DE2751303A1 - Antibiotikum 890a tief 10 - Google Patents

Description

Dr.-Ing. Walter Abitz Dr. Diele: F. M ο rf Dtpl.-Phys. M. ümschneder 8 Mönchen 86, Piemen»«*;» 15. lOVO-iOER 1977

HERCX & CO., IMC. Rahway, New Jersey 07065» 7.St.A.

Antibiotikum

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Die Erfindung betrifft das Antibiotikum MSD 89OA₁₀ und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze (im folgenden als "Antibiotikum 890A₁₀" bezeichnet), das sowohl gegenüber gram-positiven als auch gegenüber gram-negativen Bakterien aktiv ist. Das Antibiotikum wird durch Züchten von Species von Streptomyces auf geeigneten Fermentationsmedien gebildet.

Die Feststellung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften von Penicillin hat ein großes Interesse auf diesem Gebiet stimuliert. Daraufhin wurden viele andere, wertvolle, antibiotische Substanzen gefunden. Im allgemeinen umfaßt die antibakterielle Aktivität Jeder dieser Antibiotika nicht bestimmte, klinisch wichtige pathogene Bakterien. Beispielsweise sind einige hauptsächlich nur gegenüber grampositiven Arten von Bakterien aktiv. Die entstandene Beständigkeit im Verlauf der weitverbreiteten Verwendung der vorhandenen Antibiotika bei der Behandlung bakterieller Infektionen hat bewirkt, daß ein ernstes Resistenzproblem entstanden ist.

Dementsprechend haben die Nachteile der bekannten Antibiotika die weitere Forschung nach anderen Antibiotika stimuliert, die gegenüber einem großen Bereich von Pathogenen wie auch gegenüber resistenten Stämmen besonderer Mikroorganismen aktiv sind.

Die Erfindung betrifft ein neues antibiotisches Mittel. Die Erfindung betrifft insbesondere eine neue antibiotische Verbindung, die als 890A₁₀ bezeichnet wird. Die Erfindung umfaßt das Antibiotikum in verdünnter Form, als rohes Konzentrat und in reiner Form.

Der Erfindung liegt somit das Ziel zugrunde, ein neues und wertvolles Antibiotikum zu schaffen, das bei der Inhibierung

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des Wachstums verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hochwirksam 1st. Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotischen Substanz durch Fermentierung von Nährmedien mit Species von Streptomyces geschaffen werden.

Die neue erfindungsgemäße antibiotische Verbindung wird durch Züchten eines neuen Stamms von Streptomyces flavogriseus bei kontrollierten Bedingungen gebildet.

Aufgrund ausgedehnter taxonomischer Untersuchungen wurde der Stamm des Mikroorganismus, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, als zu der Species Streptomyces flavogriseus gehörig identifiziert und bei der Hinterlegungsstelle von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., als MA-4638 bezeichnet. Seine Kultur wurde permanent ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit an der Hinterlegungsstelle der Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt und ist unter der Hinterlegungsnummer NRRL 11 020 verfügbar.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 ergibt das Antibiotikum 89OA₁₀, das im wesentlichen in reiner Form aus der Fermentationsbrühe isoliert wird.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces flavogriseus MA-4638 werden in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Morphologie

Die Sporenträger sind verzweigt, geradkettige bis gekrümmte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Ketten sind mehr als 10 Sporen lang. Die Sporen sind kugelförmig bis oval -0,9/U χ 1,2yu (97Ox).

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Kultureigenschaften Hafermehlagar (ISP Medium 3)

vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun, gekräuselt;

Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Mittelgrau;

lösliches Pigment - keines; Czapek Dox Agar (Saccharosen!tratagar)

vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun gesäumt mit Dunkelbraun;

Luftmycelium - mittelgrau, samtartig;

lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums; Eialbuminagar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun;

Luftmycelium - mittelgrau, vermischt mit gelblichem Grau (2dc) und gräulichem Gelb (2db);

lösliches Pigment - hellgelbliches Dunkelgelb; Glycerin^Asparaginagar vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun; Luftmycelium - samtartig, hellgrau mit gelblichem Ton (2dc);

lösliches Pigment - helles Dunkelgelb; Anorganische Salze-Stärkeagar (ISP Medium 4)

vegetatives Wachstum - umgekehrt-grünlich-gelblich-dunkelgelb;

Luftmycelium - samtartig, mittelgrau mit gelbem Ton (3fe);

lösliches Pigment - sehr helles Dunkelgelb; Hefeextrakt-Dextrose + Salzeagar vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun; Luftmycelium - dunkelgrau, gemischt mit einem helleren Grau;

lösliches Pigment - keines; Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP Medium 2) vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun;

Luftmycelium - samtartig, dunkelgrau gesäumt mit einem helleren Grau;

lösliches Pigment - keines;

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Magermllchagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

Luftmycelium - spärlich, weißlich;

lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums;

Hydrolyse von Casein - gut; Lackmusmilch

vegetatives Wachstum - mäßiges Ringwachstum, dunkelgelb;

Luftmycelium - keines Farbe - purpur; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Pepto-

nisierung; Alkalischwerden; Magermilch

vegetatives Wachstum - mäßiges Ringwachstum, dunkelgelb;

Luftmycelium- keines;

lösliches Pigment - hellbraun; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden; Nährtyrosinagar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun;

Luftmycelium - dunkelgrau gesäumt mit gräulichem Weiß;

lösliches Pigment - leichtes Bräunwerden des Mediums;

Zersetzung von Tyrosin - positiv; Pepton-Eisen-Hefeextraktagar vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

Luftmycelium - weißlich, mäßig;

lösliches Pigment - keines;

Melanin - keines;

H₂S-BiIdUUg - negativ; Nähragar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-hellgräulich Braun;

Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Dunkelgrau;

lösliches Pigment - keines; Nährstärkeagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau;

Luftmycelium - mittelgrau;

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lösliches Pigment - keines;

Stärkehydrolyse - gut;
Nahrgelatineagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau; Luftmycelium - gräulich-weiß;

lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - gut;
Kartoffelstich bzw. -zapfen

vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmycelium - mittel- bis dunkelgrau;

lösliches Pigment - keines;
Loeffler's Blutserum

vegetatives Wachstum - creme-gefärbt; Luftmycelium - keines;

lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung - keine;
Gelatinestich

vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmycelium - keines;

lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - vollständig.

Alle oben aufgeführten Ablesungen erfolgen nach dreiwöchiger Inkubation bei 28°C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die Farbbezeichnungen, die bei der Beschreibung verwendet werden, entsprechen den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Ed. (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 wird ebenfalls auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlenhydrat auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wird der Mikroorganismus auf einem synthetischen Grundmedium (Pridham und Gottlieb), das 196 Kohlenhydrate enthält, 3 Wochen bei 28°C gezüchtet. Der

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pH-Wert der bei diesen Untersuchtangen verwendeten Medien ist etwa neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle I ist die Ausnutzung dieser Kohlenhydratquellen durch Streptomyces flavogriseus MA-4638 aufgeführt, wobei + Wachstum, + schlechtes oder fragliches Wachstum und - kein Wachstum bedeuten, verglichen mit der negativen Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle) .

Tabelle I Glucose + Maltose + Arabinose + Mannit + Cellulose - Mannose + Fructose + Raffinose Inosit - Rhamnose + Lactose + Saccharose +

Xylose +

Die Stärke des Wachstums wird sich mit der Temperatur und dem Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus wie folgt ändern: Temperaturbereich (Hefeextrakt-Oextro se+Salzeagar) 28°C - gutes vegetatives Wachstum und Luftwachstum 37⁰C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 5O⁰C - kein Wachstum.

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salzeagar)

aerob.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Organismus Streptomyces flavogriseus oder auf Organismen, die die obigen Wachstums- und mikroskopischen Eigenschaften vollständig erfüllen, beschränkt; diese sind nur zur Erläuterung aufgeführt. Von der vorliegenden Erfindung soll auch die Verwendung von Mutanten mitumfaßt werden, die aus dem beschriebenen Organismus durch verschiedene Mittel, wie Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, Stickstofflost, Bakteriophageneinwirkung u.a., gebildet werden.

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890A₁₀ wird während der aeroben Fermentation bei kontrollierten Bedingungen geeigneter wäßriger Nährmedien, die mit einem Stamm des Organismus Streptomyces flavogriseus inokuliert sind, gebildet. Wäßrige Medien, wie solche, die für die Bildung anderer Antibiotika verwendet werden, sind für die Bildung von 890A₁₀ geeignet. Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, die von dem Mikroorganismus assimilierbar sind.

Im allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit u.a., und Stärken, wie Dextrin, oder Granulate bzw. Körner, wie z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl u.a., entweder allein oder zusammen mit Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die Menge an Kohlenhydrat variiert normalerweise zwischen etwa 1 und 6 Gew.#, bezogen auf das Medium. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können in dem Medium vermischt bzw. vereinigt werden. Im allgemeinen kann man viele proteinhaltige Materialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren verwenden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen z.B. Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maiseinweichflüssigkeit, lösliche Stoffe der Branntweinherstellung bzw. Schlempen u.a.; die bevorzugte Quelle sind lösliche Stoffe, die bei der Branntweinherstellung anfallen, bzw. Schlempen. Die Quellen für Stickstoff, entweder allein oder zusammen, werden in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.%, bezogen auf das wäßrige Medium, verwendet.

Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingearbeitet werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-,

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Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen ergeben. Ebenfalls mitumfaßt werden Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für eine große Vielzahl von Medien, die verwendet werden können, und sollen keine Beschränkung darstellen.

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37°C durchgeführt; für optimale Ergebnisse ist es jedoch bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 23 bis 28°C durchzuführen. Der Anfangs-pH-Vert der Hährmedien, die für das Wachstum der Stämme von Streptomyces flavogriseus-Kultur und zur Bildimg des Antibiotikums 890A₁₀ geeignet sind, kann von etwa 6,0 bis 8,0 variieren·

Obgleich das neue Antibiotikum 890A^₀ sowohl bei Oberflächenkulturen als auch bei eingetauchten Kulturen erhalten wird, ist es bevorzugt, die Fermentation in eingetauchtem bzw. submersem Zustand durchzuführen*

Eine Fermentation des Antibiotikums In kleinem Maßstab wird zweckdienlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der das Antibiotikum liefernden Kultur Inokuliert und nach der Übertragung in das Produktionsmedium die Fermentation bei konstanter Temperatur von etwa 24°C mehrere Tage auf einer Schüttelvorrichtung ablaufen läßt.

Die Fermentation wird In einem sterilisierten Kolben von Nährmedium über eine oder mehrere Stufen der Impfmaterial« entwicklung initiiert. Das für die Impfstufe verwendete Nährmedium kann irgendeine geeignete Kombination aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein. Der Impfkolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur bei etwa 28°C einen Tag oder bis zu einem ausreichenden Wachstum geschüttelt, und

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ein Teil des entstehenden Wachstums wird zur Inokulierung entweder eines Impfmaterials der zweiten Stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Kolben mit Impfmaterial der Zwischenstufe werden, wenn sie verwendet werden, auf ähnliche Weise entwickelt, d.h. ein Teil des Kolbeninhalts aus der letzten Impfstufe wird zur Inokulation des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt, und gegen Ende der Inkubationszeit wird der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert.

Beim Arbeiten in großem Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und einer Einrichtung zur Belüftung des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Entsprechend diesem Verfahren wird das Nährmedium in einem Tank zubereitet und durch Erhitzen bei Temperaturen bis zu etwa 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit dem zuvor gezüchteten Impfmaterial der produzierenden Kultur inokuliert, und die Fermentation kann während einer Zeit von z.B. 1 bis 6 Tagen unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Aufrechterhalten der Temperatur bei etwa 22 bis 26°C durchgeführt werden. Dieses Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 89OA₁₀ ist besonders für die Herstellung von großen Mengen an Antibiotikum geeignet.

Physikalische und chemische Eigenschaften des Antibiotikums

Antibiotikum 890A₁₀ ist eine saure Verbindung, die in Richtung auf den positiven Pol bei der Elektrophorese bei neutra lem pH-Wert migriert. Bei einem Gradienten von 50 V/cm in 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,1, bewegt sich das Antibiotikum 8,0 cm in 30 min, verglichen mit einer Bewegung von 4,0 cm für 890A₁. Das Dinatriumsalz ist ein weißes oder hellgelbes Pulver nach der Lyophilisierung aus wäßriger

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Lösung. Bei sauren Bedingungen in wäßriger Lösung ist das Antibiotikum instabil, und die freie Säureform wurde nicht

isoliert.

Das Dinatriumsalz des Antibiotikums 89OA₁₀ besitzt ein Absorptionsmaximum bei 299 nm und ein Minimum bei 243 nm bei neutralem pH-Wert in Wasser. Die E# bei 300 nm der am besten gereinigten Zubereitung des Dinatriumsalzes beträgt 214. Das Verhältnis A₃₀₀/A₂₅₀ beträgt 3,33 für die reinste Probe, und das Verhältnis A₅₀₀/A₂₂Q beträgt 2,05. Das Auftreten von geringen Verunreinigungen in dieser Probe läßt vermuten, daß die entsprechenden Verhältnisse für eine Probe mit vollständiger Reinheit etwas höher wären. Mehr als 9496 der Absorption bei 300 nm können durch Umsetzung mit Hydroxylamin bei neutralem pH-Wert ausgelöscht werden. Die Absorption bei 250 nm nimmt ebenfalls bei der Umsetzung mit Hydroxylamin ab, und das Verhältnis der Absorptionsabnahme bei 250 nm zu der Abnahme bei 300 nm beträgt etwa 0,16. Die Umsetzung mit Hydroxylamin, auf die die A,₀₀-Abnahme bei den in dem Teil "Hydroxylamine Reaction" beschriebenen Bedingungen folgt, scheint erster Ordnung zu sein, mit einer Halbwertszeit bei Zimmertemperatur von 23 bis 60 Sekunden.

Bestimmt gegenüber einem Standard des Antibiotikums 890A₁, besitzt das Antibiotikum 890A₁₀ 174 Bioassay-Binheiten pro HAEA₃₀₀-Einheit. HAEA₃₀₀ wird auf Seite 25 unter der Überschrift "Hydroxylaminreaktion¹¹ beschrieben.

In Tabelle II sind die 100 MHz-Signale im kernmagnetischen .Resonanzspektrum von 890A₁₀ in D₂O bei 32°C angegeben. Die chemischen Verlagerungen werden in ppm, relativ zu HOD, bei 4,70<f bei 32⁰C angegeben, und die Kupplungskonstanten werden in Hertz aufgeführt.

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Tabelle II

OT₃CH 1,55 (3H, D, 6,5 Hz)

CH₃CO 2,02 (3H, S)

^C(6)"^{H 3}'^{89 (1H}» D»D,J₆_₅=5,4 Hz, J₆_₈=9,2 Hz) ^A4 < )

C/₅j-H ~4,34 (1H, D,T,J₅_₆=5,5 Hz,J₅_₁₌9,5 Hz) H ^4,8 (teilweise bedeckt durch HOD-Linie)

H₉ ~3,14 (1H, D,D,^9,2 + ~18 Hz) ~3,33 (1H, D,D,~1O + 18 Hz)

-CH₂NH 3,43 (2H, T, 7Hz)
-CH₂-S- 3,03 (2H, M)

Das Massenspektrum von TMSi-890A_1Q zeichnet sich durch die in Tabelle III aufgeführten Fragmente aus.

Tabelle III m/e 86

227,0224 C₅H₁₅SO₄Si₂, berechnet 227,0230

241 300/1

339,1325 C₁5H₂₅NO₄Si₂,berechnet 339,1322 342,1444 ^C15^H26^N2°3^{S Si}» ^berechliet 342,1433

368 440 458

Das Antibiotikum 89OA₁₀ besitzt die folgende Molekülstruktur;

S-CH₂-CH₂-NH-C-CH₃ j

IQOB ^(I) *

Das Antibiotikum 890A₁₀ zeichnet sich weiter durch die folgenden antibiotischen Spektrumprofile aus.

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15936 ^Λ*

Der Test zur Bestimmung der antibiotischen Spektrumprofile des Antibiotikums 890A₁₀ wird durch Anwendung eines 0,015 ml Tröpfchens einer 9,5/Ug/ml wäßrigen Lösung des Antibiotikums auf die Oberfläche einer 100 χ 15 mm Petrischale, die 5 ml angeimpften Nähragar plus fr, 2Jf Hefeextrakt enthält, bestimmt, wobei bei 25⁰C inkubiert wird. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser in Millimeter der Hemm- bzw. Inhibierungszone sind in Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IY Organismus Hemmzone. Durchmesser, mm

Bacillus sp. MB Nr. 633 30 Proteus vulgaris MB Nr. 1012 19 Pseudomonas aeruginosa MB Nr. 979 0 Serratia marcescens ATCC 890 15 Staphylococcus aureus ATCC 6538P 20 Bacillus subtilis ATCC 6633 30 Sarcina lutea ATCC 9341 33 Staphylococcus aureus MB Nr. 698 23 Streptococcus faecalis MB Nr. 753 0 Alcaligenes faecalis ATCC 213 24 Bruceila bronchiseptica ATCC 4617 0 Salmonella gallinarum MB Nr. 1287 28 Vibrio percölans ATCC 8461 33 Xanthomonas vesicatoria MB Nr. 815 20 Proteus vulgaris ATCC 21100 30 Escherichia coli MB Nr. 1418 25 Pseudomonas stutzeri ATCC 11607 0 Klebsiella pneumoniae MB Nr. 1264 19 Aerobacter aerogenes MB Nr. 835 22 Erwinia atroseptica ATCC 4446 10 Pseudomonas aeruginosa MB Nr. 2824 0 Corynebacterium pseudodiph. ATCC 9742 12 Escherichia coli ATCC 9637 17 Streptococcus faecium MB Nr. 2820 0

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Tabelle IV (Fortsetzung)

Organismus Hemmzone Durchmesser, mm

Streptococcus agalactiae MB Nr.2875 29

Vibrio percolans MB Nr.2566(res.ceph C) 22

Proteus vulgaris MB Nr.2112 (Episom) 30

Proteus mirabilis MB Nr. 3126 29

Vibrio percolans ATCC 8461 + 2 χ 10⁵/u/ml 25 Penicillinase '

Vibrio percolans ATCC 8461 + ß-Lactamase 34 von Enterobacter clacae MB 2646

Antibiotikum 890A₁₀ ist gegenüber verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien aktiv und es ist ein potenter Inhibitor bakterieller ß-Lactamasen; es kann in der Human- und Veterinärmedizin Verwendung finden. 890A₁₀ kann allein oder zusammen mit anderen antibakteriellen Arzneimitteln für die Behandlung von Infektionen, die durch grampositive oder gram-negative Bakterien hervorgerufen werden, verwendet werden, z.B. gegen Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Salmonella schottmuelleri.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann zusammen mit ß-Lactam-Antibiotika, die gegenüber ß-Lactamasen empfindlich sind, verwendet werden, um die Wirkung solcher ß-Lactarn-Antibiotika zu inhibieren, indem die Lactamase-Aktivität inhibiert wird und somit die Gebrauchsdauer der Antibiotika verlängert wird.

Ein Gemisch aus Antibiotikum 890A₁₀ mit einem lactamaseempfindlichen ß-Lactam-Antibiotikum wird bei der Behandlung von Infektionen mit ß-Lactamase liefernden Bakterien wirksamer sein, als es die gleiche Menge an ß-lactamase-empfindlichem Antibiotikum allein wäre.

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Das Antibiotikum 890A₁₀ kann als Zusatzstoff für Tierfutter, zur Konservierung von nahrungsmitteln und Futter und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Es kann in wäßrigen Zusammensetzungen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung oder bevorzugt in Konzentrationen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung zur Zerstörung und Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Vorrichtungen bzw. Geräten und als Bakterizide bei industriellen Anwendungen verwendet werden.

Das Antibiotikum 89OA₁₀ kann in pharmazeutischen Zubereitungen als einziger aktiver Bestandteil oder zusammen mit einem oder mehreren anderen Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden.

Das Antibiotikum kann oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Die für die Verabreichung verwendeten Verfahren können irgendwelche auf diesem Gebiet übliche Verfahren sein oder irgendwelche Verfahren, die dem hierin beschriebenen Antibiotikum angepaßt werden können.

Zusätzlich zu einem Träger können die erfindungsgemäßen Zubereitungen andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxydantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsmittel oder Aroma- bzw. Geschmacksmittel, enthalten, wie sie gut bekannt sind und normalerweise verwendet werden.

Bei der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Geflügel, Rindern bzw. Kühen, Schafen, Schweinen u.a., können die Zubereitungen z.B. in Form intramammarer Präparationen, entweder in langwirkenden oder schnell freisetzenden Grundstoffen, formuliert werden.

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Die zu verabreichende Dosis hängt in großem Maßstab von dem Zustand des zu behandelnden Subjekts, dem Gewicht des Wirts und der Art der Infektion, dem Weg und der Frequenz der Verabreichung ab. Für generalisierte Infektionen ist der parenterale Weg bevorzugt, und für intestinale Infektionen ist der orale Weg bevorzugt.

Bei der Behandlung bakterieller Infektionen bei Menschen bzw. Lebewesen können die erfindungsgemäßen Verbindungen gleichzeitig mit einem ß-Lactamase-empfindlichen Antibiotikum oral oder parenteral nach an sich bekannten Verfahren für die Antibiotikaverabreichung verabreicht werden. Das Antibiotikum 890A₁₀ wird in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag verabreicht und bevorzugt in einer Menge von etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag, bevorzugt in unterteilter Dosis, z.B. drei oder vier Mal am Tag. Es kann in Dosiseinheiten verabreicht werden, die z.B. 100, 330, 400 oder 1000 mg aktiven Bestandteil mit geeigneten, physiologisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten liegen in Form flüssiger Zubereitungen, wie als Lösungen oder Suspensionen, oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die optimale Dosis, die bei irgendeinem speziellen Fall verabreicht wird, wird natürlich von der Art und der Stärke der zu behandelnden Infektion abhängen. Kleinere Dosen werden in der Kinderheilkunde verwendet, wobei alle diese Einstellungen und Anpassungen dem Fachmann geläufig sind.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salze von 890A₁₀, z.B. die pharmakologisch annehmbaren Salze, die mit anorganischen und organischen Basen gebildet werden, beispielsweise Metallsalze, die sich von Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxiden, -carbonaten oder -bicarbonaten ableiten, wie solche, die sich von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium ableiten, und Salze, die sich von primären, sekundären oder tertiären Ami-

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nen, wie Monoalkylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, niedrig-Alkanolamine^ Di-niedrig-alkanolaminen, niedrig-Alkylendiaminen, Ν,Ν-Diaralkyl-niedrlg-alkylendiaminen, Aralkylamine^ Amino-subst.-niedrig-alkanolen, N,N-Diniedrig-alkylamino-subst.-niedrig-alkanolen, Amino-polyamini- und Guanidino-subst.-niedrig-alkansäuren und Stickstoff enthaltenden heterocyclischen Aminen, ableiten. Spezielle Beispiele sind Salze, die sich von Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamin, Triäthylamln, Piperidin, N-Äthylpiperidin, Horpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, Ν,Ν'-Dibeiizyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Theophyllin, N-Methylglucamin u.a. ableiten.

Die Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen können entweder direkt aus dem Fermentationsmedium unter Verwendung geeigneter Eluierungsmittel während der Ionenaustauschchromatographie isoliert werden, oder sie können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die Disalze, wie das Dinatrlumsalz, durch Behandlung von 2 Äquiv. Natriumhydroxid mit 1 Hol des Produktes (I) in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Gemischte Salze mit einwertigen Kationen können durch Vermischen von 1 Mol einer einwertigen Base mit 1 Mol des Produktes (I) plus 1 Äquiv. einer anderen Base hergestellt werden. Alternativ können monobasische Salze durch Behandlung von 1 Äquiv. einer Base mit einem einwertigen Kation mit 1 Mol des Produktes (I) hergestellt werden. Die Salze können ebenfalls durch Behandlung von 1 Mol des Produktes mit 1 Mol einer Base mit einem zweiwertigen Kation hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Salze sind pharmakologisch annehmbare, nichttoxische Derivate, die als aktiver Bestandteil in geeigneten

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pharmazeutischen Formen in Dosiseinheiten verwendet werden können. Sie können ebenfalls mit anderen Arzneimitteln unter Erzeugung von Zubereitungen mit einem breiten Aktivitätsspektrum hergestellt werden.

Fermentationsbrühen, die das Antibiotikum ₁₀ enthalten und die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, besitzen Aktivitäten im Bereich von etwa 2 bis 170 Einheiten/ml, wenn sie nach dem Scheiben-Diffusionsassay- bzw. -analysenverfahren unter Verwendung von Vibrio percolans (ATCC 8461) analysiert werden. Das in diesen Fermentationsbrühen enthaltene Antibiotikum 890A₁₀ kann nach einer Reihe von Verfahren isoliert und gereinigt werden. Bei einem solchen Verfahren wird das Antibiotikum 890A₁₀ an einem stark basischen Anionenaustauschharz adsorbiert. Beispiele für solche stark basischen Anionenaustauschharze sind solche mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix, z.B. das Polystyrolharz Dowex 1x2 mit quaternären Ammoniumgruppen am Kern (hergestellt von Dow Chemical Co., Midland, Michigan) im Chloridzyklus. Andere Beispiele von dieser Klasse von stark basischen Austauschharzen umfassen die folgenden: Duolite A-40, A-42, A-101, A-102 und A-114 (hergestellt von Chemical Process Co., Redwood City, California); Amberlite IRA-400, IRA-401 und IRA-410. Alternativ kann ein schwach basisches Anionenaustauschharz, wie Amberlite IRA-68, verwendet werden. (Amberlite-Harze werden von Rohm und Haas, Washington Square, Philadelphis 5, Pennsylvania, hergestellt.)

Das adsorbierte Antibiotikum kann leicht aus dem Anionenaustauschharz mit Salzlösungen in 80#igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol eluiert werden. Das so erhaltene Eluat kann weiter durch andere Reinigungsverfahren gereinigt werden. Das Eluat kann durch seine Konzentration und Durchleiten durch eine mit Polystyrol, einem nichtpolaren, hydrophoben, vernetzten Divinylbenzolpolymeren, wie XAD-1, 2 und 4, oder mit Polyacrylami dharzen, wie XAD-7 und 8, gepackte

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Säule gereinigt werden. XAD-2 ist bevorzugt. (XAD-1, 2, 4, und 8 werden von Rohm and Haas, Philadelphia 5, Pennsylvania, hergestellt.)

Ein Verfahren zur Herstellung von weiter gereinigtem Antibiotikum 890A₁₀ ist die Verwendung von Gelfiltration durch Polyacrylamid-Gel mit einer Porengröße, durch die Moleküle mit einem Molekulargewicht über 1800 ausgeschlossen werden, wie Bio-Gel P-2 (hergestellt von Bio.Rad, Richmond, California). Andere Gele, wie Sephadex G-10, können ebenfalls für die Entsalzung verwendet werden.

Das bevorzugte Verfahren, gemäß dem das Antibiotikum ₁₀ in hoher Reinheit aus einer Brühe erhalten wird, besteht in dem Zentrifugieren oder Filtrieren der Brühe zur Entfernung der Feststoffe; die Adsorption und Elution des Filtrats von einem Anionenaustauschharz, wie Dowex-1 χ 2,im Chloridzyklus mit 3% NaCl in 80#igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol, wodurch das Antibiotikum sowohl konzentriert als auch gleichzeitig teilweise gereinigt wird; Durchleiten über eine Säule von geeignet zubereitetem XAD-2, wodurch das Antibiotikum zurückgehalten wird und das Dowex-1 χ 2 -Eluat genLnigt und entsalzt wird. Die mit 890A₁₀ angereicherten Fraktionen werden vereinigt und weiter gereinigt. Bei der Chromatographie an einem Dowex-1 χ 2, -400 mesh(-0,037 mm), Harz unter Eluierung mit NaCl und/oder NH^Cl in 80%igem wäßrigem Methanol erhält man ein Produkt, das von vielen der ursprünglichen, ÜV-absorbierenden Verunreinigungen befreit ist (das NH^Cl wird zur Erreichung einer gewissen Pufferkapazität in dem Eluierungsmittel verwendet). Das 890A₁₀ wird dabei von anderen Antibiotika abgetrennt. Durch eine Entsalzung an Bio-Gel P-2 oder Sephadex G-10 wird die Hauptmenge des Salzes, die bei der Dowex-1 χ 2-Chromatographie eingeführt wurde, entfernt.

Die restlichen Verunreinigungen können durch zusätzliche Chromatographiezyklen an Dowex-1 χ 2, -400 mesh (-0,037 mm)

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27513ΓΠ

15936 22

mit Eluierung durch eine Lösung, die Natriumchlorid und 3O#iges Methanol enthält, gefolgt durch ein Entsalzen entfernt werden.

Bei der Reinigung durch Säulenchromatographie werden im allgemeinen nur solche Fraktionen des eluierten Volumens, die das Antibiotikum mindestens 30% so rein wie die reinste Fraktion enthalten, für die weitere Reinigung vereinigt. Die Kriterien für die Reinheit sind die Verhältnisse Bioaktivität/A₂₂o» ^300^^A250 ^{und HAEA}300^²²⁰ ^¹¹¹^ ^{bei den} E^³³I²¹¹¹¹S³" verfahren die Leitfähigkeit. Bei jeder Chromatographiestufe werden daher A₂₂Q* ^A250' ^A300 ¹^ ^die Bioaktivität geeigneter Fraktionen bestimmt. Wenn möglich, wird auch ΗΔΕΑ™« gemessen und bei der Entsalzung werden die Leitfähigkeiten bestimmt. Die Kriterien für die Entscheidung, welche Fraktionen für die nachfolgenden Behandlungen vereinigt werden, können etwas eingestellt werden, so daß man höhere Ausbeuten auf Kosten der Reinheit und umgekehrt eine höhere Reinheit auf Kosten der Ausbeute erhält.

Beim Arbeiten im Labormaßstab (weniger als 20 1 Probenvolumen) werden alle Chromatographiestufen, mit Ausnahme der XAD-2-Chromatographie, in einem Kühlraum bei 2 bis 5°C durchgeführt. Die XAD-2-Chromatographie wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der pH-Wert der zu lagernden Antibiotikalösungen wird durch sorgfältige Zugabe von verdünnten NaOH-oder HCl-Lösungen eingestellt. Wäßrige Lösungen werden in einem Kühlschrank oder bevorzugt in Eis-Wasser und 50- bis 80%ige Methanollösungen bei -20 bis -60°C gelagert.

Bei den Reinigungsstufen vor der XAD-2-Chromatographie werden die Lösungen im allgemeinen auf 25/uM in EDTA durch Zugabe von 1/4000 Volumen einer Lösung aus 0,1 M Na₂ EDTA eingestellt, die auf einen pH-Wert von 7,0 durch Zugabe von Natriumhydroxid (0,1 M "neutrales EDTA") neutralisiert wurde.

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In Fig. 1 ist ein Fließschema für das Reinigungsverfahren zur Herstellung des Antibiotikums 890A₁₀ dargestellt.

Figur 1 Schema des Reinigungsverfahrens für Antibiotikum 890A₁₀

Fermentierte, 89OAio enthaltende Brühe

1.Kühlen 2.Zentrifugieren 3.Zugabe v. EDTA

Zentrifugierte Brühe

1.Adsorb.anDowex-1x2(Cl~)

(50-100 meshaO,297-0,149 mm) 2.Waschen mit 0,15M NaCl-K),01 M

tris-HCl+25/uM EDTA in 50tfigem

MeOH ' 3.Waschen mit Wasser 4.Eluieren mit 396 NaCl-K),01 M

tris-HCl,pH 7,+25/uM neutr. ' EDTA in 80* Methanol

Dovex-1x2 (50-100mesh)

Eluat

Ii

1.Konzentrieren 2.Adsorbieren an XAD-2 'i.Eluieren mit Wasser

1 .Konzentrieren der 890A₁Q enthaltenden Fraktionen 2.Verdünnen mit MeOH 3.Adsorb.an Dowex-1x4(Cl~)

(-400 mesh=-O,O37 mm) 4.Eluieren mit 0,26M NaCl + ' 0,005M NH4C1+O,OOOO5M NH₃ in 80% Methanol

Dowex-Ix4 Eluat 890A₁₀ 1 .Verdünnen mit Wasser 2.Adsorb.an Dowex-1x2(Cl~)

(-400 meshs-0,037 mm) 3.Eluieren mit 0,26M NaCl + 0.005M NH₄Cl-K),00005M NH, _w in 30% Methanol ^

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15936

Dowex-1x2(-400 mesh) Eluat

1.Konzentrieren 2.Adsorbieren an Bio-Gel P-2 3.Eluieren mit 0,02 mM NH,

Bio-Gel P-2
Eluat

1.Konzentrieren 2.Lyophilisieren

\_y

Analysen- bzw. Assayverfahren für Antibiotikum ₁₀ I. Bioassay bzw. -analyse

Ein Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890A₁ wird als Standard verwendet. Das Antibiotikum 890A₁ wird entsprechend dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Platten, die Vibrio percolans ATCC 8461 enthalten, werden folgendermaßen hergestellt.

Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml eines sterilisierten Mediums suspendiert, das 8 g/l Difco Nährbrühe und 2 g/l Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält, "Nährbrühe-Hefeextrakt" (im folgenden als NBYE bezeichnet). Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28⁰C inkubiert. Diese Kultur wird zur Inokulierung der Oberfläche von Schrägkulturen verwendet, die 1,5% Agar in NBYE enthalten. Die inokulierten Schrägkulturen werden über Nacht bei 28⁰C inkubiert und dann in einem Kühlschrank gelagert.

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Die gekühlten Schrägkulturen, die aus einer einzigen, lyophilisierten Kultur hergestellt werden, werden bis zu 4 Wochen von ihrer Herstellung folgendermaßen verwendet. Eine öse von Inokulum aus der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, enthalten in einem 250 ml Erlenmeyerkolben, dispergiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28° C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine 50%ige Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt. Ein 33,2 ml Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 NBYE gegeben, der 15 g Agar enthält, und bei 46°C gehalten. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird auf 100 χ 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 5 ml/Schale, gegeben, abgekühlt und bei 2 bis 4⁰C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm (1/2 in) werden in die zu analysierende Lösung eingetaucht und auf das Agar gelegt. Alternativ kkönnen die Scheiben durch Aufpipettieren von 1/10 ml Lösung auf eine trockene Scheibe beladen werden, und dann kann die Scheibe auf das Agar gestellt werden. Der Durchmesser der Hemmzone wird nach geeigneter Inkubierung (12 bis 24 h bei 25⁰C) gemessen. Gegebenenfalls können Verdünnungen der zu untersuchenden Lösungen in 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, "Kaliumphosphatpuffer" (im folgenden als KPB bezeichnet), oder in entionisiertem Wasser durchgeführt werden.

Die Potenzen bzw. Stärken werden folgendermaßen berechnet. Eine Neigung wird bestimmt, indem man die Zonendurchmesser einer Lösung aus Antibiotikum 89OA₁Q und einer vierfachen Verdünnung (in KPB) dieser Lösung mißt. Zwei Scheiben von jeder Konzentration werden auf einer einzigen Platte analysiert und die durchschnittliche Zonengröße bei jeder Konzentration wird bestimmt. Die Neigung ist gleich der Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengröße. Die Potenzen werden entsprechend der folgenden Formel berechnet:

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Potenz (Einheiten/ml) =

[D-D₃] log 2

Neigung (Potenz des Standards) χ Verdünnung χ 10

worin D der durchschnittliche Durchmesser der von der Unbekannten gebildeten Zonen, D_ der durchschnittliche Durchmesser der Standardzonen und "Verdünnung" der Grad bzw. die Stärke, auf den die Unbekannte vor der Analyse verdünnt wurde, bedeuten. Wird kein Standard verwendet, wird D_ als 25 mm angenommen und (Potenz des Standards) wird als 1 Einheit/ml angenommen, bestimmt mit Vibrio percolans ATCC 8461. Reines 890A₁ wird als solches mit einer Potenz von 250 Einheiten pro Hydroxylamin auslöschbaren Absorptionseinheiten bei 300 nm definiert, wenn es als Standard verwendet wird.

II. Analyseverfahren für die Bestimmung der "890 Assayeinheiten"

Ein an sich bekanntes Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als Standard verwendet. Die Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltenden Platten werden wie folgt hergestellt. Eine Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in Nährbrühe-Hefeextrakt über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert und dann auf eine Dichte von 60^iger Durchlässigkeit bei 660 nm verdünnt. Ein 33»2 ml Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 eines Mediums zugegeben, das aus Nähragar plus 0,296 Hefeextrakt besteht und bei 46°C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100 χ 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 10 ml/Schale, gegossen, gekühlt und bei 2 bis 4⁰C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

Die Konzentration an Cephaloridin, die äquivalent zu 1 Einheit/ml 890A₁ ist, wird durch Analyse an Platten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, die jedoch 5 ml inoku-

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liertes Medium/Platte enthalten, wie folgt bestimmt. Vier Konzentrationen an Cephaloridin ergeben den Standard - 3»12, 6,25, 12,5 und 25 mcg/ml, wobei 12,5 mcg/ml als Vergleichslösung genommen wird. Die Zonendurchmesser auf einer 5 ml Platte für den Standard sind wie folgt:

Konzentration (mcg/ml) Zonendurchmesser (mm)

3,12 16,8

6,25 22,3

12,5 25,0

25 29,6

Eine Einheit wird als die Menge an Antibiotikum/ml definiert, die eine 25 mm Hemmzone auf einer 5 ml Platte, wie in Teil I oben beschrieben, ergibt. Bei dieser Analyse wird daher eine Konzentration von 12,5 mcg/ml Cephaloridin als äquivalent zu 1 Einheit 89OA₁ZmI genommen. Da die Neigung der Linie für Cephaloridin 4,0 beträgt, erfolgen die Berechnungen der Potenz einer Probe einer Verwendung einer Neigung von 4,0.

III. Hydroxylaminreaktion

Antibiotikum 890A₁₀ reagiert mit Hydroxylamin und ergibt eine Substanz, bei der die Absorption bei 300 mn stark verringert ist. Dies ergibt eine Grundlage für die quantitative Analyse des Antibiotikums

Die zu analysierende Lösung wird auf 0,05 H in Kaliumphosphat gebracht, pH 7,4, indem man 1/20 Volumen einer Lösung, die 0,8 M K₂HPO^ und 0,2 M KH₂PO^ enthält, zugibt. Dann werden 1/100 Volumen 1M Hydroxylamin-hydrochlorid zugegeben und die Absorption wird bei 300 nm in Intervallen von 1/2 bis 2 min bestimmt. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Man nimmt kinetische Werte erster Ordnung an und schätzt die Halbwertszeit aus der Absorptionsabnahme während der ersten 10 min. Aus dieser Halbwertszeit wird der Zeit-

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punkt geschätzt, nach dem keine weitere Absorptionsabnahme beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen werden über diesen Zeitpunkt hinaus weitergeführt. Beobachtet man über diesen Zeitpunkt hinaus keine weitere Abnähme, so wird die gesamte Absorptionsabnahme (wobei für die Verdünnungswirkung und die Absorption des Hydroxylamine korrigiert wird) als die "Hydroxylamin auslöschbare Absorption bei 300 nm (HAEA₃₀₀)¹¹ angenommen. Wenn die Absorption über diesen Zeitpunkt hinaus abnimmt, wird die Rate der Hintergrundsabsorptionsabnahme berechnet und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt wird durch die Hintergrundsabnahme korrigiert, wobei angenommen wird, daß die Hintergrundsabnahme im Verlauf der Zeit linear verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als aufgezeichnet.

Die Anzahl der HAEA^₀₀-Einheiten ist gleich dem HAEA^₀₀, multipliziert mit dem Volumen in ml.

Die folgenden Beispiele erläutern die Verfahren, gemäß denen die erfindungsgemäßen Produkte hergestellt werden. Diese Beispiele dienen nur zur Erläuterung, und irgendwelche Modifikationen der beschriebenen Verfahren, gemäß denen man die erfindungsgemäßen Produkte erhält, sollen als analoge Verfahren angesehen werden und werden von der vorliegenden Erfindung mitumfaßt.

Die Herstellung des Antibiotikums 890A₁ wird in der DT-PS (P 26 52 677.2 entsprechend der US-Anmeldung mit der Serial Nr. 634 300, eingereicht am 21. November 1975) beschrieben. Auf diese Patentschrift wird expressis verbis Bezug genommen.

Beispiel 1

Eine MA-4638 enthaltende Schrägkultur wird zur Inokulierung von 250 ml Erlenmeyerkolben mit Ablenkelementen, die 50 ml Medium enthalten, verwendet.

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	2751303	ml
10,0	g	ml
10,0	g	g
0,05 g	g
2,0	ml
1000
91,0
95,0
1000

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Medium A Dextrose Hefeautolysat (Ardamine⁺) MgSO₄.7H₂O Pho spha tpuf f er*"¹" destilliertes Wasser pH 6,5

⁺ Ardamine: Yeast Products, Inc. "'"'"Pho spha tpuf f er lösung: KH₂PO₄

Na₂HPO₄

destilliert.Wasser

Dieser Kolben wird bei 28° auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung, 5,08 cm (2 inch) Schwingungsamplitude, 2 Tage geschüttelt, bis das Wachstum ausreichend ist. Nach 2 Tagen wird dieses Impfprodukt zur Inokulierung von drei 250 ml Erlenmeyerkolben, die 40 ml Medium B enthalten, unter Verwendung von 2 ml/Kolben (596) verwendet.

Medium B

Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g

ganzer Hafer (gemahlen) 20,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml

pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,0 eingestellt

Diese Produktionskolben werden ebenfalls bei 28°C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung bis zu 4 Tagen geschüttelt, wobei Analysenversuche während der Fermentation durchgeführt werden. Im Alter von 3 Tagen wird ein aliquoter Teil der überstehenden Lösung von der zentrifugierten Brühe für Klassifizierungs- und Identifizierungsuntersuchungen verwendet. Unter Verwendung von 0,65 cm (1/4 in) Analysenscheiben auf Standardanalysenplatten ergibt diese Brühe 22 mm Hemmzone gegenüber Proteus vulgaris und eine 15 mm Hemmzone gegenüber Salmonella gallinarum. Die Bioautographie eines Elektrophoretogramms der zentrifugierten Brühe zeigt zwei Komponenten. Der

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sich schneller bewegende, kleinere Fleck enthält 89OA₁₀.

Beispiel 2

Zwei gefrorene Ampullen, die je 2 ml MA-4638-Inokulum enthalten, werden langsam aufgetaut, und der Inhalt wird aseptisch in zwei Impfkolben, die je 500 ml C-Medium enthalten, über führt. Die Impfkolben, 2 1, Schüttelkolben mit drei Ablenkelementen, sind mit einem Seitenarm ausgerüstet, der mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen wird.

C-Medium

Autolysierte Hefe (Ardamine⁺) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 100 ml

der pH-Wert wird vor der Sterilisierung mit NaOH auf 6,5 eingestellt

Ardamine: Yeast Procuts, Inc.

⁺⁺Phosphatpufferlösung: ICH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0

destill.Wasser 1000 ml

Die inokulierten Impfkolben werden 24 bis 30 h bei 28°+1°C auf einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt. Das Wachstum aus den Impfkolben wird zur Inokulation von zwei 14 1 Glasfermentationsbehältern, die 10 1 Produktionsmedium (D-Medium plus 0,1556 Sojabohnenöl, Vol/ VoI) enthalten, verwendet.

D-Medium

Dextrin" (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

CoCl₂.6H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

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Die Fermentationsreaktoren werden bei 24°C unter Verwendung einer Ruhrrate von 640 U/min (etwa Kd 5,5) und einer Luftströmung von 0,5 WN während 72 h betrieben. Entschäumungsmittel, Hodag-MF (Hodag Chemical Corp.) wird je nach Bedarf, aber nicht über 0,19fi, verwendet.

Der Inhalt der beiden Fenaentationsbehälter wird nach dem Fermentationsversuch vereinigt; man erhält etwa 20 1.

200 ml-Teile des Ansatzes werden in einer Servall RC-2B-Zentrifuge bei 9000 U/min 20 min zentrifugiert. Das überstehende Material wird durch eine 1 cm Schicht von Ryflo Super-CeI in einem 33 »02 cm (13 inch) Lapp-Trichter mit eine» Filtertuch filtriert. Das Filtrat besitzt eine Bioaktivität von 20 Einheiten/ml.

Die filtrierte Brühe (18 1) wird auf eine Säule (8,2 χ 29 cm) aus Dowex-1x2(Cl"), 50 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 am, bei 150 ml /min angewendet.' Die Säule wird dann mit 1 1 entionisiertem Wasser und anschließend mit 15 1 0,15 M KaCl + 0,01 H tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25*§l neutr. HDTA in 505t MeOH mit 150 ml/min gewaschen.

Das Antibiotikum 890A₁₀ wird dann mit 3,2% HaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/UM neutral.EDTA in 80# MeQH mit 100 ml/min eluiert. Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 1 1, vier Fraktionen von je 500 ml und zwölf Fraktionen von je 1 1. Die Bioaktivität und die Absorption bei 220 mn werden von jeder Fraktion bestimmt, und solche Fraktionen, die Bioaktivität/A₂₂₀-Verhältnisse über 0,6 Einheiten/A₂₂₀-Einheit ergeben und die mehr als 10£ der gesamten gewonnenen Aktivität/Fraktion enthalten, werden für die weitere Reinigung vereinigt. Es werden so die Fraktionen 4 bis vereinigt, die insgesamt 22Jf der angewandten Bioaktivität enthalten.

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15936 12

Die gesammelten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 190 ml konzentriert. Das ausgefällte Salz wird mit entionisiertem Wasser gewaschen und das Waschwasser wird zu der überstehenden Lösung gegeben. Dadurch wird das Gesamtvolumen auf 220 ml gebracht. Der pH-Wert des Konzentrats wird mit HCl auf 6,5 eingestellt und das Eluat wird auf eine Säule (6,0 χ 59 cm) aus Amberlite XAD-2 aufgebracht, die zuvor mit 8 1 60%igem wäßrigem Aceton und anschließend mit 16 1 entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Nach Beendigung der Aufbringung wird die Säule mit 5 x 10 ml Teilen entionisiertem Wasser gespült, und die Antibiotika werden mit entionisiertem Wasser mit 35 ml/min eluiert. Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 500 ml, dann sieben Fraktionen von je 250 ml, anschließend vier Fraktionen von 500 ml.

Die Bioaktivitäts- und HAEA_3o4-Werte der Fraktionen 3 bis werden gemessen. Die Fraktionen 4 bis 9 besitzen HAEA₃₀₄/ A₂₂Q"" Verhältnisse über 0,01 und werden für die weitere Reinigung vereinigt. Die Fraktion 3, die etwa 1/5 des aufgebrachten Salzes enthält, wird ebenfalls zu diesem vereinigten Material gegeben. Das vereinigte Material enthält 469 HAEA₃₀₄- Einheiten.

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,1 1 verdünnt, und sie werden auf eine Säule (2,15 x 42 cm) aus Dowex-1x4 (Cl"), -400 mesh(-0,037 mm) mit 2 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 100 ml 5O96igem Methanol gewaschen, und das Antibiotikum wird mit 0,25 M NaCl + 0,01 M NH₄Cl + 0,0001 M NH₃ in 8036 MeOH mit etwa 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 2 bis 12 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität und die Absorption bei 220 nm, 260 nm und 300 nm werden für jede fünfte Fraktion bestimmt und HAEA₃₀₀ wird bei den bioaktiven Peakfraktionen gemessen. Die 890A_1Q-

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15936 33

Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 85 bis 150 mit einem Maximum bei der Fraktion 120 auf. Fraktionen mit HAEiU₀₀/ A,QQ-Werten über 0,05 werden vereinigt und weiter gereinigt. Es werden so die Fraktionen 105 bis 133» die insgesamt 130 HAEA^QQ-Einheiten enthalten, vereinigt. Die vereinigten Fraktionen 105 bis 133 werden auf 1900 ml mit entioniertem Wasser verdünnt und der pH-Wert wird auf 7,6 eingestellt. Die Probe wird auf eine Säule (2,15 x 42 cm) aus Dowex-1x2 (Cl"), -AOO mesh (-0,037 mm),aufgebracht, die zuvor mit 3 1 3#igem NaCl in 50tfigem Methanol, gefolgt von 50 ml 50#igem Methanol gewaschen wurde. Nach Aufbringen der gesamten Probe wird die Säule mit 100 ml 30tfigem Methanol gewaschen und mit 2 ml/min mit 0,26 M NaCl + 0,005 M NH₄Cl + 0,0002 M NH₃ in 30#igem Methanol eluiert. Fraktionen von 10 bis 12 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁₀ tritt bei den Fraktionen 230 bis 290 mit einem Maximum bei der Fraktion 260 auf. Die Fraktionen mit einem A-QQ/AgcQVerhältnis über 1,10 und einem A,₀₀/A₂20"^{Vernältnis ÜDer} 0,83 werden für die weitere Reinigung gesammelt. Es werden so die Fraktionen 240 bis 275 vereinigt, die 91,6 HAEA₃₀₀-Einheiten enthalten.

Die vereinigten Fraktionen 240 bis 275 werden bei vermindertem Druck auf 10 ml konzentriert und das Konzentrat wird von dem ausgefällten Salz durch Pipettleren abgetrennt. Das Salz wird mit 2 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Waschwasser wird zu dem Konzentrat zugegeben. Die vereinigten 12 ml Konzentrat und Waschwasser werden auf eine Säule (2,15 x 76 cm) aus Bio-Gel P-2 (200 bis 400 mesh = 0,074 bis 0,037 mm) aufgebracht, die zuvor mit 30 ml gesättigtem NaCl in entionisiertem Wasser, gefolgt von 1500 ml entionisiertem Wasser und 50 ml 0,05 mMol NII, in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Nach Beendigung der Anwendung wird die Säule mit 3 x 1 ml 0,05 mM NH₃ in entionisiertem Wasser gespült. Das Anti-

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15936 3^

biotikum wird mit 0,05 mM NH, in entionisiertem Wasser mit 0,73 ml/min eluiert. Fraktionen von je 3t65 1 werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 89OA₁₀ tritt bei den Fraktionen 29 bis 50 mit einem Maximum bei der Fraktion 36 auf. Die Fraktionen mit einem A,₀₀/A₂cQ-Verhältnis über 1,9 und ebenfalls mit einem A,₀₀/A₂₂₀-Verhältnis ^{ÜDer 1} Λ5 werden für die Lyophilisierung und NMR-Analyse vereinigt. Es werden so die Fraktionen 36 bis 45 vereinigt, die 50,8 A,₀₀-Einheiten enthalten, von denen 45,1 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen 36 bis 45 werden bei vermindertem Druck auf 1 ml konzentriert und 5 ml D₂O werden zugegeben. Die Probe wird erneut auf 0,835 ml konzentriert, und 0,825 ml davon werden in eine Glasampulle überführt, gefriergetrocknet und lyophilisiert. Die lyophilisierte Probe enthält 48,2 A,qq-Einheiten und 4,6 mg Feststoffe. Sie wird als Probe 9441-154 bezeichnet.

Die Nebenfraktionen 31 bis 34 und 46 bis 49 werden vereinigt; man erhält eine "Nebenprobe¹¹, die dann auf 1 ml konzentriert wird, schnell gefroren und lyophilisiert wird. Diese Fraktionen enthalten 24 JU₀₀-Einheiten, von denen 17 durch Hydroxylamin auslöschbar sind. Diese Probe wird als Probe 9441-155 bezeichnet.

Beispiel 3

Eine gefrorene Ampulle, die 2 ml MA-4638 Inokulum enthält, wird langsam aufgetaut und der Inhalt wird aseptisch in einen 500 ml C-Medium enthaltenden Impfkolben überführt. Der Impf kolben, 2 1, ein Schüttelkolben mit dreifachen Ablenkelementen, der mit seinem Seitenarm ausgestattet ist, wird mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen.

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15936 IS

C-Medium

autolysierte Hefe (Ardamine ) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer¹"¹" 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

vor der Sterilisierung wird der pH-Wert ait NaOH auf 6,5 eingestellt

Ardamine: Yeast Products, Inc.

"^⁺PhOsphatpufferlösung: KH₂PO^ 91,0 g

Na₂HPO^ 95_fo g

destill.Wasser 1000 ml

Der inokulierte Impf kolben wird 36 h bei 28°C+1°C aus einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt.

Das Wachstum aus diesem Impfkolben wird zur Inokulierung eines 14 1 Glasfermentationsbehälters verwendet, der 10 Produktionsmedium (D-Medium plus 0,1596 Sojabohnenöl, Vol/Vol) enthält.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g

Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt · 5,0 g

CoCl₂.6H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

Der Fermentationsbehälter wird bei 24°C unter Verwendung einer Rührrate von 550 U/min (Kd 3,0 bis 3,5) und einer Luftströmung von 0,5 WM betrieben. Entschäumungsmittel, Hodag-MF (Hodag Chemical Corp.) wird gegebenenfalls verwendet, aber nicht über 0,1#.

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809820/1031

15936 Kd

Die Kulturbriihe wird nach 72stündiger Fermentation geerntet.

200 ml-Teile des Ansatzes werden auf einer Servall RC-2-Zentrifuge mit 9000 U/min zentrifugiert. Das überstehende Material enthält 7 1 mit 39 Bioassayeinheiten/ml.

Das überstehende Material wird durch einen Lapp-Trichter, der eine 1 cm Schicht aus Hyflo Super-Cel auf einem Filtertuch enthält, filtriert. Zu 6,5 1 Filtrat gibt man 3,25 ml 0,1 M neutr. EDTA, und das Filtrat wird dann auf eine Säule (8,2 χ 21,5 cm) aus Dowex-1x2(Cl~), 40 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 mm), mit 60 ml/min aufgebracht. Nach der Anwendung wird die Säule mit 1 1 entionisiertem Wasser gespült und dann mit 12 1 0,15 M NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,08, + 25/UM EDTA in 5096 MeOH mit 50 ml/min gewaschen.

Das Antibiotikum 890A₁₀ wird dann mit 12,3 1 3%igem NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,1, + 25/UM EDTA in 80% MeOH mit -60 ml/min eluiert.

Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 500 ml, vier Fraktionen von je 200 ml, Zwölf Fraktionen von je 500 ml und fünf Fraktionen von je 1 1. Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 3 bis 17 mit einem Maximum bei den Fraktionen 6, und 8 auf. Die Fraktionen mit Bioaktivität/A₂2n" Werten über 0,9 Einheiten/A22o"^Einhei'^t» ^die ebenfalls mehr als 8% der gesamten wiedergewonnenen Aktivität/Fraktion enthalten, werden für die weitere Reinigung gesammelt. Es werden so die Fraktionen 6 bis 12 vereinigt, die 106 000 Bioassay-Einheiten oder 41% der angewendeten Bioaktivität enthalten. Diese vereinigten Fraktionen werden bei -60°C gehalten, bis sie mit den Fraktionen 6 bis 13 aus einer zweiten Dowexsäule, wie in Beispiel 4 beschrieben, vereinigt sind.

- 33 -

809820/1031

15936 3?

Beispiel 4

Zwei gefrorene Ampullen, die je 2 ml MA-4638-Inokulum enthalten, werden langsam aufgetaut. Der Inhalt wird aseptisch in zwei Impfkolben überführt, die je 500 ml C-Medium enthalten. Die Impfkolben, 2 1 Schüttelkolben mit dreifachen Ablenkelementen und einem Seitenarm, werden mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen.

C-Medium

autolysierte Hefe (Ardamine⁺) 10,0 g

Glucose 10,0 g MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt

⁺ Ardamine: Yeast Procuts, Inc.

⁺⁺Phosphatpufferlösung: KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0 g

destill.Wasser 1000 ml

Die inokulierten Impfkolben werden 36 h bei 28°+1°C auf einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt.

Das Wachstum aus den Impfkolben wird zur Inokulierung von zwei 14 1 Glasfermentationsbehältern verwendet, die je 10 D-Produktionsmedium enthalten.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g

Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

CoCl₂.6H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

- 34 809820/1031

15936 3?

Zwei Fermentationsbehälter werden beladen und bei 24°C unter Verwendung einer Rührrate von 550 U/min (Kd 3,0 bis 3,5) und einer Luftströmung von 0,5 WM betrieben. Gewünschtenfalls wird ein Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000, verwendet, aber nicht mehr als 0,1%.

Die Kulturbrühen aus den beiden Fermentationsbehältem werden nach 72 h geerntet.

200 ml-Teile der 10 1-Ansätze werden in einer Servall-Zentrifuge bei 9000 U/min zentrifugiert. Man erhält 9 1 überstehendes Material aus jedem Ansatz. Die Bioanalysen zeigen, daß der Ansatz I 23,4 Einheiten/ml und der Ansatz II 31,8 Einheiten/ml enthalten.

Die Ansätze werden vereinigt, gekühlt und durch eine 1 cm Schicht aus Hyflo Super-Cel auf einem 33,02 cm (13 inch) LabTek-Porzellanbüchnertrichter filtriert. Zu den 15 1 FiI-trat gibt man 7,5 ml 0,1 M neutr. EDTA.

Das Filtrat wird auf eine Säule (13,4 x 16 cm) aus Dowex-1x2 (Cl"), 50 bis 100 mesh(0,297 bis 0,149 mm), mit 100 ml/min aufgebracht. Nach Beendigung der Anwendung wird die Säule mit 2 1 entionisiertem Wasser und dann mit 20 1 0,15 M NaCl + 0,01 M tris-HCl-Puffer, pH 7,01, + 25/uM EDTA in 50% MeOH mit 40 bis 80 ml/min gewaschen.

Das Antibiotikum 890A₁₀ wird dann mit 24,4 1 einer Lösung eluiert, die 3% NaCl + 0,02 M tris-HCl, pH 7,0, + 25/uM EDTA in 80% MeOH enthält, und zwar mit 100 ml/min. Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 800 ml, vier Fraktionen von je 400 ml, zwölf Fraktionen von je 1000 ml und fünf Fraktionen von je 2000 ml,

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80982Ü/ 1 03 1

Die antibiotische Aktivität tritt bei den Fraktionen 5 bis 16 mit einem Maximum bei den Fraktionen 7 und 8 auf. Die Gesamtaktivität in diesen Fraktionen beträgt 212 OOO Einheiten, entsprechend 5196 der angewendeten Aktivität. Die Fraktionen 6 bis 13 werden für die weitere Reinigung vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen 6 bis 13 aus der Dowexsäule werden zu den vereinigten Fraktionen 6 bis 12 aus der Dowexsäule von Beispiel 3 gegeben und bei vermindertem Druck in einem Verdampfer mit langem Rohr und Dampfmantel auf 2,6 1 konzentriert. Dieses Konzentrat wird weiter durch Verdampfen bei vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer auf 300 ml reduziert und die ausgefallenen Salzkristalle werden abfiltriert.

Durch Zugabe von 1,7 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert des Konzentrats auf 6,48 eingestellt. Das Konzentrat wird dann auf eine Säule (8,1 χ 59 cm) aus Amberlite XAD-2 gegeben, und die Säule wird mit 3 x 20 ml Chargen von entionisiertem Wasser gespült. Das Antibiotikum wird mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 60 ml/min eluiert. Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 1 1, sieben Fraktionen von je 500 ml und acht Fraktionen von je 1000 ml. Diese werden unmittelbar nach dem Sammeln in Eis gekühlt.

Die Bioanalysen- und die HAEA^QQ-Werte wie auch die A₂₂Q"» ^A260" ^xm^^{i A}300~^{Werte für} 3^{ede Fraktion} werden bestimmt. Die Fraktionen mit HAEA^QQ/A^QQ-Werten über 0,075 werden für die weitere Reinigung vereinigt. Man vereinigt so die Fraktionen 5 bis 9, die 164 000 Bioassayeinheiten enthalten.

Die gesammelten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 100 ml konzentriert und 200 ml Methanol werden zugegeben. Die Probe wird dann auf eine Säule (2,15 x 38 cm) aus Dowex-1x4(Cl"), -400 mesh (-0,037 mm), mit 2 ml/min aufgebracht.

- 36 809820/1031

15936 HO

Nach der Anwendung wird die Säule mit 100 ml 8O?6igem Methanol gewaschen, und das Antitiotikum wird mit 0,26 M NaCl + 0_f005 M NH₄Cl + 0,00005 M IiH, in 80# MeOH mit 2 ml/min eluiert.Fraktionen von je 10 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivitäten und die Werte für A,_oo, A₂₅₀* ^a?20

werden von jeder fünften Fraktion bestimmt. Die Fraktionen rait HAEA,₀₀A₂₂₀- Verhältnissen über 0,07 werden für die weitere Reinigung vereinigt. Es werden so die Fraktionen 125 bis 150 vereinigt.

Zu den vereinigten Fraktionen 125 bis 150 aus der Dowex-1x4-Säule gibt man die lyophilisierte Probe 9441-155 von Beispiel 2, wieder aufgelöst in 1,0 ml entionisiertem Wasser. Diese vereinigte Probe wird auf 1900 ml mit entionisiertem Wasser verdünnt und auf eine Dowex-1x2(Cl")-Säule (2,15 x 40 cm), -400 mesh(-O,O37 min), mit 2 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 150 ml 30#igem Methanol gespült. Das Antibiotikum wird dann mit 6 1 0,25 M NaCl + 0,005 M NH₄Cl + 0,00005 M NH₃ in 30#igem MeOH mit 2 ml/min elujert. Fraktionen von je 11,1 ml werden gesammelt.

Die Absorption bei 300 nm, 250 nm und 220 nm wird von jeder fünften Fraktion gemessen. Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁₀ tritt bei den Fraktionen 360 bis 430 mit einem Maximum bei den Fraktionen 394 bis 400 auf. Alle Fraktionen mit einem ^A300^^A220~^{Verhältnis üt)er 1}»30 werden für die weitere Reinigung vereinigt. Es werden so die Fraktionen 380 bis 420 vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen enthalten 202 A,₀₀-Einheiten, von denen 197 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Zu den vereinigten Fraktionen 380 bis 420 gibt man die Probe 9441-154 von Beispiel 2, die in 1 ml D₂O plus 4 ml entionisiertem Wasser gelöst wurde und die 30,5 HAEA^₀₀-Einheiten enthält. Die vereinigte Probe wird auf 2,0 1 mit entionisier-

- 37 809820/1031

tem Wasser verdünnt und auf eine Säule (2,15 x 41 cm) aus Dowex-1x2 (Cl"), 200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm), mit 0,6 bis 2 ml/min angewendet. Die Säule wird mit 360 ml 30#igem Methanol gespült. Das Antibiotikum 890A₁₀ wird mit 0,25 M NaCl + 0,005 M NH₄Cl + 0,00005 M NH₃ in 30#igem MeOH bei 1,9 ml/min eluiert. Fraktionen von 9,7 ml werden gesammelt.

Die Absorption bei 300 nm, 250 nm und 220 nm wird von Jeder fünften Fraktion bestimmt. Der Hauptpeak des Antibiotikums 89OA₁₀, bestimmt durch die Absorption bei 300 nm, tritt bei den Fraktionen 270 bis 358 mit einem Maximum bei der Fraktion 315 auf. Die Fraktionen mit A₃₀₀ZA₂₂₀-Verhältnissen über 1,75 werden für die weitere Reinigung gesammelt. Es werden so die Fraktionen 295 bis 335 vereinigt, die 145 A₃₀₀-Einheiten enthalten, von denen 137 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen 295 bis 335 werden bei vermindertem Druck auf 10 ml konzentriert. Das Konzentrat wird mit 1 M NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Das Konzentrat wird auf pine Säule (2,15 x 75 cm ) aus Bio-Gel P-2, 200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm), angewendet, und die Säule wird mit 3 x 1 ml Chargen von entionisiertem Wasser gespült. Das Antibiotikum wird mit entionisiertem Wasser mit 0,6 ml/min eluiert. Fraktionen von je 6,4 ml werden gesammelt.

Die Absorptionswerte bei 300 nm, 250 nm und 220 ma wie auch die Leitfähigkeiten jeder zweiten Fraktionen werden bestimmt. Der Hauptabsorptionspeak bei 300 nm tritt bei den Fraktionen 9 bis 27 mit einem Maximum bei der Fraktion 14 auf. Die Fraktionen 11 bis 16 besitzen Leitfähigkeiten, die proportional zu dem A,₀₀-Wert sind, und diese Fraktionen werden für die massenspektrometrische und NMR-Analyse vereinigt. Dieses vereinigte Material enthält 75,4 A,₀₀-Einheiten in 38,7 ml. Davon werden 34,7 ml auf 1,22 ml konzentriert. Ein 1,20 ml-

- 38 8 0 9 8 2 0/ 1031

15936 4i

Teil davon wird gefroren und für die NMR-Analyse lyophilisiert. Man erhält 2,84 mg Feststoffe. Die restlichen 4 ml werden in die NH₄ ⁺-Form durch Durchleiten durch eine Säule (0,7 x 15 cm) aus Dowex-50Wx2(NH₄ ⁺), 200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm), überführt. Das entstehende Ammoniumsalz wird auf 0,11 ml konzentriert, 10/Ul werden entfernt, 100 /Ul entionisiertes Wasser werden zugegeben und vier Proben von je 40 ml werden entfernt und einzeln für die massenspektrometrische Analyse gefroren und lyophilisiert [9441-209-2].

Die Biogel-Fraktionen 17 bis 23, die 29,4 A,_0Q-Einheiten enthalten, werden ebenfalls auf 1 ml konzentriert, gefroren und lyophilisiert; man erhält 1,80 mg Feststoffe.

Beispiel 5

Zwei gefrorene Ampullen, die je 1 ml MA-4638-Kulturbrühe enthalten, werden langsam aufgetaut, und der Inhalt wird aseptisch in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben mit dreifachen Ablenkelementen überführt, die je 50 ml C-Impfmedium enthalten. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen.

C-Medium

autolysierte Hefe (Ardamine ) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

vor der Behandlung im Autoklaven wird der pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt

⁺ Ardamine: Yeast Products, Inc.

⁺⁺ Phosphatpufferlösung: KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,Og

destill.Wasser 1000 ml

Die beiden Impfkolben werden 20 bis 24 h bei 28°+1°C auf einer 210 U/min Gyro ta tionsvorr ichtung, 5,08 cm Schv/ingungs-

- 39 809Ö2 0/ 1031

M ^275Ί303

amplitude, geschüttelt. Dann wird der Inhalt gesammelt und zur Inokulierung der Produktionskolben verwendet.

Zehn 2 1 Schüttelkolben mit Ablenkelementen, die je 300 ml D-Produktionsmedium enthalten, werden mit 10 ml/Kolben mit der Brühe aus dem Impfkolben inokuliert. Die obigen Produktionskolben werden mit Mull verschlossen.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g

Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

CoCl₂.6H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

vor der Behandlung im Autoklaven wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24+1⁰C 3 Tage unter Schütteln auf einer 210 U/min Gyrotationsvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, inkubiert. Die Kolben werden geerntet, der Inhalt wird gesammelt und die Brühe wird auf ihre Aktivität untersucht.

Emtealter (h) 72

pH-Wert 6,5

890-Assay (Einheiten/ml) 30,45

2 1 der gesamten Brühe aus den obigen D-Produktionskolben werden in 200 ml-Teilen bei 9000 ü/min zentrifugiert; man erhält 1,7 1 überstehendes Material mit einem pH-Wert von 6,8.

Das überstehende Material wird auf eine Säule aus Dowex-1x2 (Cl"), 50 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 mm), Schichtdimensionen 3,9 cm χ 25 cm, mit einer Strömungsrate von 5 bis 10 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser, gefolgt von 2 1 0,15 M NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/uM neutr. EDTA in 50#igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol gewaschen.

- 40 809820/1031

15936 UM

Das Produkt wird dann mit 30 g/l NaCi + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/UM EDTA in 80%igera (Vol/Vol) wäßrigem Methanol mit einer Strömungsrate von 5 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 5 bis 180 mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 70 auf. Die Fraktionen 12 bis 105 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 15 ml konzentriert. Der pH-Wert wird mit 1 M HCl auf 6,5 ein gestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule (3,4 χ 55 cm) aus XAD-2 aufgebracht, die mit je 2,5 1 60%igem (Vol/Vol) wäßrigem Acetion, entionisiertem Wasser und 5%igem NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Säule wird mit 3x5 ml-Teilen entionisiertem Wasser gespült und mit entionisiertem Wasser mit 10 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 32 bis 270 mit einem Maximum bei den Fraktionen 42 bis 62 auf. Die Gesamtbioaktivität, die eluiert wird, beträgt 25# der Aktivität der ursprünglichen Brühe. Die Fraktionen 40 bis 240 werden vereinigt und die gelagerten, vereinigten Fraktionen 12 bis 34 aus der XAD-2-Säule von Beispiel 1 werden zugegeben. Die gesamten, vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert, sie enthalten 120 HAEA^qa-Einheiten.

Das Konzentrat wird mit 200 ml Methanol verdünnt und mit 2 ml/min auf eine Säule (2,15 x 40 cm) aus Dowex-1x4, -400 mesh (-0,037 mm), aufgebracht, die zuvor mit 2 1 von 30 g/l NaCl in 80#igem wäßrigem Methanol und 1 1 80%igem wäßrigem Methanol gewaschen wurde. Nach Anwendung der Probe wird die Säule mit 100 ml 80%igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol gewaschen und mit 2,5 1 0,22 M NaCl + 0,01 M NH^Ol -t 0,0002 M NH, in 80?(iigem (Vol/Vol ) wäßrigem Methanol, gefolgt von 3 1 0,31 M NaCl + 0,01 M NH^Cl + 0,0002 M NH₃ in 8Oj6igem (Vol/Vol) wäßrigem

~ 41 -

8098? Π/1031

Methanol eluiert. Die Strömungsrate beträgt 2 ml/min. Fraktionen von je 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotiktun 890A₁₀ wird an der Dowex-1x4-Säule getrennt, eluiert in den Fraktionen 155 bis 195, bestimmt durch Analyse an ATCC 8461.

Beispiel 6

Antibiotikum ₁

Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4600 NRRL 8140 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium E der folgenden Zusammensetzung enthält. Medium E

Hefeextrakt 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

⁺⁺Phosphatpufferlösung: KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,Og

destill.Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlenmeyer-Impfkolbens mit dreifachen Ablenkelementen verwendet, der 54 ml Impfmedium C der folgenden Zusammensetzung enthält. Medium C

autolysierte Hefe (Ardamine⁺) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt

⁺ Ardamine: Yeast Products Corporation

- 42 -

809820/1031

⁺⁺Phosphatpufferlö"sung: KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,Og

destill.Wasser 1000 ml

Der Irapfkolben wird mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen und 30 h bei 28°+1°C auf einer 220 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt.

Fünfzig 250 ml Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkelemente, die je 40 ml Produktionsmedium F enthalten, werden mit 1 ml/Kolben der Brühe aus dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Baumwolle verschlossen. Medium F

Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g

primäre Hefe 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoCl₂-OH₂O 5,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben 3 Tage bei 28°+1°C unter Schütteln auf einer 220 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, inkubiert. Die Kolben werden auf ihre Aktivität gegenüber Standard Vibrio percolans ATCC 8461-Analysenscheiben geprüft, wobei man 1,27 cm Analysenscheiben verwendet, die in Proben der zentrifugierten Fermentationsbrühe eingetaucht sind. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Erntealter (h) 72

pH-Wert 6,4

Vibrio percolans

(1/1OO Verdünnung) Assay 23 mm

890 Assay, Einheiten/ml 103

- 43 80982 0/1031

Die gesamte Brühe wird in 200 ml-Teilen in Po lycarbonatflaschen 15 min bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält 1600 ml vereinigtes überstehenden Material mit einer Potenz von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml 0,1 M neutr. EDTA.

Die zentrifugierte Brühe wird an einer Säule aus Dowex-1x2 (Cl"), 50 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 mm), Schichtdimensionen 3,8 χ 22 cm, mit einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 1 1 entionisiertem Wasser, das 50 g Natriumchlorid enthält, 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25/uM neutr.EDTA bei einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotikum 890A₁ tritt bei den Fraktionen 13 bis 81 mit einem Maximum in den Fraktionen 25 bis 33 auf, wenn man vom Beginn der ersten Anwendung des Salzeluats an zählt. Die Fraktionen 24 bis 41 mit den höchsten Biopotenz/A₂₂Q" Verhältnissen werden für die weitere Behandlung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 29 000 Einheiten oder 1756 der angewandten Bioaktivität.

Das Dowex-Eluat wird auf 10 ml konzentriert, der pH-Wert wird mit verdünnter ChIorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3,3 χ 36 cm, aufgebracht, die zuvor mit je 2 1 60#igem wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5tfigem (Gew./Vol) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit entionisiertem Wasser mit einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität tritt bei den Fraktionen 6 bis auf, die sich von 220 bis 2560 ml eluiertem Volumen erstrecken. Der Peak tritt bei den Fraktionen 9 und 10 auf, die sich von

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370 bis 590 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 9 bis 12, die sich von 370 bis 1060 ml eluiertem Volumen erstrecken, besitzen die höchsten HAEA,_oo/A22o~^Verhäl"^{tnisse und} werden für die weitere Behandlung vereinigt. Diese Fraktionen besitzen 36 600 Einheiten, und dies entspricht 126# der offensichtlichen, angewandten Aktivität.

Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 werden auf 100 ml konzentriert, und das Konzentrat wird mit einer Strömungsrate von 2 ml/min auf eine Säule aus Dowex-1x4 (Cl"), -400 mesh (-0,037 mm), Schichtdimensionen 2,2 χ 41 cm, aufgebracht. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 3 1 0,07 M NaCl + 0,005 M NH₄Cl + 0,0001 H NH₃ in entionisiertem Wasser mit einer Rate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend von der ersten Anwendung des Eluierungsmittels.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁ tritt bei den Fraktionen 181 bis 217 mit einem Maximum bei der Fraktion 198 auf. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Absorptionseinheiten bei 300 mn enthalten, werden gesammelt.

Die gesammelten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16/Ul 1 M NaOH auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Bio-Gel P-2, 200 bis 400 mesh(0,074 bis 0,031 mm), Schichtdimension 2,15 x 70 cm, aufgebracht und mit 3 x 1 ml Teilen entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser mit 0,96 ml/min eluiert. Fraktionen von 3,85 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁ tritt bei den Fraktionen 24 bis 44 mit einem Maximum bei den Fraktionen 33 und 34 auf. Die Fraktionen 27 bis 38 mit den höchsten A-_5OO/A_2Zf5-Verhältnissen werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 72

- 45 809820/1031

15936 I^

Zur Durchführung der Lyophilisierung werden die vereinigten Fraktionen auf 3»O ml konzentriert, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 10/ul 0,1 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile von Je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml Ampullen mit Glasschraubverschluß lyophilisiert. Jede Probe enthält 1,73 mg 890A₁, dies entspricht 35,8 Einheiten.

Ende der Beschreibung.

- 46 -

809820/1031

Claims (1)

15, KOVEMdEIi 1077.

Merck & Co., Inc.

Patentansprüche

Verbindung der folgenden Struktur

,-NHC-

-CH₂-CH₂-NHC-CH₃

und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.

Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur

,-NHC-

S-CHj-CHj-NHC-CH-j ;

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung 890A₁₀, dadurch gekennzeichnet, daß man einen 890A_1Qbildenden Stamm von Streptomyces flavogriseus in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter eingetauchten, aeroben Bedingungen züchtet und das Antibiotikum gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der kultivierte Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus NRRL 11 020 ist.

5. Zusammensetzung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer antibakteriell wirksamen Menge der Verbindung der folgenden Struktur:

- 1 -809820/1031

S-CH₂-CH₂-NHC-CH.

oder ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze und einem nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür.

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