se puede determinar usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci.6:237-245 (1990)). En una alineación de secuencias, las secuencias problema y sujeto son ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación de secuencia global se expresa en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en la alineación de aminoácidos FASTDB son: Matriz= PAM 0, k-tuple= 2, penalización por apareamiento erróneo= 1, penalización por unión=20, longitud del grupo de aleatorización= 0, puntuación de corte= 1, tamaño de la ventana= longitud de la secuencia, penalización por espacio=5, penalización por tamaño del espacio =0 ,05, tamaño de la ventana= 500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos sujeto, lo que sea más corto.
45 Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia problema debido a deleciones en los extremos N o C, no por deleciones internas, se debe hacer una corrección manual de los resultados. Esto es porque el programa FASTDB no representa los truncamientos en los extremos N y C de la secuencia sujeto cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para las secuencias sujeto truncadas en los extremos N y C, respecto a la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de residuos de la secuencia problema que está en los extremos N y C de la secuencia sujeto, que no están apareados/alineados con un residuo sujeto correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Si un residuo está apareado/alineado o no se determina mediante los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. Después, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación final del porcentaje de identidad. Esta puntuación final del porcentaje de identidad es lo
55 que se usa para los fines de la presente divulgación. Solo los residuos en los extremos N y C de la secuencia sujeto que no están apareadas/alineadas con la secuencia problema se considerar para los fines de ajustar manualmente la puntuación del porcentaje de identidad. Es decir, solo las posiciones de los residuos problema fuera de los residuos más lejanos en los extremos N y C de la secuencia sujeto.
Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos de aminoácidos se alinea con una secuencia problema de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se produce en el extremo N de la secuencia sujeto y, por tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo N. Los 10 residuos no apareados representan el 10 % de la secuencia (número de residuos en los extremos N y C no apareados/número total de residuos en la secuencia problema) de modo que se resta un 10 % de la puntuación del porcentaje de identidad calculado mediante el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes estuvieran perfectamente alineados, el porcentaje final de identidad sería del 90 %. En otro ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos se compara con una secuencia problema de 100 residuos. Esta vez, las deleciones son deleciones internas de modo que no hay residuos en los extremos N o C de la secuencia sujeto que no están
5 apareados/alineados con el problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado mediante FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, solo los residuos en posiciones fuera de los extremos N y C de la secuencia sujeto, como se muestra en la alineación FASTDB, que no están apareados/alineados con la secuencia problema se corrigen de forma manual. Para los fines de la presente invención no se van a realizar otras correcciones manuales.
Normalmente, la variante tendrá una identidad de secuencia de al menos un 75 % (preferentemente de al menos
10 aproximadamente 80 %, 90 %, 95 % o 99 %) con una longitud de HA normal o proteína terapéutica que tiene la misma longitud que la variante. La homología o identidad a nivel de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos se determina mediante análisis BLAST (herramienta de búsqueda de alineación total básica) usando el algoritmo empleado mediante los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990) y Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290-300, 1993)), que están adaptados para la búsqueda de la similitud
15 de secuencia.
El enfoque usado mediante el programa BLAST es considerar primero segmentos similares entre una secuencia problema y una secuencia de la base de datos, después evaluar la significación estadística de todos los apareamientos que se identifican y, por último, resumir solo los apareamientos que satisfacen un umbral preseleccionado de significación. Para una discusión de problemas básicos en la búsqueda de similitud de las bases
20 de datos de secuencias, véase Altschul et al., (Nature Genetics 6: 119-129 (1994)). Los parámetros de búsqueda de histogramas, descripciones, alineaciones, previsiones (es decir el umbral de significación estadística para notificar apareamientos contra las secuencias de las bases de datos, cortes, matriz y filtro están en los valores por defecto. La matriz de puntuación por defecto usada mediante blastp, blastx, tblastn, y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992)).
25 Para blastn, la matriz de puntuación se fija mediante las proporciones entre M (es decir, la puntuación de recompensa para un par de residuos apareados) y N (es decir, la puntuación de penalización para los residuos apareados erróneamente), en la que los valores por defecto para M y N son 5 y -4, respectivamente. Cuatro parámetros blastn se pueden ajustar del siguiente modo: Q=10 (penalización por creación de espacio); R=10 (penalización por extensión de espacio); wink=1 (genera coincidencias de texto e cada posición winkth a lo largo del
30 problema); y gapw=16 (fija la anchura de la ventana dentro de la cual se general las alineaciones con espacios). Los valores de los parámetros de Blastp equivalentes fueron Q=9; R=2; wink=1; y gapw=32. Comparación Bestfit entre secuencias, disponible en el paquete GCG versión 10.0, usa parámetros de AND GAP= 50 (penalización por creación de espacio) y LEN=3 (penalización por extensión de espacio) y los parámetros equivalentes en las comparaciones de proteínas son GAP=8 y LEN=2.
35 Las variantes de polinucleótidos de la divulgación pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, regiones no codificantes o ambas. Especialmente preferidos son las variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, pero que no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Se prefieren las variantes de nucleótidos producidas mediante sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Además, las variantes polipeptídicas en las que menos de
40 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10 o 5-50, 5-25, 5-10, 1-5, o 1-2 aminoácidos están sustituidos, delecionados o añadidos en cualquier combinación. Las variantes polinucleotídicas se pueden producir por diversas razones, por ejemplo para optimizar la expresión de codones para un huésped concreta (cambio de codones en el ARNm humano a los preferidos por un huésped bacteriano, tal como levaduras o E. coli).
Un polinucleótido de la divulgación que codifica la porción de albúmina de una proteína de fusión de albúmina se
45 optimiza para la expresión en células de levadura o de mamífero. Un polinucleótido que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina se optimiza para la expresión en células de levadura o de mamífero. Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención se optimiza para la expresión en células de levadura o de mamífero.
Un polinucleótido optimizado por codones que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión
50 de albúmina no hibrida con el polinucleótido silvestre que codifica la proteína terapéutica en condiciones de hibridación rigurosas como se describe en el presente documento. Un polinucleótido optimizado por codones que codifica una porción de albúmina de una proteína de fusión de albúmina no hibrida con el polinucleótido silvestre que codifica la proteína de albúmina en condiciones de hibridación rigurosas como se describe en el presente documento. Un polinucleótido optimizado por codones que codifica una proteína de fusión de albúmina no hibrida
55 con el polinucleótido silvestre que codifica la porción de proteína terapéutica o la porción de proteína albúmina en condiciones de hibridación rigurosas como se describe en el presente documento.
En una realización adicional, un polinucleótido que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina no comprende o, como alternativa no consiste en, la secuencia natural de dicha proteína terapéutica. En una realización adicional, un polinucleótido que codifica una porción de proteína albúmina de una 60 proteína de fusión de albúmina no comprende o, como alternativa no consiste en, la secuencia natural de la proteína
albúmina. En una realización alternativa, un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina no comprende o, como alternativa no consiste en, la secuencia natural de una porción de proteína terapéutica o la porción de proteína albúmina.
Las variantes naturales se denominan “variantes alélicas” y hacen referencia a una de las diversas formas
5 alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar a nivel del polinucleótido y/o polipéptido y se incluyen en la presente invención. Como alternativa, las variantes de origen no natural se pueden producir mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.
Usando procedimientos conocidos de ingeniería de proteínas y de tecnología de ADN recombinante se pueden
10 generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, uno o más aminoácidos se pueden delecionar del extremo N o el extremo C del polipéptido de la presente invención sin una pérdida sustancial de la función biológica. Como ejemplo, Ron et al. (J. BioL Chem. 268: 2984-2988 (1993)) notificaron proteínas de KGF variantes que tienen actividad de unión a heparina incluso después de delecionar 3, 8,
o 27 residuos de aminoácidos en el extremo amino. De un modo similar, el interferón gamma exhibió una actividad
15 hasta diez veces mayor después de delecionar 8-10 residuos de aminoácidos del extremo carboxi de esta proteína. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988).)
Además, existen bastante pruebas que demuestran que las variantes a menudo conservan una actividad biológica similar a la de la proteína natural. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993)) realizaron un extenso análisis mutacional de la citoquina IL-1a humana. Usaron mutagénesis aleatoria para generar
20 más de 3.500 mutantes de IL-1a individuales con un cambio medio de 2,5 aminoácidos por variante sobre la longitud completa de la molécula. Se examinaron múltiples mutaciones en cada posible posición de aminoácido. Los investigadores encontraron que “la mayor parte de la molécula podría alterarse con pocos efectos sobre [la unión o la actividad biológica],”. De hecho, solo 23 secuencias de aminoácidos únicas, de más de 3.500 secuencias de nucleótidos analizadas, produjeron una proteína con una actividad significativamente diferente de la silvestre.
25 Además, aunque las deleciones uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C de un polipéptido tengan como resultado una modificación o pérdida de una o más funciones biológicas, todavía se pueden conservar otras actividades biológicas. Por ejemplo, probablemente se conservará la capacidad de una variante de deleción para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la forma secretada cuando se eliminen del extremo N o del extremo C menos de la mayoría de los residuos de la forma secretada. Si un polipéptido concreto que carece de los residuos
30 en el extremo N o el extremo C de una proteína conserva dichas actividades inmunogénicas o no se puede determinar mediante procedimientos de rutina descritos en el presente documento y de otro modo conocidos en la técnica.
Por tanto, la invención también incluye variantes polipeptídicas que tienen una actividad funcional (p. ej., actividad biológica y/o actividad terapéutica). En una realización, la invención proporciona variantes de las proteínas de fusión 35 de albúmina que tienen una actividad funcional (p. ej., actividad biológica y/o actividad terapéutica) que corresponde a una o más actividades biológicas y/o terapéuticas de la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina. En otra realización, la invención proporciona variantes de las proteínas de fusión de albúmina que tienen una actividad funcional (p. ej., actividad biológica y/o actividad terapéutica) que corresponde a una o más actividades biológicas y/o terapéuticas de la proteína terapéutica
40 correspondiente a la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina. Dichas variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de acuerdo con normas generales conocidas en la técnica de un modo que tengan poco efecto sobre la actividad. Los polinucleótidos que codifican dichas variantes también entran dentro de la invención.
En realizaciones preferidas, las variantes de la invención tienen sustituciones conservadoras. Por “sustituciones
45 conservadoras” se pretende intercambiar dentro de los grupos el reemplazo de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu e Ile; el reemplazo de los residuos hidroxilo Ser y Thr, el reemplazo de los residuos ácidos Asp y Glu; el reemplazo de los residuos amida Asn y Gln, el reemplazo de los residuos básicos Lys, Arg e His; el reemplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr y Trp, y el reemplazo de los aminoácidos de tamaño pequeño Ala, Ser, Thr, Met y Gly.
50 Una guía concerniente a cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas se proporcionan en, por ejemplo, Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990), en el que los autores indican que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos que se va a cambiar.
La primera estrategia explota la tolerancia de las sustituciones de aminoácidos mediante selección natural durante el
55 proceso de evolución. Comparando las secuencias de aminoácidos en diferentes especies se pueden identificar aminoácidos conservados. Estos aminoácidos conservados son, probablemente, importantes para la función proteica. Por el contrario, las posiciones de aminoácidos en las que las sustituciones se han tolerado mediante selección natural indican que estas posiciones no son cruciales para la función proteica. Por tanto, las posiciones que toleran la sustitución de aminoácidos se podrían modificar al tiempo que mantienen la actividad biológica de la proteína.
La segunda estrategia usa ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado para identificar regiones cruciales para la función proteica. Por ejemplo, se pueden usar mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis de barrido con alanina (introducción de mutaciones sencillas de alanina
5 en cada residuo en la molécula). Véase Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Se puede analizar la actividad biológica de las moléculas mutantes resultantes.
Como indican los autores, estas dos estrategias han revelado que las proteínas son, sorprendentemente, tolerantes de las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican también qué cambios de aminoácidos es probable que sean permisivos en ciertas posiciones de aminoácidos en la proteína. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos más 10 enterrados (dentro de la estructura terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales apolares, mientras que generalmente se conservan pocas características de las cadenas laterales de la superficie. Además, las sustituciones de aminoácidos conservadoras toleradas implican la sustitución de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu e Ile; el reemplazo de los residuos hidroxilo Ser y Thr, el reemplazo de los residuos ácidos Asp y Glu; el reemplazo de los residuos amida Asn y Gln, el reemplazo de los residuos básicos Lys, Arg e His; el 15 reemplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr y Trp, y el reemplazo de los aminoácidos de tamaño pequeño Ala, Ser, Thr, Met y Gly. Además de la sustitución de aminoácido conservadora, las variantes de la presente invención incluyen (i) polipéptidos que contienen sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos no conservadoras, en los que los residuos de aminoácidos sustituidos pueden o no ser uno codificado por el código genético o (ii) polipéptidos que contienen sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos que tienen un grupo sustituyente o
20 (iii) polipéptidos que se han fusionado con, o conjugado químicamente con, otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la estabilidad y/o la solubilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), (iv) polipéptido que contiene aminoácidos adicionales, tales como, por ejemplo, un péptido de la región de fusión Fc de una IgG. Se estima que dichos polipéptidos variantes están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento.
25 Por ejemplo, las variantes polipeptídicas que contienen sustituciones de aminoácidos de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros pueden producir proteínas con mejores características, tales como menos agregación. La agregación de formulaciones farmacéuticas reduce la actividad e incrementa el aclaramiento debido a la actividad inmunogénica del agregado. Véase Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al, Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et aL, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993).
30 En realizaciones específicas, los polipéptidos de la invención comprenden o, como alternativa consisten en, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de albúmina, en los que los fragmentos o variantes tienen las actividades especificadas en las reivindicaciones y en los que los fragmentos o variantes tienen 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 o 50-150 adiciones, sustituciones y/o deleciones de residuos de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia. En realizaciones preferidas, las
35 sustituciones de aminoácidos son conservadoras. Los ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos también entran dentro de la invención.
El polipéptido de la presente invención puede estar compuesto por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos a parte de los 20 aminoácidos codificados por el gen. Los polipéptidos pueden modificarse mediante procedimientos 40 naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una literatura de investigación voluminosa. Las modificaciones se pueden producir en cualquier punto en un polipéptido, incluida la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o 45 varios grados en varios sitios en un polipéptido dado. Asimismo, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de, por ejemplo, ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales postraduccionales o pueden fabricarse mediante procedimientos sintéticos, Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión 50 covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, 55 adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación y ubiquitinación. (Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,
B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al, Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).
Actividad funcional
“Un polipéptido que tiene actividad funcional” hace referencia a un polipéptido capaz de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con la proproteína de longitud completa y/o forma madura de la proteína terapéutica. Dichas actividades funcionales incluyen, entre otros, la actividad biológica, la antigenicidad [capacidad para unirse (o competir con un polipéptido por la unión) a un anticuerpo anti-polipéptido], la inmunogenicidad (capacidad para generar anticuerpos que se unen a un polipéptido específico de la invención), la capacidad para formar multímeros con polipéptidos de la invención y la capacidad para unirse a un receptor o ligando por un polipéptido.
“Un polipéptido que tiene actividad biológica” hace referencia a un polipéptido que exhibe actividad similar, aunque no necesariamente idéntica, a una actividad de la proteína terapéutica de la presente invención, incluidas las formas maduras, como se mide en un ensayo biológico concreto, con o sin dependencia de la dosis. En el caso de en el que exista dependencia de la dosis, no tiene que ser idéntica a la del polipéptido, sino sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con el polipéptido de la presente invención (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no más de aproximadamente diez veces menos actividad y, más preferentemente, no más de aproximadamente tres veces menos actividad co respecto al polipéptido de la presente invención).
La proteína de fusión de albúmina de la invención tiene actividad GLP-1.
Se puede analizar la actividad funcional (p. ej., la actividad biológica) de las proteínas de fusión de albúmina de la invención usando o modificando de forma rutinaria los ensayos conocidos en la técnica, así como ensayos descritos en el presente documento. Adicionalmente, un experto en la técnica pude analizar de forma rutinaria la actividad de fragmentos de la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina usando ensayos a los que se hace referencia en su correspondiente fila de la tabla 1 (p. ej., en la columna 3 de la tabla 1). Adicionalmente, un experto en la técnica pude analizar de forma rutinaria la actividad de fragmentos de una proteína de albúmina correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina usando ensayos conocidos en la técnica y/o como se ha descrito en la sección Ejemplos más adelante.
Por ejemplo, cuando se analiza la capacidad de una proteína de fusión de albúmina para unirse o competir con la proteína terapéutica por la unión a un anticuerpo anti-polipéptido terapéutico y/o a un anticuerpo anti-albúmina se pueden usar varios inmunoensayos conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos usando técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorción ligada a enzima), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando, por ejemplo, oro coloidal, marcadores enzimáticos o radioisótopos), transferencias de tipo western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación
(p. ej., ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis etc. En una realización de la divulgación, la unión del anticuerpo se detecta detectando un marcador sobre el anticuerpo primario. El anticuerpo primario se detecta detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo frente al anticuerpo primario. Se marca el anticuerpo secundario. En la técnica se conocen muchos medios para detectar la unión en un inmunoensayo.
Cuando se identifica una pareja de unión (p. ej., un receptor o un ligando) de la proteína terapéutica, se puede analizar la unión a dicha pareja de unión mediante una proteína de fusión de albúmina que comprende dicha proteína terapéutica como porción de proteína terapéutica por medio de, por ejemplo, medios bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gen reductora o no reductora, cromatografía de afinidad por proteínas y transferencia de afinidad. Véase, en general, Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995).
La capacidad de la correlación fisiológica de una proteína de fusión de albúmina para unirse a uno o más sustratos del polipéptido terapéutico correspondiente a la porción de proteína terapéutica de la fusión se puede analizar de forma rutinaria usando técnicas conocidas en la materia.
Cuando se está evaluando la capacidad de la proteína de fusión de albúmina, se puede analizar la asociación con otros componentes del multímero, por ejemplo por medios conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gel reductora o no reductora, cromatografía por afinidad de proteínas y transferencia de afinidad. Véase, generalmente, Phizicky et al., ant.
Los ensayos de la capacidad de las proteínas de fusión de albúmina para unirse (específicamente) a una proteína o epítopo específico se pueden realizar en solución (p. ej., Houghten, Bio/Techniques 13:412-421(1992)), sobre perlas
(p. ej., Lam, Nature 354:82-84 (1991)), cobre chips (p. ej., Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), sobre bacterias (p. ej., patente de EE.UU. nº 5.223.409), sobre esporas (p. ej., patente de EE.UU. nº 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), sobre plásmidos (Cull et al., Proc. NatL Acad. Sci. USA 89:1865-1869 (1992)) o sobre fagos (p. ej., Scott and Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:63786382 (1990); y Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991)).
La afinidad de unión de una proteína de fusión de albúmina a una proteína, antígeno o epítopo y la tasa de disociación de una interacción proteína de fusión de albúmina – antígeno/epítopo se puede determinar mediante ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígenos marcados (p. ej., 3H o 125I) con la proteína de fusión de albúmina de la
5 invención en presencia de cantidades crecientes de antígeno sin marcar y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad de la proteína de fusión de albúmina por una proteína, antígeno o epítopo específico y las tasas de disociación de la unión se pueden determinar a partir de los datos obtenidos mediante análisis del gráfico del trazado. La competición con una segunda proteína que se une a la misma proteína, antígeno o epítopo como las proteínas de fusión de albúmina también se puede determinar usando radioinmunoensayos. En este caso, la proteína, antígeno o epítopo se incuba con una proteína de fusión de albúmina conjugada con un compuesto marcado (p. ej., 3H o 125I) en presencia de cantidades crecientes de una segunda proteína sin marcar que se une a la misma proteína, antígeno o epítopo como la proteína de fusión de albúmina de la invención.
En una realización preferida, el análisis cinético BIACORE se usa para determinar la unión y las tasas de disociación de las proteínas de fusión de albúmina de la invención a una proteína, antígeno o epítopo. El análisis cinético
15 BIACORE™ comprende analizar la unión y la disociación de las proteínas de fusión de albúmina o polipéptidos, antígenos o epítopos específicos de los chips con polipéptidos, antígenos o epítopos o proteínas de fusión de albúmina específicos inmovilizados, respectivamente, sobre su superficie.
Los anticuerpos que se unen a la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión por una proteína o antígeno dado, preferentemente el antígeno al que se unen específicamente. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd inferior a 5 X 10-2 M, 10-2 M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M. Afinidades de unión más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd inferior a 5 X 10-5 M, 10-5 M, 5 X 10-6 M, 10-6M, 5 X 10-7 M, 107 M, 5 X 10-8 M o 10-8 M. Afinidades de unión todavía más preferidas incluyen una constante de disociación o Kd inferior a 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10
25 11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-11 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M, o 10-15 M. El experto en la técnica conocerá otros procedimientos y entran dentro del ámbito de la invención.
Albúmina
Como se ha descrito anteriormente, una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende al menos dos fragmentos o variantes orientados en tándem de la proteína terapéutica y en fragmentos o variantes de la proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de la seroalbúmina humana, que se asocian entre sí, preferentemente mediante fusión genética.
Una realización adicional comprende al menos dos fragmentos o variantes orientados en tándem de una proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de la seroalbúmina humana, que están unidos entre sí mediante conjugación química.
35 Los términos seroalbúmina humana (HSA) y albúmina humana (HA) se usan en el presente documento de forma intercambiable. Los términos “albúmina” y “seroalbúmina” son más amplios y abarcan seroalbúmina humana (y fragmentos y variantes de las mismas), así como albúmina de otra especie (y fragmentos y variantes de los mismos).
Como se usa en el presente documento, “albúmina” hace referencia en conjunto a la proteína albúmina o a la secuencia de aminoácidos o un fragmento o variante de albúmina, que tienen una o más actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas) de albúmina. En concreto, “albúmina” hace referencia a albúmina humana o fragmentos de la misma (véase, por ejemplo, los documentos EP 201 239, EP 322 094 WO 97/14445, WO95/23857), especialmente la forma madura de la albúmina humana como se muestra el la Figura 1 y la SEC ID Nº 1038, o albúmina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de las mismas.
45 En realizaciones preferidas, la proteína seroalbúmina humana usada en las proteínas de fusión de albúmina de la invención contienen uno o los dos grupos siguientes de mutaciones puntuales con referencia a la SEC ID Nº 1038: Leu-407 a Ala, Leu-408 a Val, Val-409 a Ala y Arg-410 a Ala; o Arg-410 a A, Lys-413 a Gln, y Lys-414 a Gln (véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO95/23857).
En realizaciones todavía más preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención que contienen uno o todos los grupos descritos anteriormente de mutaciones puntuales tienen mejor estabilidad/resistencia a la escisión proteolítica con Yap3p de levadura, lo que permite un incremento de la producción de proteínas de fusión de albúmina recombinantes expresadas en células huésped de levadura.
Como se usa en el presente documento, una porción de albúmina suficiente para prolongar la actividad terapéutica o la semivida de la proteína terapéutica hace referencia a una porción de albúmina de suficiente longitud o estructura 55 para estabilizar o prolongar la actividad terapéutica de la proteína de modo que la semivida de la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina se prolonga o se extiende en comparación con la semivida en estado de no fusión. La porción de albúmina de las proteínas de fusión de albúmina puede comprenden la longitud completa de la secuencia de HA como se ha descrito anteriormente o puede incluir uno o más fragmentos de las
mismas que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de la HA o puede incluir parte o todos los dominios específicos de la HA. Por ejemplo, se pueden usar uno o más fragmentos de HA que abarcan los primeros dos dominios de tipo inmunoglobulina. En una
5 realización preferida, el fragmento de la HA es la forma madura de la HA.
La porción de albúmina de las proteínas de fusión de albúmina de la invención puede ser una variante de la HA normal. La porción de proteína terapéutica de las proteínas de fusión de albúmina de la invención también puede ser variantes de las proteínas terapéuticas como se ha descrito en el presente documento. El término “variantes” incluye inserciones, deleciones y sustituciones, tanto conservadoras o no conservadoras, cuando dichos cambios no alteran
10 sustancialmente uno o más de las propiedades oncóticas, de unión a ligando útiles y no inmunogénicas de la albúmina, o el sitio activo, o el dominio activo, que confiere las actividades terapéuticas de las proteínas terapéuticas.
En concreto, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana, por ejemplo dichos fragmentos divulgados en el documento
15 (EP 322 094 (es decir, HA (Pn), donde n es de 369 a 419). La albúmina puede proceder de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo un ser humano, una vaca, una oveja o un cerdo. Las albúminas que no proceden de mamífero incluyen, entre otros, de gallina y de salmón. La porción de albúmina de la proteína de fusión de albúmina puede proceder de un animal diferente a la porción de proteína terapéutica.
En términos generales, un fragmento o variante de HA tendrá una longitud de al menos 100 aminoácidos,
20 preferentemente una longitud de al menos 150 aminoácidos. La variante de la HA pude consistir en, o, como alternativa comprender, al menos un dominio completo de la HA, por ejemplo el dominio 1 (aminoácidos 1-194 de la SEC ID Nº 1038), el dominio 2 (aminoácidos 195-387 de SEC ID Nº 1038), el dominio 3 (aminoácidos 388-585 de SEC ID Nº 1038), los dominios 1 y 2 (1-387 de SEC ID Nº 1038), los dominios 2 y 3 (195-585 de SEC ID Nº 1038) o los dominios 1 y 3 (los aminoácidos 1-194 de SEC ID Nº 1038 y los aminoácidos 388-585 de SEC ID Nº 1038). Cada
25 dominio está formado por dos subdominios homólogos, es decir 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 and 512-585, con regiones ligadores entre subdominios flexibles que comprenden residuos de Lys106 a Glu119, Glu292 a Val315 y Glu492 a Ala511.
Preferentemente, la porción de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende al menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservadoras de la misma. Si la fusión se basa en
30 subdominios, parte o todo el ligador adyacente se usa, preferentemente, para unir al resto de proteína terapéutica.
Demostración de la actividad terapéutica o profiláctica
Los compuestos y composiciones de la invención se analizan, preferentemente, in vitro y, después, in vivo, para determinar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes del uso en seres humanos. Por ejemplo, los ensayos in vitro para demostrar la utilidad terapéutica o profiláctica de un compuesto o composición farmacéutica 35 incluyen el efecto de un compuesto sobre una línea celular o una muestra de tejido del paciente. El efecto del compuesto o composición sobre la línea celular y/o la muestra de tejido se puede determinar usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica, incluidos, entre otros, ensayos de formación de rosetas y ensayos de lisis celular. Ensayos in Vitro que se pueden usar para determinar si está indicada la administración de un compuesto específico incluyen ensayos in Vitro de cultivos celulares en los que una muestra de tejido del paciente se cultiva y
40 se expone a un compuesto, o, de otro modo se administra un compuesto, y se observa el efecto de dicho compuesto sobre la muestra de tejido.
Administración y composición terapéutica/profiláctica
El compuesto o composición farmacéutica de la invención se puede usar para el tratamiento, inhibición y profilaxis mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz. En una realización preferida, el compuesto está
45 sustancialmente purificado (p. ej. sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). Preferentemente, el sujeto es un animal, incluyendo, entre otros, animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros etc. y, preferentemente, es un mamífero y, más preferentemente, un ser humano.
Anteriormente se han descrito formulaciones y procedimientos de administración que se pueden usar cuando el
50 compuesto comprende un ácido nucleico o una inmunoglobulina; formulaciones y vías de administración adecuadas adicionales se pueden seleccionar de entre las descritas en el presente documento más adelante.
Se conocen varios sistemas de liberación y se pueden usar para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu, y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), 55 construcción de un ácido nucleico como parte de un retrovirus u otro vector etc. Los procedimientos de introducción incluyen, entre otros, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos o composiciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de los revestimientos epitelial o mucocutáneo (p.
ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica u oral. Además, puede ser deseable introducir los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluida la inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante in catéter
5 intraventricular, por ejemplo fijado a un depósito, tal como un depósito de Ommaya. La administración pulmonar también se pueden emplear mediante, por ejemplo, el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente formador de aerosoles.
Puede ser deseable administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que necesite dicho tratamiento, esto se puede conseguir mediante, por ejemplo y sin limitaciones, infusión local
10 durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo junto con un vendaje para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, o por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo dicho implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. Cuando se administra una proteína, incluido un anticuerpo, se deben tomar precauciones para usar materiales que no absorban la proteína.
15 El compuesto o composición se puede liberar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pág. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pág. 317-327; véase, en general, ibid.)
El compuesto o composición se puede liberar en un sistema de liberación controlada. Se puede usar una bomba
20 (véase, Langer, ant.; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed Eng. 14:201 (1987); Buchwald, y col., Surgery 88:507 (1980); Saudek, y col., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). Se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., MacromoL Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy et al., Science 228:190 (1985); During et
25 al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J.Neurosurg. 71:105 (1989)). Un sistema de liberación controlada se puede colocar cerca de la diana terapéutica, es decir el cerebro, de modo que sólo se requiera una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, voL 2, pág. 115-138 (1984)).
Otros sistemas de liberación controlada se tratan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
30 Cuando el compuesto de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para estimular la expresión de su proteína codificada, construyéndola como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y administrarla de modo que pase a ser intracelular, por ejemplo mediante el uso de un vector retroviral (véase la patente de EE.UU. nº 4.980.286) o mediante inyección directa o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (p. ej., una pistola génica; Biolistic, Dupont), o revistiendo con lípidos o receptores
35 de superficie celular o agentes de transfección, o mediante administración en unión con un péptido similar a la homeocaja que se sepa que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot y coI., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991)), etc. Como alternativa, un ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula huésped para expresión mediante recombinación homóloga.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprende una
40 cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término “vehículo” refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la terapéutica. Dichos vehículos farmacéuticos
45 pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen en petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Un vehículo preferido es agua, cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Como vehículos líquidos se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta,
50 arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada desecada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede también contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o tamponadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como supositorio, con
55 aglutinantes tradicionales y vehículos, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándar, tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, a menudo en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la
60 forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
La composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición puede también incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lignocaína, para aliviar el dolor en el punto de la inyección. En 5 general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria como, por ejemplo, polvo liofilizado seco o concentrado sin agua, en un envase sellado herméticamente, tal como una ampolla
o un sobre, indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar mediante infusión, se puede dispensar con un bote de infusión que contiene agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyectables o solución salina de modo que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.
Los compuestos de la invención se pueden formular como formas salinas o neutras. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico etc., y las formadas con cationes, tales como los que derivan de sodio, potasio, amoniaco, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína etc.
15 La cantidad del compuesto de la invención que será eficaz en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión aberrante y/o actividad de una proteína terapéutica se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro pueden emplearse, opcionalmente, para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o trastorno y se decidirá de acuerdo con el juicio del médico encargado y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo con modelos animales o in vitro.
Proteínas de fusión de la albúmina
La presente invención se refiere a proteínas de fusión de albúmina como se ha definido anteriormente y en las reivindicaciones, y al uso de dichas proteínas de fusión de albúmina en el tratamiento, prevención o mejora de las 25 enfermedades o trastornos. Como se usa en el presente documento, “proteína de fusión de alúmina” se refiere a una proteína formada mediante la fusión de al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) con al menos dos moléculas orientadas en tándem de la proteína terapéutica (en el presente documento GLP-1) (o fragmento o variante de la misma), en la que dicha proteína tiene la actividad especificada en las reivindicaciones. Una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende al menos dos fragmentos o variantes orientados en tándem de la proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de la seroalbúmina humana, que se asocian entre sí mediante, preferentemente, fusión genética (es decir, la proteína de fusión de albúmina se genera mediante traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica toda o una porción de la proteína terapéutica está unido en el marco con un polinucleótido que codifica toda o una parte de la albúmina) o entre sí. La proteína terapéutica y la proteína albúmina, una vez parte de la proteína de fusión de albúmina, puede, cada uno,
35 denominarse “porción”, “región” o “resto” de la proteína de fusión de albúmina.
En una realización preferida, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 1 o la tabla 2. Los polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión de albúmina también entran en la invención.
Proteínas de fusión de albúmina preferidas de la invención incluyen proteínas de fusión de albúmina codificadas por una molécula de ácido nucleico que comprende o, como alternativa que consiste en, un polinucleótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o fragmento o variante de la misma) unida en el marco con al menos un polinucleótido que codifica al menos dos moléculas orientadas en tándem de la proteína terapéutica (o fragmento o variante de la misma); una molécula de ácido nucleico que comprende, o, como alternativa, que consiste en, un polinucleótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) unida en el 45 marco con al menos dos moléculas orientadas en tándem de la proteína terapéutica (o fragmento o variante de la misma) generada como se ha descrito en la tabla 1, la tabla 2 o en los ejemplos; o una molécula de ácido nucleico que comprende, o, como alternativa, que consiste en, un polinucleótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) unida en el marco con al menos un polinucleótido que codifica al menos dos moléculas orientadas en tándem de la proteína terapéutica (o fragmento o variante de las mismas), que además comprenden, por ejemplo, uno o más de los elementos siguientes: (1) un vector de autorreplicación funcional (incluido, entre otros, un vector lanzadera, un vector de expresión, un vector de integración y/o un sistema de replicación), (2) una región para el inicio de la transcripción (p. ej., una región promotora, tal como, por ejemplo, un promotor regulable o inducible, un promotor constitutivo), (3) una región para la terminación de la transcripción,
(4) una secuencia líder y (5) un marcador seleccionable.
55 En una realización, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o, como alternativa, que consiste en, al menos dos proteínas terapéuticas orientadas en tándem (p. ej., como se describe en la tabla 1) y una proteína seroalbúmina. En otras realizaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en, al menos dos fragmentos orientados en tándem biológicamente activos y/o terapéuticamente activos de la proteína terapéutica y una proteína seroalbúmina. En otras realizaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en, al menos dos variantes orientadas en tándem biológicamente activas y/o terapéuticamente activas de la proteína terapéutica y una proteína seroalbúmina. En realizaciones preferidas, el componente de proteína albúmina en suero de la proteína de fusión de albúmina es la porción madura de la seroalbúmina.
En otras realizaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende o, como
5 alternativa, que consiste en, al menos dos proteínas terapéuticas orientadas en tándem y un fragmento biológicamente activo y/o terapéuticamente activo de la seroalbúmina. En otras realizaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en, al menos dos proteínas terapéuticas orientadas en tándem y/o una variante biológicamente activa y/o terapéuticamente activa de la seroalbúmina. En realizaciones preferidas, la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina
10 es la porción madura de la proteína terapéutica.
En otras realizaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en, al menos dos fragmentos o variantes orientados en tándem biológicamente activos y/o terapéuticamente activos de una proteína terapéutica y un fragmento o variante biológicamente activo y/o terapéuticamente activo de seroalbúmina. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una proteína de
15 fusión de albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en, la porción madura de la proteína terapéutica y la porción madura de la seroalbúmina
Preferentemente, la proteína de fusión de albúmina comprende HA como la porción en el extremo N y la proteína terapéutica como la porción en el extremo C. Como alternativa, también se puede usar una proteína de fusión de albúmina que comprende HA como la porción en el extremo C y la proteína terapéutica como la porción en el
20 extremo N.
En otras realizaciones, la proteína de fusión de albúmina tiene la proteína terapéutica fusionada tanto al extremo N como al extremo C de la albúmina. En una realización preferida, las proteínas terapéuticas fusionadas en los extremos N y C son las mismas proteínas terapéuticas. En una realización preferida alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas en los extremos N y C son proteínas terapéuticas diferentes. En otra realización preferida, 25 las proteínas terapéuticas fusionadas en los extremos N y C son proteínas terapéuticas diferentes que se pueden usar para tratar o prevenir la misma enfermedad, trastorno o afección o una relacionada (p. ej., como se indica en la columna “Indicación preferida Y” de la tabla 1). En otra realización preferida, las proteínas terapéuticas fusionadas en los extremos N y C son proteínas terapéuticas diferentes que se pueden usar para tratar, mejorar o prevenir enfermedades o trastornos (p. ej., como se indica en la columna “Indicación preferida Y” de la tabla 1), que se
30 conocen en la técnica que se producen de forma habitual en pacientes de forma simultánea, concurrente o consecutiva o que se producen habitualmente en los pacientes en asociación unas con otras.
Las proteínas de fusión de albúmina abarcan proteínas que contienen uno, dos, tres, cuatro o más moléculas de la proteína terapéutica X o variante de la misma fusionada en el extremo N o C de una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o los extremos N y7o C de la albúmina o variante de la misma. Las moléculas de la proteína
35 terapéutica X, o variantes de las mismas, están presentes en la proteína de fusión de albúmina en orientación en tándem, incluyendo una orientación “cabeza a cola” (p. ej., en las que el extremo C de una molécula de la proteína terapéutica X se fusiona con el extremo N de otra molécula de la proteína terapéutica X).
En una realización, dos, tres o más polipéptidos orientados en tándem de la proteína X (o fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan en el extremo N o C de una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o los extremos
40 N y7o C de la albúmina o variante de la misma.
En otra realización específica, dos, tres, cuatro, cinco o más moléculas orientadas en tándem de GLP-1 se fusionan con el extremo N o C de la albúmina o variante de la misma. Por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más moléculas orientadas en tándem de GLP-1 (incluyendo, entre otras, moléculas de GLP-1 que comprenden, o, como alternativa, que consisten en, los aminoácidos 7 a 36, estando el residuo 8 mutado desde una alanina a una glicina) (Véase, por 45 ejemplo, los mutantes divulgados en la patente de EE.UU. nº . 5,545,618 se fusionan con el extremo N y el extremo C de la albúmina o variante de la misma. Ejemplos de proteínas de fusión de la invención que contienen múltiples porciones de proteína de GLP-1 incluyen, entre otras, GL1-GLP1-HSA, HSA-GLP1-GLP1, GLP1 mutante-GLP1 mutante-HSA, HSA-GLP1 mutante-GLP1 mutante, GLP1 mutante-GLP1-HSA, HSA-GLP1 mutante-GLP1, GLP1-GLP1 mutante-HSA o HSA-GLP1-GLP1 mutante. Realizaciones particularmente preferidas son fusiones en tándem
50 de GLP-1 tales como la construcción ID Nº 3070 y la proteína codificada por dicha construcción.
Las proteínas de fusión de albúmina abarcan además proteínas que contienen uno, dos, tres, cuatro o más de las proteínas terapéuticas X dadas o variante de la misma fusionada en el extremo N o C de una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o los extremos N y7o C de la albúmina o variante de la misma, en las que las moléculas están unidas a través de ligadores peptídicos. Ejemplos incluyen los ligadores peptídicos descritos en la patente de 55 EE.UU. Nº 5,073,627. Las proteínas de fusión de albúmina que comprenden muchos polipéptidos de la proteína terapéutica X mediante ligadores peptídicos se pueden producir usando tecnología de ADN recombinante convencional. Los ligadores son particularmente importantes cuando fusionan un péptido pequeño con la molécula de HSA grande. El propio péptido puede ser un ligador fusionando copias en tándem del péptido (véase, por ejemplo, GLP-1) o se pueden usar otros ligadores conocidos. Las construcciones que incorporan ligadores se
describen en la tabla 2 o son evidentes al examina la SEC ID Nº Y.
Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden producir fusionando la proteína terapéutica X o variantes de la misma al extremo N y/o el extremo C de la albúmina o variantes de la misma de un modo tal que permita la formación de formas multiméricas intramoleculares y/o intermoleculares. En una realización 5 de la invención, las proteínas de fusión de albúmina pueden estar en formas monoméricas o multiméricas (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores). En una realización adicional de la invención, la porción de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina puede estar en forma monomérica o multimérica (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores). En una realización específica, la porción de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina está en forma multimérica (es decir, dímeros, trímeros,
10 tetrámeros y multímeros superiores) y la porción de la proteína albúmina está en forma monomérica.
Además de las proteínas de fusión de albúmina en las que la porción de albúmina está fusionada en el extremo N y/o el extremo C de la porción de proteína terapéutica, las proteínas de fusión de albúmina también se pueden producir insertando la proteína terapéutica o péptido de interés (p. ej., una proteína terapéutica X como se divulga en la tabla 1) en una región interna de la HA. Por ejemplo, dentro de la secuencia de la proteína de la molécula de HA, 15 existe un número de bucles o giros entre el extremo y el comienzo de las a-hélices, que se estabilizan mediante puentes disulfuro. Los bucles, como se determina a partir de la estructura cristalina de la HA (identificadores de ODB 1A06, 1BJ5, 1BKE, 1BM0, 1E7E a 1E7I y 1UOR) para la mayoría se alejan del cuerpo de la molécula. Estos bucles son útiles para la inserción, o fusión interna, de péptidos terapéuticamente activos, particularmente los que requieren una estructura secundaria para ser funcionales, o proteínas terapéuticas, para generar esencialmente una molécula
20 de albúmina con actividad biológica específica.
Los bucles en la estructura de la albúmina humana en la que se pueden insertar péptidos o polipéptidos para generar proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen: Val54-Asn61, Thr76-Asp89, Ala92-Glu100, Gln170-Ala176, His 247 - Glu252, Glu 266 - Glu277, Glu 280-His288, Ala362-Glu368, Lys439-Pro447, Val462-Lys475, Thr478-Pro486 y Lys560-Thr566. En realizaciones más preferidas, los péptidos o polipéptidos se insertan
25 en los bucles de Val54-Asn61, Gln170-Ala176 y/o Lys560-Thr566 de la albúmina humana madura (SEC ID Nº 1 038).
Los péptidos que se van a insertar pueden proceder de bibliotecas de péptidos sintéticos o de expresión en fagos en las que se ha buscado actividad biológica específica o de porciones activas de una molécula con la función deseada. Adicionalmente, las bibliotecas de péptidos aleatorios se pueden generar dentro de bucles concretos o mediante
30 inserciones de péptidos aleatorizados en bucles concretos de la molécula de HA y en los que se representan toadas las posibles combinaciones de aminoácidos.
Dichas bibliotecas podrían generarse en HA o en fragmentos de dominios de HA mediante uno de los procedimientos siguientes:
mutación aleatorizada de aminoácidos dentro de uno o más bucles peptídicos de HA o de fragmentos de dominios 35 de HA. Uno o más o todos los residuos dentro de un bucle se podrían mutar de este modo:
sustitución de, o inserción en, uno o más bucles de HA o de fragmentos de dominio de HA (es decir fusión interna) de uno o más péptidos aleatorizados de longitud Xn (en el que X es un aminoácido y n es el número de residuos;
Fusiones de péptido/proteína en los extremos N-, C- o N- y and C- además de (a) y/o (b).
La HA o el fragmento del dominio de HA puede también hacerse multifuncional injertando los péptidos derivados de 40 diferentes selecciones de diferentes bucles frente a dianas distintas en la misma HA o el mismo fragmento de dominio de HA.
En realizaciones preferidas, los péptidos insertados en un bucle de seroalbúmina humana son fragmentos de péptidos o variantes de péptidos de las proteínas terapéuticas divulgadas en la tabla 1. Más particularmente, la invención abarca proteínas de fusión de albúmina que comprenden fragmentos peptídicos o variantes peptídicas de 45 una longitud de al menos 7 al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35 o al menos 40 aminoácidos insertados en un bucle de la seroalbúmina humana. La invención también abarca proteínas de fusión de albúmina que comprenden fragmentos peptídicos o variantes peptídicas de una longitud de al menos 7 al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 50 35 o al menos 40 aminoácidos fusionados en el extremo N de la seroalbúmina humana. La invención también abarca proteínas de fusión de albúmina que comprenden fragmentos peptídicos o variantes peptídicas de una longitud de al menos 7 al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35 o al menos 40 aminoácidos fusionados en el extremo C de la seroalbúmina humana. Por ejemplo, se pueden insertar péptidos cortos descritos en las tablas 1 y 2
55 (p. ej., proteína terapéutica Y) en los bucles de albúmina.
En general, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden tener una región derivada de HA y una región derivada de la proteína terapéutica. No obstante, se pueden usar múltiples regiones de cada proteína para elaborar una proteína de fusión de albúmina de la invención. De un modo similar, se puede usar más de una proteína terapéutica para elaborar una proteína de fusión de albúmina de la invención. Por ejemplo, la proteína terapéutica se puede fusionar a lo extremos N y C de la HA. En dicha configuración, las porciones de proteína terapéutica pueden ser moléculas de proteína terapéutica iguales o diferentes. La estructura de las proteínas de
5 fusión de albúmina bifuncional se puede representar como: X-HA-Y o Y-HA-X.
Las proteínas de fusión de albúmina bi o multifuncionales también se pueden preparar de modo que se dirijan a la porción de proteína terapéutica de una fusión con un órgano o tipo de célula diana mediante proteína o péptido en el extremo opuesto de la HA.
Como alternativa a la fusión de moléculas terapéuticas conocidas, los péptidos podrían obtenerse mediante
10 detección selectiva de bibliotecas construidas como fusiones en los extremos N, C o N y C de la HA, o un fragmento del dominio de la HA, de normalmente 6, 8, 12, 20 o 25 o Xn (donde X es un aminoácido (aa) y n equivale el número de residuos) de aminoácidos aleatorizados y en las que están representadas todas las posibles combinaciones de aminoácidos. Una ventaja concreta de este “enfoque es que los péptidos se pueden seleccionar in situ sobre la molécula de HA y las propiedades del péptido serían, por tanto, las seleccionadas más que las potencialmente
15 modificadas, como podría ser el caso para un péptido derivado mediante cualquier otro procedimiento que no sea la unión a HA.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden incluir un péptido ligador entre las porciones fusionadas para proporcionar mayor separación física entre los restos y, por tanto, maximizar la accesibilidad de la porción de proteína terapéutica para, por ejemplo, unirse a su receptor específico. El péptido
20 ligador puede consistir en aminoácidos de modo que sea flexible o más rígido.
La secuencia ligadora puede ser escindible por una proteasa o químicamente, para dar el resto relacionado con la hormona de crecimiento. Preferentemente, la proteasa es una producida de forma natural por el huésped, por ejemplo la proteasa kex2 de S. cerevisiae o proteasas equivalentes.
Por tanto, como se ha descrito anteriormente, las proteínas de fusión de albúmina pueden tener la siguiente fórmula
25 R1-L-R2; R2-L-R1; o R1-L-R2-L-R1, en la que R1 es al menos una proteína terapéutica, péptido o secuencia polipeptídica y no necesariamente la misma proteína terapéutica, L es un ligador y R2 es una secuencia de seroalbúmina.
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención que comprenden la proteína terapéutica tienen una semivida prolongada en comparación con la semivida de la misma proteína terapéutica
30 cuando no está fusionada con la albúmina. Normalmente, semivida se refiere al periodo de tiempo durante el cual la actividad terapéutica de la proteína terapéutica en solución o en alguna otra formulación de conservación es estable sin una pérdida indebida de actividad terapéutica. Muchas de las proteínas terapéuticas son muy lábiles en su estado sin fusionar. Como se ha descrito más adelante, la semivida típica de estas proteínas terapéuticas es marcadamente prolongada tras la incorporación en la proteína de fusión de albúmina de la invención.
35 Las proteínas de fusión de albúmina de la invención con una semivida “prolongada” o “extendida” exhiben mayor actividad terapéutica con respecto a un patrón que se ha sometido a las mismas condiciones de almacenamiento y de manipulación. El patrón puede ser la proteína terapéutica de longitud completa sin fusionar. Cuando la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es un análogo, una variante o, por otro lado, está alterada
o no incluye la secuencia completa para dicha proteína, la prolongación de la actividad terapéutica puede
40 compararse, como alternativa, con el equivalente sin fusionar de dicho análogo, variante, péptido alterado o secuencia incompleta. Como ejemplo, una proteína de fusión de albúmina de la invención puede conservar más de aproximadamente 100 % de la actividad terapéutica o más de aproximadamente 105 %, 110 %, 120 %, 130 %, 150 % o 200 % de la actividad terapéutica de un patrón cuando se somete a las mismas condiciones de almacenamiento y de manipulación que el patrón cuando se comparan en un punto de tiempo dado.
45 La semivida también se puede evaluar en términos de actividad terapéutica restante después del almacenamiento normalizada con respecto a la actividad terapéutica cuando comenzó el almacenamiento. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención con semivida prolongada o extendida exhibida mediante una actividad terapéutica prolongada o extendida pueden conservar más de aproximadamente el 50 % de la actividad terapéutica, aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 % o 90 % o más de la actividad terapéutica de la proteína terapéutica no
50 fusionada equivalente cuando se somete a las mismas condiciones. Por ejemplo, como se ha tratado en el ejemplo 38, una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprenden la hGH fusionada con la secuencia de HA de longitud completa puede conservar aproximadamente el 80 % o más de su actividad original en solución durante periodos de hasta 5 semanas o más en varias condiciones de temperatura.
Expresión de proteínas de fusión
55 Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden producir como moléculas recombinantes mediante secreción de levaduras, un microorganismo tal como una bacteria, o un ser human o una línea celular animal. Preferentemente, el polipéptido es secretado por las células huésped.
Una realización concreta de la invención comprende una construcción de ADN que codifica una secuencia señal efectiva para dirigir la secreción en levaduras, en particular una secuencia señal derivada de levadura (especialmente, una que es homóloga a la levadura huésped) y la molécula fusionada del primer aspecto de la invención, no habiendo una prosecuencia derivada de levaduras entre la señal y el polipéptido maduro.
5 La señal invertasa de Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo preferido de una secuencia señal derivada de levadura.
Los conjugados del tipo preparado por Poznansky et al., (FEBS Lett. 239:18 (1988)), en los que no se contemplan los polipéptidos preparados por separado están unidos por sobrecruzamiento químico.
La presente divulgación también incluye una célula, preferentemente una célula de levadura transformada para
10 expresar una proteína de fusión de albúmina de la invención. Además de las propias células huésped transformadas, también se divulga un cultivo de dichas células, preferentemente un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo) o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Si se secreta el polipéptido, el medio contendrá el polipéptido, con las células o sin las células, si se han eliminado por filtración o centrifugación. Se conocen y se pueden usar muchos sistemas de expresión, incluyendo bacterias (p. ej., E. coli and Bacillus
15 subtilis), levaduras (p. ej., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris, hongos filamentosos (por ejemplo, Aspergillus), células vegetales, células animales y células de insecto.
Cepas de levadura preferidas para usar en la producción de proteínas de fusión de albúmina son D88, DXY1 y BXP10. D88 [leu2-3, leu2-122, can1, pra1, ubc4] es un derivado de la cepa parental AH22his+ (también conocida como DB1; véase, por ejemplo, Sleep et al. Biotechnology 8:42-46 (1990)). La cepa contiene una mutación leu2 que 20 permite la selección auxotrópica de 2 plásmidos basados en micrones que contienen el gen LEU2. D88 también exhibe una desrepresión de PRB1 en exceso de glucosa. El promotor PRB1 normalmente está controlado por dos puntos de comprobación que monitorizan los niveles de glucosa y la etapa de crecimiento. El promotor se activa en las levaduras silvestres tras la depleción de glucosa y la entrada en fase estacionaria. La cepa D88 exhibe la represión por glucosa pero mantiene la inducción tras la entrada en fase estacionaria. El gen PRA1 codifica una 25 proteasa vacuolar de levadura, una endoproteasa A de YscA, que se localiza en el RE. El gen ABC4 está en la ruta de ubiquitinación y está implicado en el uso de las proteínas anormales y de vida corta como objetivo para la degradación dependiente de ubiquitina. Se descubrió que el aislamiento de esta mutación ubc4 aumentaba el número de copias de un plásmido de expresión en la célula y producía un incremento del nivel de expresión de una proteína deseada expresada a partir del plásmido (véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO99/00504).
30 DXY1, un derivado de D88, tiene el genotipo siguiente: [leu2-3, leu2-122, can1, pra1, ubc4, ura3::yap3]. Además de las mutaciones aisladas en D88, esta cepa también es defectiva en la proteasa YAP3. Esta proteasa produce la escisión de la mayoría de los residuos dibásicos (RR, RK, KR, KK), pero también puede estimular la escisión en residuos básicos sencillos en las proteínas. El aislamiento de esta mutación yap3 tuvo como resultado mayores niveles de producción de HSA de longitud completa (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.965.386 y Kerry
35 Williams et al., Yeast 14:161-169 (1998)).
BXP10 tiene el genotipo siguiente: leu2-3, leu2-122, can1, pra1, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp150::LYS2, pmt1::URA3. Además de las mutaciones aisladas en DXY1, esta cepa también es defectiva en el gen PMT1 y el gen HSP150. El gen PMT1 es un miembro de la familia evolutivamente conservada de la dolicil-fosfato-manosa Omanosiltransferasas (Pmts). La topología de transmembrana de Pmtlp sugiere que es una proteína integral de
40 membrana del retículo endoplásmico con una función en la glucosilación unida a O. Esta mutación sirve para reducir/eliminar la glucosilación unida a O de las fusiones de HSA (véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO00/44772).
Los estudios revelaron que la proteína Hsp150 se separa de forma ineficiente de la rHA mediante cromatografía de intercambio iónico. La mutación en el gen HSP150 elimina un potencial contaminante que se ha demostrado que es 45 difícil de eliminar mediante técnicas de purificación estándar. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº
5.783.423.
La proteína deseada se produce de formas convencionales, por ejemplo a partir de una secuencia de codificación insertada en el cromosoma del huésped o en un plásmido libre. Las levaduras se transforman con una secuencia de codificación para la proteína deseada en cualquiera de las formas habituales, por ejemplo electroporación. Los
50 procedimientos para la transformación de levaduras mediante electroporación se divulgan en Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182.
Las células transformadas con éxito, es decir las células que contienen una construcción de ADN de la presente invención, se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de una construcción de expresión se pueden cultivar para producir el polipéptido deseado. Las células se pueden
55 recoger y lisar y analizar su contenido en ADN determinar la presencia del ADN usando un procedimiento como el descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 o Berent et al. (1985) Biotech. 3, 208. Como alternativa, la presencia de la proteína en el sobrenadante se puede detectar usando anticuerpos.
Los vectores plasmídicos de levaduras útiles incluyen pRS403-406 y pro413-416 y generalmente están disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos de integración en levaduras ((YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, 7RP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos del centrómero de levadura (Ycps).
Vectores preferidos para fabricar proteínas de fusión de albúmina para expresión en levaduras incluyen pPPC0005,
5 pScCHSA, pScNHSA y pC4:HSA, que se describen con detalle en el Ejemplo 1. La figura 2 muestra un mapa del plásmido pPPC0005 que se puede usar como vector base en el que se pueden clonar los polinucleótidos que codifican las proteínas terapéuticas para formar fusiones de HA. Contiene un promotor PRB1 de S. cerevisiae (PRB1p), una secuencia líder de fusión (FL), ADN que codifica HA (rHA) y una secuencia de terminación de S. cerevisiae ADH1. La secuencia de la secuencia líder de fusión consiste en los primeros 19 aminoácidos del péptido
10 señal de la seroalbúmina humana (SEC ID Nº 1094) y los últimos cinco aminoácidos del promotor del factor de apareamiento 1 (SLDKR, véase el documento EP-A-397 319).
Los plásmidos pPPC0005, pScCHSA, pScNHSA y pC4:HSA se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 0-2209, el 11 de abril de 20010 y con los números de acceso ATCC PTA-3278, PTA-3276, PTA-3279, and PTA-3277, respectivamente. Otro vector útil para expresar
15 una proteína de fusión de albúmina en levaduras es el vector pSAC35 que se describe en Sleep et al., BioTechnology 8:42 (1990).
Otro promotor de lavadura que se puede usar para expresar la proteína de fusión de albúmina es el promotor MET25. Véase, por ejemplo, Dominik Mumburg, Rolf Muller y Martin Funk Nucleic Acids Research, 1994, Vol. 22, No. 25, pp. 5767-5768. El promotor Met25 tiene una longitud de 383 bases (bases -382 a -1) y los genes expresados
20 por este promotor también se conocen como Met15, Met17, and YLR303W. Una realización preferida usa la siguiente secuencia, en la que, en el extremo 5’ de la secuencia siguiente, el sitio Not1 usado en la clonación está subrayado y en el extremo 3', el codón de iniciación ATG está subrayado.
Se han desarrollado varios procedimientos para unir operablemente el ADN a los vectores mediante el extremo cohesivo complementario. Por ejemplo, se pueden añadir tiras de homopolímero complementario al segmento del ADN que se va a insertar en el ADN del vector. El vector y el segmento de ADN se unen después mediante puentes de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinantes.
30 Los ligadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción proporcionan un procedimiento alternativo de unir el segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN generado mediante digestión con endonucleasas de restricción se trata con la ADN polimerasa del bacteriófago T4 o la ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los extremos monocatenarios gamma sobresalientes con sus actividades 3' 5'-exonucleolíticas y llenan los extremos en 3’ rebajados con sus actividades polimerizantes.
35 Por tanto, la combinación de estas actividades genera segmentos de ADN con extremos romos. Después, los segmentos romos se incuban con un exceso molar grande de moléculas ligadoras en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la unión de las moléculas de ADN de extremos romos, tal como la ADN ligasa del bacteriófago T4. Por tanto, los productos de la reacción son segmentos de ADN portadores de secuencias ligadoras poliméricas en sus extremos. Después, estos segmentos de ADN se escinden con la enzima de restricción adecuada y se ligan
40 en un vector de expresión que se ha escindido con una enzima que produce extremos compatibles con los del segmento de ADN.
Los ligadores sintéticos que contienen diversos sitios para endonucleasas de restricción están disponibles comercialmente en una serie de fuentes, incluida International Biotechnologies Inc, New Haven, CT, EE.UU.
Un modo deseable de modificar el ADN de acuerdo con la invención si se van a preparar, por ejemplo, variantes de HA, es usar la reacción en cadena de la polimerasa como divulgan Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491. En este procedimiento, el ADN que se va a amplificar enzimáticamente está flanqueado por dos cebadores oligonucleotídicos específicos que son incorporados en al ADN amplificado. Los cebadores específicos pueden
5 contener sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción que se pueden usar para clonar en vectores de expresión usando procedimientos conocidos en la técnica.
Ejemplos de géneros de levaduras que se ha contemplado que son útiles en la práctica de la presente invención como huéspedes para expresar las proteínas de fusión de albúmina son Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces,
10 Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y similares. Géneros preferidos son los seleccionados del grupo que consiste en Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y Torulaspora. Ejemplos de Saccharomyces spp. son S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxii.
Ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie de Torulaspora adecuada es
T. delbrueckii. Ejemplos de Pichia (Hansenula) spp. son P. angusta (antes H. polymorpha), P. anomala (antes H.
15 anomala) y P. pastoris. Procedimientos para la transformación de S. cerevisiae se enseñan en general en los documentos EP 251 744, EP 258 067 y WO 90/01063, todos ellos incorporados en el presente documento por referencia.
Ejemplos de especies preferidas de Saccharomyces incluyen S. cerevisiae, S. italicus, S. diastaticus y Zygosaccharomyces rouxii. Ejemplos de especies preferidas de Kluyveromyces incluyen K. fragilis yK. lactis. 20 Ejemplos de especies preferidas de Hansenula incluyen H. polymorpha (ahora Pichia angusta), H. anomala (ahora Pichia anomala), y Pichia capsulata. Ejemplos de especies preferidas adicionales de Pichia incluyen P. pastoris. Ejemplos de especies preferidas de Aspergillus incluyen A. niger y A. nidulans. Ejemplos de especies preferidas de Yarrowia incluyen Y. lipolytica. Muchas especies de levaduras preferidas están disponibles en la ATCC. Por ejemplo, las siguientes especies de levadura preferidas están disponibles en la ATCC y son útiles en la expresión de las 25 proteínas de fusión de albúmina. Saccharomyces cerevisiae Hansen, mutante yap3 de la cepa en teleomorfo BY4743 (número de acceso en la ATCC 4022731); Saccharomyces cerevisiae Hansen, mutante hsp150 de la cepa en teleomorfo BY4743 (número de acceso en la ATCC 4021266); Saccharomyces cerevisiae Hansen, BY4743 mutante pmt1 de la cepa en teleomorfo BY4743 (número de acceso en la ATCC 4023792); Saccharomyces cerevisiae Hansen, en teleomorfo (números de acceso en la ATCC 20626; 44773; 44774; y 62995); Saccharomyces 30 diastaticus Andrews y Gilliland ex van der Walt, teleomorfo (número de acceso en la ATCC 62987); Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt, teleomorfo (número de acceso en la ATCC 76492); Pichia angusta (Teunisson et al.) Kurtzman, teleomorfo depositada como Hansenula polymorpha de Morais et Maia, teleomorfo (número de acceso en la ATCC 26012); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfo (número de acceso en la ATCC 9029); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfo (número de acceso en la ATCC 16404); Aspergillus nidulans (Eidam)
35 Winter, anamorfo (número de acceso en la ATCC 48756); y Yarrowia lipolytica (Wickerham et al.) van der Walt et von Arx, teleomorfo (número de acceso en la ATCC 201847).
Promotores adecuados para S. cerevisiae incluyen los asociados con el gen PGKI, los genes GAL1 o GAL10, CYCI, PHOS, TRPI, ADHI, ADH2, los genes para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, triosa fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, glucoquinasa, la feromona
40 factor de apareamiento alfa, [feromona factor de apareamiento a], el promotor PRBI, el promotor GUT2, el promotor GPDI y promotores híbridos que implican híbridos de partes de regiones reguladoras en 5’ con partes de las regiones reguladoras en 5’ de otros promotores o con sitios de activación cadena arriba (p. ej., el promotor del documento EP-A-258 067).
Los promotores regulables convenientes para usar en Schizosaccharomyces pombe están en el promotor reprimible
45 de tiamina del gen nmt como describen Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864 y el promotor del gen reprimible con glucosa como describen Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816.
Procedimientos de transformar Pichia para la expresión de genes extraños se enseñan en, por ejemplo, Cregg et al. (1993), y varias patentes de Phillips (p.ej., el documento US 4 857 467), y los kits de expresión en Pichia están disponibles comercialmente en Invitrogen BV, Leek, Netherlands, and Invitrogen Corp, San Diego, California.
50 Promotores adecuados incluyen AOXI y AOX2. Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 incluyen información sobre vectores de Hansenula y transformación, siendo los promotores adecuados MOX1 y FMD1; mientras que el documento EP 361 991, Fleer et al. (1991) y otras publicaciones de Rhone-Poulenc Rorer enseñan cómo expresar proteínas extrañas en Kluyveromyces spp., siendo un promotor adecuado PGKI.
La señal de terminación de la transcripción es, preferentemente, la secuencia flanqueante en 3’ de un gen
55 eucariótico que contiene señales adecuadas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación. Secuencias flanqueantes en 3’ adecuadas pueden ser, por ejemplo, las del gen unido de forma natural a la secuencia control de la expresión usada, es decir pueden corresponder al promotor. Como alternativa, pueden ser diferentes, en cuyo caso se prefiere la señal de terminación del gen ADHI de S. cerevisiae.
La proteína de fusión de albúmina deseada se puede expresar inicialmente con una secuencia líder de secreción que puede ser cualquier líder eficaz en la levadura escogida. Las líderes útiles en levaduras incluyen cualquiera de
los siguientes: a) la secuencia señal de MPIF-1 (p. ej., los aminoácidos –21 del número de acceso en GenBank AAB51134) MKVSVAALSCLMLVTALGSQA (SEC ID Nº 2132)
5 b) la secuencia señal de la estaniocalcina de (MLQNSAVLLLLVISASA, SEC ID Nº 1054)
c) la región pre-pro de la secuencia señal de HSA (p. ej., MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, SEC ID Nº 1176) d) la región pre de la secuencia señal de HSA (p. ej., MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEC ID Nº 1171) o variantes
de la misma, tales como, por ejemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEC ID Nº 1168) 10 e) la secuencia señal de la invertasa (p. ej., MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEC ID Nº 1108) f) la secuencia señal del factor alfa de apareamiento de levaduras (p. ej., MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTNNGLLFINTTTIASI- AAKEEGVSLEKR, SEC ID Nº 1109 o MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEG- DFDV AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR, SEC ID Nº 1109)
15 g) la secuencia líder de la toxina asesina de K. lactis h) una secuencia señal híbrida (p. ej., MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEC ID Nº 1110) i) una secuencia señal híbrida de HSA/MFa-1 (también conocida como HSA/kex2) (p. ej.,
MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR, SEC ID Nº 1111) j) una secuencia líder de la fusión toxina asesina de K. lactis /MFa-1 (p. ej., MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR,
20 SEC ID Nº 1169) k) la secuencia señal de la inmunoglobulina Ig (p. ej., MGWSCIILFLVATATGVHS, SEC ID Nº 1095) l) la secuencia señal del precursor de la fibulina B (p. ej., MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEC ID
Nº 1096) m) la secuencia señal del precursor de la clusterina (p. ej., MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEC ID Nº 25 1097)
n) la secuencia señal de la proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (p. ej., MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEC ID Nº 1098) o) variantes de la región pre-pro de la secuencia señal de HSA, tal como, por ejemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR (SEC ID Nº1167),
30 MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEC ID Nº 1099), MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEC ID Nº 1100), MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEC ID Nº1101), Líder modificada de HSA HSA Nº 64 MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEC ID Nº 2133);
35 Líder modificada de HSA HSA Nº 66 MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEC ID Nº 2134); Líder (A14) de HSA modificada MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEC ID Nº 1102); Líder (S14) de HSA modificada (también conocida como HSA modificada nº 65)
40 MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEC ID Nº 1103), Líder (G14) de HSA modificada MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEC ID Nº 1104), o MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS (SEC ID Nº 1105)
p) secuencia señal consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEC ID Nº 1055)
q) líder de la fosfatasa ácida (PH05) (p. ej., MFKSVVYSILAASLANA SEC ID Nº 2135)
r) presecuencia de MFoz-1
5 s) presecuencia de 0 glucanasa (BGL2)
t) líder de toxina asesina
u) presecuencia de toxina asesina
v) prepro de la toxina asesina de k. lactis (29 aminoácidos, 16 aminoácidos de pre y 13 aminoácidos de pro)
MNIFYIFLF- LLSFVQGLEHTHRRGSLDKR (SEC ID Nº 2136)
10 w) secuencia líder de la secreción de glucoarrilasa D de S. diastaticus
x) secuencia líder de la secreción de a-galactosidasa (MEL1) S. carlsbergensis
y) secuencia líder de la glucoamilasa de Candida
z) las líderes híbridas divulgadas en el documento EP-A-387 319 (incorporado en el presente documento por
referencia)
15 aa) la secuencia señal de gp67 (junto con sistemas de expresión en baculovirus) (p. ej., los aminoácidos 1-19 del número de acceso en GenBank AAA72759) o
bb) la líder natural de la proteína terapéutica X;
cc) líder de la invertasa de S. cerevisiae (SUC2), como se divulga en el documento JP 62-096086 (concedido
como 911036516, incorporado en el presente documento por referencia); o
20 dd) Inulinasa - MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEC ID Nº 2137).
ee) Una variante de la líder del propéptido TA57 modificada nº 1 – MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVN- LMADDTESAFATQTN SGGLDVVGLISMAKR (SEC ID Nº 2128)
ff) Una variante de la líder del propéptido TA57 modificada nº 2 –
25 MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTISVNLMADDTESAFATQTN SGGLDVVGLISMAEEGEPKR (SEC ID Nº 2129)
Procedimientos adicionales de la producción recombinante y sintética de las proteínas de fusión de albúmina
La presente divulgación también se refiere a vectores que contienen un polinucleótido que codifica una proteína de
30 fusión de albúmina de la presente invención, células huésped y la producción de proteínas de fusión de albúmina mediante técnicas sintéticas y recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un vector fago, un plásmido, un virus
o un retrovirus. Los vectores retrovirales pueden ser competentes en la replicación o defectivos en la replicación. En el último caso, la propagación viral generalmente solo se producirá en las células huésped de complementación.
Los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden unirse a un vector que
35 contiene un marcador seleccionable para su propagación en un huésped. En general, un vector plasmídico se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato cálcico o en un complejo con un lípido cargado. Si e vector es un virus, se puede empaquetar in vitro usando una línea celular de empaquetamiento adecuada y después transducirse en las células huésped.
El inserto polinucleotídico se unirá operativamente a un promotor adecuado, tal como el promotor del fago lambda
40 PL, los promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardíos de SV40 y los promotores de las LTR retrovirales, por citar algunas. El experto en la técnica conocerá otros promotores adecuados. Las construcciones de expresión contendrán además sitios para el inicio y la terminación de la transcripción, y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción de codificación de los transcritos expresados por las construcciones incluirán, preferentemente, un codón de iniciación de la traducción al comienzo y
45 un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado adecuadamente al final del polipéptido que se va a traducir.
Como se ha indicado, los vectores de expresión incluirán, preferentemente, al menos un marcador seleccionable. Dichos marcadores incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa, G418, glutamina sintasa o neomicina para cultivos celulares eucariotas y genes de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivos en E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de huéspedes adecuados incluyen, entre otros, células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces, y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura (p. ej., Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (Nº de acceso en la ATCC 201178)); células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera SF9; células de mamífero, tales como celulasa CHO, COS, NSO, 293 y de
5 melanoma de Bowes; y células vegetales. Medios de cultivo adecuados y las condiciones para las células huésped descritas anteriormente se conocen en la técnica.
Entre los vectores preferidos para usar en bacterias incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles en QIAGEN, Inc.; vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia Biotech, Inc. Entre los
10 vectores eucariotas preferidos se encuentran pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles en Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Vectores de expresión preferidos para usar en sistemas de levaduras incluyen, entre otros, pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, y PA0815 (todos disponibles en Invitrogen, Carlbad, CA). Para el experto en la técnica serán evidentes otros vectores adecuados.
15 En una realización, los polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden fusionar con secuencias señal que dirigirán la localización de una proteína de la invención a compartimentos concretos de una célula procariota o eucariota y/o dirigir la secreción de una proteína de la invención de una célula procariota o eucariota. Por ejemplo, en E. coli, se puede desear dirigir la expresión de la proteína al espacio periplásmico. Ejemplos de las secuencias señal o proteínas (o fragmentos de las mismas) a las que se pueden
20 fusionar las proteínas de fusión de albúmina de la invención con el fin de dirigir la expresión del polipéptido hacia el espacio periplásmico de las bacterias incluyen, entre otros, la secuencia señal pelB, la secuencia señal de la proteína de unión a la maltosa (MBP), MBP, la secuencia señal ompA, la secuencia señal de la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina. Varios vectores están disponibles comercialmente para la construcción de proteínas de fusión dirigirán la localización de una proteína, tal como la serie
25 pMAL de vectores (en particular la serie pMAL-p) disponible en New England Biolabs. En una realización específica, los polinucleótidos de las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden fusionar a la secuencia señal de la pelB pectato liasa para aumentar la eficiencia de la expresión y la purificación de dichos polipéptidos en bacterias gramnegativas. Véanse las patentes de EE.UU. números 5.576.195 y 5.846.818.
Ejemplos de péptidos señal que se pueden fusionar con una proteína de fusión de albúmina de la invención con el 30 fin de dirigir su secreción en células de mamíferos incluyen:
a) la secuencia señal de MPIF-1 (p. ej., los aminoácidos –21 del número de acceso en GenBank AAB51134)
MKVSVA- ALSCLMLVTALGSQA (SEC ID Nº 2132)
b) la secuencia señal de la estaniocalcina de (MLQNSAVLLLLVISASA, SEC ID Nº 1054)
c) la región pre-pro de la secuencia señal de HSA (p. ej., MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, SEC ID Nº 35 1176)
d) la región pre de la secuencia señal de HSA (p. ej., MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEC ID Nº 1177) o variantes
de la misma, tales como, por ejemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEC ID Nº 1168)
e) la secuencia señal de la invertasa (p. ej., MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEC ID Nº 1108)
f) la secuencia señal del factor alfa de apareamiento de levaduras (p. ej.,
40 MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAE- AVIGYSDLEGDFDVAVL PFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR, SEC ID Nº 1109 o MRFPSIFTAVLA- FAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVL PFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR, SEC ID Nº 1109)
g) la secuencia líder de la toxina asesina de K. lactis
45 h) una secuencia señal híbrida (p. ej., MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEC ID Nº 1110)
i) una secuencia señal híbrida de HSA/MFa-1 (también conocida como HSA/kex2) (p. ej.,
MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR, SEC ID Nº 1111)
j) una secuencia líder de la fusión toxina asesina de K. lactis /MFa-1 (p. ej., MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR,
SEC ID Nº 1169)
50 k) la secuencia señal de la inmunoglobulina Ig (p. ej., MGWSCIILFLVATATGVHS, SEC ID Nº 1095)
i) la secuencia señal del precursor de la fibulina B (p. ej., MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEC ID
Nº 1096)
m) la secuencia señal del precursor de la clusterina (p. ej., MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEC ID Nº
1097)
n) la secuencia señal de la proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (p. ej., MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEC ID Nº 1098) o) variantes de la región pre-pro de la secuencia señal de HSA, tal como, por ejemplo,
5 MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR (SEC ID Nº 1167), MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEC ID Nº 1099), MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEC ID Nº 1100), MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEC ID Nº 1101), Líder modificada de HSA HSA Nº 64
10 MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEC ID Nº 2133); Líder modificada de HSA HSA Nº 66 MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEC ID Nº 2134); Líder (A14) de HSA modificada MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEC ID Nº 1102);
15 Líder (S14) de HSA modificada (también conocida como HSA modificada nº 65) MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEC ID Nº 1103), Líder (G14) de HSA modificada MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEC ID Nº 1104), o MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS (SEC ID Nº 1105)
20 p) secuencia señal consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEC ID Nº 1055) q) líder de la fosfatasa ácida (PH05) (p. ej., MFKSVVYSILAASLANA SEC ID Nº 2135) r) presecuencia de MFoz-1 s) presecuencia de 0 glucanasa (BGL2) t) líder de toxina asesina
25 u) presecuencia de toxina asesina
v) prepro de la toxina asesina de k. lactis (29 aminoácidos, 16 aminoácidos de pre y 13 aminoácidos de pro) MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR (SEC ID Nº 2136) w) secuencia líder de la secreción de glucoamilasa II de S. diastaticus x) secuencia líder de la secreción de a-galactosidasa (MEL1) de S. carlsbergensis
30 y) secuencia líder de la glucoamilasa de Candida
z) las líderes híbridas divulgadas en el documento EP-A-387 319 (incorporado en el presente documento por referencia) aa) la secuencia señal de gp67 (junto con sistemas de expresión en baculovirus) (p. ej., los aminoácidos 1-19
del número de acceso en GenBank AAA72759) o 35 bb) la líder natural de la proteína terapéutica X;
cc) líder de la invertasa de S. cerevisiae (SUC2), como se divulga en el documento JP 62-096086 (concedido como 911036516, incorporado en el presente documento por referencia); o dd) Inulinasa - MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEC ID Nº 2137). ee) Una variante de la líder del propéptido TA57 modificada nº 1 –
40 MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGG LDVVGLISMAKR (SEC ID Nº 2128)
ff) Una variante de la líder del propéptido TA57 modificada nº 2 – MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDTESQTTSVNLMADD- TESAFATQTNSG GLDVVGLISMAEEGEPKR (SEC ID Nº 2129)
5 Los vectores que usan la glutamina sintasa (GS) o DHFR como marcadores seleccionables se pueden amplificar en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa es la disponibilidad de líneas celulares (p. ej., la línea celular del mieloma murino NSO) que son negativas para la glutamina sintasa. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en las células que expresan glutamina sintasa (p. ej., células de ovario de hámster chino (CHO)
10 proporcionando inhibidor adicional para evitar el funcionamiento del gen endógeno. Un sistema de expresión de la glutamina sintasa y componentes del mismo se detallan en las publicaciones PCT. WO87/04462; WO86/05807; WO89/01036; WO89/10404 y WO91/06657.
Adicionalmente, los vectores de expresión de glutamina sintasa se pueden obtener en Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). La expresión y la producción de anticuerpos monoclonales usando un sistema de expresión de
15 GS en células de mieloma murino se describe en Bebbington et al., Bio/technology 10:169(1992) y en Biblia y Robinson Biotechnol. Prog. 11:1 (1995).
La presente divulgación también se refiere a células huésped que contienen las construcciones de vectores descritas con anterioridad en el presente documento y adicionalmente abarca células huésped que contienen secuencias de nucleótidos de la invención que están asociadas operablemente con una o más regiones control 20 heterólogas (p. ej., promotor y/o potenciador) usando técnicas conocidas en la materia. La célula huésped puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero (p. ej., una célula derivada de ser humano) o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. Se puede escoger una cepa huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico del modo específico deseado. La expresión de ciertos
25 promotores se puede elevar en presencia de inductores cortina; por tanto, se puede controlar la expresión del polipéptido de ingeniería genética. Además, diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación (p. ej., fosforilación, escisión) traduccional y postraduccional de proteínas. Se pueden escoger líneas celulares adecuadas para garantizar una correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada.
30 La introducción de los ácidos nucleicos y de construcciones de ácido nucleico de la invención en la célula huésped puede efectuarse mediante transfección mediada por fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology, (1986). Específicamente se contempla que los polipéptidos de la presente invención pueden de
35 hecho expresarse en una célula huésped que carece de un vector recombinante.
Además de describir las células huésped que contienen las construcciones del vector tratadas en el presente documento, la divulgación también describe células huésped primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, en particular de origen mamífero, que se han sometido a ingeniería para delecionar o reemplazar el material genético endógeno (p. ej., la secuencia de codificación correspondiente a la proteína terapéutica se puede
40 sustituir por una proteína de fusión de albúmina correspondiente a la proteína terapéutica) y/o incluir material genético (p. ej., se pueden incluir secuencias de polinucleótidos heterólogos tales como, por ejemplo, una proteína de fusión de albúmina de la invención correspondiente a la proteína terapéutica). El material genético asociado operablemente al polinucleótido endógeno puede activar, alterar y/o amplificar los polinucleótidos endógenos.
Además, se pueden usar técnicas conocidas en la materia para asociar operablemente polinucleótidos heterólogos
45 (p. ej., polinucleótidos que codifican una proteína de albúmina, o un fragmento o variante del mismo) y/o regiones control heterólogas (p. ej., promotor y/o potenciador) con secuencias de polinucleótidos endógenos que codifican la proteína terapéutica mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 5.641.670, concedida el 24 de junio de 1997; la publicación internacional número WO 96/29411, la publicación internacional número WO 94/12650; Koller et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al.,
50 Nature 342:435-438 (1989)).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden recuperar y purificar de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos muy conocidos, que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de interacción de
55 carga hidrófoba y cromatografía lectina. Más preferentemente se usa cromatografía de líquidos de alto rendimiento (“HPLC”) para purificación.
En realizaciones preferidas, as proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando cromatografía de intercambio aniónico, incluyendo, entre otras, cromatografía en columnas de Q-sefarosa, sefarosa DEAE, poros HQ, poros DEAE, Toyopearl Q, Toyopearl QAE, Toyopearl DEAE, Resource/Source Q y DEAE, Fractogel Q y DEAE.
En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando cromatografía de intercambio catiónico, incluyendo columnas de SP-sefarosa, CM sefarosa, poros HS, poros CM, Toyopearl SP, Toynpearl CM, Resource/Source S y CM, Fractogel S y CM, y sus equivalentes y comprables.
5 En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando cromatografía de interacción hidrófoba, incluyendo, entre otras, columnas de fenilo, butilo, metilo, octilo, hexil-sefarosa, poros fenilo, butilo, metilo, octilo, hexilo, Toyopead fenilo, butilo, metilo, octilo, hexilo Resource/Source fenilo, butilo, metilo, octilo, hexilo, Fractogel fenilo, butilo, metilo, octilo, hexilo, y sus equivalentes y comparables.
En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando cromatografía
10 de exclusión por tamaño incluyendo, entre otros, columnas de sefarosa S100, S200, S300, de resina superdex y sus equivalentes y comparables.
En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando cromatografía de afinidad incluyendo, entre otros, columnas de afinidad por pigmento mimético y de afinidad por anticuerpo que son selectivos para HSA o las moléculas de “fusión diana”.
15 En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando uno o más procedimientos cromatográficos enumerados anteriormente. En otras realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando una o más de las siguientes columnas de cromatografía. Columna Q sefarosa FF, columna SP Sefarosa FF, columna Q Sefarosa de alto rendimiento, columna Blue Sefarosa FF, columna Blue, columna de fenil Sefarosa FF, columna DEAE Sefarosa FF, o columna de metilo.
20 Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden purificar usando el procedimiento descrito en la publicación internacional PCT WO 00/44772.
Un experto en la técnica podría modificar fácilmente el procedimiento descrito en la misma para usar en la purificación de las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden recuperar de: Productos de procedimientos
25 de síntesis química y productos producidos mediante técnicas recombinantes de un huésped procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilado o pueden no estar glicosilados. Además, las proteínas de fusión de albúmina de al invención pueden incluir también un residuo de metionina inicial modificado, en algunos como
30 resultado de procedimientos mediados por el huésped. Por tanto, en la técnica se conoce bien que la metionina en el extremo N codificada por el codón de iniciación de la traducción generalmente se elimina con una eficiencia elevada de cualquier proteína tras la traducción en todas las células eucariotas. Aunque la metionina en el extremo N de la mayoría de las proteínas también se elimina con eficiencia en la mayoría de los procariotas, para algunas proteínas este procedimiento de eliminación procariota es ineficiente, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al que está
35 unida covalentemente la metionina en el extremo N.
En una realización, se usa la levadura Pichia pastoris para expresar proteínas de fusión de albúmina de la invención en un sistema eucariota. Pichia pastoris es una levadura metiloprófica que puede metabolizar el metanol como su única fuente de carbono. Una etapa principal en la vía de metabolización del metanol es la oxidación del metanol en formaldehído usando O2. Esta reacción es catalizada por la enzima alcohol oxidasa. Con el fin de metabolizar el 40 metanol como su única fuente de carbono, Pichia pastoris debe generar niveles altos de alcohol oxidasa debido, en parte, a la relativamente baja afinidad de la alcohol oxidasa por el O2. En consecuencia, en un medio de crecimiento dependiente de metanol como principal fuente de carbono, la región promotora de uno de los dos genes de la alcohol oxidasa (AOX1) es altamente activa. En presencia de metanol, la alcohol oxidasa producida por el gen AOX1 comprende hasta aproximadamente un 30 % de la proteína soluble total en Pichia pastoris. Véase Ellis, S.B., et al.,
45 Mol. Cell. Biol. 5:1111-21 (1985); Koutz, P.J, et al., Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, J.F., et al., Nucl. Acids Res. 15:3859-76 (1987). Por tanto, una secuencia de codificación heteróloga, tal como, por ejemplo, un polinucleótido de la presente invención, bajo la regulación transcripcional de todo o parte de la secuencia reguladora AOX1 se expresa a niveles excepcionalmente altos en la levadura Pichia cultivada en presencia de metanol.
En un ejemplo, se usa el vector plasmídico pPIC9K para expresar ADN que codifica una proteína de fusión de
50 albúmina de la invención, como se indica en el presente documento, en un sistema de levaduras Pichea esencialmente como se ha descrito en "Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology," D.R. Higgins and J. Cregg, eds. The Humana Press, Totowa, NJ, 1998. Este vector de expresión permite la expresión y la secreción de un polipéptido de la invención en virtud del promotor AOX1 fuerte unido al péptido señal secretor (es decir, líder) de la fosfatasa alcalina (PHO) de Pichia pastoris localizado cadena arriba de un sitio de clonación múltiple.
55 Se podrían usar muchos otros vectores de levadura en lugar de pPIC9K, tales como pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalpha, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K y PAO815, como un experto en la técnica apreciará fácilmente, siempre que la construcción de expresión propuesta proporcione señales localizadas adecuadamente para transcripción, traducción, secreción (si se desea) y similares, incluyendo un AUG dentro de marco, según se requiera.
En otra realización, la expresión de alto nivel de una secuencia de codificación heteróloga, tales como, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, se puede conseguir 5 mediante la clonación del polinucleótido heterólogo de la invención en un vector de expresión tal como, por ejemplo, pGAPZ o pGAPZalpha, y cultivar el cultivo de levaduras en ausencia de metanol.
Además, las proteínas de fusión de albúmina pueden sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas en la materia (p. ej., véase Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., y Hunkapiller et al., Nature, 310:105-111 (1984)). Por ejemplo, un polipéptido correspondiente a un fragmento de un 10 polipéptido se puede sintetizar mediante el uso de un sintetizador peptídico. Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en la secuencia de polipéptidos. Aminoácidos no clásicos incluyen, entre otros, los isómeros D de los aminoácidos comunes ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina,
15 norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, �-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos diseñados tales como �-metil aminoácidos, Cametilaminoácidos, Na-metilaminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrorotatorio) o L (levorotatorio).
La invención abarca proteínas de fusión de albúmina de la presente invención que se modifican de forma diferencial
20 durante o después de la traducción mediante, por ejemplo, entre otros, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo o a otro ligando celular etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas, incluidas, entre otras, escisión química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción,
25 síntesis metabólica en presencia de tunicamicina etc.
Modificaciones postraduccionales adicionales abarcadas por la invención incluyen, por ejemplo, cadenas de hidratos de carbono unidas a O o unidas a N, procesamiento de los extremos en N-terminal o en C-terminal), unión de restos químicos a la estructura de aminoácidos, modificaciones químicas de las cadenas de hidratos de carbono unidas a O o unidas a N, y adición o deleción de un residuo de metionina en el extremo N como resultado de la expresión en
30 células huésped procariotas. Las proteínas de fusión de albúmina también se pueden modificar con un marcador detectable, tal como un marcador enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad, para permitir la detección y el aislamiento de la proteína.
Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y 35 avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina, un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y acuorina, y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen yodo (111I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn), tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno
40 (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr,105Rh, y97Ru.
En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención o fragmentos o variantes de las mismas están unidas a quelantes macrocíclicos que se asocian con iones radiometálicos, incluidos, entre otros, 177Lu, 90Y, 166Ho, y 153Sm, a polipéptidos. En una realización preferida, el ion radiometálico asociado con los 45 quelantes macrocíclicos es 111In. En otra realización preferida, el ion radiometálico asociado con el quelante macrocíclico es 90Y. En realizaciones específicas, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecanoN,N',N",N"'-tetraacético (DOTA). En otras realizaciones específicas, el DOTA se une a un anticuerpo de la invención
o fragmento del mismo a través de una molécula ligadora. Ejemplos de moléculas ligadoras útiles para conjugar DOTA con un polipéptido se conocen habitualmente en la técnica, véase, por ejemplo, Denardo y col., 1998, Clin
50 Cancer Res. 4(10):2483-90 (1998); Peterson et al., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7 (1999); y Zimmerman et al, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50 (1999).
Como se ha mencionado, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden modificar mediante procedimientos naturales, tal como procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el 55 mismo grado o grados variables en varios sitios en un polipéptido dado. Los polipéptidos de la invención pueden estar ramificados como resultado de, por ejemplo, ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales postraduccionales o pueden fabricarse mediante procedimientos sintéticos, Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión 60 covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente
de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de
5 transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación y ubiquitinación. (Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al, Meth Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Arm. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).
10 Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y anticuerpos que se unen a la proteína terapéutica o fragmentos o variantes de las mismas se pueden fusionar con secuencias marcadoras, tal como un péptido, para facilitar la purificación. La secuencia de aminoácidos marcadora puede ser un péptido de hexahistidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQe (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se ha descrito en Gentz et aL, Proc. Natl. Acad. Sci.
15 USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación cómoda de la proteína de fusión. Otras marcas peptídicas útiles para la purificación incluyen, entre otros, la marca de hemaglutinina “HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) y la marca “flag”.
Además, una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede conjugar con un resto terapéutico, tal como
20 una citotoxina, por ejemplo un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo, por ejemplo emisores de alfa, tales como, por ejemplo, 213B. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos incluyen paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramIcina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides,
25 procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (p. ej., metotrexato 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p.ej., mecloretanamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino(II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (e.g., daunorubicina (antes daunomicina) y doxorubicina),
30 antibióticos (p.ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (p.ej., vincristina y vinblastina).
Los conjugados de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, el agente terapéutico o resto farmacológico no debe interpretarse como limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas 35 proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina diftérica; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón ß, factor de crecimiento neural, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (véase la publicación internacional nº WO 97/33899), AIM II (véase la publicación internacional nº WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (véase la 40 publicación internacional nº WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o modificadores de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, linfocinas, interleucina 1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de las colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento. Las técnicas para conjugar dicho resto terapéutico a las proteínas (p. ej., proteínas de fusión de albúmina) son bien
45 conocidas en la materia.
Las proteínas de fusión de albúmina también se pueden unir a soportes sólidos que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación de polipéptidos que están unidos mediante, que se unen a o se asocian con proteínas de fusión de albúmina de la invención. Dichos soportes sólidos incluyen, entre otros, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
50 Las proteínas de fusión de albúmina con o sin un resto terapéutico conjugado a las mismas, administradas solas o en combinación con factor(es) citotóxicos y/o citoquina(s) se pueden usar como agente terapéutico.
La invención también proporciona derivados modificados químicamente de las proteínas de fusión de albúmina de la invención que pueden proporcionar ventajas adicionales, tales como un incremento de la solubilidad, estabilidad y el tiempo en circulación del polipéptido o menor inmunogenicidad (véase la patente de EE.UU. nº 4.179.337). Los
55 restos químicos para la derivación se pueden seleccionar a partir de polímeros hidrosolubles tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Las proteínas de fusión de albúmina se pueden modificar en posiciones aleatorias dentro de la molécula o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.
El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el 60 peso molecular preferido está entre 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado) para facilitar la manipulación y la fabricación. Se pueden usar otros tamaños en función del perfil terapéutico deseado (p. ej., la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si existe alguno, sobre la actividad biológica, la facilidad de la manipulación, el grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del
5 polietilenglicol con una proteína terapéutica o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 o 100,000 kDa.
Como se ha indicado anteriormente, el polietilenglicol puede tener una estructura ramificada. Los polietilenglicoles ramificados se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.43.75; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999).
15 Las moléculas de polietilenglicol (u otros restos químicos) deberán unirse a la proteína teniendo en cuenta los efectos sobre dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existen numerosos procedimientos de unión disponibles para los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, el procedimiento divulgado en el documento EP 0 401 384 (acoplamiento de PEG a G-CSF);
Véase también Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992), que indican pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo. Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse de forma covalente mediante residuos de aminoácidos a través de un grupo reactivo, tal como n grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquéllos a los que se puede unir una molécula de polietilenglicol activado. Los residuos de aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y los residuos de aminoácidos en el extremo N; los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácidos en el
25 extremo C. También se pueden usar grupos sulfhidrilo como grupo reactivo para unir las moléculas de polietilenglicol. Se prefieren para fines terapéuticos la unión en un grupo amino, tal como la unión en el extremo N o el grupo de lisina.
Como se ha sugerido anteriormente, el polietilenglicol se puede unir a las proteínas mediante unión a cualquiera de una serie de residuos de aminoácidos. Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir a proteínas mediante enlaces covalentes a residuos de lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína. Se pueden usar una o más sustancias químicas de reacción para unir el polietilenglicol a residuos de aminoácidos específicos (p. ej., lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína) de la proteína o a más de un tipo de residuo de aminoácido (p. ej., lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y combinaciones de los mismos) de la proteína.
Se puede desear específicamente proteínas modificadas químicamente en el extremo N. Usando polietilenglicol
35 como ilustración de la presente composición, se puede seleccionar a partir de diversas moléculas de polietilenglicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción entre moléculas de polietilenglicol y moléculas de proteína (polipéptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se va a realizar y el procedimiento para obtener la proteína pegilada en el extremo N seleccionada. El procedimiento de obtención de la preparación pegilada en el extremo N (es decir, separar este resto de otros restos monopegilados en caso necesario) se puede realizar mediante purificación del material pegilado en el extremo N de una población de moléculas proteicas pegiladas. Determinadas proteínas modificadas químicamente en la modificación en el extremo N se pueden conseguir mediante alquilación reductora que explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al extremo N) disponible para derivar en una proteína concreta. En las condiciones de reacción adecuadas se consigue una derivación sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N con un
45 polímero que contiene un grupo carbonilo.
Como se ha indicado anteriormente, la pegilación de las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden conseguir por cualquier número de medios. Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir a la proteína de fusión de albúmina bien directamente o mediante un ligador intermedio. En Delgado et aL, Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992); Francis et al., Intern. J. of Hematol. 68:1-18 (1998); patente de EE.UU. nº 4.002.531; patente de EE.UU. nº 5.349.052; el documento WO 95/06058 y el documento WO 98/32466. se describen sistemas sin ligadores para unir el polietilenglicol a las proteínas.
Un sistema para unir el polietilenglicol directamente a los residuos de aminoácidos de proteínas sin un ligador intermedio usa MPEG tresilado, que se produce mediante la modificación de monometoxi polietilenglicol (MPEG) usando cloruro de tresilo (ClSO2CH2CF3). Tras a reacción de la proteína con MPEG tresilado, el polietilenglicol está
55 directamente unido a grupos amina de la proteína. Por tanto, la invención incluye conjugados de proteínapolietilenglicol producidos mediante la reacción de proteínas de la invención con una molécula de polietilenglicol que tiene un grupo 2,2,2-trifluoroetano sulfonilo.
El polietilenglicol se puede unir a proteínas usando una serie de diferentes ligadores intermedios. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.612.460 divulga ligadores de uretano para conectar el polietilenglicol a las proteínas. Los conjugados de proteína-polietilenglicol en los que el polietilenglicol está unido a la proteína mediante un ligador también se pueden producir mediante reacción de las proteínas con compuestos tales como MPEGsuccinimidilsuccinato, MPEG activado con 1,1'-carbonildiimidazol, MPEG-2,4,5-triclorofenilcarbonato, MPEG-pnitrofenolcarbonato y varios derivados de MPEG-succinato. Una serie de derivados de polietilenglicol adicionales y
5 sustancias químicas de reacción para unir el polietilenglicol a las proteínas se describen en la publicación internacional nº WO 98/32466. Los productos proteicos pegilados producidos usando las sustancias químicas de reacción indicadas en el presente documento se incluyen en el alcance de la invención.
El número de restos de polietilenglicol unidos a cada proteína de fusión de albúmina de la invención (es decir, el grado de sustitución) también puede variar. Por ejemplo, las proteínas pegiladas de la invención puede unirse, de
10 media, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, o más moléculas de polietilenglicol. De un modo similar, el grado medio de sustitución dentro de intervalos tales como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 o 18-20 restos de polietilenglicol por molécula de proteína. En, por ejemplo, Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992) se tratan procedimientos para determinar el grado de sustitución.
15 Los polipéptidos de la invención se pueden recuperar y purificar a partir de síntesis química y cultivos de células recombinantes mediante procedimientos estándar, que incluyen, entre otros, precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de interacción de carga hidrófoba y cromatografía con lectina. Más preferentemente se usa cromatografía de líquidos
20 de alto rendimiento (“HPLC”) para purificación. Se pueden emplear técnicas muy conocidas para replegar proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante el aislamiento y/o la purificación.
La presencia y la cantidad de proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden determinar usando ELISA, un inmunoensayo bien conocido en la técnica. En un protocolo de ELISA que sería útil para detectar/cuantificar las 25 proteínas de fusión de albúmina de la invención comprende las etapas de recubrir una placa de ELISA con un anticuerpo anti-seroalbúmina humana, bloquear la placa para prevenir la unión inespecífica, lavar la placa de ELISA, añadir un anticuerpo específico anti-proteína terapéutica acoplado a un marcador detectable (como se describe en el presente documento o, por otro lado, se conoce en la técnica) y detectar la presencia del anticuerpo secundario. En una versión alternativa de este protocolo, la placa de ELISA podría estar revestida con el anticuerpo específico anti
30 proteína terapéutica y el reactivo secundario marcado podría ser el anticuerpo específico anti-albúmina humana.
Usos de los polinucleótidos
Cada uno de los polinucleótidos identificados en el presente documento se puede usar de muchas formas como reactivos. La siguiente descripción deberá considerarse de ejemplo y usa técnicas conocidas.
Los polinucleótidos de la presente invención son útiles para producir las proteínas de fusión de albúmina de la
35 invención. Como se describe con más detalle más adelante, los polinucleótidos de la invención (que codifican proteínas de fusión de albúmina) se pueden usar en procedimientos de ADN recombinante útiles en ingeniería genética para fabricar células, líneas celulares o tejidos que expresan la proteína de fusión de albúmina codificada por los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención.
Los polinucleótidos de la presente invención también son útiles en terapia génica. Un objetivo de la terapia génica es
40 insertar un gen normal en un organismo que tiene un gen defectivo en un esfuerzo por corregir el defecto genético. Los polinucleótidos divulgados en la presente invención ofrecen un medio para apuntar a dichos defectos génicos de un modo muy preciso. Otro objetivo es insertar un nuevo gen que no estaba presente en el genoma del huésped, produciendo de este modo un rasgo nuevo en la célula huésped. Ejemplos no limitantes adicionales de los procedimientos de terapia génica abarcados por la presente invención se describen más exhaustivamente en otros
45 lugares del presente documento (véase, por ejemplo, las secciones denominadas “Terapia génica” y los ejemplos 63 y 64),
Usos de los polipéptidos
Cada uno de los polipéptidos identificados en el presente documento se puede usar de muchas formas. La siguiente descripción deberá considerarse de ejemplo y usa técnicas conocidas.
50 Además, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades o afecciones, tales como, por ejemplo, trastornos neurales, trastornos del sistema inmunitario, trastornos de la reproducción, trastornos gastrointestinales, trastornos cardiovasculares y/o trastornos renales. Por ejemplo, se puede administrar a los pacientes un polipéptido de la presente invención en un esfuerzo por sustituir niveles ausentes o disminuidos del polipéptido (p. ej., insulina), por suplementar niveles ausentes o disminuidos de
55 un polipéptido diferente (p. ej., hemoglobina S por hemoglobina , SOD, catálisis, proteínas de reparación de ADN), por inhibir la actividad de un polipéptido (p. ej., un oncogén o supresor tumoral), por activar la actividad de un polipéptido (p. ej., mediante la unión a un receptor), por reducir la actividad de un receptor unido a la membrana compitiendo con él por el ligando libre (p. ej., receptores solubles de TNF usados en la reducción de la inflamación) o por producir una respuesta deseada (p. ej., inhibición del crecimiento de vasos sanguíneos, potenciación de la respuesta inmunitaria a células en proliferación o tejidos).
En concreto, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo terapéutico también se pueden usar para tratar la enfermedad (como se ha descrito anteriormente y en 5 otros lugares en el presente documento). Por ejemplo, la administración de una proteína de fusión de alúmina que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo terapéutico puede unir y/o neutralizar el polipéptido al que el anticuerpo terapéutico usado para fabricar la proteína de fusión de albúmina se une específicamente y/o reducir la sobreproducción del polipéptido al que el anticuerpo terapéutico usado para fabricar la proteína de fusión de albúmina se une específicamente. De un modo similar, la administración de una proteína de fusión de alúmina
10 que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo terapéutico puede activar el polipéptido al que el anticuerpo terapéutico usado para fabricar la proteína de fusión de albúmina se une específicamente uniendo el polipéptido unido a una membrana (receptor).
Como mínimo, las proteínas de fusión de albúmina de la invención de la presente invención se pueden usar como marcadores de peso molecular sobre geles de SDS-PAGE o sobre columnas de filtración en gel para tamiz 15 molecular usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden usar para producir anticuerpos que, a su vez, se pueden usar para medir la expresión de proteínas de la proteína terapéutica, proteína albúmina y/o la proteína de fusión de alúmina de la invención a partir de una célula recombinante, como modo de evaluar la transformación de la célula huésped o en una muestra biológica. Además, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden usar para
20 analizar las actividades biológicas descritas en el presente documento.
Ensayos diagnósticos
Los compuestos de la presente invención son útiles para diagnóstico, tratamiento, prevención y/o pronóstico de varios trastornos en mamíferos, preferentemente seres humanos. Dichos trastornos incluyen, entre otros, los descritos para la proteína terapéutica en la correspondiente fila de la tabla 1 y en el presente documento bajo los
25 encabezados de la sección “Actividad inmunitaria”, “Trastornos renales”, “Trastornos cardiovasculares”, “Actividad anti-angiogénesis”, “Enfermedades a nivel celular”, “Cicatrización de heridas y proliferación de células epiteliales”, “Actividad neural y enfermedades neurológicas”, “Trastornos endocrinos”, “Trastornos del sistema reproductor”, “Enfermedad infecciosa”, “Regeneración” y/o “Trastornos gastrointestinales”, más adelante.
Para una serie de trastornos se pueden detectar niveles sustancialmente alterados (aumentados o disminuidos) de
30 expresión génica en tejidos, células o fluidos corporales (p. ej., sueros, plasma, orina, semen, líquido sinovial o fluido espinal) extraídos de un individuo que tiene dicho trastorno, respecto a un nivel de expresión génica “estándar”, es decir el nivel de expresión en tejidos o fluidos corporales de un individuo que no tiene el trastorno. Por tanto, se describe un procedimiento diagnóstico útil durante el diagnóstico de un trastorno, que implica medir el nivel de expresión del gen que codifica un polipéptido en tejidos, células o fluidos corporales de un individuo y comparando el
35 nivel de expresión génica medida con un nivel de expresión génica estándar, de modo que un incremento o disminución de los niveles de expresión génica en comparación con el estándar es indicativo de un trastorno. Estos ensayos diagnósticos se pueden realizar in vivo o in vitro, tales como, por ejemplo, sobre muestras de sangre, tejido de biopsia o tejido de autopsia.
La presente divulgación también es útil como indicador pronóstico, de modo que los pacientes que exhiben una 40 expresión génica potenciada o deprimida experimentarán un peor desenlace clínico.
Con “analizar el nivel de expresión del gen que codifica un polipéptido" se pretende medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de un polipéptido concreto (por ejemplo, un polipéptido correspondiente a la proteína terapéutica divulgada en la tabla 1) o el nivel del ARNm que codifica el polipéptido de la invención en una primera muestra biológica bien directamente (p. ej., determinando o estimando el nivel de proteínas absoluto o el nivel de 45 ARNm) o relativamente (p. ej., comparando con el nivel de polipéptido o el nivel de ARNm en una segunda muestra biológica). Preferentemente, el nivel de expresión del polipéptido o el nivel de ARNm en la primera muestra biológica se mide o estima y se compara con el nivel del polipéptido o el nivel del ARNm estándar, tomándose el estándar de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o determinándose realizando la media de los niveles de una población de individuos que no tienen el trastorno. Como se apreciará en la técnica, una
50 vez que se conoce un nivel de polipéptido o un nivel de ARNm estándar, se puede usar repetidamente como patrón para comparar.
Por “muestra biológica” se quiere decir cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, línea celular, cultivo tisular u otra fuente que contiene polipéptidos de la invención (incluyendo porciones de los mismos) o ARNm. Como se ha indicado, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como sueros, plasma, orina, líquido sinovial
55 y fluido espinal) y fuentes de tejidos que se ha descubierto que expresan la longitud completa o fragmentos de los mismos de un polipéptido o ARNm. En la técnica se conoce bien procedimientos para obtener biopsias tisulares y fluidos corporales de mamíferos. Cuando la muestra biológica es para incluir ARNm, la fuente preferida es una biopsia de tejido.
Composiciones farmacéuticas o terapéuticas
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención o formulaciones de las mismas se pueden administrar mediante cualquier procedimiento convencional, incluyendo inyección parenteral (p. ej., subcutánea o intramuscular) o infusión intravenosa. El tratamiento puede consistir en una única dosis o en una pluralidad de dosis durante un periodo de
5 tiempo.
Aunque es posible administrar una proteína de fusión de albúmina de la invención sola es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica, junto con uno o más vehículos aceptables. El(los) vehículo(s) deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con la proteína de fusión de albúmina y no perjudicial para los receptores de la misma. Normalmente, los vehículos serán agua o solución salina que serán estériles o libres de
10 pirógenos. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención están particularmente bien adaptadas a la formulación en vehículos acuosos, tales como agua estéril libre de pirógenos, solución salina u otras soluciones isotónicas por su periodo de duración extendida en solución. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular con bastante antelación en forma acuosa, por ejemplo semanas o meses o periodos de tiempo más prolongados antes de su dispensación.
15 Por ejemplo, las formulaciones que contienen la proteína de fusión de albúmina se pueden preparar teniendo en cuenta el periodo de duración extendida de la proteína de fusión de albúmina en formulaciones acuosas. Como se ha tratado anteriormente, el periodo de duración de la proteína terapéutica está marcadamente incrementado o prolongado tras la fusión con HA.
En los casos en los que es adecuada la administración de aerosol, las proteínas de fusión de albúmina de la
20 invención se pueden formular como aerosoles usando procedimientos estándar. El término "aerosol" incluye cualquier fase suspendida en gas de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención que se puede inhalar para llegar a los bronquiolos o las vías nasales. Específicamente, el aerosol incluye una suspensión de transmisión por gas de gotas de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, como se puede producir en un inhalador o nebulizador de dosis medida o en un atomizador de neblina. El aerosol también incluye
25 una composición en polvo seco de un compuesto de la presente invención suspendido en aire u otro gas portador, que se puede liberar mediante insuflación de un dispositivo inhalador, por ejemplo. Véase Ganderton & Jones, Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood (1987); Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313; y Raeburn et al,. (1992) Pharmacol. Toxicol. Methods 27:143-159.
Las formulaciones de la invención son también, habitualmente, no inmunogénicas, en parte por el uso de los
30 componentes de la proteína de fusión de albúmina derivada de la especie adecuada, Por ejemplo, para uso humano, tanto la proteína terapéutica como las porciones de albúmina de la proteína de fusión de albúmina serán habitualmente humanas. En algunos casos, en los que cualquiera de los componentes no es un derivado humano, dicho componente puede ser humanizado mediante sustitución de aminoácidos clave de modo que epítopos específicos aparecen para el sistema inmunitario humano como de naturaleza humana en lugar de extraña.
35 Las formulaciones pueden presentarse cómodamente en una forma de monodosis y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de farmacia. Dichos procedimientos incluyen la etapa de llevar la proteína de fusión de albúmina en asociación con el vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto de forma uniforme y estrecha el ingrediente activo con transportadores líquidos o transportadores sólidos finamente divididos o con ambos y,
40 después, en caso necesario, dando forma al producto.
Formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos, que hacen que la formulación sea adecuada para el receptor que se pretenda;D y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de una dosis o de 45 múltiples dosis, por ejemplo ampollas, viales o jeringuillas sellados, y pueden almacenarse en estado de desecado por congelación (liofilizadas) que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para preparaciones inyectables, inmediatamente antes de usar. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos estériles. Las formulaciones para dosis pueden contener la porción de proteína terapéutica a una concentración molar menor o una dosis menor en comparación con la
50 formulación estándar no fusionada para la proteína terapéutica dada la semivida en suero extendida exhibida por muchas de las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
Las formulaciones o composiciones de la invención se pueden envasar juntas o incluidas en un kit con instrucciones
o un prospecto en el que se hace referencia al periodo de duración extendido del componente proteína de fusión de albúmina. Por ejemplo, dichas instrucciones o prospectos pueden abordar las condiciones de almacenamiento
55 recomendadas, tales como el tiempo, la temperatura y la luz, teniendo en cuenta el periodo de duración extendido o prolongado de las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Dichas instrucciones o prospectos también abordan las ventajas concretas de las proteínas de fusión de albúmina de la invención, tal como la facilidad de almacenamiento para las formulaciones que pueden requerir uso en el campo, fuera de un hospital controlado, en condiciones de clínica o consulta. Como se ha descrito anteriormente, las formulaciones de la invención pueden ser en forma acuosa y se pueden almacenar en circunstancias menores a las ideales sin una pérdida significativa de la actividad terapéutica.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden incluir en nutracéuticos. Por ejemplo, ciertas proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar en productos naturales, incluidos leche o
5 productos lácteos obtenidos de un mamífero transgénico que expresa proteínas de fusión de albúmina. Dichas composiciones también pueden incluir plantas o productos vegetales obtenidos de una planta transgénica que expresa la proteína de fusión de albúmina. La proteína de fusión de albúmina también se puede proporcionar en forma de polvo o comprimidos, con o sin otros aditivos conocidos, vehículos, cargas y diluyentes. En Scott Hegenhart, Food Product Design, Dec. 1993. se describen nutracéuticos.
10 La proteína de fusión de albúmina y/o el polinucleótido se formularán y dosificarán de un modo consistente con la buena práctica médica, teniendo en cuenta la afección clínica del paciente individual (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con la proteína de fusión de albúmina y/o el polinucleótido solos), el punto de administración, el procedimiento de administración, el calendario de administración y otros factores conocidos para aquéllos que la practican. La “cantidad eficaz” para los propósitos del presente documento se determina de este
15 modo mediante dichas consideraciones.
Como proposición general, la cantidad farmacéuticamente eficaz de la proteína de fusión de albúmina administrada por vía parenteral por dosis estará en el intervalo de aproximadamente lug/kg/día a 10 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque como se ha indicado anteriormente, estará sujeto a juicio terapéutico. Más preferentemente, esta dosis es al menos 0,01 mg/kg/día y, lo más preferentemente, para seres humanos entre aproximadamente 0,01 20 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se administra de forma continua, la proteína de fusión de albúmina normalmente se administra a una velocidad de dosis de aproximadamente 1 ug/kg/hora a aproximadamente 50 ug/kg/hora, bien mediante 1-4 inyecciones al día o mediante infusiones subcutáneas continuas, usando, por ejemplo, una minibomba. También se puede usar una solución en bolsa intravenosa. La duración del tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo tras el tratamiento para que se produzcan respuestas parece variar en función del efecto
25 deseado.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos se pueden administrar por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas, genes, gotas o parches transdérmicos), bucal o como atomizador oral o nasal. “Vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un sólido no tóxico, carga sólida, semisólida o líquida, diluyente, material de encapsulación o formulación auxiliar de cualquier
30 tipo. El término “parenteral”, como se usa en el presente documento, se refiere a los modos de administración que incluyen inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular e infusión.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención también se administran adecuadamente mediante sistemas de liberación sostenida. Ejemplos de proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de liberación sostenida se administran por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica 35 (como mediante polvos, pomadas, genes, gotas o parches transdérmicos), bucal o como atomizador oral o nasal. “Vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un sólido no tóxico, carga sólida, semisólida o líquida, diluyente, material de encapsulación o formulación auxiliar de cualquier tipo. El término “parenteral”, como se usa en el presente documento, se refiere a los modos de administración que incluyen inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular e infusión. Ejemplos de proteínas de fusión de albúmina y/o
40 polinucleótidos de liberación sostenida incluyen materiales poliméricos (tales como, por ejemplo, matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo películas, o microcápsulas), materiales hidrófobos adecuados (por ejemplo en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o en forma de derivados escasamente solubles (tales como, por ejemplo, una sal escasamente soluble).
Las matrices de liberación sostenida pueden incluyen poliláctidas (patente de EE.UU. 3.773.919, el documento EP
45 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(2- hidroxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al., Id.) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (publicación de solicitud de patente europea Nº EP 133.988).
Proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de liberación sostenida también incluyen proteínas de fusión de
50 albúmina y/o polinucleótidos atrapados en liposomas de la invención (véase, en general, Langer, Science 249:15271533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pág. 317 - 327 and 353-365 (1989)). Los liposomas que contienen la proteína de fusión de albúmina y/o polinucleótido se preparan mediante procedimientos conocidos per se: documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 77:4030
55 4034 (1980); documentos EP 52,322, EP 36,676, EP 88,046, EP 143,949, EP 142,641, la patente japonesa AppL 83-118008; las patentes de EE.UU. Nº 4.485.045 y 4.544.545; y el documento EP 102.324. Habitualmente, los liposomas son de tipo unilamelar pequeño (de aproximadamente 200-800 Angstroms) en los que el contenido en lípidos es mayor que aproximadamente 30 mol por ciento de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada según la terapéutica óptima.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden liberar mediante una bomba (véase, Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)).
Otros sistemas de liberación controlada se tratan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
5 Para administración parenteral, la proteína de fusión de albúmina y/o polinucleótido puede formularse, generalmente, mezclándola al grado de pureza deseado, en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión o emulsión), con un transportador farmacéuticamente aceptable, es decir uno que no es tóxico para los receptores a las dosis y concentraciones empleados y que es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación no incluye, preferentemente, agentes de oxidación y otros compuestos que se sabe que
10 son perjudiciales para la terapéutica.
En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto la proteína de fusión de albúmina y/o el polinucleótido de forma uniforme e íntima con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o con ambos. A continuación, en caso necesario, se da la forma al producto en la formulación deseada. Preferentemente, el vehículo es un vehículo parenteral, más preferentemente una solución que es isotónica con la sangre del receptor.
15 Ejemplos de dichos vehículos transportadores incluyen agua, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. En el presente documento también son útiles vehículos no acuosos, tales como aceites fijos y oleato de etilo, así como liposomas.
Adecuadamente, el vehículo contiene cantidades minoritarias de aditivos, tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Dichos materiales no son tóxicos para los receptores a las dosis y 20 concentraciones empleadas e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes, tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (meno de aproximadamente diez residuos), por ejemplo poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina
o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluidos celulosa o
25 sus derivados, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como polisorbatos, poloxámeros
o PEG.
Normalmente, la proteína de fusión de albúmina en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, preferentemente 1-10 mg/ml, a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se entenderá que el uso de
30 algunos de los excipientes, vehículos o estabilizantes anteriores tendrá como resultado la formación de sales polipeptídicas.
Toda sustancia farmacéutica usada para administración terapéutica puede ser estéril. La esterilidad se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej., membranas de 0,2 micrómetros). Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos se introducen, generalmente, en un envase que tiene un
35 orificio de acceso estéril, por ejemplo, un vial o bolsa de disolución intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.
Los proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos se almacenarán, habitualmente, en envases de una unidad o de múltiples dosis, por ejemplo ampollas o viales sellados, como solución acuosa o como formulación liofilizada para reconstituir. Como ejemplo de una formulación liofilizada, viales de 10 ml se cargan con 5 ml de
40 solución acuosa de proteína de fusión de albúmina y/o polinucleótidos acuosa al 1 % (p/v) esterilizada mediante filtración y la mezcla resultante se liofiliza. La solución pare infusión se prepara reconstituyendo la proteína de fusión de albúmina y/o el polinucleótido liofilizado usando agua para preparaciones inyectables bacteriostática
En una realización específica y preferida, las formulaciones de proteínas de fusión de albúmina comprenden fosfato sódico 0,01M, cloruro sódico 0,15 mM, octanoato sódico 0,16 micromolar/miligramo de proteína de fusión, 15 45 miligramos/mililitro de polisorbato aa pH 7,2. En otra realización específica y preferida, las formulaciones de proteínas de fusión de albúmina consisten en fosfato sódico 0,01M, cloruro sódico 0,15 mM, octanoato sódico 0,16 micromolar/miligramo de proteína de fusión, 15 miligramos/mililitro de polisorbato aa pH 7,2. El pH y el tampón se escogen de modo que coincidan con las condiciones fisiológicas y se añade la sal como tonificante. El octanoato sódico se ha elegido debido a su capacidad comunicada para aumentar la estabilidad térmica del problema en
50 solución. Por último, el polisorbato se ha añadido como tensioactivo genérico, que disminuye la tensión superficial de la solución y disminuye la adsorción inespecífica de la proteína de fusión de albúmina al sistema de cierre del envase.
También se divulga un paquete o kit farmacéutico que comprenden uno o más envases cargados con uno o más de los ingredientes de las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención. Asociados con dicho(s)
55 envase(s) puede adjuntarse una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, en la que se refleja la aprobación de la agencia de la fabricación, uso o venta del producto para administración en seres humano. Además, las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos se pueden usar junto con otros compuestos terapéuticos.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con adyuvantes. Los adyuvantes que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención incluyen alúmina, alúmina más desoxicolato (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS21 (Genentech, Inc.), BCG (p. ej., THERACYS®), MPL y preparaciones no viables de Corynebacterium
5 parvum. Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con alúmina. Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con QS-21. Otros adyuvantes que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen:
El inmunomodulador monofosforil lípido, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de aluminio, MF-59 y
10 tecnología adyuvante Viresomal. Las vacunas que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención incluyen vacunas dirigidas a la protección contra SPR (sarampión, paperas, rubéola), polio, varicela, tétanos/difteria, hepatitis A, hepatitis B, Haemophilus influenzae B, tos ferina, neumonía, gripe, enfermedad de Lyme, rotavirus, cólera, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, poliomielitis, rabia, tifus y pertussis. Las combinaciones se pueden administrar de forma concomitante, por ejemplo como una mezcla, por
15 separado pero simultánea o concurrentemente, o de forma secuencial. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como mezcla terapéutica y, también, procedimientos en los que los agentes combinados se administran por separado pero de forma simultánea, por ejemplo mediante vías intravenosas separadas en el mismo individuo. La administración “en combinación” incluye además la administración separada de uno de los compuestos o agentes administrados primero, seguido del segundo.
20 Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los agentes de proteína de fusión de albúmina y/o polinucleótidos que se pueden administrar en combinación con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen, entre otros, agentes quimioterapéuticos, antibióticos, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunoterapéuticos convencionales y/o tratamientos terapéuticos que se describen más adelante. Las
25 combinaciones se pueden administrar de forma concomitante, por ejemplo como una mezcla, por separado pero simultánea o concurrentemente, o de forma secuencial. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como mezcla terapéutica y, también, procedimientos en los que los agentes combinados se administran por separado pero de forma simultánea, por ejemplo mediante vías intravenosas separadas en el mismo individuo. La administración “en combinación” incluye además la administración separada de
30 uno de los compuestos o agentes administrados primero, seguido del segundo.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con un anticoagulante. Los anticoagulantes que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen, entre otros, heparina, heparina de bajo peso molecular, warfarina sódica (p. ej., COUMADIN®), dicumarol, 4hidroxicumarina, anisindiona (p. ej., MIRADON™), acenocoumarol (p. ej., nicoumalona SINTHROME™), indan-1,335 diona, fenprocoumon (p.ej., MARCUMAR™), biscoumacetato de etilo (p.ej., TROMEXAN™) y aspirina. Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con heparina y/o warfarina. Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con warfarina. Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con warfarina y aspirina. Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con heparina. Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con heparina y
40 aspirina.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con fármacos trombolíticos. Los fármacos trombolíticos que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen, entre otros, plasminógeno, lis-plasminógeno, alfa-2-antiplasmina, estreptoquinasa (p. ej., KABIKINASE™), antiresplace (p. ej., EMINASE™), activador del plasminógeno tisular (t-PA, altevasa, ACTIVASE™), uroquinasa (e.g.,
45 ABBOKINASE™), sauruplasa, (Prouroquinasa, uroquinasa monocatenaria) y ácido aminocaproico (e.g., AMICAR™) Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con activador del plasminógeno tisular y aspirina.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con fármacos antiagregantes plaquetarios. Los fármacos antiagregantes plaquetarios que se pueden administrar con las
50 composiciones de la invención incluyen, entre otros, aspirina, dipiridamol (p. ej., PERSANTINE™), y ticlopidina (p. ej., TICLID™).
El uso de anticoagulantes, fármacos trombolíticos y/o antiagregantes plaquetarios en combinación con proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención puede estar contemplado para la prevención, diagnóstico y/o tratamiento de la trombosis, la trombosis arterial, la trombosis venosa, la tromboembolia, la embolia pulmonar, la
55 aterosclerosis, el infarto de miocardio, el ataque isquémico transitorio, la angina inestable.
El uso de anticoagulantes, fármacos trombolíticos y/o antiagregantes plaquetarios en combinación con proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención puede estar contemplado para la prevención de la oclusión de injertos en la safena, para reducir el riesgo de la trombosis alrededor de un procedimiento que podría acompañar a procedimientos de angioplastia, para reducir el riesgo de ictus en pacientes con fibrilación auricular, incluyendo la 60 fibrilación auricular no reumática, para reducir el riesgo de embolia asociada con válvulas cardíacas mecánicas y/o la
enfermedad de la válvula mitral. Otros usos para los agentes terapéuticos de la invención, solos o combinados con fármacos antiagregantes plaquetarios, anticoagulantes y/o trombolíticos incluyen, entre otros, la prevención de oclusiones en dispositivos extracorpóreos (p. ej., cánulas intravasculares, derivaciones del acceso vascular en pacientes en hemodiálisis, máquinas de hemodiálisis y máquinas de derivación cardiopulmonar).
5 Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con agentes antiretrovirales, inhibidores nucleosídicos/nucleotídicos de la transcriptasa inversa (INTI), inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa (INNTI) y/o inhibidores de la proteasa (IP). Los INTI que se pueden administrar en combinación con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen, entre otros, RETROVIR™ (zidovudina/AZT), VIDEX™ (didanosina/ddI), HIVID™ (zalcitabina/ddC), ZERTT™
10 (estavudina/d4T), EPIVIR™ (lamivudina/3TC) y COMBIVIR™ (zidovudina/lamivudina). Lis INNTI que se pueden administrar combinados con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen VIRAMUNE™ (nevirapina), RESCRIPTOR™ (delavirdina) y SUSTIVA™ (efavirenz). Los inhibidores de la proteasa que se pueden administrar combinados con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen CRIXIVAN™ (indinavir), NORVIR™ (ritonavir), INVIRASE™ (saquinavir), y VIRACEPT™ (nelfinavir).
15 Los agentes antirretroviral, los inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, los inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa y/o los inhibidores de la proteasa se pueden usar en cualquier combinación con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención para tratar el SIDA y/o para prevenir o tratar la infección por VIH.
Otros INTI incluyen LODENOSINE™ (F-ddA; un INTI de adenosina estable en ácido; Triangle/Abbott; COVIRACIL™
20 (emtricitabina/FTC; relacionado estructuralmente con lamivudina (3TC) pero con una actividad de 3 a 10 veces mayor in vitro; Triangle/Abbott); dOTC (BCH-10652, también relacionado estructuralmente con lamivudina pero conserva la actividad contra una proporción considerable de aislados resistentes a lamivudina; Biochem Pharma); Adefovir (la FDA no ha concedido su aprobación para el tratamiento anti-HIV; Gilead Sciences); PREVEON® (Adefovir Dipivoxil, el profármaco activo de adefovir; su forma activa es PMEA-pp); TENOFOVIR™ (bis-POC PMPA,
25 un profármaco de PMPA; Gilead); DAPD/DXG (metabolito activo de DAPD; Triangle/Abbott); D-D4FC (relacionado con 3TC, contra virus resistentes a AZT/3TC); GW420867X (Glaxo Wellcome); ZIAGEN™ (abacavir/159U89; Glaxo Wellcome Inc.); CS-87 (3'azido-2',3'-didesoxiuridina; documento WO 99/66936) y formas profármacos portadoras de S-acil-2-tioetilo (SATE) de �-L-FD4C y �-L-FddC (documento WO 98/17281).
Otros INNTI incluyen COACTINON™ (emivirina/MKC-442, INNTI potente de la clase de HEPT; Triangle/Abbott);
30 CAPRAVIRINE™ (AG-15491/S-1153, un INNTI de la siguiente generación con actividad contra virus que contienen la mutación K103N; Agouron); PNU-142721 (tiene una actividad 20 a 50 veces mayor que su predecesor delavirdina y su forma activa contra los mutantes de K103N; Pharmacia & Upjohn); DPC-961 y DPC-963 (derivados de segunda generación de efavirenz, diseñado para ser activo contra virus con la mutación K103N; DuPont); GW-420867X (tiene actividad 25 veces mayor que HBY097 y es activo contra mutantes K103N; Glaxo Wellcome); CALANOLIDE A
35 (agente natural del árbol del látex; activo contra virus que contiene una o las dos mutaciones Y181C y K103N); y Propolis (documento WO 99/49830).
Otros inhibidores de la proteasa incluyen LOPINAVIR™ (ABT378/r; Abbott Laboratories); BMS-232632 (un azapéptido; Bristol-Myers Squibb); TIPRANAVIR™ (PNU-140690, una dihidropirona no péptica; Pharmacia & Upjohn); PD-178390 (una dihidropirona no peptídica; Parke-Davis); BMS 232632 (un azapéptido; Bristol-Myers
40 Squibb); L-756,423 (un análogo de indinavir; Merck); DMP-450 (un compuesto de urea cíclica; Avid & DuPont); AG1776 (un peptidomimético con actividad in vitro contra virus resistentes a inhibidores de la proteasa; Agouron); VX175/GW-433908 (profármaco fosfato de amprenavir; Vertex & Glaxo Welcome); CGP61755 (Ciba); y AGENERASE™ (amprenavir; Glaxo Wellcome Inc.).
Otros agentes antiretrovirales adicionales incluyen inhibidores de la fusión/aglutinantes de gp41. Los inhibidores de
45 la fusión/aglutinantes de gp41 incluyen (un péptido de los residuos 643-678 del exodominio de la proteína transmembranal gp41 del VIH que se une a gp41 en su estado de reposo y previene la transformación al estado fusogénico; Trimeris) y T-1249 (un inhibidor de la fusión de segunda generación; Trimeris).
Otros agentes antiretrovirales adicionales incluyen inhibidores de la fusión/antagonistas del receptor de quimioquinas. Los inhibidores de la fusión/antagonistas del receptor de quimioquinas incluyen antagonistas de
50 CXCR4 como AMD 3100 (un biciclámido), SDF-1 y sus análogos y ALX40-4C (un péptido catiónico), T22 (un péptido de 18 aminoácidos; Trimeris) y los análogos de T22, T134 y T140; antagonistas de CCR5 tales como RANTES (968), AOP-RANTES, NNY-RANTES y TAK-779; y antagonistas de CCR5/CXCR4 tales como NSC 651016 (un análogo de distamicina). También se incluyen antagonistas de CCR2B, CCR3 y CCR6. Los antagonistas del receptor de quimioquinas tales como RANTES, SDF-1, MIP-1a, MIP-1�, etc., también pueden inhibir la fusión.
55 Agentes antiretrovirales adicionales incluyen inhibidores de la integrasa. Los inhibidores de la integrasa incluyen ácidos dicafeoilquínicos (DFQA); ácido-L-quicórico (un ácido dicafeoiltartárico (DCTA), quinalizarina (QLC) y antraquinonas relacionadas; ZINTEVIR™ (AR 177, un oligonucleótido que probablemente actúa en la superficie celular en lugar de ser un verdadero inhibidor de la integrasa; Arondex); y naftoles tales como los divulgados en el documento WO 98/50347.
Agentes antiretrovirales adicionales incluyen compuestos de tipo hidroxiurea tales como BCX-34 (un inhibidor nucleosídico único de la fosforilasa; Biocryst); inhibidores de ribonucleótido reductasa tales como DIDOX™ (Molecules for Health); inhibidores de la inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) tales como VX-497 (Vertex); y ácidos micofólicos tales como CellCept (micofenolato mofetilo; Roche).
5 Agentes antiretrovirales adicionales incluyen inhibidores de la integrasa viral, inhibidores de la translocación al núcleo del genoma viral tal como compuestos de amileno bis(metilcetona), inhibidores de la entrada del VIH tales como proteínas de fusión AOP-RANTES, NNY-RANTES, RANTES-IgG, complejos solubles de RANTES y glucosilaminoglucanos (GAG) y AMD-3100 e inhibidores del dedo de cinc de la nucleocápside tales como compuestos de diriano; dianas de Tat y Rev del VIH y potenciadores farmacológicos tales como ABT-378.
10 Otras terapias antiretrovirales y terapias adyuvantes incluyen citoquinas y linfoquinas tales como MIP-1a, MIP-1�, SDF-1a, IL-2, PROLEUKIN™ (aldesleuquina/L2-7001; Chiron), IL-4, IL-10, IL-12 e IL-13; interferones tales como IFN-alfa 2a, IFN-alfa 2b, o IFN-beta; antagonistas de TNF, NFKB, GM-CSF, M-CSF e IL-10; agentes que modulan la activación inmunitaria tales como ciclosporina y prednisona; vacunas tales como Remune™ (inmunógeno del VIH), APL 400-003 (Apollon), gp120 recombinante y fragmentos, glicoproteína de la cubierta recombinante bivalente (B/E),
15 rgp120CM235, MN rgp120, SF-2 rgp120, complejo gp120/soluble CD4, proteína Delta JR-FL, péptido sintético ramificado derivado del dominio discontinuo de gp120 C3/C4, inmunógenos competentes de fusión y vacunas Gag, Pol, Nef y Tat; tratamientos basados en genes tales como elementos supresores genéticos (GSE; documento WO 98/54366) e intraquinas (quimioquinas CC modificadas genéticamente dirigidas al RE para bloquear la expresión en superficie de CCR5 recién sintetizado (Yang et al., PNAS 94:11567-72 (1997); Chen et al., Nat. Med. 3:1110-16
20 (1997)); anticuerpos tales como el anticuerpo anti-CXCR4 12G5, los anticuerpos anti-CCR5 2D7, 5C7, PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14, los anticuerpos anti-CD4 Q4120 y RPA-T4, el anticuerpo anti-CCR3 7B11, los anticuerpos anti-gp120 17b, 48d, 447-52D, 257-D, 268-D y 50.1, los anticuerpos anti-Tat, los anticuerpos anti-TNF-a y el anticuerpo monoclonal 33A; agonistas y antagonistas del receptor de hidrocarburos de arilo (AH) tales como TCDD, 3,3',4,4',5-pentaclorobifenilo, 3,3',4,4'-tetraclorobifenilo y a-naftoflavona (documento WO 98/30213) y
25 antioxidantes tales como éster etílico de y-L-glutamil-L-cisteína (y-GCE; documento WO 99/56764).
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con un agente antiviral. Los agentes antivirales que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen aciclovir, ribavirina, amantadina, ramantidina, maximina o timalfasina.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación
30 con agentes anti-infecciones oportunistas. Los agentes anti-infecciones oportunistas que se pueden administrar en combinación con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™, ATOVAQUONE™, ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™, ETHAMBUTOL™, RIFABUTIN, CLARITHROMYCIN™, AZITHROMYCIN™, GANCICLOVIR™, FOSCARNET™, CIDOFOVIR™, FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, KETOCONAZOLE™, ACYCLOVIR™,
35 FAMCICOLVIR™, PYRIMETHAMINE™, LEUCOVORIN™, NEUPOGEN™ (filgrastim/G-CSF) y LEUKINE™ (sargramostim/GM-CSF). Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención se pueden usar en cualquier combinación con TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™ y/o ATOVAQUONE™ para tratar o prevenir profilácticamente una infección de neumonía oportunista por Pneumocystis carinii. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden usar en cualquier
40 combinación con ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™ y/o ETHAMBUTOL™ para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por Mycobacterium avium. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden usar en cualquier combinación con RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™, y/o AZITHROMYCIN™ para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por Mycobacterium tuberculosis. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden usar en cualquier
45 combinación con GANCICLOVIR™, FOSCARNET™ y/o CIDOFOVIR™ para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por citomegalovirus. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden usar en cualquier combinación con FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™ y/o KETOCONAZOLE™ para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista fúngica. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden usar en cualquier combinación con ACYCLOVIR™ y/o FAMCICOLVIR™
50 para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por el virus del herpes simple de tipo I y/o de tipo II. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden usar en cualquier combinación con PYRIMETHAMINE™ y/o LEUCOVORIN™ para tratar o prevenir profilácticamente una infección oportunista por Toxoplasma gandii. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden usar en cualquier combinación con LEUCOVORIN™ y/o NEUPOGEN™ para tratar o prevenir profilácticamente una infección
55 oportunista bacteriana.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con un agente antibiótico. Los agentes antibióticos que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen , amoxicilina, beta-lactamasas, aminoglucósidos, betalactámidos (glucopéptido), beta-lactamasas, clindamicina, cloranfenicol, cefalosporinas, ciprofloxacino, eritromicina,
60 fluoroquinolonas, macrólidos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rapamicina, rifampicina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol y vancomicina.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con inmunoestimulantes. Los inmunoestimulantes que se pueden administrar en combinación con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen levamisol (p.ej., ERGAMISOL™), isoprinosina (p.ej. INOSIPLEX™), interferones (p.ej., interferón alfa) e interleuquinas (p.ej., IL-2).
5 Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con agentes inmunosupresores. Los agentes inmunosupresores que se pueden administrar en combinación con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen esteroides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclofosfamida, metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK-506, 15-desoxiespergualina y otros agentes inmunosupresores que actúan suprimiendo la función de respuesta de las células T. Otros agentes
10 inmunosupresores que se pueden administrar en combinación con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen prednisolona, metotrexato, talidomida, metoxsalen, rapamicina, leflunomida, mizoribina (BREDININ™), broquinar, desoxiespergualina y azaspirano (SKF 105685), ORTHOCLONE OKT® 3 (muromonab-CD3), SANDIMMUNE™, NEORAL™, SANGDYA™ (ciclosporina), PROGRAF® (FK506, tacrolimus), CELLCEPT® (micofenolato motefilo, cuyo metabolito activo es ácido micofenólico), IMURAN™ (azatioprina),
15 glucocorticosteroides, esteroides adrenocorticales tales como DELTASONE™ (prednisona) e HYDELTRASOL™ (prednisolona), FOLEX™ y MEXATE™ (metotrexato), OXSORALEN-ULTRA™ (metoxsalen) y RAPAMUNE™ (sirolimus). Se pueden usar inmunosupresores para prevenir el rechazo de transplantes de órganos y de médula ósea.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención se pueden administrar solos o en
20 combinación con una o más preparaciones de inmunoglobulina intravenosa. Preparaciones de inmunoglobulina intravenosa que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen, entre otros, GAMMAR™, IVEEGAM™, SANDOGLOBULIN™, GAMMAGARD S/D™, ATGAM™ (globulinas antitimocitos) y GAMIMUNE™ Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con preparaciones de inmunoglobulina intravenosa en tratamientos de transplantes (p.
25 ej., transplante de médula ósea).
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar solas o como parte de una terapia de combinación, in vivo a los pacientes o in vitro a las células, para el tratamiento de cáncer. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar repetidamente durante la inmunoterapia pasiva para el cáncer, tal como terapia de transferencia de células adoptivas para el melanoma
30 metastático como se describe en Dudley et al. (Science Express, 19 September 2002, at www.scienceexpress.org).
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con una agente antiinflamatorio. Los agentes antiinflamatorios que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen corticosteroides (p.ej. betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona y triamcinolona), 35 fármacos antiinflamatorios no esteroideos (p.ej., diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, floctafenina, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina ketoprofeno, meclofenamato, ácido mefenámico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofénico y tolmetin.), así como antihistamínicos, derivados de ácido aminoarilcarboxílico, derivados de ácido arilacético, derivados de ácido arilbutírico, ácidos arilcarboxílicos, derivados de ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados de ácido
40 salicílico, tiazinacarboxamidas, ácido e-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazac, bencidamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteína, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxima, proquazona, proxazol y tenidap.
Las composiciones de la invención se pueden administrar solas o en combinación con un agente antiangiogénico. Agentes antiangiogénicos que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen, entre otros,
45 angiostatina (Entremed, Rockville, MD), troponina-1 (Boston Life Sciences, Boston, MA), factor antiinvasivo, ácido retinoico y derivados del mismo, paclitaxel (Taxol), suramina, inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1, inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2, VEGI, inhibidor 1 del activador del plasminógeno, , inhibidor 1 del activador del plasminógeno 2 y varias formas del “grupo d” de metales de transición más ligeros.
Los metales de transición del "grupo d" más ligeros incluyen, por ejemplo, especies de vanadio, molibdeno,
50 tungsteno, titanio, niobio y de tántalo. Dichas especies de metales de transición pueden formar complejos de metales de transición. Complejos adecuados de las especies de metales de transición mencionadas anteriormente incluyen complejos oxo de metales de transición.
Ejemplos representativos de complejos de vanadio incluyen complejos de vanadio oxo, tales como complejos de vanadato y de vanadilo. Complejos de vanadato adecuados incluyen complejos de metavanadato y ortovanadato
55 tales como, por ejemplo, metavanadato amónico, metavanadato sódico y ortovanadato sódico. Complejos de vanadilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de vanadilo y sulfato de vanadilo, incluyendo hidratos de sulfato de vanadilo tales como mono y trihidratos de sulfato de vanadilo.
Ejemplos representativos de complejos de tungsteno y de molibdeno también incluyen complejos oxo. Complejos oxo de tungsteno adecuados incluyen complejos de tungstato y de óxido de tungsteno. Complejos de tungstato adecuados incluyen tungstato amónico, tungstato cálcico, tungstato sódico dihidrato y ácido túngstico. Óxidos de tungsteno adecuados incluyen óxido de tungsteno (IV) y óxido de tungsteno (VI). Complejos oxo de molibdeno adecuados incluyen complejos de molibdato, de óxido de molibdeno y de molibdenilo. Complejos de molibdato,adecuados incluyen molibdato amónico y sus hidratos, molibdato sódico y sus hidratos y molibdato
5 potásico y sus hidratos. Óxidos de molibdeno adecuados incluyen óxido de molibdeno (VI), óxido de molibdeno (VI) y ácido molíbdico. Complejos de molibdenilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de molibdenilo. Otros complejos de tungsteno y de molibdeno adecuados incluyen derivados hidroxo derivados de, por ejemplo, glicerol, ácido tartárico y azúcares.
También se puede usar una amplia variedad de otros factores antiangiogénicos. Ejemplos representativos incluyen
10 el factor 4 de las plaquetas, sulfato de protamina, derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de cáscaras de cangrejo reina) (Murata et al., Cancer Res. 51:22-26, (1991)); complejo de polisacáridos sulfatados y peptidoglucano (SP- PG) (la función de este compuesto se puede potenciar mediante la presencia de esteroides, tales como estrógenos y citrato de tamoxifeno); etaurosporina; moduladores del metabolismo de la matriz, incluyendo, por ejemplo, análogos de prolina, cishidroxiprolina, d,L-3,4-dehidroprolina, tiaprolina, alfa,alfa-dipiridilo,
15 fumarato de aminopropionitrilo; 4-propil-5-(4-piridinil)-2(3H)-oxazolona; metotrexato; mitoxantrona; heparina; interferones; 2 macroglobulina-sérica; ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267:17321-17326, (1992)); quimostatina (Tomkinson et al., Biochem J. 286:475-480, (1992)); ciclodextrina tetradecasulfato; eponemicina; camptotecina; fumagilina (Ingber et aL, Nature 348:555-557, (1990)); tiomalato sódico de oro ("GST"; Matsubara and Ziff, J. Clin. Invest. 79:1440-1446, (1987)); anticolagenasa sérica; alfa2-antiplasmina (Holmes et al., J. Biol. Chem. 262(4):1659
20 1664, (1987)); bisantreno (National Cancer Institute); disolución de lobenzarit disódico, ácido (N-(2)-carboxifenil-4cloroantronílico disódico o "CCA"; (Takeuchi et al., Agents Actions 36:312-316, (1992)); e inhibidores de la metaloproteinasa tales como BB94.
Factores antiangiogénicos adicionales que también se pueden usar incluyen talidomida, (Celgene, Warren, NJ); esteroides angiostáticos AGM-1470 (H. Brem and J. Folkman J Pediatr. Surg. 28:445-51 (1993)); un antagonista 3 25 alfa y beta de la integrina (C. Storgard et al., J Clin. Invest. 103:47-54 (1999)); carboxinaminoimidazol; carboxiamidotriazol (CAI) (National Cancer Institute, Bethesda, MD); conbretastatina A-4 (CA4P) (OXiGENE, Boston, MA); escualamina (Magainin Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA); TNP-470, (Tap Pharmaceuticals, Deerfield, IL); ZD-0101 AstraZeneca (Londres, Reino Unido); APRA (CT2584); benefina, birostatina-1 (SC339555); CGP-41251 (PKC 412); CM101; dexrazoxano (ICRF187); DMXAA; endostatina; flavopiridiol; genesteína; GTE; ImmTher; Iressa 30 (ZD1839); octreotida (somatostatina); panretina; penicilamina; Photopoint; PI-88; Prinomastat (AG-3340) Purlytin; Suradista (FCE26644); tamoxifeno (Nolvadex); tazaroteno; tetratiomolibdato; Xeloda (capecitabina) y 5-fluorouracilo.
Agentes antiangiogénicos que se pueden administrar en combinación con los compuestos de la invenció pueden funcionar mediante varios mecanismos incluyendo la inhibición de la proteólisis de la matriz extracelular, el bloqueo de la función de las moléculas de adhesión de la matriz extracelular-células endoteliales, antagonizando la función 35 de los inductores de la angiogénesis, tales como factores de crecimiento, y la inhibición de los receptores de integrina expresados sobre las células endoteliales en proliferación. Ejemplos de inhibidores antiangiogénicos que interfieren en la proteólisis de la matriz extracelular y que se pueden administrar en combinación con las composiciones de la invención incluyen AG-3340 (Agouron, La Jolla, CA), BAY-12-9566 (Bayer, West Haven, CT), BMS-275291 (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ), CGS-27032A (Novartis, East Hanover, NJ), Marimastat (British 40 Biotech, Oxford, Reino Unido) y Metastat (Aetema, St-Foy, Quebec). Ejemplos de inhibidores antiangiogénicos que actúan bloqueando la función de las moléculas de adhesión a la matriz extracelular de las células endoteliales y que se pueden administrar en combinación con las composiciones de la invención incluyen EMD-121974 (Merck KcgaA Darmstadt, Alemania) y Vitaxin (Ixsys, La Jolla, CA/Medimmune, Gaithersburg, MD). Ejemplos de agentes antiangiogénicos que actúan como antagonistas directos o inhibición de los inductores de la angiogénesis y que se 45 pueden administrar en combinación con las composiciones de la invención incluyen Angiozyme (Ribozyme, Boulder, CO), anticuerpo anti-VEGF (Genentech, S. San Francisco, CA), PTK-787/ZK-225846 (Novartis, Basel, Suiza), SU101 (Sugen, S. San Francisco, CA), SU-5416 (Sugen/ Pharmacia Upjohn, Bridgewater, NJ) y SU-6668 (Sugen). Otros agentes antiangiogénicos actúan inhibiendo indirectamente la angiogénesis. Ejemplos de inhibidores indirectos de la angiogénesis que se pueden administrar en combinación con las composiciones de la invención
50 incluyen IM-862 (Cytran, Kirkland, WA), interferón-alfa, IL-12 (Roche, Nutley, NJ) y polisulfato de pentosano (Georgetown University, Washington, DC).
El uso de composiciones de la invención en combinación con agentes antiangiogénicos se pueden contemplar para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad autoinmunitario, tal como, por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria descrita en el presente documento.
55 El uso de composiciones de la invención en combinación con agentes antiangiogénicos se pueden contemplar para tratar, prevenir y/o mejorar la artritis. El uso de composiciones de la invención en combinación con agentes antiangiogénicos se pueden contemplar para tratar, prevenir y/o mejorar la artritis reumatoide.
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención se pueden administrar en combinación con una proteína angiogénica, o polinucleótidos que codifican una proteína angiogénica. Ejemplos de proteínas 60 angiogénicas que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen factores de crecimiento de fibroblastos ácidos y básicos, VEGF-1, VEGF-2, VEGF-3, factor alfa y beta de crecimiento epidérmico, factor de
crecimiento de células endoteliales derivados de plaquetas, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor alfa de necrosis tumoral, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina, factor estimulante de las colonias, factor estimulante de las colonias de macrófagos, factor estimulante de las colonias de macrófagos/granulocitos y óxido nítrico sintasa.
5 Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con un agente quimioterapéutico. Agentes quimioterapéuticos que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno (por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, ciclofosfamida ifosfamida, melfalán (L-sarcolisina) y clorambucilo), etileniminas y metilmelaminas (por ejemplo, hexametilmelamina y tiotepa), sulfonatos de alquilo (por ejemplo, busulfán), nitrosoureas (por ejemplo,
10 carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU), y estreptozocina (estreptozotocina)), triazenos (por ejemplo, dacarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazolcarboxamida)), análogos del ácido fólico (por ejemplo, metotrexato (ametopterina)), análogos de la pirimidina (por ejemplo, fluorouacilo (5-fluorouracilo; 5-FU), floxuridina (fluorodesoxiuridina; FudR) y citarabina (citosina arabinósido)), análogos de la purina e inhibidores relacionados (por ejemplo, mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) y pentostatina (2'
15 desoxicoformicina)), alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina (VLB, vinblastina sulfato)) y vincristina (vincristina sulfato)), epipodofilotoxinas (por ejemplo, etopósido y tenipósido), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C), enzimas (por ejemplo, L-asparaginasa), modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo,, Interferón-alfa e interferón-alfa-2b), compuestos de coordinación con platino (por ejemplo, cisplatino (cis
20 DDP) y carboplatino), antracenodiona (mitoxantrona), ureas sustituidas (por ejemplo, hidroxiurea), derivados de metilhidrazina (por ejemplo, procarbazina (N-metilhidrazina; MIH), adrenocorticosteroides (por ejemplo, prednisona), progestinas (por ejemplo, hidroxiprogesterona caproato, medroxiprogesterona, medroxiprogesterona acetato y megestrol acetato), estrógenos (por ejemplo, dietilstilbestrol (DES), dietilstilbestrol difosfato, estradiol y etinil estradiol), antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno), andrógenos (testosterona proprionato y fluoximesterona),
25 antiandrógenos (por ejemplo, flutamida), análogos de la hormona liberadora de gonadotropina (por ejemplo, leuprorelina), otras hormonas y análogos de hormonas (por ejemplo, metiltestosterona, estramustina, estramustina fosfato sódico, clorotrianiseno y testolactona) y otros (por ejemplo, dicarbazina, ácido glutámico y mitotano).
Las composiciones de la invención se pueden administrar en combinación con uno o más de los fármacos siguientes: infliximab (también conocido como Remicade™ Centocor, Inc.), Trocade (Roche, RO-32-3555),
30 leflunomida (también conocida como Arava™ de Hoechst Marion Roussel), Kineret™ (un antagonista del receptor de IL-1 también conocido como Anakinra de Amgen, Inc.)
Las composiciones de la invención se pueden administrar en combinación con CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) o una combinación de uno o más de los componentes de CHOP. Las composiciones de la invención se pueden administrar en combinación con anticuerpos anti-CD20, anticuerpos anti-CD20 monoclonales 35 humanos. Las composiciones de la invención se pueden administrar en combinación con anticuerpos anti-CD20 y CHOP o anticuerpos anti-CD20 y cualquier combinación de uno o más de los componentes de CHOP, particularmente ciclofosfamida y/o prednisona. Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con rituximab. Las composiciones de la invención se pueden administrar en combinación con rituximab y CHOP, o rituximab y cualquier combinación de uno o más de los componentes de CHOP, particularmente 40 ciclofosfamida y/o prednisona. Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con tositumomab. Las composiciones de la invención se pueden administrar en combinación con tositumomab y CHOP,
o tositumomab y cualquier combinación de uno o más de los componentes de CHOP, particularmente ciclofosfamida y/o prednisona. Los anticuerpos anti-CD20 pueden estar asociados opcionalmente con radioisótopos, toxinas o profármacos citotóxicos.
45 Las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con Zevalin™. Las composiciones de la invención se pueden administrar con Zevalin™ y CHOP, o Zevalin™ y cualquier combinación de uno o más de los componentes de CHOP, particularmente ciclofosfamida y/o prednisona. Zevalin™ puede estar asociada con uno o más radioisótopos. Los isótopos pueden ser 90Y y 111In.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con
50 citoquinas. Las citoquinas que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-gamma y TNF-alfa. Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar con cualquier interleuquina, incluyendo, entre otras, IL-1alfa, IL-1beta, IL-2; IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16; 1L-17, IL-18, IL-19, IL-20 e IL-21.
55 Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con miembros de la familia del TNF. TNF, moléculas relacionadas con TNF o similares a TNF que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen formas solubles del TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, también conocido como TNF-beta), LT-beta (encontrado en el heterotrímero complejo LTalfa 2-beta), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (publicación internacional nº
60 WO 96/14328), AIM-I (publicación internacional nº WO 97/33899), endoquina-alfa (publicación internacional nº WO 98/07880), OPG y neutrolina-alfa (publicación internacional nº WO 98/18921, OX40, y factor de crecimiento neural (NGF) y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-IBB, TR2 (publicación internacional nº WO 96/34095), DR3 (publicación internacional nº WO 97/33904), DR4 (publicación internacional nº WO 98/32856), TR5 (publicación internacional nº WO 98/30693), TRANK, TR9 (publicación internacional nº WO 98/56892),TR10 (publicación internacional nº WO 98/54202), 312C2 (publicación internacional nº WO 98/06842) y TR12 y formas solubles de
5 CD154, CD70 y CD153.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con proteínas angiogénicas. Las proteínas angiogénicas que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen el factor de crecimiento derivado del glioma (GDGF), como se divulga en la patente europea número EP-399816; el factor de crecimiento A derivado de las plaquetas (PDGF-A), 10 como se divulga en la patente europea número EP-682110; el factor de crecimiento B derivado de las plaquetas (PDGF-B), como se divulga en la patente europea número EP-282317; el factor de crecimiento placentario (PICF), como se divulga en la publicación internacional número WO 92/06194; el factor de crecimiento placentario 2 (PIGF2), como se divulga en Hauser et aL, Growth Factors, 4:259-268 (1993); el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), como se divulga en la publicación internacional número WO 90/13649; el factor de crecimiento A endotelial 15 vascular (VEGF-A), como se divulga en la patente europea número EP-506477; el factor de crecimiento 2 endotelial vascular (VEGF-2), como se divulga en la publicación internacional número WO 96/39515; el factor de crecimiento B endotelial vascular (VEGF-3); el factor de crecimiento B endotelial vascular B-186 (VEGF-B186), como se divulga en la publicación internacional número WO 96/26736; el factor de crecimiento D endotelial vascular (VEGF-D), como se divulga en la publicación internacional número WO 98/02543; el factor de crecimiento D endotelial vascular (VEGF
20 D), como se divulga en la publicación internacional número WO 98/07832; y el factor de crecimiento E endotelial vascular (VEGF-E), como se divulga en la patente alemana número DE19639601.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con factores de crecimiento de fibroblastos. Los factores de crecimiento de fibroblastos que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF
25 5, FGF-6, FGF-7, FGF-8. FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 y FGF-15.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con factores de crecimiento hematopoyéticos. Los factores de crecimiento hematopoyéticos que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen, entre otros, el factor estimulante de las colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) (sargramostim, LEUKINE™, PROKINE™), el factor
30 estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) (filgrastim, NEUPOGEN™), el factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF, CSF-1) eritropoyetina (epoetina alfa, EPOGEN™, PROCRIT™), el factor de células madre (SCF, ligando de c-kit, factor de acero), el factor estimulante de las colonias de megacariocitos, PIXY321 (una proteína de fusión de GMCSF/IL-3), interleuquinas, especialmente una cualquiera o más de IL-1 a IL-12, interferóngamma o trombopoietina.
35 Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la presente invención se pueden administrar en combinación con bloqueantes adrenérgicos, tales como, por ejemplo, acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, carteolol, labetalol, metoprolol, nadolol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol y timolol.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con un fármaco antiarrítmico (p. ej., adenosina, amidoarona, bretirlio, digitalis, digoxina, digitoxina, diltiazem,
40 disopiramida, esmolol flecainida, lidocaína, mexiletino, moricizina, fenitoína, procainamida, N-acetil procainamida, propafenona, propranolol, quinidina, sotalol, tocainida y verapamilo).
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con agentes diuréticos tales como agentes inhibidores de la anhidrasa carbónica (p. ej., acetazolamida, diclorfenamida, y metazolamida), diuréticos osmóticos (p. ej., glicerina, isosorbida, manitol y urea), diuréticos que inhiben el simporte
45 de Na+-K+-2Cl- (p. ej., furosemida, bumetanida, azosemida, piretanida, tripamida, ácido etacrínico, muzolimina y torsemida), diuréticos tiazídicos y de tipo tiazídico (p. ej., bendroflumetiazida, benztiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, metilclotiazida, politiazida, triclormetiazida, clortalidona, indapamida, metolazona y quinetazona), diuréticos ahorradores de potasio (p. ej., amilorida y triamtereno) y antagonistas del receptor de mineralcorticoides (p. ej., espironolactona, canrenona y canrenoato potásico).
50 Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con tratamientos para trastornos endocrinos y/o de desequilibrio hormonal. Los tratamientos para trastornos endocrinos y/o de desequilibrio hormonal incluyen 127I, isótopos radioactivos de yodo tales como 131I y 123I; hormona de crecimiento recombinante, tal como HUMATROPE™ (somatropina recombinante); análogos de la hormona de crecimiento tal como PROTROPIN™ (somatrem); agonistas dopaminérgicos tales como PARLODEL™
55 (bromocriptina); análogos de la somatostatina, tales como SANDOSTATIN™ (octreotida); preparados de gonadotropina tales como PREGNYL™, A.P.L.™ y PROFASI™(gonadotropina coriónica (CG)), PERGONAL™ (menotropinas) y METRODIN™ (urofolitropina (uFSH)); preparados de la hormona liberadora de gonadotropina humana sintética tales como FACTREL™ y LUTREPULSE™ (gonadorelina clorhidrato); agonistas de la gonadotropina sintética tales como LUPRON™ (leuprorelina acetato), SUPPRELIN™ (acetato de histrelina),
60 SYNAREL™ (acetato de nafarelina) y ZOLADEX™ (acetato de goserelina); preparados sintéticos de la hormona liberadora de tirotropina tales como RELEFACT TRH™ y THYPINONE™ (protirelina); TSH humana recombinante tal como THYROGEN™; preparados sintéticos de las sales de sodio de los isómeros naturales de hormonas tiroideas tales como L-T4™, SYNTHROID™ y LEVOTHROID™ (levotiroxina sódica), L-T3™, CYTOMEL™ y TRIOSTAT™ (liotiroína sódica) y THYROLAR™ (liotrix); compuestos antitiroideos tales como 6-n-propiltiouracilo (propiltiouracilo),
5 1-metil-2-mercaptoimidazol y TAPAZOLE™ (metimazol), NEO-MERCAZOLE™ (carbimazol); antagonistas de los receptores beta-adrenérgicos tales como propranolol y esmolol; bloqueantes de los canales de Ca2+; dexametasona y medios de contraste radiológicos yodados tales como TELEPAQUE™ (ácido iopanoico) y ORAGRAFIN™ (ipodato sódico).
Tratamientos adicionales de los trastornos de desequilibrio hormonal y/o endocrinos incluyen estrógenos o
10 estrógenos conjugados tales como ESTRACE™ (estradiol), ESTINYL™ (etinil estradiol), PREMARIN™, ESTRATAB™, ORTHO-EST™, OGEN™ y estropipato (estrona), ESTROVIS™ (quinestrol), ESTRADERM™ (estradiol), DELESTROGEN™ y VALERGEN™ (valerato de estradiol), DEPO-ESTRADIOL CYPIONATE™ y ESTROJECT LA™ (cipionato de estradiol); antiestrógenos tales como NOLVADEX™ (tamoxifeno), SEROPHENE™ y CLOMID™ (clomifeno); progestinas tales como DURALUTIN™ (caproato de hidroxiprogesterona), MPA™ y
15 DEPO-PROVERA™ (acetato de medroxiprogesterona), PROVERA™ y CYCRIN™ (MPA), MEGACE™ (acetato de megestrol), NORLUTIN™ (noretindrona) y NORLUTATE™ y AYGESTIN™ (acetato de noretindrona); implantes de progesterona tales como NORPLANT SYSTEM™ (implantes subdérmicos de norgestrel); antiprogestinas tales como RU 486™ (mifepristona); anticonceptivos hormonales tales como ENOVID™ (noretinodrel más mestranol), PROGESTASERT™ (dispositivo intrauterino que libera progesterona), LOESTRIN™, BREVICON™, MODICON™,
20 GENORA™, NELONA™, NORINYL™, OVACON-35™ y OVACON-50™ (etinil estradiol/noretindrona), LEVLEN™, NORDETTE™, TRI-LEVLEN™ y TRIPHASIL-21™ (etinil estradiol/levonorgestrel) LO/OVRAL™ y OVRAL™ (etinil estradiol/norgestrel), DEMULEN™ (etinil estradiol/diacetato de etinodiol), NORINYL™, ORTHO-NOVUM™, NORETHIN™, GENORA™ y NELOVA™ (noretindrona/mestranol), DESOGEN™ y ORTHO-CEPT™ (etinil estradiol/desogestrel), ORTHO-CYCLEN™ y ORTHO-TRICYCLEN™ (etinil estradiol/norgestimato), MICRONOR™ y
25 NOR-QD™ (noretindrona) y OVRETTE™ (norgestrel).
Tratamientos adicionales para trastornos de desequilibrio hormonal y/o endocrinos incluyen ésteres de testosterona tales como acetato de metenolona y undecanoato de testosterona; andrógenos parenterales y orales tales como TESTOJECT-50™ (testosterona), TESTEX™ (propionato de testosterona), DELATESTRYL™ (enantato de testosterona), DEPO-TESTOSTERONE™ (cipionato de testosterona), DANOCRINE™ (danazol), HALOTESTIN™ 30 (fluoximesterona), ORETON METHYL™, TESTRED™ y VIRILON™ (metiltestosterona) y OXANDRIN™ (oxandrolona); sistema transdérmico de testosterona tales como TESTODERM™; antagonistas de los receptores de andrógenos e inhibidores de la 5-alfa-reductasa tales como ANDROCUR™ (acetato de ciproterona), EULEXIN™ (flutamida) y PROSCAR™ (finasterida); preparados de la hormona adrenocorticotropa tales como CORTROSYN™ (cosintropina); esteroides adrenocorticales y sus análogos sintéticos tales como ACLOVATE™ (alclometasona 35 dipropionato), CYCLOCORT™ (anicinonida), BECLOVENT™ y VANCERIL™ (beclometasona dipropionato), CELESTONE™ (betametasona), BENISONE™ y UTICORT™ (benzoato de betametasona), DIPROSONE™ (betametasona dipropionato), CELESTONE PHOSPHATE™ (betametasona fosfato sódico), CELESTONE SOLUSPAN™ (betametasona fosfato y acetato sódico), BETA-VAL™ y VALISONE™ (valerato de betametasona), TEMOVATE™ (propionato de clobetasol), CLODERM™ (pivalato de clocortolona), CORTEF™ e 40 HYDROCORTONE™ (cortisol (hidrocortisona)), HYDROCORTONE ACETATE™ (acetato de cortisol (hidrocortisona)), LOCOID™ (butirato de cortisol (hidrocortisona)), HYDROCORTONE PHOSPHATE™ (cortisol (hidrocortisona) fosfato sódico), A-HYDROCORT™ y SOLU CORTEF™ (cortisol (hidrocortisona) succinato sódico), WESTCORT™ (valerato de cortisol (hidrocortisona)), CORTISONE ACETATE™ (acetato de cortisona), DESOWEN™ y TRIDESILON™ (desonida), TOPICORT™ (desoximetasona), DECADRON™ (dexametasona), 45 DECADRON LA™ (acetato de dexametasona), DECADRON PHOSPHATE™ y HEXADROL PHOSPHATE™ (dexametasona fosfato sódico), FLORONE™ y MAXIFLOR™ (diacetato de diflorasona), FLORINEF ACETATE™ (acetato de fludrocortisona), AEROBID™ y NASALlDE™ (flunisolida), FLUONID™ y SYNALAR™ (fluocinolona acetónido), LIDEX™ (fluocinonida), FLUOR-OP™ y FML™ (fluometolona), CORDRAN™ (flurandrenolida), HALOG™ (halcinonida), HMS LIZUIFILM™ (medrisona), MEDROL™ (metilprednisolona), DEPO-MEDROL™ y 50 MEDROL ACETATE™ (acetato de fluocinonida), A-METHAPRED™ y SOLUMEDROL™ (fluocinonida succinato sódico), ELOCON™ (furoato de mometasona), HALDRONE™ (acetato de parametasona), DELTA-CORTEF™ (prednisolona), ECONOPRED™ (acetato de prednisolona), HYDELTRASOL™ (prednisolona fosfato sódico), HYDELTRA-T.B.A™ (tebutato de prednisolona), DELTASONE™ (prednisona), ARISTOCORT™ y KENACORT™ (triamcinolona), KENALOG™ (triamcinolona acetomida), ARISTOCORT™ y KENACORT DIACETATE™ (diacetato 55 de triamcinolona), and ARISTOSPAN™ (triamcinolona hexacetonida); inhibidores de la biosíntesis y la acción de os esteroides adrenocorticales tales como CYTADREN™ (aminoglutetimida), NIZORAL™ (ketoconazol), MODRASTANE™ (trilostana) y METOPIRONE™ (metirapona); insulina bovina, porcina o humana o mezclas de las mismas; análogos de la insulina; insulina humana recombinante tales como HUMULIN™ y NOVOLIN™; agentes hipoglucémicos orales tales como ORAMIDE™ y ORINASE™ (tolbutamida), DIABINESE™ (clorpropamida),
60 TOLAMIDE™ y TOLINASE™ (tolazamida), DYMELOR™ (acetohexamida), glibenclamida, MICRONASE™, DIBETA™ y GLYNASE™ (gliburida), GLUCOTROL™ (glipizida) y DIAMICRON™ (gliclazida), GLUCOPHAGE™ (metformina), ciglitazona, pioglitazona e inhibidores de la alfa-glucosidasa; glucagón bovina o porcina; somatostatinas tales como SANDOSTATIN™ (octreotida); y diazóxidos tales como PROGLYCEM™ (diazóxido).
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con tratamientos para trastornos de la motilidad del útero. Los tratamientos para los trastornos de la motilidad del útero incluyen fármacos de estrógenos tales como estrógenos conjugados (p. ej., PREMARIN® y ESTRATAB®), estradioles (p.ej., CLIMARA® y ALORA®), estropipato, y clorotrianiseno; fármacos de progestina (p.ej., AMEN®
5 (medroxiprogesterona), MICRONOR® (acetato de noretindrona), PROMETRIUM® progesterona y acetato de megestrol); y tratamientos de combinación de estrógenos/progesterona tales como, por ejemplo, por ejemplo, conjugados de estrógenos/medroxiprogesterona (p.ej., PREMPRO™ y PREMPHASE®) y acetato de noretindrona/etinil estradiol (p.ej., FEMHRT™).
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con
10 fármacos eficaces en el tratamiento de la deficiencia de hierro y de las anemias hipocrómicas, incluidos, entre otros, sulfato ferroso (sulfato de hierro, FEOSOL™), fumarato ferroso (p.ej., FEOSTAT™), gluconato ferroso (p.ej., FERGON™), complejo polisacárido-hierro (p. ej., NIFEREX™), inyección de dextrano férrico (p.ej., INFED™), sulfato cúprico, piroxidina, riboflavina, Vitamina B12, inyección de cianocobalamina (p.ej., REDISOL™, RUBRAMIN PC™), hidroxocobalamina, ácido fólico (p.ej., FOLVITE™), leucovorina (ácido folínico, 5-CHOH4PteGlu, factor de
15 citrovorum) o WELLCOVORIN (sal de calcio de leucovorina), transferrina o ferritina.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con agentes usados para tratar trastornos psiquiátricos. Los fármacos psiquiátricos que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen agentes antipsicóticos (p. ej., clorpromazina, clorprotixeno, clozapina, flufenazina, haloperidol, loxapina, mesoridazina, molindona, olanzapina, 20 perfenazina, pimozida, quetiapina, risperidona, tioridazina, tiotixeno, trifluoperazina y triflupromazina), agentes antimanía (p.ej., carbamazepina, divalproex sódico, carbonato de litio y citrato de litio), antidepresivos (p.ej., amitriptilina, amoxapina, bupropion, citalopram, clomipramina, desipramina, doxepina, fluvoxamina, fluoxetina, imipramina, isocarboxazid, maprotilina, mirtazapina, nefazodona, nortriptilina, paroxetina, fenelzina, protriptilina, sertralina, tranilcipromina, trazodona, trimipramina y venlafaxina), agentes ansiolíticos (p.ej., alprazolam, buspirona,
25 clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, halazepam, lorazepam, oxazepam y prazepam) y estimulantes (p.ej., damfetamina, metilfenidato y pemolina).
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con agentes usados para tratar trastornos neurológicos. Los agentes neurológicos que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen agentes antiepiléptico (p. ej.,
30 carbamazepina, clonazepam, etosuximida, fenobarbital, fenitoína, primidona, ácido valproico, divalproex sódico, felbamato, gabapentina, lamotrigina, levetiracetam, oxcarbazepina, tiagabina, topiramato, zonisamida, diazepam, lorazepam y clonazepam), agentes antiparkinsonianos (p. ej., levodopa/carbidopa, selegilina, amantidina, bromocriptina, pergolida, ropinirol, pramipexol, benztropina; biperideno; etopropazina; prociclidina; trihexifenidilo, tolcapona) y fármacos ALS (p. ej. riluzol).
35 Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención pueden: administrarse en combinación con agentes vasodilatadores y/o agentes bloqueantes del calcio. Los agentes vasodilatadores que se pueden administrar con las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA) (p. ej., papaverina, isoxsuprina, benazepril, captopril, cilazapril, enalapril, enalaprilat, fosinopril, lisinopril, moexipril, perindopril quinapril, ramipril. spirapril, trandolapril y nilidrina) y nitratos
40 (p.ej., dinitrato de isosorbida, mononitrato de isosorbida y nitruglicerina). Ejemplos de bloqueantes de los canales de calcio que se pueden administrar las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen, entre otros, amlodipina, bepridilo, diltiazem, felodipina, flumarizina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina y verapamilo.
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención se pueden administrar en combinación con
45 tratamientos para trastornos gastrointestinales. Los tratamientos de trastornos gastrointestinales que se pueden administrar las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos de la invención incluyen antagonistas de los receptores de histamina H2 (p. ej., TAGAMET™ (cimetidina), ZANTAC™ (ranitidina), PEPCID™ (famotidina) y AXID™ (nizatidina)); inhibidores de la ATPasa de H+, K+ (p. ej., PREVACID™ (Iansoprazol) y PRILOSEC™ (omeprazol)); compuestos de bismuto (p. ej., PEPTO-BISMOL™ (subsalicilato de bismuto) y DE-NOL™ (subcitrato
50 de bismuto)); varios antiácidos; sucralfato; análogos de prostaglandina (p. ej. ,CYTOTEC™ (misoprostol)); antagonistas colinérgicos muscarínicos; laxantes (p. ej., laxatntes tensioactivos, laxantes estimulantes, laxantes de solución salina y osmóticos); agentes antidiarreicos (p. ej., LOMOTIL™ (difenoxilato), MOTOFEN™ (difenoxina) e IMODIUM™ (loperamida clorhidrato)), análogos sintéticos de la somatostatina tales como SANDOSTATIN™ (octreotida), agentes antieméticos (p. ej., ZOFRAN™ (ondansetrón), KYTRIL™ (granisetrón clorhidrato), tropisetrón,
55 dolasetrón, metoclopramida, clorpromazina, perfenazina, proclorperazina, prometazina, thietilperazina, triflupromazina, domperidona, haloperidol, droperidol, trimetobenzamida, dexametasona, metilprednisolona, dronabinol y nabilona); antagonistas de D2 (p. ej., metoclopramida, trimetobenzamida y clorpromazina); sales biliares; ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico y preparados de enzimas pancreáticas tales como pancreatina y pancrelipasa.
60 Las proteínas de fusión de albúmina y/o los polinucleótidos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otros regímenes terapéuticos o profilácticos, tales como, por ejemplo, radioterapia.
También se divulga un paquete o kit farmacéutico que comprenden uno o más envases cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de fusión de albúmina de la invención. Asociados opcionalmente con dicho(s) envase(s) puede adjuntarse una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, en la que se refleja la aprobación de la agencia de la fabricación, uso o venta del producto para administración en seres humano.
Un procedimiento de administración local es mediante infección directa. Una proteína de fusión de albúmina de la presente invención puede formar un complejo con un vehículo de liberación y se administra mediante inyección directa en o localmente dentro del área de las arterias. La administración de una composición localmente dentro del área de las arterias se refiere a inyectar la composición unos centímetros y, preferentemente, milímetros dentro de las arterias.
Las composiciones terapéuticas útiles en la administración sistémica incluyen proteínas de fusión de la presente invención en complejo con un vehículo de liberación dirigido de la presente invención. Vehículos de liberación adecuados para usar con administración sistémica comprenden liposomas que comprenden ligandos que dirigen al vehículo a un sitio concreto.
Vehículos de liberación adecuados para usar con administración sistémica comprenden liposomas que comprenden proteínas de fusión de albúmina de la invención que dirigen al vehículo a un sitio concreto.
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden administrar a cualquier animal, preferentemente a mamíferos y aves. Mamíferos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratas, conejos, ovejas, ganado bovino, caballos y cerdos.
Actividades biológicas
Las proteínas de fusión de albúmina y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden usar en ensayos para analizar una o más actividades biológicas. Si una proteína de fusión de albúmina y/o poli nucleótido exhibe una actividad en un ensayo concreto, es probable que la proteína terapéutica correspondiente a la proteína de fusión pueda estar implicada en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. Por tanto, la proteína de fusión se podría usar para tratar la enfermedad asociada.
En realizaciones preferidas, la presente invención abarca el uso de las proteínas de fusión de albúmina definidas en las reivindicaciones para tratar una enfermedad o trastorno indicado en la columna “Indicación preferida Y” de la tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento de prevención o mejora una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprende la porción de proteína terapéutica correspondiente a la proteína terapéutica divulgada en la columna “Proteína terapéutica X” de la tabla 1 (en la misma fila que la enfermedad o trastorno que se va a tratar se indica en la columna "“Indicación preferida Y" de la tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.
En una realización preferida adicional, la presente invención abarca el uso de las proteínas de fusión de albúmina definidas en las reivindicaciones para tratar una enfermedad o trastorno indicado para una proteína terapéutica concreta en la “Indicación preferida Y” de la tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprende la porción de proteína terapéutica correspondiente a la proteína terapéutica para la cual las indicaciones en los Ejemplos están indicadas en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.
Específicamente contempladas están las proteínas de fusión de albúmina producidas por una célula cuando están codificadas por los polinucleótidos que codifican la SEC ID Nº Y. Cuando estos polinucleótidos se usan para expresar las proteínas codificadas de una célula, la secreción natural de la célula y las etapas de procesamiento producen una proteína que carece de la secuencia señal explícitamente indicada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2. La secuencia de aminoácidos específica de la secuencia señal indicada se muestra más adelante en la memoria o es bien conocida en la técnica. Por tanto, la mayoría de las realizaciones preferidas de la presente invención incluyen la proteína de fusión de albúmina producida por una célula (que carecería de la secuencia líder mostrada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2). Asimismo, los más preferidos son polipéptidos que comprenden la SEC Nº Y sin la secuencia líder específica indicada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2. También se prefieren las composiciones que comprenden estas dos realizaciones preferidas, incluyendo las composiciones farmacéuticas. Estas proteínas de fusión de albúmina se contemplan específicamente para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno indicado para una proteína terapéutica concreta en la columna “Indicación preferida Y" de la tabla 1.
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos relacionados con enfermedades y trastornos del sistema endocrino (véase, por ejemplo, la sección “Trastornos endocrinos” más adelante), el sistema nervioso (véase, por ejemplo, la sección “Trastornos neurológicos” más adelante), el sistema inmunitario (véase, por ejemplo, la sección “Actividad inmunitaria” más adelante), sistema cardiovascular (véase, por ejemplo, la sección "Trastornos cardiovasculares" más adelante), sistema reproductor (véase, por ejemplo, la sección "Trastornos del sistema reproductor" más adelante) y/o sistema digestivo (véase, por ejemplo, la sección "Trastornos gastrointestinales" más adelante).
En ciertas realizaciones, una proteína de fusión de albúmina de la presente invención se puede usar para diagnosticar y/o pronosticar enfermedades y/o trastornos asociados con el o los tejidos en los que se expresa el gen correspondiente a la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de la invención.
Por tanto, las proteínas de fusión de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención son útiles en el diagnóstico, detección y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con actividades que incluyen, entre otros, la activación de prohormonas, la actividad de neurotransmisor, la señalización celular, la proliferación celular, la diferenciación celular y la migración celular.
Más generalmente, las proteínas de fusión de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con los sistemas siguientes.
Actividad inmunitaria
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades, trastornos y/o afecciones del sistema inmunitario mediante, por ejemplo, activación o inhibición de la proliferación diferenciación o movilización (quimiotaxis) de las células inmunitarias. Las células inmunitarias se desarrollan a través de un proceso denominado hematopoyesis, produciendo células mieloides (plaquetas, glóbulos rojos, neutrófilos y macrófagos) y linfoides (linfocitos B y T) a partir de células madre pluripotenciales. La etiología de estas enfermedades, trastornos y/o afecciones inmunitarias pueden ser enfermedades genéticas, somáticas, tales como cáncer y algunas enfermedades autoinmunitarias, adquiridas (p. ej., mediante quimioterapia o toxinas) o infecciosas. Además, las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como marcadores o detectores de una enfermedad o trastorno concreto del sistema inmunitario.
En otra realización, una proteína de fusión de la invención y/o polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede usar para tratar enfermedades y trastornos del sistema inmunitario y/o para inhibir o potenciar una respuesta inmunitaria generada por células asociadas con el o los tejidos en los que se expresa el polipéptido de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de inmunodeficiencias, incluidas inmunodeficiencias tanto congénitas como adquiridas.
Las enfermedades o trastornos autoinmunitarios que se pueden crear, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar por las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otras, una o más de las siguientes: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica, trombocitopenia, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, púrpura (p. ej., púrpura de Henloch-Scoenlein), autoinmunocitopenia, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, miastenia gravis, enfermedad de Graves (hipertiroidismo) y diabetes mellitus resistente a insulina.
Trastornos adicionales que probablemente tengan un componente autoinmunitario que se pueden tratar, presentar y/o diagnosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, artritis inducida por colágeno de tipo II, síndrome antifosfolípidos, dermatitis, encefalomielitis alérgica, miocarditis, policondritis recidivante, enfermedad cardíaca reumática, neuritis, uveítis, oftalmia, poliendocrinopatías, enfermedad de Reiter, síndrome de del hombre rígido, inflamación pulmonar autoinmunitaria, autismo, síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina y trastornos oculares inflamatorios autoinmunitarios.
Trastornos adicionales que probablemente tengan un componente autoinmunitario que se pueden tratar, presentar, diagnosticar y/o pronosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, esclerodermia con anticuerpos anticolágeno (a menudo caracterizados por, por ejemplo, anticuerpos nucleolares y otros nucleares), enfermedad del tejido conjuntivo mixto (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos frente a antígenos nucleares extraíbles (p. ej., ribonucleoproteína)), polimiositis (a menudo caracterizada por, por ejemplo, ANA no histonas), anemia perniciosa (a menudo caracterizada por, por ejemplo, células antiparietales, microsomas y anticuerpos frente al factor intrínseco), enfermedad de Addison idiopática (a menudo caracterizada por, por ejemplo, citotoxicidad humoral y celular), infertilidad (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos antiespermatozoicos), glomerulonefritis (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos frente a la membrana basal glomerular o complejos inmunitarios), penfigoide ampolloso (a menudo caracterizado por, por ejemplo, IgG y complemento en la membrana basal), síndrome de Sjogren (a menudo caracterizado por, por ejemplo, anticuerpos de múltiples tejidos y/o ANA no histonas específicos (SS-B)), diabetes mellitus (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos de las células de los islotes humorales y celulares) y resistencia a fármacos adrenérgicos (incluida la resistencia a fármacos adrenérgicos con asma o fibrosis quística) (a menudo caracterizar por, por ejemplo, anticuerpos frente a los receptores beta-adrenérgicos).
Además, las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención tienen usos en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de afecciones inflamatorias Por ejemplo, ya que las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden inhibir la activación, proliferación y/o diferenciación de células implicadas en una respuesta inflamatoria, estas moléculas se pueden usar para prevenir y/o tratar afecciones inflamatorias crónicas y agudas. Dichas afecciones inflamatorias incluyen, entre otras, por ejemplo, inflamación asociada con infección (p. ej., shock séptico, sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica), lesión por reperfusión tras isquemia, letalidad de endotoxina, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citoquinas o quimioquinas, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, hiperproducción de citoquinas (p. ej., TNF o IL-1.), trastornos respiratorios (p. ej., asma y alergia); trastornos gastrointestinales (p. ej., enfermedad intestinal inflamatoria); cánceres (p. ej., gástrico, ovárico, pulmonar, de vejiga, hepático y de mama); trastornos de SNC (p. ej., esclerosis múltiple, lesión cerebral isquémica y/o ictus, lesión cerebral traumática, trastornos neurodegenerativos (p. ej., enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer); demencia relacionada con el SIDA; y enfermedad de priones); trastornos cardiovasculares (p. ej., aterosclerosis, miocarditis, enfermedad cardiovascular y complicación por derivación cardiopulmonar); así como muchas enfermedades, afecciones y trastornos adicionales que se caracterizan por inflamación (p. ej., hepatitis, artritis reumatoide, gota, traumatismo, pancreatitis, sarcoidosis, dermatitis, lesión por reperfusión tras isquemia renal, enfermedad de Graves, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus y rechazo de transplante alogénico).
En otra realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se usan en una o más de las aplicaciones descritas en el presente documento, ya que se pueden aplicar a medicamentos veterinarios.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para, por ejemplo, inhibir la quimiotaxis del polipéptido y la activación de los macrófagos y sus precursores, y de los neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunas subpoblaciones de células T, por ejemplo células T activadas y CD8 citotóxicas y células asesinas naturales, en ciertas enfermedades autoinmunitarias, e infecciosas e inflamatorias crónicas. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias se describen en el presente documento e incluyen esclerosis múltiple y diabetes dependiente de insulina.
Trastornos renales
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos del sistema renal. Los trastornos renales que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con composiciones de la invención incluyen insuficiencia renal, nefritis, trastornos de los vasos sanguíneos de trastornos renales, metabólicos y renales congénitos, trastornos urinarios de trastornos renales autoinmunitarios, esclerosis y necrosis, desequilibrio de electrolitos y cánceres renales.
Enfermedades renales que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con composiciones de la invención incluyen insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, insuficiencia renal ateroembólica, enfermedad renal terminal, enfermedades inflamatorias del riñón (p. ej., glomerulonefritis aguda, glomerulonefritis postinfecciosa, glomerulonefritis de progresión rápida, síndrome nefrótico, glomerulonefritis membranosa, síndrome nefrótico familiar, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis proliferativa mesangial I y II, glomerulonefritis crónica, nefritis tubulointersticial aguda, nefritis tubulointersticial crónica, glomerulonefritis postestreptocócica aguda (PSGN), pielonefritis, nefritis lúpica, nefritis crónica, nefritis intersticial y glomerulonefritis postestreptocócica), trastornos de los vasos sanguíneos de los riñones (p. ej., infarto renal, enfermedad renal ateroembólica, necrosis cortical, nefroesclerosis maligna, trombosis de las venas renales, subperfusión renal, retinopatía renal, reperfusión por isquemia renal, embolia de las arterias renales y estenosis de las arterias renales), y trastornos renales resultante de enfermedad del tracto urinario (p. ej., pielonefritis, hidronefrosis, urolitiasis (litiasis renal, nefrolitiasis), nefropatía por reflujo, infecciones del tracto urinario, retención urinaria y uropatía obstructiva unilateral aguda o crónica.)
Además, las composiciones de la invención se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar los trastornos metabólicos y congénitos del riñón (p. ej., uremia, amiloidosis renal, osteodistrofia renal, acidosis tubular renal, glucosuria renal, diabetes insípida neurogénica, cistinuria, síndrome de Fanconi, osteosis fibroquística renal (osteodistrofia renal), enfermedad de Hartnup, síndrome de Bartter, síndrome de Liddie, enfermedad renal poliquística, enfermedad quística medular, poliquistosis renal medular, síndrome de Alport, síndrome de uña-rótula, síndrome nefrótico congénito, síndrome de CRUSH, riñón en herradura, nefropatía diabética, diabetes insípida nefrogénica, nefropatía analgésica, cálculos renales y nefropatía membranosa) y trastornos autoinmunitarios del riñón (p. ej., lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Goodpasture, nefropatía por IgA y glomerulonefritis proliferativa mesangial por IgM).
Enfermedades cardiovasculares
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos cardiovasculares, incluidos, entre otros, enfermedad de las arterias periféricas, tal como isquemia de las extremidades.
Las enfermedades cardiovasculares incluyen, entre otros, anomalías cardiovasculares tales como fístula arterioarterial, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos cardíacos congénitos, atresia pulmonar y síndrome de la cimitarra. Defectos cardíacos congénitos incluyen, entre otros, coartación aórtica, cor triatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón entrecruzado, dextrocardia, conducto arterial persistente, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, levocardia, tetralogía de fallot, transposición de grandes vasos, doble salida del ventrículo derecho, atresia de la tricúspide, tronco arterial persistente y defectos septales cardíacos, tales como defecto septal aortopulmonar, defectos de la almohadilla endocárdica, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos septales cardíacos ventriculares.
Las enfermedades cardiovasculares incluyen, entre otras, enfermedad cardíaca, tales como arritmias, enfermedad cardíaca carcinoide, gasto cardíaco elevado, gasto cardíaco bajo, taponamiento cardíaco, endocarditis (incluyendo la bacteriana), aneurisma cardíaco, parada cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, miocardiopatía congestiva, disnea paroxística, edema cardíaco, hipertrofia cardíaca, miocardiopatía congestiva, hipertrofia del ventrículo izquierdo, hipertrofia del ventrículo derecho, rotura cardíaca postinfarto, rotura del tabique ventricular, enfermedades de las válvulas cardíacas, enfermedades del miocardio, isquemia miocárdica, derrame pericárdico, pericarditis (incluyendo constrictiva y tuberculosa), neumopericardio, síndrome pospericardiotomía, enfermedad cardíaca pulmonar, enfermedad cardíaca reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares de la gestación, síndrome de la cimitarra, sífilis cardiovascular y tuberculosis cardiovascular.
Arritmias incluyen, entre otros, arritmia sinusal, fibrilación auricular, aleteo auricular, bradicardia, extrasístole, síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de rama, bloqueo senoauricular, síndrome del QT largo, parasístole, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexcitación de tipo Mahaim, síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome del seno enfermo, taquicardias y fibrilación ventricular. Taquicardias incluyen taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal auriculoventricular, taquicardia auricular ectópica, taquicardia ectópica de la unión, taquicardia de reentrada nodal senoauricular, taquicardia sinusal, Torsades de Pointes y taquicardia ventricular.
Las enfermedades de las válvulas cardíacas incluyen, entre otras, insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, soplos cardíacos, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia de la tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide y estenosis de la válvula tricúspide.
Enfermedades del miocardio incluyen, entre otras, miocardiopatía alcohólica, miocardiopatía congestiva, miocardiopatía hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, miocardiopatía restrictiva, miocardiopatía de Chagas, fibroelastosis endocárdica, fibrosis endomiocárdica, síndrome de Kearns, lesión por reperfusión del miocardio y miocarditis.
Isquemias miocárdicas incluyen, entre otras, enfermedad coronaria, tal como angina de pecho, aneurisma coronaria, arteriosclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto de miocardio y aturdimiento miocárdico.
Las enfermedades cardiovasculares también incluyen enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, enfermedad de Hippel-Lindau, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, enfermedades aórticas, arteritis de Takayasus, aortitis, síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, arteritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, trastornos cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolias, trombosis, eritromegalgia, hemorroides, enfermedad venooclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena retiniana, síndrome de la cimitarra, síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, telangiectasia ataxia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis e insuficiencia venosa.
Los aneurismas incluyen, entre otros, aneurismas disecantes, falsos aneurismas, aneurismas infectados, rotura de aneurisma, aneurismas aórticos, aneurismas cerebrales, aneurismas coronarios, aneurismas cardíacos y aneurismas ilíacos.
Las enfermedades oclusivas arteriales incluyen, entre otras, arteriosclerosis, claudicación intermitente, estenosis de las carótidas, displasias fibromusculares, oclusión vascular mesentérica, enfermedad de Moyamoya, obstrucción de las arterias renales, oclusión de las arterias retinianas y tromboangitis obliterante.
Los trastornos cerebrovasculares incluyen, entre otros, enfermedades de las arterias carótidas, angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformación arteriovenosa cerebral, enfermedades de las arterias cerebrales, embolia y trombosis cerebral, trombosis de las arterias carótidas, trombosis sinusal, síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral (incluyendo transitoria), síndrome de robo de la subclavia, leucomalacia periventricular, cefalea vascular, cefalea en racimos, migraña e insuficiencia vertebrobasilar.
Las embolias incluyen, entre otras, embolias gaseosas, embolias de líquido amniótico, embolia de colesterol, síndrome del pie azul, embolias grasas, embolias pulmonares y tromboembolias. Trombosis incluyen, entre otras, trombosis coronarias, trombosis de las venas hepáticas, oclusión de la vena retiniana, trombosis de las arterias carótidas, trombosis sinusal, síndrome de Wallenberg y tromboflebitis.
Los trastornos isquémicos incluyen, entre otros, isquemia cerebral, colitis isquémica, síndromes compartimentales, síndrome del compartimento anterior, isquemia miocárdica, lesiones por reperfusión e isquemia de las extremidades periféricas. Las vasculitis incluyen, entre otras, aortitis, arteritis, síndrome de Behcet, síndrome de Churg-Strauss, síndrome de los ganglios linfáticos mucocutáneos, tromboangiitis obliterante, vasculitis por hipersensibilidad, púrpura de Schoenlein-Henoch, vasculitis cutánea alérgica y granulomatosis de Wegener.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, inyección directa con aguja en el punto de liberación, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja de geoespuma, otros materiales depot disponibles comercialmente, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas para supositorio u orales, aplicaciones para decantación o tópicas durante cirugía, liberación de aerosoles. Dichos procedimientos se conocen en la técnica. En el presente documento se describen con más detalle procedimientos de liberación de polinucleótidos.
Actividad antiangiogénesis
El equilibrio natural entre estimuladores e inhibidores endógenos de la angiogénesis es uno en el que predominan las influencias inhibidoras. Rastinejad et al., Cell 56:345-355 (1989). En los raros casos en los que se produce neovascularización en condiciones fisiológicas normales, como cicatrización de heridas, regeneración de órganos, desarrollo embrionario y procesos reproductores femeninos, la angiogénesis está rigurosamente regulada y delimitada en el espacio y en el tiempo.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de otros trastornos, además de cáncer, que implican angiogénesis. Estos trastornos incluyen tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicas, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; placas arteroscleróticas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, rechazo de injertos corneales, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y Pterygia (crecimiento anormal de los vasos sanguíneos) del ojo, artritis reumatoide; psoriasis; retraso en la cicatrización de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas en zonas de no unión; esclerodermia; tracoma; adherencias vasculares; angiogénesis miocárdica; colaterales coronarias; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de las extremidades isquémicas; síndrome de Osler-Webber; neovascularización en placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de heridas; enfermedad de Crohn; y aterosclerosis.
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención también proporciona procedimientos para tratar enfermedades neovasculares del ojo, incluyendo, por ejemplo, neovascularización corneana, glaucoma neovascular, retinopatía diabética proliferativa, fibroplasia retrolental y degeneración macular.
Además, los trastornos oculares asociados con neovascularización que se pueden tratar con proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros: glaucoma neovascular, retinopatía diabética, retinoblastoma, fibroplasia retrolental, uveítis, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, neovascularización de injertos corneales, así como otras enfermedades inflamatorias, tumores oculares y enfermedades asociadas con neovascularización de la coroides o del iris. Véase, por ejemplo, las revisiones de Waltman et al., Am. J. Ophthal. 85:704-710 (1978) and Gartner et al., Surv. Ophthal 22:291-312 (1978).
En otro aspecto de la presente invención, los compuestos de la invención se pueden usar para tratar la retinopatía proliferativa diabética administrando a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención de modo que se inhibe la formación de los vasos sanguíneos.
En realizaciones particularmente preferidas de la invención, la retinopatía diabética proliferativa se puede tratar mediante inyección en el humor acuoso o el vítreo, con el fin de incrementar la concentración local del polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista en la retina. Preferentemente, este tratamiento deberá iniciarse antes de la adquisición de enfermedades graves que requieren fotocoagulación.
Además, los trastornos y/o estados que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen tumores sólidos, tumores de transporte en sangre tales como leucemias, metástasis tumorales, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, rechazo de injerto corneano, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma y uveítis, cicatrización retardada de heridas, endometriosis, vasculogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides), fracturas en zonas que no son de unión, esclerodermia, tracoma, adherencias vasculares, angiogénesis miocárdica, colaterales coronarias, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis de las extremidades isquémicas, síndrome de Osler-Webber, neovascularización en placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, displasia fibromuscular, granulación de heridas, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, agentes de control de la natalidad mediante la prevención de la vascularización requerida para la implantación de embriones controlando la menstruación, enfermedades que tienen angiogénesis como consecuencia patológica tal como la enfermedad del arañazo del gato (Rochele minalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonelosis y angiomatosis bacilar.
Cicatrización de heridas y proliferación de células epiteliales
Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención podrían usarse para tratar o prevenir el inicio de la diabetes mellitus. En pacientes con diabetes de tipos I y II recién diagnosticada, en las que queda alguna función de las células de los islotes, las proteínas de fusión de la invención y/ polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención podrían usarse para mantener la función de los islotes para aliviar, retrasar o prevenir la manifestación permanente de la enfermedad. Asimismo, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención podrían usarse como auxiliares en el transplante de células de los islotes para mejorar o estimular la función de las células de los islotes.
Actividad neural y enfermedades neurológicas
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades, trastornos, daños o lesiones cerebrales y/o del sistema nervioso. Los trastornos del sistema nervioso que se pueden tratar con las composiciones de la invención (p. ej., proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención) incluyen, entre otros, lesiones del sistema nervioso y enfermedades o trastornos que tienen como resultado la desconexión de axones, una disminución o degeneración de las neuronas, o desmielinización. Las lesiones del sistema nervioso que se pueden tratar en un paciente (incluyendo pacientes mamíferos humanos y no humanos) de acuerdo con los procedimientos de la invención incluyen, entre otros, las lesiones siguientes de los sistemas nerviosos central (incluyendo la médula espinal, cerebral) o periférico. (1) lesiones isquémicas, en las que una falta de oxígeno en una porción del sistema nervioso tiene como resultado una lesión neuronal o la muerte, incluyendo infarto cerebral o isquemia, o infarto de la médula espinal o isquemia; (2) lesiones traumáticas, incluyendo lesiones causadas por lesiones físicas o asociadas con cirugía, por ejemplo lesiones que afectan a una parte del sistema nervioso, o lesiones por compresión; (3) lesiones malignas, en las que una parte del sistema nervioso es destruida o dañada por tejido maligno que es una neoplasia maligna asociada con el sistema nervioso o una neoplasia maligna derivada de tejido no perteneciente al sistema nervioso; (4) lesiones infecciosas, en las que una parte del sistema nervioso es destruida o dañada como resultado de una infección, por ejemplo, por un absceso, o asociadas con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, virus de herpes zoster o de herpes simple, o por la enfermedad de Lyme, tuberculosis o sífilis; (5) lesiones degenerativas en las que una parte del sistema nervioso es destruida o dañada como resultado de un proceso degenerativo, incluyendo, entre otros, degeneración asociada con la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, o esclerosis lateral amiotrófica (ELA); (6) lesiones asociadas con enfermedades o trastornos nutricionales en los que una parte del sistema nervioso es destruido o dañado por un trastorno nutricional o trastorno del metabolismo, incluyendo, entre otros, deficiencia de la vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopía de tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-Bignami (degeneración primaria del cuerpo calloso) y degeneración ce rebelar alcohólica; (7) lesiones neurológicas asociadas con enfermedades sistémicas, incluyendo, entre otros, diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell), lupus eritematoso sistémico, carcinoma o sarcoidosis;
(8) lesiones causadas por sustancias tóxicas, incluyendo alcohol, plomo o neurotoxinas concretas; y (9) lesiones de desmielinización en las que una parte del sistema nervioso es destruida o dañada por una enfermedad de desmielinización incluyendo, entre otras, esclerosis múltiple, inmunodeficiencia humana, mielopatía asociada con virus, mielopatía asociada con virus, mielopatía transversa o varias etiologías, leucoencefalopatía multifocal progresiva y mielinolisis pontina central.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para proteger las células neurales de los efectos dañinos de la hipoxia. En una realización preferida adicional, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se usan para proteger las células neurales de los efectos dañinos de la hipoxia cerebral. De acuerdo con la presente realización, las composiciones de la invención se usan para tratar o prevenir la lesión celular neural asociada con la hipoxia cerebral.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir las lesiones celulares neurales asociadas con isquemia cerebral. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir las lesiones celulares neurales asociadas con infarto cerebral.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir las lesiones celulares neurales asociadas con un ictus. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir las lesiones celulares neurales cerebrales asociadas con un ictus.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir las lesiones celulares neurales asociadas con un ataque al corazón. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir las lesiones celulares neurales cerebrales asociadas con un ataque al corazón.
Las composiciones de la invención que son útiles para tratar o prevenir un trastorno del sistema nervioso se pueden seleccionar analizando la actividad biológica en la estimulación de la supervivencia o diferenciación de las neuronas. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las composiciones de la invención que provocan cualquiera de los siguientes efectos pueden ser útiles de acuerdo con la invención: (1) incremento del tiempo de supervivencia de las neuronas en cultivo en presencia o ausencia de hipoxia o condiciones hipóxicas; (2) incremento de la proliferación de neuronas en cultivo o in vivo; (3) incremento de la producción de una molécula asociada con neuronas en cultivo o in vivo, por ejemplo colina acetiltransferasa o acetilcolinesterasa con respecto a neuronas motoras; o (4) disminución de los síntomas de disfunción neuronal in vivo. Dichos efectos se pueden medir mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. En realizaciones preferidas no limitantes, el incremento de la supervivencia de las neuronas se puede medir de forma rutinaria usando un procedimiento expuesto en el presente documento o, de otro modo, conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, en Zhang et al., Proc Natl Acad Sci USA 97:3637-42 (2000) o en Arakawa et. al., J. Neurosci., 10:3507-15 (1990); incremento de la proliferación de neuronas se puede detectar mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, los procedimientos expuestos en Pestronk et al., Exp Neurol., 70:65-82 (1980), o Brown et al., Ann. Rev. Neurosci., 4:17-42 (1981); el incremento de la producción de moléculas asociadas con neuronas se puede medir mediante bioensayo, ensayo enzimático, unión de anticuerpos, ensayo de transferencia de tipo Northern, etc., usando técnicas conocidas en la materia y dependiendo de la molécula que se va a medir; y la disfunción de las neuronas motoras se puede medir evaluando la manifestación física del trastorno de las neuronas motoras, por ejemplo debilidad, velocidad de la conducción de las neuronas motoras o discapacidad funcional.
Los trastornos de las neuronas motoras que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen, entre otros, trastornos tales como infarto, infección, exposición a toxinas, traumatismo, daños quirúrgicos, enfermedad degenerativa o neoplasia maligna que puede afectar a neuronas motoras, así como a otros componentes del sistema nervioso, así como trastornos que afectan de forma selectiva a neuronas tales como esclerosis lateral amiotrófica e, incluyendo, entre otros, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva de la infancia (síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome pospolio y neuropatía motora-sensorial hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth).
Además, las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden desempeñar un papel en la supervivencia neuronal; formación de sinapsis; conductancia; diferenciación neural; etc. Por tanto, las composiciones de la invención (incluyendo las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención) se pueden usar para diagnosticar y/o tratar o prevenir enfermedades o trastornos asociados con estas funciones, incluyendo, entre otros, trastornos del aprendizaje y/o la cognición. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de estados de enfermedad neurodegenerativa y/o trastornos de comportamiento. Dichos estados de enfermedad neurodegenerativa y/o trastornos de comportamiento incluyen, entre otros, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de, Huntington, síndrome de Tourette, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastorno obsesivo compulsivo, trastorno del pánico, discapacidades de aprendizaje, ELA, psicosis, autismo y comportamientos alterados, incluyendo trastornos de la alimentación, de los patrones de sueño, del equilibrio y la percepción. Además, las composiciones de la invención también pueden desempeñar un papel en el tratamiento, prevención y/o detección de trastornos del desarrollo asociados con el embrión en desarrollo o trastornos sexuales.
Además, las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en la protección de células neurales de enfermedades, daños, trastornos o lesiones asociados con trastornos cerebrovasculares incluyendo, entre otros, enfermedades de las arterias carótidas (p. ej., trombosis de las arterias carótidas, estenosis de las carótidas o enfermedad de Moyamoya), angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, enfermedades de las arterias cerebrales, embolia y trombosis cerebral (p. ej., trombosis de las arterias carótidas, trombosis sinusal o síndrome de Wallenberg), hemorragia cerebral (p. ej., hematoma epidural o subdural o hemorragia subaracnoidal), infarto cerebral, isquemia cerebral (p. ej., isquemia cerebral transitoria, síndrome del robo de la subclavia o insuficiencia vertebrobasilar), demencia vascular (p. ej., múltiples infartos), leucomalacia, periventricular y cefalea vascular (p. ej., cefalea en racimos o migrañas).
Se proporciona un procedimiento para usar proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, para fines terapéuticos, para, por ejemplo, estimular la proliferación y/o diferenciación de las células neurológicas. Por tanto, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para tratar y/o detectar enfermedades neurológicas. Además, las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como marcadores o detectores de una enfermedad o trastorno concreto del sistema nervioso.
Ejemplos de enfermedades neurológica que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen enfermedades cerebelosas, tales como enfermedades cerebelosas metabólicas que incluyen fenilcetonuria tales como fenilcetonuria materna, deficiencia de la piruvato carboxilasa, deficiencia del complejo de la piruvato deshidrogenasa, encefalopatía de Wernicke, edema cerebral, neoplasias cerebrales, tales como neoplasias cerebelosas que incluyen neoplasias infratentoriales, neoplasias del ventrículo cerebral tales como neoplasias del plexo coroideo, neoplasias del hipotálamo, neoplasias supratentoriales, enfermedad de canavan, enfermedades cerebelosas tales como ataxia cerebelosa que incluyen degeneración espinocerebelosa tales como ataxia telangiectasia, disinergia cerebelosa, ataxia de Friederich, enfermedad de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelosa, neoplasias cerebelosas tales como neoplasias infratentoriales, esclerosis cerebral difusa tales como encefalitis periaxial, leucodistrofia de células globoides, leucodistrofia metacromática y panencefalitis esclerosante subaguda.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen trastornos cerebrovasculares (tales como enfermedades de las arterias carótidas, que incluyen trombosis de las arterias carótidas, estenosis de las carótidas y enfermedad de Moyamoya), angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, enfermedades de las arterias cerebrales, embolia y trombosis cerebral, tales como trombosis de las arterias carótidas, trombosis sinusal o síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, tales como hematoma epidural, hematoma subdural y hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral, tal como isquemia cerebral transitoria, síndrome del robo de la subclavia e insuficiencia vertebrobasilar, demencia vascular, tal como múltiples infartos, leucomalacia, periventricular, cefalea vascular tal como cefalea en racimos y migrañas.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen demencia, tal como el complejo de demencia por SIDA, demencia presenil tal como enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Creutzfeldt-Jakob, demencia senil tal como enfermedad de Alzheimer' y parálisis supranuclear progresiva, demencia vascular tal como demencia múltiples infartos, encefalitis que incluyen encefalitis periaxial, encefalitis viral tal como encefalitis epidémica, encefalitis japonesa, encefalitis de St. Louis, encefalitis por garrapatas y fiebre del Nilo occidental, encefalomielitis diseminada aguda, meningoencefalitis tal como el síndrome uveomeningoencefalítico, enfermedad de Parkinson postencefalitis y panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomalacia tal como leucomalacia periventricular, epilepsia tal como epilepsia generalizada que incluye espasmos infantiles, epilepsia de ausencia, epilepsia mioclónica que incluye el síndrome de MERRF, epilepsia tónico-clónica, epilepsia parcial tal como epilepsia parcial compleja, epilepsia del lóbulo frontal y epilepsia del lóbulo temporal, epilepsia postraumática, estado epiléptico tal como epilepsia parcial continua y síndrome de Hallervorden-Spatz.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen hidrocefalia tales como el síndrome de Dandy-Walker e hidrocefalia de presión normal, enfermedades hipotalámicas tales como neoplasias hipotalámicas, malaria cerebral, narcolepsia que incluye cataplejía, poliomielitis bulbar, seudotumor cerebral, síndrome de Rett, síndrome de Reye, enfermedades talámicas, toxoplasmosis cerebral, tuberculoma intracraneal y síndrome de Zellweger, infecciones del sistema nervioso central, tal como el complejo de demencia y SIDA, absceso cerebral, empiema subdural, encefalomielitis tal como encefalomielitis equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis hemorrágica necrotizante, visna y malaria cerebral.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen meningitis tales como aracnoiditis, meningitis aséptica tales como meningitis viral que incluye coriomeningitis linfocítica, meningitis bacteriana que incluye meningitis por Haemophilus, meningitis por Listeria, meningitis meningocócica tal como el síndrome de Waterhouse-Friderichsen, meningitis neumocócica y tuberculosis meníngea, meningitis fúngica tal como meningitis criptocócica, derrame subdural, meningoencefalitis tal como síndrome uveomeningoencefalítico, mielitis tal como mielitis transversa, neurosífilis tal como tabes dorsalis, poliomielitis, que incluye poliomielitis bulbar y síndrome pospoliomielitis, enfermedades de priones (tal como el síndrome de Creutzfeldt-Jakob, la encefalopatía espongiforme bovina, síndrome de Gerstmann-Straussler, Kuru, encefalopatía espongiforme ovina) y toxoplasmosis cerebral.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen neoplasias del sistema nervioso central, tal como neoplasias cerebrales que incluyen neoplasias cerebelosas tales como neoplasias infratentoriales, neoplasias del ventrículo cerebral tal como neoplasias del plexo coroideo, neoplasias del hipotálamo y neoplasias supratentoriales, neoplasias meníngeas, neoplasias de la médula espinal que incluyen neoplasias epidurales, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades de canavan, esclerosis cerebral difusa que incluye adrenoleucodistrofia, encefalitis periaxial, leucodistrofia de células globoides, esclerosis cerebral difusa tales como leucodistrofia metacromática, encefalomielitis alérgica, encefalomielitis hemorrágica necrotizante, leucoencefalopatía multifocal progresiva, esclerosis múltiple, mielinolisis pontina central, mielitis transversa, neuromielitis óptica, encefalopatía espongiforme ovina, hiperlordosis, síndrome de fatiga crónica, visna, síndrome nervioso de presión alta, meningismo, enfermedades de la médula espinal tal como amiotonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal tal como la enfermedad de Werdnig-Hoffmann, compresión de la médula espinal, neoplasias de la médula espinal, tal como neoplasias epidurales, siringomielia, Tabes Dorsalis, síndrome del hombre rígido, retraso mental tal como síndrome de Angelman, síndrome de Cri-du-Chat, síndrome de De Lange, síndrome de Down, gangliosidosis tal como gangliosidosis G(M1), enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Hartnup, homocistinuria, síndrome de Laurence-Moon- Biedl, síndrome de Lesch-Nyhan, enfermedad de orina con olor a jarabe de arce, mucolipidosis tal como fucosidosis, lipofuscinosis neuronal ceroide, síndrome oculocerebrorrenal, fenilcetonuria tal como fenilcetonuria maternal, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, esclerosis tuberosa, síndrome WAGR, anomalías del sistema nervioso tales como holoprosencefalia, defectos del tubo neural tales como anencefalia que incluye hidrangencefalia, deformidad de Arnold-Chairi, encefalocele, meningocele, meningomielocele, disrafismo espinal tal como espina bífida quística y espina bífida oculta.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen neuropatías sensoriales y motoras hereditarias que incluyen enfermedad de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditaria, enfermedad de Refsum, paraplejia espástica hereditaria, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, neuropatías sensoriales y autónomas hereditarias tales como analgesia congénita y disautonomía familiar, manifestaciones neurológicas (tal como agnosia, que incluyen síndrome de Gerstmann, amnesia tal como amnesia retrógrada, apraxia, vejiga neurogénica, cataplejía, trastornos de la comunicación tales como trastornos de la audición que incluyen sordera, pérdida de audición parcial, audiometría y acúfenos, trastornos del habla tales como afasia que incluyen agrafia, anomia, afasia de broca y afasia de Wernicke, dislexia, tal como dislexia adquirida, trastornos del desarrollo del lenguaje, trastornos del habla tales como afasia, que incluye anomia, afasia de broca y afasia de Wernicke, trastornos de la articulación, trastornos de la comunicación tales como trastornos del habla que incluyen disartria, ecolalia, mutismo e interrupción, trastornos de a voz, tales como afonía y ronquera, estado descerebrado, delirio, fasciculación, alucinaciones, meningismo, trastornos del movimiento tales como el síndrome de Angelman, ataxia, atetosis, corea, distonía, hipocinesia, hipotonía muscular, mioclonos, tic, tortícolis y temblores, hipertonía muscular tal como rigidez muscular tales como el síndrome del hombre rígido, espasticidad muscular, parálisis tal como parálisis facial, que incluye herpes Zoster Oticus, gastroparesia, hemiplejia, oftalmoplejia tal como diplopía, síndrome de Duane, síndrome de Horner, oftalmoplejia externa progresiva crónica tal como síndrome de Kearns, parálisis bulbar, paraparesia espástica tropical, paraplejia tal como síndrome de Brown-Sequard, tetraplejia, parálisis respiratoria y parálisis de las cuerdas vocales, paresia, extremidad fantasma, trastornos del gusto tales como ageusia y disgeusia, trastornos de la visión tales como ambliopía, ceguera, defectos de la visión en color, diplopía, hemianopsia, escotoma y visión anormal, trastornos del sueño tales como hipersomnio, que incluye síndrome de Kleine-Levin, insomnio y sonambulismo, espasmo tales como trismo, inconciencia tal como coma, estado vegetativo persistente y síncope y vértigo, enfermedades neuromusculares tales como amiotonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad de las neuronas motoras, atrofia muscular tal como atrofia muscular espinal, enfermedad de Charcot-Marie y enfermedad de Werdnig-Hoffmann, síndrome pospoliomielitis, distrofia muscular, miastenia gravis, miotonía atrófica, miotonía congénita, miopatía menalina, parálisis periódica familiar, paramioclonos multiplex, paraparesia espástica tropical y síndrome del hombre rígido, enfermedades del sistema nervioso periférico tales como acrodinia, neuropatías amiloides, enfermedades del sistema nervioso autonómico tales como síndrome de Adie, síndrome de Barre-Lieou, disautonomía familiar, síndrome de Horner, distrofia simpática refleja y síndrome de Shy-Drager, enfermedades de los nervios craneales tales como enfermedades de los nervios acústicos, tal como neuroma acústico que incluye neurofibromatosis 2, enfermedades del nervio facial tal como neuralgia facial, síndrome de Melkersson-Rosenthal, trastornos de la motilidad ocular que incluyen ambliopía, nistagmo, parálisis del nervio oculomotor, oftalmoplejia tal como el síndrome de Duane, síndrome de Horner, oftalmoplejia externa progresiva crónica que incluye síndrome de Kearns, estrabismo tal como esotropía y exotropía, parálisis del nervio oculomotor, enfermedades del nervio óptico tales como atrofia óptica, que incluye atrofia óptica hereditaria, drusas de la papila óptica, neuritis óptica tal como neuromielitis óptica, edema papilar, neuralgia del trigémino, parálisis de las cuerdas vocales, enfermedades desmielinizantes tales como neuromielitis óptica e hiperlordosis y neuropatías diabéticas tales como el pie diabético.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen síndromes de compresión neural tal como el síndrome del túnel carpiano, síndrome de la salida torácica tal como el síndrome de las costillas cervicales, síndrome de compresión del nervio cubital, neuralgia, tal como causalgia, neuralgia cervico-braquial, neuralgia facial y neuralgia del trigémino, neuritis tal como neuritis alérgica experimental, neuritis óptica, polineuritis, poliradiculoneuritis y radiculitis tal como poliradiculitis, neuropatías motoras y sensoriales hereditarias tales como enfermedad de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditaria, enfermedad de Refsam, paraplejia espástica hereditaria y enfermedad de Werdnig-Hoffmann, neuropatías sensoriales y autonómicas hereditarias que incluyen analgesia congénita y disautonomía familiar, síndrome de POEMS, ciática, sudoración gustatoria y tetania).
Trastornos endocrinos
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos y/o enfermedades relacionadas con el desequilibrio hormonal y/o trastornos o enfermedades del sistema endocrino.
Las hormonas secretadas por las glándulas del sistema endocrino controlan el crecimiento físico, la función sexual, el metabolismo y otras funciones. Los trastornos se pueden clasificar de dos formas: alteraciones en la producción de hormonas y la incapacidad de tejidos para responder a las hormonas. La etiología de estas enfermedades, trastornos y/o afecciones de desequilibrio hormonal o del sistema endocrino pueden ser enfermedades genéticas, somáticas, tales como cáncer y algunas enfermedades autoinmunitarias, adquiridas (p. ej., mediante quimioterapia, lesiones o toxinas) o infecciosas. Además, las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como marcadores o detectores de una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema endocrino y/o el desequilibrio hormonal.
Las enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormona abarcan trastornos de la motilidad uterina, que incluyen: complicaciones con la gestación y el parto (p. ej., parto a término, embarazo postérmino, aborto espontáneo y parto retardado o interrumpido) y trastornos y/o enfermedades del ciclo menstrual (p. ej., dismenorrea y endometriosis).
Los trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormonal incluyen trastornos y/o enfermedades del páncreas, tales como, por ejemplo, diabetes mellitus, diabetes insípida, agenesia pancreática congénita, síndrome tumoral de células del islote-feocromocitoma, trastornos y/o enfermedades de las glándulas suprarrenales tales como, por ejemplo, enfermedad de Addison, deficiencia de corticosteroides, enfermedad virilizante, hirsutismo, síndrome de Cushing, hiperaldosteronismo, feocromocitoma; trastornos y/o enfermedades de la hipófisis, tal como, por ejemplo, hiperpituitarismo, hipopituitarismo, enanismo hipofisario, adenoma hipofisario, panhipopituitarismo, acromegalia, gigantismo; trastornos y/o enfermedades del tiroides, incluyendo, entre otros, hipertiroidismo, hipotiroidismo, enfermedad de Plummer, enfermedad de Graves (bocito difuso tóxico), bocio nodular tóxico, tiroiditis (tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis granulomatosa subaguda y tiroiditis linfocítica silente), síndrome de Pendred, mixedema, cretinismo, tirotoxicosis, defecto de acoplamiento de hormonas tiroideas, aplasia tímica, tumores de las células de Hurthle del tiroides, cáncer de tiroides, carcinoma tiroideo, carcinoma tiroideo medular; trastornos y/o enfermedades de la paratiroides tales como, por ejemplo, hiperparatiroidismo, hipoparatiroidismo; trastornos y/o enfermedades del hipotálamo.
Además, trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormonal también pueden incluir trastornos y/o enfermedades de los testículos u ovarios, incluido cáncer. Otros trastornos y/o enfermedades de los testículos o de los ovarios incluyen además, por ejemplo, cáncer de ovarios, síndrome del ovario poliquístico, síndrome de Klinefelter, síndrome del testículo ausente (anorquia bilateral), ausencia congénita de células de Leydig, criptorquidia, síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemangioma capilar del testículo (benigno), neoplasias del testículo y neo-testículo.
Además, trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormonal también pueden incuir trastornos y/o enfermedades tales como, por ejemplo, síndromes de deficiencia poliglandular, feocromocitoma, neuroblastoma, neoplasia endocrina múltiple y trastornos y/o cánceres de tejidos endocrinos.
En otra realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para diagnostica, pronosticar, prevenir y/o tratar enfermedades y/o trastornos endocrinos asociados con el o los tejidos en los que se expresa la proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de la proteína de albúmina de la invención.
Trastornos del sistema reproductor
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de enfermedades y/o trastornos del sistema reproductor.
Otros trastornos y/o enfermedades del sistema reproductor masculino incluyen, por ejemplo, síndrome de Klinefelter, síndrome de Young, eyaculación precoz, diabetes mellitus, fibrosis quística, síndrome de Kartagener, fiebre alta, esclerosis múltiple y ginecomastia.
Adicionalmente, enfermedades y/o trastornos del sistema reproductor incluyen trastornos y/o enfermedades de la gestación, incluidos abortos espontáneos y mortinatos, diabetes gestacional, diabetes mellitus.
Trastornos gastrointestinales
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos gastrointestinales, incluidas enfermedades y/o trastornos inflamatorios, infecciones, cánceres (p. ej., neoplasias intestinales (tumor carcinoide del intestino delgado, linfoma no Hodgkin del intestino delgado, , linfoma del intestino delgado)) y úlceras, tales como úlceras pépticas.
Trastornos gastrointestinales incluyen disfagia, odinofagia, inflamación del esófago, esofagitis péptica, reflujo gástrico, fibrosis y estenosis de la submucosa, lesiones de Mallory-Weiss, leiomiomas, lipomas, cánceres epidérmicos, adenocarcinomas, trastornos de retención gástrica, gastroenteritis, atrofia gástrica, cánceres gástricos/de estómago, pólipos del estómago, trastornos autoinmunitarios tales como anemia perniciosa, estenosis pilórica, gastritis (bacteriana, viral, eosinófila, inducida por estrés, erosiva crónica, atrófica, de células plasmáticas y de Ménétrier) y enfermedades peritoneales (p. ej., quiloperitoneo, hemoperitoneo, quistes mesentéricos, linfadenitis mesentérica, oclusión vascular mesentérica, paniculitis, neoplasias, peritonitis, neumoperitoneo, absceso bufrénico).
Los trastornos gastrointestinales también incluyen trastornos asociados con el intestino delgado, tales como síndromes de malaabsorción, distensión, síndrome del intestino irritable, intolerancia al azúcar, enfermedad celíaca, úlceras duodenales, duodenitis, esprúe tropical, enfermedad de Whipple, linfangiectasia intestinal, enfermedad de Crohn, apendicitis, obstrucciones del íleon, divertículos de Meckel, múltiples divertículos, fracaso en la rotación completa del intestino grueso y delgado, linfoma, enfermedades bacterianas y parasitarias (tales como diarrea del viajero, tifoides y paratifoides, cólera, infección por nematodos (Ascariasis lumbricoides), anquilostomas (Ancylostoma duodenale), oxiuros (Enterobius vermicularis), tenias (Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Diphyllobothrium spp., y T. solium).
Enfermedades y/o trastornos hepáticos incluyen colestasis intrahepática (síndrome de Alagille, cirrosis hepática biliar), hígado graso (hígado graso alcohólico, síndrome de reye), trombosis de las venas hepáticas, degeneración hepatoventricular, hepatomegalia, síndrome hepatopulmonar, síndrome hepatorrenal, hipertensión portal (varices esofágicas y gástricas), absceso hepático (absceso hepático por amebas), cirrosis hepática (alcohólica, biliar y experimental), enfermedades hepáticas alcohólicas (hígado graso, hepatitis, cirrosis), parásitos (equinococcosis hepática, fascioliasis, absceso hepático amébico), ictericia (hemolítica, hepatocelular y colestática), colestasis, hipertensión portal, hepatomegalia, ascitis, hepatitis (hepatitis alcohólica, hepatitis animal, hepatitis crónica (autoinmunitaria, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, inducida por fármacos), hepatitis tóxica, hepatitis viral humana (hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E), enfermedad de Wilson, hepatitis granulomatosa, cirrosis biliar secundaria, encefalopatía hepática, hipertensión portal, varices, encefalopatía hepática, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, adenoma hepatocelular, hemangiomas, cálculos biliares, insuficiencia hepática (encefalopatía hepática, insuficiencia hepática aguda) y neoplasias hepáticas (angiomiolipoma, metástasis hepáticas calcificadas, metástasis hepáticas quísticas, tumores epiteliales, hepatocarcinoma fibrolamelar, hiperplasia nodular focal, adenoma hepática, adenoma quístico hepatobiliar, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, hepatoma, cáncer hepático, hemangioendotelioma hepático, hamartoma mesenquimatoso, tumores mesenquimatosos del hígado, hiperplasia regenerativa nodular, tumores hepáticos benignos (quistes hepáticos [quistes simples, enfermedad hepática poliquística, adenoma quístico hepatobiliar, quiste del colédoco], tumores mesenquimatosos [hamartoma mesenquimatoso, hemangioendotelioma infantil, hemangioma, púrpura hepática , lipomas, seudotumor inflamatorio, otros], tumores epiteliales [epitelio de las vías biliares (hamartoma de las vías biliares, adenoma de las vías biliares), hepatocitos (adenoma, hiperplasia nodular focal, hiperplasia regenerativa nodular)], tumores hepáticos malignos [hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, colangiocelular, colangiocarcinoma, adenocarcinoma quístico, tumores de los vasos sanguíneos, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, otros tumores, sarcoma embrionario, fibrosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinosarcoma, teratoma, carcinoide, carcinoma escamoso, linfoma primario]), púrpura hepática, porfiria eritrohepática, porfiria hepática (porfiria intermitente aguda, porfiria cutánea tardía), síndrome de Zellweger).
Enfermedades y/o trastornos pancreáticos incluyen pancreatitis aguda, pancreatitis crónica (pancreatitis necrotizante aguda, pancreatitis alcohólica), neoplasias (adenocarcinoma del páncreas, adenocarcinoma quístico, insulinoma, gastrinoma y glucagonoma, neoplasias quísticas, tumores de las células de los islotes, pancreoblastoma) y otras enfermedades pancreáticas (p. ej., fibrosis quística, quistes (seudoquiste pancreático, fístulas pancreáticas, insuficiencia)).
Las enfermedades de la vesícula biliar incluyen cálculos biliares (colelitiasis y coledocolitiasis), síndrome poscolecistectomía, diverticulosis de la vesícula biliar, colecistitis aguda, colecistitis crónica, tumores de las vías biliares y mucocele.
Enfermedades y/o trastornos del intestino delgado incluyen colitis asociada con antibióticos, diverticulitis, colitis ulcerosa, megacolon adquirido, abscesos, infecciones fúngicas y bacterianas, trastornos anorrectales (p. ej., fisuras, hemorroides), enfermedades colónicas (colitis, neoplasias colónicas [cáncer de colon, pólipos colónicos adenomatosos (p. ej., adenoma villoso), carcinoma de colon, cáncer colorrectal], diverticulitis colónica, diverticulosis colónica, megacolon [enfermedad de Hirschsprung, megacolon tóxico]; enfermedades del colon sigmoide [proctocolitis, neoplasias del colon sigmoide]), estreñimiento, enfermedad de Crohn, diarrea (diarrea infantil, disentería), enfermedades duodenales (neoplasias duodenales, obstrucción duodenal, úlcera duodenal, duodenitis), enteritis (enterocolitis), enteropatía por VIH, enfermedades del íleon (neoplasias del íleon, ileítis), enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado, enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), atresia intestinal, enfermedades parasitarias (anisakiasis, balantidiasis, infecciones por blastocistos, criptosporidiosis, dientamoebiasis, disentería amébica, giardiasis), fístulas intestinales (fístula rectal), neoplasias intestinales (neoplasias cecales, neoplasias colónicas, neoplasias duodenales, neoplasias del íleon, pólipos intestinales, neoplasias del yeyuno, neoplasias rectales), obstrucción intestinal (síndrome del asa aferente, obstrucción duodenal, impactación de heces, seudoobstrucción intestinal, [vólvulos cecales], invaginación), perforación intestinal, pólipos intestinales (pólipos colónicos, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers), enfermedades del yeyuno (neoplasias del yeyuno), síndromes de malaabsorción (síndromes del asa ciega, enfermedad celíaca, intolerancia a la lactosa, síndrome del intestino corto, esprúe tropical, enfermedad de Whipple), oclusión vascular mesentérica, cistoides pneumatosis intestinal, enteropatías perdedoras de proteínas (linfagiectasia intestinal), enfermedades rectales (enfermedades del ano, incontinencia fecal, hemorroides, proctitis, fístula rectal, prolapso rectal, rectocele), úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagitis péptica, hemorragia, perforación, úlcera de estómago, síndrome de Zollinger-Ellison), síndromes posgastrectomía (síndrome de evacuación gástrica), enfermedades del estómago (p. ej., aclorhidria, reflujo duodenogástrico (reflujo biliar), ectasia vascular del antro gástrico, fístula gástrica, obstrucción de la salida gástrica, gastritis (atrófica o hipertrófica), gastroparesia, dilatación del estómago, divertículos estomacales, neoplasias estomacales (cáncer gástrico, pólipos fástricos, adenocarcinoma gástrico, pólipos gastricos hiperplásicos), rotura estomacal, úlcera de estómago, vólvulo estomacal), tuberculosis, visceroptosis, vómitos (p. ej., hematemesis, hiperemesis gravídica, náuseas y vómitos postoperatorios) y colitis hemorrágica.
Otras enfermedades y/o trastornos del sistema gastrointestinal incluyen enfermedades del tracto biliar, tales como gastrosquisis, fístulas (p. ej., fístulas biliares, fístulas esofágicas, fístulas gástricas, fístulas intestinales, fístulas pancreáticas), neoplasias (p. ej., neoplasias del tracto biliar, neoplasias esofágicas, tales como adenocarcinoma del esófago, carcinoma de células escamosas esofágicas, neoplasias gastrointestinales, neoplasias pancreáticas, tales como adenocarcinoma del páncreas, neoplasias quísticas mucinosas del páncreas, neoplasias quísticas pancreáticas, pancreatoblastoma y neoplasias peritoneales), enfermedad esofágica (p. ej., enfermedades ampollosas, candidiasis, acantosis glicogénicas, ulceración, varices esofágicas de barrett, atresia, quistes, divertículos (p. ej., divertículos de Zenker), fístulas (p. ej., fístulas traqueoesofágicas), trastornos de la motilidad (p. ej., síndrome de CREST, trastornos de la deglución, acalasia, espasmos, reflujo gastroesofágico), neoplasias, perforación (p. ej., síndrome de Boerhaave, síndrome de Mallory-Weiss), estenosis, esofagitis, hernia diafragmática
(p. ej., hernia de hiato); enfermedades gastrointestinales, tales como gastroenteritis (p. ej., cholera morbus, infección por el virus Norwalk), hemorragia (p. ej., hematemesis, melena, hemorragia por úlcera péptica), neoplasias estomacales (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma, cáncer de estómago)), hernia (p. ej., hernia diafragmática congénita, hernia femoral, hernia inguinal, hernia de obturación, hernia umbilical, hernia ventral) y enfermedades intestinales (p. ej., enfermedades cecal (apendicitis, neoplasias cecales)).
Actividad de unión
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para detectar moléculas que se unen a la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión o moléculas a las que se une porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión. La unión de la proteína de fusión y la molécula puede activar (agonista), incrementar, inhibir (antagonista) o disminuir la actividad de la proteína de fusión o de la molécula unida. Ejemplos de tales moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas (p. ej., receptores) o moléculas pequeñas.
Preferentemente, la molécula está estrechamente relacionada con el ligando natural de la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de la invención, por ejemplo un fragmento del ligando, o un sustrato natural, un ligando, un mimético estructural o funcional. (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)). De un modo similar, la molécula puede estar estrechamente relacionada con el receptor natural al que se une la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención o, al menos, un fragmento del receptor capaz de unirse mediante la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., sitio activo). En cualquier caso, la molécula puede diseñarse de un modo racional usando técnicas conocidas.
Preferentemente, la detección de estas moléculas implica producir células adecuadas que expresan las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Las células preferidas incluyen células de mamíferos, levaduras, Drosophila o E. coli.
El ensayo puede simplemente analizar la unión de un compuesto candidato a una proteína de fusión de albúmina de la invención, en el que la unión se detecta mediante un marcador, o en un ensayo que implica la competición con un competidor marcado. Además, el ensayo puede analizar si el compuesto candidato tiene como resultado una señal generada mediante la unión a la proteína de fusión.
Como alternativa, el ensayo se puede llevar a cabo usando preparados sin células, fusión de proteína/molécula fijada a un soporte sólido, bibliotecas químicas o mezclas de productos naturales. El ensayo puede simplemente comprender las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene una proteína de fusión de albúmina, medir la actividad de la proteína de fusión /molécula o la unión y comparar la actividad de la proteína de fusión /molécula o la unión a un patrón.
Preferentemente, un ensayo de ELISA puede medir el nivel o la actividad de las proteínas de fusión en una muestra
(p. ej., muestra biológica) usando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo se puede medir el nivel o la actividad de la proteína de fusión mediante la unión, directa o indirecta, a la proteína de fusión de albúmina o compitiendo con la proteína de fusión de albúmina por un sustrato.
Adicionalmente, el receptor al cual se une la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede identificar mediante numerosos procedimientos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, adsorción de ligando y clasificación por FACS (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991)). Por ejemplo, en los casos en los que la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión corresponde a FGF, se puede usar expresión por clonación en la que se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula respondedora a la proteína de fusión de albúmina, por ejemplo células NIH3T3 que se sabe que contienen múltiples receptores para las proteínas de la familia de FGF y células SC-3 y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en grupos y se usan para transfectar células COS u otras células que no responden a la proteína de fusión de albúmina. Las células transfectadas que se cultivan en portaobjetos de cristal se exponen a la proteína de fusión de albúmina de la presente invención después de haberse marcado. Las proteínas de fusión de albúmina se pueden marcar mediante varios medios, incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio.
Tras la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográficos. Los grupos positivos se identifican y los subgrupos se preparan y vuelven a transfectar usando un procedimiento de subagrupamiento repetitivo y repetición de detección selectiva, que, en última instancia, da un único clon que codifica el supuesto receptor.
Como enfoque alternativo para la identificación del receptor, la proteína de fusión marcada se puede unir por fotoafinidad a preparados de membrana o de extracto celular que expresan la molécula receptora para el componente de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, el material unido se puede resolver mediante análisis PAGE y se expone a rayos X. El complejo marcado que contiene los receptores de la proteína de fusión se puede escindir, resolver en fragmentos peptídicos y someter a microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida de la microsecuenciación se usaría para diseñar un conjunto de sondas oligonucleotídicas degeneradas para seleccionar en una biblioteca de ADNc para identificar los genes que codifican los supuestos receptores.
Además, las técnicas de barajado de genes, barajado de motivos, barajado de exones y/o barajado de codones (en conjunto denominados “barajado de ADN”) se pueden usar para modular las actividades de la proteína de fusión y/o la porción de proteína terapéutica o componente de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, de modo que se generan con eficacia agonistas y antagonistas de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención. Véase, en general, las patentes de EE.UU. Nº 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252, y 5.837.458, and Patten, P. A., et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, S. Trends Beotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, L. O., et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); y Lorenzo, M. M. and Blasco, R. Biotechniques 24(2):308-13 (1998);cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan en el presente documento por referencia). En una realización, la alteración de los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención y, por tanto, las proteínas de fusión de albúmina codificadas por los mismos se puede realizar mediante barajado de ADN. El barajado de ADN implica el ensamblaje de dos o más segmentos de ADN en una molécula deseada mediante recombinación homóloga o específica de sitio. En otra realización, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención y, por tanto, las proteínas de fusión de albúmina codificadas en los mismos, se pueden alterar mediante mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros procedimientos antes de la recombinación. En otra realización, uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos etc. de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención se pueden recombinar con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos etc. de una o más moléculas heterólogas. En realizaciones preferidas, las moléculas heterólogas son miembros de la familia. En realizaciones preferidas adicionales, la molécula heteróloga es un factor de crecimiento tal como, por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I), el factor de crecimiento transformante (TGF)-alfa, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el TGF-beta, la proteína morfogenética ósea (BMP)-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, las activinas A y B, el decapentaplégico(dpp), 60A, OP-2, dorsalina, los factores de diferenciación del crecimiento (GDF), nodal, MIS, inhibina-alfa, TGF-beta, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta5 y el factor neurotrófico derivado de glía (GDNF).
Otros fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos de la porción de proteína terapéutica y/o el componente albúmina de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención. Los fragmentos biológicamente activos son los que exhiben una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la porción de proteína terapéutica y/o el componente albúmina de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una actividad deseada mejorada o una actividad indeseable disminuida.
Adicionalmente, la presente invención proporciona un procedimiento de detección selectiva de compuestos para identificar las que modulan la acción de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención. Un ejemplo de dicho ensayo comprende combinar una célula fibroblasto de mamífero, una proteína de fusión de albúmina de la presente invención y el compuesto que se va a someter a detección selectiva y 3[H] timidina en condiciones de cultivo celular en las que normalmente proliferaría la célula fibroblasto. Se puede realizar un ensayo control en ausencia del compuesto que se va a someter a detección selectiva y comparar la cantidad de proliferación de fibroblastos en presencia del compuesto para determinar si el compuesto estimula la proliferación determinando la captación de 3[H] timidina en cada caso. La cantidad de proliferación de las células fibroblastos se mide mediante cromatografía de centelleo líquido, que mide la incorporación de timidina [3H]. Mediante este procedimiento se pueden identificar compuestos tanto agonistas como antagonistas.
En otro procedimiento, una preparación de membrana o de célula de mamífero que expresa un receptor para el componente de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la invención se incuba con una proteína de fusión marcada de la presente invención en presencia del compuesto. A continuación podría medirse la capacidad del compuesto para potenciar o bloquear esta interacción. Como alternativa, la respuesta de un sistema de segundo mensajero conocido tras la interacción de un compuesto que se va a someter a detección selectiva y se mide el receptor y se mide la capacidad del compuesto para unirse al receptor, y producir una respuesta de segundo mensajero para determinar si el compuesto es una potencial proteína de fusión. Dichos sistemas de segundo mensajero incluyen, entre otros, AMPc guanilato ciclasa, canales de iones o hidrólisis de fosfoinosítido.
Todos estos ensayos anteriores se pueden usar como marcadores diagnósticos o pronósticos. Las moléculas descubiertas usando estos ensayos se pueden usar para tratar la enfermedad u obtener un resultado concreto en un paciente (p. ej., crecimiento de vasos sanguíneos) activando o inhibiendo la proteína/molécula de fusión. Además, los ensayos pueden descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de las proteínas de fusión de albúmina de la invención a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados.
Por tanto, la invención incluye un procedimiento de identificar compuestos que se unen a una proteína de fusión de albúmina de la invención, que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto de unión candidato con una proteína de fusión de albúmina de la presente invención; y (b) determinar si se ha producido la unión. Además, la invención incluye un procedimiento de identificar agonistas/antagonistas que comprenden las etapas de: (a) incubar un compuesto candidato con una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, (b) analizar una actividad biológica y (b) determinar si se ha alterado una actividad biológica de la proteína de fusión.
Liberación dirigida
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento de liberar composiciones a células objetivo que expresan un receptor para un componente de una proteína de fusión de albúmina de la invención.
Como se trata en el presente documento, las proteínas de fusión de la invención se pueden asociar con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas o profármacos mediante interacciones hidrofóbicas, hidrofílicas, iónicas y/o covalentes. En una realización, la invención proporciona un procedimiento para la liberación específica de composiciones de la invención en células administrando proteínas de fusión de la invención (incluyendo anticuerpos) que se asocian con polipéptidos o ácidos nucleicos heterólogos. En un ejemplo, la invención proporciona un procedimiento para liberar una proteína terapéutica en la célula objetivo. En otro ejemplo, la invención proporciona un procedimiento para liberar un ácido nucleico monocatenario (p. ej., antisentido o ribozimas)
o ácido nucleico bicatenario (p. ej., ADN que se puede integrar en el genoma de las células o replicar episomalmente y que se puede transcribir) en la célula objetivo.
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para la destrucción específica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) administrando una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., polipéptidos de la invención o anticuerpos de la invención) en asociación con toxinas o profármacos citotóxicos.
Por “toxina” se quiere decir compuestos que se unen y activan sistemas efectores citotóxicos endógenos, radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas o cualquier molécula o enzima que normalmente no está presente dentro o sobre la superficie de la célula que en condiciones definidas producen la muerte de la célula. Las toxinas que se pueden usar de acuerdo con los procedimientos de la invención incluyen, entre otros, radioisótopos conocidos en la técnica, compuestos tales como, por ejemplo, anticuerpos (con porciones de los mismos que contienen fijación al complemento) que se unen a un sistema efector citotóxico endógeno inherente o inducido, timidina quinasa, endonucleasas, ARNasa, toxina alfa, ricina, abrina, exotoxinas A de Pseudomonas, toxina diftérica, saporina, momordina, gelonina, proteína antiviral de la hierba carmín, alfa-sarcina y toxina del cólera. Por “profármaco citotóxico” se quiere decir un compuesto no tóxico que se convierte en un compuesto citotóxico mediante una enzima, presente normalmente en la célula. Los profármacos citotóxicos que se pueden usar de acuerdo con los procedimientos de la invención incluyen, entre otros, derivados de glutamilo de ácido benzoico, agente alquilante de mostaza, derivados de fosfato de etopósido o mitomicina C, arabinósido citosina, daunorubicina y derivados de fenoxiacetamida de doxorubicina.
Detección selectiva de fármacos
Adicionalmente se contempla el uso de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención o los polnucleótidos que codifican estas proteínas de fusión para detectar moléculas que modifican las actividades de la proteína de fusión de albúmina de la presente invención o proteínas correspondientes a la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina. Dicho procedimiento incluiría poner en contacto la proteína de fusión con uno o más compuestos seleccionados que se sospecha que tienen actividad antagonista o agonista, y analizar la actividad de la proteína de fusión tras la unión.
Esta invención es particularmente útil para la detección selectiva de compuestos terapéuticos mediante el uso de proteínas de fusión de la presente invención o fragmentos de unión a las mismas mediante cualquiera de diversas técnicas de detección selectiva de fármacos. La proteína de fusión de albúmina usada en dicho ensayo se puede fijar a un soporte sólido, expresada en una superficie celular, libre en solución o localizada en el interior de la célula. Un procedimiento de detección selectiva del fármaco usa células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan la proteína de fusión de albúmina. Los fármacos se someten a detección selectiva frente a tales células transformadas o sobrenadantes obtenidos de cultivar dichas células en ensayos de unión competitiva. Se puede medir, por ejemplo, la formulación de complejos entre el agente que se está analizando y una proteína de fusión de albúmina de la presente invención.
Por tanto, la presente invención proporciona procedimientos de detección selectiva de fármacos o cualquier otro agente que afecta a las actividades medidas por las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención. Estos procedimientos comprenden poner en contacto tal agente con una proteína de fusión de albúmina de la presente invención o un fragmento del mismo y analizar la presencia de un complejo entre el agente y la proteína de fusión de albúmina o un fragmento del mismo, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En dicho ensayo de unión competitiva, normalmente se maran los agentes que se van a someter a detección selectiva. Tras la incubación, el agente libre se separa del presente en forma unida, y la cantidad de marcador libre o sin formar complejos es una medida de la capacidad de un agente concreto para unirse a la proteína de fusión de albúmina de la presente invención.
Otra técnica para la detección selectiva del fármaco proporciona una detección selectiva de alto rendimiento para compuestos que tienen una afinidad de unión a una proteína de fusión de albúmina de la presente invención y se describe con gran detalle en la solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984, que se incorpora en el presente documento por referencia. Brevemente indicado, grandes cantidades de diferentes compuestos de prueba peptídicos pequeños se sintetizan en un sustrato sólido, como agujas de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo peptídicos se hacen reaccionar con una proteína de fusión de albúmina de la presente invención y se lavan. A continuación, los péptidos unidos se detectan mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. La proteína de fusión de albúmina purificada se puede colocar directamente en placas como revestimiento para usar en las técnicas de detección selectiva del fármaco citado anteriormente. Además, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido.
La presente invención también contempla el uso de ensayos competitivos de detección selectiva de fármacos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a una proteína de fusión de albúmina de la presente invención compiten específicamente con un compuesto de ensayo para la unión a una proteína de fusión de albúmina o fragmentos de la misma. De este modo, se usan anticuerpos para detectar la presencia de algún péptido que compara uno o más epítopos antigénicos con una proteína de fusión de albúmina de la invención.
Péptidos de unión y otras moléculas
La invención también abarcar procedimientos de detección selectiva para identificar polipéptidos y no polipéptidos que se unen a las proteínas de fusión de albúmina de la invención y las moléculas de unión identificadas de este modo. Estas moléculas de unión son útiles como, por ejemplo, agonistas y antagonistas de las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Dichos agonistas y antagonistas se pueden usar de acuerdo con la invención en las realizaciones terapéuticas descritas con detalle más adelante.
Este procedimiento comprende las etapas de:
poner en contacto una proteína de fusión de albúmina de la invención con una pluralidad de moléculas; y
dentificar una molécula que se une a la proteína de fusión de la albúmina.
La etapa de poner en contacto la proteína de fusión de albúmina de la invención con la pluralidad de moléculas se puede efectuar de varios modos. Por ejemplo, se puede contemplar inmovilizar la proteína de fusión de albúmina sobre un soporte sólido y poner en contacto una solución de la pluralidad de moléculas en contacto con los polipéptidos inmovilizados. Dicho procedimiento estaría relacionado con un procedimiento cromatográfico de afinidad, estando la matriz de afinidad comprendida por la proteína de fusión de albúmina inmovilizada de la invención. Las moléculas que tiene una afinidad selectiva por la proteína de fusión de albúmina se pueden purificar mediante selección por afinidad. La naturaleza del soporte sólido, el procedimiento de unión de la proteína de fusión de albúmina al soporte sólido, el disolvente y las condiciones del aislamiento o selección por afinidad son en gran medida convencionales y son bien conocidos para los expertos en la técnica.
Como alternativa, también se puede separar una pluralidad de polipéptidos en fracciones sustancialmente separadas que comprenden una subpoblación de o polipéptidos individuales. Por ejemplo, se puede separar la pluralidad de polipéptidos mediante electroforesis en gel, cromatografía en columna o un procedimiento similar conocidos para los expertos en la técnica para la separación de polipéptidos. Los polipéptidos individuales también se pueden producir en una célula huésped transformada de un modo tal que se exprese sobre o alrededor de su superficie externa (p. ej., un fago recombinante). Después, los aislamientos individuales se pueden “sondar” mediante una proteína de fusión de albúmina de la invención, opcionalmente en presencia de un inductor se puede requerir la expresión para determinar si tiene lugar alguna interacción de afinidad selectiva entre la proteína de fusión de albúmina y el clon individual. Antes de poner en contacto la proteína de fusión de albúmina con cada fracción que comprende polipéptidos individuales, los polipéptidos podrían transferirse primero a un soporte sólido por comodidad adicional. Dicho soporte sólido puede ser, simplemente, un pedazo de membrana de filtro, tal como una hecha de nitrocelulosa o nailon. De este modo, los clones positivos podrían identificarse a partir de un conjunto de células huésped transformadas de una biblioteca de expresión, que alojan una construcción de ADN que codifica un polipéptido que tiene una afinidad selectiva de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Además, la secuencia de aminoácidos del polipéptido que tiene una afinidad selectiva por una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede determinar directamente por medios convencionales o la secuencia de codificación del ADN que codifica el polipéptido puede determinarse con frecuencia más convenientemente. La secuencia primaria se puede deducir después a partir de la correspondiente secuencia de ADN. Si la secuencia de aminoácidos se va a determinar a partir del propio polipéptido, se pueden usar técnicas de microsecuenciación. La técnica de secuenciación puede incluir espectroscopia de masas.
En ciertas situaciones puede ser deseable eliminar mediante lavado cualquier polipéptido sin unir a partir de una mezcla de una proteína de fusión de albúmina de la invención y la pluralidad de polipéptidos antes de intentar determinar o detectar la presencia de una interacción por afinidad selectiva. Dicha etapa de lavado puede ser particularmente deseable cuando la proteína de fusión de albúmina de la invención o la pluralidad de polipéptidos están unidos a un soporte sólido.
La pluralidad de moléculas proporcionadas de acuerdo con el presente procedimiento se pueden proporcionar a modo de varias bibliotecas, tales como bibliotecas peptídicas o no peptídicas combinatorias o aleatorias que se pueden someter a detección selectiva de moléculas que se unen específicamente a una proteína de fusión de albúmina de la invención. En la técnica se conocen muchas bibliotecas que se pueden usar, por ejemplo bibliotecas sintetizadas químicamente (p. ej., bibliotecas de expresión en fagos) y en bibliotecas basadas en traducción in vitro. Ejemplos de bibliotecas sintetizadas químicamente se describen en Fodor et al., Science 251:767-773 (1991); Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991); Lam et aL, Nature 354:82-84 (1991); Medynski, Bio/Technology 12:709710 (1994); Gallop et aL, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251 (1994); Ohlmeyer et al., Proc. NatL Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426 (1994); Houghten et al., Biotechniques 13:412 (1992); Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618 (1994); Salmon et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712 (1993); publicación PCT nº WO-93/20242; y Brenner y Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 (1992).
Ejemplos de las bibliotecas de expresión en fagos se describen en Scott et al., Science 249:386-390 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990); Christian et al., 1992, J. Mol. BioL 227:711-718 1992); Lenstra, J. Immunol. Meth. 152:149-157 (1992); Kay et al., Gene 128:59-65 (1993); y la publicación PCT nº WO 94/18318 fechada el 18 de agosto de 1994.
Las bibliotecas basadas en traducción in vitro incluyen, entre otras, las descritas en la publicación PCT nº WO 91/05058 fechada el 18 de abril de 1981 y Mattheakis et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994).
A modo de ejemplos de bibliotecas no peptídicas, una biblioteca de benzodiacepinas (véase, p. ej., Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712 (1994)) se pueden adaptar para usar. También se pueden usar bibliotecas de peptoides (Simon et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1992)). Otro ejemplo de una biblioteca que se puede usar en la que las funcionalidades amida en los péptidos se han permetilado para generar una biblioteca combinatoria transformada químicamente se describe en Ostresh et al. (Proc. NatL Acad. Sci. USA 91:11138-11142 (1994)).
La variedad de bibliotecas no peptídicas que son útiles en la presente invención es grande. Por ejemplo, Ecker y Crooke (Bio/Technology 13:351-360 (1995) enumeran benzodiacepinas, hidantoínas, piperacinadionas, bifenilos, análogos de azúcar, beta-mercaptocetonas, ácidos arilacéticos, acilpiperidinas, benzopiranos, cubanos, xantinas, aminimidas y oxazolonas como entre las especies químicas que forman la base de varias bibliotecas.
Las bibliotecas no peptídicas se pueden clasificar ampliamente en dos tipos: monómeros y oligómeros decorados. Las bibliotecas de monómeros decorados usan una estructura armazón relativamente simple sobre el cual se añaden diversos grupos funcionales. A menudo, el armazón será una molécula con una actividad farmacológica útil conocida. Por ejemplo, el armazón podría ser la estructura de benzodiacepina.
Las bibliotecas de oligómeros no peptídicos usan un gran número de monómeros que se ensamblan de un modo tal que crean nuevas formas que dependen del orden de los monómeros. Entre las unidades monoméricas que se han usado están carbamatos, pirrolinonas y morfolinos. Los peptoides, los oligómeros similares a péptidos en los que la cadena lateral está unida al grupo alfa amino en lugar del carbono alfa, forman la base de otra versión de bibliotecas de oligómeros no peptídicos. Las primeras bibliotecas de oligómeros no peptídicos usaron un único tipo de monómero y, por tanto, contenían una estructura de repetición. Las bibliotecas recientes han usado más de un monómero, dando a las bibliotecas flexibilidad añadida.
La detección selectiva de las bibliotecas se puede conseguir mediante diversos procedimientos conocidos habitualmente. Véase, por ejemplo, las referencias siguientes, que divulgan la detección selectiva de bibliotecas peptídicas: Parmley et aL, Adv. Exp. Med. BioL 251:215-218 (1989); Scott et al,. Science 249:386-390 (1990); Fowlkes et al., BioTechniques 13:422-427 (1992); Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397 (1992); Yu et aL, Cell 76:933-945 (1994); Staudt et al., Science 241:577-580 (1988); Bock et al., Nature 355:564-566 (1992); Tuerk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992 (1992); Ellington et al., Nature 355:850-852 (1992); la patente de EE.UU. nº 5.096.815, la patente de EE.UU. nº 5.223.409, y la patente de EE.UU. nº 5.198.346, todos de Ladner et al.; Rebar et al., Science 263:671-673 (1993); y la publicación PCT nº WO 94/18318.
En una realización específica, la detección selectiva para identificar una molécula que se une a una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede llevar a cabo poniendo en contacto los miembros de la biblioteca con una proteína de fusión de albúmina de la invención inmovilizada sobre una fase sólida y recoger los miembros de la biblioteca que se unen a la proteína de fusión de albúmina. Ejemplos de dichos procedimientos de detección selectiva denominadas técnicas de "adsorción" se describen, a modo de ejemplo, en Parmley et al., Gene 73:305318 (1988); Fowlkes et al., BioTechniques 13:422-427 (1992); publicación de PCT nº WO 94/18318; y en referencias citadas en el presente documento.
En otra realización, el sistema de dos híbridos para seleccionar las proteínas de interacción en levaduras (Fields et aL, Nature 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991) se puede usar para identificar moléculas que se unen específicamente a los polipéptidos de la invención.
Cuando la molécula de unión es un polipéptido, el polipéptido se puede seleccionar convenientemente de cualquier biblioteca peptídica, incluidas las bibliotecas peptídicas aleatorias, bibliotecas peptídicas combinatorias o bibliotecas peptídicas sesgadas. El término “sesgado” se usa en el presente documento para indicar que el procedimiento de generar la biblioteca se manipula de un modo tal que se restringen uno o más parámetros que gobiernan la diversidad de la colección resultante de moléculas, en este caso péptidos.
Por tanto, una biblioteca peptídica verdaderamente aleatorias generaría una colección de péptidos en la que la probabilidad de hallar un aminoácido concreto en una posición dada del péptido es la misma para los 20 aminoácidos. No obstante, se puede introducir un sesgo en la biblioteca especificando, por ejemplo, que hay una lisina cada cinco aminoácidos o que se fijen las posiciones 4, 8 y 9 de una biblioteca de decapéptidos para que incluyan solo arginina. Claramente se pueden contemplar muchos tipos de sesgos y la presente invención no está restringida a ningún sesgo concreto. Además, la presente invención contempla tipos específicos de bibliotecas peptídicas, tal como bibliotecas de péptidos expresados en fagos y las que usan una construcción de ADN que comprende un vector fago lambda con una inserción de ADN.
Como se ha mencionado anteriormente, en el caso de una molécula de unión que es un polipéptido, el polipéptido puede tener de aproximadamente 6 a menos de aproximadamente 60 residuos de aminoácidos, preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 residuos de aminoácidos y, lo más preferentemente, de aproximadamente 6 a aproximadamente 22 aminoácidos. En otra realización, un polipéptido de unión tiene en el intervalo de 15-100 aminoácidos o 25-50 aminoácidos.
El polipéptido de unión seleccionado se puede obtener mediante síntesis química o expresión recombinante.
Otras actividades
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse en el tratamiento para estimular la revascularización de tejidos isquémicos debido a varias enfermedades, tales como trombosis, arteriosclerosis y otras afecciones cardiovasculares. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para estimular la angiogénesis y la regeneración de extremidades, como se ha tratado anteriormente.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden usar para tratar heridas debidas a lesiones, quemaduras, reparaciones tisulares postoperatorias y úlceras, ya que son mitógenos para varias células de diferentes orígenes, tales como células de fibroblastos y células de músculos esqueléticos y, por tanto, facilitan la reparación o sustitución de tejido dañado o enfermo.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden usar para estimular el crecimiento neuronal y para tratar y prevenir el daño neuronal que se produce en ciertos trastornos neuronales o afecciones neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y el complejo relacionado con el SIDA. Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican la proteína de fusión de albúmina de la invención puede tener la capacidad para estimular el crecimiento de condorcitos, por tanto se pueden usar para potenciar la regeneración ósea y periodontal, y ayudar en los transplantes de tejidos o injertos óseos.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para prevenir el envejecimiento de la piel por quemaduras solares mediante estimulación del crecimiento de los queratinocitos.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para prevenir la pérdida de cabello, ya que los miembros de la familia de FGF activan las células formadoras de vello y estimula el crecimiento de melanocitos. De acuerdo con esto, una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para estimular el crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas y células de la médula ósea cuando se usan en combinación con otras citoquinas.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para mantener los órganos antes del transplante o para soportar el cultivo celular de tejidos primarios. Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para inducir tejido de origen mesodérmico para diferenciarse en embriones tempranos.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden aumentar o disminuir la diferenciación o proliferación de las células madre embrionarias, además de, como se ha tratado anteriormente, el linaje hematopoyético.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para modular las características de mamífero, tales como la altura del cuerpo, el peso, el color del cabello, el color de los ojos, la piel, el porcentaje de tejido adiposo, la pigmentación, el tamaño y la forma (p. ej., cirugía cosmética). De un modo similar, una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para modular el metabolismo del mamífero que afecta al catabolismo, anabolismo, procesamiento, uso y almacenamiento de energía.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para cambiar el estado mental o el estado físico de un mamífero influyendo sobre los biorritmos, los ritmos cardíacos, la depresión (incluidos los trastornos depresivos), la tendencia a la violencia, la tolerancia del dolor, las capacidades reproductoras (preferentemente mediante actividad de activita o de tipo inhibina), los niveles hormonales o endocrinos, el apetito, la libido, la memoria, el estrés u otras cualidades de cognición.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse como aditivos o conservantes alimentarios, para incrementar o disminuir las capacidades de conservación, el contenido en grasas, los lípidos, las proteínas, los hidratos de carbono, las vitaminas, los minerales, los cofactores u otros componentes nutricionales.
Las aplicaciones citadas anteriormente tienen usos en una amplia variedad de huéspedes. Dichos huéspedes incluyen, entre otros, seres humanos, murinos, conejos, cabras, cobayas, camellos, caballos, ratones, ratas, hámsters, cerdos, cerdos enanos, pollos, cabras, vacas, ovejas, perros, gatos, primates no humanos y seres humanos. En realizaciones específicas, el huésped es un ratón, conejo, cabra, cobaya, pollo, rata, hámster, cerdo, oveja, perro o gato. En realizaciones preferidas, el huésped es un mamífero. En realizaciones más preferidas, el huésped es un ser humano.
Habiendo descrito en general la invención, la misma se entenderá con más facilidad haciendo referencia a los ejemplos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de pScNHSA y pScCHSA
Los vectores pScNHSA (Nº de depósito en la ATCC PTA-3279) y pScCHSA (Nº de depósito en la ATCC PTA-3276) son derivados de pPPC0005 (Nº de depósito en la ATCC PTA-3278) y se usan como vectores de clonación en los que los polinucleótidos que codifican una proteína terapéutica o fragmento o variante de la misma se insertan adyacentes y dentro del marco de traducción de los polinucleótidos que codifican la seroalbúmina humana “HAS”. El pScCHSA se puede usar para generar las fusiones proteína terapéutica-HSA, mientras que pScNHSA se puede usar para generar fusiones proteína terapéutica-HSA.
Generación de pScCHSA: fusión de albúmina con el extremo C del resto albúmina con la porción terapéutica
Se fabricó un vector para facilitar la clonación de ADN que codifica un extremo N de la proteína terapéutica con el ADN que codifica la proteína albúmina madura alterando la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de la HSA quimérica en pPPC0005 para incluir los sitios de restricción Xho I y Cla I.
Primero, los sitios Xho I y Cla I inherentes a pPPC0005 (localizados en 3’ de la secuencia de terminación de ADH1) se eliminaron digiriendo pPPC0005 con los sitios Xho I y Cla I, llenando los extremos pegajosos con ADN polimerasa de T4 y volviendo a unir los extremos romos para crear pPPC0006.
En segundo lugar, los sitios de restricción Xho I y Cla I se sometieron a ingeniería en la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de la HSA (una quimera del líder de HSA y un sitio kex2 del factor alfa de apareamiento "MAF") en pPPC0006 usando dos ciclos PCR. En la primera ronda de PCR, se realizó la amplificación con los cebadores mostrados como las SEC ID Nº 1039 y SEC ID Nº 1040- El cebador cuya secuencia se muestra como SEC ID nº 1039 comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica parte de la secuencia del péptido señal de HSA, un sitio kex2 de la secuencia líder del factor de apareamiento alfa y parte del extremo amino de la forma madura de HSA. Se introdujeron cuatro mutaciones puntuales en la secuencia, creando los sitios Xho I y Cla I hallados en la unión del péptido señal quimérico y la forma madura de HSA. Estas cuatro mutaciones están subrayadas en la secuencia que se muestra a continuación. En pPPC0005, los nucleótidos en estas cuatro posiciones de 5’ a 3’ son T, G, T y G.
5'-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGAT TTGGG-3' (SEC ID Nº 1039) y 5'-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAA TAAGC-3' (SEC ID Nº 1040). Una segunda ronda de PCR se realizó con un cebador flanqueante cadena arriba 5'-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3' (SEC ID Nº 1041) t un cebador flanqueante cadena abajo 5'-CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT-3' (SEC ID Nº 1042). El producto de PCR resultante se purificó después y se digirió con Afl II y Xba I y se ligó en los mismos sitios en pPPC0006 creando pScCHSA. El plásmido resultante tiene los sitios Xho I y Cla I modificado por ingeniería en la secuencia señal. La presencia del sitio Xho I crea un cambio de un solo aminóácido al final de la secuencia señal de LDKR a LEKR. El cambio de D a E no estará presente en el plásmido de expresión de la proteína de fusión de albúmina final cuando una secuencia de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica la porción terapéutica de la proteína de fusión de albúmina con un sitio 5' Sal I (que es compatible con el sitio Xho I) y un sitio 3' Cla I se liga en los sitios Xho I y Cla I de pScCHSA. La unión de de Sal I a Xho I restablece la secuencia de aminoácidos original de la secuencia del péptido señal. El ADN que codifica la porción terapéutica de la proteína de fusión de albúmina se puede insertar después del sitio Kex2 (Kex2 escinde después de la secuencia de aminoácidos dibásica KR al final del péptido señal) y antes del sitio Cla I.
Generación de pScNHSA: fusión de albúmina con el extremo N del resto albúmina con la porción terapéutica
Se crea un vector para facilitar la clonación del ADN que codifica la porción en el extremo C de la proteína terapéutica en el ADN que codifica la proteína de albúmina madura añadiendo a pScCHSA tres sitios de restricción de ocho pares de bases. Los sitios de restricción Asc I, Fse I, y Pme I se añadieron entre los sitios Bsu36 I y Hind III al final de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de HSA madura. Esto se consiguió mediante el uso de dos cebadores sintéticos complementarios que contienen los sitios de restricción Asc I, Fse I, y Pme I subrayados (SEC ID Nº 1043 y SEC ID Nº 1044). 5'-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCT TAATTCT-3' (SEC ID Nº 1043) y 5-AGAAWAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCCTATTATAAGCCTAAG GCAGCTT-3' (SEC ID Nº 1044). Estos cebadores se hibridaron y digirieron con Bsu36 I y Hind III y se ligaron en los mismos sitios en pScCHSA creando pScNHSA
Ejemplo 2: Generación de construcción general para la transformación en levaduras.
Los vectores pScNHSA y pScCHSA se pueden usar como vectores de clonación en los que los polinucleótidos que codifican una proteína terapéutica o fragmento o variante de la misma se insertan adyacentes a los polinucleótidos que codifican la seroalbúmina humana “HSA”. El pScCHSA se usa para generar las fusiones proteína terapéutica-HSA, mientras que pScNHSA se puede usar para generar fusiones proteína terapéutica-HSA.
Generación de construcciones de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión HSA-proteína terapéutica
El ADN que codifica una proteína terapéutica (p. ej., secuencias mostradas en la SEC ID Nº X o conocidas en la técnica) se puede amplificar por PCR usando los cebadores que facilitan la generación de una construcción de fusión (p. ej., añadiendo sitios de restricción, codificando fusiones continuas, codificando secuencias de ligadores etc.). Por ejemplo, un experto en la técnica podría diseñar un cebador en 5' que añade polinucleótidos que codifican los últimos cuatro aminoácidos de la forma madura de HSA (y que contiene el sitio Bsu36I) sobre el extremo 5’ delADN que codifica una proteína terapéutica; y un cebador 3’ que añade un codón de TERMINACIÓN y sitios de clonación adecuados sobre el extremo 3’ de la secuencia de codificación de la proteína terapéutica. Por ejemplo, el cebador directo usado para amplificar el ADN que codifica una proteína terapéutica podría tener la secuencia 5'-aagctGCCTTAGGCTTA(N)15-3' (SEC ID Nº1045), en la que la secuencia subrayada es un sitio Bsu36I, los nucleótidos en mayúsculas codifican los últimos cuatro aminoácidos de la proteína madura HAS (ALGL), y (N)15 es idéntica a los primeros 15 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. De un modo similar, el cebador inverso usado para amplificar el ADN que codifica una proteína terapéutica podría tener la secuencia 5'-GCGCGCGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTA(N)15-3' (SEC ID Nº1046), en la que la secuencia en cursiva es un sitio Pme I, la secuencia con doble subrayado es un sitio Fse I, la secuencia con un solo subrayado es un sitio Asc, los nucleótidos en recuadros son los complementarios inversos de dos codones de terminación en tándem y (N)15 es idéntica al complementario inverso de los últimos 15 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. Una vez que se ha amplificado el producto, se puede cortar con Bsu36I y uno de (Asc I, Fse I,
o Pme I) y ligar en pScNHSA.
La presencia del sitio Xho I en la secuencia líder quimérica de HSA crea un cambio de un solo aminóácido al final de la secuencia señal quimérica, es decir la secuencia señal de HSA-kex2, de LDKR (SEC ID Nº 2139) a LEKR (SEC ID Nº 2140).
Generación de construcciones de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión pene-HSA
De un modo similar al procedimiento descrito con anterioridad, el ADN que codifica una proteína terapéutica se puede amplificar mediante PCR usando los cebadores siguientes: Un cebador en 5’ que añade polinucleótidos que contienen un sitio SalI y que codifican los últimos tres aminoácidos de la secuencia líder de HSA, DKR, sobre el extremo 5' del ADN que codifica una proteína terapéutica; y un cebador en 3' que añade polinucleótidos que codifican los primeros pocos aminoácidos de la HSA madura que contienen un sitio Cla I sobre el extremo 3' del ADN que codifica una proteína terapéutica. Por ejemplo, el cebador directo usado para amplificar el ADN que codifica una proteína terapéutica podría tener la secuencia 5'-aggagcgtcGACAAAAGA(N)15-3' (SEC ID Nº1047), en la que la secuencia subrayada es un sitio Sal I , los nucleótidos en mayúsculas codifican los últimos tres aminoácidos de la secuencia líder de HSA (DKR), y (N)15 es idéntica a los primeros 15 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. De un modo similar, el cebador inverso usado para amplificar el ADN que codifica una proteína terapéutica podría tener la secuencia 5'-CTTTAAATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)15-3'(SEC ID Nº 1048), en la que la secuencia en cursiva es un sitio Cla I, los nucleótidos subrayados son la complementaria inversa del ADN que codifica los primeros 9 aminoácidos de la forma madura de HSA DAHKSEVAH, (DAHKSEVAH, SEC ID Nº 1106) y (N)15 es idéntica al complementario inverso de los últimos 15 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. Una vez que se ha amplificado el producto, se puede cortar con Sal I y Cla I y ligar en pScCHSA digerido con Xho I y Cla I. Se puede desear una secuencia señal o líder diferente, por ejemplo invertasa "INV" (Acceso en Swiss-Prot P00724), el factor alfa de apareamiento "MAF" (acceso en GenBank AAA18405), MPIF (Geneseq AAF82936), Fibulina B (Acceso en Swiss-Prot P23142), Clusterina (Acceso en Swiss-Prot P10909), proteína 4 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (Acceso en Swiss-Prot P22692) y permutaciones de la secuencia líder de HSA se pueden subclonar en el vector adecuado por medio de procedimientos estándar conocidos en la técnica.
Generación de la construcción de fusión de albúmina compatible para la expresión en la levadura S. cerevisiae.
El fragmento Not I que contiene el AND que codifica una proteína de fusión de albúmina en el extremo N o el extremo C generada del pScNHSA o pScCHSA se puede clonar en el sitio Not I de pSAC35 que tiene un marcador seleccionable de LEU2. A continuación, el vector resultante se usa en la transformación de un sistema de expresión en levaduras S. cerevisiae.
Ejemplo 3: Expresión general en la levadura S. cerevisiae.
Un vector de expresión compatible con la expresión en levadura se puede transformar en la levadura S. cerevisiae mediante transformación con acetato de litio, electroporación u otros procedimientos conocidos en la técnica y o como se describe en parte en Sambrook, Fritsch, and Maniatis. 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition", volumes 1-3, y en Ausubel et al. 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School "Current Protocols in Molecular Biology", volumes 1-4. Los vectores de expresión se introducen en las cepas de S. cerevisiae DXY1, D88, o BXP10 mediante transformación, los transformantes individuales se pueden cultivar, por ejemplo, durante 3 días a 30ºC en 10 ml de YEPD (1 % p/v de extracto de levadura, 2 % p/v, peptona, 2 % p/v, dextrosa) y las células se pueden recoger en la fase estacionaria tras 60 horas de crecimiento. Los sobrenadantes se recogen aclarando las células a 3.000 g durante 10 minutos.
El pSAC35 (Sleep et al., 1990, Biotechnology 8:42 y véase la Figura 3) comprende, además del marcador seleccionable LEU2, todo el plásmido de 2 μm de levadura para proporcionar funciones de replicación, el promotor PRB1 y la señal de terminación ADH1.
Ejemplo 4: Purificación general de una proteína de fusión de albúmina expresada de una fusión de albúmina en la levadura S. cerevisiae.
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden la forma madura de HSA fusionada con el extremo N o C de la forma madura de una proteína terapéutica o porciones de la misma (p. ej., l a forma madura de una proteína terapéutica indicada en la tabla 1 o la forma madura de una proteína terapéutica mostrada en la tabla 2 como SEC ID Nº Z). En una realización de la invención, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden además una secuencia señal que dirige el polipéptido de fusión naciente en las vías secretoras del huésped usado para la expresión. En una realización preferida, el péptido señal codificado por una secuencia señal se elimina y la proteína de fusión de albúmina madura se secreta directamente al medio de cultivo. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden, preferentemente, secuencias señal heterólogas
(p. ej., la secuencia señal no nativa de una proteína terapéutica concreta), incluyendo, entre otras, MAF, INV, Ig, Fibulina B, Clusterina, proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina, variante de las secuencias líder de la HAS, incluyendo, entre otros, una secuencia líder de HSA/MAF quimérica, y otras secuencias señal heterólogas conocidas en la técnica. Especialmente preferidas como dichas secuencias señal enumeradas en la tabla 2 y/ la secuencia señal indicada en la sección "Expresión de proteínas de fusión" y/o "Procedimientos adicionales de producción sintética y recombinante de proteínas de fusión de albúmina" de la memoria que se indican anteriormente. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la invención comprenden además un residuo de metionina en el extremo N. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, incluidos fragmentos y/o variantes, también entran dentro de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina en levaduras como se ha descrito anteriormente se pueden purificar a pequeña escala sobre columnas de afinidad de péptidos Dyax del siguiente modo. Los sobrenadantes de levaduras que expresan una proteína de fusión de albúmina se someten a diafiltración contra tampón fosfato 3 mM a pH 6,2, NaCl 20 mM y 0,01 % de Tween 20 para reducir el volumen y eliminar los pigmentos. La solución se filtra después a través de un dispositivo de 0,22 !m. El filtrado se carga sobre una columna de afinidad peptídica Dyax. La columna se eluye con tampón Tris /HCl 100 mM- pH 8,2. Las fracciones máximas que contienen proteína se recogen y analizan en SDS-PAGE después de concentrar cinco veces.
Para la purificación a gran escala, se puede usar el siguiente procedimiento. El sobrenadante en exceso de 2 l se somete a diafiltración y se concentra hasta 500 ml en Tris/HCl 20 mM a pH 8,0. La solución proteica concentrada se carga en una columna de 50 ml preequilibrada de flujo rápido DEAE-Sepharose, la columna se lava y la proteína se eluye con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,4 M NaCl en Tris/HCl 20 mM a pH 8,0. Las fracciones que contienen la proteína se combinan, se ajustan a un pH 6,8 con fosfato sódico 0,5M (NaH2PO4). A la solución proteica se añade una concentración final de (NH4)2SO4 0,9 M y la solución completa se carga sobre una columna Buty1650S de 50 ml preequilibrada. La proteína se eluye con un gradiente lineal de sulfato amónico ((NH4)2SO4) de 0,9 a 0 M). Las fracciones con la fusión de albúmina se combinan de nuevo, se someten a diafiltración contra tampón de Na2HPO4/ácido cítrico 10 mM a pH 5,75, y se cargan en una columna de 50 ml preequilibrada de flujo rápido SP-Sepbarose. La proteína se eluye con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,5 M. Las fracciones que contienen la proteína de interés se combinan, el tampón se cambia a Na2BPO4/ácido cítrico 10 mM a pH 6,25 con un concentrador Amicon, la conductividad es < 2,5 mS/cm. Esta solución se cargan en una columna de 15 ml preequilibrada de alto rendimiento Q-Sepharose, la columna se lava y la proteína se eluye con un gradiente lineal de NaCl de NaCl de 0 a 0,15M. La proteína purificada se puede formular después en una composición tampón específica mediante intercambio de tampón.
Ejemplo 5: Generación de construcción general para la transfección en células de mamífero.
Generación de la construcción de fusión de albúmina compatible para la expresión en líneas celulares de mamífero
Las construcciones de fusión de albúmina se pueden generar en vectores de expresión para usar en sistemas de cultivo de células de mamífero. El ADN que codifica una proteína terapéutica se pueden clonar en el extremo N y el extremo C con HSA en un vector de expresión de mamífero mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica (p. ej., amplificación por PCR, digestión de restricción y ligación). Una vez que le vector de expresión se ha construido se puede proceder a la transfección en un sistema de expresión en mamíferos. En la técnica se conocen vectores de expresión adecuados incluyendo, entre otros, por ejemplo, el vector pC4 y/o vectores disponibles en Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH).
El ADN que codifica seroalbúmina humana se ha clonado en el vector pC4 que es adecuado para los sistemas de expresión en mamíferos, creando el plásmido pC4:HSA (nº de depósito en la ATCC PTA-3277). Este vector tiene un gen de la dihidrofolato reductasa "DHFR" que permitirá la selección en presencia de metotrexato.
El vector pC4:HSA es adecuado para la expresión de proteínas de fusión de albúmina en células CHO. Para la expresión en otros sistemas de cultivo celular en mamíferos, puede ser deseable subclonar un fragmento que comprende o, como alternativa, que consiste en, ADN que codifica una proteína de fusión de albúmina en un vector de expresión alternativo. Por ejemplo, un fragmento que comprende, o, como alternativa, que consiste en, ADN que codifica una proteína de fusión madura se puede subclonar en otro vector de expresión, incluidos, entre otros, cualquiera de los vectores de expresión de mamíferos descritos en el presente documento.
En una realización preferida, el ADN que codifica una construcción de fusión de albúmina se subclona en vectores proporcionados por Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) mediante procedimientos conocidos en la técnica para la expresión en células NS0.
Generación de construcciones de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión HSA-proteína terapéutica
Usando pC4:HSA (Nº de depósito en la ATCC PTA-3277), se pueden generar construcciones de fusión de albúmina en las que la porción de proteína terapéutica está en el extremo C de la secuencia de albúmina madura. Por ejemplo, se puede clonar ADN que codifica una proteína terapéutica del fragmento o variante de la misma entre los sitios de restricción Bsu 36I y Asc I del vector. Cuando se clona en Bsu 36I y Asc I, se puede usar el mismo diseño de cebador usado para clonar en el sistema de vector de levadura (SEC ID Nº 1045 y 1046) (véase el ejemplo 2).
Generación de construcciones de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión gen-HSA
Usando pC4:HSA (Nº de depósito en la ATCC PTA-3277), se pueden generar construcciones de fusión de albúmina en las que una porción de proteína terapéutica se clona en el extremo N de la secuencia de albúmina madura. Por ejemplo, se puede clonar ADN que codifica una proteína terapéutica que tiene su secuencia original entre los sitios Bam HI (o Hind III) y Cla I de pC4:HSA.. Cuando se clona en el sitio Bam HI o Hind III, es preferible incluir una secuencia Kozak (CCGCCACCATG, SEC ID Nº 1107) antes del codón de inicio de la traducción del ADN que codifica la proteína terapéutica Si una proteína terapéutica no tiene una secuencia señal, el ADN que codifica dicha proteína terapéutica se puede clonar entre los sitios Xho I y Cla I de pC4:HSA Cuando se usa el sitio Xho I, se pueden usar los siguientes ejemplos de cebadores en 5' (SEC ID Nº 1052) y 3' (SEC ID Nº 1053):
5'-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)18-3' (SEC ID Nº 1052)
5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)18-3' (SEC ID Nº1053)
En el cebador 5’ (SEC ID Nº 10552), la secuencia subrayada es un sitio Xho I; y el sitio Xho I y el AND tras el sitio Xho I codifica los últimos siete aminoácidos de la secuencia líder de la seroalbúmina humana natural. En la SEC ID Nº 10552 "(N)18” es AND idéntico a los primeros 18 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. En el cebador 3’ (SEC ID Nº 1053), la secuencia subrayada es un sitio Cla I; y el sitio Cla I y el ADN tras él son la complementaria inversa del ADN que codifica los primeros 10 aminoácidos de la proteína HSA madura (SEC ID Nº 1038). En la SEC ID Nº 1053 "(N)18” es la complementaria inversa del ADN que codifica los últimos 18 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. Usando estos dos cebadores, se puede amplificar por PCR la proteína terapéutica de interés, purificar el producto de la PCR, digerirlo con las enzimas de restricción Xho I y Cla I y clonarlo en los sitios Xho I y Cla I en el vector pC4:HSA.
Si se desea una secuencia líder alternativa, la secuencia líder de la albúmina nativa se puede sustituir con la líder de la albúmina quimérica, es decir el péptido señal HSA-kex2, o una líder alternativa mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, un experto en la técnica podría amplificar por PCR de forma rutinaria una líder alternativa y subclonar el producto de la PCR en una construcción de fusión de albúmina en lugar de la líder de albúmina manteniendo el marco de lectura).
Ejemplo 6: Expresión general en líneas celulares de mamífero.
Una construcción de fusión de albúmina generada en un vector de expresión compatible con la expresión en líneas celulares de mamífero se puede transfectar en líneas celulares adecuadas mediante precipitación en fosfato cálcico, lipofectamina, electroporación u otros procedimientos de transfección conocidos en la técnica y/o como se describe en Sambrook, Fritsch, and Maniatis. 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition" and in Ausubel et aL 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School "Current Protocols in Molecular Biology", volumes 1-4. Las células transfectadas se seleccionan después mediante la presencia de un agente de selección determinado mediante el marcador seleccionable en el vector de expresión.
El vector de expresión pC4 (nº de acceso en ATCC 209646) es un derivado del plásmido pSV2-DHFR (nº de acceso en ATCC 37146). pC4 contiene repeticiones terminales largas "LTR" del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., March 1985, Molecular and Cellular Biology, 438-447) y un fragmento del potenciador del citomegalovirus "CMV" (Bosbart et aL, 1985, Cell 41: 521-530). El vector también contiene el intrón en 3’, la señal de poliadenilación y de terminación del gen de la preproinsulina de rata y el gen de la DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano del SV40. Para la transfección se usan células de ovario de hámster chino “CHO” u otras líneas celulares que carecen de un gen de la DHFR activo. La transfección de una construcción de fusión de albúmina en pC4 en las células CHP mediante procedimientos conocidos en la técnica permitirá la expresión de la proteína de fusión de albúmina en células CHO, seguido de la escisión de la secuencia líder y la secreción al sobrenadante. La proteína de fusión de albúmina se purifica después del sobrenadante.
El vector de expresión pEE12.1 es suministrado por Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) y es un derivado de pEE6 (Stephens and Cockett, 1989, Nucl. Acids Res. 17: 7110). Este vector comprende un promotor, un potenciador y la región no traducida en 5’ completa del gen temprano inmediato mayor del citomegalovirus humano "hCMV-MIE" (publicación internacional nº WO89/01036), cadena arriba de una secuencia de interés y un gen de la glutamina sintasa (Murphy et al., 1991, Biochem J. 227: 277-279; Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10:169-175; patente de EE.UU. 5.122.464) para los fines de selección de células transfectadas en medio selectivo que contiene metionina sulfoximina. La transfección de las construcciones de fusión de albúmina en pEE12.1 en las células NS0 (publicación internacional nº WO86/05807) mediante procedimientos conocidos en la técnica permitirá la expresión de la proteína de fusión de albúmina en células NS0, seguido de la escisión de la secuencia líder y la secreción al sobrenadante. Después, la proteína de fusión de albúmina se purifica del sobrenadante usando técnicas descritas en el presente documento o, por otro lado, conocidas en la materia.
La expresión de una proteína de fusión de albúmina se puede analizar mediante, por ejemplo, SDS-PAGE y transferencia Western, análisis de HPLC de fase inversa u otros procedimientos conocidos en la técnica.
Las líneas celulares CHO y NS0 estables transfectadas con construcciones de fusión de albúmina generadas mediante procedimientos conocidos en la técnica (p. ej., transfección en lipofectamina) y seleccionadas con, por ejemplo, metotrexato 100 nM por vectores que tienen el gen de la dihidrofolato reductasa 'DHFR' como marcador seleccionable o mediante el crecimiento en ausencia de glutamina. Los niveles de expresión se puede examinar mediante, por ejemplo, inmunotransferencia, principalmente, con un suero anti-HSA como anticuerpo primario o, en segundo lugar, con suero que contiene anticuerpos dirigidos a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina como anticuerpo primario.
Los niveles de expresión se examinan mediante detección con inmunotransferencia con suero anti-HSA como anticuerpo primario. Las tasas de productividad específicas se determinan mediante ELISA, en el que el anticuerpo de captura puede ser un anticuerpo monoclonal hacia la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina y el anticuerpo de detección puede ser el anticuerpo monoclonal anti-HS-biotinilado (o vice versa), seguido de unión de peroxidasa de rábano/estreptavidina y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Ejemplo 7: Purificación general de una proteína de fusión de albúmina expresada de una construcción de fusión de albúmina en líneas celulares de mamífero
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden la forma madura de HSA fusionada con el extremo N o C de la forma madura de una proteína terapéutica o porciones de la misma (p. ej., l a forma madura de una proteína terapéutica indicada en la tabla 1 o la forma madura de una proteína terapéutica mostrada en la tabla 2 como SEC ID Nº Z). En una realización de la invención, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden además una secuencia señal que dirige el polipéptido de fusión naciente en las vías secretoras del huésped usado para la expresión. En una realización preferida, el péptido señal codificado por una secuencia señal se elimina y la proteína de fusión de albúmina madura se secreta directamente al medio de cultivo. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden, preferentemente, secuencias señal heterólogas
(p. ej., la secuencia señal no nativa de una proteína terapéutica concreta), incluyendo, entre otras, MAF, INV, Ig, Fibulina B, Clusterina, proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina, variante de las secuencias líder de la HAS, incluyendo, entre otros, una secuencia líder de HSA/MAF quimérica, y otras secuencias señal heterólogas conocidas en la técnica. Especialmente preferidas como dichas secuencias señal enumeradas en la tabla 2 y/ la secuencia señal indicada en la sección "Expresión de proteínas de fusión" y/o "Procedimientos adicionales de producción sintética y recombinante de proteínas de fusión de albúmina" de la memoria que se indican anteriormente. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la invención comprenden además un residuo de metionina en el extremo N. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, incluidos fragmentos y/o variantes, también entran dentro de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de sobrenadantes de líneas celulares de mamífero se purifican de acuerdo con diferentes protocolos en función del sistema de expresión usado.
Purificación de líneas celulares CHO y 293T
La purificación de una proteínas de fusión de albúmina de sobrenadante de células CHO o de sobrenadante de células 293T transfectadas de forma transitoria puede implicar la captura inicial con una resina HQ aniónica usando un tampón de fosfato sódico y una elución por gradiente de fosfato, seguido de cromatografía de afinidad en una columna Blue Sepharose FF usando una elución de gradiente de sales. La Blue Sepharose FF elimina los principales contaminantes BSA/fetuina. Otra purificación sobre la resina Poros PI 50 con un gradiente de fosfato puede eliminar y reducir la contaminación de endotoxina, así como el concentrado de la proteína de fusión de albúmina.
Purificación de la línea celular NS0
La purificación de una proteína de fusión de albúmina del sobrenadante de células NS0 puede implicar cromatografía de intercambio aniónico Q-Sepharose, seguida de purificación en SP-sepharose con una etapa de elución, seguida de purificación en Phenyl-650M con una etapa de elución y, en última instancia, diafiltración.
Después, la proteína purificada se puede formular mediante intercambio en tampón.
Ejemplo 40: Aislamiento de un clon de ADNc seleccionado de la muestra depositada
Muchas de las construcciones de fusión de albúmina de la invención se han depositado con la ATCC como se muestra en la tabla 3. Las construcciones de fusión de albúmina pueden comprenden uno cualquiera de los siguientes vectores de expresión: el vector de expresión en la levadura S. cerevisiae pSAC35, el vector de expresión en mamíferos pC4 o el vector de expresión en mamíferos pEE12.1.
Los vectores pSAC35 (Sleep et al., 1990, Biotechnology 8:42), pC4 (nº de acceso en la ATCC 209646; Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (1985); Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)), and pEE12.1 (Lonza Biologics, Inc.; Stephens and Cockett, Nucl. Acids Res. 17: 7110 (1989); publicación internacional nº WO89/01036; Murphy et al., Biochem J. 227: 277-279 (1991); Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10:169-175 (1992); ; patente de EE.UU. 5.122.464; publicación internacional nº WO86/05807) comprenden un gen de resistencia a ampicilina para el crecimiento en células bacterianas. Estos vectores y/o la construcción de fusión de albúmina que los comprende se pueden transformar en una cepa de E. coli tal como Stratagene XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, Inc., 11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037) usando técnicas descritas en la materia, tal como Hanahan, extensión en placas de agar Luria-Broth que contienen 100 μg/ml de ampicilina y crecimiento durante la noche a 37 °C.
El material depositado en la muestra asignada con el número de depósito en la ATCC citado en la tabla 3 para cualquier construcción de fusión de albúmina dada también puede contener una o más construcciones de fusión de albúmina adicionales, codificando cada una diferentes proteínas de fusión de albúmina. Por tanto, los depósitos que comparten el mismo número de depósito en la ATCC contienen al menos una construcción de fusión de albúmina identificada en la correspondiente fila de la tabla 3.
Se pueden usar dos enfoques para aislar una construcción de fusión de albúmina concreta de la muestra depositada de los ADN plasmídicos citados para dicha construcción de fusión de albúmina en la tabla 3.
Procedimiento 1: Detección selectiva
Primero, una construcción de fusión de albúmina se puede aislar directamente mediante detección selectiva de la muestra del ADN plasmídico depositado usando una sonda polinucleotídica correspondiente a la SEC ID Nº X para un ID nº de construcción individual en la tabla 1, usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar un polinucleótido específico con 30-40 nucleótidos usando un sintetizador de ADN de Applied Biosysteins de acuerdo con la secuencia indicada. El oligonucleótido se puede marcar con, por ejemplo, 32P-y-ATP usando la polinucleótido quinasa de Y4 y se purifica de acuerdo con procedimientos de rutina. (p. ej., Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). La construcción de fusión de albúmina de un depósito de la ATCC dado se transforma en un huésped adecuado, como se ha indicado anteriormente (tal como XL-1 Blue (Stratagene)) usando técnicas conocidas para el experto en la técnica, tal como las proporcionadas por el suministrador del vector o en publicaciones o patentes relacionadas citadas anteriormente. Los transformantes se siembran en placas de agar al 1,5 % (que contienen el agente de selección adecuado, por ejemplo ampicilina) hasta una densidad de aproximadamente 150 transformantes (colonias) por placa. Estas placas se someten a detección selectiva usando membranas de nailon de acuerdo con procedimientos rutinarios para detección selectiva de colonias bacterianas (p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edit., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 1.93 a 1.104), u otras técnicas conocidas para los expertos en la técnica.
Procedimiento 2: PCR
Como alternativa, el ADN que codifica una proteína de fusión de albúmina dada se puede amplificar de una muestra de una construcción de fusión de albúmina depositada con SEC ID Nº X, por ejemplo usando dos cebadores de 1720 nucleótidos que hibridan con la construcción de fusión de albúmina depositada 5’ y 3’ con el AD que codifica una proteína de fusión de albúmina dada, La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo en condiciones de rutina, por ejemplo en 25 μl de la mezcla de reacción con 0,5 ug del molde de ADNc anterior. Una mezcla de reacción conveniente es MgCl2 1,5-5 mM, 0,1 % (p/v) de gelatina, 20 μM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmol de cada cebador y 0,25 unidades de la Taq polimerasa. Se realizan treinta y cinco ciclos de PCR (desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto, hibridación a 55 ºC durante 1 minuto, elongación a 72 ºC durante 1 minuto) con un ciclador térmico automático Perkin-Elmer Cetus. El producto amplificado se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y la banda de ADN con el peso molecular previsto se escinde y purifica. El producto de PCR se verifica que es la secuencia seleccionada mediante subclonación y secuenciación del producto de ADN.
Se dispone de varios procedimientos para la identificación de las porciones no codificantes en 5' y 3’ de un gen que puede no estar presente en el clon depositado. Estos procedimientos incluyen, entre otros, sondaje con filtro, enriquecimiento del clon usando sondas específicas y protocolos similares o idénticos a los protocolos “RACE” en 5’ y 3’ que se conocen en la técnica. Por ejemplo, se dispone de un procedimiento similar al RACE en 5’ para generar el extremo 5' ausente de un tránscrito de longitud completa deseado. (Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res., 21(7):1683-1684 (1993)).
Brevemente, un oligonucleótido de ARN específico se liga a los extremos 5' de una población de ARN que posiblemente contenga los tránscritos de ARN del gen de longitud completa. Un conjunto de cebadores que contienen un cebador específico del oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico de una secuencia conocida del gen de interés se usa para amplificar por PCR la porción en 5' del gen de longitud completa deseado. Este producto amplificado se puede secuenciar después y usar para generar el gen de longitud completa.
Este procedimiento anterior comienza con el ARN total aislado de la fuente deseada, aunque se puede usar poli-A+ARN. La preparación de ARN se puede tratar después con fosfatasa en caso necesario para eliminar los grupos fosfato en 5' sobre ARN degradado o dañado que pede interferir con la última etapa de ARN ligasa. La fosfatasa deberá inactivarse y el ARN tratarse con la pirofosfatasa ácida de tabaco con el fin de eliminar la estructura de capuchón presente en los extremos 5’ de los ARN mensajeros. Esta reacción deja un grupo fosfato en 5’ en el extremo 5’ del ARN sin capuchón que después se puede ligar en un oligonucleótido de ARN usando la ARN ligasa de T4.
Esta preparación de ARN modificado se usa como molde para la síntesis de la primera hebra del ADNc usando un oligonucleótido específico del gen. La reacción de síntesis de la primera hebra se usa como molde para la amplificación por PCR del extremo 5’ deseado usando un cebador específico del oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico de la secuencia conocida del gen de interés. El producto resultante se secuencia después y analiza para confirmar que la secuencia del extremo 5' pertenece al gen deseado.
Ejemplo 41: Ensayo de captación de [3H]-2-Desoxiglucosa
Los tejidos adiposo, de músculo esquelético y hepático son tejidos sensibles a insulina. La insulina puede estimular la captación/transporte de glucosa en estos tejidos. En el caso de los tejidos adiposo y de músculo esquelético, la insulina inicia la transducción de señal que en última instancia conduce a la translocación de la molécula 4 transportadora de glucosa, GLUT4, desde un compartimento intracelular especializado a la superficie de la célula. Una vez en la superficie de la célula, GLUT4 permite la captación/transporte de glucosa.
Captación de [3H]-2-Desoxiglucosa
Se puede usar una serie de líneas celulares relacionadas con los tejidos adiposo y muscular para analizar la actividad de captación/transporte de glucosa en ausencia o presencia de una combinación de uno cualquiera de los fármacos terapéuticos indicados para el tratamiento de la diabetes mellitus. En particular, las células de fibroblastos murinos 3T3-L1 y las células de músculo esquelético murino L6 se pueden diferenciar en adipocitos 3T3-L1 y en miotubos, respectivamente, para servir como modelos in vitro adecuados para el ensayo de captación de [3H]-2-Desoxiglucosa (Urso et al., J Biol Chem, 274(43): 30864-73 (1999); Wang et al., J Mol Endocrinol, 19(3): 241-8 (1997); Haspel et al., J Membr Biol, 169 (1): 45-53 (1999); Tsakiridis et al., Endocrinology, 136(10): 4315-22 (1995)). Brevemente, 2 x 105 células/100 μl de adipocitos o de células L6 diferenciadas se transfieren a placas de cultivo tisular de 96 pocillos, “CT”, tratadas, es decir, revestidas, con 50 μg/ml de poli-L-lisina, placas en medio posdiferenciación y se incuban durante la noche a 37ºC en 5 % de CO2. Las células se lavan primero una vez con medio DMEM con poca glucosa sin suero y después se mantienen con 100 μl/pocillo del mismo medio y con 100 μl/pocillo de tampón o de una combinación de una cualquiera o más de los fármacos terapéuticos enumerados para el tratamiento de la diabetes mellitus, por ejemplo concentraciones crecientes de 1 nM, 10 nM, y 100 nM de los agentes terapéuticos de la invención sujeto (p. ej., fusiones específicas divulgadas como la SEC ID Nº Y y fragmentos y variantes de las mismas) durante 16 horas a 37 ºC en ausencia o presencia de insulina 1 nM. Las placas se levan tres veces con 100 μl/pocillo de solución salina tamponada HEPES. Se añade insulina a 1 nM en solución salina tamponada HEPES durante 30 min a 37 °C en presencia de 10 μM [3H]-2-desoxiglucosa marcada (Amersham, #TRK672) y 2-desoxiglucosa 10 μM sin marcar (SIGMA, D-3179). Como control se realizan las mismas condiciones a excepción de en ausencia de insulina. Se añade una concentración final de citochalasina B (SIGMA, C6762) a 100 μl/pocillo en un pocillo aparte para medir la captación inespecífica. Las células se levan tres veces con solución salina tamponada HEPES. Se añaden [3H]-2-desoxiglucosa marcada 10 μM sin marcar, es decir 2desoxiglucosa 10 μM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se levan tres veces con solución salina tamponada con fosfato “PBS" fría. Las células se lisan tras la adición de 150 μ/pocillo de NaOH 0,2 N y la posterior incubación con agitación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después, las muestras se transfieren a un vial de centelleo al que se añaden 5 ml de fluido de centelleo. Los viales se cuentan en un contador de centelleo beta. La captación en condiciones de duplicado, siendo la diferencia la ausencia o presencia de insulina, se determina con la ecuación siguiente: [(cuentas de insulina por minuto "cpm" – cpm inespecíficas)/(cpm sin insulina- cpm inespecíficas)]. Las respuestas medias entran dentro de los límites de aproximadamente por 5 y por 3 las de los controles por adipositos y miotubos.
Diferenciación de células
Se deja que las células lleguen a confluencia completa en un matraz de T-75 cm2. Se retira el medio y se sustituye con 25 ml de medio de prediferenciación durante 48 horas. Las células se incuban a 37 ºC en 5 % de CO2, 85 % de humedad. Tras 48 horas, se retira el medio de prediferenciación y se sustituye con 25 ml de medio de diferenciación durante 48 horas. Las células se incuban de nuevo a 37 ºC en 5 % de CO2, 85 % de humedad. Tras 48 horas, se retira el medio y se sustituye con 30 ml de medio de posdiferenciación. El medio posdiferenciación se mantiene durante 14-20 días o hasta que se consigue la diferenciación completa. El medio se cambia cada 2-3 días. Los adipositos humanos se pueden adquirir de Zen-Bio, INC (# SA-1096).
Ejemplo 42: Ensayo in vitro de incorporación de timidina-[3H]- en líneas de células de pancreáticas
Recientemente se ha mostrado que GLP-1 induce la diferenciación de la línea celular epitelial ductal pancreática de rata ARIP de un modo dependiente del tiempo y de la dosis, que se asocia con un incremento de la homeocaja 1 duodenal de los islotes (IDX-1) y los niveles de ARNm de insulina (Hui et at., 2001, Diabetes, 50(4): 785-96). El IDX1 aumenta, a su vez, los niveles de ARNm del receptor del GLP-1.
Tipos de células analizados
Células RIN-M: Estas células están disponibles en la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, número de línea celular CRL-20577). La línea celular RIN-M derivaba de un tumor de células de islotes de rata transplantables inducido por radiación. La línea se estableció a partir de un xenoinjerto del tumor de ratón atímico Las células producen y secretan hormonas polipeptídicas del islote y producen L-dopa descarboxilasa (un marcador de células que tienen captación del precursor de aminas y descarboxilación, o actividad APUD).
Células ARIP: Estas son células exocrinas pancreáticas de morfología epitelial disponibles en la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, número de línea celular CRL-1674). Véanse también las referencias: Jessop,
N.W. and Hay, R.J., "Characteristics of two rat pancreatic exocrine cell lines derived from transplantable tumors," In Vitro 16: 212, (1980); Cockell, M. et al., "Identification of a cell-specific DNA-binding activity that interacts with a transcriptional activator of genes expressed in the acinar pancreas," Mol. Cell. Biol. 9: 2464-2476, (1989); Roux, E., et al. "The cell-specific transcription factor PTF1 contains two different subunits that interact with the DNA" Genes Dev. 3: 1613-1624, (1989); and, Hui, H., et al., "Glucagon-like peptide 1 induces differentiation of islet duodenal homeobox-1-positive pancreatic ductal cells into insulin-secreting cells," Diabetes 50: 785-796 (2001).
Preparación de las células
La línea celular RIN-M se cultiva en medio RPMI 1640 (Hyclone, #SH300027.01) con 10 % de suero bovino fetal (HyClone, #SH30088.03) y se subcultiva cada 6 a 8 días a una proporción de 1:3 a 1:6. El medio se cambia cada 3 a 4 días.
La línea celular ARIP (ATCC #CRL-1674) se cultiva en medio F12K de Ham (ATCC, #30-2004) con L-glutamina 2 mM ajustada para contener 1,5 g/l de bicarbonato sódico y 10 % de suero bovino fetal. La línea celular ARIP se subcultiva en una proporción de 1:3 a 1:6 dos veces a la semana. El medio se cambia cada 3 a 4 días.
Protocolo del ensayo
Las células se siembran a 4.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivan de 48 a 72 horas hasta una confluencia del 50 %. Las células se pasan a medio sin suero a 100 μl/pocillo. Tras incubar durante 48-72 horas, al pocillo se añaden sustancias terapéuticas de la invención sujeto (p. ej., proteínas de fusión de albúmina de la invención y fragmentos y variantes de las mismas). La incubación persiste durante 36 horas adicionales. La timidina [3H] (5-20 Ci/mmol) (Amersham Pharmacia, #TRK120) se diluye hasta 1 microCuries/5 microlitros. Después de una incubación de 36 horas se añaden 5 microlitros por pocillo durante otras 24 horas. La reacción se termina mediante lavado suave de las células con solución salina tamponada con fosfato “PBS" fría una vez. Las células se fijan después con 100 microlitros de 10 % de TCA helado durante 15 minutos a 4 ºC. El PBS se elimina y se añaden 200 microlitros de NaOH 0,2 N. Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La solución se transfiere a un vial de centelleo y se añaden 5 ml de fluido de centelleo compatible con soluciones acuosas y se mezclan enérgicamente. Los viales se cuentan en un contador de centelleo beta. Como control negativo solo se usa tampón. Como control positivo se usa suero bovino fetal.
Ejemplo 43: Ensayo de glucosuria
La glucosuria (es decir, un exceso de azúcar en la orina) se puede determinar fácilmente para proporcionar un índice del estado de la enfermedad de diabetes mellitus. El exceso en orina en una muestra de pacientes en comparación con una muestra normal de un paciente es sintomática de DMDI y de DMNDI. La eficacia del tratamiento de dicho paciente con DMDI y DMNDI viene indicada por una disminución resultante de la cantidad de exceso de glucosa en orina. En una realización preferida para el control de la DMDI y DMNDI, las muestras de orina de pacientes se analizan para determinar la presencia de glucosa usando técnicas conocidas en la materia. La glucosuria en seres humanos se define por una concentración de glucosa en orina superior a 100 mg por 100 ml. Los niveles excesivos de azúcar en los pacientes que exhiben glucosuria se pueden medir incluso con mayor precisión obteniendo muestras de sangre y analizando la glucosa en suero.
Ejemplo 44: Diabetes en ratones NOD.
Los ratones NOD (diabéticos no obesos) hembra se caracterizan por DMDI con una evolución similar a la hallada en seres humanos, aunque la enfermedad es más pronunciada en ratones NOD hembra que en macho. En lo sucesivo en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, la expresión “ratón NOD” hace referencia a un ratón NOD hembra. Los ratones NOD tienen una destrucción progresiva de las células beta que se debe a una enfermedad autoinmunitaria crónica. Por tanto, los ratones NOD comienzan la vida con euglucemia o niveles normales de glucosa en sangre. A aproximadamente las 15 a 16 semanas de edad, los ratones NOD comienzan a estar hiperglucémicos, lo que indica destrucción de la mayoría de las células beta pancreáticas y la correspondiente incapacidad del páncreas para producir suficiente insulina. Por tanto, tanto la causa como la progresión de la enfermedad son similares a las de los pacientes DMDI humanos.
Los ensayos de eficacia In vivo de los regímenes de inmunización se pueden evaluar en ratones NOD/LtJ hembra (disponibles comercialmente en The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me.). En la literatura, se ha comunicado que e 80 % de los ratones hembra desarrolla diabetes a las 24 semanas de edad y la insulitis comienza a las 6-8 semanas de edad. Los ratones NOD son endogámicos y muy respondedores a diversas estrategias inmunorreguladoras. Los ratones NOD adultos (6-8 semanas de edad) tienen una masa media de 20-25 g.
Estos ratones pueden estar sin tratar (control), tratados con las sustancias terapéuticas de la invención sujeto (p. ej., proteínas de fusión de albúmina de la invención y fragmentos y variantes de las mismas), solas o en combinación con otros compuestos terapéuticos indicados anteriormente. El efecto de estos diversos tratamientos sobre la progresión de la diabetes se puede medir del siguiente modo:
A las 14 semanas de edad, los ratones NOD hembra se pueden fenotipar de acuerdo con la tolerancia a la glucosa. La tolerancia a la glucosa se puede medir con la prueba de la tolerancia a la glucosa intraperitoneal ( Brevemente, se extrae sangre del plexo paraorbital a 0 minutos y a 60 minutos de la inyección intraperitoneal de glucosa (1 g/kg de peso corporal). La tolerancia normal se define como la glucosa en plasma a 0 minutos de menos de 144 mg, %,
o a 60 minutos de menos de 160 mg %. Los niveles de glucosa en sangre se miden con un glucosímetro Elite.
Según este análisis fenotípico, se puede asignar a los animales a los diferentes grupos experimentales. En concreto, los animales con niveles de glucosa en sangre más elevados se pueden asignar al grupo de tolerancia a la glucosa alterada. Se puede alimentar a los ratones a demanda y se les puede suministrar agua acidificada (pH 2,3).
Los ratones tolerantes e intolerantes a la glucosa se pueden subdividir además en grupos control, de proteínas de fusión de albúmina de la invención sujeto, y de combinación de proteínas de fusión de albúmina /compuestos terapéuticos. Los ratones del grupo control pueden recibir una inyección interperitoneal de vehículo al día, seis veces a la semana. Los ratones del grupo de fusión de albúmina pueden recibir una inyección interperitoneal de las sustancias terapéuticas de la invención sujeto (p. ej., las proteínas de fusión de albúmina de la invención y fragmentos y variantes de las mismas) en vehículo diario, seis ves a la semana. Los ratones del grupo de combinación proteínas de fusión de albúmina / compuestos terapéuticos pueden recibir proteínas de fusión de albúmina y combinaciones de compuestos terapéuticos como se ha descrito anteriormente.
EL nivel de glucosa en orina en los ratones NOD se puede determinar dos veces a la semana usando Labstix (Bayer Diagnostics, Hampshire, England). El peso y la ingesta de fluidos también se puede determinar dos veces a la semana. El inicio de la diabetes se define después de la aparición de glucosuria en dos determinaciones consecutivas. Tas 10 semanas de tratamiento, se puede realizar una nueva prueba de IPGTT adicional y se puede sacrificar a los animales al día siguiente.
Durante las 10 semanas del tratamiento, los animales control de los grupos tolerantes a glucosa e intolerantes a glucosa desarrollan diabetes a una velocidad del 60 % y 86 %, respectivamente (véase la patente de EE.UU. nº 5.866.546, Gross et al.). Por tanto, se producen altas tasas de diabetes incluso en ratones NOD que eran inicialmente tolerantes a la glucosa si no se realiza ninguna intervención.
Los resultados se pueden confirmar mediante la determinación de los niveles de glucosa en sangre en ratones NOD, antes y después del tratamiento. Los niveles de glucosa en sangre se miden como se ha descrito anteriormente en ratones tanto tolerantes como intolerantes a la glucosa en todos los grupos descritos.
En una realización alternativa, las sustancias terapéuticas de la invención sujeto (p. ej., fusiones específicas divulgadas como la SEC ID Nº Y y fragmentos y variantes de las mismas) se pueden cuantificar usando análisis espectrométrico y cantidades adecuadas de proteínas se pueden resuspender antes de la inyección en 50 mu.l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por dosis. Se pueden administrar dos inyecciones, separadas por una semana, por vía subcutánea debajo de la piel dorsal de cada ratón. La monitorización se puede realzar dos veces separadas antes de la inmunización y se puede realizar semanalmente a lo largo del tratamiento y continuar después. La orina se puede analizar para determinar la glucosa cada semana (Keto-Diastix.RTM.; Miles Inc., Kankakee, III.) y en los ratones glucosúricos se controlarán los niveles de glucosa en suero (ExacTech.RTM., MediSense, Inc., Waltham, Mass.). Se diagnostica diabetes cuando la glucemia en ayunas es superior a 2,5 g/l.
Ejemplo 45: Exploración histológica de ratones NOD.
La exploración histológica de las muestras de tejido de ratones NOD puede demostrar la capacidad de las composiciones de la presente invención y/o la combinación de las composiciones de la presente invención con otros agentes terapéuticos para diabetes, para incrementar la concentración relativa de las células beta en el páncreas. El procedimiento experimental es el siguiente:
Se puede sacrificar a los ratones del ejemplo 44 al final del periodo de tratamiento y se pueden tomar muestras de tejido del páncreas. Las muestras se pueden fijar en 10 % de formalina en solución salina al 0,9 % y se incluyen en cera. Se pueden cortar dos conjuntos de 5 secciones mu.m en serie para inmunomarcaje a un intervalo de corte de 150 .mu.m. Las secciones se pueden inmunomarcar para insulina (dilución 1:1000 de anticuerpo anti-insulina de cobaya, ICN Thames U.K.) y glucagón (dilución 1:2000 de antisuero anti-glucagón de páncreas de conejo) y se detecta con antisuero de cobaya conjugado con peroxidasa (Dako, High Wycombe, Reino Unido.) o antisuerpo de conejo conjugado con peroxidasa (dilución a 1:50, Dako).
La composición de la presente invención puede o no tener un fuerte efecto sobre la masa visible de las células beta, como sobre las manifestaciones clínicas de la diabetes en animales tolerantes a la glucosa o intolerantes a la glucosa.
Ejemplo 46: Terapia de combinación de transplantes de células beta pancreáticas.
El transplante es una forma habitual de tratamiento de enfermedad autoinmunitaria, especialmente cuando el propio tejido diana se ha visto dañado gravemente. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el transplante de páncreas y el transplante de células de los islotes son opciones terapéuticas para la DMID (véase, por ejemplo, Stewart et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 86 (3): 984-988 (2001); Brunicardi, Transplant. Proc. 28: 2138-40 (1996); Kendall & Robertson, Diabetes Metab. 22: 157-163 (1996); Hamano et al., Kobe J. Med. Sci. 42: 93-104 (1996); Larsen & Stratta, Diabetes Metab. 22: 139-146 (1996); and Kinkhabwala, et al., Am. J. Surg. 171: 516-520 (1996)). Como ocurre con cualquier procedimiento de transplante, los tratamientos de transplantes para pacientes con enfermedades autoinmunitarias incluyen tratamientos para minimizar el riesgo de rechazo del huésped del tejido transplantado. No obstante, la enfermedad autoinmunitaria implica el riesgo independiente adicional de que la respuesta autoinmunitaria preexistente del huésped que dañó el tejido propio original ejercerá el mismo efecto dañino sobre el tejido transplantado. De acuerdo con esto, la presente invención abarca procedimientos y composiciones para el tratamiento de enfermedades pancreáticas autoinmunitarias usando las proteínas de fusión de albúmina de la invención sujeto en combinación con inmunomoduladores/inmunosupresores en individuos sometidos a terapia de transplante de la enfermedad autoinmunitaria.
De acuerdo con la invención, las composiciones basadas en fusión de albúmina y las formulaciones descritas anteriormente se administran para prevenir y tratar los daños en el órgano, tejido o células transplantadas resultantes de la respuesta autoinmunitaria del individuo huésped dirigida inicialmente contra el tejido propio original. La administración se puede llevar a cabo antes y después del transplante en de 2 a 4 dosis, separadas cada una por una semana.
Los siguientes inmunomoduladores/inmunosupresores, incluyendo, entre otros, AI-401, CDP-571 (anticuerpo monoclonal anti-TNF), CG-1088, Diamyd (vacuna para la diabetes), ICM3 (anticuerpo monoclonal anti-ICAM-3), linomida (Roquinimex), NBI-6024 (ligando peptídico alterado), TM-27, VX-740 (HMR-3480), inhibidores de la caspasa 8 proteasa, talidomida, hOKT3gammal (Ala-ala) (anticuerpo monoclonal anti-CD3), interferón-alfa oral, lactobacillus oral y LymphoStat-B™ se pueden usar junto con las sustancias terapéuticas de fusión de albúmina de la invención sujeto en transplante de las células de los islotes o de páncreas.
Ejemplo 47: Modelo de ratón in vivo de DMNID
Los ratones C57BL/6J macho de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) se pueden obtener a las 3 semanas de edad y se les alimentó con pienso convencional o dietas enriquecidas con grasa (35,5 % peso/peso, Bioserv.Frenchtown, NJ) o fructosa (60 % peso/peso, Harlan Teklad, Madison, WI). El pienso regular está compuesto por 4,5 % peso/peso de grasa, 23 % peso/peso de proteína, 3,19 % peso/peso de almidón, 3,7 % peso/peso de fructosa y 5,3 % peso/peso de fibra. La dieta rica en grasa (manteca) está compuesta por 35,5 % peso/peso de grasa, 20 % peso/peso de proteína, 36,4 % peso/peso de de almidón, 0,0 % peso/peso de fructosa y 0,1 % peso/peso de fibra. La dieta rica en fructosa está compuesta por 5 % peso/peso de grasa, 20 % peso/peso de proteína, 0,0 % peso/peso de almidón, 60 % peso/peso de fructosa y 9,4 % peso/peso de fibra. Los ratones se enjaularán a no más de cinco por jaula a una habitación con temperatura de 22° +/- 3°C y 50 % +/- 20 % de humedad controladas con un ciclo de 12 horas de luz (de 6 de la mañana a 6 de la noche)/ oscuridad (Luo et al., 1998, Metabolism 47(6): 6638, "Nongenetic mouse models of non-insulin-dependent diabetes mellitus"; Larsen et al., Diabetes 50(11): 2530-9 (2001), "Systemic administration of the long-acting GLP-1 derivative NN2211 induces lasting and reversible weight loss in both normal and obese rats"). Tras la exposición a las respectivas dietas durante 3 semanas, se puede inyectar a los ratones por vía intraperitoneal estreptozotocina "STZ" (Sigma, St. Louis, MO), a 100 mg/kg de peso corporal o vehículo (0,05 mol/l de ácido cítrico, pH 4,5) y se mantuvieron con la misma dieta durante la siguientes 4 semanas. En condiciones sin ayuno se obtiene sangre 1, 2 y 4 semanas después de la STZ extrayéndola en la parte distal de la cola. Las muestras se usan para medir a glucosa en plasma sin ayunar y las concentraciones de insulina. El peso corporal y la ingesta de alimentos se registran semanalmente.
Para determinar directamente el efecto de la dieta rica en grasas sobre la capacidad de la insulina para estimular la eliminación de la glucosa, los experimentos se pueden iniciar en tres grupos de ratones, alimentados con grasas, alimentados con pienso y a los que se inyectó vehículo y alimentados con grasa y a los que se inyectó STZ al final del periodo de 7 semanas descrito anteriormente. Los ratones se pueden dejar en ayunas durante 4 horas antes de los experimentos. En la primera serie de experimentos, se puede anestesiar a los ratones mediante inhalación de metoxiflurano (Pitman-Moor, Mundelein, IL). Se puede inyectar insulina regular (Sigma) por vía intravenosa ([IV] 0,1 U/kg de peso corporal) a través de la vena de la cola y se puede extraer sangre 3, 6, 9, 12 y 15 minutos después de la inyección de una vena de la cola diferente. Las concentraciones de glucosa en plasma se pueden determinar en estas muestras y se puede calcular la semivida (t½) de la desaparición de glucosa del plasma usando WinNonlin (Scientific Consulting, Apex, NC), un programa de software de farmacocinética/farmacodinamia.
En la segunda serie de experimentos, se puede anestesiar a los ratones con pentobarbital sódico intraperitoneal (Sigma). Se abre la cavidad abdominal y se expone la principal vena abdominal y se introduce un catéter i.v. de calibre 24 (Johnson-Johnson Medical, Arlington, TX). El catéter se fija al tejido muscular adyacente a la vena abdominal, se corta por el fondo de la conexión de la jeringa y se engancha a un tubo de plástico PE50 precargado, que a se vez está conectado a una jeringa con la solución de infusión. Después, se cierra la cavidad abdominal mediante suturas. Con este enfoque, no se produciría un bloqueo del retroflujo de la sangre desde la parte inferior del cuerpo. Se puede perfundir continuamente glucosa en los ratones (24,1 mg/kg/min) e insulina (10 mU/kg/min) a un volumen de infusión de 10 μl/min. Se puede extraer muestras de sangre retroorbital (70 μl cada una) a 90, 105, 120 y 135 minutos después del inicio de la infusión para medir las concentraciones de glucosa y de insulina en plasma. La media de estas cuatro muestras se usa para estimar las concentraciones en equilibrio de glucosa (SSPG) y de insulina (SSPI) en plasma para cada animal.
Por último, se pueden realizar experimentos para evaluar la capacidad de las proteínas de fusión de albúmina, las composiciones terapéuticas de la presente solicitud, solas o en combinación con uno cualquiera o más de los fármacos terapéuticos indicados para el tratamiento de la diabetes mellitus, para disminuir la glucosa en plasma, en los dos grupos siguientes de modelos de ratones “DMNID" en los que se ha inyectado STZ. (1) C57BL/6J alimentados con grasas y (2) C57BL/6J alimentados con fructosa. Las concentraciones de glucosa en plasma de los ratones para estos estudios pueden variar de 255 a 555 mg/dl. Los ratones se asignan a azar a recibir tratamiento con vehículo, sustancias terapéuticas de fusión de albúmina de la presente invención, solas o en combinación con uno cualquiera o más de los fármacos terapéuticos indicados para el tratamiento de la diabetes mellitus. Se puede administrar un total de tres dosis. Se pueden extraer muestras de sangre de la vena de la cola para medir la concentración de glucosa en plasma antes de la primera dosis y 3 horas después de la dosis final.
Las concentraciones de glucosa en plasma se pueden determinar usando el kit Glucose Diagnostic de Sigma (Sigma No. 315), un ensayo colorimétrico enzimático. Los niveles de insulina en plasma se pueden determinar usando el kit RIA para insulina en ratas de Linco Research (#RI-13K; St. Charles, MO).
Ejemplo 51: Preparación de la proteína de fusión de hormona-HA (tal como insulina, LH, FSH).
El ADNc de la hormona de interés, como insulina, se puede aislar mediante diversos medios, incluyendo, aunque no exclusivamente, bibliotecas de ADNc, RT-PCR y PCR usando una serie de cebadores oligonucleotídicos sintéticos solapantes, todos ellos usando procedimientos estándar. Las secuencias de nucleótidos para todas estas proteínas se conocen y están disponibles en, por ejemplo, las bases de datos públicas, tales como GenBank. El ADNc se puede ajustar en los extremos 5’ 3’ para generar sitios de restricción, de forma que se puedan usar ligadores oligonucleotídicos para clonar el ADNc en un vector que contiene el ADNc para HA. Esto Puede ser en el extremo N
o C con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El ADNc de la hormona se clona en un vector tal como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA del cual se escinde el casete de expresión completa y se inserta en el plásmido pSAC35 para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en levaduras. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger después y purificar del medio, y se analiza su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar a excepción de que el casete de expresión usado emplea un promotor de mamífero, una secuencia líder y un terminador (véase el ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde e inserta en un plásmido adecuado para la transfección en líneas celulares de mamífero.
Ejemplo 57: Preparación de proteínas de fusión de HA objetivo.
El ADNc de la proteína de interés se puede aislar de la biblioteca de ADNc o se puede sintetizar usando varios oligonucleótidos solapantes usando procedimientos de biología molecular estándar. Los nucleótidos adecuados se pueden modificar mediante ingeniería en el ADNc para formar sitios de restricción convenientes y también permitir la unión del ADNc de la proteína al ADNc de la albúmina similar al procedimiento descrito para hGH. Asimismo, un ADNc de la proteína o péptido dirigido, tal como un anticuerpo monocatenario o péptidos, como señales de localización nuclear, que pueden dirigir las proteínas al interior de las células se puede fusionar con el otro extremo de la albúmina. La proteína de interés y el péptido dirigido se clona en un vector, tal como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA o pC4:HSA, que permite la fusión con el ADNc de la albúmina. De este modo, ambos extremos, N y C, de la albúmina se fusionan con otras proteínas. A continuación, el ADNc fusionado se escinde de pPPC0005 y se inserta en un plásmido, tal como pSAC35, para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en levaduras. Todos los procedimientos anteriores se pueden realizar usando procedimientos de biología molecular. La proteína de fusión de albúmina secretada de levadura se puede recoger y purificar del medio, y se analiza su actividad biológica y su actividad de dirección usando pruebas bioquímicas y biológicas adecuadas.
Ejemplo 59: Expresión bacteriana de una proteína de fusión de albúmina
Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención que comprende una secuencia señal bacteriana se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos para PCR correspondientes a los extremos 5’ y 3’ de la secuencia de ADN para sintetizar los fragmentos de inserción. Los cebadores usados para amplificar el polinucleótido que codifica el inserto deberán contener, preferentemente, sitios de restricción tales como BamHI y XbaI, en el extremo 5’ de los cebadores con el fin de clonar el producto amplificado en el vector de expresión. Por ejemplo, BamHI y XbaI corresponden a los sitios de las enzimas de restricción sobre el vector de expresión bacteriano pQE-9. (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). El vector plasmídico codifica resistencia a antibióticos (Ampr), un origen de replicación bacteriano (ori), un promotor/operador regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión al ribosoma (RBS), una cola de 6-histidina (6-His) y sitios de clonación para enzimas de restricción.
El vector pQE-9 se digiere con BamHI y XbaI y el fragmento amplificado se liga en el vector pQE-9 manteniendo el marco de lectura iniciado en el RBS bacteriano. La mezcla de ligación se usa después para transformar la cepa de
E. coli M15/rep4 (Qiagen, Inc) que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacl y también confiere resistencia a kanamicina (Kanr). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. El ADN plasmídico se aísla y se confirma mediante análisis de restricción.
Los clones que contienen las construcciones deseadas se cultivan durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado con Amp (100 ug/ml) y Kan (25 ug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo grande a una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se cultivan hasta una densidad óptica de 600 (DO 600) de entre 0,4 y 0,6. Después se añade IPTG (isopropil-B-D-tiogalacto piranósido) hasta una concentración final de 1 mM. El IPTG induce inactivando el represor lacl, eliminando el líder P/O para aumentar la expresión génica.
Las células se cultivan durante 3 horas a 4 horas adicionales. Después, las células se recogen mediante centrifugación (20 min a 6.000 Xg). El sedimento celular se solubiliza en el agente caotrópico guanidina HCl 6 molar o, preferentemente, en urea 8M y concentraciones superiores a 0,14 M de 2-mercaptoetanol agitando durante 3-4 horas a 4 ºC (véase, por ejemplo, Burton et al., Eur. J. Biochem. 179:379-387 (1989)). Los residuos celulares se eliminan mediante centrifugación y el sobrenadante que contiene el polipéptido se carga sobre una columna de resina de afinidad de níquel-nitrilo-tri-ácido acético ("Ni-NTA") (disponible en QIAGEN, Inc., supra). Las proteínas con una cola 6 x His se unen a la resina Ni-NTA con una afinidad elevada y se pueden purificar en un simple procedimiento de una sola etapa (para los detalles, véase: The QIAexpressionist (1995) QIAGEN, Inc., supra).
Brevemente, el sobrenadante se carga sobre la columna en guanidina-HCl 6 M, a pH 8. La columna se lava primero con 10 volúmenes de guanidina-HCl 6 M, a pH 8, después se lava con 10 volúmenes de guanidina-HCl 6 M, a pH 6, y, por último, el polipéptido se eluye con guanidina-HCl 6 M, a pH 5.
A continuación, la proteína purificada se renaturaliza mediante diálisis contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) o Na-acetato 50 mM, a pH 6, más NaCl 200 mM. Como alternativa, la proteína se puede volver a plegar con éxito mientras está inmovilizada sobre la columna de Ni-NTA. Ejemplos de condiciones son los siguientes: renaturalización usando un gradiente linear de urea 6M-1M en NaCl 500 mM, 20 % de glicerol, Tris/HCl 20 mM a pH 7,4, que contiene inhibidores de la proteasa. La renaturalización se realizará durante un periodo de 1,5 horas o más. Tras la renaturalización, las proteínas se eluyen mediante la adición de imidazol 250 mM. El imidazol se retira mediante una última etapa de diálisis contra PBS o tampón acetato sódico 50 mM a pH 6 más NaCl 200 mM. La proteína purificada se almacena a 4° C o se congela a -80 ºC.
Además del vector de expresión anterior, la presente invención incluye además un vector de expresión denominado HE4a (número de acceso en la ATCC 209645, depositado el 25 de febrero de 1998), que contiene elementos del fago, operador y promotor, unidos operativamente a un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención denominada pHE4a. (número de acceso en la ATCC 209645, depositado el 25 de febrero de 1998). Este vector contiene: 1) un gen de la neomicinfosfotransferasa como marcador de selección, 2) un origen de replicación de E. coli, 3) una secuencia promotora del fago T5, 4) dos secuencias del operador lac, 5) una secuencia de Shine-Delgarno y 6) el gen represor del operón lactosa (lacIq). El origen de replicación (oriC) deriva de pUC19 (LTI, Gaithersburg, MD). Las secuencias del promotor y del operador se preparan sintéticamente.
El ADN se puede insertar en pHE4a mediante restricción del vector con NdeI y XbaI, BamHI, XhoI, o Asp718, pasando el producto restringido por un gel y aislando el fragmento más grande (el fragmento de relleno deberá ser de aproximadamente 310 pares de bases). El inserto de ADN se genera de acuerdo con los protocolos de PCR descritos en el presente documento o, por otro lado, conocidos en la técnica, usando cebadores de PCR que tienen sitios de restricción para NdeI (cebador 5') y XbaI, BamHI, XhoI, o Asp718 (cebador 3'). El inserto de PCR se purifica en gel y se restringe con enzimas compatibles. El inserto y el vector se unen de acuerdo con protocolos estándar.
El vector modificado mediante ingeniería se puede sustituir en el protocolo anterior para expresar la proteína en un sistema bacteriano.
Ejemplo 60: Expresión de una proteína de fusión de albúmina en células de mamífero
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden expresar en una célula de mamífero. Un vector de expresión en mamíferos típico contiene un elemento promotor que media en la iniciación de la transcripción de ARNm, una secuencia de codificación proteica y las señales requeridas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación del tránscrito. Elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donantes y aceptores para corte y empalme del ARN. Se consigue una transcripción muy eficaz con los promotores tardío y temprano de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo RSV, HTLVI, HIVI, y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). No obstante, también se pueden usar elementos celulares (p. ej., el promotor de la actina humana).
Los vectores de expresión adecuados para usar en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport 2.0 y pCMVSport 3.0. Entre las células huésped de mamífero que se pueden usar se incluyen Hela humanas, 293, H9 y células Jurkat, NIH3T3 de ratón y células C127, células Cos 1, Cos 7 y CV1, células quail QC1-3, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO).
Como alternativa, la proteína de fusión de albúmina se puede expresar en líneas celulares estables que contienen el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de albúmina integrada en un cromosoma. La cotransfección con un marcador seleccionable, tal como DHFR, gpt, neomicina, higromicina, permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas.
El polinucleótido transfectado que codifica la proteína de fusión también se puede amplificar para expresar cantidades grandes de la proteína de fusión codificada. El marcador de DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos, o incluso varios miles, de copias del gen de interés. (Véase, por ejemplo, Alt et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin et al., Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143 (1990); Page et al., Biotechnology 9:64-68 (1991)). Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992). Usando estos marcadores, las células de mamífero se cultivan en medio selectivo y se seleccionan las células con la mayor resistencia. Estas líneas celulares contienen el o los genes amplificados integrados en un cromosoma. Se suelen usar células de ovario de hámster chino (CHO) y células NSO para la producción de proteínas.
Los derivados del plásmido pSV2-dhfr (nº de acceso en la ATCC 37146), los vectores de expresión pC4 (nº de acceso en ATCC 209646) y pC6 (nº de acceso en ATCC 209647) contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (March, 1985)) más un fragmento del potenciador del CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Los sitios de clonación múltiples, por ejemplo con oos sitios de escisión con enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores también contienen el intrón en 3’, la señal de poliadenilación y de terminación del gen de la preproinsulina de rata y el gen de la DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano del SV40.
Específicamente, el plásmido pC6, por ejemplo, se digiere con enzimas de restricción adecuadas y después se desfosforila usando fosfatos intestinales bovinos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Después se aísla el vector desde un gel de agarosa al 1 %.
Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención se genera usando técnicas conocidas en la materia y este polinucleótido se amplifica usando tecnología de PCR conocida en la materia. Si se usa una secuencia señal natural para producir la proteína de fusión de la presente invención, el vector no necesita un segundo péptido señal. Como alternativa, si no se usa una secuencia señal natural, el vector se puede modificar para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Nº WO 96/34891.)
El fragmento amplificado que codifica la proteína de fusión de la invención se aísla de un gel de agarosa al 1 % usando un kit disponible comercialmente ("Geneclean," BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se digiere después con las enzimas de restricción adecuadas y de nuevo se purifican en un gel de agarosa al 1 %.
El fragmento amplificado que codifica la proteína de fusión de albúmina de la invención se digiere después con las mismas enzimas de restricción y se purifican en un gel de agarosa al 1 %. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan después con ADN ligasa de T4. Después, las células E. coli HB101 o XL-1 Blue se transforman y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC6 usando, por ejemplo, análisis con enzimas de restricción.
Para la transfección se usan células de ovario de hámster chino que carecen de un gen de la DHFR activo. Cinco μg del plásmido de expresión pC6 o pC4 se cotransfecta con 0,5 μg del plásmido pSVneo usando lipofectina (Felgner et al., supra). El plásmido pSVneo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos, incluyendo G418. Las células se siembran en medio MEM menos alfa suplementado con 1 mg/ml de G418. Tras 2 días, las células se digieren con tripsina y se siembran en placas de clonación con hibridoma (Greiner, Alemania) en medio MEM menos alfa suplementado con 10, 25, o 50 ng/ml de metotrexato más 1 mg/ml de G418. Tras aproximadamente 10-14 días, los clones se digieren con tripsina y después se siembran en placas petri de 6 pocillos o matraces de 10 ml usando concentraciones diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). A continuación, los clones que crecen a las concentraciones más altas de metotrexato se transfieren a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones todavía mayores de metotrexato (1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 mM, 20 mM). El mismo procedimiento de repite hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100 - 200 μM. La expresión de la proteína de fusión deseada se analiza mediante, por ejemplo, SDS-PAGE y transferencia Western o mediante análisis de HPLC de fase inversa.
Ejemplo 69: Efectos biológicos de las proteínas de fusión de la invención.
Ensayos con astrositos y neuronas
En las proteínas de fusión de albúmina de la invención se analiza la actividad en la estimulación de la supervivencia, el sobrecrecimiento de neuritas o la diferenciación fenotípica de células neuronales corticales y para inducir la proliferación de células inmunopositivas para la proteína ácida fibrilar de glía, los astrositos. La selección de células corticales para el bioensayos se basa en la expresión prevalente de FGF-1 y FGF-2 en estructuras corticales y en la potenciación notificada previamente sobre la supervivencia neuronal cortical resultante del tratamiento con FGF-2. Por ejemplo, se puede usar un ensayo de incorporación de timidina para elucidad una proteína de fusión de albúmina de la actividad de la invención con estas células.
Además, informes previos que describen los efectos biológicos de FGF-2 (FGF básico) sobre neuronas corticales o del hipocampo han demostrado in vitro incrementos de la supervivencia de las neuronas y del sobrecrecimiento de las neuritas (Walicke et al., "Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extension." Proc. NatL Acad Sci. USA 83:3012-3016. (1996)). No obstante, los informes de experimentos realizados con células PC-12 sugieren que estas dos respuestas no son necesariamente sinónimas y pueden depender de no solo qué FGF se está tratando sino también sobre qué receptor(es) se expresan en las células diana. Usando el paradigma del cultivo neuronal cortical primario, la capacidad de una proteína de fusión de albúmina de la invención para inducir el sobrecrecimiento de neuritas se puede comparar con la respuesta alcanzada con FGF-2 usando, por ejemplo, un ensayo de incorporación de timidina.
Ensayos en fibroblastos y células endoteliales
Los fibroblastos pulmonares humanos se obtienen en Clonetics (San Diego, CA) y se mantienen en medio de crecimiento de Clonetics. Las células endoteliales microvasculares dérmicas se obtienen de Cell Applications (San Diego, CA). Para los ensayos de proliferación, los fibroblastos pulmonares humanos y las células endoteliales microvasculares dérmicas se pueden cultivar a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día en medio de crecimiento. Después, las células se incuban durante un día en medio basal de BSA al 0,1 % Después de sustituir el medio con medio de BSA al 0,1 % fresco, las células se incuban con la proteína de fusión de ensayo de las proteínas de invención durante 3 días. A cada pocillo se añade Alamar Blue (Alamar Biosciences, Sacramento, CA) hasta una concentración final del 10 %. Las células se incuban durante 4 horas. La viabilidad celular se mide leyendo en un lector de fluorescencia CytoFluor. Para los ensayos de PGE2, los fibroblastos pulmonares humanos se cultivan a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día. Después de un cambio de medio a medio basal de BSA al 0,1 %, las células se incuban con FGF-2 o la proteína de fusión de la invención con o sin IL1a durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogen y se analiza la PGE2 mediante el kit EIA (Cayman, Ann Arbor, MI). Para los ensayos de IL-6, los fibroblastos pulmonares humanos se cultivan a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día. Después de un cambio de medio a medio basal de BSA al 0,1 %, las células se incuban con FGF-2 o con o sin una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o IL-1a durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogen y se analiza la IL-6 mediante el kit ELISA (Endogen, Cambridge, MA).
Los fibroblastos pulmonares humanos se cultivan con FGF-2 p con proteína de fusión de albúmina de la invención durante 3 días en medio basal antes de la adición de Alamar Blue para evaluar los efectos sobre el crecimiento de fibroblastos. FGF-2 deberá mostrar una estimulación a 10 - 2500 ng/ml que se puede usar para comparar la estimulación con la proteína de fusión de la invención.
Proliferación celular basada en incorporación de timidina-[3H]
El siguiente ensayo de incorporación de timidina-[3H] se puede usar para medir el efecto de una proteína terapéutica, por ejemplo proteínas factores de crecimiento, sobre la proliferación de células tales como células fibroblastos, células epiteliales o células musculares inmaduras.
Los cultivos subconfluentes se detienen en la fase G1 mediante una incubación de 18 horas en medio sin suero. Después se añaden proteínas terapéuticas durante 24 horas y durante las últimas 4 horas, los cultivos se marcan con timidina-[3H] a una concentración final de 0,33 μM (25 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL). La timidina[3H] incorporada se precipita con ácido tricloroacético al 10 % helado durante 24 horas. Después, las células se aclaran secuencialmente con ácido tricloroacético al 10 % helado y, después, con agua helada. Tras la lisis en NaOH 0,5 M, los lisados y aclarados con PBS (500 ml) se combinan y si la cantidad de radioactividad es NaOH, los lisados y aclarados con PBS (500 ml) se combinan y se mide la cantidad de radioactividad-
Modelos de Parkinson
La pérdida de función motora en la enfermedad de Parkinson se atribuye a una deficiencia de dopamina del estrato resultante de la degeneración de las neuronas de proyección dopaminérgicas nigroestriatales. Un modelo animal de Parkinson que se ha caracterizado ampliamente implica la administración sistémica de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6tetrahidropiridina (MPTP). En el SNC, el MPTP es captado por los astrocitos y catabolizado por la monoamino oxidasa B en 1-metil-4-fenilpiridina (MPP+) y se libera. Posteriormente, el MPP+ se acumula de forma activa en las neuronas dopaminérgicas mediante el transportador para dopamina de recaptación de alta afinidad. Después, el MPP+ se concentra en las mitocondrias mediante el gradiente electroquímico e inhibe de forma selectiva la nicotinamida adenina disfosfato: ubiquinona oxidoreductionasa (complejo I), de modo que interfiere con el transporte de electrones y, en último término, genera radicales de oxígeno.
Se ha demostrado en paradigmas de cultivo tisular que el FGF-2 (FGF básico) tiene actividad trófica hacia las neuronas dopaminérgicas nígricas (Ferrari et al., Dev. Biol. 1989). Recientemente, el grupo del Dr. Unsicker ha demostrado que la administración de FGF-2 en implantes de espuma de gel en el estrato tiene como resultado la protección casi completa de las neuronas dopaminérgicas nígricas frente a la toxicidad asociada con la exposición a MPTP (Otto and Unsicker, J. Neuroscience, 1990).
Basándose en los datos con FGF-2, una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede evaluar para determinar si tiene una acción similar a la de FGF-2 en la potenciación de la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas in vitro y también se pueden analizar in vivo para determinar la protección de las neuronas dopaminérgicas en el estrato frente al daño asociado con el tratamiento con MPTP. El potencial efecto de una proteína de fusión de albúmina de la invención se examina primero in vitro en un paradigma de cultivo celular neuronal dopaminérgico. Los cultivos se preparan diseccionando la placa del suelo del mesencéfalo del día 14 de la gestación de embriones de rata Wistar. El tejido se disocia con tripsina y se siembra a una densidad de 200.000 células/cm2 sobre cubreobjetos de cristal recubiertos con poliornitina-laminina. Las células se mantienen en medio Eagle modificado de Dulbecco y medio F12 que contiene suplementos hormonales (N1). Los cultivos se fijan con paraformaldehído tras 8 días in vitro y se procesan para la tirosina hidroxilasa, un marcador específico para neuronas dopaminérgicas, tinción inmunohistoquímica. Los cultivos de células disociadas se preparan a partir de embriones de rata. El medio de cultivo se cambia cada tres días y los factores también se añaden en ese momento.
Dado que las neuronas dopaminérgicas se aíslan de animales en el día 14 de la gestación, un tiempo de desarrollo que ha pasado la etapa en la que las células precursoras dopaminérgicas están proliferando, un incremento en el número de neuronas inmunopositivas para tirosina hidroxilasa representaría un incremento en el número de neuronas dopaminérgicas que sobreviven in vitro. Por tanto, si una proteína terapéutica de la invención actúa prolongando la supervivencia de neuronas dopaminérgicas, se sugeriría que la proteína de fusión puede estar implicada en la enfermedad de Parkinson.
Ejemplo 70: El efecto de las proteínas de fusión de albúmina de la invención sobre el crecimiento de las células endoteliales vasculares.
El día 1, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se siembran a 2-5x104 células/35 mm a una densidad en medio M199 que contiene 4 de suero bovino fetal (FBS), 16 unidades/ml de heparina y 50 unidades/ml de suplementos de crecimiento de células endoteliales. El día 2, el medio se sustituye con M199 que contiene 10 % de FBS, 8 unidades/ml de heparina. Una proteína de fusión de albúmina de la invención y se añaden los controles positivos, tales como VEGF y FGF básico (bFGF) a concentraciones variables. Los días 4 y 6, se sustituye el medio. El día 8 se determina el número de células con un contador Coulter.
Un incremento en el número de células HUVEC indica que la proteína de fusión puede proliferar las células endoteliales vasculares, mientras que una disminución del número de células HUVEC indica que la proteína de fusión inhibe las células endoteliales vasculares.
Ejemplo 72: Modelos de cicatrización de heridas alterada por glucocorticoides y ratón diabético: Modelo de ratón db+/db+ diabético
Para demostrar que una proteína de fusión de albúmina de la invención acelera el proceso de cicatrización se usa el modelo de cicatrización de heridas en ratón diabético genéticamente. El modelo de cicatrización de heridas en ratón diabético de espesor completo en ratón db+/db+ es un modelo bien caracterizado, clínicamente relevante y reproducible de la cicatrización de heridas alterada. La cicatrización de heridas en diabéticos depende de la formación de tejido de granulación y reepitelización más que contracción (Gartner, M.H. et al., J. Surg. Res. 52:389 (1992); Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)).
Los animales diabéticos tienen muchas de los rasgos característicos observados en la diabetes mellitus de tipo II. Los ratones homocigotos (db+/db+) son obesos en comparación con sus hermanos de camada heterocigotos (db+/+m) normales. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen una única mutación autosómica recesiva en el cromosoma 4 (db+) (Coleman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283-293 (1982)). Los animales muestran polifagia, polidipsia y poliuria. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) presentan niveles elevados de glucosa en sangre, niveles de insulina incrementados o normales y supresión de la inmunidad celular (Mandel et al., J. Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs, M. et al., Clin. Exp. Immunol. 51(1):1-7 (1983); Leiter et al., Am. J. of Pathol. 114:46-55 (1985)). En estos animales se ha descrito neuropatía periférica, complicaciones miocárdicas y lesiones microvasculares, espesamiento de la membrana basal y anomalías en la filtración glomerular (Norido, F. et al., Exp.
Neurol. 83(2):221-232 (1984); Robertson et al., Diabetes 29(1):60-67 (1980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40(4):460473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (Suppl):1-6 (1982)). Estos ratones diabéticos homocigotos desarrollan hiperglucemia que es resistente a los análogos de la insulina de la diabetes de tipo II humana (Mandel et al., J. Immunol. 120:1375-1377 (1978)).
Las características observadas en estos animales sugieren que la cicatrización en este modelo puede ser similar a la cicatrización observada en la diabetes humana (Greenhalgh, et al., Am. J. of Pathol. 136:1235-1246 (1990)).
En este estudio se usan ratones hembra diabéticas genéticamente C57BL/KsJ (db+/db+) y sus hermanos de camada heterocigotos no diabéticos (db+/+m) (Jackson Laboratories). Los animales se adquieren a las 6 semanas de edad y al comienzo de estudio tienen 8 semanas de edad. Los animales se enjaulan individualmente y se les ofrece agua y alimentos a demanda. Todas las manipulaciones se realizan usando técnicas asépticas. Los experimentos se realizan de acuerdo con las normas y guías del Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care y el Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals
El protocolo de formación de heridas se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos indicados anteriormente (Tsuboi, R. and Rifkin, D.B., J. Exp. Med. 172:245-251 (1990)). Brevemente, el día de la realización de la herida, se anestesia a los animales con una inyección intraperitoneal de avertina (0,01 mg/ml), 2',2,2-tribromoetanol y 2-metil-2butanol disueltos en agua desionizada. Se afeita la región dorsal del animal y se lava la piel con una solución de etanol al 70 % y yodo. El área quirúrgica se seca con una gasa estéril antes de la formación de heridas. A continuación se crea una herida de 8 mm de espesor completa usando un perforador de tejido Keyes. Inmediatamente después de la formación de la herida, la piel circundante se estira suavemente para eliminar la expansión de la herida. Las heridas se dejan abiertas durante todo el experimento. La aplicación del tratamiento se realiza tópicamente durante 5 días consecutivos comenzando el día de la formación de la herida. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina estéril y esponjas de gasa.
Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día de la cirugía y después a intervalos de dos días. El cierre de la herida se determina mediante medición diaria los días 1-5 y el día 8. Las heridas se miden horizontalmente y verticalmente usando un compás de Jameson calibrado. Las heridas se consideran curadas si ya no se tejido de granulación y la herida está cubierta con un epitelio continuo.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención se administra usando una serie de dosis diferentes, desde 4 mg a 500 mg, por herida al día durante 8 días en vehículo. Los grupos control con vehículo recibieron 50 ml de la solución vehículo.
Se sacrifica a los animales el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). A continuación se recogen las heridas y la piel circundante para análisis histológicos e inmunohistoquímicos. Las muestras de tejido se introducen en formalina tamponada neutra al 10 % en casetes de tejido entre las esponjas de biopsia para su posterior procesamiento.
Se evalúan tres grupos de 10 animales cada uno (5 diabéticos y 5 controles no diabéticos). 1) Vehículo control placebo, 2) grupo no tratado y 3) grupo tratado.
El cierre de heridas se analiza midiendo el área en el eje vertical y horizontal y obteniendo el área cuadrada total de la herida. Después se estima la contracción estableciendo las diferencias entre el área de la herida inicial (día 0) y el de después del tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 es de 64 mm2, el tamaño correspondiente de la perforación dérmica. Los cálculos se realizan usando la fórmula siguiente:
a. [área abierta el día 8] – [área abierta el día 1] / [área abierta el día 1]
Las muestras se fijan en formalina tamponada al 1 % e incluidos en bloques de parafina se seccionan perpendicularmente a la superficie de la herida (5 mm) y se cortan usando un microtomo Reichert-Jung. Se realiza una tinción de rutina de hematoxilina-eosina (H y E) en secciones transversales de heridas diseccionadas. La exploración histológica de las heridas se usa para evaluar si el proceso de cicatrización y el aspecto morfológico de la piel reparada se alteran por el tratamiento con una proteína de fusión de albúmina de la invención. Esta evaluación incluyó la verificación de la presencia de acumulación celular, las células inflamatorias, los capilares, los fibroblastos, la reepitelización y la madurez epidérmica (Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)). Un observador enmascarado usa un micrómetro de lente calibrado.
Las secciones de tejido también se tiñen inmunohistoquímicamente con un anticuerpo policlonal anti-queratina humana de conejo usando el sistema de detección ABC Elite. La piel humana se usa como control tisular positivo, mientras que como control negativo se usa IgG no inmunitaria. El crecimiento de queratinocitos se determina evaluando la extensión de la reepitelización de la herida usando un micrómetro de lente calibrada.
La proliferación celular con antígeno nuclear/ciclina (PCNA) en muestras de piel se demuestra usando un anticuerpo anti-PCNA (1:50) con un sistema de detección ABC Elite El cáncer de colon humano sirvió como control tisular positivo y el tejido cerebral humano se usa como control negativo. Cada muestra incluyó una sección con omisión del anticuerpo primario y sustitución con IgG de ratón no inmunitaria. La clasificación de estas secciones se basa en la extensión de la proliferación en una escala de 0-8, el lado inferior de la escala refleja la ligera proliferación y el lado superior refleja la proliferación intensa.
Los datos experimentales se analizan usando una prueba t no pareada. Un valor de P < 0,05 se considera significativo.
Modelo de ratas con alteración por esteroides
La inhibición de la cicatrización de heridas con esteroides está bien documentada en varios sistemas vitro e in vivo (Wahl, Glucocorticoids and Wound healing. En: Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280302 (1989); Wahlet al., J. Immunol. 115: 476-481 (1975); Werb et al., J. Exp. Med. 147:1684-1694 (1978)). Los glucocorticoides retrasan la cicatrización de heridas inhibiendo la angiogénesis, disminuyendo la permeabilidad vascular (Ebert et al., An. Intern. Med. 37:701-705 (1952)), la proliferación de fibroblastos y la síntesis de colágeno (Beck et al., Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978)) y produciendo una reducción transitoria de los monocitos en circulación (Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989)). La administración sistémica de esteroides para alterar la cicatrización de heridas es un fenómeno bien establecido en ratas (Beck et al., Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989); Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 2229-2233 (1989)).
Para demostrar que una proteína de fusión de albúmina de la invención puede acelerar el proceso de cicatrización, se evalúan los efectos de múltiples aplicaciones tópicas de la proteína de fusión sobre las heridas de la piel de espesor completo producidas por escisión en ratas en las que se ha alterado la cicatrización mediante la administración sistémica de metilprednisolona.
En este ejemplo se usan ratas macho adultas Sprague-Dawley de 250-300 g de peso (Charles River Laboratories). Los animales se adquieren a las 8 semanas de edad y al comienzo de estudio tienen 9 semanas de edad. La respuesta de cicatrización de las ratas se ve alterada por la administración sistémica de metilprednisolona (17 mg/kg/rata por vía intramuscular) en el momento de la formación de la herida. Los animales se enjaulan individualmente y se les ofrece agua y alimentos a demanda. Todas las manipulaciones se realizan usando técnicas asépticas. El estudio se realiza de acuerdo con las normas y guías del Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care y el Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals.
Se sigue el protocolo de formación de heridas de acuerdo con lo descrito anteriormente. El día de la formación de heridas se anestesia a los animales con una inyección intramuscular de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg). Se afeita la región dorsal del animal y se lava la piel con una solución de etanol al 70 % y yodo. El área quirúrgica se seca con una gasa estéril antes de la formación de heridas. Se crea una herida de 8 mm de espesor completa usando un perforador de tejido Keyes. Las heridas se dejan abiertas durante todo el experimento. Las aplicaciones de los materiales de ensayo se administran tópicamente una vez al día durante 7 días consecutivos comenzando el día de la formación de la herida y después de la administración de metilpredinisolona. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina estéril y esponjas de gasa.
Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día de la formación de heridas y al final del tratamiento. El cierre de la herida se determina mediante medición diaria los días 1-5 y el día 8. Las heridas se miden horizontalmente y verticalmente usando un compás de Jameson calibrado. Las heridas se consideran curadas si ya no se tejido de granulación y la herida está cubierta con un epitelio continuo.
La proteína de fusión de la invención se administra usando una serie de dosis diferentes, desde 4 mg a 500 mg, por herida al día durante 8 días en vehículo. Los grupos control con vehículo recibieron 50 ml de la solución vehículo.
Se sacrifica a los animales el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). A continuación se recogen las heridas y la piel circundante para análisis histológicos. Las muestras de tejido se introducen en formalina tamponada neutra al 10 % en casetes de tejido entre las esponjas de biopsia para su posterior procesamiento.
Se evalúan tres grupos de 10 animales cada uno (5 con metilprednisolona y 5 son glucocorticoides). 1) Grupo son tratar, 2) vehículo control placebo 3) grupos tratados.
El cierre de heridas se analiza midiendo el área en el eje vertical y horizontal y obteniendo el área total de la herida. Después se estima el cierre estableciendo las diferencias entre el área de la herida inicial (día 0) y el de después del tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 es de 64 mm2, el tamaño correspondiente de la perforación dérmica. Los cálculos se realizan usando la fórmula siguiente:
a. [área abierta el día 8] – [área abierta el día 1] / [área abierta el día 1]
Las muestras se fijan en formalina tamponada al 1 % e incluidos en bloques de parafina se seccionan
perpendicularmente a la superficie de la herida (5 mm) y se cortan usando un microtomo Olympus. Se realiza una tinción de rutina de hematoxilina-eosina (H y E) en secciones transversales de heridas diseccionadas. La exploración histológica de las heridas permite evaluar si el proceso de cicatrización y el aspecto morfológico de la piel reparada mejoran con el tratamiento con una proteína de fusión de albúmina de la invención. Un observador
5 enmascarado usa un micrómetro de lente calibrado para determinar la distancia del espacio de la herida.
Los datos experimentales se analizan usando una prueba t no pareada. Un valor de p < 0,05 se considera significativo.
Ejemplo 75: Construcción de la construcción del indicador GAS
Una vía de transducción de señal implicada en la diferenciación y proliferación de las células se denomina la vía
10 Jaks-STAT. Las proteínas activadas en la vía Jaks-STAT se unen a los elementos “GAS” del sitio de activación gamma o al elemento respondedor sensible al interferón ("ISRE") localizados en el promotor de muchos genes. La unión de una proteína a estos elementos altera la expresión del gen asociado.
Los elementos GAS e ISRE son reconocidos por una clase de factores de transcripción denominados transductores de señal y activadores de la transcripción o “STAT”. Existen seis miembros de la familia STAT. Stat1 y Stat3 están
15 presentes en muchos tipos de células como Stat2 (dado que la respuesta alo IFN-alfa es amplia). Stat4 es más restringida y no está en muchos tipos de células, aunque se ha encontrado en las células T colaboradoras de clase I tras el tratamiento con IL-12. Stat5 se denominó inicialmente factor de crecimiento de mamíferos, pero se ha encontrando a concentraciones más altas en otras células, incluido en células mieloides. Se puede activar en células de cultivo tisular mediante muchas citoquinas.
20 Las STAT se activan para translocarse desde el citoplasma al núcleo tras la fosforilación de la tirosina mediante un conjunto de quinasas conocidas como la familia de Janus quinasas (“Jaks”). Las Jaks representan una familia distinta de tirosina quinasas solubles e incluyen Tyk2, Jak1, Jak2 y Jak3. Estas quinasas muestran una similitud de secuencia significativa y en general están catalíticamente inactivas en las células en reposo.
Las Jaks se activan mediante una amplia gama de receptores resumidos en la Tabla siguiente. (Adaptado de la
25 revisión de Schidler and Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64:621-51 (1995)). Una familia de receptores de citoquinas capaz de activar Jaks se divide en dos grupos: (a) la clase 1 incluye los receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, Epo, PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, LIF. CNTF, y trombopoyetina; y (b) Clase 2 incluye IFN-a, IFN-g e IL-10. Los receptores de la clase 1 comparten un motivo de cisteína conservado (un conjunto de cuatro cisteínas conservadas y un triptófano) y un motivo WSXWS (una región proximal a la membrana que codifica Trp-Ser-Xaa
30 Trp-Ser (SEC ID Nº 1113)).
Por tanto, al unirse un ligando a un receptor se activan las Jaks, que, a su vez, activan las STAT, que después se translocan y se unen a los elementos GAS. La totalidad de este proceso están dentro de la vía de transducción de señal Jaks-STAT. Por tanto, la activación de la vía de Jaks-STAT, que se refleja mediante la unión del elemento GAS o ISRE, se puede usar para indicar las proteínas implicadas en la proliferación y diferenciación de células. Por
35 ejemplo, se muestra que los factores de crecimientos y las citoquinas activan la vía de Jaks-STAT (véase la Tabla 5, más adelante). Por tanto, usando los elementos GAST unidos a moléculas indicadoras se pueden identificar los activadores de la vía Jaks-STAT.
Tabla 5
JAKs STATS (elementos) GAST o ISRE
Ligando tyk2 Jak1 Jak2 Jak3
Famlia de IFN
IFN-a/B + + --1,2,3 ISRE
IFN-g + + -1 GAS (IRF1>Lys6>IFP)
Il-10 + ? ? -1,3
Familia de gp130 JAKs STATS (elementos) GAST o ISRE Ligando tyk2 Jak1 Jak2 Jak3 IL-6 (Pleiotrópica) + + + ? 1,3 GAS(IRF1>Lys6>IFP) Il-11(Pleiotrópica) ? + ? ? 1,3 OnM(Pleiotrópica) ? + + ? 1,3 LIF(Pleiotrópica) ? + + ? 1,3 CNTF(Pleiotrópica) -/+ + + ? 1,3 G-CSF(Pleiotrópica) ? + ? ? 1,3 IL-12(Pleiotrópica) + -+ + 1,3
Familia de g-C IL-2 (linfocitos) -+ -+ 1,3,5 GAS IL-4 (linfocitos/mieloides) -+ -+ 6GAS(IRF1=IFP>>Ly6)(IgH) IL-7 (linfocitos) -+ -+ 5 GAS IL-9 (linfocitos) -+ -+ 5 GAS IL-13 (linfocitos) -+ ? ? 6 GAS IL-15 ? + ? + 5 GAS
Familia de gp140
IL-3 (mieloide)
- - + - 5 GAS(IRF1>IFP>>Ly6)
IL-5 (mieloide)
- - + - 5 GAS
GM-CSF (mieloide)
- - + - 5 GAS
Familia de
la hormona del
crecimiento
GH
? - + - 5
PRL
? +/- + - 1,3,5
EPO
? - + - 5 GAS (B-CAS>IRF1=IFP>>Ly6)
Tirosina quinasas receptoras
EGF
? + + - 1,3 GAS (IRF1)
JAKs STATS (elementos) GAST o ISRE
Ligando tyk2 Jak1 Jak2 Jak3
PDGF ? + + -1,3
CSF-1 ? + + -1,3 GAS(not IRF1)
Para construir un elemento promotor que contenga GAS, que se usa en los ensayos biológicos descritos en los ejemplos 78-80, se usa una estrategia basada en PCR para generar una secuencia promotora de GAS-SV40. El cebador en 5’ contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión GAS hallado en el promotor IRF1 y demostrado anteriormente que se une a las STAT tras la inducción con una serie de citoquinas (Rothman et al., Immunity 1:457468 (1994).), aunque se pueden usar en su lugar otros elementos GAS o ISRE. El cebador en 5’ también contiene 18 pb de secuencia complementaria a la secuencia del promotor temprano de SV40 y está flanqueado por un sitio XhoI. La secuencia del cebador en 5’ es:
10 El cebador cadena abajo es complementario al promotor de SV40 y está flanqueado por un sitio Hind III: 5':GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (SEC ID Nº 1115)
La amplificación por PCR se realiza usando el molde del promotor SV40 presente en plásmido B-gal:promotor obtenido en Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con XhoI/Hind III y se subclona en BLSK2-. (Stratagene.) La secuenciación con cebadores directos e indirectos confirma que el inserto contiene la secuencia
15 siguiente:
Con este elemento promotor GAS unido al promotor de SV40, después se somete a ingeniería la construcción indicadora GAS:SEAP2. Aquí, la molécula indicadora es una fosfatasa alcalina secretada o "SEAP." No obstante, está claro que se puede usar cualquier molécula indicadora en lugar de SEAP, en este o en cualquiera de los otros
20 ejemplos. Las moléculas indicadoras bien conocidas que se pueden usar en lugar de SEAP incluyen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, fosfatasa alcalina, B-galactosidasa, proteína fluorescente verde (GFP), o cualquier proteína detectable mediante un anticuerpo.
La secuencia anterior confirmó que el elemento promotor GAS-SV40 sintético se subclona en el vector pSEAP-Promotor obtenido de Clontech usando HindIII y XhoI, sustituyendo con eficacia el promotor de SV40 con el
25 elemento promotor amplificado GAS:SV40 para crear el vector GAS-SEAP. No obstante, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina y, por tanto, no se prefiere para los sistemas de expresión en mamíferos.
Por tanto, con el fin de generar líneas celulares estables de mamíferos que expresan el indicador GAS-SEAP, se retira el casete GAS-SEAP del vector GAS-SEAP usando SalI y NotI, y se inserta en un vector de estructura que contiene el gen de resistencia a neomicina, tal como pGFP-1 (Clontech), usando estos sitios de restricción en el sitio
30 de clonación múltiple para crear el vector GAS-SEAP/Neo. Una vez que este vector se transfecta en células de mamífero, este vector se puede usar después como molécula indicadora para la unión de GAS como se describe en los ejemplos 78-80.
Se pueden realizar otras construcciones usando la descripción anterior y sustituyendo GAS con una secuencia promotora diferente. Por ejemplo, la construcción de moléculas indicadoras que contienen las secuencias 35 promotoras EGR y NF-KB se describen en los ejemplos 78-82. No obstante, muchos otros promotores se pueden sustituir usando los protocolos descritos en estos ejemplos. Por ejemplo, los promotores SRE, IL-2, NFAT u osteocalcina se pueden sustituir, solos o en combinación (p. ej., GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB, II-2/NFAT o NF-KB/GAS). De un modo similar, se pueden usar otras líneas celulares para analizar la actividad de la construcción
indicadora, tal como HELA (epiteliales), HUVEC (endoteliales), Reh (células B), Saos-2 (osteoblastos), HUVAC (aórticas) o cardiomiocitos.
Ejemplo 76: Ensayo de actividad de SEAP.
Como molécula indicadora de los ensayos descritos en los ejemplos divulgados en el presente documento, se
5 analiza la actividad de SEAP usando el kit Tropix Phospho-light (cat. BP-400) de acuerdo con el siguiente procedimiento general. El kit Tropix Phospho-light suministra la dilución, el ensayo y los tampones de reacción que se usan más adelante.
Cebar un dispensador con 2,5 x del tampón de dilución y dispensar 15 ul de 2,5x del tampón de dilución en Optiplates que contienen 35 ul de una solución que contiene una proteína de fusión de albúmina de la invención.
10 Sellar las placas con un sellador de plástico e incubar a 65 ºC durante 30 minutos. Separar las Optiplates para evitar un calentamiento no uniforme.
Enfriar las muestras hasta la temperatura ambiente durante 15 minutos. Vaciar el dispensador y cebar con el tampón de ensayo. Añadir 50 ml de tampón de ensayo e incubar a temperatura ambiente 5 minutos. Vaciar el dispensador y cebar con el tampón de reacción (ver la tabla más adelante). Añadir 50 ul de tampón de reacción e
15 incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Dado que la intensidad de la señal quimioluminiscente depende del tiempo y se requieren aproximadamente 10 minutos para leer 5 placas en un luminómetro, se deben tratar 5 pacas cada vez y comenzar con el segundo grupo 10 minutos después.
Leer las unidades relativas de luz en el luminómetro. Establecer H12 como blanco e imprimir los resultados. Un incremento de la quimioluminiscencia indica actividad indicadora.
20 Tabla 6
Nº placas
de Diluyente tampón Rxn (ml) CSPD (ml) Nº placas de Diluyente tampón Rxn (ml) CSPD (ml)
10
60 3 31 165 8,25
11
65 3,25 32 170 8,5
12
70 3,5 33 175 8,75
13
75 3,75 34 180 9
14
80 4 35 185 9,25
15
85 4,25 36 190 9,5
16
90 4,5 37 195 9,75
17
95 4,75 38 200 10
18
100 5 39 205 10,25
19
105 5,25 40 210 10,5
20
110 5,5 41 215 10,75
21
115 5,75 42 220 11
22
120 6 43 225 11,25
23
125 6,25 44 230 11,5
24
130 6,5 45 235 11,75
25
135 6,75 46 240 12
Nº placas
de Diluyente tampón Rxn (ml) CSPD (ml) Nº placas de Diluyente tampón Rxn (ml) CSPD (ml)
26
140 7 47 245 12,25
27
145 7,25 48 250 12,5
28
150 7,5 49 255 12,75
29
155 7,75 50 260 13
30
160 8

Ejemplo 77: Ensayo de identificación de la actividad neuronal.
Cuando las células se diferencian y proliferan se activa un grupo de genes mediante muchas vías de transducción de señal diferentes. Uno de estos genes, EGR1 (gen 1 de respuesta temprana de crecimiento), se induce en varios
5 tejidos y tipos celulares tras la activación. El promotor de EGR1 es responsable de esta inducción. Usando el promotor de EGR1 unido a las moléculas indicadoras se puede evaluar la capacidad de las proteínas de fusión de la invención para activar células.
En concreto, se usa el protocolo siguiente para evaluar la actividad neuronal en las líneas celulares PC12. Se sabe que las células PC12 (células de feocromocitoma de rata) proliferan y/o se diferencian mediante la activación con
10 una serie de mitógenos, tales como TPA (acetato de tetradecanoil forbol), NGF (factor de crecimiento neural) y EGF (factor de crecimiento epidérmico). La expresión del gen EGR1 se activa durante este tratamiento. Por tanto, mediante a transfección estable de las células PC12 con una construcción que contiene un promotor de EGR unido a indicador SEAP se puede evaluar la activación de las células PC12 mediante una proteína de fusión de albúmina de la presente invención.
15 La construcción indicadora EGR/SEAP se puede ensamblar mediante el protocolo siguiente. La secuencia promotora de EGR-1 (-633 a +1)(Sakamoto K et al., Oncogene 6:867-871 (1991)) se puede amplificar por PCR a partir del AND genómico humano usando los cebadores siguientes:
Primer cebador: 5' GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3' (SEC ID Nº 1117)
Segundo cebador: 5' GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3' (SEC ID Nº 1118)
20 Usando el vector GAS:SEAP/Neo producido en el ejemplo 75, el producto amplificado de EGR1 se puede insertar en este vector. Linealizar el vector GAS:SEAP/Neo usando las enzimas de restricción XhoI/HindIII, eliminado el GAS/SV40. Restringir el producto amplificado de EGR1 con estas mismas enzimas. Ligar el vector y el promotor de EGR1.
Para preparar placas de 96 pocillos para cultivo celular, se añaden dos ml de una solución de revestimiento (dilución
25 1:30 de colágeno de tipo I (Upstate Biotech Inc. Nº de Cat. 08-115) en etanol al 30 % (esterilizada por filtración)) por una placa de 10 cm o 50 ml por pocillo de la placa de 96 pocillos, y se deja secar al aire durante 2 horas.
Las células PC12 se cultivan de forma rutinaria en medio RPMI-1640 (Bio Whittaker) que contiene 105 de suero de caballo (JRH BIOSCIENCES, nº de Cat. 12449-78P), 5 % de suero bovino fetal (FBS) inactivado con calor suplementado con 100 unidades/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina en una placa de cultivo tisular de 10
30 cm revestida previamente. Cada tres-cuatro días se realizan de una a cuatro divisiones. Se extraen las células de las placas mediante raspado y se resuspenden con pipeteo arriba y abajo más de 15 veces.
Transfectar la construcción EGR/SEAP/Neo en PC12 usando técnicas conocidas en la materia. Las células estables EGR-SEAP/PC12 se obtienen cultivando las células en 300 ug/ml de G418. El medio sin G418 se usa para crecimiento de rutina pero cada de uno a dos meses las células se volverán a cultivar en 300 ug/ml de G418 un par
35 de pases.
Para analizar la actividad neuronal se realiza una detección de una placa de cm con células de una confluencia de aproximadamente 70 a 80 % eliminando el medio antiguo. Lavar las células una vez con PBS (solución salina tamponada con fosfato). Después, dejar sin alimento a las células en medio con poco suero (RPMI-1640 que contiene 1 % de suero de caballo y 0,5 % de FBS con antibióticos) durante la noche.
40 A la mañana siguiente, retirar el medio y lavar las células con PBS. Raspar las células de la placa, suspender las células bien en 2 ml de medio con poco suero. Contar el número de células y añadir más medio con poco suero para alcanzar una densidad celular final de 5 x 105 células/ml.
Añadir a cada pocillo de la placa de 96 pocillos 200 ul de la suspensión celular (equivalente a 1x105 células/pocillo). Añadir una serie de concentraciones diferentes de una proteína de fusión de albúmina de la invención a 37 ºC durante de 48 a 72 horas. Como control positivo se puede usar un factor de crecimiento que se sabe que activa las células PC12 a través del EGR, tal como 50 ng/ul del factor de crecimiento neuronal (NGF). Normalmente, en los pocillos control positivo se ve una multiplicación por cincuenta de la inducción de SEAP. El ensayo de SEAP se puede realizar rutinariamente usando técnicas conocidas en la materia y/o como se describe en el ejemplo 76.
Ejemplo 78: Ensayo de la actividad de las células T.
El siguiente protocolo se usa para evaluar la actividad de los linfocitos T identificando factores y determinando si una proteína de fusión de albúmina de la invención prolifera y/o se diferencia en células T. La actividad de las células T se evalúa usando la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el Ejemplo 75. Por tanto, los factores que aumentan la actividad de SEAP indican la capacidad para activar la vía de transducción de señal Jaks-STATS. Las células T usadas en este ensayo son células T Jurkat (nº de acceso en la ATCC TIB-152), aunque también se pueden usar las células Molt-3 (nº de acceso en la ATCC CRL-1552) y las células Molt-4 (nº de acceso en la ATCC CRL-1582).
Las células T Jurkat son células colaboradoras Th1 CD4+ linfoblásticas. Con el fin de generar líneas celulares estables, aproximadamente 2 millones de células Jurkat se transfectan con el vector GAS-SEAP/neo usando DMRIE-C (Life Technologies) (procedimiento de transfección descrito más adelante). Las células transfectadas se siembran hasta una densidad de aproximadamente 20.000 células por pocillo y se seleccionan los transfectantes resistentes a 1 mg/ml de denticina. Las colonias resistentes se expanden y después se analiza su respuesta a concentraciones crecientes de interferón gamma. Se demuestra la respuesta a la dosis de un clon seleccionado.
Específicamente, el protocolo siguiente dará suficientes células para 75 pocillos que contienen 200 ul de células. Por tanto, se escala o se realiza varias veces para generar suficientes células para múltiples placas de 96 pocillos. Las células Jurkat se mantienen en medio RPMI + 10 % de suero con 1 % de Pen-Strep. Combinar 2,5 ml de OPTI-MEM (Life Technologies) con 10 ug de AND plasmídico en un matraz T25. Añadir 2,5 ml de OPTI-MEM que contiene 50 ul de DMRIE-C e incubar a temperatura ambiente durante 15-45 minutos.
Durante el periodo de incubación, contar la concentración celular, centrifugar el número requerido de células (107 por transfección) y resuspender en OPTI-MEM hasta una concentración final de 107 células/ml. Después, añadir 1 ml de 1 x 107 células en OPTI-MEM a un matraz T25 e incubar a 37 ºC durante 6 horas. Después de la incubación, añadir 10 ml de RPMI + 15 % de suero.
Las líneas indicadoras estables Jurkat:GAS-SEAP se mantienen en medio RPMI + 10 % de suero, 1 mg/ml de denticina y 1 % de Pen-Strep. Estas células se tratan con concentraciones variables de una o más proteínas de fusión de la presente invención.
El día del tratamiento con la proteína de fusión, se deberán lavar las células y resuspender en RPMI + 10 % de suero recién preparado hasta una densidad de 500.000 células por ml. El número exacto de células necesarias dependerá del número de proteínas de fusión y el número de concentraciones diferentes de las proteínas de fusión que se van a someter a detección selectiva. Para una placa de 96 pocillos se necesitan aproximadamente 10 millones de células (para 10 placas, 100 millones de células).
Las placas de pocillos que contienen células Jurkat tratadas con la proteína de fusión se introducen en un incubador durante 48 horas (nota: este tiempo es variable entre 48 y 72 horas). Muestras de 35 ul de cada pocillo se transfieren después a una placa opaca de 96 pocillos usando una pipeta de 12 canales. Las placas opacas se cubrirán (usando cubiertas de celofán) y se almacenarán a -20 ºC hasta que se realizan los ensayos de SEAP de acuerdo con el ejemplo 76. Las placas que contienen las células tratadas restantes se introducen a 4ºC y sirven como fuente de material para repetir el ensayo en un pocillo específico si se desea.
Como control positivo, se pueden usar 100 unidades/ml de interferón gamma que se sabe que activan las células Jurkat T. Normalmente, en los pocillos control positivo se ve una multiplicación por 30.
El protocolo anterior se puede usar en la generación de células transfectadas tanto de forma transitorias como estable, lo que será evidente para los expertos en la técnica.
Ejemplo 79: Ensayo de la actividad de las células T.
NF-KB (el factor nuclear KB) es un factor de transcripción activado por una amplia variedad de agentes, incluidas las citoquinas inflamatorias IL-1 y TNF, CD30 y CD40, la linfotoxina alfa y la linfotoxina beta, mediante exposición a LPS
o trombina, y mediante la expresión de ciertos productos génicos virales. Como factor de transcripción, el NF-KB regula la expresión de los genes implicados en la activación de las células inmunitarias, el control de la apoptosis (NF- KB parece proteger a las células de la apoptosis), el desarrollo de células B y T, las respuestas antivirales y antimicrobianas y múltiples respuestas al estrés.
En condiciones sin estimulación, el NF- KB se retiene en el citoplasma con I-KB (Inhibidor KB). No obstante, tras la estimulación, el I- KB se fosforila y se degrada, haciendo que el NF- KB pase al núcleo y, de este modo, se activa la transcripción de los genes diana. Los genes diana activados por NF- KB incluyen los de IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 y el MHC de clase 1.
5 Debido a su papel central y la capacidad para responder a una serie de estímulos, las construcciones indicadoras que usan el elemento promotor de NF-KB se usan para seleccionar la proteína de fusión. Los activadores o inhibidores de NF-KB serían útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de enfermedades. Por ejemplo, los inhibidores de NF-KB se podrían usar para tratar las enfermedades relacionadas con la activación aguda o crónica de NF-KB, tal como la artritis reumatoide.
10 Para construir un vector que contiene el elemento promotor de NF-KB se usa una estrategia basada en PCR. El cebador cadena arriba contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión de NF-KB (GGGGACTTTCCC) (SEC ID Nº 119), 18 pb de secuencia complementaria al extremo 5’ de la secuencia del promotor temprano de SV40 está flanqueado por un sitio XhoI.
15 El cebador cadena abajo es complementario al extremo 3’ del promotor de SV40 y está flanqueado por un sitio Hind
III:
5':GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (SEC ID Nº 1115)
La amplificación por PCR se realiza usando el molde del promotor SV40 presente en pB-gal:promotor obtenido en Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con XhoI y Hind III y se subclona en BLSK2-. (Stratagene) La 20 secuenciación con cebadores directos e indirectos confirma que el inserto contiene la secuencia siguiente:
Después, sustituir el elemento del promotor mínimo de SV40 presente en el plásmido pSEAP2-promotor (Clontech) con este fragmento de NF-KB/SV40 usando XhoI y HindIII. No obstante, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina y, por tanto, no se prefiere para los sistemas de expresión en mamíferos.
25 Con el fin de generar líneas celulares de mamífero estables, se extrae el casete NF-KB/SV40/SEAP del vector NF-KB/SEAP anterior usando las enzimas de restricción SalI y NotI, y se inserta en un vector que contiene resistencia a neomicina. Particularmente, el casete NF-KB/SV40/SEAP se insertó en pGFP-1 (Clontech), sustituyendo el gen de GFP, restringiendo después el pGFP-1 con SalI y NotL
Una vez creado el vector NF-KB/SV40/SEAP/Neo, se crean células T Jurkat estables y se mantienen de acuerdo
30 con el protocolo descrito en el ejemplo 76. De un modo similar, el procedimiento para analizar las proteínas de fusión con estas células T Jurkat estables también se describe en el ejemplo 76. Como control positivo, a los pocillos H9, H10 y H11 se añade TNF-alfa exógeno (0,1, 1, 10 ng) y normalmente se observa una multiplicación de 5-10 de la activación.
Ejemplo 80: Ensayo de identificación de la actividad mieloide
35 El siguiente protocolo se usa para evaluar la actividad mieloide de una proteína de fusión de albúmina de la invención determinando si la proteína de fusión prolifera y/o se diferencia en células mieloides. La actividad de las células mieloides se evalúa usando la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el Ejemplo 75. Por tanto, los factores que aumentan la actividad de SEAP indican la capacidad para activar la vía de transducción de señal Jaks-STATS. La célula mieloide usada en este ensayo es U937, una línea celular pre-monocito, aunque se puede usar
40 TF-1, HL60 o KG1.
Para transfectar las células U937 de forma transitoria con la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el ejemplo 75 se usa un procedimiento DEAE-Dextrano (Kharbanda et. al., 1994, Cell Growth & Differentiation, 5:259-265). Primero, recolectar 2x107 células U937 y lavar con PBS. Las células U937 normalmente se cultivan en medio RPMI 1640 que contiene 10 % de suero bovino fetal (FBS) inactivado con calor suplementado con 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina.
Después, suspender las células en 1 ml de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) que contiene 0,5 mg/ml de DEAE-Dextrano, 8 ug de AND del plásmido GAS-SEAP2, NaCl 140 mM, KCI 5 mM, Na2HPO4.7H2O 375 uM, MgCl2 1 mM y CaCl2 675 uM. Incubar a 37 ºC durante 45 minutos.
Lavar las células con medio RPMI 1640 que contiene 10 % de FBS y, después, resuspender en 10 ml de medio completo e incubar a 37ºC durante 36 horas.
Las células estables GAS-SEAP/U937 se obtienen cultivando las células en 400 ug/ml de G418. El medio sin G418 se usa para crecimiento de rutina pero cada de uno a dos meses las células se volverán a cultivar en 400 ug/ml de G418 un par de pases.
Estas células se analizan mediante recolección de 1x108 células (esto es bastante para un ensayo de diez placas de 96 pocillos) y lavar con PBS. Suspender las células en 200 ml del medio de crecimiento descrito anteriormente, con una densidad final de 5x105 células/ml. Sembrar en placas 200 ul de células por pocillo en la placa de 96 pocillos (o 1x105 células/pocillo).
Añadir diferentes concentraciones de la proteína de fusión. Incubar a 37 ºC durante de 48 a 72 horas. Como control positivo, se pueden usar 100 unidades/ml de interferón gamma que se sabe que activan las células U937. Normalmente, en los pocillos control positivo se ve una multiplicación por 30. Se realiza el ensayo de SEAP del sobrenadante de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica y/o el protocolo descrito en el ejemplo 76.
Ejemplo 81: Ensayo de identificación de cambios en la concentración de moléculas pequeñas y la permeabilidad de la membrana.
Se sabe que la unión de un ligando a un receptor altera los niveles intracelulares de las moléculas pequeñas, tales como calcio, potasio, sodio, y el pH, así como el potencial de membrana. Estas alteraciones se pueden medir en un ensayo para identificar las proteínas de fusión que se unen a los receptores de una célula concreta. Aunque el siguiente protocolo describe un ensayo para el calcio, este protocolo se puede modificar fácilmente para detectar los cambios en el potasio, el sodio, el pH, el potencial de membrana, o cualquier otra molécula pequeña que se pueda detectar mediante una sonda fluorescente.
El ensayo siguiente usa el lector de placas Fluorometric Imaging Plate Reader ("FLIPR") para medir los cambios en las moléculas fluorescentes (Molecular Probes) que se unen a las moléculas pequeñas. Claramente, se puede usar cualquier molécula fluorescente que detecta una molécula pequeña en lugar de la molécula de calcio fluorescente, fluo-4 (Molecular Probes, Inc.; nº de catálogo F-14202), usada en el presente documento.
Para las células adherentes, sembrar las células a 10.000-20.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos negra Co-star con fondo transparente. La placa se incuba en un incubador de CO2 durante 20 horas. Las células adherentes se lavan dos veces en un lavador Biotek con 200 ul de HBSS (solución salina equilibrada de Hank) que deja 100 ul de tampón después del lavado final.
Se prepara una solución madre de 1 mg/ml fluo-4 en 10 % de ácido plurónico DMSO. Para cargar las células con fluo-4, a cada pocillo se añaden 50 ul de 12 ug/ml de fluo-4. La placa se incuba a 37ºC en un incubador de CO2 durante 60 minutos. La placa se lava cuatro veces en el lavador Biotek con HBSS dejando 100 ul de tampón.
Para células ni adherentes, las células se centrifugan desde el medio de cultivo. Las células se resuspenden a 25x106 células/ml con HBSS en un tubo cónico de 50 ml. A cada ml de suspensión celular se añaden 4 ul de una solución de 1 mg/ml fluo-4 en 10 % de ácido plurónico DMSO. Después, el tubo se introduce en un baño de agua a 37 ºC durante 30-60 minutos. Las células se lavan dos veces con HBSS, se resuspenden hasta 1x106 células/ml y se dispensan en una microplaca a 100 ul/pocillo. La placa se centrifuga a 1.000 rpm durante 5 minutos. Después, la placa se lava una vez en Denley Cell Wash con 200 ul, seguido de una etapa de aspiración hasta un volumen final de 100 ul.
Para un ensayo no basado en células, cada pocillo contiene una molécula fluorescente, tal como fluo-4. La proteína de fusión de la invención se añade al pocillo y se detecta un cambio en la fluorescencia.
Para medir la fluorescencia del calcio intracelular, el FLIPR se fija para los parámetros siguientes: (1) la ganancia del sistema es de 300-800 mW; (2) el tiempo de exposición es de 0,4 segundos; (3) Cámara F/fin es F/2; (4) la excitación es de 488 nm; (5) la emisión es 530 nm; y (6) la adición de muestra es 50 ul. La emisión incrementada a 530 nm indica un acontecimiento de señalización extracelular causado por una proteína de fusión de albúmina de la presente invención o una molécula inducida por una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, que ha dado como resultado un incremento de la concentración de Ca++ intracelular.
Ejemplo 82: Ensayo de identificación de la actividad tirosina quinasa
Las proteínas tirosina quinasas (PTK) representan un grupo diverso de quinasas transmembranales y citoplásmicas.
Dentro del grupo de las proteínas tirosina quinasas receptoras (RPTK) están los receptores de una serie de factores de crecimiento mitogénicos y metabólicos, incluidas las subfamilias de receptores de PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF e insulina. Además existe una gran familia de RPTK para las que se desconoce el correspondiente ligando. Los ligandos de los RPTK incluyen principalmente, proteínas pequeñas secretadas, pero también proteínas unidas a la membrana y de la matriz extracelular,
La activación de los RPTK por los ligandos implica dimerización de receptor mediada por ligandos, que tienen como resultado la transfosforilación de las subunidades del receptor y la activación de las tirosina quinasas citoplásmicas. Las tirosina quinasas citoplásmicas incluyen tirosina quinasas asociadas a receptores de la familia src (p. ej., src, yes, lck, lyn, fyn) y proteínas tirosina quinasas no unidas a receptores y citosólicas, tales como la familia Jak, cuyos miembros participan en la transducción de señal desencadenada por la superfamilia de receptores de citoquinas (p. ej., las interleuquinas, los interferones, GM-CSF y leptina).
Dado el amplio abanico de factores conocidos capaces de estimular la actividad de tirosina quinasa, la identificación de si una proteína de fusión de albúmina de la presente invención o una molécula inducida por una proteína de fusión de la presente invención es capaz de activar las vías de transducción de la señal de la tirosina quinasa es de interés. Por tanto, el siguiente protocolo está diseñado para identificar dichas moléculas capaces de activar las vías de transducción de la señal de la tirosina quinasa.
Sembrar las células diana (p. ej., queratinocitos primarios) a una densidad de aproximadamente 25.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos Loprodyne Silent Screen Plates adquirida en Nalge Nunc (Naperville, IL). Las placas se esterilizan con dos aclarados de 30 minutos con etanol al 100 %, aclaradas con agua y secadas durante la noche. Algunas placas se revisten durante 2 horas con 100 ml de cultivo celular de colágeno de tipo 1 (50 mg/ml), gelatina (2 %) o polilisina (50 mg/ml), todos los cuales se pueden adquirir en Sigma Chemicals (St. Louis, MO) o 10 % de Matrigel adquirida de Becton Dickinson (Bedford,MA), o suero de ternero, r se aclaran con PBS y se almacenan a 4ºC. El cultivo celular en estas placas se analiza sembrando 5.000 células/pocillo en medio de crecimiento y cuantificación indirecta del número de células mediante el uso de alamarBlue como ha descrito el fabricante Alamar Biosciences, Inc. (Sacramento, CA) tras 48 h. Se usan cubiertas de placa Falcon nº 3071 de Becton Dickinson (Bedford,MA) para cubrir las placas Loprodyne Silent Screen Plates. También se pueden usar placas de cultivo celular Falcon Microtest III en algunos experimentos de proliferación.
Para preparar extractos, se siembran células A431 sobre las membranas de nailon de placas Loprodyne (20.000/200 ml/pocillo) y se cultivan durante la noche en medio completo. Las células se inactivan mediante incubación en medio basal sin suero durante 24 horas. Tras 5-20 minutos, el tratamiento con EGF (60ng/ml) o concentraciones diferentes de una proteína de fusión de albúmina de la invención, se extrajo el medio y a cada pocillo se añaden 100 ml del tampón de extracción ((HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 1 % de Triton X-100, 0,1 % de SDS, Na3VO4 2 mM, Na4P2O7 2 mM y un cóctel de inhibidores de la proteasa (nº 1836170) obtenidos de Boeheringer Mannheim (Indianapolis, IN)) y la placa se agita en un agitador rotatorio durante 5 minutos a 4ºC. Después, la placa se coloca en un colector de transferencia de vacío y el extracto se filtra a través de fondos de membrana de 0,45 mm de cada pocillo usando vacío doméstico. Los extractos se recogen en una placa de captura/ensayo de 96 pocillos en el fondo del colector de vacío e inmediatamente se introducen en hielo. Para obtener extractos aclarados mediante centrifugación, el contenido de cada pocillo después de solubilizar con detergente durante 5 minutos, se retira y se centrífuga durante 15 minutos a 4 ºC a 160.000 x g.
Se analizan los extractos filtrados para determinar los niveles de actividad tirosina quinasa. Aunque se conocen muchos procedimientos de detección de la actividad tirosina quinasa, en el presente documento se describe un procedimiento.
En general, la actividad tirosina quinasa de una proteína de fusión de albúmina de la invención se evalúa determinando su capacidad para fosforilar un residuo de tirosina sobre un sustrato específico (un péptido biotinilado). Los péptidos biotinilados que se pueden usar para este fin incluyen PSK1 (correspondiente a los aminoácidos 6-20 de la división celular quinasa cdc2-p34) y PSK2 (correspondiente a los aminoácidos 1-17 de gastrina). Ambos péptidos son sustratos de una serie de tirosina quinasas y están disponibles en Boehringer Mannheim.
La reacción de tirosina quinasa se establece añadiendo los siguientes componentes en orden. Primero, añadir 10 ul de péptido biotinilado 5uM, después 10 ul de ATP/Mg2+ (ATP 5mM / MgCl2 50mM), después 10ul de 5x de tampón de ensayo (imidazol clorhidrato 40mM, pH 7,3, beta-glicerofosfato 40 mM, EGTA 1mM, MgCl2 100mM, MaCl2 5 mM, 0,5 mg/ml de BSA), después 5 ul de vanadato sódico (1mM) y después 5 ul de agua. Mezclar los componentes suavemente y preincubar la mezcla de reacción a 30 ºC durante 2 minutos. Iniciar la reacción añadiendo 10 ul de la enzima control o el sobrenadante filtrado.
La reacción del ensayo de tirosina quinasa se termina después añadiendo 10 ul de EDTA 120 nM e introducir las reacciones en hielo.
La actividad tirosina quinasa se determina transfiriendo un alícuota de 50 ul de la mezcla de reacción a una placa de microtitulación (MTP) e incubando a 37ºC durante 20 minutos. Esto permite revestir con estreptavidina la placa de 96 pocillos para asociar con el péptido biotinilado. Lavar el módulo MTP con 300 ul/pocillo de PBS cuatro veces. Después, añadir a cada pocillo 75 ul de anticuerpo anti-fosfotirosina conjugado con peroxidada de rábano (anti-P-Tyr-POD (0,5 u/ml)) e incubar a 37ºC durante una hora. Lavar el pocillo como se ha indicado con anterioridad.
Después, añadir 100 ul de la solución de sustrato de peroxidada (Boehringer Mannheim) e incubar a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos (hasta 30 minutos). Medir la absorbancia de la muestra 405 nm usando un lector de ELISA. El nivel de actividad de peroxidada unida se cuantifica usando un lector de ELISA y refleja el nivel de actividad tirosina quinasa.
Ejemplo 86: Proliferación de fibroblastos dérmicos humanos y de células de músculo liso aórtico.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención se añade a cultivos de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) y células de músculo liso aórtico humano (AoSMC) y se realizan dos co-ensayos con cada muestra. El primer ensayo examina el efecto de la proteína de fusión sobre la proliferación de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) o células de músculo liso aórtico humano (AoSMC). El crecimiento aberrante de fibroblastos o de células de músculo liso es parte de varios procesos patológicos, incluyendo fibrosis y restenosis. El segundo ensayo examina la producción de IL-6 por NHDF y SMC. La producción de IL-6 es una indicación de la activación funcional. Las células activadas tendrán un incremento de la producción de una serie de citoquinas y otros factores que puede tener como resultado un desenlace proinflamatorio o inmunomodulador. Los ensayos se realizan con y son estimulación con co-TNFa con el fin de comprobar la actividad coestimulatoria o inhibidora.
Brevemente, el día 1, en las placas negras de 96 pocillos se introducen 1.000 células/pocillo (NHDF) o 2.000 células/pocillo (AoSMC) en 100 μl de medio de cultivo. El medio de cultivo para NHDF contiene: Medio basal Clonetics, 1mg/ml de hFGF, 5 mg/ml de insulina, 50 mg/ml de gentamicina, 2 % de FBS, mientras que el medio de cultivo para AoSMC contiene medio basal Clonetics SM, 0,5 μg/ml de hEGF, 5 mg/ml de insulina, 1 μg/ml de hFGF, 50 mg/ml de gentamicina, 50 μg/ml de anfotericina B, 5 %de FBS. Después de incubar a 37 ºC durante al menos 4-5 horas se aspira el medio de cultivo y se reemplaza con medio para la detención del crecimiento. El medio para la detención del crecimiento para NHDF contiene medio basal para fibroblastos, 50 mg/ml de gentamicina, 2 % de FBS, mientras que el medio para la detención del crecimiento para AoSMC contiene medio basal SM, 50 mg/ml de gentamicina, 50 μg/ml de anfotericina B, 0,4 % de FBS. Incubar a 37 ºC hasta el día 2.
El día 2, se diseñan diluciones en serie y plantillas de una proteína de fusión de albúmina de la invención de un modo tal que siempre incluyen controles de medio y controles de proteína conocida. Para los experimentos de estimulación y de inhibición las proteínas se diluyen en medio de detención del crecimiento. Para los experimentos de inhibición se añade TNFa hasta una concentración final de 2 ng/ml (NHDF) o 5 ng/ml (AoSMC). Añadir 1/3 vol de controles que contienen medio o una proteína de fusión de albúmina de la invención e incubar a 37ºC/5 % de CO2 hasta el día 5.
Transferir 60 μl de cada pocillo a otra placa de 96 pocillos marcada, cubrir con un sellador de placas y almacenar a 4ºC hasta el día 6 (para ELISA de IL6). A los 100 ul restantes en la placa de cultivo celular, añadir en asepsia Alamar Blue en una cantidad igual al 10 % del volumen de cultivo (10 μl). Devolver las placas al incubador durante de 3 a 4 horas. Después, medir la fluorescencia con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm usando el CytoFluor. Esto da los datos es estimulación/inhibición del crecimiento.
El día 5 se realiza el ELISA de IL6 revistiendo una placa de 96 pocillos con 50-100 ul/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-IL6 humano diluido en PBS a pH 7,4, se incuba a temperatura ambiente.
El día 6, vaciar las placas en la pila y se transfieren a toallitas de papel. Preparar el tampón de ensayo con PBS con 4 % de BSA. Bloquear las placas con 200 μl/pocillo de tampón de bloqueo de Pierce Super Block en PBS durante 12 h y después lavar las placas con tampón de lavador (PBS, 0,05 % de Tween-20). Transferir las placas a toallitas de papel. Después, añadir 50 μl/pocillo del anticuerpo monoclonal anti-IL6 humana marcado con biotina a 0,50 mg/ml. Realizar diluciones de la madre de IL-6 en medio (30, 10, 3, 1, 0,3, 0 ng/ml). Añadir muestras por duplicado a la fila superior de la placa. Cubrir las placas e incubar durante 2 horas a TA en el agitador.
Las placas se lavan con tampón de lavado y se transfieren a toallas de papel. Diluir estreptavidina marcada con EU a 1:1000 en tampón de ensayo y añadir 100 μl/pocillo. Cubrir la placa e incubar 1 hora a TA. Las placas se lavan de nuevo con tampón de lavado y se transfieren a toallas de papel.
Añadir 100 μl/pocillo de solución de potenciación. Agitar durante 5 minutos. Leer la placa en el Wallac DELFIA Fluommeter. Las lecturas de muestras por triplicado en cada ensayo se tabularon y promediaron.
Un resultado positivo en este ensayo sugiere proliferación de células AoSMC y que la proteína de fusión de albúmina puede estar implicada en la proliferación de fibroblastos dérmicos y/o en la proliferación de células de músculo liso. Un resultado positivo también sugiere muchos usos potenciales de la proteína de fusión y los polinucleótidos que codifican la proteína de fusión de albúmina. Por ejemplo, la inflamación y las respuestas inmunitarias, la cicatrización de heridas y la angiogénesis tal como se detallan en la presente memoria. En particular, las proteínas de fusión se pueden usar en la cicatrización de heridas y la regeneración dérmica, así como la estimulación de la vasculogénesis, tanto de los vasos sanguíneos como de los linfáticos. El crecimiento de los vasos se puede usar en el tratamiento de por ejemplo, enfermedades cardiovasculares. Adicionalmente, las proteínas de fusión que muestran actividad antagonista en este ensayo pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, trastornos y/o afecciones que implica angiogénesis actuando como agente anti-vascular (p. ej., antiangiogénesis). Estas enfermedades, trastornos y/o afecciones se conocen en la técnica y/o se describen en el presente documento, tales como, por ejemplo, neoplasias malignas, tumores sólidos, tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicas, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; placas arteroscleróticas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, rechazo de injertos corneales, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y Pterygia (crecimiento anormal de los vasos sanguíneos) del ojo, artritis reumatoide; psoriasis; retraso en la cicatricación de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas en zonas de no unión; esclerodermia; tracoma; adherencias vasculares; angiogénesis miocárdica; colaterales coronarias; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de las extremidades isquémicas; síndrome de Osler-Webber; neovascularización en placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de heridas; enfermedad de Crohn; y aterosclerosis. Además, las proteínas de fusión que actúan como antagonistas en este ensayo pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades antihiperproliferaticas y/o antiinflamatorios conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento.
Ejemplo 87: Expresión de la molécula de adhesión celular (CAM) en células endoteliales
El reclutamiento de linfocitos en áreas de inflamación y angiogénesis implica interacciones ligando-receptor específicas entre las moléculas de adhesión a la superficie celular (CAM) sobre linfocitos y el endotelio vascular. El proceso de adhesión, en contextos normales y patológicos, sigue una cascada de múltiples etapas en la que participan la expresión de la molécula 1 de adhesión celular (ICAM-1), la molécula 1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) y la molécula 1 de adhesión leucocitaria endotelial (E-selectina) en células endoteliales (EC). La expresión de estas moléculas y de otras sobre el endotelio vascular determina la eficiencia con la que los leucocitos se pueden adherir a la vasculatura local y extravasar al tejido local durante el desarrollo de una respuesta inflamatoria. La concentración local de citoquinas y del factor de crecimiento participa en la modulación de la expresión de estas CAM.
Brevemente, las células endoteliales (p. ej., las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)) se cultivan en una placa estándar de 96 pocillos hasta confluencia, se retira el medio de crecimiento de las células y se sustituye con 100 μl de medio 199 (10 % de suero bovino fetal (FBS)). Las muestras para análisis (que contienen una proteína de fusión de la invención) y los controles positivos o negativos se añaden a la placa por triplicado (en volúmenes de 10 μl). Después, las placas se incuban a 37ºC durante 5 horas (expresión de selectina y de integrina)
o 24 horas (solo expresión de integrina). Las placas se aspiran para eliminar el medio y a cada pocillo se añaden 100 μl de 0,1 % de paraformaldehído –OBS (con Ca++ y Mg++). Las placas se mantienen a 4ºC durante 30 minutos. La fijación se retira de los pocillos y los pocillos se lavan 1X con PBS(+Ca,Mg) + 0,5 % de BSA y se drenan. Se añaden 10 μl de anticuerpo primario diluido a los pocillos de ensayo y control. Se usan Anti-ICAM-1-Biotina, AntiVCAM-1-Biotina y Anti-E-selectina-Biotina a una concentración de 10 ug/ml (dilución 1:10 de 0,1 mg/ml de anticuerpo madre). Las células se incuban a 37ºC durante 30 minutos en un ambiente humidificado. Los pocillos se lavan tres veces con PBS(+Ca,Mg) + 0,5 % de BSA. A cada pocillo se añaden 20 μl de estreptavidina-fosfatasa alcalina diluida (dilución 1:5.000, en el presente documento denominada dilución de trabajo) y se incuban a 37ºC durante 30 minutos. Los pocillos se lavan tres veces con PBS(+Ca,Mg) + 0,5 % de BSA. Disolver un comprimido de p-nitrofenol fosfato pNPP por 5 ml de tampón de glicina (pH 10,4). A cada pocillo de ensayo se añaden 100 μl de sustrato pNPP en tampón de glicina. Los pocillos estándar por triplicado se preparan a partir de la dilución de trabajo de estreptavidina-fosfatasa alcalina en tampón de glicina: 1:5.000 (10°) > 10-0.5 > 10-1 > 10-1.5. 5 μl de cada dilución se añaden a los pocillos por triplicado y el contenido en AP resultante es de 5,50 ng, 1,74 ng, 0,55 ng, 0,18 ng. Después, a cada uno de los pocillos convencionales se añaden 100 μl del reactivo pNNP. La placa se incuba a 37ºC durante 4 horas. A todos los pocillos se añade un volumen de 50 μl de NaOH 3M. La placa se lee en un lector de palcas a 405 nm usando la opción de sustracción de fondo sobre pocillos blanco llenos con únicamente tampón de glicina. Adicionalmente, se establece la plantilla para indicar la concentración del conjugado-AP en cada pocillo estándar [ 5,50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng]. Los resultados se indican como la cantidad de conjugado-AP unido en cada muestra.
Ejemplo 88: Ensayo de proliferación de células endoteliales con Alamar Blue.
Este ensayo se puede usar para determinar cuantitativamente la inhibición mediada por proteínas de la proliferación inducida por bFGF de células endoteliales linfáticas bovinas (LEC), células endoteliales aórticas bovinas (BAEC) o células del miometrio uterino microvasculares humanas (UTMEC). Este ensayo incorpora un indicador de crecimiento fluorométrico basado enla detección de la actividad metabólica. Se prepara un ensayo de proliferación estándar Alamar Blue en EGM-2MV con 10 ng /ml de bFGF añadido como fuente de estimulación de las células endoteliales. Este ensayo se puede usar con varias células endoteliales con ligeros cambios en el medio de crecimiento y la concentración celular. Las diluciones de los lotes de proteínas a analizar se diluyen del modo adecuado. Se usa medio sin suero (GIBCO SFM) sin bFGF como control sin estimular y se incluyen angiostatina o TSP-1 como controles inhibidores conocidos.
Brevemente, se siembran LEC, BAEC o UTMEC en medio de crecimiento a una densidad de 5.000 a 2.000
células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se colocan a 37ºC durante la noche. Después de incubar durante la noche las células, se extrae el medio de crecimiento y se sustituye con GIBCO EC-SFM. Las células se tratan con las diluciones adecuadas de una proteína de fusión de albúmina de la invención o muestra(s) de proteína control (preparadas en SFM) en pocillos por triplicado con bFGF adicional hasta una concentración de 10 ng7ml. Una vez que las células se han tratado con las muestras, la o las placas se introducen de nuevo en el incubador a 37ºC durante tres días. Después de tres días, a cada pocillo se añaden 10 ml de la reserva de alamar blue (Biosource Cat# DAL1100) y la o las placas se introducen de nuevo en el incubador a 37ºC durante cuatro horas. La o las placas se leen después con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm usando el lector de fluorescencia CytoFluor. Se registra la salida directa en unidades de fluorescencia relativas.
Alamar blue es un indicador de la oxidación-reducción que brilla y cambia de color en respuesta a la reducción química del medio de crecimiento a causa del crecimiento celular. A medida que las células crecen en el cultivo, la actividad metabólica innata tiene como resultado una reducción química del entorno inmediato circundante. La reducción relacionada con el crecimiento hace que el indicador cambie de forma oxidada (azul no fluorescente) a forma reducida (rojo fluorescente) (es decir, la proliferación estimulada producirá una señal más fuerte y la proliferación inhibida producirá una señal más débil y la señal total es proporcional al número total de células, así como a su actividad metabólica). El nivel de actividad de fondo se observa con medio sin nutrientes solo. Esto se compara con el resultado observado en las muestras control positivo (bFGF en medio de crecimiento) y las diluciones de las proteínas.
Ejemplo 92: Ensayos de unión a ligando
El siguiente ensayo se puede usar para evaluar la actividad de unión al ligando de una proteína de fusión de albúmina de la invención.
Los ensayos de unión a ligando proporcionan un procedimiento directo para determinar la farmacología del receptor y se pueden adaptar a un formato de rendimiento elevado. El ligando purificado para una proteína de fusión de albúmina de la invención se marca radioactivamente hasta un actividad específica alta (50-2.000 Ci/mmol) para los estudios de unión. Después se realiza una determinación de que el proceso de radiomarcaje no disminuye la actividad del ligando hacia la proteína de fusión. Las condiciones de ensayo para tampones, iones, pH y otros moduladores tales como nucleótidos se optimizan para establecer una proporción señal-ruido procesable para fuentes de polipéptidos de membrana y de células enteras. Para estos ensayos, la unión polipeptídica específica se define como la radioactividad total asociada menos la radioactividad medida en presencia de un exceso de ligando de competición sin marcar. Cuando sea posible, se usa más de un ligando de competición para definir la unión inespecífica residual.
Ejemplo 101: Soporte de supervivencia de neuronas de embriones de pollo.
Para analizar si la viabilidad celular neuronal simpática está soportada por una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede usar un ensayo de supervivencia de neuronas en embrión de pollo de Senaldi et al (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 96:11458-63 (1998)).
Brevemente, las neuronas motoras y simpáticas se aislan de embriones de pollo, se resuspenden en medio L15 (con 105 de FCS, glucosa, selenito sódico, progesterona, conalbúmina, putrescina e insulina; Life Technologies, Rockville, MD.) y medio Eagle modificado de Dulbecco [con 10 % de FCS, glutamina, penicilina y Hepes 25 mM (pH 7,2); Life Technologies, Rockville, MD.], respectivamente y se incuba a 37°C en 5 % de CO2 en presencia de concentraciones diferentes de la proteína de fusión purificada de la invención, así como un control negativo que carece de citoquinas. Tras 3 días se determina la supervivencia de las neuronas mediante evaluación de la morfología celular y mediante el uso del ensayo colorimétrico de Mosmann (Mosmann, T., J. Immunol. Methods, 65:55-63 (1983)). La viabilidad de las células neuronales potenciada en comparación con los controles que carecen de citoquinas es indicativa de que la proteína de fusión de albúmina potencia la supervivencia de las células neuronales.
Ejemplo 105: Inmovilización de biomoléculas.
Este ejemplo proporciona un procedimiento para la estabilización de una proteína de fusión de albúmina de la invención en construcciones de bicapas lipídicas de células no huésped (véase, por ejemplo, Bieri et al., Nature Biotech 17:1105-1108 (1999)) que se pueden adaptar para el estudio de las proteínas de fusión de la invención en los diversos ensayos funcionales descritos anteriormente. Brevemente, se usa química específica de carbohidratos para biotinilación para confinar una marca de biotina a una proteína de fusión de albúmina de la invención, de modo que permite una orientación uniforme tras la inmovilización. Una solución 50uM de una proteína de fusión de albúmina de la invención en membranas lavadas se incuba en NaIO4 20 mM y 1,5 mg/ml (4mM) de BACH o 2 mg/m1 (7,5mM) de biotina-hidrazida durante 1 hora a temperatura ambiente (volumen de reacción 150 ul). Después, se dializa la muestra Pierce Slidealizer Cassett, corte a 10 kDa; Pierce Chemical Co., Rockford IL) a 4 ºC primero durante 5 h, intercambiando el tampón tras cada hora y, por último, durante 12 horas contra 500 ml de tampón R (NaCl 0,15 M, MgCl2 1 mM, fosfato sódico 10 mM , pH 7) Justo antes de añadir a una cubeta, la muestra se diluye a
1:5 en tampón ROG50 (tampón R suplementado con octilgucósido 50 mM).
Ejemplo 116: Actividad de la construcción 3070 (fusión de albúmina GLP-1) medida mediante estimulación In Vitro del ARNm de insulina en células INS-1
Recientemente se ha demostrado que el GLP-1 aumenta la expresión del ARNm de insulina en células beta pancreáticas (Buteau et al., Diabetologia 1999 Jul;42(7):856-64). Por tanto, la capacidad de la proteína de fusión de albúmina GLP-1 codificada por CID 3070 para estimular el ARNm de insulina se evaluó usando la línea d células beta pancreáticas INS-1 (832/13).
La Figura 14 ilustra los niveles en equilibrio del ARNm de insulina en células INS-1 (832/13) después del tratamiento con GLP-1 o la proteína de fusión de albúmina y GLP-1 codificada por la construcción 3070 (proteína CID 3070). Tanto el GLP-1 como la proteína CID 3070 estimulan la transcripción del gen de la insulina. La primera barra (negra) representa las células sin tratar. Las barras 2-4 (blancas) representan las células tratadas con las concentraciones indicadas de GLP-1. Las barras 5-7 (grises) representan las células tratadas con las concentraciones indicadas de la proteína CID 3070.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Human Genome Sciences, Inc.
<120> Proteínas de fusión de albúmina
<130> PF564PCT
<150> 60/341,811
<151> 2001-12-21
<150> 60/360,000
<151> 2002-02-28
<150> 60/378,950
<151> 2002-05-10
<150> 60/398,008
<151> 2002-07-24
<150> 60/411,355
<151> 2002-09-18
<150> 60/414,984
<151> 2002-10-02
<150> 60/417,611
<151> 2002-10-11
<150> 60/420,246
<151> 2002-10-23
<150> 60/423,623
<151> 2002-11-05
<150> 60/351,360
<151> 2002-01-28
<150> 60/382,617
<151> 2002-05-24
<150> 60/383,123
<151> 2002-05-28
<150> 60/385,708
<151> 2002-06-05
<150> 60/394,625
<151> 2002-07-10
<150> 60/411,426
<151> 2002-09-18
<150> 60/350,358
<151> 2002-01-24
<150> 60/359,370
<151> 2002-02-26
<150> 60/367,500
<151> 2002-03-27
<150> 60/402,131
<151> 2002-08-09
<150> 60/402,708
<151> 2002-08-13
<150> 60/370,227
<151> 2002-04-08
<160> 2222
<170> Patentin Ver. 2.0
5 <210> 110
<211> 1203
<212> ADN
<213> Homo sapiens
10 <400> 110
15 <210> 198
<211> 543
<212> ADN
<213> Homo sapiens
20 <400> 198
<210> 200
<211> 543
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 200
<210> 201
<211> 543
<212>
ADN 10 <213> Homo sapiens
<400> 201
<210> 414
<211> 639
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 414
<210> 416
<211> 639
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 416
<210> 417
<211> 639
<212>
PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 417
<210> 418
<211> 639
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 418
<210> 630
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 630
<210> 632
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 632
<210> 633
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 633
<210> 634
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 634
<210> 988
<211> 90
<212>
ADN 15 <213> Homo sapiens
15
<210> 202
<211> 543
<212> ADN
<213> Homo sapiens
20
<400> 202
<400> 988
<210> 989
<211> 75
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 989
<210> 992
<211> 89
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 992
<210> 993
<211> 49
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 993 ggcgcgcctc atctaccctt aaccaaccaa gcaatgaatt ccttagcag 49
<210> 994
<211> 90
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 994
<210> 995
<211> 75
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 995
<210> 996
<211> 89
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 996
<210> 997
<211> 49
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 997 ggcgcgcctc atctaccctt aaccaaccaa gcaatgaatt ccttagcag 49
<210> 1037
<211> 1782
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1037
<210> 1038
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 1038
<210> 1039
<211> 58 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial.
<220>
<221> cebador_unión
10 <223> cebador usado para generar XhoI y ClaI sitio en pPPC0006
<400> 1039 gcctcgagaa aagagatgca cacaagagtg aggttgctca tcgatttaaa gatttggg
58
<210> 1040 <211> 59 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <221> cebador_unión <223> cebador usado para generar XhoI y ClaI Sitio en pPPC0006
<400> 1040 aatcgatgag caacctcact cttgtgtgca tctcttttct cgaggctcct ggaataagc
59
<210> 1041 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <221> cebador_unión <223> cebador usado para generar XhoI and ClaI sitio en pPPC0006
<400> 1041 tacaaactta agagtccaat tagc
24
<210> 1042 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <221> cebador_unión <223> cebador usado para generar XhoI and ClaI sitio en pPPC0006
<400> 1042 cacttctcta gagtggtttc atatgtctt 29
<210> 1043
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Misc_Structure
<223> Oligonucleótido sintético usado paa alterar la restricción sitios en pPPC0007
<400> 1043 aagctgcctt aggcttataa taaggcgcgc cggccggccg tttaaactaa gcttaattct 60
<210> 1044
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Misc_Structure
<223> Oligonucleótido sintético usado paa alterar la restricción sitios en pPPC0007
<400> 1044 agaattaagc ttagtttaaa cggccggccg gcgcgcctta ttataagcct aaggcagctt 60
<210> 1045
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> cebador_unión
<223> cebador directo útil para generar proteína de fusión de albúmina en la que el resto albúmina está en el extremo N de la proteína terapéutica <220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (25) <223> n equivale a a,t.g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<400> 1045 aagctgcctt aggcttannn nnnnnnnnnn nn 32
<210> 1046
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> cebador_unión
<223> cebador inverso útil para generar proteína de fusión de albúmina en la que el resto albúmina está en el extremo N de la proteína terapéutica
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature <222> (50)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<400> 1046 gcgcgcgttt aaacggccgg ccggcgcgcc ttattannnn nnnnnnnnnn n 51
<210> 1047
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo útil para generar proteína de fusión de albúmina en la que el resto albúmina está en el extremo C de la proteína terapéutica
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)
<223> n equivale a a,t,g, or c <220>
<221> misc_feature
<222> (23)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (30) <223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<400> 1047 aggagcgtcg acaaaagann nnnnnnnnnn nnn 33
<210> 1048
<211> 52
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> cebador_unión
<223> cebador inverso útil para generar proteína de fusión de albúmina en la que el resto albúmina está en el extremo C de la proteína terapéutica
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)
<223> n equivale a a,t,g, or c <220>
<221> misc_feature
<222> (40)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (47) <223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<400> 1048 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnnnnnnnnn nn
<210> 1049
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> signal
<223> péptido señal de la proteína de seroalbúmina humana natural
<400> 1049
<210> 1052
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> unión del cebador
<223> cebador directo útil para insertar la proteína terapéutica en el vector pC4:HSA
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)
<223> n equivale a a,t,g, orc
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)
<223> n equivale a a,t,g, orc
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)
<223> n equivale a a,t,g, orc <220>
<221> misc_feature
<222> (34)
<223> n equivale a a,t,g, orc
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)
<223> n equivale a a,t,g, orc
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<400> 1052 ccgccgctcg aggggtgtgt ttcgtcgann nnnnnnnnnn nnnnnn 46
<210> 1053
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> cebador_unión
<223> cebador inverso útil para insertar la proteína terapéutica en el vector pC4:HSA
<220> <221> misc_feature
<222> (38)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)
<223> n equivale a a,t,g, or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)
<223> n equivale a a,t,g, o c
<400> 1053 agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnnnnnnnnn nnnnn 55
<210> 1054
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> señal
<223> péptido señal de estanniocalcina
<400> 1054
<210> 1055
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> señal
<223> Péptido señal sintético
<400> 1055
<210> 1093 5 <211> 1830
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1093 10
<210> 1094 15 <211> 609
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1094 20
<210> 1095
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1095
<210> 1096
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1096
10
<210> 1097
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15
<400> 1097
20 <210> 1098
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
25 <400> 1098
<210>
1099 30 <211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14) to (18)
<223> Variante de la líder nativa de HSA
<400> 1099
<210> 1100
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14) to (18)
<223> Variante de la líder nativa de HSA
<400> 1100
<210> 1101
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14) to (18)
<223> Variante de la líder nativa de HSA
<400> 1101
<210> 1102
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14) to (18)
<223> Variante de la líder nativa de HSA
<400> 1102
<210> 1103
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14) to (18)
<223> Variante de la líder nativa de HSA
<400> 1103
<210> 1104
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14) to (18)
<223> Variante de la líder nativa de HSA
<400> 1104
<210> 1105
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14) to (23)
<223> Variante de la líder nativa de HSA
<400> 1105
<210> 1106
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1106
<210> 1107
<211> 11
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) to (11)
<223> Secuencia Kozak
<400> 1107 ccgccaccat g 11
<210> 1108
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1108
<210> 1109
<211> 86
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (84)
<223> Xaa equivale a uno cualquiera de Glu o Asp
<400> 1109
<210>
1110 5 <211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1110 10
<210> 1111
<211> 24 15 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1111
<210> 1113
<211> 5
<212> PRT 25 <213> Homo sapiens <220>
<221> Site
<222> (3)
<223> Xaa equivale a cualquiera de los veinte L-aminoácidos naturales
<400> 1113
<210> 1114
<211> 86
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador_unión
<223> Secuencia sintética con 4 copias en tándem del sitio de unión de GAS hallado en el promotor de IRF1 (Rothman et al., Immunity 1:457-468 (1994)), 18 nucleótidos complementarios al promotor temprano de SV40, y un sitio de restricción Xho.
<400> 1114
<210> 1115
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador_unión
<223> Secuencia sintética complementaria al promotor de SV40; incluye un sitio de restricción Hind III.
<400> 1115 gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc 27
<210> 1116
<211> 271
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Proteína_unión
<223> Promotor sintético para usar en ensayos biológicos; incluye los sitios de unión a GAS hallados en el promotor de IRF1 (Rothman et al., Immunity 1:457-468 (1994)).
<400> 1116
<210> 1117
<211> 32
<212> ADN.
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador_unión
<223> Cebador sintético complementario a la secuencia del promotor de EGR-1 genómico humano (Sakamoto et al., Oncogene 6:867-871 (1991)); incluye un sitio de restricción Xho I.
<400> 1117 gcgctcgagg gatgacagcg atagaacccc gg 32
<210> 1118
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador_unión
<223> Cebador sintético complementario a la secuencia del promotor de EGR-1 genómico humano (Sakamoto et al., Oncogene 6:867-871 (1991)); incluye un sitio de restricción Hind III.
<400> 1118 gcgaagcttc gcgactcccc ggatccgcct c 31
<210> 1119
<211> 12
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 1119 ggggactttc cc 12
<210> 1120 10 <211> 73
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <221> Cebador_unión
<223> Cebador sintético con 4 copias en tándem del sitio de unión de NF-KB (GGGGACTTTCCC), 18 nucleótidos complementarios al extremo 5' de la secuencia del promotor temprano de SV40, y un siito de restricción XhoI.
<400> 1120 20
<210> 1121
<211> 256 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Proteína Unión 30 <223> Promotor sintético para usar en ensayos biológicos, incluye sitios de unión a NP-KB.
<400> 1121
<210> 1167
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1167
<210> 1168
<211> 18 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1168
<210> 1169
<211> 21
<212>
PRT 20 <213> Homo sapiens
<400> 1169
<210> 1177
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1177
<210> 1216
<211> 543
<212>
ADN 15 <213> Homo sapiens
25
<210> 1176
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
30
<400> 1176
<400> 1216
20
<210> 1217
<211> 543
<212> ADN
<213> Homo sapiens
25
<400> 1217
<210> 1218 5 <211> 543
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1218 10
<210> 1219
<211> 543 15 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1219
<210> 1220
<211> 543
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1220
<210> 1221
<211> 180
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1221
<210> 1222
<211> 180
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1222
<210> 1231
<211> 669
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1231
<210> 1232
<211> 669
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1232
<210> 1233
<211> 669
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1233
<210> 1234
<211> 667
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1234
<210> 1235
<211> 669
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1235
<210> 1236
<211> 669
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1236
<210> 1237
<211> 669
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1237
<210> 1246
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1246
<210> 1247
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1247
5 <210> 1248
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 1248
<210> 1249
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1249
<210> 1250
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1250
<210> 1251
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1251
<210> 1252
<211> 60
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 1252
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22
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26
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<400> 1263 aggagcgtcg acaaaagaca cg
22
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26
<210> 1265 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1265 aggagcgtcg acaaaagaca cg
22
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<400> 1266 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc
26
<210> 1267 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1267 aggagcgtcg acaaaagaga ag
22
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<400> 1268 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc
26
<210> 1269 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1269
aggagcgtcg acaaaagaca ca
22
<210> 1270 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1270 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc
26
<210> 1271 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> '1271 agcgtcgaca aaagacacgc tgaaggtac
29
<210> 1272 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1272 catgatcttc aaatggacac t
21
<210> 1273 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1273 aggagcgtcg acaaaagaca cg
22
<210> 1274 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1274 catgatcttc aaatggacac t
21
5
<210> 1280 <211> 674 <212> PRT <213> Homo sapiens
10
<400> 1280
<210> 1281
<211> 267
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1281
<210> 1282
<211> 89
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1282
10 15
<210> 1283 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1283 gtcaatacct tcttgaacca 20
20
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25
<400> 1284 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa 27
30
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<400> 1391
5
10
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<400> 1395 gctggttgta agaacttctt ctggaagact ttcacttctt gt
42
15
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20
<400> 1439
25 <210> 1440
<211> 543
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1440
5
<210> 1452
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
10
<400> 1452
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<400> 1453
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<211> 435
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1454
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<211>
231 15 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1455
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<211>
435 25 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1456
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<211> 249
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1457
10
15
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<400> 1458
20
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<400> 1559
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<211> 623
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1563
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<211> 664
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1607
<210> 1608 5 <211> 664
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1608 10
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<211>
663 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1609
<210> 1610
<211> 663
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1610
<210> 1620
<211>
700 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1620
<210> 1621
<211> 668
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1621
<210> 1622
<211>
730 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1622
<210> 1623
<211> 662
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1623
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<211> 668
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1625
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<211> 662
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1626
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
<400> 1731 10
<210>
1775 15 <211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<210>
1776 5 <211> 180
<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1791
10
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<211> 145
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15
<400> 1792
<210> 1793 5 <211> 83
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1793 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1794 20
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1808 10
15
<210> 1922 <211> 35 <212> ADN <213> Homo sapiens
20
<400> 1922 aagctgcctt aggcttagct ggttgtaaga acttc 35
25
<210> 1923 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1923 cggccggggc gcgccttaac aagaagtgaa agtcttcca
39
<210> 2004
<211> 26
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2004 gcacacggtg aaggtacttt cacttc
<210> 2005
<211> 26
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2005 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc
<210> 2006
<211> 26
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2006 gcacacggtg aaggtacttt cacttc
<210> 2007
<211> 26
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2007 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc
<210> 2008
<211> 28
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2008 actgctgatg cagcggccgc ccgtaatg
<210> 2009 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2009 catgatcttc aaatggacac t
21
<210> 2010 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2010 actgctgatg cagcggccgc ccgtaatg
28
<210> 2011 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens
<400> 2011 catgatcttc aaatggacac t
21
<210> 2030 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2030 gcaggacctt accacccctc ag
22
<210> 2031 <211> 58 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2031
ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctct acccttaacc aaccaagc
<210> 2032
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2032 aattaaccct cactaaaggg 20
<210> 2033
<211> 27
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2033 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa 27
<210> 2034
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2034 gtcaatacct tcttgaacca 20
<210> 2035
<211> 27
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2035 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa 27
<210> 2036
<211> 20
<212> ADN
<213>
Homo sapiens
<213>
Homo sapiens
<400> 2036 gtcaatacct tcttgaacca
20
<210> 2037 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2037 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa
27
<210> 2038 <211> 20 <212> ADN. <213> Homo sapiens
<400> 2038 gtcaatacct tcttgaacca
20
<210> 2039 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2039 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa
27
<210> 2040 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2040 aattaaccct cactaaaggg
20
<210> 2041 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2041 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa
27
<210> 2042 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2042 gtcaatacct tcttgaacca
20
<210> 2043 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2043 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa
27
<210> 2064 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2064 catacaaact taagagtcca
20
<210> 2065 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2065 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa
27
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<400> 2128
<210> 2129
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<400> 2129
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<211> 21 20 <212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2136
<210> 2137
<211> 23
<212>
PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 2137
<210> 2138
<211> 394
<212>
ADN 25 <213> Homo sapiens
<400> 2138
<210> 2139
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2139
<210> 2140
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2140
<210> 2160
<211> 180
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2160
<210> 2170
<211> 673
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2170
<210> 2180 5 <211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2180 10
15
<210> 2194 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens
20
<400> 2194 aaacttaaga gtccaattag cttcatcgc <210> 2195 29
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2195 ccggaattcc ttagcagctt gacc 24

Claims (35)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una proteína de fusión de la albúmina que comprende dos o más polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem, en la que
    (i)
    dichos polipéptidos GLP-1 se seleccionan de
    (a)
    GLP-1 de tipo silvestre;
    (b)
    GLP-1 (9-36);
    (c)
    GLP-1 (7-36);
    (d)
    GLP-1 (7-36(A8G));
    (e)
    GLP-1 (7-36(A8S)); y
    (f)
    otros fragmentos de GLP-1 y/o variantes de GLP-1 que tienen actividad de GLP-1, fusionados a albúmina, que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1038, un fragmento de albúmina, o variante de albúmina de la misma,
    (ii)
    dicho fragmento de albúmina o variante de albúmina aumenta la semivida plasmática en suero de los polipéptidos GLP-1 y
    (iii) dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.
  2. 2. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en la que dichos polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem se seleccionan de
    (i)
    al menos una secuencia de GLP-1 de tipo silvestre fusionada con al menos una secuencia del fragmento de GLP-1 que tiene actividad de GLP-1;
    (ii)
    al menos una secuencia de GLP-1 de tipo silvestre fusionada con al menos una secuencia de la variante de GLP-1 que tiene actividad de GLP-1; y
    (iii) al menos una secuencia del fragmento de GLP-1 fusionada con al menos una secuencia de la variante de GLP-1 que tiene actividad de GLP-1.
  3. 3.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en la que dichos polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem se seleccionan dos GLP-1 (7-36(A8G)) orientados en tándem.
  4. 4.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de fusión de albúmina se produce en una célula huésped que comprende una construcción que expresa dicha proteína de fusión de albúmina, en donde dicha construcción se selecciona de las construcciones siguientes como se define en la tabla 2.
    (a)
    construcción ID 2900;
    (b)
    construcción ID 2964;
    (c)
    construcción ID 2803;
    (d)
    construcción ID 2804;
    (e)
    construcción ID 2945;
    (f)
    construcción ID 2982;
    (g)
    construcción ID 3070;
    (h)
    construcción ID 3027;
    (i)
    construcción ID 3028;
    (j)
    construcción ID 3045;
    (k)
    construcción ID 3046;
    (l)
    construcción ID 3069;
    (m)
    construcción ID 3071;
    (n)
    construcción ID 3072;
    (o)
    construcción ID 3085;
    (p)
    construcción ID 3086;
    (q)
    construcción ID 3087;
    (r)
    construcción ID 3309; y
    (s)
    construcción ID 2904;
  5. 5.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de
    (a)
    los aminoácidos 1 a 30 de SEC ID Nº 1808,
    (b)
    los aminoácidos 100 a 127 de SEC ID Nº 1249; y
    (c) los aminoácidos 98 a 127 de SEC ID Nº 630; en donde dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.
  6. 6.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 5, en la que dichos polipéptidos de GLP-1 comprenden
    (i)
    al menos dos secuencias de aminoácidos de (a);
    (ii)
    al menos dos secuencias de aminoácidos de (b);
    (iii) al menos dos secuencias de aminoácidos de (c);
    (iv)
    al menos una secuencia de aminoácidos de (b) y al menos una secuencia de aminoácidos de (c); o
    (v)
    al menos una secuencia de aminoácidos de (a) y al menos una secuencia de aminoácidos de (c).
  7. 7.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
    (a)
    los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1231;
    (b)
    los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1232;
    (c)
    los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1233;
    (d)
    los aminoácidos 25 a 667 de SEC ID Nº 1234;
    (e)
    los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1235;
    (f)
    los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1236;
    (g)
    los aminoácidos 25 a 667 de SEC ID Nº 1237;
    (h)
    los aminoácidos 30 a 674 de SEC ID Nº 1280;
    (i)
    los aminoácidos 20 a 664 de SEC ID Nº 1607;
    (j)
    los aminoácidos 20 a 664 de SEC ID Nº 1608;
    (k)
    los aminoácidos 19 a 663 de SEC ID Nº 1609;
    (l)
    los aminoácidos 19 a 663 de SEC ID Nº 1610;
    (m)
    los aminoácidos 24 a 668 de SEC ID Nº 1621;
    (n)
    los aminoácidos 87 a 730 de SEC ID Nº 1622;
    (o)
    los aminoácidos 18 a 662 de SEC ID Nº 1623;
    (p)
    los aminoácidos 87 a 730 de SEC ID Nº 1624;
    (q)
    los aminoácidos 24 a 668 de SEC ID Nº 1625;
    (r)
    los aminoácidos 18 a 662 de SEC ID Nº 1626; y
    (s) los aminoácidos 30 a 673 de SEC ID Nº 2170; en donde dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.
  8. 8.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de fusión se produce en una célula huésped que comprende la secuencia de aminoácidos de la construcción 3070 contenida en la ATCC con el depósito número PTA-4671.
  9. 9.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dichos polipéptidos de GLP-1 se fusionan en el extremo N o en el extremo C con albúmina.
  10. 10.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha proteína de fusión de albúmina está glicosilada o no glicosilada.
  11. 11.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha proteína de fusión de albúmina se expresa en levaduras.
  12. 12.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 11, en la que dicha levadura es S. cerevisiae, K. lactis o P. pastoris
  13. 13.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 11 o 12, en la que dicha levadura es deficiente en glicosilación.
  14. 14.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que dicha levadura es deficiente en glicosilación y en proteasa.
  15. 15.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha proteína de fusión de albúmina se expresa en una célula de mamífero.
  16. 16.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 15, en donde dicha célula de mamífero es una célula CHO, una célula COS o una célula NSO.
  17. 17.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende además una secuencia líder de secreción.
  18. 18.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicha proteína de fusión de albúmina se formula con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  19. 19.
    Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  20. 20.
    Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 19.
  21. 21.
    Un procedimiento para producir una proteína de fusión de albúmina, que comprende
    (a)
    transformar una célula huésped que comprende al menos un vector de la reivindicación 20.
    (b)
    cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de la albúmina; y
    (c)
    aislar la proteína de fusión de la albúmina.
  22. 22.
    Una composición farmacéutica, que comprende la proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
  23. 23.
    La proteína de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para usar como medicamento.
  24. 24.
    La proteína de fusión de la albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para usar en el tratamiento de hiperglucemia, diabetes, diabetes insípida, diabetes mellitus; diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina, hiperlipidemia, hipercetonemia, diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI), diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI), obesidad, retinopatía, las úlceras, supresión del peso corporal, supresión del apetito, el síndrome X, trastornos metabólicos, inmunitarios y vasculares asociadas a la diabetes y trastornos cardiovasculares.
  25. 25.
    Uso de la proteína de fusión de la albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para la fabricación de un medicamento para tratar hiperglucemia, diabetes, diabetes insípida, diabetes mellitus; diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina, hiperlipidemia, hipercetonemia, diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI), diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI), obesidad, retinopatía, las úlceras, supresión del peso corporal, supresión del apetito, el síndrome X, trastornos metabólicos, inmunitarios y
    vasculares asociados a la diabetes y trastornos cardiovasculares.
  26. 26.
    La proteína de fusión de la reivindicación 24 o el uso de la reivindicación 25, en donde el trastorno es diabetes de tipo 2.
  27. 27.
    La proteína de fusión de la reivindicación 24 o el uso de la reivindicación 25, en donde dicho trastorno cardiovascular se selecciona del grupo que consiste en fístula arterio-arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos cardíacos congénitos, atresia pulmonar y síndrome de la cimitarra.
  28. 28.
    La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 27, en donde dicho defecto cardíaco congénito se selecciona del grupo que consiste en coartación aórtica, cor triatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón entrecruzado, dextrocardia, conducto arterial persistente, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de grandes vasos, doble salida del ventrículo derecho, atresia de la tricúspide, tronco arterial persistente y defectos septales cardíacos, tales como defecto septal aortopulmonar, defectos de la almohadilla endocárdica, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot y defectos septales cardíacos ventriculares.
  29. 29.
    La proteína de fusión de la reivindicación 24 o el uso de la reivindicación 25, en donde dicho trastorno cardiovascular se selecciona del grupo que consiste en enfermedad cardíaca, arritmias, enfermedad cardíaca carcinoide, gasto cardíaco elevado, gasto cardíaco bajo, taponamiento cardíaco, endocarditis, aneurisma cardíaco, parada cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, disnea paroxística, edema cardíaco, hipertrofia cardíaca, miocardiopatía congestiva, hipertrofia del ventrículo izquierdo, hipertrofia del ventrículo derecho, rotura cardíaca postinfarto, rotura del tabique ventricular, enfermedades de las válvulas cardíacas, enfermedades del miocardio, isquemia miocárdica, derrame pericárdico, pericarditis, neumopericardio, síndrome pospericardiotomía, enfermedad cardíaca pulmonar, enfermedad cardíaca reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares de la gestación, síndrome de la cimitarra, sífilis cardiovascular y tuberculosis cardiovascular.
  30. 30.
    La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 29, en donde dicha arritmia se selecciona del grupo que consiste en arritmia sinusal, fibrilación auricular, aleteo auricular, bradicardia, extrasístole, síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de rama, bloqueo senoauricular, síndrome del QT largo, parasístole, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexcitación de tipo Mahaim, síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome del seno enfermo, taquicardias y fibrilación ventricular.
  31. 31.
    La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 30, en donde dicha taquicardia se selecciona del grupo que consiste en taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal auriculoventricular, taquicardia auricular ectópica, taquicardia ectópica de la unión, taquicardia de reentrada nodal senoauricular, taquicardia sinusal, Torsades de Pointes y taquicardia ventricular.
  32. 32.
    La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 29, en donde dicha enfermedad de válvula cardíaca se selecciona del grupo que consiste en insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, soplos cardíacos, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia de la tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide y estenosis de la válvula tricúspide.
  33. 33.
    La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 29, en donde dicha enfermedad miocárdica se selecciona del grupo que consiste en miocardiopatía alcohólica, miocardiopatía congestiva, miocardiopatía hipetrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, miocardiopatía restrictiva, miocardiopatía de Chagas, fibroelastosis endocárdica, fibrosis endomiocárdica, síndrome de Kearns, lesión por reperfusión del miocardio y miocarditis.
  34. 34.
    La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 29, en donde dicha isquemia miocárdica se selecciona del grupo que consiste en enfermedad coronaria, angina de pecho, aneurisma coronario, arteriosclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto de miocardio, aturdimiento miocárdico.
  35. 35.
    La proteína de fusión de la reivindicación 24 o el uso de la reivindicación 25, en donde dicho trastorno cardiovascular se selecciona del grupo que consiste en aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, enfermedad de Hippel-Lindau, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, enfermedades aórticas, arteritis de Takayasu, aortitis, síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, arteritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, trastornos cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolias, trombosis, eritromegalgia, hemorroides, enfermedad venooclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena retiniana, síndrome de la cimitarra, síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, telangiectasia ataxia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis e insuficiencia venosa.
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