DE2621690A1

DE2621690A1 - Neues antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2621690A1
Application number: DE19762621690
Authority: DE
Inventors: Hannelore Dr Drautz; Walter Prof Dr Keller; Hans Prof Dr Zaehner
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1975-05-20
Filing date: 1976-05-15
Publication date: 1976-12-09
Also published as: NL7605303A; NZ180898A; US4277478A; IL49591A0; DK143907B; FR2372629B1; GB1550700A; IL49591A; AU508077B2; DK143907C; CA1079213A; JPS51142597A; FR2372629A1; AU1408076A; DK221476A; GR59336B

Description

Case 4-9904/-'·/1+2/+' Deutschland

Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft das neue wasserunlösliche Antibiotikum Lysolipin, das in Form seiner Komponenten X und I oder von .Mischungen dieser Komponenten vorliegt, und Derivate des Antibiotikums sowie Präparate, welche diese Verbindungen enthalten und Verfahren zur Herstellung dieser Stoffe.

Das Antibiotikum Lysolipin entsteht bei der Züchtung des Stammes Streptomyces violaceoniger (Waksman et Curtis) V7aksman et Henrici TIi 96, dor unter dieser Bezeichnung im Institut für Mikrobiologie der Universität Tübingen (Deutschland) aufbewahrt wird. Der Stamm ist unter der Bezeichnung

609850/1103

ORIGINAL INSPECTED

262169Q

NRRL 8097 beim Northern Regional Lab., US.-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt.

Der Stamm S. violaceoniger TU 96 bildet noch ein weiteres Antibiotikum, Ropalocidin, das in der Dissertation von Dietmar Mahl "Ropalicidin ein antifungisches Antibiotikum aus Streptomyces violaceoniger", Stuttgart, 1971, beschrieben ist.

Der Stamm S. violaceoniger TU 96 bildet ein anfangs V7eisses, später aschgraues Luftmyeel. Die Sporenketten sind monopodial verzweigt und haben die Form von engen, regelnässigen Schrauben, die selten mehr als drei Windungen utafassen. Die Sporen sind ellipsoid, etwa 0,9 nm breit und 1,2 nm lang und haben eine glatte Oberfläche. Beim Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden (Pepton-Eisenagar) wird auch nach mehrtägiger Inkubation keine melanoide Verfärbung beobachtet. Der Stamm zeigt also keine Chromogenität, da er keine Tyrosinase zu bilden vermag.

Das Antibiotikum Lysolipin wird gewonnen, indes man den Stamm S. violaceoniger TU 96 oder eine Lysolipin bildende Mutante dieses Stammes in einer wässerigen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob züchtet, bis die Nährlösung eine wesentliche antibiotische Wirkung aufweist, und das Antibiotikum Lysolipin hierauf aus dem Kulturfiltrat isoliert. "Antibiotikum bildende Mutanten können z.B. unter der Einwirkung von

609850/1 103

Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senf öl en gewonnen werden.

Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu

nennen: assimilierbare Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, St'ärke, Glycerin. Als stickstoffhaltige Nährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekömern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Phosphate von Alkali-r oder Erdalkalimetallen, von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelkolben oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40⁰C, vorzugsweise 27°C. Eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 3 bis 7 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Nähr-r

609050/1103

medium her, die dann in das eigentliche Produkt ion sir.ed ium, z.B. im Verhältnis 1:20, Uberimpft werden. Die Vorkultur erhält man beispielsweise, indem man ein durch ca. 14-tägiges Wachstum auf einem Nährboden erhaltenes versportes Mycel in ein flüssiges Medium Uberimpft und 72 Stunden wachsen lässt.

Das Antibiotikum ist im Kulturfiltrat enthalten. Die Isolierung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat erfolgt nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen, insbesondere der lipophilen Eigenschaften des Antibiotikums. Zum. Testieren der Antibiotikawirkung (d.h. des Vorhandenseins des Antibiotikums) eignet sich als Testorganismus besonders gut Bacillus subtilis.

Aus dem Kulturfiltrat kann das Antibiotikum mit einem mit VJasser nicht mischbaren lipophilen Lösungsmittel, z.B. mit Essigester, Kohlenwasserstoffen, wie Cyclohexan, Benzol, oder mit halogenierten Kohlenwasserstoffen, z.B. Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Tetrachlorkohlenstoff, Tetrachloräthylen, extrahiert werden.

Zur Reinigung des nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Rohproduktes kann man sich z.B. der Extraktion, der Fällung, der Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen oder der Adsorption, vor allem Chromatographie bedienen. Ein grosser Teil der lipophileren Begleitstoffe

609850/1103

kann durch Extraktion des Rohproduktes mit Petrolather ent- '

fernt werden. Man kann auch das Rohprodukt lösen,z.B. in Methanol, und durch Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid oder Mischungen davon oder Adsorptionsharze, z.B. vernetzte Dextrane wie "Sephadex" (der Fa. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) von Begleitstoffen abtrennen. Beispielsweise kann das Rohprodukt durch wiederholte Sc'ulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel, zweckm'ässig mit geringen Zusätzen von Aktivkohle, gereinigt werden. Das Antibiotikum wird vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit Mischungen von Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff und Methanol eluiert, wobei der prozentuale Gehalt des stärker polaren Lösungsmittels stufenweise gesteigert wird.

Die oben erwähnte Verteilung zwischen nicht-mischbaren .Lösungsmittelphasen kann auch als Gegenstromverteilung mit einer Craig-Apparatur vorgenommen werden. Als Lösungsmittel sy st em dient beispielsweise eine Mischung von Chloroform, Cyclohexan, Methanol und Wasser.

Zur Gewinnung der einzelnen einheitlichen Komponenten des Antibiotikums kann ihre Trennung und isolierung z.B. nach der Methode der prä'parativen Dünnschicht chromat ο-

609850/1103

graphie unter den fur den analytischen Nachweis beschriebenen Bedingungen erfolgen. Vorteilhafter ist die Trennung mittels Säulenchromatographie, wobei als Adsorptionsmittel z.B. Kieselgel mit einem Gehalt von 1-5 Prozent Aktivkohle benutzt und die Elution vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit einer Mischung von Chloroform und Methanol bev?irkt wird. Die Steigerung der Konzentration des weniger polaren Lösungsmittels erfolgt zweckmä'ssig in kleineren prozentualen Abstufungen, z.B. 5-20% Chloroform, oder man arbeitet nach der kontinuierlichen Gradientenelutionsmethode. Das Reinigungsverfahren kann gegebenenfalls wiederholt werden.

Im Dlinnschichtchromatogracnm auf Silicagelplatten der Firma Merck (Kieselgel 60, F254) zeigen die Komponenten folgende Rf-Werte: in Chloroform-Methanol (9:1): X = 0,58; I = 0,81; in Benzol-Methanol (9:1): X= 0,26; I = 0,30; in Chloroform-Aceton (5:5): X= 0,40; I = 0,53; in Benzol-Aceton (5:5): X= 0,47; I-= 0,74. FürLysolipin I wurden im Reihenverdünnungstest folgende minimale Hemmkonzentrationen (MIC) gefunden:

Mikroorganismen MIC in γ/ml

Lysolipin I

Eubacteriales (gram-negativ)

Achromobacter geminiani (27°) >O,OO25 <0,005

609850/1103

Salmonella niinnesota (37°) >O,5 < 1

Salmonella typhimuriuin (37°) >100

Proteus vuJ gar is (37°) >Q,001 < 0,0025

Eubacteriales (gram-positiv)

Arthrobacter aurescens (27°) y0,001 <0,0025

Arthrobacter crystallopoietes (27°) >0,001 <0,0025

Arthrobacter simplex (27°) >0,001 <0,0025

Bacillus brevis (37°) >0,025 40,05

Bacillus megaterium (37°) >0,001 ^0,0025

Bacillus subtilis (37°) >0,001 40,0025

Brevibacterium flavum (27°) >0,001 40,0025

Clostridium pasteurianum (30°) >0,001 <0,0025

Chromobacteriuai violaceum (27°) >0,l 40,5

Corynebacterium poinsettiae (27°) >0,001 40,0025

Corynebacterium rathayi (27°) >0,001 " <0,0025

Micrococcus luteus (27°) >0,001 <0,0025

Micrococcus roseus (27°) >O,001 <0,0025

Sarcina lutea (27°) >0,001 < 0,0025

Staphylococcus aureus (37°) >0,001 <0,0025

Pseudomonadales

Pseudomonas fluorescens (27°) . >0,001 <0,0025

Pseudomonas saccharophila (27°) >O,001 < 0,0025

FUr Lysolipin X liegt die MIC ura den Faktor 10-50

höher. 60 9 850/1103

Die Komponente I des Lysolipins weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf:

Es ist eine tief gelbe kristalline Substanz, die in Wasser und wässerigen Säuren und Basen praktisch unlöslieh ist; in Niederalkanolen wie Methanol, Aethanol, n-Propanol, sowie in Aether und. Petroläther ist"" sie teilweise .löslich. In Aceton, Dimethylformamid, Diaiethylsulfoxid, Essigester, Kohlenwasserstoffen, z.B.,Cyclohexan, Benzol, und halogenierten Kohlenwasserstoffen wie oben erw*ä"hnt ist sie gut löslich. ■

Lysolipin I aus Aceton-Aether kristallisiert, schmilzt bei 260-262° unter Zersetzung. [«3^ = -50,2° (Chloroform). Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagel im System Chloroform-Methanol (19:1) ist Rf = 0,6.

Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C₂₉H₂₄ClNO₁₁ (597,95):

Ber. C58,25 H 4,05 Cl 5,93 N 2,34 3 OCH₃ 15,57 % Gef. C 58,36 H 4,22 Cl 6,03 N 2,48 OCH₃ 15,43 %

. C 58,30 H 4,27 N 2,38 . . : Bestimmung nach Zeisel)

Hol. Gew. durch Dampfdruckostnometrie in Aethylacetat: gef. 536. Milcrotitration mit 0,1 N Tetramethylammoniumhydroxid in Methylcellbsolve-Wasser (8: 2): gef. pK*_KCS 9,72, Aeq.-G. Titration mit 0,1 N HCl: keine Stufe (N-Atom demnach nicht basisch).

609850/1103

Fig. 1 zeigt das IR.-Spektrum von Lysolip5.n I in KBr, Fig. 2 das UV-Spektrum in Aethanol (96%ig). Fig. 3 zeigt das NMR-Spektrum in CDCl₃ (100 MKz); durch Austausch rait D₂O verschwinden nur die beiden Signale im Offset-Gebiet sowie das breite Signal bei ca. 2,7 ppm. Fig. 4 zeigt das

C-NMR-Spektrum in CDCl₃ und wenig Dimethylsulfoxid mit

13

vollständiger Rauschentkopplung, Fig. 5 das C-NMR-Spektrucn, Off-Resonance. Tabelle 1 gibt eine Zusammenstellung der Maxima von Fig. 4 wieder. Tabelle 2 zeigt das Massenspektrum von Lysolipin I. .

Zum NMR-Spektrum (Fig. 3) sind folgende Ergänzungen anzubringen:
1.) Spinentkopplung

Einstrahlung bei 4,43: das Dublett bei 5,02 ppm wird zu einem Singlett. Einstrahlung bei 5,0?. ppm: die Dublette bei 4,43 und 4,68 ppm werden gleichzeitig zu Singuletten.

Das Signal bei 5,02 ppm entspricht im Integral 2 Protonen und kann als Ueberlagerung eines Dubletts und eines breiten MuItipletts aufgefasst werden. Das Dublett steht zu dem bei 4,43 ppai in Wechselwirkung, das Multiplett zum Dublett bei 4,68 ppm. 2.) Die exakten Kopplungskonstanten wurden in einem vierfach gedehnten Spektrum ausgemessen und ergaben: 4,43 (d): 3,0 Hz., 4,68 (d): 4,1 Hz., 5,02 (d): 3,0 Hz., 5,40 (d): 5,7 Hz., 5,62 (d): 5,7 Hz. Die letzten beiden

6 09850/1103

- LO - c

SignaLe biLden zusammen ein AB-Spektrum, ebenso die beiden DubLette bei 7,36 und 7,90 ppm (J = 8 Hz., o-ständige Wasserstoffatome an einem aromatischen Ring).

LysoLipin I weist mindestens zwei acylierbare Hydroxylgruppen auf. Durch Längere AcetyLierung (2 Wochen bei Raumtemperatur) erh'äit man das Di-O-acetyL-LysoLipin I, das aus Aceton-Wasser kristaLLisiert wurde; bLass geLbe KristaiL-prismen vom F. 2L6-224⁰. Fig. 6 zeigt das NMR-Spektrum in CDClo (LOO MHz). Die verwendete Substanzprobe enthielt noch AethyLacetat. Dieses verursacht foigende SignaLe: das Tri-pLett bei L,2 ppm; ein teiiweise von OCH^-SignaLen überdecktes Quartett bei ca. 3,5 ppm und einen TeiL des SignaLs bei ca. .2,35 ppm. TabeLLe 3 gibt das Massenspektrum von Di-O-acetyL-LysoLipin I wieder.

Wenn die Acyiierung nur wie übLich über Nacht durchgeführt wird, erh'äit man ein Gemisch zweier Produkte^ die durch KristaLLisation nicht getrennt werden konnten, offenbar ein Mono- und das Diacetat. Im Massenspektrum dieses Gemisches erscheinen die Signaie bei 683 und 68L Masseneinheiten (M des Diacetats) mit wesentiich geringerer Intensität.

609850/1103

AA

Durch Röntgenspektrometrxe wurde für die Komponente I von Lysolipin folgende Strukturformel ermittelt:

OCH,

HO

CHoO '

6 09850/1 103

Lysolipin X wurde als farbloses amorphes Pulver erhalten. Es bildet Lysolipin I beim Erhitzen oder bei Bestrahlung mit UV-Licht. Es ist sehr instabil; beim Aufbewahren an der Luft, insbesondere bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur, geht es allmählich in Lysolipin I über. Eine teilweise Trennung von Lysolipin X und I liess sich durch Craig-Verteilung im System Tetrachlorkohlenstoff-Chloroform-Methanol-Wasser (3,42:2,28:4:1) erreichen. Das so erhaltene fast farblose amorphe Pulver, Lysolipin X, konnte nicht kristallisiert werden. Im Dünnschichtchromatogramm auf SiIicagel im System Chloroform-Methanol(39:1) ist Rf = 0,22 (Rf von Lysolipin I ist = 0,39). Fig. 7 zeigt das NMR-Spektrum von Lysolipin X in CDCl₃ (100 MHz). Die Signale bei 0,9 und 1,3 ppm si.nd wahrscheinlich einer fettartigen Verunreinigung zuzuschreiben. Die meisten Signale im Gebiet von 3 bis 8 ppm sind aber sehr ähnlich denen des Lysolipins I und weisen auf die nahe Verwandtschaft der beiden Verbindungen hin. Fig. 8 zeigt das UV-Spektrum von Lysolipin X in Chloroform.

Lysolipin und seine Derivate weisen neben ihrer antibakteriellen Wirkung gegen Bakterien auch eine geringe Wirkung gegenüber hefeartigen Pilzen wie Candida albicans, Candida lipolytica und Saccharomyces cerevisiae auf. Es ist

6 09850/1103

sowohl gegen wachsende und ruhende mikrobielle Zellen wie auch gegen deren Sphäroplasten wirksam. Seine Wirkung beruht wahrscheinlich auf eüier Hemmung der Zellwandsynthcse. Die Wirkung wird durch einen Ueberschuss an Lipiden, z.B. Sphingolipiden, Phosphoglyceriden, Bakterienzellwandlipiden. teilweise aufgehoben.

Lysolipin und seine Derivate können allein oder in Kombination mit anderen die Zellwandsynthese hemmenden Antibiotika wie Penicillinen, Cephalosporinen, Cycloserin, zur Bekämpfung von Infektionen, die durch Bakterien wie die genannten hervorgerufen werden,und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Mit einigen Antibiotika, z.B. mit Penicillinen, wurde eine synergistische Wirkung beobachtet.

Zwecks Herstellung pharmazeutischer Präparate kann das Antibiotikum mit einem für die topische, enterale oder parenterale Applikation geeigneten anorganischen oder organischen Trägermaterial vermischt werden. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol, oder andere Arzneiinittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien, oder in. flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen oder Salben vorliegen. Gegebenenfalls sind sie stex-i-

6 09850/1103 '

lisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten, Auch die Desinfektionsmittel können mit geeigneten Trägerstoffen, wie bekannt, vermischt werden.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgradcn angegeben.

Die Figuren stellen dar:

Fig. 1 : IR-Spektrum von Lysolipin I in KBr. Fig. 2 : UV.-Spektrum von Lysolipin I in Feinsprit. Fig. 3 : NMR.-Spektrum von Lysolipin I in CDCl₃.

Ί O

Fig. 4 : C-MR.-Spektrum von Lysolipin I mit vollständiger Rauschentkopplung.

13
Fig. 5 : C-NMR. -Spektrum von Lysolipin I, off-resonance.

Fig. 6 : .NMR.-Spektrum von Di-O-acetyllysolipin I.

Fig. 7 : NMR.-Spektrum von Lysolipin X, nicht völlig rein.

Fig. 8 : UV.-Spektrum von Lysolipin X in CHCl₃.

Die Tabellen stellen dar:

Tab. 1 : Massenspektrum von Lysolipin I.

13
Tab. 2 : C-NMR. -Spektrum von Lysolipin I.

Tab. 3 : Massenspektrum von Di-O-acetyllysolipin I.

609850/1103

AS

Beispiel 1

Eine Lyoampulle mit 5 ml Sporensuspension von S. violaceoniger Tu 96 wird mit 5 ml 0,2-m. Phosphatpuffer pH 7 aufgeschwemmt. 3 Erlenmeyerkolben mit 1 Schikane (Einbuchtung, "baffle") mit je 100 ml Nährlösung, welche pro Liter Leitungswasser 4 g Hefeextrakt, 10 g Malzextrakt und 4 g Glucose enthält und deren pH vor der Sterilisation mit 1-n. Natronlauge auf 7,3 eingestellt wurde, werden mit je 2 ml der Streptomyces-Suspension beimpft und 24 Stunden auf einer rotierenden Schüttel·· maschine mit 250 upm bei 27° inkubiert. Je 25 ml der so gewonnenen Kultur werden in 6 2-Liter Erlenmeyerkolben mit 4 Schikanen und 500 ml der obigen Nährlösung geimpft. Die Kolben werden anschliessend bei 27° auf einer rotierenden Schütteltnaschine mit 120 upm 48 Stunden inkubiert.

0,75 Liter der Kultur aus den 2 Liter-Kolben werden in einen 50-Liter Fermenter, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält, übertragen und 24 Stunden bei 27° inkubiert. Dann werden 15 Liter der Kultur in einen Fermenter mit 300 Liter der obigen Nährlösung übertragen. Dieser Fermenter weist ein Totalvolumen von 500 Liter auf und besitzt einen 6-blättrigen Turbinenrührer und 4 Schikanen (Prallbleche "baffles"). Die Züchtungsbedingungen im Fermenter sind: Druck 0,5 atü, Rührge-

609850/1103

schwindigkeit 450 upm, Temperatur 27°C, Luftdurchsatz 1 Liter V/VMin. Die Bedingungen entsprechen einer in Sulfitlösung gemessenen Sauerstoffabsorptionsrate von 150 mM 0~/l/h. Die optimale Bildung des Antibiotikums Lysolipin erfolgt nach ca. 100 Stunden Inkubation. Die Kulturlösung weist dann ein pH von 7,5 auf. Sie zeigt im Agradiffusionstest mit Bacillus subtilis im einen Hemmhof von 14-15 mm unter Verwendung von Whatmann A Filterrondellen mit einem Durchmesser von 6 mm.

Beispiel 2.

600 Liter der nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturlösung werden unter Zugabe von 2% Filterhilfsmittel "Dicalite" (Diatomeenerde) filtriert. 560 Liter Kulturfiltrat werden mit Natronlauge auf pH 9,0 gestellt und auf einem kontinuierlichen Extraktor zweimal mit Chloroform :'_n Verhältnis 2:1 extrahiert. Das inakative wässrige Raffinat wird verworfen. 600 Liter Chloroformphase V7erden im Vakuum konzentriert- Es resultieren 290 g Trockenrückstand. Dieser wird mit 2 Liter Petroliäther digeriert. Der inaktive Petrol'ätherextrakt wird verworfen und der unlösliche Anteil im Vakuum getrocknet. Es bleibt ein gelbbrauner, halbfester Rückstand zurück (46 g).

609850/1-103

Beispiel 3:

262169Ü

2,8 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohproduktes werden

(R)
an einer Säule von Sephadex LH-20 (alkyliertes vernetztes Dextran), L'änge 73 cm, Durchmesser 3 cm, mit Chloroform-Methanol (1:1) mit einer Geschwindigkeit von 20 ml pro Stunde chromatographiert. Es werden Fraktionen zu 5 ml aufgefangen. Der relative Gehalt der Fraktionen an Lysolipin I wird photometrisch bei 360 nrn bestimmt; der in den Fraktionen 40-47 ermittelte Gehalt an Lysolipin I wird willkürlich als 1 angenommen. Es ergibt sich folgende Verteilung:

Frakt	ion
1 -	27
28 -	29
30 -	39
40 -	47
48 -	55
56 -	80

mg Trockenrückstand

relat. Gehalt an Lysolipin I

40 30 524 618 234 233

unter 0,05 0,46 0,58 1
0,29

unter 0,1

Die Fraktionen 40 - 47 geben aus Aceton-Aether 416 mg tief gelbe Kristalle von Lysolipin I, F. 260-262° (Zers.). Weitere chemische, physikalische und biologische Eigenschaften sind im

609850/1 103

allgemeinen Teil der Beschreibung aufgeführt.

Aus den Mutterlaugen der Kristallisation und aus den NachbarTraktionen lassen sich bei erneuter Chromatographie an

Cr)

SephadejK LII-20 weitere 360 mg Kristalle gewinnen.

Beispiel 4:

300 mg Lysolipin I werden mit 10 ml Pyridin und 10 ml Essigsäureanhydrid 2 Wochen bei Raumtemperatur stehengelassen, dann wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird an 30 g Kieselgel mit Chloroform-Essigesüer (4:1) chromatographiert. Die ersten 150 ml Eluat enthalten 48 mg uneinheitliches Material. Die nachfolgenden 210 ml geben 220 mg blassgelbes b'liges Material, das im DUnnschichtchroEiiatogramm (Kiesel·· gel, Essigester als Fliessmittel; Anfärben mit Joddampf) einen Hauptfleck mit Rf 0,33 und zwei schwache Verunreinigungen zeigt, Durch langsames Kristallisieren aus Aceton-Wasser bilden sich blass gelbe Kristallprismen mit einem unscharfen F. 216-224°. NMR.-Spektrum in CDCl₃ (100 MHz) s. Figur 6. Die Probe enthält noch etwas Aethylacetat (von der Chromatographie) das sich im NMR.-Spektrum bemerkbar macht. Auf Grund des Massenspektrums (s.· Tab. 3) liegt ein Diacetat vor.

Wenn die Acetylierung nur wie üblich über Nacht durchgeführt wird, erhält man ei.n Gemisch zweier Produkte, die durch Kristallisation nicht getrennt werden konnten, offenbar ein

609850/1103

Mono- und das Diacetat. Im Massjenspektrum dieses Gemisches treten die Signale bei 683 und 681 Masseneinheiten (M des Diacetats) mit wesentlich geringerer Intensität auf.

Beispiel 5:

1,5 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohproduktes werden einer Craigverteilung über 190 Stufen im Lösungsmittelsystem Tetrachlorkohlenstoff (3,42 Liter)-Chloroform (2.28 Liter) Methanol (4 Liter)-Wasser (1 Liter) unterworfen. Die stark gelb gefärbten Fraktionen 26-54 enthalten vor allem Lysolipin Es wird isoliert, indem man die Fraktionen mit dem doppelten Volumen Wasser verdünnt, die organische Phase abtrennt, die wässerige Phase dreimal mit Methylenchlorid ausschüttelt, die organischen Phasen vereint, mit Natriumsulfat trocknet und im Vakuum eindampft. Man erhält 258 mg -dünnschichtehromatographisch einheitliches Lysolipin I, das durch Chromatograhie an Sephadex^ LH-.20 und Umkristallisieren wie oben beschrieben weitergereinigt wird.

Die Fraktionen 76-100 geben bei analoger Aufarbeitung ein fast farbloses amorphes Pulver (393 mg), Lysolipin X, das sich nicht durch Kristallisation reinigen lässt. NMR- und UV-Spektrum s. Fig. 7 und 8. Bei DUnnschichtchromatogiaphie an Kieselgel in Chloroform-Methanol (39:1) ist Rf = 0,22 (gegen-

609850/1103

liber 0,39 für Lysolipin I). Auf der Dünnschichtplatte wird der anfänglich sehr blasse, kaum erkennbare Fleck von Lysolipin X beim Stehen an der Luft, rascher beim Erwärmen, tief gelb . Bei Elution des Flecks und erneuter Dünnschicht-Chromatographie zeigt sich, dass Lysolipin X in Lysolipin I übergängen ist.

Eine Probe Lysolipin X wird mit Methanol an Sephadcx LH-20 chromatographiert. Eine anfangs blass gelbe Zone wird bei fortschreitendem Chromatographieren immer·intensiver gelb. Die gelben Eluatfraktionen erweisen sich in der Dünnschichtchromatographie als identisch mit Lysolipin I.

Ein anfangs fast farbloses Präparat von Lysolipin X wird mehrere Monate im Kühlschrank aufbewahrt. Es nimmt in dieser Zeit eine intensiv gelbe Farbe an. Durch eine Craig-Verteilung (s.oben) werden aus dem Präparat noch geringe Mengen Lysolipin X erhalten. Die Hauptmenge kann als Lysolipin I identifiziert werden.

609850/1103

Tabelle 1

Lysolipin I. .

-NHR.-Spektrum (25,2 KHz). Lösungssi.: CDCl +etwas DIISO

Nr, ö (pP^m) ε Nr. '. -O (pp^) πι

1.	181,26	S
2.	168,26	S
3.	158,60	S
4.	151,26	S
5.	149,65.	S
6.	144195	S
7.	143,17	S
•8.	140,53	. S
.9·	138,86	S
10.	134,06	S
11.	133,09	S
12.	127,91	S
13.·	125,48	d
14.	120,62	?

15.	117,77	S
16.·	116,15	d
17.	111,24	S
18. ·	110,37	S
19.	108,54 .	S
20.	•92,63	d
21.	.90,95	t
22. .	78,87	d
23.'	75,31	d
24.	67,70	d
25.	61,55	q OCH₅
26.	58,42	q OCH
27.	57,67 .	q OCK
28.	35,55	q

ü ί Chemische Verschiebung gegenüber Tetraaethylsilan als
internen Standard, m: Aufspaltung in "off resonance"-Spsktrun. Von den 29 C-Atomen sind 28/; tils selbständige Signale erkenrice.r

ORiQiNAL INSPECTED

609850/1103

Tabelle 2

Bolipin I

Gelbe Kristalle, Mas sens peL'-trum. Di = 14O G,

m/e $ ra/e

601	0₆2	und	rf	0,5	524	•	497	0,5	475·	-	450	0,25
600	1,0 -	Spur,		1,2	525	496	0,2	474	459	0,20
599	5,2	unter	1,5	522	495	0,15	475	■ 448	0,5
598	2,7	4,0	521	494	0,5		447
597	0,0	1,0	• 520	495	0,55	471	446	0,1
596	0,2	2,2.	519	492	0,55	470	445	O₅I
		•	518	491 .	0,55	469		0,2
579	0_f2		490		460	441	0_e6
581:	0,1-	507	409	0,5	467	440	0,4
weit	0,15	506	488	0,7	466'	' 459	1,5
0,1	0_P2	505	487	0,7	'465	458	0_P2
r		504	486	1,4	464	457	0_f4
570	0,7	505		0,2	' 465	456	0,3
569	2,5	502	478	0,2	,452	455	0p4
568	2,7	477	-	461	454	0,25
567	6,5	476	0,2
566	2,2	609850	0,6	0,1
565	0,5	0,4	0,15
	■0,4	1*2	0,2
552		0,5 .	0,2
551	0,2	0,2
550	0,15	0,3
549	0,2
	0,5	0,1
559	0,5	0,4
558	0,2	0,5
557	0,2	1,1
556		0,1
555	0,15	0,5
554	0,2	0,2
555	0,25	0_t25
	/110 3

ra/e £ m/o

225 0,2

224 0,2

225 0,55

219 0,2

218 0,2 217 - 0,5 216 · 0,2

215 0,55

214 0,1

215 0,5 212 · 0,25 211 0,5 210 0,5

191 0,2

190 0,5

189 0,6

188 0,5

187 1,0

186 0,2

185 0,4

178 0,2

177 0,55

176 1,0

175 O_f5

von 576 - 226

keine klar aus

dem Background 150 ■ 2,7

hervortretenden

Per.ks, kein

Peak über 0,1 # 148 0,8

455	0,2
452	O_rl
451	0,1
450	0,1
425	ο,ι
422	0,2
421	O_f2
420	0,4
419	0,2
418	0,25
417	0,55
410	O_fO5
409	0,1
408	0,2
407	0,25
406	0,5
405	0,5
404	0,2
405 .	0,1
402	■ °'²
580	0,1
579	0,2
578	0,5
577	0,1

	2621690
m/o	$ .
147	0,6 .
146	0,25
145 "	1,2
144	0,5
145	0,7
142	0,5
141	0,6
140	0,2
159	0,55
158	0,5
157	0,55
156	0,5
155	1,2
154	0,2
155	. 0,4
152	0,6
151	4,5
150	0,5
129	1,6
128	1,2
127	0,6
126	0,5
125	0,4
124	0,55
125	0,6
122	0,5
121	0,6
120	0,4
119	0,8
118	0,7
117	3,9
116	0_f8

6098·50/110.3 original inspected

ία/θ.

115 114 115 112 111 110 109 108 107 106 105 104 105 102 101 100 99 98 97 96 95 94 93 92 91 90 89 88 87 86 85 84

m/e

_m/e 26^1690

2,2 0,5 0,4 0,5 0,4 0,9 0,7 0,4 1,0 0,7 2,5 0,4 0_f8 0,4 0,ß 0,2 0,5 0,8

1,5 0,8 1,6 0,6 1,2 0,6

3,4 0,2

0,5 0,2

0,9 0,2 1*2 1,2

85	5,7	.51	33	0,8
82	0,9	50	32.	1,2
81	1,5		31
80	0,5	46	30	0_f5
79	1,5	. 45	.29	4,8
78	0,7	.44	28	3,5
77	. 1,9	43	27
76	0,5	42	26	2,6
75	0,6	41 .	. .'	6,1
74	6,5	40	19	0,5
75	2,1	39	18	2,3
72	0,5	38	17	0,6
71	l_f7	37	16	0,5
70,	l_r6	.36 .	15	0,3
69	3,5	•	14
68	0,9		2,3
67	1,4	Ablesung Spur: 1	89
66	0,5	100
65	0,9	15
64-	0,5	67
65	0,4	5,7
62	0,15	2,6
61	0,5	0,8
60	1,8
59	4,8	0,7
58	8,5	6,0
57	3,2	1,5
56	1,5	0,3
55	5,5	26 .
54	0,5	2,2
55	1.0
52	0,5	auf der ersten /Q ·~ eil Hiiu

609850/1 103

ORIGINAL INSPECTED

Di-0-acütyl-l^Trsoli"oin I Mass-incpektrun. Di = 120

m/e . 1 (#) m/e

685	2	577	7
684	8	. 576	' 2
683	24
682	21	568	- ι
681	58	567	1,3
		. 566	2,5
653	0,8	565 -	2
652	1,2	564	" 1,7
651	3,0	563	0,9
650	2,5	562	1,3
649	5,5
		551	1,2
643	5	.550	1,7
642	. 20	549	4,0
641	40	548	2,5
640	. 37	. 547	1,7
639	100	546	3,7
612	5	537	• 2,5
611	16	536	3,3
610	17	" 535	6,7
609	50	534	3,7
608	15	526	. 3,7
607	27	525	4,6
		524	10,2
600	metastab. Ion	523	6,2
581	me tastab. Ion	522	1,7
		521	2,5
581	5,5	520	4,6
580	15	519	5,4
579	17 .	518	7,1

m/e	1(55}
507	3
506	4
505	6,2
504	6,7
503	3,3
502	1,6
497	2,5
496	•9
495	11
494	23 ·
493"	16
492	5,4
491	3,7
490	3,3
489	3,7
488	6,3
487	4
486	••6
479	1,2
478	3,0
477	3,3
476	3,7
475	4,0
474	2,5
473	2,0
472	1,2
471	1,7
470	1,7
469	1,2
468	3,3

578 40 ■ 609850/1103

ORIGINAL INSPECTED

Di-0-ac3tyl--lysolipin I, MauGenspokt.-'urr:, Fur^se^ur-s«

m/e

467	1,7
466	4,0
465	3,7
464	5,1
463	6,0
462	10
461	8
460	2,5
Von 4	60 bis 8
keine	signifi
kante	Peaks
85	3,3
84	2,0
83	4,4
82	l_t7
81	2,0

74	12
73	1,7
72	1,2
71	5,4
70	3,0
69	9,5
.61	2,5·
60	6,5
57	7,5
56	2,5
55	■ 5,4

45 12

44 '5

43 48

42 13

41 "7

32 " 53

31" 45

50 12

29 39

28 10

18 . 8

17 '2

16 . . 1,2

15 15

14 . 5

ORiGiäMAL INSPECTED 609 850/1103

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, Lysolipin, in Form seiner Komponenten I und X, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Streptomyces violaceoniger TU 96 oder eine Lysolipin bildende Mutante in einer wässrigen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob züchtet, bis diese eine wesentliche antibiotische Wirkung aufweist, und das Lysolipin hierauf isoliert und, wenn erwünscht, in seine Komponenten auftrennt und/oder in Derivate überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Prüfung auf Anwesenheit des Antibiotikums Bacillus subtilis verw.endet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturfiltrat mit einem mit Wasser nur wenig mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert wird.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturfiltrat mit Essigester extrahiert wird.

609850/1103

5. Vorfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Extraktion mit Pctrolather gereinigt wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie gereinigt wird.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an Adsorptionsharzen gereinigt und/oder in seine Komponenten aufgetrennt wird.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an vernetzten Dextranen gereinigt und/oder in seine Komponenten, auftrennt wird.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibioti-kum mit Mischungen von Chloroform und Methanol eluiert.

10. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lysolipin und/oder seiner Komponenten und Derivate wie in den Beispielen beschrieben.

609850/1 103

Das Antibiotikum Lysolipin und seine Derivate

12. Die Komponente I des Antibiotikums Lysolipin der Formel

HO

CHoO'

13. Die Komponente X des Antibiotikums Lysolipin.

14. Das-Di-O-acetyl-lysolipin I.

15. Pharmazeutische Präparate, enthaltend das Antibiotikum Lysolipin oder seine Komponenten oder Derivate dieser Verbindungen.

6098 5 0/1 103