DE69233501T2

DE69233501T2 - Kombinatorische Strategien für die Polymersynthese

Info

Publication number: DE69233501T2
Application number: DE69233501T
Authority: DE
Inventors: James L. Winkler; Christopher J. Buchko; Lois Aldwin; Stephan P.A. Fodor
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1991-11-22
Filing date: 1992-11-20
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2012-11-21
Also published as: CA2124087A1; EP0972564A2; ATE241426T1; EP1086742B1; DE69233331T2; US6136269A; DE69233331T3; DE69233501D1; AU3148193A; US6040193A; ATE262374T1; EP1086742A1; US5677195A; EP1588761A3; JP2006194897A; ATE293011T1; EP0916396A2; DE69233087T2; EP1086742B2; EP1588761A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Anmeldung ist verwandt zur US Serial No. 796,243 (eingereicht am 22. November 1991) und zur US Serial No. 874,849 (eingereicht am 24. April 1992).
Die vorliegende Erfindung betrifft das Feld der Polymersynthese und des Screenings. Genauer gesagt, stellt die Erfindung in einer Ausführungsform ein verbessertes Verfahren und System für Synthesearrays von diversen Polymersequenzen zur Verfügung. Gemäß einem speziellen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Synthese diverser Polymersequenzen, wie z.B. von Peptiden oder Oligonukleotiden, zur Verfügung gestellt. Die diversen Polymersequenzen können beispielsweise im Rahmen von Screeninguntersuchungen zur Bestimmung von Bindungsaffinität verwendet werden.
Verfahren zur Synthese gewünschter Polymersequenzen, wie z.B. von Peptidsequenzen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt. Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden werden beispielsweise in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gate, ed., IRL Press, Oxford (1984) offenbart. Die so genannte "Marrifield"-Festphasen-Peptid-Synthese wurde über Jahre hinaus allgemein verwendet und wird in Marrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85: 2149–2154 beschrieben. Festphasensynthesetechniken wurden für die Synthese von verschiedenen Peptidsequenzen beispielsweise auf einer Anzahl von "Pins" zur Verfügung gestellt. Dazu siehe Geysen et al., J. Immun. Meth. (1987) 102: 259–274. Andere Festphasen-Techniken schließen beispielsweise die Synthese von verschiedenen Peptidsequenzen auf verschiedenen Cellulosescheiben unterstützt in einer Säule ein. Dazu siehe Frank und Doring, Tetrahedron (1988) 44: 6031–6040. Noch andere Festphasentechniken sind im US-Patent Nr. 4,728,502, im Namen von Hamill, und in WO 90/00626 (Erfinder: Beattie) beschrieben.
Jede der oben genannten Techniken stellt nur ein Array von Polymeren von relativ geringer Dichte her. So ist die Technik, wie sie in Geysen et al. beschrieben wird, limitiert auf die Produktion von 96 verschiedenen Polymeren auf Pins, zwischen welchen Abstände in den Dimensionen einer Standardmikrotiterplatte liegen.
Verbesserte Verfahren zum Ausbilden großer Arrays von Peptiden, Oligonukleotiden und anderen Polymersequenzen sind in einem kurzen Zeitraum umgesetzt worden. Besonders zu erwähnen ist Pirrung et al., US-Patent Nr. 5,143,854 (siehe auch PCT-Anmeldung Nr. WO 90/15070) und Fodor et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092, welche Verfahren zum Ausbilden großer Arrays von Peptiden und weiteren Polymersequenzen offenbaren, die beispielsweise lichtinduzierte Synthesetechniken verwenden. Dazu siehe auch Fodor et al., Science (1991) 251: 767–777.
Einige Arbeit wurde bislang in die Automatisiersynthese von Polymerarrays gesteckt. Beispielsweise beschreibt Southern, PCT-Anmeldung Nr. WO 89/10977, die Verwendung eines herkömmlichen Tintenplotters, um drei verschiedene Monomere ab zwölf verschiedene Stellen auf einem Substrat abzulagern. Diese Monomere wurden anschließend zur Reaktion gebracht, um drei verschiedene Polymere auszubiden, die jeweils zwölf Monomere lang waren. Die Southern-Anmeldung erwähnt auch die Möglichkeit der Verwendung eines Tintenstrahldruckers, um Monomere auf einem Substrat abzuscheiden. Des Weiteren ist in der oben zitierten PCT-Anmeldung von Fodor et al. ein elegantes Verfahren beschrieben, indem ein Computer-gesteuertes System zur Steuerung der VLSIPS^®-Prozedur verwendet wird. Verwendet man diese Anordnung, wird ein heterogenes Array von Polymeren durch gleichzeitiges Koppeln an eine Anzahl von Reaktionsplätzen in verschiedene heterogene Arrays konvertiert. Dieser Ansatz wird im Allgemeinen als "kombinatorische" Synthese bezeichnet.
Die VLSIPS^®-Techniken haben substanziellen Erfolg gebracht. Jedoch ist es in einigen Fällen wünschenswert, alternative/zusätzliche Verfahren zum Ausbilden von Polymersequenzen zur Verfügung zu haben, welche beispielsweise nicht Licht als einen Aktivator verwenden bzw. welche nicht ausschließlich Licht verwenden.
Zusammenfassung der Erfindung
Verfahren und Einheiten zur Synthese von hoch-dichten Arrays von diversen Polymersequenzen, wie z.B. verschiedenen Peptiden und Oligonukleotiden, werden kraft der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden Verfahren und Einheiten zum Anliefern (und in einigen Fällen zum Immobilisieren) verfügbarer Bibliotheken von Verbindungen auf speziellen Regionen eines Substrates durch diese Erfindung bereitgestellt. In speziellen Ausführungsformen werden verschiedene Monomere und andere Reaktanten an eine Vielzahl von Reaktionsplätzen auf einem einzelnen Substrat angeliefert, wo sie parallel zur Reaktion gebracht werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden eine Reihe von Kanälen, Rillen oder Inseln (Spots) auf oder benachbart zu dem Substrat ausgebildet. Reagenzien werden zum selektiven Fließen durch die Kanäle, Rillen oder Inseln gebracht oder in den Kanälen, Rillen oder Inseln abgeschieden, welche ein Array ausbilden, welches verschiedene Verbindungen und in einigen Ausführungsformen verschiedene Klassen von Verbindungen – an ausgewählten Stellen auf dem Substrat – aufweist.
Gemäß dem ersten spezifischen Aspekt der Erfindung wird ein Block verwendet, welcher eine Reihe von Kanälen auf einer seiner Oberflächen aufweist. Der Block wird in Kontakt mit einem derivatisierten Glas oder einem weiteren Substrat gebracht. In einem ersten Schritt wird eine Pipette oder ein anderes Anlieferungssystem verwendet, um ausgewählte Reagenzien zum Fließen durch eine oder mehrere einer Serie von Öffnungen zu bringen, welche mit den Kanälen verknüpft sind, oder Reagenzien direkt in die Kanäle zu platzieren, wobei die Kanäle befüllt werden bzw. das Substrat mit einem ersten Reagenz zu "bestreifen", wobei eine erste Gruppe von Monomeren daran gebunden wird. Die erste Gruppe von Monomeren muss nicht homogen sein. Beispielsweise kann ein Monomer A in eine erste Gruppe der Kanäle platziert werden, ein Monomer B in eine zweite Gruppe von Kanälen und ein Monomer C in eine dritte Gruppe von Kanälen. Die Kanäle können in einigen Ausführungsformen im weiteren Verlauf mit weiteren Reagenzien versorgt werden, wobei das Anbinden der weiteren Monomere an die erste Gruppe von Monomeren bereitgestellt wird. Der Block wird dann translatiert oder rotiert, erneut auf dem Substrat platziert und das Verfahren wird mit einem zweiten Reagenz wiederholt, wobei eine zweite Gruppe von Monomeren an verschiedene Regionen des Substrates gekoppelt wird. Das Verfahren wird wiederholt, so lange als ein diverser Satz von Polymeren von gewünschter Sequenz und Menge auf dem Substrat ausgebildet wird.
Kraft des Verfahrens werden eine Anzahl von Polymeren, welche verschiedene Monomersequenzen aufweisen, wie z.B. Peptide oder Oligonukleotide, auf dem Substrat auf bekannten Stellen ausgebildet.
Gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine Serie von Mikrokanälen oder Mikrorillen auf einem Substrat ausgebildet zusammen mit einem geeigneten Array von Mikroventilen. Die Kanäle und Ventile werden verwendet, um ausgewählte Reagenzien zum Fließen über eine derivatisierte Oberfläche zu bringen. Die Mikroventile werden verwendet, um zu bestimmen, welche der Kanäle für einen jeden besonderen Anbindungsschritt geöffnet werden.
Dementsprechend stellt eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zum Ausbilden unterschiedlicher Polymersequenzen auf einem einzigen Substrat zur Verfügung, wobei das Substrat eine Oberfläche mit einer Vielzahl von ausgewählten Regionen umfasst. Das Verfahren schließt die Schritte des Ausbildens einer Vielzahl von Kanälen benachbart zu der Oberfläche ein, wobei die Kanäle zumindest teilweise eine Wand davon aufweisen, welche durch eine Portion der ausgewählten Regionen definiert wird; und des Platzierens ausgewählter Reagenzien in den Kanälen, um Polymersequenzen an der Portion der ausgewählten Regionen zu synthetisieren, wobei die Portion der ausgewählten Regionen Polymere umfasst mit einer Sequenz von Monomeren, welche von den Polymeren in mindestens einer anderen der ausgewählten Regionen verschieden sind. In alternativen Ausführungsformen konstituieren die Kanäle oder Fließpfade selbst die ausgewählten Reaktionsregionen. Beispielsweise kann das Substrat eine Serie von aneinander grenzenden parallelen Kanälen aufweisen, welche jeweils Reaktionsstellen im Inneren aufweisen.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Substrat zur Verfügung gestellt, welches ein Array von unterschiedlichen Reaktionsreaktionen, welche voneinander durch inerte Regionen getrennt sind, aufweist. In einer Ausführungsform wird eine erste Monomerlösung auf einem ersten Satz von Reaktionsregionen eines geeignet derivatisierten Substrates platziert. Anschließend wird eine zweite Monomerlösung auf einem zweiten Satz von Regionen platziert, eine dritte Monomerlösung auf einen dritten Satz platziert usw.; letztendlich hat eine Anzahl der Regionen jeweils eine darin befindliche Monomerspezies. Diese Monomere werden mit der Oberfläche zur Reaktion gebracht und das Substrat wird anschließend gewaschen und für die Reaktion mit einem neuen Satz von Monomeren präpariert. Dimere, Trimere und größere Polymere von kontrollierter Länge und Monomersequenz werden durch Wiederholen der oben genannten Schritte mit verschiedenen Gruppierungen der Reaktionsregionen und Monomerlösungen hergestellt. In alternativen Ausführungsformen werden die Polymere oder andere Verbindungen des Arrays an die Regionen als komplette Spezies angeliefert und folglich sind die oben genannten Schritte der Polymersynthese nicht notwendig.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vielzahl von Reaktionsregionen auf der Substratoberfläche von einer begrenzenden Region umgeben, wie z.B. einer nicht-benetzbaren Region, welche den Transport der Reaktanten zwischen benachbarten Reaktionsregionen verhindert. Folglich können die Reaktanten in einer Region nicht in andere Regionen fließen, wo sie die Reaktion kontaminieren könnten. In besonders bevorzugten Ausführungsformen werden die Regionen des Arrays durch selektive Bestrahlung einer Substratoberfläche definiert, welche fotolabile hydrophobe Schutzgruppen enthält. In Flächen, wo die Oberfläche bestrahlt wird, werden die hydrophoben Schutzgruppen entfernt, um die Reaktionsregionen zu definieren. Wenn eine wässrige Lösung oder eine Lösung von einem anderen polaren Reaktanten in der Reaktionslösung abgeschieden wird, wird sie einen relativ großen Benetzungswinkel mit dem Substrat aufweisen, so dass durch Einstellen der abgeschiedenen Menge sichergestellt werden kann, dass kein Fließen zu benachbarten Regionen auftritt.
Ein weiteres Verständnis der Natur und der Vorteile der Erfindungen, die hier vorliegen, kann unter Bezug auf die verbleibenden Teile der Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen erhalten werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein generalisiertes Diagramm, welches die Erfindung illustriert;
2 ist ein Flussdiagramm, welches die Behandlungsschritte illustriert, welche in der Synthese eines Arrays von verschiedenen Polymeren durchgeführt werden;
3 ist eine Kartierung des resultierenden Arrays von Polymeren;
4a bis 4c illustrieren die Anordnung von drei Kanalblocktemplaten in sechs Verfahrensschritten, welche durchgeführt werden, um 64 Millionen Hexapeptide aus einem Basissatz von 20 Aminosäuren zu synthetisieren;
5a ist eine Aufsicht von oben und 5b ein Querschnitt einer ersten Ausführungsform einer Einheit, welche verwendet wird, um Arrays von Polymersequenzen zu synthetisieren;
6 ist ein Querschnitt einer Ausführungsform, welche eine Druckkammer zum Festhalten eines Substraten gegen einen Kanalblock enthält;
7a und 7b sind Ansichten von oben von zwei verschiedenen aufgefächerten Array-(„fanned Array")Kanalblöcken;
8 ist ein Querschnitt eines Kanalblocks und assoziierter Zuflussanschlüsse gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
9 ist ein detaillierter Querschnitt des Zuflussanschlusses in einem Kanalblock;
10 ist ein Diagramm eines Fließsystems, welches verwendet wird, um verknüpfende Verbindungen und Reagenzien an eine Fließzelle anzuliefern;
11a und 11b zeigen einen Apparat, welcher verwendet wird, um ein Substrat von einem Kanalblock zum anderen zu transferieren;
12 ist ein Diagramm eines Vielkanal-Festphasen-Synthetisierers;
13a und 13b illustrieren alternative Anordnungen der Rillen in einem Kanalblock;
14 ist eine schematische Illustration der Reaktionspfade, welche verwendet werden, um einige hydrophobe Gruppen der vorliegenden Erfindung herzustellen;
15a und 15b illustrieren eine Mikroventileinheit;
16a und 16b illustrieren eine alternative Ausführungsform der Erfindung;
17 ist eine Kartierung der erwarteten Fluoreszenzintensitäten mit einem Substrat, welches selektiv Fluoreszenzfarbstoffen ausgesetzt wird.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Inhalt

I. Glossar
II. Allgemeines
III. Verfahren zur mechanischen Anlieferung von Reagenzien
IV. Fließkanalausführungsformen
V. Platzierende Ausführungsformen
VI. Alternative Ausführungsformen
VII. Beispiele
A. Dichtheitstest
B. Ausbildung von YGGFL
C. 100-μm-Kanalblock
D. Kanal-Matrix-Hybridisierungs-Assay
VIII. Schlussfolgerung

I. Glossar
Im Folgenden sind die Begriffe so gedacht, dass sie die folgenden allgemeinen Bedeutungen haben, wenn sie im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden:

1. Ligand: Ein Ligand ist ein Molekül, welches von einem Rezeptor erkannt wird. Beispiele von Liganden, welche im Rahmen dieser Erfindung untersucht werden können, schließen Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Toxine und Gifte (venoms), virale Epitope, Hormone, Opiate, Steroide, Peptide, Enzymsubstrate, Co-Faktoren, Arzneimittel (drugs), Lectine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide und Proteine ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
2. Monomer: Ein Monomer ist ein Mitglied des Satzes von kleinen Molekülen, welche entweder miteinander verknüpft sind oder untereinander verknüpft werden können, um ein Polymer auszubilden oder eine Verbindung bestehend aus zwei oder meh reren Mitgliedern. Der Satz an Monomeren schließt beispielsweise den Satz von allgemeinen L-Aminosäuren, den Satz von D-Aminosäuren, den Satz von synthetischen und/oder natürlichen Aminosäuren, den Satz von Nukleotiden und den Satz von Pentosen und Hexosen ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Die spezielle Reihenfolge der Monomere innerhalb eines Polymers wird hier als die "Sequenz" des Polymers bezeichnet. Wie hier verwendet, bezeichnen Monomere jegliche Art eines Mitgliedes eines Basissatzes zur Synthese eines Polymers. Beispielsweise Dimere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren bilden einen Basissatz von 400 Monomeren zur Synthese von Polypeptiden aus. Verschiedene Basissätze von Monomeren können in nachfolgenden Schritten in der Synthese eines Polymers verwendet werden. Des Weiteren kann ein jeder der Sätze geschützte Mitglieder enthalten, welche nach der Synthese modifiziert werden. Die Erfindung wird hier primär im Hinblick auf die Herstellung von Molekülen beschrieben, welche Sequenzen von Monomeren, wie z.B. Aminosäuren, aufweisen, kann jedoch sofort in der Herstellung von anderen Polymeren verwendet werden. Solche Polymere schließen beispielsweise sowohl lineare als auch zyklische Polymere von Nukleinsäuren, Polysacchariden, Phospholipiden und Peptiden, welche entweder α-, β- oder ω-Aminosäuren aufweisen, Heteropolymere, in welchen ein bekanntes Arzneimittel kovalent an jeden der oben genannten Vertreter gebunden ist, Polynukleotide, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide, Polyacetate und andere Polymere ein, die nach Studium dieser Offenbarung offensichtlich sein werden. Solche Polymere sind "verschieden", wenn die Polymere, welche unterschiedliche Monomersequenz haben, an verschiedenen vordefinierten Regionen eines Substrates ausgebildet werden. Verfahren zur Zyklisierung und zum Polymerabbau von Polymeren werden in der gleichzeitig anhängigen serielle Anmelde-Nr. 796,727, eingereicht am 22. November 1991, mit dem Titel "POLYMER-ABBAU AUF FESTEN OBERFLÄCHEN" offenbart.
3. Peptide: Ein Peptid ist ein Polymer, in welchen die Monomere α-Aminosäuren sind, und diese untereinander durch Amidbindung verknüpft sind; sie werden alternativ auch als Polypeptide bezeichnet. Aminosäuren können das L-optische Isomer oder das D-optische Isomer darstellen. Peptide sind zwei oder mehrere Aminosäuremonomere lang und sind oft mehr als 20 Aminosäuremonomere lang. Üb liche Abkürzungen von Aminosäuren werden verwendet (beispielsweise P für Prolin). Diese Abkürzungen sind in Stryer, Biochemistry, Third Ed., 1988 enthalten.
4. Rezeptor: Ein Rezeptor ist ein Molekül, das eine Affinität für einen Liganden hat. Rezeptoren können natürlich auftretende oder synthetisierte Moleküle sein. Sie können in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit weiteren Spezies verwendet werden. Rezeptoren können an ein bindendes Mitglied angebunden werden, sei es kovalent oder nicht-kovalent, entweder direkt oder über eine spezifisch bindende Substanz. Beispiele von Rezeptoren, welche in dieser Erfindung verwendet werden können, schließen Antikörper, Zellmembranrezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren ein, welche mit spezifischen Antigenen-Determinanten reaktiv sind, sowie Viren, Zellen, Arzneimittel (drugs), Polynukleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Co-Faktoren, Lectine, Zucker, Polysaccharide, zelluläre Membrane und Organelle, sind aber nicht darauf beschränkt. Rezeptoren werden manchmal im Stand der Technik als Anti-Liganden bezeichnet. Wenn die Bezeichnung Rezeptoren hier verwendet wird, ist keine andere Bedeutung beabsichtigt. Ein "Ligand-Rezeptorpaar" wird ausgebildet, wenn zwei Moleküle durch Molekülerkennung sich miteinander kombiniert haben, um einen Komplex auszubilden. Spezielle Beispiele von Rezeptoren, welche von dieser Erfindung untersucht werden können, schließen folgende Substanzen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt:
a) Mikroorganismus-Rezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, welche Rezeptoren von Mikroorganismen binden, wie z.B. spezifische Transportproteine, oder Enzyme, welche zum Überleben der Mikroorganismen essentiell sind, würde ein geeignetes Hilfsmittel zum Entdecken neuer Klassen von Antibiotika darstellen. Von besonderem Wert würden Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Einzeller und Bakterien sein, welche resistent gegen die derzeit gebräuchlichen Antibiotika sind.
b) Enzyme: Beispielsweise kann ein Rezeptor eine Bindungsstelle eines Enzyms umfassen, beispielsweise eines Enzyms, welches für das Schneiden eines Neurotransmitters verantwortlich ist; die Bestimmung von Liganden für diesen Typ an Rezeptor, und die Aktivität eines Enzyms zu modulieren, welches einen Neurotransmitter schneidet, ist hilfreich zur Entwicklung von Arzneimitteln, welche in der Behandlung von Krankheiten der Neurotransmission verwendet werden können.
c) Antikörper: Beispielsweise kann die Erfindung hilfreich für die Untersuchung des Rezeptors sein, welcher eine Liganden bindende Stelle auf einem Antikörpermolekül umfasst, welches mit einem Epitop eines Antigens von Interesse kombiniert; die Bestimmung einer Sequenz, welche ein Antigenepitop mimt, kann zu der Entwicklung von Vakzinen führen, in welchen das Immunogen auf einer oder mehrerer solcher Sequenzen basiert, oder zu der Entwicklung von verwandten diagnostischen Agenzien von Verbindungen, welche in therapeutischen Behandlungen, wie z.B. für Autoimmunerkrankungen hilfreich sind (beispielsweise durch Blockade der Bindung der Selbst-Antikörper).
d) Nukleinsäuren: Sequenzen von Nukleinsäuren können synthetisiert werden, um DNA- oder RNA-bindende Sequenzen zu etablieren, welche als Rezeptoren für synthetisierte Sequenzen agieren.
e) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Antikörper, welche in der Lage sind, chemische Reaktionen voranzutreiben, welche die Konversion von einem oder mehreren Reaktanten in ein oder mehrere Produkte einschließen. Solche Peptide schließen generell eine Bindungsstelle, welche spezifisch für zumindest einen Reaktanten oder ein Reaktionszwischenprodukt ist, ein sowie eine aktive Funktionalität benachbart zu der Bindungsstelle, wobei diese Funktionalität in der Lage ist, den gebundenen Reaktanten chemisch zu modifizieren. Katalytische Polypeptide und andere sind beispielsweise in den PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 90/05746, WO 90/05749 und WO 90/05785 beschrieben.
f) Hormonrezeptoren: Die Bestimmung der Liganden, welche mit hoher Affinität einen Rezeptor, wie z.B. den Rezeptor für Insulin und Wachstumshormon binden, ist hilfreich in der Entwicklung beispielsweise eines oralen Substituts für die tägliche Injektion, die Diabetiker empfangen müssen, um die Symptome der Diabetes zu mildem oder ein Substitut für ein Wachstumshormon. Weitere Beispiele für Hormonrezeptoren schließen die vasokonstriktiven Hormonrezeptoren ein; die Bestimmung von Liganden für diese Rezeptoren kann zu der Entwicklung von Arzneimitteln zur Kontrolle des Blutdrucks führen.
g) Opiatrezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, welche an die Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist hilfreich für die Entwicklung von weniger süchtig machenden Substituten für Morphin und verwandten Arzneimitteln.
5. Substrat: Ein Material, welches eine rigide oder semi-rigide Oberfläche aufweist. In vielen Ausführungsformen wird zumindest eine Oberfläche des Substrates substanziell eben sein, obwohl in einigen Ausführungsfomen es wünschenswert sein kann, physikalisch Syntheseregionen für viele Polymer beispielsweise mit Wänden, erhöhten Regionen, geätzten Rinnen oder dergleichen abzutrennen. In einigen Ausführungsformen enthält das Substrat selbst Wände, Rinnen, Fließpfade durch Regionen, etc., welche die gesamte oder Teile der Syntheseregionen ausbilden. Gemäß anderen Ausführungsfomen können kleine Beats an der Oberfläche bereitgestellt werden, und Verbindungen, welche daran synthetisiert werden, können nach Vervollständigungen der Synthese entfernt werden.
6. Kanalblock: Ein Material, welches eine Vielzahl von Rillen oder begrenzten Regionen auf seiner Oberfläche aufweist. Die Rillen oder begrenzten Regionen können eine Vielzahl von geometrischen Konfigurationen einnehmen, einschließlich, aber nicht limitiert auf Streifen, Kreise, serpentinartige Pfade oder dergleichen. Kanalblöcke können in einer Vielzahl von Arten hergestellt werden, einschließend das Ätzen von Siliziumblöcken, das Gießen oder Pressen von Polymeren etc.
7. Schutzgruppe: Ein Material, welches an eine Monomereinheit gebunden ist, und welches selektiv von dieser entfernt werden kann, um eine aktive Stelle zu exponieren, wie z.B. in dem speziellen Beispiel einer Aminosäure eine Aminogruppe. Spezielle Beispiele von fotolabilen Schutzgruppen werden in Fodor et al., PCT- Veröffentlichungs-Nr. WO 92/10092 sowie US Serial No. ___ (Anwalt-Aktennummer 11509-68) diskutiert.
8. Vordefinierte Region: Eine vordefinierte Region ist eine lokalisierte Fläche auf einem Substrat, welche zur Ausbildung eines ausgewählten Polymers verwendet wird, wurde oder beabsichtigt wird, dafür verwendet zu werden; und sie wird hier auch alternativ als "Reaktions"-Region, eine "ausgewählte" Region, oder einfach als "Region" bezeichnet. Die vordefinierte Region kann jede Art einer günstigen Form aufweisen, z.B. kann sie kreisrund, rechtwinklig, ellipsoid, keilförmig, etc., sein. In einigen Ausfühnungsformen ist die vordefinierte Region und deshalb auch die Region, innerhalb welcher eine ausgewählte Polymersequenz synthetisiert wird, kleiner als etwa 1 cm², mehr bevorzugt kleiner als 1 mm² und noch mehr bevorzugt weniger als 0,5 mm². In den meist bevorzugten Ausführungsformen weisen die Regionen eine Fläche von weniger als ungefähr 10 000 μm² oder mehr bevorzugt, weniger als 100 μm² auf. Innerhalb dieser Regionen wird das darin synthetisierte Polymer vorzugsweise in einer substanziell reinen Form synthetisiert.
9. Substanziell rein: Ein Polymer wird als "substanziell rein" innerhalb einer vordefinierten Region eines Substrates betrachtet, wenn es Charakteristika zeigt, welche es von anderen vordefinierten Regionen unterscheiden. Typischerweise wird die Reinheit mit Hilfe der biologischen Aktivität oder Funktion als ein Resultat einer einheitlichen Sequenz gemessen. Solche Charakteristika werden typischerweise mit Hilfe des Anbindens an einen ausgewählten Liganden oder Rezeptor gemessen. Vorzugsweise ist die Region hinreichend rein, so dass die vorherrschende Spezies in einer vordefinierten Region die gewünschte Sequenz ist. Gemäß den bevorzugten Aspekten der Erfindung ist das Polymer zumindest 5% rein, mehr bevorzugt mehr als 10 bis 20% rein, mehr bevorzugt mehr als 80 bis 90% rein und am meisten bevorzugt mehr als 95% rein, wobei die Reinheit zu diesem Zweck sich auf das Verhältnis der Anzahl der Ligandenmolekülen, welche in einer vordefinierten Region ausgebildet werden, die eine gewünschte Sequenz aufweisen, zu der Gesamtzahl der Moleküle, welche in der vordefinierten Region ausgebildet werden, bezieht.

II. Allgemeines
Die Erfindung kann in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Beispielsweise kann die Erfindung als Synthesewerkzeug verwendet werden (wie z.B. in der Peptidsynthese), als Screeningwerkzeug (wie z.B. zum Screenen von Verbindungsbibliotheken zur Wirkstoffaktivität), oder als überwachendes/diagnostisches Werkzeug (wie z.B. in medizinischen oder umweltanalytischen Tests). In einer spezifischen Ausführungsform wird die Erfindung für Diagnosen auf Nukleinsäurebasis verwendet.
Als ein Synthesewerkzeug stellt die vorliegende Erfindung zum Ausbilden von Arrays eine große Anzahl von verschiedenen Polymersequenzen bereit. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Synthese eines Arrays von verschiedenen Peptiden oder Oligonukleotiden in ausgewählten Regionen auf dem Substrat bereit. Solche Substrate, welche die verschiedenen Sequenzen ausgebildet darauf aufweisen, können beispielsweise in Screeninguntersuchungen zur Bewertung ihrer Interaktion mit Rezeptoren, wie z.B. Antikörpern und Nukleinsäuren, verwendet werden. Beispielsweise stellt die Erfindung in bevorzugten Ausführungsformen das Screenen von Peptiden zur Verfügung, um zu bestimmen, welcher – wenn überhaupt einer – der verschiedenen Sätze von Peptiden eine starke Bindungsaffinität mit einem Rezeptor aufweist, und, in besonders bevorzugten Ausführungsformen, um die relative Bindungsaffinität von verschiedenen Peptiden mit einem Rezeptor von Interesse zu bestimmen.
Solch unterschiedliche Polymersequenzen werden bevorzugterweise auf einem einzigen Substrat synthetisiert. Durch die Synthese der unterschiedlichen Polymersequenzen auf einem einzigen Substrat kann die Verarbeitung der Sequenzen, im Hinblick auf die Bewertung ihrer Eigenschaften, wie z.B. die relative Bindungsaffinität, wesentlich einfacher durchgeführt werden. Um an einem Beispiel zu verdeutlichen, wenn ein Array von Peptidsequenzen (oder eine Bibliothek von anderen Verbindungen) ausgewertet wird, um die relative Bindungsaffinität der Peptide an einem Rezeptor zu bestimmen, kann das gesamte Substrat und damit alle oder eine Gruppe der Polymersequenzen einem geeignet gelabelten Rezeptor ausgesetzt werden und gleichzeitig ausgewertet zu werden.
In einigen Ausführungsformen kann die vorliegende Erfindung eingesetzt werden, um große Kollektionen von synthetischen chemischen Verbindungen oder natürlichen Produktextrakten zu lokalisieren und – in einigen Fällen – zu immobilisieren. In solchen Verfahren werden Verbindungen auf vordefinierten Regionen auf einem Substrat abgeschieden. Die Reaktion der immobilisierten Verbindung (oder der immobilisierten Verbindungen) mit verschiedenen Testzusammensetzungen, wie z.B. den Vertretern der chemischen Bibliothek oder einem biologischen Extrakt werden durch Dispergieren von kleinen Aliquots von jedem Mitglied der Bibliothek oder des Extraktes auf verschiedene Regionen getestet. Kompetitive Arrays oder wohl bekannte Techniken können verwendet werden, um die gewünschte Aktivität zu identifizieren. Als ein Beispiel wird eine große Kollektion von menschlichen Rezeptoren auf einem Substrat abgeschieden und zwar einer in jeder Region, um ein Array aufzubilden. Ein Pflanzen/tierischer Extrakt wird dann gescreent hinsichtlich des Bindens an verschiedene Rezeptoren des Arrays.
Die vorliegende Erfindung weist bestimmte Merkmale in Übereinstimmung mit den "lichtinduzierten" Verfahren, welche in US-Patent Nr. 5,143,854 beschrieben werden, auf. Die lichtinduzierten Verfahren, welche in dem '854-Patent diskutiert werden, involvieren das Aktivieren von vordefinierten Regionen des Substrates und das anschließende Inkontaktbringen des Substrates mit einer vorausgewählten Monomerlösung. Die vordefinierten Regionen können mit einer Lichtquelle, welche durch eine Maske scheint, aktiviert werden (in sehr ähnlicher Weise zu fotolithografischen Techniken, welche in der integrierten Schaltkreisfabrikation verwendet werden). Weitere Regionen des Substrates bleiben inaktiv, da sie durch die Maske gegen Bestrahlung blockiert sind. Folglich definiert ein beleuchtetes Muster, welche Regionen des Substrats mit einem gegebenen Monomer reagieren. Durch wiederholtes Aktivieren verschiedener Sätze von vordefinierten Regionen und Kontaktieren verschiedener Monomerlösungen mit dem Substrat wird ein unterschiedliches Array von Polymeren auf dem Substrat produziert. Natürlich können andere Schritte, wie z.B. das Waschen von unreagierter Monomerlösung gegen das Substrat als notwendig verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung definiert eine mechanische Einheit oder eine physikalische Struktur die Regionen, welche verfügbar sind, um mit einem gegebenen Monomer zu reagieren. In einigen Ausführungsformen wird eine Wand oder andere physikalische Barriere verwendet, um eine gegebene Monomerlösung gegen das Kontaktieren einer jeden außer wenigen ausgewählten Regionen des Substrates zu blockieren. In anderen Ausführungsformen agiert die Menge der Monomer-(oder anderen)Lösung, welche abgeschieden wurde, und die Zusammensetzung des Substrates so, dass verschiedene Monomerlösungen auf dem Substrat getrennt werden. Dies ermöglicht, dass verschiedene Monomere zugeführt und an verschiedene Regionen gleichzeitig angebunden werden können (oder annähernd simultan) und reduziert die Anzahl von separaten Wasch- und anderen Reaktionsschritten, die notwendig sind, um ein Array aus Polymeren auszubilden. Des Weiteren können die Reaktionsbedingungen in verschiedenen aktivierten Regionen unabhängig voneinander kontrolliert werden. Folglich können Konzentrationen von Reaktanten und andere Parameter unabhängig voneinander von Reaktionsstelle zu Reaktionsstelle variiert werden, um das Vorgehen zu optimieren.
In alternativen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird Licht oder ein anderer Aktivator in Zusammenhang mit den physikalischen Strukturen verwendet, um Reaktionsregionen zu definieren. Beispielsweise aktiviert eine Lichtquelle verschiedene Regionen des Substrats zu einer Zeit und anschließend dirigiert parallel ein mechanisches System Monomerlösungen zu anderen aktivierten Regionen.
III. Verfahren zur mechanischen Zufuhr von Reagenzien
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Reagenzien dem Substrat zugeführt, entweder durch (1) Fließen innehalb eines Kanals definiert auf einer vordefinierten Region oder (2) "Platzieren" (spotting) in vordefinierten Regionen. Jedoch können andere Ansätze, wie auch Kombinationen von Platzieren und Fließen verwendet werden. In jedem Fall werden bestimmte aktivierte Regionen des Substrates mechanisch von anderen Regionen separiert, wenn die Monomerlösungen in verschiedenen Reaktionsplätzen zugeführt werden.
Ein typisches "Fließkanal"-Verfahren der vorliegenden Erfindung kann allgemein wie folgt beschrieben werden. Verschiedene Polymersequenzen werden in ausgewählten Regionen eines Substrates durch das Ausbilden von Fließkanälen auf der Oberfläche des Substrates synthetisiert, wobei durch diese Kanäle geeignete Reagenzien fließen bzw. in diesen Kanälen geeignete Reagenzien platziert werden. Es sei beispielsweise angenommen, dass ein Monomer "A" an das Substrat in einer ersten Gruppe von ausgewählten Regionen angebunden werden soll. Falls nötig wird die gesamte oder ein Teil der Oberfläche des Substrates in dem gesamten oder einem Teil der ausgewählten Regionen für die Bindung aktiviert, beispielsweise durch das Fließenlassen geeigneter Reagenzien durch alle oder einige der Kanäle oder durch Waschen des gesamten Substrates mit geeigneten Reagenzien. Nach der Platzierung eines Kanalblocks auf der Oberfläche des Substrates fließt ein Reagens, welches das Monomer A aufweist, durch den/die oder wird in der Gesamtheit oder einigen der/des Kanäle/Kanals platziert. Die Kanäle stellen den Flüssigkeitskontakt zu den ersten ausgewählten Regionen bereit, wobei das Monomer A auf dem Substrat direkt oder indirekt (über einen Linker) in den ersten ausgewählten Regionen gebunden wird.
Anschließend wird ein Monomer B an zweite ausgewählte Regionen gekoppelt, wobei einige davon unter den zuerst ausgewählten Regionen eingeschlossen sein können. Die zweiten ausgewählten Regionen werden in Flüssigkeits-Kontakt mit einem zweiten Fließkanal (mit zweiten Fließkanälen) durch Translation, Rotation oder Substitution des Kanalblocks auf der Oberfläche des Substrates sein; durch Öffnen oder Schließen eines ausgewählten Ventils; oder durch Abscheiden einer Schicht an Fotolack. Falls notwendig, wird ein Schritt zum Aktivieren zumindest der zweiten Region durchgeführt. Anschließend wird das Monomer B zum Durchfluss durch den zweiten Fließkanal (die zweiten Fließkanäle) gebracht oder in diesen platziert, wobei das Monomer B in den zweiten ausgewählten Regionen gebunden wird. In diesem speziellen Beispiel werden die resultierenden Sequenzen, welche an das Substrat in diesem Stadium der Verarbeitung gebunden sind, beispielsweise A, B und AB sein. Das Verfahren wird wiederholt, um ein großes Array von Sequenzen von gewünschter Länge an bekannten Stellen auf dem Substrat auszubilden.
Nachdem das Substrat aktiviert worden ist, kann das Monomer A durch einige der Kanäle fließen, das Monomer B kann durch andere Kanäle fließen, ein Monomer C kann wieder durch andere Kanäle fließen, etc. Auf diese Art und Weise werden viele oder alle der Reaktionsregionen mit einem Monomer zur Reaktion gebracht, bevor der Kanalblock bewegt werden muss oder das Substrat gewaschen und/oder reaktiviert werden muss. Durch die Anwendung von vielen oder allen der verfügbaren Reaktionsregionen zugleich kann die Anzahl der Wasch- und Aktivierungsschritte minimiert werden.
Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung werden alternativen Verfahren zum Ausbilden von Kanälen zur Verfügung stellen oder in anderer Weise einen Teil der Oberfläche des Substrates schützen. Beispielsweise kann gemäß einigen Ausführungsformen ein schützendes Coating, wie z.B. ein hydrophiles oder hydrophobes Coating (abhängig von der Natur des Verfahrens), über Teilen des Substrates, welches geschützt werden soll, angewandt werden, manchmal in Kombination mit Materialien, welche das Benetzen durch die Lösung von Reaktanten in anderen Regionen ermöglichen. Auf diese Art und Weise werden die fließenden Lösungen nochmals abgehalten, außerhalb ihrer vorgegeben Fließwege zu laufen.
Die "Platzierenden"-Ausführungsformen der Erfindung können sehr in derselben Art und Weise wie die Fließkanal-Ausführungsformen implementiert werden. Beispielsweise kann ein Monomer A an eine erste Gruppe von Reaktionsregionen, welche geeignet aktiviert worden sind, angeliefert und angebunden werden. Anschließend kann ein Monomer B an eine zweite Gruppe von aktivierten Reaktionsregionen angeliefert und mit diesem zur Reaktion gebracht werden. Im Gegensatz zu den Fließkanal-Ausführungsformen, wie sie oben beschrieben werden, werden die Reaktanten durch direktes Abscheiden (anstelle des Zuflusses) relativ kleiner Mengen von ihnen in ausgewählten Regionen angeliefert. In einigen Schritten kann die gesamte Substratoberfläche besprüht oder anderweitig mit einer Lösung gecoatet werden. In bevorzugten Ausführungsformen bewegt sich ein Spender von Region zu Region, und scheidet nur soviel Monomer ab, wie bei jedem Stopp notwendig ist. Typische Spender schließen eine Mikropipette ein, um die Monomerlösung an das Substrat anzuliefern und ein Robotersystem, um die Position der Mikropipette relativ zu dem Substrat gesehen, zu kontrollieren. In anderen Ausführungsformen schließt der Spender eine Reihe von Schläuchen, einen Verteiler, ein Array von Pipetten oder dergleichen ein, so dass verschiedene Reagenzien gleichzeitig an die Reaktionsregionen angeliefert werden können.
IV. Fließkanalausführungsformen
1 illustriert ein Beispiel der Erfindung. In diesem speziellen Beispiel sollen Monomere und Dimere der Gruppen A, B, C und D an ausgewählten Regionen auf dem Substrat gebunden werden. Das Substrat kann biologisch, nicht-biologisch, organisch, anorganisch oder eine Kombination von irgendeiner der oben genannten Klassen sein, existierend als Partikel, Stränge, Präzipitate, Gele, Beschichtungen, Röhren, Kugeln, Container, Kapillaren, Blöcke, Blätter, Filme, Platten, Deckgläschen, etc. Das Substrat kann jegliche Art von herkömmlicher Form, wie z.B. Scheibe, Quadrat, Kugel, Kreis, etc., sein. Das Substrat ist vorzugsweise flach, kann aber eine Vielzahl von alternativen Oberflächenkonfigurationen einnehmen. Beispielsweise kann das Substrat erhöhte oder erniedrigte Regionen, in welchen die Synthese stattfindet, enthalten.
Das Substrat und seine Oberfläche bilden eine Unterlage, auf welcher die hier beschriebenen Reaktionen ausgeführt werden sollen. Diese Monomere werden unter Verwendung von ersten Fließkanalpfaden x₁, x₂, x₃ und x₄ gebunden, welche ausgebildet oder platziert auf bzw. benachbart zu dem Substrat in einer ersten Orientierung werden, und unter Verwendung zweiter Fließkanalpfade y₁, y₂, y₃ und y₄, welche ausgebildet oder platziert auf oder benachbart zu dem Substrat in einer zweiten Orientierung werden. Die zweiten Fließkanalpfade schneiden überlagernd zumindest einen Teil der ersten Fließkanalpfade. Die Fließkanäle werden gemäß den Techniken, welche in größeren Details an anderer Stelle in dieser Beschreibung beschrieben werden, ausgebildet.
Anfangs wird das Substrat einer oder mehreren vorläufigen Behandlungen unterzogen, wie z.B. einem Reinigungsschritt und dem optionalen Platzieren von "Linker"-Moleküle auf seiner Oberfläche. Das Substrat kann auch mit verschiedenen aktiven Gruppen versorgt werden, allgemeinen Monomersequenzen, welche ein Teil der Polymere ausbilden werden oder dergleichen.
Anschließend werden in einem ersten Kopplungsschritt ein oder mehrere der Fließkanäle mit dem ersten Monomer A versorgt, welches durch kovalente Bindung oder anderweitig an das Substrat (direkt oder indirekt) bindet, und zwar dort, wo der Fließkanal das Substrat kontaktiert. Wie in dem speziellen Beispiel, welches in 1 gezeigt wird, werden die Fließkanäle x₁ und x₂ verwendet, um das Monomer A an das Substrat entlang der gesamten Länge des Substrates angrenzend an die x₁- und x₂-Kanäle zu binden. Jeder Kopplungsschritt kann in einigen Ausführungsformen aus einer Vielzahl von untergeordneten Schritten bestehen. Beispielsweise kann jeder Kopplungsschritt ein oder mehrere untergeordnete Schritte zum Waschen, der chemischen Aktivierung oder dergleichen enthalten.
Anschließend oder zeitgleich damit wird, wie in 2 gezeigt, ein zweites Monomer B in den ausgewählten Fließkanälen zur Verfügung gestellt und das Monomer B bindet das Substrat, und zwar dort, wo die zweiten Fließkanäle den Kontakt damit herstellen. In dem speziellen Beispiel, welches in 2 gezeigt ist, wird das Monomer B entlang der Kanäle x₃ und x₄ gebunden. Wenn das Monomer A und das Monomer B durch ihre jeweiligen Fließkanäle zu gleicher Zeit fließen, ist nur ein einziger Prozessschritt vonnöten, um zwei koppelnde Schritte zugleich durchzuführen. Wie hier verwendet, bezieht sich ein "Prozessschritt" auf die Injektion eines oder mehrerer Kanäle mit einem oder mehreren Reagenzien. Ein "Kopplungsschritt" bezieht sich auf die Zugabe eines Monomers in ein Polymer.
Die Verarbeitung geht dann in ähnlicher Art und Weise mit den Monomeren C und D in der Weise, wie im Flussdiagramm 2 gezeigt, weiter, mit dem Monomer C, welches in den Fließkanälen y₁ und y₂ gebunden wird, und dem Monomer D, welches in den Fließkanälen y₃ und y₄ gebunden wird. Vorzugsweise werden die Monomere C und D durch die Fließkanäle y₁ bis y₄ zur gleichen Zeit geleitet, wobei zwei koppelnde Schritte mit einem einzelnen Prozessschritt durchgeführt werden. Die hellen Regionen in 1 zeigen die Überschneidungen der resultieren Fließpfade an.
3 illustriert die Kartierung von Sequenzen, welche ausgebildet wurden unter der Verwendung der oben illustrierten Schritte. Wie dort gezeigt, wurden die Sequenzen A, B, C, D, AD, BD, AC und BC, unter Verwendung von lediglich zwei Prozessschritten ausgebildet. Dementsprechend sieht man, dass der Prozess die Synthese eines großen Arrays von Polymersequenzen bereitstellt unter der Verwendung von relativ wenigen Prozessschritten. Wie man an einem weiteren Beispiel sieht, ist es notwendig, nur zwei Prozessschritte zu verwenden, um alle der 4² = 16 Dimere aus einem Basissatz von vier Monomeren auszubilden. Um ein weiteres Beispiel zu nennen, ist es nur notwendig, 256 Fließkanäle, orientiert in der x-Richtung und 256 Fließkanäle, orientiert in der y- Richtung bereitzustellen, um alle 4⁸-Oktamere eines Basissatzes von vier Monomeren mit einer Gesamtzahl von acht Kopplungsschritten auszubilden.
Das Potenzial der Technik wird des Weiteren illustriert durch das Synthetisieren des kompletten Arrays von sechs Hexamerpeptiden eines Basissatzes von 20 Aminosäuren. Dieses Array wird 20⁶ oder 64 000 000 Regionen, welches 64 000 000 verschiedene Peptide definieren, einschließen, und kann in nur sechs Verfahrensschritten ausgebildet werden. Des Weiteren bedarf das Verfahren nur dreier unterschiedlicher Template, eines, welches 20 parallele Kanäle aufweist, ein zweites, welches 400 Kanäle aufweist, wobei ein jeder 1/20 der Breite der ersten Kanäle aufweist, und ein drittes, welches 8 000 Kanäle aufweist, wobei ein jeder 1/20 die Breite der zweiten Kanäle aufweist. Jedes Templat wird in zwei Prozessschritten verwendet werden, jeweils in einer Orientierung von 90° zu dem anderem, wie in 4 illustriert wird. Mit dem ersten Templat wird das Substrat aktiviert und dann werden Lösungen einer jeden Aminosäure des 20 Aminosäuren starken Basissatzes (oder eines anderen Basissatzes von 20 Mitgliedern) zum Fließen über die verschiedenen vordefinierten Streifen einer ersten Orientierung gebracht und zur Reaktion gebracht. Dies ist der erste Prozessschritt und schließt 20 koppelnde oder anbindende Schritte ein, welche gleichzeitig durchgeführt werden können. Danach wird das gesamte Substrat erneut aktiviert und das erste Templat wird in einer zweiten Orientierung platziert, senkrecht zu dem ersten (4a). Die Lösungen von 20 Aminosäuren werden dann entlang 20 neu vordefinierter Streifen zum Fließen gebracht (ein jeder senkrecht zu dem originalen Satz von Streifen). In jedem der zwei Prozessschritte werden die 20 vordefinierten Regionen (die Streifen entlang der Fließkanäle) zuerst aktiviert und dann mit den individuellen Monomeren kontaktiert, so dass alle 20 Streifen zur Reaktion gebracht werden, bevor der nächste Aktivierungsschritt notwendig wird. In anderen Worten, 20 Kopplungsschritte werden parallel durchgeführt, was die Zahl der notwendigen Aktivierungsschritte drastisch reduziert.
Die vier verbleibenden Kopplungsschritte verwenden das zweite und dritte Templat. In dem dritten und vierten Verfahrensschritt (4b) werden 20 Kanäle jedem Monomer zugeteilt und in dem fünften und sechsten Verfahrensschritt (4c) werden 400 Kanäle jedem Monomer zugeteilt. Wie bei den ersten beiden Schritten wird das gesamte Substrat der Reaktion während einem einzigen Prozessschritt unterzogen. Folglich sind nur sechs Prozessschritte (welche insgesamt etwa 24 Stunden benötigen) vonnöten, um die gesamte Bibliothek von 64 000 000 Peptidhexameren zu produzieren. In einer anderen Ausführungsform kann ein einzelnes Templat, welches 8 000 Kanäle aufweist, um die Zufuhr zu kontrollieren (beispielsweise 400 Kanäle für jede der 20 Aminosäuren in der ersten Runde), die vollständige Bibliothek von Hexameren mit nur einem einzelnen Rotationsschritt herstellen. Folglich bietet die vorliegende Erfindung extrem schnelle Verfahren der Herstellung verschiedener Polymerarrays.
5a und 5b illustrieren Details einer ersten Ausführungsform einer Einheit, welche zum Durchführen der Syntheseschritte, wie sie oben beschrieben werden, verwendet wird. Insbesondere 5a illustriert die Einheit in einer Ansicht von oben, wohingegen 5 die Einheit in einer Seitenansicht im Querschnitt illustriert. In der besonderen Ausführungsform, welche in 5 gezeigt ist, wird die Einheit verwendet, um die Polymersequenzen auf Substrat 401 zu synthetisieren. Substrat 401 ist an eine rotierende Ebene 402 gekoppelt und reversibel mit einer Klammer 405 an dem Kanalblock 407 fixiert. Kanalblock 407 weist eine Vielzahl von darin eingeätzten Kanälen 409 in Form von Streifen auf. Jeder Kanal ist mit einem Fließeinlass 411 und einem Fließauslass 413 versehen. Eine Vakuumquelle 415 ist auf einem oder mehreren der Auslasse 413 angebracht, wohingegen eine Pipettiereinheit 417 gleitbar auf einem Arm 419 montiert ist, um ausgewählte Reagenzien von dem Reservoir (den Reservoiren) 421 an ausgewählte Flusseinlässe 411 zu geleiten.
Die Details einer zweiten bevorzugten Ausführungsform sind in den 6 bis 11 dargestellt. 6 zeigt einen Apparat zum Fixieren eines Substrats 111 gegen einen Kanalblock 109 durch gleichmäßiges Verteilen von Druck über das Substrat in einer Druckkammer 101. Gas unter Druck wird durch einen Gasdruckeinlass 103 zugeführt, um den Klemmdruck zur Verfügung zu stellen und danach das Substrat zu immobilisieren, während Flüssigkeiten vom Flüssigkeitsflusseinlass 115 durch den Kanal 123 und aus dem Fließauslass 117 gebracht werden. Die oberen und unteren Teile des Druckkammergehäuses 104 und 125 werden durch Muttern 121 und Bolzen 104 zusammengehalten. Selbstverständlich können auch andere Mittel, wie z.B. Klammem, verwendet werden, um die Teile des Druckkammergehäuses zusammenzuhalten.
7 illustriert bevorzugte Konfigurationen von Fließpfaden in Kanalblöcken der vorliegenden Erfindung. Wie in 7a dargestellt, sind die Flüssigkeitszufuhrstellen 127, 129, 131, 133, 135 und 137 mit Kanälen verknüpft, welche zur Reaktionsregion 141 führen. Eine ähnliche Anordnung ist für Vergleichszwecke in 7b dargestellt, wo die Orientierung der Fließkanäle in den Reaktionsregionen um 90° auf einem rechtwinkligen Kanalblock gedreht ist. Vakuumcodes 145 und 146 zur externen Vakuumzufuhr werden bereitgestellt, so dass die Substratposition während dem Flüssigkeitsfluss beibehalten wird.
Die Kanäle, welche in den 7a und 7b gezeigt sind, bilden ein gefächertes ("fanned") Kanalarray auf dem Kanalblock 139 in einer Art aus, welche analog zu der von Leitstrukturen, die in integrierten Schaltkreisen verwendet werden, ist. Dies stellt signifikant vergrößerte Trennung der Flüssigkeitszulieferungspunkte im Vergleich zu der hohen Dichte der Kanäle in der Reaktionsregion zur Verfügung. In einem 2 Inch × 3 Inch-Substrat kann typischerweise zumindest eine 4:1-Vergrößerung in der räumlichen Trennung durch die gefächerte Anordnung erzielt werden. Folglich können die Zufuhrports um 0,8 mm getrennt werden, wenn die Kanäle in den Reaktionsregionen um 200 μm getrennt sind.
Die räumliche Trennung kann des Weiteren durch Staffeln der Zufuhrports – wie für die Ports 127, 129 und 133 gezeigt – vergrößert werden. Dies kann eine zusätzliche Kanaltrennung von zumindest etwa 3:1 zur Verfügung stellen. Folglich stellt ein gestaffeltes gefächertes Array eine 2,4 mm-Trennung zwischen den Zufuhrports zur Verfügung für Kanäle, die um 200 μm getrennt sind. Folglich kann Flüssigkeit durch ein hoch dichtes Array von Kanälen in der Reaktionsregion ausgehend von 1,6 mm Teflon^®-Rohmaterial geliefert werden. Falls zusätzliche räumliche Aufweitung notwendig ist, kann die Substratgröße vergrößert werden, während die Reaktionsregionsgröße beibehalten wird.
Wie in 8 gezeigt, werden die Flüssigkeits-Zufuhrports von Löchern in der rückwärtigen Oberfläche auf der stabilisierenden Platte 108 auf dem Kanalblock erreicht. Die stabilisierende Platte, welche vorzugsweise aus Fused-Pyrex besteht, stellt strukturelle Integrität des Kanalblocks während des Einklemmens in die Druckkammer zur Verfügung. Sie kann auch ein Mittel zur Verfügung stellen, um die Kanalblockports zu erreichen und das Lecken zwischen Ports oder Kanälen reduzieren. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Kanäle des Kanalblocks auf einem Wafer 106 ausgebildet, welcher generell jegliche Art eines ver- oder bearbeitbaren Materials sein kann und vor zugsweise geätztes Silizium oder eine mikromaschinell bearbeitete Keramik sein kann. In anderen Ausführungsformen ist der Kanalblock Druck-geformt oder durch Injektion aus einem geeigneten Polymers formgepresst. Die gesamte Anordnung des Kanalblocks wird auf einer festen Unterplatte für den Kanalblock 110 montiert, welcher eine Vakuumzufuhr 112 enthält, so wie Ports für die Flüssigkeits-Zulieferungs-Leitungen 115, Ports für die Flüssigkeits-Abfuhrleitungen 117 und erniedrigte Regionen für die Dübel-Enden 151 und 153. Mit dieser Anordnung kann das Substrat gegen die obere Oberfläche des Kanalblocks geklemmt werden (durch Vakuum oder Druckgas, wie in der Ausführungsform von 6), während die Flüssigkeit von unten ein- und austritt. Vorzugsweise wird die Unterplatte aus einem steifen Material, wie z.B. rostfreiem Stahl oder anodisiertem Aluminium, bestehen.
Individuelle Verknüpfungen aus Mikrorohrwerk können für jeden der Kanäle, wie in 9 gezeigt, erstellt werden. Dübelenden 151 mit einer konischen oberen Oberfläche, die mit einer konischen Einkerbung 118 in einer Pyrex-stabilisierenden Platte 108 zusammenpassen, werden bereitgestellt. Dübelenden 151 weisen auch eine zylindrische untere Oberfläche auf, welche mit der zylindrischen Einkerbung 116 in der Unterplatte 110 zusammenpasst. Die Unterplatte und die stabilisierende Platte werden von einem Bolzen 114 und einem Gewindeinsert 112 oder anderen geeigneten Verbindungsmitteln zusammengehalten.
10 zeigt ein Flüssigkeitsfließdiagramm eines bevorzugten Systems der vorliegenden Erfindung. Der Druck wird am Punkt 25 (P1) und am Punkt 21 (P2) kontrolliert, so dass ein Druckabfall (P1–P2) über das ganze System beibehalten wird. Koppelnde Verbindungen, wie z.B. aktivierte Monomere, werden von den Reservoiren 31, 32 und 33 zugeführt. Zusätzliche Reagenzien werden von den Reservoiren 15, 17 und 19 zugeführt. Selbstverständlich sind die Monomer- bzw. koppelnden Reagenzreservoire, welche in 10 gezeigt sind, repräsentativ für eine potenziell viel größere Serie an Reservoiren. Die Reagenzien und koppelnden Verbindungen werden an den Knotenpunkten 27, 28 und 29 kombiniert, bevor sie in den Kanalblock 139 geleitet werden. Das Mischen von geeigneten Reagenzien und koppelnden Verbindungen wird durch Ventile an den Knotenpunkten gesteuert, welche wiederum von einer elektronischen Steuerung 23 gesteuert werden. Abfallflüssigkeiten, welche über das Substrat geleitet worden sind, werden durch Leitung 35 entfernt.
Das System, welches in 10 dargestellt ist, erlaubt die parallele Steuerung aller Kanäle durch Regulierung von nur wenigen Variablen. Beispielsweise wird ein konstanter Druckgradient über alle Kanäle gleichzeitig beibehalten durch die Fixierung von P1 und P2. Daher hängt die Fließrate in jedem Kanal von der Querschnittsfläche des Fließkanals und den rheologischen Eigenschaften der Flüssigkeiten ab. Da die Kanäle einen einheitlichen Querschnitt aufweisen und die koppelnden Verbindungen typischerweise in Form von verdünnten Lösungen eines einzelnen Solvens bereitgestellt werden, wird eine einheitliche Fließrate über alle Kanäle hinweg erzeugt. Mit diesem System kann die Kopplungszeit in allen Kanälen gleichzeitig durch simples Einstellen des Druckgradienten über das gesamte System variiert werden. Die Ventile des Systems werden vorzugsweise durch einen einzigen elektronischen Output der Steuerung 23 gesteuert.
Das gefächerte Kanalarray-Design, das in 7 gezeigt ist, stellt zwei separate Kanalblöcke, welche in aufeinanderfolgenden Prozessschritten verwendet werden sollen, während einer chemischen Synthese zur Verfügung. Ein Block bildet ein horizontales Array auf dem festen Substrat aus, wohingegen der andere Block ein vertikales Array ausbildet. Um eine Matrix von sich kreuzenden Reihen und Säulen von chemischen Verbindungen zu erzeugen, wird das feste Substrat von einem Block auf den anderen während der aufeinanderfolgenden Prozessschritte übertragen. Während viele Experimente nur einen einzigen Transfer von einem Block auf den anderen während einer Reihe von Prozessschritten verlangen, stellt die gefächerte Kanalanordnung des Transferblocks 75, wie in 11a und 11b dargestellt, eine Einheit zur Beibewahrung der akkuraten Registration des festen Substrates 71 relativ zu den Kanalblöcken 79 während wiederholtem Transfer zur Verfügung. In einigen Ausführungsformen kann ein einzelner Kanalblock für horizontale und vertikale Arrays durch einfaches Rotieren um 90° wie nötig verwendet werden.
Der Transferblock wird im Hinblick auf den Kanalblock so positioniert, dass die dimensionalen Eigenschaften des festen Substrates für die Ausrichtung nicht verwendet werden. Der Transferblock 75 wird durch den kinematischen Mount 81 an dem Kanalblock ausgerichtet, während das Vakuum von der Vakuumleitung 83 auf dem Kanalblock zur Vakuumleitung 77 auf dem Transferblock (während der normalen Operation hält ein Vakuum das Substrat gegen den Kanalblock) geschaltet wird. Das Substrat und der Trans ferblock werden dann bewegt und relativ gegen den zweiten Kanalblock neu positioniert. Vakuum wird dann auf dem zweiten Kanalblock geschaltet, wobei das Substrat in geeigneter Ausrichtung gehalten wird. Auf diese Weise kann akkurate Registration zwischen Prozessschritten unabhängig der Variation in den Dimensionen des individuellen Substrates gewährleistet werden. Das Transferblocksystem behält auch die Ausrichtung der Matrixfläche während des Transfers zu und von der Fließzelle während Experimenten, die sowohl mechanische als auch lichtinduzierte Prozessschritte verwenden, bei.
In einigen Ausführungsformen ist es nicht notwendig, den Kanalblock zu verwenden. Stattdessen werden in einigen Ausführungsformen kleine "Streifen" des Reagens auf das Substrat, beispielsweise durch Streifenbildung auf dem Substrat bzw. das Einbringen von Kanälen mit einer Pipettiereinheit, appliziert. Solche Ausführungsformen bergen gewisse Ähnlichkeit mit den Inseln-(spot)bildenden Ausführungsformen dieser Erfindung. Gemäß den anderen Ausführungsformen werden die Kanäle durch Abscheiden eines Fotolacks, wie er z.B. extensiv in der Halbleiterindustrie verwendet wird, ausgebildet. Solche Materialien schließen Polymethylmethacrylat (PMMA) und seine Derivate und Elektronenstrahl-resistente Substanzen, wie z.B. Poly(olefinsulfone) und dergleichen (detaillierter beschrieben in Ghandi, "VLSI Fabrication Prinicples", Wiley (1983) Chapter 10) ein. Gemäß diesen Ausführungsformen wird ein Lack abgeschieden, selektiv exponiert und geätzt, wobei ein Teil des Substrates exponiert zum Ankoppeln zurückgelassen wird. Diese Schritte des Abscheidens des Lackes, des selektiven Entfernens des Lackes und des Monomeranbindens werden wiederholt, um Polymere in einer gewünschten Sequenz an gewünschten Stellen auszubilden.
In einigen Ausführungsformen kann ein Lack verwendet werden, um bestimmte Regionen des Substrates zu aktivieren. Bestimmte Lackmaterialien, wie z.B. Säure-generierende Polymere, werden Protonen infolge von Bestrahlung freisetzen. Gemäß diesen Ausführungsformen wird ein Substrat mit einem solchen Material durch eine Maske oder in anderer Weise selektiv bestrahlt, so dass die bestrahlten Regionen des Substrates den sauren Bedingungen ausgesetzt werden. Eine Säure-labile Schutzgruppe auf dem Substrat oder Oligomere auf dem Substrat werden entfernt und hinterlassen eine aktivierte Region. An diesem Punkt kann der gesamte oder ein Teil des Lackes entfernt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Lack nur in den aktivierten Regionen entfernt, so dass die Kanäle in den aktivierten Regionen ausgebildet werden. Alternativ kann der Lack von dem gesamten Substrat entfernt werden. In diesem Fall kann ein separater Kanalblock mit dem Substrat in Kontakt gebracht werden, um Fließkanäle zu definieren oder es kann eine konventionelle VLSIPS^®-Prozedur eingesetzt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Substrat konventionelles Glas, Pyrex, Quarz, irgendeines der Vielzahl von polymeren Materialien oder dergleichen. Selbstverständlich kann das Substrat auch von irgendeinem der Vielzahl von Materialien, wie z.B. Silizium, Polystyrol, Polycarbonat oder dergleichen sein. In bevorzugten Ausführungsformen besteht der Kanalblock aus Silizium oder Polychlorotrifluorethylen, wie z.B. ein Material, das unter dem Handelsnamen KeIF^® 80, hergestellt von 3M bekannt ist, obwohl eine große Vielzahl von Materialien, wie z.B. Polystyrol, Polycarbonat, Glas, Elastomere, wie z.B. Kalrez, hergestellt von DuPont, verschiedene Keramiken, Edelstahl oder dergleichen verwendet werden können.
Die Kanäle in dem Kanalblock werden vorzugsweise maschinell hergestellt, durch Druckformgießen, durch Injektionsformen, durch Lithografie, durch Laserschneiden oder dergleichen, je nachdem, welches Material von Interesse ist. In einigen Ausführungsformen, welche größere Kanalblöcke einsetzen, werden die erhöhten Teile des Kanals im Kanalblock durch Läppen mit einem Läppingfilm (0,3 μm Gitter) behandelt. Solche glatten Oberflächen stellen gute Versiegelungen für das Substrat bereit, ohne dass ein Versiegelungsmittel dafür verwendet werden muss, und daher ohne dass die Möglichkeit besteht, dass versiegelndes Materials auf dem Substrat beim Rotieren des Kanalblocks zurückbleibt. Vorzugsweise werden alle Arbeitsschritte substanziell bei Umgebungstemperaturen und Umgebungsdrücken durchgeführt.
Ein besonders bevorzugter Kanalblock wird durch chemisches Ätzen von polierten Silizium-Wafern hergestellt. Chemisches Ätzen ist eine weitverbreitete Technik, welche in der integrierten Schaltkreisherstellung verwendet wird. Damit können leicht 60 oder mehr 100 μm große Kanäle auf einer 12,8 μm-Region eines polierten Siliziumwafers bereitgestellt werden. Sogar nach dem Ätzen bewahrt die oberen (ungeätzten) Oberflächenregionen des Wafers das sehr flache Profil des ungeätzten Wafers. Folglich ist enger Kontakt mit dem Substrat während dem Fließzellarbeitsschritt gewährleistet.
Während des Arbeitsvorgangs wird die Oberfläche des Substrates in geeigneter Form durch Reinigen beispielsweise mit organischen Lösungsmitteln, Methylchlorid, DMF, Ethylalkohol oder dergleichen behandelt. Optional kann das Substrat mit geeignetem Linkermolekül auf seiner Oberfläche versehen werden. Die Linkermoleküle können beispielsweise Arylacetylen, Ethylenglykol-Oligomere, welche zwischen 2 und 10 Monomere oder mehr enthalten, Diamine, Diazide, Aminosäuren oder Kombinationen davon sein. Im Anschluss wird die Oberfläche mit geschützten oberflächenaktiven Gruppen, wie z.B. TBOC- oder FMOC-geschützten Aminosäuren versehen. Solche Techniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt.
Anschließend werden der Kanalblock und das Substrat in Kontakt gebracht, wobei Flüssigkeits-enge Kanäle ausgebildet werden, die durch die Rillen in dem Kanalblock und das Substrat abgegrenzt werden. Wenn der Kanalblock und das Substrat in Kontakt stehen, wird anschließend ein Agens, welches die Schutzgruppen entfernt, durch einen ersten ausgewählten Kanal geleitet oder durch Gruppen von Kanälen durch Platzieren der Pipettierhilfe auf dem Fließeinlass des gewählten Kanals und optional der Vakuumquelle am Auslass des Kanals. Im Fall beispielsweise von TBOC-geschützten Aminosäuren kann das die Schutzgruppen entfernende Agens beispielsweise Trifluoroessigsäure (trifluoroacetic acid, TFA) sein. Auf diesen Schritt können optional Schritte folgen, in welchen der Überschuss an TFA beispielsweise mit Dichloromethan (DCM) gewaschen wird.
Anschließend wird eine erste Aminosäure oder ein anderes Monomer A durch den ersten ausgewählten Fließkanal geleitet. Vorzugsweise ist die erste Aminosäure auch mit einer geeigneten Schutzgruppe, wie z.B. TBOC, FMOC, NVOC oder dergleichen, versehen. Auf diesen Schritt folgen ebenso wieder geeignete Waschschritte. Die Schritte der Deprotonierung/des Koppelns, welche in der ersten Gruppe von Kanälen ausgeführt werden, werden zeitgleich oder im Anschluss in weiteren Gruppen von Kanälen wiederholt. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Monomer A durch die erste Gruppe von Kanälen geleitet werden, das Monomer B wird durch eine zweite Gruppe von Fließkanälen, etc., geleitet werden, so dass eine Vielzahl von verschiedenen Monomeren auf parallelen Kanälen des Substrates gekoppelt werden.
Anschließend werden das Substrat und der Kanalblock getrennt und optional wird das gesamte Substrat mit einem geeigneten Material gewaschen, um jegliche Form von unerwünschten Materialien von den Punkten zu entfernen, wo die Kanäle das Substrat berühren.
Das Substrat und/oder der Block wird dann optional gewaschen und verschoben und/oder mit dem Gestell rotiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Substrat um 90° aus einer ursprünglichen Position gedreht, obwohl einige Ausführungsformen stärkere oder geringere Rotation, wie z.B. von 0 bis 180° bereitstellen können. In weiteren Ausführungsformen, wie diejenigen, welche in Verbindung mit der Einheit aus 5 diskutiert wurden, werden zwei oder mehr verschiedene Kanalblöcke eingesetzt, um verschiedene Fließmuster über das Substrat zu erzeugen. Wenn der Kanalblock rotiert wird, kann er gleichzeitig relativ auf das Substrat bezogen, verschoben (translatiert) werden. "Translatiert" steht für jegliche relative Bewegung des Substrates und/oder des Kanalblocks, wohingegen "Rotation" sich auf Rotation des Substrates und/oder Kanalblocks um eine Achse, welche senkrecht zu dem Substrat und/oder Kanalblock steht, beziehen soll. Gemäß einigen Ausführungsformen erfolgt die relative Rotation in verschiedenen Winkeln für verschiedene Stadien der Synthese.
Die Schritte des Deprotonierens und des Koppelns von Aminosäuren oder anderen Monomeren werden dann wiederholt, was in der Ausbildung eines Arrays von Polymeren auf der Oberfläche des Substrates resultiert. Beispielsweise kann ein Monomer B durch ausgewählte Fließkanäle gelenkt werden, wodurch das Polymer AB an Schnittstellen der Kanäle, welche durch den Kanalblock in der ersten Position ausgebildet wurden, mit den Kanälen, welche durch den Kanalblock nach 90°-Rotation ausgebildet wurden, zur Verfügung gestellt werden.
Während Rotation des Kanalblocks gemäß bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung zur Verfügung gestellt wird, ist eine solche Rotation nicht notwendig. Beispielsweise können durch einfaches Fließen verschiedener Reagenzien durch die Kanäle Polymere, welche verschiedene Monomersequenzen aufweisen, ausgebildet werden. Um ein spezielles Beispiel zu nennen: es kann ein Teil der Kanäle mit Monomer "A" und ein Teil mit Monomer "B" in einem ersten Kopplungsschritt befüllt werden. Alle oder ein Teil der ersten Kanäle werden dann mit einem Monomer "C" befüllt und alle oder ein Teil der zweiten Kanäle mit einem Monomer "D"; dabei werden die Sequenzen AB bzw. CD ausgebildet. Solche Schritte könnten verwendet werden, um 100 Sequenzen unter Verwendung eines Basissatzes von 10 Monomeren mit einem 100 Rillen starken Kanalblock auszubilden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen viele Kanäle umfassenden Festphasensyntheseautomaten, wie in 12 dargestellt, bereit. In dieser Ausführungsform führt eine Kollektion von Zufuhr-Leitungen, wie z.B. ein Verteiler oder eine Kollektion von Röhren 1 000 aktivierte Reagenzien zu einer Unterlagenmatrix für die Synthese 1 002. Die Kollektion von Röhren 1 000 kann die Form eines steifen Syntheseblockverteilers einnehmen, welcher präzise an die Unterlagenmatrix für Synthese 1 002 angepasst werden kann. Die Unterlagenmatrix enthält eine Vielzahl von Reaktionsregionen 1 004, in welchen Verbindungen immobilisiert oder synthetisiert werden können. In bevorzugten Ausführungsformen schließen die Reaktionsregionen Synthesefritten, Blöcke, Harze oder dergleichen ein.
Die Lösungen, welche an die individuellen Reaktionsregionen der Unterlagenmatrix zugeführt werden, fließen durch die Reaktionsregionen zu Abfallentsorgungsregionen, Recyclingtank(s), Separatoren, etc. In einigen Ausführungsformen können die Reaktionslösungen einfach durch die Reaktionsregionen unter dem Einfluss der Schwerkraft fließen, wohingegen in anderen Ausführungsformen die Lösungen durch die Reaktionsregionen gezogen oder geschoben werden, durch Vakuum oder Druck.
Die individuelle Reaktionsregion 1 004 der Unterlagenmatrix werden voneinander durch eine Wand oder Dichtung 1 006 getrennt. Diese verhindern, dass die Reaktionslösung in einer Reaktionsregion in benachbarte Reaktionsregionen fließt und dort zu Verunreinigungen führt. In einer Ausführungsform werden die Reaktionsregionen durch Röhren definiert, welche mit Harz oder einer Reaktionsmischung gefüllt sein können. Die Dichtungen ermöglichen engen Kontakt zwischen der Unterlagenmatrix 1 002 und einer "Maske" 2 (nicht gezeigt). Die Maske dient dazu, die Zufuhr einer ersten Gruppe von Reaktionslösungen durch vorbestimmte Leitungen (Röhren) in Richtung eines ersten Satzes von Reaktionsregionen zu steuern. Dadurch, dass enger Kontakt zwischen den Zufuhrröhren 1 000, der Maske und der Unterlagenmatrix 1 002 gewährleistet wird, ist die Wahrscheinlichkeit, dass Reaktionslösungen versehentlich zum falschen Reaktionsplatz hinzugefügt werden, reduziert.
Nach jedem Verfahrensschritt kann die Maske verändert werden, so dass eine neue Gruppe von Reaktanten in Richtung eines neuen Satzes von Reaktionsregionen geliefert wird. Auf diese Art und Weise kann eine kombinatorische Strategie umgesetzt werden, um ein großes Array von Polymeren oder anderen Verbindungen herzustellen. In anderen Ausführungsformen können Mechanismen, verschieden von Masken, eingesetzt werden, um die individuellen Zufuhrröhren zu blockieren. Beispielsweise kann eine ein Array von steuernden Ventilen innerhalb der Röhren für einige Ausführungsformen geeignet sein.
Durch Einstellen der Dicke der Synthese-Unterlagenmatrix kann die Quantität des immobilisierten Materials in den Reaktionsregionen kontrolliert werden. Beispielsweise können dünne Synthese-Unterlagenmatrizen verwendet werden, um kleine Mengen von oberflächengebundenen Oligomeren zur Analyse zu produzieren, wohingegen dicke Unterlagenmatrizen verwendet werden können, um relativ große Mengen an Oligomeren zu synthetisieren, welche von der Unterlage zur weiteren Verwendung abgespalten werden können. In der letztgenannten Ausführungsform kann ein Kollektor, welcher Dimensionen aufweist, die an individuellen Syntheseunterlagen angepasst sind, verwendet werden, um Oligomere zu sammeln, welche ultimativ von der Reaktionsmatrix freigesetzt werden.
Um das Potenzial des Systems in der Synthese einer Vielzahl von Polymeren zu illustrieren: eine quadratische Synthesematrix, welche entlang jeder Kante 10 cm misst und Reaktionsregionen von 5 mm getrennt durch 5 mm breite Abdichtungen aufweist, stellt 100 individuelle Syntheseplätze (Reaktionsregionen) zur Verfügung. Durch Reduktion der Größe der Reaktionsregion auf 2,5 mm auf jeder Kantenlänge, werden 400 Reaktionsregionen verfügbar.
Während lineare Rillen hier in den bevorzugten Aspekten der Erfindung gezeigt werden, werden andere Ausführungsformen der Erfindung zirkulare Ringe oder andere Anordnungen, wie z.B. zirkulare Ringe mit radialen Rillen, welche zwischen ausgewählten Ringen hin- und herlaufen, bereitstellen. Entsprechend einiger Ausführungsformen werden Kanalblöcke in verschiedenen geometrischen Konfigurationen von einem Schritt auf den anderen verwendet, beispielsweise zirkulare Ringe in einem Schritt und lineare Streifen in dem nächsten. 13a illustriert eine der möglichen Anordnungen, in welchen die Kanäle 409 in einer serpentinenartigen Anordnung in dem Kanalblock 407 angeordnet sind. Durch geeignete Translation und/oder Rotation des Kanalblocks werden Polymere einer gewünschten Monomersequenz an der Schnittstelle der Kanäle im Verlauf sukzessiver Polymerzufuhr, beispielsweise an der Stelle 501, wo die Schnittstelle eines früheren bzw. späteren Satzes von Kanälen in gestrichelten Linien dargestellt ist, ausgebildet. 13b illustriert eine andere Anordnung, in welcher die Kanäle (in diesem Fall ohne Fließpfade 413), in einer linearen Anordnung bereitgestellt werden, wobei die Gruppen 503 und 505 in benachbarten Regionen des Substrates lokalisiert sind und sich nur über einen Teil der Substratlänge erstrecken.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden die verschiedenen Reagenzien, wie z.B. diejenigen, die die verschiedenen Monomere enthalten, nicht durch die Öffnungen 413 gepumpt. Stattdessen wird das Reagens in eine der Rillen, wie beispielsweise die Rillen 409, dargestellt in 13b, unter Befüllen der Rille platziert. Das Substrat wird dann oben auf dem Kanalblock platziert, und es wird ermöglicht, dass die exponierten Teile des Substrates mit den Materialien in den Rillen reagieren. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Kanäle von der gleichen Breite wie die erhöhten Regionen zwischen den Kanälen. Gemäß dieser Ausführungsformen kann das Substrat dann lateral um eine Kanalbreite oder ein ganzteiliges Vielfalt der Kanalbreite verschoben werden, was die Reaktion mit bzw. das Platzieren von Monomeren auf den Regionen zwischen den Kanälen in einem vorangehenden Kopplungsschritt erlaubt. Anschließend werden das Substrat oder der Kanalblock für die nächste Serie von Kopplungsschritten rotiert.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren wiederholt, um mehr als 10 verschiedene Polymersequenzen auf der Oberfläche des Substrates bereitzustellen. In mehr bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren wiederholt, um mehr als 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ oder mehr Polymersequenzen auf einem einzigen Substrat bereitzustellen. In einigen Ausführungsformen wird das Verfahren wiederholt, um Polymere mit nicht mehr als zwei Monomeren bereitzustellen. Obwohl das Verfahren vollständig adaptiert werden kann, um Polymere, welche 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100 oder mehr Monomere darin aufweisen, auszubilden.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen wird das Array von Polymersequenzen in einer oder mehreren einer Vielzahl von Screeningverfahren verwendet; ein solches wird in der gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung Serien-Nr. 796,947, eingereicht am 22. November 1991, beschrieben. So wird beispielsweise gemäß einer Ausführungsform das Substrat dann einem Rezeptor von Interesse exponiert, beispielsweise einem Enzym oder einem Antikörper. Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen wird der Rezeptor mit Fluorescin gelabelt oder in anderer Weise gelabelt, so dass einfache Detektion der Stelle, an welche der Rezeptor bindet, ermöglicht wird. Gemäß einigen Ausführungsformen wird der Kanalblock verwendet, um Lösungen, welche einen Rezeptor enthalten, über ein synthetisiertes Array von Polymeren zu leiten. Beispielsweise wird gemäß einigen Ausführungsformen der Kanalblock verwendet, um Rezeptorlösungen, welche verschiedene Rezeptorkonzentrationen aufweisen, über Regionen des Substrates zu leiten.
Gemäß der meist bevorzugtesten Ausführungsformen wird die Amplifikation des durch Fluorescinlabeling bereitgestellten Signals durch Exponieren des Substrates gegenüber dem Antikörper von Interesse zur Verfügung gestellt und anschließend des Exponieren des Substrates gegen ein gelabeltes Material, welches komplementär zum gewünschten Antikörper ist, und welches vorzugsweise an vielen Stellen des Antikörpers von Interesse bindet. Beispielsweise kann in einer speziellen Ausführungsform, falls ein Mausantikörper untersucht werden soll, ein gelabelter zweiter Antikörper dem Substrat ausgesetzt werden, welcher beispielsweise ein Ziege-anti-Maus-Antikörper ist. Solche Techniken sind in PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092 beschrieben.
V. Platzierende(Abscheidungs-)Ausführungsformen (Spotting Embodiments)
Gemäß einigen Ausführungsformen werden Monomere (oder andere Reaktanten) durch einen Spender in Tropfen, die vordefinierte Regionen befüllen, abgeschieden. Beispielsweise scheidet der Spender in einem einzigen Kopplungsschritt ein erstes Monomer in einer Reihe von vordefinierten Regionen durch Bewegen über eine erste Region, Abscheiden eines Tropfens und Bewegen zu einer zweiten Region, Abscheiden eines Tropfens, usw., bis jede der gewählten Regionen das Monomer aufgenommen hat, ab. Anschließend scheidet der nächste Spender ein zweites Monomer in einer zweiten Serie von vordefinierten Regionen in der gleichen Art und Weise ab. In einigen Ausführungsformen können mehr als ein Spender verwendet werden, so dass mehr als ein Monomer gleichzeitig abgeschieden wird. Die Monomere können sofort nach Kontakt mit den Reaktionsregionen reagieren oder können einen weiteren Aktivierungsschritt erforderlich machen, beispielsweise die Zufuhr eines Katalysators. Nach der Abscheidung einer Reihe von Monomeren und die Reaktionen vordefinierter Regionen über das gesamte Substrat hinweg, wird die Lösung von unreagiertem Monomer von dem Substrat entfernt. Dies schließt einen ersten Verfahrensschritt ab.
Für Zwecke dieser Ausführungsform wird der Raum zwischen den einzelnen Reaktionsregionen des Substrates vorzugsweise weniger als 3 mm sein und noch mehr bevorzugt zwischen 5 und 100 μm. Des Weiteren wird der relative Winkel zwischen den Regionen vorzugsweise innerhalb 1°, mehr bevorzugt innerhalb 0,1° liegen. Vorzugsweise wird das Substrat zumindest ungefähr 100 Reaktionsregionen einschließen und mehr bevorzugt mindestens ungefähr 1 000 Reaktionsregionen und am meisten bevorzugt zumindest ungefähr 10 000 Reaktionsregionen. Selbstverständlich wird die Dichte der Reaktionsregionen auf dem Substrat variieren. In bevorzugten Ausführungsformen existieren zumindest ungefähr 1 000 Reaktionsregionen pro cm² des Substrates, und mehr bevorzugt ungefähr 10 000 Reaktionsregionen pro cm².
Um Reaktionstropfen konsistent an präzise spezifizierte Regionen abzuscheiden, ist ein Referenz-Rahmen, welcher dem Zufuhrinstrument und dem Substrat gemeinsam ist, vonnöten. In anderen Worten, müssen die Referenzkoordinaten des Instrumentes akkurat auf die Referenzkoordinaten des Substrates passen. Idealerweise sind nur zwei Referenzpunkte auf dem Substrat notwendig, um das Array der Polymerregionen komplett anzupassen. Das Spenderinstrument lokalisiert diese Referenzpunkte und stellt dann seine internen Referenzkoordinaten ein, um den notwendigen Abgleich bereitzustellen. Danach kann sich der Spender um eine bestimmte Distanz in einer speziellen Richtung bewegen und kann direkt über einer bekannten Region positioniert werden. Selbstverständlich muss das Spenderinstrument präzise wiederholbare Bewegungen durchführen können. Des Weiteren dürfen die individuellen Regionen des Arrays sich nicht in Bezug auf die Referenzmarkierungen auf dem Substrat, nachdem diese Referenzmarkierungen ausgebildet wurden, bewegen. Unglücklicherweise können das Pressen oder andere mechanische Operationen, welche allgemein in der Fabrikation auftreten, wie auch die Verwendung eines Substrates, das Substrat verformen, so dass die Übereinstimmung zwischen den Referenzmarkierungen und den Reaktionsregionen verändert wird.
Folglich wird in bevorzugten Ausführungsformen ein Substrat verwendet, welches sowohl "globale" wie auch "lokale" Referenzmarkierungen enthält. In bevorzugten Ausführungsformen sind die beiden globalen Referenzmarkierungen günstig auf dem Substrat lokalisiert, um den ursprünglichen Referenzrahmen zu definieren. Wenn diese Punkte lokalisiert werden, weist das Spenderinstrument einen geeigneten Abgleich des Substrats und den vordefinierten Regionen darauf auf. Um in der Lokalisierung der exakten Position der Regionen zu assistieren, wird das Substrat weiter in lokale Referenzrahmen unterteilt. Auf diese Weise wird in einem anfänglichen "Kurs" Einstellungsverfahren der Spender innerhalb einer der lokalen Referenzrahmen positioniert. Sobald es in der lokalen Region ist, sucht das Spenderinstrument lokale Referenzmarkierungen, um weiter einen lokalen Referenzrahmen zu definieren. Ausgehend von diesem bewegt sich der Spender exakt zu der Reaktionsregion, wo das Monomer abgeschieden wird. Auf diese Art und Weise können die Effekte von Wölbungen oder anderen Deformationen minimiert werden. Die Anzahl an lokalen Referenzmarkierungen wird durch die Menge der Deformationen, welche für das Substrat zu erwarten sind, bestimmt. Wenn das Substrat hinreichend steif ist, so dass kaum oder keine Deformation auftreten wird, sind nur sehr wenige lokale Referenzmarkierungen notwendig. Wenn substanzielle Deformation erwartet wird, sind jedoch mehrere lokale Referenzmarkierungen vonnöten.
Um geeignete Referenzpunkte anfänglich zu lokalisieren und den Spender im Hinblick darauf abzugleichen, kann ein bildgebendes oder verdunkelndes System eingesetzt werden. In einem bildgebenden System wird eine Kamera fest auf der Spenderdüse montiert. Wenn die Kamera den Referenzpunkt (die Referenzpunkte) lokalisiert, weiß man, dass der Spender um einen fixen Abstand in einer fixen Richtung von dem Punkt entfernt ist, und ein Referenzrahmen wird etabliert. Verdunkelungssysteme der vorliegenden Erfindung lokalisieren den Referenzpunkt (die Referenzpunkte) beispielsweise durch kapazitive, resistive oder optische Techniken. In einem Beispiel einer optischen Technik wird ein Laserstrahl durch das Substrat transmittiert oder von dem Substrat reflektiert. Wenn der Strahl auf eine Referenzmarkierung stößt, wird eine Veränderung der Lichtintensität von einem Sensor delektiert. Kapazitive und resistive Techniken werden auf ähnliche Art und Weise verwendet. Ein Sensor registriert eine Veränderung hinsichtilich der Kapazität oder des Widerstandes, wenn ein Referenzpunkt getroffen wird.
Ausgehend von einem einzelnen Referenzpunkt wird der Spender von einer Reaktionsregion zu anderen Reaktionsregionen des Substrates um eine korrekte Distanz in der korrekten Richtung translatiert (man nennt dies "Dead Reckoning"-Navigierungstechnik). An jedem Haltepunkt scheidet der Spender korrekt abgemessene Mengen von Monomer ab. Analoge Systeme, welche weit verbreitet in der Herstellung mikroelektronischer Einheiten verwendet werden und in testenden Wissenschaften, können sich in Geschwindigkeiten von bis zu 3 bis 10 Haltepunkten pro Sekunde bewegen. Die translatorische (X-Y) Genauigkeit solcher Systeme liegt gut innerhalb 1 μm.
Translatorische Mechanismen zum Bewegen des Spenders werden vorzugsweise mit geschlossenen Wiederholungs-Positionierungs-Feedback-Mechanismen (Impulsgebern) ausgerüstet, und haben unsignifikanten Totgang (backlash) und unsignifikante Hysterese. In bevorzugten Ausführungsformen weist der Translationsmechanismus eine hohe Auflösung auf, d.h., besser als ein Bewegungsschritt pro Impulsgebertakt. Des Weiteren weist der elektromechanische Mechanismus vorzugsweise eine hohe Wiederholbarkeit relativ bezogen auf die Reaktionsregionen-Durchmesser-Weglänge auf (typischerweise = ±1 μm oder besser).
Um einen Tropfen der Monomerlösung akkurat auf dem Substrat abzuscheiden, muss die Spenderdüse in einem korrekten Abstand über der Oberfläche platziert werden. In einer Ausführungsform wird die Spenderspitze vorzugsweise von 5 bis 15 μm oberhalb der Oberfläche lokalisiert werden, wenn ein fünf Nanoliter Tropfen freigesetzt wird. Mehr bevorzugt wird der Tropfen etwa 10 μm über der Substratoberfläche sein, wenn der Tropfen freigesetzt wird. Der Grad der Steuerung, die notwendig ist, um solch eine Genauigkeit zu erzielen, wird mit einem wiederholbaren hochauflösenden Translationsmechanismus von dem oben beschriebenen Typus erreicht. In einer Ausführungsform wird die Höhe über dem Substrat durch Bewegen des Spenders in Richtung des Substrates in kleinen Inkrementen bestimmt, so lange, bis die Spenderspitze das Substrat berührt. An diesem Punkt wird der Spender von der Oberfläche um eine festgesetzte Anzahl von Inkrementen wegbewegt, was mit einem speziellen Abstand korrespondiert. Von dort wird der Tropfen auf die Zelle unterhalb freigesetzt. Vorzugsweise liegen die Inkremen te, in denen der Spender sich bewegt, bei weniger als etwa 5 μm und mehr bevorzugt bei weniger als etwa 2 μm.
In einer alternativen Ausführungsform wird die Spenderdüse von einer Ummantelung umgeben, welche sich um einen fixierten Abstand über die Spenderspitze ausdehnt. Vorzugsweise korrespondiert dieser Abstand mit dem Abstand, um den der Tropfen fallen wird, wenn er auf die ausgewählte Reaktionsregion angeliefert wird. Wenn also die Ummantelung die Substratoberfläche kontaktiert, wird die Bewegung des Spenders unterbrochen und der Tropfen wird freigesetzt. Es ist nicht notwendig, in dieser Ausführungsform die Spitze zurück, weg von dem Substrat, bewegen, nachdem ein Kontakt hergestellt wurde. Der Punkt des Kontakts mit der Oberfläche kann mit einer Vielzahl von Techniken bestimmt werden, beispielsweise durch Aufzeichnen der Kapazität oder des Widerstandes zwischen der Spitze des Spenders (oder der Ummantelung) und dem Substrat unterhalb. Eine rapide Veränderung in irgendeiner dieser Eigenschaften wird nach Kontakt mit der Oberfläche festgestellt.
Bis zu diesem Punkt wurde das platzierende Systems nur mit Blick auf translatorische Bewegungen beschrieben. Jedoch können andere Systeme ebenso eingesetzt werden. In einer Ausführungsform wird der Spender im Hinblick auf die Region von Interesse durch ein System, das analog zu einem solchen ist, welches auf den Gebieten der magnetischen und optischen Speichermedien eingesetzt wird, angepasst. Beispielsweise wird die Region, in welcher ein Monomer abgeschieden werden soll, durch eine Spur- und Sektorlokalisierung auf der Scheibe (Disk) identifiziert. Der Spender wird dann in Richtung einer geeigneten Spur bewegt, während das scheibenförmige Substrat rotiert. Wenn die geeignete Zelle unterhalb des Spenders positioniert ist (wie durch den geeigneten Sektor auf der geeigneten Spur angegeben), wird ein Tropfen der Monomerlösung freigesetzt.
Die Steuerung der Tropfengröße kann durch verschiedene Techniken bewerkstelligt werden. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform ein herkömmliches Mikropipettierinstrument angepasst, um Tropfen von fünf Nanolitern oder weniger aus einer Kapillare zu spenden. Solche Tropfen passen in Regionen, welche einen Durchmesser von 300 μm oder weniger aufweisen, wenn eine nicht-benetzbare Maske der Erfindung eingesetzt wird.
In einer anderen Ausführungsform ist der Spender eine piezoelektrische Pumpe, welche geladene Tropfen generiert und sie in die Reaktionsregionen durch ein elektrisches Feld in einer Art und Weise dirigiert, welche analog zu konventionellen Tintenstrahldruckern ist. Tatsächlich können einige Tintenstrahldrucker mit kleiner Modifikation durch einfaches Ersetzen einer Monomer enthaltenden Lösung anstelle der Tinte eingesetzt werden. So beschreiben beispielsweise Wong et al., Europäische Patentanmeldung 0260965, die Verwendung eines herkömmlichen Druckers, um einen Antikörper auf eine feste Matrix zu applizieren. In dem Verfahren wird eine Lösung, die den Antikörper enthält, durch eine kleine Bohrungsdüse, die vibriert, gezwungen, und zwar in einer Art und Weise, dass die Lösung in verschiedene diskrete Tropfen aufgeteilt wird. Die Tropfen werden nacheinander durch Passieren durch ein elektrisches Feld geladen und dann auf das Matrixmaterial abgelenkt.
Ein herkömmlicher Tintentropfendrucker enthält ein Reservoir, in welchem die Tinte unter Druck gehalten wird. Das Tintenreservoir befüllt eine Leitung, welche mit einer Düse verknüpft ist. Ein elektromechanischer Wandler wird eingesetzt, um die Düse bei einer gewissen geeigneten hohen Frequenz vibrieren zu lassen. Die tatsächliche Struktur der Düse kann eine Vielzahl von verschiedenen Konstruktionen haben, einschließend eine ausgezogene Glasröhre, welche durch einen externen Wandler zum Vibrieren gebracht wird, oder eine Metallröhre, welche von einem externen Wandler (z.B. einem piezoelektrischen Kristall) vibriert wird, oder ein magnetostriktives Metallrohr, welches magnetostriktiv vibriert wird. Die Tinte wird dementsprechend aus der Düse in einem Strahl ausgeschleudert, welcher kurz danach in individuelle Tropfen zerfällt. Eine Elektrode kann in der Nähe der Düse vorhanden sein, um eine Ladung auf die Tropfen zu übertragen. Konventionelle Tintentropfenspender werden in US-Patent Nrn. 3,281,860 und 4,121,222 beschrieben.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Reaktionslösungen von einem Reservoir auf das Substrat durch eine elektrophoretische Pumpe zugeführt. In dieser Einheit verbindet eine dünne Kapillare ein Reservoir des Reaktanten mit der Düse des Spenders. An beiden Enden der Kapillare liegen Elektroden vor, um eine Potenzialdifferenz aufzubauen. Wie im Stand der Technik bekannt ist, ist die Geschwindigkeit, mit welcher eine chemische Spezies in einem Potenzialgradienten eines elektrophoreti schen Mediums wandert, durch eine Vielzahl von physikalischen Eigenschaften bestimmt, unter diesen die Ladungsdichte, die Größe, die Form der Spezies, welche transportiert werden soll, wie auch die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Transport-mediums selbst. Unter geeigneten Bedingungen des Potenzialgradienten der Kapillardimensionen und der Rheologie des Transportmediums, ein hydrodynamischer Fluss innerhalb der Kapillare eingestellt werden. Folglich wird in einer elektrophoretischen Pumpe in der vorliegenden Erfindung der Großteil der Flüssigkeit, die den gewünschten Reaktanten enthält, von einem Reservoir zu einem Substrat gepumpt. Durch Einstellen der geeigneten Position des Substrates mit Bezug auf die Düse der elektrophoretischen Pumpe wird die Reaktionslösung präzise an vordefinierte Reaktionsregionen angeliefert.
In einer speziell hilfreichen Anwendung wird die elektrophoretische Pumpe verwendet, um ein Array zu produzieren, das verschiedene Fraktionen von unbekannten Reaktionslösungen enthält. Beispielsweise kann ein Extrakt eines biologischen Materials, wie z.B. eines Blattes oder einer Zellkultur verschiedene unbekannte Materialien enthalten, einschließlich Rezeptoren, Liganden, Alkaloide, Nukleinsäuren und sogar biologische Zellen, von denen einige eine gewünschte Aktivität aufweisen. Wenn ein Reservoir eines solchen Extraktes elektrophoretisch gepumpt wird, werden die verschiedenen Spezies, welche darin enthalten sind, durch die Kapillare mit verschiedenen Geschwindigkeiten wandern. Selbstverständlich sollten die verschiedenen zu pumpenden Komponenten eine gewisse Ladung tragen, so dass sie getrennt werden können. Falls das Substrat im Hinblick auf den Spender bewegt wird, während die Extraktkomponenten elektrophoretisch getrennt werden, wird ein Array produziert, welches verschiedene unabhängige Spezies enthält. Dieses Array wird dann hinsichtlich seiner Aktivität in einem Bindungs-Assay oder in einem anderen geeigneten Test untersucht. Die Elemente des Arrays, welche vielversprechende Aktivität zeigen, werden mit einer Fraktion des Extraktes korreliert, welche anschließend aus anderer Quelle zum Zwecke weiterer Untersuchungen isoliert wird. In einigen Ausführungsformen werden die Komponenten in der Extraktlösung beispielsweise mit einem Fluoreszenzlabel markiert. In diesem Fall detektiert während des Verfahrens der Zufuhr der Lösung mit der elektrophoretischen Pumpe, ein Fluoreszenzdetektor, wann eine gelabelte Spezies auf dem Substrat abgeschieden wird. In einigen Ausführungsformen bindet die Markierung selektiv an bestimmte Typen von Verbindungen innerhalb des Extraktes und verleiht diesen Verbindungen eine Ladung.
Andere geeignete Zufuhrverfahren schließen osmotische Pumpen und Zell-(biologische)-Sortierer ein. Eine osmotische Pumpe liefert einen stetigen Fluss der Lösung über einen relativ langen Zeitraum. Die Konstruktion solcher Pumpen ist im Stand der Technik wohl bekannt, wobei allgemein eine Lösung des Extrakts von Interesse in einen für die Lösung permeablen Beutel eingebracht wird. Osmotischer Druck wird auf die Extraktlösung von den Lösungsmittelmolekülen ausgeübt, welche durch den Beutel diffundieren, um den Konzentrationsausgleich herzustellen. Der Extrakt wird auf diese Weise durch eine Düse in dem Beutel mit einer konstanten Geschwindigkeit gezwungen. Zellsortierer sind im Stand der Technik wohl bekannt und können in Anwendungen verwendet werden, wo es wünschenswert ist, einzelne biologische Zellen auf verschiedene Stellen auf dem Substrat aufzubringen.
Obwohl die oben genannten Ausführungsformen auf Systeme gerichtet sind, die flüssige Tropfen einsetzen, können kleinere Mengen von jeder Testsubstanz auch zu der Zelle in Form von Miniaturpellets geliefert werden. Solche Pellets können von der Verbindung von Interesse (beispielsweise Liganden, die Anwendungen in einem Affinitätsassay) ausgebildet werden und von einem oder mehreren Arten von inertem bindenden Material. Die Zusammensetzung solcher Bindemittel und Verfahren für die Herstellung der Pellets werden den Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein. Solche "Minipellets" werden kompatibel mit einer großen Vielzahl von Testsubstanzen sein, über einen langen Zeitraum stabil sein, geeignet für die leichte Rückgewinnung vom Aufbewahrungsbehälter und dispergierbar (d.h. nicht klebrig, vorzugsweise in einer Flüssigkeit, wie einem physiologischen Puffer suspendierbar) sowie inert im Hinblick auf die Bindungsaktivität des Rezeptors sein.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Reaktantenlösungen in jeder vordefinierten Region vom Bewegen in benachbarte Regionen durch geeignete Barrieren oder begrenzende Regionen gehindert. Beispielsweise wird zur Begrenzung von wässrigen Monomerlösungen ein hydrophiles Material verwendet, um die Reaktionsregionen zu coaten, während hydrophobes Material in bevorzugten Ausführungsformen verwendet wird, um die Region, welche die individuellen Reaktionsreaktionen umgibt, zu coaten. Selbstverständlich sind, wenn nicht-wässrige oder nicht-polare Lösungsmittel eingesetzt werden, verschiedene Oberflächencoatings im Allgemeinen bevorzugt. Durch Wahl der geeigneten Materialien (Substrate, hydrophobe Coatings und Reaktantenlösungsmitteln) wird der Kontaktwinkel zwischen dem Tropfen und dem Substrat in vorteilhafter Weise kontrolliert. Große Kontaktwinkel zwischen den Reaktantentropfen und dem Substrat sind gewünscht, da die Lösung dann eine relativ kleine Reaktionsregion benetzt; mit kleinen Kontaktwinkeln benetzt der Tropfen auf der anderen Seite eine größere Fläche. In extremen Fällen werden die Tropfen verteilt, so dass sie die ganze Oberfläche bedecken.
Der Kontaktwinkel wird durch den folgenden Ausdruck, welcher als Youngs Gleichung bekannt ist, bestimmt: cosθ = (σsg – σsl)/σlg wobei θ der Benetzungswinkel, σ_sg die Fest-zu-Gasförmig-Grenzflächenspannung, σ_sl die Fest-zu-Flüssig-Grenzflächenspannung und σ_la die Flüssig-zu-Gasförmig-Grenzflächenspannung ist. Die Werte dieser Oberflächenspannungen werden durch thermodynamische Betrachtungen, einschließend die chemischen Komponenten und das flüssige bzw. feste Substrat bestimmt. Die Flüssig-zu-Gasförmig-Grenzflächenspannung für verschiedene Chemikalien kann einfach durch eine Vielzahl von Techniken gemessen werden, beispielsweise durch diejenigen, welche in Adamson, Physical Chemistry of Surfaces, John Wiley and Sons, 5th. Ed. (1990), beschrieben werden. Der Unterschied der Fest-zu-Flüssig- und der Fest-zu-Gasförmig-Spannung kann für ein bekanntes System empirisch aus einem Zisman-Plot bestimmt werden. In diesem Ansatz werden die Kontaktwinkel für eine homologe Serie von Flüssigkeiten auf einer gegebenen festen Oberfläche gemessen. Für einige Flüssigkeiten in der Serie wird ein "kritischer Kontaktwinkel" beobachtet, unterhalb welchem Flüssigkeiten von geringerer Oberflächenspannung die Oberflächen benetzen. Die Flüssig-zu-gasförmig-Oberflächenspannung der Flüssigkeit an diesem kritischen Kontaktwinkel wird als die Oberflächenspannung der festen Phase angenommen. Dieser Ansatz hat sich für Feststoffe von niedriger Energie, wie z.B. Teflon, Polyethylen, Kohlenwasserstoffe, etc., als recht vernünftige Resultate liefernd herausgestellt. Die Information, die aus solchen Untersuchungen erhalten wird, wird verwendet, um Substratzusammensetzungen zu optimieren und Benetzungswinkel für bekannte Lösungen von Reaktanten in dem Array zu vergrößern.
Verfahren zur Kontrolle chemischer Zusammensetzung und damit der lokalen freien Oberflächenenergie einer Substratoberfläche schließen eine Vielzahl von Techniken ein, die dem Fachmann offensichtlich sind. Chemische Gasphasenabscheidung und andere Techniken, welche in der Herstellung von integrierten Schaltkreisen angewandt werden, können eingesetzt werden, um hocheinheitliche Schichten auf ausgewählten Regionen einer Oberfläche abzuscheiden. Als ein spezielles Beispiel wurde die Benetzbarkeit eines Siliziumwafers auf der Mikrometerskala durch eine Kombination von Abscheidungen einer selbst-organisierenden Monoschicht und Feinstzerspanung (micro machining) Manipuliert. Siehe Abbott et al., "Manipulation of the Wettability of Surfaces on the .1 to 1 Micrometer Scale Through Micromachining and Molecular Self-Assembly", Science, 257 (4. Sept., 1992).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Umgebungen der individuellen Regionen auf einem hydrophilen Substrat, welches durch das selektive Entfernen hydrophober Schutzgruppen von der Substratoberfläche definiert ist, ausgebildet. Beispielsweise kann eine Monoschicht von hydrophoben fotoschützenden Gruppen beispielsweise an Linkermoleküle gekoppelt werden, die an die Substratoberfläche angebunden sind. Die Oberfläche wird dann selektiv (oder auf andere Weise, beispielsweise durch Säure aktiviert) durch eine Maske bestrahlt, um diejenigen Flächen zu exponieren, in welchen die Reaktionsregionen lokalisiert sind. Dies trennt die Schutzgruppen von der Substratoberfläche ab, und verursacht dabei, dass die Reaktionsregionen weniger hydrophob als die Umgebungsfläche sind. Dieses Verfahren erzeugt eine hohe Dichte von Reaktionsregionen auf der Substratoberfläche. Da hydrophobe Materialien niedrigere freie Oberflächenenergien (Oberflächenspannungen) als Wasser aufweisen, zieht sich der Lösungstropfen in der Zelle eher zusammen, als dass er sich verteilt.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird das Substrat zunächst durch kovalentes Anbinden einer Monoschicht aus gewünschten funktionellen Gruppen (z.B. Amin, Hydroxyl, Carboxyl, Thiol, etc.), die durch eine hydrophile fotolabile Schutzgruppen geschützt ist, hergestellt. Falls das Substrat eine Glasoberfläche bereitstellt, kann die Monoschicht in einer Silanisierungsreaktion, wie unten gezeigt, abgeschieden werden.
In den oben abgebildeten Strukturen ist Y eine überbrückende Gruppe, wie z.B. eine Polymethylenkette, X ist eine reaktive geschützte Gruppe, wie z.B. NH, C(O)O, O, S, etc., und Pr ist eine hydrophobe fotolabile Schutzgruppe.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform, wie unten gezeigt, werden die Substratoberfläche zuerst beispielsweise durch eine Silanisierungsreaktion mit geeigneten Agenzien derivatisiert, um eine Aminschicht bereitzustellen. Ein Molekül, welches einen Spacer enthält, eine reaktive Gruppe und eine fotolabile Gruppe wird dann auf der Oberfläche angebunden.
Die fotolabile Schutzgruppe sollte hinreichend hydrophob sein, um die Substratoberfläche substanziell nicht benetzbar zu machen. Die Entfernung der Schutzgruppe in speziellen Flächen durch Exposition gegen Licht durch eine geeignete Maske setzt die reaktiven funktionellen Gruppen frei. Da diese Gruppen hydrophil ihrem Charakter nach sind, werden sie das Substrat in den exponierten Regionen benetzbar machen.
Die Klasse der Nitrobenzyl-Schutzgruppen, welche durch eine Nitroveratryl-Gruppe beispielhaft dargestellt wird, vermittelt den Glasoberflächen, an welche ein Mitglied der Klasse angebunden wird, hinreichend Hydrophobizität. Die Hydrophobizität der Basisschutzgruppe aus Nitrobenzyl wird durch Anhängen von einer Gruppe aus einem ketten förmigen Kohlenwasserstoff-Substituenten verstärkt. Beispiele für hydrophobe Ketten schließen C₁₂H₂₅(Lauryl)- oder C₁₈H₃₇(Stearyl)-Substituenten ein. Die Synthese von geeignet aktivierten Formen (Bromid, Chloromethylether und Oxycarbonylchlorid) einer typischen Schutzgruppe ist schematisch in 14 dargestellt.
Die Abstandshaltergruppe ("Y") verleiht dem Netz die hydrophobe oder hydrophile Natur der Oberfläche. Beispielsweise tendieren diejenigen Spacer, die in erster Linie aus Kohlenwasserstoffketten bestehen, wie z.B. -(CH₂)_n-, dazu, die Benetzbarkeit herabzusetzen. Abstandshalter, welche Polyoxyethylen-(-(CH₂CH₂O)_n-)- oder Polyamid-(-(CH₂CONH)_n--Ketten enthalten, tendieren dazu, die Oberfläche hydrophiler zu machen. Einen sogar noch größeren Effekt kann man erzielen, wenn Abstandshaltergruppen verwendet werden, die über die schützenden funktionellen Gruppen hinaus mehrere "maskierte" hydrophile Gruppen besitzen. Dies wird unten illustriert.
In bevorzugten Ausführungsformen stellen die hydrophilen Reaktionsregionen einen zweidimensionalen Kreis und eine andere Form dar, die ein Seitenverhältnis in der Nähe von 1 aufweisen (d.h. die Länge ist substanziell größer oder kleiner als die Breite). Jedoch in anderen Ausführungsformen kann die hydrophile Region die Form eines langen Kanals einnehmen, welcher verwendet wird, um die fließenden Reaktanten in Art und Weise wie oben beschrieben zu leiten.
In noch anderen Ausführungsformen sind die Reaktionsregionen dreidimensionale Flächen, welche beispielsweise durch Dichtungsringe oder Vertiefungen definiert werden. Die Vertiefungen oder Dichtungsringe können auch als Identifikationsmarkierungen zum Dirigieren des Spenders in Richtung der Region von Interesse fungieren.
Falls das Lösungsmittel (oder eine andere Flüssigkeit, welche zum Anliefern des Reaktanten verwendet wird) einen hinreichend hohen Dampfdruck aufweist, kann das Verdampfen verursachen, dass die Reaktantenkonzentration vergrößert wird. Wenn das nicht kontrolliert wird, verursacht dieser Prozess letztendlich das Ausfallen des gelösten Stoffes aus der Lösung. Die Effekte des Verdampfens können durch Versiegeln ausgewählter Regionen des Substrates eliminiert werden, wenn sie nicht zugänglich sein müssen. Alternativ kann der Partial-Druck der volatilen Reagenzien eingestellt werden, so dass die flüssige und die Gasphase in ihrer Fugazität angeglichen werden und die thermodynamische Kraft, welche die Verdampfung treibt, reduziert wird. Der Partialdruck der Reagenzien kann durch die Bereitstellung eines relativ großen Reservoirs an volatilen Reagenzien in einer versiegelten Kammer vergrößert werden. Beispielsweise können Lösungsmittel, die einen niedrigen Dampfdruck unter den gewünschten Bedingungen aufweisen, verwendet werden. In einigen Fällen kann die Verdampfung weiter kontrolliert werden durch die Anwendung eines Films oder einer Abdeckplatte, die ein reverses Arraymuster aufweist. Andere Verfahren zum Verhindern des Verdampfens sind im Fachbereich der physikalischen Chemie wohl bekannt und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird Verdampfen in vorteilhafter Weise eingesetzt, um die Hybridisierung von Targetoligonukleotiden mit immobilisierten Nukleotiden in den Reaktionsregionen zu beschleunigen. In einer speziellen Ausführungsform werden fluoreszenzmarkierte oder in anderer Form gelabelte Targetoligonukleotide in Lösung (beispielsweise eine Lösung, welche ein Salz, wie z.B. Ammoniumacetat oder Magnesiumchlorid enthält) an die Reaktionsregionen angeliefert, die immobilisierte Sondenoligonukleotide enthalten. Da die volatile Salzlösung aus dem Reaktanten-Tropfen verdampft (in der gleichen Art und Weise wie das Lösungsmittel aus einem Tintentropfen abgeschieden bei einem Tintenstrahldrucker verdampft), resultiert ein lokal hohes Konzentrationsverhältnis von Target- zu Sondenoligonukleotid, was die Hybridisierung beschleunigt. Falls die Hybridisierung bei Raumtemperatur durchgeführt wird, sind typischerweise 10 Minuten bis wenige Stunden notwendig, um die Reaktion zu vervollständigen. Nach hinreichender Zeit wird die unhybridisierte DNA gewaschen oder in anderer Form vom Substrat entfernt. Schließlich wird das Substrat abgebildet, um die Regionen zu detektieren, in welchen die Sonde und die Target-DNA hybridisiert haben. Selbstverständlich kann das Verdampfen in vorteilhafter Weise eingesetzt werden, um die lokale Konzentration von Nicht-DNA-Lösungen in einer Vielzahl von Reaktionen, abgesehen von Hybridisierung, zu vergrößern. Beispielsweise sind in einigen Ausführungsformen Rezeptorlösungen hinreichend volatil, so dass die lokale Rezeptorkonzentration in den Reaktionsregionen, welche beispielsweise zu screenende Peptide enthält, ansteigt.
Die Arrays, welche gemäß den oben genannten platzierenden Ausführungsformen hergestellt werden, werden allgemein stark in der gleichen Art und Weise verwendet, wie diejenigen Arrays, welche von den Fließkanal-Ausführungsformen oben beschrieben, hergestellt werden. Beispielsweise können die Arrays beim Screening in Fluorescingelabelten Rezeptoren, wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092 beschrieben, verwendet werden.
VI. Alternative Ausführungsformen
Gemäß einigen Ausführungsformen der Erfindung werden Mikroventilstrukturen verwendet, um Kanäle entlang ausgewählter Fließpfade auf dem Substrat auszubilden. Gemäß diesen Ausführungsformen wird ein Array von Mikroventilen ausgebildet und durch ein darüber liegendes oder darunter liegendes Array von Elektroden gesteuert, wobei das Array von Elektroden verwendet wird, um ausgewählte Ventile unter Energie zu setzen, so dass sie sich öffnen und schließen.
15 illustriert solch eine Struktur. 15a zeigt das System in einer Querschnittsansicht am Ende und 15b zeigt das System in einer Ansicht von oben. Die darin abgebildete Struktur stellt nur zwei Synthesekammern aus Gründen der Übersichtlichkeit dar, jedoch wird in den meisten Ausführungsformen eine viel größere Anzahl von Kammern bereitgestellt. Mikroventile werden im Detail beispielsweise in Zdeblick, US-Patent Nr. 4,966,646, und Knutti, "Advanced Silicon Microstructures", ASICT Conference (1989) diskutiert.
Wie darin gezeigt, wird ein Substrat 602 mit einer Vielzahl von Kammern 604, welche unter Verwendung von Fotolithografie oder anderen verwandten Techniken erzeugt wurden, bereitgestellt. Die Kanälen führen bis zu einer Synthesekammer 606. Am Ende von jedem Kanal ist eine Ventilstruktur 608. Wie in 15 gezeigt, führen die Kanäle hin zu diesen Kammern, können jedoch von den Kammern durch die Ventile isoliert werden. Eine Vielzahl von Ventilen kann für jede Kammer verwendet werden. In der speziellen Struktur, die in 15 gezeigt ist, wird das rechte Ventil auf der linken Kammer und das linke Ventil auf der rechten Kammer geöffnet, während die übrigen Ventile geschlossen bleiben. Dementsprechend wird, falls ein Reagens oben auf dem Substrat angeliefert wird, es durch den offenen Kanal in und durch die Kammer auf der linken Seite, jedoch nicht auf der rechten Seite fließen. Dementsprechend können Kopplungsschritte auf der Kammer mit ausgewählten Reagenzien durchgeführt werden, welche zu ausgewählten Kammern geleitet werden, wobei die Techniken wie oben diskutiert, verwendet werden.
Gemäß einigen Ausführungsformen wird ein Ventil auf einer Seite der Kammer 606 ergänzt, aber das Ventil auf der gegenüberliegenden Seite wird durch eine semipemteable Membran ersetzt. Gemäß dieser Ausführungsformen wird es möglich, ein selektives Reagens in die Kammer 606 fließen zu lassen und anschließend ein anderes ausgewähltes Reagens durch den Fließkanal benachbart zu der semipermeablen Membran fließen zu lassen. Die semipermeable Membran wird erlauben, dass ein Teil des Materials auf einer Seite oder der anderen Seite durch die Membran passieren kann. Solche Ausführungsformen sind beispielsweise bei Zelluntersuchungen sinnvoll.
Screenen kann beispielsweise unter Trennen oder Schneiden von zwei Hälften der Einheit und unter Ermöglichen von Screenen beispielsweise durch Kontakt mit einem Fluorescin-gelabelten Antikörper oder dergleichen durchgeführt werden, gefolgt von Fotodetektion.
16a und 16b illustrieren eine andere alternative Ausführungsform der Erfindung, welche die mechanische Polymersynthesetechniken, die hier offenbart sind, mit lichtgesteuerten Synthesetechniken kombiniert. Gemäß dieser Ausführungsformen wird ein Substrat 401 in ausgewählten Regionen bestrahlt, die als Streifen in 16a dargestellt sind. Die Oberfläche des Substrates wird mit fotoentfernbaren Gruppen in Übereinstimmung mit der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092 versehen, beispielsweise auf Aminogruppen im speziellen Fall der Peptidsynthese. Während dieses Schrittes entfernt man in den Regionen 701, 702 und 703 des Substrates unter anderem die Schutzgruppen, wobei in den übrigen Regionen des Substrates durch fotoentfernbare Gruppen, wie z.B. Nitroveratryloxycarbonyl ("NVOC") geschützt bleiben. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist die Breite der bestrahlten Regionen gleich der Breite der geschützten Regionen des Substrates.
Anschließend wird das Substrat, wie in 16b gezeigt ist, mit einem Kanalblock 407 in Kontakt gebracht. In der speziellen Ausführungsform, die in 16b gezeigt ist, werden die Kanäle 704, 705 und 707 an den Regionen 701, 702 bzw. 703 auf dem Substrat 401 angepasst. Es wird offensichtlich sein, dass spezielle Ausführungsformen der Erfindung bestrahlte Regionen und Kanäle in der Form von Streifen bereitstellen, welche während dieses Schrittes angepasst werden. Andere Ausführungsformen werden jedoch andere Formen von bestrahlten Regionen und Kanälen bereitstellen und andere relative Orientierungen der bestrahlten Regionen und Kanäle. Der Kanalblock und das Substrat werden beispielsweise mit einer Anpassungsmarkierung, die sowohl auf dem Substrat an dem Kanalblock platziert ist, angepasst. Der Substratkanal kann dann auf dem Kanalblock beispielsweise mit einer Vakuumspitze platziert werden.
Anschließend wird ein ausgewähltes Reagens durch die Kanäle geleitet oder in dem Kanalblock platziert, um die Regionen, welche zuvor dem Licht ausgesetzt wurden, anzukoppeln. Wie bei den Fließkanal-Ausführungsformen oben beschrieben, kann das Substrat in Kontakt mit einem vorher befüllten Kanalblock in einigen Ausführungsformen gebracht werden, um das Drücken des Kanalblockes auf das Substrat zu vermeiden und das Zerstören von Inseln (spots) während dem Pumpen. Gemäß bevorzugten Aspekten der Erfindung fließen unterschiedliche Reagenzien durch jeden der Kanäle 701, 702 und 703, wie z.B. Reagenzien, welche die Monomere A, B bzw. C enthalten. Das Verfahren kann dann optional einen zweiten Kopplungsschritt enthalten, in welchen das Substrat verschoben wird, beispielsweise, um eine Kanalbreite, um das Koppeln eines Monomers in den Regionen zwischen den ursprünglichen Kanälen bereitzustellen.
Anschließend wird das Verfahren der gerichteten Lichtanregung gefolgt vom Ankoppeln des Kanalblocks an dem zuvor nicht exponierten Regionen wiederholt. Das Verfahren wird anschließend vorzugsweise erneut wiederholt mit den Streifen der Maske und dem Kanalblock rotiert, beispielsweise um 90°. Die Kopplungsschritte werden die Ausbildung des Polymers, welches verschiedene Monomersequenzen an ausgewählten Regionen des Substrates aufweist, durch geeignete Translation der Maske und des Substrates und durch geeignete Wahl der Maske bereitstellen. Durch eine Kombination der lichtgerichteten Techniken und der mechanischen Fließkanaltechniken, wie sie hier offenbart werden, wird größere Effizienz beim Ausbilden verschiedener Sequenzen erreicht, da eine Vielzahl von Monomeren in einem einzelnen Anregungs-/Kopplungsschritt gekoppelt werden.
In lichtgesteuerten Verfahren wird das Licht, welches durch die Maske dringt, in variierendem Maße um die Ecken der dunklen Regionen der Maske gebeugt. Folglich tritt etwas ungewünschte Entfernung von fotosensitiven Schutzgruppen an den Kanten der "dunklen" Regionen auf. Dieser Effekt wird durch die wiederholte Maskentranslation und die folgenden Expositionen verschlechtert, was letztendlich zu inhomogenen Synthesestellen an den Kanten der vordefinierten Regionen führt. Dieser Effekt ist selbstverständlich abhängig von der Dicke des Glassubstrates und dem Winkel, in welchem das Licht gebeugt wird. Falls die Maske auf der "Rückseite" des Substrates positioniert wird, erzeugt ein Beugungswinkel von 2,5° zusammen mit einer Substratdicke von 0,7 mm einen 60 μm Streifen von Licht (von variabler Intensität), welcher jede Kante umgibt. Für ein 0,1 mm dickes Substrat ist der Streifen ungefähr 5 μm breit.
Um diese "Überblendungs"-Effekte der Beugung zu reduzieren, kann eine Pinholemaske eingesetzt werden, um die Reaktionsregionen des Substrates zu aktivieren und/oder zu definieren. Folglich wird Licht, welches durch die Pinholemaske scheint, auf ein Substrat gerichtet, das fotoentfernbare hydrophobe Gruppen aufweist. Die Gruppen in dem beleuchteten Regionen werden dann entfernt, um hydrophile Reaktionsregionen zu definieren. In einer speziellen Ausführungsform enthält die Pinholemaske eine Serie von kreisförmigen Löchern von vordefiniertem Durchmesser und Abstand, beispielsweise 20 μm Durchmesserlöcher im Abstand von 50 μm. In einigen Ausführungsformen wird eine stationäre Pinholemaske zwischen dem Substrat und der Translationsmaske des Typus, wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092 beschrie ben, in der Form eines Sandwiches eingebracht. Auf diese Art und Weise können ausgewählte Regionen des Substrates zur Polymersynthese ohne Überblendungseffekt aktiviert werden. Die Translationsmaske wird verwendet, um ausgewählte Löcher der stationären Pinholemaske zu beleuchten und wird so angepasst, dass ihre Eckkanten den Abstand, welcher die Löcher der stationären Maske voneinander haben, zerlegt und dadurch die durch Beugung verursachte Entfernung der fotosensitiven Schutzgruppen an benachbarten Stellen eliminiert wird. Da in vernachlässigbarem Maße einfallendes Überblendungslicht auftritt, wird inhomogene Synthese an Stellen, welche benachbart entlang der Kante sind, eliminiert. Ihre resultierenden kreisförmigen Stellen enthalten selbstverständlich verschiedene Sequenzdichte infolge der Beugung an den Kanten der Pinholemaske, aber die Sequenzen in jeder vordefinierten Region sind homogen. Darüber hinaus wird jede Syntheseregion von einer "dunklen" Region umgeben, wenn das Substrat mit einem gelabelten Target getestet wird. Folglich wird kein Fluoreszenzsignal aufgrund von Überblendung durch Binden an benachbarte Stellen eingeführt.
Eine Pinholemaske, welche 20 μm große kreisförmige Löcher getrennt um 50 μm umfasst, benötigt eine Gesamtsynthesefläche für den kompletten Satz von Oktanucleotiden von nur 1,78 cm². Für eine gegebene Pinholemaske erlauben dünnere Substrate kleinere Reaktionsstellen getrennt um größere Distanzen. Jedoch die Fläche, von welcher verlässliche Daten erhalten werden können, wird auch reduziert, wenn kleinere Stellen verwendet werden. Die Dichte der Reaktionsstellen wird letztendlich durch den Beugungswinkel und den Abstand zwischen der Pinholemaske und den Reaktionsregionen (typischerweise die Substratdicke) bestimmt.
Obwohl die Diskussion bislang auf kreisförmige Pinholes fokussiert war, können andere Formen, wie z.B. Spalte, Quadrate, Halbmonde, etc., eingesetzt werden, wenn dies für das ausgewählte Zufuhrverfahren geeignet ist. Für einige Fließkanal-Ausführungsformen können lineare oder Serpentinen-artige Spalte wünschenswert sein.
In alternativen bevorzugten Ausführungsformen nimmt die Pinholemaske die Form einer auf dem Substrat gecoateten Schicht ein. Dies vermeidet den Bedarf für eine separate stationäre Maske, um das Punktmuster zu erzeugen. Darüber hinaus stellt die Oberflächenschicht wohl definierte Syntheseregionen bereit, in welchen abgeschiedene Reak tanten gemäß den platzierenden Ausführungsformen, wie oben beschrieben, abgeschieden werden. Des Weiteren wird die Oberflächenpinholemaske in angenehmer Weise mit lokalen Referenzkoordinaten zur Verwendung in navigierenden Systemen versehen, die verwendet werden, Monomerlösungen an geeignete Regionen, wie oben beschrieben, anzuliefern. Bevorzugte Pinholemasken werden aus opaken oder reflektierenden Materialien, wie z.B. Chrom, hergestellt.
VI. Beispiele
A. Lecktest
Ein erstes Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung einer Fließkanaleinheit, um sicherzustellen, dass Lösungen an ausgewählte Stellen eines Substrates angeliefert werden könnten und davon abgehalten werden können, mit anderen Flächen in Kontakt zu treten. Darüber hinaus wurde das Experiment verwendet, um zu demonstrieren, dass Reagenzien in einer einheitlichen Weise angeliefert werden können.
Dementsprechend wurde ein flaches Stück von konventionellem Glas, welches Abmessungen von ungefähr 42 mm × 42 mm aufwies, mit Aminopropyltriethoxysilan derivatisiert. Die gesamte Oberfläche wurde von Schutz-Gruppen befreit und mit herkömmlichen Techniken gewaschen. Ein Fluorescinmarker aus FITC wurde dann in die Fließkanäle injiziert, welche ausgebildet wurden, wenn ein Block von KeIF^® 81 mit 10 Kanälen von 1 mm Tiefe und 1 mm Breite in Kontakt mit dem Substrat gebracht wurde. Der Fluorescinmarker lag in einer Lösung von DMF vor und wurde durch die Kanäle durch Injizieren des Materials in die Rillen mit einer manuellen Pipette geleitet.
Fluorescinfarbstoff wurde in ähnlicher Weise in jeden anderen Kanal in dem Block injiziert, der Block wurde rotiert und das Verfahren wurde wiederholt. Der erwartete resultierende Klotz an Fluoreszenzintensität gegen Lokalisierung ist schematisch in 17 dargestellt. Dunkle Regionen sind an den Überschneidungen von vertikalen und horizontalen Streifen gezeigt, während hellere graue Regionen an nicht-überschneidenden Regionen des Streifens sich zeigen. Die dunklen grauen Regionen zeigen erwartete Regionen von hoher Farbstoffkonzentrationen an, wohingegen die hellen Regionen Regionen von erwarteter niedriger Farbstoffkonzentration anzeigen.
Eine Kartierung der Fluoreszenzintensität eines Teiles eines aktuellen Objektträgers mit Intensitätsdaten, erhalten gemäß dem Verfahren von PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092, wurde erstellt. Die Resultate stimmen sehr gut mit den erwarteten Ergebnissen überein, zeigen hohe Fluoreszenzintensität an den Überschneidungen der Kanäle (etwa 50% höher als in den nicht-überschneidenden Regionen der Streifen) und niedrige Fluoreszenzintensitäten an anderen Regionen der Kanäle. Regionen, welche nicht dem Fluoreszenzfarbstoff ausgesetzt worden waren, zeigen geringe Aktivität, was auf ein gutes Signal-zu-Untergrund-Verhältnis hindeutet. Schnittstellen weisen eine Fluoreszenzintensität von etwa 9 × so hoch wie der Hintergrund auf. Regionen innerhalb der Kanäle zeigen auch geringe Variationen in der Fluoreszenzintensität, was darauf hindeutet, dass Regionen gleichförmig innerhalb der Kanäle behandelt wurden.
B. Ausbildung von YGGFL
Das System wurde verwendet, um vier verschiedene Peptide zu synthetisieren: YGGFL (SEQ. ID NR: 1), YpGFL (SEQ. ID NR: 2), pGGFL (SEQ. ID NR: 3) und ppGFL (die Abkürzungen sind in Stryer, Biochemistry, Third Ed. (1988) enthalten; die Kleinbuchstaben deuten auf D-optische Isomere hin und die Großbuchstaben auf L-optische Isomere). Ein vollständiges Glassubstrat wurde mit TBOC-geschütztem Aminopropyltriethoxysilan derivatisiert, die Schutzgruppen wurden mit TFA entfernt, das Substrat mit FMOC-geschützter Capronsäure (einem Linker) gecoatet, mit Piperidin von der Schutzgruppe befreit, und mit FMOC-geschütztem Glycin-Phenylalanin-Leucin (GFL) gecoatet.
Diese FMOC-GFL-gecoatete Oberfläche wurde mit dem Kanalblock versiegelt und alle 10 Rillen wurden mit Piperidin in DMF von den Schutzgruppen befreit. Nach dem Waschen der Rillen wurde FMOC-Glycin (G) in die ungeradzahligen Rillen injiziert und FMOC-d-Prolin (p) wurde in die geradzahligen Rillen injiziert. Nach einer Dauer von zwei Stunden Kopplungszeit unter Verwendung von Standardkopplungschemie wurden alle Rillen mit DMF gewaschen. Die Rillen wurden in Vakuum getrocknet, der Block entfernt und um 90° gedreht. Nach erneutem Versiegeln wurden alle Rillen mit Piperdin in DMF von den Schutzgruppen befreit und gewaschen. FMOC-Tyrosin (Y) wurde in die ungeradzahligen Rillen injiziert und FMOC-p in die geradzahligen Rillen. Nach dem Koppeln wurden die Gruppen gewaschen und im Vakuum getrocknet. Dementsprechend wurden 25 Regionen jeweils der Verbindungen YGGFL, YpGFL, pGGFL und ppGFL auf dem Substrat synthetisiert. Das Substrat wurde entfernt und mit FITC-gelabelten Antikörpern angefärbt (Herz-Antikörper 3E7).
Die resultierende Oberfläche zeigte helle Regionen von hoher Fluoreszenz. Weiße Quadrate lagen an den Stellen von YGGFL. Die dunkelsten Regionen sind pGGFL und ppGFL. Die YGGFL-Stellen waren die am meisten intensiven, gefolgt von den YpGFL-Stellen. Die pGGFL- und ppGFL-Intensitäten waren annähernd auf dem Niveau des Hintergrundes, was konsistent mit den erwarteten Resultaten für die Herz-Antikörper war.
Die quantitative Analyse der Ergebnisse zeigte Gesamtintensitäts-Verhältnisse für YGGFL:YpGFL:pGGFL:ppGFL von 1,7:1,5:1,1:1,0. Da allerdings eine große Stan dardabweichung auf dem YGGFL und YpGFL auftritt, kann das Vergleichen aller dieser Stellen miteinander nicht akkurat die aktuellen Kontraste repräsentieren. Der Vergleich der Intensitäten der Stellen innerhalb des gleichen "Streifen" führt zu größeren Kontrasten, obwohl sie in der Größenordnung von 2:1 bleiben.
C. 100-Mikrometer-Kanalblock
Ein Gittermuster von Fluorescin-Isothiocyanat, gekoppelt an ein Substrat, wurde unter Verwendung einer Fließzelle der Erfindung hergestellt. Ein 2 × 3 Inch großes NVOC-derivatisiertes Substrat wurde fotolysiert durch eine Maske, um 400 μm große aktivierte Bänder entlang einer Achse herzustellen. Ein geätzter Siliziumkanalblock mit 64 parallelen 100 Mikrometer großen Kanälen getrennt durch 100 Mikrometer große Wände wurde dann auf das Substrat auf der anderen Achse geklemmt (d.h. senkrecht zu der Achse der 400 Mikrometer großen aktivierten Bänder). Die Klemmvorrichtung, bestehend aus einer Aluminium-Oberseite und Klemm-Bodenplatten, wurde verwendet. Druck wurde durch Zusammendrücken der beiden Bolzen mit einem Schraubstock auf 400 psi aufgebaut. Eine 7 mM Fluorescin-Isothiocyanatlösung wurde durch die Kanäle durch das Pipettieren direkt auf die exponierten Kanalenden zum Fließen gebracht.
Ein Bild des Substrates zeigt Regionen von hoher Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass Fluorescin an das Substrat gebunden hatte. Weiße Flächen, welche darauf hindeuten, dass Fluorescin bindet, waren als 400 Mikrometer breite horizontale Streifen auf den fotolysierten Regionen innerhalb der 100 Mikrometer vertikalen Fließpfade vorhanden. Kontrast-Verhältnisse von 8:1 wurden zwischen den Kanälen und den Kanalzwischenräumen beobachtet. Dies demonstriert die annähernd vollständige physikalische Isolation der Flüssigkeit, welche durch die 100 Mikrometer-Kanäle unter 400 psi Klemmdruck passiert wird.
D. Kanalmatrix-Hybridisierungsassay
Eine mittlere Region eines 2 × 3 Inch großen Objektträgers wurde mit bis (2-Hydroxyethyl) aminopropyltriethoxysilan derivatisiert. Sechs Nukleotide wurden dann auf die gesamte Reaktionsregion unter Verwendung eines Syntheseverfahrens, bestehend aus Deprotonierung, Koppeln und Oxidationsschritten für jedes applizierte Mono mer gekoppelt. Diese ersten sechs Nukleotide wurden in einer Reaktionsregion angebunden, welche durch ein 0,84 Inch Durchmesser großes kreisförmiges Well definiert war, in einem Aluminiumtemplat, welches an dem 2 × 3 Inch-Träger geklemmt war.
Das siebte und achte Monomer wurden auf das Substrat per Fließen der Monomerlösungen durch 100 Mikrometer große Kanäle in einem geätzten Siliziumkanalblock (eingesetzt in Beispiel C oben) aufgebracht. Die siebte Base wurde entlang der Längsachse (vertikal) des 2 Inch × 3 Inch-Trägers gekoppelt und die achte Base senkrecht zu der siebten, entlang der kurzen Achse (horizontal) zum Träger. Dies definierte eine aktive Matrixregion von 1,28 × 1,28 cm mit einer Dichte von 2 500 Reaktionsregionen pro cm².
Der Kanalblock wurde zentral oberhalb der Reaktionsregion aufgebracht und auf das Substrat unter Verwendung einer Klemmvorrichtung, bestehend aus bearbeitetem Aluminiumplatten geklemmt. Dies passt das 2 Inch × 3 Inch-Substrat relativ, bezogen auf den Kanalblock in der gewünschten Orientierung an. Rotation der oberen Klemmplatte und des Kanalblocks relativ zur unteren Klemmplatte und dem Substrat zwischen dem siebten und dem achten Kopplungsschritt stellten die Matrix von sich schneidenden Reihen und Spalten zur Verfügung.
In der oberen Klemmplatte wurden Flüssigkeitszufuhrwells mit Laser-gebohrten Löchern verbunden, welche in einzelne Kanäle von der rückwärtigen Oberfläche des Kanalblocks eintreten. Diese Zufuhrwells wurden benutzt, um Kopplungsreagenzien in Kanäle zu pipettieren, während der Kanalblock auf das Substrat geklemmt war. Korrespondierende Flüssigkeits-rückgewinnende Wells wurden mit Vakuum an der am Ende des Flusses gelegenen Stelle des Kanalblocks verbunden, was die Flüssigkeit durch den Kanalblock zog und aus diesem heraus in einen Abfallbehälter. Folglich wurde ein kontinuierlicher Flüssigkeitsfluss über das Substrat in die Kanalregion während der Kopplungsschritte erreicht.
Das komplette Oktamer, welches an den Kanalschnittstellen synthetisiert wurde, ausgebildet durch den siebten und achten Kopplungsschritt, wies folgende Sequenz auf:
Substrat – (3') CGCAGCCG (5') (SEQ. ID NR: 4)
Nach Vervollständigen des Syntheseprozesses wurde das Abschneiden der exozyklischen Amine durch Immersion der Reaktionsregionen in konzentriertem Ammoniumhydroxid durchgeführt. Die Reaktionsregion wurde dann bei 15°C für eine Stunde in einer 10 nM-Lösung der komplementären Basissequenz 5' GCGTCGGC-F (SEQ. ID NR: 5) inkubiert, wobei "F" ein Fluorescinmolekül ist, das an das 3'-Ende des Oligonucleotids gekoppelt ist. Die Targetketten-Lösung wurde dann aus der Reaktionsregion gespült und mit Neat 6 × SSPE-Puffer, auch bei 15°C, ersetzt. Letztendlich wurde die Reaktonsregion dann unter Verwendung des Laserfluoreszenz-Detektionssystems während der Immersion in dem Puffer gescannt.
Die hellsten Regionen in dem resultierenden Bild korrespondieren mit den Kanalüberschneidungen, wo ein komplettes Oktamer auf der Substratoberfläche synthetisiert wurde. Vertikale Säulen auf dem Bild zeigten die Kanalregionen an, wo die siebte Base angebunden wurde, wohingegen horizontale Reihen die Kanalregionen anzeigen, wo die achte Base angekoppelt wurde. Helligkeit in den Kanalüberschneidungsregionen zeigte die Hybridisierung zwischen der fluoreszierenden Targetkette und der komplementären Kette, synthetisiert und gebunden an das Substrat in diesen Regionen an. Die vertikalen Streifen des Bildes zeigten eine konsistente Helligkeit mit Regionen von signifikant größerer Helligkeit an den Querschnittsregionen. Die horizontalen Streifen enthielten die konsistente Helligkeit der vertikalen Streifen nicht, wiesen aber Regionen von Helligkeit an den Querschnitten mit den vertikalen Streifen auf. Die konsistente Helligkeit entlang der Achse des siebten Monomers (vertikal) deutete auf teilweise Hybridisierung der Targetkette in Flächen hin, wo sieben der acht komplementären Basen an der Substratoberfläche angebunden waren. Die nicht-auftretende Helligkeit entlang der Achse des achten Monomers (horizontal) ist konsistent mit der Erwartung, dass eine Kette von sechs stimmenden Basen gebunden an die Substratoberfläche nicht effektiv an ein Oktamer in Lösung hybridisieren wird (Heptamere mit sechs stimmenden Basen, gefolgt von einem Mismatch an der Position sieben). Der dunklere Hintergrund besteht aus Hexameren, welche aus sechs Monomeren gebunden an die gesamte Reaktionsregion bestehen.
VII. Zusammenfassung
Die Beschreibung oben ist illustrativ und nicht beschränkend. Viele Variationen der Erfindung werden für den Fachmann nach Studium der Offenbarung offensichtlich. Lediglich kann mit Hilfe von Beispielen eine Vielzahl von Substraten, Rezeptoren, Liganden und anderen Materialien ohne Abweichen vom Umfang der Erfindung verwendet werden. Der Umfang der Erfindung sollte folglich nicht unter Verweis auf die obige Beschreibung bestimmt werden, sondern unter Verweis auf die beigefügten Ansprüche zusammen mit ihrem vollen Umfang an Äquivalenten.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Ausbilden von Polymeren mit diversen monomeren Sequenzen auf einem einzelnen Substrat zur Verfügung gestellt, wobei besagtes Substrat eine Oberfläche umfasst mit einer Vielzahl von ausgewählten Regionen und besagtes Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Ausbilden einer Vielzahl von Kanälen benachbart zu besagter Oberfläche, wobei besagte Kanäle zumindest teilweise eine Wand davon aufweisen, definiert durch einen Teil von besagten ausgewählten Regionen;
b) Plazieren ausgewählter Monomere in besagten Kanälen, um Polymere an besagtem Teil von besagten ausgewählten Regionen zu synthetisieren, wobei besagter Teil von besagten ausgewählten Regionen Polymere umfasst mit einer Sequenz von Monomeren, welche verschieden sind von den Polymeren in zumindest einer anderen ausgewählten Region; und
c) Wiederholen der Schritte a) und b), wobei besagte Kanäle entlang eines zweiten Teils von besagten ausgewählten Regionen ausgebildet werden.

Vorzugsweise werden besagte Schritte des Ausbildens einer Vielzahl von Kanälen den Schritt des Platzieren eines Kanalblocks benachbart zu besagter Oberfläche umfassen, wobei besagter Kanalblock eine Vielzahl von Rillen darin aufweist, und die Wände von besagten Rillen und besagte Oberfläche zumindest teilweise besagte Fließkanäle ausbilden.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung kann der Schritt des Platzierens ausgewählter Reagenzien in den besagten Kanälen die folgenden Schritte umfassen:
Entfernen einer Schutzgruppe von einer aktiven Stelle in zumindest einem ersten Kanal;
Fließen eines ersten Monomers durch besagten zumindest einen ersten Kanal, wobei besagtes erstes Monomer eine Schutzgruppe darauf umfasst und besagtes erstes Monomer an besagte aktive Stelle in besagtem ersten Kanal bindet;
Entfernen einer Schutzgruppe von besagter aktiver Stelle in besagten zumindest einem zweiten Kanal, wobei zumindest ein Teil von besagtem zweiten Kanal mit einem Teil von besagtem Substrat kontaktiert durch besagten ersten Kanal überlappt; und
Fließen eines zweiten Monomers durch besagten zumindest einen zweiten Kanal, wobei besagtes zweites Monomer an besagter aktiver Stelle in besagtem zweiten Kanal bindet.
In dieser Ausführungsform können die Schritte des Entfernens und des Fließens des weiteren die folgenden Schritte umfassen:

a) Platzieren eines Kanalblocks in Kontakt mit besagter Oberfläche in einer ersten Orientierung und Platzieren eines Materials umfassend ein erstes Monomer durch zumindest einen Kanal in besagtem Kanalblock;
b) Rotieren von einem von besagtem Kanalblock und besagtem Substrat relativ zum anderen;
c) Platzieren eines Kanalblocks in Kontakt mit besagter Oberfläche in einer zweiten Orientierung und Platzieren eines Materials umfassend ein zweites Monomer durch zumindest einen Kanal im besagtem Kanalblock.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren dieses Aspekt der Erfindung des weiteren den Schritt des Screenens besagten Polymers hinsichtlich der Bindungsaffinität mit seinem Rezeptor.
Vorzugsweise werden zumindest 10 verschiedene Polymere auf besagter Oberfläche ausgebildet. Alternativ werden zumindest 1 000 verschiedene Polymere auf besagter Oberfläche ausgebildet.
Alternativ werden zumindest 100 000 verschiedene Polymere auf besagter Oberfläche ausgebildet.
Vorzugsweise werden besagte Polymere ausgebildet aus der Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden und Peptiden.
Vorzugsweise werden besagte ausgewählte Regionen jeweils eine Fläche von weniger als ungefähr 10 000 μm² aufweisen.
In einer Ausbildungsform dieses Aspekts der Erfindung kann besagter Schritt des Platzieren ausgewählter Reagenzien in besagten Kanälen umfassen:
Platzieren einer Pipette in flüssiger Kommunikation mit besagtem Kanal; und
Injizieren besagter ausgewählter Reagenzien durch besagter Kanäle.
In dieser Ausbildungsform kann besagter Schritt des Platzieren einer Pipette in Flüssigkeitskommunikation mit besagtem Kanal ein Schritt des Platzierens besagter Pipette in Kontakt mit einer Öffnung auf einer Seite von besagten Substrat gegenüberliegend von besagter Oberfläche sein.
Alternativ kann besagter Schritt des Platzierens einer Pipette in flüssiger Kommunikation mit besagten Kanal ein Schritt des Platzierens einer Vielzahl von Pipetten in Kommunikation mit einer Vielzahl von besagten Kanälen und Fließen von verschiedenen Reagenzien durch zumindest zwei von besagten Kanälen sein.
Dem Verfahren dieses Aspekts der Erfindung kann der Schritt des Ausbildens eines Array von Ventilen von besagter Oberfläche vorausgehen, wobei die Flüssigkeit an gewünschte Stellen auf besagter Oberfläche gelenkt werden kann und besagte Ventile selektiv arbeiten können, und besagte ausgewählte Reagenzien durch die dadurch geformten Kanäle fließen.
Dem Verfahren dieses Aspekts der Erfindung kann der Schritt des Bestrahlens von Teilen von besagten Substrat mit Licht vorangehen, wobei fotoentfernbare Gruppen von aktiven Gruppen auf besagten Substrat entfernt werden. Besagte ausgewählte bestrahlte Teile können in der Form von Streifen sein und dabei umfasst besagter Schritt des Ausbildens von Kanälen das Ausbilden von besagten Kanälen entlang eines Pfades von besagten Streifen sowie unterschiedliche Reagenzien platziert in zumindest einem Teil von besagten Kanälen.
Gemäß eines weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt zum Ausbilden einer Vielzahl von Peptidsequenzen auf einer Oberfläche eines einzelnen Substrats umfassend die folgenden Schritte:

a) Platzieren besagten Substrats in Kontakt mit einem Kanalblock in einer ersten Orientierung, wobei besagter Kanalblock eine Vielzahl von Kanälen darin aufweist;
b) Fließen von zumindest einer ersten Aminosäure durch zumindest einen von besagten Kanälen, Koppeln besagter erster Aminosäure an Teile auf besagter Oberfläche;
c) Fließen von zumindest einer zweiten Aminosäure durch zumindest einen von besagten Kanälen, Koppeln besagter zweiter Aminosäure an Teile auf besagter Oberfläche;
d) Rotieren besagten Kanalblocks relativ zu besagten Substrat und erneutes Platzieren von besagtem Substrat in Kontakt mit besagtem Kanalblock;
e) Fließen einer dritten Aminosäure durch zumindest einen von besagten Kanälen, um zumindest erste und zweite Peptidsequenzen auf besagter Oberfläche auszubilden;
f) Fließen einer vierten Aminosäure durch zumindest einen von besagten Kanälen, um zumindest dritte und vierte Peptidsequenzen auf besagter Oberfläche auszubilden.

Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit bereitgestellt zum Ausbilden diverser Polymersequenzen umfassend:
ein Substrat;
einen Kanalblock, wobei besagter Kanalblock eine Vielzahl von Rillen darin enthält;
Mittel zum Halten von besagten Kanalblocks in Kontakt mit besagten Substrat;
Mittel zum Verschieben von besagtem Kanalblock und besagtem Substrat relativ zueinander; und
Mittel zum Injizieren ausgewählter Reagenzien in besagten Rillen.
In diesem Kit-Aspekt der vorliegenden Erfindung kann besagtes Substrat aktive Stellen schützende Gruppen umfassen und kann des weiteren schützende Gruppen entfernendes Material zur Entfernung besagter schützender Gruppen umfassen.
In dem Kit-Aspekt der Erfindung können besagte Rillen mit Öffnungen in besagten Kanalblock verknüpft sein, wobei besagte Öffnungen sich durch eine rückwärtige Oberfläche durch besagten Substrat erstrecken.
In dem Kit-Aspekt der Erfindung kann der Kit des weiteren Mittel zum Bestrahlen von ausgewählten Teilen von besagten Substrats zur Entfernung von Schutzgruppen auf besagtem Substrat umfassen, wobei besagte Schutzgruppen von aktiven Stellen auf besagten Substrat entfernt werden nach Expositionen gegen Licht. Besagte Mittel zum Bestrahlen können eine Lichtquelle und eine Lichtmaske umfassen, wobei besagte Lichtmaske Regionen umfasst die opak für besagtes Licht sind und Regionen welche transmissiv für besagtes Licht sind.
In dem Kitaspekt der Erfindung können besagte Mittel zum Injizieren einen Pipetor umfassen. Besagter Pipetor kann eine Vielzahl von Pipetten umfassen, wobei jede davon mit einer verschiedenen von besagten Rillen gekoppelt ist.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein System bereitgestellt zum Durchführen einer Vielzahl von Reaktionen auf einem einzelnen Substrat wobei das System folgendes umfasst:
Zumindest 100 Reaktionsregionen auf dem einzelnen Substrat, wobei jede Region in der Lage ist, eine eigene Reaktion durchzuführen;
Mittel zum Zuführen von einem oder mehreren Reaktanten zu einer oder mehreren Reaktionsregionen; und
Mittel zum Abgrenzen von zumindest einigen der Reaktanten, so dass sie zumindest nicht mit einigen Reaktionsregionen in Kontakt kommen.
Das Substrat kann eine Vielzahl von Durchtritten umfassen und die Reaktionsregionen sind Unterlagen innerhalb besagter Durchtritte.
Die Mittel zum Zuführen von einem oder mehreren Reaktanten können Fließkanäle eines Kanalblocks angrenzen an das Substrat sein und Mittel zum Begrenzen von zumindest einigen der Reaktanten sind Wände des Fließkanals.
Die Mittel zum Begrenzen von zumindest einigen Reaktanten können hydrophobe Schichten auf der Oberfläche des Substrats sein.
Gemäß einem Substrat-Aspekte der Erfindung wird eine Substrat bereitgestellt umfassend:
Mehr als ungefähr 100 Reaktionsregionen, welche verschiedene Verbindungen daran gekoppelt aufweisen;
Eine begrenzende Region umgebend die Reaktionsregionen, wobei die begrenzende Region hydrophober ist als die Reaktionsregionen.
Die begrenzende Region kann hydrophobe Schutzgruppen umfassen. Die Schutzgruppen können fotolabil sein.
Die Reaktionsregionen können Kanäle definieren.
Das Substrat kann mehr als ungefähr 1 000 Reaktionsregionen enthalten.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Ausbilden einer Vielzahl von Polymeren mit verschiedenen Monomersequenzen auf einem Substrat, wobei das Substrat eine Vielzahl von Reaktionsregionen enthält, umgeben durch eine begrenzende Region, und die Reaktionsregionen stärker benetzbar durch eine oder mehrere Monomerlösungen sind als die umgebende Region und das Verfahren folgendes umfasst:
Sequentielles Platzieren der einen oder mehreren Monomerlösungen in einer ersten Reaktionsregion, um ein erstes Polymer auszubilden mit einer ersten Monomersequenz, wobei die Monomerlösungen begrenzt sind auf die erste Reaktionsregion durch die eingrenzende Region; und
Sequentielles Platzieren der einen oder mehreren Monomerlösungen in einer zweiten Reaktionsregion, um ein zweites Polymer auszubilden mit einer zweiten Monomersequenz, wobei die Monomerlösungen begrenzt sind auf die erste Reaktionsregion durch die eingrenzende Region.
Die Schritte des Platzierens der Monomerlösungen in der ersten Reaktionsregion können das Bewegen einer Pipette relativ zum Substrat und das Abscheiden von zumindest einer Monomerlösung in der ersten Reaktionsregion umfassen.
Das Verfahren dieses Aspekts der Erfindung kann des weiteren Schritte des periodischen Entfernens von Monomerlösungen aus den ersten und zweiten Reaktionsregionen umfassen, nach dem ausgewählte Monomere an die ersten und zweiten Polymere gekoppelt haben.
In diesem Aspekt der Erfindung kann ein erstes Monomer in der ersten Reaktionsregion gekoppelt und ein zweites Monomer kann in der zweiten Reaktion gekoppelt werden, bevor weitere Monomere in den ersten und zweiten Reaktionsregionen gekoppelt werden.
Die Monomerlösungen können in der ersten oder zweiten Reaktionsregion durch einen Spender platziert werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer elektrophoretischen Pumpe, einer Pipette und einem aufgeladenen Tropfen-Spender.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Transformieren eines ersten heterogenen Arrays von Verbindungen auf einem einzelnen Substrat, wobei das heterogene Array von Verbindungen eine Vielzahl von Reaktionsregionen aufweist und das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Aktivieren einer ersten Gruppe von Reaktionsregionen und einer zweiten Gruppe von Reaktionsregionen;
Zuführen eines ersten Reaktanten zur ersten Gruppe von Reaktionsregionen, jedoch nicht zur zweiten Gruppe von Reaktionsregionen;
Ermöglichen, dass der erste Reaktant an der ersten Gruppe von Reaktionsregionen umgesetzt wird, um das erste heterogene Array in ein zweites heterogenes Array zu konvertieren, wobei die heterogenen Arrays mehr als ungefähr 100 verschiedene Reaktionsregionen aufweisen.
Das Verfahren dieses Aspekts der Erfindung kann des weiteren einen Schritt des Isolierens der ersten Gruppe von Reaktionsregionen von der zweiten Gruppe von Reaktionsregionen umfassen. Die erste Gruppe von Reaktionsregionen kann isoliert werden durch das Platzieren eines Kanalblocks gegen das Substrat.
In diesem Verfahrens-Aspekt der Erfindung kann die erste Gruppe von Reaktionsregionen isoliert werden von der zweiten Gruppe von Reaktionsregionen durch Wände des Substrates. Das Substrat kann eine Serie von Flüssen durch Reaktionsregionen einschließend welche voneinander durch Wände getrennt sind.
In diesem Verfahren-Aspekt der Erfindung kann die erste Gruppe von Reaktionsregionen isoliert werden von der zweiten Gruppe von Reaktionsregionen durch eine oder mehrere nicht-benetzten Regionen auf dem Substrat. In diesem Aspekt der Erfindung können die heterogenen Arrays mehr als ungefähr 1.000 verschiedene Reaktionsregionen aufweisen.
Das Verfahren dieses Aspekts der Erfindung kann des weiteren die folgenden Schritte umfassen:
Zuführen eines zweiten Reaktanten zur zweiten Gruppe von Reaktions-Regionen, jedoch nicht zur ersten Gruppe von Reaktions-Regionen;
Ermöglichen, dass der zweite Reaktant an der zweiten Gruppe von Reaktionsregionen reagiert;
Aktivieren einer dritten Gruppe von Reaktions-Regionen, wobei die dritte Gruppe einige Reaktionsregionen gemeinsam mit der ersten Gruppe von Reaktionsregionen aufweist;
Zuführen eines Reaktanten zur dritten Gruppe von Reaktionsregionen, jedoch nicht zur zweiten Gruppe von Reaktionsregionen und
Ermöglichen, dass die Reaktion in der dritten Gruppe von Reaktionsregionen stattfindet.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays diverser Polymersequenzen auf einem Substrat, wobei verschiedene Polymere in verschiedenen Regionen auf dem Substrat lokalisiert werden, das die Sequenz der folgenden Schritte umfasst: (a) das zur Verfügungstellen eines Substrats mit einer Oberfläche zum Verbinden mit einem Reagens, (b) das Absetzen einer Widerstandsschicht auf der Oberfläche des Substrats, (c) das selektive Bestrahlen der Widerstandsschicht, (d) das Entfernen der bestrahlten Regionen der Widerstandsschicht oder der gesamten Widerstandsschicht, um eine Bindungsregion herzustellen, und (e) das kovalente Verbinden eines Reagens mit der Bindungsregion.
Ein Verfahren wie es in Anspruch 1 beansprucht wird, worin nach dem kovalenten Verbinden mit Reagens die Sequenz der Schritte des Absetzens der Widerstandsschicht, des Entfernens der Widerstandsschicht und des kovalenten Bindens des Reagens an die Oberfläche mehrfach wiederholt wird, so dass verschiedene Polymere an verschiedene Regionen auf dem Substrat gebunden werden.
Ein Verfahren wie es in Anspruch 2 beansprucht wird, worin Reagenzien, die an die Oberfläche gebunden sind, durch Schutzgruppen geschützt sind, und die Schutzgruppen vor dem Reagieren exponierter Regionen mit Reagens entfernt werden.
Ein Verfahren wie es in Anspruch 2 oder Anspruch 3 beansprucht wird, worin die Bestrahlung der Widerstandsschicht die Oberfläche darunter aktiviert.
Ein Verfahren wie es in Anspruch 4 beansprucht wird, worin die Widerstandsschicht ein Säure-generierendes Polymer ist.
Ein Verfahren wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin die Widerstandsschicht Polymethylmethacrylat (PMMA) oder seine Derivate umfasst.
Ein Verfahren wie es in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht wird, worin die Widerstandsschicht einen Elektronenstrahlwiderstand umfasst, vorzugsweise ein Poly(olefinsulfon).
Ein Verfahren wie es in einem der Ansprüche 3 bis 7 beansprucht wird, worin die Schutzgruppen säurelabil sind.
Ein Verfahren wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin das Reagens ein Monomer ist.
Ein Verfahren wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin die Reagenzien eine Bibliothek von Verbindungen umfassen.
Ein Verfahren wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin ein separater Block, der mindestens einen Kanal auf einer Oberfläche davon umfasst, mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird, wodurch mindestens ein Flusskanal für Reagenzien zur Verfügung gestellt wird.
Die Verwendung einer Widerstandsschicht in einem Verfahren zur Herstellung eines Arrays diverser Polymersequenzen auf einem Substrat, worin verschiedene Polymer in verschiedenen Regionen auf dem Substrat lokalisiert sind.
Eine Verwendung wie sie in Anspruch 12 beansprucht wird, worin das Verfahren ein solches ist, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert wird.