DE1642752B1

DE1642752B1 - Verfahren zur Herstellung von L-Prolin

Info

Publication number: DE1642752B1
Application number: DE19671642752
Authority: DE
Inventors: Ichiro Chibata; So Horie; Joji Kato; Masahiko Kobe Kisumi; Saburo Komatsubara
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1966-11-10
Filing date: 1967-11-10
Publication date: 1971-10-07
Also published as: CH492782A; GB1186270A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien.

L-Prolin ist eine der wichtigsten biologisch aktiven Aminosäuren, welche auf dem pharmazeutischen Gebiet Interesse als wertvolle Substanz erweckt. Als praktische Methoden zur Gewinnung waren jedoch bisher nur die Hydrolyse von natürlichem Protein und die Extraktion von L-Prolin aus dem Hydrolysat sowie durch Züchten von Mikroorganismen in bestimmten Nährmedien nach der französischen Patentschrift 1 427 534 bekannt. Demzufolge ist es schwierig, die Verbindung in industriellem Maßstab zu liefern. Denn auch nach dem letztgenannten biotechnischen Verfahren unter Einsatz von Brevibacterium flavum-Stämmen und Verwendung einer der Aminosäuren i-Leucin, Ornithin, Citrullin, Arginin, Histidin enthält die Fermentationslösung optimal nur 0,5 bis 1,5 g/dl L-Prolin, bestimmt durch Biotitration der Fermentationsflüssigkeit mit Hilfe von Leuconostoc Citrovorum.

Es wurde nun gefunden, daß Kurthia catenaforma ATCC 21144 eine starke Fähigkeit zur Akkumulation von L-Prolin in hoher Konzentration in einem Nährmedium hat und damit die stets mit Verlusten verbundene Isolierung in größerer Menge gestattet.

Die morphologischen, züchterischen und physiologischen Merkmale des Stammes Kurthia Catenaforma ATCC 21144 werden wie folgt beschrieben:

(A) Züchtungsmerkmale

1. Wachstum in Nähragar

Bildet glatte, insgesamt runde Kolonie mit konvexer, grauer und durchscheinender Peripherie. Es ist kein fauliger Geruch zu beobachten.

2. Wachstum in Nährbrühe

Wächst ohne Häutchenbildung zu Ringen. Es ist keine mäßige Trübung zu beobachten, jedoch wird Sediment gebildet.

3. Wachstum in Nähragar-Schrägschnitten
Ausbreitung, graues strahlenförmiges Wachstum.

(B) Morphologie

Aussehen: Bildet Stäbchen, gekrümmte Stäbchen, kokkoide Formen und Fäden

10

Länge: 0,8 ·3,5 μ -

50 μ.

Zellen existieren in unabhängiger Form, in Paaren oder in wachsenden langen Ketten mit gerundeten Enden ohne Verzweigung. Die Ketten sind sehr oft gekrümmt und können sich später zu kokkoiden Formen teilen. Schwach motil mit fragiler peritrichischer FIagella. Sie werden nicht eingekapselt und bilden keine Sporen.

(C) Physiologische Merkmale

1. Bedingungen für Züchtung

Optimaltemperatur 37 ⁰C

Wachstumstemperatur 10 bis 43 ⁰C

Wachstums-pH-Bereich 6 bis 9

2. Verhalten gegen Sauerstoff fakultativ

anaerob

3. Gram-Einteilung (Gram's stain) ... variabel

4. Methylrotprüfung negativ

5. Voges-Proskauer-Reaktion ........ negativ

6. Bildung von Indol aus Tryprophan negativ

7. Produktion von Schwefelwasserstoff (auf Bleiacetat-Agar und Cystin-medium) negativ

8. Reduktion von Nitrat zu Nitrit negativ

9. Produktion von Katalase positiv

10. Verflüssigung von Gelatine negativ

11. Hydrolyse von Stärke positiv

12. Citratverwertung positiv

13. Koagulation von Milch negativ

14. Reduktion von Lackmusmilch positiv

15. Verwertung von Harnstoff negativ

16. Kovac's Oxydasetest negativ

17. Wachstum bei NaCl Konzentration

von 5 % positiv

Wachstum bei NaCl Konzentration von 7% negativ

(D) Kohlenhydrat-Reaktionen

Diese Reaktionen sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Kohlehydrate	Säure	Gas
30 Glucose Lactose Maltose Saccharose 35 Galactose Mannit Mannose Glycerin Melibiose 40 Stärke	negativ negativ positiv negativ positiv negativ negativ negativ negativ negativ	negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ

Im Hinblick auf die obenerwähnten Merkmale wurde der Stamm in den Genus Kurthia eingeteilt, und zwar gemäß der Klassifikation von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage. Die morphologischen Merkmale des Stammes waren nämlich identisch mit denjenigen des Genus Kurthia, die durch die Bildung von besonderen langen Stäben und das Wachsen zu Fäden, die sich später ohne Verzweigung in kokkoide Formen teilen können, charakterisiert ist. Die physiologischen Merkmale des Stammes passen ebenfalls zu denen des Genus Kurthia, welches Kohlehydrate wenig oder nicht angreift. Im Hinblick auf die Kettenbildung wurde die Bezeichnung »catenaforma« gewählt.

Ausgehend von der biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Kurthia catenaforma ATCC 21144 einsetzt und das Nährmedium L-Asparaginsäure in eine Menge von 0,5 bis 5 Gewichts/Volumprozent enthält.

Nach Durchführung der Fermentation unter geeigneten Bedingungen wird eine Fermentationsflüssigkeit erhalten, welche L-Prolin in hoher Konzentration bis zu 35 mg/ml enthält. Da die Bildung anderer Aminosäuren als L-Prolin als Nebenprodukt bemerkenswert gering ist, wird im Verfahren der Erfindung

L-Prolin fast als einziges Produkt gebildet, so daß das angesammelte L-Prolin leicht aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert werden kann.

Als zweckmäßige Nährstoffe des Mediums zur Erzeugung von L-Prolin können vorzugsweise Zucker, wie Glucose, als hauptsächliche Kohlenstoff quelle verwendet werden (insbesondere bei einer Konzentration von etwa 3 bis 10 %) und als Stickstoff quelle derartige Stoffe wie Maisquellwasser, Reisquellwasser, Casaminosäure, Harnstoff oder Malzextrakt (insbesondere bei einer Konzentration von etwa 0,5 bis 4%)· Es können jedoch auch anorganische Quellen für Stickstoff verwendet werden, wie Ammoniak oder Ammoniumsalze. Stets erfolgt ein Zusatz von Asparaginsäure in einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gewichts-/Volumprozent. Als Mineralstoffe können auch Kaliumsalze, Magnesiumsalze und andere anorganische Salze, je nach den jeweiligen Bedingungen, dem Medium zugesetzt werden. Das Verfahren der Erfindung wird gewöhnlich als aerobe Schüttelkultur in einem wäßrigen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37°C durchgeführt.

Nach der Fermentation kann das angesammelte L-Prolin aus der Fermentationsflüssigkeit durch geeignete Maßnahmen gewonnen werden. So wird z. B. die Fermentationsflüssigkeit filtriert oder zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und L-Prolin wird aus dem Filtrat durch Konzentrieren, vorzugsweise unter anschließender üblicher Ionenaustauscherharzbehandlung, isoliert. Kationenaustauscherharze sind für diesen Zweck geeignet. In diesem Fall wird L-Prolin am Harz aus dem Filtrat adsorbiert, mit einer wäßrig alkalischen Lösung, wie wäßrigem Ammoniak, eluiert und aus dem Eluat auf übliche Weise kristallisiert.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das folgende Bestandteile enthielt:

Gewichtsprozent

Glucose 6

Maisquellwasser 0,7

Casaminosäure 1,1

L-Asparaginsäure 2

Harnstoff 0,5

NH₄Cl 0,3

K₂HPO₄ 2,0

MgSO₄ · 7 H₂O 0,1

Wasser Rest

Das obige Medium wurde auf pH 7,0 eingestellt. ml des Mediums wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben eingebracht und sterilisiert. Ein Löffel voll Inoculum von Kurthia catenaforma ATCC 21144 wurde in das Medium inokuliert, und das Medium Stunden bei 28°C unter Hin- und Herschütteln (140 Upm) inkubiert. Auf diese Weise wurden 18,4mg/ ml an L-Prolin in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Kurthia catenaforma ATCC 21144 einsetzt und das Nährmedium L-Asparaginsäure in einer Menge von 0,5 bis 5 Gewichts-/Volumprozent enthält.