DE1205934B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Citrullin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. σ.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C12d

Deutsche Kl.: 6b-16/02

1205 934
A 47106IV a/6 b
18. September 1964
2. Dezember 1965

Die Erfindung betrifft ein wirtschaftliches Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Citrullin aus leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien.

Citrullin stellt wie Arginin und Ornithin ein Zwischenprodukt bei der Harnstoffbildung in menschlichen und sonstigen lebenden Körpern dar und ist daher wie diese Verbindungen für Biochemiker und Biologen von Interesse. Es hat auch bei medizinischen Untersuchungen als Zwischenprodukt bei der Bildung von anderen für die Biochemiker wertvollen Verbindungen und als Nahrungszusatz Bedeutung gewonnen.

Citrullin wurde zunächst aus Wassermelonensaft isoliert. Es ist aber auch auf chemischem und biochemischem Wege synthetisiert worden. Einige dieser Verfahren basieren auf der Hydrolyse von Arginin.

Es wurde gefunden, daß 1-Citrullin in relativ hohen Konzentrationen — von 1 bis 2 g/100 ecm Kulturmedium — angereichert werden kann, wenn man Bacillus subtilis ATCC 15 562 oder Bacillus subtilis ATCC 15 561 in einem Nährmedium, das neben üblichen Bestandteilen 5 bis 100 mg Arginin pro 100 ecm enthält, bei aeroben Bedingungen züchtet.

Die gemäß Erfindung benutzten auxotrophen Mutantenstämme von Bacillus subtilis kommen vermutlich auch in der Natur vor. Einfacher werden sie durch Selektion aus dem Mikroorganismus Bacillus subtilis Stamm K, dessen vegetative Zellen oder Sporen UV-Licht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder ähnlicher elektromagnetischer Bestrahlung ausgesetzt oder mit einer Natriumnitritlösung in Berührung gebracht worden sind, gewonnen. Es können aber auch andere Mutationen hervorrufende Behandlungen angewendet werden.

Die gemäß Erfindung verwendeten Mutantenstämme von Bacillus subtilis benötigen für die 1-Citrullinproduktion Arginin. Ersetzt man aber das Arginin im Kulturmedium durch so nah verwandte Aminosäuren, wie 1-Citrullin oder 1-Ornithin, bilden sich keine Wachstumsstufen und kein 1-Citrullin.

Unterschreitet die Argininkonzentration in dem Nährmedium die Menge von 5 bis 100 mg/100 ecm, so ist die Geschwindigkeit des Mikroorganismenwachstums und der 1-Citrullinproduktion sehr gering. Bei höheren Argininkonzentrationen geht das Wachstum der Mikroorganismen gewöhnlich schnell vonstatten, jedoch das Maß der 1-Citrullinproduktion ist eingeschränkt. Wird dagegen das Wachstum der Mikroorganismen durch Modifikationen der Fermentationsbedingungen in bekannter Weise eingeschränkt, können ausreichende 1-Citrullinausbeuten auch bei Argininkonzentrationen oberhalb des angegebenen Vorzugsbereichs erhalten werden.

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von
1-Citrullin

Anmelder:

Ajinomoto Co., Inc., Tokio
Vertreter:

Dr. G. W. Lotterhos

und Dr.-Ing. H. W. Lotterhos, Patentanwälte,
Frankfurt/M., Annastr. 19

Als Erfinder benannt:

Shinji Okumura,

Masao Shibuya,

Shimpachi Konishi,

Teruo Shiro,

Noboru Katsuya, Kanagawa-ken (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 19. September 1963 (49 438)

Wie die Beispiele 3 und 4 mehr im einzelnen zeigen, kann die 1-Citrullinbildung noch weiter beschleunigt werden, wenn neben Arginin 1-Leucin oder !-Isoleucin im Medium vorhanden ist. Durch einen Zusatz von mindestens 50 mg/100 ecm 1-Leucin oder 1-Isoleucin zum Kulturmedium kann man die 1-Citrullinausbeute um 10 bis 15% gegenüber derjenigen steigern, die bei sonst gleichem Fermentationsverfahren erhalten wird. Durch höhere Konzentration läßt sich die Ausbeute noch weiter verbessern.

Maximale 1-Citrullinausbeuten bei hoher Geschwindigkeit können nur dann erzielt werden, wenn man die Wasserstoffionenkonzentration im Kulturmedium regelt. Zweckmäßig wird im Kulturmedium ein pH-Bereich zwischen 6,0 und 9,0 aufrechterhalten, indem man wäßriges Ammoniak, Calciumcarbonat oder Alkalihydroxyd dem Nährmedium von Zeit zu Zeit je nach Bedarf zusetzt.

Abgesehen von dem Zusatz von Arginin und gegebenenfalls 1-Leucin oder 1-Isoleucin können die für die 1-Citrullinproduktion gemäß Erfindung benutzten Kulturmedien eine völlig konventionelle Zusammensetzung haben. Sie müssen assimilierbare Lieferanten für Kohlenstoff und für Stickstoff und die üblichen geringfügigen Nährstoffe enthalten.

Einige Beispiele für geeignete Kohlenstofflieferanten sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose,

509 740/5*

Saccharose, Xylose, Galactose, Stärkehydrolysat und Melassen; jedoch auch Glycerin, organische Säuren, wie Essig-, Fumar-, Malein-, Milch-, «-Ketoglutar-, Glucon-, Brenztrauben- und Citronensäure können als Ergänzungskohlenstofflieferanten benutzt werden.

Der Stickstoff kann von Ammoniumsalzen anorganischer oder organischer Säuren, wie der Salz-, Phosphor-, Salpeter-, Essig- und Milchsäure, von Harnstoff und von Ammoniak in wäßriger Lösung oder gasförmigem Zustand geliefert werden.

Die ergänzenden anorganischen Nährstoffe umfassen die wesentlichen anorganischen Ionen, die aus Kaliumphosphat, Magnesium-, Mangan-, Zink-, Ferrosulfat, Natriumchlorid und Calciumcarbonat zugänglich sind. Organische, wachstumsfördernde Mittel, durch die die Ausbeute und die Geschwindigkeit der Citrullinbildung verbessert werden, umfassen allgemein Aminosäuren, Biotin, Vitamine und Fettsäuren. Sie können dem Kulturmedium in Form von Substanzen zugesetzt werden, die das aktive Mittel bei den Fermentationsbedingungen liefern, wie Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Magermilch, Chlorellaextrakt, Sojabohnenproteinhydrolysat sowie verschiedene andere Extrakte von pflanzlichen und tierischen Geweben, die als solche wohlbekannt sind.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Das Nährmedium kann mit dem Sauerstoff durch Schütteln, Rühren oder indem man Luft hindurchleitet, in Berührung gebracht werden. Beste Ergebnisse erzielt man, wenn man während der Fermentation die Temperatur des Mediums zwischen 24 und 40⁰C hält.

Der 1-Citrullingehalt des Nährmediums wurde durch den Mikroversuch mit Hilfe von Lactobacillus casei (ATCC 7469) bestimmt. Zu diesem Zweck kann aber auch eine andere bekannte Methode benutzt werden. Die isolierte Aminosäure wurde durch Papierchromatographie und ihr charakteristisches Infrarotspektrum identifiziert.

Das 1-Citrullin kann aus dem Nährmedium in bekannter Weise isoliert werden, beispielsweise indem man die Bakterienzellen abfiltriert oder abzentrifugiert, aus der erhaltenen Flüssigkeit das 1-Citrullin an Ionenaustauscherharzen adsorbiert und dann durch selektive Elution von Begleitmaterialien abtrennt.

Das Verfahren der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Bacillus subtilis K-X-I A-9 (ATCC 15 562) wurde durch Selektion aus Bacillus-subtilis-K-Stamm, der mit Röntgenstrahlen bestrahlt worden war, auf der Basis seines Argininbedarfs isoliert und auf einer Bouillon-Agar-Schrägschnitte kultiviert. Ein Inokulum wurde auf ein Nährmedium übertragen.

Es wurde eine Nährlösung folgender Zusammensetzung hergestellt:
Süßkartoffelstärkehydrolysat

(Glucoseäquivalent) 10 %

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7H₂O 0,04%

Fe⁺+ 2 ppm

Mn⁺⁺ 2 ppm

Gemischte Aminosäuren 0,3 %

1-Arginin-Hydrochlorid 10 mg/100 ecm

Biotin 40γ/1

Thiamin-Hydrochlorid 200 γ/Ι

Magermilch 0,3 %

Das pH der Lösung betrug 7. 20-ccm-Ansätze der Lösung gab man in 500-ccm-Schüttelkolben, sterilisierte sie mit Dampf in den Flaschen 5 Minuten bei HO⁰C und beimpfte sie mit den weiter oben angegebenen Mikroorganismen, worauf man dem Medium 1% getrennt sterilisiertes dibasisches Ammoniumphosphat und 1 g Calciumcarbonat zusetzte und die Fermentation bei 31⁰C unter Schütteln durchführte. Nach 24stündiger Fermentation setzte man dem Medium dibasisches Ammoniumphosphat in einer Menge von nahezu 2% zu.

Die gesamte Fermentationsperiode dauerte 72 Stunden, und der schließlich erhaltene 1-Citrullingehalt des Mediums betrug nach der Bestimmung mittels des Bioversuchs 1,2 g/100 ecm. Dieses Ergebnis sowie die anderen Daten bezüglich der Zusammensetzung des Mediums während der Fermentation sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Fermentations dauer (Stunden)	pH	Verbrauchte Glucose (g/100 ecm)	Gebildetes 1-Citrullin (g/100 ecm)
24 48 72	7,2 7,8 8,0	2,5 5,7 9,2	0,13 0,72 1,20

Die Zellen der Mikroorganismen filtrierte man vom Medium ab, führte das Filtrat durch eine mit einem Kationenaustauscherharz des Η-Typs gepackte Kolonne, eluierte das 1-Citrullin aus der Kolonne mit 1,0 n-Ammoniumhydroxydlösung und fällte aus dem Eluat mit absolutem Äthanol das kristalline Rohprodukt. Die Kristalle löste man in Wasser, behandelte die Lösung zur Entfärbung mit Aktivkohle und fällte die reinen Kristalle aus. Man kristallisierte sie ferner aus einer kleinen Menge heißem Wasser um. Aus 11 Medium mit 12 g 1-Citrullin erhielt man 10,2 g reine Säure in kristalliner Form.

Beispiel 2

Bacillus subtilis K-X-I A-I (ATCC 15 561) erhielt man aus Bacillus-subtilis-K-Stamm durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen und Selektion auf Grund seines Argininbedarfs. Die Mikroorganismen kultivierte man in praktisch der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 angegeben (in diesem Fall wurde nur 1 g Calciumcarbonat den jeweiligen Medien zugegeben und die Fermentation bei 34° C unter Belüftung und Rühren durchgeführt), auf einem Kulturmedium, das zu Beginn folgende Zusammensetzung hatte:

Süßkartoffelstärkehydrolysat

(Glucoseäquivalent) 13 %

KH₂PO₄ 0,3%

MgSO₄-7 H₂O 0,04%

Fe⁺+ 2 ppm

Mn⁺⁺ 2 ppm

Gemischte Aminosäuren 0,3 %

Sojabohnenproteinhydrolysat lccm/lOOccm

1-Arginin-Hydrochlorid 0,01%

Biotin 40y/l

Thiamin-Hydrochlorid 200 γβ

NH₄Cl 1,5%

pH 7

Nach 24stündiger Fermentation fügte man dem Nährmedium Ammoniumchlorid in einer Menge von nahezu 1,5 % zu. Nach 72stündiger Fermentation bei

34° C wies das Kulturmedium 1,6 g/100 ecm 1-Citrullin auf.

Beispiel 3

Das Verfahren^ von Beispiel 2 wurde mit einem Kulturmedium wiederholt, das, abgesehen von einem zusätzlichen Gehalt an 0,1% 1-Leucin, mit dem weiter oben beschriebenen identisch war. Der 1-Citrullingehalt des Kulturmediums betrug nach 72 Stunden 1,9 g/100 ecm, womit eine Zunahme von nahezu 20% gegenüber den unter sonst gleichen Bedingungen in der Abwesenheit von 1-Leucin erzielten Ergebnissen erreicht worden war.

B e i s.p i e 1 4

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde mit einem Kulturmedium wiederholt, das, abgesehen von einem zusätzlichen Gehalt an 0,1% !-Isoleucin, mit dem weiter oben beschriebenen identisch war. Der 1-Citrullingehalt des Kulturmediums betrug nach 72 Stunden 1,8 g/100 ecm und war somit nahezu gleich dem, der in Anwesenheit von 1-Leucin erzielt wurde.
5

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Citrullin, dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus subtilis ATCC 15562 oder Bacillus subtilis ATCC 15561 in einem Nährmedium, das neben üblichen Bestandteilen 5 bis 100 mg Arginin pro 100 ecm enthält, bei aeroben Bedingungen gezüchtet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Nährmedium mindestens 50 mg 1-Leucin oder 1-Isoleucin pro 100 ecm zugesetzt werden.

509 740/54 11.65 © Bundesdruckerei Berlin