DE68903907T2

DE68903907T2 - Cyclisches peptid, seine herstellung und seine verwendung zur behandlung von cardiovasculaeren stoerungen.

Info

Publication number: DE68903907T2
Application number: DE8989308901T
Authority: DE
Inventors: Kouhei C O Sankyo Compa Furuya; Kiyoshi C O Sankyo Comp Hamano; Takeshi C O Sankyo Co Kagasaki; Takeshi C O Sankyo C Kinoshita; Masaaki C O Sankyo Co Miyamoto; Kazuhiko C O Sankyo Co Tanzawa
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1988-09-05
Filing date: 1989-09-01
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2009-09-02
Also published as: EP0358418A1; GR3007079T3; ATE83480T1; ES2054011T3; US5112807A; EP0358418B1; DE68903907D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verbindung, die wir mit "Leualacin" bezeichnet haben und die durch Fermentation unter Verwendung geeigneter Mikroorganismusstämme der Gattung Hapsidospora, insbesondere Hapsidospora irregularis, gebildet werden kann. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung dieser neuen Verbindung sowie Zusammensetzungen und Methoden für ihre Verwendung bei der Behandlung und Prophylaxe von cardiovaskulären Erkrankungen und Störungen. Sie offenbart einen Mikroorganismusstamm der Species Hapsidospora irregularis, die zur Bildung der neuen Verbindung verwendet werden kann.
Es steht nun eindeutig fest, daß das Einströmen von Calciumionen in bestimmte Zellen im Körper von Säugern einschließlich der Zellen der glatten Muskulatur des vasculären Systems und der myocardialen Zellen an der Aktivität solcher Zellen teilhat und daß der Dihydropyridinempfindliche Calciumkanal, der an den Zelloberflächen der Skelettmuskeln und des Myocardiums sitzt, bei der Regulierung des Einströmens der Calciumionen in die Zellen eine Rolle spielt. Daher würde die Verabreichung von Calciumkanal-Blockern (auch bekannt als Calciumantagonisten), die ein derartiges Einströmen inhibieren, die myocardiale kontraktile Kraft und Rate dämpfen und zu einer Vasodilatation führen. Calciumkanal-Blocker sind daher bei der Behandlung und Prophylaxe einer Vielzahl von Erkrankungen und Störungen des Herzens und des vasculären Systems, wie Angina pectoris, Myocardinfarkt, Arrhythmien, Hypertension, cerebrovasculärem Spasma und anderen ischämischen Erkrankungen und Störungen, verwendbar.
Es wurde offenbart, daß Verapamil (Handelsbezeichnung "Vasolan", Produkt von Eisai Co., Ltd.) und andere Calciumkanal-Blocker die Bindung von ³H-Nitrendipin an Calciumkanäle der Zellmembran inhibieren. Man nimmt daher an, daß andere Substanzen, die die Bindung von Nitrendipin an den Calciumkanal der Zellmembran inhibieren, ebenfalls als Calciumkanal-Blocker verwendbar sein könnten. Als Ergebnis ihrer Blockierung der Calciumkanäle unterdrückt ein Calciumkanal-Blocker jede Erhöhung der intrazellularen Calciumkonzentration und schützt den Patienten gegenüber Koronarspasma und einer Dilatation der Blutgefäße.
Zahlreiche Verbindungen mit Calciumkanal-blockierender Aktivität sind bekannt, z.B. bestimmte Dihydropyridinderivate, wie Nifedipin (Handelsbezeichnung "Adalat", Produkt von Bayer Yakuhin Co., Ltd.) und Nicardipin, und andere Verbindungen, wie Verapamil (vorstehend erwähnt), Diltiazem und Flunarizin. Unter diesen werden Nifedipin, Nicardipin und Diltiazem weitverbreitet eingesetzt, sie sind jedoch strukturell mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung nicht verwandt. Verapamil und Flunarizin sind ebenfälls strukturell mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung nicht verwandt. Überdies sind sämtliche dieser bekannten Verbindungen chemisch synthetisierte Verbindungen, wohingegen die Verbindung der vorliegenden Erfindung ein "natürliches" Produkt ist, insoweit als es ein Fermentationsprodukt darstellt. Lediglich ein früheres "natürliches" Produkt ist uns bekannt, das Calciumantagonistenaktivität besitzt, und dieses ist, wie die Verbindung der vorliegenden Erfindung, ein cyclisches Peptid. Diese bekannte Verbindung ist Scytonemin A, die in Journal of Organic Chemistry, 53, 1298-1307 (1988), geoffenbart wird, jedoch wurde diese Verbindung bisher klinisch nicht verwendet. Überdies besitzt sie, wie aus dem vorstehenden Artikel zu entnehmen ist, obgleich sie ein cyclisches Peptid ist, eine von derjenigen der Verbindung der vorliegenden Erfindung völlig verschiedene Struktur und sie wird durch blaugrüne Algen der Gattung Scytomenin gebildet, wohingegen die Verbindung der vorliegenden Erfindung durch einen Schimmelpilz der Gattung Hapsidospora gebildet wird.
Somit wird in einer ersten Ausführungsform der Erfindung eine neue Verbindung bereitgestellt, von der wir gefunden haben, daß sie Calcium-blockierende Aktivität besitzt, die durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Hapsidospora hergestellt werden kann.
Es wird angenommen, daß Leualacin die Formel (I)
besitzt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Leualacin durch Kultivierung eines Leualacin bildenden Stamms des Mikroorganismus der Gattung Hapsidospora und Gewinnung von Leualacin aus der Kulturbrühe.
Die Erfindung betrifft ferner Leualacin der Formel (I), wie vorstehend definiert, der Formel (II), wie nachstehend definiert, oder die nachstehend definierten Eigenschaften für die Verwendung in der Therapie.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Leualacin zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prophylaxe von cardiovasculären Erkrankungen und Störungen bei Lebewesen, insbesondere Säugern, bei denen es sich um Menschen handeln kann.
In den beiliegenden Zeichnungen zeigt:
Fig. 1 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Leualacin;
Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Leualacin;
Fig. 3 das magnetische ¹³C-Kernresonanzspektrum von Leualacin; und
Fig. 4 das magnetische ¹H-Kernresonanzspektrum von Leualacin.
Leualacin besitzt die vorstehend gezeigte Molekülstruktur und die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften.
(1) Beschreibung: neutral, fettlöslich;
(2) Schmelzpunkt: 140ºC;
(3) spezifische optische Drehung: [α]20D -102º (c=1,14, Methanol);
(4) Elementaranalyse:
gefunden : C 64,65% H 8,33% N 7,21%
berechnet: 64,90 8,26 7,32;
(5) Molekulargewicht: 573 (gemessen durch Massenspektrometrie);
(6) Molekülformel: C&sub3;&sub1;H&sub4;&sub7;N&sub3;O&sub7; (gemessen durch Hochauflösungsmassenspektrometrie);
(7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: das Ultraviolett-Absorptionsspektrum, gemessen in Methanol, wird in Fig. 1 der beigefügten Abbildungen gezeigt;
(8) Infrarot-Absorptionsspektrum: das an einem Kaliumbromidpreßling gemessene Infrarot-Absorptionsspektrum wird in Fig. 2 der beigefügten Abbildungen gezeigt;
(9) ¹³C-NMR-Spektrum: das magnetische Kernresonanzspektrum (bei 125 MHz), gemessen in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard, wird in Fig. 3 der beigefügten Abbildungen gezeigt; unter den verwendeten Versuchsbedingungen schien sich das Signal des Lösungsmittels (CDCl&sub3;) bei 77,1 ppm zu zentrieren; weiterhin und in Übereinstimmung mit den Massenspektrometriedaten wurden die Signale von 31 Kohlenstoffatomen beobachtet;
(10) ¹H-NNR-Spektrum: das kernmagnetische Resonanzspektrum (bei 270 MHz), gemessen in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard, wird in Fig. 4 der beigefügten Abbildungen gezeigt;
(11) Löslichkeit: löslich in Methanol, Aceton, Chloroform und Ethylacetat; unlöslich in Wasser;
(12) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie:
Säule: Radialpack Novapack Patrone C18, Teilchengröße 4 um, Säulengröße 8 mm x 10 cm (Waters Co., Ltd.),
mobile Phase: ein 7:3 Volumen-Gemisch von Acetonitril und Wasser,
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min,
Nachweis: UV, 210 nm,
ein Peak wird bei 5,7 Minuten bei einer Säulentemperatur von 25ºC nachgewiesen;
(13) saure Hydrolyse: die saure Hydrolyse der Verbindung ergibt Leucin, N-Methylphenylalanin, β-Alanin und Leucinsäure.
Die systematische Bezeichnung von Leualacin gemäß den Empfehlungen der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) ist 11-Benzyl-2,5,8-triisobutyl-10- methyl-1,7-dioxa-4,10,13-triazacyclohexadecan-3,6,9,12,16- penton. Jedoch, ebenfalls entsprechend den Empfehlungen der IUPAC,wird auf die Verbindung vorliegend in Form ihres trivialen Namens "Leualacin" Bezug genommen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß das folgende Leualacinisomere, wie in Formel (II) gezeigt, gebildet wird:
d.h. 11(S)-Benzyl-2(R),5(S),8(S)-triisobutyl-10-methyl- 1,7-dioxa-4,10,13-triazacyclohexadecan-3,6,9,12,16-penton.
Es liegen jedoch, wie vorstehend gezeigt, zahlreiche asymmetrische Kohlenstoffatome in dem Molekül dieser Verbindung vor, und demzufolge sind zahlreiche Stereoisomere möglich. Die vorliegende Erfindung umfaßt sämtliche derartige Isomere, ob isoliert oder als Mischungen. Wird die Verbindung als Mischung der Isomeren gebildet, kann sie als solche Mischung verwendet werden oder die individuellen Isomeren können getrennt und einzeln verwendet werden.
Leualacin wurde durch einen Mikroorganismusstamm gebildet, den wir als Stamm SANK 17182 bezeichnet haben. Dieser bei der vorliegenden Erfindung verwendete, Leualacin bildende Mikroorganismusstamm SANK 17182 ist ein Mikroorganismus der Familie der Ascomyceten und wurde von uns aus dem Boden bei Manigaon im Königreich Nepal isoliert. Die mikrobiologischen Eigenschaften des Leualacin bildenden Stamms, SANK 17182, sind wie folgt.

Morphologische Eigenschaften

Das Wachstum auf Weizmann-Agarmedium ist gering; die Kolonie erreicht einen Durchmesser von 15 mm in 7 Tagen und 35 mm in 14 Tagen bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie ist eben und weiß (weiß, 1-1-A) bis leicht gelblichweiß (gelblichweiß, 1-2-A). Die Rückseite der Kolonie ist ebenfalls farblos bis leicht gelblichweiß.
Ascocarps besitzen eine dunkelbraune Farbe; ein wenig im Zentrum der Kolonie ausgebildet; oberflächlich, globular bis subglobular, nonostiolat; Durchmesser 250-400 um.
Ascen: 8-sporig; globular bis subglobular, durchscheinend, flüchtig; Durchmesser 8 - 15 um.
Ascosporen: globular mit vernetzten Oberflächen; dunkelbraune Farbe; ohne Keimporen; Durchmesser 4 - 6 um.
Das Anamorph ist ein Acremonium sp. und es werden Konidien in feuchten Massen am Ende der Phialiden gebildet.
Konidien: glasähnlich, durchscheinend; ellipssoidal bis oval mit Dimensionen von 3,5 bis 10,0 x 2,0 bis 3,5 um.
Durch Vergleich der vorstehenden morphologischen Charakteristika mit denjenigen bekannter Species wurde eine erhebliche Entsprechung mit denjenigen von Hapsidospora irregularis beobachtet, die in Canadian Journal of Botany, 48, 1815-1825 (1970), von D.Malloch und R.F.Cain beschrieben wird. Demgemäß wurde der bei der vorliegenden Erfindung verwendete Stamm als bekannter Stamm, Hapsidospora irregularis Malloch et Cain, identifiziert und der company code number SANK 17182 zugeordnet. Die Farbexpressionen und -codes, welche vorliegend verwendet werden, wurden entsprechend den Richtlinien in Methuen Handbook of Colour, 3.Auflage (1978), verfaßt von A.Kornerup und J.H. Wanscher und publiziert von Eyre Nethuen, London, zugeordnet.
Der Stamm wurde von uns an dem Fermentation Research Institute, Tokyo, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERN P-10199 hinterlegt und unter den vom Budapester Vertrag am 12. Juli 1989 vorgeschriebenen Bedingungen unter der Zulassungsnummer FERN BP-2511 erneut hinterlegt.
Es wurde festgestellt, daß der Stamm SANK 17182 Leualacin bildet. Wie jedoch gut bekannt-ist, können die Eigenschaften von Fungi im allgemeinen erheblich variieren,und solche Fungi können leicht einer Mutation unterliegen sowohl durch natürliche Ursachen als auch als Ergebnis der Auslösung durch künstliche Mittel. Demzufolge umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung jeglichen Mikroorganismus, der innerhalb der Gattung Hapsidospora, insbesondere Hapsidospora irregularis, klassifiziert werden kann und der mit dem Stamm SANK 17182 die charakteristische Fähigkeit, Leualacin zu bilden, teilt. Es ist lediglich ein einfacher Versuch nötig, um auf Basis der vorliegend gegebenen Information im Hinblick auf die Eigenschaften von Leualacin zu bestimmen, ob ein gegebener Stamm Leualacin bildet oder es in ausreichender Menge bildet, um diesem Stamm potentielles kommerzielles Interesse zu verleihen.
Die erfindungsgemäße neue Verbindung, Leualacin, kann durch Kultur dieser Fungusstämme in Kulturmedien des üblicherweise für die Herstellung anderer Fermentationsprodukte aus ähnlichen Mikroorganismen verwendeten Typs hergestellt werden. Solche Medien enthalten notwendigerweise mikrobiologisch assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze, wie dem Fachmann gut bekannt ist.
Bevorzugte Beispiele für Kohlenstoffquellen umfassen: Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannit, Glycerin, Dextrin, Hafer, Roggen, Maisstärke, Kartoffelstärke, Maismehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenkuchen, Melassen, Citronensäure, Weinsäure und dergl. Solche Verbindungen können allein oder in jeder geeigneten Kombination eingesetzt werden. Im allgemeinen kann die verwendete Menge im Bereich von 1 bis 10 Gew.% des Kulturmediums variieren.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind normalerweise Protein enthaltende Materialien, wie sie üblicherweise in einem Fermentationsverfahren verwendet werden. Beispiele solcher Stickstoffquellen umfassen: Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Erdnußmehl, Baumwollsamenkuchen, Baumwollsamenmehl, Caseinhydrolysate, Pharmamin, Fischmehl, Maiseinweichflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Malzextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergl. Diese Stickstoffquellen können allein oder in jeder geeigneten Kombination eingesetzt werden. Im allgemeinen bevorzugen wir es, sie bei einer Konzentration zwischen 0,2 und 6 Gew.% des Kulturmediums zu verwenden.
Die anorganischen Nährsalze, die dem Kulturmedium zugesetzt werden sollten, sind übliche Salze, die in der Lage sind, verschiedene Ionen zu liefern, welche für das Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, wie Natrium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen. Zusätzlich sollte das Medium geringere Mengen essentieller Metalle, wie Kalium, Calcium, Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium enthalten.
Wird das erfindungsgemäße Verfahren durch eine Flüssigkulturtechnik durchgeführt, wird vorzugsweise ein Antischaummittel, wie ein Siliconöl, Pflanzenöl oder oberflächenaktives Mittel, in dem Kulturmedium verwendet. Der pH des Kulturmediums zur Erzeugung von Leualacin durch Kultivierung von Hapsidospora irregularis Malloch et Cain SANK 17182 variiert vorzugsweise im Bereich von 5,0 bis 8,0.
Die Kultivierung kann bei jeder Temperatur im Bereich von 15 bis 35ºC durchgeführt werden, obgleich eine Temperatur von 22 bis 35ºC für ein gutes Wachstum bevorzugt ist, und eine Temperatur von 22 bis 28ºC ist bevorzugt, um die Erzeugung von Leualacin zu optimieren.
Leualacin wird unter aeroben Kulturbedingungen gebildet, und es können übliche aerobe Kulturmethoden, wie Festkultur-, Schüttelkultur- und Belüftungs-Rühr(Tauch)kultur- Methoden, verwendet werden. Für den Fall einer Kultivierung in kleinem Maßstab ist die Schüttelkultur für wenige Tage bei 26ºC typisch. Bei einer Kulturmethode im kleinen Maßstab kann die Kultur mit ein oder zwei Proliferationsstufen unter Bildung von Keimkulturen in beispielsweise Erlenmeyerkolben initiiert werden, die mit Ablenkplatten versehen sind, welche als Regulator für den Flüssigkeitsstrom dienen. Das Medium für die Keimkulturstufen enthält vorzugsweise sowohl Kohlenstoff- als auch Stickstoffquellen. In der bevorzugten Verfahrensabfolge für eine derartige Kultivierung in kleinem Maßstab werden die Keimkulturflaschen in einem Inkubator mit konstanter Temperatur von 26ºC während 7 Tagen oder bis zur Erzielung eines ausreichenden Wachstums geschüttelt. Die gewachsene Keimkultur wird dann zu einem zweiten Keimmedium oder zu dem Produktionsmedium übergeführt. Wird eine Zwischenwachstumsphase angewandt, wird im wesentlichen die gleiche Methode für das Wachstum verwendet, und es wird ein Aliquot des entstandenen Zwischenprodukts in das Produktionsmedium inokuliert. Der inokulierte Kolben kann mehrere Tage unter Schütteln inkubiert werden, und nach Beendigung der Inkubation kann der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert werden.
Im Fall einer Produktion in großem Maßstab ist die Verwendung eines geeigneten Fermentors, der mit einem Rührer und einer Belüftungsapparatur versehen ist, bevorzugt. In diesem Fall kann das Nährmedium im Inneren des Fermentors hergestellt werden. Das Medium wird vorzugsweise sterilisiert, indem man die Temperatur auf 125ºC erhöht. Nach dem Abkühlen kann das sterilisierte Medium mit der zuvor hergestellten Keimkultur inokuliert werden. Die Kultur schreitet dann unter Rühren und Belüftung bei 26ºC fort. Diese Methode ist zur Erzielung der erfindungsgemäßen Verbindung in großer Menge geeignet.
Der Fortschritt der Kultivierung und die Menge des mit fortschreitender Kultur gebildeten Leualacins kann durch eine Radioligandenbindungs-Assaymethode bestimmt werden, d.h. beispielsweise die Methode von G.A.Weiland und R.E. Oswald [Journal of Biological Chemistry, 260, 8456-8464 (1985)], die auf der Fähigkeit des Leualacins, die Bindung von ³H-Nitrendipin an Mikrosomen zu inhibieren, basiert. Eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie kann ebenfalls verwendet werden. Im allgemeinen erreicht die Leualacin-Menge ein Maximum zwischen 72 und 150 Stunden nach Initiierung der Fermentation, jedoch hängt die exakte Dauer von der Temperatur und anderen Fermentationsbedingungen ab. Die exakte optimale Zeitdauer kann jedoch für jede Kombination von Bedingungen einfach bestimmt werden, indem man die Bildung von Leualacin, wie vorstehend empfohlen, verfolgt.
Das Leualacin kann aus der Kulturbrühe mit Hilfe gut bekannter, herkömmlicher Mittel für die Gewinnung von Verbindungen dieses Typs aus Fermentationsbrühen, welche sowohl in den Mikrobenzellen verbleiben als auch in das Kulturmedium freigegeben werden, gewonnen werden. Beispielsweise können nach Beendigung der Kultur das Myzel und andere feste, das Leualacin enthaltende Materialien aus der Brühe durch Filtrieren, im allgemeinen mit einem Filterhilfsmittel, z.B. Diatomeenerde, oder durch Zentrifugieren abgetrennt werden, und das in dem Filtrat oder dem Überstand vorhandene Leualacin sowie dasjenige in dem Myzel können durch Extraktions- und Reinigungsverfahren unter Zunutzemachen der physikochemischen Eigenschaften des Leualacins gewonnen werden. Beispielsweise kann das in dem Filtrat oder dem Überstand vorhandene Leualacin extrahiert und unter neutralen pH-Bedingungen durch Verteilung des Leualacins zwischen Wasser und einem einzigen nicht-mischbaren, organischen Lösungsmittel oder einer Mischung von derartigen Lösungsmitteln, z.B.Ethylacetat, Hexan, Chloroform, Ethylenchlorid oder Methylenchlorid, gereinigt werden. Eine weitere Methode besteht darin, ein Adsorptionsmittel, z.B. Aktivkohle, oder ein Adsorptionsharz, wie Amberlite (Handelsbezeichnung) XAD-2 oder XAD-4 (Rohm and Haas Co., Ltd.) oder Diaion (Handelsbezeichnung) HP-10, HP-20, CHP-20P oder HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation), zu verwenden. Die das Leualacin enthaltende Flüssigkeit wird durch eine Schicht eines dieser Adsorbentien geleitet, um die adsorbierten Verunreinigungen zu entfernen, oder das adsorbierte Leualacin wird mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie wäßrigem Methanol, wäßrigem Aceton oder wäßrigem Butanol, eluiert. Das in dem Myzel anwesende Leualacin kann mit wäßrigem, 50 bis 90 Vol-% Wasser enthaltendem Aceton oder Methanol extrahiert werden, wonach das organische Lösungsmittel entfernt wird, und es können Extraktions- und Reinigungsmethoden ähnlich denjenigen für das Filtrat angewandt werden.
Das wie vorstehend erhaltene Leualacin kann weiter mit Hilfe verschiedener herkömmlicher Techniken, insbesondere verschiedener Chromatographietechniken, wie Adsorptions- Säulenchromatographie unter Verwendung eines Trägers, wie Silicagel oder Magnesia-Silicagel, wie Florisil (Handelsbezeichnung), Verteilungs-Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex (Handelsbezeichnung) LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule für ein normales oder reverses Phasenverfahren, gereinigt werden.
Leualacin, die erfindungsgemäße Verbindung, ist eine neue Verbindung, die zuvor in der Literatur nicht beschrieben worden ist und die calciumantagonistische Wirkung bei Testtieren zeigt und von der man daher annimmt, daß sie sich auch bei anderen Lebewesen (z.B. Menschen, Hunden, Katzen, Kaninchen, etc.) ähnlich verhält. Es ist daher zu erwarten, daß es für die Prophylaxe oder Therapie von Hypertension, Arrhythmien, Herzversagen und Angina pectoris bei allen Lebewesen, insbesondere Säugern und vor almem Menschen, wertvoll ist.
Leualacin kann allein als pharmazeutischer Wirkstoff verwendet werden oder es kann mit pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Exzipienten und/oder Verdünnungsmitteln gemischt werden, die für den vorgesehenen Verabreichungsweg geeignet sind, wie es aus dem Stand der Technik gut bekannt ist. Beispielsweise kann es für die orale Verabreichung in Form von Pulvern, Granulaten, Tabletten oder Kapseln eingesetzt werden; für die parenterale Verabreichung kann es in Form von Injektionen verwendet werden. Die Dosierung der Verbindungen hängt von der Schwere und der Natur der Erkrankung oder Störung, dem Alter, dem Körpergewicht und dem Zustand des Patienten und vom Verabreichungsweg, der Verabreichungshäufigkeit und Verabreichungsperiode ab. Eine geeignete Tagesdosis Leualacin bei einem erwachsenen Menschen würde jedoch im Bereich von 0,01 bis 2,0 g liegen, die als Einzeldosis oder als aufgeteilte Dosen, z.B. 1 bis 3 Mal je Tag, verabreicht werden können.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung wird durch die folgenden Beispele veranschaulicht.

Beispiel 1

A) Kultur

Eine Schleifenfüllung einer Kultur von Hapsidospora irregularis Malloch et Cain, SANK 17182, wurde aseptisch in einen 500 ml Erlenmeyerkolben, der mit Ablenkblechen (Keimkolben) versehen war und 100 ml sterilisiertes Medium mit der nachstehend beschriebenen Zusammensetzung enthielt, inokuliert. Der inokulierte Kolben wurde dann 7 Tage auf einer Rotationsschüttelapparatur bei 200 U/min (Radius der Rotation: 7 cm) bei 26ºC inkubiert.

Zusammensetzung des Mediums

Saccharose 20 g
Kartoffel (roh und zerstoßen) 100 g
Casaminosäure (vitaminfrei) 10 g
Kaliumphosphat, einbasisch 5g
Magnesiumsulfat (7H&sub2;O) 2,5 g
entionisiertes Wasser 1000 ml
pH: nicht eingestellt
100 ml eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie die vorstehend gezeigte wurde in jede von zwanzig 500 ml-Erlenmeyerkolben eingebracht. Nach Sterilisierung der Kolben und des Inhalts wurden 2 ml gewachsene Myzelien der Keimkultur in jeden der Kolben inokuliert. Die zwanzig Kolben wurden dann auf einem Rotationsschüttler 7 Tage unter den gleichen Bedingungen, wie sie für die Keimkultur angewandt wurden, inkubiert.

B) Isolierung

Die gesamte Masse der Kulturbrühe wurde 20 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wurde für die spätere Extraktion aufbewahrt. Der pH des Überstands (1,7 l) wurde auf einen Wert von 7,0 eingestellt, und die Flüssigkeit wurde in einen Scheidetrichter überführt und zweimal mit jeweils 2 l Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurdenvereinigt und mit 3 l gesättigter, wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, wonach sie über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingeengt wurden, um 273 mg Öl zu ergeben.
Indessen wurde der vorstehende, die Myzelien enthaltende Niederschlag mit 300 ml Aceton gemischt und 1 Stunde gerührt. Am Ende dieser Zeitdauer wurde die entstandene Mischung filtriert und das Aceton unter vermindertem Druck aus dem Filtrat unter Verwendung eines Rotationsverdampfers abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Wasser gemischt, um ein Volumen von 1000 ml zu ergeben, und die entstandene Mischung wurde euf einen pH-Wert von 7,0 durch Zusatz von Natriumhydroxid eingestellt. Die Mischung wurde hiernach zweimal mit jeweils 1000 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden vereinigt und mit 2 l einer gesättigten, wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, wonach sie über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt wurden, um 391 mg Öl zu ergeben.
Die aus dem Kulturfiltrat erhaltene, ölige Substanz (273 mg) und die 391 mg aus dem Myzel erhaltenes Öl wurden vereinigt, um insgesamt 664 mg Öl zu ergeben. Das Ganze wurde in einer 4:6 Volumenmischung von Hexan und Ethylacetat gelöst. Das Öl in der Lösung wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer mit Silicagel (Lobar Column, Art.10401 LiChroprep Si60, Größe B, Merck AG) bepackten Säule, die mit einer 4:6 Volumenmischung von Hexan und Ethylacetat prä-äquilibriert worden ist, gereinigt. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min unter Verwendung eines Differential-refraktometrischen Detektors wurden sämtliche den nachgewiesenen Peaks entsprechenden Fraktionen getrennt gesammelt. Jede der Fraktionen wurde unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Eine jede der resultierenden Fraktionen wurde zur Bestimmung ihrer Aktivität mit Hilfe der Radioligandenbindungsassay-Methode, die nachstehend in Experiment 1 beschrieben wird, untersucht. Eine wirksame Calcium-blockierende Aktivität wurde in 100 mg der Fraktionen mit Retentionszeiten von 30 bis 37 Minuten gefunden, und der IC&sub5;&sub0;-Wert war so hoch wie 1,38 ug/ml. Wurde ein Aliquot dieser aktiven Fraktion einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterzogen [Säule: Radialpack Novapack Patrone C18, Teilchengröße 4 um, Säulengröße 8 mm x 10 cm (Waters Ltd.); mobile Phase: ein 7:3 Volumengemisch von Acetonitril und Wasser; Fließgeschwindigkeit 2 ml/min; Nachweis-Wellenlänge: UV 210 nm; Säulentemperatur: 25ºC], wurde ein einziger Peak mit einer End-UV-Absorption bei 5,7 Minuten beobachtet.
Die entstandene aktive Fraktion wurde dann durch reverse Phasen-Flüssigkeitschromatographie gereinigt. Im einzelnen wurde die gesamte Masse, gelöst in 200 ul Acetonitril, auf eine Senshu pack ODS H-5251 (20 mm innerer Durchmesser x 250 mm, Senshu Kagaku Co., Ltd.)-Säule aufgebracht. Die Entwicklung und Elution wurden mit 60% Vol/Vol wäßrigem Acetonitril durchgeführt, und diejenigen Fraktionen, die ein Differential-refraktometrischer Detektor als ein bei 28 Minuten eluierter Peak zeigte, wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden dann zur Trockene unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer eingeengt, um 70 mg reines Leualacin als weißes Pulver zu ergeben. Das Pulver wurde hiernach aus einer Mischung von Aceton und Hexan kristallisiert, um 40 mg farblose Nadeln zu ergeben.
Das erhaltene Produkt besaß die vorstehend angegebenen Eigenschaften und erwies sich als das Isomere der vorstehend gezeigten Formel (II).

Beispiel 2

A) Kultur

Es wurde eine Fermentation in großem Maßstab von Hapsidospora irregularis Malloch et Cain, SANK 17182, zur Erzielung von Leualacin durchgeführt. Das verwendete Keimmedium besaß die folgende Zusammensetzung:

Zusammensetzung des Keimmediums

Saccharose 20 g
Kartoffel 100 g
Casaminosäure (Vitamin-frei) 10 g
Kaliumphosphat, monobasisch 5g
Magnesiumsulfat (7H&sub2;O) 2,5 g
Antischaummittel (CB-442) 0,2 g
entionisiertes Wasser 1000 ml
pH: nicht eingestellt
100 ml dieses Mediums wurden einem 500 ml Erlenmeyerkoiben, der mit Ablenkplatten versehen war, zugegeben, und das Medium wurde 20 Minuten bei 120ºC sterilisiert. Am Ende dieser Zeitdauer wurden Sporen von Hapsidospora irregularis Malloch et Cain, SANK 17182, durch aseptische Inokulation dem Kolben zugegeben, und der Mikororganismus wurde 7 Tage bei 200 U/min auf einem Rotationsschüttler bei 26ºC kultiviert.
15 l des gleichen Mediums, wie es für die Keimkultur verwendet wurde, wurden in jeden von zwei 30 l Schüttelfermentatoren gegossen, die dann 30 Minuten bei 120ºC sterilisiert wurden. 200 ml der vorstehenden Keimkultur wurden hiernach in jeden der Schüttelfermentatoren inokuliert, und es wurde eine Belüftungs-Rühr-Kultur 6 Tage bei 60ºC fortgeführt, wobei die Bewegungsgeschwindigkeit automatisch innerhalb des Bereichs zwischen 100 und 300 U/min und bei einer Luftfließgeschwindigkeit von 7,5 l/min kontrolliert wurde, um die gelöste Sauerstoffkonzentration bei 0,3 bis 0,5 ppm zu halten.

B) Isolierung

Etwa 3 kg Celite (Handelsbezeichnung)-Filterhilfsmittel wurden zu 15 l der gesamten Masse der Kulturbrühe von SANK 17182, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, zugegeben, und die Mischung wurde durch eine Filterpresse zur Erzielung eines Filtrats und einer Myzelfraktion filtriert. 35 l Aceton wurden hiernach zu 8 kg des Myzelkuchens zugegeben, und dann wurde die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Am Ende dieser Zeitdauer wurde die Mischung filtriert, um das Filtrat und das Myzel zu trennen. Erneut wurden 15 l 80% Vol/Vol wäßriges Aceton zu der Myzelfraktion zugegeben, und die Mischung wurde extrahiert, während 1 Stunde gerührt wurde. Hiernach wurde die Mischung filtriert und das entstandene Filtrat mit dem zuvor erhaltenen Filtrat vereint. Die vereinten Filtrate wurden in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum eingedampft, um das Aceton zu vertreiben und 10 l wäßrige Lösung zu ergeben. Der pH der wäßrigen Lösung wurde auf einen Wert von 6,5 durch Zusatz einer 4N wäßrigen Natriumhydroxidlösung eingestellt, und danach wurde die Lösung zweimal mit jeweils 10 l Ethylacetat extrahiert; man erhielt 18 l einer Ethylacetatlösung. Diese Lösung wurde mit 15 l einer gesättigten, wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und dann mit 800 g wasserfreiem Natriumsulfat entwässert. Sie wurde dann in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum zur Trockene eingeengt, um 21,2 g eines öligen Materials zu ergeben. Dieses ölige Material wurde in 80 ml einer 4:6 Volumenmischung von Hexan und Ethylacetat gelöst und die Lösung (aufgeteilt in 4 etwa gleiche Teile) wurde auf eine Silicagelsäule (Lobar column, Art. 10402 LiChroprep Si60 Größe C, Merck AG) gegeben, die zuvor mit einer 4:6 Volumenmischung von Hexan und Ethylacetat äquilibriert worden war. Bei jeder der Aufbringungen wurde das gleiche Lösungsmittel für die Elution verwendet und die Fraktionen, die, angezeigt durch ein mit der Säule verbundenes Differential-Refraktometer, Peaks bei 35 bis 50 Minuten zeigten, wurden gesammelt. Auf die gleiche Weise,wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden die Reinheiten dieser Fraktionen mit Hilfe von HPLC überwacht und die Aktivitäten wurden durch eine Radioligandenbindungsassay-Methode bestätigt. Die Fraktionen wurden dann zur Trockene unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer eingedampft, um insgesamt 1,8 g öliges Material zu ergeben. Dieses ölige Material wurde dann durch reverse Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie gereinigt. Im einzelnen wurde das ölige Material, gelöst in 8 ml Acetonitril und aufgeteilt in 10 Aliquots, auf eine reverse Phasensäule von Senshupack ODS H-5251 (20 = Innendurchmesser x 250 mm, Senshu Kagaku Co., Ltd.) aufgebracht. Die Säule wurde mit einer 60:40 Volumenmischung von Acetonitril und Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von 7,0 ml/min eluiert, und die Eluate wurden mit einem Differential-Refraktometer überwacht. Die einen Peak bei 28 Minuten zeigende Fraktion wurde gesammelt und in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, um 1,66 g reines Leualacin als farbloses, öliges Material zu ergeben. Dieses ölige Mäterial wurde weiterhin mit einer Mischung von Aceton und Hexan trituriert, um zu einer Kristallisation von 800 mg Leualacin in Form farbloser Nadeln zu führen.

Experiment 1

Radioligandenbindungsassay-Methode

Dieses Experiment verwendete eine Radioligandenbindungsassay-Methode, die eine Modifizierung der Methode von G.A.Weiland und R.E.Oswald [Journal of Biological Chemistry, 260, 8456-8464 (1985)] ist, um die Aktivität zu ermitteln, die die Bindung von ³H-Nitrendipin an Mikrosomen inhibiert.
Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 25ºC in 1 ml einer Reaktionsmischung durchgeführt, die 15 bis 20 ug einer Mikrosomenfraktion, hergestellt aus Schweineherz, 200 pM ³H-Nitrendipin (NEN-DuPont Pharmaceuticals, spezifische Aktivität 88,1 Ci/mM), 50 mM NaOH-HEPES-Puffer (pH 7,4) und 0,5 Vol-% Ethanol,enthielt. (HEPES ist N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure.) Leualacin wurde bei verschiedenen Konzentrationen in dem Ethanol gelöst, und die serienverdünnte Lösung wurde in einer ausreichenden Menge zugegeben, um die Ethanolkonzentration auf 0,5% in der Reaktionsmischung zu bringen. Das mit einer Reaktionsmischung unter Verwendung von 1 uM kaltem Nitrendipin erzielte Resultat wurde als Kontrolle verwendet. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf einem Glasfaserfilter (GF/C) filtriert und die auf dem Filter zurückgehaltene Fraktion wurde mit Hilfe eines Cell Harvester (Typ M-24, Brandel Co., Ltd.) gewaschen. Das Glasfaserfilter wurde dann in ein Fläschchen eingegeben und man verwendete OPTIFLUOR (Packard Co., Ltd.) als Szintillator und bestimmte die Radioaktivität (als Zerfalle/Minute). Man fand, daß Leualacin einen starken ID&sub5;&sub0;-Wert besaß, der so gering wie 0,99 ug/ml war.

Experiment 2

Calcium-antagonisierende Wirkung in dem Tenia Caecum

Die Calcium-antagonisierende Aktivität in dem Tenia Caecum wurde nach der Methode von M. Spedding [Naunyn- Schmiedeberg's Arch.Pharmacol., 318, 234-240 (1982)] bestimmt. Männliche Meerschweinchen mit einem Gewicht von 250 bis 300 g wurden unter Pentobarbital-Anästhesie laparotomisiert, und die Tenia wurde unmittelbar darauf aus dem Caecum entfernt. Die Tenia wurde in Streifen von 6 bis 7 cm Länge geschnitten und in einem Magnusgefäß suspendiert, welches mit 20 ml Tyrode-Lösung ohne Calcium gefüllt war und mit einer Gasmischung belüftet (O&sub2; 95% - CO&sub2; 5 Vol-%) wurde. Nachdem die Probe durch einstündiges Stehen unter den vorstehenden Bedingungen äquilibriert war, wurden 0,2 ml jeweils von 30, 100 und 300 mM wäßrigen Calciumchloridlösungen kumulativ in 3 Minuten-Intervallen zugegeben und die Kontraktion der Probe gemessen. Nach den Messungen wurde die Probe zweimal mit Tyrode-Lösung ohne Calcium gewaschen und 30 Minuten belassen. Die Probe wurde hiernach mit Leualacin 30 Minuten inkubiert, wonach 0,2 ml jeweils von 30, 100 und 300 mM Calciumchloridlösungen kumulativ in 3 Minuten-Intervallen in der gleichen Weise wie vorstehend zugegeben wurden und die Kontraktion erneut gemessen wurde. Die Kontraktion nach der Behandlung mit der Leualacinlösung wurde aus derjenigen nach der Behandlung mit der Calciumchloridlösung allein abgeleitet und der erhaltene Wert wurde durch die Kontraktion nach der Behandlung mit der Calciumchloridlösung allein dividiert, um die Antagonisierungsrate zu ergeben.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Leualacin-Konzentration (g/ml) Antagonisierungsrate (%)
Aus den vorstehenden Ergebnissen geht klar hervor, daß Leualacin eine starke antagonistische Aktivität zeigte.

Experiment 3

Antihypertensive Aktivität

Männliche SHR (spontan hypertensive Ratten) mit einem Alter von 15 Wochen wurden mit Natriumpentobarbital anästhesiert (50 mg/kg intraperitoneal), und eine Polyethylenkanüle wurde durch die linke Femoralarterie in die abdominale Aorta eingeschoben. Das andere Ende der Kanüle wurde aus dem Körper herausgeführt und an der Rückseite des Halses fixiert. Eine Woche nach der Operation, als sich das Tier von dem Stress des chirurgischen Eingriffs erholt hatte, wurde das andere Ende der Kanüle an den Blutdruck-Transducer gebunden, der entsprechend den Richtlinien von Laffan et al. [P.J.Laffan, A.Peterson, S.W. Hitch und C.Jeunelot, Cardiovascular Res. 6, 319-324 (1972)], jedoch mit geringen Modifikationen konstruiert war. Der Blutdruck und die Herzgeschwindigkeit der bei Bewußtsein befindlichen und nichtgestressten SHR wurden gemessen. Nachdem der Blutdruck und die Herzgeschwindigkeit mehr als 1 Stunde stabilisiert waren, wurde der Testwirkstoff durch Sondenzufuhr verabreicht.
Der Testwirkstoff war in Ethanol gelöst und mit physiologischer Salzlösung verdünnt und wurde in der in Tabelle 2 angegebenen Dosis verabreicht. Nach Verabreichung der Testprobe wurden der Blutdruck und die Herzgeschwindigkeit alle 15 Minuten über einen Zeitraum von 24 Stunden gemessen. Die so bestimmte, maximale Abnahme des Blutdrucks wird in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Dosis Abnahme des Blutdruck (mmHg)
Wie vorstehend gezeigt, besaß Leualacin eine ausgezeichnete antihypertensive Aktivität.

Experiment 4

Akute Toxizität

Es wurde keine Toxizität festgestellt, als Leualacin oral an Mäuse in einer Dosis von 200 mg/kg, die bei weitem über jeder vernünftigen therapeutischen Dosis liegt, verabreicht wurde.
Das folgende ist ein Beispiel für eine pharmazeutische Formulierung. Kapseln für die orale Verabreichung Leualacin Lactose Maisstärke Magnesiumstearat
Die Pulver der vorstehenden Formulierung wurden gemischt, und nach Durchleiten durch ein 30 Mesh (Tyler-Standardmesh)-Sieb wurden 350 mg des Pulvers in eine Gelatinekapsel gegeben, um Kapseln herzustellen.

Claims

1. Verbindung der Formel (I)

2. Verbindung der Formel (II)

3. Verbindung, die durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist und die zur Bildung durch Fermentation eines Mikroorganismus der Gattung Hapsidospora irregularis befähigt ist:

(1) Beschreibung: neutral, fettlöslich;

(2) Schmelzpunkt: 140ºC;

(3) spezifische optische Drehung: [α]20D -102º (c=1,14, Methanol);

(4) Elementaranalyse:

gefunden : C 64,65% H 8,33% N 7,21%

berechnet: 64,90 8,26 7,32;

(5) Molekulargewicht: 573 (gemessen durch Massenspektrometrie);

(6) Molekülformel: C&sub3;&sub1;H&sub4;&sub7;N&sub3;O&sub7; (gemessen durch Hochauflösungsmassenspektrometrie);

(7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: das Ultraviolett-Absorptionsspektrum, gemessen in Methanol, wird in Fig. 1 der beigefügten Abbildungen gezeigt;

(8) Infrarot-Absorptionsspektrum: das an einem Kaliumbromidpreßling gemessene Infrarot-Absorptionsspektrum wird in Fig. 2 der beigefügten Abbildungen gezeigt;

(9) ¹³C-NMR-Spektrum: das magnetische Kernresonanzspektrum (bei 125 MHz), gemessen in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard, wird in Fig. 3 der beigefügten Abbildungen gezeigt; unter den verwendeten Versuchsbedingungen schien sich das Signal des Lösungsmittels (CDCl&sub3;) bei 77,1 ppm zu zentrieren; weiterhin und in Übereinstimmung mit den Massenspektrometriedaten wurden die Signale von 31 Kohlenstoffatomen beobachtet;

(10) ¹H-NMR-Spektrum: das kernmagnetische Resonanzspektrum (bei 270 MHz), gemessen in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard, wird in Fig. 4 der beigefügten Abbildungen gezeigt;

(11) Löslichkeit: löslich in Methanol, Aceton, Chloroform und Ethylacetat; unlöslich in Wasser;

(12) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie:

Säule: Radialpack Novapack Patrone C18, Teilchengröße 4 um, Säulengröße 8 mm x 10 cm (Waters Co., Ltd.),

mobile Phase: ein 7:3 Volumen-Gemisch von Acetonitril und Wasser,

Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min,

Nachweis: UV, 210 nm,

ein Peak wird bei 5,7 Minuten bei einer Säulentemperatur von 25ºC nachgewiesen;

(13) saure Hydrolyse: die saure Hydrolyse der Verbindung ergibt Leucin, N-Methylphenylalanin, β-Alanin und Leucinsäure;

(14) besitzt calciumkanalblockierende Aktivität.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 3 durch Kultivierung eines Leualacin bildenden Mikroorganismusstamms der Gattung Hapsidospora und Gewinnung von Leualacin aus der Kulturbrühe.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der Mikroorganismus ein Stamm der Gattung Hapsidospora irregularis ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der Mikroorganismus Hapsidospora irregularis FERN BP-2511 ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4, 5 und 6, worin die Kultivierung unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, worin die Kultivierung bei einer Temperatur von 15 bis 35ºC durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die Temperatur 22 bis 35ºC beträgt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Temperatur 22 bis 28ºC beträgt.

11. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Verbindung, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 10, für die Verwendung bei der Therapie oder Prophylaxe.

12. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Verbindung, hergestellt durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 10, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von cardiovaskulären Erkrankungen und Störungen.

13. Verwendung gemäß Anspruch 12 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prophylaxe der Hypertension.