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DE69133293T2 - Verfahren und Reagenzien für immobilisierten Polymersynthese in sehr grossem Masstab - Google Patents

Verfahren und Reagenzien für immobilisierten Polymersynthese in sehr grossem Masstab Download PDF

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DE69133293T2
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synthesis
group
strategy
binary
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DE69133293T
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Stephen P.A. Fodor
Lubert Stryer
James L. Sunnyvale Winkler
Christopher W. Holmes
Dennis W. Solas
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Affymetrix Inc
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Description

  • Stand der Technik
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Fachgebiet der Polymersynthese. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines Monomers, das eine durch einen Aktivator entfernbare Schutzgruppe aufweist, in einem geordneten Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von Polymersequenzen durch das fortlaufende Zufügen von Reagenzien. Außerdem betrifft die Erfindung Verbindungen, die photoentfernbare Schutzgruppen aufweisen, ein Reaktorsystem zum Synthetisieren einer großen Anzahl von Polymersequenzen auf einem Substrat und ein Verfahren zum Screening einer großen Anzahl von Linkerpolymeren zur Verwendung in Bindungsaffinitätsstudien.
  • EP-A-400 920 beschreibt die mehrfache gleichzeitige Synthese von Peptiden in einer Mikrotiterplatte.
  • V. K. Haridasan und V. N. Rajasekharan Pillai: "Peptide Synthesis using Photolytically Cleavable 2-Nitrobenzyloxycarbonyl Protecing Group", Proceedings of the Indian National Science Academy; Teil A; Physical Sciences, Bd. 53, Nr. 6, November 1987 (1987-11), Seiten 717-728, XP 0096 1323 Neu-Delhi, in ISSN: 0370-0048, beschreibt eine Peptidsynthese unter Verwendung von photolytisch spaltbaren Schutzgruppen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Monomers, das eine durch einen Aktivator entfernbare Schutzgruppe aufweist, ist einem geordneten Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von Polymersequenzen durch das fortlaufende Zufügen von Reagenzien bereit, umfassend den Schritt zum seriellen Schützen und Schutzgruppen-Entfernen von Teilen der großen Anzahl von Polymersequenzen für das Zufügen anderer Teile der Polymersequenzen unter Verwendung einer binären Synthesestrategie, wobei entweder:
    • a) die binäre Synthesestrategie eine binäre Maskierungsstrategie ist und wobei die Maskierungsstrategie mindestens zwei aufeinander folgende Schritte bereitstellt, in denen eine Maske eine vorherige Maske ablöst, indem ein Teil eines vorher angestrahlten Teils vor Licht geschützt wird und ein Teil eines vorher geschützten Teils dem Licht ausgesetzt wird; oder
    • b) die binäre Synthesestrategie eine binäre Maskierungsstrategie ist und wobei die Masken in einer Gray-Code-Maskierungsstrategie angeordnet sind, wobei die Gray-Code-Maskierungsstrategie auf jeder von einer großen Anzahl von Synthesestellen eine Randausleuchtung aufweist.
  • Vorzugsweise ist die Schutzgruppe photolabil, insbesondere wenn das Monomer ein natürliches oder nicht-natürliches Ribonukleosid oder Desoxyribonukleosid ist.
  • Das geordnete Verfahren kann den Schritt zum Erzeugen eines Teils des Polymers mit einer nicht-binären Markierungsstrategie umfassen.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein geordnetes Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von Polymersequenzen durch fortlaufendes Zufügen von Reagenzien bereit, umfassend den Schritt zum seriellen Schützen und Schutzgruppen-Entfernen von Teilen der großen Anzahl von Polymersequenzen für das Zufügen anderer Teile der Polymersequenzen unter Verwendung einer binären Synthesestrategie, wobei die binäre Synthesestrategie eine binäre Maskierungsstrategie ist und wobei entweder:
    • a) die binäre Maskierungsstrategie mindestens zwei aufeinander folgende Schritte bereitstellt, in denen eine Maske eine vorherige Maske ablöst, indem ein Teil eines vorher angestrahlten Teils vor Licht geschützt wird und ein Teil eines vorher geschützten Teils dem Licht ausgesetzt wird; oder
    • b) die Masken in einer Gray-Code-Maskierungsstrategie angeordnet sind, wobei die Gray-Code-Maskierungsstrategie auf jeder von einer großen Anzahl von Synthesestellen eine Randausleuchtung aufweist.
  • In Schritt (a) können mindestens zwei aufeinander folgende Schritte in der Maskierungsstrategie etwa die eine Hälfte eines Bereichs von Interesse auf dem Substrat anstrahlen.
  • Weiterhin kann in Schritt (a) die Maskierungsstrategie eine große Anzahl von Polymersequenzen auf einem einzelnen Substrat erzeugen.
  • Die Maskierungsstrategie kann eine Mindestzahl von Maskierungsschritten für mehrere synthetisierte Polymere zur Folge haben.
  • Alle möglichen Polymere mit einer Länge von weniger als oder gleich 1 können mit einem gegebenen Basissatz von Monomeren erzeugt werden.
  • Die Maskierungsstrategie kann in einem geeignet programmierten digitalen Computer entwickelt werden, wobei mindestens ein gewünschter Basissatz und die Länge der Polymere eingegeben werden, gegebenenfalls weiterhin umfassend den Schritt zum Ausgeben einer Maskierungsstrategie oder zum Ausgeben einer Karte der synthetisierten Polymere auf dem Substrat, wobei die Karte vorzugsweise in der Form von 9 vorliegt.
  • Das geordnete Verfahren kann weiterhin den Schritt zum Erzeugen eines Teil der Polymere mit einer nicht-binären Maskierungsstrategie umfassen.
  • In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, umfassend ein natürliches oder nicht-natürliches Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das kovalent über die C-5'-Sauerstoffgruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, oder eine natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die kovalent über die Amino- oder Carboxylgruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, wobei die photoentfernbare Schutzgruppe die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 00030001
  • In der R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidorest darstellen oder angrenzende Substituenten (d.h. R1-R2, R2-R3, R3-R4) substituierte Sauerstoffgruppen sind, die zusammen ein ringförmiges Acetal oder Ketal bilden; und R5 ein Wasserstoffatom oder einen Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylrest darstellt.
  • Vorzugsweise stellen R1 und R4 jeweils ein Wasserstoffatom dar, wobei R5 gegebenenfalls eine Methylgruppe bedeutet.
  • Eine bevorzugte Verbindung umfasst ein natürliches oder nicht-natürliches Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das kovalent über seine C-5'-Sauerstoffgruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, oder eine natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die kovalent über die Carboxyl- oder Aminogruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, wobei die Schutzgruppe die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 00040001
    in der R1 und R2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidorest darstellen; und R3 einen Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylrest bedeutet.
  • Vorzugsweise stellen R1 und R2 ein Wasserstoffatom dar, wobei R3 gegebenenfalls eine Methylgruppe bedeutet.
  • Eine weitere bevorzugte Verbindung umfasst ein natürliches oder nicht-natürliches Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das kovalent über seine C-5'-Sauerstoffgruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, oder eine natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die kovalent über ihre Carboxyl- oder Aminogruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, wobei die Schutzgruppe die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 00040002
    in der R1 und R2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidorest darstellen; und R3 einen Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Wasserstoff- oder Alkenylrest bedeutet.
  • Vorzugsweise stellen R1 und R2 jeweils ein Wasserstoffatom dar, wobei R3 gegebenenfalls ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet.
  • In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Reaktorsystem zum Synthetisieren einer großen Anzahl von Polymersequenzen auf einem Substrat bereit, umfassend:
    • a) einen Reaktor zum Inkontaktbringen von Reaktionsflüssigkeiten mit dem Substrat;
    • b) ein System zum Abgeben ausgewählter Reaktionsflüssigkeiten an den Reaktor;
    • c) eine Translationsvorrichtung zum Bewegen einer Maske oder eines Substrats von mindestens einer ersten relativen Position zu einer zweiten relativen Position;
    • d) ein Licht zum Anstrahlen des Substrats durch eine Maske zu ausgewählten Zeiten; und
    • e) einen geeignet programmierten digitalen Computer zum selektiven Steuern eines Ablaufs von Flüssigkeiten aus dem Reaktorsystem, zum selektiven Aktivieren der Translationsvorrichtung und zum selektiven Anstrahlen des Substrats, so dass auf dem Substrat an vorher bestimmten Positionen eine große Anzahl verschiedener Polymersequenzen erzeugt wird.
  • Das Reaktorsystem kann so ausgerichtet werden, dass es eine große Anzahl von Monomeren in einer Reaktionsflüssigkeit für das Substrat bereitstellt, wobei das Substrat für ein anfängliches Screening von Polymersequenzen verwendet wird.
  • In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screening einer großen Anzahl von Linkerpolymeren zur Verwendung in Bindungsaffinitätsstudien bereit, umfassend die folgenden Schritte:
    • a) Herstellen einer großen Anzahl von Linkerpolymeren auf einem Substrat in ausgewählten Bereichen, wobei die Linkerpolymere durch die folgenden Schritte gebildet werden, die rekursiv sind:
    • i) auf einer Oberfläche eines Substrats Anstrahlen eines Teils der ausgewählten Bereiche, um eine Schutzgruppe zu entfernen; und
    • (ii) Inkontaktbringen der Oberfläche mit einem Monomer;
    • b) Inkontaktbringen der großen Anzahl von Linkerpolymeren mit einem Liganden; und
    • c) Inkontaktbringen des Liganden mit einem markierten Rezeptor.
  • Der Ligand kann ein Polypeptid sein, wobei gegebenenfalls der Rezeptor ein Antikörper ist.
  • Die in Schritt ii) zugegebenen Monomere können in jedem der rekursiven Schritte die gleichen sein, wobei die ausgewählten Bereiche Linkermoleküle mit unterschiedlichen Längen umfassen.
  • Eine verbesserte Ausstattung zur Datenerfassung und verbesserte Verfahren können eingesetzt werden. Z.B. können die Instrumente ein System umfassen, mit dem die Affinität eines Rezeptors für einen Liganden bestimmt werden kann, umfassend: Mittel zum Anwenden von Licht auf eine Oberfläche eines Substrats, wobei das Substrat eine große Anzahl von Liganden an vorher bestimmten Positionen umfasst, wobei die Mittel zum Anwenden von gezieltem Licht ein gleichzeitiges Anstrahlen an einer großen Anzahl von vorher bestimmten Positionen bereitstellt; und eine Anordnung ("Array") von Detektoren zum Nachweisen von Fluoreszenz an der großen Anzahl von vorher bestimmten Positionen. Weiterhin stellt die Erfindung verbesserte Datenanalyseverfahren bereit, umfassend die folgenden Schritte: Aussetzen von fluoreszierend markierten Rezeptoren einem Substrat, wobei das Substrat eine große Anzahl von Liganden in Bereichen an bekannten Positionen umfasst; Bestimmen der Fluoreszenzstärke aus den Datenerfassungspunkten, und zwar an einer großen Anzahl von Datenerfassungspunkten innerhalb jedes der Bereiche; Entfernen der Datenerfassungspunkte, die von einer vorher bestimmten statistischen Verteilung abweichen; und Bestimmen einer relativen Bindungsaffinität des Rezeptors aus den restlichen Datenerfassungspunkten.
  • Außerdem sind geschützte Aminosäure-N-Carboxyanhydride für die Verwendung in der Polymersynthese geeignet. Z.B. kann eine Verbindung mit der folgenden Formel eingesetzt werden:
    Figure 00060001
    wobei R eine Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellt und X eine photoentfernbare Schutzgruppe bedeutet.
  • Die Art und die Vorteile der vorliegenden Erfindung lassen sich noch besser verstehen, wenn man die restlichen Teile der Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen beachtet.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 erläutert schematisch die lichtgesteuerte räumlich-ansprechbare parallele chemische Synthese;
  • 2 erläutert schematisch ein Beispiel einer lichtgesteuerten Peptidsynthese (SEQ ID NO: 1, 2 und 21);
  • 3 erläutert schematisch die Software für das automatische System zum Synthetisieren unterschiedlicher Polymersequenzen; Die 4a und 4b erläutern den Ablauf eines Programms für die Polymersynthese;
  • 5 erläutert schematisch eine "reine" binäre Maskierungsstrategie;
  • 6 erläutert schematisch eine binäre Gray-Code-Maskierungsstrategie;
  • 7 erläutert schematisch eine modifizierte binäre Gray-Code-Maskierungsstrategie;
  • 8a erläutert schematisch eine Maskierungsstrategie für eine vierstufige Synthese;
  • 8b erläutert schematisch die Synthese von allen 400 Peptiddimeren;
  • 9 stellt eine Koordinatenkarte für die zehnstufige binäre Synthese dar;
  • 10 erläutert schematisch ein Datenerfassungssystem;
  • 11 stellt ein Blockdiagramm dar, das die Architektur des Datenerfassungsystems erläutert;
  • 12 stellt ein Flussdiagramm dar, welches den Ablauf der Software für das System zur Datenerfassung/-analyse erläutert; und
  • 13 erläutert schematisch ein Beispiel einer lichtgesteuerten Oligonukleotid-Synthese.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Inhalt
    • 1. Definitionen
    • II. Allgemeines
    • A. Entfernen der Schutzgruppen und Zufügen
    • 1. Beispiel
    • 2. Beispiel
    • B. Erkennen durch einen Antikörper
    • 1. Beispiel
    • III. Synthese
    • A. Reaktorsystem
    • B. Binäre Synthesestrategie
    • 1. Beispiel
    • 2. Beispiel
    • 3. Beispiel
    • 4. Beispiel
    • 5. Beispiel
    • 6. Beispiel
    • C. Auswahl des Linkers
    • D. Schutzgruppen
    • 1. Verwendung von photoentfernbaren Schutzgruppen während der Festphasensynthese von Peptiden
    • 2. Verwendung von photoentfernbaren Schutzgruppen während der Festphasensynthese von Oligonukleotiden
    • E. Aminosäure-N-Carboxyanhydride, geschützt mit einer photoentfernbaren Gruppe
    • IV. Datenerfassung
    • A. Datenerfassungssystem
    • B. Datenanalyse
    • V. Andere repräsentative Anwendungen
    • A. Oligonukleotid-Synthese
    • 1. Beispiel
    • VI. Schlussfolgerung
  • 1. Definitionen
  • Bestimmte hier verwendete Begriffe sollen die folgenden allgemeinen Definitionen haben:
  • 1. Komplementarität: Dieser Begriff bezieht sich auf die topologische Kompatibilität oder das Zusammenpassen von interagierenden Oberflächen eines Ligandmoleküls und seines Rezeptors. Somit können der Rezeptor und sein Ligand als komplementär beschrieben werden, und ferner sind die Eigenschaften der Kontaktoberflächen komplementär zueinander.
  • 2. Epitop: Hierbei handelt es sich um den Teil eines Antigenmoleküls, der durch den Bereich einer Wechselwirkung mit der Unterklasse von Rezeptoren gekennzeichnet ist, die als Antikörper bekannt sind.
  • 3. Ligand: Ein Ligand ist ein Molekül, das durch einen bestimmten Rezeptor erkannt wird. Beispiele von Liganden, die durch die vorliegende Erfindung untersucht werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Agonisten und Antagonisten von Zellmembran-Rezeptoren, Toxine und Tiergifte, virale Epitope, Hormone (z.B. Opiate, Steroide usw.), Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, Cofaktoren, Arzneistoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine und monoklonale Antikörper.
  • 4. Monomer: Hierbei handelt es sich um ein Mitglied eines Satzes von kleinen Molekülen, die zusammengefügt werden können, so dass ein Polymer entsteht. Der Satz von Monomeren umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf z.B. den Satz von herkömmli- chen L-Aminosäuren, den Satz von D-Aminosäuren, den Satz von synthetischen Aminosäuren, den Satz von Nukleotiden und den Satz von Pentosen und Hexosen. In der Verwendung hier bezieht sich der Begriff Monomer auf ein beliebiges Mitglied eines Basissatzes für die Synthese eines Polymers. Z.B. bilden die Dimere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren einen Basissatz von 400 Monomeren für die Synthese von Polypeptiden. Unterschiedliche Basissätze von Monomeren können in aufeinander folgenden Schritten in der Synthese eines Polymers eingesetzt werden. Weiterhin kann jeder der Sätze geschützte Mitglieder enthalten, die nach der Synthese modifiziert werden.
  • 5. Peptid: Hierbei handelt es sich um ein Polymer, in welchem die Monomere α-Aminosäuren sind, die über Amidbindungen miteinander verbunden sind, ein solches Polymer wird alternativ auch als Polypeptid bezeichnet. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung sollte es so verstanden werden, dass die Aminosäuren als das optische L-Isomer oder als das optische D-Isomer vorliegen können. Peptide weisen häufig eine Länge von zwei oder mehr Aminosäure-Monomeren auf, und häufig sind sie mehr als 20 Aminosäure-Monomere lang. Herkömmliche Abkürzungen für Aminosäuren werden verwendet (z.B. P für Prolin). Diese Abkürzungen finden sich in Stryer, Biochemistry, 3. Aufl., 1988.
  • 6. Strahlung: Die Energie, die selektiv angewendet werden kann, umfasst eine Energie mit einer Wellenlänge zwischen 10-14 und 104 m, umfassend z.B. Elektronenstrahlung, Gammastrahlung, Röntgenstrahlung, Ultraviolett-Strahlung, sichtbares Licht, Infrarotstrahlung, Mikrowellenstrahlung und Radiowellen. „Bestrahlung" bezieht sich auf die Anwendung einer Strahlung auf eine Oberfläche.
  • 7. Rezeptor: Hierbei handelt es sich um ein Molekül, das eine Affinität für einen bestimmten Liganden hat. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle sein. Außerdem können sie in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Stoffen verwendet werden. Rezeptoren können entweder direkt oder über eine spezifische bindende Substanz kovalent oder nicht-kovalent an eine bin- dende Einheit gebunden sein. Beispiele von Rezeptoren, die in dieser Erfindung eingesetzt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Antikörper, Zellmembran-Rezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren, die reaktiv sind mit spezifischen antigenen Determinanten (z.B. auf Viren, Zellen oder anderen Materialien), Arzneistoffe, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Cofaktoren, Lektine, Zucker, Polysaccharide, Zellen, Zellmembranen und Organellen. Rezeptoren werden manchmal vom Fachmann als Anti-Liganden bezeichnet. Wenn hier der Begriff Rezeptoren verwendet wird, soll es keinen Unterschied in der Bedeutung geben. Ein „Ligand-Rezeptor-Paar" wird gebildet, wenn sich zwei Makromoleküle anhand der molekularen Erkennung vereinigt haben, so dass sie einen Komplex erzeugen.
  • Andere Beispiele von Rezeptoren, die durch die vorliegende Erfindung untersucht werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf:
  • a) Rezeptoren von Mikroorganismen: Wenn Liganden bestimmt werden, die an Rezeptoren binden, wie spezifische Transportproteine oder Enzyme, die für das Überleben von Mikroorganismen essentiell sind, kann dies für eine neue Klasse von Antibiotika genutzt werden. Von besonderem Wert wären Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Protozoa und diejenigen Bakterien, die gegenüber den üblicherweise eingesetzten Antibiotika resistent sind.
  • b) Enzyme: Z.B. können durch das Bestimmen der Bindungsstelle von Enzymen, etwa den Enzymen, die für das Spalten von Neurotransmittern verantwortlich sind, nützliche Informationen bereitgestellt werden. Wenn Liganden bestimmt werden, die an bestimmte Rezeptoren binden, um die Wirkung der Enzyme zu modulieren, welche die verschiedenen Neurotransmitter spalten, kann dies für die Entwicklung von Arzneistof fen eingesetzt werden, welche zur Behandlung von Störungen der Nervenübertragung genutzt werden können.
  • c) Antikörper: Z.B. kann die Erfindung eingesetzt werden, um die Ligand-Bindungsstelle auf dem Antikörpermolekül zu untersuchen, das sich mit dem Epitop eines Antigens von Interesse vereinigt; wenn eine Sequenz bestimmt wird, die ein antigenes Epitop nachahmt, kann dies zur Entwicklung von Impfstoffen führen, deren Immunogen auf einer oder auf mehreren solchen Sequenzen basiert, oder dies kann zur Entwicklung verwandter diagnostischer Mittel oder Verbindungen führen, die für therapeutische Behandlungen, z.B. bei Autoimmunleiden, eingesetzt werden können (z.B. indem die Bindung der „Selbst"-Antikörper blockiert wird).
  • d) Nukleinsäuren: Sequenzen von Nukleinsäuren können synthetisiert werden, um damit DNA- oder RNA-bindende Sequenzen zu bestimmen.
  • e) Katalytische Polypeptide: Hierbei handelt es sich um Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die in der Lage sind, eine chemische Reaktion zu fördern, welche die Umwandlung von einem oder von mehreren Reaktionsteilnehmern zu einem oder mehreren Produkten umfassen. Solche Polypeptide enthalten im Allgemeinen eine Bindungsstelle, die für mindestens einen Reaktionsteilnehmer oder ein Reaktionszwischenprodukt spezifisch ist, und eine Funktionalität in der Nähe der Bindungsstelle, wobei die Funktionalität befähigt ist, den gebundenen Reaktionsteilnehmer chemisch zu modifizieren. Katalytische Polypeptide werden z.B. in der US-Anmeldung Seriennummer 404 920 beschrieben.
  • f) Hormonrezeptoren: Hierbei handelt es sich z.B. um die Rezeptoren für Insulin und Wachstumshormon. Wenn Liganden bestimmt werden, die mit einer höheren Affinität an einen Rezeptor binden, kann dies nützlich sein in der Entwicklung von z.B. einer oralen Ersatztherapie für die täglichen Injektionen, die sich Diabetiker setzen müssen, um die Symptome der Diabetes zu lindern, und in einem anderen Fall als Ersatz für das knappe menschliche Wachstumshormon, das nur aus Leichen oder durch DNA-Rekombinationstechnologie erhalten werden kann. Andere Beispiele sind die vasokonstriktiven Hormonrezeptoren; wenn Liganden bestimmt werden, welche an einen Rezeptor binden, kann dies zur Entwicklung von Arzneistoffen führen, mit denen der Blutdruck eingestellt werden kann.
  • g) Opiatrezeptoren: Wenn Liganden bestimmt werden, welche an die Opiatrezeptoren im Gehirn binden, kann dies genutzt werden, um weniger abhängig-machende Ersatzstoffe für Morphin und verwandte Arzneistoffe zu entwickeln.
  • 8. Substrat: Hierbei handelt es sich um ein Material, das eine starre oder halbstarre Oberfläche besitzt. In vielen Ausführungsformen ist mindestens eine Oberfläche des Substrats im Wesentlichen eben, wobei es in einigen Ausführungsformen wünschenswert sein kann, Synthesebereiche für unterschiedliche Polymere physikalisch voneinan der zu trennen, z.B. anhand von Vertiefungen, erhabenen Bereichen, geätzten Gräben oder dergleichen. Gemäß anderen Ausführungsformen können auf der Oberfläche kleine Kügelchen bereitgestellt werden, die nach dem vollständigen Ablauf der Synthese freigesetzt werden können.
  • 9. Schutzgruppen: Hierbei handelt es sich um ein Material, das an eine Monomereinheit chemisch gebunden ist und das durch die selektive Exposition gegenüber einem Aktivator, wie einer elektromagnetischen Strahlung, entfernt werden kann. Beispiele von Schutzgruppen, die hier eingesetzt werden können, umfassen diejenigen, die Nitropiperonyl, Pyrenylmethoxycarbonyl, Nitroveratryl, Nitrobenzyl, Dimethyldimethoxybenzyl, 5-Brom-7-nitroindolinyl, o-Hydroxy-α-methylcinnamoyl und 2-Oxymethylenanthrachinon enthalten.
  • 10. Vorher definierter Bereich: Ein vorher definierter Bereich ist ein begrenzter Bereich auf einer Oberfläche, der zum Erzeugen eines Polymers aktiviert wird, wurde oder werden soll. Der vorher definierte Bereich kann eine beliebige geeignete Form haben, z.B. kann er kreisförmig, rechteckig, elliptisch, keilförmig usw. sein. Der Einfachheit halber werden hier die „vorher definierten Bereiche" manchmal einfach nur als „Bereiche" bezeichnet.
  • 11. Im Wesentlichen rein: Ein Polymer wird als „im Wesentlichen rein" innerhalb eines vorher definierten Bereichs eines Substrats angesehen, wenn dieser Bereich Eigenschaften zeigt, die ihn von anderen vorher definierten Bereichen unterscheiden. Typischerweise wird die Reinheit als die biologische Aktivität oder Funktion gemessen, die aus einer einheitlichen Sequenz stammt. Solche Charakteristika werden typischerweise anhand der Bindung an einen ausgewählten Liganden oder Rezeptor gemessen.
  • 12. Aktivator bezieht sich auf eine Energiequelle, die so gestaltet ist, dass sie eine Gruppe aktiv macht, und die von einer Quelle aus auf eine vorher definierte Position auf einem Substrat gerichtet ist. Eine wichtiger Vertreter eines Aktivators ist Licht. Andere Beispiele von Aktivatoren umfassen Ionenstrahlen, elektrische Felder, magnetische Felder, Elektronenstrahlen, Röntgenstrahlen und dergleichen.
  • 13. Binäre Synthesestrategie bezieht sich auf eine geordnete Strategie für eine parallele Synthese von verschiedenen Polymersequenzen durch das fortlaufende Zufügen von Reagenzien, dieser Vorgang kann durch eine Reaktionspartner-Matrix und eine Schalt-Matrix („switch matrix") dargestellt werden, wobei das Produkt hiervon eine Produkt-Matrix ist. Die Reaktionspartner-Matrix ist eine 1 × m-Matrix der Bildungsblöcke, die zugefügt werden sollen. Die Schalt-Matrx ist die Gesamtheit oder eine Teilmenge der Binärzahlen, vorzugsweise der Reihenfolge nach, die zwischen 1 und m in Spalten angeordnet sind. In bevorzugten Ausführungsformen ist eine binäre Strategie eine solche, in der mindestens zwei aufeinander folgende Schritte die Hälfte eines Bereichs von Interesse auf dem Substrat anstrahlen. In den am stärksten bevorzugten Ausführungs formen bezieht sich die binäre Synthese auf eine Synthesestrategie, die außerdem einen vorherigen Zugabeschritt ablöst. Z.B. eine Strategie, in der eine Schalt-Matrix für eine Maskierungsstrategie Bereiche halbiert, die vorher angestrahlt waren, wobei etwa die eine Hälfte des vorher angestrahlten Bereichs angestrahlt wird und die restliche Hälfte geschützt wird (während auch etwa die eine Hälfte der vorher geschützten Bereiche geschützt wird und etwa die andere Hälfte der vorher geschützten Bereiche angestrahlt wird). Es ist so zu verstehen, dass zwischen den binären Runden auch nicht-binäre Runden eingefügt werden können und dass lediglich ein Teil eines Substrats einem binären Schema unterworfen werden kann, wobei dies jedoch immer noch als eine binäre Maskierungsstrategie innerhalb der vorliegenden Definition angesehen wird. Eine binäre „Maskierungs"strategie ist eine binäre Synthese, bei der Licht eingesetzt wird, um Schutzgruppen von Stoffen zu entfernen, so dass andere Stoffe, wie Aminosäuren, zugefügt werden können. In bevorzugten Ausführungsformen sind ausgewählte Spalten der Schalt-Matrix in der Reihenfolge der ansteigenden Binärzahlen in den Spalten der Schalt-Matrix angeordnet.
  • 14. Linker bezieht sich auf ein Molekül oder eine Gruppe von Molekülen, das/die an einem Substrat gebunden ist und einen Abstand zwischen einem synthetisierten Polymer und dem Substrat bildet, so dass die Exposition/Bindung an einen Rezeptor möglich wird.
  • II. Allgemeines
  • Die vorliegende Erfindung stellt Synthesestrategien und Vorrichtungen zum Erzeugen einer chemischen Diversität in einem großen Maßstab bereit. Hierbei werden die Festphasenchemie, photolabile Schutzgruppen und die Photolithographie gemeinsam eingesetzt, so dass in bevorzugten Ausführungsformen eine lichtgesteuerte räumlich-ansprechbare parallele chemische Synthese erreicht wird.
  • Die Erfindung wird hier zum Zweck der Erläuterung hauptsächlich mit Bezug auf das Herstellen von Peptiden und Nukleotiden beschrieben, sie könnte jedoch auch einfach auf das Herstellen anderer Polymere übertragen werden. Solche Polymere umfassen z.B. sowohl lineare als auch cyclische Polymere von Nukleinsäuren, Polysaccharide, Phospholipide und Peptide, die entweder α-, β- oder ω-Aminosäuren aufweisen, Heteropolymere, in denen ein bekannter Arzneistoff kovalent an einen beliebigen Vertreter der vorstehenden Substanzen gebunden ist, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylene, Sulfide, Polysiloxane, Polyimide, Polyacetate oder andere Polymere, die bei Durchsicht der vorliegenden Beschreibung ersichtlich sind. Ferner ist es so zu verstehen, dass die hier dargestellten Erläuterungen sich hauptsächlich auf eine Synthese vom C- zum N-Terminus beziehen, wobei die Erfindung jedoch auch einfach auf eine Synthese vom N- zum C-Terminus angewendet werden kann, ohne dass vom Umfang der Erfindung abgewichen wird.
  • A. Entfernen der Schutzgruppen und Anfügen
  • sDie vorliegende Erfindung setzt eine maskierte Lichtquelle oder einen anderen Aktivator ein, um die gleichzeitige Synthese von vielen verschiedenen chemischen Verbindungen zu steuern. 1 zeigt ein Flussdiagramm, das den Prozess zum Erzeugen chemischer Verbindungen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erläutert. Die Synthese findet auf einem festen Träger 2 statt. Durch ein Anstrahlungsmuster durch eine Maske 4a unter Verwendung einer Lichtquelle 6 wird festgelegt, welche Bereiche des Trägers für eine chemische Kopplung aktiviert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aktivierung durch die Anwendung von Licht, wodurch photolabile Schutzgruppen an ausgewählten Bereichen des Substrats entfernt werden.
  • Nach dem Entfernen der Schutzgruppen wird ein erster Bildungsblock von einem Satz von Bildungsblöcken (in 1 mit „A" bezeichnet), die jeweils eine photolabile Schutzgruppe tragen (mit „X" bezeichnet), der Oberfläche des Substrats ausgesetzt, und er reagiert mit Bereichen, die in dem vorhergehenden Schritt durch Licht angesprochen wurden. Danach wird das Substrat durch eine zweite Maske 4b angestrahlt, wodurch ein anderer Bereich für die Umsetzung mit einem zweiten geschützten Bildungsblock „B" aktiviert wird. Durch das Muster der Masken, die bei diesem Anstrahlen eingesetzt werden, und durch die Reihenfolge der Reaktionspartner werden die endgültigen Produkte und ihre Positionen definiert, dies führt zu unterschiedlichen Sequenzen an vorher definierten Positionen, wie mit den Sequenzen ACEG und BDFH im unteren Teil der 1 gezeigt wird. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung nutzen kombinatorische Maskierungsstrategien, wodurch eine große Zahl von Verbindungen in einer kleinen Zahl von chemischen Schritten hergestellt werden kann.
  • Hierbei ist eine Miniaturisierung in hohem Ausmaß möglich, da die Dichte der Verbindungen größtenteils durch die räumliche Ansprechbarkeit des Aktivators, in einem bestimmten Fall die Beugung von Licht, bestimmt wird. Jede Verbindung ist physikalisch zugänglich, und ihre Position ist genau bekannt. Somit ist die Anordnung räumlich ansprechbar, und ihre Wechselwirkungen mit anderen Molekülen können bestimmt werden.
  • In einer speziellen Ausführungsform, die in 1 dargestellt ist, enthält das Substrat Aminogruppen, die mit einer photolabilen Schutzgruppe blockiert sind. Die Aminosäuresequenzen werden für die Kopplung an einen Rezeptor zugänglich gemacht, indem die Photoschutzgruppen entfernt werden.
  • Wenn eine Polymersequenz, die synthetisiert werden soll, z.B. ein Polypeptid ist, werden Aminogruppen an den Enden von Linkem, die an einem Glassubstrat befestigt sind, mit Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), einer photoentfernbaren Schutzgruppe, derivatisiert. Die Linkermoleküle können z.B. Arylacetylen, Ethylenglykol-Oligomere, die 2 bis 10 Monomere enthalten, Diamine, Disäuren, Aminosäuren oder Kombinationen da von sein. Das Photoentfernen von Schutzgruppen wird durch Anstrahlen des Substrats durch z.B. eine Maske erreicht, in welcher das Muster transparente Bereiche aufweist, mit Dimensionen von z.B. weniger als 1 cm2, 10-1 cm2, 10-2 cm2, 10-3 cm2, 10-4 cm2, 10-5 cm2, 10-6 cm2, 10-7 cm2, 10-8 cm2 oder 10-10 cm2. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Bereiche zwischen etwa 10 × 10 μm und 500 × 500 μm. Gemäß einigen Ausführungsformen sind die Masken so angeordnet, dass eine schachbrettartige Anordnung von Polymeren erzeugt wird, wobei jedoch auch jede beliebige andere von einer Vielzahl von geometrischen Konfigurationen eingesetzt werden kann.
  • 1. Beispiel
  • Freie Aminogruppen wurden fluoreszierend markiert, indem die gesamte Substratoberfläche nach dem Photoentfernen der Schutzgruppen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) behandelt wurde. Hierzu wurden die mikroskopischen Objektträger aus Glas gereinigt, durch Behandlung mit 0,1% Aminopropyltriethoxysilan in 95% Ethanol aminiert und 20 Minuten bei 110°C inkubiert. Danach wurde die aminierte Oberfläche des Objektträgers einer 30 mM Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von NVOC-GABA (Nitroveratryloxycarbonyl-γ-Aminobuttersäure) in DMF ausgesetzt. Die NVOC-Schutzgruppe wurde photolytisch entfernt, indem die 365-nm-Ausgangsleistung einer Hg-Bogenlampe durch eine 100-μm-Schachbrettmaske aus Chrom auf Glas 20 Minuten bei einer Leistungsdichte von 12 mW/cm2 auf einem Substrat abgebildet wurde. Danach wurde die exponierte Oberfläche mit 1 mM FITC in DMF behandelt. Die Substratoberfläche wurde in einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axioskop 20) mit einer Anregung bei 488 nm aus einem Argonionen-Laser (Spectra-Physics, Modell 2025) gescannt. Die Fluoreszenzemission oberhalb von 520 nm wurde durch einen gekühlten Photonenvervielfacher (Hamamatsu 943-02) nachgewiesen, der in einem Photon-Zählmodus arbeitete. Die Fluoreszenzintensität wurde auf einen Farbbildschirm übersetzt, wobei rot die Bereiche mit der höchsten Intensität und schwarz die Bereiche mit der niedrigsten Intensität darstellte. Das Vorliegen eines fluoreszierenden Schachbrettmusters aus Elementen von 100 × 100 μm mit einem hohen Kontrast zeigte, dass durch das örtlich begrenzte Photoentfernen der Schutzgruppen freie Aminogruppen in spezifischen Bereichen erzeugt wurden.
  • 2. Beispiel
  • 2 stellt ein Flussdiagramm dar, das dieses Beispiel erläutert. Hierzu ließ man ein Carboxy-aktiviertes NVOC-Leucin mit einem aminierten Substrat reagieren. Der Carboxy-aktiverte HOBT-Ester von Leucin und anderen Aminosäuren, die in dieser Synthese eingesetzt wurden, wurde hergestellt, indem 0,25 mMol der NVOC-Aminogeschützten Aminosäure mit 37 mg HOBT (1-Hydroxybenzotriazol), 111 mg BOP (Benzotriazolyl-n-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexa-fluorophosphat) und 86 μl DIEA (Diisopropylethylamin) in 2,5 ml DMF umgesetzt wurden. Die NVOC-Schutzgruppe wur de durch ein gleichmäßiges Anstrahlen entfernt. Das Carboxy-aktivierte NVOC-Phenylalanin wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur mit den exponierten Aminogruppen gekoppelt und danach mit DMF und Methylenchlorid gewaschen. Danach wurden zwei unmaskierte Zyklen mit Photoentfernen von Schutzgruppen und Koppeln mit Carboxy-aktiviertem NVOC-Glycin durchgeführt. Anschließend wurde die Oberfläche durch eine Maske aus Chrom auf Glas mit einem 50-μm-Schachbrettmuster angestrahlt. Danach wurde Carboxy-aktiviertes Nα-tBOC-O-tButyl-L-Tyrosin zugefügt. Die gesamte Oberfläche wurde gleichmäßig angestrahlt, um die restlichen NVOC-Gruppen zu photolysieren. Schließlich wurde Carboxy-aktiviertes NVOC-L-Prolin zugefügt, die NVOC-Gruppe wurde durch Anstrahlen entfernt, und die t-BOC- und t-Butyl-Schutzgruppen wurden mit TFA entfernt. Nach dem Entfernen der Schutzgruppen bestand die Oberfläche aus einer 50-μm-Schachbrettanordnung von Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (YGGFL) und Pro-Gly-Gly-Phe-Leu (PGGFL). Vgl. auch SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2.
  • B. Erkennen durch einen Antikörper
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Substrat eingesetzt, um zu bestimmen, welche von einer großen Anzahl von Aminosäuresequenzen durch einen Antikörper von Interesse erkannt wird.
  • 1. Beispiel
  • In einem Beispiel wurde die Anordnung von Pentapeptiden, wie in dem in 2 erläuterten Beispiel, mit einem monoklonalen Antikörper der Maus getestet, der gegen β-Endorphin gerichtet war. Von diesem Antikörper (der mit 3E7 bezeichnet wird) ist bekannt, dass er an YGGFL und YGGFM (vgl. auch SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 20) mit einer nanomolaren Affinität bindet, und er wird in Meo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 4084, beschrieben. Dieser Antikörper benötigt das aminoterminale Tyrosin für die Bindung mit einer hohen Affinität. Die Anordnung von Peptiden, die wie in 2 beschrieben erzeugt wurde, wurde mit einem monoklonalen Antikörper der Maus (3E7) bei 2 μg/ml inkubiert, von dem bekannt ist, dass er YGGFL erkennt. Vgl. auch SEQ ID NO: 1. 3E7 bindet nicht an PGGFL: Vgl. auch SEQ ID NO: 2. Eine zweite Inkubation mit einem Fluorecein-behandelten Anti-Maus-Antikörper der Ziege markierte die Bereiche, an die 3E7 band. Die Oberfläche wurde mit einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop gescannt. Die Ergebnisse zeigten abwechselnde helle und dunkle 50-μm-Quadrate, dies macht deutlich, dass YGGFL (SEQ ID NO: 1) und PGGFL (SEQ ID NO: 2) in einer geometrischen Anordnung synthetisiert wurden, die durch die Maske festgelegt worden war. Eine schachbrettartige Fluoreszenzaufzeichnung mit einem hohen Kontrast (Intensitätsverhältnis von mehr als 12:1) zeigt, (a) dass YGGFL (SEQ ID NO: 1) und PGGFL (SEQ ID NO: 2) in abwechselnden 50-μm-Quadraten synthetisiert wurden, (b) dass das an der Oberfläche gebundene YGGFL (SEQ ID NO: 1) für die Bindung an den Antikörper 3E7 zugänglich ist, und (c) dass der Antikörper 3E7 nicht an PGGFL (SEQ ID NO: 2) bindet.
  • Eine dreidimensionale Darstellung der Daten der Fluoreszenzintensität eines 2 x 4 Quadrate großen rechteckigen Teils des Schachbretts wurde erstellt. Sie zeigt, dass die Grenze zwischen den Synthesestellen scharf ausgeprägt ist. Die Größe jeder Spitze ist in dieser Darstellung linear proportional zu der integrierten Fluoreszenzintensität bei einer Pixelgröße von 2,5 μm. Der Übergang zwischen PGGFL (SEQ ID NO: 2) und YGGFL (SEQ ID NO: 1) erfolgt innerhalb von zwei Spitzen (5 μm). Es liegt nur eine geringe Variation der Fluoreszenzintensität bei den verschiedenen YGGFL-Quadraten vor. Die durchschnittliche Intensität von 16 YGGFL-Synthesestellen betrug 2,03 × 105 Impulse, und die Standardabweichung war 9,6 × 103 Impulse.
  • III. Synthese
  • A. Reaktorsystem
  • 3 erläutert schematisch eine Vorrichtung, die zum Synthetisieren unterschiedlicher Polymersequenzen auf einem Substrat verwendet wurde. Die Vorrichtung umfasst einen automatischen Peptidsynthesizer 401. Der automatische Peptidsynthesizer ist eine Vorrichtung, die ausgewählte Reagenzien unter der Steuerung eines Computers 404 durch eine Durchlaufzelle 402 durchlaufen lässt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Synthesizer ein ABI Peptide Synthesizer, Modell Nr. 431A. Der Computer kann aus den verschiedensten Computern oder einer diskreten Logik ausgewählt werden, umfassend z.B. einen IBM PC-AT oder einen ähnlichen Computer, der mit geeigneten, im Peptidsynthesizer enthaltenen Steuerungssystemen verbunden ist. An den PC werden die Signale aus dem im Gerät eingebauten Computer geliefert, die z.B. das Ende eines Kopplungszyklus anzeigen.
  • Das Substrat 406 wird auf der Durchlaufzelle so montiert, dass zwischen dem Substrat und der Durchlaufzelle eine Vertiefung entsteht. Ausgewählte Reagenzien fließen zu ausgewählten Zeiten vom Peptidsynthesizer aus durch diese Vertiefung, wodurch auf der Seite des Substrats in der Vertiefung eine Anordnung von Peptiden erzeugt wird. Oberhalb des Substrats und vorzugsweise in Kontakt mit dem Substrat wird eine Maske 408 angebracht. Die Maske 408 ist in ausgewählten Bereichen für eine gewählte Lichtwellenlänge durchlässig und in anderen Bereichen für die gewählte Lichtwellenlänge undurchlässig. Die Maske wird mit einer Lichtquelle 410, z.B. einer UV-Lichtquelle, angestrahlt. In einer spezifischen Ausführungsform ist die Lichtquelle 410 das von Oriel hergestellte Modell Nr. 82420. Die Maske wird von einer x-y-z-Translationshalterung 412 entsprechend bewegt, z.B. von einer x-y-Translationshalterung, die von Newport Corp. hergestellt wurde. Der Computer koordiniert die Arbeitsweise des Peptidsynthesizers, der x-y-Translationshalterung und der Lichtquelle.
  • Natürlich kann die Erfindung auch in Ausführungsformen eingesetzt werden, bei denen die Translation des Substrats anstelle der Translation der Maske erfolgt.
  • Wenn das System arbeitet, wird das Substrat auf der Durchlaufzelle montiert. Das Substrat, dessen Oberfläche durch eine geeignete photoentfernbare Schutzgruppe geschützt ist, wird an ausgewählten Positionen dem Licht ausgesetzt, indem die Maske entsprechend positioniert und das Licht aus der Lichtquelle durch die Maske einen gewünschten Zeitraum auf das Substrat ausgerichtet wird (z.B. im Fall einer Peptidsynthese 1 Sek. bis 60 Min.). Ein gewähltes Peptid oder ein anderes Monomer/Polymer wird durch den Peptidsynthesizer durch die Vertiefung des Reaktors gepumpt, so dass die Bindung an den ausgewählten Stellen auf dem Substrat erfolgen kann. Nach einer ausgewählten Reaktionszeit (z.B. im Fall von Peptidreaktionen etwa 1 Sek. bis 300 Min.) wird das Monomer aus dem System ausgewaschen, die Maske wird entsprechend neu positioniert oder ersetzt, und der Zyklus wird wiederholt. In den meisten Ausführungsformen der Erfindung können die Reaktionen bei oder in der Nähe der Raumtemperatur durchgeführt werden.
  • Die 4a und 4b sind Flussdiagramme der Software, die für den Betrieb des Reaktorsystems eingesetzt wurde. Die Software für die Peptidsynthese wird in Schritt 502 initialisiert. In Schritt 504 eicht das System die Positionierer auf der x-y-Translationshalterung und beginnt mit einer Hauptschleife. In Schritt 506 stellt das System fest, welche der Funktionstasten des Computers gedrückt wurden, sofern überhaupt welche betätigt wurden. Wenn F1 gedrückt wurde, fordert das System den Anwender auf, einen gewünschten Syntheseprozess einzugeben. Wenn der Anwender F2 drückt, gestattet das System dem Anwender in Schritt 510, eine Datei für einen Syntheseprozess zu editieren. Wenn der Anwender F3 eingibt, lädt das System in Schritt 512 einen Prozess von einer Disk. Wenn der Anwender F4 eingibt, speichert das System in Schritt 514 einen eingegebenen oder editierten Prozess auf einer Disk. Wenn der Anwender F5 wählt, wird in Schritt 516 der laufende Prozess angezeigt, während das Drücken von F6 das Hauptprogramm startet, d.h. die aktuelle Synthese gemäß dem ausgewählten Prozess. Wenn der Anwender F7 eingibt, zeigt das System die Position der synthetisierten Peptide an, während das Betätigen von F10 den Anwender zum Betriebssystem zurückbringt.
  • 4b erläutert den Syntheseschritt 518 noch ausführlicher. Die Hauptschleife des Programms wird gestartet, wobei das System zuerst in Schritt 526 die Maske zu einer nächsten Position bewegt. Während der Hauptschleife des Programms fließen die erforderlichen Reagenzien unter der Steuerung des im Peptidsynthesizer enthaltenen Computers durch die Reaktionszelle. In Schritt 528 wartet das System sodann auf ein Kommando zur Exposition, und wenn es ein solches empfängt, exponiert es das Substrat in Schritt 530 einen gewünschten Zeitraum lang. Wenn in Schritt 532 die Bestäti gung einer vollständigen Exposition empfangen wird, stellt das System in Schritt 534 fest, ob der Prozess vollständig abgelaufen ist, und wenn dies der Fall ist, wartet es in Schritt 536 auf weitere Eingaben über die Tastatur, und danach verlässt es die Durchführung des Syntheseprozesses.
  • Ein Computerprogramm, das für die Durchführung des vorstehend beschriebenen Systems verwendet wird, ist in Turbo C erstellt (Borland Int'l) und wurde in einem IBM-kompatiblen System implementiert. Die Software für die Motorsteuerung wird aus einer durch die Newport Corporation erstellten Software abgeleitet. Es ist so zu verstehen, dass die verschiedensten Programmiersprachen eingesetzt werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Bestimmte Aufrufe zur Darstellung der Grafik wurden dem folgenden Werk entnommen: „Programmen Guide to PC and PS2 Video Systems", (Wilton, Microsoft Press, 1987).
  • Das Ausrichten der Maske erfolgt in bevorzugten Ausführungsformen durch eines von zwei Verfahren. In einer ersten Ausführungsform wird eine relative Ausrichtung der verschiedenen Komponenten für das System verwendet, diese Ausrichtung kann normalerweise akzeptiert werden, da die x-y-z-Translationshalterungen für den vorliegenden Zweck ausreichend genau arbeiten. In anderen Ausführungsformen werden die Ausrichtungsmarkierungen auf dem Substrat mit einer CCD-Vorrichtung gekoppelt, so dass eine geeignete Ausrichtung erfolgen kann.
  • Gemäß einigen Ausführungsformen werden nicht in jedem Schritt reine Reagenzien zugegeben, oder nicht in jedem Schritt erfolgt eine vollständige Photolyse der Schutzgruppen. Gemäß diesen Ausführungsformen werden an jeder Synthesestelle mehrere Produkte gebildet. Wenn z.B. die Monomere A und B während eines Syntheseschrittes miteinander gemischt werden, binden A und B an ungeschützte Bereiche, und zwar grob in dem Mengenverhältnis, das ihrer Konzentration in der Lösung entspricht. Somit wird in einem Synthesebereich ein Gemisch aus Verbindungen erzeugt. Ein Substrat, das so erzeugt wurde, dass es in verschiedenen Synthesebereichen Gemische von Verbindungen enthält, kann z.B. eingesetzt werden, um ein anfängliches Screening einer großen Zahl von Verbindungen durchzuführen, und danach kann eine kleinere Zahl von Verbindungen in den Bereichen, die eine hohe Bindungsaffinität zeigen, noch weiter gescreent werden. Ähnliche Ergebnisse können erhalten werden, wenn ein Bereich nur teilweise photolysiert wird, ein erstes Monomer zugegeben wird, der gleiche Bereich wieder photolysiert wird und der Bereich einem zweiten Monomer ausgesetzt wird.
  • B. Binäre Synthesestrategie
  • Bei einer lichtgesteuerten chemischen Synthese sind die erzeugten Produkte abhängig von dem Muster und der Reihenfolge der Masken sowie von der Reihenfolge der Reaktionspartner. Im Allgemeinen kann eine begrenzte Zahl von möglichen Maskie rungsstrategien eingesetzt werden, um einen Satz von Produkten herzustellen. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine binäre Synthesestrategie verwendet. Die binäre Synthesestrategie wird hier hauptsächlich mit Bezug auf eine Maskierungsstrategie erläutert, wobei es jedoch so zu verstehen ist, dass sie auch auf andere Polymersynthesestrategien angewendet werden kann, z.B. die Pin-Strategie und dergleichen.
  • In einer binären Synthesestrategie wird das Substrat mit einer ersten Maske angestrahlt, einem ersten Bildungsblock ausgesetzt, mit einer zweiten Maske angestrahlt, einem zweiten Bildungsblock ausgesetzt usw. Jede Kombination eines maskierten Anstrahlens und einer Exposition gegenüber einem Bildungsblock wird hier als ein „Zyklus" bezeichnet.
  • In einer bevorzugten binären Maskierungsstrategie lassen die Masken für jeden Zyklus zu, dass die eine Hälfte eines Bereichs von Interesse auf dem Substrat angestrahlt wird und die restliche Hälfte des Bereichs von Interesse nicht angestrahlt wird. Mit einer Hälfte" soll hier nicht genau die Hälfte des Bereichs von Interesse gemeint sein, vielmehr soll ein großer Anteil des Bereichs von Interesse gemeint sein, wie etwa 30 bis 70% des Bereichs von Interesse. Es ist so zu verstehen, dass nicht die gesamte Maskierungsstrategie in binärer Form ablaufen muss; vielmehr können zwischen den binären Zyklen gegebenenfalls nicht-binäre Zyklen eingefügt werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der binären Maskierungsstrategie wird in einem bestimmten Zyklus nur etwa die eine Hälfte des Bereichs angestrahlt, der in einem vorhergehenden Zyklus angestrahlt wurde, während die restliche Hälfte des im vorherigen Zyklus angestrahlten Teils jetzt nicht angestrahlt wird. Umgekehrt wird in solchen bevorzugten Ausführungsformen in einem bestimmten Zyklus die eine Hälfte des Bereichs angestrahlt, der in dem vorherigen Zyklus nicht angestrahlt wurde, und die andere Hälfte des Bereichs wird nicht angestrahlt, der in einem vorherigen Zyklus nicht angestrahlt wurde.
  • In der hier beschriebenen Synthesestrategie ist die längste Länge (l) der synthetisierten Polymere l = n/a; wobei n die Anzahl der Zyklen darstellt und a die Anzahl der chemischen Bildungsblöcke bedeutet (wobei zu beachten ist, dass ein bestimmter Bildungsblock wiederholt werden kann).
  • Die Synthesestrategie lässt sich am einfachsten in einer Matrixdarstellung erläutern und handhaben. An jeder Synthesestelle handelt es sich bei der Bestimmung, ob ein bestimmtes Monomer zugegeben werden muss, um einen binären Prozess. Somit wird jedes Produktelement Pj durch das Skalarprodukt zweier Vektoren angegeben, eines Vektors des chemischen Reaktionspartners, z.B. C = [A, B, C, D], und eines binären Vektors σj. Beim Betrachten der Produkte in dem nachstehenden Beispiel für eine vierstufige Synthese wird deutlich, dass in einer vierstufigen Synthese σ1 = [1,0,1,0], σ2 = [1,0,0,1], σ3 = [0,1,1,0] und σ4 = [0,1,0,1], wobei eine 1 für ein Anstrahlen und eine 0 für kein Anstrahlen steht. Auf diese Weise wird es möglich, aus den Spaltenvektoren σj Q = 1,k, wobei k die Anzahl der Produkte ist) eine „Schalt-Matrix" S aufzubauen.
  • Figure 00200001
  • Das Ergebnis P einer Synthese ist somit einfach P = CS, das Produkt der Matrix der chemischen Reaktionspartner und der Schalt-Matrix.
  • Die Schalt-Matrix für eine Synthese mit n Zyklen, die k Produkte ergibt, hat n Reihen und k Spalten. Eine wichtige Eigenschaft von S besteht darin, dass jede Reihe eine bestimmte Maske charakterisiert. Eine zweidimensionale Maske mj für den j. chemischen Schritt einer Synthese wird direkt aus der j. Reihe von S erhalten, indem die Elemente sj1, ... sjk z.B. in ein quadratisches Format gestellt werden. Die nachstehende spezielle Anordnung stellt ein quadratisches Format dar, wobei jedoch auch lineare oder andere Anordnungen eingesetzt werden können.
  • Figure 00200002
  • Natürlich können Verbindungen, die in einer lichtaktivierten Synthese erzeugt werden, in jeder beliebigen definierten geometrischen Anordnung positioniert werden. Eine quadratische oder rechteckige Matrix ist günstig, jedoch nicht erforderlich. Die Reihen der Schalt-Matrix können in jede geeignete Anordnung übertragen werden, so lange jede Reihe in gleichwertiger Weise übertragen wird.
  • Z.B. werden die Masken in der vierstufigen Synthese sodann wie folgt bezeichnet:
    Figure 00200003
    wobei 1 ein Anstrahlen (Aktivieren) bedeutet und 0 kein Anstrahlen darstellt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird die Matrixdarstellung verwendet, um einen gewünschten Satz von Produkten und Produktkarten herzustellen. Jede Verbindung ist durch das Produkt des chemischen Vektors und eines bestimmten Schalt-Vektors definiert. Somit speichert man für jede Syntheseposition einfach den Schalt-Vektor, stellt die Werte in Form einer Schalt-Matrix zusammen und entnimmt jeweils eine der Reihen, um die Masken zu erzeugen.
  • In einigen Fällen sind bestimmte Produktverteilungen oder eine maximale Zahl von Produkten gewünscht. Z.B. besteht für C = [A, B, C, D] ein beliebiger Schalt-Vektor (σj) aus vier Bits. Es gibt 16 Vier-Bit-Vektoren. Somit können maximal 16 verschiedene Produkte durch das fortlaufende Zufügen der Reagenzien [A, B, C, D] hergestellt werden. Diese 16 Spaltenvektoren können in 161 unterschiedlichen Arten zusammengefügt werden, so dass eine Schalt-Matrix entsteht. Die Reihenfolge der Spaltenvektoren definiert die Maskierungsmuster und somit die räumliche Anordnung der Produkte, nicht jedoch ihre Zusammensetzung. Die eine Anordnung dieser Spalten ergibt die folgende Schalt-Matrix (worin die „Null-" (⌀-) Zugaben der Vollständigkeit halber in Klammem gesetzt sind, obwohl solche Null-Zugaben hier an anderer Stelle ignoriert werden):
    Figure 00210001
  • Gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind die Spalten von S die binären Darstellungen der Ziffern 15 bis 0. Die 16 Produkte dieser binären Synthese sind ABCD, ABC, ABD, AB, ACD, AC, AD, A, BCD, BC, BD, B, CD, C, D und ⌀ (Null). Außerdem ist zu beachten, dass jeweils die Schalt-Vektoren aus den Masken der vorstehenden vierstufigen Synthese (und somit die Syntheseprodukte) in der binären Vier-Bit-Schalt-Matrix vorliegen (vgl. die Spalten 6, 7, 10 und 11).
  • Dieses Syntheseverfahren bietet einen einfachen Weg für die Kartierung der vollständigen Produkte. Die Produkte in den verschiedenen Positionen auf dem Substrat werden einfach durch die Spalte der Schalt-Matrix definiert (wobei die erste Spalte z.B. anzeigt, dass das Produkt ABCD in der oberen linken Position des Substrats vorliegen wird). Wenn weiterhin nur ausgewählte gewünschte Produkte hergestellt werden sollen, kann die Maskensequenz hergeleitet werden, indem die Spalten mit den gewünschten Sequenzen herausgegriffen werden. Um z.B. den Produktsatz ABCD, ABD, ACD, AD, BCD, BD, CD und D herzustellen, werden die Masken unter Verwendung einer Schalt-Matrix mit nur den Spalten 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 und 15 erzeugt, diese werden dann als die Schalt-Matrix angeordnet:
    Figure 00220001
  • Um alle Polymere mit der Länge 4 zu erzeugen, wird die Reaktionsteilnehmer-Matrix [ABCDABCDABCDABCD] eingesetzt. Die Schalt-Matrix wird aus einer Matrix der Binärzahlen von 0 bis 216, angeordnet in Spalten, erzeugt. Anschließend werden die Spalten, die vier Monomere aufweisen, ausgewählt und als Schalt-Matrix angeordnet. Somit ist ersichtlich, dass mit der binären Schalt-Matrix im Allgemeinen alle Produkte dargestellt werden, die aus einer n-stufigen Synthese hergestellt werden können, und anschließend können aus ihnen die gewünschten Produkte herausgegriffen werden.
  • Die Reihen der binären Schalt-Matrix werden in bevorzugten Ausführungsformen die Eigenschaft aufweisen, dass jeder Maskierungsschritt eine Hälfte der Synthesefläche anstrahlt. Außerdem löst jeder Maskierungsschritt den vorherigen Maskierungsschritt ab; d.h. die eine Hälfte des Bereichs, der in dem vorherigen Schritt angestrahlt war, ist wieder angestrahlt, wohingegen die andere Hälfte nicht mehr angestrahlt ist. Die eine Hälfte des Bereichs, der in dem vorherigen Schritt nicht angestrahlt war, ist auch angestrahlt, während die andere Hälfte nicht angestrahlt ist. Somit ist die Maskierung rekursiv. Die Masken werden wie vorstehend beschrieben konstruiert, indem die Elemente jeder Reihe herausgegriffen und in eine quadratische Anordnung gestellt werden. Z.B. sind die vier Masken in S für eine vierstufige Synthese wie folgt:
    Figure 00220002
  • Das rekursive Einsetzen von Masken macht es möglich, dass die Produkte einer lichtgesteuerten Synthese durch ein Polynom dargestellt werden. (Einige lichtaktivierte Synthesen können nur durch unzerlegbare, d.h. Prim-Polynome charakterisiert werden.) Z.B. ist das Polynom, das der in 8a oben dargestellten Synthese entspricht (nachstehend beschrieben), wie folgt: P = (A + B) (C + D)
  • Das Polynom einer Reaktion kann erweitert werden, als ob es ein algebraischer Ausdruck wäre, vorausgesetzt, dass die Reihenfolge beim Zusammenfügen der Reaktionspartner X1 und X2 erhalten bleibt (X1X2 ≠ X2X1), d.h. dass die Produkte nicht kommutativ sind. Das Produkt ist dann AC + AD + BC + BD. Das Polynom spezifiziert explizit die Reaktionspartner und es spezifiziert implizit die Maske für jeden Schritt. Jedes Paar von Klammem markiert eine Syntheserunde. Die chemischen Reaktionspartner von einer Runde (z.B. A und B) reagieren an nicht-überlappenden Stellen und können sich somit nicht miteinander kombinieren. Die Synthesefläche ist unter den Elementen einer Runde gleichmäßig aufgeteilt (z.B. ist A auf die eine Hälfte der Fläche und B auf die andere Hälfte gerichtet). Somit sind die Masken für eine Runde (d.h. die Masken mA und mB) orthogonal und bilden einen orthogonalen Satz. Außerdem gibt die Bezeichnung des Polynoms an, dass jedes Element in einer Runde mit jedem Element der nächsten Runde gekoppelt wird (z.B. A mit C, A mit D, B mit C, und B mit D). Dies wird erreicht, indem die Maske mC so gestaltet wird, dass sie mA und mB gleichermaßen überlappt, und das Entsprechende gilt auch für mD. Da C und D Elemente einer Runde sind, sind mC und mD zueinander orthogonal und bilden einen orthogonalen Satz.
  • Die Polynom-Darstellung der vorstehend beschriebenen binären Synthese, bei der 16 Produkte aus vier Reaktionspartnern hergestellt werden, ist wie folgt: P = (A + Q3) (B + ⌀) (C + ⌀) (D + ⌀),dies ergibt ABCD, ABC, ABD, AB, ACD, AC, AD, A, BCD, BC, BD, B, CD, C, D und so, wenn erweitert wird (mit der Regel, dass ⌀X = X und X⌀ = X, und wobei daran erinnert wird, dass das Zusammenfügen geordnet ist). In einer binären Synthese umfasst jede Runde einen Reaktionspartner und eine Null (bezeichnet mit Q1). Die Hälfte der Synthesefläche erhält den Reaktionspartner und die andere Hälfte erhält nichts. Jede Maske überlappt jede andere Maske gleichermaßen.
  • Wenn es gewünscht wird, können zwischen den binären Runden auch nichtbinäre Runden eingefügt werden, wie in: P = (A + ⌀) (B) (C + D + ⌀) (E + F + G).
  • Die 18 erzeugten Verbindungen sind ABCE, ABCF, ABCG, ABDE, ABDF, ABDG, ABE, ABF, ABG, BCE, BCF, BCG, BDE, BDF, BDG, BE, BF und BG. Die Schalt-Matrix S für diese siebenstufige Synthese ist wie folgt:
    Figure 00230001
  • In der mit (B) bezeichneten Runde wird B in alle Produkte eingebracht, da die Reaktionsfläche gleichmäßig aktiviert wurde (die Maske für B bestand gänzlich aus den Ziffern 1).
  • Die Zahl der Verbindungen k, die in einer aus r Runden bestehenden Synthese erzeugt werden, wobei die i. Runde bi chemische Reaktionspartner und zi Nullen aufweist, ist k = Σ (bi + zi), und die Zahl der chemischen Schritte n ist n = Σbi
  • Die Zahl der Verbindungen, die synthetisiert werden, wenn in allen Runden b = a (die Zahl der chemischen Bildungsblöcke) und z = 0 ist an/a, im Vergleich zu 2n für eine binäre Synthese. für n = 20 und a = 5 würden 625 Verbindungen (alle Tetramere) erzeugt werden, im Vergleich zu 1,049 × 106 Verbindungen in einer binären Synthese mit der gleichen Anzahl von chemischen Schritten.
  • Es ist zu beachten, dass die Runden in einem Polynom auch verschachtelt sein können, wie in (A + (B + ⌀) (C + ⌀)) (D + ⌀).
  • Die Produkte sind AD, BCD, BD, CD, D, A, BC, B, C und so.
  • Binäre Synthesen sind aus zwei Gründen attraktiv. Erstens erzeugen sie die maximale Zahl von Produkten (2n) für eine bestimmte Anzahl von chemischen Schritten (n). Bei fünf Reaktionsteilnehmern werden in der binären Synthese 16 Verbindungen hergestellt, wohingegen nur 4 erzeugt werden, wenn jede Runde zwei Reaktionspartner hat. Eine zehnstufige binäre Synthese ergibt 1 024 Verbindungen, und eine 20-stufige Synthese ergibt 1 048 576 Produkte. Zweitens sind die Produkte, die in einer binären Synthese gebildet werden, ein vollständiger verschachtelter Satz mit Längen im Bereich von 0 bis n. Alle Verbindungen liegen vor, die gebildet werden können, indem von dem längsten Produkt (dem n-Mer) eine oder mehrere Einheiten deletiert werden. Innerhalb des binären Satzes sind die kleineren Sätze enthalten, die aus den gleichen Reaktionspartnern unter Verwendung eines beliebigen anderen Satzes von Masken hergestellt werden können (z.B. liegen AG, AD, BC und BD, die in der in 5 dargestellten Synthese erzeugt werden, in dem durch die binäre Synthese hergestellten Satz der 16 Verbindungen vor). In einigen Fällen kann es jedoch sein, dass die experimentell erreichbare räumliche Auflösung nicht ausreichend ist, um alle erzeugten Verbindungen unterzubringen. Deshalb kann es aufgrund von praktischen Einschränkungen erforderlich sein, für eine bestimmte Synthese eine spezielle Teilmenge der möglichen Schalt-Vektoren auszuwählen.
  • 1. Beispiel
  • 5 erläutert eine Synthese mit einer binären Maskierungsstrategie. Die binäre Maskierungsstrategie stellt bei einer bestimmten Anzahl von Zyklen die größte Zahl von Sequenzen bereit. Gemäß dieser Ausführungsform erlaubt eine Maske m1 das Anstrahlen der einen Hälfte des Substrats. Danach wird das Substrat dem Bildungsblock A ausgesetzt, der an den angestrahlten Bereichen bindet.
  • Danach erlaubt die Maske m2 das Anstrahlen der einen Hälfte des vorher angestrahlten Bereichs, während die andere Hälfte des vorher angestrahlten Bereichs nicht angestrahlt wird. Danach wird der Bildungsblock B zugefügt, der an die von m2 ange- strahlten Bereiche bindet.
  • Der Prozess wird mit den Masken m3, m4 und m5 fortgesetzt, wobei die Anordnung der Produkte entsteht, die im unteren Teil der Figur dargestellt ist. Der Prozess erzeugt mit fünf (Anzahl der Monomeren) Zyklen 32 Sequenzen (2 hoch die Anzahl der Monomeren).
  • 2. Beispiel
  • 6 erläutert eine weitere bevorzugte binäre Maskierungsstrategie, die hier als die Gray-Code-Maskierungsstrategie bezeichnet wird. Gemäß dieser Ausführungsform werden die Masken m1 bis m5 so ausgewählt, dass eine Seite eines bestimmten Synthesebereichs durch die Kante von nur einer einzigen Maske definiert ist. Bei der Stelle, an der z.B. die Sequenz BCDE erzeugt wird, wird ihre rechte Kante durch m5 definiert und ihre linke Seite durch die Maske m4 gebildet (wobei an den Seiten dieser Stelle keine andere Maske ausgerichtet wird). Auf diese Weise können die Probleme minimiert werden, die durch ein fehlerhaftes Ausrichten, durch eine Diffusion von Licht unter der Maske und dergleichen zustande kommen.
  • 3. Beispiel
  • 7 erläutert eine weitere binäre Maskierungsstrategie. Gemäß diesem Schema, das hier als eine modifizierte Gray-Code-Maskierungsstrategie bezeichnet wird, wird die Zahl der erforderlichen Masken minimiert. Z.B. könnte die Maske m2 die gleiche Maske sein wie m1, wobei sie einfach seitlich verschoben werden könnte. Genauso könnte die Maske m4 die gleiche Maske sein wie m3 und einfach seitlich verschoben werden.
  • 4. Beispiel
  • 8A zeigt eine vierstufige Synthese. Die Reaktionspartner stellen einen geordneten Satz dar (A, B, C, D). Im ersten Zyklus aktiviert das Anstrahlen durch m1 die obere Hälfte der Synthesefläche. Danach wird der Bildungsblock A zugegeben, wodurch die Verteilung 602 erhalten wird. Das Anstrahlen durch die Maske m2 (welche die untere Hälfte aktiviert), gefolgt von der Zugabe von B, ergibt die nächste Verteilung der Zwischenprodukte 604. Nach dem Anstrahlen durch die Maske m3 (welche die linke Hälfte aktiviert) wird C zugefügt, wodurch die Verteilung 604 erhalten wird, schließlich wird D nach dem Anstrahlen durch die Maske m4 (welche die rechte Hälfte aktiviert) zugefügt, wodurch das endgültige Produktmuster 608 (AC, AD, BC, BD) erhalten wird.
  • 5. Beispiel
  • Die vorstehende Maskierungsstrategie für die Synthese kann auf alle 400 Dipeptide aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren erweitert werden, wie in 8b dargestellt ist. Die Synthese besteht aus zwei Runden, wobei pro Runde 20 Zyklen jeweils mit einer Photolyse und einer chemischen Kopplung durchgeführt werden. Im er sten Zyklus von Runde 1 aktiviert die Maske 1 1/20. des Substrats für die Kopplung mit der ersten von 20 Aminosäuren. Die 19 anschließenden Zyklen mit Anstrahlen und Koppeln in Runde 1 ergeben ein Substrat, das aus 20 rechteckigen Streifen besteht, die jeweils ein unterschiedliches Mitglied der 20 Aminosäuren enthalten. Die Masken von Runde 2 sind senkrecht zu den Masken von Runde 1 ausgerichtet, und deshalb ergibt ein einzelner Zyklus mit Anstrahlen und Koppeln in Runde 2 sodann 20 Dipeptide. Anhand der 20 Zyklen mit Anstrahlen und Koppeln der Runde 2 wird die Synthese der 400 Dipeptide vollständig durchgeführt.
  • 6. Beispiel
  • Die Leistungsfähigkeit der binären Maskierungsstrategie lässt sich durch das Ergebnis einer zehnstufigen Synthese zeigen, wodurch 1 024 Peptide erzeugt werden. Die Polynom-Darstellung für diese zehnstufige binäre Synthese war wie folgt: (f+⌀)(Y+⌀)(G+⌀)(A+⌀)(G+⌀)(T+⌀)(F+⌀)(L+⌀)(s+⌀)(F+⌀).
  • Jedes Peptid besetzte ein Quadrat von 400 × 400 μm. In einer Fluoreszenzaufzeichung war deutlich eine Anordnung von 32 × 32 Peptiden ersichtlich (1 024 Peptide, einschließlich des Null-Peptids und der 10 Peptide von 1 = 1, sowie einer begrenzten Zahl von Duplikaten), nachdem die Schutzgruppen der Seitenketten entfernt worden waren und eine Behandlung mit dem Antikörper 3E7 und einem fluoresceinierten Antikörper erfolgt war. Jede Synthesestelle bestand aus einem Quadrat von 400 × 400 μm.
  • Die Aufzeichnung zeigte einen Bereich von Fluoreszenzintensitäten, die von einem Hintergrundwert von 3 300 Impulsen bis zu 22 400 Impulsen im hellsten Quadrat reichten (bei x = 20, y = 9). Lediglich 15 Verbindungen wiesen eine Intensität auf, die größer als 12 300 Impulse war. Der Mittelwert der Anordnung lag bei 4 800 Impulsen.
  • Die Identität jedes Peptids in der Anordnung konnte aus seinen x- und y-Koordinaten (jeweils im Bereich von 0 bis 31) und der Karte von 9 bestimmt werden. Die chemischen Einheiten an den Positionen 2, 5, 6, 9 und 10 sind durch die y-Koordinate und die diejenigen an den Positionen 1, 3, 4, 7, 8 durch die x-Koordinate angegeben. Alle Peptide außer einem waren kürzer als zehn Reste. Z.B. ist das Peptid, das an x = 12 und y = 3 liegt, YGAGF (SEQ ID NO: 3; wobei die Positionen 1, 6, 8, 9 und 10 jeweils Null sind). YGAFLS (SEQ ID NO: 4), das hellste Element der Anordnung, liegt bei x = 20 und y = 9.
  • Häufig soll aus der gemessenen Fluoreszenzintensität die Bindungsaffinität eines bestimmten Peptids hergeleitet werden. Im einfachsten Fall bindet ein einzelnes Peptid an ein einwertiges Antikörpermolekül. Die Fluoreszenzaufzeichnung wird aufgenommen, nachdem der Objektträger eine definierte Zeit mit einem Puffer gewaschen wurde. Die erhaltene Verteilung der Fluoreszenzintensitäten dient als ein wichtiges Maß für die relativen Dissoziationsraten der Antikörper-Peptid-Komplexe. Wenn die „Onrate"-Konstanten gleich sind (z.B. wenn sie diffusionsgesteuert sind), dann entspricht die Verteilung der Fluoreszenzintensitäten typischerweise der Verteilung der Bindungsaffinitäten. Jedoch ist die Situation manchmal komplexer, etwa wenn ein zweiwertiger primärer Antikörper und ein zweiwertiger sekundärer Antikörper eingesetzt werden. Die Dichte der Peptide in einem Synthesebereich entsprach einer durchschnittlichen Auftrennung von ~7 nm, dies würde mehrwertige Antikörper-Peptid-Wechselwirkungen möglich machen. Somit können die gemäß dem vorliegenden Verfahren erhaltenen Fluoreszenzintensitäten häufig als qualitativer Indikator für die Bindungsaffinität dienen.
  • Eine weitere wichtige Überlegung betrifft die Genauigkeit der Synthese. Deletionen werden erzeugt, indem die Schutzgruppen unvollständig photoentfernt werden und die Kopplung unvollständig durchgeführt wird. Die Kopplungsausbeute pro Zyklus liegt in diesen Experimenten typischerweise zwischen 85% und 95%. Die Anwendung einer Schalt-Matrix mittels Maskierens ergibt keine perfekten Ergebnisse, und zwar aufgrund der Lichtbeugung, der inneren Reflexion und der Streuung. Folglich kommen durch ein unbeabsichtigtes Anstrahlen von Bereichen, die eigentlich dunkel sein sollten, Nebenprodukte zustande (d.h. chemische Einheiten, die auf der Fläche eigentlich nicht vorliegen sollten). Eine binäre Syntheseanordnung enthält viele der Kontrollen, die erforder- lich sind, um die Genauigkeit der Synthese zu bestimmen. Z.B. könnte das Fluoreszenzsignal aus einem Synthesebereich, der eigentlich ein Tetrapeptid ABCD enthalten sollte, aus einer Tripeptid-Deletions-Verunreinigung wie ACD stammen. Ein solcher Artefakt ließe sich durch das Ergebnis ausschließen, dass die Fluoreszenzintensität an der ACD-Stelle geringer ist als an der ABCD-Stelle.
  • Die 15 am stärksten fluoreszierenden Peptide in der Anordnung, die bei der vorstehend beschriebenen Synthese von 1 024 Peptiden erhalten wurden, waren YGAfLS (SEQ ID NO: 4), YGAFS (SEQ ID NO: 5), YGAFL (SEQ ID NO: 6), YGGFLS (SEQ ID NO: 7), YGAF (SEQ ID NO: 8), YGALS (SEQ ID NO: 9), YGGFS (SEQ ID NO: 10), YGAL (SEQ ID NO: 11), YGAFLF (SEQ ID NO: 12), YGAF (SEQ ID NO: 8), YGAFF (SEQ ID NO: 13), YGGLS (SEQ ID NO: 14), YGGFL (SEQ ID NO: 1), YGAFSF (SEQ ID NO: 15), und YGAFLSF (SEQ ID NO: 16). Ein entscheidendes Merkmal besteht dann, dass alle 15 Peptide mit YG beginnen, dies stimmt mit früheren Erkenntnissen überein, die zeigen, dass ein aminoterminaler Tyrosinrest eine Schlüsseldeterminante für die Bindung an 3E7 ist. Der Rest 3 ist in diesem Satz entweder A oder G, und der Rest 4 ist entweder F oder L. Der Ausschluss von S und T an diesen Positionen ist eindeutig. Der Befund, dass die bevorzugte Sequenz YG (A/G) (F/L) (SEQ ID NO: 22) ist, stimmt gut mit dem Ergebnis einer Studie überein, in der eine sehr große Peptidbank auf einem Phagen, die durch DNA-Rekombinations-Verfahren erzeugt wurde, auf die Bindung an den Antikörper 3E7 gescreent wurde (vgl. Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6378). Weitere binäre Synthesen, die auf Hinweisen aus Expenmenten mit auf Phagen vorliegenden Peptiden basierten, zeigen, dass YGAFMQ (SEQ ID NO: 17), YGAFM (SEQ ID NO: 18) und YGAFR (SEQ ID NO: 19) stärkere Fluoreszenzsignale ergeben als YGGFM (SEQ ID NO: 20), das Immunogen, das eingesetzt wurde, um den Antikörper 3E7 herzustellen.
  • Unter bestimmten Umständen können auch Variationen der vorstehenden Maskierungsstrategie verwendet werden. Wenn z.B. eine „Kern-" („kernel-") Sequenz von Interesse aus PQR besteht, wobei die Sequenz von XYZ getrennt vorliegt, ist es das Ziel, Peptide zu synthetisieren, in denen diese Einheiten durch eine variable Anzahl von unterschiedlichen Resten getrennt sind. Der Kern kann in jedem Peptid plaziert werden, indem eine Maske verwendet wird, die überall 1 er besitzt. Die Polynom-Darstelllung einer geeignete Synthese ist wie folgt: (P) (Q) (R) (A + ⌀) (B + ⌀) (C + ⌀) (D + ⌀) (x) (Y) (Z).
  • 16 Peptide werden gebildet, wobei ihre Länge im Bereich von dem 6-Mer PQRXYZ bis zu dem 10-Mer PYRABCDXYZ reicht.
  • Außerdem können unter bestimmten Umständen auch verschiedene andere Maskierungsstrategien eingesetzt werden. Indem eine bestimmte Maske öfters als einmal verwendet wird, können zwei oder mehrere Reaktionspartner in dem gleichen Satz von Produkten erscheinen. Man kann z.B. annehmen, dass die Maske für eine achtstufige Synthese wie folgt aussieht:
    Figure 00280001
  • Die Produkte sind ACEG, ACFG, ADEG, ADFG, BCEH, BCFH, BDEH und BDFH. A und G liegen immer im gleichen Produkt vor, nicht jedoch unbedingt nebeneinander, da ihre Zugabe jeweils durch die gleiche Maske gesteuert wurde, das Gleiche gilt für B und H.
  • C. Auswählen des Linkers
  • Die Linkermoleküle, die als ein Zwischenstück zwischen den synthetisierten Polymeren und dem Substrat eingesetzt werden, werden vorzugsweise so ausgewählt, dass sie eine optimale Länge aufweisen und/oder einen optimalen Typ für eine verbesserte Bindungswechselwirkung mit einem Rezeptor darstellen. Verschiedene Linker unterschiedlicher Längen und unterschiedlichen Typs werden synthetisiert und anschließend mit einem Liganden verbunden. Die Bindungswechselwirkung zwischen ei nem immobilisierten Liganden und seinem Rezeptor kann optimiert werden, indem die Länge und der Typ des Linkers variiert werden.
  • Das Ausmaß der Bindung zwischen einem Liganden (Peptid, Inhibitor, Hapten, Arzneistoff usw.) und seinem Rezeptor (Enzym, Antikörper usw.) kann, wenn einer der Partner auf einem Substrat immobilisiert ist, in einigen Ausführungsformen von der Zugänglichkeit des immobilisierten Liganden für den in Lösung vorliegenden Rezeptor abhängen. Die Zugänglichkeit ihrerseits hängt von der Länge und/oder dem Typ des Linkermoleküls ab, das zum Immobilisieren des einen Partners eingesetzt wird. Nachstehend wird vorzugsweise die hier beschriebene VLSIPS-Technologie eingesetzt, um eine Anordnung von vorzugsweise inaktiven oder inerten Linkern mit variierenden Längen und/oder Typen zu erzeugen, wobei photochemische Schutzgruppen verwendet werden, um unterschiedliche Bereiche des Substrats selektiv zu exponieren und auf die chemisch aktiven Gruppen aufzubauen.
  • In der einfachsten Ausführungsform dieses Konzepts wird eine Einheit anhand von VLSIPS-Verfahren an ein Substrat gekoppelt, so dass die gleiche Einheit in variierenden Vielfachen oder Längen an bekannten Positionen auf dem Substrat vorliegt, wodurch eine Anordnung von Polymeren mit unterschiedlichen Längen erzeugt wird. Ein einzelner Ligand (Peptid, Arzneistoff, Hapten usw.) wird an jedes von ihnen gebunden, anschließend wird ein Test mit dieser Bindungsstelle durchgeführt, wobei das Ausmaß der Bindung an einen Rezeptor ermittelt wird, von dem bekannt ist, dass er an den Liganden bindet. In den Fällen, in denen die Länge des Linkers die Fähigkeit des Rezeptors, an den Liganden zu binden, beeinflusst, wird man unterschiedliche Bindungsstärken feststellen können. Im Allgemeinen wird anschließend derjenige Linker, der die höchste Bindung bereitstellt, dazu verwendet, um andere Liganden zu testen, die gemäß den hier beschriebenen Verfahren synthetisiert wurden.
  • Die Bindung zwischen einem einzelnen Ligand/Rezeptor-Paar kann für Linker mit unterschiedlichen Monomersequenzen ermittelt werden. Die Linker werden gemäß den hier beschriebenen Verfahren in einer Anordnung synthetisiert und weisen unterschiedliche Monomersequenzen (und gegebenenfalls unterschiedliche Längen) auf. Danach werden alle Linkermoleküle mit einem Liganden versehen, von dem bekannt ist, dass er mindestens eine gewisse Bindungsaffinität für einen bestimmten Rezeptor aufweist. Danach wird der bestimmte Rezeptor dem Liganden ausgesetzt und sodann die Bindungsaffinität bestimmt. In anschließenden Screeningstudien werden diejenigen Linkermoleküle eingesetzt, die eine ausreichende Bindung zwischen dem Liganden und dem Rezeptor bereitstellen.
  • D. Schutzgruppen
  • Wie vorstehend erläutert machen es selektiv entfernbaren Schutzgruppen möglich, dass gut definierte Bereiche der Substratoberfläche erzeugt werden, die unter schiedliche Reaktivitäten aufweisen. Vorzugsweise werden die Schutzgruppen aus der Oberfläche selektiv entfernt, indem ein spezifischer Aktivator angewendet wird, etwa eine elektromagnetische Strahlung einer spezifischen Wellenlänge und Intensität. Stärker bevorzugt exponiert der spezifische Aktivator ausgewählte Bereiche der Oberfläche, wodurch die Schutzgruppen in den exponierten Bereichen entfernt werden.
  • Schutzgruppen werden im Zusammenhang mit einer Festphasen-Oligomersynthese eingesetzt, etwa bei Peptidsynthesen unter Verwendung natürlicher oder nicht-natürlicher Aminosäuren, Nukleotidsynthesen unter Verwendung von Desoxyribonukleinsäuren und Ribonukleinsäuren, Oligosaccharidsynthesen und dergleichen. Die Schutzgruppen blockieren zusätzlich dazu, dass sie die Substratoberfläche vor einer unerwünschten Reaktion schützen, auch ein reaktives Ende des Monomers, so dass eine Selbstpolymerisation verhindert wird. Z.B. verhindert das Anhängen einer Schutzgruppe an das Aminoende einer aktivierten Aminosäure, z.B. ein N-Hydroxysucciniimid-aktivierter Ester der Aminosäure, dass das Aminoende des einen Monomers während der Peptidsynthese mit dem aktivierten Esterteil eines anderen reagiert. Andererseits kann die Schutzgruppe auch an die Carboxylgruppe einer Aminosäure gebunden werden, um eine Reaktion an dieser Stelle zu verhindern. Die meisten Schutzgruppen können entweder an die Amino- oder an die Carboxylgruppe einer Aminosäure gebunden sein, wobei durch die Art der chemischen Synthese vorgeschrieben wird, für welche reaktive Gruppe eine Schutzgruppe erforderlich ist. Entsprechend verhindert das Anhängen einer Schutzgruppe an der 5'-Hydroxylgruppe eines Nukleosids während der Synthese unter Verwendung z.B. der Phosphat-Triester-Kopplungschemie, dass das 5'-Hydroxyl des einen Nukleosids mit dem 3'-aktivierten Phosphat-Triester eines anderen reagiert.
  • Ungeachtet der spezifischen Verwendung werden Schutzgruppen eingesetzt, um eine Einheit auf einem Molekül davor zu schützen, mit einem anderen Reagens zu reagieren. Schutzgruppen besitzen die folgenden Eigenschaften: Sie hindern ausgewählte Reagenzien daran, die Gruppe zu modifizieren, an die sie gebunden sind; sie sind gegenüber den Bedingungen der Synthesereaktion stabil (d.h. sie bleiben an das Molekül gebunden); sie können unter Bedingungen entfernt werden, welche die restliche Struktur nicht ungünstig beeinflussen; und wenn sie entfernt sind, reagieren sie nicht nennenswert mit der Oberfläche oder mit dem auf der Oberfläche gebundenen Polymer. Die Auswahl einer geeigneten Schutzgruppe hängt natürlich von der chemischen Natur der Monomereinheit und des Oligomers und außerdem von den spezifischen Reagenzien ab, gegen die sie schützten sollen.
  • Vorzugsweise sind die Schutzgruppen photoaktivierbar. Die Eigenschaften und Anwendungsmöglichkeiten von photoreaktiven Schutzgruppen wurden bereits zusammengestellt. Vgl. z.B. McCray et al., Ann. Rev. of Biophys. and Biophys. Chem. (1989) 18: 239-270. Vorzugsweise können die photosensitiven Schutzgruppen durch Strahlung im ultravioletten (UV) oder sichtbaren Teil des elektromagnetischen Spektrums entfernt werden. Stärker bevorzugt können die Schutzgruppen durch Strahlung im nahen UV- oder sichtbaren Teil des Spektrums entfernt werden. Jedoch kann die Aktivierung auch durch andere Verfahren erfolgen, z.B. durch ein örtlich begrenztes Erhitzen, eine Elektronenstrahl-Lithographie, durch Laserpumpen, eine Oxidation oder Reduktion mit Mikroelektroden und dergleichen. Sulfonylverbindungen sind geeignete reaktive Gruppen für eine Elektronenstrahl-Lithographie. Ein oxidatives oder reduktives Entfernen erfolgt, indem die Schutzgruppe einer elektrischen Stromquelle ausgesetzt wird, vorzugsweise unter Verwendung von Mikroelektroden, die auf vorher definierte Bereiche der Oberfläche gerichtet sind, welche aktiviert werden sollen. Auch andere Verfahren können im Sinn der vorliegenden Beschreibung eingesetzt werden.
  • Viele, jedoch nicht alle der photoentfernbaren Schutzgruppen sind aromatische Verbindungen, die in der Nähe der UV- oder sichtbaren Strahlung absorbieren. Geeignete photoentfernbare Schutzgruppen sind beschrieben, z.B. in McCray et al., Patchornik, J. Amer. Chem. Soc. (1970) 92: 6333, und Amit et al., J. Org. Chem. (1974) 39: 192.
  • Eine bevorzugte Klasse von photoentfernbaren Schutzgruppen hat die folgende allgemeine Formel:
    Figure 00310001
    in der R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido- oder Phosphidorest darstellen oder angrenzende Substituenten (d.h. R1-R2, R2-R3, R3-R4) substituierte Sauerstoffgruppen sind, die zusammen ein ringförmiges Acetat oder Ketal bilden; R5 ein Wasserstoffatom oder einen Alkoxy-, Alkyl-, Halogen-, Aryl- oder Alkenylrest darstellt, und n = 0 oder 1.
  • Eine bevorzugte Schutzgruppe, 6-Nitroveratryl (NV), die zum Schützen des Carboxylendes einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nukleotids eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R2 und R3 jeweils eine Methoxygruppe darstellen, R1, R4 und R5 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, und n = 0:
    Figure 00320001
  • Eine bevorzugte Schutzgruppe, 6-Nitroverantryloxycarbonyl (NVOC), die zum Schützen des Aminoendes einer Aminosäure eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R2 und R3 jeweils eine Methoxygruppe darstellen, R1, R4 und R5 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, und n = 1:
    Figure 00320002
  • Eine weitere bevorzugte Schutzgruppe, 6-Nitropiperonyl (NP), die zum Schützen des Carboxylendes einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nukleotids eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R2 und R3 zusammen ein Methylenacetal bilden, R1, R4 und R5 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, und n = 0:
    Figure 00320003
  • Eine weitere bevorzugte Schutzgruppe, 6-Nitropiperonyloxycarbonyl (NPOC), die zum Schützen des Aminoendes einer Aminosäure eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R2 und R3 zusammen ein Methylenacetal bilden, R1, R4 und R5 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, und n = 1:
    Figure 00320004
  • Eine am stärksten bevorzugte Schutzgruppe, Methyl-6-nitroverantryl (MeNV), die zum Schützen des Carboxylendes einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nukleotids eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R2 und R3 jeweils eine Methoxygruppe darstellen, R1 und R4 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, R5 eine Methylgruppe darstellt, und n = 0:
    Figure 00330001
  • Eine weitere am stärksten bevorzugte Schutzgruppe, Methyl-6-nitroverantryloxycarbonyl (MeNVOC), die zum Schützen des Aminoendes einer Aminosäure eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R2 und R3 jeweils eine Methoxygruppe darstellen, R1 und R4 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, R5 eine Methylgruppe darstellt, und n = 1:
    Figure 00330002
  • Eine weitere am stärksten bevorzugte Schutzgruppe, Methyl-6-nitropiperonyl (MeNP), die zum Schützen des Carboxylendes einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nukleotids eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R2 und R3 zusammen ein Methylenacetal bilden, R1 und R4 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, R5 eine Methylgruppe darstellt, und n = 0:
    Figure 00330003
  • Eine weitere am stärksten bevorzugte Schutzgruppe, Methyl-6-nitropiperonyloxycarbonyl (MeNPOC), die zum Schützen des Aminoendes einer Aminosäure oder zum Schützen der 5'-Hydroxylgruppe von Nukleosiden eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R2 und R3 zusammen ein Methylenacetal bilden, R1 und R4 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, R5 eine Methylgruppe darstellt, und n = 1:
    Figure 00330004
  • Eine geschützte Aminosäure, die am Aminoende eine photoaktivierbare Oxycarbonyl-Schutzgruppe, wie NVOC oder NPOC, oder ihre entsprechenden Methylderivate, MeNVOC bzw. MeNPOC, aufweist, wird hergestellt, indem das Amin der Aminosäure mit einem aktivierten Oxycarbonylester der Schutzgruppe acyliert wird. Beispiele von aktivierten Oxycarbonylestern von NVOC und MeNVOC haben die folgenden allgemeinen Formeln:
    Figure 00340001
    in denen X ein Halogenatom, ein gemischtes Anhydrid, eine Phenoxy-, p-Nitrophenoxy-, N-Hydroxysuccinimidgruppe und dergleichen darstellt.
  • Eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Nukleotid, die am Carboxylende der Aminosäure oder das am 5'-Hydroxylende des Nukleotids eine photoaktivierbare Schutzgruppe, wie NV oder NP, oder ihre entsprechenden Methylderivate, MeNV bzw. MeNP, aufweist, wird hergestellt, indem das Carboxylende oder die 5'-ON-Gruppe mit einem aktivierten Benzylderivat der Schutzgruppe acyliert wird. Beispiele von aktivierten Benzylderivaten von MeNV und MeNP haben die folgenden allgemeinen Formeln:
    Figure 00340002
    in denen X ein Halogenatom, eine Hydroxyl-, Tosyl-, Mesyl-, Trifluormethyl-, Diazo-, Azidogruppe und dergleichen darstellt.
  • Ein weiteres Verfahren zum Herstellen von geschützten Monomeren besteht darin, das Benzylalkoholderivat der Schutzgruppe mit einem aktivierten Ester des Monomers umzusetzen. Um z.B. das Carboxylende einer Aminosäure zu schützen, wird ein aktivierter Ester der Aminosäure mit dem Alkoholderivat der Schutzgruppe, wie 6-Nitroverantrol (NVOH), umgesetzt. Beispiele von aktivierten Estern, die für eine solche Verwendung geeignet sind, umfassen Halogenformiat, gemischtes Anhydrid, Imidazolformiat, Acylhalogenid, und sie umfassen außerdem die in sifu-Bildung eines aktivierten Esters und die Verwendung herkömmlicher Reagenzien, wie DCC und dergleichen. Vgl. Atherton et al., hier finden sich weitere Beispiele von aktivierten Estern.
  • Ein weiteres Verfahren zum Erzeugen von geschützten Monomeren besteht darin, das Benzylalkoholderivat der Schutzgruppe mit einem aktivierten Kohlenstoffatom des Monomers umzusetzen. Um z.B. die 5'-Hydroxylgruppe einer Nukleinsäure zu schützen, wird ein Derivat, das ein 5'-aktiviertes Kohlenstoffatom aufweist, mit dem Alkoholderivat der Schutzgruppe, wie Methyl-6-nitropiperonol (MePyROH), umgesetzt. Beispiele von Nukleotiden, die Aktivierungsgruppen aufweisen, die an die 5'-Hydroxylgruppe gebunden sind, haben die folgende allgemeine Formel:
    Figure 00350001
    in der Y ein Halogenatom, eine Tosyl-, Mesyl-, Trifluormethyl-, Azido oder Diazogruppe und dergleichen darstellt.
  • Eine weitere Klasse von bevorzugten photochemischen Schutzgruppen hat die
    Figure 00350002
    in der R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Car boxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfanat-, Sulfido- oder Phosphidorest darstellen, R4 und R5 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Alkoxy-, Alkyl-, Halogen-, Aryl- oder Alkenylrest darstellen, und n = 0 oder 1.
  • Eine bevorzugte Schutzgruppe, 1-Pyrenylmethyloxycarbonyl (PyROC), die zum Schützen des Aminoendes einer Aminosäure eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R1 bis R5 jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, und n = 1:
    Figure 00350003
  • Eine weitere bevorzugte Schutzgruppe, 1-Pyrenylmethyl (PyR), die zum Schützen des Carboxylendes einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nukleotids eingesetzt wird, wird z.B. erzeugt, wenn R1 bis R5 jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, und n = 0:
    Figure 00360001
  • Eine Aminosäure, die an ihrem Aminoende eine Pyrenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe aufweist, wird hergestellt, indem das freie Amin der Aminosäure mit einem aktivierten Oxycarbonylester der Pyrenyl-Schutzgruppe acyliert wird. Beispiele von aktivierten Oxycarbonylestern von PyROC haben die folgende allgemeine Formel:
    Figure 00360002
    in der X ein Halogenatom oder eine gemischte Anhydrid-, p-Nitrophenoxy- oder N-Hydroxysuccinimidgruppe und dergleichen darstellt.
  • Eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Nukleotid, die/das eine photoaktivierbare Schutzgruppe, wie PyR, am Carboxylende der Aminosäure bzw. am 5'-Hydroxylende der Nukleinsäure aufweist, wird hergestellt, indem das Carboxylende oder die 5'-OH-Gruppe mit einem aktivierten Pyrenylmethylderivat der Schutzgruppe acyliert wird. Beispiele von aktivierten Pyrenylmethylderivaten von PyROC haben die folgende
    Figure 00360003
    in der X ein Halogenatom, eine Hydroxyl-, Diazo- oder Azidogruppe und dergleichen darstellt.
  • Ein weiteres Verfahren zum Erzeugen von geschützten Monomeren besteht darin, die Pyrenylmethylalkoholeinheit der Schutzgruppe mit einem aktivierten Ester des Monomers umzusetzen. Z.B. kann ein aktivierter Ester einer Aminosäure mit dem Alkoholderivat der Schutzgruppe, wie Pyrenylmethylalkohol (PyROH), umgesetzt werden, um das geschützte Derivat des Carboxylendes der Aminosäure herzustellen. Beispiele von aktivierten Estern umfassen Halogenformiat, gemischtes Anhydrid, Imidazoylformiat, Acylhalogenid, und sie umfassen außerdem die in situ-Bildung des aktivierten Esters und die Verwendung herkömmlicher Reagenzien, wie DCC und dergleichen.
  • Natürlich sind zahlreiche photosensitive Schutzgruppen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
  • Vorzugsweise wird das Substrat angestrahlt, wodurch die photoentfernbaren Schutzgruppen entfernen werden und dadurch die Bereiche, die freie reaktive Einheiten aufweisen, und die aus der Schutzgruppe resultierenden Nebenprodukte erzeugt werden. Die Rate beim Entfernen der Schutzgruppen hängt ab von der Wellenlänge und der Intensität der angewendeten Strahlung und außerdem von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Schutzgruppe selbst. Bevorzugte Schutzgruppen werden mit einer schnelleren Rate und mit einer geringeren Strahlungsintensität entfernt. Z.B. werden MeNVOC und MeNPOC bei bestimmten Bedingungen vom N-Terminus einer Peptidkette schneller photolytisch entfernt als ihre unsubstituierten elterlichen Verbindungen NVOC bzw. NPOC.
  • Das Entfernen der Schutzgruppe wird durch Bestrahlen erreicht, wobei die reaktive Gruppe und die aus der Schutzgruppe stammenden Abbauprodukte getrennt werden. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass beim Bestrahlen eines NVOC- und eines MeNVOC-geschützten Oligomers die folgenden Reaktionsschemata ablaufen: NVOC-AA → 3,4-Dimethoxy-6-nitrosobenzaldehyd + CO2 + AA MeNVOC-AA → 3,4-Dimethoxy-6-nitrosoacetophenon + CO2 + AA wobei AA den N-Terminus des Aminosäure-Oligomers darstellt.
  • Zusammen mit der ungeschützten Aminosäure werden noch andere Produkte in die Lösung freigesetzt: Kohlendioxid und eine 2,3-Dimethoxy-6-nitrosophenylcarbonyl-Verbindung, die mit nukleophilen Teilen des Oligomers reagieren kann, wodurch unerwünschte Sekundärreaktionen zustande kommen. Im . Fall einer NVOC-geschützten Aminosäure ist das Abbauprodukt ein Nitrosobenzaldehyd, während das Abbauprodukt im anderen Fall ein Nitrosophenylketon ist. Z.B. wird angenommen, dass das bei der Spaltung von NVOC entstandene Aldehyd mit freien Aminen reagiert, wodurch eine Schiff-Base (Imin) entsteht, welche die restliche Polymersynthese stört. Bevorzugte photoentfernbare Schutzgruppen reagieren mit dem Oligomer auf dem Träger nur langsam oder reversibel.
  • Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass das bei der Bestrahlung eines MeNVOC-geschützten Oligomers entstandene Keton mit den Nukleophilen auf dem Oligomer mit einer langsameren Rate reagiert als die bei der Bestrahlung des gleichen NVOC-geschützten Oligomers entstandenen Aldehy de. Obwohl es nicht eindeutig bestimmt wurde, wird angenommen, dass dieser Unterschied in der Reaktionsgeschwindigkeit auf dem Unterschied in der allgemeinen Reaktivität zwischen Aldehyden und Ketonen gegenüber Nukleophilen beruht, der auf sterische und elektronische Effekte zurückzuführen ist.
  • Die photoentfernbaren Schutzgruppen können einfach entfernt werden. Z.B. wurde die Photolyse eines N-geschützten L-Phenylalanins in Lösung analysiert, das unterschiedliche photoentfernbare Schutzgruppen aufwies, wobei die Ergebnisse in der nachfolgenden Tabelle dargestellt sind: Tabelle Photolyse des geschützten L-Phe-ON
    Figure 00380001
  • Die Halbwertszeit t½ ist die Zeit in Sekunden, die erforderlich ist, um 50 % der am Anfang vorliegenden Menge der Schutzgruppe zu entfernen. NBOC ist die 6-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe, NVOC ist die 6-Nitroveratryloxycarbonylgruppe, MeNOVC ist die Methyl-6-nitroveratryloxycarbonylgruppe und MeNPOC ist die Methyl-6-nitropiperonyloxycarbonylgruppe. Die Photolyse wurde in dem angegebenen Lösungsmittel durchgeführt, indem eine Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 362/364 nm bei einer Intensität von 10 mW/cm2 erfolgte, und wobei die Konzentration des jeweiligen geschützten Phenylalanin 0,10 mM war.
  • Die Tabelle zeigt, dass das Entfernen der Schutzgruppen aus dem NVOC-, MeNVOC- und MeNPOC-geschützten Phenylalanin schneller ablief als das Entfernen der Schutzgruppe NBOC. Außerdem zeigt sie, dass das photolytische Entfernen der Schutzgruppen bei den zwei Derivaten, die am Benzylkohlenstoffatom substituiert sind, MeNVOC und MeNPOC, sowohl in Dioxan als auch in angesäuertem Dioxan am schnellsten erfolgte.
  • 1. Verwendung von photoentfernbaren Gruppen während einer Festphasensynthese von Peptiden
  • Wenn Peptide auf einem Festphasenträger hergestellt werden, wird jeweils eine Aminosäure an eine Substrat-gebundene wachsende Kette schrittweise angehängt. Um eine unerwünschte Polymerisation der monomeren Aminosäure unter den Reaktionsbedingungen zu vermeiden, muss das Aminoende der Aminosäure geschützt werden. Nachdem das Monomer mit dem Ende des Peptids verknüpft wurde, wird die N-terminale Schutzgruppe entfernt und sodann eine weitere Aminosäure an die Kette ge bunden. Dieser Zyklus aus Koppeln und Schutzgruppen-Entfernen wird für jede, in der Peptidsequenz vorliegende Aminosäure fortgesetzt. Vgl. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85: 2149, und Atherton et al., „Solid Phase Peptide Synthesis", 1989, IRL Press, London. Wie vorstehend beschrieben macht es die Verwendung einer photoentfernbaren Schutzgruppe möglich, dass beim Entfernen der Schutzgruppen während des Zyklus der Festphasensynthese die Entfernung an ausgewählten Teilen der Substratoberfläche anhand einer Bestrahlung mit einem bestimmten Muster erfolgt. Hierdurch kann die Synthese selektiv räumlich gesteuert werden, d.h. die nächste Aminosäure wird nur an den bestrahlten Bereichen gebunden.
  • Die photoentfernbaren Schutzgruppen können an einen aktivierten Ester einer Aminosäuren am Aminoende gebunden werden:
    Figure 00390001
    wobei R die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellt, X eine photoentfernbare Schutzgruppe bedeutet und Y ein aktiviertes Carbonsäurederivat darstellt. Die photoentfernbare Schutzgruppe X ist vorzugsweise NVOC, NPOC, PyROC, MeNVOC, MeNPOC und dergleichen, wie vorstehend angegeben. Der aktivierte Ester Y ist vorzugsweise ein reaktives Derivat, das eine hohe Kopplungseffizienz aufweist, wie ein Acylhalogenid, gemischtes Anhydrid, N-Hydroxysuccinimidester, Perfluorphenylester oder eine Urethan-geschützte Säure und dergleichen. Andere aktivierte Ester und die Reaktionsbedingungen sind bekannt (vgl. Atherton et al.).
  • 2. Verwendung von photoentfernbaren Gruppen während der Festphasensynthese von Oligonukleotiden
  • Wenn Oligonukleotide auf einem Festphasenträger hergestellt werden, wird jeweils ein Nukleotid an ein Substrat-gebundenes wachsendes Oligomer schrittweise angehängt. Um eine unerwünschte Polymerisation des monomeren Nukleotids unter den Reaktionsbedingungen zu vermeiden, muss die 5'Hydroxylgruppe des Nukleotids geschützt werden. Nachdem das Monomer mit dem Ende des Oligomers verknüpft wurde, wird die 5'Hydroxyl-Schutzgruppe entfernt und sodann ein weiteres Nukleotid an die Kette gekoppelt. Dieser Zyklus aus Koppeln und Schutzgruppen-Entfernen wird für jedes, in der Oligomersequenz vorliegende Nukleotid fortgesetzt. Vgl. Gait „Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", 1984, IRL Press, London. Wie vorstehend beschrieben macht es die Verwendung einer photoentfernbaren Schutzgruppe möglich, dass beim Entfernen der Schutzgruppen während des Zyklus der Festphasensynthese die Entfernung an ausgewählten Teilen der Substratoberfläche anhand einer Bestrahlung mit einem bestimmten Muster erfolgt. Hierdurch kann die Synthese selektiv räum lich gesteuert werden, d.h. das nächste Nukleotid wird nur an den bestrahlten Bereichen gebunden.
  • Die Oligonukleotidsynthese umfasst im Allgemeinen das Koppeln eines aktivierten Phosphorderivats an der 3'-Hydroxylgruppe eines Nukleotids mit der 5'-Hydroxylgruppe eines Oligomers, das an einen festen Träger gebunden ist. Es gibt zwei wichtige chemische Verfahren, um diese Kopplung durchzuführen: das Phosphat-Triester-Verfahren und das Phosphoramidit-Verfahren (vgl. Gait). Die Schutzgruppen der vorliegenden Erfindung können in beiden Verfahren eingesetzt werden.
  • Eine photoentfernbare Schutzgruppe kann an ein aktiviertes Nukleotid an der 5'-Hydroxylgruppe gebunden werden:
    Figure 00400001
    wobei B die Base ist, die an dem Zuckerring gebunden ist; R ein Wasserstoffatom darstellt, wenn der Zucker Desoxyribose ist, oder R eine Hydroxylgruppe darstellt, wenn der Zucker Ribose ist; P eine aktivierte Phosphorgruppe darstellt; und X eine photoentfernbare Schutzgruppe bedeutet. Die photoentfernbare Schutzgruppe X ist vorzugsweise NV, NP, PyR, MeNV, MeNP, NVOC, NPOC, PyROC, MeNVOC, MeNPOC und dergleichen, wie vorstehend angegeben. Die aktivierte Phosphorgruppe P ist vorzugsweise ein reaktives Derivat, das eine hohe Kopplungseffizienz aufweist, wie ein Phosphat-Triester, Phospharamidit oder dergleichen. Andere aktivierte Phosphorderivate und die Reaktionsbedingungen sind bekannt (vgl. Gait).
  • E. Aminosäure N-Carboxyanhydride die mit einer photoentfernbaren Gruppe geschützt sind
  • Während der Merrifield-Peptidsynthese wird ein aktivierter Ester von einer bestimmten Aminosäure mit dem freien Aminoende eines Substrat-gebundenen Oligomers gekoppelt. Aktivierte Ester von Aminosäuren, die für die Festphasensynthese geeignet sind, umfassen Halogenformiat, gemischtes Anhydrid, Imidazolformiat, Acylhalogenid, und sie umfassen außerdem die in situ-Bildung des aktivierten Esters und die Verwendung herkömmlicher Reagenzien, wie DCC und dergleichen (vgl. Atherton et al.). Eine bevorzugte geschützte und aktivierte Aminosäure hat die folgende allgemeine Formel:
    Figure 00400002
    in der R die Seitenkette der Aminosäure bedeutet und X eine photoentfernbare Schutzgruppe darstellt. Diese Verbindung ist eine Urethan-geschützte Aminosäure mit einer photoentfernbaren Schutzgruppe, die am Amin gebunden ist. Eine stärker bevorzugte aktivierte Aminosäure wird hergestellt, wenn die photoentfernbare Schutzgruppe die folgende allgemeine Formel hat:
    Figure 00410001
    in der R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido- oder Phosphidorest darstellen oder angrenzende Substituenten (d.h. R1-R2, R2-R3, R3-R4) substituierte Sauerstoffgruppen sind, die zusammen ein ringförmiges Acetal oder Ketal bilden; und R5 ein Wasserstoffatom oder einen Alkoxy-, Alkyl-, Halogen-, Aryl- oder Alkenylrest darstellt.
  • Eine bevorzugte aktivierte Aminosäure wird hergestellt, wenn die photoentfernbare Schutzgruppe 6-Nitroveratryloxycarbonyl ist. D.h. R1 und R4 sind jeweils ein Wasserstoffatom, R2 und R3 stellen jeweils eine Methoxygruppe dar, und R5 bedeutet ein Wasserstoffatom. Eine weitere bevorzugte aktivierte Aminosäure wird hergestellt, wenn die photoentfernbare Gruppe 6-Nitropiperonyl ist: R1 und R4 sind jeweils ein Wasserstoffatom, R2 und R3 bilden zusammen ein Methylenacetal, und R5 bedeutet ein Wasserstoffatom. Auch andere Schutzgruppen sind möglich. Ein weiterer bevorzugter Ester wird gebildet, wenn die photoentfernbare Gruppe Methyl-6-nitroveratryl oder Methyl-6-nitropiperonyl ist.
  • Eine weitere aktivierte Aminosäure wird hergestellt, wenn die photoentfernbare Schutzgruppe die folgende allgemeine Formel hat:
    Figure 00410002
    in der R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfanat-, Sulfido- oder Phosphidorest darstellen, und R4 und R5 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Alkoxy-, Alkyl-, Halogen-, Aryl- oder Alkenylrest darstellen. Die resultierende Verbindung ist eine Urethangeschützte Aminosäure, die eine Pyrenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe aufweist, die am Amin gebunden ist. Eine stärker bevorzugte Ausführungsform wird hergestellt, wenn R1 bis R5 jeweils ein Wasserstoffatom darstellen.
  • Die Urethan-geschützten Aminosäuren, die eine photoentfernbare Schutzgruppe der vorliegenden Erfindung aufweisen, werden durch Kondensation einer N-geschützten Aminosäure mit einem Acylierungsmittel, wie einem Acylhalogenid, Anhydrid, Chlorformiat und dergleichen hergestellt (vgl. Fuller et al., US Patent Nr. 4 946 942; und Fuller et al., J. Amer. Chem. Soc. (1990) 112: 7414-7416.
  • Urethan-geschützte Aminosäuren, die photoentfernbare Schutzgruppen aufweisen, sind im allgemeinen als Reagenzien für eine Festphasensynthese geeignet, und aufgrund der räumlichen Selektivität, die mit den photoentfernbaren Schutzgruppen möglich ist, sind sie besonders gut für die räumlich-ansprechende Peptidsynthese geeignet. Diese Aminosäuren weisen zwei Funktionen auf: Erstens dient die Urethangruppe dazu, das Carboxylende für die Umsetzung mit dem an der Oberfläche gebundenen Amin zu aktivieren, und außerdem, sobald die Peptidbindung gebildet ist, schützt die photoentfernbare Schutzgruppe das neu gebildete Aminoende vor einer weiteren Umsetzung. Diese Aminosäuren sind auch sehr reaktionsfähig gegenüber Nukleophilen, z.B. Aminen, auf der Oberfläche des festen Trägers, bei denen die Schutzgruppen entfernt wurden, und aufgrund dieser hohen Reaktivität sind die Kopplungszeiten bei den Festphasenpeptiden signifikant kürzer, und die Ausbeuten sind typischerweise höher.
  • IV. Datenerfassung
  • A. Datenerfassungssystem
  • Substrate, die gemäß der vorstehenden Beschreibung hergestellt wurden, können eingesetzt werden, um zu bestimmen, welche Sequenz aus der großen Anzahl der darauf vorliegenden Sequenzen an einen Rezeptor von Interesse bindet. 10 erläutert eine Ausführungsform einer Vorrichtung, die eingesetzt wurde, um diejenigen Bereiche eines Substrats nachzuweisen, die fluoreszierende Marker enthalten. Diese Vorrichtung könnte z.B. verwendet werden, um das Vorliegen oder die Abwesenheit eines fluoreszierend markierten Rezeptors nachzuweisen, z.B. eines Antikörpers, der an ein synthetisiertes Polymer auf einem Substrat gebunden hat.
  • Das Licht wird aus einer Lichtquelle 1002 auf das Substrat gerichtet, z.B. aus einer Laser-Lichtquelle eines Typs, der dem Fachmann bekannt ist, etwa Modell Nr. 2025 von Spectra Physics. Das Licht wird aus der Quelle durch eine Linse 1004 gelenkt, wobei es sich vorzugsweise um eine zylindrische Linse eines Typs handelt, der dem Fachmann bekannt ist. Aus der Linse 1004 wird ein Linearstrahl abgegeben und kein Lichtpunkt. Somit können die Daten anhand einer linearen Pixel-Anordnung im Wesentlichen gleichzeitig nachgewiesen werden, und sie müssen nicht auf der Basis von Pixel zu Pixel ermittelt werden. Es ist so zu verstehen, dass hier zwar zur Erläuterung einer bestimmten Technik eine zylindrische Linse verwendet wird, um einen linearen Lichtstrahl auf einer Oberfläche zu erzeugen, dass jedoch auch andere Techniken eingesetzt werden können.
  • Der aus der zylindrischen Linse stammende Lichtstrahl wird durch einen dichroitischen Spiegel oder Prisma gelenkt und auf die Oberfläche des auf geeignete Weise hergestellten Substrats 1008 gerichtet. Das Substrat 1008 wird auf einer x-y-Translationshalterung 1009 angebracht, z.B. auf dem Modell Nr. PM500-8, hergestellt von Newport. Bestimmte Positionen auf dem Substrat fluoreszieren, und die Fluoreszenz wird entlang des Strahlengangs, der mit gestrichelten Linien gekennzeichnet ist, zurück durch den dichroitischen Spiegel gelenkt und mit einer geeigneten Linse 1010, z.B. einer f/1.4-Kameralinse, über eine Fokussierungslinse 1014 mit variabler f auf einen Lineardetektor 1012 fokussiert. Die Verwendung eines linearen Lichtstrahls macht es möglich, dass die Daten entlang einer Linie von Pixel (z.B. etwa 1 cm) auf dem Substrat und nicht aus einzelnen Punkten auf dem Substrat erzeugt werden. In anderen Ausführungsformen wird das Licht auf eine zweidimensionale Fläche des Substrats gelenkt, und die Fluoreszenz wird durch eine zweidimensionale CCD-Anordnung nachgewiesen. Der lineare Nachweis ist bevorzugt, da hiermit wesentlich höhere Leistungsdichten erhalten werden können.
  • Der Detektor 1012 weist die Stärke der Fluoreszenz, die aus dem Substrat emittiert wird, als eine Funktion der Position nach. Der Detektor kann eine lineare CCD-Anordnung eines Typs sein, der dem Fachmann im Allgemeinen bekannt ist. Die x-y-Translationshalterung, die Lichtquelle und der Detektor 1012 sind alle mit einem Computer 1016, z.B. einem IBM PC-AT oder einem gleichwertigen Gerät, betriebsbereit verbunden, wodurch sich die Vorrichtung und die Erfassung der Daten aus der CCD-Anordnung steuern lassen.
  • Während des Programmablaufs wird das Substrat durch die Translationshalterung entsprechend positioniert. Danach wird die Lichtquelle angeschaltet und die Daten der Fluoreszenzintensität mit dem Computer über den Detektor erfasst.
  • Andererseits können das Substrat und die x/y-Translationsvorrichtung auch unter ein Mikroskop gestellt werden, das ein oder mehrere Objektive umfasst. Das Licht (etwa 488 nm) aus einem Laser, wobei es sich in einigen Ausführungsformen um den Argonionen-Laser, Modell Nr. 2020-05, hergestellt von Spectraphysics, handelt, wird durch einen dichroitischen Spiegel auf das Substrat gelenkt, wobei der Spiegel Licht mit über etwa 520 nm passieren lässt, jedoch Licht mit 488 nm reflektiert. Der dichroitische Spiegel kann z.B. das Modell Nr. FT510 sein, hergestellt von Carl Zeiss. Das Licht, das durch den Spiegel reflektiert wird, tritt sodann in das Mikroskop ein, das z.B. das Modell Axioscop Nr. 20, hergestellt von Carl Zeiss, sein kann. Die mit Fluoreszein markierten Stoffe auf dem Substrat fluoreszieren das Licht mit > 488 nm, und das fluoreszierte Licht wird durch das Mikroskop gesammelt und durch den Spiegel gelenkt. Danach wird das fluoreszierende Licht aus dem Substrat durch ein Wellenlängen-Filter und anschließend durch eine Lochblende gelenkt. Das Wellenlängen-Filter kann z.B. das Modell Nr. OG 530, hergestellt von Malles Griot, sein, und die Lochblende kann z.B. das Modell Nr. 477352/477 380, hergestellt von Carl Zeiss, sein.
  • Danach tritt das fluoreszierte Licht in eine Photonenvervielfacherrohre ein, wobei es sich um das Modell Nr. R 943-02, hergestellt von Hamamatsu, handeln kann, das Signal wird in einem Vorverstärker verstärkt, und die Photonen werden durch einen Photonenzähler gezählt. Die Zahl der Photonen wird sodann in dem Computer als Funktion der Position aufgezeichnet. Der Vorverstärker kann z.B. das Modell Nr. SR440, hergestellt von Stanford Research Systems, sein, und der Photonenzähler kann das Modell Nr. SR400, hergestellt von Stanford Research Systems, sein. Anschließend wird das Substrat zur nächsten Position bewegt, und der Prozess wird wiederholt. Vorzugsweise werden die Daten alle 1 bis 100 um mit einem bevorzugten Datenerfassungs-Durchmesser von etwa 0,8 bis 10 um aufgenommen. Bei einer ausreichend hohen Fluoreszenz kann ein CCD-Detektor mit Breitfeld-Anstrahlung eingesetzt werden.
  • In 11 wird die Architektur des Datenerfassungssystems noch genauer erläutert. Der Arbeitsablauf des Systems wird durch das Photonenzählprogramm 1102 gesteuert. Der Anwender gibt die Abmessungen der Aufzeichnung, die Zahl der Pixel oder der Datenpunkte in einem Bereich und die Aufzeichungsgeschwindigkeit in das Zählprogramm ein. Das Programm (das z.B. auf einem IBM PC-kompatiblen Computer läuft) wird über eine GPIB-Bus-Schnittstelle 1104 mit einem Mehrkanal-Skalierer 1106, z.B. Modell SR 430 von Stanford Research, und einer Steuerung der x-y-Halterung 1108, z.B. Modell PM 500 von Newport, verbunden. Das Signal aus dem Licht, das aus dem fluoreszierenden Substrat stammt, tritt in einen Photonenvervielfacher 1110 ein, dessen Ausgang an den Skalierer 1106 weitergeleitet wird. Die aus dem Skalierer gelieferten Daten geben die Zahl der Impulse in einem bestimmten Bereich an. Nach dem Abtasten eines ausgewählten Bereichs wird die Steuerung der Halterung mit Beschleunigungs- oder Geschwindigkeitskommandos aktiviert, die ihrerseits die Abtasthalterung 1112, z.B. das Modell PM500-A von Newport, zu einem anderen Bereich hinsteuert.
  • Die Daten werden in einer Bilddatei 1114 erfasst und in einem Skalierungs-Programm 1116 verarbeitet. Ein skaliertes Bild wird sodann zur Anzeige weitergegeben, z.B. auf einem VGA-Bildschirm 1118. Anschließend wird das Bild basierend auf einer Eingabe oder einem Prozentsatz an Pixeln ausgeschnitten und aufgrund der minimalen und maximalen Pixelwerte, die betrachtet werden sollen, skaliert. Das System gibt in den Rohdaten die minimalen und die maximalen Pixelwerte mit aus.
  • B. Analyse der Daten
  • sAus dem Datenerfassungssystem wird eine Anordnung von Daten ausgegeben, welche die Fluoreszenzintensität, bezogen auf die Position auf dem Substrat, angibt. Die Daten werden typischerweise in Bereichen aufgenommen, die im Wesentlichen kleiner sind als die Fläche, in der die Synthese eines bestimmten Polymers erfolgt ist. Bloß als Beispiel soll Folgendes dienen, wenn Polymere in Quadraten auf dem Substrat synthetisiert wurden, die Abmessungen von 500 μm × 500 μm aufweisen, können die Daten in Bereichen mit Abmessungen von 5 μm × 5 μm übernommen werden. Am stärksten bevorzugt sind die Bereiche, in denen die Fluoreszenzdaten, die von dem Substrat aufgenommen wurden, weniger als etwa ½ der Fläche der Bereiche ausma- chen, in denen die einzelnen Polymere synthetisiert wurden, vorzugsweise weniger als etwa 1/10 der Fläche, in der ein einzelnes Polymer synthetisiert wurde, und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 1/100 der Fläche, in der ein einzelnes Polymer synthetisiert wurde. Somit wird innerhalb jeder beliebigen Fläche, in der ein bestimmtes Polymer synthetisiert wurde, eine große Zahl von Flureszenzdatenpunkten erfasst.
  • Eine Darstellung der Anzahl von Pixel über der Fluoreszenzintensität wird bei der Aufzeichnung einer Zelle, die z.B. einem markierten Antikörper ausgesetzt wurde, typischerweise die Form einer Glockenkurve annehmen, jedoch lassen sich Störspitzen (Ausreißer) feststellen, und zwar besonders bei höheren Intensitäten. Da es wünschenswert ist, beim Bestimmen der relativen Bindungsaffinität in einem bestimmten Synthesebereich eine durchschnittliche Fluoreszenzintensität zu verwenden, kann es sein, dass diese Störspitzen die Werte verfälschen.
  • Demgemäß können die Werte korrigiert werden, indem diese Störspitzen entfernt werden, und danach wird die relative Bindungseffizienz anhand eines Durchschnitts der Datenpunkte bestimmt.
  • 12 erläutert ein Beispiel eines Systems zum Entfernen von Störspitzen aus einem Satz von Fluoreszenzdaten, z.B. Daten, die in Affinitätsscreeningstudien verwendet werden. Ein Anwender oder das System gibt in Schritt 1302 Daten ein, die sich auf das Positionieren des Chips und die Ecken der Zelle beziehen. Aus diesen Informationen und der Bilddatei erzeugt das System in Schritt 1304 eine Computerdarstellung eines Histogramms, wobei das Histogramm (mindestens in Form einer Computerdatei) die Zahl der Datenpixel gegen die Intensität aufträgt.
  • Für jede Zelle wird sodann in einer Hauptschleife die Datenanalyse durchgeführt. Für jede Zelle berechnet das System in Schritt 1306 die gesamte Fluoreszenzintensität oder die Zahl der Pixel für die Bandbreite, zentriert um verschiedene Intensitätsstufen herum. Wie z.B. in dem Diagramm rechts von Schritt 1306 zu sehen ist, berechnet das System die Zahl der Pixel innerhalb eines Bandes mit der Breite w. Danach „bewegt" das System diese Bandbreite zu einer höheren Mittel-Intensität, berechnet wiederum die Zahl der Pixel innerhalb der Bandbreite. Dieser Vorgang wird so lange wiederholt, bis der gesamte Bereich von Intensitäten abgearbeitet wurde, und in Schritt 1308 bestimmt das System, welches Band die höchste Gesamtzahl von Pixel aufweist. Die Daten innerhalb dieser Bandbreite werden sodann für die weitere Analyse eingesetzt. Wenn man davon ausgeht, dass die Bandbreite so ausgewählt wird, dass sie entsprechend klein ist, dann hat dieses Verfahren den Effekt, dass Störspitzen eliminiert werden, die bei höheren Intensitäten auftreten. Falls alle Zellen untersucht wurden, verlässt das System Schritt 1310, ansonsten wiederholt es die Untersuchung für die nächste Zelle.
  • Im Schritt 1312 integriert das System sodann die Daten innerhalb der Bandbreite für jede der ausgewählten Zellen, sortiert die Daten in Schritt 1314 unter Verwendung der Datei des Syntheseverfahrens und zeigt dem Anwender die Daten z.B. auf einem Bildschirm oder einem Drucker an.
  • V. Repräsentative Anwendungen
  • A. Oligonukleotidsynthese
  • Die Allgemeingültigkeit einer lichtgesteuerten räumlich-ansprechbaren parallelen chemischen Synthese wird demonstriert, indem sie auf die Nukleinsäuresynthese angewendet wird.
  • 1. Beispiel
  • Eine lichtaktivierte Bildung eines Tymidin-Cytidin-Dimers wurde durchgeführt. Eine dreidimensionale Darstellung einer Fluoreszenzaufzeichnung wurde erstellt, die ein Schachbrettmuster von 7 Quadraten mal 4 Quadraten zeigt, welches durch die lichtgesteuerte Synthese eines Dinukleotids erzeugt wurde. 5'Nitroveratrylthymidin wurde über die 3'-Hydroxylgruppe an ein Synthesesubstrat gebunden. Die Nitroveratryl-Schutzgruppen wurden durch Anstrahlen durch eine 500-μm-Schachbrettmaske entfernt. Danach wurde das Substrat mit Phosphoramidit-aktiviertem 2-Desoxycytidin versetzt. Um die Reaktion fluorometrisch verfolgen zu können, war das Desoxycytidin mit einem FMOC-geschützten Aminohexyl-Linker modifiziert worden, der an dem exozyklische Amin gebunden war (5'-O-Dimethoxytrityl-4-N-(6-N-fluorenylmethylcarbamoylhexylcarboxy)-2'-desoxycytidin). Nach Entfernen der FMOC-Schutzgruppe mit einer Base, wurden die Bereiche, die das Dinukleotid enthielten, durch eine einstündige Behandlung des Substrats mit 1 mM FITC in DMF fluoreszierend markiert.
  • Die dreidimensionale Darstellung der Fluoreszenzintensitätsdaten, die abwechselnde Quadrate mit hellen hervorgehobenen Pixel zeigt, reproduziert das schachbrettförmige Anstrahlungsmuster, das während der Photolyse des Substrats verwendet wurde. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass auch Oligonukleotide wie Peptide durch das lichtgesteuerte Verfahren synthetisiert werden können.
  • In einem anderen Beispiel wurde die lichtaktivierte Bildung von Thymidin-Cytidin-Cytidin wie in 13 dargestellt durchgeführt. Hier wurde wie in dem vorherigen Beispiel 5'-Nitroveratrylthymidin an das Substrat mittels des Phosphoramidit-Verfahrens an eine Oberfläche gebunden, die [Bis(2-hydroxyethyl)-3-aminopropylsiloxan] enthielt. Danach wurde der Objektträger zehn Minuten in Gegenwart von Dioxan gleichmäßig angestrahlt (362 nm, bei 14 mW/cm2). Nach dem Trocknen wurde die Oberfläche mit N,4-Dimethoxytrityl-5'nitroveratryl-2'-desoxcytidin-3'-O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit in Gegenwart von Tetrazol behandelt (herkömmliches Verfahren der Phosphoramidit-Kopplung). Nach dem Oxidieren und Trocknen wurde die Platte erneut wie vorher angestrahlt, mit der Ausnahme, dass eine 500-μm-Schachbrettmaske zwischen die Lichtquelle und den Objektträger gestellt wurde. Die Oberfläche wurde sodann dem 5'-O-(4,4'-Dimethoxy)-N-4-(6-((biotinoyl)amino)hexanoyl)amino)hexanoyl-aminohexyl)-5-methyl-2'-desoxycytidin-3'-O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit mit Tetrazol ausgesetzt. Nach dem Oxidieren und Trocknen wurden die Bereiche, die das Trinukleotid enthielten, durch die Behandlung mit FITC-markiertem Streptavidin fluoreszierend markiert. Die daraus resultierende Darstellung der Fluoreszenzintensitätsdaten zeigte abwechselnde helle und dunkel Quadrate, die dem 500-μm-Schachbrettmuster der Anstrahlung entsprachen, das während der Photolyse eingesetzt wurde.
  • VI. Schlussfolgerung
  • Die vorliegenden Erfindungen stellen eine neue Vorgehensweise zum gleichzeitigen Synthetisieren einer großen Zahl von Verbindungen bereit. Das Verfahren kann immer dann angewendet werden, wenn man chemische Bindungsblöcke hat, die in einem Festphasenformat gekoppelt werden können, und wenn Licht eingesetzt werden kann, um eine reaktive Grippe zu erzeugen.
  • Die vorstehende Beschreibung dient lediglich der Erläuterung und soll die Erfindung in keiner Weise einschränken. Für den Fachmann werden beim Durcharbeiten der vorliegenden Beschreibung viele Variationen der Erfindung ersichtlich. Die Erfindung wird hauptsächlich hinsichtlich der Peptid- und Nukleotidsynthese erläutert, dies soll jedoch lediglich als. Beispiel dienen und die Erfindung in keiner Weise hierauf beschränken. Der Umfang der Erfindung wird somit nicht durch die vorstehende Beschreibung, sondern vielmehr anhand der beiliegenden Patentansprüche bestimmt.

Claims (23)

  1. Verwendung eines Monomers, das eine durch einen Aktivator entfernbare Schutzgruppe aufweist, in einem geordneten Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von Polymersequenzen durch das fortlaufende Zufügen von Reagenzien, umfassend den Schritt zum seriellen Schützen und Schutzgruppen-Entfernen von Teilen der großen Anzahl von, Polymersequenzen für das Zufügen anderer Teile der Polymersequenzen unter Verwendung einer binären Synthesestrategie, wobei entweder: a) die binäre Synthesestrategie eine binäre Maskierungsstrategie ist und wobei die Maskierungsstrategie mindestens zwei aufeinander folgende Schritte bereitstellt, in denen eine Maske eine frühere Maske ablöst, indem ein Teil eines vorher angestrahlten Teils vor Licht geschützt wird und ein Teil eines vorher geschützten Teils dem Licht ausgesetzt wird; oder b) die binäre Synthesestrategie eine binäre Maskierungsstrategie ist und wobei die Masken in einer Gray-Code-Maskierungsstrategie angeordnet sind, wobei die Gray-Code-Maskierungsstrategie auf jeder von einer großen Anzahl von Synthesevorrichtungen eine Randausleuchtung aufweist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Schutzgruppe photolabil ist, vorzugsweise wobei das Monomer ein natürliches oder nicht-natürliches Ribonukleosid oder Desoxyribonukleosid ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das geordnete Verfahren den Schritt zum Erzeugen eines Teils des Polymers mit einer nicht-binären Markierungsstrategie umfasst.
  4. Geordnetes Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von Polymersequenzen durch fortlaufendes Zufügen von Reagenzien, umfassend den Schritt zum seriellen Schützen und Schutzgruppen-Entfernen von Teilen der großen Anzahl von Polymersequenzen für das Zufügen anderer Teile der Polymersequenzen unter Verwendung einer binären Synthesestrategie, wobei die binäre Synthesestrategie eine binäre Maskierungsstrategie ist und wobei entweder: a) die binäre Maskierungsstrategie mindestens zwei aufeinander folgende Schritte bereitstellt, in denen eine Maske eine frühere Maske ablöst, indem ein Teil eines vorher angestrahlten Teils vor Licht geschützt wird und ein Teil eines vorher geschützten Teils dem Licht ausgesetzt wird; oder b) die Masken in einer Gray-Code-Maskierungsstrategie angeordnet sind, wobei die Gray-Code-Maskierungsstrategie auf jeder von einer großen Anzahl von Synthesevorrichtungen eine Randausleuchtung aufweist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4 (a), in dem mindestens zwei aufeinander folgende Schritte in der Maskierungsstrategie etwa eine Hälfte eines Bereichs von Interesse auf dem Substrat anstrahlen.
  6. Verfahren nach Anspruch 4 (a) oder Anspruch 5, wobei die Maskierungsstrategie eine große Anzahl von Polymersequenzen auf einem einzelnen Substrat erzeugt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Maskierungsstrategie eine Mindestzahl von Maskierungsschritten für mehrere synthetisierte Polymere zur Folge hat.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei alle möglichen Polymere mit einer Länge von weniger als oder gleich 1 mit einem gegebenen Basissatz von Monomeren gebildet werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die Maskierungsstrategie in einem geeignet programmierten digitalen Computer entwickelt wird, wobei mindestens ein gewünschter Basissatz und die Länge der Polymere eingegeben werden, gegebenenfalls weiterhin umfassend den Schritt zum Ausgeben einer Maskierungsstrategie oder zum Ausgeben einer Karte der synthetisierten Polymere auf dem Substrat, wobei die Karte vorzugsweise in Form von 9 vorliegt.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, das weiterhin den Schritt zum Erzeugen eines Teil des Polymers mit einer nicht-binären Maskierungsstrategie umfasst.
  11. Verbindung, umfassend ein natürliches oder nicht-natürliches Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das kovalent über die C-5'-Sauerstoffgruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, oder eine natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die kovalent über die Amino- oder Carboxylgruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, wobei die photoentfernbare Schutzgruppe die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 00500001
    in der R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidorest darstellen oder angrenzende Substituenten (d.h. R1-R2, R2-R3, R3-R4) substituierte Sauerstoffgruppen sind, die zusammen ein ringförmiges Acetal oder Ketal bilden; und R5 ein Wasserstoffatom oder einen Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylrest darstellt.
  12. Verbindung nach Anspruch 11, in der R1 und R4 jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, in der gegebenenfalls R5 eine Methylgruppe bedeutet.
  13. Verbindung, umfassend ein natürliches oder nicht-natürliches Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das kovalent über seine C-5'-Sauerstoffgruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, oder eine natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die kovalent über ihre Carboxyl- oder Aminogruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, wobei die Schutzgruppe die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 00510001
    in der R1 und R2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidorest darstellen; und R3 einen Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylrest bedeutet.
  14. Verbindung nach Anspruch 13, in der R1 und R2 ein Wasserstoffatom darstellen, in der gegebenenfalls R3 eine Methylgruppe bedeutet.
  15. Verbindung, umfassend ein natürliches oder nicht-natürliches Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das kovalent über seine C-5'-Sauerstoffgruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, oder eine natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die kovalent über ihre Carboxyl- oder Aminogruppe an eine photoentfernbare Schutzgruppe gebunden ist, wobei die Schutzgruppe die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 00510002
    ist der R1 und R2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl-, Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidorest darstellen; und R3 einen Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Wasserstoff- oder Alkenylrest bedeutet.
  16. Verbindung nach Anspruch 15, in der R1 und R2 jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten, in der gegebenenfalls R3 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe darstellt.
  17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Monomer eine Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 16 ist.
  18. Reaktorsystem zum Synthetisieren einer großen Anzahl von Polymersequenzen auf einem Substrat, umfassend: a) einen Reaktor zum Inkontaktbringen von Reaktionsflüssigkeiten mit dem Substrat; b) ein System zum Abgeben ausgewählter Reaktionsflüssigkeiten an den Reaktor; c) eine Translationsvorrichtung zum Bewegen einer Maske oder eines Substrats von mindestens einer relativen Position zu einer zweiten relativen Position; d) ein Licht zum Anstrahlen des Substrats durch eine Maske zu ausgewählten Zeiten; und e) einen geeignet programmierten digitalen Computer zum selektiven Steuern eines Ablaufs von Flüssigkeiten aus dem Reaktorsystem, zum selektiven Aktivieren der Translationsvorrichtung und zum selektiven Anstrahlen des Substrats, so dass auf dem Substrat an vorher bestimmten Positionen eine große Anzahl verschiedener Polymersequenzen erzeugt wird.
  19. Reaktorsystem nach Anspruch 18, ausgerichtet zum Bereitstellen einer großen Anzahl von Monomeren in einer Reaktionsflüssigkeit für das Substrat, wobei das Substrat für ein anfängliches Screening von Polymersequenzen verwendet wird.
  20. Verfahren zum Screening einer großen Anzahl von Linkerpolymeren zur Verwendung in Bindungsaffinitätsstudien, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer großen Anzahl von Linkerpolymeren auf einem Substrat in ausgewählten Bereichen, wobei die Linkerpolymere durch die folgenden Schritte gebildet werden, die rekursiv sind: i) auf einer Oberfläche eines Substrats, Anstrahlen eines Teils der ausgewählten Bereiche, um eine Schutzgruppe zu entfernen; und (ii) Inkontaktbringen der Oberfläche mit einem Monomer; b) Inkontaktbringen der großen Anzahl von Linkerpolymeren mit einem Liganden; und c) Inkontaktbringen des Liganden mit einem markierten Rezeptor.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Ligand ein Polypeptid ist, wobei gegebenenfalls der Rezeptor ein Antikörper ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei die in Schritt ii) zugegebenen Monomere in jedem der rekursiven Schritte die gleichen sind, wobei ausgewählte Bereiche Linkermoleküle mit unterschiedlichen Längen umfassen.
  23. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 22, wobei der markierte Rezeptor ein Fluorescein enthaltender Rezeptor ist.
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