JP2001512318A

JP2001512318A - 植物における成熟タンパク質の産生

Info

Publication number: JP2001512318A
Application number: JP53599798A
Authority: JP
Inventors: ディー．ストリッフ，トーマス; エル．ロドリゲス，レイモンド
Original assignee: アプライドフィトロジックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-02-13
Filing date: 1998-02-13
Publication date: 2001-08-21
Also published as: CA2280894A1; EP0981635A1; WO1998036085A1; AU746826B2; AU6171698A

Abstract

(57)【要約】トランスジェニック単子葉植物細胞において以下のタンパク質の内の１つを産生する方法を開示する：（ｉ）成熟グリコシル化α１−アンチトリプシン（AAT）であって、ヒトにおいて産生される成熟AATと同じＮ末端アミノ酸配列、および血清の半減期を成熟非グリコシル化AATの半減期よりも実質的に増加させるグリコシル化パターンを有する、成熟グリコシル化AAT；（ｉｉ）成熟グリコシル化アンチトロンビンIII（ATIII）であって、ヒトにおいて産生される成熟ATIIIと同じＮ末端アミノ酸配列を有する成熟グリコシル化ATIII；（ｉｉｉ）成熟ヒト血清アルブミン（HSA）であって、ヒトにおいて産生される成熟HSAと同じＮ末端アミノ酸配列を有し、そしてそのビリルビン結合特性によって証拠付けられるような天然の成熟HSAのフォールディングパターンを有する成熟HSA；ならびに（ｉｖ）成熟した活性なズブチリシンBPN'（BPN'）であって、Bacillusにおいて産生されたBPN'と同じＮ末端アミノ酸配列を有する成熟した活性なズブチリシンBPN'。単子葉植物細胞は以下を有する融合タンパク質をコードするDNAコード配列を含むキメラ遺伝子で形質転換される：（ｉ）イネα−アミラーゼシグナル配列ペプチドに対応するＮ末端部分、および（ｉｉｉ）前記ペプチドのＣ末端アミノ酸に直接隣接した、産生される成熟タンパク質に対応するタンパク質部分。

Description

【発明の詳細な説明】植物における成熟タンパク質の産生発明の分野本発明は、植物細胞での成熟タンパク質の産生に関し、そして特に成熟分泌型タンパク質の産生に関する。発明の背景バイオテクノロジーの主要な商業的焦点は、工業的酵素および重要な治療用途を有するタンパク質の両方を含むタンパク質の組換え産生である。治療的タンパク質は、一般的に、微生物発現系（例えば、E.coli系および酵母系であるS.cerevisiae）により組換え的に産生される。今日までに、微生物宿主で産生される組換えタンパク質の経費は、種々の治療的に重要なタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)およびα₁アンチトリプシン(AAT)）の利用可能性を、このタンパク質の供給が不十分である程度まで限定していた。いくつかの治療的タンパク質は、最適な活性または安定性に関してはグリコシル化に依るようである。そして一般的に、微生物系は哺乳動物タンパク質をグリコシル化または適切にグリコシル化し得ないために、これらの組換え発現系の有用性もまた限定してきた。いくつかの場合では、哺乳動物特異的フォルダーゼまたは他の折り畳み条件が必要とされるため、適切なタンパク質の折り畳みが起こり得ない。ある程度は、培養された哺乳動物細胞またはトランスジェニック動物でのタンパク質発現は、微生物発現系の制限を克服し得る。しかし、タンパク質の重量あたりの経費の割合は、哺乳動物発現系においても、なお高い。そして哺乳動物ウイルスによるタンパク質汚染の危険性は、重大な統制されるべき問題であり得る。トランスジェニック動物によるタンパク質産生はまた、ある世代から別の世代への遺伝的な変化の危険性を有する。付随する危険性は、産生される組換えタンパク質の変化、例えば、異なるＮ末端残基を有する天然の活性タンパク質を生じるタンパク質プロセシングにおける変化である。それゆえ、微生物系および哺乳動物細胞系に関連する問題を大いに克服するタンパク質発現系での選択された治療的タンパク質または工業的タンパク質を産生することが所望されている。特に、タンパク質の産生は、少ない経費で、大容量の産生を可能にするべきであり、そして適切にプロセシングされ、グリコシル化されたタンパク質の産生を可能にするべきである。産生系はまた、代々比較的安定な遺伝形質を有するべきである。これらの目的は、治療的タンパク質であるAA T、HSA、およびアンチトロンビンIII(ATIII)ならびに工業的酵素であるズブチリシンBPN'について本発明において、達成される。ヒトα₁アンチトリプシンヒトα₁アンチトリプシン(AAT)は、分子量約52kDを有するモノマーである。通常のAATは、394残基を含み、アスパラギン46、83、および247に結合し、分子の表面に露出された３つの複合型オリゴ糖単位を有する(Carrell，P.ら、Nature(1 982)298:329)。 AATは、主な機能が血漿中のトリプシン、エラスターゼ、およびキモトリプシンのタンパク質分解活性を制御することである、主要な血漿プロテイナーゼインヒビターである。特に、このタンパク質は、好中球エラスターゼの強力なインヒビターであり、そしてAATの欠乏症は、慢性の肺気腫を有する多くの患者に認められる。AATの血清欠乏症を有する患者のある割合は、肝硬変および肝不全に進行し得る（例えば、Wu，Y.ら、BioEssays 13(4):163(1991)）。エラスターゼインヒビターとしてAATの重要な役割のため、そしてAAT血清レベルの欠乏を生じる遺伝性疾患の罹患率のために、ヒトの治療用途のためのAATの組換え合成における盛んな興味が存在している。現在まで、このアプローチは、上記で議論された理由のために、組換え方法によって産生されるAATに関して満足のいく状態ではなかった。ヒトアンチトロンビンIII アンチトロンビンIII（ATIII）は、トロンビンおよび第Xa因子の主要なインヒビターであり、そしてより劣っている程度であるが、凝血プロセスの間に産生される他のセリンプロテアーゼのインヒビターである（例えば、第IXa因子、第XIa 因子、および第XIIa因子）。ATIIIの阻害効果は、ヘパリンによって劇的に促進される。深部静脈血栓および肺塞栓症の病歴を有する患者では、ATIII欠乏症の罹患率は、２〜３％である。 ATIIIタンパク質は、遺伝性ATIII欠乏症を処置するに有用であり、そしてヘパリンと組み合わせて用いた場合、例えば、手術および分娩のような高い危険性を伴う状況における血栓症の予防のために、および急性の血栓症状の発現を処置するために、広範な臨床適用がある。 ATIIIは、分子量58,200、432のアミノ酸を有する糖タンパク質であり、３つのジスルフィド結合および４つのアスパラギン結合型バイアンテナリー糖鎖を含む。アンチトロンビン因子としてのATIIIの重要な役割のため、そして抗血栓症治療での広範な臨床的潜在能力のために、ヒト治療用途のためのATIIIの組換え合成における盛んな興味が存在している。現在まで、このアプローチは、上記で議論された理由のために、微生物または哺乳動物組換え方法によって産生されるAA TIIIに関して満足のいく状態ではなかった。ヒト血清アルブミン血清アルブミンは、血漿の主要なタンパク質成分である。その主な機能は、血流でのコロイド浸透圧の調節である。血清アルブミンは、Ca²⁺、Na⁺、K⁺、脂肪酸、ホルモン、ビリルビンおよび特定の薬物を含む、非常に多くのイオンおよび低分子と結合する。ヒト血清アルブミン(HSA)は、609のアミノ酸プレプロタンパク質として発現され、これは、１つのアミノ末端のペプチドおよびさらなる６つのアミノ酸残基の除去によりさらにプロセシングされ、成熟タンパク質を形成する。ヒト血清中に見出されるこの成熟タンパク質は、モノマーの、585アミノ酸長(66kDal)のグリコシル化されていないタンパク質であり、17のジスルフィド結合により維持された球状構造を有する。ジスルフィド結合のパターンは、高親和性のビリルビン結合部位を形成する、１つの小さなジスルフィド結合したおよび２つの大きなジスルフィド結合した二重ループの構造単位を形成する(Geisow，M.J.ら(1977)Bioch em．J．163:477-484)。 HSAは、血液容量を増すため、そしてショック、外傷、および手術後の回復の場合に、低い血液タンパク質レベルを上昇させるために用いられる。HSAは、しばしば、緊急事態に血圧を安定化させるために投与される。浸透圧安定因子としてHSAの重要な役割のため、そして例えば、血漿置換治療におけるその広範な臨床的潜在能力のために、ヒト治療用途のためのHSAの組換え合成における盛んな興味が存在している。このアプローチは、上記で議論された理由のために、微生物または哺乳動物組換え方法によって産生されるHSAに関して満足のいく状態ではなかった。ズブチリシンBPN' ズブチリシンBPN'(BPN')は、特に界面活性剤酵素としての用途に重要な工業的酵素である。いくつかのグループは、酵素の活性、至適pH、安定性および/または治療的用途を増強させる際に効果的である酵素のアミノ酸置換改変を報告している。 BPN'は、381のアミノ酸プレプロ酵素として発現され、分泌に必要な35のアミノ酸配列および折り畳みを容易にするシャペロンとして作用する77アミノ酸部分を含む。研究では、このプロ部分は、細胞外でトランスに作用することが示されている。現在まで、BPN'の大規模産生は、微生物発酵によるものが主である。この微生物発酵に関しては、比較的高い経費が必要である。さらに、この酵素は、至適な発酵増殖培地条件において自動分解する傾向がある。発明の要旨１つの局面において、本発明は、単子葉植物細胞での、以下からなる群より選択される成熟異種タンパク質を産生する方法を含む：(i)ヒトで産生される成熟 α1アンチトリプシン(AAT)と同一のＮ末端アミノ酸配列、および非グリコシル化成熟AATの血清半減期を実質的に超えて血清半減期を増加させるグリコシル化パターンを有する、成熟なグリコシル化されたAAT；(ii)ヒトで産生される成熟アンチトロンビンIII(ATIII)と同一のＮ末端アミノ酸配列を有する、成熟なグリコシル化されたATIII；(iii)ヒトで産生される成熟HSAと同一のＮ末端アミノ酸配列を有し、そしてそのビリルビン結合特性により証明されるような、天然の成熟ヒト血清アルブミン(HSA)の折り畳みパターンを有する成熟HSA；および(iv)Baci llusで産生されるズブチリシンBPN'(BPN')と同一なＮ末端アミノ酸配列を有する、グリコシル化されたかまたはグリコシル化されていない、成熟な活性BPN'。この方法は、以下を有するキメラ遺伝子で形質転換された単子葉植物細胞を得る工程を包含する：(i)低分子の付加もしくは除去による、または種子成熟化の間に誘導可能な単子葉植物転写調節領域；(ii)異種タンパク質をコードする第１のDNA配列；および(iii)シグナルペプチドをコードする第２のDNA配列。第２のD NA配列は、転写調節領域に、および第１のDNA配列に作動可能に連結される。第１のDNA配列は、第２のDNA配列とともに翻訳フレーム内にあり、そしてこの２つの配列が融合タンパク質をコードする。形質転換細胞は、転写調節領域を誘導するために効果的な条件下で培養され、それによって、融合タンパク質の発現および形質転換細胞からの成熟異種タンパク質の分泌を促進する。次いで、形質転換細胞によって産生されたこの成熟異種タンパク質は、単離される。この方法の１つの実施態様において、第１のDNA配列は、プロズブチリシンBPN '(proBPN')をコードし、培養工程は、pH５〜６で形質転換細胞を培養することを包含し、そして単離する工程は、proBPN'を活性な成熟BPN'に自動変換させるのに効果的な条件下でproBPN'をインキュベートすることを包含する。別の実施態様においては、第１のDNA配列は、成熟BPN'をコードし、そして細胞は以下を含む第２のキメラ遺伝子で形質転換される：(i)低分子の付加または除去による誘導可能な転写調節領域、(ii)BPN'のプロペプチド部分をコードする第３のDNA配列、および(iii)シグナルポリペプチドをコードする第４のDNA配列。第４のDNA 配列は、転写調節領域に、および第３のDNA配列に作動可能に連結される。そしてシグナルポリペプチドは、プロペプチド部分とともに翻訳フレーム内にあり、形質転換細胞から発現されるプロペプチド部分の分泌を容易にするのに効果的である。この培養工程は、pH５〜６で形質転換細胞を培養することを包含し、そして単離する工程は、プロ部分により活性な成熟BPN'へのBPN'の変換を可能にするのに効果的な条件下で成熟BPN'およびプロ部分をインキュベートすることを包含する。この方法の別の実施態様においては、シグナルペプチドは、RAmy3Dシグナルペプチド（配列番号１）またはRAmy1Aシグナルペプチド（配列番号４）である。シグナルペプチドのコード配列は、例えば、配列番号３として同定されるコドン最適化RAmy3D配列のようなコドン最適化配列であり得る。第１のDNA配列はまた、コドンを最適化され得る。例示的なコドン最適化シグナルペプチド−異種タンパク質融合タンパク質コード配列には、3D-AAT（配列番号18）、3D-ATIII（配列番号19）、および3D-HSA（配列番号20）が挙げられる。第１のDNA配列は、例えば、3D-proBPN'をコードするコドン最適化配列（配列番号21）のような、異種タンパク質の天然のアミノ酸配列に存在する１つ以上の潜在的なグリコシル化部位を排除するコドン置換をさらに含み得る。この方法の他の実施態様においては、転写調節領域は、RAmy1A、RAmy1B、RAmy 2A、RAmy3A、RAmy3B、RAmy3C、RAmy3D、RAmy3E、pM/C、gKAmy141、gKAmy155、Am y32b、またはHV18を含む、イネまたはオオムギαアミラーゼ遺伝子由来のプロモーターであり得る。キメラ遺伝子は、転写調節領域と融合タンパク質コード領域との間に、上記のイネまたはオオムギαアミラーゼ遺伝子の１つのような誘導可能単子葉植物遺伝子の5'非翻訳領域(5'UTR)をさらに含み得る。１つの好ましい5 'UTRは、RAmy1A遺伝子由来のものであり、これは、遺伝子転写物の安定性を増強するために有効である。キメラ遺伝子は、コード配列の下流に、上記のイネまたはオオムギαアミラーゼ遺伝子の１つのような誘導可能単子葉植物遺伝子由来の 3'非翻訳領域(3'UTR)をさらに含み得る。１つの好ましい3'UTRは、RAmy1A遺伝子由来である。この方法が、単子葉植物細胞培養でのタンパク質産生に用いられる場合、好ましいプロモーターは、RAmy3DおよびRAmy3E遺伝子プロモーターであり、これは、細胞培養において、糖の枯渇によりアップレギュレートされる。この遺伝子が発芽種子でのタンパク質産生に用いられる場合、好ましいプロモーターは、RAmy1A 遺伝子プロモーターであり、これは、種子発芽の間にジベレリン酸によりアップレギュレートされる。遺伝子が、種子成熟の間にアップレギュレートされる場合、好ましいプロモーターは、オオムギ胚乳特異的B1ホルデインプロモーターである。本発明はまた、上記の方法によって産生される成熟異種タンパク質を含む。このタンパク質は、タンパク質が産生される単子葉植物に特徴的であるグリコシル化パターンを有する。このグリコシル化パターンは、以下からなる群より選択される：(i)ヒトで産生された成熟α1アンチトリプシン(AAT)と同一のＮ末端アミノ酸配列を有する成熟グリコシル化AATおよび非グリコシル化成熟AATの血清半減期を実質的に超えて血清半減期を増加するグリコシル化パターンを有する成熟グリコシル化AAT；(ii)ヒトで産生された成熟アンチトロンビンIII(ATIII)と同一のＮ末端アミノ酸配列を有する成熟グリコシル化ATIII；(iii)Bacillusで産生されたズブチリシンBPN'と同一なＮ末端アミノ酸配列を有する成熟グリコシル化BP N'。本発明は、上記の方法に従って成熟異種タンパク質を産生し得る植物細胞および種子もまた含む。本発明のこれらの目的および他の目的ならびに特徴は、以下の発明の詳細を添付の図面と組み合わせて読む場合、より十分に理解される。図面の簡単な説明図１は、下部列において、配列番号１として同定される、本発明で使用される RAmy3Dシグナル配列部分のアミノ酸配列を示し；中央の列では、配列番号２として同定される、その対応する天然のコード配列を示し；および上部列では、配列番号３として同定される対応するコドン最適化配列を示す；図２は、本発明の実施態様に従って構築されたキメラ遺伝子の成分を示す；図3Aおよび3Bは、本発明の１つの実施態様に従って細胞培養にて成熟タンパク質を産生するために、単子葉植物を形質転換する際に使用するための例示的な形質転換ベクターの構築を示す（RAmy3Dプロモーターおよびシグナル配列の制御下の天然の成熟AATコード配列）；図４は、イネ細胞培養におけるAAT産生の代謝的調節の因子を示す；図５は、AATのＣ末端領域に対して惹起された抗体を用いるAATの免疫検出を示す；図６は、形質転換されたイネ細胞株18F、11B、および27Fにより産生されたAAT のウェスタンブロット分析を示す；図７は、ヒト産生形態AATおよびイネ産生形態AATのエラスターゼ:AAT複合体形成の時間経過を示す；図８は、本発明に従って産生され、本明細書中、配列番号22として同定される成熟α1アンチトリプシン(AAT)のＮ末端配列を示す；図９は、本発明に従って産生されるATIIIのウェスタンブロットを示す；図１０は、コドン最適化配列および天然のコード配列からの発現を比較した、植物産生BPN'のウェスタンブロットを示す；図11は、イネカルス細胞培養でのBPN'コドン最適化(AP106)対BPN'天然(AP101) 発現の比活性を比較する；そして図12は、本発明に従った発芽種子で産生されたHSAのウェスタンブロットを示す。配列の簡単な説明配列番号１は、RAmy3Dシグナルペプチドのアミノ酸配列である；配列番号２は、RAmy3Dシグナルペプチドをコードするネイティブ配列である；配列番号３は、RAmy3Dシグナルペプチドをコードするコドン最適化配列である；配列番号４は、RAmy1Aシグナルペプチドのアミノ酸配列である；配列番号５は、RAmy1A遺伝子由来の5'UTRである；配列番号６は、RAmy1A遺伝子由来の3'UTRである；配列番号７は、成熟α1-アンチトリプシン（AAT）のアミノ酸配列である；配列番号８は、成熟AATの配列のネイティブDNAコード配列である；配列番号９は、成熟アンチトロンビンIII（ATIII）のアミノ酸配列である；配列番号１０は、成熟ATIIIの配列のネイティブDNAコード配列である；配列番号１１は、成熟ヒト血清アルブミン（HSA）のアミノ酸配列である；配列番号１２は、成熟HSAの配列のネイティブDNAコード配列である；配列番号１３は、ネイティブプロBPN'のアミノ酸配列である；配列番号１４は、プロBPN'のネイティブDNAコード配列である；配列番号１５は、BPN'の「プロ」部分のアミノ酸配列である；配列番号１６は、ネイティブ成熟BPN'のアミノ酸配列である；配列番号１７は、全ての強力なN-グリコシル化部位が表２に従って除去されている、成熟BPN'改変体のアミノ酸配列である；配列番号１８は、RAmy3Dシグナル配列／成熟α1-アンチトリプシン融合タンパク質をコードするコドン最適化配列である；配列番号１９は、ネイティブ成熟アンチトロンビンIIIコード配列と融合したコドン最適化RAmy3Dコード配列を有する、RAmy3Dシグナル配列／成熟ATIII融合タンパク質をコードする配列である；配列番号２０は、ネイティブ成熟HSAコード配列と融合したコドン最適化RAmy3 Dコード配列を有する、RAmy3Dシグナル配列／成熟ヒト血清アルブミン融合タンパク質をコードする配列である；配列番号２１は、RAmy3Dシグナル配列／プロズブチリシンBPN'融合タンパク質をコードするコドン最適化配列である；配列番号２２は、本発明に従って作製された成熟α1-アンチトリプシンのN-末端配列である；配列番号２３は、実施例１の中間体p3DProSig構築物の調製に使用されるオリゴヌクレオチドである；配列番号２４は、配列番号２３の相補体である；配列番号２５は、実施例１の中間体p3DProSigENDlink構築物の調製に使用されるオリゴヌクレオチドである；配列番号２６は、配列番号２５の相補体である；配列番号２７は、実施例１の中間体p1AProSig構築物の調製に使用される６つのオリゴヌクレオチドの１つである；配列番号２８は、実施例１の中間体p1AProSig構築物の調製に使用される６つのオリゴヌクレオチドの１つである；配列番号２９は、実施例１の中間体p1AProSig構築物の調製に使用される６つのオリゴヌクレオチドの１つである；配列番号３０は、実施例１の中間体p1AProSig構築物の調製に使用される６つのオリゴヌクレオチドの１つである；配列番号３１は、実施例１の中間体p1AProSig構築物の調製に使用される６つのオリゴヌクレオチドの１つである；配列番号３２は、実施例１の中間体p1AProSig構築物の調製に使用される６つのオリゴヌクレオチドの１つである；配列番号３３は、実施例１に従うAATコード配列のPCR増幅に使用されるN-末端プライマーである；および配列番号３４は、実施例１に従うAATコード配列のPCR増幅に使用されるC-末端プライマーである；発明の詳細な説明Ｉ．定義：下記の用語は、明細書中で他に示さない限り、次の意味を有する。「細胞培養物」は、適切な増殖培地中で増殖しているかまたは懸濁されている、細胞および細胞の集団、典型的にはカルス細胞をいう。「発芽」は、種子の休止状態の破壊、および種子の胚乳のデンプンの効果的な分解を行う酵素の産生を含む、種子の代謝活性の回復をいう。「誘導可能」は、低分子の存在または非存在によってアップレギュレートされるプロモーターを意味する。それは間接的な誘導および直接的な誘導の両方を含む。「発芽の間に誘導可能」は、発芽の前に実質的にサイレントであるが、全体的にサイレントではなく、しかし、発芽および種子の中での発生の間、実質的に（ 25%より大）活動（turn on）であるプロモーターをいう。発芽の間、誘導可能なプロモーターの例は下記に示される。「低分子」は、プロモーター誘導の文脈において、代表的には1kDal未満の小さい有機物または生物有機分子である。そのような低分子の例は、糖、糖誘導体（リン酸誘導体を含む）、および植物ホルモン（例えば、ジベレリン酸またはアブシジン酸）を含む。「特異的に調節可能」は、例えば、低分子による、細胞内の全体的な転写の増加または減少のような、非特異的な効果とは反対に、１つのプロモーターまたはプロモーターの一群（例えば、α-アミラーゼ遺伝子ファミリー）からの転写に優先的に影響を与える低分子の能力をいう。「種子成熟」または「穀粒発生」は、受精によって開始され、そこで代謝可能な貯蔵物（例えば、糖類、オリゴ糖類、デンプン、フェノール類、アミノ酸、およびタンパク質）が、液胞を標的にするかまたはせずに、種子（穀粒）中の多様な組織（例えば、胚乳、種皮、糊粉層、および胚盤上皮（scutellar epithelium ））へ蓄積され、穀粒拡大、穀粒の充填を導き、そして穀粒の乾燥によって終了する期間をいう。「種子成熟の間に誘導可能」は、種子成熟の間に実質的に（25%より大）作動するプロモーターをいう。「異種DNA」または「外来DNA」は、別の供給源からの植物細胞、または同じ植物の供給源を含む植物の供給源であるが、通常は異種DNAの発現を調節していないプロモーターまたはターミネーターの制御下にある植物細胞に導入されたDNA をいう。「異種タンパク質」は、異種DNAによりコードされる、ポリペプチドを含むタンパク質である。「転写調節領域」または「プロモーター」は、転写の開始に影響を与えるかおよび／または促進する核酸配列をいう。プロモーターは、代表的には、エンハンサーまたはインデューサーエレメントといった調節領域を含むと考えられる。「キメラ遺伝子」は、本発明の文脈において、代表的には、異種遺伝子産物をコードするDNA配列、例えば、選択マーカー遺伝子または融合タンパク質遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。キメラ遺伝子はまた、さらなる転写調節エレメント、例えば、転写終結シグナル、および終止コドンのような翻訳調節シグナルを含み得る。「作動可能に連結する」とは、異種タンパク質を発現する単位として機能する、キメラ遺伝子または発現カセットの構成成分をいう。例えば、タンパク質をコードする異種DNAに作動可能に連結されたプロモーターは、異種DNAに対応する機能的なmRNAの産生を促進する。 DNA分子によりコードされる「産物」は、例えば、RNA分子およびポリペプチドを含む。代謝物の文脈における「除去」は、洗浄、および吸収を通しての代謝物の枯渇といった物理的除去、ならびに細胞による代謝物の代謝の両方を含む。「実質的に単離された」はいくつかの文脈で使用され、そして代表的には、関係のないまたは混在する成分を分離する、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも部分精製をいう。タンパク質またはポリペプチドの単離または精製の方法および手順は、当該分野で公知である。本発明で使用する「安定に形質転換された」とは、多くの世代を通して伝達される、そのゲノムに安定に組み込まれた外来の核酸分子を有する、穀物の細胞または植物をいう。「α1-アンチトリプシン」または「AAT」は、配列番号７により同定されるAAT タンパク質と実質的に同一かまたは相同的なアミノ酸配列を有する、プロテアーゼインヒビターをいう。「アンチトロンビンIII」または「ATIII」は、トロンビンおよび第Xa因子のヘパリン活性化インヒビターであり、そして配列番号９により同定されるATIIIタンパク質と実質的に同一かまたは相同的なアミノ酸配列を有するものをいう。「ヒト血清アルブミン」または「HSA」は、配列番号１１により同定される成熟HSAタンパク質と実質的に同一かまたは相同的なアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。「ズブチリシン」または「ズブチリシンBPN」または「BPN」は、B．amyloliqu efaciensにより天然に産生されるプロテアーゼ酵素をいい、そして配列番号１６の配列またはそれに相同な配列を有する。「プロBPN'」は、BPN'の折り畳みおよび活性化を補助するシャペロンポリペプチドとして機能する約78アミノ酸の「プロ」部分を有し、そして配列番号１３の配列またはそれに相同な配列を有する、BPN'の形態をいう。「コドン最適化」は、ネイティブコドンを、宿主植物中で最適なコドンに対応するコドンに置換するための、遺伝子のコード配列における変化をいう。 DNA配列は、それがその遺伝子のセグメントまたは領域の配列に一致する場合、例えば、イネまたはオオムギのα-アミラーゼ遺伝子に「由来する」。遺伝子由来であり得る遺伝子のセグメントは、遺伝子のプロモーター領域、5'非翻訳領域、および3'非翻訳領域を含む。II ．形質転換植物細胞本発明のプロセスに使用される植物は単子葉由来であり、特にGramineaeとして知られる分類学的ファミリーのメンバーである。このファミリーは、その食用種が穀物として知られる、草本のファミリーの全てのメンバーを含む。穀物は、コムギ（Triticum sps.）、イネ（Oryza sps.）、オオムギ（Hordeum sps.）、オートムギ（Avena sps.）、ライムギ（Secale sps.）、トウモロコシ（Zea sps .）およびキビ（Pennisettum sps.）といった広範な多様な種を含む。本発明において、好ましいファミリーメンバーはイネおよびオオムギである。ファミリーのメンバー由来の植物細胞または組織は、種々の標準的な技術（例えば、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合またはマイクロパーティクルボンバードメント）を用いて、発現構築物（すなわち、目的の遺伝子が挿入されたプラスミドDNA）を用いて形質転換される。発現構築物は、転写調節領域（プロモーター）を含む。その転写は、糖（例えば、培養培地中または植物組織（例えば、発芽種子）中のショ糖）の減少または欠乏のような、低分子の存在または非存在により、特異的にアップレギュレートされる。本発明において、パーティクルボンバードメントは、好ましい形質転換手順である。構築物はまた、植物細胞からの分泌に適した形態である、成熟異種タンパク質をコードする遺伝子を含む。組換え異種タンパク質をコードする遺伝子は、代謝的に調節されるプロモーターの制御下に置かれる。代謝的に調節されるされるプロモーターは、mRNA合成または転写が低分子またはホルモン分子によって抑制されるかまたはアップレギュレートされるプロモーターであり、例えば、イネのRA my3DおよびRAmy3Eプロモーターである。これらは細胞培養物中で糖欠乏によりアップレギュレートされる。再生されたトランスジェニック植物由来の発芽種子中のタンパク質産生のために、好ましいプロモーターは、種子が発芽する間にジベレリン酸によってアップレギュレートされる、Ramy 1Aプロモーターである。発現構築物はまた、以下で記載するように、AATの効果的な翻訳を促進するために付加的な調節DNA配列（例えば、好ましいコドン、終止配列）を利用する。Ａ．植物発現ベクター本発明の使用のための発現ベクターは、キメラ遺伝子（または発現カセット）を含む。これは植物における操作のために設計され、発現カセットから上流および下流のコンパニオン配列を有する。コンパニオン配列はプラスミドまたはウイルス起源であり、そしてベクターにバクテリアから所望される植物宿主へDNAを移動させるためにベクターに必要な特徴を提供する。適切な形質転換ベクターは、1995年５月25日に公開された、関連出願PCT WO 95/14099（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。誘導可能なプロモーター、シグナルペプチドをコードする配列、成熟異種タンパク質をコードする配列、および適切な終結配列を含む発現ベクターの適切な成分は、以下で議論される。１つの例示的ベクターは、図3Aおよび3B中に図示されるp3D(AAT)v1.0ベクターである。 A1．プロモーター転写調節領域またはプロモーター領域が、選択された培養条件下（例えば、培養物中の糖欠乏または出芽種子中の水分の取り込み、続いてジベレリン酸の産生）での誘導を可能にする様式で調節されるように選択される。適切なプロモーターおよびこれらの選択した方法は、上で援用したPCT出願WO 95/14099中で詳細にされている。このようなプロモーターの例は、穀物のα−アミラーゼ遺伝子およびスクロースシンターゼ遺伝子を転写するプロモーターを含み、そして糖のような低分子、糖欠乏、または植物ホルモン（例えば、ジベレリン酸またはアブシジン酸(absissic acid)）によって抑制されるかまたは誘導される。代表的なプロモーターは、イネα−アミラーゼRAmy1A、RAmy1B、RAmy2A、RAmy3A、RAmy3B、RA my3C、RAmy3D、およびRAmy3E遺伝子由来のプロモーター、ならびにpM/C、gKAmy1 41、gKAmy155、Amy32b、およびHV18オオムギα−アミラーゼ遺伝子由来のプロモーターを含む。これらのプロモーターは、例えば、ADVANCES IN PLANT BIOTEC HNOLOG YRyu，D.D.Y.ら編、Elsevier，Amsterdam，1994，37頁（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載される。他の適切なプロモーターは、イネおよびオオムギ由来のスクロースシンセターゼおよびスクロース−６−リン酸シンセターゼ(SPS)プロモーターを含む。他の適切なプロモーターは種子成熟条件下での誘導を可能するための様式において調節されるプロモーターを含む。このようなプロモーターの例は、以下の単子葉植物保存タンパク質：イネグルテリン、オリジン(oryzin)、およびプロラミン、オオムギホルデイン（hordein）、コムギグリアジンおよびグルテリン、トウモロコシゼインおよびグルテリン、オートムギグルテリン、およびサトウモロコシカフィリン(kafirin)、キビペニセチン(pennisetin)、およびライムギセカリン(secalin)に関連するプロモーターを含む。出芽種子における発現のための好ましいプロモーターは、イネαアミラーゼRA my1Aプロモーター（シベレリン酸によりアップレギュレートされる）である。細胞培養物中での発現のための好ましいプロモーターは、イネαアミラーゼRAmy3D プロモーターおよびαアミラーゼRAmy3Eプロモーター（培養物中で糖欠失により強くアップレギュレートされる）である。これらのプロモーターはまた、種子発芽の間活性である。成熟している種子中の発現のための好ましいプロモーターは、オオムギ胚乳特異的B1ホルデインプロモーターである(Brandt，A.ら、（1985 ）Carlsberg Res．Commun．50:333-345)。キメラ遺伝子はさらに、プロモーターとコード配列との間に、誘導可能な単子葉植物遺伝子の5'非翻訳領域(5'UTR)（例えば、上述のイネαアミラーゼ遺伝子またはオオムギαアミラーゼ遺伝子の１つ由来の5'UTR）を含み得る。１つの好ましい5'UTRは、遺伝子転写の安定性を増強するために効果的なRAmy1A遺伝子由来の5'UTRである。この5'UTRは、本明細書中の配列番号５により提供される配列を有する。 A2.シグナル配列目的のタンパク質をコードすることに加えて、キメラ遺伝子は、タンパク質のプロセシングおよび転移を可能にするシグナル配列（またはシグナルペプチド）を適切にコードする。適切なシグナル配列は上記で参考にしたPCT出願WO95/1409 9中に記載される。１つの好ましいシグナル配列は配列番号１として同定され、R Amy3Dプロモーター由来である。別の好ましいシグナル配列は配列番号４として同定され、RAmy1Aプロモーター由来である。植物シグナル配列は成熟タンパク質をコードする異種核酸を有してインフレームで配置され、シグナルペプチドに対応するN-末端領域を有する融合タンパク質をコードし、そしてシグナルペプチドのＣ末端アミノ酸、成熟異種タンパク質のＮ−末端アミノ酸に直接隣接する構築物を形成する。発現融合タンパク質は続いて分泌され、そしてシグナルペプチドと成熟タンパク質との接合部で正確にシグナルペプチダーゼによりプロセスされ、成熟異種タンパク質を産生する。本発明の別の実施態様において、融合タンパク質遺伝子中のコード配列（少なくともシグナル配列コード領域において）は、以下に記載されるような植物細胞（例えば、イネ細胞）において最適な発現のためのコドン最適化であり得る。図１中の上列は、配列番号３として本明細書中で同定されるRAmy3Dシグナル配列のための１つのコドン最適化コード配列を示す。 A3.天然に存在する異種タンパク質コード配列 (i)αアンチトリプシン：成熟ヒトAATは、配列番号７として本明細書中で同定される配列を有する394のアミノ酸から構成される。タンパク質はアスパラギン46、83、および247にＮ−グリコシル化部位を有する。対応する天然のDNAコード配列は配列番号８として本明細書中で同定される。 (ii)アンチトロンビンIII：成熟ヒトATIIIは、配列番号９として本明細書中で同定される配列を有する432のアミノ酸からなる。このタンパク質は、４つのアスパラギン残基96、135、155、および192にN-グリコシル化部位を有する。対応する天然のDNAコード配列は、配列番号10として本明細書中で同定される。 (iii)ヒト血清アルブミン：ヒト血清中で見い出されるような成熟HSAは、配列番号11として本明細書中で同定される配列を有する585アミノ酸からなる。このタンパク質はN結合化グルコシル化部位を有さない。対応する天然DNAコード配列は、配列番号12として本明細書中で同定される。 (iv)ズブチリシンBPN':B．amyloliquefaciens中で産生されるような天然のプロBPN'は、配列番号13として本明細書中で同定される配列を有する352のアミノ酸からなる。対応する天然のDNAコード配列は、配列番号14として本明細書中で同定される。プロBPN'ポリペプチドは、配列番号15として本明細書中で同定される77アミノ酸の「プロ」部分を含む。ポリペプチドの残部（成熟活性BPN'を形成する）は、配列番号16により本明細書中で同定される275のアミノ酸配列である。Bacillus中で産生されるような天然のBPN'はグリコシル化されない。Ａ４．コドン−最適化コード配列本発明の１つの局面により、植物細胞宿主中に見出される、主にまたは排他的に最も高い頻度のコドンを含むことによって異種遺伝子の天然のコード配列を改変することによって、数倍の増強の発現レベルが植物細胞培養物中で達成され得ることが発見されている。この方法は、イネ植物細胞中の異種遺伝子の発現について示され、この方法は任意の単子葉植物に一般に適用可能であることが認識されている。最初の工程として、イネ由来の公知の遺伝子コード配列の代表的な組が組み立てられる。次いで、配列はそれぞれのアミノ酸におけるコドン頻度について分析され、そして最も頻度の高いコドンがそれぞれのアミノ酸について選択される。このアプローチは初期に報告したコドンマッチング方法とは異なり、この方法では、１回を超える頻度のコドンが、少なくともいくつかのアミノ酸について選択される。イネおよびオオムギについてこの様式で選択される最適なコドンが表１に示される。上記のように、キメラ遺伝子中の融合タンパク質をコードする配列は、シグナル配列中の最終(C-末端)コドンが異種タンパク質の成熟型におけるN-末端アミノ酸のコドンに直接に続くように構築される。本発明に従って、例示的な融合タンパク質遺伝子が以下のように本明細書中で同定される：配列番号18、これは、RAmy3Dシグナル配列／成熟α１−アンチトリプシンからなる融合タンパク質のコドン最適化コード配列に対応する；配列番号19、これは、コドン最適化RAmy3Dシグナル配列および天然の成熟アンチトロンビンIII配列からなる融合タンパク質コード配列に対応する；配列番号20、これは、コドン最適化RAmy3Dシグナル配列および天然の成熟ヒト血清アルブミン配列からなる融合タンパク質コード配列に対応する；配列番号21、これは、融合タンパク質RAmy3Dシグナル配列／プロスブチリジン BPN'のコドン最適化コード配列に対応する。この場合、プロズブチリシンは「成熟」タンパク質分泌されたプロズブチリシンとみなされ、ここで活性な成熟ズブチリシンへ自己触媒し得る。好ましい実施態様において、BPN'をコードする配列は、天然のBPN'はグリコシル化されないので、強力なN-グリコシル化部位を取り除くためにさらに改変される。表２は、ズブチリシンBPN'中の全ての強力なN-グリコシル化部位を取り除く、好ましいコドン置換を示す。配列番号17は、表２に提供される置換体を含む成熟BPN'アミノ酸配列に対応する。 ^1.熱安定的に改良された；Bryanら、Proteins:Structure，Function，and Genet ics 1:326(1986)．Ａ５．転写および翻訳のターミネーターキメラ遺伝子はまた、コード配列の下流、誘導可能な単子葉植物遺伝子（例えば、上述した、一つのイネαアミラーゼ遺伝子またはオオムギαアミラーゼ遺伝子）由来の3'非翻訳領域(3'UTR)を含む。１つの好ましい3'UTRは、RAmy1A遺伝子由来の遺伝子である（この配列は配列番号６により提供される）。この配列は、ポリアデニル化部位に対する非コード配列5'、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含む。転写終結領域は、発現を増強するためのmRNAの安定性について特に選択され得る。ポリアデニル化テール(AlberおよびKawasaki,1982，Mol．an d Appl．Genet.1:419-434)はまた、高いレベルの転写を最適化するために、および転写終結を適切にするために、それぞれ、発現カセットへ一般的に加えられる。ポリアデニル化配列はAgrobacteriumオクトピンシンセターゼシグナル(Gielen ら、EMBO J．3:835-846(1984))、または同種のノパリンシンターゼ(Depickerら、Mol．Appl．Genet．1:561-573(1982))を含むが、これらに限定されない。異種タンパク質の究極的発現は、真核生物細胞（この場合、イネ科草本ファミリーのメンバー）中でおこるので、クローン化遺伝子の任意の部位が、宿主のスプライシング機構によりイントロンとしてプロセスされる配列を含むかをどうかを決定することが所望される。その場合、「イントロン」領域の部位特異的突然変異誘発は、偽イントロンコードとして遺伝子メッセージの一部の欠損を阻止するように実施され得る(ReedおよびManiatis，Cell 41:95-105(1985))。図２は、本発明に従って構築され、そしてイネ細胞懸濁液培養物におけるタンパク質発現の使用のために特に意図される、１つの好ましいキメラ遺伝子の要素を示す。この遺伝子は、5'から3'方向において、RAmy3D遺伝子由来のプロモーター（細胞培養物中で糖欠損とともに誘導され得る）、RAmy1A遺伝子由来の5'UTR （遺伝子転写物へ増強した安定性を与える）、RAmy3Dシグナル配列をコードする領域（上で同定されるような）、産生されるべき異種タンパク質のコード領域、およびRAmy1A遺伝子由来の3'UTR領域を含む。 III．植物形質転換植物の形質転換のために、キメラ遺伝子を、植物での操作のために設計した適切な発現ベクター中におく。ベクターは、DNAを細菌から所望の植物宿主に移すことをベクターが可能にするのに必要な性質をベクターに提供する、プラスミドまたはウイルス起源の適切なエレメントを含有する。適切な形質転換ベクターは、本明細書中参考として援用される、関連PCT出願WO 95/14099（1995年5月25日に公開）に記載されている。上記のキメラ遺伝子を含む発現ベクターの適切な構成要素を、下記に論ずる。１つの例示的なベクターは、実施例１に記載のp3Dv1. 0ベクターである。Ａ．形質転換ベクター本発明のキメラ遺伝子を含むベクターはまた、植物細胞において使用するための選択マーカー（例えば、カナマイシンを含有する培地における選択のためのnp tIIカナマイシン耐性遺伝子、またはホスフィノスリシン(PPT)を含む培地における選択のためのホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を含有し得る。ベクターはまた、複製起点、ならびに抗生物質および除草剤耐性遺伝子（例えば、HPH(Hagioら、Plant Cell Reports 14:329(1995);van der Elzer、Plant Mo l．Biol．5:299-302(1985))のような選択マーカーを含有する配列のような、第２の宿主におけるこれらの選択および増殖を可能にする配列を含有し得る。代表的な第２の宿主としては、細菌および酵母が挙げられる。１つの実施態様において、第２の宿主は、複製起点がcolE1型であり、そして選択的マーカーがアンピシリン耐性遺伝子をコードする遺伝子であるEscherichia coliである。このような配列は、当該分野において周知であり、そしてその上商業的に利用可能である（例えば、Clontech，Palo Alto，CA;Stratagene，La Jolla，CA）本発明のベクターはまた、Agrobacterium tumefaciensベクターと相同な領域、Agrobacterium tumefaciens由来のT-DNA境界領域、ならびにキメラ遺伝子または発現カセット（上記）を含有する中間体植物形質転換プラスミドに改変され得る。さらに、本発明のベクターは、Agrobacterium tumefaciensの無力化された植物腫瘍誘導可能プラスミドを含有し得る。実施例１に記載され、そしてRAmy3D遺伝子由来のプロモーターを有するベクターは、RAmy3Dプロモーターが細胞培地での糖の欠乏により誘導される、細胞培養中での成熟タンパク質の生産方法における使用のために適切である。他のプロモーターも上記の他の用途で選択され得る。例えば、出芽中の種子における成熟タンパク質発現について、コード配列は、種子出芽中にジベレリン酸により誘導されるイネαアミラーゼRAmy1Aプロモーターの制御下におかれ得る。Ｂ．植物細胞の形質転換植物細胞（例えば、植物プロトプラスト細胞）の直接的あるいはベクターによる形質転換の種々の方法が記載されている（例えば、上記に引用したPCT出願 WO 95/14099）。参考文献に記載されているとおり、植物形質転換に用いられる選択マーカーの発現を指向するプロモーター（例えば、nptII）は、植物宿主で効果的に作動するべきである。１つのこのようなプロモーターは、ネイティブTi プラスミド由来のnosプロモーター（Herrera-Estellaら、Nature，303:209-213( 1983)）である。他に、カリフラワーモザイクウイルスの35Sおよび19Sプロモーター（Odellら、Nature 313:810-812(1985)）および2'プロモーター（Veltenら、EMBO J．3:2723-2730(1984)）が挙げられる。１つの好ましい実施態様において、胚盤（scutulum）組織細胞を露出するため、成熟種子の胚細胞および胚乳を除去する。細胞は、DNA衝撃もしくは注入、またはベクターによる形質転換（例えば、細胞をAgrobacterium感染に対して感受性とするため、胚盤細胞をマイクロパーティクルで衝撃した後の、Agrobacteriu m感染（Bidneyら、Plant Mol．Biol.18:301-313,1992））により、形質転換され得る。１つの好ましい形質転換は、一般に、Sivamani，E.ら、Plant Cell Reports 1 5 :465(1996);Zhang，S.ら、Plant Cell Reports 15:465(1996);およびLi，L.ら、Plant Cell Reports 12:250(1993)に詳述された方法に従う。手短に言えば、イネ種子を標準的な方法で滅菌し、そして種子からのカルス誘導を、2,4Dを含む MB培地について行う。第一のインキュベーション期間中、カルス組織が種子の胚周辺に形成される。インキュベーション期間の終わり（例えば、28℃で14日間）までに、カルスは約0.25〜0.5cmの直径である。次いで、カルスの固まりを種子より引き離し、そして新しいNB培地上におき、再度、28℃で14日間インキュベーションする。第２のインキュベーション期間の後、サテライトカルスは本来の「マザー（mother）」カルスの固まりの周囲に発生する。これらのサテライトカルスは、最初の組織より、わずかにより小さく、より緻密であり、そして、より輪郭がはっきりとしている。新しい培地へ移されるのは、これらのカルスである。「マザー」カルスは、移さない。目的は、さらなる培養のために、最も強く、最も精力的に増殖する組織を選ぶことのみににある。衝撃されるカルスは、14日齢の２次培養より選択した。大きさ、形態、色および密度は全て、形質転換にとって至適な生理条件においてカルスを選択する際に重要である。カルスは、直径0.8〜1.1mmの間であるべきである。カルスは、粗い外面を有する球状の固まりとして出現するべきである。形質転換は、上記に引用した参照に詳述しているとおり、粒子衝撃により行う。形質転換の工程の後、細胞は代表的に、選択マーカー遺伝子の発現を可能にする条件下で生育した。好適な実施態様において、選択マーカー遺伝子は、HPHである。均一に安定的に形質転換した細胞株を生産するために、形質転換細胞を、多段階の選択下で培養することが好ましい。ＩＶ．成熟異種タンパク質の細胞培養産生トランスジェニック細胞（代表的にはカルス細胞）を、植物細胞の増殖を支持する条件下で、細胞が所望の細胞密度に到達するまで培養し、次いで、所定のプロモーターの制御下にある成熟タンパク質の発現を支持する条件下で培養した。好ましい培養条件を、下記および実施例２に記載した。培地に分泌された成熟タンパク質の精製は、当業者に公知である標準的な技術による。成熟AATの産生：好ましい実施態様において、培養培地は、金属により触媒されるAATの分解を減少させるために、リン酸緩衝液（例えば、20mMリン酸緩衝液p H6.8、実施例２に記載）を含有する。あるいは、または加えて、例えばEDTAのような金属キレート試薬を、培地に添加し得る。実施例２に記載の細胞培養方法に続き、細胞培養培地を部分精製し、そして図４に示すように、AATを含む画分をウエスタンブロットで分析した。初めの２レーン（「リン酸」）は、エラスターゼの存在下および非存在下（「＋Ｅ」および「−Ｅ」）の両方における、AATのバンドを示す。この場合、エラスターゼ存在下の高分子量のバンドは、およそ58〜59kdalのAAT／エラスターゼ複合体に相当する。また、図に示されるように、発現はショ糖非存在下で高く、しかしショ糖存在下でほとんど検出不可能であった。グリコシル化の程度（SDS-PAGEの見かけ上の分子量より決定される）を確認するために、培養中に産生されるタンパク質をSDS-PAGEで分画し、そして図５に示すように、AATのＣ未端部分に対し産生させた標識抗体で免疫検出した。レーン４は、ヒトAATを含み、そしてその移動位置は約52kdalに相当する。レーン３は、植物で産生したAATであり、約49〜50kdalの見かけ上の分子量を有し、グリコシル化の程度はヒトAATで見出されるグリコシル化の60〜80％に達することを示す（非グリコシル化AATの分子量は45kdalである）。同様の結果を、図６のウエスタンブロットに示した。この図のレーン１〜３は減少した量（15、10、および5ng）のヒトAATに；レーン４は非発現性の植物細胞株由来の上清10μlに；レーン５および６はAATを発現している植物細胞株11Bおよび27F由来の上清10μlにそれぞれ相当し、そしてレーン７は250ngのトリプシンを加えた細胞株27F由来の上清10μlに相当する。レーン７の上向きの移動度の変化は、トリプシンと植物で生産したAAT間の会合を示す。植物で産生したAATのエラスターゼに結合する能力を図７に示す。図７は、52k dalヒトAAT（レーン１〜４）および49〜50kdalの植物で生産したAATの、３０分結合インターバルにわたる、分子量変化を示す。成熟タンパク質が所望のＮ末端とともに分泌型として産生されることを示すために、上記のとおり構築し、そして成熟α₁アンチトリプシンのコード配列を有するキメラ遺伝子を発現し、実施例２に記載のとおり細胞培養中に分泌させた。次いで、単離したタンパク質のＮ末端領域をシーケンスし、図８に示したＮ末端配列を得た。本明細書中の配列番号22と同一であるこの配列は、ネイティブ成熟 α₁アンチトリプシンと同一のＮ末端残基を有している。成熟ATIIIの産生：好ましい実施態様において、培養培地はMES緩衝液，pH6.8 を含有する。図９のレーン４および６に示した、産生されたATIIIタンパク質のウエスタンブロット分析は、ショ糖非存在下（存在下ではない）で生育した場合、細胞株42および46において、ATIII（レーン１）に相当するバンドを示した。成熟BPN'の生産：BPN'が酵素のプロBPN'型として分泌される本発明の１つの実施態様において、酵素のシャペロン「プロ」部分は、酵素のフォールディングを促進し、そして、活性な成熟型BPN'を残して酵素より切り出される。別の実施態様において、酵素を遊離型のシャペロン存在下で生じる活性型に変換しながら（ Ederら、Biochem．（1993）32:18-26;Ederら、（1993）J．Mol．Biol．223:293- 304）、成熟酵素は「プロ」シャペロン部分と同時発現し、そして同時分泌される。本発明のさらに別の実施態様において、BPN'は、pHが6〜8の範囲であり得る場合、不活性型として分泌され、引き続き不活性型の活性化がなされる（例えば、酵素の単離後、「プロ」シャペロン部分にさらすことにより、例えば、固体支持体に固定化することにより）。これら両方の実施態様において、BPN'の活発な発現および分泌の期間の間、培養培地を、5および6の間のpHに、好ましくは約5.5に維持して、通常アルカリpH で活性なBPN'を至適活性未満のpHに保つ。コドンを宿主植物において最も頻繁にあるコドンへ最適化することは、図１１に示すように、細胞培養において発現された異種タンパク質のレベルの数倍の増強をもたらした。増強の程度は、ウエスタンブロット分析からわかる（２つの細胞株について図１０に示し、および図１１でさらに実証した）。図１０のレーン２（左より２番目）は、ネイティブプロBPN'コード配列で形質転換した細胞由来の培養物で得られたBPN'のウエスタンブロットを示す。観察された２つのバンドは、プロBPN'の分子量に相当する分子量約35kdalの低分子量タンパク質に相当する。上部のバンドは、おそらくグリコシル化された、いくらか高分子量の種に相当する。図の第１レーンは、配列番号２１で同定されるコドンを最適化したプロBPN'配列で形質転換した植物細胞による培養で生産されたBPN'ポリペプチドを示す。比較する目的のために、細胞密度を調製した、同一容量の培養培地をレーン１および２の両方に加えた。示されるように、コドンを最適化した配列では、産生されたBPN'酵素の量は、ネイティブコード配列で生産されるズブチリシンBPN'より数倍高かった。さらに、暗いバンドまたは成熟ペプチド（分子量27.5kdal）に相当するバンドが観察された。しかし、真上の35kDのバンドは、さらに活性型に切り出さる前成熟産物であり得る、より明白なバンドであることに注目すべきである。図１１は、イネカルス細胞培養でのコドンを最適化したBPN'(AP106)対ネイティブBPN'(AP101)発現物の比活性を、DelMar，E．G.ら、（1979;Anal．Biochem． 99:316-320）に記載された発色性ペプチド基質suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNAを用いアッセイし、比較する。図１１に示すように、コドンを最適化したキメラ遺伝子で形質転換された細胞株のいくつかは、培養培地の比活性を測定することより証明されるように、ネイティブプロBPN'配列で形質転換された植物細胞で観察される最も高いレベルの２〜５倍のレベルのBPN'を生産した。本発明の別の側面に従い、形質転換した植物細胞培養は、細胞培養のpHが成熟活性BPN'の自己分解を大きく阻害するpH5.5で、BPN'を発現および分泌し得ることが見出された。至適pH条件をアッセイするために、様々なpH条件下でBPN'形質転換細胞株由来の培養液を試験するため、DelMar（前出）らによって開示されたアッセイ（前出）を用いた。形質転換したイネカルス細胞は、実施例２で開示されたのと類似の条件下（しかし、培地のpHは5〜8.0の間の選択されたpHに維持される）のMES培地中で培養した。各pHにおいて、BPN'の発現および分泌の総量は、ウエスタンブロット分析により決定した。BPN'活性は、DelMarにより記載されたアッセイ（前出）により試験され得る。Ｖ．発芽中の種子での成熟異種タンパク質の生産この実施態様において、上記のとおり形質転換された単子葉細胞は、植物を再生するために用いられ、植物の種子は収穫され、次いで、出芽し、そして成熟タンパク質は出芽した種子より単離された。培養プロトプラストまたはカルス組織からの植物の再生は、標準的な方法（例えば、Evansら、HANDBOOK OF PLANT CELL CULTURES第１巻:(MacMillan Publishi ng Co．New York，1983);およびVasil I.R．（編）によるCELL CULTURE AND SOM ATIC CELL GENETICS OF PLANTS ，Acad．Press，Orlando，第I巻，1984，および第III巻，1986によって記載されたとおり）、および上記で引用されたPCT出願に記載されたとおりに行われた。Ａ．種子発芽条件再生植物より得られたトランスジェニック種子は収穫され、そして最初の浸潤（steeping）工程（ここで、水に浸した、または水を噴霧した種子は、種子の水分含有量を35〜45％の間まで増加させる）により発芽のために調製される。この工程は、発芽を開始させる。浸潤は、代表的には、種子が自由に流出することが可能なように、代表的に、円錐形の末端を備え付けられた浸潤タンクで行われる。浸潤過程に酸素を増し加えるため、圧縮空気を加えることは、選択肢である。温度は、種子に依存して、約22℃で制御される。浸潤の後、種子は、水分で飽和した空気を含み、そして制御された温度および空気流下にある発芽コンパートメントに移される。代表的な温度は、12〜25℃の間であり、発芽は3〜7日間継続させておく。異種タンパク質をコードする遺伝子が、糖または植物ホルモンのような代謝産物（例えば、2〜100μMのジベレリン酸）を必要とする誘導プロモーターに、作動可能に連結された場合、この代謝産物は、浸潤水媒体に添加、除去もしくは涸渇させられ、および／または発芽中に用いられた水分で飽和した空気に加えられる。種子は水性媒体を吸収し、そして発芽を始め、異種タンパク質を発現する。次いで、媒体は回収され得、そして種子を湿度温度を制御した通気した環境下に維持することにより、モルト化（malting）が開始され得る。このようにして、種子は、発現に先立ち成長を開始し得るので、発現産物は、過程の間に部分的に分解または変性される可能性がより少なくなる。より具体的には、吸収または浸潤期の間の温度は、約15〜25℃の範囲内に保たれ、一方、発芽中の温度は通常約20℃である。吸収の時間は、通常約1〜4日間である、一方、発芽の時間は通常さらなる1〜10日、より通常には3〜7日間である。通常、モルト化の時間は、約10日を越えることはない。モルト化の期間は、吸収中に植物ホルモン（特に、ジベレリン酸）を用い、短縮され得る。モルト化より組換えタンパク質の最大量の生産を達成するために、モルト化手順は、上記に引用したPCT出願WO 95/14099に記載されたように、外皮を取り除いた、および胚を取り除いた種子へ適応するように変更され得る。胚乳由来の糖の非存在下において、RAmy3Dプロモーター活性、従って、異種タンパク質の発現が 5〜10倍上昇することが予想される。あるいは、胚のない半分の種子を、10mM Ca Cl₂および5μMジベレリン酸中でインキュベートすると、RAmy1Aプロモーター活性は50倍上昇する。成熟HSAの生産：上記に概要を述べ、および実施例３により詳細に述べた発芽条件に従い、上清をウエスタンブロットにより分析した。ウエスタンブロット分析により、発芽中のイネ種子におけるHSAの生産が示される（種子サンプルは、ジベレリンによる誘導の、24，72，120時間後に採取した）。HSAの生産は、誘導後約24時間後に、最も高かった（図12、レーン3および4）。ビリルビン（biliru bin）の結合（植物で生産されたHSAの正確な折りたたみを測定）は、実施例３に示した方法に従ってアッセイされる。ＶＩ．成熟中の種子における成熟異種タンパク質の産生本実施態様においては、上記のとおり形質転換された単子葉細胞が、植物を再生するために用いられ、そしてこの植物からの種子が、結果として種子中での異種タンパク質の生産を伴って成熟すること（代表的には圃場で）を可能とする。例えば、異種タンパク質が全体として種子に利点を与えることを意図される（例えば、種子を選択されたタンパク質で富化する）場合、種子の成熟に続き、種子およびその異種タンパク質は、直接、すなわちタンパク質の単離なしに、用いられ得る。あるいは、種子は、標準的な方法により、富化されたあるいは精製された形態で異種タンパク質を得るために、分画され得る。１つの一般的なアプローチとしては、第一に種子を粉砕し、次いで、目的のタンパク質あるいは代謝産物を抽出するために、種子を適切な抽出媒体（例えば、水性あるいは有機性溶媒）に懸濁する。もし望まれる場合、異種タンパク質は、標準的な精製方法を用いて、さらに分画および精製され得る。以下の実施例は、限定するためではなく、例示のためのみに提供される。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすために変更され得るあるいは修正され得る多種の重要でないパラメーターを、容易に認識する。一般的な方法一般的に、標準的な組換えＤＮＡの技法に関する命名法および実験室手順は、 Sambrookら、MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor La boratory，Cold Spring Harbor，New York 1989ならびにS.B．GelvinおよびR.A ．Schilperoot，PLANT MOLECULAR BIOLOGY，1988に見出され得る。他の一般的な参照は、本書類中の至る所に提供している。本明細書中の手順は、当該分野で公知であり、読者の便宜のため提供する。実施例１コドンを最適化したα₁アンチトリプシン配列を含む形質転換ベクターの構築Ａ．ハイグロマイシン耐性遺伝子の挿入 35Sプロモーター-Hph-NOSを含む3kbのBamHIフラグメントをプラスミドpMON410 (Monsanto，St．Louis，MO)より切り出し、部位特異的変異導入をしたpUC18の14 63位のBglII部位へ配置し、プラスミドpUCH18+を形成した。Ｂ．ターミネーターの挿入 pOSg1ABK5は、pBluescript KS-(Stratagene，San Diego，CA)にクローン化されたラムダクローンλOSg1A(Huang,N.,ら、（1990）Nuc．Acids Res．18:7007) 由来の5kb BamHI-KpnIフラグメントである。プラスミドpOSg1ABK5をMspIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、その後、SpeIで消化した。350bpのターミネーターフラグメントを、BamHIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化し、そしてXbaIで消化しておいたpUC19(New England BioLabs，Beverly，MA)にサブクローン化し、pUC19/ターミネーターを形成した。Ｃ． RAmy3D プロモーターの挿入 p1AS1.5(Huang，N.ら、（1993）Plant Mol．Biol．23:737-747)由来の1.1kbの NheI-PstIフラグメントをベクターpGEM5zf-［多重クローニング部位(MCS)(Prome ga，Madison，WI):ApaI，AatII，SphI，NcoI，SstII，EcoRV，SpeI，NotI，PstI ，SalI，NdeI，SacI，MluI，NsiI］のSpeIおよびPstI部位にクローン化し、pGEM 5zf-(3D/NheI-PstI)を形成した。次いで、pGEM5zf-(3D/NheI-PstI)をPstIおよび SacIで消化し、そして相補的配列、5' GCTTG ACCTG TAACT CGGGC CAGGC GAGCT 3 '(配列番号23)および5' CGCCT AGCCC GAGTT ACAGG TCAAG CAGCT3'(配列番号24) を有する２つのキナーゼ未処理30マーをその中に連結し、p3DProSigを形成した。p3DProSigのNcoI消化、T4 DNAポリメラーゼによる平滑化、およびSs tI消化により調製されたプロモーターフラグメントを、EcoRI消化、T4 DNAポリメラーゼによる平滑化、およびSstI消化したpUC19/ターミネーターにサブクローン化し、p3DProSigENDを形成した。Ｄ．多重クローニング部位の挿入 p3DProSigENDをSstIおよびSmaIで消化した後、キナーゼ未処理相補オリゴヌクレオチド（5' AGCTC CATGG CCGTG GCTCG AGTCT AGACG CGTCC CC 3'(配列番号25) および5' GGGGA CGCGT CTAGA CTCGA GCCAC GGCCA TGG 3'(配列番号26)）を用いて構築された新しい合成リンカーフラグメントを連結し、p3DProSigENDlinkを形成した。Ｅ． p3DProSigENDlink 側方部位の改変 p3DProSigENDlinkをSalIで消化し、そしてT4 DNAポリメラーセで平滑化した後、EcoRVで消化した。次いで、HindIII部位がプロモーター配列の近位にあり、そしてEcoRI部位がターミネーター配列の近位にあるように、平滑フラグメントを、pBluescript KS+(Stratagene)のEcoRV部位に連結した。次いで、HindIII-EcoR IフラグメントをpUCH18+のポリリンカー内に移し、p3Dv1.0発現ベクターを形成した。Ｆ． RAmy1A プロモーターの挿入ラムダクローンλOSg2(Huangら、（1990）Plant Mol．Biol．14:655-668)由来のサブクローンpOSG2CA2.3由来の1.9kb NheI-PstIフラグメントを、SpeIおよびP stI部位でベクターpGEM5zf-にクローン化し、pGEM5zf-(1A/NheI-PstI)を形成した。pGEM5zf-(1A/NheI-PstI)をPstIおよびSacIで消化し、そして２つのキナーゼ未処理35マーおよび４つのキナーゼ処理32マーを以下のような相補配列と連結し、p1AProSigを形成した：5' GCATG CAGGT GCTGA ACACC ATGGT GAACAAACAC 3'(配列番号27)；5' TTCTT GTCCC TTTCG GTCCT CATCG TCCTC CT3'(配列番号28)；5' T GGCC TCTCC TCCAA CTTGA CAGCC GGGAG CT 3'(配列番号29)；5' TTCAC CATGG TGT TC AGCAC CTGCA TGCTG CA3'(配列番号30)；5' CGATG AGGAC CGAA A GGGAC AAGAA GTGTT TG 3'(配列番号31)；5' CCCGG CTGTC AAGTT GGAGG AGAGG CCAAG GAGGA 3'(配列番号32)。HindIII-SacI 0.8kbプロモーターフラグメントを、p1AProSigより、HindIII-SacIで消化したp3Dv1.0ベクターにサブクローン化し、p1Av1.0発現ベクターを得た。Ｇ． p3D-AAT プラスミドの構築 Genebank登録番号K01396番として開示された配列に従い、AATをコードするフラグメントを増幅するために、２つのPCRプライマーを用いた：Ｎ末端プライマー5' GAGGA TCCCC AGGGA GATGC TGCCC AGAA3'(配列番号33)およびＣ末端プライマー5' CGCGC TCGAG TTATT TTTGG GTGGG ATTCA CCAC3'(配列番号34)。Ｎ末端プライマーは、p3Dシグナルペプチドの末端とのインフレーム挿入のための平滑部位を増幅し、そしてＣ末端プライマーは、図３Ａおよび図３Ｂに示されるようにフラグメントをベクターへクローニングするためのXhoI部位を含む。あるいは、成熟AAT（配列番号8）またはコドンを最適化したAATをコードする配列は、上記の発現ベクターへの挿入のために終結コドンの3'にXhoI制限部位を組み入れ、当該分野で公知である技法を用いて、化学的に合成され得る。実施例２細胞培養物における成熟αアンチトリプシンの生産トランスジェニックカルスの選択の後、カルス細胞を、AA2培地（Thompson，J .A.，ら、Plant Science 47:123(1986)，3%ショ糖、pH15.8）を含む液体培養物中に懸濁した。その後、細胞を、10mLマルチウエル（multi-well）組織培養プレートを用いるリン酸緩衝化媒体（20mMリン酸緩衝液、pH6.8）に移し、暗所にて、48時間、120rpmで振盪した。その後上清を取り出し、ウエスタンブロッティング分析の前に、-80℃で貯蔵した。上清をセントリコン(Centricon)-10フィルター（Amicon cat．#4207）を用いて濃縮し、そして誘導媒体で洗浄し、電気泳動移動を妨げる物質を取り除いた。サンプルを約１０倍に濃縮し、成熟AATをSDS PAGE電気泳動で精製した。精製タンパク質を電気泳動媒体より抽出し、そのＮ末端の配列を決定したところ、本明細書中で配列番号２２と同定した、図８に示す配列を示した。実施例３発芽中の種子でのHSA誘導 GA₃-応答性RAmy1Aプロモーターにより駆動されるコドン最適化したHSA遺伝子の存在につき陽性と検定されたトランスジェニック植物の選択の後、種子を収穫し、25℃の暗所にて、100rpmで24時間回転振盪しつつ吸水させた。GA₃を終濃度5 μMになるよう加え、さらに24〜120時間インキュベートした。120μl粉砕緩衝液中で各種子を２度粉砕し、23,000×gで4℃、１分間遠心することにより、全可溶性タンパク質を単離した。透明上清を、注意深くペレットより取り除き、新しいチューブに移した。ビリルビン結合アッセイ成熟HSAにおけるその高親和性部位に対するビリルビン結合を、Jacobsen，J. ら（1974;Clin．Chem．20:783）およびReed，R.G．ら（1975;Biochemistry 14:4 578-4583）に記載された方法を用いてアッセイする。手短に言えば、タンパク質結合型ビリルビンと平衡状態にある遊離型ビリルビンの濃度を、過酸化物−ペルオキシダーゼの触媒による遊離型ビリルビンの酸化速度により決定する。ビリルビン（Nutritional Biochemicals Corp.）のストック溶液を、毎日新たに5mM水酸化ナトリウムを含む1mM EDTAで調製し、そして濃度を、440nmでの47,500M^-1cm^-1 のモル吸光度を用いて決定する。5から30nmolの間のビリルビンを含むアリコートを、37℃で、1mlのPBSおよび約30nmol HSAを含有するlcmキュベットに加える。500から350nm間の吸収スペクトルを記録する。セイヨウワサビペルオキシダーセ（Sigma）（PBS中に0.05mg/ml）および0.05％のヒドリコートを加え、そしてλmaxにおける吸光度の変化を、３〜５分間記録する。異なる全ビリルビン濃度を用いて観察された酸化速度より計算された遊離型および結合型のビリルビンの濃度を用いて、スキャッチャードプロットを作成し、ここから単独結合部位での会合定数を決定する。本発明は、特定の実施態様に関して記載されたが、本発明より外れることなく、多くの変更および修正がなされ得ることが、理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (31)優先権主張番号６０／０３８，１６９ (32)優先日平成９年２月13日(1997．2．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０３８，１７０ (32)優先日平成９年２月13日(1997．2．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ【要約の続き】遺伝子で形質転換される：（ｉ）イネα−アミラーゼシグナル配列ペプチドに対応するＮ末端部分、および（ｉｉｉ）前記ペプチドのＣ末端アミノ酸に直接隣接した、産生される成熟タンパク質に対応するタンパク質部分。

Claims

【特許請求の範囲】１．以下：（ｉ）成熟グリコシル化α1−アンチトリプシン（AAT）であって、ヒトにおいて産生される成熟AATと同じＮ末端アミノ酸配列、および血清の半減期を成熟非グリコシル化AATの半減期よりも実質的に増加させるグリコシル化パターンを有する、成熟グリコシル化AAT；（ｉｉ）成熟グリコシル化アンチトロンビンIII（ATIII）であって、ヒトにおいて産生される成熟ATIIIと同じＮ末端配列を有する成熟グリコシル化ATIII；（ｉｉｉ）成熟ヒト血清アルブミン（HSA）であって、ヒトにおいて産生される成熟HSAと同じＮ末端アミノ酸配列を有し、そしてそのビリルビン結合特性によって証拠付けられる様な天然の成熟HSAのフォールディングパターンを有する成熟HSA；ならびに（ｉｖ）成熟した活性なズブチリシンBPN'（BPN'）であって、Bacillusにおいて産生されたBPN'と同じＮ末端アミノ酸配列を有する成熟した活性なズブチリシンBPN'；からなる群から選択された成熟異種タンパク質を、単子葉植物細胞において、生成する方法であって、該方法は以下：（ａ）（ｉ）低分子の添加もしくは除去によって、または種子の成熟化の間に、誘導可能な単子葉転写調節領域、（ｉｉ）異種タンパク質をコードする第１の DNA配列、および（ｉｉｉ）シグナルペプチドをコードする第２のDNA配列、を有するキメラ遺伝子で形質転換された単子葉植物細胞を得る工程であって、該第１のDNA配列および第２のDNA配列が翻訳フレーム内にあり、そして融合タンパク質をコードし、そしてここで（ｉ）該転写調節領域は該第２のDNA配列に作動可能に連結されており、そして（ｉｉ）該シグナルペプチドは該形質転換細胞から成熟異種タンパク質の分泌を容易にするのに有効である工程；（ｂ）該転写調節領域を誘導するのに有効な条件下で該形質転換細胞を培養する工程であって、それによって該融合タンパク質発現、および該成熟異種タンパク質の該形質転換細胞からの分泌を促進させる工程；ならびに（ｃ）該形質転換細胞によって生成された該成熟異種タンパク質を単離する工程、を包含する方法。２．請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１のDNA配列はプロBPN'をコードし、前記培養工程は該形質転換細胞からプロBPN'の発現および分泌を促進するために５〜６の間のpHで該形質転換細胞を培養する工程を包含し、そして前記単離工程はプロBPN'の活性な成熟BPN'への自動変換を可能にするのに有効な条件下でプロBPN'をインキュベートする工程を包含する方法。３．請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１のDNA配列が成熟BPN'をコードし、そして該方法がさらに以下：（ｉ）低分子の添加もしくは除去によって、または種子の成熟化の間に、誘導可能な転写調節領域、（ｉｉ）BPN'のプロペプチド部分をコードする第３のDNA 配列、ならびに（ｉｉｉ）シグナルポリペプチドをコードする第４のDNA配列を含む第２のキメラ遺伝子で前記細胞を形質転換する工程であって、ここで該第４のDNA配列が、該転写調節領域および該第３のDNA配列に作動可能に連結されており、ここで該シグナルポリペプチドは該プロポリペプチド部分と翻訳フレーム内に存在し、そして前記形質転換細胞から発現されたプロペプチド部分の分泌を容易にするのに有効である、工程、を包含し；前記培養工程が、該形質転換細胞からのBPN'およびプロペプチド部分の発現および分泌を促進するために５〜６の間のpHで該細胞を培養することを包含し；そして前記単離工程が、BPN'を活性な成熟BPN'への変換を可能にするのに有効な条件下で該BPN'および該プロ部分をインキュベートすること、および該活性な成熟BPN'を単離することを包含する、方法。４．前記シグナルペプチドが、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列を有するRAmy3Dシグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。５．前記第２のDNA配列が、RAmy3Dシグナルペプチド（配列番号１）をコードし、そして配列番号３によって同定されるコドン最適化ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。６．前記シグナルペプチドが、配列番号４によって同定されるアミノ酸配列を有するRAmy1Aシグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。７．前記第２のDNA配列、前記第１のDNA配列、または該第２および該第１のDN A配列の両方が、前記植物において増強された発現のためにコドン最適化されている、請求項１に記載の方法。８．前記転写調節領域が、RAmy1A、RAmy1B、RAmy2A、RAmy3A、RAmy3B、RAmy3C 、RAmy3D、およびRAmy3E、pM/C、gKAmy141、gKAmy155、Amy32b、ならびにHV18遺伝子からなる群から選択される、イネまたはオオムギα−アミラーゼ遺伝子由来のプロモーターである、請求項１に記載の方法。９．前記キメラ遺伝子が、前記転写調節領域と前記第２のDNAコード配列との間に、RAmy1A、RAmy3B、RAmy3C、RAmy3D、HV18、およびRAmy3Eからなる群から選択される、誘導可能単子葉植物遺伝子の5'非翻訳領域をさらに含む、請求項８に記載の方法。１０．前記キメラ遺伝子が、前記融合タンパク質をコードする配列の下流に、 RAmy1A、RAmy1B、RAmy2A、RAmy3A、RAmy3B、RAmy3C、RAmy3D、およびRAmy3E、pM /C、gKAmy141、gKAmy155、Amy32b、ならびにHV18遺伝子からなる群から選択される、イネまたはオオムギα−アミラーゼ遺伝子由来誘導可能単子葉植物遺伝子の 3'非翻訳領域をさらに含む、請求項８に記載の方法。１１．前記培養工程が、前記形質転換植物細胞を糖を含まない培地または糖欠乏培地中で培養することを包含する、請求項１に記載の方法であって、前記転写調節領域が前記RAmy3EまたはRAmy3D遺伝子由来であり、前記5'非翻訳領域がRAmy 1A遺伝子由来であってかつ配列番号５によって同定される配列を有し、そして前記3'非翻訳領域がRAmy1A遺伝子由来である、方法。１２．前記形質転換細胞が成熟種子の糊粉細胞であり、前記転写調節領域が種子の発芽を促進する低分子の添加によってアップレギュレートされ、そして前記培養工程が胚を有する形態または胚を有さない形態のいずれかの該種子を発芽させることを含む、請求項１に記載の方法。１３．前記転写調節領域がイネα−アミラーゼRAmy1AプロモーターまたはオオムギHV18プロモーターであり、そして前記低分子がジベレリン酸である、請求項 12に記載の方法。１４．請求項１に記載の方法によって作製される成熟異種タンパク質であって、ここで該タンパク質が、以下：（ｉ）成熟グリコシル化α１−アンチトリプシン（AAT）であって、ヒトにおいて産生される成熟AATと同じＮ末端アミノ酸配列を有し、そして血清の半減期を成熟非グリコシル化AATの半減期よりも実質的に増加させるグリコシル化パターンを有する、成熟グリコシル化AAT；（ｉｉ）成熟グリコシル化アンチトロンビンIII（ATIII）であって、ヒトにおいて産生される成熟ATIIIと同じＮ末端アミノ酸配列を有する成熟グリコシル化A TIII；ならびに（ｉｉｉ）成熟したグリコシル化ズブチリシンBPN'（BPN'）であって、Bacill usにおいて産生されたBPN'と同じＮ末端アミノ酸配列を有する成熟グリコシル化ズブチリシンBPN'；からなる群から選択され、ここで該タンパク質が前記単子葉植物において作製されるタンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する、成熟異種タンパク質。１５．前記単子葉植物細胞が、形質転換されたイネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ、オートムギ、ライムギ、サトウモロコシ、またはキビ細胞である、請求項１に記載の方法。１６．前記単子葉植物細胞が形質転換されたイネまたはオオムギ細胞である、請求項１に記載の方法。１７．請求項１に記載の方法に従って、前記成熟異種タンパク質を産生し得る植物細胞であって、ここで前記培養工程が該形質転換植物細胞を糖を含まない培地または糖欠乏培地中で培養することを含み、前記転写調節領域がRAmy3Eまたは RAmy3D遺伝子由来であり、5'非翻訳領域がRAmy1A遺伝子由来であって、かつ配列番号５によって同定される配列を有し、そして3'非翻訳領域がRAmy1A遺伝子由来である、植物細胞。１８．請求項１に記載の方法に従って、前記成熟異種タンパク質を産生し得る種子であって、ここで前記形質転換細胞が糊粉細胞であり、前記転写調節領域が種子の発芽を促進する低分子の添加によってアップレギュレートされ、そして前記培養工程が胚を有する形熊または胚を有さない形態のいずれかの該種子を発芽することを含む、種子。