JPH03201987A - ヒト血清アルブミン断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明はヒト血清アルブミンの部分から成る蛋白質断片
に関する。この蛋白質断片は薬物等の運搬・供給系のキ
ャリヤー等としての用途が期待される。

〔従来の技術〕

ヒト血清アルブミンはヒト肝臓で合成される分子１６６
．４５８の高分子血漿蛋白質で、生体内では主に血液の
浸透圧調節、種々の物質（例えば脂肪酸、Ｃｕ”・Ｎｉ
ハなどの金属イオン、胆汁ビリルビン、多くの薬物、一
部の水溶性ビタミン、など）と結合してそれらの標的臓
器への運搬、組織へのアミノ酸供給源、などの重要な役
割を果している。これらの作用を基礎にして火傷や腎炎
などによるアルブミンの喪失や肝硬変などによるアルブ
ξン合成の低下で起こる低アルブミン血症や出血性ショ
ックなどの治療にヒト血清アルブミンは大量に使用され
ている。血清アルブミンはまた、多くの薬物と非特異的
に結合し、それらの血中１１１１の役割を果たしている
。アルブミンと結合した薬物は血液循環によって体内を
動き、やがてアルブミンとｉ離して毛細血管壁を通過し
て拡散し、作用部位へと到達すると考えられている。ア
ルブミンは毒性が少ない、抗原性が低い、生体内で簡単
に分解される、薬物との共有結合及び複合体形成が簡単
にできる、等のドラッグデリバリ−のための担体（ドラ
ッグキャリヤー）として優れた特徴を有しており、また
各種薬剤の結合サイトも決定または推定されているもの
が多く、製剤化のためのデザインが簡単にできるという
利点も有している。

基本的にはヒト血清アルブミンの断片でも推定されてい
る多くの薬剤に対する結合部位はほとんど含んでおり、
ドラッグキャリヤーとしての活性を示すことができると
考えられる。薬物等の運搬・供給系におけるキャリヤー
等として使用する場合には、薬物等との結合性を限定す
る等の見地から、むしろヒト血清アルプξン分子全体を
使用するよりもその断片を使用する方が有利であると予
想される 一般に、蛋白質を切断してその断片を調製する方法とし
て、蛋白質を臭化シアンのごとき化学物質又はトリプシ
ン、ペプシン等のプロテアーゼを用いる方法が知られて
いる。しかしながら、これらの方法においては、蛋白質
のアミノ酸配列に依存して切断部位が必然的に定まるた
め、任意の部位で切断することができず、従って理想的
な蛋白質断片を得ることはできない。従って、ヒト血清
アルブミンについてもその様な断片は得られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

これに対して、組換えＤＮＡ技術を用いれば、任意の部
分からなるヒト血清アルブミン断片を適当な宿主細胞中
で合成させることができる。従って本発明は、ヒト血清
アルブミンの所望の蛋白質断片をコードするＤＮＡを作
製し、これに基く組換ＤＮＡ技術により、ヒト血清アル
ブミンの蛋白質断片及びその製造手段を提供しようとす
るものである。

さらに詳しくは、本発明は、ヒト血清アルブミンのＣ−
末端部分が欠失したヒト血清アルブミン断片、及び該断
片と他のポリペプチドとから成る融合蛋白質、並びにヒ
ト血清アルブミンのＮ−末端部分が欠失したヒト血清ア
ルブミン断片、及び該断片と他のポリペプチドとから成
る融合蛋白質；これらの蛋白質断片又は融合蛋白質をコ
ードするＤＮＡ１該ＤＮＡを含有するプラスくド；該プ
ラスミドにより形質転換された宿主；及び前記宿主を培
養してヒト血清アルブミン蛋白質断片又は該断片を含む
融合蛋白質を発現せしめ、融合蛋白質を発現せしめた場
合には所望により該融合蛋白質から該ヒト血清アルブミ
ン断片を宿主細胞内又は試験管内で切り出すことを特徴
とするヒト血清アルブミン蛋白質断片又は該断片を含有
する融合蛋白質の製造方法に関する。

［具体的な説明］ 正常ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮＡはすで
にクローン化されている（特願昭６３−０３７４５３）
。

従って、このｃＤＮＡを用いて、遺伝子工学的手法によ
り正常ヒト血清アルブミンＡの任意の断片を製造するこ
とができる。

本発明は、この様な断片として、（１）ヒト血清アルブ
ミンのＣ−末端を欠失した血清アルブミン断片、及び（
２）ヒト血清アルブミンのＮ−末端を欠失した血清アル
ブミン断片を提供する。本発明は例えば、Ｃ−末端が欠
失したアルブミン断片の例として正常ヒト血清アルブミ
ンの１位のアスパラギン酸から３０３位のプロリンまで
のアミノ酸配列を有するアルブミン断片（これをミニＨ
３Ａと称する場合がある）について記載し、そしてＮ−
末端が欠失したアルブミン断片の例として正常ヒト血清
アルブミンの１２３位のメチオニンから５８５位のロイ
シンまでのアミノ酸配列から成るアルブミン断片（これ
を短縮Ｉ　Ｓ　Ａと称する場合がある）について記載す
る。

これら本発明の２つのタイプのアルブミン断片はそれぞ
れ下記のごとき特徴を有している。

本発明のアルブミン断片は、いずれもヒト血清アルブミ
ンの中央部分を含有している。この様に、中央部分を含
めたのは、ヒト血清アルブミン分子上の薬剤結合位置は
現在までに４つ（サイｌ−１〜■）知られており（Ｓｊ
Ｏｈｏｌｍ、　１．　、　Ｅｋ＋＋＋ａｎ、　Ｂ、Ｅ、
　＋　Ｋｏｂｅｒ。

Ａ、、Ｌｊｕｇｓｔｅｄｔ−Ｐａｈｌｍａｎ、１．、Ｓ
ｅｉｖｉｎｇ、Ｂ、＆　５ｊＯｄｉｎ、Ｔ。

Ｍｏ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１６，７６７−　（１９
７９）　）　、これらのサイトにおいて薬物の結合に重
要な役割を果たすアミノ酸残基もいくつか知られている
（　Ｆｅｈｓｋｅ、に、らＢｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｌ
Ｉ＋ａｃｏ１．３０．６８８−（１９８１）　）が、そ
のほとんどがこの中央部分に集中しているためである。

Ｓｊｄｈｏｌｍ　らは薬物をヒト血清アルブミンに均一
に分散させた小球体を使い、多種の薬物の結合位置を調
べ、ジアゼパムサイト（サイトＩ）、ジギトキシンサイ
ト（サイト■）、及びワルファリンサイト（サイト■）
に分類しているが、この他にタモキシフェン（サイト■
）またはビリルビン結合サイトが存在するらしい。Ｆｅ
ｈｓｋｅらはジアゼパムサイト、ワルファリンサイト、
ビリルビン結合サイトにおいて重要な役割をしているア
ミノ酸として各々Ｌｙｓ１９５と旧５１４６及びＡｒｇ
１４５　、　Ｔｒｐ２１４及びＬｙｓ１９９　、　Ｌｙ
ｓ２４０を推定している。一方パルミチン酸塩のような
長鎖脂肪酸の結合サイトはＣ端側領域にあるらしく　（
Ｒｅｅｄ、　Ｒ，Ｇ　−＋　Ｆｅ１ｄｈｏｆ　ｆ　＋　
Ｒ，Ｃ，＋　Ｃ１ｕ　ｔｅ＋０、Ｌ、＆　Ｐｅｔｅｒｓ
、Ｔ、Ｔｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　１４＋　４
５７８−（１９７５）　；　Ｂｅｒｄｅ、　Ｃ，Ｂ、　
、　Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｂ、Ｓ、　、　Ｓｉｍｏｎ　ｉ、
　、　Ｒ，Ｄ、＆５ｋｌａｒ、Ｌ、Ａ、Ｊ、Ｂｉｏ１．
Ｃｈｅ＋ｓ、２５４，３９１　　（１９７９））、本発
明のＣ−末端を欠失したヒト血清アルブミン断片を利用
すれば長鎖脂肪酸が結合できず、ジアゼパム、ワルファ
リン等が結合できるドラッグキャリヤーの作製が可能と
なる。

ヒト血清アルブミンは５８５個のアミノ酸から戒る高分
子蛋白質で、しかも分子内に３５個のシスティン残基を
有し、そのうち最もＮ端側に位置するシスティン残基（
Ｃｙｓ−３４）のみが遊離の５ＨＪＪを有する状態で存
在し、その他のものは互いにジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結
合を形成し、計１７個のＳＳ橋が分子内に形成されてい
る。蛋白質分子の高次（立体）構造形成の過程で少なく
とも２種の酵素〔ペプチジルプロリルｃｉｓ　−ｔｒａ
ｎｓイソメラーゼ及びプロティンジスルフィドイソメラ
ーゼ（ＰＤＩ）　）が関与していることが最近間らかに
なってきたが、Ｓ−５橋形成に重要な役割を果たすのは
後者のＰＤＩである。血清アルブミンを産生ずる哺乳類
の細胞内では生合成及び血清アルブミン蛋白質の細胞内
輸送の過程でＰＤＩが働き蛋白質分子内にＳ−５橋が形
成され、ＰＤＩの主な存在場所は小胞体を含むミクロソ
ーム画分であることが知られている。大腸菌をはしめと
する原核生物細胞内でヒト血清アルブミンを生合成させ
た場合には上述のような反応が起き、分子内に正しいＳ
−３橋が形成さ５れる保証はなく、Ｃｙｓ　−３４が分
子内のシスチン残基とチオール／ジスルフィド交換反応
を起こし、Ｓ−３橋のかけ違えが生じ、異性体を生じる
可能性がある。このように遊離のＳＨ基を有するシステ
ィン残基が存在すると本来あるべき正常な立体構造をと
った蛋白質ができる効率が低くなり、異常な立体構造を
とった蛋白質は機能的にも正常でなくなる危険性が大と
なる。これに対して、本発明のＮ−末端部分が欠失した
、１２３位のメチオニンから５８５位のロイシンまでの
アミノ酸配列から成るアルブミン断片では、Ｃｙｓ３４
が他の６個のアミノ末端側に位置するシスティンと共に
除かれており、このような危険性を少なくしである。

本発明においては、前記２つのタイプのアルブミン断片
の代表例として特定のアミノ配列範囲を有する２種類の
アルブミン断片を具体的に記載するが、２つのタイプの
アルブミン断片はそれぞれ前記のごとき特徴を有してお
り、それらの特徴を発揮することができるアルブミン断
片はすべて本発明の範囲に属する。例えば、薬剤結合部
位が集中している中央部分として第１２３位のメチオニ
ンから３０３位のプロリンまでの範囲を例示したが、中
央部分は必ずしもこの範囲に限定されず、薬剤結合部位
の大部分を含む範囲であれば、第１２３位〜３０３位よ
りも長くても、短かくてもよい。また、長鎖脂肪酸の結
合部位が存在し、従って除去されるべきＣ−末端側領域
として３０４位からＣ−末端までの範囲を例示したが、
これに限らず、長鎖脂肪酸の結合部位を含む範囲であれ
ば、さらに長い範囲でもよく、又短い範囲でもよい。さ
らに、システィンを多数含有し、従って除去されるべき
Ｎ末端の範囲としてＮ−末端から１２２位までの範囲を
例示したが、第３４位のシスティンを含有するＮ−末端
側領域であればＮ−末端から１２２位までの範囲に限定
されるものではなく、さらに長いか又は短い範囲であっ
てもよい。

従って、次の条件を考慮しながら種々のアルブミン断片
をデザインすることができ、それらは本発明の範囲に属
する。ヒト血清アルブミンの断片をデザインするために
重要な条件として、特定の薬物結合に必要な立体構造を
保持することが期待できるような断片を選定することが
重要である。

この際注意すべきことは（ｉ）天然のヒト血清アルプ旦
ンの構造中に存在するＳ−５橋をそのままの形で保持さ
せること、（ｉｉ）そのため断片を構成するポリペプチ
ド鎖中には偶数個のシスティン残基を有すること、（ｉ
ｉｉ）Ｓ−３橋で結ばれてループを形成しているポリペ
プチド鎖の途中に切断を入れないこと、即ち天然ヒト血
清アルプξン分子中にいくつか存在する主要なドメイン
構造あるいは少なくともサブドメイン構造は破壊しない
こと、などがあげられる。

１、遺伝ヱ糸 宿ユ 正常ヒト血清アルブミンは分子内に多くのジスルフィド
結合を含有しており、組換えＤＮＡ法によって天然物と
同じ立体構造を有する正常ヒト血清アルブミン又は断片
を製造するには、これらのジスルフィド結合が生産宿主
細胞中で正しく形成されることが必須である。正常な立
体構造の形成にはプロティンジスルフィドイソメラーゼ
、ペプチジルプロリルｃｉｓ　−ｔｒａｎｓイソメラー
ゼ等の酵素が関与していることが最近明らかになり、多
数のＳ−３結合を有し複雑な立体構造をとる蛋白質を殆
ど含まない大腸菌や枯草菌のような原核生物細胞ではた
とえあってもこのような立体構造形成（フォールディン
グ）関連酵素系の働きは強くないことが予想される。一
方、ヒトをはじめとする真核高等生物の細胞は数多くの
複雑な高次構造を有する蛋白質（糖蛋白質や他の修飾蛋
白質も含む）を細胞外に分泌することが知られているが
、下等真核微生物である酵母菌でも、哺乳動物の細胞で
蛋白質が分泌されるのと非常によく似た経路により蛋白
質が分泌されることが知られている（　１１　ｕ　ｆｆ
ａｋｅｒ、Ｔ、Ｃ，ａｎｄ　Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｐ、Ｗ、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋、２５７＋３２０３−３２
１０（１９８２）　；　５ｎｉｄｅｒ、Ｍ、Ｄ、ｉｎ　
Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、Ｖ、＆Ｒｏｂｂｉｎｓ＋Ｐ、Ｗ、（
ｅｄｓ、）Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅｓ。

Ｖｏｌ、２．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８
４）、ｐｐ、１６３−１９８３゜このため異種生物由来
（特に哺乳動物）の遺伝子（主としてｃＤＮＡ　）を酵
母菌内で発現させ遺伝子産物である蛋白質を、細胞外に
分泌せしめようとする実験が最近多く試みられてきた。

たとえばヒトインターフェロンα１．αｔ＋　ｒ　（Ｈ
ｉｔｚｅｍａｎ、Ｒ，Ａ、。

Ｌｅｕｎｇ＋　Ｄ、Ｗ、、Ｐｅｒｒｙ、Ｌ、Ｊ、、Ｋｏ
ｈｒ＋Ｗ、Ｊ、、Ｌｅｖｉｎｅ＋Ｉ１．Ｌ、＋Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、５ｃｉｅｎｃｅ　２１９．６２０−６
２５（１９８３）　　）、仔ウシプロキモシン（Ｓａ＋
ｉ　ｔｈ、Ｒ，Ａ、、Ｄｕｎｃａｎ、Ｍ、Ｊ、。

Ｍｏ１ｒ、Ｄ、Ｔ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９．１２１９
−１２２４（１９８５））　、ヒト上皮戒長因子（Ｂｒ
ａｋｅ、　Ａ、Ｊ、　、　Ｍｅｒｒｙｗｅａｔｈｅｒ＋
　Ｊ、Ｐ、　＋Ｃｏ１ｔ、Ｄ、Ｇ、、ｔｌｅｂｅｒｌｅ
ｉｒ＋＋Ｕ、Ａ、、Ｍａｓｉａｒｚ、Ｆ、Ｒ，、Ｍｕｌ
ｌｅｎｂａｃｈ＋Ｇ、Ｔ、、Ｕｒｄｅａ、Ｍ、Ｓ、、Ｖ
ａｌｅｎｚｕｅｌａ＋Ｐ、、Ｂａｒｒ、Ｐ、Ｊ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８
１．４６４２−４６４６（１９８４））、マウスインタ
ーロイキン２　（Ｍｉｙａｊｉｍａ、Ａ、、Ｂｏｎｄ、
Ｍ。

Ｗ、、０ｔｓｕ、に、＋へｒａｉ＋に、、Ａｒａｉ＋Ｎ
、Ｇｅｎｅ　　３ヱ、１５５−１６１（１９８５））　
、ヒトβ−エンドルフィン［Ｂｉｔｔｅｒ、Ｇ。

Ａ、、Ｃｈｅｎ、に、に、、Ｂａｎｋｓ、Ａ、Ｒ，、Ｌ
ａｉ＋１’、−Ｈ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８１．５５３０−５５３
４（１９８４））などで酵母菌による細胞外分泌が報告
されているが、その分泌効率はマウスインターロイキン
２の約８０％からヒトインターフェロンの４〜１０％ま
で目的とする蛋白質によりかなりの差がある。又、これ
らのうちその蛋白質自身のシグナルペプチドを用いて細
胞内輸送を試み、そのシグナルペプチドがうまく切断さ
れて分泌することに成功しているのはヒトインターフェ
ロンである。その他のものは酵母インベルターゼ（ＳＵ
Ｃ２）のシグナルペプチドや接合因子α１　　（ＭＦα
１）のリーダー配列など酵母の蛋白質の細胞内輸送に必
要なシグナル配列を目的とする成熟蛋白質に直接融合し
た形で発現させ、細胞内輸送を行わせたものである。さ
らに正しい位置でプロセシングを受けていることが明ら
かなものは少なく、ヒトインターフェロンの場合は約半
分が正しいプロセシングを受けているが、ヒトβ−エン
ドルフィンではペプチド内部でも切断を受けている。

酵母菌を宿主として用いる遺伝子工学的物質生産性の特
徴としては以下のようなものがある。

１、大量高密度培養による発酵生産が容易かつ経済的で
ある。また動植物の培養細胞系と比較して厳密に管理制
御された培養装置を特別必要としない。

２、　発酵生産に多くの経験が蓄積されている。

３、　分子遺伝学的な知識が急速に蓄積されつつある。

４、外来性の遺伝物質を細胞内及びゲノム内に取り込ま
せることが容易である。

５、蛋白質の細胞内輸送及び、細胞外分泌の遺伝学及び
生理学に対する理解が急速に高まってきている。

６、　適切なプラスごドベクターを選択すれば、外来性
の遺伝子をエビソーム状ＬＪｔ（ＹＥｐ系プラプラスミ
ド使用ゲノムに組み込ませた状態（Ｙｌｐプラスミド使
用）、酵母のセントロメアを含み細胞分裂に伴い染色体
ＤＮＡとともに複製できる状態（ＹＣｐプラスミド使用
）、及び酵母の自律複製配列（ＡＲ３）を含み自律的に
複製できる状態（ＹＲｐプラスミド使用）の４種の状態
におくことができる。

７、　シグナルペプチドやプロ配列などの細胞内プロセ
シング機能がある。

８、酵母菌で合成される糖蛋白質に見い出される糖鎖は
高等動植物の糖蛋白質における複合型糖鎖とは異なる高
マンノース型ｔｊ！鎖ではあるが、酵母菌の小胞体で起
こるコア糖鎖の付加は高等動物と共通した過程であり、
両者における相違は外側のＩＪＭ鎖の付加に見られるの
みである。

９、　ビタミン、微量因子等の添加により完全合成培地
で形質転換体を生育させることができる。

１０、純粋なグルコースでなく粗製の糖源を利用てして
も形質転換体を生育させることができる。

この様な背景に基づいて、本発明においては酵母を宿主
として使用する。

（プレプロ配列） ヒト血清アルブミン断片を酵母細胞中で発現せしめ、こ
れを効率よく分泌せしめるためには、Ｎ−末端にプレプ
ロ配列が存在する必要がある。また、このプレプロ配列
は目的蛋白質の分泌の際に切除されて該目的蛋白質が成
熟型で分泌される必要がある。このため本発明において
は、この様な条件を満たすプレプロ配列としてヒト血清
アルブミンの本来のプレプロ配列を使用する。

酵母における蛋白質の発現を増強するためには該蛋白質
のＮ−末端領域をコードするコドンとして、酵母中で効
率よく翻訳されるコドンを使用するのが好ましい。この
ため、本発明においては、前記プレプロ配列をコードす
るＤＮＡ配列として、酵母において効率よく発現される
遺伝子において高頻度で使用されるコドンから構成され
る合成りＮＡ配列を使用する。この様なコドンとして例
えば次のコドンを用いる。

プレプロ配列をコードするＤＮＡ部分の一例として次の
配列を用いることができる。

Ｇｌｙ　　Ｖａｔ　　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　　Ａｒｇ上記の
配列のＮ−末端のＭｅｔのコドンの上流にはＥｃｏＲＩ
粘着末端が設けられており、この制限酵素部位により上
記配列はベクターに挿入される。

また、上記プレプロ配列のＣ−末端のＡｒｇのコドンと
しては、酵母での翻訳のために好ましいとして上記した
コドンではなく、ＣＧＣが採用されており、これにより
５′−末端をＣ１ａｌにより切断したヒト血清アルブミ
ン断片と連結することができる。

ヒト　′アルブミン ヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）
はすでにクローン化されており、その塩基配列及び該塩
基配列から推定されるアミノ酸配列は、特願昭６３−０
３７４５３に詳細に記載されている。従って本発明にお
いては、このｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｕｃ　−
ＨＳ＾　・ＣＩ等をヒト血清アルブミン断片をコードす
る遺伝子の供給源として使用することができる。なお、
これらのプラスごドの作製方法を参考例として後記する
。

ポリＡ配　　びＡＡＴＡＡＡシグナル コード配列の３′−末端の下流に存在するポリＡ配列及
びＡＡＴＡＡＡシグナルが真核生物のｍＲＮＡ０安定性
に寄与すると言われている（Ｂｅｒｇｍａｎｎ及びＢｒ
ａｗｅｒｍａｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１６．
２５９　２６４（１９７７）；Ｈｕ　ｅ　ｚら、　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　７８
，９０８−９１１（１９８１）　）。従って、本発明の
好ましい態様においては、ヒト血清アルブミンＡをコー
ドするｃＤＮＡの下流にこれらの配列を配置する。ポリ
Ａ配列及びＡＡＴＡＡＡシグナルとしては、例えばヒト
血清アルブミンＡｃＤＮ＾に自然に付随しているこれら
の配列を使用することができる。これらの配列を含有す
るヒト血清アルブミンＡ遺伝子はすでにクローン化され
ており、特願昭６３−０３７４５３に記載されている。

これらの配列の供給源として例えばλｇｔｌｌ（ＩＩｓ
Ａ１八）を使用することができ、その作製方法を参考例
において後記する。

プロモーター 本発明においては、酵母細胞中で機能するものであれば
いずれのプロモーターを使用することもできる。しかし
ながら本発明においては誘導可能なプロモーターではな
く構成的プロモーターを使用するのが好ましい。誘導可
能なプロモーターを使用して誘導操作を行った場合には
ヒト血清アルブミンが細胞内に急激に蓄積し、分子間ジ
スルフィド結合が形成されて非天然型の立体構造を有す
る分子が生成する可能性があるからである。

弱い誘発性を示すか又は構成性の酵母プロモーターの内
、強力な活性を持つものとしては、例えば、アルコール
デヒドロゲナーセ（ＡＤＨＩ　）プロモーター、グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）
プロモーター、及びグリセリン酸リン酸キナーゼ（ＰＧ
Ｋ）プロモーターがあり、本発明においては、ＡＤＨＩ
プロモーターを例にとって具体的に説明する。

酵母ＡＤＨＩ遺伝子（ＡＤＣ１）を含む約２．１００塩
基対の領域の塩基配列が既に決定されており、ＭＤＩＩ
Ｉをコードする約１．１００塩基対の配列の他に７５０
塩基対の５′側非翻訳配列と３２０塩基対の３′側非翻
訳配列が判明している（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ＋　Ｊおよ
びＨａｌｌ、Ｂ、Ｊ、Ｒｉａｌ、Ｃｈｅｍ、２５７．３
０１８　３０２５（１９Ｂ２））。

転写においてＲＮＡポリメラーゼによる認識配列と考え
られているＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボックス
（ＴＡＴＡボックス）は翻訳開始コドンＡＴＧの１２８
塩基上流（−１２８の位置）にあり、ＡＤＨＩプロモー
ター活性は−４１０の位置にあるＳｐｈ　Ｉ認識部位よ
り上流を欠失させても失われないといわれている（Ｂｅ
ｉｅｒ及びＹｏｕｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ　３００，７２４
　７２８（１９８２）　）。

八〇ＩＩ　１プロモーターによる転写物は通常の酵母菌
で全ポリ（Ａ）ＲＮＡの少なくとも１％に達する（Ａｎ
＋ｎ＋ｅｒｅｒ、Ｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、　１０１＋　１９２−２０１（１９８３）　）。

ｌ：」】ヒ二り二 転写における読み越しくｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）に
より遺伝子生成物の量が減少する例が報告されている［
例えば、Ｚａｒｅｔ、に、Ｓ、及び５ｈｅｒ＋＋＋ｅｎ
、Ｆ、＋Ｃｅ１ｌ　２８＋５６３−５７３．　（１９８
２）　］。この現象を防止するためには発現されるべき
構造遺伝子の下流にターミネータ−を設けるのが好まし
い。酵母ターミネータ−を外来遺伝子の下流に配置し、
遺伝子の発現を上昇させた例としてはたとえばＰＧＫプ
ロモーター／ターミネータ−からなるサンドインチヘク
ターを用いて子牛キモシンを発現させた実験があり、タ
ーミネータ−の導入により数倍〜十倍程度の発現上昇が
報告されている（ＭｅｌｌｏｒらＧｅｎｅ２Ａ＋　　１
−１４　（１９８３）　）。このような目的のためのタ
ーミネータ−としてはさまざまな遺伝子由来のものが使
用でき、たとえばＴＲＰ５（１−リプトファン合戊酵素
）遺伝子やＣＹＣＩ（イソ−１−チトクロームＣ）遺伝
子などのターミネータ−が利用されている。

強力なプロモーターが関与する転写の場合、リードスル
ーを防ぐために強力なターミネータ−がその下流に配置
されている方が発現の制御に好都合と考えられる。この
ため本発明においては例えば強力なプロモーターを有す
る遺伝子のターミネータ−であるＡＤＨＩターミネータ
−１ＧＡＰター嵩ネーター等を用いるのが好ましい。

ぺ１９二要素 以上、本発明の発現プラスミド中に含有される、発現に
直接関連する要素について説明したが、本発明の発現プ
ラスミドは、さらに、酵母複製起点及び標識遺伝子を含
有しなければならない。酵母複製起点としては、例えば
酵母由来の２／／ｍプラスミドＤＮＡの複製起点等を使
用することができる。

標識遺伝子としては、宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子
、宿主の栄養要求性を補完する遺伝子等、常用の標識遺
伝子を用いることができる。さらに、プラスミドの組換
え操作の際にプラスミドの複製を大腸菌中で行わせる必
要があるため、本発明のプラスミドは大腸菌複製起点及
び標識遺伝子を含有するシャトルベクターであることが
好ましい。

この様な、シャトルベクターとしての基本的要件を備え
たベクターとして市販のプラスミドｐＪＤ８２０７等を
用いることができる。このプラスミドｐＪ［１８２０７
中の酵母標識遺伝子は、ロイシン生合成酵素であるβ−
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素をコードするＬＥＩ！
　２遺伝子である。

発臭工ｉ茎ま上 従って本発明の好ましい発現プラスミドにおいては、酵
母複製起点及び標識遺伝子並びに大腸菌複製起点及び標
識遺伝子を含んでなるシャトルベクターに、プロモータ
ー、プレプロ配列をコードするり−ダー配列が連結され
たヒト血清アルブミン断片をコードする遺伝子、ポリＡ
配列及びターミネータ−がこの順序で挿入されている。

２、盈１転換 本発明のプラスミドによる宿主酵母の形質転換は常法に
従って行うことができ、その具体例を実施例９に記載す
る。

３、　　　の　　　びヒト　　アルブミン　　の堰 ヒト血清アルブミン断片ｃＤＮ＾を含んだ発現プラスミ
ドにより形質転換された宿主酵母菌は通常の酵母の培養
法により培養できる。たとえばＹＰＤのような天然完全
培地やＳＤ培地に１％の酵母エギスを加えたような不完
全合成培地でも培養できる。

培養後細胞外に分泌されたヒト血清アルブミン断片の回
収は種々の方法で可能である。エタノール、アセトン、
硫酸アンモニウムなどによる分別沈澱、等電点沈澱、限
外ろ過などによる濃縮及び部分精製を行った後に各種ク
ロマトグラフィーや上記部分精製法を組み合わせれば高
度に分泌ヒト血清アルブミン断片が精製されることが期
待できる。

正常ヒト血清アルブミンＡの全体又は大部分をコードす
るｃＤＮＡの作製方法は参考例１において具体的に記載
する。目的とする蛋白質断片をコードするＤＮＡは、そ
の全体を常法に従って化学合成することもでき、又前記
のｃＤＮＡから調製することもできる。ｃＤＮＡから調
製する場合、正常ヒト血清アルブミンＡの全体又は大部
分をコードするｃＤＮＡを、目的とする蛋白質断片をコ
ードするｃＤＮＡ領域の５′末端又は３′末端の内側で
、適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断し、不足の
末端コード配列を化学合成したＤＮＡにより補完するこ
とにより調製される。あるいは、ｃＤＮＡを、目的とす
る蛋白質断片をコードするｃＤＮＡｓＩ域の５′末端又
は３′末端外側で、適切な制限エンドヌクレアーゼによ
り切断した後、余分のＤＮＡ部分をエキソヌクレアーゼ
により除去することもできる。上記２つの方法の内５′
末端と３′末端の加工において異る方法を組み合わせて
用いることもできる。

本発明の例においては、ヒト血清アルブミンのシグナル
ペプチド及びプロペプチドとミニＩＳＡの融合蛋白質を
コードするＤＮＡとしては既に特願昭６３−２６８３０
２に記載のヒト血清アルブミンのシグナルペプチド及び
プロペプチドと全長の成熟ヒト血情アルブミン分子との
融合蛋白質をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＵｃ
−ＨＳＡ　−ＥＨからヒト血清アルブミンのシグナルペ
プチド及びプロペプチド及びヒト血清アルブミンＡのＡ
ｓｐｌ−Ｐｒｏ１５２までをコードするＤＮＡを特願昭
６３−２６８３０２に記載のプラスミドｐＵｃ−ＩＳＡ
　−１から切り出したＧ１ｕ１５３〜Ｐｒｏ３０３をコ
ードするＤＮＡ断片とを融合したものを使用する。短Ｉ
Ｈ３ＡをコードするＤＮＡとしてはヒト血清アルブミン
のカルボキシル末端側をコードする部分を欠（ｃＤＮＡ
クローンＵＳＡ−Ｈ（Ｓ６３２／２２出願分に記載）か
らヒト血清アルブミンのプレプロ配列を、大腸菌アルカ
リホスファターゼのシグナルペプチド及び短縮型ヒト血
清アルブミンの融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
むｐＡＴ−ｔｒｐ　−ｐｈｏＡ−ｔ）ＩＳＡ　（Ｈｌ、
　８／２５出願分に記載）から短縮型ヒト血清アルブミ
ン（Ｍｅｔ１２３〜Ｌｅｕ５８５）をコードする部分を
各々得て、これらを適当な方法で連結すれば完成する。

本発明の正常ヒト血清アルブミン断片をコードするＤＮ
Ａは、それ自体として発現させることもできるが、他の
ペプチドをコードするＤＮＡと連結した状態で発現せし
め、融合蛋白質を得ることができる。この様な融合蛋白
質を得る場合の融合パートナ−として種々のペプチドを
用いることができ、その１つとして例えばヒト血清アル
ブミンのリーダー配列が挙げられる。目的とするヒト血
清アルブミン断片をこの様な融合蛋白質として得る場合
には、その後、細胞内または試験管内でリーダー配列を
除去してヒト血清アルブミン断片を得ることができる。

ヒト血清アルブごン断片の発現のためには、例えば前記
のごとき融合蛋白質をコードするＤＮＡを適当な発現ベ
クター、例えばプラスミドに挿入した後、該ベクターを
宿主に導入する。発現用宿主としては動物細胞や酵母の
ごとき真核細胞、及び細菌のごとき原核細胞を用いるこ
とができ、ベクターは宿主に依存して選択される。

（発明の効果〕 本発明のＣ−末端領域を欠失したアルブミン断片は、Ｃ
−末端に存在する長鎖脂肪酸の結合部位を欠いているた
め、長鎖脂肪酸を結合せず、しかも中央領域により種々
の薬物と結合することができるという特徴を有する。他
方、Ｎ−末端領域を欠失したアルブミン断片はＣｙｓ３
４及び他の多数のシスティン残基を欠いており、蛋白質
の安定なフォールディングのために有利である。

次に、本発明のヒト血清アルブミン断片の製造について
、実施例により具体的に説明する。

なお、実施例中に特に記載しない場合、ＤＮＡの処理の
ための酵素反応は次の条件によった。

実験方法 酵素反応 各酵素反応は次の条件で行った。制限酵素ＥｃｏＲ■　
にッポンジーン；２０ユニット／ＩＩＩ）、旧ｎｄｌｌ
ｌ（宝酒造；１０ニー’−７ト／１ｔｌ）　、８ａｓ＋
ＨＩ　　（宝酒造；１２ユニット／ハ〉、Ｘｈｏｌ（宝
酒造；１２ユニット／　ｐｌ　）によるＤＮＡの消化：
ＤＮＡ２１１ｇ、酵素１１１１及び１０　Ｘ　ＥｃｏＲ
ｌ緩衝液（Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）
、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｚ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ１
）　２　ｔｔｌに滅菌蒸留水を加えて２０ｐｌとする。

３７°Ｃで１時間反応させて切ｔｔｌｉする。ＢｓｔＥ
ＩＩ　にッポンジーン：７．５ユニット／　ｐｌ　）、
ＰｓｔＩにッポンジーン；２０ユニット／ハ）の場合は
１０　Ｘ　ＥｃｏＲｌ緩衝液の代わりに１００ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｊｌ！　（ｐＨ８，０）　、７０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１ｔ　、　１．５Ｍ　ＮａＣｊ！を使用し、ＢｓｔＥ
ＩＩは６０″Ｃで、Ｐｓｔｌは３７゛Ｃでそれぞれ１時
間保温して反応させる。５Ｉｌａｌにッポンジーン；１
０ユニット／　ｐｉ　）の場合は１ＱＸＥｃｏＲＩ緩衝
液の代わりに１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐｌ！
８．０）　、７０ｍＭＭｇｃｆ２．２００ａ＋　ＫＣ／
！　４ｕｌを使用し、３７°Ｃでそれぞれ１時間保温し
て反応させる。Ｔ４リガーゼ処理は次の条件で行った。

ベクターＤＮＡ１ｇ、ベクターＤＮＡと等モル量のＤＮ
Ａフラグメント、１０Ｘリガーゼ緩衝液（６６０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　−ＦＩＣＩ！、（ｐＨ７，５）、６６ｍＭ　
ＭｇＣｌ２　ｚ　、１００ａ＋Ｍジチオスライトール、
ＩＩＩＩＭＡＴＰ）２ｔｔｌ及びＴ４１）ＮＡリガーゼ
ｌμｌ（宝酒造；約４００ユニット／１１１）に滅菌蒸
留水を加えて２０Ｊ１！とし、１６°Ｃで一晩保温する
。

ミニＩＳＡ発現プラスミドの構築は次のように行った。

まずｐＵｃ−ＩＳＡ　−ＥＨ（参考例３）からＥｃｏＲ
Ｉ　−Ｈｐａ　ＩＩで切り出した天然型Ｈ３Ａプレプロ
配列とＡｓｐｌ”−”Ｐｒｏ１５２をコードするフラグ
メント、及びｐＵｃ　−ＩＳＡ−■　（参考例５）から
Ｈｐａ　ＩＩ　−Ｐｓｔｌにより切り出したＧ１ｕ１５
３〜Ｐｒｏ３０３をコードするフラグメントを、プラス
ミドｐＨＣ１９のＥｃｏＲＩＰｓｔ１部位に挿入してプ
ラスミドｐ［Ｉｃ　−ｍＨ３ＡＥＨを作製した。このｐ
Ｈｃ　−ｍＨｓＡ　−ＥＨをプレプロ１１ｓＡ　ｃＤＮ
Ａ配列の５′端にあるＥｃｏＲ１部位で切断し、ここに
両末端がＥｃｏＲＩ粘着末端配列で内部にＸｈ。

１部位をもっ合成リンカ、−を挿入してプラスミドｐＵ
ｃ−ｍＦｌｓＡをイ乍製した。コ（７）　ｐＵｃ−ｍＨ
ｓＡからＸｈ。

１−Ｈｌｎｄ　ｌ［で切り出したフラグメント、及びｐ
Ｈｃｎ　ＩＩ　Ｓ　Ａから旧ｎｄ　ｍ　−Ｂａｍ１ｌ　
Ｉで切り出したプレプロＨ５Ａ　ｃＤＮＡの３′側配列
でポリＡシグナル及びポリＡ配列を含む領域を、プラス
ミドｐＵｃ１８ＸのＸｈｏ　ＩＢａｍＨ１部位に挿入し
てプラスミドｐｔｌｃ　−ｔａＨ５ＡＡを作製した。な
お、ここで用いたプラスミドｐＵｃ１８Ｘは、ｐＵｃｌ
ＢのＥｃｏＲ１部位に上記と同様に両末端がＥｃｏＲＩ
粘着末端配列で内部にＸｈｏ　１部位をもつ合成リンカ
−を挿入して作製したものである。

またｐυＣ−ｒ＋Ｈ５Ａは天然のプレプロｌｌ５Ａ　ｃ
ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＡＴ　−ｎｆｌｓＡ　−
Ａ　（参考例８）をＸｈｏ　Ｉ　／　Ｂａａ＋ｌｌ　Ｉ
で二重消化して、プレプロｌｌ５Ａ　ｃＤＮＡ部分を含
む断片を得て、これをｐＵｃ１８ＸをＸｈｏ　Ｉ　／Ｂ
ａｍｔｌｌで二重消化して得た大きな断片と連結して作
製したプラスミドである。次に、プラスミドｐＵｃｍＨ
５Ａ−Ａのプレプロξ二Ｉ　Ｓ　Ａ翻訳領域、ポリＡシ
グナル、ポリＡ配列を含むＸｈｏ　Ｉ　−Ｂａｎ＋ｌｌ
　ｒフラグメントを、ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｎ１ｌｓＡ　
−Ａプラスミド（このプラスミドを含有する大腸菌Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＩＩＢＩＯＩ／ｐＪＤＢ
−ＡＤＨ−ｎＨ５Ａ−Ａは工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第２４５４号（ＦＥＲＭＢＰ　−２４
５４）として１９８９年６月８日にブタペスト条約に基
き国際寄託されている。）からＸｈｏ　Ｉ〜Ｂａｍ１ｌ
　Ｅにより切り出した大きい方のフラグメントと連結し
、ｐＪＤＢ　−Ａ０＋１−　ｍＨｓＡプラスミドを作製
した。

短縮ＩＳＡ発現プラスミドの構築は以下のように行った
。まず、ヒト血清アルブ短ンのカルボキシル末端側をコ
ードする部分を欠（ｃＤＮＡクローン＋１ｓＡ・■をＥ
ｃｏＲＩで切り、生じたフラグメントをｐＵｃ１９のＥ
ｃｏＲＩサイトに挿入しプラスξドｐＵｃＨＳへ−［８
を得た。プラスミドｐｕｃ　−Ｈ５八−１１ＢからＥｃ
ｏＲＩ　−Ｔａｑ　ＩによりＩＳＡの５′側非翻訳領域
、及び天然型ＩＳＡプレプロ配列を含むフラグメントを
切り出し、プラスミドｐＵｃ１ＢのＥｃｏＲＩ−Ａｃｃ
１部位に挿入してプラスミドｐｌＪｃ−３ｉｇを作製し
た。このプラスミドｐＵｃ−Ｓｉｇから旧ｎｃＩＩによ
りＩＳＡの５′側非翻訳領域、及び天然型Ｈ３Ａプレプ
ロ配列を含むフラグメントを切り出し、プラスミドｐｓ
ＡＬＩＩ　　（参考例５）のＳｍａ　１部位に挿入して
プラスミドｐｌＪｃ−５ｉｇ　−５ＡＬＩ［を作製した
。これにより得られたプラスミドｐＵｃ−３ｉｇＳＡＬ
　ＩＩはＨ３Ａの５′側非翻訳領域、天然型Ｈ３Ａプレ
プロ配列及びＭｅｔ１２３〜Ｐｒｏ　３０３をコードす
るが、プレプロ配列とＭｅｔ１２３の間にアミノ酸でＧ
ｌｙ−５ｅｒに対応するコドンＧＧＡＴＣＣがアダプタ
ー配列として残っている。次にｐｌＪｃ−Ｓｉｇ　−Ｓ
ＡＬ■からＢｓｔＥＩＩ　−Ｐｓｔ　Ｉにより切り出し
たプレプロ配列とＧｌｙ−Ｓｅｒ及びＭｅｔ１２３〜Ｐ
ｒｏ３０３をコードするフラグメントを、前述のｐＵｃ
　−ｎＨ３ＡからＢｓｔＥＩＩＰｓｔＩにより切断して
得られる大きい方のフラグメントに連結し、プラスミド
ｐＵｃ　−ｎ５ＡＬ　Ｕを作製した。この）゛ラスξド
ｐＵｃ　−ｎ５ＡＬ　ＵからＢａｍ１ｌ　ｌ１１ｉｎｄ
ｌＩ［により切り出した大きい方のフラグメントに、ｐ
ＡＴ−ｔｒｐ　−ｐｈｏＡ−ｔＨＳＡ　（このプラスミ
ドを含有する大腸菌ＨＢＩＯＩ（ｐＡＴ　−ｔｒｐ　−
ｐｈｏＡ−ｔＨＳＡ）は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第１０９５１号（ＦＥＭＰ　Ｐ−１０５
１）として寄託されている。）からＢａｌ１ｌ（Ｉ　−
）１ｉｎｄ［ＩＩにより切り出した短縮Ｉ　Ｓ　Ａをコ
ードするフラグメントを挿入し、プラスミドｐＬＩｃ−
ｎｔＨ３八を作製した。このプラスミドｐＵｃ　＝　ｎ
　ｔｌｌｓＡからＸｈｏ　Ｉ　−ＨｌｎｄＩ［Ｉにより
切り出したプレプロ配列とｔＨＳＡをコードするフラグ
メント、及びｐｕｃ　−ｎＨ３Ａから旧ｎｄＩ［［Ｂａ
ｍＨＩにより切り出したポリＡシグナルを含むフラグメ
ントをプラスミドｐυＣｌ８ＸのＸｈｏ　Ｉ　　Ｂａｌ
１ａｌｔ　１部位に挿入し、プラスミドｐＵｃ　−ｎ　
ｔｌｌｓＡ−Ａを作製した。このプラスミドｐＵｃ　−
ｎ　ｔＨｓＡ−ＡからＸｈｏ　Ｉ　　５ＩＩＩａ　Ｉに
より切り出したフラグメントをｐＪＤＢ　−ＡＤＩＩ　
−ｎｔｌｓＡ　−ＡプラスミドからＸｈｏ　Ｉ　−Ｓｅ
ａ　Ｉにより切り出した大きい方のフラグメントと連結
し、酵母菌での発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｔｌ
ｌｓＡを作製した。

夫侮択蛋　酵旦Ｅ匡ｍ換 ＩＳＡ断片発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＩＩ　−ｍ）
ＩＳＡ及びｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｔ）ＩＳＡによる酵母菌
の形質転換は、橋本英明、木材光のＫＵＲ法〔発酵と工
業、４３゜６３（１−６３７（１９８５）　）を改変し
た方法により行った。

まず、ＹＰＤ培地〔１％酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）　、
２％バクトペプトン（Ｄｉｒｃｏ）　、２％グルコース
］５０ｄにＡＨ２２株（ＭＡＴａ　、　１ｅｕ２　３．
　１ｅｕ２−１１２．　　ｈｉｓ４−５１９．　ｃａｎ
ｌ　）のＹＰＤ培地による一晩培養液ｌ−を加え・３０
°Ｃで６００ｎｍでの吸光度が０．５に達するまで培養
した。これを４°Ｃで２０００ｒρ鵬、５分間の遠心で
集菌し、菌体を５成の０．　Ｉ　Ｍ　Ｌｉ５ＣＮに懸濁
した。次にそのうちの１．５　ｄを分取して２０００ｒ
ｐｎ＋　、５分間の遠心で集菌し、菌体を１ＯｕＩの２
ＭＬｉ５ＣＮ　、４６μｌの５０％ポリエチレングリコ
ール４０００に懸濁し、さらにＬＯｔｔｌのＤＮＡ溶液
（５−１０ｊｒｇのＤＮＡを含む）を加えて３０″Ｃで
一晩保温した。この懸濁液に５００ＪＩＺの滅菌蒸留水
を加えてポルテックスミキサーにてゆるく振とうした後
、２０００ｒｐｍ、５分間遠心して集菌し、菌体を１０
０ｕ１の滅菌蒸留水で再懸濁し選択用の寒天培地（ＳＤ
培地：２０ｎ／雌ヒスチジン塩酸塩、０．６７％アミノ
酸非含有イーストニトロゲンベース（Ｄｉｆｃｏ）　、
２％クルコースに２％の寒天を加えたもの）にまいた。

３０°Ｃで数日培養した後、生じたコロニーについて、
実施例４に示す方法でＨ３Ａ断片の発現を検出すること
により各々のＨ３Ａ断片を発現するプラスミドを含むＡ
Ｈ２２（ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｍＨ５＾）とＡｌ−１２２
（ｐＪＤＢＡＤＨ−ｔｌｌｓＡ）を得た。

実ＩＨ牝４．　　■１」１社り彰免現 前記の形質転換体Ａ１１２２　（ｐＪＤＢ　−Ａｎｔ（
−ｄＳＡ）及び八〇２２　（ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｔＨｓ
Ａ）を５　ｍｌのＹＰＤ培地で３０°Ｃで２４時間培養
した。

細胞外に分泌されたＨ３Ａ断片の検出は以下のようにし
て行った。培養液を１１０００Ｏｒｐ、５分間遠心した
後の上清を８００１ｔ１分取し、エタノール８００１を
加え水中で３０分間放置した。これを１２００Ｏｒｐｍ
、５分間遠心し、得られた沈澱を遠心エバポレーターで
乾固させた後ＳＯＳ　−ＰＡＧＥ試料用緩衝液〔２％Ｓ
Ｏ５，５％２−メルカプトエタノール、７％グリセロー
ル、０．００６２５％ブロムフェノールブルー０．０６
２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ緩衝液ｐＨ６，８）　２０ｔ
ｔｌに溶かし、５分間煮沸した。この試料ＬＯｔｔｌを
分離ゲル濃度４２０％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルにより電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉの方法：　Ｎａｔｕ
ｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２７７゜６８０　（１９７０））
　した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）によ
り染色した。

また、同様に行った電気泳動後のゲルについて、以下に
示すようにウェスタンプロッティングを行った。すなわ
ち、ＳＯ５−ＰＡＧＥ終了後のゲルをプロッティング装
置（ＴＥＦＣＯ社、Ｍｏｄｅ　１　：　ＴＣ８０８）に
よりニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−ｒａｄ社、
Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔＱ　）にプロッティングした。プ
ロッティング終了後、フィルターを３％のゼラチンを含
むＴＢＳ液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｆｆｉ　（ｐ
Ｈ７，５）　、０．５Ｍ　ＮａＣ１）で３０分間処理し
た後、ＴＴＢＳ液（０，０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む
ＴＢＳ液〕にて５分間の洗浄をＴＴＢＳ液をかえて２回
行った。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Ｈ５
Ａ抗体（カッベル社）を１％ゼラチンを含むＴＴＢＳ液
で１０００倍に希釈した溶液中にフィルターを移し、１
時間処理した。フィルターをＴＴＢＳ液で２回、ＴＢＳ
液で１回、それぞれ５分間洗浄した後、０．０１５％Ｉ
Ｉ　２０、．０．０５％ＨＲＰ−カラーデへロプメント
リージエント（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）、２０％メタノール
を含むＴＢＳ液にフィルターを移して１５分間反応させ
た。反応終了後はフィルターを水で洗浄した。

菌体内に蓄積したＩＳＡ断片の検出は以下のように行っ
た。すなわち、培養液３００　Ｉｌｌを５００Ｏｒｐｍ
、５分間遠心して集菌し、菌体を３０μｌのＳＤＳ　−
ＰＡＧＥ試料用緩衝液に懸濁し、１００″ＣＴ：１０分
間煮沸した。

この試料１Ｏｔｔｌを上と同じ方法で電気泳動してウェ
スタンブロッティングを行った。

クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色の結果を第
４図に示す。この図において、レーンｌはＩＳＡ標準、
レーン２及び６は分子量標準、レーン３はＡｔ（２２（
ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｍｔｌｓＡ）　（７）発現生成物、
レーン４は宿主ＡＨ２２の培養物、そしてレーン５は４
１１２２　（ｐＪＤＢ−ＡＤ）ｌ−ｔＨ５Ａ）の発現生
成物、につぃての結果を示す。またウェスタンブロッテ
ィングの結果を第５図に示す。この図中、レーン１は宿
主＾Ｈ２２の培養物、レーン２はＡｌ１２２　（ｐＪＤ
Ｂ−ＡＤＨ−ｔｌｌＳＡ）の培養上清、レーン３はＡ１
１２２　（ｐＪＤＢ−ＭＤＩｌｍｌＩｓＡ　）の培養上
清、レーン４はＩＳＡ標準、レーン５はＡｌ２２　（ｐ
ＪＤＢ−＾叶−ｔｌｌｓＡ）の培養細胞内蛋白質、レー
ン６はＡｌＩ２２　（ｐＪＤＢ−八ＤＨ−ｍＨＳＡ）の
培養細胞内の蛋白質、そしてレーン７は宿主ＡＩ＋２２
の細胞内蛋白質、についての結果を示す。

図に示すようにミニＨ３Ａは菌体外に分泌され、５Ｏ５
−ＰＡＧＥで分子量約３５０００のバンドとして同定さ
れた。しかし、短縮ＨＳ　Ａは培地中に少量分泌され、
菌体内に多量蓄積していた。

夫巖班至　ミニＩＳＡの　叶　び■ 前記の形質転換体ＡＨ２２（ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｍｌｌ
ｓＡ）を、グルコース５％を含むＹＰＤ培地〔１％酵母
エキス（旧ｆｃｏ）　、２％バタトペグトン（Ｄｉｆｃ
ｏ）　、５％グルコース〕４２で３０°Ｃで４０時間培
養した。この培養液１５０Ｍ！をＯ′Ｃに冷却し、これ
に−２０°Ｃのエタノールを１５００雌を加えた後０°
Ｃで３０分間攪はんした。１２０００ｒｐＨ，１５分間
の遠心により得られた沈澱を、３０ｍ１の１００ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　−１１ｃ　Ｑ　緩衝液ｐｔ＋ｓ、ｏに熔解し
た後、１００ｄの１０ｍｇ　／　ｍｌ　ＲＮａｓｅＡ　
（熱処理済）を加え室温で１５分間処理した。これを７
５０ｍＭ　ＮａＣｆｆ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ６，９に対して一晩透析した後、１８０００ｒｐ
Ｉ１１で１０分間遠心して上清を得た。この上清を高速
液体クロマトグラフィーのヒドロキシアパタイトカラム
（Ｔｏｎｅｎ　１ｌｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉＬｅＴＡＰ
Ｓｉ５２１１０　（φ２１Ｘ　１００腑）〕にかけて、
流速３　Ｉｎｌ１／ｍｉｎ　、　６０分間の１０ａ＋Ｍ
〜２００ｍＭのリン酸濃度勾配により溶出した。ξ二Ｈ
３Ａのピークの同定は２８０ｎｍの吸光度、及びＳＯ５
−ＰＡＧＥにより行った。

得られたミニＩＳＡのピークを水に対して透析した後、
凍結乾燥し、さらニ３　ｔｒｔｌ、ノ５００ｍＭ　Ｎａ
Ｃｅ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（／！　ｐＨ８，０，０
，０５％ＮａＮ、に溶解した。

この試料を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００（Ｐｈａｒ
ｍａｓｉａ社、５ｕｐｅｒ　ｆｉｎｅ　ｇｒａｄｅ（１
，６Ｘ９０ｃｍ）　）のゲル濾過カラムにかけ、試料の
溶媒と同じ溶液により、流速８、６　ｄ／ｈｒで溶出し
た。ミニＩＳＡのピークの同定は上と同様に行った。次
に、得られたミニＨ３Ａのピークを高速液体クロマトグ
ラフィーの逆相カラム（ＴＳＫ　ｇｅｌ、ｐｈｅｎｙｌ
　−５ＰＷ　ＲＰ（４，６Ｘ７６ｍｍ）　）にかけ、０
．１％トリフルオロ酢酸存在下で流速１ｍ１／ｗｉｎ　
、６０分間の０％〜７０％のアセトニトリル濃度勾配に
より溶出した。２８０ｎｓ＋の吸光度により同定した結
果ミニＩ　Ｓ　Ａは２つのピークとして検出されこれら
のピークを最終精製標品とした。

ミニＩＳＡのＮ　　アミノ　配　の 精製したミニＩＳＡの試料を凍結乾燥した後、トリフル
オロ酢酸に溶解し、アミノ酸配列自動分析機（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ　５
ｅｑｕｅｎｃｅｒ４７７Ａ）によりＮ末端アごノ酸配列
を同定した。アミノ酸配列自動分析機により同定された
２つのξ二ＩＩ　Ｓ　ＡのＮ末端アミノ酸配列はともに
以下の通りであった。

八５ｐ−Ａｌａ−Ｈｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
−Ａｌａこの配列は成熟Ｈ３ＡのＮ末端アミノ酸配列と
同一であり、ミニＩ　Ｓ　Ａの発現、分泌の際にも天然
のＩ　Ｓ　Ａと同しプロセシングが行われていることが
わかった。

ミニＨＳ　ＡのＣ１のアミノ　の 上で精製したξ二Ｈ３Ａの試料（約１　ｎｍｏｌ）を加
水分解用試験管に入れて凍結乾燥した後、無水ヒドラジ
ン（Ａｒｄ　Ｉ　ｉｃｈ社）　５０μｌを加えて、減圧
下で１００’Ｃ１５時間反応させた。室温に冷却した後
、減圧により過剰のヒドラジンを除去し、さらに減圧デ
シケータ−中で一晩乾燥した。この試料について、アミ
ノ酸自動分析機（日本電子、ＪＬＣ−３００）を用いて
アミノ酸分析を行い、Ｃ末端アミノ酸を同定した。また
、上の試料を塩酸加水分解した後アミノ酸分析を同様に
行い、試料を定量してＣ末端アミノ酸の回収率を求めた
。この結果、ミニＨ３ＡのＣ末端アミノ酸は、ヒドラジ
ン分解法により２本の精製ピークともＰｒｏと同定され
た。

構築されたミニＩＳＡはＣ末端にＰｒｏが存在するべき
なので、この結果はそれと矛盾しないものである。

ミニＨ３Ａのアミノ 上で精製したξ二ＩＳＡの試料（約１００ｐ１００ｐを
試料用試験管に入れて凍結乾燥した後、ＰＩＣＯ−ＴＡ
Ｇ　（ＴＭ）ワークステーション用反応バイアルに入れ
た。この反応バイアルに定沸点塩酸（和光純薬、精密分
析用）５００Ｊ！１を入れて、減圧下、１１０″Ｃで加
水分解した。反応時間は２４　、４８　、７２時間とし
た。

加水分解終了後、試料用試験管内の塩酸を減圧下で除去
し、得られた試料のアミノ酸組威を、アミノ酸自動分析
機（日本電子、ＪＬＣ−３００）を用いて分析した。

この結果を次の表に示す。

ビーク１　ハピーク アミノ酸　　　　実験値　　　理論値 Ａ　ｌ　ａ　　　　　　３５．０　　　　３５Ａ　ｒ　
ｇ　　　　　　１２．８　　　　１４Ａ　ｓ　ｘ　　　
　　３１．９　　　　３１Ｃｙ　ｓ　　　　　　ＮＤ　
　　　　　１９Ｇ　Ｉ　ｘ　　　　　４５．５　　　　
４２Ｇ　Ｉ　ｙ　　　　　　７．８　　　　　７Ｈｉ　
ｓ　　　　　　１１．４　　　　１０１１　ｅ　　　　
　　４．９　　　　　５Ｌｅｕ　　　　　２９．６　　
　　３２Ｌｙｓ　　　　　　２Ｂ、、３　　　　２８Ｍ
　ｅ　ｔ　　　　　　３．０　　　　　３Ｐ　ｈ　ｅ　
　　　　　１６．９　　　　１７Ｐ　ｒ　ｏ　　　　　
　１１．４　　　　１２Ｓ　ｅ　ｒ　　　　　　１０．
９　　　　１２Ｔｈｒ　　　　　　１１．７　　　　１
２Ｔｒｐ　　　　　　ＮＤ　　　　　　ＩＴｙｒ　　　
　　　７．３　　　　　８Ｖａｌ　　　　　　１４．７
　　　　１５ＮＤ＝未決定 ピー　　　　　ピー アミノ酸　　　　実験値　　　理論値 Ａ　Ｉ　ａ　　　　　　３５．０　　　　３５Ａ　ｒ　
ｇ　　　　　　１３．４　　　　１４Ａｓｘ　　　　　
３１．７　　　　３１Ｃｙ　ｓ　　　　　　ＮＤ　　　
　　　１９Ｇ　ｌ　ｘ　　　　　４５．３　　　　４２
Ｇ　ｌ　）＋　　　　　　７．５　　　　　７Ｈｉ　ｓ
　　　　　　１１．０　　　　１０Ｉ　１　ｅ　　　　
　　５．１　　　　　５Ｌ　ｅ　ｕ　　　　　３０．０
　　　　３２Ｌ　）’　Ｓ　　　　　　２８．０　　　
　２８Ｍｅｔ　　　　　　２．６　　　　　３Ｐ　ｈ　
ｅ　　　　　　１７．０　　　　１７Ｐ　ｒ　ｏ　　　
　　　１２．０　　　　１２Ｓ　ｅ　ｒ　　　　　　１
１．７　　　　１２Ｔ　ｈ　ｒ　　　　　　１１．８　
　　　１２Ｔ　ｒ　ｐ　　　　　　ＮＤ　　　　　　Ｉ
Ｔ　ｙ　ｒ　　　　　　？、６　　　　　８Ｖａｌ　　
　　　　１４．８　　　　１５ＮＤ＝未決定 前記の表から明らかなごとく、得られた実験値は理論値
とほぼ等しく、また、上に示したＮ末端アミノ酸配列及
びＣ末端アミノ酸の結果をあわセると、発現分泌された
ミニｔ（Ｓ　Ａは構築された通りの構造であった。

正常ヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮ八を含むクローンの
プラークハイブリダイゼーションによるスクリニングの
ため米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のλｇｔｌｌをベクターと
して作成されたヒト肝ｃＤＮパライブラリイーを用いた
。λｇｔｌ１組換え体ファージを大腸菌Ｙ１０９０を宿
主として感染させ、形質転換プラーク合計５．５Ｘ１０
’個をＬＢ寒天培地（ルリア培地＋１．５％寒天）上に
形成させ組換えＤＮＡをメンブランフィルタ−（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社１１ｙｂｏｎｄ　−Ｎ）に移した後、ｉｚ
ｐ放射性同位元素で標識した台底オリゴヌクレオチド３
種（比活性≧１０’ｃｐｍ／μｇ）をプローブとして用
いスクリーニングした（Ｉｌｅｎｔｏｎ　＆　Ｄａｖｉ
ｓＳｃｉｅｎｃｅ　１９６，１８０−１８２（１９７７
））　、この３種のプローブは各々Ｌａｗｎら　（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　９　＋　６ｆ０３６
１１４（１９８１）によって報告されたヒト血清アルブ
≧ンｃＤＮＡの配列のうち５′非翻訳領域（翻訳開始の
ＡＴＧコドンより１２ヌクレオチド上流からＡＴＧコド
ンの前のヌクレオチドまでの部分）と翻訳領域（アミノ
末端のメチオニンコドンすなわちＡＴＧより９番目のア
ミノ酸ロイシンをコードする部分）を含むもの（ＩＳＡ
−１）、２４８番目のグリシンから２６０番目のロイシ
ンをコードするもの（ＨＳＡ−２）、並びに５７６番目
のバリンからカルボキシル末端５８５番目のロンシンを
コードする部分とそれに続く６ヌクレオチドから成る３
′−非翻訳領域を含むもの（ＩＳＡ−３）と同じ配列で
ある。

このプローブの合成は自動ＤＮＡシンセサイザーにより
行い、標識は〔γ−”　Ｐ　）　ＡＴＰとポリヌクレオ
チドキナーゼを用いて行った。ｌ５Ａ−２で陽性のシグ
ナルを与えた２００個のλｇｔｌｌクローンのうち４個
のクローンからＤＮＡを調製（Ｂｌａｔｔｎｅｒら５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２０２．１２７９−１２８４（１９７Ｂ）
）　シ、これをＥｃｏＲＩ酵素で消化し、消化物のサザ
ーンブロ・ントをｌ５Ａ−２プローブとハイブリダイズ
させた［５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、５０３−５１７（１９７５）　）。

ハイブリダイズしたフラグメントは３つのクローンか得
られ各々１．８ｋｂ　、　１．４ｋｂ　、　１．３ｋｂ
の長さであった。このうち１．８ｋｂと１．３　ｋｂの
長さのフラグメントをｐＵｃ１９ヘクターにサブクロー
ニングした。

このサブクローンを）ＩｓＡ−１とＨＳバー３を各々プ
ローブとしてコロニーハイブリダイゼーション（Ｇｒｕ
ｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ　ｒ’ｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ。

１１ＳＡ坐、　３９６１−３９６５（１９７５））によ
りスクリーンした。この結果ｌ５Ａ−３のみにハイブリ
ダイズするクローンλｇｔｌｌ（ＨＳＡ　Ｉ−Ａ）が得
られた。このクローンの各種ＤＮＡ断片を塩基配列決定
用ヘクター門１３ｍｐ１８およびｍｐ１９　ＲＰ−ＤＮ
Ａ上に移し、グイデオキシヌクレオチドターミネーショ
ン法［Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆ、　、Ｎ１ｃｋｌｅｎ＋Ｓ、およびＣｏｕｌｓｏｎ、
Ａ、Ｒ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　７４．５４６３　５４６
７（１９７７））により塩基配列を決定した。一方ｌ５
Ａ−２をプローブとして行ったλｇｔｌｌクローンのプ
ラークハイブリダイゼーションにおいて陽性のシグナル
を与えたクローンのうち２０個についてｌ５Ａ−１をプ
ローブ゛として再びプラークハイブリダイゼーションを
行い、１個の陽性のシグナルを与えるクローンλｇｉｌ
ｌ（ＩＩＳＡ−ＩＩ　）を得た。これからファージＤＮ
Ａを調製しＥｃｏＲＩ消化物についてｌｌ５Ａ−１をプ
ローブとして用いサザーンハイプリダイゼーションを行
い１．２５ｋｂのフラグメント（ＩＳＡ−ＩＩ）がプロ
ーブとハイブリダイズすることを６Ｉ　ＬＷした。この
フラグメントの塩基配列をグイデオキシヌクレオチドタ
ーミネーション法で決定した。ＨＳＡ−■はＩＩｓ＾−
３プローブとはハイブリダイズしなかった。この結果ｌ
ｌ５Ａ−■はカルボキシル末端側をコードする部分を欠
き、ｌ５Ａ−１〜Ａはヒト血清アルブミンのアミノ末端
側をコードする部分を欠き、さらに３０４番目のセリン
をコードするコドン（ＴＣＡ）が翻訳終止コドンのオパ
ールコドンＴＧＡに変化していることがわかった。この
２つのＤＮＡフラグメントの制限酵素地図を第６図に示
す。酵素認識サイトの正確な位置は最終的な塩基配列か
ら得た。

参盈明盗　ブースミ　′　υＣ−ｌ５Ａ　−ＣＨの成熟
正常ヒト血清アルブミンへの全体をコードするＤＮＡを
含む７”／　スミＦ　ｐＵｃ−ＩＳＡ　−ＣＨを次の様
にして遺戒した。

ヒト肝ｃＤＮ＾ライブラリィ−から得たｌｌ５Ａ　ｃＤ
ＮＡを含むクローンλｇＬ１１（ＩＳＡ−■）からＥｃ
ｏＲＩとＸｂａＩ消化によって生しるフラグメントを調
製し、これをｐＵｃ１９プラスミドのＥｃｏＲＩとＸｂ
ａ　Ｉとの二重消化物のうち大きな方のフラグメントと
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて結合させ組換えプラスミ
ドｐＵｃＩＳＡ　−ＥＸを構築した。

このプラスミドからＡｈａ　ｍと５ａｉｌの二重消化に
より生ずる小さい方のフラグメントを精製した。

このフラグメントは成熟正常ヒト血清アルブミンＡ蛋白
質の１２番目のＬｙｓから３５６番目のＴｈｒまでをコ
ードする。成熟正常ヒト血清アルプξンＡ蛋白質をアミ
ノ末端からコードする遺伝子を構築するために５′端に
相当するＤＮＡ配列を、化学合成したフラグメント２本
をアニールすることにより作成した。この合成りＮＡ配
列はアルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列と融合できるようにＨｐａ　Ｉｔ及
びＣ１ａＩ酵素切断によって生ずる粘着末端配列ＣＧを
５′端側に有し、成熟正常ヒト血清アルブミンＡ蛋白質
の１番目のアミノ酸Ａｓｐから１１番目のアミノ酸Ｐｈ
ｅをコードする配列を有している。このアニールさせた
ＤＮＡ配列にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを作用させ
て５′端をリン酸化させたものと、ｐＵｃ−）１３Ａ−
ＥＸから生じたＡｈａＩＩＩ　／　Ｓａｌ　に二重消化
物とを混合し、さらにこれに大腸菌のマルチコピークロ
ーニングベクターの代表的なものの一つｐＡＴ１５３　
（Ａ＋ｗｅｒｓｈａｍ社製、Ｔｗｉｇｇ、　Ａ、Ｊ、及
び５ｈｅｒｒａｔｔ、口、　　Ｎａｔｕｒｅ　　２８３
　２１６−２１８．１９８０）　　の　Ｃ１ａ１／５ａ
ｉｌの二重消化物のうち大きなフラグメントと混合しこ
の３者を７４　ＤＮ八へガーゼにより結合させ、組換え
プラスミドｐＡＴ−１１ｓＡ　−ＣＸを得た。

このプラスミド上で正常ヒト血清アルブミンへの１位の
アミノ酸Ａｓｐから１１位のアミノ酸Ｐｈｅをコードす
るＤＮＡ配列がつながった。ｐＡＴ−１１５Ａ−ＣＸを
ＥｃｏＲＩ　／　Ｘｂａ　Ｉで二重消化し、正常ヒト血
清アルブミンＡのＡｓｐｌ＝Ｐｈｅ３５６をコードする
ＤＮＡ配列を含む小さい方のフラグメントを得た。

一方ＨＳＩＩ−Ａのカルボキシル末端側をコードするｃ
ＤＮＡは、ヒト肝ｃＤＮ＾ライブラリィ−から得たクロ
ーンλｇｔｌｌ（）ＩｓＡ　Ｉ　−Ａ　）から外来ｃＤ
ＮＡ配列の挿入されているＥｃｏＲＩフラグメントを調
製し、ｐＵｃ１８プラスミドのＥｃｏＲＩサイトに挿入
することにより組換えプラスミドｐｕｃ　−ｌ５Ａ−ビ
中にクローニングした。これによりＩＳＡ　−Ａの３５
８番目のアミノ酸Ｌｅｕからカルボキシル末端の５８５
番目のＬｅｕをコードし、さらに３′側の非翻訳領域６
２ヌクレオチドを含むＸｂａ　ｒ　／　Ｈｉｎｄ　ｍの
二重消化物を調製した。これをｐＡＴ−１１３Ａ　−Ｃ
Ｘより得たＥｃｏＲｌ　／　Ｘｂａ　に二重消化物及び
ｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ■二重消化物の
うち大きなフラグメントと混ぜてＴ４　ＤＮＡ　リガー
ゼにより連結反応を行い、成熟正常ヒト血清アルブミン
ＡのｃＤＮＡ全体を含む組換えプラスミドｐＵｃ−Ｈ５
Ａ　−ＣＨを得た。

１１１例」４　プレプロ　　　コー′　るＤＮＡの入次
の配列を有する４種類のオリゴヌクレオチド：１、　Ａ
ＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣＡＴＣ
ＴＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴ２、　　ＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡ
ＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＡＣ
ＴＴＣＡＴＧ３、　　ＣＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣ
ＴＴＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡＣＧ４
、　　ＣＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡ
ＧＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧを、ＭａｔＬｅｕｃｃｉ、　Ｍ
、Ｄ、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ，、Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２１．７１９（１９８０
）に記載されているホスホアミダイト法により、自動Ｄ
ＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモ
デル３８０Ｂ）を用いて合成した。オリゴヌクレオチド
断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５′−リン
酸化した後、アニーリングせしめ、次にＴ４　ＤＮ＾リ
ガーゼにより連結して、プレプロ配列をコードする一個
の二本鎖ＤＮＡを得た。

次に、正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡを含むプラ
スミドｐＬｌｃ−ＩＳＡ−Ｃ）Ｉ　（参考例２）を制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＣ１ａ　Ｉで二重消化して大きい方
のフラグメントを得、これを前記の合ｒｆｉ、ＤＮＡと
Ｔ４ＤＮ八リガーゼにより結合させプラスミドｐｕｃ　
−ＨＳＡＥｌｌを作成した。

５′端にＢａｍＨ！付着端をもち、３′端付近にＨｐａ
　Ｉｆ　（Ｍｓｐ　ｒ　）認識配列をもち、その二本鎖
部分がヒト血清アルブミンのＭｅｔ（１２３）−Ａｌａ
（１５１）を完全にコードする遺伝子断片の構築を以下
のように行った。大腸菌での発現を効率よくするために
大腸菌で高い効率で発現される遺伝子によってよく使用
されるコドン（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｃｏｄｏｎ
ｓ）をできるだけ多く含むよう配列をデザインした。こ
れらのコドンに対するｔＲＮ＾種は一般に大腸菌内に多
量に存在しており〔たとえば、ｒｋｅｍｕｒａ、Ｔ、Ｊ
、Ｍｏ！。

旧ｏｆ、　１５１，３８９−４０９（１９８１）　；Ｇ
ｏｕｙ、Ｍ、＆　Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｃ０Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、圭０．　７０５５−７０７
４（１９８２））　　、　翻訳効率に影響することが期
待される。

次の４種類のオリゴヌクレオチド： をＣａｒｕｔｈｅｒｓら（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ
、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋Ｍ、１１．Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２１．７１９（１９８０）
　）により開発されたホスホアミダイト法を応用した自
動台底機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデ
ル３８０Ｂ）を用いて合成した。合成されたＤＮＡ鎖（
約３０ｐａｏｌｅｓ）　５０ｓ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃ
ｊ！（ｐＨ７，６）、　　１０５Ｍ　ＭｇＣｊ！□５−
ジチオスライトール及び０．２ｓＭ＾ＴＰを含有する溶
液（５０Ｉｉ）中で６単位のＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造）存在下で３７°Ｃ１６０分間処理するこ
とにより５′一端をリン酸化した。

リン酸化されたフラグメント４本を混ぜ１００°Ｃの水
浴中に５分間保温しついで室温で放冷してアニーリング
を行った。２１１１のＴ４０ＮＡ１ノガーゼ（８００単
位、宝酒造）を加えて１６°Ｃで一晩保温しフラグメン
ト間を連結して二本鎖フラグメントとした。

次にこの二本鎖フラグメントをＨｐａ　ＩＩ　（Ｍｓｐ
　Ｉ　）で切断して９６ｂｐのフラグメントを得た。

た後、ｐＵｃ１９のＢａｍＨＩとＰｓｔｌの二重消化物
の大きい方のフラグメントとＴ４　ＤＮＡリガーゼによ
り連結しｐＳＡＬ　Ｉ［プラスミドを得た。

正常ヒト血清アルブミンのアミノ末端側をコードする部
分を欠き、さらに３０４番目のセリンをコードするコド
ンが翻訳終止コドンに変化している配列を含むλｇｔｌ
ｌヒトｃＤＮＡクローン（ＩＳＡ　−Ｉ　Ａ）（参考例
１：第６図）をＥｃｏＲＩにより切断してヒト血清アル
ブミンｃＤＮＡ部分を取出し、これをプラスミドｐＵｃ
１９のＥｃｏＲ１部位に挿入してプラスミドｐＵｃ−１
１ＳＡ　−１を作製した。

ｐＵｃ−ＩＳＡ　−１をＰｓｔｌで切断し、生じた５′
端のリン酸基をバクテリアアルカリ性ホスファターゼで
処理して除去した後、Ｈｐａ　ＩＩ　（Ｍｓｐ　Ｉ　）
で切断して７５０ｂｐのフラグメントを切り出した。こ
の７５０ｂｐのフラグメントを実施例１において合成し
た９６ｂｐのフラグメントとＴ４　ＤＮＡリガーゼでＩ
ｌｐａＩＩ（Ｍｓｐ　ｒ　）の付着末端同士の対合を利
用して結合しヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡの３′側
領域を含有するλｇｔｌｌ（ＵＳＡ　−ＩＡ）　（参考
例１、第６図）をＥｃｏＲＩにより消化してヒト血清ア
ルブミンＡのｃＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントを
得、これをＥｃｏＲＩにより切断したプラスミドｐＵｃ
１８に連結してブ７　スｌドｐＵｃ−ＩＳＡ　−１’を
得た。

１濤１１ユ　　ブースミド　ＡＴ　−ｎＨＳＡの　　　
　９　）プレプロヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮＡの５
′−非翻訳領域とコーディング領域の前半部分を含むプ
ラスミドρＵＣ−Ｈ５＾−ＥＸ　（参考例２）からプレ
プロヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮ八部骨部分ｃｏＲＩ
とＸｂａＩによる二重消化によって切り出し、ヒト血清
アルブミンＡ　ｃＤＮＡのコーディング領域の後半部分
と３′−非翻訳領域を含むプラスミドｐｕｃ　−ＩＳＡ
！′（参考例６）から切り出したＸｂａ　Ｉ　−１１ｉ
ｎｄｌＩＩフラグメントおよびｐＡＴ１５３ベクター（
Ａｍｅｒｓｈａ−社製：　Ｔｗｉｇｇ＋Ａ、Ｊ、及び５
ｈｅｒａｔｔ、Ｄ、、Ｎａｔｕｒｅ　２８３＋　２１６
２１８、１９８０）から切り出したＥｃｏＲＩ　−Ｈｌ
ｎｄＩ［Ｉフラグメントとを連結し、プラスミドｐＡＴ
−Ｈ５Ａ　−ｆ’ｌｌを得た。プレプロヒト血清アルブ
ミンＡをコードするｃＤＮＡ配列の酵母菌由来の強力な
プロモーター配列と隣接させるためにｃＤＮＡ配列の５
′末端に付けられているＥｃｏＲＩサイトとプレプロヒ
ト血清アルブミンへのシグナルペプチドをコードする配
列中三番目のアミノ酸Ｔｒｐから５番目のアミノ酸Ｔｈ
ｒのコドンにわたって存在するＢｓｔＥＩ［サイトを利
用した。プレプロヒト血清アルブミンへの５′−非翻訳
領域とシグナルペプチドのアミノ末端から３個のアよ）
酸をコードする配列とを含むＥｃｏＲｌ−ＢｓｔＥＩＩ
フラグメントをｐＡＴ−ＩＳＡ−［Ｈから切除した。残
った大きなりＮＡフラグメントを５′末端に［ｃｏＲＩ
粘着末端配列を、３′末端にＢｓｔＥＩＩ粘着末端配列
を有し、プレプロヒト血清アルブミンへのシグナルペプ
チドの三番目のアミノ酸までをコードすることのできる
合成ＤＮＡフラグメント： ＥｃｏＲＩ　　　　　　ＢｓｔＥ　ＩＩ５　’　　−Ａ
ＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＡ
ＴＴＧ−５’と連結した。すなわち、この合成フラグメ
ントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理することに
より５′−末端をリン酸化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼに
よりこの連結を行い、天然型のプレプロヒト血清アルブ
ミンＡ　ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＴ　−ｎＨ３Ａ
を作製した。

ｐＡＴ−ｎＨＳ＾（参考例７）をプレプロヒト血清アル
ブミンＡ　ｃＤＮＡ配列の５′端にあるＥｃｏＲＩサイ
トで切断し、ここに両末端がＥｃｏＲＩ粘着末端配列で
内部にＸｈｏ　Ｉサイトを含む台底リンカ−ＥｃｏＲＩ
ＸｈｏｌＥｃｏＲＩ ５　’　　−ＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧ ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡ−５’ を挿入しプラスミドｐＡＴ−Ｘ−ｎＨ３＾を作製した。

このｐＡＴ　−Ｘ−ｎｌ（ＳＡ中のプレプロヒト血清ア
ルブミンＡ　ｃＤＮＡ配列の３′末端に隣接するｐＡＴ
１５３プラスごド由来の旧ｎｄ　ｍ　−Ｂａ５ＨＩフラ
グメントを切り出し、ｐＵｃ−ＩＳＡ　−１’より切り
出したプレプロヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮＡの３′
側配列でポリＡシグナル及びポリＡ配列を含む領域とｐ
Ｕｃ１８ベクター由来の領域とを含む旧ｎｄ　Ｉ［−Ｂ
ａｍＨｒフラグメントと置換しプラスミドｐＡＴ　−ｎ
Ｈ３Ａ　−Ａを作製した。

【図面の簡単な説明】

第１−１〜ｌ−２図はミニＩＳＡ発現プラスミドｐＪＤ
Ｂ−八Ｄｆｌ　−ｍＨ５＾の作製過程を示す。 第２−１〜２−３図は短縮Ｈ３Ａ発現プラスミドｐＪＤ
Ｂ−ＡＤＨ−ｔＨｓＡの作製過程を示す。 第３図はプラスミドｐＵｃ　−ｎＨ５Ａの作製過程を示
す。 第４図は、ＡＨ２２（ｐＪＤＢ　−ＡＤＩＩ　−＋５Ｈ
ＳＡ）　（レーン３）及びＡＨ２２（ｐＪＤＢ−ＡＤ）
ｌ−ｔ）ＩｓＡ）（レーン５〉からの発現生成物の５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図であり、クマシ
ーブリリアントブルーにより蛋白質バンドを染色しであ
る。レーンｌは精製ヒト血清由来ヒト血清アルブミン、
レーン２及び６は分子量標準であり、ホスホリラーゼＢ
（分子量９４．０００）　、ウシ血清アルブミン（分子
量６７．０００）　、オバルブξン（分子量４３，００
０）　、炭酸脱水素酵素（分子量３０．０００）　、大
豆トリプシンインヒビター（分子量２０，０００）及び
ラクトアルブミン（分子量１４，４００）でありレーン
４はＨ３Ａフラグメント発現プラスミドを含まない宿主
Ａ１１２２株培養液中の蛋白質の電気泳動図である。 第５図は、ＡＨ２２（ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｔＨＳＡ）の
培養上清（レーン２）及び細胞内蛋白質（レーン５）、
ＡＨ２２（ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｍＨ５Ａ）の培養上清（
レーン３）及び細胞内蛋白質（レーン６　）　、ＡＨ２
２の培養上清（レーンｌ）及び細胞内蛋白質（レーン７
）、それに精製ヒト血清由来ヒト血清アルブミン（レー
ン４）のウェスタンプロット図であり、抗ヒト血清アル
ブミン抗体と反応した蛋白質を示す。 第６図はヒト血清アルブミンをコードするｃＤＮＡの制
限酵素地図を示す。 第７図はプラスミドρＩＣ−Ｈ５＾−ＥＨの作製過程を
示す。 第８図はプラスミドｐＳＡＬ　ＩＩの作製過程を示す。 第９図はプラス、ミドｐＡＴ　−ｎＨ５Ａの作製過程を
示す。 第１０図はプラスミドｐＡＰ　−ｎ）ＩＳＡ−Ａの作製
過程を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト血清アルブミンのＣ末端部分が欠失したヒト血
   清アルブミン断片。 ２、ヒト血清アルブミンの１位のアスパラギン酸から３
   ０３位のプロリンまでのアミノ酸配列を有する請求項１
   に記載の断片。 ３、ヒト血清アルブミンのＣ末端部分の欠失したヒト血
   清アルブミン断片と他のポリペプチドとから成る融合蛋
   白質。 ４、ヒト血清アルブミンのシグナルペプチド及びプロペ
   プチドと、ヒト血清アルブミンの１位のアスパラギン酸
   から３０３位のプロリンまでのアミノ酸配列とから成る
   請求項３に記載の融合蛋白質。 ５、ヒト血清アルブミンのＮ−末端部分が欠失したヒト
   血清アルブミン断片。 ６、ヒト血清アルブミンの１２３位のメチオニンから５
   ８５位のロイシンまでのアミノ酸配列を有する請求項５
   に記載のヒト血清アルブミン断片。 ７、ヒト血清アルブミンのＮ−末端部分が欠失したヒト
   血清アルブミン断片と他のポリペプチドとから成る融合
   蛋白質。 ８、ヒト血清アルブミンのシグナルペプチド及びプロペ
   プチドとヒト血清アルブミンの１２３位のメチオニンか
   ら５８５位のロイシンまでのアミノ酸配列とから成る請
   求項７に記載の融合蛋白質。 ９、請求項１、５に記載の蛋白質断片又は請求項３、７
   に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列。 １０、請求項９に記載のＤＮＡ配列を含有するプラスミ
   ド。 １１、前記ＤＮＡ配列の上流に、該ＤＮＡ配列を宿主内
   で効率よく発現せしめるための制御配列を含有する発現
   プラスミドである、請求項１０に記載のプラスミド。 １２、請求項１１に記載のプラスミドにより形質転換さ
   れた宿主。 １３、請求項１２に記載の宿主を培養してヒト血清アル
   ブミン蛋白質断片又は該断片を含む融合蛋白質を発現せ
   しめ、融合蛋白質を発現せしめた場合には所望により該
   融合蛋白質から該ヒト血清アルブミン蛋白質断片を切り
   出すことを特徴とする、ヒト血清アルブミン蛋白質断片
   又は該断片を含有する融合蛋白質の製造方法。