DE2321174C2 - Nonapeptidamid und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Description

Claims

DE2321174C2

Publication number: DE2321174C2
Application number: DE2321174A
Authority: DE
Inventors: Masahiko Hyogo Fujino; Tsunehiko Osaka Fukuda; Shigeru Kobayashi; Mikihiko Obayashi; Susumu Shinagawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-04-29
Filing date: 1973-04-26
Publication date: 1982-04-15
Also published as: ES414197A1; GB1403642A; AT333988B; SE397520B; AU453931B2; CH580065A5; AU5467673A; US3853837A; NL7305995A; CS188162B2; DK147851B; FI56676C; HU168696B; FR2183021B1; DE2366379C2; NL930004I1; NO139560B; DE2321174A1; CA1005815A; FR2183021A1

Die Erfindung betrifft neue Nonapeptidamide mit starker ovulationsfördernder Wirkung. Die neuen Nonapeptidamide haben die allgemeine Formel

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A,-Gly-A₂-Arg-Pro-Y

in der A. für Tyr oder Phe, A2 für Leu, lie, Nie oder Met und Y für NHR steht, worin R ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen ist oder eine Pyrrolidinogruppe ist.

Die Erfindung umfaßt ferner die pharmazeutisch unbedenklichen Salze der Nonapeptidamide sowie ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen.

In dieser Beschreibung stehen (Pyr)Glu, His, Trp, Ser, Tyr, Phe, GIy, Leu, He, Nie, Met, Arg und Pro für »Reste« von L-Pyroglutaminsäure, L-Histidin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, Glycin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Methionin, L-Arginin bzw. L-Prolin. Unter dem »Rest« ist ein Radikal zu verstehen, das von der entsprechenden «-Aminosäure durch Eliminierung des OH-Teils der Carboxylgruppe und des Η-Teils der oc-Aminogruppe abgeleitet ist. Beispielsweise stellt im Falle von L-Arginin

HN

H₃N

C-NHCH₂Ch₂CH₂CHCOOH

NH₂

das durch die Formel H₂N-A-COOH dargestellt werden kann (worin NH₂ der «-Aminorest ist), das Radikal ( — NH- Λ — CO — ) einen »Rest« von L-Arginin dar und wird als » — Arg — « abgekürzt. Die Abkürzungen für die anderen vorstehend genannten «-Aminosäuren haben die entsprechende Bedeutung, wie sie vorstehend für L-Arginin dargelegt wurde.

Der vorstehend genannte Substituent R, d. h. der geradkettige oder verzweigte Alkylrest, der 1 bis 3 C-Atome enthält, kann ein Methylrest, Äthylrest, n-Propylrest oder Isopropylrest sein.

Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß der Hypothalamus Faktoren enthält, die bei höherer Konzentration die Sekretion der tropen Hormone aus der Hypophyse steuern. Kürzlich wurde anschließend an die Isolierung eines Thyrotropin freigebenden Hormons (TRH=Thyrotropin-releasing hormone) ein Hormon, das die Sekretion des luteinisierenden Hormons fördert, in reiner Form aus Schweinen und Schafen extrahiert und als Decapeptid der Struktur H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Por-Gly-NH₂ identifiziert (A. V.

Schally und Mitarbeiter, Biochem. Biophys. Res. Commun., 43,1334 [1971]; R. Gnillemin und Mitarbeiter, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 69, 278 [1972]). Dieser Feststellung folgte die Synthese einer Anzahl ähnlicher Peptide. Außerdem wurden biologische Tests mit diesen analogen Peptiden durchgeführt. Jedoch verringert selbst eine geringfügige Modifikation der vorstehend genannten Aminosäurezusammensetzung stark die physiologische Aktivität des Peptids, und die vorstehende chemische Struktur wird als wesentlich für die Genese maximaler physiologischer Aktivität angesehen (A. V. Schally und Mitarbeiter, Biochem. Biophys. Res. Commun. 4,366 [1972]).

Es gelang die Synthese der Nonapeptidamide (I) sowie ihrer pharmazeutisch unbedenklichen Salze.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Verbindungen eine stärkere ovulationsauslösende Wirkung haben als das natürlich vorkommende Decapeptid. Ferner wurde gefunden, daß diese Verbindungen auf die Hypophyse einwirken und die Sekretion sowohl des luteinisierenden Hormons als auch des follikelstimulierenden Hormons fördern. Ferner wurde gefunden, daß diese Verbindungen nicht nur wertvoll als Medikamente für den Menschen, z. B. als Medikamente für die Diagnose der Hypophysenfunktion oder des Gonadotropinmangels und für die Therapie der Amenorrhoe, sondern auch als Veterinärmedikamente insbesondere für die Zwecke der Viehzucht sind. Der Erfindung liegen die vorstehenden überraschenden Feststellungen zugrunde.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen dargelegten Gegenstände.

Zur Vereinfachung wird mit Reagens (A) die L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment, das eine L-Pyroglutaminsäureeinheit an seinem N-endständigen Teil und gleichzeitig anschließend daran die Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel (I) enthält, bezeichnet, und die mit dem Reagens (A) zu kondensierende Aminkomponente, die dem restlichen Teil des vorstehend genannten, als Produkt gewünschten Nonapeptidamids (I) entspricht, als Reagens (B).

Die Reagentien (A) und (B) sind wahlweise geschützt. Das Reagens (A) hat somit die folgende Beziehung zum Reagens (B):

Methode	Reagens (A)	Reagens (B)
Nr.
1	H-(Pyr)Glu-OH	H-His-Trp-Ser-A,-
		GIy-A₂-Arg-Pro-Y
2	H-(Pyr)Glu-His-OH	H-Trp-Ser-Aj-Gly-
		A₂-Arg-Pro-Y
3	H-(Pyr)GIu-His-	H-Ser-A_rGIy-A₂-
	Trp-OH	Arg-Pro-Y
4	H-(Pyr)Glu-His-Trp-	H-A,-Glv-A,-Arg-
	Ser-OH	Pro-Y
5	H-(Pyr)GIu-His-Trp-	H-Gly-Aj-Arg-Pro-Y
	Ser-Λ,-ΟΗ
6	H-(Pyr)Glu-His-Trp-	H-A₂-Arg-Pro-Y
	Ser-A,-Gly-OH
7	H-(Pyr)Glu-His-Trp-	H-Arg-Pro-Y
	Ser-A,-Gly-A₂-OH
8	H-(Pyr)Giu-His-Trp-	H-Pro-Y
	Ser-A,-Gly-A,-
	Arg-OH
9	H-(Pyr)Glu-His-Trp-	H-Y
	Ser-A,-Gly-A,-Arg-
	Pro-OH

15

20 bekannter Weise durchgeführt werden. Die Kondensation gemäß der Erfindung kann somit vorgenommen werden, indem man in einer ersten Stufe die C-endständige Carboxylgruppe des Reagens (A) oder die N-endständige Aminogruppe des Reagens (B) aktiviert und in der zweiten Stufe die Bildungsreakticn der Peptidbindung zwischen dem aktivierten Reagens (A) und dem Reagens (B) oder zwischen dem Reagens (A) und dem aktivierten Reagens (B) durchführt oder als Alternative die Bildungsreaktion der Peptidbindung zwischen dem Reagens (A) und dem Reagens (B) in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels durchführt, wobei die Reagentien (A) und (B) wahlweise geschützt sind.

Es ist ferner bekannt, daß in Fällen, in denen die vorstehend genannten funktioneilen Gruppen durch eine oder mehrere Schutzgruppen vor der Kondensationsreaktion geschützt werden, die schützende Gruppe oder schützenden Gruppen nach der Kondensationsreaktion entfernt werden. Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die Entfernung der Schutzgruppen ebenfalls in bekannter Weise vorgenommen werden.

Es ist in diesem Zusammenhang ebenfalls bekannt, daß eine geschützte L-Glutamylgruppe der allgemeinen Formel

Wenn eine Verbindung aus der linken Spalte als Reagens (A) verwendet wird, wird die Verbindung in der rechten Spalte in der gleichen Zeile als Reagens (B), d. h., als entsprechende Gegenverbindung des Reagens (A), bei der Kondensationsreaktion verwendet. Die Reagentien (A) und/oder (B) können vor der Kondensationsreaktion geschützt oder während der Kondensationsrekation, genauer gesagt, vor der Bildungsreaktion der Peptidbindung, aktiviert werden. Hierauf wird nachstehend ausführlicher eingegangen. Wie dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannt ist, können alle Arten von Peptiden durch Kondensation einer Aminosäure oder eines Peptidfragments (d. h. <fo eines Peptids mit weniger Einheiten) mit einer Aminosäure oder einem Peptidfragment (d. h. Peptid mit weniger Einheiten) hergestellt werden. Eine Anzahl ausgereifter Verfahren zur Durchführung der Kondensationsreaktion ist bereits entwickelt worden.

Beispielsweise kann man die funktioneile Gruppe oder die funktioneilen Gruppen (z. B. die Aminogruppe, Carboxylgruppe, Hydroxylgruppe, Guanidingruppe), die an der Bildungsreaktion der Peptidbindung (d.h. -CONH-) über die Kondensationsreaktion nicht beteiligt sind, vor der Kondensationsreaktion durch die Schutzgruppe oder Schutzgruppen schützen. Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann man die nicht an der Kondensationsreaktion teilnehmenden funktioneilen Gruppen von Reagens (A) oder (B) ebenfalls nach an sich bekannten Methoden schützen.

Bekanntlich wird vor der Bildungsreaktion der Peptidbindung die C-endständige Carboxylgruppe oder die N-endständige Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Peptidfragments, die an der Bildungsreaktion der Peptidbindung beteiligt ist, aktiviert, damit sie die Bildung der Peptidbindung zustande bringt, und, wenn die Aktivierung nicht erfolgt, die Bildungsreaktion der Peptidbindung wird in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels durchgeführt. Verfahren zur Aktivierung der C-endständigen Carboxylgruppe sowie der N-endständigen Aminogruppe sind allgemein bekannt. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in an sich RCO — CH₂CH₂CH(NH₂)CO —

in der R ein Alkoxyrest (z. B. ein Methoxyrest, Äthoxyrest, n-Propoxyrest, Isopropoxyrest oder n-Butoxyrest), ein Aralkyloxyrest (z. B. ein Benzyloxyrest) oder eine Aminogruppe ist, sich durch Umsetzung mit einer Base (z. B. Ammoniak) oder einer Säure (z. B. Essigsäure) leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst

CO-

O H
V^N

umwandeln läßt, und daß die Gruppe (II) hierbei der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist. Beim Verfahren gemäß der Erfindung ist vorauszusetzen, daß das L-Pyroglutamyl (d.h. H—(Pyr)Glu —) des Reagens (A) nicht nur die L-Pyroglutamylgruppe selbst, sondern auch die geschützte L-Glutamylgruppe der Formel (II) einschließt. Wenn H-(Pyr)Glu- des Reagens (A) die Gruppe (II) ist, läßt sich diese in an sich bekannter Weise leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umwandeln.

Nachstehend werden einige Verfahren aufgeführt, die vorteilhaft zur Durchführung der Bildungsreaktion der Peptidbindung gemäß der Erfindung angewandt werden können.

I) Das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe eine freie Carboxylgruppe ist, wird mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B), dessen N-endständige Aminogruppe eine freie Aminogruppe ist, in Gegenwart eines Kondensationsmittels umgesetzt.

II) Das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe aktiviert worden ist, wird mit dem Reagens (B) umgesetzt, dessen N-endständige Aminogruppe eine freie Aminogruppe ist.

III) Das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe frei ist, wird mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B) umgesetzt, dessen N-endständige Aminogruppe aktiviert worden ist.

Als Schutzgruppe für die innermolekulare Acylaminogruppe der L-Pyroglutaminsäure kommen somit beispielsweise die Benzylnxycarbonylgruppe, terL-Butoxycarbonylgruppe und Isobornyloxycarbonylgruppe, als Schutzgruppe für die Iminogruppe von L-Histidin beispielsweise die Benzylgruppe, Tosylgruppe, 2,4-Dinitrophenylgruppe, tert-Butoxycarbonylgruppe und Carbobenzoxygruppe, als Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von L-Serin beispielsweise ätherbildende Gruppen, z. B. die Benzylgruppe und tert-Buty'gruppe, als Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyrosin beispielsweise ätherbildende Gruppen, z. B. die Benzylgruppe und tert-Butylgruppe, und als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von L-Arginin beispielsweise die Nitrogruppe, Tosylgruppe, Carbobenzoxygruppe, Isobornyloxycarbonylgruppe und Adamantyloxycarbonylgruppe in Frage. Ferner kann die Guanidinogruppe von L-Arginin durch Salzbildung mit einem Proton, das von einer Säure (z. B. Salzsäure und Bromwasserstoffsäure) abgeleitet ist, geschützt werden. Natürlich ist das Proton im Rahmen dieser Beschreibung als zu den Schutzgruppen gehörend anzusehen.

Als Beispiele der aktivierten Form der C-endständigen Carboxylgruppe des Reagens (A) sind die entsprechenden Säureanhydride, z. B. die gemischten Anhydride mit einem Kohlensäuremonoalkylester, Azide und aktiven Ester (z. B. die entsprechenden Ester mit Alkoholen wie Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanmethylalkohol, p-Nitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, N-Hydroxyphthalimid und N-Hydroxybenztriazol) zu nennen. Von diesen Estern wird der N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester bevorzugt. Die N-Hydroxy-S-norbornen^.S-dicarboximidester von Aminosäuren oder Peptiden sind zwar neu, können jedoch in der gleichen Weise wie die N-Hydroxysuccinimidester von Aminosäuren oder Peptiden hergestellt werden.

Das entsprechende Amid der phosphorigen Säure ist ein Beispiel einer aktivierten Form der N-endständigen Aminogruppe des geschützten oder ungeschützten Reagens (B).

Als Dehydratisierungsmittel können alle Verbindungen der Art, die für die Peptidsynthese geeignet bind, verwendet werden. Besonders bevorzugt werden beispielsweise die sogenannten Carbodiimidreagentien, z. B. Dicyclohexylcarbodümid.

ίο Zur Durchführung der Kondensationsreaktion gemäß der Erfindung können natürlich in einen einzelnen Reaktor

1) das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe frei ist,

2) das geschützte oder ungeschützte Reagens (B),

dessen N-endständige Aminogruppe frei ist,
3) der vorstehend genannte Alkohol (z. B. N-Hydroxy-5-norbornen-23-dicarboximid oder N-Hydroxysuccinimid) und

4) das Dehydratisierungsmittel gegeben werden.
In diesem Fall reagiert zuerst das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe frei ist, mit dem Alkohol mit Hilfe des Dehydratisierungsmittels unter Bildung des geschützten oder ungeschützten Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe aktiviert ist, worauf das letztere mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B), dessen N-endständige Aminogruppe frei ist, reagiert Bei diesem Prozeß werden die Aktivierung der C-endständigen Carboxylgruppe und die Bildungsreaktion der Peptidbindung in einem Einstufenverfahren durchgeführt.

Für die Herstellung der vorstehend beschriebenen, als Produkte gewünschten Peptide stehen somit die verschiedensten Kombinationen von Verfahren zur Auswahl. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ist nachstehend schematisch dargestellt:

(I) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A,-Gly-OH (Reagens (A)) + DCC + HONBl

Aktivierung

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A,-Gly-ONBI + H-A₂- Arg-Pro-Y

(Aktiviertes Reagens (A)) (Geschütztes
Reagens (B))

Bildung der Peptidbindung

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A_rGly-A₂-Arg-Pro-Y Entfernung der Schutzgruppen

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A,-Gly-A₂-Arg-Pro-Y

(11) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A|-Gly-OH ι- H-A,-Arg-Pro-Y

(Reagens (A))
+ DCC + HONBl

(Geschütztes Reagens (B))

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A_rGly-A₂-Arg-l'ro-Y

Entfernung der Schutzgruppen

H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-A|-Gly-A_rArg-Pro-Y

Im vorstehenden Schema bedeuten DCC das N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid, HONBI das N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid und Z eine Schutzgruppe der Guanidinogruppe des L-Argininrestes.

Die Bildungsreaktion der Peptidbindung, z. B. nach den vorstehend genannten Verfahren (I), (II) oder (III), wird im allgemeinen in einem Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungsmittel eignen sich beispielsweise trockenes oder wäßriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan. Tetrahydrofuran und Gemische dieser Lösungsmittel.

Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von etwa —20° bis 3O⁰C, jedoch kann die Reaktion auch bei niedrigeren Temperaturen oder unter Erhitzen durchgeführt werden.

Die beiden Ausgangsmaterialien, die eine Peptidbindung bilden sollen, werden gewöhnlich in äquimolaren Mengen verwendet, jedoch sind gegebenenfalls auch andere Mengenverhältnisse geeignet Im allgemeinen werden für jedes molare Äquivalent eines Ausgangsmaterials gewöhnlich etwa 1 bis 2 molare Äquivalente, vorzugsweise etwa 1 bis 1,4 molare Äquivalente der zugehörigen Verbindung (d. h. der Gegenverbindung) verwendet. Der Anteil des Dehydratisierungsmittels beträgt im allgemeinen etwa 1 bis 2 molare Äquivalente, bezogen auf das Wasser, das bei der Bildungsreaktion der Peptidbindung gebildet wird.

Gute Ergebnisse werden in vielen Fällen erhalten, wenn die Reaktion etwa 6 bis 10 Stunden durchgeführt wird.

Nach Beendigung der Bfldungsreaktion der Peptidbindung kann das Reaktionsprodukt beispielsweise durch Ausfällung mit einem Lösungsmittel (in dem die gewünschte Verbindung schwer löslich ist) und anschließendes Abfiltrieren der gebildeten Fällung isoliert werden.

Wenn das Reagens (A) und/oder das Reagens (B) durch die Schutzgruppe oder Schutzgruppen geschützt sind, enthält das Kondensationsprodukt im allgemeinen die Schutzgruppe oder Schutzgruppen in seinem Molekül Wie bereits erwähnt, werden jedoch die Schutzgruppe oder Schutzgruppen nach üblichen Methoden entfernt, die die Aminosäuresequenz des gewünschten Nonapepödamidderivats nicht beeinträchtigen. Nach der Entfernung der Schutzgruppen bleibt das von Schutzgruppen freie Nonapeptidamidderivat (I) zurück.

Als Beispiele solcher üblichen Verfahren sind die katalytische Reduktion mit einem Katalysator wie Palladiumschwarz, Palladiumkohle oder Platin, die Säurehydrolyse beispielsweise mit Fluorwasserstoff oder Trifluoressigsäure und die chemische Reduktion beispielsweise mit Natriummetall in flüssigem Ammoniak zu nennen. Bei jedem dieser Verfahren kann die gewünschte Verbindung nach üblichen Methoden, z. B.

durch die oben beschriebene Ausfällung, isoliert werden.

Das in dieser Weise isolierte Endprodukt kann nach

üblichen Methoden, z. B. durch Säulenchromatographie beispielsweise an Carboxymethylcellulose und handelsüblichen Polymerisaten für die Reinigung, z. B. an den Ionenaustauscherharzen »Sephadex®« oder »Amberlite® XAD-2«, gereinigt werden.

In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen wird die gewünschte Verbindung in Form einer Base oder als Salz einschließlich der pharmazeutisch unbedenklichen Salze erhalten. Aus dem Salz kann die Base nach üblichen Verfahren hergestellt werden, und die Base kann durch Umsetzung mit Säuren, die für die Herstellung pharmazeutisch unbedenklicher Salze geeignet sind, in Salze umgewandelt werden. Als Säuren eignen sich für diesen Zweck verschiedene anorganische Säuren, z. B. Halogenwasserstoffsäuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, und verschiedene organische Säuren, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranylsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure und Sulfanilsäure.

Aufgrund ihrer äußerst geringen Toxizität können die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten Nonapeptidamide oder ihre pharmazeutisch unbedenklichen Salze unbedenklich verabreicht werden. Diese Verbindungen zeigen eine starke ovulationsinduzieren de Wirkung.

Wenn Ratten eine winzige Menge (z.B. 50 bis 500ng/100g) eines Nonapeptidamids (I) oder dessen pharmazeutisch unbedenklichen Salzes intravenös.

intramuskulär oder subkutan erhalten, ist ein steiler Anstieg der Konzentration des luteinisierenden Hormons und des follikelstimulierenden Hormons im Blut festzustellen.

Wenn Ratten eine Infusion von 10 bis 200ng/100g der Verbindung intravenös oder intramuskulär erhalten, wird die Ovulation bei etwa 50% der Ratten ausgelöst. Wenn die Ratten eine Infusion von 0,1 bis 5 μg/100 gder Verbindung intravenös oder intramuskulär erhalten, wird die Ovulation bei 100% der als Versuchstiere verwendeten Ratten ausgelöst, auch wenn die Ratten sich im Diöstrus befinden. Bei unveränderter Dosis ist die intravenöse Infusion im allgemeinen doppelt so wirksam wie die subkutane Infusion.

Die vorstehenden Werte zeigen, daß die Peptide gemäß der Erfändung stärkere Hormonwirkungen haben als das natürlich vorkommende, die Sekretion des luteinisierenden Hormons auslösende Hormon.

Injektionslösungen können durch Auflösen der Verbindungen gemäß der Erfindung in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt werden.

Da diese Verbindungen auch bei Verwendung in sehr winzigen Mengen eine genügende physiologische Wirkung aufweisen, ist es zweckmäßig, sie als gefriergetrocknete Ampullenpräparate, die Mannit als Hilfsstoff enthalten, zu verwenden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen werden die folgenden Abkürzungen mit den nachstehend genannten Bedeutungen verwendet:

Z-:	Benzyloxycarbonyl;
IBOC-:	Isobomyloxycarbonyl;
BOC- :	tert.- Butyloxycarbany 1;
-OEt:	Äthylester:
-OSU:	N-Hydroxysuccinimidester;
-OtBu:	tert.-Butylester;
-ONDP:	2,4-Dinitrophenolester;
-ONBl:	N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbon
	säureimidester;
HONBl:	N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbon
	säureamid;
DCC:	Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid;
DMF:	N,N-Dimethylformamid;
DSC:	Dünnschichtchromatographie;
DCHA:	Dicyclohexylamin.

Rf 1 = Chloroform-Methanol-Essigsäure

(9:1: 0,5)
Rf 2 = Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser

(60:20:6:11)
Rf 3 = n-Butanol-Athylacetat-Essigsäure-Wasser

(1:1:1:1)
Rf 4 = n-Butanol-Essigsäure-Wasser

(4:1:1)
Rf 5 = n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser

(30:20:6:24)

Haas Co., USA); »Sephadex LH 20« (verestertes Dextrangel, Hersteller Pharmacia Fine Chemicals, Sweden); »Amberlite XAD-2« (makroreükuläres Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat) und »Amberlite IRA-400« (Copolymerisat von tertiärem Amin, Styrol und Divinylbenzol, Hersteller Rohm & Haas Co., USA).

Beispiel 1

Herstellung von

K) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅

a) Herstellung von Z-A^(NO₂J-PrO-NHC₂H₅

In 10 Raumteilen DMF werden 0,901 Gew.-Teile Z-Arg(NO₂)-Pro-OH und 0,181 Gew.-Teile Äthylaminhydrochlorid gelöst. Während bei 0°C gehalten wird, werden 0,38 Raumteile Triäthylamtn zugetropft. Nach Zusatz von 0,43 Gew.-Teilen HONBl und 0,495 Gew.-Teilen DCC wird das Gemisch 5 Stunden bei 0⁰C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Chloroform wird abdestilliert und der Rückstand mit Äther behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt.
Ausbeute 0,692 Gew.-Teile; Rf 1 =0,50;
Schmelzpunkt 141° - 145°C(Zers.);
[α] " = 44,6° (C= 1, Methanol).

Elementaranalyse:

20

25

30

35

40

45

Für die Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Entwicklerlösungsmittelsysteme verwendet:

50

55

60

In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter. Die Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen, falls nicht anders angegeben. Die folgenden Ionenaustauscherharze werden verwendet:

»Amberlite CG-400« (Copolymerisat von tertiärem Amin, Styrol und Divinylbenzol, Hersteller Rohm&

Berechnet	für	C 52,82.	H 6,54,	N	20,53;
C₂₁H₃₁O₆N	7:	C 52.95.	H 6,77,	N	19,65.
gefunden:

b) Herstellung von Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHC₂H₅

In 5 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure werden 0,572 Gew.-Teile Z-Arg(NO₂)-Pro-NHC₂H₅ gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird trockener Äther zum Reaktionsgemisch gegeben und die gebildete Fällung H-Arg(NO₂)-Pro-NHC2H5 abfiltriert und getrocknet. Getrennt hiervon werden 0,291 Gew.-Teile Z-Leu-OH in 5 Raumteilen Dioxan gelöst. Unter Kühlen werden 0,247 Gew.-Teile DCC und 0,215 Gew.-Teile HONBI zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt und der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff abfiltriert. Zum Filtrat wird die in der oben beschriebenen Weise erhaltene Fällung gegeben, die durch Zusatz von 3 Raumteilen DMF gelöst wird. Während gekühlt wird, werden 0,17 Raumteile Triäthylamin zugetropft, worauf das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand mit Chloroform extrahiert und mit Wasser gewaschen. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Chloroform abdestilliert Der Rückstand wird mit Äther behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt
Ausbeute 0,47 Gew.-Teile (72%);
Schmelzpunkt 144° -146°C(Zers.);
Rf 1 =0,40; [λ]? = -58,0° (c= 1, Methanol).

c) In 25% HBr-Essigsäure werden 0,165 Gew.-Teile Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHC2H5 gelöst Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird trockener Äther dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die gebildete Fällung abfiltriert und gut getrocknet Diese Fällung wird in 3 Raumteilen DMF gelöst

Während gekühlt und gerührt wird, werden 0,05 Raumteile N-Äthylmorpholin zugetropft. In dieser Lösung werden 0,19 Raumteile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid gelöst. Zur Lösung werden 0,054 Gew.-Teile HONBI und 0,062 Gew.-Teile DCC gegeben.

Das Gemisch wird 2 Stunden bei 0° und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird mit Äthylacetat in behandelt, wobei 0,32 Gew.-Teile eines Pulvers erhalten werden. Dieses Produkt wird auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben und in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem wäßrigem Äthanol bis Äthanol desorbiert. Die Hauptfraktion wird 15 gefriergetrocknet, wobei 0,11 Raumteile reines H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHC₂Hs erhalten werden. Dieses Produkt wird 1 Stunde mit 4 Raumteilen Fluorwasserstoff bei 0°C in Gegenwart von 0,02 Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen 2» Mercaptoäthanol behandelt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert und der Rückstand nach der Trocknung in Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule von Amberlite IRA-400 (Acetatform) geleitet und dann an einer Carboxymethylcellulosesäule adsorbiert. Die Sau- 2^r> Ie wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von wäßrigem 0.005N Ammoniumacetat bis zu wäßrigem 0,2N Ammoniumacetat eluiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet. Hierbei werden 0,087 C₂OH₄₀O₇Ns: C 5^,15, H 7,02, Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly- 30 gefunden: C54-.37, H 6,98, Leu-Arg-PrO-NHC₂H₅ erhalten.
Rf 3 = 0,36;
[λ];- = -56,2° (f=O,5,5% Essigsäure).

Aminosäureanalyse:

His 0,95 (1); Arg 0,98 (1); Ser 0,95 (1); GIu 0,98(1), Pro 1,00(1); GIy 1,00(1);
Leu l,00(l);Tyrl,00(l);NH₂C₂H₅1,10(1).

Die Klammerzahlen sind die berechneten Werte.

Beispiel 2
Herstellung von

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHCH₃

a) Herstellung von Z-Arg(NO₂)-Pro-NHCH₃

In 5 Raumteilen DMF werden 0,675 Gew.-Teile Z-Arg(N0₂)-Pro-OH und 0,101 Gew.-Teile Methylaminhydrochlorid gelöst Während die Lösung bei 0⁰C gehalten wird, werden 0,21 Raumteile Triäthylamin zugetropft Nach Zusatz von 0.322 Gew.-Teilen HONBI und 0,37 Gew.-Teilen DCC wird das Gemisch 5 Stunden bei 0⁰C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert Der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesium Magnesiumsulfat getrocknet Das Chloroform wird abdestilliert und der Rückstand mit Äthanol behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt
Ausbeute 0,612 Gew.-Teile (88%);
Rf 1 =030; Schmelzpunkt 137° - 143°C(Zers.);
[α]? 41,5° (c= 1,Methanol).

Elementaranalyse:

Berechnet für

C₂₀H₂₉O₆N₇: C 51,82, H 631, N 21,15;
gefunden: C 51,84, H 6,54, N 21,57.

60

65

b) Herstellung von Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHCHj

In 5 Gew.-Teilen 25% HBr-Essigsäure werden 0,556 Gew.-Teile Z-Arg(NO₂)-Pro-NHCH₃gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird trockener Äther zugesetzt, worauf die gebildeten Kristalle abfiltriert und getrocknet werden. Getrennt hiervon werden 0,312 Gew.-Teile Z-Leu-OH in 5 Raumteilen Dioxan-Äthylacetat (1 :1) gelöst. Während die Lösung gekühlt wird, werden 0,268 Gew.-Teile DCC und 0,232 Gew.-Teile HONBl zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert. Zum Filtrat werden die in der oben beschriebenen Weise hergestellten Kristalle gegeben und durch Zusatz von 3 Raumteilen DMF gelöst. Während gekühlt wird, werden 0,17 Raumteile Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert. Der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert und mit V/asser gewaschen. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert, worauf das Chloroform abdestilliert wird Der Rückstand wird mit Äther behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt
Ausbeute 0,45 Gew.-Teile (78%); Rf 1 =0,25.

Elementaranalyse:

Berechnet für

N 19,43;
N 19.52.

c) In 5 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure werden 0,144 Gew.-Teile Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHCH₃ gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf trockener Äther zugesetzt wird. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und gut getrocknet. Sie wird dann in 3 Raumteilen DMF gelöst. Während die Lösung gekühlt und gerührt wird, werden 0,05 Raumteile N-Äthylmorpholin zugetropft

In dieser Lösung werden 0,19 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrorhlorid gelöst. Zur Lösung werden 0,054 Gew.-Teile HONBl und 0,062 Gew.-Teile DCC gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 0⁰C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert Der Rückstand wird auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben und in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem wäßrigem Äthanol bis Äthanol desorbiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,137 Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHCH₃ erhalten werden. 0,09 Gew.-Teile dieses Produktes werden mit 4 Gew.-Teilen Fluorwasserstoff in Gegenwart von 0,02 Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen Mercaptoäthanol 1 Stunde bei 0° C behandelt Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert und der Rückstand nach dem Trocknen in Wasser gelöst Die Lösung wird durch Amberlite IRA-400 (Acetatform) geleitet und dann an einer Säule von Carboxymethylcellulose adsorbiert Die Säule wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von wäßrigem 0,005N Ammoniumacetat bis zu wäßrigem 0,2N Ammoniumacetat eluiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet Hierbei werden 0,06 Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHCH₃ erhalten.

Rf 3=037; [α]? = -55,6° (c=0,5 5%iger wäßriger Essigsäurelösung).

Aminosäureanalyse:

His 0,96(1); Arg 0,98 (l);Ser 0,96(1); GIu 1,00(1); Pro 1,00(1);GIy 1,00(1); Leu 0,98(1); Ty r 0,98(1); NH₂CH₃1,12(1).

Die Klammerzahlen sind die berechneten Werte.

Beispiel 3

Herstellung von

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Pyrrolidid

a) Herstellung von IBOC-Pro-Pyrrolidid

In 30 Raumteilen Acetonitril werden 11,7 Gew.-Teile IBOC-Pro-OSU und 2,3 Raumteile Pyrrolidin gelöst. Die Lösung wird über Nacht gerührt. Das Acetonitril wird abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert. Das Äthylacetat wird abdestilliert Die erhaltenen Kristalle werden aus Äthylacetat-Erdölbenzin umkristallisiert. Ausbeute 8,4 Raumteile (80,2%);
Schmelzpunkt 84° -84,5°C;
[<x] =-83,4° (c= 1.0, Methanol).

Elementaranalyse:

Berechnet für

C₂₀H₃₂O₃N,: C 68,93, H 9,26, N 8,04;

gefunden: C 68,93, H 9,43, N 8,17.

b) Herstellung von

IBOC- Arg(N O₂)- Pro- Py rrolidid

In 30 Raumteilen Trifluoressigsäure werden 6,96 Gew.-Teile IBOC-Pro-Pyrrolidid gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Zur Lösung wird trockener Äther gegeben. Das erhaltene öl wird durch Dekantieren isoliert und in einem Exsiccator, der Natriumhydroxyd enthält, getrocknet Getrennt hiervon werden 7,98 Gew.-Teile lBOC-Arg(NO₂)-OH in 40 Raumteilen Acetonitril gelöst. Während die Lösung bei 0°C gehalten wird, v/erden 4,0 Gew.-Teile Dinitropheno! und 4,6 Gew.-Teile DCC zugesetzt worauf 2 Stunden gerührt wird. Der als Nebenprodukt gehildete Harnstoff wird abfiltriert und das in der oben beschriebenen Weise erhaltene Öl dem Filtrat zugesetzt Das Gemisch wird auf 0°C gekühlt, worauf 2,5 Raumteile N-Äthylmorpholin zugetropft werden. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Acetonitril wird abdestilliert und der Rückstand an 100 Gew.-Teilen Kieselgel adsorbiert und mit 5%igem wäßrigem Methanol desorbiert Nach dieser Reinigung wird das Lösungsmittel abdestilliert wobei 6,0 Gew.-Teile eines Pulvers erhalten werden. Ausbeute 54,5%;

Schmelzpunkt 190° - 193°C (Zers.); [«]'.· = -59,7° (c= 1,Methanol).

Elementaranalyse:

Berechnet für

C₂₆H₄₃O₆N₇: C 56,82, H 7,88, N 17,84;

gefunden: C 57,00, H 8,26, N 17,51.

c) Herstellung von IBOC-Leu-Arg(NO2)-Pro-Pyrrolidid

In 30 Raumteilen Trifluoressigsäure werden 5,49 Gew.-Teile IBOC-Arg(NO₂)-Pro-Pyrrolidid gelöst Die

60

65 Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird trockener Äther zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und gut getrocknet, wobei ein Pulver erhalten wird. Getrennt hiervon werden 3,95 Gew.-Teile IBOC-Leu-OH in 20 Raumteilen Dioxan gelöst. Während die Lösung bei O⁰C gehalten wird, werden 1,52 Gew.-Teile N-Hydroxysuccinimid und 2,7 Gew.-Teile DCC zugesetzt, worauf das Gemisch 2 Stunden gerührt wird. Der als Nebenprodukt abgeschiedene Harnstoff wird abfiltriert. Zum Filtrat wird das in der oben beschriebenen Weise erhaltene Pulver gegeben, worauf 10 Raumteile Tetrahydrofuran zugesetzt werden. Das Gemisch wird auf 0°C gekühlt, worauf 1,4 Raumteile Triethylamin zugetropft werden. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, das Lösungsmittel abdestillierl und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit einer 5%igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und einer 10%igen wäßrigen Citronensäurelösung gewaschen. Er wird dann mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert. Das Äthylacetat wird abdestilliert und der Rückstand mit Erdölbenzin gewaschen. Der Rückstand wird dann aus Äthylacetat-Erdölbenzin erneut ausgefällt.
Ausbeute 5,8 Gew.-Teile;
Schmelzpunkt 185° - 186°C (Zers.);
[öl]: = -53,6° (C= 0,98,Methanol).

Elementaranalyse:

Berechnet für C32H54O7N8 · H₂O:

C 56,45, H 8,29, N 16,46;
gefunden: C 56,97, H 8,17, N 15,25.

d) In 50 Raumteilen Methanol werden 0,22 Gew.-Teile IBOC-Leu-Arg(NO₂)-Pro-Pyrrolidid gelöst. Die Lösung wird 8 Stunden der Hydrierung in Gegenwart von Palladiumschwarz unterworfen. Das Methanol wird abdestilliert und der Rückstand mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver wird in einem Gemisch von 5 Raumteilen Trifluoressigsäure und 1 Raumteil 2N HCl-Essigsäure gelöst. Die Lösung wird 40 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Trifluoressigsäure wird abdestilliert, worauf trockener Äther zugesetzt wird. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und gut getrocknet Dieses Pulver (0,153 Gew.-Teile) wird in 3 Raumteilen DMF zusammen mit 0,24 Gew.-Teilen H-(Pyr-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid gelöst. Zur Lösung werden 0,0742 Gew.-Teile DCC, 0,0644 Gew.-Teile HONBI und 0.084 Raumteile N-Äthylmorpholin gegeben. Das Gemisch wird 5 Stunden bei 0°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert Zum Filtrat wird Äthyiacetat gegeben. Die Faiiung wird filtriert und in einer Menge von 0,26 Gew.-Teilen gewonnen. Eine Menge von 0,2 Gew.-Teilen dieses Produktes wird an einer Säule von Amberlite® XAD-2 adsorbiert und in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem wäßrigem _Äthanol (180 Raumteile) bis zu 50%igem wäßrigem Äthanol eluiert Die Fraktionen, die scharf abgegrenzte Zonen bei der Dünnschichtchromatographie (Kieselgel) bilden, werden aufgefangen und gefriergetrocknet
Die Ausbeute beträgt 0,02 Gew.-Teile.
[α]? = -91,0° (c= 0,5,5% Essigsäure;
Papierchromatographie: Rf=0,72 (n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 30:20:6:24).

Aminsäureanalyse:

His 1,09(1): Arg 0,96 (l);.Ser 0,82(1);
GIu 1,00(1); Pro 0,96~;);Gly 1,00(1);
Leu 1,00(1); Tyr 0,96(1).

Beispiel 4

Herstellung von

H-(Pyr)G Iu-H is-Trp-Ser-Tyr-

Gly-Nle-Arg-Pro-NH-CH₂CH₃

a) Herstellung von
Z-NIe-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CHj

In 4 Raumteilen 25% Bromwasserstoff-Essigsäure werden 0,4775 Gew.-Teile Z-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃ gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann werden 50 Raumteile trockener Äther zum Reaktionsgemisch gegeben. Die abgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen und über Natriumhydroxyd unter vermindertem Druck getrocknet. Getrennt hiervon werden 0,2653 Gew.-Teile Z-NIe-OH in einem Gemisch von 2 Raumteilen Äthylacetat und 12 Raumteilen Dioxan gelöst. Während die Lösung bei 0°C gehalten wird, werden 0,197 Gew.-Teile HONBI und 0,226 Gew.-Teile DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden gerührt Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriiert und das Filtrat zu einer Lösung der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Fällung in 1 Raumteil DMF gegeben, worauf 0,28 Raumteile Triäthylamin zugetropfl werden. Das Gemisch wird über Nacht gerührt, das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit 100 Raumteilen Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird mit 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser, 0,5N Salzsäure und Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert Das Chloroform wird abdeütilliert und der Rückstand mit Äther behandelt und aus Äthanol-Äther erneut ausgefällt.

Die Ausbeute beträgt 0,41 Gew.-Teile;
Schmelzpunkt 109° -11 l°C(Zers.);
[«]-;■ = -50,4° (C= 0,5,Äthanol).

Elementaranalyse:

Berechnet für C₂₇H₄₂O₇N₈ · 0,5 H₂O:

C 54,07, H 7,22, N 18,68;
gefunden: C 53,79, H 7,09, N 18,24.

In 2 Raumteilen 25% Bromwasserstoff-Essigsäure werden 0.155 Gew.-Teile Z-Nle-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH2CH3 gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann werden 50 Raumteile trockener Äther zum Reaktionsgemisch gegeben. Die abgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen und über Natriumhydroxyd unter vermindertem Druck getrocknet.

Die Fällung wird in 2 Raumteilen DMF gelöst. Während die Lösung bei 0° C gehalten wird, werden 0,19 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid, 0,09 Gew.-Teile HONBI, 0,103 Gew.-Teile DCC und 0,1 Raumteil N-Äthylmorpholin in dieser Reihenfolge zugegeben. Das Gemisch wird 5 Stunden bei 0°C und 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt abgeschiedene Harnstoff wird abfiltriert und das DMF unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 4 Raumteilen

5%igem wäßrigem Äthanol zusammen mit 0,2 Gew.-Teilen Harnstoff gelöst Die Lösung wird an einer Säule von Amberlite XAD-2 adsorbiert und in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem ) wäßrigem Äthanol bis 80%igem wäßrigem Äthanol desorbiert Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,067 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-GIy-Nle-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃ erhalten werden. Eine Menge von 0,060 Gew.-Teilen dieses Produktes

1« wird in 4 Raumteilen Fluorwasserstoff bei — 50⁰C in Gegenwart von 0,05 Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen 2-Mercaptoäthanol gelöst Die Lösung wird 1 Stunde bei 0°C gerührt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der

υ Rückstand in einem Natriumhydroxyd enthaltenden Exsiccator getrocknet. Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Wasser gelöst und die Lösung durch Amberlite CG-400 (Acetatform) geleitet. Der Ablauf wird gefriergetrocknet und auf eine Säule von

-'« Carboxymethylcellulose aufgegeben. Er wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 0.005N Ammoniumacetat bis 0,2N Ammoniumacetat desorbiert Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,035 Gew.-Teile des gewünschten Produktes erhalten werden. Dieses P. odukt wird auf eine Säule von »Sephadex LH-20« aufgegeben und mit 0,1 N Essigsäure desorbiert. Die homogene Fraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,028 Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Nle-Arg-Pro-NH-CH₂CH₃ erhalten werden.

[λ] = -52,2° (c= 0,5,5%ige Essigsäure).

Aminosäureanalyse:

His 1,00(1); Arg l,02(l);Trp 1,00(1);

SerO,91 (l);Glu 1,00(1); Pro 1,05(1);

GIy 0,98 (l);Tyr 1,00(1); Nie 1,02(1).

Beispiel 5

Herstellung von

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-

Gly-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂CH₃

a) Herstellung von Z-Ser-Phe-Gly-OEt

2,5 Gew.-Teile Z-Phe-Gly-OEt werden in 50 Raumteilen Methanol gelöst. Die Lösung wird 4 Stunden der katalytischen Reduktion mit 5%iger Palladiumkohle unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 2,6 Gew.-Teile Z-Ser-ODNP gegeben. Das Gemisch wird 8 Stunden gerührt Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat gelöst Das Lösungsmittel wird mit 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, IN Salzsäure und Wasser gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der feste Rückstand aus Äthylacetat-Erdölbenzin

to kristallisiert

Die Ausbeute beträgt 1,75 Gew.-Teile (74,2%):
Schmelzpunkt 128° -129° C;
[«]{.· = -26,6° (c= 0,6,Äthanol).

b) Herstellung von Z-Ser-Phe-Gly-NHNH₂

1,65 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly-OEt werden in 20 Raumteilen Methanol gelöst. Zur Lösung werden 0,71 Raumteile Hydrazinhyd at gegeben. Das Gemisch wird 8 Stunden stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert und mit Methanol-Äther (1:1) gewaschen.

Die Ausbeute beträgt 1,6 Gew.-Teile (100%);
Schmelzpunkt 191 ° -193° C;
[α]-,· = -23,0° (c= 2, DMF).

Elementaranalyse:

Berechnet für

CmHvN₅O₆: C 57,76, H 5,95, N 15,31;

gefunden: C57.32, H 6,21, N 15,53.

c) Herstellung von

Z-Ser-Phe-Gly-Leu-

Arg(NO₂)-Pro-NH-CI-bCHj

0,8 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly-NHNH₂ werden in 10 Raumteilen DMF gelöst. Die Lösung wird gekühlt. Dann werden 3,5 Raumteile 2N Salzsäure zugesetzt. Während bei — 6°C gerührt wird, wird eine wäßrige 2N Natriumnitritlösung zugesetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten der Reaktion überlassen. Die Fällung wird durch Zugabe von 10 Raumteilen DMF gelöst. Zum Reaktionsgcmisch wird eine gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung gegeben, worauf mit Äthylacetat extrahiert wird. Der Extrakt wird mit der Waschflüssigkeit zusammengegossen. Die Lösung wird mit 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die Äthylacetatschicht (80 Raumteile) wird über Natriumsulfat getrocknet und dann zu 20 Raumteilen einer Lösung von 1,04 Gew.-Teilen H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃ in DMF gegeben. Das Äthylacetat wird in ein Eisbad abdestilliert Die erhaltene homogene Lösung wird 2 Tage bei 3°C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Das Chromatogramm wird mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (60 : 20 : 6 :10) entwickelt. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und zur Entfernung der Lösungsmittel destilliert. Zum Rückstand wird Wasser gegeben. Der gebildete Feststoff wird abfiltriert.
Die Ausbeute beträgt 0,87 Gew.-Teile (61,2%);
Schmelzpunkt 108⁰C;
[λ] =-59,l°(c=0,7.Äthanol).

Elementaranalyse:

Berechnet für C4iH5iOnNii ■ H₂O:

C 54,72, H 6,83, N 17,12:
gefunden: C 54,95, H 6,84, N 16,74.

d) 0,836 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂CH₃ werden in Methanol gelöst. Zur Lösung wird 1 Raumteil IN Salzsäure gegeben. Die Lösung wird der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 10 Raumteilen DMF gelöst. In der Lösung werden 0,83 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-OH und 0,36 Gew.-Teile HONBl gelöst. Das Gemisch wird auf -5°C gekühlt, worauf 0,412 Gew.-Teile DCC zugesetzt werden. Das Gemisch wird 2 Tage der Reaktion überlassen, worauf die Fällung abfiltriert und das DMF abdesiilliert wird Der Ruckstand wird durch Chromatographie an einer Säule von Amberlite XAD-2 in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem wäßrigem Äthanol bis 80%igem wäßrigem Äthanol ϊ gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und zur Entfernung des Äthanols destilliert Die als Rückstand verbleibende wäßrige Lösung wird gefriergetrocknet Das erhaltene Pulver wird durch lonenaustauschchromatographie an Carboxymethylcel-

K) lulose in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 0,005N bis 0,1N wäßrigem Ammoniumacetat weiter gereinigt. Die aktive Fraktion wird gefriergetrocknet, wobei ein rein weißes Pulver erhalten wird.
Die Ausbeute beträgt 0,424 Gew.-Teile;

Ii [et]: =-55° (c= 0,5,5% Essigsäure).

Aminosäureanalyse:

His 1,02(1); Arg 1,101 (l);Trp 0,91(1);
Ser0,90(l);GIu 1,00(1); Pro 1,00(1);
GIy 0,98 (1); Leu 1,00 (l);Phe 1.00(1);

Älhylamin 1,06(1).

Um die Ausbeute an Trp zu ermitteln, werden alle Aminosäureanalysen durch Säurehydrolyse mit 5,7N HCl in Gegenwart von Thioglykolsäure durchgeführt.

Beispiel 6

Herstellung von

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-

Gly-Ile-Arg-Pro-NHC₂H₅

a) Herstellung von
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-O\Bu

1,57 Gew.-Teile H-GIy-OtBu und 4,0 Gew.-Teile Z-Phe-OSU werden in 20 Raumteilen Äthylacetat gelöst. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wird mit 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlesung, IN Salzsäure und Wasser gewaschen, über Magensiumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird Petroläther gegeben. Die Fällung wird abfiltriert, wobei 3,5 Gew.-Teil (85%) Z-Phe-Gly-OlBu vom Schmelzpunkt 78° -79°C erhalten werden.
[«];■ =-16.7° (c= 1,0, Äthanol).

50 Elementaranalyse:

Berechnet für
C₂₃H₂₈O₅N₂: C 66,97,
gefunden: C 67,14,

H 6,87,
H 6,64,

N 6,79;
N 6,88.

7,0 Gew.-Teile Z-Phe-Gly-OtBu werden in 50 Raumteilen Methanol gelöst. Die Lösung wird unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator 5 Stunden reduziert. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat durch Abdampfen des Lösungsmittels eingeengt. Der Rückstand wird in 10 Raumteilen Acetonitril gelöst. Zur Lösung werden !,62 Gew.-Teile Z-Ser-ODNP gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 1 Tag bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Acetonitril abgedampft wird. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 10%igem wäßrigem Ammoniak, IN Salzsäure und Wasser gewaschen, über

wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert und durch Abdampfen des Lösungsmittels eingeengt Der Rückstand wird in Petroläther aufgenommen und aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert, wobei 1,41 Gew.-Teile (70%) Z-Ser-Phe-Gly-OtBu vom Schmelzpunkt 105° - 106⁰C erhalten werden,
[cc]. =-26,6° (c= 0,74,Äthanol).

Elenientaranalyse:

Berechnet für

C₂OH₃₃O₇N

gefunden:

C 62,50,
C 62,91,

H 6,66,
H 6,38,

N 8,41;
N 8,12.

1,34 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-GIy-OtBu werden in 50 Raumteilen Methanol gelöst Die Lösung wird 5 Stunden der katalytischen Reduktion unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator unterworfen. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand sowie 1,27 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-OH und 0,83 Gew.-Teile HONBI werden in 20 Raumteilen DMF gelöst. Die Lösung wird mit Eis gekühlt. Nach Zugabe von 0,95 Gew.-Teilen DCC wird das Gemisch über Nacht der Reaktion überlassen. Die Fällung wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Nach Zugabe von Acetonitril zum Rückstand wird das Gemisch erhitzt. Das abgeschiedene Pulver wird vom Gemisch abfiltriert und aus 50%igem wäßrigem Äthanol erneut ausgefällt, wobei 1,8 Gew.-Teile (87%) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-OtBu erhalten werden.
[Oi]: = - 20,6" (C= 1,0, DMF).

Elementaranalyse:

Berechnet für C40H49O9N9 · 2 H₂O:

C 58,59, H 6,52,
gefunden: C 59,02, H 6,62,

N 15,38;
N 15,23.

b) Herstellung von Z-Ile-Arg(NO₂)-Pro-WHC₂H₅

1,43 Gew.-Teile Z-Arg(NO₂)-Pro-NHC₂H₅ werden in 10 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure gelöst. Das Gemisch wird 40 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann werden 80 Raumteile trockener Äther zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und getrocknet, wobei ein Pulver erhalten wird.

0,795 Gew.-Teile Z-IIe-OH werden in 10 Raumteilen Dioxan gelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt. Nach Zugabe von 0,59 Gew.-Teilen HONBI und 0,68 Gew.-Teilen DCC zur Lösung wird das Gemisch 2 Stunden gerührt. Das Gemisch wird zur Entfernung der Fällung filtriert. Zum Filtrat wird das in der oben beschriebenen Weise hergestellte Pulver gegeben. Nach Zusatz von 0,84 Raumteilen Triethylamin wird das Gemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das als Lösungsmittel verwendete Dioxan wird abgedampft. Der Rückstand wird in 100 Raumteilen Chloroform gelöst und die Lösung mit O₁IN Salzsäure, 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Abdampfen des Chloroforms eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, wobei eine Fällung gebildet wird, die aus Äthanol-Äther erneut ausgefällt wird, wobei 1,1 Gew.-Teile Z-IIe-Arg(NO₂)-Pro-NHC₂H₅ vom Schmelzpunkt

103° -105°C (Zers.) erhalten werden.
M? = -58,1° (c= 1, Methanol).

Elementaranalyse:

Berechnet für C₂₇H₄₂O₇N₈ · 0,5 H₂O:

C 54,08, H 7,23, N 18,68;
gefunden: C 53,80, H 7,15, N 18,84.

c) 0,177 Gew.-Teile Z-Ile-Arg(NO₂)-Pro-NHC₂H₅ werden in 3 Raumteilen 25% H Br-Essigsäure gelöst Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 50 Raumteilen trockenem Äther versetzt Die Fällung wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen und getrocknet, wobei eine Aminkomponente erhalten wird.

0,221 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-OtBu werden in 5 Raumteilen Trifluoressigsäure gelöst Die Lösung wird 40 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 0,05 Raumteilen 5,7N Salzsäure und anschließend mit 50 Raumteilen Äther versetzt. Die Fällung wird abfiltriert, getrocknet und in 3 Raumteilen DMF gelöst Die Lösung wird auf 0°C gekühlt ur.d dann mit der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Aminkomponente, 0,097 Gew -Teilen HONBI, 0,111 Gew.-Teilen DCC und 0,126 Raumteiler. Triäthylamin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 5 Stunden bei 0°C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird zur Entfernung des hierbei gebildeten Dicyclohexylharnstoffes filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt Der Rückstand wird in 10 Raumfjilen 10%igem wäßrigem Äthanol gelöst. Die Lösung wird oben auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben. Die Desorbtion wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 10%igem bis 80%igem wäßrigem Äthanol durchgeführt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen, durch Abdampfen des als Lösungsmittel verwendeten Äthanols eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 0.085 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-G!y-lIe-

Arg(NO₂)-Pro-NHC₂H₅ erhalten werden.

0,07 Gew.-Teile des Produktes werden in einem Gemisch von 0,02 Raumteilen Anisol, 0,02 Raumteilen 2-Mercaptoäthanol und 4 Raumteiien wasserfreiem Fluorwasserstoff gelöst. Die Lösung wird 1 Stunde bei 0⁰C gerührt, worauf der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der Rückstand wird im Exsiccator getrocknet, in 50 Raumteilen Wasser gelöst und durch eine Säule von Amberlite® IRA-400 (Acetatform) geleitet. Die von der Säule ablaufende Lösung wird gefriergetrocknet, wobei 0,075 Gew.-Teile rohes Produkt erhalten werden. Dieses Produkt wird an einer Säule von Carboxymethylcellulose adsorbiert und in einem Elutionssystem mit linearen Gradienten von 0.005N Ammoniumacetat bis 0,2N Ammoniumacetal desorbiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden gefriergetrocknet. Das hierbei erhaltene Produkt wird in wäßriger 0,1 N Essigsäurelösung gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule von Sephadex® LH-20 geleitet. Die von der Säule ablaufende Lösung wird gefriergetrocknet, wobei 0,043 Gew.-Teile reines Produkt erhalten werden.
Rf 3 = 0,41;
[ac] = - 59,4° (C= 0,5, 5% Essigsäure).

Aminosäureanalyse:

His 1,1 (1); Arg 1,1 (l);Trp 0,87(1);
Äthylamin 1,0(1); Ser 0,81 (l);Glu 1,03(1);

Phe 0,97(1).
Die Klammerzahlen sind die theoretischen Werte.

Beispiel 7

Herstellung von

H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-Pro-NHC₂H₅

a) Herstellung von BOC-Met-Arg-Pro-NHC₂H₅

1,91 Gew.-Teile Z-Arg(NO₂)-Pro-NHC₂H5 werden in 10 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure gelöst Die Lösung wird 30 Minuten stehengelassen und dann mit trockenem Äther versetzt. Die Fällung wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen und getrocknet, wobei eine Aminkomponente erhalten wird.

1,75 Gew.-Teile BOC-Met-OH - DCHA werden in 100 Raumteilen Äther gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 50 Raumteilen einer wäßrigen 0,2N Schwefelsäurelösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wird abgedampft und der Rückstand in 20 Raumteilen Dioxan gelöst Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und mit 0,905 Gew.-Teilen DCC und 0,79 Gew.-Teilen HONBI versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Zum Rückstand werden 5 Raumteile DMF und die gesamte Menge der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Aminkomponente gegeben. Die erhaltene Lösung wird gekühlt und dann mit 1,12 Raumteilen Triäthylamin versetzt. Das Gemisch wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das DMF abgedampft. Der Rückstand wird in 100 Raumteilen Chloroform gelöst, mit 0,1 N Salzsäure, 5%iger wäßriger Natriumhyd-ogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Abdampfen des Chloroforms eingeengt. Durch Zugabe von Äther zum Rückstand wird ein Feststoff gebildet. Dieser Feststoff wird aus Äthylacetat-Äther erneut ausgefällt, wobei 1,4 Gew.-Teile BOC-Met-Arg-Pro-NHC₂H₅ vom Schmelzpunkt 101° -104⁰C (Zers.) erhalten werden,
[α] =-64,4° (c= 1,0,Methanol).

Elementaranalyse:

Berechnet WrC₂₃H₄₂O₇N₈S · 0,5 H₂O:

C 47,33, H 7,42, N 19,20, 55,49; gefunden: C 47,67, H 7,23, N 18,94, S 5,48.

b)H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-PrO-NHC₂H₅

0,275 Gew.-Teile BOC-Met-Arg(N0₂)-Pro-NHC₂H₅ werden in einem Gemisch von 0,! Raumteilen 2-Mercaptoäthanol und 5 Raumteilen Trifluoressigsäure gelöst Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 0,085 Raumteilen 5,7N Salzsäure versetzt. Das Gemisch wird gekühlt und mit 50 Raumteilen Äther versetzt. Die Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen, getrocknet, in DMF

gelöst und auf 0°C gekühlt Zur Losung werden 0,318 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid, 0,107 Gew.-Teile HONBI, 0,124 Gew.-Teile DCC und 0,17 Raumteile N-Athylmorpholin gegeben. Das Gemisch wird 12 Stunden gerührt Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt Der Rückstand wird in 5 Raumteilen 5°/oigem wäßrigem Äthanol gelöst. Die Lösung wird auf eine Säule von Amberlite XAD-2 ίο aufgegeben und in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5°/oigem bis 80%igem wäßrigem Äthanol desorbiert Die Hauptfraktionen werden gefriergetrocknet und getrocknet wobei 0,135 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg(NO₂)-li PrO-NHC₂Hs erhalten werden. 0,1 Gew.-Teile dieses Produktes werden in einem Gemisch von 0,02 Raumteilen Anisol, 0,02 Raumteilen Äthanol, 0,02 Raumteilen 2-Mercaptoäthanol und 6 Raumteilen Fluorwasserstoff gelöst Die Lösung wird 1 Stunde bei 0^cC gerührt Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand im Exsiccator getrocknet. Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Wasser gelöst und durch eine Säule von Amberlite CG-400 (Acetatform) geleitet Die aus der Säule ablaufende Lösung wird gefriergetrocknet Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Wasser gelöst Zur Lösung werden 0,4 Raumteile Thioglykolsäure gegeben. Das Gemisch wird 10 Stunden bei 60⁰C stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit 50 Raumteilen Wasser verdünnt, an einer Säule von Carboxymethylcellulose adsorbiert und in einem Elutionssystem von 0.005N bis 0,2N Ammoniumacetat desorbiert. Die Hauptfraktionen werden gefriergetrocknet, wobei 0,02 Gew.-Teile des rohen gewünschten Produktes erhalten werden. Das Produkt wird an einer Säule von Sephadex LH-20 adsorbiert und mit 0,1N Essigsäure eluiert. Die eluierte Lösung wird gefriergetrocknet, wobei das gereinigte Produkt erhalten wird.
Dünnschichtchromatographie: Rf=0,31 (Kieselgel;

n-Butanol: Essigsäure : Äthylacetat: Wasser
= 1:1:1:1).
[<x]i? = -43,2° (c=25,5,5% Essigsäure).

Aminosäureanalyse:

His 0.9(1); ArgO,9(l);Trp 0,8(1);
SerO,7(l);GluO,9(l);Pro 1,1(1);

GIy 1,0(1); Met 0,9(l);Tyr 0,7(1);
Äthylamin 0,9(1).

Die Klammerzahlen sind die theoretischen Werte.
Versuch

Die Nonapeptidamidderivate gemäß der Erfindung wurden Ratten im Diöstrus subkutan verabreicht und auf ihre ovulationsinduzierende Wirkung untersucht Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

Ovulationsinduzierende Wirkung bei Ratten im Diöstrus

A,	A₂	Y	ED_so(ng/100g
			Körpergewicht)
Tyr	Leu	NH-CH₃	165,0
Tyr	Leu	NH-CH₂-CH₃	32,0
Tyr	Leu	NH-CH₂-CH₂-CH₃	56,0
Tyr	Leu	NH-CH(CH₃)₂	76,0
Tyr	Nie	NH-CH₂-CH₃	53,6

23

Tyr	Met	NH-CH₂-CH₃
Phe	Leu	NH-CH₂-CH₃
Phe	lie	NH-CH₂-CH₃

Tyr

Leu

GIy-NH₂

Natürliches Decapeptid.

24

ED₅₁, (ng/100 g Körpergewicht)

Physikalische Daten für die n-Propylverbindung:

(«]-· = -58,8° (c= 0,5 in5% Essigsäure); Rf 2 = 0,47; Rf 5 = 0,54.

Aminosäureanalyse:

His 0,81(1); Arg 0,97 (l);Ser 0,92(1); GIn 1,00(1); Pro 0,97 (l);Gly 1,03(1); Leu l,05(l);Tyr 1,03(1); Propylamin 0,97 (1);Trp 0,98 (1).

35,0

84,0

115,0

215 ±12 ng

Physikalische Daten für die Isopropylverbindung:

[«.]? = -55,4° (c=0,5 in 5% Essigsäure): Rf 2 = 0,41; Rf 5 = 0,65.

Aminosäureanalyse:

His 0,98(1); Arg 1,00 (l);Ser 0,78(1); GIn 1,00(1); Pro 0,97(1); GIy 1,03(1); Leu 1,00 (l);Tyr 0,97 (l);Trp 0,89(1).

ifeft-iW^fa^-ffi^^^

Elementaranalyse

C61.13,
C 60,47,

6,20,
6,00,

8,91;
8,88.

Berechnet für
C₂₄H₂₉O₇N₃:
gefunden:

Patentansprüche:

1. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel

L-Pyroglutamyl L-Histidyl-L-Tryptophyl-L-Seryl-A]-Glycyl-A2-L-Arginyl-L-Proiin-Y

in der Ai für L-Tyrosyl oder L.-Phenylalanyl, A2 für L-Leucyl, L-Isoleucyl, L-Norleucyl oder L-Methionyl und Y für NHR steht, worin R ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen ist oder eine Pyrrolidinogruppe ist, und deren pharmazeutisch unbedenkliche Salze.

2. Nonapeptidamid nach Anspruch 1 mit der dort genannten Formel, in der Ai für L-Tyrosyl, A2 für L-Leucyl und Y für NHCH₂CH₃ steht.

3. Nonapeptidamid nach Anspruch 1 mit der dort

genannten Formel, in der Ai für L-Tyrosyl, A2 für L-Methionyl und Y für NHCH₂CH₃ steht

4. Verfahren zur Herstellung der Nonapeptidamide nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise L-Pyroglutaminsäure oder ein der in Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz entsprechendes, N-terminal einen L-Pyroglutaminsäurerest aufweisendes Peptidfragment mit einer Aminkomponente, die dem restlichen Teil des gewünschten Nonapeptidamids entspricht, kondensiert, wobei die beiden Reaktionspartner wahlweise eine oder mehrere Schutzgruppen enthalten können, und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen abspaltet