ES2731653T3

ES2731653T3 - Métodos y usos para predecir la respuesta a la eribulina

Info

Publication number: ES2731653T3
Application number: ES12710643T
Authority: ES
Inventors: Sergei I Agoulnik; Michael Chapman Byrne; Bruce A Littlefield
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2019-11-18
Anticipated expiration: 2032-03-16
Also published as: CA2828959A1; US20140235707A1; SG193489A1; CN103562406B; US9637795B2; EP2686441B1; JP2019150027A; JP2014509515A; JP6612280B2; JP2017148049A; EP2686441A1; SG10201602147YA; WO2012129100A1; CN103562406A

Abstract

Un método para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 en una muestra derivada de dicho sujeto, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador es indicativo de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, será efectiva para tratar a dicho sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y usos para predecir la respuesta a la eribulina

Antecedentes de la invención

Cáncer es un término usado para describir una amplia variedad de enfermedades que se caracterizan por el crecimiento incontrolado de un tipo particular de célula. Comienza en un tejido que contiene dicha célula y, si el cáncer no se ha extendido a ningún tejido adicional en el momento del diagnóstico, puede ser tratado, por ejemplo, mediante cirugía, radiación u otro tipo de terapia localizada. Sin embargo, cuando existe evidencia de que el cáncer se ha metastatizado desde el tejido de origen, habitualmente se usan diferentes estrategias de tratamiento. De hecho, debido a que no es posible determinar la extensión de la metástasis, habitualmente se contemplan estrategias sistémicas de terapia cuando se detecta cualquier evidencia de expansión. Estas estrategias implican la administración de fármacos quimioterapéuticos que interfieren con el crecimiento de las células en rápida división, tal como células cancerosas.

La halicondrina B es un compuesto macrocíclico estructuralmente complejo que fue aislado originalmente de la esponja marina Halichondria okadai, y posteriormente se encontró en Axinella sp., Phakellia carteri, y Lissodendoryx sp. En 1992 se publicó una síntesis total de la halicondrina B (Aicher et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 3162-3164, 1992). Se ha demostrado que la halicondrina B inhibe la polimerización de tubulina, el ensamblaje de microtúbulos, la reticulación de beta-tubulina, la unión de GTP y vinblastina a tubulina, y la hidrólisis de GTP dependiente de tubulina in vitro. También se ha demostrado que esta molécula posee propiedades anticancerígenas in vitro e in vivo. En la Patente de EE.UU. n° 6.214.865 B1 se describen análogos de halicondrina B.

En particular, el mesilato de eribulina, un análogo de halicondrina B, ha sido desarrollado como fármaco anticancerígeno. Recientemente, el mesilato de eribulina ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico que han recibido previamente al menos dos regímenes quimioterapéuticos para el tratamiento de enfermedad metastásica, en donde la terapia previa puede haber incluido una antraciclina y/o un taxano en el adyuvante o el marco metastásico. La capacidad de predecir antes del tratamiento si un paciente de cáncer tiene probabilidad de responder a un agente anticancerígeno puede servir de guía en la selección del tratamiento apropiado, y ser beneficioso para los pacientes. Por consiguiente, existe una necesidad de métodos y composiciones útiles para determinar o predecir la capacidad de respuesta a la eribulina en pacientes que padecen cáncer y, en particular, cáncer de mama.

Sumario de la invención

La invención se basa, al menos en parte, en la observación de que un nivel bajo de expresión, p.ej., la ausencia de expresión, de los biomarcadores identificados en la presente memoria, es indicativo de la capacidad de respuesta a eribulina, a un análogo de la misma, o a una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). Específicamente, la ausencia de expresión o un nivel bajo de expresión de uno o más de los biomarcadores establecidos en la Tabla 1, en un sujeto, es indicativo de que el sujeto responderá al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina).

La invención queda definida por las reivindicaciones.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer, realizando un ensayo de una muestra derivada del sujeto para determinar el nivel de expresión en la muestra de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador es indicativo de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), será efectiva en el tratamiento del sujeto que padece cáncer de mama. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar a un sujeto que padece cáncer de mama, determinando el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1 en una muestra derivada del sujeto, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador es indicativo de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), será efectiva en el tratamiento del sujeto que padece cáncer de mama. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama, determinando el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 en una muestra derivada del sujeto, y predecir que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), será efectiva en el tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama cuando existe un nivel bajo de expresión del biomarcador en la muestra. En una realización de los aspectos precedentes de la invención, el método puede incluir además obtener una muestra de un sujeto.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la sensibilidad de un tumor de mama, por ejemplo, derivado de un sujeto que padece cáncer de mama, al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), determinando el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1 en el tumor, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador en el tumor indica que el tumor es sensible al tratamiento con eribulina, o un análogo de la misma. En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la sensibilidad de un tumor de mama, por ejemplo, derivado de un sujeto que padece cáncer de mama, frente al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), determinando el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 en el tumor, e identificando el tumor como sensible al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), cuando el biomarcador es expresado en el tumor en un nivel bajo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama. Los métodos incluyen identificar un sujeto que padece cáncer de mama en el que un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1 está expresado en un nivel bajo, y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), al sujeto.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama, evaluando una muestra derivada del sujeto para determinar el nivel de expresión en la muestra de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1, y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), al sujeto cuando se detecta un nivel bajo de expresión del biomarcador en la muestra. En un ejemplo de la descripción, los métodos pueden incluir además la obtención de una muestra de un sujeto.

En una realización particular, la presente invención proporciona eribulina, un análogo de las mismas, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que presenta cáncer de mama que es sensible a eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. Los métodos incluyen identificar un sujeto que padece cáncer de mama que es sensible a eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, (p.ej., un cáncer de mama en el que un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 es expresado en un nivel bajo), y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), al sujeto. Se describen adicionalmente métodos de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama que es sensible a eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, evaluando una muestra derivado del sujeto para determinar el nivel de expresión en la muestra de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1, y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), al sujeto cuando se detecta un nivel bajo de expresión del biomarcador en la muestra. Los métodos pueden incluir adicionalmente la obtención de una muestra de un sujeto.

En varias realizaciones, el sujeto no ha sido tratado previamente con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). Alternativamente, el sujeto ha sido tratado previamente con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En determinadas realizaciones, el cáncer de mama es un cáncer de mama negativo de Receptor de Estrógeno (ER) y/o un cáncer de mama negativo de Receptor de Progesterona (PR) y/o un cáncer de mama negativo de Her-2.

En varias realizaciones, se determina el nivel de expresión de al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1.

En realizaciones particulares, se usa una firma genética predictiva que comprende una sub-combinación de 2 o más biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1. En varias realizaciones, se determina el nivel de expresión de al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, la firma genética predictiva puede incluir al menos 2 biomarcadores, p.ej., DYSF y EDIL3; GNAT1 y ERGIC3; KRT24 y PAPLN; MANSC1 y PDGFB; PCDH1 y PDGFB; o PHOSPHO2 y PSENEN. En otra realización, la firma genética predictiva puede incluir al menos 3 biomarcadores; p.ej., COL7A1, YTHDF1 y ZIC5; CKLF, IL10 y TUBB6; CDC20, CFL1 y TMEM79; HYAL2, NCBP1 y SNX11; o CEP152, NCBP1 y SATB1. En otra realización, la firma genética predictiva puede incluir al menos 4 biomarcadores; p.ej., APBB2, CCL26, PSENEN y SATB1; ANG, JAM3, KLHL17 y PAPLN; ITFG3, MAD2L1BP, NMU y PDGFB; SPTA1, TYROBP, SNX11 y PSENEN; GRAMD4, GNAT1, TMIGD2 y YTHDF1; o GRAMD4, HYAL2, PHOSPHO2 y TUBB6. En otra realización, la firma genética predictiva puede incluir al menos 5 biomarcadores; p.ej., CCL26, CDC20, ERGIC3, EDIL3 y PCDH1; DYSF, NMU, PHOSPHO2, PSENEN y SNX11; APBB2, CKLF, CYP4F3, TUBB6 y YTHDF1; o CEP152, MAD2L1BP, SPTA1, TMEM79 y ZIC5.

En realizaciones particulares, la firma genética predictiva puede incluir 2 o más de los biomarcadores ABI3, ANG, APBB2, CCL26, CDC20, CEP152, CFL1, CKLF, COL7A1, CYP4F3, DYSF, GNAT1, GRAMD4, HYAL2, IL10, ITFG3, JAM3, KLHL17, KRT24, MAD2L1BP, MANSC1, MOBKL1B, NCBP1, NMU, PCDH1, PHOSPHO2, SPTA1, TMIGD2, TYROBP, ZIC5, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 y YTHDF1, p.ej., ABI3 y ANG; APBB2 y CCL26; GNAT1 y GRAMD4; IL10 y ITFG3; MACSC1 y MOBKL1B; NMU y PCDH1; o TYROBP y ZIC5. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 3 de los biomarcadores mencionados previamente, p.ej., ABI3, ANG y APBB2; CCL26, CKLF y COL7A1; DYSF, GNAT1 y HYAL2; JAM3, KLHL17 y KRT24; NCBP1, NMU y PCDH1; SPTA1, TMIGD2 y TYROBP; o ZIC5, MAD2L1BP y CDC20. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 4 de los biomarcadores mencionados previamente, p.ej., ABI3, ANG, APBB2 y CCL26; CEP152, CFL1, CKLF y COL7A1; KRT24, MANSC1, MOBKL1B y SPTA1; TYROBP, TMIGD2, PHOSPHO2 y NMU; ABI3, GNAT1, KLHL17 y SPTA1; o CEP152, HYAL2, PCDH1 y TMIGD2. En otras realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 5 de los biomarcadores mencionados previamente, p.ej., CKLF, COL7A1, GRAMD4, JAM3 y PCDH1; APBB2, CEP152, DYSF, IL10 y TYROBP; CYP4F3, HYAL2, ITFG3, KLHL17 y KRT24; NCBP1, SPTA1, TMIGD2, IL10 y JAM3; o CCL26, PHOSPHO2, SPTA1, TMIGD2 y ZIC5.

En otras realizaciones, la firma genética predictiva puede incluir 2 o más de los biomarcadores ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 o Yt Hd F1, o cualquier sub-combinación de los mismos, p.ej., ERGIC3 y PDGFB; ERGIC3 y PSENEN; ERGIC3 y SATB1; ERGIC3 y SNX11; ERGIC3 y TMEM79; ERGIC3 y YTHDF1; PDGFB y PSENEN; PDGFB y SATB1; PDGFB y SNX11; PDGFB y TMEM79; PDGFB y YTHDF1; PSENEN y SATB1; PSENEN y SNX11; PSENEN y TMEM79; PSENEN y YTHDF1; SATB1 y SNX11; SATB1 y TMEM79; SATB1 y YTHDF1; SNX11 y TMEM79; SNX11 y YTHDF1; o TMEM79 y YTHDF1. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 3 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB y PSENEN; SATB1, SNX11 y TMEM79; SNX11, TMEM79 y YTHDF1; o ERGIC3, PDGFB y SATB1. En realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 4 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB, PSENEN y SATB1; SNX11, TMEM79, YTHDF1 y ERGIC3; o ERGIC3, PDGFB, PSENEN y YTHDF1. En realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 5 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1 y SNX11; ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1 y TMEM79; o Ps En EN, sAt B1, SNX11, TMEM79 y YTHDF1. En otras realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 6 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11 y TMEM79; PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 y YTHDF1; o ERGIC3, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 y YTHDF1. En otra realización adicional, la firma genética predictiva incluye 7 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 y YTHDF1.

En varias realizaciones, el biomarcador no es uno o más de SPTA1, PAPLN, PCDH1, TMIGD2 y/o KRT24. En una realización particular, el biomarcador no es SPTA1, PAPLN, PCDH1, TMIGD2 y KRT24. En una realización, el biomarcador no es SPTA1. En otra realización, el biomarcador no es PAPLN. En otra realización, el biomarcador no es PCDH1. En otra realización, el biomarcador no es TMIGD2. En otra realización adicional, el biomarcador no es KRT24.

En realizaciones particulares, la firma genética predictiva puede incluir 2 o más biomarcadores ABI3, ANG, APBB2, CCL26, CDC20, CEP152, CFL1, CKLF, COL7A1, CYP4F3, DYSF, GNAT1, GRAMD4, HYAL2, IL10, ITFG3, JAM3, KLHL17, MAD2L1BP, MANSC1, MOBKL1B, NCBP1, NMU, PHOSPHO2, TYROBP, ZIC5, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79, YTHDF1, EDIL3 y TUBB6, p.ej., ABI3 y ANG; GRAMD4 y HYAL2; NMU y PHOSPHO2; ZIC5 y PSENEN; o SNX11 y MOBKL1B. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 3 de los biomarcadores mencionados previamente, p.ej., APBB2, CDC20 y CKLF; COL⁷A ¹, DYSF y GNAT1; NCBP1, SATB1 y EDIL3; PSENEN, DYSF y GNAT1; MANSC1, ZIC5 y CFL1; o CKLF, GRAMD4 y NMU. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 4 de los biomarcadores mencionados previamente, p.ej., ANG, CCL26, CEP152 y JAM3; APBB2, CYP4F3, ITFG3 y TYROBP; CYP4F3, MANSC1, PDGFB y YTHDF1; TUBB6, DYSF, PHOSPHO2 y CDC20; o CKLF, KLHL17, HYAL2 y ZIC5. En otras realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 5 de los biomarcadores mencionados previamente, p.ej., IL10, CEP152, COL7A1, TYROBP y ERGIC3; TMEM79, SNX11, PSENEN, GNAT1 y GRAMD4; JAM3, SNX11, KLHL17, MOBKL1B y ERGIC3; o NMU, PHOSPHO2, PDGFB, CFL1 y ANG.

En varios métodos y/o kits de la invención, el biomarcador no es ABI3, no es ANG, no es APBB2, no es CCL26, no es CDC20, no es CEP152, no es CFL1, no es CKLF, no es COL7A1, no es CYP4F3, no es DYSF, no es GNAT1, no es GRAMD4, no es HYAL2, no es IL10, no es ITFG3, no es JAM3, no es KLHL17, no es KRT24, no es MAD2L1BP, no es MANSC1, no es MOBKL1B, no es NCBP1, no es NMU, no es PCDH1, no es PHOSPHO2, no es SPTA1, no es TMIGD2, no es TYROBP, no es ZIC5, no es ERGIC3, no es PDGFB, no es PSENEN, no es SATB1, no es SNX11, no es TMEM79, no es EDIL3, no es PAPLN, no es TUBB6 y/o no es YTHDF1.

En determinadas realizaciones, el biomarcador no se expresa en un nivel detectable. En otra realización, el biomarcador se expresa en un nivel bajo en comparación con un control. La expresión se puede determinar directa o indirectamente mediante cualquier método adecuado. En determinadas realizaciones, el nivel de expresión del biomarcador se determina a nivel de ácido nucleico usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, el nivel de expresión del biomarcador se puede determinar mediante la detección de ADNc, ARNm o ADN. En realizaciones particulares, el nivel de expresión del biomarcador se determina usando una técnica seleccionada del grupo que consiste en reacción de amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR), análisis de PCR de transcriptasa inversa, análisis de PCR de transcriptasa inversa cuantitativa, análisis de transferencia Northern blot, ensayo de protección de ARNasa, detección/cuantificación de ARN digital (p.ej., nanoString) y combinaciones o sub combinaciones de los mismos.

En determinadas realizaciones, el nivel de expresión del biomarcador puede determinarse detectando miARN. Específicamente, la expresión de ARNm se puede determinar indirectamente estableciendo los niveles de miARN, en donde un nivel elevado de un miARN que controla la expresión de un ARNm es indicativo de un nivel bajo de expresión del ARNm que codifica el biomarcador.

En otras realizaciones, el nivel de expresión del biomarcador se determina a nivel de proteína usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, la presencia o el nivel de la proteína pueden detectarse usando un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la proteína. En realizaciones particulares, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo bi-específico, un anticuerpo quimérico, un Fab, Fab', F(ab')², ScFv, SMIP, aficuerpo, avímero, versacuerpo, nanocuerpo, y un anticuerpo de dominio, o un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores. En realizaciones particulares, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es marcado, por ejemplo, con una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en una radiomarca, una marca de biotina, una marca de cromóforo, una marca de fluoróforo y una marca enzimática. En determinadas realizaciones, el nivel de expresión del biomarcador se determina usando una técnica seleccionada del grupo que consiste en un inmunoensayo, un análisis de transferencia Western blot, un radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA), ensayo ELISA, reacción en cadena de inmunopolimerasa y combinaciones o sub combinaciones de los mismos. En realizaciones particulares, el inmunoensayo es un inmunoensayo basado en disolución seleccionado del grupo que consiste en electroquimioluminiscencia, quimioluminiscencia, quimioluminiscencia fluorogénica, polarización de fluorescencia, y fluorescencia resuelta en el tiempo. En otras realizaciones, el inmunoensayo es un inmunoensayo sándwich seleccionado del grupo que consiste en electroquimioluminiscencia, quimioluminiscencia, y quimioluminiscencia fluorogénica. También se pueden usar otros ensayos que se basan en agentes capaces de detectar la proteína, tal como los basados en una pareja de unión adecuada o una actividad enzimática adecuada (p.ej., uso de un ligando para detectar una molécula receptora).

Las muestras pueden haber sido obtenidas de un sujeto mediante cualquier método adecuado, y pueden haber sido sometidas opcionalmente a etapa(s) de procesamiento adicional(es) (p.ej., congelación, fraccionamiento, fijación, tratamiento de guanidina, etc.). Se puede usar cualquier muestra adecuada derivada de un sujeto, tal como cualquier tejido (p.ej., biopsia), célula o fluido, así como cualquier componente de los mismos, tal como una fracción o extracto. En varias realizaciones, la muestra es un fluido obtenido del sujeto, o un componente de dicho fluido. Por ejemplo, el fluido puede ser sangre, plasma, suero, esputo, linfa, fluido quístico, aspirado de pezón, orina o fluido recogido de una biopsia (p.ej., biopsia de bulto). En otras realizaciones, la muestra es un tejido o componente del mismo obtenido del sujeto. Por ejemplo, el tejido puede ser tejido obtenido de una biopsia (p.ej., biopsia de bulto), tejido de mama, tejido conectivo, y/o tejido linfático. En una realización particular, el tejido es tejido de mama, o un componente del mismo (p.ej., células recogidas del tejido de mama). En una realización particular, el componente del tejido de mama son células de tejido de mama. En otra realización, el componente del tejido de mama son células tumorales de mama en circulación.

En una realización, el sujeto es un humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un kit, tal como se define en la reivindicación 15, para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), se puede usar para tratar un sujeto que padece cáncer de mama, que incluye reactivos para determinar el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1; e instrucciones para uso del kit para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que presenta cáncer de mama. Por ejemplo, el reactivo para determinar el nivel de expresión del biomarcador puede ser una sonda para identificar una mutación nula en el biomarcador. El reactivo para determinar el nivel de expresión del biomarcador puede ser una sonda para amplificar y/o detectar el biomarcador. En otra realización adicional, el reactivo para determinar el nivel de expresión del biomarcador puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico para el producto de la expresión de la versión silvestre o mutante nula del biomarcador.

En una realización particular, el kit incluye además reactivos para obtener una muestra biológica de un sujeto. En otra realización, el kit incluye una muestra de control.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), se puede usar para tratar un sujeto que padece cáncer de mama determinando y/o identificando sin el sujeto porta al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene una mutación nula. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama evaluando una muestra derivada del sujeto para determinar si el sujeto porta al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene una mutación nula. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para determinar la sensibilidad de un tumor de mama frente al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma determinando y/o identificando si dicho tumor se caracteriza por al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene una mutación nula.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama, identificando si al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene una mutación nula, y administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) al sujeto.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra los métodos de cribado de ARNsi de alta capacidad en líneas celulares de cáncer de mama llevados a cabo como se describe en el Ejemplo 1.

Figura 2: muestra la identificación y selección de determinados genes para consideración adicional como biomarcadores de eficacia de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

Figura 3: muestra los ensayos de confirmación llevados a cabo como se describe en el Ejemplo 1.

Figura 4: muestra los resultados de los ensayos QuantiTect SYBR para determinar las cantidades relativas de ADNcs después del tratamiento con ARNsi establecido en el Ejemplo 1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer, métodos para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama, métodos para determinar la sensibilidad de un tumor de mama frente al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), y métodos de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama. Generalmente, los métodos implican determinar el nivel de expresión de al menos un biomarcador establecido en la Tabla 1 en una muestra derivada del sujeto, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador es una indicación de que la eribulina, o un análogo de la misma, puede usarse para tratar cáncer de mama y/o que el tumor de mama es sensible al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina).

La invención se basa, al menos en parte, en la observación de que un nivel bajo de expresión, p.ej., la ausencia de expresión, de los biomarcadores identificados en la presente memoria es indicativa de respuesta a eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). Tal como se muestra en la presente memoria, se emplearon técnicas de ARNsi para “bloquear” la expresión de determinados genes y determinar la sensibilidad de las células bloqueadas resultantes a mesilato de eribulina. En base a lo observado en estos estudios, se identificó que un nivel bajo de expresión de cada uno de los genes establecidos en la Tabla 1 está asociado a la sensibilidad de las células de cáncer de mama frente al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina).

A menos que se defina de otro modo en la presente memoria, los términos científicos y técnicos usados en relación a la presente invención tendrán el significado habitualmente utilizado por los especialistas en la técnica. El significado y alcance de los términos debería estar claro, sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente memoria adoptarán precedente sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular, por ejemplo, aquellos caracterizados por “un” o “una”, incluirán el plural, p.ej., uno o más biomarcadores. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o”, a menos que se indique lo contrario. Adicionalmente, el uso del término “que incluye”, así como otras formas del término, tales como “incluye” e “incluido”, no es limitativo. Asimismo, términos tales como “elemento” o “componente” abarcan tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una unidad, a menos que específicamente se indique lo contrario.

La frase “determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama” se refiere a determinar la probabilidad de que el tratamiento de un sujeto con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) será efectivo (p.ej., proporcionará un beneficio terapéutico al sujeto) o no será efectivo en el sujeto. La determinación de la probabilidad de que el tratamiento sea o no sea efectivo se puede llevar a cabo típicamente antes de que se haya iniciado el tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), o antes de que se retome el tratamiento. Alternativamente o en combinación, la determinación de la probabilidad de un tratamiento eficaz se puede llevar a cabo durante el tratamiento, por ejemplo, para determinar si el tratamiento debería continuarse o finalizarse. Por ejemplo, dicha determinación se puede llevar a cabo (a) determinando el nivel de expresión de un biomarcador, por ejemplo, un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1, en una muestra derivada de dicho sujeto, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador indica que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar dicho sujeto que padece cáncer de mama, o (b) evaluando una muestra derivada de dicho sujeto para determinar el nivel de expresión en dicha muestra de un biomarcador, por ejemplo, un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador indica que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar dicho sujeto que padece cáncer de mama.

La frase “determinar la sensibilidad de un tumor de mama frente al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma”, tal como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la determinación de la susceptibilidad de un tumor de mama, p.ej., células de cáncer de mama, al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). La sensibilidad de un tumor puede incluir la capacidad de la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), para matar células tumorales, para inhibir la extensión y/o metástasis de las células tumorales, y/o para inhibir el crecimiento de células tumorales completa o parcialmente (p.ej., frenar el crecimiento de células tumorales en al menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%). La determinación puede llevarse a cabo (i) antes de que haya comenzado el tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina); (ii) antes de que el tratamiento se retome en el sujeto; y/o durante el tratamiento, por ejemplo, para determinar si el tratamiento debería continuarse o finalizarse. Por ejemplo, dicha determinación se puede llevar a cabo (a) determinando el nivel de expresión de un biomarcador, p.ej., un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1, en dicho tumor, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador en dicho tumor indica que dicho tumor es sensible al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, o (b) determinando el nivel de expresión de un biomarcador p.ej., un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en los biomarcadores enumerados en la Tabla 1, en dicho tumor, e identificando dicho tumor como sensible al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, cuando dicho biomarcador es expresado en dicho tumor en un nivel bajo.

El término “eribulina” tal como se usa en la presente memoria se refiere al análogo de cetona macrocíclica completamente sintético reconocido en la técnica de la halicondrina B. Tal como se establece en la Patente de EE.UU. n° 6.214.865, la eribulina tiene la siguiente estructura

y puede generarse usando técnicas como las descritas en la presente memoria o como se describe en Kim DS et al. (noviembre de 2009) J. Am. Chem. Soc. 131 (43): 15636-41. La eribulina también es conocida como ER-086526 y se identifica mediante el número CAS 253128-41-5. El mesilato de eribulina también es conocido como E7389.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “análogo de eribulina” incluye compuestos en los que uno o más átomos o grupos funcionales de eribulina han sido reemplazados con diferentes átomos o grupos funcionales. Por ejemplo, los análogos de eribulina incluyen compuestos que presentan la siguiente fórmula (I), que también abarca la eribulina:

En la fórmula (I), A es un esqueleto hidrocarbonado C1-6 saturado o C2-6 insaturado, estando sustituido el esqueleto o presentando entre 1 y 13 sustituyentes, preferiblemente entre 1 y 10 sustituyentes, p.ej., al menos un sustituyente seleccionado entre ciano, halo, azido, Q1, y oxo. Cada Q1 se selecciona de forma independiente entre OR1, SR1, SO2 R1, OSO2R1, NR2R1, NR2(CO)R1, NR2(CO)(CO)R1, NR4(CO)NR2R1, NR2(CO)OR1, (CO)OR1, O(CO)R1, (CO)NR2R1, y O(CO)NR2R1. El número de sustituyentes puede ser, por ejemplo, de 1 a 6, de 1 a 8, de 2 a 5, o de 1 a 4. A lo largo de toda la descripción, se entiende que los rangos numéricos son inclusivos.

Cada uno de R1, R2, R4, R5, y R6 se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6, aminoalquilo C1-6, arilo C6-10, haloarilo C6-10 (p.ej., p-fluorofenilo o p-clorofenilo), hidroxiarilo C6-10, alcoxi-C1-4-arilo C 6 (p.ej., alcoxi-C1-3-arilo C 6, p-metoxifenilo, 3,4 ,5-trimetoxifenilo, p-etoxifenilo, o 3,5-dietoxifenilo), arilo-C6-10-alquilo C1-6 (p.ej., bencilo o fenetilo), alquilo-C1_6-arilo C6-10, haloarilo-C6-10-alquilo C1.6, alquilo-C1-6-haloarilo C6-10, (alcoxi-C1-3-arilo C 6)-alquilo C1.3, radical heterocíclico C2-9, radical heterocíclico C2-9-alquilo C1-6, heteroarilo C2-9, y heteroarilo C2-9-alquilo C1.6. Puede haber más de un R1, por ejemplo, si A está sustituido con dos grupos alcoxi (OR1) diferentes tal como butoxi y 2-aminoetoxi.

Los ejemplos de A incluyen 2 ,3-dihidroxipropilo, 2-hidroxietilo, 3-hidroxi-4-perfluorobutilo, 2 ,4 ,5-trihidroxipentilo, 3-amino-2-hidroxipropilo, 1,2-dihidroxietilo, 2 ,3-dihidroxi-4-perfluorobutilo, 3-ciano-2-hidroxipropilo, 2-amino-1-hidroxi etilo, 3-azido-2-hidroxipropilo, 3,3-difluoro-2 ,4-dihidroxibutilo, 2 ,4-dihidroxibutilo, 2-hidroxi-2(p-fluorofenilo)-etilo, -CH2 (CO)(arilo sustituido o no sustituido), -CH2 (CO)(alquilo sustituido o no sustituido, tal como haloalquilo o hidroxialquilo) y 3,3-difluoro-2-hidroxipent-4-enilo.

Los ejemplos de Q1 incluyen -NH(CO)(CO)-(radical heterocíclico o heteroarilo), -OSO2 -(arilo o arilo sustituido), -O(CO)NH-(arilo o arilo sustituido), aminoalquilo, hidroxialquilo, -NH(CO)(CO)-(arilo o arilo sustituido), -NH(CO)(alquilo)(heteroarilo o radical heterocíclico), O(alquilo sustituido o no sustituido)(arilo sustituido o no sustituido), y -NH(CO)(alquilo)(arilo o arilo sustituido).

Cada uno de D y D' es seleccionado de forma independiente entre R3 y OR3, en donde R3 es H, alquilo C1-3, o haloalquilo C1.3. Los ejemplos de D y D' son metoxi, metilo, etoxi, y etilo. En algunas realizaciones, uno de D y D' es H.

El valor para n es 1 o preferiblemente 0, formando de este modo un anillo de seis miembros o un anillo de cinco miembros. Dicho anillo puede estar sin sustituir o sustituido, p.ej., donde E es R5 u OR5, y puede ser un radical heterocíclico o un cicloalquilo, p.ej., donde G es S, CH2, NR6 o preferiblemente O.

Cada uno de J y J' es de forma independiente H, alcoxi C1-6, o alquilo C1-6; o J y J' considerados juntos son =CH2 o -O-(alquileno C1-5 lineal o ramificado)-O-, tal como un metilideno exocíclico, isopropilideno, metileno o etileno.

Q es alquilo C1-3, y preferiblemente es metilo.

T es etileno o etenileno, opcionalmente sustituido con (CO)OR7, donde R7 es H o alquilo C1-6.

Cada uno de U y U' es de forma independiente H, alcoxi C1-6, o alquilo C1-6; o U y U' considerados juntos son =CH2 o -O-(alquileno C1-5 lineal o ramificado)-O-.

X es H o alcoxi C1-6.

Cada uno de Y e Y' es de forma independiente H o alcoxi C1-6; o Y e Y' considerados juntos son =O, =CH2 o -O -(alquileno C1-5 lineal o ramificado)-O-.

Cada uno de Z y Z' es de forma independiente H o alcoxi Ci-a; o Z y Z' considerados juntos son =O, =CH2 o -O -(alquileno C1-5 lineal o ramificado)-O-.

En determinadas realizaciones, los análogos de eribulina incluyen compuestos que tienen la siguiente fórmula (II):

A es un esqueleto hidrocarbonado C ^ saturado o C2-6 insaturado, estando sustituido dicho esqueleto o presentando entre 1 y 10 sustituyentes, inclusive, seleccionados de forma independiente entre ciano, halo, azido, oxo, y Q1. Cada Q1 se selecciona de forma independiente entre OR1, SR1, SO2R1, OSO2R1, NR2R1, NR2(CO)R1, NR2(CO)(CO)R1, NR4(CO)NR2R1, NR2(CO)OR1, (CO)OR1, O(CO)R1, (CO)NR2R1, y O(CO)NR2R1.

Cada uno de R1, R2, y R4 se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C ^ , haloalquilo C ^ , hidroxialquilo C1-6, aminoalquilo C ^ , arilo C6-10, haloarilo C6-10, hidroxiarilo C6-10, alcoxi-C1-3-arilo C 6, arilo-C6-10-alquilo C ^ , alquilo-C1-6-arilo C6-10, haloarilo-C6-10-alquilo C ^ , alquilo-C1-6-haloarilo C6-10, (alcoxi-C1-3-arilo C 6)-alquilo C1.3, radical heterocíclico C2-9, radical heterocíclico C2-9-alquilo C ^ , heteroarilo C2-9, y heteroarilo C2-9-alquilo C ^ .

Cada uno de D y D' se selecciona de forma independiente entre R3 y OR3, en donde R3 es H, alquilo C1-3, o haloalquilo C1-3.

n es 0 o 1.

E es R5 u OR5, en donde R5 se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C ^ , haloalquilo C ^ , hidroxialquilo C1-6 y aminoalquilo C ^ .

G es O.

Cada uno de J y J' es de forma independiente H, alcoxi C ^ , o alquilo C ^ ; o J y J' considerados juntos son =CH2. Q es alquilo C1-3.

T es etileno o etenileno.

Cada uno de U y U' es de forma independiente H, alcoxi C ^ , o alquilo C ^ ; o U y U' considerados juntos son =CH2. X es H o alcoxi C ^ .

Cada uno de Y e Y' es de forma independiente H o alcoxi C ^ ; o Y e Y' considerados juntos son =O.

Cada uno de Z y Z' es de forma independiente H o alcoxi C ^ ; o Z y Z' considerados juntos son =O.

En algunas realizaciones, los análogos de eribulina incluyen compuestos que tienen la siguiente fórmula (III):

en donde A es un esqueleto hidrocarbonado C^1-6saturado o C^2-6insaturado, estando sustituido el esqueleto o presentando entre 1 y 13 sustituyentes, p.ej., entre 1 y 10 sustituyentes seleccionados entre ciano, halo, azido, Q¹, y oxo;

cada Q¹se selecciona de forma independiente entre OR¹, SR¹, SO²R¹, OSO²R¹, NR²R¹, NR²(CO)R¹, NR²(CO)(CO)R¹, NR4(CO)NR2R1, NR²(CO)OR¹, (CO)OR¹, O(CO)R¹, (CO)NR²R¹, y O(CO)NR²R¹; y

cada uno de R¹, R², y R⁴se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C^1-6, haloalquilo C^1-6, hidroxialquilo C¹-6, aminoalquilo C^1-6, arilo C^6-10, haloarilo C^6-10, hidroxiarilo C^6-10, alcoxi-C^1-4-arilo C6, arilo-C^6-10-alquilo C^1-6, alquilo-C¹-6-arilo C^6-10, haloarilo-C^6-10-alquilo C^1-6, alquilo-C^1-6-haloarilo C^6-10, (alcoxi-C^1-3-arilo C6)-alquilo C^1-3, radical heterocíclico C^2-9, radical heterocíclico C^2-9-alquilo C^1.6, heteroarilo C^2-9, y heteroarilo C^2-9-alquilo C^1-6.

Los esqueletos hidrocarbonados contienen átomos de carbono y de hidrógeno y pueden ser lineales, ramificados o cíclicos. Los hidrocarburos insaturados incluyen uno, dos, tres o más enlaces dobles C--C (sp2) o enlaces triples C--C (sp). Los ejemplos de radicales hidrocarbonados insaturados incluyen etinilo, 2-propinilo, 1-propenilo, 2-butenilo, 1,3-butadienilo, 2-pentenilo, vinilo (etenilo), alilo, e isopropenilo. Los ejemplos de radicales hidrocarbonados insaturados bivalentes incluyen alquenilenos y alquilidenos tales como metilidina, etilideno, etilidina, vinilideno e isopropilideno. En general, los compuestos presentan esqueletos hidrocarbonados (“A” en la fórmula (I)) que están sustituidos, p.ej., con hidroxi, amino, ciano, azido, heteroarilo, arilo y otros grupos funcionales descritos en la presente memoria. Los esqueletos hidrocarbonados pueden tener dos átomos de hidrógeno geminales reemplazados con oxo, un átomo de oxígeno de carbonilo bivalente (=O), o un sustituyente formador de anillo, tal como --O-(alquileno o alquilideno lineal o ramificado)-O-- para formar un acetal o cetal.

Alquilo C^1-6incluye hidrocarburos lineales, ramificados y cíclicos, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, sec-pentilo, neo-pentilo, terc-pentilo, ciclopentilo, hexilo, isohexilo, sec-hexilo, ciclohexilo, 2-metilpentilo, terc-hexilo, 2,3-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, y 2,3-dimetilbuti-2-ilo. Alcoxi (--OR), alquiltio (--SR), y otros grupos funcionales derivados de alquilo (sustituidos, insaturados o bivalentes) son análogos a los grupos alquilo (R). Los grupos alquilo, y los grupos derivados de alquilo tales como los grupos alcoxi, haloalquilo, hidroxialquilo, alquenilo, alquilideno y alquileno representativos pueden ser C^2-6, C^3-6, C^1-3, o C2-4.

Los alquilos sustituidos con halógeno, hidroxi, amino, ciano, azido, etc., pueden tener 1, 2, 3, 4, 5 o más sustituyentes, que se seleccionan de forma independiente (pueden ser el mismo o no) y que pueden estar en el mismo átomo de carbono o no. Por ejemplo, los haloalquilos son grupos alquilo con al menos un sustituyente seleccionado entre flúor, cloro, bromo y iodo. Los haloalquilos pueden tener dos o más sustituyentes halo que pueden ser el mismo halógeno o no, y que pueden estar en el mismo átomo de carbono o no. Los ejemplos incluyen clorometilo, periodometilo, 3,3-dicloropropilo, 1,3-difluorobutilo, y 1-bromo-2-cloropropilo.

Los radicales heterocíclicos y los heteroarilos incluyen furilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatienilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, imidazolilo (p.ej., 1-, 2- o 4-imidazolilo), pirazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, piridilo (p.ej., 1-, 2- o 3-piridilo), pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, indolilo (p.ej., 1-, 2- o 3-indolilo), indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, isoquinolilo, quinolilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperidilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, y morfolinilo. Los radicales heterocíclicos y los heteroarilos pueden estar ligados al resto de la molécula en cualquier posición del anillo. Los radicales heterocíclicos y los heteroarilos pueden ser C^2-9, o más pequeños, tal como C^3-6, C^2-5, o C^3-7.

Los grupos arilo incluyen fenilo, bencilo, naftilo, tolilo, mesitilo, xililo y cumenilo.

Debe entenderse que “radical heterocíclico”, “arilo”, y “heteroarilo” incluyen aquellos que tienen 1, 2, 3, 4 o más sustituyentes seleccionados de forma independiente entre alquilo inferior, alcoxi inferior, amino, halo, ciano, nitro, azido y hidroxilo. Los radicales heterocíclicos, heteroarilos, y arilos también pueden ser sustituyentes bivalentes del esqueleto hidrocarbonado “A” de la fórmula (I).

El término “análogo de eribulina” incluye profármacos de eribulina. El término “profármacos de eribulina” incluye eribulina que ha sido modificada químicamente para ser inactiva o menos activa hasta bioactivación (p.ej., metabolismo in vivo) por una enzima que rompe la porción modificada químicamente del profármaco de eribulina, proporcionando de este modo la forma activa de la eribulina.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “análogo de eribulina” incluye todos los estereoisómeros de eribulina y otros compuestos de fórmula (I), que incluyen diastereoisómeros y enantiómeros de los mismos. “Estereoisómeros” se refiere a isómeros que difieren solo en la disposición de los átomos en el espacio. “Diastereoisómeros” se refiere a estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles uno respecto al otro. Por ejemplo, la Fórmula (IV) abarca eribulina y dichos estereoisómeros:

La frase “sal farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en la presente memoria, en una sal formada a partir de un ácido y un grupo de nitrógeno básico de eribulina o un análogo de eribulina. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición ácida y sales de adición básica, tal como sales de ácidos inorgánicos o sales de ácidos orgánicos (p.ej., sal de ácido clorhídrico, sal de ácido sulfúrico, sal de ácido bromhídrico, sal de ácido yodhídrico, sal de ácido nítrico, bisulfato, sal de ácido fosfórico, sal de ácido superfosfórico, sal de ácido isonicotínico, sal de ácido acético, sal de ácido láctico, sal de ácido salicílico, sal de ácido tartárico, sal de ácido pantoténico, sal de ácido ascórbico, sal de ácido succínico, sal de ácido maleico, sal de ácido fumárico, sal de ácido glucónico, sal de ácido sacarínico, sal de ácido fórmico, sal de ácido benzoico, sal de ácido glutámico, sal de ácido metanosulfónico, sal de ácido etanosulfónico, sal de ácido bencenosulfónico, sal de ácido p-toluenosulfónico, sal de ácido pamoico (pamoato)), así como sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, calcio, sodio, zinc y dietanolamina. Debe entenderse que la referencia a eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, incluye sales farmacéuticamente aceptables de eribulina y sales farmacéuticamente aceptables de un análogo de la misma. Los ejemplos de dichas sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, una sal farmacéuticamente aceptable de Fórmula I, una sal farmacéuticamente aceptable de Fórmula II, una sal farmacéuticamente aceptable de Fórmula III o una sal farmacéuticamente aceptable de Fórmula IV.

En una realización particular, se pretende indicar mesilato de eribulina, una forma salina farmacéuticamente aceptable de la eribulina. El mesilato de eribulina se vende bajo la marca comercia1 HALAVEN®. El nombre químico correspondiente al mesilato de eribulina es 11,15:18,21:24,28-Triepoxi-7,9-etano-12,15-metano-9H,15H-furo[3,2-i]furo[2',3':5,6]pirano[4,3-b] [1,4]dioxoaciclopentacosin-5(4H)-ona, 2-[(2S)-3-amino-2-hidroxipropil]hexacosahidro-3-metoxi-26-metil-20,27-bis(metileno)-(2R,3R,3aS,7R,8aS,9S,10aR,11S,12R,13aR,13bS,15S,18S,21S,24S,26R,28R, 29aS)-metanosulfonato (sal). El mesilato de eribulina tiene la siguiente estructura:

El mesilato de eribulina está indicado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico que han recibido previamente al menos dos regímenes quimioterapéuticos para el tratamiento de la enfermedad metastásica, que incluyen, por ejemplo, terapia con una antraciclina y un taxano en el conjunto de adyuvante o metastásico.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “biomarcador” pretende abarcar una sustancia que se usa como indicador de un estado biológico e incluye por ejemplo, genes (o porciones de los mismos), ARNms (o porciones de los mismos), miARNs (microARNs), y proteínas (o porciones de las mismas). Un “patrón de expresión de biomarcador” pretende referirse a un sumario cuantitativo o cualitativo de la expresión de uno o más biomarcadores en un sujeto, tal como en comparación con un estándar o un control.

Varios biomarcadores que pueden usarse en los métodos descritos en la presente memoria se resumen en la Tabla 1. La Tabla 1 proporciona abreviaturas de genes, números Gen_ID y Números de Acceso para tránscritos a partir de los cuales se pueden identificar secuencias génicas de nucleótidos codificadoras. Por ejemplo, gen ABI3 se refiere a la familia ABI de Homo sapiens, miembro 3. La secuencia de nucleótidos correspondiente a la variante 1 de tránscrito de ABI3 se puede encontrar en el Número de Acceso NM_016428. La referencia a un gen (p.ej., ABI3) pretende abarcar las versiones naturales o endógenas del gen, que incluyen la silvestre, polimórfica o variantes alélicas o mutantes (p.ej., mutación de línea germinal, mutación somática) del gen, que pueden encontrarse en un sujeto y/o tumor de un sujeto. En algunas realizaciones, la secuencia del gen biomarcador es al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% idéntica a una secuencia identificada en la Tabla 1 mediante el Número de Acceso o el número Gen_ID. Por ejemplo, la identidad de secuencia se puede determinar comparando secuencias usando NCBI BLAST (p.ej., Megablast con los parámetros por defecto).

Tal como se usa en la presente memoria, la frase “firma genética predictiva” se refiere a los niveles de expresión de dos o más biomarcadores de la presente invención en un sujeto que son indicativos de la capacidad de respuesta al tratamiento con eribulina, o un análogo de eribulina. Por ejemplo, la expresión de nivel bajo de al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 biomarcadores de la Tabla 1 en un sujeto puede constituir una firma genética que indica que el sujeto responderá positivamente al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). Cualquier sub-combinación de 2 o más marcadores de la Tabla 1 puede constituir una firma genética predictiva de la invención. En otro ejemplo, la expresión de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 biomarcadores de la Tabla 1 por debajo de niveles de umbral particulares, o cualquier sub-combinación de los mismos, constituye una firma genética que indica que el sujeto responderá positivamente al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina).

Una “expresión de nivel bajo” del biomarcador, por ejemplo, un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1, se refiere a un nivel de expresión del biomarcador en una muestra de ensayo (p.ej., una muestra derivada de un sujeto) que se correlaciona con la sensibilidad a la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). Esto puede determinarse comparando el nivel de expresión del biomarcador en la muestra de ensayo con el de un control adecuado. Un “nivel bajo de expresión” también incluye una falta de expresión detectable del biomarcador.

En algunas realizaciones, el nivel de expresión del biomarcador se determina respecto a una muestra de control, tal como el nivel de expresión del biomarcador en tejido normal (p.ej., un rango determinado a partir de los niveles de expresión del biomarcador observados en muestras de tejido normal). En dichas realizaciones, un nivel bajo de expresión estará por debajo o dentro de los límites inferiores de dicho rango. En algunas realizaciones, el nivel de expresión del biomarcador se determina respecto a una muestra de control, tal como el nivel de expresión del biomarcador en muestras (p.ej., muestras tumorales, células tumorales en circulación) de otros sujetos. Por ejemplo, se puede determinar el nivel de expresión del biomarcador en muestras de otros sujetos para definir los niveles de expresión que se correlacionan con la sensibilidad al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), y el nivel de expresión del biomarcador en la muestra del sujeto de interés se compara con dichos niveles de expresión, en donde un nivel de expresión comparable o inferior en la muestra procedente del sujeto es indicativo de un “bajo nivel de expresión” del biomarcador en la muestra. En otro ejemplo, se puede determinar el nivel de expresión del biomarcador en muestras (p.ej., muestras tumorales, células tumorales en circulación) procedentes de otros sujetos para definir los niveles de expresión que se correlacionan con resistencia o falta de respuesta al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), y el nivel de expresión del biomarcador en la muestra procedente del sujeto de interés se compara con dichos niveles de expresión, en donde un nivel de expresión más bajo en la muestra del sujeto es indicativo de un “nivel bajo de expresión” del biomarcador en la muestra.

El término “nivel estándar conocido” o “nivel de control” puede referirse a un nivel de expresión aceptado o pre determinado del biomarcador, por ejemplo, un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1, que se usa para comparar con el nivel del biomarcador en una muestra derivada de un sujeto. En una realización, el nivel de expresión de control del biomarcador es el nivel de expresión promedio del biomarcador en muestras derivadas de una población de sujetos. Por ejemplo, el nivel de expresión de control puede ser el nivel de expresión promedio del biomarcador en células de cáncer de mama derivadas de una población de sujetos con cáncer de mama. La población pueden ser sujetos que no han respondido al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), o la población puede ser un grupo de sujetos que expresan el respectivo biomarcador en niveles altos o normales. En algunas realizaciones, el nivel de control puede constituir un rango de expresión del biomarcador en tejido normal, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, el nivel de control puede constituir un rango de expresión del biomarcador en muestras tumorales procedentes de una variedad de sujetos que padecen cáncer de mama, tal como se ha descrito anteriormente.

Según se vaya disponiendo de más información como resultado de la aplicación rutinaria de los métodos descritos en la presente memoria, se pueden usar los valores promedio de población para el nivel de expresión de “control” de los biomarcadores de la presente invención. En otras realizaciones, el nivel de expresión de “control” de los biomarcadores se puede determinar determinando el nivel de expresión del biomarcador respectivo en una muestra sujeto obtenida de un sujeto antes del inicio sospechado del cáncer de mama en el sujeto, a partir de muestras sujeto archivadas, etcétera.

Los niveles de expresión de control de biomarcadores de la invención pueden encontrarse disponibles en bases de datos disponibles públicamente. Adicionalmente, se pueden usar como controles “Universal Reference Total RNA” (Clontech Laboratories) y “Universal Human Reference RNA” (Stratagene) y similares. Por ejemplo, se puede usar qPCR para determinar el nivel de expresión de un biomarcador, y un aumento en el número de ciclos necesarios para detectar la expresión de un biomarcador en una muestra procedente de un sujeto, respecto al número de ciclos necesarios para la detección usando dicho control, es indicativo de un nivel bajo de expresión del biomarcador.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “sujeto” o “paciente” se refiere a animales humanos y no humanos, p.ej., pacientes veterinarios. El término “animal no humano” incluye vertebrados, p.ej., mamíferos, tales como primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perro, gato, caballo, vaca u otra especie de roedor, ovino, canino, felino, equino o bovino. En una realización, el sujeto es un humano.

El término “muestra” tal como se usa en la presente memoria se refiere a células, tejidos o fluidos aislados de un sujeto, así como células, tejidos o fluidos presentes en un sujeto. El término “muestra” incluye cualquier fluido corporal (p.ej., sangre, linfa, fluido quístico, aspirados de pezón, orina y fluidos recolectados de una biopsia (p.ej., biopsia de bulto)), tejido o una células o colección de células de un sujeto, así como cualquier componente de los mismos, tal como una fracción o extracto. En una realización, el tejido o célula ha sido extraído del sujeto. Otras muestras incluyen lágrimas, plasma, suero, fluido cerebroespinal, heces, esputo y extractos celulares. En una realización, la muestra contiene proteína (p.ej., proteínas o péptidos) procedente del sujeto. En otra realización, la muestra contiene ARN (p.ej., moléculas de ARNm) procedente del sujeto o ADN (p.ej., moléculas de ADN genómico) procedentes del sujeto.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “cáncer de mama” se refiere generalmente al crecimiento incontrolado de tejido de mama y, más específicamente, a una afección que se caracteriza por la proliferación anómala rápida de células anormales en una o ambas mamas de un sujeto. Las células anormales a menudo son referidas como células malignas o “células neoplásicas”, que son células transformadas que pueden formar un tumor sólido. El término “tumor” se refiere a una masa anormal o población anormal de células (es decir, dos o más células) que es el resultado de una división celular excesiva o anormal, tanto maligna como benigna, y células pre-cancerosas y cancerosas. Los tumores malignos se distinguen de los crecimientos o tumores benignos en que, además de la proliferación celular incontrolada, pueden invadir los tejidos circundantes y pueden metastatizarse. En el cáncer de mama, las células neoplásicas pueden identificarse en una o ambas mamas solo y no en ningún otro tejido u órgano, en una o ambas mamas y en uno o más tejidos u órganos adyacentes (p.ej., nodo linfático), en un una mama y en uno o más tejidos u órganos no adyacentes a los cuales han metastatizado las células de cáncer de mama.

La eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, pueden usarse para tratar el cáncer de mama, y, por consiguiente, los métodos de la presente invención pueden usarse en el cáncer de mama y en sujetos que padecen cáncer de mama.

En una realización, el cáncer de mama es cáncer de mama negativo de Receptor de Estrógeno (ER), cáncer de mama negativo de Receptor de Progesterona (PR) y/o cáncer de mama negativo de HER-2. Por ejemplo, el cáncer de mama puede ser cáncer de mama negativo de Receptor de Estrógeno (ER) y negativo de Receptor de Progesterona (PR); cáncer de mama negativo de Receptor de Estrógeno (ER) y negativo de HER-2; cáncer de mama negativo de Receptor de Progesterona (PR) y negativo de HER-2; o cáncer de mama negativo de Receptor de Estrógeno (ER), cáncer de mama negativo de Receptor de Progesterona (PR) y cáncer de mama negativo de HER-2 (triple negativo). La determinación del estatus ER, PR y HER-2 se puede realizar usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, el estatus de HER-2 se puede determinar mediante inmunohistoquímica (IHC) y/o amplificación génica mediante hibridación in situ de fluorescencia (FISH), por ejemplo según las guías de la “National Comprehensive Cancer Network” [NCCN].

Por ejemplo, el cáncer de mama puede ser adenocarcinoma, cáncer de mama inflamatorio, cáncer de mama recurrente (p.ej., recurrente localmente) y/o metastásico. En algunas realizaciones, el cáncer de mama es refractario endocrino o refractario a hormona. Los términos “refractario endocrino” y “refractario a hormona” se refieren a un cáncer que es resistente al tratamiento con terapia hormonal para el cáncer de mama, p.ej., inhibidores de aromatasa o tamoxifen. Los cánceres de mama surgen con mayor frecuencia en el recubrimiento de los conductos lácteos de la mama (carcinoma ductal), o en los lóbulos en los que se produce la leche (carcinoma lobular). Por consiguiente, en varias realizaciones de la invención, el cáncer de mama puede ser carcinoma ductal o carcinoma lobular. Las células cancerosas de la(s) mama(s) pueden invadir o metastatizarse a cualquier otro órgano o tejido del cuerpo. Por ejemplo, las células cancerosas a menudo invaden células de nodos linfáticos y/o se metastatizan al hígado, cerebro y/o hueso.

En varias realizaciones de la presente invención, el sujeto puede estar padeciendo cáncer de mama de Estadio I, Estadio II, Estadio III o Estadio IV. El estadio de un cáncer de mama puede clasificarse como un rango de estadios entre Estadio 0 y Estadio IV en base a su tamaño y al grado en el que se ha extendido. La siguiente tabla resume los estadios, que son bien conocidos por los médicos:

En las siguientes subsecciones se describen varios aspectos de la invención con más detalle.

I. Predicción de la capacidad de respuesta a la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) en sujetos con cáncer de mama

En un aspecto, la invención proporciona un método para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama y/o para determinar la sensibilidad de un tumor de mama al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). Los métodos implican la determinación del nivel de expresión de al menos un biomarcador, por ejemplo, evaluando una muestra derivada de un sujeto que padece cáncer de mama. La identificación de niveles bajos de expresión de al menos un biomarcador es indicativa de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) puede usarse para el tratamiento del cáncer de mama y/o que el tumor de mama es sensible al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina).

En los métodos de la invención, se determina el nivel de expresión de al menos un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que, como se ha explicado en la presente memoria, puede comprender determinar el nivel de expresión de uno o más de estos genes (p.ej., ABI3, ANG) usando diversas aproximaciones, tal como determinar en una muestra adecuada la presencia de determinados polimorfismos de ADN o mutaciones nulas, determinando el nivel de ARN expresado a partir de un gen, que incluye un ARNm ejemplificado en la Tabla 1 y/u otros tránscritos a partir del gen, o un(os) producto(s) de proteína de cualquiera de los anteriores.

Tabla 1: Biomarcadores de capacidad de respuesta a eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina)

Cada uno de los números de acceso identificados en la Tabla 1, y sus correspondientes secuencias, se incorporan a la presente memoria a modo de referencia.

En varias realizaciones, se determina el nivel de expresión de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1.

En realizaciones particulares, se usa una firma genética predictiva que comprende una sub-combinación de 2 más biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1. En varias realizaciones, se determina el nivel de expresión de al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, la firma genética predictiva puede incluir al menos 2 biomarcadores, p.ej., DYSF y EDIL3; GNAT1 y ERGIC3; KRT24 y PAPLN; MANSC1 y PDGFB; PCDH1 y PDGFB; o PHOSPHO2 y PSENEN. En otra realización, la firma genética predictiva puede incluir al menos 3 biomarcadores, p.ej., COL7A1, YTHDF1 y ZIC5; CKLF, IL10 y TUBB6; CDC20, CFL1 y TMEM79; HYAL2, NCBP1 y SNX11; o CEP152, NCBP1 y SATB1. En otra realización, la firma genética predictiva puede incluir al menos 4 biomarcadores, p.ej., APBB2, CCL26, PSENEN y SATB1; ANG, JAM3, KLHL17 y PAPLN; ITFG3, MAD2L1BP, NMU y PDGFB; SPTA1, TYROBP, SNX11 y PSENEN; GRAMD4, GNAT1, TMIGD2 y YTHDF1; o GRAMD4, HYAL2, PHOSPHO2 y TUBB6. En otra realización, la firma genética predictiva puede incluir al menos 5 biomarcadores, p.ej., CCL26, CDC20, ERGIC3, EDIL3 y PCDH1; DYSF, NMU, PHOSPHO2, PSENEN y SNX11; APBB2, CKLF, CYP4F3, TUBB6 y YTHDF1; o CEP152, MAD2L1BP, SPTA1, TMEM79 y ZIC5.

En realizaciones particulares, la firma genética predictiva puede incluir 2 o más de los biomarcadores ABI3, ANG, APBB2, CCL26, CDC20, CEP152, CFL1, CKLF, COL7A1, CYP4F3, DYSF, GNAT1, GRAMD4, HYAL2, IL10, ITFG3, JAM3, KLHL17, KRT24, MAD2L1BP, MANSC1, MOBKL1B, NCBP1, NMU, PCDH1, PHOSPHO2, SPTA1, TMIGD2, TYROBP, ZIC5, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 e YTHDF1, p.ej., ABI3 y ANG; APBB2 y CCL26; GNAT1 y GRAMD4; IL10 e ITFG3; MACSC1 y MOBKL1B; NMU y PCDH1; o TYROBP y ZIC5. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 3 de los biomarcadores enumerados previamente, p.ej., ABI3, ANG y APBB2; CCL26, CKLF y COL7A1; DYSF, GNAT1 y HYAL2; JAM3, KLHL17 y KRT24; NCBP1, NMU y PCDH1; SPTA1, TMIGD2 y TYROBP; o ZIC5, MAD2L1BP y CDC20. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 4 de los biomarcadores enumerados previamente, p.ej., ABI3, ANG, APBB2 y CCL26; CEP152, CFL1, CKLF y COL7A1; KRT24, MANSC1, MOBKL1B y SPTA1; TYROBP, TMIGD2, PHOSPHO2 y NMU; ABI3, GNAT1, KLHL17 y SPTA1; o CEP152, HYAL2, PCDH1 y TMIGD2. En otras realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 5 de los biomarcadores enumerados previamente, p.ej., CKLF, COL7A1, GRAMD4, JAM3 y PCDH1; APBB2, CEP152, DYSF, IL10 y TYROBP; CYP4F3, HYAL2, ITFG3, KLHL17 y KRT24; NCBP1, SPTA1, TMIGD2, IL10 y JAM3; o CCL26, PHOSPHO2, SPTA1, TMIGD2 y ZIC5.

En otras realizaciones, la firma genética predictiva puede incluir 2 o más de los biomarcadores ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 o Yt Hd F1, o cualquier sub-combinación de los mismos, p.ej., ERGIC3 y PDGFB; ERGIC3 y PSENEN; ERGIC3 y SATB1; ERGIC3 y SNX11; ERGIC3 y TMEM79; ERGIC3 e YTHDF1; PDGFB y PSENEN; PDGFB y SATB1; PDGFB y SNX11; PDGFB y TMEM79; PDGFB e YTHDF1; PSENEN y SATB1; PSENEN y SNX11; PSENEN y TMEM79; PSENEN e YTHDF1; SATB1 y SNX11; SATB1 y TMEM79; SATB1 e YTHDF1; SNX11 y TMEM79; SNX11 e YTHDF1; o TMEM79 e YTHDF1. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 3 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB y PSENEN; SATB1, SNX11 y TMEM79; SNX11, TMEM79 e YTHDF1; o ERGIC3, PDGFB y SATB1. En realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 4 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB, PSENEN y SATB1; SNX11, TMEM79, YTHDF1 y ERGIC3; o ERGIC3, PDGFB, PSENEN e YTHDF1. En realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 5 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1 y SNX11; ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1 y TMEM79; o Ps En EN, sAt B1, SNX11, TMEM79 e YTHDF1. En otras realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 6 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11 y TMEM79; PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 e YTHDF1; o ERGIC3, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 e YTHDF1. En otra realización adicional, la firma genética predictiva incluye 7 biomarcadores, por ejemplo, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79 e YTHDF1.

En varias realizaciones, el biomarcador no es uno o más de SPTA1, PAPLN, PCDH1, TMIGD2 y/o KRT24. En una realización particular, el biomarcador no es SPTA1, PAPLN, PCDH1, TMIGD2 y KRT24. En una realización, el biomarcador no es SPTA1. En otra realización, el biomarcador no es PAPLN. En otra realización, el biomarcador no es PCDH1. En una realización alternativa, el biomarcador no es TMIGD2. En otra realización adicional, el biomarcador no es KRT24.

En realizaciones particulares, la firma genética predictiva puede incluir 2 o más de los biomarcadores ABI3, ANG, APBB2, CCL26, CDC20, CEP152, CFL1, CKLF, COL7A1, CYP4F3, DYSF, GNAT1, GRAMD4, HYAL2, IL10, ITFG3, JAM3, KLHL17, MAD2L1BP, MANSC1, MOBKL1B, NCBP1, NMU, PHOSPHO2, TYROBP, ZIC5, ERGIC3, PDGFB, PSENEN, SATB1, SNX11, TMEM79, YTHDF1, EDIL3 y TUBB6, p.ej., ABI3 y ANG; GRAMD4 y HYAL2; NMU y PHOSPHO2; ZIC5 y PSENEN; o SNX11 y MOBKL1B. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 3 de los biomarcadores enumerados previamente, p.ej., APBB2, CDC20 y CKLF; COL7A1, DYSF y GNAT1; NCBP1, SATB1 y EDIL3; PSENEN, DYSF y GNAT1; MANSC1, ZIC5 y CFL1; o CKLF, GRAMD4 y NMU. En otras realizaciones, la firma genética predictiva incluye al menos 4 de los biomarcadores enumerados previamente, p.ej., ANG, CCL26, CEP152 y JAM3; APBB2, CYP4F3, ITFG3 y TYROBP; CYP4F3, MANSC1, PDGFB y YTHDF1; TUBB6, DYSF, PHOSPHO2 y CDC20; o CKLF, KLHL17, HYAL2 y ZIC5. En otras realizaciones adicionales, la firma genética predictiva incluye al menos 5 de los biomarcadores enumerados previamente, p.ej., IL10, CEP152, COL7A1, TYROBP y ERGIC3; TMEM79, SNX11, PSENEN, GNAT1 y GRAMD4; JAM3, SNX11, KLHL17, MOBKL1B y ERGIC3; o NMU, PHOSPHO2, PDGFB, CFL1 y ANG.

Cualquier método analítico adecuado, puede ser utilizado en los métodos de la invención para determinar (directa o indirectamente) el nivel de expresión de un biomarcador en una muestra. En algunas realizaciones, se observa una diferencia entre el nivel de expresión de un biomarcador, en comparación con el nivel de expresión de control del biomarcador. En una realización, la diferencia es superior al límite de detección del método para determinar el nivel de expresión del biomarcador. En realizaciones adicionales, la diferencia es superior o igual al error estándar del método de determinación, y preferiblemente la diferencia es aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 100 veces, aproximadamente 500 veces o aproximadamente 1000 veces superior al error estándar del método de determinación. En algunas realizaciones, el nivel de expresión del biomarcador en una muestra en comparación con un nivel de expresión de control se determina usando estadística descriptiva paramétrica o no paramétrica, comparaciones, análisis de regresión, etcétera.

En algunas realizaciones, se detecta una diferencia en el nivel de expresión del biomarcador en la muestra derivada del sujeto con respecto al control, y la diferencia es aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 90% inferior al nivel de expresión del biomarcador en la muestra de control.

El nivel de expresión de un biomarcador, por ejemplo, como los establecidos en la Tabla 1, en una muestra obtenida de un sujeto se puede evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de técnicas y métodos, que transforman el biomarcador de la muestra en un grupo funcional que puede ser detectado y/o cuantificado. Los ejemplos no limitativos de dichos métodos incluyen analizar la muestra usando métodos inmunológicos para la detección de proteínas, métodos de purificación de proteínas, ensayos de función o actividad de proteínas, métodos de hibridación de ácido nucleico, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ácido nucleico, inmunotinción, transferencia Western, transferencia Northern, microscopía electrónica, espectrometría de masas, p.ej., MALDI-TOF y SELDI-TOF, inmunoprecipitaciones, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISAs), p.ej., ELISA amplificado, ensayos cuantitativos de base sanguínea, p.ej., ELISA de suero, ensayos cuantitativos de base orina, citometría de flujo, hibridaciones Southern, análisis de conjunto, y similares, y combinaciones o sub-combinaciones de los mismos.

En una realización, el nivel de expresión del biomarcador en una muestra se determina detectando un polinucleótido transcrito, o una porción del mismo, p.ej., ARNm, o ADNc, del gen biomarcador. El ARN se puede extraer de células usando técnicas de extracción de ARN que incluyen, por ejemplo, el uso de extracción ácida de fenol/isotiocianato de guanidina (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparación de ARN RNeasy (Qiagen) o PAXgene (PreAnalytix, Suiza). Los formatos de ensayo típicos que usan hibridación de ácido ribonucleico incluyen ensayos run-on nucleares, RT-PCR, análisis PCR cuantitativo, ensayos de protección de ARNasa (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12: 7035), transferencia Northern e hibridación in situ. Otros sistemas adecuados para análisis de muestras de ARNm incluyen análisis de microconjuntos (p.ej., usando el sistema de microconjuntos de Affymetrix o la Tecnología BeadArray de Illumina).

En una realización, el nivel de expresión del biomarcador se determina usando una sonda de ácido nucleico. El término “sonda”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier molécula que es capaz de unirse selectivamente a un biomarcador específico. Las sondas pueden ser sintetizadas por un especialista en la técnica, o derivar de preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas pueden diseñarse específicamente para ser marcadas, por adición o incorporación de una etiqueta. Los ejemplos de moléculas que pueden utilizarse como sondas incluyen, aunque sin limitación, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos, y moléculas orgánicas.

Tal como se ha indicado anteriormente, se puede usar ARNm aislado en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, aunque sin limitación, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de polimerasa (PCR) y conjuntos de sondas. Un método para la determinación de los niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse con el ARNm biomarcador. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos aproximadamente 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 250 o aproximadamente 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente en las condiciones de hibridación apropiadas con el ADN genómico biomarcador. En una realización particular la sonda se unirá al ADN genómico biomarcador en condiciones severas. Dichas condiciones severas, por ejemplo, hibridación en 6X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 50-65°C, son conocidas por los especialistas en la técnica y pueden encontrarse en “Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), secciones 2, 4 y 6. Otras condiciones severas adicionales pueden encontrarse en “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), capítulos 7, 9 y 11.

En una realización, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, haciendo correr el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En una realización alternativa, la(s) sonda(s) se inmoviliza(n) sobre una superficie sólida, por ejemplo, en un conjunto chip génico Affymetrix, y la(s) sonda(s) se pone(n) en contacto con ARNm. El especialista en la técnica puede adaptar fácilmente los métodos de detección de ARNm para uso en la determinación del nivel del ARNm biomarcador.

El nivel de expresión del biomarcador en una muestra también se puede determinar usando métodos que implican el uso de amplificación de ácido nucleico y/o transcriptasa inversa (para preparar ADNc) de por ejemplo ARNm en la muestra, p.ej., mediante RT-PCR (la realización experimental establecida en Mullis, 1987, Patente de EE.UU. N° 4.683.202), reacción en cadena de ligasa (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193), replicación de secuencia auto-sostenida (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi et al (1988) Bio/Technology 6: 1197), replicación de círculo rotatorio (Lizardi et al, Patente de EE.UU. n° 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas. Estas estrategias son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en cantidades muy pequeñas. En aspectos particulares de la invención, el nivel de expresión del biomarcador se determina mediante RT-PCR fluorogénica cuantitativa (p.ej., el sistema TaqMan™). Dichos métodos utilizan habitualmente pares de cebadores de oligonucleótido que son específicos para el biomarcador. Los métodos para diseñar cebadores de oligonucleótido específicos para una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica.

Los niveles de expresión del ARNm biomarcador pueden monitorizarse usando una transferencia a membrana (tal como las usadas en análisis de hibridación tales como Northern, Southern, dot, y similares), o micropocillos, tubos de muestra, geles, perlas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos ligados). Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. n° 5.770.722, 5.874.219, 5.744.305, 5.677.195 y 5.445.934.

La determinación del nivel de expresión de biomarcador puede comprender también el uso de sondas de ácido nucleico en disolución.

En una realización de la invención, se usan microconjuntos para detectar el nivel de expresión de un biomarcador. Los microconjuntos son particularmente adecuados para este propósito debido a la reproducibilidad entre experimentos diferentes. Los microconjuntos de ADN proporcionan un método para la medida simultánea de los niveles de expresión de grandes números de genes. Cada conjunto consiste en un patrón reproducible de sondas de captura unidas a un soporte sólido. El ARN o ADN marcado se hibridan a sondas complementarias del conjunto y a continuación es detectado mediante escaneo láser. Se determinan las intensidades de hibridación de cada sonda del conjunto y se convierten a un valor cuantitativo que representa niveles de expresión génica relativos. Véase, p.ej., las Patentes de EE.UU. n° 6.040.138, 5.800.992 y 6.020.135, 6.033.860 y 6.334.316. Los conjuntos de oligonucleótidos de alta densidad son particularmente útiles para determinar el perfil de expresión génica correspondiente a un gran número de ARNs en una muestra.

La expresión de un biomarcador también puede determinarse a nivel de proteína, usando un reactivo de detección que detecta el producto proteínico codificado por el ARNm del biomarcador, directa o indirectamente. Por ejemplo, si se dispone de un reactivo de anticuerpo que se une específicamente a un producto proteínico de biomarcador a detectar, entonces dicho reactivo de anticuerpo puede usarse para detectar la expresión del biomarcador en una muestra procedente del sujeto, usando técnicas tales como inmunohistoquímica, ELISA, análisis FACS y similares.

Otros métodos conocidos para detectar el biomarcador a nivel de proteína incluyen métodos tales como electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión, y similares, o varios métodos inmunológicos tales como reacciones de precipitación de fluido o de gel, inmunodifusión (sencilla o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISAs), ensayos inmunofluorescentes, y análisis de transferencia Western.

Las proteínas procedentes de las muestras pueden aislarse usando una variedad de técnicas, que incluyen aquellas bien conocidas por el especialista en la técnica. Los métodos de aislamiento de proteínas empleados pueden ser, por ejemplo, los descritos en Harlow y Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

En una realización, los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, se usan en métodos tales como análisis Western o técnicas de inmunofluorescencia para detectar las proteínas expresadas. Los anticuerpos para determinar la expresión de los biomarcadores usados en la invención se encuentran disponibles comercialmente. Por ejemplo, los anticuerpos específicos de ERGIC-3 se encuentran disponibles comercialmente en Santa Cruz Biotechnology, Inc. (ERGIC-3 (P-16) Antibody and ERGIC-3 (Y-23) Antibody) y en Sigma Aldrich (HPA015968, AV47209, HPA015242, SAB4502151). Los anticuerpos específicos de PDGFB se encuentran disponibles comercialmente en Santa Cruz Biotechnology, Inc. (p.ej., PDGF-B (C-5) Antibody y PDGF-B (H-55) Antibody) y en Sigma Aldrich (p.ej., HPA011972, SAB2101755 y Sa B2900226). Los anticuerpos específicos de PSENEN se encuentran disponibles comercialmente en Origene (p.ej., n° de catálogo TA306367) y en Sigma Aldrich (p.ej., PRS3981, WH0055851M1, PRS3979 y P5622). Adicionalmente a modo de ejemplo, los anticuerpos de SATB1 se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, en Abcam (n° de catálogo ab49061, ab92307 y ab70004), Abnova Corporation (n° de catálogo PAB13379), y Aviva Systems Biology (n° de catálogo ARP33362_P050). Los anticuerpos de SNX11 se encuentran disponibles comercialmente en Abcam (n° de catálogo ab4128, ab67578, ab76816 y ab76762) y en Abnova Corporation (n° de catálogo PAB6362 y H00029916-B01). Los anticuerpos de TMEM79 se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, en Abcam (n° de catálogo ab81539) y en Sigma Aldrich (n° de catálogo SAB2102475). Finalmente, los anticuerpos de YTHDF1 se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, en Abnova Corporation (n° de catálogo PAB17446), Aviva Systems Biology (n° de catálogo ARP57032_P050) y Santa Cruz Biotechnology (n° de catálogo sc-86026).

Generalmente es preferible inmovilizar el anticuerpo o las proteínas sobre un soporte sólido para los ensayos de transferencia Western y para las técnicas de inmunofluorescencia. Los soportes o vehículos de fase sólida adecuados incluyen cualquier soporte capaz de unirse a un antígeno o a un anticuerpo. Los soportes y vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros, y magnetita.

El especialista en la técnica conocerá otros vehículos adecuados para unir el anticuerpo o antígeno, y será capaz de adaptar dicho soporte para uso con la presente invención. Por ejemplo, la proteína aislada de las células se puede hacer correr en una electroforesis de gel de poliacrilamida e inmovilizarse sobre un soporte de fase sólida tal como nitrocelulosa. A continuación, el soporte puede ser lavado con tampones adecuados, seguido de tratamiento con el anticuerpo marcado de forma detectable. El soporte de fase sólida se puede lavar entonces con el tampón una segunda vez para eliminar el anticuerpo no ligado. La cantidad de marca unida sobre el soporte sólido puede detectarse a continuación empleando medios convencionales. Los medios para detectar proteínas usando técnicas electroforéticas son bien conocidos por los especialistas en la técnica (ver de forma general, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).

Otros métodos estándar incluyen técnicas de inmunoensayo que son bien conocidas por el especialista en la técnica y pueden encontrarse en “Principles And Practice Of Immunoassay”, 2nd Edition, Price and Newman, Eds., MacMillan (1997) y en “Antibodies, A Laboratory Manual”, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory”, Capítulo 9 (1988).

Los anticuerpos usados en inmunoensayos para determinar el nivel de expresión del biomarcador, pueden marcarse con una etiqueta detectable. El término “marcar”, con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo de la sonda o anticuerpo por incorporación de una etiqueta (p.ej., un átomo radiactivo), acoplamiento (es decir, unión física) de una sustancia detectable por la sonda o anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que esté marcado directamente. Los ejemplos de marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y el marcado de extremo de una sonda de ADN con biotina, de tal modo que pueda ser detectada con estreptavidina marcada fluorescentemente.

En una realización, el anticuerpo está marcado, p.ej., un anticuerpo radio-marcado, marcado con cromóforo, marcado con fluoróforo, o marcado con enzima. En otra realización, se usa un derivado de anticuerpo (p.ej., un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o ligando de un par proteína-ligando (p.ej., biotina-estreptavidina), o un fragmento de anticuerpo (p.ej., un anticuerpo de cadena sencilla, o un dominio hipervariable de anticuerpo aislado) que se une específicamente con el biomarcador.

En una realización de la invención, se usan métodos proteómicos, p.ej., espectrometría de masas. La espectrometría de masas es una técnica analítica que consiste en ionizar compuestos químicos para generar moléculas cargadas (o fragmentos de las mismas) y medir sus ratios masa-a-carga. En un procedimiento de espectrometría de masas típico, se obtiene una muestra de un sujeto, se carga en la espectrometría de masas, y sus componentes (p.ej., el biomarcador) son ionizados mediante diferentes métodos (p.ej., impactándolos con un haz de electrones), dando como resultado la formación de partículas cargadas (iones). La ratio masa-a-carga de las partículas se calcula entonces a partir del movimiento de los iones según avanzan a través de campos electromagnéticos.

Por ejemplo, se puede usar la espectrometría de masas de tiempo-de-vuelo de desorción/ionización por láser asociado a matriz (MALDI-TOF MS) o la espectrometría de masas de tiempo-de-vuelo de desorción/ionización por láser potenciado superficialmente (SELDI-TOF MS) que implica la aplicación de una muestra biológica, tal como suero, a un chip de unión a proteína (Wright, G.L., Jr., et al (2002) Expert Rev Mol Diagn 2: 549; Li, J. et al (2002) Clin Chem 48: 1296; Laronga, C., et al (2003) Dis biomarkers 19: 229; Petricoin, E.F., et al (2002) 359: 572; Adam, B.L., et al (2002) Cancer Res 62: 3609; Tolson, J., et al (2004) Lab Invest 84: 845; Xiao, Z., et al (2001) Cancer Res 61: 6029) para determinar el nivel de expresión de un biomarcador a nivel de proteína.

Adicionalmente, las técnicas in vivo para la determinación del nivel de expresión del biomarcador incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado dirigido contra el biomarcador, que se une y transforma el biomarcador en una molécula detectable. Como se ha discutido anteriormente, la presencia, nivel, o incluso la localización del biomarcador detectable en un sujeto puede detectarse mediante técnicas estándar de imagen.

En general, cuando se va a detectar una diferencia en el nivel de expresión de un biomarcador y el control, es preferible que la diferencia entre el nivel de expresión del biomarcador en una muestra de un sujeto que padece cáncer de mama y que está siendo tratado con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), o que está siendo considerado para tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), y la cantidad del biomarcador en una muestra de control, sea lo más grande posible. Aunque dicha diferencia puede ser tan pequeña como el límite de detección del método de determinación del nivel de expresión, se prefiere que la diferencia sea mayor que el límite de detección del método o mayor que el error estándar del método de evaluación, y preferiblemente una diferencia de al menos aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 100 veces, aproximadamente 500 veces, aproximadamente 1000 veces mayor que el error estándar del método de evaluación.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar a un sujeto que padece cáncer de mama determinando y/o identificando si el sujeto porta la menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene un polimorfismo, por ejemplo, una mutación, que da como resultado una expresión reducida y/o una función reducida de la proteína codificada, en donde la presencia de un polimorfismo en al menos un gen es indicativa de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, será efectiva para el tratamiento de un sujeto. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) será efectiva para tratar un sujeto que padece cáncer de mama ensayando una muestra derivada del sujeto para determinar si el sujeto porta al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecidos en la Tabla 1, que contiene un polimorfismo, por ejemplo, una mutación, que da como resultado una expresión reducida y/o una función reducida de la proteína codificada, en donde la presencia del polimorfismo en al menos un gen en dicha muestra es indicativa de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar dicho sujeto. En un aspecto adicional, se proporciona un método para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, será efectiva para el tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama, comprendiendo el método la determinación de la presencia de un polimorfismo que da como resultado una expresión reducida y/o una función reducida en un gen que codifica un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 en una muestra derivada de dicho sujeto, y prediciendo que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar dicho sujeto en base a la presencia del polimorfismo.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para determinar la sensibilidad de un tumor de mama al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, determinando y/o identificando si dicho tumor contiene un polimorfismo en al menos un gen que da resultado a una expresión reducida y/o una función reducida de la proteína codificada, en donde el gen se selecciona del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1. La identificación y/o la determinación de que el tumor contiene dicho polimorfismo son indicativas de la sensibilidad de dicho tumor al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

En otro aspecto adicional, la presente invención está dirigida a eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para uso en un método para tratar un sujeto que padece cáncer de mama, comprendiendo el método identificar si una muestra derivada de dicho sujeto presenta al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene un polimorfismo que resulta en una expresión reducida y/o una función reducida de la proteína codificada y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) al sujeto cuando se identifica el polimorfismo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama determinando y/o identificando si el sujeto porta al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene una mutación nula, en donde la presencia de una mutación nula en al menos un gen es indicativa de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, será efectiva para el tratamiento del sujeto. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama ensayando una muestra derivada del sujeto para determinar si el sujeto porta al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene una mutación nula, en donde la presencia de una mutación nula en al menos un gen en dicha muestra es indicativa de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, será efectiva en el tratamiento del sujeto. En un aspecto adicional, se proporciona un método para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama, comprendiendo el método la determinación de la presencia de una mutación nula en un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 en una muestra derivada de dicho sujeto, y prediciendo que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar dicho sujeto en base a la presencia de dicha mutación nula.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para determinar la sensibilidad de un tumor de mama al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, determinando y/o identificando si dicho tumor contiene una mutación nula en al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1. La identificación y/o determinación de que el tumor contiene una mutación nula son indicativas de la sensibilidad de dicho tumor al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. Se describen métodos para tratar un sujeto que padece cáncer de mama con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, identificando si una muestra derivada de dicho sujeto tiene al menos un gen, seleccionado del grupo de biomarcadores establecido en la Tabla 1, que contiene una mutación nula, y administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) al sujeto cuando se identifica una mutación nula.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “mutación nula” se refiere a una mutación en una secuencia de ADN genómico que hace que el producto del gen esté no funcional o ampliamente ausente. Dichas mutaciones pueden producirse en las regiones de codificación y/o de regulación del gen, y pueden ser cambios de residuos individuales, o inserciones o eliminaciones de regiones de ácidos nucleicos. Dichas mutaciones también pueden producirse en las regiones de codificación y/o regulación de otros genes que pueden regular o controlar el gen y/o el producto del gen de tal modo que hagan que el producto génico esté no funcional o ampliamente ausente. La mutación nula puede ser una eliminación del gen nativo o de una porción del mismo. Estas alteraciones o modificaciones de secuencia pueden incluir inserciones, mutaciones contrasentido, mutaciones de cambio estructural, eliminaciones o sustituciones, o reemplazamientos de secuencia de ADN, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, la mutación nula puede dar como resultado la inserción de un codón de parada prematura. La mutación nula da como resultado la desactivación funcional del producto génico, por ejemplo, inhibiendo su producción parcial o completamente; alterando, inhibiendo o acortando la traducción del producto proteínico, o dando como resultado una proteína no funcional. La mutación nula puede ser una mutación pre-existente en el sujeto o una mutación que surge en un tumor. La presencia de una mutación nula en un biomarcador puede venir indicada por la carencia de expresión detectable del biomarcador. Sin embargo, la presencia de una mutación nula puede determinarse mediante otros métodos. Por ejemplo, en dichas realizaciones, se puede secuenciar una muestra del ADN del sujeto para identificar la presencia de una mutación nula. Se puede usar cualquiera de los métodos bien conocidos para secuenciamiento de los biomarcadores en los métodos de la invención, tal como los métodos descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n° 5.075.216, Engelke et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 544-548 y Wong et al (1987) Nature 330, 384-386; Maxim y Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 560; o Sanger (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463. Adicionalmente, se puede utilizar cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciamiento automatizados, véase, p.ej., Naeve, C.W. et al (1995) Biotechniques 19: 448, incluyendo el secuenciamiento mediante espectrometría de masas (véase, p.ej., la Publicación PCT Internacional n° WO 94/16101; Cohen et al (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-162; y Griffin et al (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159.

La determinación de la presencia o ausencia de una mutación nula en la muestra también se puede llevar a cabo usando diversas técnicas tales como la reacción de amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR), el análisis de PCR de transcriptasa inversa, el análisis de polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP), la detección de ruptura de discordancia, el análisis de heterodúplex, el análisis de transferencia Southern, el análisis de transferencia Western, el secuenciamiento de ácido desoxirribonucleico, el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, el análisis de haplotipo, el serotipado, y combinaciones o sub-combinaciones de los mismos.

Se puede usar cualquier muestra adecuada obtenida de un sujeto que padece cáncer de mama para determinar el nivel de expresión, que incluye una falta de expresión, del biomarcador, por ejemplo, un biomarcador proporcionado en la Tabla 1. Por ejemplo, la muestra puede ser cualquier fluido o componente del mismo, tal como una fracción o extracto, p.ej., sangre, plasma, linfa, fluido quístico, orina, aspirados de pezón, o fluidos recogidos en una biopsia (p.ej., biopsia de bulto), obtenido del sujeto. En una situación típica, el fluido puede ser sangre, o un componente de la misma, obtenida del sujeto, que incluye sangre entera o componentes de la misma, incluyendo, plasma, suero y células sanguíneas, tal como glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. La muestra también puede ser cualquier tejido o fragmento o componente del mismo, p.ej., tejido de mama, tejido conectivo, tejido linfático o tejido muscular, obtenido del sujeto.

Las técnicas o métodos para obtener muestras de un sujeto son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, obtener muestras con un frotis de boca o con un lavado de boca; extrayendo sangre; u obteniendo una biopsia. El aislamiento de los componentes de muestras de fluido o de tejido (p.ej., células o ARN o ADN) se puede llevar a cabo usando una variedad de técnicas.

La muestra del cáncer se puede obtener mediante biopsia del cáncer del paciente. Se puede obtener más de una muestra del tumor del paciente a fin de adquirir una muestra representativa de células para un estudio adicional. Por ejemplo, un paciente con cáncer de mama puede tener una biopsia de aguja para obtener una muestra de células cancerosas. Se pueden usar varias biopsias del tumor para obtener una muestra de células cancerosas. En otras realizaciones, la muestra puede haberse obtenido por escisión quirúrgica del tumor. En este caso, se pueden tomar una o más muestras del tumor escindido para análisis usando los métodos de la invención.

Después de obtener la muestra, puede ser procesada adicionalmente. Las células cancerosas pueden ser cultivadas, lavadas, o seleccionadas de otro modo para eliminar el tejido normal. Las células puede ser tripsinizadas para eliminar las células de la muestra tumoral. Las células pueden clasificarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) u otra técnica de clasificación celular. Las células pueden cultivarse para obtener un mayor número de células para estudio. En determinados casos, las células pueden ser inmortalizadas. Para algunas aplicaciones, las células pueden ser congeladas o las células pueden embeberse en parafina.

II. Tratamiento con eribulina, análogos de la misma, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma (p.ej., mesilato de eribulina)

Dada la observación de que los niveles de expresión de determinados biomarcadores, por ejemplo. los establecidos en la Tabla 1. en un sujeto que padece cáncer de mama influyen en la capacidad de respuesta del sujeto a la eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). un especialista en la técnica puede seleccionar un régimen de tratamiento apropiado para el sujeto en base a los niveles de expresión de los biomarcadores en el sujeto. Por consiguiente. la presente invención proporciona eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. para uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama (i) identificando un sujeto que padece cáncer de mama en el que al menos un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1 presenta un nivel bajo de expresión y (ii) administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). al sujeto. En otro aspecto. la presente descripción proporciona métodos para tratar un sujeto que presenta cáncer de mama (i) evaluando una muestra derivada del sujeto para determinar el nivel de expresión de al menos un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 y (ii) administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) al sujeto cuando se detecta en la muestra un nivel bajo de expresión del al menos un biomarcador.

En varias realizaciones. el sujeto puede haber sido tratado previamente con eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). En otras realizaciones. el sujeto puede estar bajo consideración para tratamiento con eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). por vez primera. Se determina el nivel de expresión de uno o más. p.ej., al menos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9 o 10. biomarcadores identificados en la Tabla 1. Si se determina que el nivel de expresión de al menos un biomarcador (p.ej., 1.2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9 o 10 biomarcadores) es un nivel de expresión bajo. es probable que el tratamiento con eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). sea eficaz. Sin embargo. no es necesario que todos los biomarcadores evaluados presenten un nivel bajo de expresión en comparación con el control respectivo. Por ejemplo. aunque determinados biomarcadores pueden estar presentes en niveles normales o elevados de expresión. el tratamiento con eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). puede estar indicado cuando. por ejemplo. hay presente un nivel bajo de expresión correspondiente a al menos 1. al menos 2. al menos 3. al menos 4. al menos 5. al menos 6. al menos 7. al menos 8. al menos 9 o al menos 10 biomarcadores.

Cuando se observa un nivel de expresión bajo de uno o más de los biomarcadores de la Tabla 1 (p.ej., debido a la presencia de una mutación nula en el gen biomarcador) en una muestra derivada de un sujeto que padece cáncer de mama. el sujeto puede ser tratado con eribulina. que tiene la siguiente estructura. con una sal farmacéuticamente aceptable de eribulina. o con un análogo de eribulina o farmacéuticamente aceptable de la misma.

En algunas realizaciones. se administra al sujeto una sal farmacéuticamente aceptable de eribulina. tal como mesilato de eribulina.

El régimen de tratamiento de eribulina. un análogo de la misma. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina). que se selecciona típicamente incluye al menos uno de los siguientes parámetros y más típicamente incluye muchos o todos los siguientes parámetros: la dosis. la formulación. la ruta de administración y/o la frecuencia de administración. La selección de los parámetros particulares del régimen de tratamiento puede basarse en parámetros de tratamiento conocidos para la eribulina establecidos previamente en la técnica. tal como los descritos en los protocolos de dosis y administración establecidos en la marca aprobada por la FDA HALAVEN®. Por ejemplo. el mesilato de eribulina se puede administrar intravenosamente en los días 1 y 8 de un ciclo de 21 días. por ejemplo en una dosis de 1.4 mg/m2, o si está indicada una reducción de la dosis (p.ej., por afección hepática o renal). a una dosis de 0.7 mg/m2 o 1.1 mg/m2. Se pueden realizar diversas modificaciones de dosis. formulación. ruta de administración y/o frecuencia de administración en base a diversos factores. que incluyen. por ejemplo. la enfermedad.

edad, sexo y peso del paciente, así como la gravedad o estadio del cáncer (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 6.653.341 y la Patente de EE.UU. n° 6.469.182).

Tal como se usa en la presente memoria, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” significa una cantidad de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) tal como se ha descrito en la presente memoria, que es capaz de tratar el cáncer de mama. La dosis de un compuesto a administrar será determinada, por supuesto, a la luz de las circunstancias particulares que rodeen el caso, incluyendo, por ejemplo, el compuesto administrado, la ruta de administración, la condición del paciente, y la afección patológica que esté siendo tratada, por ejemplo, el estadio del cáncer de mama.

Para administración a un sujeto, la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), se formula típicamente en una composición farmacéutica que comprende eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones terapéuticas típicamente deberían ser estériles y adecuadamente estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las composiciones farmacéuticas también pueden administrarse en una terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes, tal como los agentes establecidos más adelante (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 6.214.865 y la Patente de EE.UU. n° 6.653.341).

Tal como se usa en la presente memoria, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración parenteral (p.ej., intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal) (p.ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo puede estar recubierto de un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables, como se ha definido anteriormente.

Existen numerosos tipos de estrategias anticancerígenas que pueden usarse en combinación con la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina) para uso en el tratamiento, según la invención. Éstos incluyen, por ejemplo, el tratamiento con agentes quimioterapéuticos, agentes biológicos (p.ej., agentes hormonales, citocinas (tal como interleucinas, interferonas, factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF), y factor estimulante de colonia de granulocito-macrófagos (GM-CSF)), quimioquinas, antígenos de vacuna, y anticuerpos), agentes anti-angiogénicos (p.ej., angiostatina y endostatina), radiación, y cirugía, como se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. n° 6.653.341 B1 y en la Publicación de EE.UU. n° 2006/0104984 A1.

La eribulina para uso en la invención puede emplear estas estrategias para tratar los mismos tipos de cánceres para los que ya es conocido su uso en la técnica, así como otros, como pueden determinar los especialistas en la técnica. Asimismo, dichas estrategias pueden llevarse a cabo según los parámetros (p.ej., regímenes y dosis) que son similares a los conocidos en la técnica para su uso. Sin embargo, como es conocido en la técnica, puede ser deseable ajustar alguno de dichos parámetros, debido al uso adicional de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), con estas estrategias. Por ejemplo, si un fármaco se administra normalmente como agente terapéutico único, cuando se combina con eribulina puede ser deseable reducir la dosis del fármaco, como pueden determinar los especialistas en esta técnica. Los ejemplos de los métodos y de las composiciones que pueden usarse en dichos métodos se proporcionan más adelante.

Fármacos quimioterapéuticos de diferentes tipos que incluyen, por ejemplo, antimetabolitos, antibióticos, agentes alquilantes, alcaloides vegetales, agentes hormonales, anticoagulantes, antitrombóticos, y otros productos naturales, entre otros, pueden usarse en combinación con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. Los ejemplos específicos no limitativos de dichas clases de fármacos, así como los cánceres que pueden ser tratados para su uso, son los siguientes.

En la técnica se conocen numerosas estrategias para administrar fármacos anti-cancerígenos, y se pueden adaptar fácilmente. En el caso de que se tenga que administrar uno o más fármacos en combinación con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), por ejemplo, los fármacos se pueden administrar juntos, en una única composición, o por separado, como parte de un régimen de tratamiento completo. Para administración sistémica, los fármacos se pueden administrar, por ejemplo, mediante infusión intravenosa (continua o en bolo). El calendario y la dosificación apropiados para dicha administración pueden ser determinados fácilmente por los especialistas en esta técnica en base a, por ejemplo, estudios preclínicos en animales y estudios clínicos (p.ej., estudios de fase I) en humanos.

Muchos regímenes usados para administrar fármacos quimioterapéuticos implican, por ejemplo, la administración intravenosa de un fármaco (o fármaco) seguida de la repetición de dicho tratamiento tras un periodo (p.ej., 1-4 semanas) durante el cual el paciente se recupera de cualquier efecto adverso del tratamiento. Puede ser deseable usar ambos fármacos en cada administración o, alternativamente, hacer que algunos (o todos) de los tratamientos incluyan solo un fármaco (o un subconjunto de fármacos).

Uso de los kits de la invención

La invención también proporciona composiciones y el uso de un kit para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama. Estos kits incluyen reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos uno, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1, e instrucciones de uso del kit para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama.

Los kits pueden comprender opcionalmente componentes adicionales útiles para llevar a cabo los métodos descritos. A modo de ejemplo, los kits pueden comprender reactivos para obtener una muestra biológica a partir de un sujeto, una muestra de control, y/o eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina).

En una realización, los reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un biomarcador en una muestra biológica procedente del sujeto comprenden una preparación de ácido nucleico suficiente para detectar la expresión de un ácido nucleico, p.ej., ARNm, que codifica el biomarcador. Esta preparación de ácido nucleico incluye al menos una, y puede incluir más de una, sonda de ácido nucleico o cebador, cuya(s) secuencias se diseña(n) de tal modo que la preparación de ácido nucleico puede detectar la expresión de ácido nucleico, p.ej., ARNm, que codifica el biomarcador en la muestra procedente del sujeto. Una preparación de ácido nucleico preferida incluye dos o más cebadores de PCR que permiten la amplificación de PCR de un segmento del ARNm que codifica el biomarcador de interés. En otras realizaciones, el kit incluye una preparación de ácido nucleico para cada uno de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biomarcadores proporcionados en la Tabla 1.

Alternativamente, los reactivos para detectar los niveles de expresión en el sujeto de uno o más biomarcadores predictivos de la capacidad de respuesta a eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), puede comprender un reactivo que detecta el producto génico del ácido nucleico que codifica el(los) biomarcador(es) de interés lo suficiente para distinguirlo de otros productos génicos en una muestra del sujeto. Un ejemplo no limitativo de dicho reactivo es una preparación de anticuerpo monoclonal (que comprende uno o más anticuerpos monoclonales) suficiente para detectar la expresión proteínica de al menos un biomarcador en una muestra del sujeto, tal como una muestra de células mononucleares sanguíneas periféricas.

Los medios para determinar el nivel de expresión de los biomarcadores de la Tabla 1 también puede incluir, por ejemplo, tampones u otros reactivos para uso en un ensayo para evaluar la expresión (p.ej., a nivel de ácido nucleico o de proteína).

En otra realización, el kit puede comprender además eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (p.ej., mesilato de eribulina), para tratar cáncer de mama u otro cáncer, tal como se describe en la presente memoria en el sujeto.

Preferiblemente, el kit está diseñado para uso con un sujeto humano.

La presente invención queda ilustrada adicionalmente a través de los siguientes ejemplos, que no deberían ser considerados como limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1 : Identificación de biomarcadores de resistencia para el tratamiento con eribulina

Se emplearon técnicas siARN para “bloquear” la expresión de determinados genes y determinar la sensibilidad de las células bloqueadas resultantes frente a la eribulina. En base a estos estudios, se identificó la expresión de los genes establecidos en la Tabla 1 como asociada a la sensibilidad de las células de cáncer de mama al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

Optimización de la transfección siARN y desarrollo del ensayo

Las condiciones de transfección para líneas celulares de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (n° de catálogo ATCC HTB26™) y BT-549 (n° de catálogo ATCC HTB122TM) fueron optimizadas usando el reactivo de transfección DharmaFect 1 de Dharmacon. Se ha publicado que las líneas celulares MDA-MB-231 y BT-549 son negativas para receptor de estrógeno (ER), negativas para receptor de progesterona (PR) y negativas para HER-2 (triple negativo). Como control negativo no dirigido usamos siARN de control negativo silenciador n°1 de Applied Biosystems. El control de transfección siGENOME TOX (siTOX) (Dharmacon), un dúplex de ARN diseñado para inducir la muerte celular, se usó como control positivo para los ensayos de proliferación celular. En todos los experimentos se usó un procedimiento de transfección inversa en el que en primer lugar se mezcló siARN con reactivo de transfección y después se añadieron las células al pocillo. Se comparó la viabilidad celular en células tratadas con medio, siARN de control negativo y reactivo siTOX combinado con diferente cantidad de DharmaFect 1. Las condiciones de transfección seleccionadas finales fueron las siguientes: células MDA-MB-231 a 0,035 pL de DharmaFect 1 por pocillo, y las células BT-549 a 0,05 |jL de DharmaFect 1 por pocilio. Los ensayos y el cribado de biblioteca se llevaron a cabo a una concentración final de siARNs de 50 nM. La eficacia de la transfección se confirmó adicionalmente mediante qPCR con reactivos de control de siARN SMARTpool dirigidos a genes PPIA y GAPDH (Dharmacon).

Cribado de siARN de alta capacidad

Se adquirió en Dharmacon la biblioteca de siARN del genoma humano completo. La biblioteca se diluyó a 5 j M. Cada pocillo contenía 4 reactivos de siARN SMARTpool, cada uno dirigido contra un gen particular (cuatro siARNs dirigidos al mismo gen en un pocillo individual). Con esta librería se actuó sobre más de 18.500 genes humanos. 4 j L de cada conjunto de siARNs procedente de las placas de biblioteca fueron transferidos a placas maestras de 384 pocillos que contenían 36 j L de medio OPTI-MEM por pocillo. Se añadieron 40 j L de reactivo DharmaFect 1 diluido a cada pocillo de la placa maestra y se mezclaron. Se distribuyeron 10 j L de siARN y mezcla de reactivo de transfección por pocillo en cinco placas de cribado. Después de 10 minutos de incubación, a cada pocillo se añadieron células en 40 j L de medio de crecimiento. Cada placa de cribado incluyó pocillos que contenían varias réplicas de siARN de control negativo, control positivo siTOX, así como medio más reactivo de transfección (sin siARN). Después de 24 horas de incubación, 3 placas de cribado recibieron 10 j L de DMSO diluido en medio de crecimiento celular, mientras que 2 repeticiones fueron tratadas con 10 j L de mesilato de eribulina (E7389) en medio de crecimiento, dando lugar a una concentración final que corresponde a la IC²⁰para E7389 para la línea evaluada (0,75 nM de E7389 para MDA-MB-231; la eribulina se proporcionó en una disolución reserva de DMSO y diluida en medio de crecimiento) (véase la Figura 1). Se determinó la viabilidad celular a las 96 horas de la transfección con un ensayo luminiscente CellTiter-Glo de Promega. Se usaron 10 j L de disolución CellTiter-Glo por pocillo. Las placas fueron mezcladas durante 2 minutos en un agitador horizontal, se incubaron durante 10 minutos y se leyeron en un lector de placa multietiqueta EnVision® de PerkinElmer.

Identificación de dianas primarias

La identificación de genes con un efecto significativo sobre la sensibilidad celular a E7389 se llevó a cabo mediante un método que fue similar al método descrito para un cribado de siARN de paclitaxel (Whitehurst et al. (2007) Nature 446: 815-819). Resumidamente, la medida de cada pocillo se normalizó mediante promedio de pocillos de referencia que contenían medio más reactivo de transfección en una placa (32 pocillos/placa). Los replicados biológicos fueron promediados para las placas tratadas con DMSO y E7389. Para cada gen, se llevó a cabo un ensayo-t de dos muestras para identificar los valores significativamente diferentes para pocillos tratados con dos condiciones diferentes. Para reducir la lista de dianas, la magnitud de la respuesta se tuvo en cuenta organizando todos los datos según una ratio de tasa de cambio (promedio de E7389/promedio de DMSO) en orden creciente. 364 genes con una tasa de cambio entre el percentil 5 inferior de la distribución pasaron el nivel de corte. A continuación, se excluyeron los marcos de lectura abiertos hipotéticos y los genes que codifican proteínas hipotéticas y el análisis se centró en los 240 genes restantes (véase la Figura 2).

Ensayos de confirmación

Se pidieron siARN SMARTpools para los 240 genes seleccionados en formato ON-TARGETp/us de Dharmacon. Estos reactivos contienen una cadena sentido modificada para prevenir la interacción con RISC y favorecer la captación de cadena antisentido. La región de semilla de cadena antisentido se modifica para disminuir la actividad fuera de diana y potenciar la especificidad de diana. Estos reactivos se usaron para el cribado secundario de confirmación. Para identificar los genes comunes que influyen en la sensibilidad de células cancerosas frente a E7389, las células de cáncer de mama BT-549 fueron cribadas con los 240 grupos de siARN seleccionados. Este cribado se llevó a cabo usando el mismo protocolo que en el cribado primario con células MDA-MB-231, correspondiente la concentración final de mesilato de eribulina (E7389) en cada pocillo a la IC²⁰para células BT-549 (E73890,25 nM).

El análisis de datos mostró que el tratamiento con 40 de los 240 grupos de siARN provocó diferencias significativas al comparar los pocillos tratados con E7389 con los pocillos tratados con vehículo en ambas líneas celulares (Tabla 2).

Para confirmar la regulación a la baja específica de 40 genes con grupos de siARN, se llevó a cabo el análisis PCR cuantitativo de ARNms diana. Se transfectaron células MDA-MB-231 y BT-549 con 40 siARNs ON-TARGETp/us o con siARN de control negativo no dirigido según el protocolo anterior. 48 horas después las células fueron lisadas y se sintetizaron ADNcs según las instrucciones del fabricante para uso del Kit TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ (Applied Biosystems). Las cantidades relativas de ADNcs remanentes después del tratamiento con siARNs fueron evaluadas usando el kit QuantiTect SYBR Green PCR con los ensayos de cebador QuantiTect específicos de gen (Qiagen). Los resultados del análisis se muestran en la Figura 4. Los siguientes 18 genes fueron regulados a la baja más de un 50 por ciento en ambas líneas celulares evaluadas: CFL1, NMU, MOBKL1B, HYAL2, PSENEN, CYP4F3, ITFG3, EDIL3, YTHDF1, CDC20, CCL26, TMEM79, MANSC1, DYSF, ERGIC3, GRAMD4, NCBP1, SNX11. 14 genes fueron regulados a la baja más del 50 por ciento en al menos una línea celular (PDGFB, APBB2, SATB1, MAD2L1BP, TUBB6, CEP152, KLH17, COL7A1, CKLF, PHOSPHO2, GNAT1, ABI3, TYROBP, IL10), mientras que otros 3 genes fueron regulados a la baja más del 35 por ciento en al menos una línea celular (ANG, ZIC5, JAM3). La expresión de SPTA1, PAPLN, PCDH1, TMIGD2, y Kr T24 fue no detectable mediante este método en células MdA-m B-231 o no cambión después del tratamiento con siARN en células BT-549. Los resultados anteriores indican que la regulación a la baja de los 40 genes puede conducir a un aumento de la sensibilidad a la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

Tabla 2. Lista de 40 genes solapados del cribado de células MDA-MB-231 y BT-549. Se muestran las tasas de cambio (FC, del inglés “Fold Changes”) en comparación con el control y los valores-p asociados.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama, comprendiendo el método

determinar el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 en una muestra derivada de dicho sujeto, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador es indicativo de que la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, será efectiva para tratar a dicho sujeto.

2. Un método para determinar la sensibilidad de un tumor de mama frente al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, comprendiendo dicho método

determinar el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 en dicho tumor, en donde un nivel bajo de expresión del biomarcador en dicho tumor indica que dicho tumor es sensible al tratamiento con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

3. El método de la reivindicación 2, en donde se obtiene una muestra del tumor de mama de un sujeto que padece cáncer de mama.

4. Eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama, comprendiendo dicho método

identificar un sujeto que padece cáncer de mama en el cual un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1 presenta un nivel bajo de expresión, y

administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, a dicho sujeto.

5. Eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de mama, comprendiendo dicho método

evaluar una muestra derivada de dicho sujeto para determinar el nivel de expresión en dicha muestra de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerado en la Tabla 1, y

administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, a dicho sujeto cuando se detecta un nivel bajo de expresión del biomarcador en dicha muestra.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde (a) la sal farmacéuticamente aceptable de eribulina es mesilato de eribulina.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde (a) al menos 2 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1 presentan un nivel bajo de expresión; o (b) al menos 3 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1 presentan un nivel bajo de expresión; o (c) al menos 4 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1 presentan un nivel bajo de expresión; o (d) al menos 5 biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1 presentan un nivel bajo de expresión.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho biomarcador no es expresado en un nivel detectable.

9. El método una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde (a) el nivel de expresión de dicho biomarcador se determina a nivel de ácido nucleico; opcionalmente en donde el nivel de expresión de dicho biomarcador se determina (i) detectando ADNc; o (ii) detectando ARNm o miARN; o (iii) detectando ADN; o (iv) usando una técnica seleccionada del grupo que consiste en reacción de amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR), análisis PCR de transcriptasa inversa, análisis PCR de transcriptasa inversa cuantitativa, análisis de transferencia Northern, ensayo de protección de ARNasa, detección/cuantificación de ARN digital, y combinaciones o sub-combinaciones de los mismos; o (b) el nivel de expresión de dicho biomarcador se determina a nivel de proteína; opcionalmente en donde la presencia de la proteína se detecta usando un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la proteína; opcionalmente en donde (i) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo bi-específico, un anticuerpo quimérico, un Fab, Fab', F(ab')2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avímero, versacuerpo, nanocuerpo, un anticuerpo de dominio, y un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores; o (ii) en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado; opcionalmente en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado con una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en una radio-etiqueta, una etiqueta de biotina, una etiqueta de cromóforo, una etiqueta de fluoróforo, y una etiqueta de enzima.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde (a) dicho sujeto no ha sido tratado previamente con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; o (b) dicho sujeto ha sido tratado previamente con eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en donde dicho cáncer de mama es (a) un cáncer de mama negativo para receptor de estrógeno (ER); o (b) un cáncer de mama negativo para receptor de progesterona (PR); o (c) un cáncer de mama negativo para HER-2; o (d) un cáncer de mama negativo para receptor de estrógeno (ER) y negativo para receptor de progesterona (PR); o (e) un cáncer de mama negativo para receptor de estrógeno (ER) y negativo para HER-2; o (f) un cáncer de mama negativo para receptor de progesterona (PR) y negativo para HER-2; o (g) un cáncer de mama negativo para receptor de estrógeno (ER), negativo para receptor de progesterona (PR) y negativo para HER-2.

12. El método de la reivindicación 9, en donde el nivel de expresión de dicho biomarcador se determina usando una técnica seleccionada del grupo que consiste en un inmunoensayo, un análisis de transferencia Western, un radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA), ensayo ELISA, reacción en cadena de inmunopolimerasa y combinaciones o sub combinaciones de los mismos; opcionalmente en donde (a) el inmunoensayo es un inmunoensayo basado en disolución seleccionado del grupo que consiste en electroquimioluminiscencia, quimioluminiscencia, quimioluminiscencia fluorogénica, polarización de fluorescencia, y fluorescencia resuelta en el tiempo; o (b) el inmunoensayo es un inmunoensayo de sándwich seleccionado del grupo que consiste en electroquimioluminiscencia, quimioluminiscencia, y quimioluminiscencia fluorogénica.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde (i) dicha muestra comprende un fluido, o componente del mismo, obtenido de dicho sujeto; opcionalmente en donde el fluido se selecciona del grupo que consiste en sangre, linfa, suero, plasma, fluido quístico, aspirados de pezón, orina, esputo, y fluido recogido de una biopsia; o (ii) la muestra comprende un tejido, o componente del mismo, obtenido de dicho sujeto; opcionalmente en donde (a) dicho tejido se selecciona del grupo que consiste en tejido de mama, tejido conectivo, tejido linfático, tejido obtenido de una biopsia y tejido obtenido de una biopsia de bulto; o (b) el tejido es tejido de mama o un componente del mismo; opcionalmente en donde dicho componente de dicho tejido de mama comprende células de tejido de mama; opcionalmente en donde dichas células de tejido de mama son células tumorales de mama en circulación.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho sujeto es un sujeto humano.

15. El uso de un kit en los métodos de las reivindicaciones 1 a 14, comprendiendo el kit

reactivos para determinar el nivel de expresión de un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores enumerados en la Tabla 1; e

instrucciones para uso del kit para predecir si la eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, puede usarse para tratar un sujeto que padece cáncer de mama.

16. El uso del kit de la reivindicación 15, en donde (a) la sal farmacéuticamente aceptable de eribulina es mesilato de eribulina; o (b) el reactivo para determinar el nivel de expresión del biomarcador es una sonda para identificar una mutación nula en el biomarcador; o (c) el reactivo para determinar el nivel de expresión del biomarcador es una sonda para amplificar y/o detectar el biomarcador; o (d) el reactivo para determinar el nivel de expresión del biomarcador es un anticuerpo; o (e) el kit comprende además reactivos para obtener una muestra biológica de un sujeto; o (f) el kit comprende además una muestra de control.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el biomarcador es TUBB6.

18. Eribulina, un análogo de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para uso en la reivindicación 4 o 5, en donde el biomarcador es TUBB6.