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DE2718782A1 - Antibiotika - Google Patents

Antibiotika

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DE2718782A1
DE2718782A1 DE19772718782 DE2718782A DE2718782A1 DE 2718782 A1 DE2718782 A1 DE 2718782A1 DE 19772718782 DE19772718782 DE 19772718782 DE 2718782 A DE2718782 A DE 2718782A DE 2718782 A1 DE2718782 A1 DE 2718782A1
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deionized water
column
medium
gal
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DE19772718782
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English (en)
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DE2718782C2 (de
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Patrick Joseph Cassidy
Robert Thomas Goegelman
@@ Hernandez Sebastian Dr
Edward Olley Stapley
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Merck and Co Inc
Original Assignee
Merck and Co Inc
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description

Bestimmungsverfahren für die Antibiotika 890A2 und 89OA5 I. Bioassav (Bioversuch)
Ein Agarplatten Scheiben-Diffusions-Verfahren wird entweder unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 oder von Salmonella gallinarum MB-1287 als Testorganismen verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890A1 wird als Standard verwendet. Das Antibiotikum 890A1 wird gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt.
Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml sterilisiertem Medium suspendiert, das 8 g/l Difco Nährbrühe und 2 g/l Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält ("Nährbrühe-Hefeextrakt", im folgenden als NBYE bezeichnet). Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotatlonsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert. Diese Kultur wird dann zum Inokulieren der Oberflächen von Schrägkulturen, die 1,596 Agar in NBYE enthalten, verwendet. Die inokulierten Schrägkulturen werden über Nacht bei 28°C inkubiert und dann in einem Kühlschrank gelagert.
Die gekühlten Schrägkulturen, die aus einer einzigen, lyophilisierten Kultur hergestellt werden, werden bis zu 4 Wochen von ihrer Herstellung folgendermaßen verwendet: Eine Schleife des Inokulums aus der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, das in einem 250 ml Erlenmeyerkolben enthalten ist, dispergiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert. Sie wird dann auf eine Dichte, die eine 50%ige Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt, verdünnt. Ein 33»2 ml Teil der verdünnten Kultur wird zu 1 1 NBYE, das 15 g Agar enthält, zugegeben und bei 46°C gehalten. Das Inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100 χ 15 mm
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Kunststoff-Petrischalen gegossen, jeweils 5 ml/Schale, anschließend wird abgekühlt und vor der Verwendung lagert man bei 2 bis 4°C bis zu 5 Tagen.
Salmonella gallinarum MB-1287 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt.
Ein verschlossenes Rohr, das Salmonella gallinarum MB-1287-Zellen in Hagermilch enthält, das unter Vakuum gefroren, lyophilisiert und verschlossen wurde ., wird geöffnet und zum Inokulieren von 15 ml Gehirn-Herz-Infusionsbrühe verwendet. Die Zellen können ohne Schütteln bei 37°C über Nacht wachsen und diese Kultur wird dann zum Inokulieren von Schrägkulturen von 0,8% BBL-Nährbrühe + 0,2% Difco Hefeextrakt + 1»5% Agar verwendet. Nach dem Wachsen über Nacht bei 37°C wird eine Schlinge der Kultur von der Schrägkultur in einen Kolben übertragen, der 50 ml 0,8%ige Nährbrühe +0,2% Hefeextrakt enthält. Der Kolben wird über Nacht geschüttelt und 20 ml dieser Kultur werden zum Inokulieren in 1 1 eines Gemisches aus 0,8% Nährbrühe + 0,2% Hefeextrakt + 1,5% Agar verwendet, das zuvor sterilisiert und auf 480C abgekühlt wurde. Der inokulierte NBYE-Agar wird sofort in 100 χ 15 mm Kunststoff-Petrischalen gegeben, 5 ml/Schale, und die Platten werden dann bei 2 bis 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm (1/2 in.) werden in die zu prüfende Lösung eingetaucht und dann auf das Agar gelegt. Alternativ können die Scheiben durch Auftragen mit der Pipette von 1/10 ml Lösung auf eine trockene Scheibe beladen werden, und dann können die Scheiben auf den Agar gesetzt werden. Der Durchmesser der Hemmzone wird nach der geeigneten Inkubation (9 bis 18 h bei 370C für Salmonella gallinarum MB-1287 oder 12 bis 24 h bei 25°C für Vibrio percolans ATCC 8461) bestimmt. Gegebenenfalls werden Verdünnungen der zu prüfenden Lösungen in 0,05 Hol Kaliumphosphat-
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puffer, pH 7,4 ("Kaliumphosphatpuffer", der im folgenden als KPB bezeichnet wird) oder in entionisiertem Wasser hergestellt.
Die Berechnungen der Potenz (Wirksamkeit) erfolgt folgendermaßen: Die Steigung wird bestimmt, indem man die Durchmesser der Zone einer Lösung des Antibiotikums 890A2 oder 890Ac bestimmt und dann die vierfache Verdünnung (in KPB) dieser Lösung. Zwei Scheiben von jeder Konzentration werden auf einer einzelnen Platte geprüft, und dann wird die durchschnittliche Zonengröße bei Jeder Konzentration bestimmt. Die Steigung entspricht der Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengrößen. Die Wirksamkeiten werden dann nach der Formel berechnet:
Potenz (Einheiten/ml) =
WD-D ] log 2 ν
\ Steigung J (Potenz des Standards) χ Verdünnung χ 10
wobei D der durchschnittliche Durchmesser der Zonen bedeutet, die von der unbekannten Verbindung gebildet werden, Ds der durchschnittliche Durchmesser der Standardzonen bedeutet, und "Verdünnung" den Wert bedeutet, auf den die unbekannte Probe vor*dem Versuch verdünnt wurde. Wird kein Standard verwendet, wird angenommen, daß D_ 25 mm beträgt und die (Potenz des Standards) wird als 1 Einheit/ml angenommen, bestimmt an Vibrio percolans ATCC 8461. Reines 890A1 wird so definiert, daß es eine Potenz von 250 Einheiten/hydroxylaustauschbarer Absorptionseinheit bei 300 nm besitzt, wenn es als Standard verwendet wird.
Für Untersuchungen an Salmonella gallinarum MB-1287-Platten wird die Steigung auf gleiche Weise wie bei Vibrio percolan3 ATCC 8461-Platten bestimmt. Wenn kein Standard verwendet wird, werden nur relative Wirksamkeiten berechnet. Wird keine Steigung gemessen, wird ein Wert von 2,3 mm angenommen. Die
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Potenzberechnungen erfolgen wie bei dem Vibrio percolans ATCC 8461-Versuch. Wird kein 890A--Standard verwendet, kann zur Verifizierung, daß die Empfindlichkeit des Organismus im normalen Bereich liegt, eine Kontrolle mit Penicillin G mit 250 /ug/ml verwendet werden.
II. Assayverfahren bzw. Untersuchungsverfahren für die He der "890 Assay-Elnheiten"
Ein übliches Agarplatten Scheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als Standard verwendet. Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt. Eine Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in einer Nährbrühe-Hefeextrakt über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert und dann auf eine Dichte von 60% Durchlässigkeit bei 660 nm verdünnt. Ein 33,2 ml-Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 eines Mediums zugegeben, das aus einem Nähragar + 0,2% Hefeextrakt besteht und bei 460C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100 χ 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 10 ml/Schale, gegossen, abgekühlt und bei 2 bis 4°C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.
Die Konzentration an Cephaloridin, die 1 Einheit/ml von 890A äquivalent ist, wird durch Assay auf Platten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, jedoch 5 ml inokuliertes Medium/Platte enthalten, folgendermaßen bestimmt. Vier Konzentrationen von Cephaloridin stellen den Standard dar 3,12, 6,25, 12,5 und 25/Ug/ml mit 12,5/Ug/ml als Vergleichslösung. Die Durchmesser der Zonen auf einer 5 ml Platte für den Standard sind die folgenden.
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Konzentration (/Ug/ml) Zonendurchmesser (mm)
3,12 16,8
6,25 22,3
12,5 25,0
25 29,6
Eine Einheit wird als die Menge Antibiotikum/ml definiert, die eine 25 mm Hemmzone auf einer 5 ml Platte, wie bei Teil I oben beschrieben, ergibt. Bei diesem Assay wird eine Konzentration von 12,5/ug/ml Cephalodirin als äquivalent zu 1 Einheit 890A/ml angesehen. Da die Krümmung der Linie für Cephaloridin 4,0 beträgt, erfolgen die Berechnungen für die Potenz der Probe unter Verwendung einer Krümmung von 4,0.
III. Hvdroxvlamin-Reaktion
Beide Antibiotika 890A2 und 890Ac reagieren mit Hydroxylamin und ergeben eine Substanz mit stark verminderter Absorption bei 308 nm. Dies kann al3 Grundlage für die quantitative Bestimmung der Antibiotika 890A2 und 890Ac verwendet werden.
Die zu prüfende Lösung wird auf 0,05 Mol in Kaliumphosphat, pH 7,4, durch Zugabe vcn 1/20 Volumen einer Lösung eingestellt, die 0,8 Mol K2HPO^ und 0,2 Mol KH2PO^ enthält. 1/100 Volumen von 1 Mol Hydroxylamin-hydrochlorid wird dann zugegeben, und die Absorption bei 308 nm wird in Intervallen von 1/2 bis 2 min bestimmt. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Es wird eine Kinetik erster Ordnung angenommen, und die Halbwertszeit wird aus der Absorptionsabnahme während der ersten 10 min geschätzt. Aus dieser Halbwertszelt wird die Zeit, über die hinaus keine weitere Absorptionsabnahme mehr beobachtet werden sollte, bestimmt und die Beobachtungen werden über diese Zeit hinweg geführt. Beobachtet man keine weitere Abnahme über diese Zeit hinaus, so wird die gesamte Absorptionsabnahme (korrigiert für den Verdünnungseffekt und für die Absorption des Hydroxylamine) als "durch
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Hydroxylamin beseitigbare Absorption bei 3o8 nm (HAEA3Qg)11 genommen. Wird eine Absorptionsabnahme Über diese Zeit hinaus beobachtet, so wird die Rate der Hintergrundabsorptionsabnahme berechnet, und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt wird durch die Hintergrundabnahme korrigiert, unter der Annahme, daß die Hintergrundabnahme mit der Zelt linear ist. Der korrigierte Wert wird dann ale HAEA508 aufgezeichnet.
Die Zahl der NAEA,08-Einheiten ist gleich der HAEUUq8, multipliziert mit dem Volumen in ml.
In den folgenden Beispielen werden die Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Produkte erläutert.
Beispiel 1
Herstellung eines die Antibiotika 890A2 und 89OA5 enthaltenden Gemisches
Ein Rohr mit einer lyophilisierten Kultur von Streptomyces flavogrlseus MA-4434 wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Lösung aus Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung enthält.
Davis-Salze Natriumeitrat 0,5 g
K2HPO4 7,0 g
KH2PO4 3,0 g
(NH4)2S04 1,0g
MgSO4.7H2O 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Diese Suspension wird zum Inokulieren von vier Schrägkulturen aus sterilem Medium A der folgenden Zusammensetzung verwendet.
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Medium A
Dextrose 10,0
Pepton 5,0
Hefeextrakt 3,0
NaCl 12,705
KCl 0,72
FeSO4(NH4)2S04.6H2O 0,0351
MgCl2.6H2O 5,32
CaCl2.2H2O 0,728
destilliertes Wasser 1000 ml
pH 7,4 (vor der Sterilisation)
Agar 25,0 g
Die inokulierten Schrägkulturen werden 1 Woche bei 27 bis 280C inkubiert und dann bei 4 bis 60C, bis sie 10 Tage später verwendet werden. Der halbe Teil des Oberflächenwachstums einer dieser Schrägkulturen wird zur Inokulierung von 250 ml Erlenmeyerkolben mit Ablenkeinrichtungen verwendet, die 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten.
Medium B
Hefeautolysat (+Ardamine) 10,0 g
Glucose 10,0 g
Phosphatpuffer' ' 2,0 ml
MgSO4.7H2O 50,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von HCl oder NaOK auf 6,5 eingestellt
+Ardamine: Yeast Products Corporation (1) PhosphatpufferlSsung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,Og
destilliertes Wasser 1000 ml
Drei Impf kolben werden inokuliert, so daß man ausreichend Inokulum für die . zwölf 2 1-Produktionskolben, die bei diesem Ansatz fermentiert werden, erhält. Die Impfkolben werden
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1 Tag bei 280C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5t08 cm = 2" Schwingungsamplitude) geschüttelt. Die Kolben werden von der Schüttelvorrichtung entfernt und 1 Tag bei 40C gelagert. Der Inhalt dieser Impfkolben wird zur Inokulierung von zwölf 2 1 Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkeinrichtungen (7 ml Inokulum/Kolben), die 250 ml des Produktionsmediums C der folgenden Zusammensetzung enthalten , verwendet.
Medium C
Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g
primäre Hefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
entionisiertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,3 eingestellt.
Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24°C unter Bewegen auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) während 4 Tagen und 5 Stunden verwendet. Am Ende dieser Zeit wird der Inhalt der Kolben gesammelt und auf die Aktivität unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MG-1287- und Vibrio percolans ATCC 8461-Versuchsplatten geprüft, wobei 1,27 cm Versuchsscheiben verwendet werden, die in die zentrifugierten Brühenproben eingetaucht werden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Sammelversuch
Alter zum Zeitpunkt des Sammelns (h) 101 pH 7,1
Salmonella gallinarum (mm Zone) 31
Vibrio percolans (mm Zone) 43
Die Fermentationsbrühe wird zentrifugiert. Man erhält 2,2 1 klares Zentrifuget mit einem pH-Wert von 6,8. Dazu gibt man 22 mg (Äthylendinitrllo)-tetraessigsäure und stellt den pH-Wert auf 7,2 ein. Das Zentrifugat mit eingestelltem pH-Wert wird an 150 ml Dowex 1x2 Harz in dem Cl~-Zyklus bei
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15 ml/min adsorbiert, wobei der verbrauchte Strom als eine Fraktion gesammelt wird. Das Adsorbat wird mit 150 ml entionisiertem Wasser, das 10/Ug/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, und dann mit 596 NaCl, das 10/ug/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, gewaschen. Es werden 5 x 75 ml Fraktionen gesammelt.
Auf die 5#ige NaCl-Eluierungslösung folgt ein Verdrängungswaschen mit 60 ml entionisiertem Wasser, und dann werden die Antibiotika 890A2 und 89OA5 mit 90#igem (VoI/VoI) Methanol; 3#igem Ammoniumchlorid (Gew./Vol.); 10# Wasser (Vol./Vol.), das 10/ug/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, eluiert, wobei man 5 x 75 ml Fraktionen sammelt. Die Fraktionen werden gegenüber Vibrio percolans ATCC 8461 geprüft, und die erhaltenen Ergebnisse werden im folgenden als Prozent der Ausgangsbioaktivität angegeben.
Fraktion Wiedergewinnung, %
Beschickung verbraucht Wasserverdrängungswaschen
MeOH/NH4Cl-Eluatfraktionen 1 bis 3
Beispiel 2
SchUttelkolbenherstellung des Antibiotikums 890A2
Ein Rohr mit lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus HA-4434 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salze der folgenden Zusammensetzung enthält.
Davis-Salze
Natriumeitrat 0,5 g
K2HPO4 7,0 g
KH2PO4 3,0 g
(NH4J2SO4 1,0 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml
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Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen aus sterilem Medium A der folgenden Zusammensetzung verwendet.
Medium A 20,0 g
Glycerin 5,0 g
primäre Hefe 15,0 g
Fischmehl 1000 ml
destilliertes Wasser 20,0 g
Agar
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 eingestellt.
Die inokulierten Schrägkulturen werden eine Woche hei 27 his 28°C inkuhiert und dann bei 4 bis 6°C bis zu ihrer Verwendung (nicht länger als 21 Tage) gelagert.
1/3-Teil des Wachstums von einer Schrägkultur wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlenmeyerkolbens mit Ablenkeinrichtungen verwendet. Insgesamt werden vier Schrägkulturen zur Inokulierung von zwölf Kolben verwendet. Jeder Kolben enthält 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung.
Medium B (+Ardamine) 10,0 g
Hefeautolysat 10,0 g
Glucose 1 2,0 ml
Phosphatpuffer 50,0 mg
MgSO4.7H2O Wasser 1000 ml
destilliertes
pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt. +Ardamine: Yeast Products Corporation
PhosphatpufferlSsung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,Og
destilliertes Wasser 1000 ml
Die Impfkolben werden 1 Tag bei 27 bis 280C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt.
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Die Kolben und ihr Inhalt werden 1 Tag bei 40C stationär gelagert.
Vierundvierzig 2 1 Erlenmeyer-Produktionskolben, die je 200 ml Medium C enthalten, werden mit 8 ml/Kolben des Wachstums von den Impfkolben inokuliert. Das Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung.
Medium C
Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g
primäre Hefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
CoCl2.6H2O 5,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.
Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24°C inkubiert. Dabei rührt man auf einer 212 ü/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 4 Tage und 5 Stunden. Der Inhalt der Kolben wird gesammelt und seine Aktivität wird unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MB-1287- und Vibrio percolans ATCC 8461-Versuchsplatten und 1,27 cm (i/2 in.) Assayscheiben, die in die zentrifugieren Brühenproben eingetaucht wurden, bestimmt. Die Proben werden, sofern erforderlich, mit 0,02 Mol Phosphatpuffer, pH 7,0, verdünnt. Die Ergebnisse sind im folgenden tabellarisch aufgeführt.
Zeitpunkt der Gewinnung des Ertrags, Std. 101 pH 7,2
Salmonella gallinarum (mm Zone) 35
Vibrio percolans 1/10 Verdünnung (mm Zone) 25
890 Assayeinheit 121
Die Gesamtmenge von 7,0 1 der gesamten Brühe, die man bei dieser Fermentation erhält, wird auf 3°C gekühlt und in 200 ml-Teilen bei 9000 U/min während jeweils 15 min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Lösungen gibt man 1,7 ml
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0,1 Mol neutralem EDTA und dann wird die Charge bei 3°C gehalten.
Die obige Fermentation wird bei im wesentlichen identischen Bedingungen wiederholt, mit der Ausnahme, daß die vierundvierzig 2 1 Erlenmeyer-Produktionskolben mit 7 ml/Kolben mit gewachsenem Material aus den Impfkolben inokuliert wurden. Der pH-Wert und die Versuchsergebnisse sind im folgenden aufgeführt.
Zeitpunkt der Gewinnung des Ertrags, Std. 101 pH 7,3
Salmonella gallinarum (mm Zone) 38
Vibrio percolans 1/10 Verdünn, (mm Zone) 27
890 Assayeinheiten 92,8
Die Gesamtmenge von 7,4 1 der gesamten Brühe, die man bei dieser Fermentation erhält, wird auf 30C gekühlt und in 200 ml-Teilen bei 9000 U/min während jeweils 15 min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Lösungen gibt man 1,8 ml 0,1 Mol neutralem EDTA.
Die überstehenden Lösungen aus den zentrifugieren Brühen, die man bei den beiden obigen Fermentationen dieses Beispiels erhält, werden vereinigt und ergeben ein Gesamtvolumen von 13 1 mit einer Potenz von 80 Einheiten/ml, bestimmt durch Assay an Vibrio percolans ATCC 8461.
Die vereinigten überstehenden Lösungen werden durch eine Säule aus Dowex-1 χ 2 (Cl"), 0,297 bis 0,149 mm (50-100 mesh), mit Schichtdimensionen von 4,7 cm χ 50 cm und einer Strömungsrate von 60 ml/min geleitet. Die Säule wird mit 1 1 entionisiertem Wasser gewaschen und mit 5 1 einer 5%igen (Gew./Vol.) NaCl-Lösung, die 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 /uMol neutrales EDTA enthält, in einer Strömungsrate von 50 ml/min eluiert.
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Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser gewaschen und die Antibiotika 890A2 und 89OA5 werden mit 2 1 3%igem NaCl + 0,01 Mol tris-HCl, pH 7,0, + 25/uMol neutralem EDTA in 5Oj6igem Methanol in einer Strömungsrate von 40 ml/min eluiert. Fraktionen von 220 ml werden gesammelt.
Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella gallinarum MG-1287, erscheint in den Fraktionen 4 bis 8 mit einem Maximum in der Fraktion 5. Die Fraktionen 4 bis 8 enthalten 996 der in der Brühe vorhandenen anfänglichen Aktivität.
Die Fraktionen 4 bis 7 werden vereinigt, auf 150 ml an einem Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck konzentriert und durch Zugabe von 200 ml entionisiertem Wasser auf 350 ml verdünnt. Die Probe wird auf eine Säule (5 cm χ 25 cm) von XAD-2 gegeben, das zuvor mit jeweils 3 1 60#igem (Vol.AoI.) Aceton, entionisiertem Wasser und 5%igem (Gew./Vol.) NaCl gewaschen wurde. Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem V/asser bei 20 ml/min und anschließend mit 500 ml 60#igem (Vol./Vol.) wäßrigem Aceton eluiert. Es werden Fraktionen von jeweils 160 ml gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella gallinarum MB-1287, erscheint in den Fraktionen 1 bis 5 mit einem Maximum in den Fraktionen 3 und 4.
Die Fraktion 4, die erste, Aceton enthaltende Fraktion, wird auf 10 ml bei vermindertem Druck konzentriert und mit 90 ml entionisiertem Wasser verdünnt. Diese Probe wird auf eine Säule (5 cm χ 25 cm) von XAD-2 gegeben, das zuvor mit je 3 1 60#igem (Vol./Vol.) Aceton, entionisiertem Wasser und 5#igem (Gew./Vol.V NaCl gewaschen wurde. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 20 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen von 140 bis 190 ml gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt an Versuchen mit
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5Ό
Salmonella gallinarum MG-1287, erscheint in den Fraktionen 2 bis 7 mit einem Maximum in der Fraktion 4. Die Fraktionen 3, 4 und 5 werden vereinigt und zu der Fraktion 3 aus der XAD-Säule, die im vorhergehenden Absatz beschrieben wurde, zugegeben. Die vereinigten Fraktionen enthalten 26 400 BIoassayeinheiten, bestimmt durch Versuche an Vibrio percolans ATCC 8461; dies entspricht 2,5% der Ausgangsaktivität.
Die vereinigten XAD-2-Fraktionen 3 aus der ersten XAD-Säule, und die Fraktionen 3» 4 und 5 aus der zweiten XAD-Säule werden bei vermindertem Druck auf 25 ml konzentriert und dann werden 25 ml entionisiertes Wasser und 50 ml Methanol zugegeben. Die methanolische Lösung wird an einer Säule (2,15 x 26,4 cm) von Dowex-1 χ 4 (Cl"), minus 400 mesh (0,037 mm Öffnungen), adsorbiert, das mit 50#igem wäßrigem Methanol (Vol./Vol.) ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wird mit 1,44 ml von 0,07 Mol NaCl + 0,005 Mol NH4Cl + 0,0001 Mol NEU In 50%igem Methanol in einer Strömungsrate von 2 ml /min eluiert. Die Fraktionen von 12,1 ml werden gesammelt. Die Elution wird mit 2 1 von 0,08 Mol NaCl + 0,005 Mol NH4Cl + 0,0001 Mol NH, in 50#igem Methanol weitergeführt, wobei man Fraktionen von je 11,7 ml isoliert.
In den Fraktionen 138 bis 162 tritt in der UV-Absorption bei 300 nm ein Peak auf, mit einem Maximum bei den Fraktionen 149 bis 150. Die Absorption bei 305 nm. kann durch Umsetzung mit L-Cystein bei neutralem pH-Wert bis zu 77# ausgelöscht werden. Die Fraktionen 145 bis 155, die das Antibiotikum 890A2 enthalten, werden gesammelt und auf 2,4 ml konzentriert, die insgesamt 70,5 A,00-Einheiten enthalten.
Die konzentrierte Probe wird auf eine Säule (2,2 χ 70 cm) aus Bio-Gel P-2, 0,074 bis 0,037 mm Öffnungen (200 bis 400 mesh), das mit 1 1 entionisiertem Wasser gewaschen wurde, aufgebracht. Die Probe kann bis zur Schichthöhe ablaufen, und
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der Rückstand wird durch zweimaliges Spülen mit je 1 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser in einer Rate von 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 2 bis 3,5 ml werden gesammelt.
Der Hauptabsorptionspeak tritt bei den Fraktionen 64 bis bei 308 nm auf, die unmittelbar dem Natriumchlorid vorhergehen und von diesem nicht vollständig abgetrennt sind. Die Fraktionen 66 und 67 werden vereinigt. Sie enthalten 27 Absorptionseinheiten des Antibiotikums 890A2 bei 308 nm und 29 bis 43 mg NaCl (geschätzt durch Leitfähigkeitsmessungen) . Diese vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 1,5 ml konzentriert und lyophilisiert; man erhält 43,7 mg Feststoffe.
Beispiel 3
Herstellung der Antibiotika 890A2 und 89OA5
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salze der folgenden Zusammensetzung enthält.
Davis-Salze 0,5 g
Natriumeitrat 7,0 g
K2HPO4 3,0 g
KH2PO4 1,0 g
(NH4)2S04 0,1 g
MgSO4.7H2O 1000 ml
destilliertes Wasser
Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen des Mediums A der folgenden Zusammensetzung verwendet.
Medium A
Glycerin 20,0 g
primäre Hefe 5,0 g
Fischmehl 15,0 g
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destilliertes Wasser 1000 ml Agar 20,0 g
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 eingestellt.
Die inokulierten Schrägkulturen werden 1 Woche bei 27 bis 28°C inkubiert und dann bei 4 bis 6°C bis zu ihrer Verwendung gelagert (nicht langer als 21 Tage).
10 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung Medium B
Hefeautolysat (+Ardamine) 10,0 g
Glucose 10,0 g
Pho sphatpuffer 2,0 ml
MgSO4.7H2O 50,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt
+Ardamine: Yeast Products Corporation Phosphatpufferlösung KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,Og
destilliertes Wasser 1000 ml
werden aseptisch zu einer dieser Schrägkulturen gegeben» die Sporen und Luftmyzelia werden in die Suspension abgekratzt und 3,3 ml dieser Suspension werden zur Inokulierung von 2 Erlenmeyerkolben mit Ablenkeinrichtungen, der 500 ml Medium B enthält, verwendet. Dieser Impfkolben wird bei 28°C auf einer 160 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 36 h geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt ist das Wachstum zufriedenstellend.
Der Bewuchs (bzw. das gewachsene Material) aus diesem Impfkolben wird zur Inokulierung von einem 189 1 rostfreien Stahlimpf tank, der 160 1 Medium B enthält, verwendet. Dieser Tank wird 24 h bei 28°C gehalten, wobei eine RUhrrate von
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150 U/min und eine Luftströmung von 84,9 1(3 cu.ft.)/min verwendet werden. Ein Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000 (Dow Chemical Corp.), wird je nach Bedarf verwendet, aber nicht in einer größeren Menge als 0,196. Die pH-Bestimmungen werden wie folgt durchgeführt:
Alter, Std. J>_
pH 6,3 6,35
43 1 des in diesem Impftank gewachsenen Materials werden zur Inokulierung von einem 756 1 rostfreien Stahl-Fermentationsbehälter, der 467 1 Medium C enthält, verwendet. Das Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung.
Medium C
Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g
primäre Hefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
CoCl2.6H2O 5,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.
Dieser Tank wird unter Verwendung einer Rührrate von 146 U/min und einer Luftströmung von 255 1 (9 cu.ft.)/min 92 h bei 25°C in Gang gehalten. Zusätzliches Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000, wird je nach Bedarf zugegeben, wobei jedoch nicht mehr als 0,196 zugefügt wird. Die antibakteriellen Assays werden mit Salmonella gallinarum MB-1287, Vibrio percolans ATCC 8461 durchgeführt; man erhält die folgenden Ergebnisse.
Alter, h 0 12 24 36 43 60 72 84 92
pH 6,6 6,7 6,65 6,3 6,0 6,4 6,15 6,5 6,5
MB-1287
OUB - 		S 19 26 28 32
ATCC 8461
mm(i-10)		 S •m 21 24 26 30
890A Ein
heiten/ml		 NA NA 6,8 13,5 24,9 24,3
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15 839 ° γ
Die 890A Einheiten/ml werden bestimmt, wie in dem Teil mit der Überschrift "II. Untersuchungsverfahren für die Bestimmung von '890 Assayeinheiten111 angegeben wird.
473 1 (125 gal.) Brühe werden auf 50C gekühlt und durch bzw. mit einer Titan P-9 Zentrifuge zentrifugiert. 22,7 kg (50 lbs.) Celite werden zu 379 1 (100 gal.) der überstehenden Flüssigkeit gegeben, und die Suspension wird durch eine Shriver 45,7 cm (18 in.) Filterpresse filtriert. Die 344 1 (91 gal.) Filtrat werden an einer Säule adsorbiert, die 26,5 1 (7 gal.) Dowex-1 χ 2 (Cl"), 0,297 bis 0,149 mm öffnungen (50-100 mesh), enthält, und die Säule wird mit 37,9 1 (10 gal.) entionisiertem Wasser und anschließend mit 114 1 (30 gal.) 5% NaCl + 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0 , + 25/uMol neutrales EDTA in entionisiertem Wasser gewaschen. Nach einem weiteren Waschen mit 18,9 1 (5 gal.) entionisiertem Wasser werden die Antibiotika 890A2 und 89OA5 mit 94,6 1 (25 gal.) 3% NaCl + 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/uMol neutrales EDTA in 50#Lgem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol eluiert. 18,9 1 (5 gal.) Fraktionen werden gesammelt.
Die antibiotische Aktivität, die durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287 bestimmt wird, erscheint in den Fraktionen 1 bis 5 mit einem Maximum in der Fraktion 3· Die Fraktionen 2 und 3» die 10,996 der Aktivität der angewendeten Brühe enthalten, werden vereinigt und auf 7,57 1(2 gal.) bei vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Probe wird mit 30,3 1 (8 gal.) entionisiertem Wasser verdünnt und erneut auf 7,57 1 bei vermindertem Druck zur Entfernung von restlichem Methanol konzentriert.
7,57 1 (2 gal.) Konzentrat werden auf eine Säule aufgebracht, die 37,9 1 (10 gal.) XAD-2 enthält, das zuvor mit 189 1 (50 gal.) 60%igem wäßrigem Aceton und anschließend mit 189 1 entionisiertem Wasser und 189 1 5%igem NaCl gewaschen wurde.
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Die Säule wird mit 142 1 (37,5 gal.) entionisiertem Wasser eluiert. Es werden drei Fraktionen mit 9,46 1 (2,5 gal.) und anschließend 6 Fraktionen mit 18,9 1 (5 gal.) gesammelt. Die Aktivität, die durch Versuche an Salmonella gallinarum MB-1287-Platten bestimmt wird, tritt in den Fraktionen 1 bis 6 auf mit einem Potenzpeak bei der Fraktion 2. Die Fraktionen 2 bis 5, die 64% der Aktivität, die auf die XAD-Säule aufgebracht wurde,oder 520 000 Einheiten enthalten, werden vereinigt.
Die Fraktionen 2 bis 5 werden durch Verdampfen bei vermindertem Druck auf 120 ml konzentriert. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat wird auf eine Säule (7 x 50 cm) von XAD-2, die mit 8 1 60%igem wäßrigem Aceton und anschließend mit 4 1 entionisiertem Wasser und 8 1 5%igem NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde, aufgebracht. Die Probe kann bis zur Schichthöhe ablaufen, und dann wird die Säule dreimal mit 20 ml Teilen entionisiertem Wasser gespült, wobei man jedesmal bis zur Schichthöhe ablaufen läßt. Das Antibiotikum wird mit 6 1 entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 40 ml/min eluiert. Acht Fraktionen von 200 ml und anschließend elf Fraktionen von 400 ml werden gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella gallinarum MB-1287-Platten, tritt in den Fraktionen 3 bis 18 auf, wobei ein Aktivität speak in der Fraktion 8 beobachtet wird.
Die Fraktionen 8 bis 12 mit den höchsten Verhältnissen der Bioaktivität/A220 und mit 225 000 Bioaktivitätseinheiten, bestimmt durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287, werden für die weitere Verarbeitung vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert und 50 ml Methanol werden zugegeben. Die Probe wird auf eine Säule von Dowex-1 χ 4 (Cl"), minus 400 mesh
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(0,037 mm offnungen), Schichtdimensionen 2,2 χ 40 cm, das zuvor mit 50#igem Methanol gewaschen wurde, aufgebracht. Die Säule wird mit 2 1 von 0,07 Mol NaCl + 0,005 Mol NH4Cl + 0,0001 Mol NH3 in 50#igem wäßrigem Methanol mit einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 12 ml werden gesammelt.
Man beobachtet in dem Abstrom zwei ungleiche Bioaktivitätspeaks, bestimmt durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287, die den zwei Peaks des Materials mit einem Absorptionsmaximum bei 308 nm entsprechen. Der größte Teil der Absorption bei 308 nm in beiden Peaks ist durch Umsetzung mit Hydroxylamin auslöschbar.
Der erste Peak, der 890A2 enthält, tritt in den Fraktionen 98 bis 136 auf, und der zweite Peak, der 89OA5 enthält, tritt in den Fraktionen 136 bis 158 auf. Die Fraktionen 112 bis 130 werden vereinigt; man erhält eine 890A2 Dowex-Charge, und die Fraktionen 138 bis 148 werden vereinigt; man erhält eine 890Ae Dowex-Charge. Das 890A2 wird weiter durch Entsalzen an Sephadex G-10 gereinigt.
Die Fraktionen 112 bis 130, die 890A2 enthalten, werden bei vermindertem Druck auf 5,5 ml konzentriert, und das Konzentrat wird auf eine Säule (2,15 x 70 cm) aus Sephadex G-10 aufgebracht und mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert. Es werden jeweils Fraktionen von 2,85 ml gesammelt. Die Bioaktivität, die durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287 bestimmt wurde, tritt in den Fraktionen 60 bis 98 auf. Die Fraktionen 78 bis 90 zeigen die höchsten A,08/A2g0-Verhältnisse und diese werden für die Lyophilisierung vereinigt. Der pH-Wert der vereinigten Fraktionen beträgt 4,1 und durch Zugabe von 8/ul 1 molarem Ammoniak wird er auf 7,8 eingestellt. Das vereinigte Material enthält 52 A,QQ-Einheiten mit einem A,08/A2g0-Verhältnis von
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0,76, was einen wesentlichen Abbau des Antibiotikums während dieses Verfahrens anzeigt.
Die gesammelten Fraktionen 78 bis 90 werden bei vermindertem Druck auf 1,69 ml konzentriert. Zwei 0,1 ml Proben werden entfernt und getrennt in kleinen, kegelförmigen Reaktionsglasampullen lyophilisiert. Der Rest wird in einer 14 ml Glasampulle mit Schraubverschluß lyophilisiert; man erhält 1,29 mg Feststoffe, die 890A2 enthalten.
Beispiel 4
Herstellung von
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salze der folgenden Zusammensetzung enthält.
Davis-Salze
Natriumeitrat 0,5 g
K2HPO4 7,0 g
KH2PO4 3,0 g
(NH4)2SO4 1,0g
MgSO4.7H2O 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen aus Medium A der folgenden Zusammensetzung verwendet.
Medium A
Glycerin 20,0 g
primäre Hefe 5,0 g
Fischmehl 15,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Agar 20,0 g
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 eingestellt.
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Die inokulierten Schrägkulturen werden 1 Woche bei 27 bis 28°C inkubiert und dann bei 4 bis 6°C bis zu ihrer Verwendung gelagert (nicht länger als 21 Tage).
10 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung Medium B
Hefeautolysat (+Ardamine) 10,0 g Glucose 10,0 g
Phosphatpuffer 2,0 ml
MgSO4.7H2O 50,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt
+Ardamine: Yeast Products Corporation Phosphatpufferlösung
KH2PO4 Wasser 91,0 g
Na2HPO4 95,0 g
destilliertes 1000 ml
werden aseptisch zu einer dieser Schrägkulturen gegeben, wobei die Sporen und Luftmyzelia in die Suspension abgekratzt werden und die Suspension dann zur Inokulierung von drei 2 1 Erlenmeyerkolben mit Ablenkeinrichtungen, die 500 ml Medium B enthalten, zugegeben wird, und zwar in einer Menge von 3,3 ml/Kolben. Diese Impf kolben werden bei 28° C auf einer 160 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 36 h geschüttelt, wobei zu diesem Zeitpunkt das Wachstum zufriedenstellend ist.
500 ml des gewachsenen Materials aus diesen Impfkolben werden zur Inokulierung eines 189 1 rostfreien Stahlimpftanks, der 16O 1 Medium B enthält, verwendet. Dieser Tank wird bei 280C unter Verwendung einer Rührrate von 150 U/min und einer Luftströmung von 84,93 1 (3 cu.ft.)/min während 24 h betrieben. Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000 (Dow Chemical Corp.)» wird je nach Bedarf, aber nicht in einer Menge über 0,196, verwendet. Die pH-Bestimmungen werden wie folgt durchgeführt.
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Alter, h O 24
pH 6,1 5,6
43 1 des in diesem Impftank gewachsenen Materials werden zur Inokulierung eines 756 1 rostfreien Stahlfermentationsgefäßes, das 460 1 Medium C enthält, verwendet, wobei das Medium C die folgende Zusammensetzung besitzt. Medium C
Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g
primäre Hefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
CoCl2.6H2O 5,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.
Das Medium war zuvor 60 min bei 120°C sterilisiert worden. Dieser Tank wird bei 25°C unter Verwendung einer Rührrate von 160 U/min und einer Luftströmung von 283 1 (10 cu.ft.)/min 144 h betrieben. Zusätzliches Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000, wird je nach Bedarf zugegeben, jedoch nicht in einer Menge über 0,1%. Die antibakteriellen Versuche werden an Salmonella gallinarum MB-1287 und Vibrio percolans ATCC 8461 durchgeführt, und die Werte sind die folgenden.
Alter, h 0 24 48 72 96 120 144
pH 6,2 6,2 6,3 7,0 7,3 7,7 8,2
MB-1287 mm T 26,5 28,0 33,5 32,5 31,5
MB-1272 mm
(1-10 Verdünn.) -		 0 21,5 26,5 35,0 31,5 33,0
890A Einheiten/
ml		 NA 6,4 16,5 16,7 22,5 19,5
Die 890A Einheiten/ml werden bestimmt, wie in dem Teil mit der Überschrift "II. Versuchsverfahren für die Bestimmung von '890 Assayeinheiten"1 beschrieben.
379 1 (100 gal.) Brühe werden auf 5°C gekühlt und mit bzw. durch eine Titan P-9 Zentrifuge zentrifugiert. 18,1 kg (40 lbs) CeIite werden zu 289 1 (75 gal.) der überstehenden
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Flüssigkeit gegeben und die Suspension wird durch eine Shriver 45,7 cm (18 in.) Filterpresse filtriert. 227 1 (60 gal.) des Filtrats werden an einer Säule adsorbiert, die 26,5 1 (7 gal.) Dowex-1 χ 2 (Cl"), 16 bis 100 mesh (entsprechend 1,19 bis 0,149 mm Öffnungen), enthält, und die Säule wird mit 37,9 1 (10 gal.) entionisiertem Wasser und dann mit 114 1 (30 gal.) 5#igem NaCl + 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/uMol neutralem EDTA gewaschen. Nach weiterem Waschen mit 18,9 1 (5 gal.) entionisiertem Wasser werden die Antibiotika 890A2 und 89OA5 mit 132 1 (35 gal.) 3#igem NaCl + 0,01 Mol tris-HCl, pH 7,0, + 25/uMol neutralem EDTA in 50#igem Methanol eluiert. Es werden jeweils Fraktionen von 18,9 1 (5 gal.) gesammelt.
Die Bioaktivität, bestimmt durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287, tritt in den Fraktionen 1 bis 7 auf mit einem Maximum bei der Fraktion 3.
Die Fraktionen 3 bis 7, die 18# der aufgebrachten Aktivität enthalten, werden bei vermindertem Druck auf 9,46 1 (2,5 gal.) konzentriert und das Konzentrat wird auf eine Säule aufgebracht, die 37,9 1 (10 gal.) XAD-2 enthält, das zuvor mit 189 1 (50 gal.) von jeweils 60#igem (Vol.AoI.) wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5#lgem NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Antibiotika 890A2 und 890Ae werden mit 132 1 (35 gal.) von 25/uMol neutralem EDTA in entionisiertem Wasser eluiert. Zuerst wird eine Fraktion von 18,9 1 (5 gal.) und anschließend werden vier Fraktionen von 9,46 1 (2,5 gal.) und vier Fraktionen von 18,9 1 (5 gal.) gosammelt. Die Bioaktivität, die durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287 bestimmt wird, tritt in den Fraktionen 3 bis 9 auf mit einem Maximum bei der Fraktion 4.
Die Fraktionen 3 bis 6, die 1896 der Aktivität der gefilterten Brühe enthalten, werden vereinigt und bei vermindertem
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Druck auf 122 ml konzentriert. Das Konzentrat wird durch Zugabe von 5 ml 1 molarer HCl auf einen pH-Wert von 6,45 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule (7,9 x 60 cm) aus XAD-2, das zuvor mit je 16 1 6O96igem wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5#igem NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde, gegeben. Die Antibiotika 890A2 und 890Ac werden mit 8 1 entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 50 ml/min eluiert. Fraktionen von 200 bis 1000 ml werden gesammelt.
Die Bioaktivität, bestimmt durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287, tritt in den Fraktionen 5 bis 20 auf, was 1900 bis 7700 ml eluiertem Volumen entspricht. Die und HAEA^QA-Werte werden ebenfalls bei den Fraktionen 9 bis 20 bestimmt. Die Fraktionen 9 bis 12 besitzen 261 bis 286 Biopotenzeinheiten/HAEA,oZf-Einheit, die Fraktionen 16 bis 20 haben 23 bis 28 Einheiten/HAEA,n/L-Einheit und die Fraktionen
jKJH
13 bis 16 besitzen Zwischenwerte, was eine wesentliche Trennung der Antibiotika 890A2 und 890Ac auf dieeer Säule anzeigt. Die Fraktionen 15 bis 19, die hauptsächlich 890Ac enthalten, werden für die weitere Reinigung vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen 15 bis 19 werden bei vermindertem Druck auf 250 ml konzentriert. Zu dem Konzentrat gibt man 250 ml Methanol und die Probe wird in einer Strömungsrate von 2 ml/min auf eine Säule (3,4 x 50 cm) aus Dowex-1 χ 4 (Cl"), minus 400 mesh (0,037 mm öffnungen), gegeben, das zuvor mit 50#igem Methanol gewaschen wurde. Die Säule wird mit 8 1 0,1 M NaCl + 0,005 M NH4Cl + 0,0001 M NH3 in 50&Lgem Methanol in einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.
Das Antibiotikum 890Ac wird in den Fraktionen 505 bis 605 mit einem Peak in der Fraktion 550 eluiert. Die Fraktionen 520 bis 580 werden gesammelt und ein 300 ml Teil des gesam-
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melten Materials werden entnommen und bei vermindertem Druck auf 4 ml konzentriert. Zu dem Konzentrat gibt man 6 ml Methanol und 25/Ul 1 M NaOH; man erhält einen End-pH-Wert von 7»3.
Das Konzentrat mit eingestelltem pH-Wert wird auf eine Säule (2,2 χ 70 cm) aus Sephadex G-10 gegeben, das zuvor mit 0,02 mMol NH3 in 50#igem Methanol äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 0,02 mMol NH, in 50#igem Methanol in einer Strömungsrate von 1ml/min eluiert.
Das 890Ac erscheint in den Fraktionen 38 bis 88 mit einem Maximum bei den Fraktionen 39 und 40. Die Fraktionen 40 bis 68 werden vereinigt und mit 1 M NaOH wird der pH-Wert auf 6,3 bis 6,8 eingestellt. Die vereinigten Fraktionen 40 bis 68 werden bei vermindertem Druck auf 4 ml konzentriert. 80 /Ul 1 M NaOH werden während der Konzentration so zugegeben, daß der pH-Wert zwischen 7,0 und 7,3 bleibt. Zu den letzten 4 ml Konzentrat gibt man 20/ul 1 M NaOH, wodurch der pH-Wert auf 7,4 eingestellt wird.
Das Konzentrat wird weiter gereinigt, indem man es auf eine Säule (3,4 χ 46 cm) aus Dowex-50 χ 2 (Na+), 200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm Öffnungen), aufbringt, das zuvor mit 4 1 0,2 mM NaOH und dann mit 800 ml entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Das Antibiotikum wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 4,1 ml/min eluiert. Fraktionen von 8,2 ml werden gesammelt.
Das Antibiotikum tritt in den Fraktionen 22 bis 27 mit einem Maximum bei der Fraktion 23 auf. Die Fraktionen 23 bis 25 werden vereinigt, die 152 A,0Q-Einheiten mit einem Verhältnis A308^A260 von 2'°° entnalten· Leitfähigkeitsmessungen zeigen, daß 70/uMol NaCl in den gesammelten Fraktionen vorhanden sind.
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Ein 4 ml Teil der gesammelten Dowex-50-Fraktionen 23 bis wird in die Ammoniumform durch Durchleiten durch eine Säule (0,7 cm χ 12 cm) aus Dowex-50 χ 2 (NH^+), 200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm Öffnungen), überführt, wobei das Harz zuvor mit 100 ml 0,1 mM NH, und anschließend mit 10 ml entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit entionisiertem Wasser eluiert; es werden Fraktionen von 1 bis 2 ml gesammelt. Alle Fraktionen mit einem A508-Wert Über 1 werden vereinigt; man erhält insgesamt 6 ml mit A,0Q = 30. Diese Probe wird bei vermindertem Druck auf 0,725 ml konzentriert, und zwei 50/ul aliquote Teile werden getrennt in zwei konische 0,5 ml Reaktionsampullen pipettiert und lyophilisiert.
Die Trimethyl-Silylierung des Antibiotikums 89oAc ergibt drei unterschiedliche Derivate: ein Di- und ein Tri-methylsilylderivat (Molekulargewichte 456 bzw. 528) und eine geringe Menge eines Tetra-trimethylsilylderivats eines hydrolysierten Produktes (Molekulargewicht 618), worin der ß-Lactamring geöffnet ist.
Die Werte für die wichtigsten Massenfragmente im Spektrum werden im folgenden aufgeführt.
Di-trimethylsilylderivat: 441, 299, 298 und 84; Tri-trimethylsilylderivat: 513, 371 und 156; Tetra-trimethylsilylderivat (es wird nur ein Signal mit niedriger Auflösung beobachtet): 618 und 603.
Ein 18,6 ml Teil der gesammelten Dowex-50-Fraktionen 23 bis 25 wird bei vermindertem Druck auf 3 ml konzentriert. Ein 1,96 ml aliquoter Teil wird gefroren und in einer 14 ml Glasampulle lyophilisiert; man erhält 2,73 mg Feststoffe, die ein Gemisch aus Antibiotikum 890Ac und Natriumchlorid enthalten. Da die Leitfähigkeiten der Fraktionen 23 bis 25 anzeigen, daß 45% Feststoffe aus Natriumchlorid bestehen, kann
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ein E%-Wert von 490 bei 308 mn für eine salzfreie'Probe von 890Ac aus dem beobachteten E?S-Wert von 272 berechnet werden. Die restlichen 1,0 ml von den 3,0 ml Konzentrat werden getrennt für die NMR-Analyse lyophilisiert.
In der folgenden Tabelle sind die 100 MHz-NMR-Signale für das 890Ac-Natriumsalz in D2O, bezogen auf den Innenstandard DSS, angegeben. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm aufgeführt und die Kupplungskonstanten in Hz. Die offensichtlichen Mehrfachheiten sind angegeben.
1,29 (D, J=6,2, CH3-CH); 2,05 (S, CH,C=O); 3,09 (entsprechend D eines D, C-CH2-C); 3,41 (D eines D, J=5,0, 3,0,J^CH-C=O); 4,16 (M, >^H-N und>CH-0H); 6,00 und 7,11 (Dublette, J=13,8, S-CH=CH-N).
Beispiel 5
Schüttelkolbenproduktion des Antibiotikums 890A1
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4600 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält.
Medium A
Hefeextrakt
Glucose
MgSO4.7H2O
Pho sphatpuffer1
destilliertes Wasser
Phosphatpufferlösung
KH2PO4
Na2HPO4
destilliertes Wasser
Diese Suspension wird zur Inokulation eines 250 ml Erlenmeyer-Impf kolbens mit Dreifachablenkeinrichtungen verwendet,
- 61 709846/0891
10,0 g ml
10,0 g g
0,05 g g
2 ml ml
1000
91,0
95,0
1000
der 54 ml Impfmedium B der folgenden Zusammensetzung enthält. Medium B
Autolysierte Hefe (Ardamine ) 10,0 g
Glucose 10,0 g
MgSO4.7H2O 0,05 g
Phosphatpuffer 2 ml
destilliertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 6,5 eingestellt +Ardamine: Yeast Products Corporation
Phosphatpufferlösung
KH2PO4 Wasser 91 ,0 g
Na2HPO4 95 ,0 g
destilliertes 1000 ml
Die Impfkolben werden mit Baumwolle verschlossen und 30 h bei 28+10C auf einer 220 U/min Gyro-Rotationsschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt.
Fünfzig 250 ml Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkeinrichtungen, die je 40 ml Produktionsmedium C enthalten, werden mit 1 ml/Kolben Brühe aus dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Baumwolle verschlossen. Medium C
Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g
primäre Hefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
CoCl2.6H2O 5,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt,
Nach der Inokulation werden die Produktionskolben bei 28+10C unter Schütteln auf einer 220 U/min Gyro-Rotationsschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 3 Tage inkubiGrt. Die Aktivität des Materials in den Kolben wird gegenüber Standard Vibrio percolans ATCC 8461-Assayplatten unter Verwendung von 1,27 cm Versuchsscheiben, die in die zentrifu-
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gierten Fermentationsbrühenprobe eingetaucht sind, geprüft. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt.
Zeitpunkt bei der Sammlung des
Egtrags, h 7| 4
Vibrio percolans (1/100 Ver- '
dünnung; Assay 23 mm
890 Assay, Einheiten/ml 103
Die 890A Einheiten/ml werden bestimmt, wie in dem Teil mit der Überschrift "II. Untersuchungsverfahren für die Bestimmung von '890 Assay Einheiten"1 beschrieben.
Die gesamte Brühe wird in 200 ml Teilen in Polycarbonatflaschen bei 9000 U/min während 15 min zentrifugiert; man erhält 1600 ml vereinigte überstehende Lösung mit einer Wirksamkeit von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml 0,1 M neutrales EDTA. ·
Die zentrifugierte Brühe wird an Dowex-1 χ 2 (Cl"), 50 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 mm Öffnungen) Säule, Schichtdimensionen 3»8 χ 22 cm, in einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 1 1 entionisiertem Wasser, das 50 g Natriumchlorid, 0,02 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25/uMol neutrales EDTA, in einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen von 10 ml gesammelt.
Das Antibiotikum 890A1 tritt in den Fraktionen 13 bis 81 auf mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 33, was durch die erste Anwendung des Salzeluats hervorgerufen wird. Die Fraktionen 24 bis 41 mit den höchsten Biopotenz/AgpQ-Verhältnissen werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 29 000 Einheiten oder 1796 der angewendeten Bioaktivität.
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Das Dowex-Eluat wird auf 10 ml konzentriert, der pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3»3 x 36 cm, gegeben, wobei das Harz zuvor mit je 2 1 60%igem wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5% (Gew./ Vol.) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt.
Die antibiotische Aktivität tritt in den Fraktionen 6 bis 14 auf, was 220 bis 2560 ml des eluierten Volumens entspricht. Der Peak tritt bei den Fraktionen 9 und 10 auf und erstreckt sich von 370 bis 590 ml des eluierten Volumens. Die Fraktionen 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens entsprechen, besitzen die höchsten HAEAaQ0 ^^n^Verhältnisse und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Diese Fraktionen enthalten 36600 Einheiten; dies entspricht 126% der offensichtlich angewendeten Aktivität.
Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 werden auf 100 ml konzentriert, und das Konzentrat wird auf eine Säule aus Dowex-1x4 (Cl"), minus 400 mesh (0,037 mm öffnungen), Schichtdimensionen 2,2 χ 41 cm, in einer Strömungsrate von 2 ml/min gegeben. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 3 1 0,07 M NaCl + 0,005 M NH^Cl + 0,0001 M NH3 in entionisiertem Wasser in einer Rate von 2 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend mit der ersten Anwendung des Eluierungsmittels.
Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A1 tritt in den Fraktionen 181 bis 217 auf mit einem Maximum bei der Fraktion 198. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Adsorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.
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Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16/Ul 1M NaOH auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Bio-Gel P-2, 200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm Öffnungen), Schichtdimensionen 2,15 x 70 cm, gegeben, mit 3 x 1 ml Waschlösungen aus entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser von 0,96 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 3,85 ml werden gesammelt.
Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A1 tritt in den Fraktionen 24 bis 44 auf mit einem Maximum bei den Fraktionen 33 und 34. Die Fraktionen 27 bis 38 mit den höchsten A3oo/A245~Ver~ hältnissen werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 72 A,oo-Einheiten.
Zur Durchführung der Lyophilisierung werden die vereinigten Fraktionen auf 3,0 ml konzentriert, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 10/ul 0,1M NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile von Je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml Glasampullen mit Schraubverschluß lyophilisiert. Jede Probe enthält 1,73 mg 890A1; dies entspricht 35,8
Die Antibiotika 890A2 und 890Ac enthaltende Zubereitung
Zubereitungen, die die erfindungsgemäßen Antibiotika enthalten, können in verschiedenen Einheitsdosisformen verabreicht werden, z. B. in festen oder flüssigen oral einnehmbaren Dosisformen. Die Antibiotika 890A2 und 890Ac können ge trennt oder zusammen verwendet werden. Die im folgenden beschriebenen Zusammensetzungen betreffen die Antibiotika 890A2 und 890Ac allein und gemeinsam. Für eine gegebene klinische Situation werden die Mengen an Antibiotikum 890Ae, die verabreicht werden, im allgemeinen größer sein als die
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Mengen an 890A2· Die Zusammensetzungen pro Einheitsdosis können sowohl in flüssiger als auch in fester Form von 0,1 bis 99% aktives Material enthalten, wobei der bevorzugte Bereich etwa 10 bis 60% beträgt. Die Zusammensetzung wird im allgemeinen etwa 100 bis etwa 2000 mg, ausgedrückt durch das Gewicht, an aktivem Bestandteil, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthalten. Es ist jedoch im allgemeinen bevorzugt, eine Dosismenge im Bereich von etwa 250 bis 2000 mg zu verwenden. Bei der parenteralen Verabreichung ist die Einheitsdosis im allgemeinen die reine Verbindung in steriler Wasserlösung oder in Form eines löslichen Pulvers, das für eine Lösung bestimmt ist. Beispielhafte Zubereitungen können nach den folgenden Verfahren hergestellt werden.
Kapseln pro Kapsel
Antibiotikum 400 mg
Lactose, U.S.P. in einer Menge, die ausreicht, in Nr. 0 Kapseln jeweils etwa 475 mg einzufüllen.
Bei dem obigen Beispiel werden die aktive Verbindung und das Verdünnungsmittel unter Bildung eines einheitlichen Gemisches, das dann in Nr. 0 Hartgelatinekapseln mit der Hand oder gegebenenfalls mit einer geeigneten Vorrichtung eingefüllt wird, vermischt. Das Mischen und Abfüllen erfolgt bevorzugt in einem Raum mit einer relativen Feuchtigkeit unter 40%.
Tabletten pro Tablette
Antibiotikum 890A2 330 mg
Calciumphosphat 192 mg
Lactose, U.S.P. 190 mg
Maisstärke 80 mg
Magnesiumstearat 8 mg
800 mg
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Bei dem obigen Beispiel wird die aktive Verbindung mit dem Calciumphosphat, der Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke vermischt. Das Gemisch wird mit einer 15^igen Maisstärkepaste granuliert und grobgesiebt und dann erneut durch Nr. 16 (1,19 nun) Siebe gesiebt. Der Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat werden zugegeben und das Gemisch wird zu Tabletten verpreßt, die einen Durchmesser von etwa
1,27 cm (I/211) besitzen und je 800 mg wiegen.
Alternativ kann die aktive Komponente mit dem Calciumphosphat, Lactose und der Hälfte der Maisstärke vermischt werden. Das Gemisch wird auf einer schweren Arbeitspresse unter Bildung einer kompakten, tablettenartigen Masse "verdichtet". Diese Masse wird zu einem Nr. 16 mesh Granulat (entsprechend einem Sieb mit 1,19 mm Öffnungen) zerkleinert.
Der Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat werden
zugegeben und das Gemisch wird zu Tabletten, die einen
Durchmesser von etwa 1,27 cm (1/2") besitzen und je 800 mg wiegen, gepreßt.
Lyo-Form (für die Injektion pro Ampulle
Antibiotikum 890A2 500 mg
Wasser für die Injektion, U.S.P. bis zu 2 ml
Bei dem obigen Beispiel wird die aktive Verbindung in ausreichend Wasser für die Injektion in dem angegebenen Verhältnis gelöst. Die Lösung wird zur Sterilisierung durch
Selas-Kerzen (Selas candles) oder Milliporen-Membranfilter filtriert. Die Lösung wird geteilt und in sterile Ampullen abgefüllt. Die Ampullen und der Inhalt werden gefroren, und das Wasser wird durch Lyophilisierung aseptisch entfernt.
Die Ampullen, die den sterilen, trockenen Feststoff enthalten, werden aseptisch abgedichtet bzw. verschlossen.
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Für die parenterale Verabreichung werden zu dem Inhalt einer Ampulle 2 ml steriles V/asser für die Injektion zugegeben.
Formen für die orale Verabreichung
Antibiotikum 890A2
Saccharose
Glucose
Natriumbenzo at
konzentriertes Orangenöl
gereinigtes Wasser, U.S.P. bis zu
pro 1000 ml
1,0 g 600,0 g 250,0 g 1,0 g 0,2 ml 1000,0 ml
Die Saccharose und Glucose werden in etwa 400 ml Wasser unter Erhitzen zur leichteren Auflösung gelöst. Diese Lösung wird abgekühlt. Natriumbenzoat und anschließend konzentriertes Orangenöl werden zugegeben. Die Lösung wird mit Wasser auf ein Volumen von etwa 900 ml eingestellt und das Antibiotikum wird zugegeben. Die Lösung wird durch Filtration durch ein grobes Filter geklärt.
Ende der Beschreibung.
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709846/0891 ORIGINAL INSPECTED

Claims (8)

Merck & Co., Inc. 271878? 1^ Patentansprüche
1. Verbindlang der folgenden Struktur
CH3-CH(OH)
:ooh
und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.
2. Verbindung 890A2'
3. Verbindung 890Ac.
4. Gemisch, dadurch gekennzeichnet, daß es die Verbindungen 890A2 und 890Ac enthält.
5. Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine antibakteriell wirksame Menge einer Verbindung der folgenden Struktur
CH3-CH(OH>
und/oder eines oder mehrerer ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze und einen nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür enthält.
6. Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine antibakterielle, wirksame Menge der Verbindung 890A2 und/oder
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ORIGINAL INSPECTED
eines oder mehrerer ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze und einen nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür enthält.
7. Zubereitung» dadurch gekennzeichnet, daß sie eine antibakterielle, wirksame Menge der Verbindung 890Ae und/oder eines oder mehrerer Ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze und einen nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür enthält.
8. Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine antibakterielle, wirksame Menge der Verbindung 890A2 zusammen mit der Verbindung 890Ac und/oder eines oder mehrerer ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze und einen nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür enthält.
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