DE2808563A1 - Derivate der 3-thio-6-(1-hydroxyaethyl)-7-oxo-1-aza-bicyclo eckige klammer auf 3.2.0 eckige klammer zu hept-2-en- 2-carbonsaeure, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel - Google Patents
Derivate der 3-thio-6-(1-hydroxyaethyl)-7-oxo-1-aza-bicyclo eckige klammer auf 3.2.0 eckige klammer zu hept-2-en- 2-carbonsaeure, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittelInfo
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Description
Derivate der 3-Thio-6-(l-hydroxyäthyl)-7-oxo-l-azabicyclo-/J.2.o7hept-2-en-2-carbonsäure,
Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
beanspruchte
Prioritäten:
Prioritäten:
5. März 1977 - Großbritannien - Nr. 9366/77 5. August 1977 - Großbritannien - Nr. 32836/77
In den britischen Patentschriften 1 467 413, 1 489 235 und
1 483 142, die den deutschen Offenlegungsschriften 25 I3 855,
25 13 854 und 26 09 766 entsprechen, ist beschrieben* daß bei
der Fermentation von Streptomyces olivaceus Antibiotika hergestellt werden können, die als 11MM 4550, MM 13902 und MM I7880"
bezeichnet worden sind und die die nachstehenden Formeln III, IV und V besitzen:
HO3SO
O H
t I
S-C=C-NH-
CO-CH.
(III)
809836/0718
HO3SO
AO
S-C=C-NH-CO-CH.
(IV)
H3C H
HO3SO
O.
,j S-CH2-CH2-NH-CO-CH3 (V)
In keiner dieser britischen Patentschriften bzw. deutschen Offenlegungsschriften findet sich ein Hinweis, daß aus der Fermentationsflüssigkeit
von Streptomyces olivaceus ein weiteres Antibiotikum isoliert werden könnte. Es ist jetzt gefunden worden,
daß in der Fermentationsflüssigkeit weitere Antibiotika vorhanden sind, die isoliert worden sind.
Gegenstand vorliegender Erfindung sind Derivate der 3-Thlo-6-(l-hydroxyäthyl)-7-oxo-l-azabicycloi/5.2.07hept-2-en-2-carbonsäure
der nachstehenden Formeln I und II
if— S-CH2-CH2-NH-CO-CH3
(D
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S-C=C-NH-CO-CH
(H)
und deren Salze.
Am zweckmäßigsten liegen die Verbindungen der Formeln I und II in Form ihrer Salze vor, da es scheint, daß die Salze der Verbindungen
der Formeln I und II beständiger als die entsprechenden freien Säuren sind.
Geeignete Salze von Verbindungen der Formeln I und II sind pharmakologisch verträgliche Alkali- und Erdalkalimetallsalze,
wie die Natrium-, Kalium- und Calciumsalze, sowie pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze mit stickstoffhaltigen
Basen, wie die Ammonium-, Trimethylamin-, Dimethylamin- und
Pyrrolidinsalze und dergleichen.
Besonders geeignete Salze der Verbindungen der Formeln I und II
sind deren Natrium- und Kaliumsalze.
Eine bevorzugte Verbindung vorliegender Erfindung ist das Natriumsalz der Verbindung der Formel I. Eine weitere bevorzugte
Verbindung vorliegender Erfindung ist das Natriumsalz der Verbindung der Formel II.
Da vorgesehen ist, die Verbindungen der Formeln I und II in
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Arzneimitteln zu verwenden, ist es ohne weiteres verständlich,
daß diese Verbindungen in weitgehend reiner Form vorliegen sollen, beispielsweise in einer Reinheit von mindestens 50 %,
doch zweckmaßigerweise mindestens 75 % und vorzugsweise mindestens 90 $ und ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %· Unreine
Präparate von Verbindungen der Formeln I und II und deren Salzen können zur Herstellung von reineren Verbindungen verwendet
werden, die dann zur Zubereitung von Arzneimitteln eingesetzt werden können. Diese weniger reinen Präparate der Verbindungen
der Formeln I und II und deren Salzen sollten mindestens 1 %3
zweckmaßigerweise mindestens 5 $> und vorzugsweise 10 bis 4-9 %
an einer Verbindung der Formel I oder II oder deren Salzen enthalten.. Diese weniger reinen Präparate bestehen am vorteilhaftesten
aus einem Salz einer Verbindung der Formeln I oder II, wobei sich die Prozentangaben auf Gewichtsprozente beziehen, bezogen
auf das Gewicht des Präparats.
Im allgemeinen ist es vorteilhaft, daß die praktisch reinen
Salze einer Verbindung der Formel I oder der Formel II nicht durch wesentliche Mengen anderer antibakterieller Mittel verun_
reinigt sind, wie von Salzen der Verbindungen der Formeln III, IV und V, die aus der Fermentationsflüssigkeit stammen.
Die Verbindungen der Formeln I und II liegen hinsichtlich des ß-Lactamringes sowohl als Cis- als auch als Trans-Isomere vor.
Diese Isomeren können durch die Formeln Ia, Ib, Ha und Hb veranschaulicht
werden:
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/) S-CH2-CH2-NH-CO-CH3
(Ia)
., S-CH2-CH2-NH-CO-CH3
(Ib)
H-.C H H
ι ■ ·
·
η— S-C=C-NH-CO-CH3
H
(Ha)
S-C=C-NH-CO-CH.
(Hb)
Diese vorgenannten Verbindungen können wie folgt benannt werden:
Ia) (5R,6R)-3-(2-Acetamido-äthylthio)-6-/Cs)-l-hydroxyäthyl7-7-oxo-l-azabicyclo/5.2.07hept-2-en-2-carbonsäure;
809836/0716
Ib) (5R,6s)-5-(2-Acetamido-äthylthio)-6-/JS)-1-hydroxy ä thy l/-7-oxo-l-azabicyclo^.2.07hept-2-en-2-carbonsäure;
Ha) (5R,6r) -^-
äthyl7-7-oxo-l-azabicyelo//^'.2.o7hept-2-en-2-carbonsäure;
Hb) (5Ri6s)->/TE)-2-Acetamido-äthenylthio_7-6-/X'S)-l-hydroxyäthyl7"-7-oxo-1-azabicyclo^.
2.07hept-2-en-2-carbonsäure.
Sowohl die Cis- als auch die Trans-Isomeren der Verbindungen
der Formeln I und II besitzen wertvolle antibakterielle und ß-Lactamase hemmende Eigenschaften, und demzufolge erstreckt
sich die vorliegende Erfindung sowohl auf die isolierten Verbindungen der Formeln Ia und Ib und deren Gemische als auch auf
die isolierten Verbindungen der Formeln Ha und Hb und deren
Gemische.
Selbstverständlich sind die isolierten Cis- und Trans-Isomeren besonders geeignet in Formen von praktisch reinen pharmazeutisch
verträglichen Salzen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, so daß sie einen Reinheitsgrad von mindestens 50 %, zweckmäßigerweise
von mindestens 75 %» vorzugsweise von 90 % und am
vorteilhaftesten von mindestens 95 % besitzen. Weiterhin bevorzugt
man die Verwendung einer der vorgenannten Verbindungen, wenn sie praktisch frei von ihrem 6-Stellungsisomeren ist , d.h.
eine von der Verbindung Ib freie Verbindung Ia, eine von der Verbindung Hb freie Verbindung Ha, eine von der Verbindung
Ia freie Verbindung Ib oder eine von der Verbindung Ha freie Verbindung Hb. Im allgemeinen sollten derartige Verbindungen
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nicht mehr als 5 % ihres 6-Stellungsisomeren und vorzugsweise
nicht mehr als 1 % ihres 6-Stellungsisomeren enthalten. Zur Aufzeichnung
der Reinheiten kann die Hochdruckflussigchromatographie
angewendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausfuhrungsform bildet den Gegenstand
vorliegender Erfindung ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel Ia mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von
nicht unter 7700- in Wasser bei neutralem"pH-Wert, vorzugsweise nicht unter 7900,bei einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 298 nm.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform bildet den
Gegenstand vorliegender Erfindung ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel Ib mit einem molaren Extinktionskoeffizienten
von nicht unter 7700 in Wasser bei neutralem pH-Wert,
vorzugsweise nicht unter 7900/bei einem UV-Absorptionsmaximum
bei etwa 301 nm.
Nach einer· dritten bevorzugten Ausfuhrungsform bildet den
Gegenstand vorliegender Erfindung ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel Ha mit einem molaren Extinktionskoeffizienten
von nicht unter IjJOOO in Wasser bei neutralem pH-Wert,
vorzugsweise nicht unter lJ500,bei einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 508 nm.
Nach einer vierten bevorzugten Ausführungsform bildet den Gegenstand vorliegender Erfindung ein Alkalimetallsalz einer
Verbindung der Formel Hb mit einem molaren Extinktionskoeffizienten
von nicht unter 1^000 in V/asser bei neutralem pH-Wert,
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vorzugsweise nicht unter 135OO,bei einem UV-Absorptionsmaximum
bei etwa 308 nm.
Vorzugsweise handelt es sich bei den vorgenannten Alkalimetallsalzen
um die Natriumsalze.
Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bilden Arzneimittel,
die durch einen Gehalt an einer Verbindung der Formel I oder der Formel II oder deren Salze gekennzeichnet sind. Die
Arzneimittel können ferner pharmakologisch verträgliche Trägermaterialien,
Verdünnungsmittel, Exzipientien und/oder weitere Zusatzstoffe enthalten.
In den Arzneimitteln vorliegender Erfindung kommen gewöhnlich die pharmakologisch verträglichen Salze der Verbindungen der
Formeln I oder II, beispielsweise die Natrium- oder Kaliumsalze, in Betracht.
Die Arzneimittel vorliegender Erfindung können oral oder parenteral
verabreicht werden. Zweckmäßigerweise enthalten die Arzneimittel vorliegender Erfindung 50 bis 500 mg einer Verbindung
der Formeln I oder II oder deren Salze, beispielsweise etwa 100, 150, 200 oder 250 mg.
Am meisten geeignet sind Arzneimittel in einer injizierbaren Form.
Diese Arzneimittel können Verdünnungsmittel, Bindemittel, Zerfallhilfsmittel,
Gleitmittel und andere übliche Exzipientien
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enthalten und können nach üblichen Verfahren, z.B. durch Vermischen,
Abfüllen oder dergleichen, hergestellt sein.
Die Arzneimittel können in Form von Tabletten, Kapseln, Ampullen
oder ähnlichen Formen vorliegen.
Gegebenenfalls können die Arzneimittel vorteilhafterweise, ein
Penicillin oder Cephalosporin als Zusatzstoffe enthalten. In diesen Fällen liegt das Verhältnis von Synergist - d.h. der Verbindung
vorliegender Erfindung, vorzugsweise als Salz - zum Penicillin oder Cephalosporin gewöhnlich bei 2 : 1 bis 1 : 12,
zweckmäßigerweise von 1 : 1 bis 1 : 53 beispielsweise 1 ι 2,
.1 : 3 oder 1:4. Alle Angaben beziehen sich auf das Gewicht.
Besonders geeignete Penicilline zur Verwendung in den Arzneimitteln
vorliegender Erfindung sind Ampicillin, Amoxycillin,
Carbenicillin, Ticarcillin und ihre Vorstufen. Wenn die Arzneimittel für Injektionszwecke zubereitet werden sollen, liegen
derartige Verbindungen gewöhnlich in Form ihrer Natriumsalze vor.
Besonders geeignet sind Cephalosporine, wie Cephaloridin und Cephazolin, zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln.
Bevorzugte Penicilline in den Arzneimitteln vorliegender Erfindung sind Ampicillin-trihydrat, Amoxycillin-trihydrat,
das Natriumsalz des Ampicillins und das Natriumsalz des Amoxycillins.
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Bevorzugte Cephalosporine in den erfindungsgemaßen Arzneimitteln
sind Cephaloridin und das Natriumsalz< des Cephazolins.
Die Verbindung der Formel I oder der Formel II oder deren Salze kann eine isolierte Verbindung der Formel Ia, der Formel Ib,
der Formel Ha, der Formel Hb oder deren Salzen oder Gemischen von Verbindungen der Formeln Ia und Ib oder von Verbindungen
der Formeln Ha und Hb oder deren Salzen sein. Bevorzugt ist
jedoch die Verwendung einer Verbindung einer der vorgenannten Formeln, die frei von ihrem Isomeren ist. Eine derartige Verbindung
liegt gewöhnlich in Form eines pharmakolοgisch verträglichen
Salzes, wie des Natriumsalzes, vor.
Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bildet ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I oder der
Formel II und deren Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm von Streptomyces olivaceus oder Streptomyces
gedanensis/ die diese Verbindungen erzeugen, züchtet, bis eine beträchtliche Menge an einer Verbindung der Formel I oder der
Formel II oder deren Salzen erzeugt worden ist, und daß man danach die Verbindung der Formel I oder der Formel II oder deren
Salz aus dem Züchtungsmedium Isoliert.
Der hier verwendete Ausdruck "Streptomyces olivaceus" ist nach
der Klassifikation von R.Hütter in dem Buch "Systematik der Streptolyceten", Verlag S. Korger, Basel, S. 8-32, definiert
worden. Es ist zu beachten, daß die Definitionen "Streptomyces fulvovoridis","Streptomyces flavus" und "streptomyces flavovirens"
als Synonyme für "Streptomyces olivaceus" betrachtet wer-
809836/0716
den können.
Geeignete Stämme sind in der GB-PS 1 467 4Γ3 bzw. der DE-OS
25 13 855 beschrieben.
Ein bevorzugter Organismus zur Verwendung bei diesem Verfahren ist Streptomyces olivaceus ATCC J51126 oder eine Mutante, die
hohe Ausbeuten erzielen läßt. -
Ein weiterer bevorzugter Organismus zur Verwendung bei vorgenanntem
Verfahren ist Streptomyces olivaceus ATCC 3I365 oder
eine Mutante, die hohe Ausbeuten erzielen läßt.
Wie bereits vorstehend beschrieben worden ist, sollte die isolierte
Verbindung einen Reinheitsgrad von mindestens 1 %3 zweckmäßigerweise
von 5 %> noch zweckmäßiger von mindestens 50 %, vorzugsweise
von mindestens 75 % und noch bevorzugter von mindestens 90 % haben, beispielsweise von mindestens 95 $·
Der hier verwendete Ausdruck "Züchtung" bedeutet das bewußte
aerobe Vfachstum eines Organismus in Gegenwart von assimilierbaren
Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelquellen und Mineralsalzen. Ein derartiges aerobes Wachstum findet auf einem festen
oder halbfesten Medium statt, doch bevorzugt man im allgemeinen die Verwendung eines flüssigen Mediums. Die allgemeinen Züchtungsbedingungen
für das Wachstum von Streptomyces olivaceus sind in der GB-PS 1 467 4l^ bzw. der DE-OS 25-I3 855 beschrieben.
Die allgemeinen Bedingungen für das Wachstum von Streptomyces gedanensis sind ähnlicher Art.
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ZO
Das Verfahren vorliegender Erfindung ist auf die Herstellung einer Verbindung der Formel I oder deren Salz, einer Verbindung
der Formel II oder deren Salz oder einer Verbindung der Formel I oder deren Salz zusammen mit einer Verbindung der Formel II oder
deren Salz abgestellt.
Normalerweise ist das Verfahren eher auf die Herstellung eines Salzes als auf die Herstellung der freien Säure abgestellt.
Vorzugsweise enthält das Züehtungsmedium kein zugesetztes Sulfat,
da dies häufig zur Bildung - der Verbindungen MM 4550,
MM 13902 und MM I7880 auf Kosten der Erzeugung der Verbindungen
der Formel I und der Formel II und deren Salze führt.
Die Verbindungen der Formel I und der Formel II in Form ihrer Salze können aus dem Filtrat der Kulturflüssigkeit erhalten werden
durch
(a) Kontaktieren des Filtrats mit Aktivkohle, bis daran die antibiotische Aktivität adsorbiert ist,
(b) Eluieren der antibiotischen Aktivität von der Aktivkohle unter Verwendung von wäßrigem Aceton,
(c) Vereinigen der Fraktionen, die die ß-Lactamase hemmenden
Fraktionen enthalten,
(d) Abdampfen des Acetons und des größten Teils des Wassers, so -daß man eine konzentriertere wäßrige Lösung erhält,
(e) Aufbringen der Lösung auf eine Anionenaustauschersäule,
(f) Eluieren der ß-Lactamase hemmenden Stoffwechselprodukte mit · einer Lösung eines bis annähernd zum Neutralpunkt
gepufferten Elektrolyten und Sammeln der die Verbindungen
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der Formel I oder der Formel II in Salzform enthaltenden
Fraktionen,
(g) Aufbringen der erhaltenen Lösung auf ein Harz, das die anorganischen Substanzen von den Verbindungen der Formel I
(g) Aufbringen der erhaltenen Lösung auf ein Harz, das die anorganischen Substanzen von den Verbindungen der Formel I
und der Formel II abtrennt und
(h) Isolieren des festen Salzpräparats einer Verbindung der Formel I oder der Formel II aus der erhaltenen Lösung.
(h) Isolieren des festen Salzpräparats einer Verbindung der Formel I oder der Formel II aus der erhaltenen Lösung.
Die Verbindungen der Formel I und der Formel II in Form ihrer Salze können auch aus dem Filtrat der Kulturflüssigkeit erhalten
werden durch
(1) Kontaktieren der geklärten Züchtungsflüssigkeit mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz auf Acrylsäurebasis,
bis die antibiotische Aktivität daran adsorbiert ist,
(2) Eluieren der antibiotischen Aktivität von dem Harz unter Verwendung einer wäßrigen Pufferlösung, die gegebenenfalls
auch ein Salz enthalten kann,
(5) Vereinigen der Fraktionen mit einer ß-Lactamase hemmenden Aktivität,
(4) Aufbringen der vereinigten Fraktionen auf eine Säule mit einem Austauscherharz auf Basis von Phenol-Formaldehyd-Kondensationsprodukten,
die speziell für wasserlösliche organische Verbindungen eingestellt sind ("Amberlite
XAD-4"),
(5) Eluieren mit wäßrigem Isopropanol,
(6) Vereinigen der Fraktionen mit einer ß-Lactamase hemmenden Aktivität,
(7) Entfernen des Isopropanols und Einengen der Lösung durch
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Eindampfen,
(8) Aufbringen der Lösung auf ein Anionenaustauscherharz und Weiterarbeiten wie vorstehend bei den Stufen (f), (g) und (h)
angegeben ist.
Bevorzugt verwendet man stark basische Anionenaustauseherharze auf Acrylsäurebasis in Form ihrer Säureadditionssalze des« Hydrochlorids,
wie das von der
Firma Rohm & Haas im Handel befindliche . "Amberlite IRA 458".
Ein Vorteil eines derartigen Harzes besteht darin, daß es bei Verwendung einer wäßrigen Salzlösung, beispielsweise einer
gepufferten Lösung eines Chlorids, wie Natriumchlorid oder dergleichen, gestattet, die Salze der Verbindungen der Formel I
und der Formel II nacheinander zu eluieren. Wenn etwas weniger vorteilhafte stark basische Harze auf Basis von Polystyrol/
Divinylbenzol verwendet werden, ist es im allgemeinen erforderlich, mit einer wäßrigen, einen niederen Alkohol enthaltenden
Lösung eines Salzes, z.B. eines Chlorids, wie Natriumchlorid, zu eluieren, um zufriedenstellende Ausbeuten zu erhalten. Zu
beachten ist jedoch, daß derartige Lösungsmittel zu weniger reinen Produkten an den gewünschten Verbindungen führen können.
Diese Ve rfahrensVariante unterscheidet sich von dem
Adsorptionsverfahren an Kohle insofern, als die Salze der Verbindungen MM 4550, MM 13902 und MM I788O von den Salzen der
erfindungsgeraäßen Verbindungen der Formeln I und II in der
ersten Eluierungsstufe abgetrennt werden.
Das Verfahren vorliegender Erfindung unterscheidet sich grund-
809836/071S
ZZ .
legend von dem früher beschriebenen Verfahren dadurch, daß
die für die weitere Verarbeitung in der Stufe (f) ausgewählten Fraktionen solche sind, die das Salz einer Verbindung der Formein
I und II enthalten, welche praktisch frei von anderen Antibiotika sind.
Die freien Säuren der Formeln I und II können durch vorsichtiges Ansäuern der Lösung eines Salzes einer Verbindung der
Formeln I oder II bzw. durch anschließendes rasches Extrahieren in ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel
mit schließlicher Gewinnung der Säure aus der Lösung erhalten werden.
Bei den Verfahren vorliegender Erfindung ist es häufig besonders zweckmäßig, mit einem Alkalimetallsalz der Verbindungen der
Formeln I und/oder II zu arbeiten, wie den Lithium-, Natriumoder Kaliumsalzen, wobei das Natriumsalz bevorzugt ist .Es ist möglich,
auch andere Salze mittels des Extraktionsverfahrens herzustellen,
doch ist es gewöhnlich zweckmäßiger, zuerst das gereinigte Alkalimetallsalz, insbesondere das Natriumsalz, zu bilden und
dann dieses in ein anderes Salz zu überführen, beispielsweise indem man die Lösung durch ein Kationenaustauscherbett in Form
des anderen Salzes leitet. Somit können gemäß dieser Beschreibung andere Elektrolyse, wie Lithium-, Kalium- oder andere
Salze, anstelle der beschriebenen Natriumsalze eingesetzt werden, doch"bevorzugt man im allgemeinen^mit dem Natriumsalz zu
arbeiten. In gleicher Weise können andere Salze als die Chloride, nämlich beispielsweise Bromide, Nitrate oder dergleichen,
eingesetzt werden, obwohl man im allgemeinen bevorzugt, mit
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dem Chlorid zu arbeiten.
Bei einem bevorzugten Chromatographieverfahren zur Reinigung gemäß den Stufen (f) und (g) verwendet man eine wäßrige Lösung
des Natriumsalzes, die bis annähernd zum Neutralpunkt gepuffert
ist, in Verbindung mit einem basischen Ionenaustauscherharz. Demzufolge kann eine wäßrige Lösung von Natriumchlorid (oder
einem anderen ähnlichen Salz), die mit einem geeigneten Puffer, wie einem Phosphatpuffer, auf etwa pH 7 gepuffert worden ist,
in Verbindung mit einem Trägerharz verwendet werden, das sekundäre oder tertiäre Aminogruppen oder quartäre Aminogruppen enthält.
Geeignete Trägerstoffe umfassen basische Ionenaustauscher auf Cellulosebasis oder aus vernetzten Dextranen, wie sie als
DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex, QAE-Sephadex und dergleichen
bekannt sind.
Bei einem verwandten geeigneten Chromatographieverfahren zur Reinigung gemäß den Stufen (f) und (g) verwendet man ein
Lösungsmittelsystem, das aus einem Gemisch von Wasser und geringen Mengen eines mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmittels, wie einem niederen Alkohol, z.B. mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, in Verbindung mit einem inerten Trägermaterial,
wie Silikagel oder Cellulose, besteht. Beispiele geeigneter Lösungsmittelsysteme sind wäßriges Isopropanol, wäßriges
n-Butanol und dergleichen. Beispielsweise kann man in Verbindung mit einem Celluloseträgermaterial ein Gemisch von grobangenähert 1 Teil Wasser und 4 Teilen Isopropanol verwenden.
Das Produkt aus den vorgenannten Verfahrensstufen enthält häufig
einen hohen Anteil an Natriumchlorid, so daß es vorteilhaft
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ist, die vereinigten Lösungen zu entsalzen. Das Entsalzen kar:n dadurch, bewirkt werden, daß man die Lösung durch ein Bett
einer lipophilen Substanz leitet, an das das Antibiotikum/jedoch
nicht das Natriumchlorid adsorbiert wird. Geeignete Substanzen sind auf Polystyrol basierende Polymerisat-Absorptionsmittel,
wie "Amberlite'XAD-4", "Diaion HP20" und dergleichen.
Das Produkt aus dem vorgenannten Verfahren kann auch mittels Chromatographie an geeigneten Gelfiltrationsmitteln entsalzt
werden, wie an vernetzten Dextranen, beispielsweise "Sephadex GlO" und "Sephadex G15"* sowie an Polyacrylamidgelen, wie
"Biogel P2". Das Antibiotikum kann von derartigen Substanzen unter Verwendung von Wasser, wäßrigem Methanol oder dergleichen
-eluiert werden.
Die Säulen werden mit einer solchen Geschwindigkeit eluiert, daß eine Trennung der Antibiotika in verschiedene Fraktionen
erreicht werden kann. Im allgemeinen können unterschiedliche Zonen aus diesen Säulen eluiert werden. Diese enthalten das
Dinatriumsalz der Verbindung MM 4-550, das Dinatriumsalz der Verbindung MM Γ3902, das Dinatriumsalz der Verbindung MM I7880,
die Natriumsalze der Verbindungen der Formel I und die Natriumsalze der Verbindungen der Formel II, weichletztere unmittelbar
nach den Natriumsalzen der Verbindungen der Formel I eluiert werden. Gewöhnlich liegen die drei Dinatriumsalze ziemlich
weit von den Mononatriumsalzen auf den Anionenaustauscherharzen
auseinander. Wenn die Säule nicht sorgfältig überwacht wird, kann es sein, daß die Mononatriumsalze in sich überlappenden
Fraktionen erhalten werden. Falls dies eintritt, kann man entweder (a) diese Lösung gefriertrocknen, um einen brauchbaren
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unreinen Komplex mit einem Gehalt an den Antibiotika zu erhalten, der dann später aufgearbeitet werden kann , oder (b) die
Lösung per se mit einer sorgfältig berechneten Menge Eluierungsmittel
nochmals Chromatographieren, um eine Anreicherung an der Lösung des Natriumsalzes einer Verbindung der Formel I, die
frei von dem Natriumsalz einer Verbindung der Formel II ist, und/oder eine Anreicherung einer Lösung des Natriumsalzes einer
Verbindung der Formel II, die 'frei von dem Natriumsalz einer Verbindung der Formel I ist, zu erhalten. Diese erhaltenen
Lösungen können dann gefriergetrocknet oder in anderer Weise lösungsmittelfrei gemacht werden.
Die für eine Anreicherung ausgewählten Fraktionen sind solche, die eine bemerkenswerte ß-Lactamase hemmende Aktivität oder
eine antibakterielle Aktivität zeigen. Geeignete Methoden zur Feststellung einer ß-Lactamase hemmenden Aktivität sind in den
eingangs genannten britischen Patentschriften bzw. deutschen Offenlegungsschriften beschrieben, obwohl auch andere geeignete
Verfahren angewendet werden können.
Die nachfolgenden Schemata zeigen die bevorzugten Verfahrensstufen,
um die Verbindungen der Formeln I und II in Form ihrer Natriumsalze zu erhalten. Die auf diese Art und Weise erhaltenen
Natriumsalze können gegebenenfalls weiter gereinigt werden, indem man die vorstehend beschriebenen chromatographischen Verfahren anwendet.
Ein Verreiben der Salze der Verbindungen der Formeln I und II in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, wie Wasser ent-
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haltendem Acetonitril oder Aceton, kann ein Entfernen von Verunreinigungen
wertvoll unterstützen.
Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
Absorption an Aktivkohle
Eluieren mit 20prozentigem wäßrigen Aceton
Vereinigen der Fraktionen mit ß-Lactamase hemmender Wirkung
\J
Abdampfen des Acetons und Einengen durch Eindampfen
Cellulöse-DE52-Anionenaustauscherharζ
Eluieren mit Phosphatpufferlösung vom pH 7
Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
entsalzte Lösung
achromatographie
an "AmberIite / XAD 4"
entsalzte Lösung
gefriergetrocknete feste Verbindung
gefriergetrocknete feste Verbindung
Dinatriumsalze der Substanzen MM455O,
MM 13902 und MM I788O
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Piltrat der Züchtungsflüssigkeit
Absorbieren an einem stark basischen Austauscherharz auf Acrylbasis
Eluieren mit Pufferlösung
Vereinigen der Fraktionen mit der zuerst eluierten . ß-Lactamase hemmenden Aktivität
Entsalzen an "Amberlite XAD 1"
Eluieren mit wäßrigem. Isopropanol
Vereinigen der Fraktionen mit ß-Lactamase hemmender Aktivität
Abdampfen des Isopropanols und Einengen durch Eindampfen
Cellulose-DE52-Anionenaustauscherharz
Eluieren mit Phosphatpufferlösung vom pH
Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
^—Shromatographieren an "Amberlite V
entsalzte
Lösung
Lösung
y/
entsalzte Lösung
gefriergetrocknete feste Verbindung
gefriergetrocknete feste Verbindung
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-1J-
Gegebenenfalls können die Salze der Verbindungen der Formeln I und II, die nach den vorstehenden Verfahren hergestellt worden
sind, weiteren chromatographischen Trennverfahren unterworfen werden, um die isolierten jeweiligen Salze der Verbindungen
der Formeln Ia, Ib, Ha oder Hb zu erhalten. Derartige Verfahren sind bevorzugte Ausführungsformen vorliegender Erfindung.
Üblicherweise ist das in einem derartigen Verfahren verwendete Salz ein einwertiges Salz, wie das Ammoniumsalz oder ein Alkalimetallsalz,
wie das Natrium- oder Kaliumsalz.
Eines der geeigneten chromatographischen Trennverfahren ist die Hochdruckflüssigchromatographie, beispielsweise unter
Verwendung einer wäßrigen, mit Ammoniumformiat gepufferten
Fraktionen Lösung. Sobald die die gewünschte Verbindung enthaltenden /,
erhalten worden sind, kann man sie daraus in fester Form durch Gefriertrocknen oder dergleichen gewinnen.
Verbindungen der Formeln Ia und Ib- können durch Säulenchromatographie
an einem Trägermaterial, wie acetylierte Cellulose, und Eluieren mit Gemischen aus Wasser und' Alkohol getrennt v/erden.
Die Verbindungen der Formeln Ha und Hb können ebenfalls unter Verwendung gleicher chromatographischer Methoden getrennt werden.
Wenn die die gewünschte Verbindung enthaltenden Fraktionen erhalten worden sind, können die Verbindungen in fester Form
durch Gefriertrocknen oder dergleichen gewonnen werden.
809836/0716 '
Gegenstand vorliegender Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel Ia1 die
praktisch frei von der Verbindung der Formel Ib ist, mit dem kennzeichnenden Merkmal, daß man ein Gemisch dieser Salze
einer chromatographischen Trennung an einem vernetzten Divinylbenzolharz . . ("Diaion HP2O") oder
einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
Des weiteren bildet einen Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der
Formel Ib, die praktisch frei von einer Verbindung der Formel Ia ist, mit dem kennzeichnenden Merkmal, daß man ein Gemisch dieser
Salze einer chromatographischen Trennung an einem vernetzten Divinylbenzolharz . ("Diaion HP 20")
oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.·
Des weiteren bildet einen Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der
Formel Ha, die praktisch frei von einer Verbindung der Formel lib ist, mit dem kennzeichnenden Merkmal, daß man ein
Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem vernetzten Divinylbenzolharz
("Diaion HP 20") oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft
.
Schließlich ist ein Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung eines Salzes der Verbindung, der Formel Hb, die praktisch frei von einer Verbindung der Formel Ha
ist, mit dem kennzeichnenden Merkmal, daß man ein Gemisch dieser
809836/071ß
Salze einer chromatographischen Trennung an einem
vernetzten Divinylbenzolharz ("Diaion HP 20")
oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
Die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten Salze sind üblicherweise einwertige Salze, wie Alkalimetallsalze,
beispielsweise das Lithium-, Natrium- oder Kaliumsalz, vorzugsweise das Natriumsalz.
Die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten Salze enthalten gewöhnlich nicht mehr als etwa 5 % und noch
zweckmäßiger nicht mehr als etwa 1 % an dem unerwünschten Isomeren.
Die bei den vorgenannten Verfahren verwendeten Adsorptionsharze
("Diaion") sind hochporöse Polymerisate, die von der japanischen Firma Mitsubishi Chemical Industries hergestellt werden,
und stellen nicht im eigentlichen Sinne Ionenaustauscherharze dar, sondern sind synthetische Adsorptionsmittel, die einen
besonders großen aktiven Oberflächenbereich aufweisen, an den organische Verbindungen wirksam adsorbiert werden können.
Das speziell genannte Adsorptionsmittel "Diaion HP 20" ist ein Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat in Perlchenform mit einer
makrovernetzten Struktur und einem spezifischen Oberflächenbereich von etwa 7,8 m /g und einem Porenvolumen von 1,16 ml/g.
Weitere Einzelheiten dieses Harzes sind in dem Prospekt "Diaion HP-Series" der genannten Firma vom Oktober 1976 enthalten.
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Die dem vorgenannten Adsorptionsmittel äquivalenten Harze für Chromatographiezwecke sind in chemischer und physikalischer
Hinsicht gewöhnlich ähnlich, denn sie stellen im allgemeinen makrovernetzte Harze "auf der Basis von Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisaten
dar und enthalten keine ionisierbaren Gruppen.
Am zweckmäßigsten ist das Isomerengemisch, das auf die Säule aufgebracht wird, von guter Reinheit und praktisch frei von
anderen organischen Verunreinigungen, obwohl anorganische Verunreinigungen, z.B. Alkalimetallsalze, wie ein Chlorid, z.B.
Natriumchlorid, vorhanden sein können.
Zweckmäßigerweise ist das verwendete Lösungsmittel Wasser oder Wasser im Gemisch mit einem niederen Alkanol oder einem ähnlichen
mischbaren organischen Lösungsmittel. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel jedoch Wasser.
Die gewünschten Substanzen können dann durch Entfernen des Lösungsmittels, beispielsweise durch Abdampfen, Gefriertrocknen
und dergleichen, erhalten werden. Gegebenenfalls kann die Lösung unmittelbar an einem geeigneten Harz, z.B. "Biogel P2"
und/oder "Diaion HP20", zur weiteren Reinigung vor einem Entfernen
des Lösungsmittels nochmals Chromatograph!ert werden.
Aus den wäßrigen Lösungen der erfindungsgemäßen Salze kann das Wasser beispielsweise durch Eindampfen unter vermindertem
Druck auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens, Auffüllen mit Äthanol auf das ursprüngliche Volumen, Wiedereindampfen
unter vermindertem Druck auf etwa ein Zehntel des
809836 /0716
IZ
ursprünglichen Volumens, Wiederauffüllen auf das ursprüngliche
Volumen durch Zugabe von Toluol und anschließendes Eindampfen unter vermindertem Druck zur Trockne entfernt werden. Spuren
von Lösungsmittel können durch Aufbewahren der Substanzen unter Hochvakuum entfernt werden.
Es wird eine Sporensuspension von Strepomyces olivaceus
ATCC 3II26 verwendet und auf 100 ml eines Anzuchtmediums in
einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft, der mit
einem Schaumstopfen verschlossen ist. Das Anzuchtmedium enthält 2 % Glucose und 1 % Sojabohnenmehl in voll entsalztem
Wasser.
• beimpfte
Das/Anzuchtmedium läßt man 48 Stunden bei 26 C auf einem Drehschüttler
wachsen. Dann werden 5 ml-Anteile des Anzuchtmediums
verwendet und auf 100 ml-Anteile eines Permentationsmediums
in 500 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, die mit Schaumstopfen
verschlossen sind. Das Fermentationsmedium, das mit dem voll entsalztem Wasser zubereitet worden ist, enthält die folgenden
Bestandteile:
ÖO9836/071B
Glucose 2,0 ^
Sojabohnenmehl 1,0 %
CaCO, 0,02 %
CoCl2*6H2O 0,0001 #
Die Fermentationsflaschen werden 72 Stunden bei 26°C auf einem Drehschüttler· bebrütet. Dann werden 20 Flaschen abgeerntet,
und die gesamte erhaltene Kulturflüssigkeit wird 10 Minuten bei 2200 g zentrifugiert.
Vorteilhaft ist auch die Verwendung von Streptomyces olivaceus
ATCC 31365 bei dem vorgenannten Verfahren.
1500 ml des nach dem Zentrifugieren erhaltenen Filtrats der
Züchtungsflüssigkeit werden unter Verwendung von einer Säule
mit Aktivkohle wie folgt einer Reinigung unterworfen: Eine Säule mit granulierter Aktivkohle mit einer Länge von
37 cm und einem Durchmesser von 2,5 cm wird mit voll entsalztem Wasser vorbereitet. Die Säule wird dann nacheinander mit
1 Liter einer 2prozentigen Natriumhydroxidlösung, mit 1 Liter voll entsalztem Wasser, mit 1 Liter 1-n Salzsäure und schließlich
mit 1 Liter voll entsalztem V/asser gewaschen, wobei jeweils 15 ml je Minute durchlaufen. Anschließend wird die Säule
mit einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 gewaschen, bis der pH-Wert des Eluats 7,0 ist. '
809838/0718
1500 ml des Filtrats der ZUchtungsflüssigkeit läßt man durch
die Säule mit Aktivkohle mit einer Geschwindigkeit von 15 ml
je Minute laufen . Dann wird die Säule mit einem Gemisch von 1 Teil Aceton und'4 Teilen Wasser mit einer Geschwindigkeit
von 15 ml je Minute eluiert, und es werden 22 ml-Fraktionen gesammelt.
Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Wirkung gegenüber einem R^^-Enzym-Präparat, das von der Microbiological
Research Establishment, Porton, geliefert worden ist, untersucht. Die Fraktionen, welche die größte Aktivität zeigen,-nämlich
die Fraktionen 8 bis 22, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, um das Aceton zu entfernen.
Die erhaltene wäßrige Lösung wird vor der anschließenden Aufarbeitung tiergefroren gelagert.
(Das PLvgjyj-Enzym ist typisch für plasmatisch beeinfluß-te ß-Lactamasen
und kann gegebenenfalls durch andere R-Faktorß-Lactamasen
ersetzt werden).
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Isolierung der ^ferbindungpi der Formeln I und II in Form ihrer
Natriumsalze, die praktisch frei von Salzen der Verbindungen MM 4550, MM I3902 und MM I788O sind
Die nach der Beschreibung Nr. 2 erhaltene rohe Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck auf etwa 20'ml eingedampft und auf
eine 3*8 χ 27 cm große Säule mit einem schwach basischen Anionenaustauscher
"DEAE-Cellulose", die mit einer 0,025-m Phosphatpufferlösung
vom pH 7 aufgezogen worden ist, gegeben. Dann wird
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3G
28Ü8563
die Säule mit einer 0,025-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 Mit
einer Geschwindigkeit von 8 ml je Minute eluiert. Es werden 25 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre
ß-Lactamase hemmende Wirkung gegenüber einem RTEM-ß-Lactamase-
Fraktionen mit den
Präparat untersucht. Die/beiden ersten Maxima hinsichtlich einer hemmenden Aktivität werden zurückbehalten. Die Fraktionen
13 bis 16 mit dem ersten Maximum, die das Salz der Verbindung
der Formel I enthalten, werden vereinigt und gefriergetrocknet, so daß man eine feste Substanz mit einem Gehalt an dem Natriumsalz
der Verbindung der Formel I eriiältr die praktisch frei
von Salzen der dibasischen Antibiotika ist. Die Fraktionen 19 bis 21 mit dem zwei ten Maximum, die das Salz der Verbindung
der Formel II enthalten, werden vereinigt und gefriergetrocknet, so daß man eine feste Substanz mit einem Gehalt an dem
Natriumsalz der Verbindung der Formel II erhält, die praktisch frei von Salzen der dibasischen Antibiotika ist.
(Das Gefriertrocknen der vereinigten Fraktionen I3 bis 16 und
19 bis 21 führt natürlich zu einer Substanz, die ein Gemisch
der Natriumsalze der Antibiotika der Formeln I und II enthält. Die Dinatriumsalze der Verbindungen MM 4550, MM Γ59Ο2 und
MM I788O werden im Anschluß an die gewünschten Salze eluiert).
Teilweise Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Die gefriergetrocknete Substanz mit dem Salz der Verbindung des Beispiels 1 wird in 10 ml voll entsalztem Wasser gelöst
und die Lösung wird mit 1 g Natriumchlorid versetzt. Diese
809836/071B
Lösung wird auf eine 1,5 χ 15 cm große Säule mit "Amberlite
XAD-V gegeben, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist. Die Säule wird mit einem Gemisch von 4 Teilen Wasser
und 1 Teil n-Propanol mit einer Geschwindigkeit von 2 .ml je
Minute eluiert, und es werden 4 ml-Praktionen aufgefangen. Die
Fraktionen werden durch Zugabe von Silbernitrat auf Chlorid und weiterhin gegen ein Bmg^-ß-Lactamase-Präparat auf ihre ß-JLactamase
hemmende Aktivität geprüft. Die Fraktionen mit der größten hemmenden Aktivität und einer negativen Silbernitratreaktion,
nämlich die Fraktionen 6 bis 1J>, werden vereinigt und gefriergetrocknet,
wobei man 32,5 mg eines amorphen Feststoffes mit
einem Gehalt an dem Natriumsalz der Verbindung der Formel I erhält.
Die Eigenschaften dieser Substanz sind folgende:
(A) Chromatographische Eigenschaften
(i) Chromatographie an einem schwach basischen Ionenaustauschpapier
("Whatman DE8l"):
| Eluierungsmittel | Rp-Wert des Natrium-! salzes |
| 1.) 0,05-molare Phosphatpuffer lösung vom pH 7 2.) 0,05-molare Phosphatpuffer lösung vom pH 7 rait einem Gehalt von 0,2-m NaCl |
0,69 0,80 |
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(ii) Chromatographie an "Whatman No. 1 Paper"
| Losungsraittelsystem | R^-Wert des Natrium salzes |
| 1.) Butanol:Äthanol:Was ser obere Phase 4:1:5 2.) Butanol:Pyridin:Was ser 1:1:1 |
0,12 0,42 |
(B) „Hochspannungspapier-Elektrophorese
Die Elektrophorese wird an einem Papier Nr. 20 mit einer Pyridin/Essigsäure-Pufferlösung
vom pH 5*3 als Laufmittel bei 5000 V 15 Minuten lang durchgeführt. Die R^-Werte für das
Natriumsalz betragen wie für die Vergleichsverbindung Benzylpenicillin 1,0.
(C) Antibakterielle Wirksamkeit
Die antibakterielle Wirksamkeit der Substanz unter Verwendung der Microtiter-Methode wurde wie folgt bestimmt:
| Organismus | Mind es themmkonzent rat i on |
| Bacillus subtilis A | ^ 40 |
| Enterobacter cloacae Nl | 1250 |
| Escherichia coli 10*18 | 150 |
| E.coli JT 410 | 625 |
| Klebsiella aerogenes A | 312 |
| Proteus mirabilis C977 | 625 |
| Pseudomonas aeruginosa A | >2500 |
| Salmonella typhimurium CTlO | 312 |
| Serratia marcescens US39 | 625 |
| Staph. aureus Russell | I50 |
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'38
28Ü8563
(D) Enzymhemmung
Die enzymhemmende Wirksamkeit der Substanz gegenüber einer Reihe
von ß-Lactamase-Präparaten 'ist nachstehend wie folgt zusammengefaßt
:
| ß-Lactamase-Präparate aus: |
$ Hemmung bei 200 ps/rnl |
Konzentration, die eine 50prozentige Hemmung ergibt,(pg/ml) |
| Staph. aureus Russell | 40 | - |
| E. coli JT4' | 95 | |
| Proteus mirabilis C889 | - | 112 |
| Pseudomonas aeruginosa Dalgleish |
_ | 170 |
| Enterobacter cloacae P99 | 83 - | |
| Pseüdomonas aeruginosa A | 30 | |
| Klebsiella aerogenes E70 | 27 |
(Verfahren nach der BE-PS 827 926)
Beispiel 2
Teilweise Reinigung des Natriumsalzes der Verbindungen der Formel II
Die gefriergetrocknete Substanz des Salzes der Verbindung II des Beispiels 1 wird in 10 ml voll entsalztem Wasser gelöst. Die
Lösung wird mit 1 g Natriumchlorid versetzt. Dann wird die Lösung auf eine 1,5 χ 15 cm große Säule mit "Amberlite XAD-V'*
die mit voll entsalztem V/asser aufgezogen worden ist, gegeben. Die Säule wird mit einem Gemisch von 4 Teilen Wasser und 1 Teil
n-Propanol mit einer Geschwindigkeit von 2 ml je Minute eluiert.
Es werden 4 ml-Fraktionen gesammelt» Die Fraktionen werden mittels
·Silbernitrat auf Chlorid und gegenüber einem RTEM-ß-Lacta-
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to
mase-Präparat auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht.
Die Fraktionen mit der größtem hemmenden Aktivität und einer negativen Reaktion auf Silbernitrat, nämlich die Fraktionen
7 bis IJ), werden vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch
man 32,5 mg eines amorphen Feststoffes mit einem Gehalt an dem
Natriumsalz der Verbindung der Formel II erhält.
Die Eigenschaften dieser Substanz sind folgende:
(A) Chromatographische Eigenschaften
(i) Unter Verwendung eines schwach basischen Anionenaustauschpapiers
("DE8l-Cellulose") beträgt der Laufwert des
Natriumsalzes 0,5^·* wenn man mit 0,05-m Phosphatpufferlösung
vom pH 7 eluiert.
(ü) Unter Verwendung des Whatman No. 1 Paper: Das Natriumsalz
besitzt einen Laufwert von 0,20, wenn man mit einem Gemisch
von Butanol/Äthanol/Wasser im Verhältnis 4:1:5 als obere Phase eluiert.
(B) Hochspannungspapier-Elektrophorese
Die Elektrophorese wird an Whatman No. 20-Papier in Pyridin/-Essigsäure-Pufferlösung
vom pH 5»3 als Laufmittel bei 5000 V 15 Minuten lang durchgeführt. Der R„-Wert für das Salz beträgt
0,95 gegenüber Benzylpenicillin mit dem Wert 1,0.
(C) Antibakterielle Wirksamkeit
Die antibakterielle Wirksamkeit der Substanz wurde unter Verwendung
der Microtiter-Methode bestimmt. Die Ergebnisse lauten wie folgt:
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| Organismus | Mindesthemmkonzen- trationen (ug/ml) |
| Bacillus subtilis A Enterobacter cloacae Nl Escherichia coli 10418 Klebsiella aerogenes A Proteus mirabilis C977 Pseudomonas aeruginosa A Salmonella typhimurium CTlO Serratia marscens US39 Staph. aureus Oxford Staph. aureus Russell |
250 >1000 250 500 500 > 1000 250 "> 1000 500 250 . |
(D)- Enzymhemmung
Die ß-Lactamase hemmende Aktivität der Substanz gegenüber einer Anzahl von Enzympräparaten wurde mit den folgenden Ergebnissen
bestimmt:
| ß-Lactamase-Präparate aus |
fo Hemmung bei 200 pg/ml |
Konzentration, die eine 50$ige Hemmung ergibt (ug/ml) |
| Staph. aureus Russell | _ | I50 |
| E. coli JT4 | - | 72 |
| Proteus mirabilis C889 | - | 62 |
| Pseudomonas aeruginosa Dalgleish |
_ | 53 |
| Enterobacter cloacae P99 | - | .10 |
| Pseudomonas aeruginosa A | 39 | |
| Klebsiella aerogenes Ξ70 | 13 |
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Beispiel 4
Wei'-.-ι-re Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der
Formel I
Die nach Beispiel 2 erhaltene Substanz wird in voll entsalztem Wasser gelöst und auf eine stark basische Anionenaustauschersäule
("QAE-Sephadex A25") gegeben, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist. Die Säule wird mit voll entsalztem
Wasser mit einem steigenden Natriumchloridgradienten von O bis 0,18-m eluiert. Die Fraktionen aus der Säule werden gegenüber
einem Rn^-Präparat auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität
untersucht. Diejenigen Fraktionen mit der größten Aktivität werden vereinigt. Zu den vereinigten Fraktionen wird Natriumchlorid
bis zu einer Endkonzentration von mindestens 5 $ zugegeben.
Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule von -"Amberlite
XAD-V gegeben. Dann wird die Säule mit einem Gemisch aus 1 Teil n-Propanol und 4 Teilen Wasser eluiert. Die Fraktionen mit
einem Gehalt an dem gewünschten Salz, die aufgrund ihrer ß-Lactamase hemmenden Wirkung ausgewählt werden, werden vereinigt,
zur Entfernung des organischen Lösungsmittels unter vermindertem Druck eingedampft und dann gefriergetrocknet.
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Die vereinigten Fraktionen aus der Chromatographie an "QAE-Sephadex"
des Beispiels 4 können entsalzt und chromatographisch an einer Säule mit "Biogel P2" wie folgt weiter gereinigt werden:
Der gefriergetrocknete Feststoff aus der Säule mit "QAE-Sepha-
Der gefriergetrocknete Feststoff aus der Säule mit "QAE-Sepha-
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dex" wird in einem geringer! Volumen voll entsalztem Wasser
gelöst und auf eine Säule mit "Biogel P2" gegeben. Die Säule wird mit lprozentigem wäßrigen Butanol eluiert. Die Fraktionen
werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität und auf die Reaktion
mit Silbernitrat geprüft. Diejenigen Fraktionen, die eine negative Reaktion auf Silbernitrat, jedoch eine angemessene
ß-Lactamase hemmende Aktivität zeigen, werden vereinigt und gefriergetrocknet.
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Die nach dem Verfahren des Beispiels 2 erhaltene Substanz wird in voll entsalztem V/asser gelöst und auf eine Säule mit einem
stark basischen Anionenaustäuscherharz "Amberlite IRA 458" gegeben.
Die Säule wird mit 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 aufgezogen und mit Phosphatpufferlösung mit steigendem Gehalt
an Natriumchlorid eluiert, bis der Natriumchloridgehalt 1,0-molar
ist. Die Fraktionen mit der größten ß-Lactamase hemmenden Aktivität werden vereinigt. Dann wird Natriumchlorid zu
den vereinigten Fraktionen zugegeben, bis zu einer Konzentration von mindestens 5 %>
Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule mit "Amberlite XAD-4" gegeben, die mit voll entsalztem
Wasser aufgezogen worden ist. Dann wird die Säule mit einem ^ Gemisch aus 1 Teil n-Propanol und 4 Teilen Wasser eluiert. Die
Fraktionen mit der größten ß-Lactamase hemmenden Aktivität jedoch einer negativen Reaktion auf Silbernitrat werden vereinigt
und gefriergetrocknet.
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Beispiel 7
V/eitore Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der
Formel I
Das Salz der Verbindung der Formel I kann chromatographisch an einer Säule mit Cellulose-Füllung ("Cellulose CCJ51") wie
folgt weiter gereinigt werden:
Der unreine Feststoff mit einem Gehalt an dem Salz der Verbindung der Formel I wird in der Mindestmenge voll entsalztem
Wasser gelöst und bis zu etwa 50 % mit n-Propanol versetzt.
Die erhaltene Lösung wird auf die Säule mit Cellulose gegeben. Dann wird die Säule mit einem Gemisch aus 4 Teilen n-Propanol
und 1 Teil Wasser eluiert. Die erhaltenen Fraktionen werden nach Verdünnen mit voll entsalztem Wasser auf ihre ß-Lactamase
hemmende Aktivität untersucht. Die Fraktionen mit einem Gehalt an dem gewünschten Salz werden vereinigt, zum Entfernen des
Lösungsmittels unter vermindertem Druck eingedampft und dann
gefriergetrocknet.
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
Es wird das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren angewendet,
jedoch wird als Ausgangssubstanz die nach dem Verfahren des
Beispiels 3 erhaltene Substanz verwendet.
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Beispiel 9
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der ■
Formel II
Es wird das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren angewendet,
jedoch mit der nach Beispiel 8 erhaltenen Verbindung als Au.sgangssubstanz.
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
Es wird das.in Beispiel 6 beschriebene Verfahren angewendet,
jedoch mit der nach . Beispiel 5 erhaltenen Substanz als Ausgangsverbindung.
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der
Formel II
Es wird das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren angewendet, jedoch mit der nach Beispiel 3 erhaltenen Substanz als Ausgangs
verbindung.
Herstellung der rohen Antibiotika aus dem Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
80 ml des Filtrats der Züchtungsflüssigkeit, das im wesentlichen
nach dem in der Beschreibung Nr. 1 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, werden auf eine 1,5 x 15 cm große Säule
mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz auf Acrylbasis
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("Amberlite IRA 458") gegeben. Dann wird die Säule mit 0,05-m
Phosphatpufferlösung vom pH 7 niit einem allmählich ansteigenden
Gehalt von O bis 1,0-m Natriumchlorid mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2,5 ml je Minute eluiert. Es werden 5 ml-Fraktionen
gesammelt. Die Fraktionen werden gegen ein BmEM-ß-Lactarnase-Präparat
auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität«und
einem Gehalt an den Natriumsalzen der Verbindungen der Formeln
I und II, nämlich die Fraktionen 4 bis Ij?* werden vereinigt. "
(die Dinatriumsalze der Verbindungen MM 4550, MM 13902 und
MM I788O werden erst mit Beginn der Fraktion I7 eluiert).
.Zu den vereinigten Fraktionen werdenJ5 g Natriumchlorid gegeben.
Die erhaltene Lösung wird auf eine 1,5 x 15 cm große Säule
mit "Amberlite XAD-4" gegeben, die mit voll entsalztem Wasser
aufgezogen worden ist. Dann wird die Säule mit einem Gemisch von 1 Teil n-Propanol und 4 Teilen Wasser mit einer Geschwindigkeit
von 3 ral Je Minute eluiert. Es werden 4 ml-Fraktionen
gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität und auf ihre Reaktion mit Silbernitratlösung untersucht.
Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität und einer negativen Reaktion auf Silbernitrat werden verein
einigt und gefriergetrocknet, so daß man/teilweise gereinigtes Präparat der Natriumsalze der Verbindungen der Formeln I und
II erhält. Dieses verunreinigte Präparat wird nach den vorstehend beschriebenen Verfahren weiter gereinigt. '
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Herstellung roher Antibiotika aus dem Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
305 ml des Filtrats der Züchtungsflüssigkeit, die im wesentlichen
nach dem in der Beschreibung Nr. 1 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, werden auf eine 1,5 χ .15 cm große Säule
mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz auf Acrylbasis
("Amberlite IRA 458") gegeben. Die Säule wird mit einer
Geschwindigkeit von 5 ml je Minute mit 100 ml voll entsalztem
Wasser gewaschen und dann mit einer Geschwindigkeit von 5 ml je Minute mit einer"0,025~m Phosphatpufferlösung vom pH 7
elulert. Es werden 10 ml -Fraktionen gesanmelt. Die Fraktionen
•werden' gegen ein R^^-ß-Lactamase-Präparat auf ihre ß-Lactamase
hemmende Aktivität untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität und einem Gehalt an Natriumsalzen
der Verbindungen der Formeln I und II, nämlich die Fraktionen 12 bis 32, werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden
gefriergetrocknet. Der gefriergetrocknete Feststoff wird in
20 ml voll entsalztem V/asser gelöst. Die Lösung wird mit 2 g Natriumchlorid versetzt und dann auf eine 1,5 χ 15 cm große
Säule mit "Amberlite XAD-4" gegeben, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit
von 2 ml je Minute mit einem Gemisch aus 1 Teil n-Propanol und 4 Teilen V/asser eluierto Es werden 4 ml-Fraktionen
gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität und auf die Reaktion mit Silbernitra'tlösung
untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einer guten .hemmenden Aktivität und einer negativen Reaktion mit Silbernitrat, nämlich
die Fraktionen 7 bis 14, werden vereinigt und gefriergetrocknet,
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lze der
so daß man ein teilweise gereinigtes Präparat der Sa Verbindungen der Formeln I und II erhält. Dieses unreine Präparat
kann nach den vorstehend beschriebenen Verfahren weiter gereinigt werden.
Fermentationsbedingungen für eine 3Ό0 Liter--Fermentation
Eine gefriergetrocknete Ampulle von Streptomyces olivaceus ATCC 51365 wird in 10 ml einer sterilen Lösung von 2 % Glucose
und 1 % Sojabohnenmehl vom pH 6,5 in voll entsalztem Wasser
resuspendiert♦
1 ml dieser Suspension wird auf 100 ml eines Mediums der gleichen Zusammensetzung überimpft, die in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben
enthalten ist und mit einem Schaumstopfen verschlossen. Nach dem Überimpfen wird der Kolben ^O Stunden bei 28°C auf
einem Drehschüttler bebrütet. Dann werden 5 ml-Anteile des Anzuchtmediums zur Impfung eines festen Schrägagars in Roux-Flaschen
überimpft. Der Agar hat die folgende Zusammensetzung:
V8-Gemüsesaft 20,0 %
"Bacto-Agar (Difco)" 2,5 %
vom pH 6,0
Die Zusammensetzung wird in voll entsalztem Wasser hergestellt.
Jede Roux-Flasche wird eine Woche lang bei 280C bebrütet. Danach
werden 100 ml steriles, voll entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,1 % einer grenzflächenaktiven Verbindung ("Triton
X") zu einer Roux-Flaschenkultur zugefügt und die Sporen durch Schütteln suspendiert. Die Sporensuspension wird als Impfstoff
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-Λ
zu 75 Liter sterilisiertem Anzuohtmedium in einem Fermenter mit
rostfreien Leitblechen .gegeben. Die Zusammensetzung des Mediums ist
1 % Sojabohnenmehl
2 % Glucose
0,03 % Antischaummittel ("Pluronic LSI"), in
destilliertem Wasser.
Das Medium wird 20 Minuten bei 12O0C in dem Fermenter mit
Dampf sterilisiert. Die Anzuchtkultur wird mittels eines 19,05 cm Leitschaufelrührers mit l40 UpM gerührt und mit einer Geschwindigkeit
von 75Liter je Minute mit steriler Luft durch das .offene Ende des Rührers belüftet. Die Einhaltung der Temperatur
.von 28°C wird überprüft. Nach 48stündiger Bebrütung unter diesen
Bedingungen werden 7,5 Liter dieses Anzuchtmediums als Impfstoff für 150 Liter steriles Fermentationsmedium in einem 300 Liter
Fermenter überimpft, der vollständig mit rostfreien Leitblechen ausgerüstet ist. Das Fermentationsmedium besitzt die folgende
Zusammensetzung:
Sojabohnenmehl 0,9 %
Glucose 2,0 %
Kreide 0,02 %
CoCl2.6H2O 0,0001 %
Antischaummittel 0,2 $ ("Pluronic l81")
Vor der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,0. Die Zusammensetzung wird mit destilliertem Wasser hergestellt.
Das Fermentationsmedium wird mit einem 21,59 om Turbinenmischer
mit 3^0 UpM gerührt. Es wird die Einhaltung der Temperatur bei
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SO
29 C kontrolliert. Mit einer Geschwindigkeit von 50 Liter je
Minute wird Luft zugeführt und der pH-Wert bei 6,5 bis 7,0 gehalten.
Die Fermentationsprodukte können nach einer Zeit von 48 bis 54 Stunden geerntet werden.
Fermenfcätionsbedingungen für einen 2000 Liter Fermentationsansatz
Die Fermentationsbedingungen bis zu und einschließlich der Anzucht entsprechen im wesentlichen den in Beispiel 14 beschriebenen
Bedingungen. Es werden 75 Liter Anzucht zum Impfen eines I500
Liter sterilen Fermentationsmediums verwendet, das sich in einem 2000 Liter, voll mit Leitblechen ausgerüsteten rostfreien Fermenter
befindet. Das Fermentationsmedium ist das gleiche wie in 'Beispiel 14.
Die Fermentationsbrühe wird mit 2 Turbinenmischern mit einem jeweiligen Durchmesser von 48,26 cm und mit I06 UpM gerührt.
Mit einer Geschwindigkeit von 400 Liter je Minute wird Luft eingeleitet.
Die Temperatur wird auf 290C und der pH-Wert bei 6,5
bis 7,0 gehalten, und der Fermenter wird nach 48 Stunden abgeerntet .
Isolationsverfahren für die Herstellung von im wesentlichen reinen Natriumsalzen der Verbindungen der Formeln I und II
I50 Liter des Gesamtmediums, das im wesentlichen wie in Beispiel 14 beschrieben hergestellt worden ist, werden in einer kontinu-
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ierlieh arbeitenden Zentrifuge bei annähernd 2,4 Liter/Minute
geklärt. 120 liter des geklärten Piltrats der Fermentationsflüssigkeit werden an einer Säule mit einem Durchmesser von 15*24 cm
und einem Bettvolumen von 9,6 liter, die mit einem stark basischen
Anionenaustauscherharz ("Amberlite IRA 458") in der Chloridform
gefüllt ist, mit einer Geschwindigkeit, von·.400 ml je Minute
perkoliert. Die Säule ist zuvor mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden. Nach dem Perkolieren des Piltrats der Züchtungsflüssigkeit wird die Säule mit dem halben Bettvolumen Wasser
gewaschen, dann mit einer Geschwindigkeit von 2^0 ml je Minute
mit einer Ö,Ö5-m Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7 mit einem Gehalt von 0,2-m Natriumchlorid eluiert. Es werden 2 Liter-Fraktionen
gesammelt. Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität gegenüber einem . RTEM-ß-Lactamase-Präparat,
nämlich die Fraktionen 2 bis 11, werden vereinigt. Dann werden 46,75 g/Liter Natriumchlorid den vereinigten Fraktionen
zugesetzt/ so daß diese eine Konzentration'von 1-m NaCl- enthalben.
Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule von 10,16 cm Durchmesser und einem Bettvolumen von 4 Liter und einer Füllung von "Amberlite
XAD-4" gegeben und mit einer 1-m Natriumchloridlösung ins Gleichgewicht gebracht.
Die Perkolationsgeschwindigkeit beträgt 200 ml je Minute. Dann wird die Säule mit 10 Liter voll entsalztem Wasser und dann mit
einem Gemisch von 4 Teilen Wasser und 1 Teil Isopropanol jeweils' mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/Minute eluiert. Die Fraktionen
mit einer guten ß-Lactamase hemmenden Aktivität gegenüber einem RTEM-Enzym-Präparat, nämlich die Fraktionen J bis 10 und
13 bis 17, werden vereinigt, zum Entfernen des Isopropanols
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unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet.
Es wird eine 3>8 x 30 cm große Säule mit schwach basischem
Anionenaustauscherharz "Cellulose DE52" in der Chloridform mit voll entsalztem Wasser vorbereitet. Der gefriergetrocknete
Peststoff aus der Entsalzungsstufe wird in 300 ml voll entsalztem
Wasser gelöst. Die Lösung, wird mit einer Geschwindigkeit von 6 ml je Minute auf die Säule mit "Cellulose DE52" gegeben.
Die Säule wird mit 200 ml voll entsalztem Wasser gewaschen und dann mit 0,025-m Kaliumphosphatpufferlösung vom pH J mit einer
Geschwindigkeit von 2,5 ml je Minute eluiert. Es werden 10 ml-Fraktionen
gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Die ersten beiden Hauptmaxima
der Aktivität/ nämlich die Fraktionen 30 bis 85* die das
Natriumsalz der Verbindung der Formel I enthalten, und die
Fraktionen 86 bis lj50, die das Natriumsalz der Verbindung der
Formel II enthalten, werden jeweils für sich vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen 30 bis 85 werden auf eine 3,8 χ 29 cm
große Säule mit "QAE-Sephadex A25" in der Chloridform, die mit
voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist, gegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 nil j.e Minute mit
einer 0,1-m Natriumchloridlösung eluiert. Es werden 18 ml-Fraktionen
gesammelt.
Die Fraktionen, die eine gute I^gj^-ß-Lactamase hemmende Aktivität
aufweisen,
/ nämlich die Fraktionen 58 bis 68, werden vereinigt.
Zu dieser Lösung (I80 ml) werden 9 g Natriumchlorid gegeben.
Die erhaltene Lösung wird auf eine 1,5 x 15 cm Säule mit "Amber-
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SS
lite XAD-4" gegeben. Die Säule wird mit 135 ml voll entsalztem
T.T"~3er und dann mit einem Gemisch aus 4 Teilen V/asser und 1 Teil
Isopropanol mit einer Geschwindigkeit von 3 ml je Minute eluiert,
Es werden 4,5 ml-Praktionen gesammelt. Die Fraktionen mit UV-Spektren,
die für die teilweise gereinigten Natriumsalze der Verbindungen der Formel I charakteristisch sind, nämlich UV-Maxima
bei annähernd 297 nm - es handelt sich um die Fraktionen
8 bis 16 und 34 bis 40 - werden vereinigt und gefriergetrocknet,
so daß man 53 mg bzw. 42 mg Feststoffe mit den charakteristischen
Eigenschaften von im wesentlichen reinen Natriumsalzen der Verbindungen der Formel I erhält.
-Die Fraktionen 86 bis I30 aus der Säule mit "Cellulose DE52"
werden auf eine 3,8 χ 29 cm große Säule mit "QAE-Sephadex A25"
in der Chloridform gegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit
von 3 ml je Minute mit 0,1-m Natriumchloridlösung eluiert.
Es werden 18 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf
ihre iVnEM-ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Diejenigen
Fraktionen mit einer guten Wirkung , nämlich die Fraktionen 94 bis 100, werden vereinigt (120 ml). Zu den vereinigten Fraktionen
werden 6 g Natriumchlorid gegeben. Die erhaltene Lösung wird auf eine 1,5 χ 15 cm große Säule mit "Amberlite XAD-4" gegeben.
Die Säule wird mit 90 ml voll entsalztem Wasser und dann mit einem Gemisch aus 4 Teilen V/asser und 1 Teil Isopropanol
jeweils mit einer Geschwindigkeit von 3 ml je Minute eluiert.
Es werden 4 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit den charakteristischen Spektren der unreinen Natriumsalze der Verbindungen
der Formel II mit einem Maximum bei annähernd 307 nm,
nämlich die Fraktionen 10 bis 16 und 26 bis 32, werden verei-
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nigt und gefriergetrocknet, so daß man 9,7 mg bzw. 21,7 mg Feststoffe
erhält. Diese Peststoffe besitzen Eigenschaften, die im wesentlichen mit den reinen Natriumsalzen der Verbindungen der
Formel II übereinstimmen.
Wahlweise anzuwendendes weiteres Verfahren zur Gewinnung der Natriumsalze der Verbindungen der Formeln I und II
Das Filtrat der Kulturbrühe (120 Liter), das die Natriumsalze der Verbindungen der Formeln I und II enthalt, wird gemäß der
Arbeitsweise des Beispiels 16 an einem Ionenaustauscherharz in der Chloridform ("Amberlite IRA 458") Chromatograph!ert und mit
einem Ionenaustauscherharz entsalzt ("Amberlite XAD-V).
Der entsalzte gefriergetrocknete Feststoff wird in j500 ml entsalztem
V/asser gelöst und auf eine Cellulosesäule in der Chloridform (3,8 χ 25 cm,"Cellulose DE52") aufgegeben. Diese Säule
wird mit 200 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit 0,025-m Kaliumphosphatpuffer, pH 7* mit einer Geschwindigkeit von 6 ml
Je Minute eluiert. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, die eine gute iL,EM-ß-Lactamase-Hemmwirkung zeigen
(350 ml) werden vereinigt und auf eine Säule mit vernetztem
Dextran (3,8 χ 30 cm, "QAE-Sephadex A25") aufgegeben. Die Säule
wird mit 0,18-m Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 3.ml/Minute eluiert. Es werden 20 ml-Fraktionen gesammelt und
anhand ihres UV-Spektrums analysiert. Fraktionen, die die charakteristischen Absorptionseigenschaften der Natriumsalze der Verbindungen
der Formel I (Fraktionen 50 bis 56) bzw. für das
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Natriumsalz der Verbindung der Formel II (Fraktionen 88 bis 97) zeigen, werden getrennt vereinigt.
Die Fraktionen 50 bis 56 werden mit 15 g Natriumchlorid versetzt
und auf eine Ionenaustauschersäule aufgegeben (1,5 x 15 cm, "Amberlite XAD-4"). Die Säule wird mit I5 ml entionisiertem
Wasser gewaschen und mit Wasser/n-Propanol im Verhältnis '4 : 1 mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute eluiert. Es werden
3 ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen, die das charakteristische UV-Spektrum des gereinigten Natriumsalzes der Verbindung der
Formel I zeigen (Fraktionen 9 "bis 15), werden vereinigt, zur
Entfernung des Propanols unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 35 mg eines Feststoffes, der
die Eigenschaften des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel I zeigt.
Die Fraktionen 88 bis 97 werden mit 24 g Natriumchlorid versetzt
und auf eine Ionenaustauschersäule (1,5 χ 15 cm, "Amberlite XAD-4") aufgegeben. Die Säule wird mit I5 ml entionisiertem
Wasser gewaschen und mit Wasser/n-Propanol im Verhältnis 4 : 1
eluiert. Die Fraktionen., die das charakteristische UV-Spektrum des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel II zeigen,
werden vereinigt, zur Entfernung des Propanols unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 34 mg
des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel II.
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sre
Beispiel l8
Das Piltrat der Kulturbrühe (105 Liter) wird gemäß der Arbeitsweise
des Beispiels 16 mit lonenaustauschersaulen des Typs "Amberlite
IRA 458" und "Amberlite XAD-4" aufgearbeitet.
Die Fraktionen aus der "Amberlite XAD-4"-Saule werden zur Entfernung des Isopropanols auf das
halbe Volumen eingeengt und etwa 65 Stunden bei 5°C gelagert.
Die Lösung (800 ml) wird auf eine Säule mit vernetzten! Dextran
in entionisiertem V/asser (3,8 x 30 cm, "QAE-Sephadex A25")
aufgegeben. Die Säule wird mit 800 ml 0,05-ni Natriumchlorid,
dann mit 0,1-m Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Minute eluiert. Es werden 20 ml-Praktionen gesammelt, die
auf ihre Rmg^-ß-Lactamase-Hemmwirkung und anhand ihrer UV-Spektren
analysiert werden. Die Fraktionen, die das Natriumsalz dar
Verbindung der Formel I (Fraktionen 73 bis 80) bzw. das Natriumsalz
der Verbindung der Formel II (Fraktionen 112 bis 125) enthalten, werden getrennt vereinigt.
Die Fraktionen 73 bis 80 werden unter vermindertem Druck auf
etwa 15 ml eingeengt und auf eine Polyacrylamldgelsäule (3,8 χ 30 cm, "Biogel P2", Teilchengröße 0,3 bis 0,4 mm, der Fa.
Biorad Laboratories, Bromley, Kent^ die mit 1 % Butanol enthal-
aufgezogen wurde, aufgegeben,
tendem Wasser / Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute mit 1 % Butanol enthaltendem entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 6 ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums und der Silbernitratreaktion analysiert. Fraktionen, die das Natriumsalz der Verbindung der Formel I enthalten und eine negative Silbernitratreaktion zeigen (Fraktionen 29 bis 39)> werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 72 mg eines Feststoffes mit den charakteristischen Eigenschaften des
tendem Wasser / Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute mit 1 % Butanol enthaltendem entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 6 ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums und der Silbernitratreaktion analysiert. Fraktionen, die das Natriumsalz der Verbindung der Formel I enthalten und eine negative Silbernitratreaktion zeigen (Fraktionen 29 bis 39)> werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 72 mg eines Feststoffes mit den charakteristischen Eigenschaften des
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gereinigten Natriurasalzes der Verbindung der Formel I.
Die Fraktionen 112 bis 125 werden auf etwa I5 ml unter vermindertem
Druck eingeengt und auf die oben beschriebene Polyacrylamidgelsäule
aufgegeben. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser, das 1 % Butanol-enthält, mit einer Geschwindigkeit von
3 ml/Minute eluiert. Es werden 6 ml-Fraktionen gesammelt..Die
Fraktionen, die das charakteristische UV-Spektrum des Natriumsalzes der Verbindung der Formel II sowie eine negative Silbernitratreaktion
zeigen, werden vereinigt (Fraktionen 4j5 bis 48) . Die vereinigten Fraktionen werden gefriergetrocknet, man erhält
27 mg eines Feststoffes mit den charakteristischen Eigenschaften
des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel II.
I5OO Liter der gemäß Beispiel 15 hergestellten Gesamtbrühe
werden durch Diatomeenerde auf einem drehbaren Hilfsschichtfilter
filtriert. Man erhält 14OO Liter Filtrat, das durch eine Ionenaustauschersäule in der Chloridform ("Amberlite IRA 4-58")
mit einem Durchmesser von 30,5 cm und einem Bettvolumen von
100 Litern mit einer mittleren Durchflußgesehwindigkeit von
4 Litern pro Minute aufgegeben wird. Die Säule wird mit einer
Geschwindigkeit von 1,6 Litern/Minute mit 0,2-m Natriumchlorid
Es werden 20 Liter-Fraktionen gesammelt. in 0,05-m Natriumphosphatpuffer, pH 6,7.» eluiert ./Fraktionen
mit einer guten antibakteriellen Wirkung gegen Klebsiella aerogenes
A (eine Variante von NCTG 418) werden vereinigt (Fraktionen
1 bis 5). Diese Fraktionen werden mit Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1,0-m versetzt. Die Lösung wird
auf eine lonenaustauschersäule ("Amberlite XAD-4") mit .einem
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Durohmesser von 15,3 cm und einem Bettvolumen von 22,4 Litern
mit einer Geschwindigkeit von 1,2 Litern/Minute aufgegeben. Diese Säule wird mit 20 Litern entionisiertem Wasser, dann mit Wasser/-Isopropanol
im Verhältnis 4 : 1 mit einer Geschwindigkeit von 500 ml/Minute eluiert. Es werden 8 Liter-Fraktionen gesammelt.
Die Fraktionen, die die gewünschten Salze enthalten-(Fraktionen
2 bis 4) werden vereinigt (24 Liter) und auf 11,4 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird nach Einstellen des pH-Werts auf
7,0 etwa 65 Stunden bei 50C gelagert. Die Lösung wird dann auf
5,75 Liter weiter eingeengt und auf eine Cellulosesäule (7,8 χ
31 cm, "DE 52") mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Minute aufgegeben.
Die Säule wird mit 0,025-m Kaliumphosphatpuffer, pH 7, mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Minute eluiert. Es werden
22 ml-Fraktionen gesammelt.und auf ihre R_E„-ß-Lactamase-Hemmwirkung
untersucht. Die Fraktionen 60 bis 135 und I36 bis 210
zeigen gute Hemmwirkung und werden getrennt vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen 60 bis 135 (158Ο ml) werden auf eine
Säule mit vernetztem Dextran (4,8 χ 25 cm, "QAE-Sephadex A25")
mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Minute aufgegeben. Diese Säule wird mit 0,1-m, Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit
von 4 ml/Minute eluiert. Es werden 20 ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihrer UV-Spektren analysiert. Die Fraktionen, die das
charakteristische Spektrum des Natriumsalzes der Verbindung der Formel I zeigen (Fraktionen 50 bis 70), werden vereinigt.
Die Fraktionen 136 bis 210 werden auf eine Säule mit vernetztem
Dextran (4,8 χ 26 cm) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von
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SrQ-
-*- 2803563
β ml/Minute aufgegeben. Die Säule wird mit 0,1-m Natriumchlo-
vA <*■ mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Minute eluiert. Es werden
20 ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit den charakteristischen Spektren der teilweise gereinigten Salze der Verbindungen
der Formel II (Fraktionen 91 bis 104) werden vereinigt,
mit 25 g Natriumchlorid versetzt und auf eine Ionenaustausehersäule
(2,4 χ 32 cm, "Amberlite XAD-4") mit einer Geschwindigkeit
von 6 ml/Minute aufgegeben.
Die Säule wird mit etwa 50 ml entionisiertem V/asser gewaschen und mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute mit Wasser/n-Propanol
im Verhältnis 4 : 1 eluiert. Es werden 10 ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen, die eine negative Silbernitratreaktion
auf Chlorid ergeben, jedoch das charakteristische UV-Spektrum des Natriumsalzes der Verbindung der Formel II haben, werden
vereinigt (Fraktionen VJ bis 30)· Diese Fraktionen werden unter
vermindertem Druck zur Entfernung des n-Propanols eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 5^5 mg des reinen Natriumsalzes
der Verbindung der Formel II.
Die Natriumsalze der Verbindungen der Formeln I und II haben folgende Eigenschaften:
1. UV-Spektrum:
Die vermischten Natriumsalze der Verbindungen der Formel I haben ein charakteristisches Maximum bei etwa 297 nm.
Die vermischten Natriumsalze der Verbindungen der Formel II haben ein charakteristisches Maximum bei etwa 307 nm (1 von 2) /
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Das IR-Spektrum der Natriumsalze zeigt bei 1750 cm~
v ■ rakteristische ß-Lactamcarbonylabsorptionen.
3. Die in vitro antibakterielle Aktivität der in den vorherigen Beispielen beschriebenen Verbindungen ist in der Tabelle
zusammengestellt.
| Organismus | Natriumsalz der Verbindung der Formel I; Mindesthemm- konzentratio- nen (μg/ml) |
I Natriumsalz der ! Verbindung der ; I Formel II; ι ! Mindesthemm- I konzentratio- ! nen (ug/ml) : |
| Bacillus subtilis A | 0,8 | 0,2 |
| Enterobacter cloacae Nl | 25,0 | 25,0 |
| Escherichiä coli 104l8 | l,-5 | 1,5 |
| Klebsiella aerogenes A | 12,5 | 6,25 |
| Proteus mirabilis C977 | 6,25 | 6,25 |
| Pseudomonas aeruginosa A | P^lOO | -^100 |
| Salmonella typhimurium CTlO | 5,12 | 0,8 |
| Serratia marcescens US39 | 50,0 | 25,0 |
| Staph. aureus Oxford | 0,8 | 1,5 |
| Staph. aureus Russell | 3,12 | 1,5 |
Die praktisch reinen vermischten Natriumsalze der Verbindungen der Formeln Ia und Ib werden durch Hochdruckflüssigchromatographie
unter folgenden Bedingungen geprüft: Säule: 300 mm χ 3,9 mm , gefüllt mit einer monomolekularen
Octadecylsilanöehicht auf einem festen Träger. Lösungsmittel: 0,05-ffi Ammoniumacetat, eingestellt auf pH 4,5
mit Essigsäure in 5 % Acetonitril/95 % Wasser.
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2Β08563
Fließgeschwindigkeit: 2,5 ml/Minute.
Nachweis: UV-Absorption bei 295 mn.
Aufgabe : 50 Mikroliter einer Lösung von 1,6 rag in 0,5 ml
Wasser.
Die beiden Natriumsalze werden in zwei Gipfel aufgelöst von 3 Min. 45 Sek. und 4 Min. 4-5 Sek. Die Eluate beider Gipfel werden
getrennt vereinigt und mit verdünnter Natronlauge auf,pH 1J
neutralisiert. Die Lösungen werden eingedampft, man erhält die gewünschten festen Salze der Verbindungen der Formeln Ia und Ib.
Gemäß der Arbeitsweise des Beispiels 21 werden die gemischten Natriumsalze der Verbindung der Formeln Ha und Hb durch Hochdruckflüssigchromatographie
mit Verweilzeiten von 6,0 Minuten bzw. 7 Minuten 10 Sekunden aufgetrennt.
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Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
2"8tf 8"5 6 3
Absorption an einem stark basischen Harz "Amberlite
IRA 458"
H Φ •Η ft CQ •Η
Φ PQ
Eluieren mit 0,2-m NaCl in Pufferlösung
Vereinigen der Fraktionen, die die Verbindungen der Formeln Ia, Ib, Ha und Hb enthalten
Entsalzen an "Amberlite XAD-4" Eluieren mit Isopropanol/
Wasser
Eindampfen unter vermindertem Druck zum Entfernen des Isopropanols
Chromatographie an 11QAE-Sephadex"
Ia, Ib
Entsalzen an "Amberlite XAD-4"
\f
Gefriertrocknen der Fraktionen mit einem Gehalt an den Verbindungen
Ia, Ib
Chromatographie an "QAE-Sephadex
Fraktionen mit einem Gehalt an den Verbindungen Ia, Ib
Chromatographie an ifDiaion HP20"
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung Ia
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung Ib
Chromatographie an "Biogel P2" "
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung Ia
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung Ib
Chromatographie an J'Diaion HP20" und]
'Gefriertrocknen "Ί
Ia Ib
Ha, Hb
Entsalzen an "Amberlite XAD-V
Gefriertrocknen der Fraktionen mit einem Gehalt an den Verbindungen
Ha, Hb
Chromatographie an "Diaion HP20"
Fraktionen mit
einem Gehalt
an der Verbindung Ha
einem Gehalt
an der Verbindung Ha
Fraktionen mit
einem Gehalt an der Verbindung Hb
U-Chromatographie—7
j-an "Biogel P2" ^
Fraktionen mit Fraktionen mit einem Gehalt einem Gehalt an der Verbin- an der Verbindung
Ha dung Hb
Chromatographie an 'Diaion HP20" und gefriertrocknen
Ha - Hb
Ia, Ib, Ha und Hb bedeuten hier die Natriumsalze
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Die Sporen von Streptomyces olivaceus ATCC 31J565 werden gemäß
der Arbeitsweise des Beispiels 14 gezüchtet.
Die Sporensuspension aus einer Roux-Flasche wird als Inoculum
für 75 Liter sterilisiertes Nährmedium in einem 100 Liter fassenden,
mit Leitblechen versehenen Permenter aus rostfreiem Stahl verwendet. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:
Sojabohnenmehl 1 %
Glucose 2 %
Antischaummittel ("Pluro-
nic L81") 0,03 %
in destilliertem Wasser.
Das Medium wird in dem Permenter 20 Minuten bei 1200C mit
Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit'140 UpM mittels
eines Leitschaufelrührers mit 19 cm Durchmesser gerührt und durch eine offenendige Sprüheinrichtung mit 75 Liter/Minute
steriler Luft versorgt. Die Temperatur wird auf 280C eingeregelt.
Nach 48stündiger Bebrütung unter diesen Bedingungen werden 75 Liter dieser Kulturlösung als Inoculum für 1500 Liter
steriles Nährmedium in einem 2000 Liter fassenden Permenter aus rostfreiem Stahl, der mit Leitblechen versehen ist, verwendet.
Das Fermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:
' . 'Sojabohnenmehl 2,0 %
Glucose 0,9 %
Kreide 0,02 %
CoCl2-OH2O 0,0001 %■
Antischaummittel ("Pluronic
L8l") 0,2 %
in destilliertem Wasser, vor der Sterilisation auf pH 6 eingestellt.
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Das Fermentationsmedium wird mit 2 Scheiben-Turbinenmischern mi*' einem Durchmesser von je 48 cm bei 106 UpM gerührt und mit
Luft mit einer Geschwindigkeit von 400 Liter/Minute versorgt. Die Temperatur wird auf 290C, der pH-Wert auf 6,5 bis 7,0 gehalten.
Die Ernte erfolgt nach 48 Stunden.
Ein weiteres für die Extraktion der Verbindungen der Formeln Ia, Ib, Ha und Hb geeignetes Kulturfiltrat wird erhalten, indem
man die Sporensuspension von S. olivaceus aus 2 Roux-Flaschen als Inoculum für I50 Liter steriles Nährmedium in einem
300 Liter fassenden Stahlfermenter verwendet. Das Medium und
die Wachstumsbedingungen sind wie oben beschrieben. Nach 48 Stunden werden I50 Liter dieses Mediums zur Beimpfung von 3OOO Liter
Fermentati'onsbrühe in einem 5OOO Liter fassenden Fermenter aus
Stahl verwendet. Das Fermentationsmedium wird wie oben bebrütet, die Ernte erfolgt jedoch erst nach 55 Stunden.
Die Kulturbrühen aus den beiden 2000 und 5OOO Liter fassenden Fermentern
geben zusammen ein Volumen von 4725 Liter. Sie werden auf einem
drehbaren Hilfsschichtfilter unter vermindertem Druck filtriert.
Man erhält 4200 ^iter klare Brühe, die auf Säulen mit stark
basischem Anionenaustauscherharz in der Chloridform ("Amberlite
IRA 458") mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 Liter/Minute
aufgegeben werden. Das Harz wird mit 60 Liter entionisiertem Wasser gewaschen3 dann EP.it einer wäßrigen Lösung von 0,2-rn
Natriumchlorid und 05G75-ei ITa tr ium phosphat,, pH 63J3 eluiert.
Di3 Elution der Verbindungen der Formeln Ia5 Ib5 Ha und Hb
beginntj wenn die Leitfähigkeit des Eluiermittels die Leitfähigkeit
7on Qpl-m natriumchlorid erreicht hat und wenn 450 Liter
E-Iulernmittel abgeflossen sind. Wenn notwendig,, wird die Anwesen-
Q08838/Ö71S
heit von Verbindungen der Formeln Ia, Ib, Ha und Hb mittels
analytischer Hochdruckflüssigchromatographie gemäß Beispiel 21 bestimmt.
Die vereinigten Eluate, die die Verbindungen der Formeln Ia, Ib, Ha und Hb enthalten, werden mit 90 kg (Feuchtgewicht) Iönenaustauscherharz
("Amberlite XAD-4") versetzt. Das Gemisch.wird
mit 50prozentiger Salzsäure auf pH 6,0 eingestellt und 1 Stunde bei 5 C schwach gerührt. Das Harz wird dann abfiltriert und mit
entionisiertem Wasser bei 5°C gewaschen, bis die Leitfähigkeit des Waschwassers unter der von 0,05-m Natriumchlorid ist. Das
gewaschene Harz wird in 42 Liter Isopropanol/Wasser im Verhältnis
1:1 aufgeschlämmt und mit 20prozentiger Natronlauge versetzt, bis der pH-Wert konstant auf 7,5 bleibt. Das Eluiermittel
wird filtriert und gesammelt..Die Elution des Harzes wird zuerst
mit weiterem Isopropanol/Wasser im Verhältnis 1:1, dann mit
Isopropanol/Wasser im Verhältnis 1 : 3 wiederholt. Die vereinigten
Eluate (Γ30 Liter) werden unter vermindertem Druck zur Entfernung
des Isopropanols eingedampft. Die erhaltene Lösung (67 Liter) wird auf eine Säule mit vernetztem Dextran (15 χ 43
cm,. "QAE-Sephadex A25"), die mit 0,1-m Natriumchlorid vorbehandelt
wurde, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 15 Liter/Std. aufgegeben. Die Säule wird mit 7*5 Liter 0,05-m Natriumchlorid
gewaschen und mit 0,1-m Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 7,8 Liter/Stunde eluiert. Es werden 500 ml-Fraktionen
gesammelt, die mittels Hochdruckflüssigchromatographie· auf die Anwesenheit von Verbindungen der Formeln Ia, Ib, Ha und Hb
untersucht werden. Fraktionen, die die Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthalten, die zusammen eluiert wurden, werden vereinigt
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(12,6 Liter). Fraktionen, die die Verbindungen der Formeln Ha und Hb enthalten, eluieren später und werden ebenfalls vereinigt
(5,9 Liter).
Die die Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthaltenden Fraktionen
werden mit 44,16 g/Liter Natriumchlorid versetzt und auf eine Ionenaus tauscher säule (10 χ ^>6 cm, "Amberlite XAD-4")
mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 5*8 Liter/Stunde aufgegeben. Die Säule wird mit 3 Liter entionisiertem Wasser mit
einer Geschwindigkeit von 2,9 Liter/Stunde gewaschen, dann mit Isopropanol/Wasser im Verhältnis 1 : 9 eluiert. Die· Fraktionen,
die die Verbindungen der Formeln Ia und/oder Ib in genügenden .Mengen enthalten (bestimmt durch Hochdruckflüssigchromatographie),
werden gesammelt, nachdem die Leitfähigkeit des Eluats der Leitfähigkeit von 0,01-m .Natriumchlorid entspricht. Die die
Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthaltende eluierte Lösung (7,7 Liter) wird auf pH 7,0 mit 20prozentiger Natronlauge eingestellt,
unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 38',5 g eines Feststoffes.
Die vereinigten Eluate aus der Säule mit dem vernetzten Dextran, die die Verbindungen der Formeln Ha und Hb enthalten, werden
entsprechend behandelt. Man erhält 13*7 g Feststoff.
Das die Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthaltende gefriergetrocknete
Produkt (38,5 g) wird in 50 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Säule mit v.ernetztem Dextran (7,8 χ
30 cm, "QAE-Sephadex A25") in entionisiertem Wasser aufgegeben.
Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 8 ml/Minute zuerst
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mit 4 Liter 0,05-m Natriumchlorid gewaschen, dann mit 0,08-m
Natriumchlorid elulert. Es werden Fraktionen von etwa 20 ml gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums auf 'die Anwesenheit von
Verbindungen der Formeln Ia und Ib untersucht.(Fraktionen I30
bis I70). Diese Fraktionen werden vereinigt (950 ml). Die Chromatographie
wird bei 5°C durchgeführt.
450 ml dieser vereinigten, die Verbindungen der Formeln Ia und
Ib enthaltenden Fraktionen werden mit 23,8 g Natriumchlorid versetzt und auf eine Säule (4,8 χ 62 cm, "Diaion HP20" der
Firma Mitsubishi Chemicals Ltd. 3 Agents Nippon Rensui Co»,
Tokio, Japan) mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/Minute aufgegeben. Es werden 20 ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihrer
UV-Spektren bestimmt. Die Fraktionen, die die Verbindung der Formel Ia (Fraktionen 58 bis 74) bzw. die Verbindung der Formel
Ib (Fraktionen 78 bis 97) enthalten* werden getrennt vereinigt s
unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 490 mg bzw. 357 mg Feststoff.
Das restliche Eluat aus der Dextrankolonne wird entsprechend
aufgearbeitet, man erhält 363 mg bzw. 258 mg Feststoff.
538 mg des die Verbindung der Formel Ia enthaltenden Feststoffes
werden in 25 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Polyacrylamidgelsaule (7S8 χ 4θ cm, "Biogel P2", Teilchengröße
Q9J bis O54 mm) aufgegeben. Die Säule wird bei 50C mit entionisiertem
Wasser mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute eluiert
Es werden 25 ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihrer UV-Spektren analysiert. Fraktionen, die ein charakteristisches Spek-
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trum für sehr reine Verbindungen der Formel Ia aufweisen (Fraktionen
37 bis 42)^ werden vereinigt und unter vermindertem Druck
auf etwa 10 ml eingeengt. Diese Lösung wird auf eine "Diaion HP20"-Säule (3,0 χ 50 cm) aufgegeben und mit entionisiertem
Wasser mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute eluiert. Es werden 10 ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihrer UV-Spektren
analysiert. Fraktionen mit einem charakteristischen Spektrum für sehr reine Verbindungen der Formel Ia (Fraktionen 50 bis 62)
werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 40 mg der Verbindung der Formel Ia als
Feststoff.
5,8 mg des die Verbindung der Formel Ib enthaltenden; Feststoffes
werden in etwa 25 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Polyacrylamidgelsäule (7*8 χ 4θ cm) aufgegeben. Die Säule
wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 25 ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen,
die sehr reine Verbindungen der Formel Ib enthalten (Fraktionen 32 bis 37"* bestimmt anhand ihres UV-Spektrums), werden
vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingeengt. Die Lösung wird auf eine "Diaion HP20"-Säule (2,4 χ
40 cm) aufgegeben und mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 10 ml-Fraktionen
gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums analysiert. Fraktionen, die sehr reine Verbindungen der Formel Ib enthalten (Fraktionen
35 bis 48), werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 53 mg der Verbindung der Formel Ib als Feststoff.
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7 g des die Verbindungen der Formeln Ha und Hb enthaltenden
gefriergetrockneten Peststoffes aus der mit "Amberlite XÄD-4"
durchgeführten Entsalzungsbehandlung
/ werden in 50 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf
eine "Diaion ΉΡ20"-Säule (4,8 χ 57 cm) aufgegeben. Die Säule
wird mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 20 ml-Praktionen gesammelt und
anhand ihres UV-Spektrums analysiert. Fraktionen, die die ,Verbindung
der Formel Ha (49 bis 6$) bzw.. Hb (71 bis HO) enthalten,
werden getrennt vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 875 mg bzw. 1,47 g Feststoff.
Der restliche, die Verbindungen der Formeln Ha und Hb enthaltende
Feststoff wird entsprechend aufgearbeitet, man erhält 860 mg bzw. 1,44 g Verbindungen der Formeln Ha bzw. Hb.
860 mg der Verbindung der Formel Ha werden in 25 ml'entionisiertem
Wasser gelöst und auf eine Polyacrylamidgelsäule (7*8
χ 40 cm, "Biogel P2", Teilchengröße 0,3 bis 0,4 mm) aufgegeben.
Die Säule wird mit einer■Geschwindigkeit von 3 ml/Minute mit entionisiertem
Wasser eluiert. Es werden 25 ml-Fraktionen gesammelt.
Fraktionen, die sehr reine Verbindung der Formel Ha enthalten (Fraktionen 42 bis 50, bestimmt anhand ihres UV-Spektrums), werden
vereinigt, auf etwa 10 ml unter vermindertem Druck eingedampft und auf eine "Diaion HP20"-Säule (2,8 χ 4θ cm) aufgegeben.
Die Säule wird mit entionisiertem Wasser eluiert. Die Fraktionen, deren UV-Spektrum auf sehr reine Verbindung der
Formel Ha hinweist (Fraktionen 52 bis 64^ werden vereinigt,
eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 95 mg der Verbindung
der Formel Ha als Feststoff.
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750 mg der Verbindung der Formel Hb werden in etwa 25 ml entionisiertem
Wasser gelöst und auf eine Polyacrylamidgelsaule (7,8 χ 40 cm, "Biogel P2", Teilchengröße 0,3 bis 0,4 mm) gegeben.
Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute mit entionisiertem V/asser eluiert. Es werden 25 ml-Praktionen
gesammelt. Fraktionen, deren UV-Spektrum auf sehr reine Verbindung der Formel Hb hinweist (Fraktionen 47 bis 55), werden vereinigt,
unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingedampft und auf eine "Diaion HP20"-Säule (2,8 χ 42 cm) aufgegeben. Die
Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute mit entionisiertem
Wasser eluiert. Die ersten 25 Fraktionen werden als 5 ml-Fraktionen, die restlichen Fraktionen als 10 ml-Fraktionen
gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums analysiert. Fraktionen, die sehr reine Verbindung der Formel Hb (Fraktionen
77 bis 91) enthalten, werden vereinigt und gefriergetrocknet.
Man erhält 105 mg der Verbindung der Formel Hb als Feststoff.
Die gemäß Beispiel 23 hergestellten Natriumsalze der Verbindungen
der Formeln Ia, Ib, Ha und Hb sind rein und haben folgende Eigenschaften:
(1) UV-Spektrum
Ia: ein einzelnes Maximum bei 298 nm (molare Extinktion
E= ^8131) (vgl. Fig. 1).
Ib: ein einzelnes Maximum bei 30I nm (molare Extinktion &= 7930) (vgl. Fig. 2).
Ib: ein einzelnes Maximum bei 30I nm (molare Extinktion &= 7930) (vgl. Fig. 2).
Ha: 2 Maxima bei 228 und 308-309 nm (£= I3627)
(vgl. Fig. 3).
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lib: 2 Maxima bei 229 und 3O8-3IO nra (S= 13933J
(vgl. Fig. 4).
(2) Die antibakterielle Aktivität der Natriumsalze wird durch
die Microtiter-Methode bestimmt und ist in Tabelle A angegeben.
(3) Die ß-Lactamase-Hemmwirkung der Natriumsalze ist in Tabelle B angegeben.
(4) NMR-Spektren (jeweils bestimmt in D3O)
Ia : vgl. Fig. 5
Ib : vgl. Fig. 6
Ha: vgl. Fig. 7
Hb: vgl. Fig. 8
Ha: vgl. Fig. 7
Hb: vgl. Fig. 8
(5) Die synergistische Aktivität der Natriumsalze ist in Tabelle C angegeben.
(6) Die Natriumsalze haben bei Mäusen nach subkutaner Verabreichung
in einer Dosis von 50 mg/kg keine toxische Wirkung.
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Tabelle A Mindesthemnikonzentrationen (pg/ml)
| Stamm | Ia | Ib | Ha | Hb | Ampi cillin |
| B.subtiiis | 0,16 | M | <0,08 | 2,5 | «3,0 |
| Enterobacter cloacae Nl |
2,5 | 10 | 2,5 | 10 | 200 |
| E.coil 10418 | 0,3 | ■ 2,5 | '0,3 | 5,0 | «3,0 |
| E.coli JT39 | 5,0 | 2I5 | •5,0 | 5,0 | 800 |
| E.coil JT68 | 5,0 | 2I5 | 10 | 5,0 | 1600 |
| E.coli JT41O | 0j6 | 5,0 | 0,6 | 5,0 | 200 |
| Klebsiella A | 2I5 | 5,0 | 1I2 | 5,0 | 100 |
| Klebsiella E7O | 10 | 5,0 | 10 | 10 | 400 |
| Klebsiella Ba95 | 40 | 10 | . 40 | 10 | >64OO |
| Proteus mirabilis C977 Proteus mirabilis C889 Proteus morganii 1580 Proteus vulgaris •Q3618 Pseudomonas aeruginosa A |
0,6 5,0 2,5 S1O |
10 10 10 10 |
• 0,6 10 2,5 10 |
10 20 20 20 |
«3,0 400 100 400 |
| Salmonella CTlO | >160 | >160 | >160 | >160 | 1600 |
| Serratia US39 | 0,3 | 2I5 | 0,3 | 5,0 | «0, 3 |
| Staph. Oxford | 20 | 10 | 20 | 10 | 1600 |
| Staph. Russell | 1,25 | 1I2 | 0,3 | 2,5 | <3, 0 |
| Staph. Smith | 0,6 | 2I5 | 0;3 | 2,5 | 400 |
| Strep.faecalis | 0,6 | 2,5 | 0,6 | 2,5 | «3,0 |
| 1,25 | 20 | 1,2 | 20 | <3,0 |
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| Verbin dung |
I50 (jig/ml) | Entero- bacter P99 |
Ps. aerug. A |
Proteus C889 |
E.coli . JT4 |
Staph, Russell |
| Ha Hb Ia Ib |
0,02
0,04 0,02 0f04 |
3,0 4,0 4,0 4i°. |
0,04 0,4 0,1 >2jO |
>2,0 0,1 >2,0 0,28 |
0f08 >2,0 3,25 >>2,0 |
| Verbindung | Mindesthemrak.onzentrationen ψ g/ml i |
E.coli JT39 |
| Ampicillin allein +/ΤΛχ Of1 yg/ml + (Ia) Ί yg/ml |
Staph« aureus Russell |
2000 >500 500 |
| + (Ib) 0IJ yg/^ ' 1 μg/ml |
1000 >10 |
500 31,2 |
| + (1Ia)V μ9/πι1 1 yg/ml |
>10 10 |
>500 500 |
| + (Hb)0/?- vg/ni 1 yg/ml |
10 | 500 31,2 |
| >10 10 |
$09836/071$
Claims (1)
- Patentansprüche\lj Derivate der 5-Thio-6-(l-hydroxyäthyl)-7-oxo-l-azabicyclo/3.2.o7hept-2-en-2-carbonsäure der Formeln I und IIS-CH2-CH2-NH-CO-CH,(DS-C=C-NH-CO-CH.(H)und deren Salze.2. Verbindung der Formel IaS-CH2-CH2-NH-CO-CH3(la)und deren Salze.00983(WO1MSORlGiHAL INSPECTEDVerbindung der Formel Ibj X-S-CH2-CH2-NH-CO-CH3^808563(Ib)und deren Salze.4. Verbindung der Formel HaH^C η Η-S-C=C-NH-CO-CH-I H(Ha)und deren Salze.5· Verbindung der Formel HbS-C=C-NH-CO-CH-(Hb)und deren Salze.6. Pharmakologiseh verträgliche Salze der Derivate der Ansprüche 1 bis 5·7. Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze der Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 5·809836/Ο7Ί88. Natriumsalze der Derivate der Ansprüche 1 bis 5·I b υ ö b 6 39· Kaliumsalze der Derivate der Ansprüche 1 bis 5·10. Ein Salz nach den Ansprüchen 6 bis 9 mit einem Reinheitsgrad von mindestens 50 %·11. Ein Salz nach den Ansprüchen 6 bis 9 mit einem Reinheitsgrad von mindestens 75 $·12. Ein Salz nach den Ansprüchen 6 bis 9 mit einem Reinheitsgrad von mindestens 90 #·.13· Ein Salz der Verbindung der Formel Ia nach einem der Ansprüche β bis 12, das frei von einem Salz der Verbindung der Formel Ib ist.14. Ein Salz der Verbindung der Formel Ib nach einem der Ansprüche 6 bis 12, das frei von einem Salz der Verbindung der Formel Ia ist.15. Ein Salz der Verbindung der Formel Ha nach einem der Ansprüche 6 bis 12, das frei von einem Salz der Verbindung der Formel Hb ist.16. Ein Salz der Verbindung der Formel Hb nach einem der Ansprüche 6 bis 12, das frei von einem Salz der Verbindung der Formel Ha ist.17. Ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel Ia809836/07 1'6ORJGJNAL INSPECTEDS-CH,-CH,-NH-CO-CH-(la)mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 7700.18. Ein Salz nach Anspruch I7 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 79OO.19· Natriumsalz der Verbindungen nach den Ansprüchen I7
oder 18.20. Ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel Ib
[3(Ib)mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 77ΟΟ.21. Ein Salz nach Anspruch 20 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 7900.809836/071622. Natriumsalz der Verbindungen nach den Ansprüchen 20 oder 21.23. Ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel HaS-C=C-NH-CO-CH(Ha)mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter I3OOO.24. Ein Salz nach Anspruch 20 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter Γ55ΟΟ.25. Natriumsalz einer Verbindung der Ansprüche 23 oder 24,26. Ein Alkalimetallsalz der Verbindung der Formel HbS-C=C-NH-CO-CH,(Hb)mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter I3000.809836/0716280356327. Ein Salz nach Anspruch 20 mit einem molaren Extinktionskceffizienten von nicht unter I35OO.28. Natriumsalz der Verbindungen nach den Ansprüchen 25 oder 2Ά.29. Verfahren zur Herstellung von Derivaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces olivaceus oder Streptomyces gedanensis züchtet, bis eine wesentliche Menge der Derivate erzeugt ist und danach die Derivate aus dem Züchtungsmedium gewinnt.30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces olivaceus ATCC 31126 oder dessen Mutante, die eine hohe Ausbeute liefert, verwendet.31. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces olivaceus ATCC 313Ö5 oder eine Mutante, die eine hohe Ausbeute liefert, verwendet.32. Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel Ia, das praktisch frei von einer Verbindung der Formel Ib ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem auf Polystyrol basierenden Polymerisatabsorptionsmittel ("Diaion HP 20") oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.33· Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel Ib, das praktisch frei von einer Verbindung der809836/0716Formel Ia ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem auf Polystyrol basierenden Polymerisatabsorptionsmittel ("Diaion HP20") oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.34. Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel Ha, das praktisch frei.von einer Verbindung der Formel Hb ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem auf Polystyrol basierenden Polymerisatabsorptionsmittel ("Diaion HP 20") oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.35· Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel lib, das praktisch frei von einer Verbindung der Formel Ha ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem auf Polystyrol basierenden Polymerisatabsorptionsmittel ("Diaion HP 20") oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.36. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 35* dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz ein Alkälimetallsalz verwendet.37· Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkalimetallsalz das Natriumsalz verwendet.38. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel V/asser verwendet.&Q9836/071839· Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an ein^m Derivat der 3-Thio-6-(l-hydroxyäthyl)-7-oxo-l-azabicyclo-/5.2.07hept-2-en-2-carbonsäure der FormelnI oder II oder deren Salzen.4-0. Arzneimittel nach Anspruch 39* gekennzeichnet durch . einen Gehalt an pharmakologisch verträglichen Trägermaterialien, Verdünnungsmitteln, Exzipientien und/oder Zusatzstoffen.41. Arzneimittel nach den Ansprüchen 39 oder 40, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Penicillin oder Cephalosporin als Zusatzstoff.42. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 39 bis 41, gekennzeichnet durch einen Gehalt von 50 bis 500 mg eines Derivats nach den Ansprüchen 1 bis 28.43. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 39 bis 42 in injizierbarer Form.809836/0716
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: JUNG, E., DIPL.-CHEM. DR.PHIL. SCHIRDEWAHN, J., DI |
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| 8141 | Disposal/no request for examination |