DE2362288C2

DE2362288C2 -

Info

Publication number: DE2362288C2
Application number: DE2362288A
Authority: DE
Inventors: Fumihiro Fujisawa Kanagawa Jp Yoshinaga; Takayasu Tsuchida; Kenji Kawasaki Kanagawa Jp Kikuchi; Shinji Tokio/Tokyo Jp Okumura
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-12-16
Filing date: 1973-12-14
Publication date: 1987-08-27
Also published as: GB1428497A; JPS5317675B2; JPS4981587A; FR2210663A1; US3886039A; DE2362288A1; FR2210663B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Glutamin.

L-Glutamin wird als Aminosäure klassifiziert, die für Ratten nicht essentiell ist; sie hat jedoch Verwendung als Rohstoff in der Kosmetik und Medizin oder als Nahrungsmittelzusatz gefunden.

Es ist bekannt, daß L-Glutamin zusammen mit Glutaminsäure mit Hilfe eines Fermentationsverfahrens gebildet wird, bei dem Glutaminsäure bildende Stämme der Gattungen Brevibacterium, Bacillus, Micrococcus, Microbacterium und Escherichia verwendet wurden (bekanntgemachte Japanische Patentanmeldungen 5449/1964, 7391/1964, 12474/1965 und 7595/1967), sowie US-PS 34 14 478.

In der zuletzt genannten Literaturstelle finden sich nur sehr allgemeine Angaben über die einzusetzenden Mikroorganismen, so daß es nicht möglich ist, die genannten, zur Bildung von L-Glutaminsäure befähigten Mikroorganismen zu erhalten. Darüber hinaus ist das bekannte Verfahren nachteilig, da es den Zusatz von Schwermetallionen, d. h. von Zink- und/oder Molybdänionen, zum Kulturmedium erfordert. Ein derartiger Zusatz hat jedoch zur Folge, daß das gebildete L-Glutamin zusätzlichen aufwendigen Reinigungsoperationen unterworfen werden muß, da es andernfalls nicht für medizinische Zwecke oder Nahrungsmittelzwecke eingesetzt werden kann.

Der Erfindung liegt dagegen die Aufgabe zugrunde, L-Glutamin in einfacherer und wirtschaftlicherer Weise herzustellen, als es bisher möglich war.

Es wurde nun gefunden, daß L-Glutamin in höherer Konzentration und in höheren Ausbeuten als mit Hilfe der bekannten L-Glutamin-bildenden Stämme erzeugt wird, wenn unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen Mutantenstämme verwendet werden, die Resistenz gegen mindestens eine Sulfaverbindung haben, wenn diese Mutantenstämme auf einem an sich üblichen Medium gezüchtet werden, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische Ionen und unspezifische organische wachstumsfördernde Mittel enthält.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin durch Züchten eines L-Glutamin-bildenden Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze enthält, und Gewinnen des angereicherten L-Glutamins aus dem Kulturmedium. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Glutamin-bildenden Mikroorganismus einen Mutantenstamm von Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum oder Microbacterium flavum verwendet, der resistent gegenüber mindestens einer Sulfaverbindung ist.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Mutanten werden mit Hilfe von üblichen mutagenen Mitteln, wie Ultraviolett-Licht, Röntgenstrahlen oder Gammastrahlen in mutagenen Dosen, Natriumnitrit, Nitrosoguanidin oder Diäthysulfat-Lösung aus Elternstämmen, die zur Bildung von Glutaminsäure befähigt sind, eines Mikroorganismus der Art Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum und Microbacterium flavum, und Selektion der so bebildeten Mutanten im Hinblick auf die erforderliche Resistenz gegenüber Wachstumshemmung durch Sulfa-Verbindung abgeleitet. Eine solche Mutante kann auch dann, wenn die vorstehend erwähnten mutagenen Mittel nicht angewendet wurden, durch Selektion bzw. Screening von Stämmen mit Resistenz gegen Sulfa-Verbindungen aus Kolonien erhalten werden, die durch Züchtung des Elternstammes auf einem solche Sulfa-Verbindungen enthaltenden Medium gebildet werden.

Wenn diese Mutantenstämme mit Resistenz gegenüber Sulfa-Verbindungen von Elternstämmen abgeleitet werden, die bereits Fähigkeit zur Glutaminbildung haben, wird die Menge des gebildeten Glutamins beträchtlich erhöht.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Mikroorganismen können Mutanten sein, die andere biologische Eigenschaften, wie einen bestimmten Nährstoffbedarf und/oder Resistenz gegenüber anderen Reagenzien zusätzlich zu der Resistenz gegenüber Sulfa-Verbindungen haben.

Die Sulfa-Verbindungen, gegen welche die erfindungsgemäß verwendeten Mutantenstämme resistent sind, haben folgende allgemeine Eigenschaften und sind allgemein als Antagonisten von p-Aminobenzoesäure bekannt.

1. Sie enthalten in ihrem Molekül eine Gruppe der allgemeinen Formel und zeigen allgemein antimikrobielle Wirkung.
2. Die antimikrobielle Wirkung gegen übliche Wildstämme wird durch Zugabe von p-Aminobenzoesäure unterdrückt.

Zu Beispielen für solche Sulfa-Verbindungen, welche die vorstehenden Eigeschaften haben, gehören Sulfapyridin, Sulfathiazol, Phthalylsulfathiazol, Sulfadiazin, Sulfaguanidin, Sulfamethazin, Sulfamerazin, Sulfadimethoxin, Sulfamethomidin, Sulfamethoxypyridazin, Sulfisomidin, Sulfisoxazol, Acetosulfamin, Sulfanylamid, Sulfisomezol, Sulfaphenazol, Sulfamethizol, Sulfaethidol, Sulfapyrazin, Irgafen und Irganmid.

Es wurde gefunden, daß die wirksamsten Glutamin-bildenden Mutanten Brevibacterium flavum FERM BP-662, Corynebacterium glutamicum FERM BP-663 und Microbacterium flavum FERM BP-664 sind.

Diese Mikroorganismen waren ursprünglich unter den Bezeichnungen FERM P-1684, FERM P-2372 und FERM P-2374 hinterlegt und sind von der Hinterlegungsstelle selbst in die entsprechenden Internationalen Hinterlegungen umgewandelt worden.

Kulturproben von Mikroorganismen, die durch FERM-Nummern bezeichnet sind, sind durch das Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science of Technology, the Ministry of Industrial Trade and Industry, 1-8-5, Inage Higashi, Chiba-shi, Chiba, Japan, frei erhältlich.

Verfahren zur Herstellung von Mutantenstämmen, die Resistenz gegenüber Sulfa-Verbindungen zeigen, werden in den nachstehenden Versuchen beschrieben.

Versuch 1

(1) Brevibacterium flavum ATCC 14067 wurde 30 Minuten bei 30°C mit 200 µg Nitrosoguanidin/ml behandelt und wurde dann auf eine Agarplatte aufgeimpft, die 2% Glucose, 0,2% Harnstoff, 1% Ammoniumsulfat, 0,3% K₂HPO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,04%MgSO₄ · 7H₂O, 2 ppm Fe⁺², 50 µg/l Biotin, 350 µg/l Thiamin. HCl, 400 g/ml Sulfaguanidin und 2% Agar enthielt und einen pH-Wert von 7,0 hatte. Nach vier- bis zehntägiger Züchtung bei 31°C wurden Mutantenstämme mit Resistenz gegenüber Sulfa-Arzneimitteln aus etwa 100 auf der bebrüteten Agarplatte aufgetretenen Kolonien isoliert. Daraus wurden drei Mutantenstämme durch Selektion erhalten, die zur Bildung einer großen Menge an L-Glutamin befähigt waren. Es wurde bestätigt, daß diese drei Mutantenstämme keinen spezifischen Nährstoffbedarf haben. In der vorstehend beschriebenen Weise wurde Brevibacterium flavum FERM BP-662 erhalten.

Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wurden außerdem Corynebacterium glutamicum FERM BP-663 und Microbacterium flavum FERM BP-664 aus den Elternstämmen Micrococcus glutamicus ATCC 21010 (die taxonomische Bezeichnung dieses Stammes wurde in Corynebacterium glutamicum geändert) und Microbacterium flavum ATCC 10340 erhalten. Es wurde bestätigt, daß diese Stämme Glutamin-bildende Mutanten mit Resistens gegenüber Sulfa-Verbindungen sind.

(2) Wachstumstest des Stammes Brevibacterium flavum FERM BP-662 in einem Medium, das variierende Mengen an Sulfaguanidin enthält:
Der Elternstamm Brevibacterium flavum ATCC 14067 und der Mutantenstamm FERM BP-662, die vorher während 24 Stunden auf Schrägagar-Nährmedium gezüchtet worden waren, wurden mit einem flüssigen Medium der folgenden Zusammensetzung gewaschen und in 3-ml-Anteile des mit Sulfaguanidin versetzten Mediums, wie in Tabelle 1 angegeben ist, eingeimpft. Die Konzentration der Mikrobenzellen, die in jedes Medium eingeimpft wurden, wurde auf etwa 1,5 × 10⁷ eingestellt.

Zusammensetzung des Mediums

Glucose2% (NH₄)₂SO₄1% Harnstoff0,2% KH₂PO₄0,1% K₂HPO₄0,3% MgSO₄ · 7H₂O0,1% Fe++2 ppm Mn++2 ppm Biotin50 g/l Thiamin · HCl100 g/l (pH 7,0)

Die Züchtung wurde 48 Stunden bei 31,5°C durchgeführt, und das resultierende Wachstum und das relative Wachstum jedes Stammes in jedem Medium, das unterschiedliche Anteile an Sulfaguanidin enthielt, werden in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

(3) Ein Wachstumstest der Stämme Corynebacterium glutamicum FERM BP-663 und Microbacterium flavum FERM BP-664 in einem Medium, das variierende Mengen an Sulfaguanidin und Sulfamethoxypyridyzin enthielt, wurde in gleicher Weise wie in Abschnitt (2) durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 2 und 3 gezeigt.

Tabelle 2

Tabelle 3

Das Fermentationsmedium kann ein natürliches Nährmedium oder ein synthetisches Nährmedium sein, das den grundlegenden Bedürfnissen der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen Rechnung trägt.

Geeigneten Kohlenstoffquellen gehören die üblichen Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen, sowie auch organische Säuren, insbesondere Essigsäure, Propionsäure, Fumarsäure oder Benzoesäure und Alkohole, insbesondere Methanol und Äthanol an. Ein Medium kann auch verschiedene Kohlenstoffquellen enthalten. Einige der neuen Mutanten assimilieren Kohlenwasserstoffe als überwiegende oder in geringfügigem Maß verwendete Kohlenstoffquelle.

Stickstoff kann durch Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon, Caseinhydrolysate und Gemische solcher Substanzen sowie auch durch Ammoniak zugeführt werden.

Die erforderlichen anorganischen Ionen können durch Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kalium-mono- und dihydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und andere Verbindungen zur Verfügung gestellt werden.

Um eine gute Ausbeute an Glutamin zu erzielen, sollte die Fermentation unter aeroben Bedingungen unter Belüftung und/oder Bewegen bzw. Rühren durchgeführt werden. Für eine optimale Ausbeute sollte der pH-Wert innerhalb des Bereiches von 5,5 bis 8,5 gehalten werden. Der gewünschte pH-Wert kann durch Zugabe von gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak, Calciumcarbonat, Alkalimetallhydroxiden, Harnstoff oder organischen oder anorganischen Säuren zu dem Medium, die von Zeit zu Zeit erfolgt, aufrechterhalten werden. Gewisse dieser Zusätze sind auch Quellen für assimilierbaren Stickstoff. Wenn die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 24°C bis 37°C durchgeführt wird, erreicht die Glutamin-Konzentration in dem Medium gewöhnlich ihren Maximalwert innerhalb zwei bis fünf Tagen.

Zum Gewinnen des angereicherten Glutamins aus der Kulturbrühe können übliche Methoden angewendet werden, vorzugsweise nach dem Entfernen der Mikrobenzellen durch Filtration oder Zentrifugation. Das Glutamin wird vorteilhaft durch Ionenaustauscherharze aus der zellfreien Brühe absorbiert. Kristallines L-Glutamin wird aus dem Eluat nach üblichen Methoden erhalten.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Ein Fermentationsmedium der nachstehenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

Glucose10% Ammoniumsulfat1% KH₂PO₄0,25% MgSO₄ · 7H₂O0,04% FeSO₄ · 7H₂O1 mg/dl Thiamin-hydrochlorid350 γ/l Biotin5 γ/l Sojabohnenprotein-Hydrolysat0,5 ml/dl pH 7,0

300-ml-Proben des Mediums wurden in Fermentationskolbens aus Glas eingeführt und mit Hilfe von Dampf sterilisiert. Die Medien wurden mit Brevibacterium flavum FERM BP-662 inoculiert, das vorher auf Bouillon-Schrägplatten 24 Stunden bei 31,5°C gezüchtet worden war. Die Fermentation wurde bei 1.200 Upm bei 31,5°C während 30 Stunden unter Belüftung mit 1/4 Volumteil Luft pro Minute pro Volumteil der Brühe durchgeführt. Der pH- Wert jedes Mediums wurde durch Zugabe von gasförmigem Ammoniak bei etwa 6,5 gehalten. Nach 30 Stunden dauernder Züchtung wurden in der Brühe 3,9 g L-Glutamin/dl aufgefunden.

Die Kulturbrühe wurde zum Entfernen der Zellen zentrifugiert, und ein Liter der überstehenden Flüssigkeit wurde durch Leiten durch eine Säule mit einem Ionenaustauscherharz von L-Glutamin befreit. Aus der Brühe wurden mit Hilfe einer üblichen Methode 15,5 g kristallines L-Glutamin gewonnen.

Andererseits fanden sich nur 0,85 g/dl L-Glutamin in der Brühe, in der Brevibacterium flavum ATCC 14067 in gleicher Weise wie vorstehend angegeben gezüchtet worden war.

Beispiel 2

Corynebacterium glutamicum FERM BP-663, Microbacterium flavum FERM BP-664 und ihre Elternstämme Micrococcus glutamicus ATCC 21010 bzw. Microbacterium flavum ATCC 10340 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet.

Nach 30 Stunden dauernder Züchtung hatten die in der Brühe gebildeten Mengen an L-Glutamin die in der folgenden Tabelle 4 angegeben Werte.

Tabelle 4

Beispiel 3

Ein Fermentationsmedium der nachstehenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

Glucose10% Ammoniumsulfat7% KH₂PO₄0,25% MgSO₄ · 7H₂O0,04% FeSO₄ · 7H₂O1 mg/dl Thiamin-hydrochlorid350 γ/l Biotin5 γ/l Sojabohnenprotein-Hydrolysat0,5 ml/dl CaCO₃4% pH 6,5

20-ml-Anteile des Medium wurden in 500-ml-Schüttelkolben eingeführt und mit Hilfe von Wasserdampf sterilisiert. Die jeweiligen Medien wurden mit den in der nachstehenden Tabelle 5 angegebenen sechs Stämmen beimpft, die vorher 24 Stunden bei 30°C auf Bouillon-Schrägkulturen gezüchtet worden waren. Die Fermentation wurde 48 Stunden unter Schütteln bei 31,5°C durchgeführt.

Das in jeder Kulturbrühe nach 48stündiger Züchtung gebildete L-Glutamin ist in der nachstehenden Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Beispiel 4

Die fünf in der nachstehenden Tabelle 6 angegebenen Stämme wurden in das nachstehende Medium A eingeimpft und 12 Stunden unter Rühren und Belüftung bei 31°C gezüchtet.

Zusammensetzung des Mediums A
Stärkehydrolysat (berechnet als Glucose)1,5% Ammoniumacetat0,3% Ammoniumsulfat0,3% KH₂PO₄0,15% MgSO₄ · 7H₂O0,04% FeSO₄ · 7H₂O1 mg/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat1 ml/dl Thiamin-hydrochlorid350 γ/l Biotin3 γ/l Harnstoff0,1%

Je 15 ml Impfmaterial aus dieser Kultur wurden zu 300-ml-Anteilen des Hauptkulturmediums in gläserne Fermentationskolben gegeben. Das Hauptkulturmedium hatte nachstehende Zusammensetzung.

Zusammensetzung des Hauptkulturmediums
Ammoniumacetat0,8% Natriumacetat0,41% Ammoniumsulfat1% KH₂PO₄0,25% MgSO₄ · 7H₂O0,04% FeSO₄ · 7H₂O1 mg/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat1 ml/dl Biotin5 γ/l Thiamin-hydrochlorid350 q/l pH 7,2

Die Fermentationsgemische wurden mit 1.200 Upm bei 31°C gerührt und mit einem Volumenteil Luft pro Minute pro Volumenteil der Brühe belüftet. Der pH-Wert jedes Mediums wurde durch Zugabe einer 70%igen Lösung von Essigsäure und gasförmigen Ammoniak automatisch zwischen 7,0 und 8,0 gehalten. Nach 48 Stunden wurde festgestellt, daß jeder Stamm L-Glutamin in der betreffenden Kulturbrühe in einer Menge gebildet hatte, die in Tabelle 6 angegeben ist.

Tabelle 6

Die Kulturbrühe des Stammes Brevibacterium flavum FERM BP-662 wurde zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und 7,5 g rohes kristallines L-Glutamin wurden mit Hilfe einer üblichen Methode aus 380 ml der Brühe isoliert.

Beispiel 5

Die in der nachstehenden Tabelle 7 aufgeführten sechs Stämme wurden in das Medium B eingeimpft, das die nachstehend angegebene Zusammensetzung hatte, und wurden 18 Stunden unter Rühren und Belüften bei 30°C gezüchtet.

Zusammensetzung des Mediums B
Glucose2% Äthanol0,5% Ammoniumsulfat0,5% KH₂PO₄0,15% MgSO₄ · 7H₂O0,14% FeSO₄ · 7H₂O1 mg/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat3 ml/dl Biotin3γ/l Thiamin-hydrochlorid350 γ/l Harnstoff0,2% pH 7,0

Je 30 ml Impfmaterial aus dieser Kultur wurden zu 300-ml-Anteilen der Hauptkulturmedien mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in Fermentationskolben aus Glas gegeben.

Zusammensetzung des Hauptkulturmediums
Äthanol1,5% Ammoniumsulfat1% KH₂PO₄0,25% MgSO₄ · 7H₂O0,04% FeSO₄ · 7H₂O1 mg/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat1 ml/dl Biotin5 γ/l Thiamin-hydrochlorid350 γ/l pH 7,2

Das Fermentationsgemisch wurde mit 1.200 Upm bei 31,5°C gerührt und mit einem halben Volumenteil Luft pro Minute pro Volumenteil der Brühe belüftet.

Während der Fermentation wurde der pH-Wert jedes Mediums durch Zugabe von gasförmigem Ammoniak zwischen 6,5 und 7,5 gehalten. Der Äthanolgehalt jedes Mediums wurde durch Gaschromatographie bestimmt, und das Äthanol wurde ergänzt, sowie der Restgehalt an Äthanol auf etwa 0,1% abgefallen war.

Nach 48 Stunden wurde festgestellt, daß jeder Stamm in der entsprechenden Kulturbrühe L-Glutamin in der Tabelle 7 angegebenen Menge gebildet hatte.

Tabelle 7

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin durch Züchten eines L-Glutamin-bildenden Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze enthält, und Gewinnen des angereicherten L-Glutamins aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Glutamin-bildenden Mikroorganismus einen Mutantenstamm von Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum oder Microbacterium flavum verwendet, der resistent gegenüber mindestens einer Sulfa-Verbindung ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutantenstämme die Stämme Brevibacterium flavum FERM BP-662 Corynebacterium glutamicum FERM BP-663 oder Microbacterium flavum FERM BP-664 verwendet.