DE2223385C3

DE2223385C3 - Verfahren zum Nachweis eines organischen Liganden und enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen

Info

Publication number: DE2223385C3
Application number: DE2223385A
Authority: DE
Inventors: Edwin F. Atherton Calif. Ullman
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1971-05-14
Filing date: 1972-05-12
Publication date: 1984-10-25
Also published as: NL7206434A; NL170564C; NL170564B; FR2139505A5; DE2223385B2; BR7202989D0; JPS5327763B1; IL39323A0; GB1401298A; CH553410A; DE2223385A1; SE403190B; IT972332B; ES402720A1; CA1003770A; GB1401297A; IL39323A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines organischen Liganden, insbesondere von biologisch wirksamen Verbindungen.

Es besteh; ein Bedürfnis nach schnellen, genauen qualitativen und quantitativen Bestimmungsmethoden für biologisch wirksame Substanzen in äußerst niedrigen Konzentrationen, ζ. B. von Drogen oder Narkotika in Körperflüssigkeiten, wie Speichel, Blut oder Urin. Weiterhin ist es bei der medizinischen Diagnose häufig wichtig, Substanzen, .die auf natürlichem Wege durch den Körper synthetisiert bzw. eingenommen werden, nachzuweisen. Hierbei handelt es sich z.B. um Hormone, und zwar sowohl um Steroidhormone als auch um Polypeptide, weiterhin um Prostaglandine, Toxine und andere Substanzen, die an Körj-erfunktionen beteiligt sind. Häufig handelt es sich um äußerst kleine Mengen und gelegentlich um sehr geringe Konzentrationsunterschiede. Entsprechende Bestimmungsverfahren sind auch bei Schädlingsbekämpfungsmitteln, wie Insekticiden, Baktericiden, Fungiciden usw.

is sowie bei anderen organischen Substanzen, die die Luft und das Wasser verunreinigen, erwünscht Organische Verunreinigungen können analysiert werden, wenn es gelingt, einen geeigneten Rezeptor zu finden, und die verunreinigende Substanz gegenüber den verwendeten Reagentien inert ist

Es sind verschiedene Verfahren zur Analyse dieser Substanzen in Spurenmengen beicannt, z.B. die Dünnschichtchromatographie. Dieses hat jedoch eine Reihe von Nachteilen, d. h. sie ist langsam, erfordert bei ihrer Ausführung sehr viel Übung, wird durch eine Vielzahl von Substanzen gestört, und ihre Zuverlässigkeit unterliegt starken Schwankungen.

Bei der Radioimmunanalyse werden Antikörper für spezifische Haptene oder Antigene verwendet Beim Vermischen des Antikörpers mit Lösungen des Haptens oder Antigens und eines radioaktivmarkierten Hapten- oder Antigen-Analogen wird das radioaktive Analoge daran gehindert, sich mit dem Antjkörper zu verbinden, und zwar in einer Menge, die in direkter Beziehung zu

der Konzentration des tiaptens oder Antigens in der Lösung steht Wird dann das freie radioaktive Analoge von dem an den Antikörper gebundenen radioaktiven Analogen getrennt, kann die Menge des Haptens oder Antigens in der ursprünglichen Lösung bestimmt werden.

Die Handhabung radioaktiver Substanzen ist schwierig und gefährlich und an bestimmte behördliche Auflagen gebunden. Weiterhin ist die Trennung des gebundenen von dem nichtgebundenen radioaktiven Analogen schwierig und mit Fehlern behaftet (vgl. zum Beispiel Abraham, J. Clin. Endoc. Metab. (Prelim. Comm),29,866[1969]).

Die Anwendung der Radioimmunanalyse ist ferner in zwei Aufsätzen von Murphy, ). Clin. Endocr., 27, 973 (1967); ibid, 28,343 (1968), beschrieben. Die Verwendung von Peroxydase als Markierungssubstanz bei der immunochemischen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern ist von Stanislawski et al, C. R. Acad Sei. Ser. D., 1970, 271 (16), 1452-5 (C. A. 74, '. 1444b), beschrieben. Weiterhin wird auf die Arbeiten von N a k a η e et al, J. of Histochem. and Cytochem., 14, 929 (1967), und Avrameas, Int. Rev. of Cytology, 27, 349 (1970) sowie in Bull. Soc. Chem. Bio!.. 50 (1968), S. 1173, verwiesen. In letzterer ist angegeben, daß Antigene und

b0 Antikörper mit Enzymen gekoppelt werden können. Die gekoppelten Verbindungen können zur Kennzeichnung von Antikörpern nach der Immunelektrophorese benutzt werden.

Schließlich wird auf Percr. et al, Immunologie Methods in Steroid Determination, Appleton-Century-Crofts, New York, 1970, hingewiesen.

Gegenstand des älteren Patents 2155 658 ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von

einem Hapten oder dessen Antikörper unter Ausnutzung der für derartige Substanzen bekannten Bindungsaktivität; dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung mit einer bestimmten Menge eines Kopplungsproduktes aus dem Hapten und einem Enzym und einem in unlösliche Form gebrachten Bestandteil der Reaktion Hapten-Antikörper durchgeführt wird und die Enzymaktivität in der flüssigen oder festen Phase bestimmt wird. Als Hapten kann ein Vitamin oder Hormon und als Enzym eine Oxidoreduktase verwendet werden.

Bei diesem Verfahren ist zur Bestimmung der Enzymaktivität in der flüssigen oder festen Phase eine Trennung der beiden Phasen erforderlich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein immunologisches N achweis verfahren zur Verfugung zu stellen, das auf einfache und zuverlässige Weise die Bestimmung sehr kleiner Mengen der eingangs erwähnten Substanzen ermöglicht

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis eines organischen Liganden in einem Medium, in welchem man diesen Liganden vermutet; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einer flüssigen Zone (1) das Medium mit (2) einem enzymgebundenen Liganden und (3) einem Rezeptor, der dem Liganden und dem enzymgebundenen Liganden gemeinsam ist, in Berührung bringt, wobei die enzymatische Aktivität des enzymgebundenen Liganden weitgehend inhibiert wird, wenn der enzymgebundene Ligand an den Rezepte- gebunden ist, und daß jo man den Einfluß des vorhandenen Liganden bei der Bestimmung der enzymatischen Aktivität analysiert.

Frfindungsgemäß können Liganden in äußerst niedrigen Konzentrationen durch Anwendung spezifischer Rezeptorstellen für den Liganden und durch Enzymver-Stärkung der Ligandenverdrängung bestimmt werden. Indem man einen Liganden oder einen »nachgemachten« Liganden unter Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität an ein Enzym bindet, worauf man den enzymgebundenen Liganden mit einem Rezeptor für den Liganden kombiniert, kann man die Anwesenheit und die Menge des Liganden in einer unbekannten Lösung leicht bestimmen. Infolge des Wettbewerbs zwischen dem enzymgebundenen Liganden und dem freien Liganden um die Rezeptorstellen können die beiden Ligandenformen, die gleichzeitig oder nacheinander dem Rezeptor zugesetzt werden, aufgrund der unterschiedlichen enzymatischen Aktivität bei vorhandenem oder fehlendem Liganden bestimmt werden. Diese Differenz steht in Beziehung mit der in der unbekannten Lösung vorhandenen Menge an Ligand. Die enzymatische Aktivität kann leicht in an sich bekannter Weise bestimmt werden, indem man die Konzentrationsänderungen eines Enzyrr.substrates oder -Produktes des Substrats nach Standardmethoden bestimmt.

Die Verstärkung durch das Enzym erfolgt dadurch, daß durch ein Enzym-Molekül eine große Anzahl von anderen Molekülen gebildet oder umgewandelt wird, wobei der zu analysierende Ligand bzw. der »nachge- to machte« Ligand an ein Enzym gebunden ist (enzymgebundener Ligand). Als Ligand-Analoges wird entweder ein Ligand, der durch Ersatz eines Protons durch eine verbindende Gruppe zum Enzym modifiziert ist, oder ein »nachgemachter« Ligand, d. h. ein auf andere Weise «,5 als durch einfachen Ersatz eines Protons zwecks Erzeugung einer verbindenden Stelle zum Enzym modifizierter Ligand, bezeichnet. Der Ligand und der enzymgebundene Ligand sind in der Lage, um spezifische Rezeptorstellen in Wettbewerb zu treten. Es können auch andere Verbindungen mit sehr ähnlicher Struktur als LJganden dienen, die um diese Stellen in Wettbewerb treten können; z. B. treten Morphin-Glucuronid und Codein mit enzymgebundenem Morphin in Wettbewerb, um sich mit gewissen Arten von Morphin-Antikörpern zu verbinden. In den meisten Fallen ist dies von Vorteil, da auf diese Weise eine ganze Klasse von physiologisch eng verwandten Verbindungen analysiert werden kann.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Zone hinsichtlich (I) des Mediums, (2) des enzymgebundenen Liganden und (3) des Rezeptors im wesentlichen homogen ist, und daß der Ligand eine biologisch wirksame Verbindung darstellt Das Arbeiten in einem homogenen System setzt voraus, daß eine signifikante Inhibition der enzymatischen Aktivität auftritt, wenn der enzymgebundene Ligand an den Rezeptor gebunden ist Werden der Ligand und der enzymgebundene Ligand in eine Lösung eingebracht, die den Ljgand-Rezeptor-Komplex enthält, so wird die enzymatische Aktivität der Lösung nach der Kombination der drei Substanzen durch die Konzentration des in der Lösung vorhandenen Liganden beeinflußt, d. h. der enzymgebundene Ligand und der freie Ligand treten um die Rezeptorstellen in Wettbewerb. Liegt am Gleichgewicht eine unzureichende Anzahl von Rezeptorstellen vor, so steht die Anzahl der enzymgebundenen Ligand-Moleküle, die durch den Rezeptor nicht inhibiert sind, in direkter Beziehung zu der Anzahl der in der Lösung vorhandenen Ligand-Moleküle. Man kann diesen Zustand auf zwei Wegen erreichen:

(1) Entweder durch Wettbewerb, wobei der enzymgebundene Ligand und der freie Ligand praktisch gleichzeitig mit dem Rezeptor zusammengebracht werden, oder (2) der enzymgebundene Ligand oder der freie Ligand können dem Rezeptor zuerst zugesetzt werden, worauf man das System ins Gleichgewicht kommen läßt und anschließend den Liganden bzw. den enzymgebundenen Liganden zusetzt, um das ursprünglich zugesetzte Material zu verdrängen. Da die enzymatische Aktivität sich infolge der Inhibierung vermindert, wenn der enzymgebundene Ligand am Rezeptor gebunden wird, steht die enzymatische Aktivität der Lösung direkt mit der Menge des in der Lösung vorhandenen Liganden in Beziehung.

Die Konzentrationen des enzymgebundenen Liganden und des Rezeptors können in weiten Grenzen variiert werden. Normalerweise liegt die Konzentration des Rezeptors und des enzymgebundenen Liganden zwischen etwa lO-'bis 10-'« Mol, gewöhnlich zwischen etwa 10"⁶ und 10"^l2 Mol. Die untere Grenze für die Konzentration des enzymgebundenen Liganden ist durch die Nachweisgrenze bestimmt. Diese ändert sich mit den jeweiligen Enzymen und den jeweiligen Nachweissystemen.

Die Menge des Rezeptors wird normalerweise nach den Rezeptorstellen berechnet und ändert sieh mit der Konzentration an enzymgebundenem Liganden, dem Verhältnis zwischen Liganden und Enzym im enzymgebundenen Liganden und der Affinität des Rezeptors gegenüber dem Liganden. Gewöhnlich ist mindestens 1,0 aktive Rezeptorstelle je Molekül enzymgebundener Ligand und weniger als etwa 20 aktive Stellen je Molekül Ligand als enzymgebundener Ligand vorhanden, doch kann das Verhältnis zwischen den Rezeotor-

stellen und den Molekülen auch bis zu 1000 :1 gehen, was von der Art der Analyse und der Affinität des Rezeptors abhängt. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der aktiven Stellen am Rezeptor zu den Molekülen des enzymgebundenen Liganden mindestens 2:1, während das Verhältnis zwischen den aktiven Stellen des Rezeptors zum Liganden als enzymgebundenem Liganden weniger als etwa 5 :1 beträgt. Das Verhältnis hängt in starkem Ausmaß von den Bindekonstanten und der vermuteten Menge Ligand ab. Das Verfahren zur Bestimmung der Bindestellen für den Rezeptor ist nachstehend im experimentellen Teil angegeben.

Bei dem enzymgebundenen Liganden liegt das Verhältnis zwischen den Enzym-Untereinheiten und dem Liganden im Bereich von etwa 0,01 bis 100:1, häufig zwischen etwa 0,02 bis 50 :1 und noch häufiger zwischen etwa 0,04 bis 25 :1 (bei Proteinen sollen die Protein-Untereinheiten als Liganden gelten). Die Höchstzahl der Enzymeinheiten je Ligand wird durch die Art des Ligaxnlen und sein Molekulargewicht bestimmt Bei niedrigmolekularen Enzymen mit einem Molekulargewicht von etwa 12 000 bis 80 000 sind etwa 1 bis 40, gewöhnlich 2 bis 35 Ligar.den je Enzym-Untereinheit vorhanden. Im allgemeinen liegt nur eine Enzym-Einheil auf ein Molekulargewicht des Liganden von 2000, gewöhnlich nur eine Enzyn·-Einheit auf ein Molekulargewicht von 4000 des Liganden und normalerweise eine Enzym-Einheit auf ein Molekulargewicht von 6000 des Liganden vor. Diese Werte sind Durchschnittswerte für die Zusammensetzung des enzymgebundenen Li^anden.

In einigen Fällen verbinden «ich mehrere Enzyme in einer stabilen Anordnung zu einem Multienzymkomplex. Wegen der gleichzeitigen An· "»senheit der Enzyme kann eine Anzahl von Reaktionen nacheinander in wirksamer Weise durchgeführt werden, wobei hohe lokalisierte Konzentrationen an Reaktionsteilnehmern vorliegen. Deshalb kann der Ligand mit einer Kombination von Enzymen verbunden werden, wodurch mehrere Enzyme je Ligand vorhanden sind. Wenn 4C mehrere Liganden mit dem Multienzymkomplex verbunden sind, kann das Molverhältnis zwischen Enzymen und Ligand 1 :1 betragen, obgleich tatsächlich mehrere Enzyme und Liganden in einer einzigen Aggregation vorliegen. Die Anzahl der verbundenen Enzyme (entweder als Multienzymkomplex oder nach einem anderen Mechanismus) liegt selten über 20, gewöhnlich nicht über 10 und üblicherweise im Bereich von 2 bis 5 Enzymen.

Wenn alle anderen Parameter gleich sind, so ist die Empfindlichkeit der Analyse um so größer, je größer die Zahl der Enzyme je großen Ligand ist. Die Enzyme können aber die Rezeptorerkennung stören, die Löslichkeit beeinflussen und auch auf andere Weise nachteilig sein. Deshalb ist die. Anzahl der mit einem Liganden verbundenen Enzyme derart, daß nicht mehr als eine Enzym-Polypeptidkette auf ein Molekulargewicht von 2000 des Liganden vorhanden ist.

Wenn der Ligand ein großer organischer Komplex, z, B, eine Zeile oder ein Virus ist, so geht die Zahl der an ω die Zelle oder das Virus gebundenen Enzymeinheiten in die Tausende, damit die gewünschte Empfindlichkeit erreicht wird. Die Anzahl der gebundenen Enzymeinheiten soll ausreichen, um nachweisbare Veränderungen des Substrats zu verursachen, soll jedoch nicht so groß h-; sein, daß die Erkennung durch den Rezeptor verhindert wird.

Die Anzahl der mit einem Enzym verbundenen Liganden hängt von folgenden Faktoren ab:

Den für die Bindung mit dem Liganden verfügbaren Stellen, der Anzahl der zur Erzielung des gewünschten Effektes notwendigen Liganden (z. B. zur Erzielung des Inhibitionseffektes, wenn der Ligand mit dem Antikörper verbunden wird), dem Einfluß der Anzahl der an das Enzym gebundenen Liganden auf die Löslichkeit und die Aktivität sowie von allosterischeh Effekten usw.

In einem gewissen Grad können die Wirkungen der Iigandensubstitution auf das Enzym modifiziert werden. Beispielsweise kann bei der Bindung des Liganden an Lysin mittels einer Carboxylgruppe und bei einem neutralen Ligandenmolekül eine verbindende Gruppe mit oiner positiven Ladung, z. B. Ammonium, verwendet werden; man kann- auch eine verbindende Gruppe verwenden, die auf den pH-Wert ähnlich wie das Lysin · anspricht, z. B. ein Amin. Ist der Ligand stark lipophil, z. B. Testosteron, so ist es gewöhnlich erwünscht, die Anzahl der am Enzym gebundenen Liganden möglichst niedrig zu halten. Gehört der Ligand demselben Ladungstyp wie die verdrängte Gruppe an, so wird gewöhnlich eine ungeladene verbindende Gruppe verwendet Auch durch Änderung der Funktionalität der verbindenden Gruppe kann die Anzahl der am Enzym gebundenen Liganden und der Stellen, an denen der Ligand gebunden ist, variiert werden.

Die Konzentrationen äff Rezeptor und Enzym stehen mit dem Konzentrationsbereich des zu analysierenden Liganden in Beziehung. Die zu analysierende Lösung wird unmittelbar verwendet, es sei denn, daß der Ligand in einer verhältnismäßig hohen Konzentration vorhanden ist. Bei einer hohen Konzentration wird die unbekannte Lösung bis auf eine geeignete Konzentration verdünnt. In vielen interessierenden biologischen Systemen ist die zu analysierende Substanzmenge jedoch verhältnismäßig gering, weshalb gewöhnlich eine Verdünnung des unbekannten Substrats nicht notwendig ist.

Bei dem Verfahren im homogenen S>,;;m wird eir. löslicher Rezeptor für den jeweiligen Liganden verwendet. Zum Beispiel sei als Ligand das Hapten, d. h. das Morphin, angenommen, wobei dann der Rezeptor ein für Morphin spezifischer Antikörper ist. Nur am Rand sei erwähnt, daß Antikörper im allgemeinen die Molekülform und die Verteilung der polaren Gruppen in einem Liganden »erkennen«, wobei ein anderer Teil des Moleküls stark modifiziert sein kann, ohne daß das »Erkennen« verlorengeh¹.. Zum Beispiel können sowohl Morphin, als auch sein Glucuronid mit gewissen Morphin-Antikörpern verbunden werden.

Ein Enzym wird zuerst dadurch modifiziert, daß man ein oder mehrere Morphinmoleküle mit dem Enzym verbindet. Es kann jedes beliebige Enzym verwendet werden, das mit einem leicht nachweisbaren Substrat reagiert.

Es wird eine Lösung des Antikörpers in der erforderlichen Konzentration hergestellt, wobei nur einige Mikroliter der Lösung erforderlich sind. Der Antikörper, der auf einem pH-Wert gehalten wird, bei dem er das Morphin wirksam bindet, wird in eine Lösung des an das Enzym gebundenen Morphins bei der gewünschten Konzentration eingebracht. Das Reaktionsvermögen der vereinigten Lösung von Antikörper und enzymgebundenem Morphin kann dadurch bestimmt werden, daß man einen gemessenen Anteil herausnimmt, diesen unter den Bedingungen, bei denen das Enzym aktiv ist, zum Substrat gibt und die spektroskopische Veränderung als Funktion der Zeit bei

einer konstanten Temperatur bestimmt Die Geschwindigkeit dieser Änderung ist das Ergebnis, das erhalten werden sollte, wenn in der unbekannten Lösung kein Morphin vorhanden ist

Dann wird ein zweiter gemessener Anteil entnommen und der unbekannten Lösung zugesetzt Die unbekannte Lösung kann das Substrat und beliebige andere Zusätze enthalten, die zur Erzielung einer enzymatischen Aktivität notwendig sind. Man kann aber auch zuerst die unbekannte Lösung mit dem Komplex aus Antikörper und enzymgebundenem Morphin kombinieren, und ins Gleichgewicht bringen und anschließend mit dem Substrat vermischen. In jedem Fall wird die Änderungsgeschwindigkeit im Spektrum bestimmt Eine Variante des vorstehend beschriebenen Verfahrens besteht darin, daß man ein Gemisch aus enzymgebundenem Morphin und unbekannter Lösung dem Antikörper zusetzt, worauf man diese Lösung dem Substrat zusetzt Es sind auch andere Varianten leicht vorstellbar.

Wenn alle Konzentrationen an Reagentien, ausgenoinrnen Morphin, konstaiUgeliaiien und mehrere Morphin-Standard-Lösungen verwendet \.erden, kann die Veränderung des Spektrums Ober bestimmte Zeiträume mit den Morphinkonzentrationen in Beziehung gesetzt werden. Das standardisierte System kann also dann zur schnellen, genauen und wirksamen Bestimmung der Menge des Morphins oder eines anderen Liganden in der unbekannten Lösung verwendet werden.

Eine andere Ausführungsform des erfindungsgemä-Ben Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Zone heterogen ist, der Ligand eine biologisch aktive Verbindung darstellt und der Rezeptor an einen unlöslichen Träger gebunden ist. Auch in diesem Fall wird der enzymgebundene Ligand weitgehend inhibiert, wenn er an den Rezeptor gebunden ist. Heterogene Systeme werden dann bevorzugt, wenn die Bedingungen, unter denen der enzymgebundene Ligand enzymatisch aktiv ist, deutlich verschieden von den Bedingungen sind, unter denen der Rezeptor bezüglich der jo Bindung des Liganden aktiv ist. Beispielsweise kann ein Rezeptor bei einem pH-Wert um 7 sehr aktiv, dagegen bei einem basischen pH-Wert verhältnismäßig inaktiv sein, während die Enzymaktivität bei einem höheren pH-Wert zunehmen kann.

Wenn der Rezeptor an einen unlöslichen Träger gebunden ist, so ist das Enzym über den Liganden, an den es gebunden ist, mii dem Rezeptor verbunden. Bei gleichzeitiger oder anschließender Zugabe einer einen Liganden enthaltenden Lösung und des enzymgebundenen Liganden zu dem an den Träger gebundenen Rezeptor steht die Menge des nicht am Träger gebundenen enzymgebundenen Liganden mit der Konzentralion d« Liganden in Beziehung.

Die Analysen werden gewöhnlich bei mäßigen Temperaturen, im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 50° C, gewöhnlich im Bereich von etwa 15 bis 40° C, durchgeführt. Der pH-Wert der zi> analysierenden Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis 10, gewöhnlich im Bereich von etwa 6 bis 9, f,o

Ob in Anwesenheit von Sauerstoff oder in einer inerten Atmosphäre gearbeitet wird, hängt von der jeweiligen Analyse ab. Wenn Sauerstoff stört, so wird normalerweise eine inerte Atmosphäre verwendet. Normalerweise werden hydroxylgruppenhaltige Mt- ti dien verwendet, insbesondere wäßrige Medien, da in diesen Medien das Enzym aktiv ist. Es können aber auch 0 bis 40 Vol.-% anderer Flüssigkeiten als Hilfslösungsmittel vorhanden sein, z. B. Alkohole, Ester, Ketone, Amide usw. Die Auswahl des jeweiligen Hilfslösungsmittels hängt von den anderen, im Medium vorhandenen Reagentien, dem Einfluß auf die Enzymaktivität und anderen erwünschten oder unerwünschten Wechselwirkungen mit dem Substrat oder den Produkten ab.

Falls es zweckmäßig erscheint, können die Reagentien in trockener Form auf einem Grundmateria! niedergeschlagen werden, so daß sie beim Einbringen in ein flüssiges Medium, insbesondere eine Körperflüssigkeit, wie Speichel, Urin oder Serum, aktiviert werden und auf die Anwesenheit eines Liganden ansprechen. Wenn das Enzymsubstrat ein leicht nachweisbares (z. B. durch Farbänderung) Produkt bildet, so kann die Anwesenheit oder Abwesenheit des jeweiligen Liganden bestimmt werden.

Wie schon gesagt, können Antikörper häufig eine ganze Verbindungsgruppe »erkennen«, wenn die Geometrie und die räumliche Verteilung der polaren Gruppen ähnlich ist Häufig kar/ die Spezifizität des Antikörpers dadurch variiert wcidrn, daß man die Haptenstruktur und die Art der Bindung mit dem Antigen bei der Erzeugung Antikörper variiert In einigen Fällen kann es erwünscht sein, zwei oder mehrere Antikörper, gewöhnlich nicht mehr als 6 Antikörper, zu verwenden, so daß die Antikörper-Reagenslösung in der Lage ist, eine ganze Verbindungsgruppe, z. B. Barbiturate, oder mehr als eine Verbindungsgruppe, z. B. Morphin und Barbiturate, nachzuweisen. Dies kann besonders dann wertvoll sein, wenn man eine Probe daraufhin untersucht, ob ein Vertreter einer Verbindungsgruppe vorhanden ist oder ob eine spezielle Klasse von Verbindungen vorhanden ist, z. B. mißbräuchlich verwendete Drogen oder Geschlechtshormone. Wenn Kombinationen von Antikörpern verwendet werden, so ist es gewöhnlich nötig, entsprechende Kombinationen von enzymgebundenen Liganden zu verwenden.

Liganden

Bei einer allgemeinen Betrachtung der Reagentien ist zuerst der Ligand zu berücksichtigen. Es können alle Liganden verwendet werden, die von biologischem Interesse sind und für die ein geeigneter Rezeptor mit einer ausreichenden Spezifizität für den Liganden gefunden werden kann. In der neueren Literatur sind viele Arbeiten über Rezeptoren für eine zunehmende Zahl von biologisch aktiven Substanzen zu finden. Verbindungen, für die Rezeptoren zur Verfügung stehen, umfassen einfache Phenylalkylamine, z. B. Amphetamin bis hochmolekulare Polymere, z. B. Proteine und Polysaccharide. Neben Verbindungen oder Gemischen von verwandten Verbindungen können gewisse Systeme von organischen Verbindungen, z. B. Zellen und Viren, nach immunanalytischen Methoden nachgewiesen werden. Deshalb sind Beschränkungen hinsichtlich des Molekulargewichts oder der Zusammensetzung der Verbindungen oder Systeme, die analysiert werden können, nicht gerechtfertigt.

Die Liganden umfassen solche Verbindungen, die Narkotika, Hypnotika, Sedativa, Analgetika, Antipyre'ika, Anästhetika, psychogene Drogen, Muskelrelaxantien, Stimulaniien ^für das Nervensystem, Anticholinesterase-Mittel, parasympathomimetische Mittel, sympathomimetische Mittel, a-adrenergische Blockiermittel, antiandrenergische Mittel, ganglienstimulierende- und -blockierende Mittel, neuromuskulärblockierende Mit-

tel. Histamine, Antihistamine, 5-Hydroxytryptamin und Antagonisten, cardiovaskuläre Drogen, antiarrhythmische Drogen, Antihypertensiv-Mittel, vasodilatorische Drogen, Diuretika, Pesticide (Fungicide, Antihelminthica, Insecticide, Ekloparasiticide usw.), Antimalariadrogen. Antibiotika, Antimetaboliten, Hormone, Vitamine, Zucker, Thyroid- und Antithyroid-Drogen, Corticosteroide, Insulin und orale hypoglämische Drogen und Stoffwechselprodukte darstellen.

Diese Drogen und Mittel umfassen beispielsweise Alkaloide, Steroide, Polypeptide, Prostaglandine, Catecholamine, Xanthine, Aralkylamine, heterocyclische Verbindungen, z. B. Thiazine, Piperazine, Indole und Thiazole; Aminosäuren usw.

Im allgemeinen sind die Liganden organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis 10*, gewöhnlich von etwa 125 bis 40 000, insbesondere von etwa 125 bis 20 000. Die Liganden ..2DS" gSWCiiPiiiCii CiW'S u ui5 ji/uw ivuiiiciliioi laiome und etwa 1 bis 35 000 Heteroatome.

Ein großer Teil der Liganden sind Monomere oder niedrigmolekulare Polymere mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 100 bis 2000, gewöhnlich von etwa 125 bis 1000. Ein weiterer großer Teil der Liganden sind Polymere (Verbindungen mit wiederkehrenden Einheiten) mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 750 bis 1000 000, häufig von 2000 bis 100 000 und gewöhnlich von 2000 bis 50 000. Handelt es sich um Polymere mit wechselndem Molekulargewicht, so soll sich das angegebene Molekulargewicht auf das durch- jo schnittliche Molekulargewicht beziehen.

Die Liganden sind normalerweise aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Halogen und Metallen, hauptsächlich in Form der Kationen, z. B. von Alkali- und Erdalkalimetallen und J5 den Metallen der Gruppen I B, II B, VII B und VIII B, insbesondere der dritten Reihe des Periodensystems, zusammengesetzt Insbesondere sind die Liganden hauptsächlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel zusammengesetzt.

Strukturell können die Liganden Monomere oder Polymere darstellen, wobei es sich um acyclische, mono- oder poiycyclische Verbindungen mit carbocyclischen oder heterocyclischen Ringen handeln kann. Die Liganden können eine Vielzahl von funktioneilen Gruppen, z. B. Halogen, Oxocarbonyl, Nicht-Oxocarbonyl, Amino-Oxy (Hydroxy, Aryloxy, Aryloxy und Cycloalyloxy [»alyl« bedeutet einen einwertigen aliphatischen Rest]), Thiooxy-, Dithio-, Hydrazo- und Kombinationen dieser Gruppen darstellen.

Die Liganden können in drei verschiedene Kategorien eingeteilt weden, die sich durch ihre biologische Wechselwirkung mit dem Rezeptor bestimmen. Die erste Kategorie umfaßt die Antigene, die beim Einführen in den Blutkreislauf eines Vertebraten zur Bi'dung von Antikörpern führen. Die zweite Kategorie umfaßt die Haptene, die in Bindung mit einem Protein bei der Erfindung in den Blutkreislauf eines Vertebratens die Bildung von Antikörpern verursachen, welche spezifisch für das Hapten sind. Die dritte Kategorie von Liganden umfaßt solche mit natürlich vorkommenden Rezeptoren in lebenden Organismen, wobei die Rezeptoren in einer für den Liganden spezifischen Form isoliert werden können.

Biologische Substanzen, die für eine Art von es Lebewesen spezifisch sind und in dieser Art natürlich vorkommende Rezeptoren besitzen, können natürlich, auch Haptene sein, wenn sie an ein Protein gebunden sind und einem Lebewesen der gleichen oder einer anderen Art verabreicht werden. Deshalb ist die Klassifizierung etwas willkürlich, da der Ligand gegenüber einer Art ein Antigen, gegenüber einer anderen Art ein Hapten sein kann und bei einer dritten Art natürlich vorkommende Rezeptoren besitzen kann.

Die Antigene fallen zum größten Teil in die Gruppe der Proteine oder Polysaccharide und sind gegenüber dem Lebewesen, dem sie injiziert werden, Fremdsubstanzen.

Die wichtigsten Vertreter von Liganden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die Haptene. Unter Haptenen versteht man Substanzen, die bei der Injizierung keine Antikörperbildung verursachen, die aber in der Lage sind, spezifisch mit Antikörpern zu reagieren, um entweder eine Fällung zu erzeugen oder zu verhindern. Diese Definition umfaßt nicht nur die einfachen chemischen Substanzen, die die Determinanten der Spezitizität sind, wenn sie mit Proteinen verbunden werden und die eine Fällung verhindern, sondern auch Substanzen aus natürlichen Quellen, z. B. die für Pneumococcen spezifischen Polysaccharide und Dextrane, die beim Kaninchen bei der Erstinjektion keine Antigenbildung verursachen (Definition nach K. a b a t et al., Experimental Immunochemistry, Charles C. Thomas, Springfeld, Illinois [1967]). In der nachstehenden Diskussion ist der Begriff »Hapten« beschränkt aui nichtantigene Gruppen, die künstlich in Proteine eingeführt werden, die die Spezifizität beeinflussen und die für diese Gruppen gelten, ganz gleich, ob die Gruppe mti dem Protein verbunden ist oder nicht.

Die dritte Gruppe von Liganden umfaßt diejenigen mit natürlich vorkommenden Rezeptoren. Diese Rezeptoren können Proteine, Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure (RNS) oder Desoxyribonucleinsäure (DNS) oder

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l*ll-lltUI OIICI1,

mit Zellen assoziiert sind, sein.

Beispiele für solche Liganden mit natürlich vorkommenden Rezeptoren sind Thyroxin, viele Steroide, wie die östrogene. Cortison, Corticosteron und östradiol; Polypeptide, wie Insulin und Angiotensin II sowie andere, natürlich vorkommende biologisch aktive Verbindungen. Vergleiche z. B. M u r ρ h y et al, J. Clin. Endocr, 24, 187 (1964); Murphy, ibid, 27, 973 (1967); ibid, 28, 343 (1968); BBA, 176, 626 (1969); Mc E w e η et al. Nature, 226, 263 (1970); und Morgan et al. Diabetes (1966); P a g e et al, ibid, 28,200 (1969).

Die Liganden können auch aufgrund der chemischen Familien, die in der Literatur akzeptiert wurden, eingruppiert werden. In einigen Fällen sind für die Zwecke der Erfindung in eine Familie phys.'omimetische Substanzen eingeordnet, die hinsichtlich ihrer Struktur einem Teil der natürlich vorkommenden Struktur ähnlich sind und die physiologischen Eigenschaften der Natursubstanz entweder nachahmen oder hemmen. Auch Gruppen von synthetischen Substanzen, z. B. die Barbiturate und Amphetamine, sind in diesen Familien eingeschlossen. Weiterhin können alle diese Verbindungen zur Bindung an das Enzym an einer Stelle, an der die biologische Aktivität zerstört werden kann, modifiziert sein. Diese modifizierten Verbindungen werden als »nachgemachte« Liganden bezeichnet

Alkaloide

Die erste Kategorie umfaßt die Alkaloide. In dieser Kategorie sind erfindungsgemäß auch solche Verbindungen eingeschlossen, die synthetisch hergestellt

werden und als physiologische Ersatzstoffe für die natürlich vorkommenden Alkaloide in Frage kommen. Alle natürlich vorkommenden Alkaloide haben ein Aminstickstoflatom als heterocyclisches Glied. Die synthetischen Alkaloide enthalten normalerweise ein tertiäres Amin-Stickstoffatom, das gegebenenfalls auch ein heterocyclisches Glied darstellen kann. Die Alkaloid«· enthalten im Molekül eine Vielzahl von Funktionalitäten, z. B. Äther, Hydroxylgruppen, Ester, Acetale, Amine, Isoxazole, Olefine, von denen alle, in Abhängigkeit von ihrer bestimmten Stellung im Molekül, als Stellen zur Verbindung mit der Funktionalität des Enzyms verwendet werden können.

Eine besonders bevorzugte Gruppe von Alkaloiden sind die Morphin-Alkaloide und ihre physiologisch nachgeahmten synthetischen Analogen. Alle diese Moleküle haben die nachstehend angegebene Funktionalität und Grundstruktur:

Das an das Enzym gebundene Morphin und seine nahe verwandten Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

N-VV"

20

-'5

30

Cm r\^* ·* HfTB « ■ ^Λ w *^anc

r.r.,„J L

X-A

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:
Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein oder ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

worin die freien Valenzen durch sehr unterschiedliche Gruppen, hauptsächlich Kohlenstoff und Wasserstoff, abgesättigt sind.

Das an das Enzym gebundene Analoge zu diesen Verbindungen hat in den meisten Fällen die nächste-

45

50

worin X eine Bindung oder eine Funktionalität, z.B. Imino, Azo, Oxy, Thio, Sulfonyl, Oxocarbonyl, Nicht-Oxocarbonyl oder Kombinationen dieser Funktionalitäten darstellt. Der Sauerstoff steht in der Ortho-, Meta- oder ^-Stellung. A ist ein Enzym, das mit X an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle verbunden ist und bei dem ein großer Teil der natürlichen enzymatischen Aktivität erhalten geblieben ist Es ist nur ein X — A je Ligand-Molekül vorhanden, obgleich mehrere w Liganden über X mit dem Enzym A verbunden sein können. Wenn auf ein Molekül im Zusammenhang mit einem -X⁺-A⁺ Bezug genommen wird, so ist das Ligandenmolekül gemeint. Deshalb sollten die vorstehend und die nachstehend angegebenen Formeln nicht &5 dahingehend ausgelegt werden, daß die Moleküle auf einen Liganden je Enzym beschränkt werden. Dies ist nachstehend noch näher erläutert

W¹ = Wasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und Aralkyl, z. B. Methyl und 0-Phenäthyl;

W2 = Wasserstoff;

W3 = Wasserstoff;

W⁴ = Wasserstoff oder zusammen mit W³ ein zweiwertiger Rest mit 3 — 6 Kohlenstoffatomen und 0 — 2 Sauerstoffatomen, der einen sechsgliedrigen carbocyclischen Ring mit der Kohlenstoffkette bildet, an die er gebunden ist, z.B. Propylen-13. l-Hydroxyprop-2-enylen-13, l-Hydroxypropyien-13, 1 - Acetoxypropylen-13, l-Acetoxyprop^-enylen-lA 1-Oxopropylen-13,1 -Oxoprop-2-enylen-13;

W⁵ = Wasserstoff oder Hydroxyl;

W⁶ = Wasserstoff, Hydroxyl oder zusammen mit W⁵ Oxy(-O-);

W⁷ = Wasserstoff oder Methyl;

A'⁸ = Wasserstoff oder Hydroxyl;

W⁹ = Wasserstoff. Hydroxy, Acyloxy mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z. B. Acetoxy (Acyloxy umfaßt nur Carboxy, falls nichts anderes gesagt ist), Hydrocarbyloxy mit 1 -3 Kohlenstoffatomen, z. B. Methoxy, Äthoxy, 2-(N-morpholino)-äthoxy und Glucuronyl; und

W^9a = Wasserstoff (in allen Formeln sind die ungesättigten Valenzen durch Wasserstoff abgesättigt, ausgenommen wenn eine Grundstruktur angegeben ist).

Unter Hydrocarbyl versteht man einen organischen Rest, der nur aus Wasserstoff und Kohlenstoff zusamm angesetzt isl und der gesättig t oder ungesättigt, aliphatisch, alicydisch oder aromatisch sein kann bzw. die entsprechenden Kombinationen enthalten kann.

Die eng verwandten Morphin-Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

— N-W

0—1 äthylenisch

ungesättigte Stellen

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:
Jede Gruppe W kann -X⁺-A⁺ sein, oder ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W = Alkyl mit 1 -3 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl; W⁴' = Wasserstoff, Hydroxy, Oxo oder Acetoxy;
W⁵' = Wasserstoff oder Hydroxyl;
W⁶' = Wasserstoff, Hydroxyl oder zusammen mit W⁵' Oxy(-O-);und

W⁹' = Hydroxy oder Alkoxy mit 1-3 Kohlenstoffatomen.

Beispiele für Verbindungen, die an ein Enzym gebunden werden können, sind Morphin, Heroin, Hydromorphon, Oxymorphon, Metopon, Codein, Hydrocodon. Dihydrocodein, Dihydrohydroxycodeinon, Pholcodin, Dextromethorphan Phenazocin und Dionin bzw. ihre Stoffwechselprodukte.

In den bevorzugten Verbindungen ist W¹ oder W⁹ gleich — X⁺ — Αλ bzw. es bilden W³ und W⁴ zusammen die Gruppierung

A⁺-X⁺-CHCH₂-A⁺-X^-CH-CH=CH-

Interesse in Beziehung gesetzt werden können. Der Hauptunterschied zwischen den bekannten Verbindungen und den vorliegenden Verbindungen ist die verbindende Gruppe und die Anwesenheit des Enzyms. Eine weitere Gruppe von Verbindungen mit narkotischer Wirksamkeit umfaßt Methadon und seine Analogen, die größtenteils die nachstehend angegebene Struktur haben:

W¹⁰

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind

O³-Carboxymethylmorphin,
N-(2'-Carboxypropyi)-0³-Methylmorphin,
O³-Methyl-O⁷-Morphinylsuccinat,
2-Aza-2-(2"-phenyIäthy!)-5,9-imethyl-6,7-(5'-carboxymethoxybenzolj-bicyclop^.l'-'loct-e-en,
O³-Äthyl-O⁷-(3'-aza-5-chlorpentyl)-morphin,
0⁷-Acetyl-0³-Carboxymethylmorphin,

7,8- Dihydro- 14-hydroxymorphinon-O-carboxymethyloxim und
O³-(2'-Aminoäthyl)-morphin.

Die einzelnen Gruppen werden so ausgewählt, daß sie mit bekannten Verbindungen mit physiologischem

W¹^-C-(O)_n-C

W"

-N

In dieser Forme! bedeuten:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

n = 0 oder 1 (gewöhnlich dieselbe Zahl in beiden Fällen);
m — 2 oder 3;
W⁰ISt Wasserstoff;

W" und W'2 sind Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Methylgruppe; sie können aber zusammen auch einen sechsgliedrigen Ring mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, bilden, z. B. in Form der Gruppen Pentylen-1,5 und 3-Oxa-oder 3-Azapentylen-1,5;

W¹³ ist Wasserstoff oder Methyl, wobei nur ein W¹³ Methyl ist;
W'" ist Wasserstoff;
W's ist Wasserstoff oder Hydroxyl;
W¹⁶ ist Wasserstoff, eine Acyloxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Propionoxygruppe, oder eine Hydroxylgruppe (wenn sowohl W¹⁵ als auch W¹⁶ Hydroxylgruppen sind, so liegt die Oxogruppe vor); und W'⁷ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Äthylgruppe.

Als Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, seien Methadon, Dextromoramid, Dipipanon, Phenadoxon, Propoxyphen (Darvon) und Acetylmethadon genannt.

Metaboliten von Methadon oder Methadon-Analogen kommen ebenfalls in Betracht Von den Methadon Metr.'ioliten ist N-Methal^-äthyl-S^-diphenyl-S-methylpyrrolin zu nennen.

Bevorzugte Verbindungen liegen vor, wenn W" oder W¹⁷ die Gruppe — X - — A ⁺ bedeuten.

Eine engere Klasse von Methadon- und Methadon-Analogen umfaßt Verbindungen mit der Formel

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten, oder ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ erseizi sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Siclle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

VV¹⁰ und W¹⁴' bedeuten Wasserstoff;

W"' und W¹²' bedeuten Methyl oder bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Morpholin- oder Piperidinring;

W¹⁵' und W¹⁶' bedeuten Wa; serstoff, Hydroxy- oder Acetoxy, wobei mindestens eine Gruppe eine Hydroxy- oder Acetoxygruppe darstellt; und

W¹⁷' ist eine Alkylgruppe mit 1 -3 Kohlenstoffatomen.

Die Methadon-Metaboiiten und nahe verwandten Analogen haben größtenteils die nachstehend angegebene Formel ν

20 Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind

Phenylbenzyl-(l-dimethylamino-2-propyl)-methylsuccinat,

Phenylbenzyl-(l-dimethylamir,o-2-propyl)-methyloxalat,

Diphenyl-(2-dimethylamino-1 -propyl)-methylmaleat,

O-Carboxymethyl-M-diphenyl-Z-dimethyiamino-2-heptanonoxim,
4,4-Diphenyl-7-dimethylamino-3-octylsuccinat, N-(2,2-diphenyl-3-methyI-4-morpholir:o-butyry!)-glycin und

3-Äthyl-4,4-diphenyl-6-dimethylaminohept-2-ensäurc.

Die dritte Gruppe von Verbindungen, die eine narkotische Wirkung haben, sind Mependin- oder Meperidin-Analoge, die sich in den meisten Fällen durch die nachsiehende Formel kennzeichnen lassen:

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worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:
Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein oder ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten:
Φ = Phenyl;
W»>" ₌ Wasserstoff;

W¹¹" = Wasserstoff, Methyl oder eine freie Valenz, die mit W¹⁵" verbunden ist;
W'³' = Wasserstoff oder Methyl;
W¹⁵" = Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe oder bildet zusammen mit W"" eine Doppelbindung zwischen dem Stickstoffatom und dem Kohlenstoffatom, an das W¹¹" und W^Iä" jeweils gebunden sind; und
VV¹⁷" ist eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich mit 2 Kohlenstoffatomen.

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65 W²²—C

In dieser Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ bedeuten bzw. ein H jeder der Gruppen W Kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 his zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W^ = Wasserstoff;

W²¹ = Wasserstoff, eine Aikylgruppe mit 1 -3 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Methylgruppe, eine Aminophenylalkylgruppe, z. B. die /?-(Aminophenyl)-äthyIgruppe, eine Phenylaminoalkylgruppe, z. B. die Phenylaminopropylgiuppe (die Alkylgruppe enthält hier 2 — 3 Kohlenstoffatome);

W²² ist eine Hydroxygruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Äthoxygruppe; W²³ ist Wasserstoff oder die Methylgruppe.

Als Beispiele für diese Verbindungen seien Meperidin, alpha-Prodin, Alvodin und Anileridin genannt

Bevorzugte Verbindungen sind solche, die denen W²¹ oder W²² -X⁺-A⁺ bedeutet bzw. in denen ein Wasserstoff von W²¹ durch -X⁺-A⁺ ersetz! ist

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym gebunden werden können, sind 13-Dimethyl-4-phenylpiperidinylcarbonsäure, 1 -Carboxymethyl^-phenyM-carboxylpiperidin und N-(l-Methyl-4-phenyl-piperidylcarbonyl)-glycin.

Eine zweite Gruppe von interessierenden Liganden leiten sich vom Tryptamin ab und fallen in die Klasse der Indolalkaloide, insbesondere in die Klasse der Ereotal-

kaloide. Diese Verbindungen haben die nachstehende Grundstruktur:

worin die freien Valenzen durch eine Vielzahl von Gruppen abgesättigt sind, insbesondere Kohlenstoff und Wasserstoff, obgleich auch andere Substituenten vorhanden sein können, z. B. Carboxylgruppen, Hydroxylgnzppen, Ketognippen usw. Der häufigste Vertreter dieser Klasse, der erfindungsgemäß in Betracht gezogen wird, ist die Lysergsäure, hauptsächlich ihr Diäthylamid. Andere Vertreter dieser Klasse umfassen Ergotamin, Ergotaminin, Isolysergsäure und Ergosin. Andere Vertreter der Indolalkaloid-Familie, die ebenfalls analysiert werden können, sind die Strychningruppe und die Indolopyndocolingruppe; in diese Klasse fallen Yohimbin und Reserpin.

Die mit dem Enzym substituierten Indolalkaloide haben die nachstehende Formel:

-X-A

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worin X und A die vorstehend angegebene Bedeutung haben.

Andere Gruppen von Alkaloiden umfassen die Steroidalkaloide, die Iminazolylalkaloide, die Chinazolinalkaloide, die Isochinolinalkaloide, die Chinolinalkaloide (am bedeutendsten ist hier das Chinin) und die Diterpenalkaloide.

Zum größten Teil haben; die Alkaloide, die mit einer Enzym-Funktionalität verbunden sind, ein Molekulargewicht von etwa 300—1500, gewöhnlich von etwa 400— 1000. Sie sind normalerweise nur aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff zusammengesetzt. Der Sauerstoff ist in Form von Oxy- und Oxogruppen vorhanden, und der Stickstoff liegt in Form von Amino- oder Amidogruppen vor.

Von großer Bedeutung sind auch Drogen, die zwar, medizinisch richtig angewendet, einen guten Zweck erfüllen, die aber auch außerhalb des medizinischen Gebietes mißbräuchlich verwendet wurden. Beispiele innerhalb dieser Kategorie sind Amphetamine, Barbiturate und andere Drogen, die gefühlsanregend wirken.

Catecholamine

Unter die erste Gruppe fallen Catecholamine mit der Formel:

VV'¹ VV-" W³"

60 In dieser Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ bedeuten bzw. ein H von jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereidi von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W³⁰ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1—3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Methylgruppe;
W³¹ ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Methylgruppe;
W^und W= sind Wasserstoff;

W³* ist Wasserstoff, die Hydroxy-, Dimethoxycarboxyphenacyl- und Dimethoxy-a-phthalidylgruppe;
W³⁵ und W³⁶ sind Wasserstoff, wobei eine Gruppe mit W³' eine Bindung bilden kann; wenn W³¹ und W³⁵ miteinander verbunden sind, können W³² und W³³ bzw. W³⁰ und W³⁶ zusammen eine Doppelbindung bilden;
W³⁷ ist Wasserstoff oder eine Alkoxygruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Methoxygruppe;
W³⁸ und W³⁹ sind Hydroxy- oder Alkoxygruppen mit 1 —3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Methoxygruppe.

Als Beispiele für diese Verbindungen seien Cotarnin, Narcein, Noscapin und Papaverin genannt.

In den bevorzugten Verbindungen bedeuten W³⁰, W³⁸ oder W³⁹ die Gruppe -X⁺-A⁺, bzw. ein Wasserstoff ist durch -X⁺-A⁺ ersetzt.

Beispiele für derartige Verbindungen, die mit einem Enzy;n verbunden werden können, sind Narcein, l-Carboxymethy!-2-methyl-6,7-möthylendioxy-8-methoxy,l,23,4-tetrahydroiso-hinolin und l-(2',3',4'-Trimethoxy-2-carboxybenzyl)-2-methyl-6,7-methylendioxy-8-methoxy-l,2,3,4-tetrahydrochinolin.

Eine weitere Gruppe von Catecholaminen sind Epinephrin oder die Amphetnmine und verwandte Verbindungen. Diese Verbindungen haben die Formel

55 VV-¹

CH

-C

I \

VV⁴²

VV

Die Substituenten in dieser Formel haben folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺ -A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von I bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W« und W«' sind Wasserstoff, die 2-Phenyl-2-Butylgruppe oder Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Methyl- und Isopropylgruppe, wobei vorzugsweise ein Substitueit Wasserstoff ist;
W⁴² (die jeweils gleich oder verschieden sind) sine¹ Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit I —3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Methyl- und Äthylgruppc. sowie die Carboxygruppe. wobei nur eine Carboxygruppe vorhanden ist: eine Gruppe W^JJ kann aber auch zusammen

mit W⁴¹ einen Piperidinring bilden; gewöhnlich ist W⁴² Wasserstoff oder eine Methylgruppe; W⁴³ ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und W⁴⁴ und W« sind Wasserstoff, Hydroxyl- oder Alkoxylgruppen mit 1—3 Kohlenstoffatomen.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Ephedrin, Epinephrin, L-dopa, Cohefrin, Benzidrfn (Amphetamin), Paredrin, Methamphetamin, Phentermin, Methylphenidat und Norephedrin.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind

3-(3',4'-Dihydroxyphenyl)-3-hydroxypropionsäure, N-flS-ü^-Trihydroxyphen^äthylJ-N-methylglycin,

N-(l-Phenyl-2-propyl)-N-methylglydn, N-( 1 -Phenyl-2-propyI)-oxalamsäure, 0-( 1 -PhenyI-2- methylamino-1 -propyl)-g!y kolsäure, p-(2-DimethylaminopropyI-l)-phenoxyessigsäure, N-( 1 '-Phenyl-2'-propyl)-glycin, 4-Methylamino-4-phenylvaIeriansäure, para-(2-Aminopropyl-l)-phenoxyessigsäureund 2-Amino-4-phenylbuttersäure.

Wenn W⁴⁴ und W⁴⁵ Wasserstoff bedeuten, haben bevorzugte Verbindungen die nachstehend angegebene Formel:

W'³

CH-

W⁴²

-CH

-N

-W*

W⁴

CH CH

•N

60

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben: Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A ⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine

10

15

20 verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeoien;

W«o-, W⁴«- und W«" sind Wasserstoff oder eine Methylgruppe;

W⁴³" ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und

W⁴⁴" und W⁴⁵" sind Hydroxyl- oder Methoxylgruppen.

Mit Amphetaminen nahe verwandte Verbindungen sind solche, in denen ein gesättigter fünf- oder sechsgliedriger Ring anstelle des Phenylringes steht Diese Verbindungen haben die nachstehend angegebene Formel:

W⁴⁰"

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺ -A⁺ sein, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt ao sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, 4; bedeuten:

W⁴⁰' und W⁴¹' sind Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, wobei vorzugsweise ein Wasserstoff vorhanden ist;

W⁴²'ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe; W⁴³' ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W⁴«· ist Wasserstoff.

We:m W⁴⁴ und W⁴⁵ Oxygruppen bedeuten, haben die bevorzugten Verbindungen die nachstehend angegebene Formel worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:
Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W⁴⁰"-⁴³' haben die vorstehend angegebene Bedeutung;
W⁴⁶' ist Wasserstoff;und
η = eine ganze Zahl von 4 bis 5.

Barbiturate

Eine breite Klasse von synthetischen Drogen, die einem ausgedehnten und häufigen Mißbrauch ausgesetzt sind, sind die Barbiturate. Diese Verbindungen sind synthetisch leicht zugänglich, und ihr Gebrauch kann nur schwierig überwacht werden. Die in Betracht kommenden Verbindungen lassen sich durch die nachstehende Formel kennzeichnen:

W⁵·'—N

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

W⁵⁰ ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Methylgruppc oder ein Alkalimetallkation, z. B. Natrium:

W* und W» sind Wasserstoff, eine Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- oder Arylkohlenwasserstoffgruppe mit 1—8, insbesondere 1—6 Kohlenstoffatomen, z.B. die Äthyl-, η-Butyl-, α-Methylbutyl-, Isoamyl-, Allyl-, ^!-Cyclohexenyl- und Phenylgruppe; gewöhnlich ist W^a eine Kohlenwasserstoff gruppe mit 2—8 Kohlenstoffatomen;

W⁵³ ist Wasserstoff oder ein Alkalimetallkation, z. B. Natrium; W^ist Sauerstoff oder Schwefel.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Veronal, Medina!, Lumina!, Prominal, Soneryl, Nembutal, Amytal, Dial, Phenadorn, Seconal, Evipan, Phenobarbital und PentothaL

In den bevorzugten Verbindungen sind W⁵⁰ oder W⁵¹ bzw. ein Wasserstoff von W⁵⁰ oder W⁵' gleich -X+-A+.

Bevorzugte Verbindungen liegen auch dann vor, wenn ein W⁵¹ bis·. W^M eine Alkylgruppe mit 1—4 Kohlenstoff bedeutet

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind

5,5-DiäthyI-l -carboxymethylbarbitursäure, 5-Äthyl-5-n-butyl-1 -succinoylbarbitursäure,
5-Äthyl-5-phenyl-1 -(N-(2'"-ch!oräthyl)-2"-aminoäthyl)-barbitursäure,

5-(2'-Carboxy-4^l'²'-cyclohexenyl)-l^-dimethylbarbitursäure und l-Methyl-5-äthyl-5-(p-carboxyphenyl)-barbitursäure.

Cocain

Eine Droge von großer Bedeutung hinsichtlich der verbrauchten Menge ist das Cocaia Das mit dem Enzym markierte Cocain bzw. Cocain-Stoffwechselprodukt oder -Analoge, wie Ecgonin, haben im wesentlichen die nachstehend angegebene Formel

CH,-

-CH CHCOW⁵⁵

\ I

N-W⁵⁷ CH-OW⁵⁶
-CH CH,

In dieser Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H von jeder Gruppe W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A+, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;
W⁵⁵ ist eine Hydroxy-, Methoxy- oder Aminogruppe;
f, W⁵⁶ISt Wasserstoff oder eine Benzoylgruppe;und
% W³⁷ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 _bo Kohlenstoffatomen,z. B. die Methylgruppe.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Norecgoninyl-8-essigsäure und N-Carboxymethylnorcocain.

Diphenylhydantoin ^b~"

Eine weitere Verbindung von Interesse ist die antiepileptische Droge Diphenylhydantoin. Diese Verbindung und ihre Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

Φ—W¹*⁰

__N [__φ

O=I_nJ=O

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jeu« der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

Φ = Phenyl; und

W¹», W^a61 und W^a62 sind Wasserstoff.

Aminosäuren, Polypeptide und Proteine

Die nächste Verbindungsgruppe umfaßt die Aminosäuren, Polypeptide und Proteine. In den meisten Fällen enthalten die Aminosäuren 2 — 14 Kohlenstoffatome und umfassen eine Vielzahl von funktioneilen Gruppen, wie die Mercapto-, Dithio-, Hydroxyl-, Amino-, Guanidyl-, Pyrrolidinyl-, Indolyl-, Imidazolyl-, Methylthio-, Jod-, Diphenyläther-, Hydroxyphenyl- und andere Gruppen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um die menschlichen Aminosäuren, wobei es auch andere Aminosäuren gibt, die in Pflanzen und Tieren vorkommen.

Die Polypeptide haben normalerweise etwa 2 bis 100 wiederkehrende Aminosäureeinheiten. Ihr Molekulargewicht ist gewöhnlich niedriger ate etwa Ί2 000. Größere Polypeptide werden willkürlich Proteine genannt. Proteine sind gewöhnlich aus 1 —20 Polypeptidketten (Untereinheiten) zusammengesetzt, die durch kovalente oder nichtkovalente Bindungen assoziiert sind. Die Untereinheiten enthalten normalerweise etwa 100 — 300 Aminosäuregruppen und haben ein Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 35 000. Die individuellen Polypeptide und Protein-Untereinheiten haben normalerweise etwa 2 bis 300, gewöhnlich etwa 2 bis 150 wiederkehrende Aminosäuregruppen. Gewöhnlich haben die Polypeptide und Proteinuntereinheiten, die hier interessieren, ein Molekulargewicht von nicht mehr als etwa 40 000, gewöhnlich nicht mehr als etwa 20 000 und mehr als etwa 750. Alle Aminosäuren können zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden. Wegen der großen Vielzahl der funktioneilen Gruppen in den Aminosäuren und in den verschiedenen natürlich vorkommenden Polypeptiden kann das Enzym mit jeder beliebigen Funktionalität verbunden werden, indem für die freie Radikalverbindung die geeignete Funktionalität gewählt wird. Gewöhnlich kann das Enzym mit einer Cystein-, Lysin- oder Arginirgruppe verbunden werden, obgleich auch Serin, Threonin oder eine andere Aminosäure mit einer Dassenden Funktionalität ve-wendei werden kann, z. B. mit der Carboxy- und Hydroxy-Funktionalität.

Enzymgebundene Polypeptide sind an sich bekannt. Die für das Verfahren gemäß der Erfindung brauchba-

ren Substanzen haben im allgemeinen die folgende Formel

H,N fCHCO—ΝΗλ CHCQ₁H^ (X-A)_n-

worin X und A die vorstehend angegebene Bedeutung haben, R einen Aminosäurerest und η eine ganze Zahl von 1 bis 2000, gewöhnlich von 1 —500, üblicherweise von 2—200 bedeuten, n' ist eine ganze Zahl von mindestens 1 und nicht größer als das Molekulargewicht des Polypeptids, geteilt durch 20 000. Bei kleinen Liganden ist nur ein Enzym mit einem Liganden verbunden, während bei hochmolekularen Liganden, z.B. Polypeptiden, mit einem Molekulargewicht von 4000 oder darüber, mehrere Enzyme mit dem Liganden verbunden sein können.

Beispiele für Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Serin, Histidin, Methionin, Hydroxyprolin, Tryctophaci, Tyrosin, Thyroxin, Ornithin, Phenylalanin, Arginin und Lysin. Interessierende Polypeptide sind AClM, Oxytocin, Gelbkörperhormon, Insulin, Bence-Jones-Protein, Choriongonadotrophin, Hypophysen-Gonadotropin, Wuchshormon, Renin, thyroxidbindendes Globulin, Bradykinin, Angiotensin, follikelanregendes Hormon.

In vielen Fällen ist es erwünscht, ein Protein abzubauen und die kleineren Poiypeptidfragmente zu analysieren. Die Konzentration des Fragments kann dann mit der Menge des ursprünglichen Protein:, in Beziehung gesetzt werden.

Steroide

Eine weitere wichtige Gruppe von Verbindungen, die js erfindungsgemäß verwendet werden können, sind die Steroide, die einen weiten Bereich von Funktionalitäten haben, was von ihrer Körperfunktion abhängt. Neben den Ste-oiden gibt es die steroidähnlichen Substanzen, die zwar nicht die polycyclische Grundstruktur der Steroide haben, jedoch einige der physiologischen Wirkungen der Steroide.

Die Steroide wurden sehr intensiv untersucht, und es wurden Derivate hergestellt, die zur Gewinnung von Steroiri-Antikörpern mit antig&ien Proteinen verbunden wurden. Als Beispiele seien folgende Verbindungen genannt:

17/?-Östradiol-6-(O-carboxymethyl-oxim)-RSA (Rinderserumalbumin) (F. χ ley et al., Steroids 18, 593 [1971]); Testosteron-3-oxim-Derivat von RSA (Midgley, et al., Acta Endocr. 64, Supplement 147, 320 [1970]) und Progesteron-3-oxim-Derivat von RSA (M i d g I e y et al, ibid).

In den meisten Fällen haben die verwendeten Steroide die folgende Grundstruktur:

C an den Stellungen 2, 3, 4, 6 oder 11 bzw. an der Stellung 16 oder 17 des Ringes D bzw. att den Seitenketten der Stellung 17 verbunden. Die Ringe können verschiedene Substituenten tragen, insbesondere Methylgruppen, Hydroxylgruppen, Oxocarbonylgruppen, Äthergruppen und Aminogruppen. Alle diese Gruppen können dazu verwendet werden, um das Enzym mit der Ringgrundstruktur zu verbinden. Zum größten Teil haben die interessierenden Steroide mindestens eine, gewöhnlich 1—6, insbesondere 1—4 Sauerstoff-Funktionalitäten, z. B. Alkohol-, Äther-, Ester- oder Ketofunktionen. Weiterhin können HaIogensubstituenten vorhanden sein. Die Steroide haben gewöhnlich 18 bis 27 Kohlenstoffatome.

Die Ringe können eine oder mehrere ungesättigte Stellen (äthylenisch oder aromatisch ungesättigte Stellen) aufweisen; sie können weiterhin in gewissen Stellungen mit sauerstoffhaltigen Substituenten substituiert sein, z. B. in den Stellungen 6, 7 und 11. Weiterhin können Methylgruppen in den Stellungen 10 und 13 vorhanden sein. Die mit Z bezeichnete Stellung, nämlich die Stellung 17, kann sehr unterschiedlich substituiert sein, was von dem jeweiligen Steroid abhängt Z steht für zwei einwertige Gruppen oder eine zweiwertige Gruppe und kann ein Carbonylsauerstoff, eine aliphatische Gruppe mit 1—8 Kohlenstoffatomen, einschließlich einer Acetylgruppe, einer Hydroxyacetylgnjppe, einer Hydroxy-Carboxygruppe cder eine Carboxyalkylgruppe mit 2 — 6 Kohlenstoffatomen, eine acetylenische Gruppe mit 2 — 6 Kohlenstoffatomen oder eine halogensubstituierte Alkyl- oder eine sauerstoffhaltige Alkylgruppe, oder eine Gruppe mit mehr als einer Funktionalität, gewöhnlich mit 1—3 Funktionalitäten, sein.

Die Gruppe Z kann Wasserstoff oder eine zweite Gruppe bedeuten, insbesondere eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe, z. B. die Methylgruppe, eine Hydroxyalkylgruppe, z. B. die Hydroxymethylgruppe, Halogen. z. B. Fluor oder Chlor, eine Oxyäthergruppe und dergleichen.

Diese Steroide stellen Hormone dar, z. B. männliche und weibliche Geschlechtshormone, die in Östrogene, Gestogene und Androgene unterteilt werden können; weiterhin können sie adrenocoaieoide Hormone (Glucocorticoide), Gallensäuren, cardiotonische Glycoside und Aglycone sowie Saponine und Sapogenine darstellen.

Als Beispiel für steroidähnliche Substanzen, insbesondere Geschlechtshormone, sei Diäthylstilhöstrol angegeben.

Die interessierenden Geschlechtshormone können in zwei Gruppen unterteilt werden: Die männlichen Hormone (Androgene) und die weiblichen Hormone (östrogene).

Brauchbare Androgene hat die nachstehend angegebene Formel

60

Χ—Λ

65

worin X und Λ wie vorstehend definiert sind. Gewöhnlich wird das Enzym mit den Ringen A, B oder

0—-I äth\lcnisch imucsiiltiiMc Stellen

In dieser Formel können die Substituenlen folgende Bedeutungen haben:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten; ι ο

W⁶⁰ ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;
W" ist Wasserstoff, eine Methyl- oder Hydroxylgruppe (wenn zwei Hydroxylgruppen mit demselben Kohlenstoffatom verbunden sind, handelt es sich um eine Oxogruppe); W⁶² und W⁶³ sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, wobei mindestens eine der Gruppen W⁶⁰-⁶³ eine Hydroxylgruppe (eine eigentliche Hydroxylgruppe oder eine oxogruppe) darstellt;

W*⁴ ist Wasserstoff bzw. zwei W^M können zusammen eine Doppelbindung bilden;
W« ist Methyl; und
WM ist Wasserstoff.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Testosteron, Androste- 2i ron, Isoandrosteron, Äthiocholanon, Methyltestosteron und Dehydroisoandrosteron.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind N-Carboxymethoxytestosteronimin, 17-Monou stosteronylcarbonai, Androsteronylsuccinat, Testosteronylmaleat, O³-Carboxymethyl-O^l7-methyl-androst-5-en-3/f, 17/?-dioI, Testosteron-O-carboxymethyloxim und Androsteronylcarbonat.

Die östrogene haben einen aromatischen Ring A und zum größten Teil die nachstehend angegebene Formel: J5 W'⁴ ist Wasserstoff bzw.es können zwei W⁷⁴ zusammen eine Doppelbindung bilden; und
W" ist Wasserstoff.

Beispiel»' für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Equilenin, ^-Östradiol, östron,östriol und 17-a-Äthinyl-östradiol.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind 3-Carboxymethylästradiol, 2-Chlormethylöstron, östronglutarat, Equileninylaspartat, östron •O-carboxymethyloxim und Equileninyl-N-carboxyniiMhylthiocarbamat.

Eine weitere Klasse von Hormonen sind die Gestogene mit der nachstehend angegebenen Formel:

40

0—1 äthylenisch
ungesättigte Stellen

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:
Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A^ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich vor 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W™ oder W⁷' sind Wasserstoff, eine Äthinylgruppe oder Hydroxylgruppe (wenn zwei Hydroxylgruppen am selben Kohlenstoffatom stehen, handelt es sich um eine Oxogruppe); &5

W⁷² ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;
W⁷³ ist eine Hydroxyl- oder Alkoxylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen:

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben: Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ darstellen, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ srsstzt sein w"*rin X⁺ eine ni^^n«*» ηΛ**- _α·ηα verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W⁸⁰ und W⁸¹ sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist (wenn zwei Hydroxylgruppen an demselben Kohlenstoffatom stehen, so handelt es sich um die Oxogruppe); W⁸² ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W⁸³ und W⁸⁴ sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist; und

W⁸⁵ ist Wasserstoff bzw. zwei W⁸⁵ können zusammen eine Doppelbindung bilden.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Progesteron, Pregnenolon, Allopregnan-3a : 20a-diol und AIlopregnan-3aol-20-on.

Beispiele für Verbindungen, die mit Enzymen verbunden werden können, sind

20-Progesteron-O-carboxymethyIoxim, Pregn-4-6^20-0^3^110^10^11^^(^30^3^6, O-CaTboxymetIiylprogesteron-3-oxim, Pregnenolonyltartrat,

O-Pregnenolonyl-Milchsäure und A!iopregnan-3-i;arboxyrnethy!-20-oL

Die nächste wichtige Gruppe von Steroiden sind die Carticosteroide. die sowohl die Mineralocorticoide und

die Glucocorticoide umfassen. Diese Verbindungen haben die nachstehend angegebene Formel:

0—I äthylenisch ungesättigte bleuen

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben: Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A ⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten:

V ^TO ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W⁹¹ und W^H sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist (stehen zwei Hydroxylgruppen an demselben Kohlenstoffatom, so handelt es sich um eine Oxogruppe); W" ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; WM, W», W* und W" sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine Gruppe W^w und W⁹⁵ eine Hydroxylgruppe darstellt; und W" ist eine Methyl- oder Formylgruppe; W" ist Wasserstoff oder zwei W" können zusammen eine Doppelbindung bilden.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind 17-Hydroxydioxycorticosteron (Verbindung S), Desoxycorticosteron, Cortison, Corticosteron, 11-Dihydrocortison (Verbindung F), Cortisol, Prednisolon und Aldosteron.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden sein können, sind O^2l-Carboxymethylcorticosteron, N-Carboxymethyl-21 -carbamat-cortisol, 21 -Cortisonsuccinat, 21 -Desoxocorticosteronsuccinat undO¹⁷-Methyl-O²¹-carboxymethylcortison.

Eine weitere Steroidfamilie umfaßt die Sapogenine, von denen Digitalis ein wichtiges Glied ist Die Grundverbindung ist das Gitoxigenin, das auch als Glycosid vorkommt. Die interessierenden Verbindungen haben die nachstehend angegebene Formel:

0—I äthylenisch ungesättigte Stellen

In der Forme! haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt,

ίο bedeuten;

W*¹, W^a2 und W^a3 sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, gewöhnlich eine Hydroxylgruppe;
und wobei für den Fall, daß am Lactonring eine äthylenisch ungesättigte Stelle vorhanden ist, am Kohlenstoffatom 12 eine Hydroxylgruppe vorhanden sein kann.

Marihuana

Wegen seiner leichten Zugänglichkeit und wege·!

seines häufigen Gebrauchs ist Tetrahydrocannabinol (der wirksame Bestandteil von Marihuana) zusammen mit den verwandten Verbindungen Cannabidiol und Cannabinol und deren Stoffwechselprodukten eine Verbindung von großem Interesse, weshalb eine einfache Analysenmethode wichtig wäre. Die Verbindungen, die als Analoge in Frage kommen, haben die nachstehend angegebene Formel:

w^al2

0-3 äthylenisch ungesättigte Stelle:!

W^a

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben: Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;·

so W^aI° ist Wasserstoff oder eine Carboxylgruppe;
W»" ist eine Hydroxylgruppe;
W^a'³ ist eine Pentylgruppe;

W^aM ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe, bzw. die beiden Gruppen W^aM können miteinander einen

carbocyclischen Ringmit4—6 Ringgliedern bilden; und W^al5 ist eine Methyl- oder Carboxylgruppe.

Vitamine

Die nächste Gruppe von Verbindungen umfaßt die ω Vitamine. Chemisch sind die Vitamine keine einfache chemische Klasse, da sie sich in ihrer Struktur stark unterscheiden; sie werden jedoch hinsichtlich ihrer Wirkungsweise als eine Gruppe zusammengefaßt Die Vitamine umfassen Vitamin A, das ein Carotin darstellt, die Vitamin-B-Gruppe die Riboflavin, Thiamin, Niacin, Pyridoxin, Pantothensäure, Biotin, Folsäure und Cyanocobalamin (Vitamin Bn) einschließt. Ascorbinsäure (Vitamin C), die Vitamine D, die sich von den Steroiden

ableiten, Tocopherol (Vitamin E), und Phylyi-l,4-naphthochinon (Vitamin K).

Zucker

Die nächste Gruppe von Verbindungen umfaßt die Zucker und Saccharide. Die Saccharide sind Kombinationen verschiedene Zucker, die Dimere, Trimere und hochmolekulare Polymere bilden, die man als Polysaccharide bezeichnet.

Prostaglandin

Eine weitere Gruppe von Verbindungen von biologischer Bedeutung sind die Prostaglandine. Diese Verbindungen haben an ein Enzym gebunden zum größten Teil die nachstehend angegebene Formel

W-²"

/v

W"

Cs H₉ -! ι

CH₁₀-,2-COW

C₃H-

-COCH₂-C-CH,-O—CVV^a

0—I äthvlenisch iiimesattisite Stellen

die

In dieser Formel haben die Substituenten
nachstehend angegebenen Bedeutungen:
Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W^a20 ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;
W^a21 und W^a22 sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe (wenn zwei Hydroxylgruppen mit demselben Kohlenstoffatom verbunden sind, handelt es sich um eine Oxogruppe);

W^a23 ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und
W=²⁴ ist eine Hydroxyl-, Amino- oder Carboxygruppe mit 1 —6 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Alkoxygruppe.

Tranquilizer (Beruhigungsmittel)

Eine Reihe von Verbindungen hat Tranquilizer-Wirkung, und infolge ihrer mißbräuchlichen Verwendung kann es Fälle geben, in denen ihre Bestimmung wichtig ist.

Der erste interessierende Tranquilizer ist Meprobamat. Diese Verbindung und ihre Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

In dieser Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ei?> H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende .44

Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W¹²⁵ und W^a26 sind Aminogruppen.

Die nächste Gruppe von Tranquilizern sind Benzdiazocycloheptane, die als Diazepam oder Oxazepam bekannt sind. Diese Verbindungen und ihre Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

w-³²

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W^o und w« sind Wasserstoff; W^a3' ist Wasserstoff, sine niedere Alkylgruppe ™it ! —3 Kohiensioffatorrien, z. B. die Methylaminogruppe, bzw. kann in Verbindung mit W^a32 eine Doppelbindung zwischen dem Kohlenstoff- und Stickstoffatom bilden;
W^a33 ist eine Amino- oder niedere Alkylamino^ruppe mit 1—3 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Methylaminugruppe, bzw. kann zusammen mit W^a32 eine Carbonylgruppe bilden;

W^a34 ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und
W^a36 ist eine Oxygruppe oder zwei ungepaarte Elektronen.

Die nächste Gruppe von Verbindungen umfaßt die Phenothiazine, zu denen das Chlorpromazin gehört. Diese Verbindungen haben zum größten Teil die nachstehend angegebene Formel

W--¹²

XVsx/χ

ⁿ ¹A

w-

w^a

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

W^a4° ist Wasserstoff, eine Alkyigruppe mit 1—6 &5 KohWr.stoffatornen, eine Dialkyiaminoalkylgrüppe mit 4—8 Kohlenstoffatomen, z. B.S-Dimethylamino-propyl; eine N-Hydroxyalkylgruppe (Alkylrest mit 2—3 Kohlenstoffatomen), eine N'-Piperazinoalkylgruppe (Alkyl-

rest mit 2-3 Kohlenstoffatomen), z.B. N-Hydroxyä:- hyl-N'-^iperazinopropyl; eine N-Alkylgruppe (Alkylrest mit !—3 Kohlenstoffatomen), eine N'-Piperazinoalkyl· gruppe (Alkylrest mii 2 — 3 Kohlenstoffatomen), z.B. N-Methyl-N'-piperazinopropyl; und eine 2-{N-A!kyl)-piperidinylalkylgruppe, worin die N-Alkylgruppe 1-3 Kohlenstoffatome und die andere Alkyigruppe 2-3 Kohlenstoffatome enthält, ζ. B. 2-(N-Methyl)-piperidinyläthyl, wobei mindestens zwei Kohlenstoffatome zwischen den Heteroatomen stehen; iu

W^a41 ist Wasserstoff, Chlor, eine Trifluormethyl- oder Alkylmercaptogruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Methylmercaptogruppe, oder eine Acylgruppe mit 1—3 lCohlenstoff atomen, z.B. die Acetylgruppe; und W»« und W^a« sind Wasserstoff.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Chlorpromazin. Promazin, TrifliiOipromazin, Fluphenazin, Thioridazin, Perphenazin \md Prochlorperazin. jo

Andere Verbindungen

Die letzte Gruppe umfaßt andere Verbindungen, die eine Vielzahl von Drogen oder anderen Chemikalien einschließen, die in der Medizin, in der Tiermedizin und auf anderen Gebieten Anwendung finden.

In diese Gruppe fallen die Antibiotika, z. B. Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin und Nucleinsäuren oder deren Derivate, wie Nucleoside und Nucleotide.

Von Interesse ist weiterhin das Serotonin, bei dem es sich um 3-(2'-Aminoäthyl)-5-hydroxyindo! handelt. -X⁺-A⁺ kann mit jedem der beiden Stickstoffatome oder mit der Hydroxylgruppe verbunden sein.

Natürlich erleiden viele der interessierenden Verbindüngen im Stoffwechsel von Vertebraten Veränderungen. Die jeweilige physiologische Flüssigkeit, die getestet wird, kann nur einen kleinen Teil bzw. nichts mehr von der ursprünglichen Verbindung enthalten. Deshalb kann die ursprünglich vorhandene Verbindung nur als Metabolit (Stoffwechselprodukt) nachweisbar sein. In vielen Fällen kann der Metabolit das Glucuronid (Oxy- oder Oxoderivat) der ursprünglichen Verbindung sein. In anderen Fällen kann die ursprüngliche Verbindung oxydiert (hydroxyliert), reduziert, desaminiert, aminiert, methyliert oder stark abgebaut worden sein. Hat der Metabolit immer noch einan wesentlichen Anteil der räumlichen und polaren Geometrie der ursprünglichen Verbindung, so ist es häufig möglich, das Ligand-Analoge entweder auf die ursprüngliche Verbindung oder den Metaboliten zu beziehen. Unterscheidet sich der Metabolit deutlich von der ursprünglichen Verbindung, so wird das Ligand-Analoge auf den Metaboliten bezogen.

Neben den Metaboliten der verschiedenen Arzneimittel, Hormone und anderen Verbindungen, die vorstehend beschrieben wurden, sind auch Metaboliten von großem Interesse, die sich auf Krankhekszustände beziehen.

Beispiele für diese Verbindungen sind Spermin, Galactose, Phenylpyruvsäure und Porphyrin-Typ 1, die als diagnostisch für gewisse Tumoren, für Galactosämie, Phenylketonurie bzw. kongenitale Porphyrie gelten.

Zwei interessierende Verbindungen, die Metaboüten von Epinephrin darstellen, sind Vanillylmandelsäure und b5 Homovanillinsäure. Bei diesen Verbindungen kann entweder die Hydroxylgruppe oder die Carboxylgruppe als die Stelle für -X⁺-A⁺ verwendet werden.

Eine weitere interessierende Verbindung ist Gluthethimid, worin das an das Enzym gebundene Analoge die nachstehend angegebene Formel hat:

ο ι ο

V Nv/

W^a

In der Formel haben die Substituenien folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. -:in H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Fn7vm. das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W^a5° und W^a51 sind Wasserstoff; und
W^a52 ist eine niedere Alkyigruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen, z. B. die Äthylgruppe.

Eine weitere interessierende allgemeine Gruppe umfaßt die Pesticide, ζ. B. die Insecticide, Fungicide, Bactericide und Nematocide. Beispiele für diese Verbindungen sind Phosphate, wie Malathion, DDVP, Dibrom;Carbamate, wie Carbarylusw.

Weiterhin können auch große organische Strukturen oder Systeme, wie Viren und Zellen, Liganden darstellen. Es ist bekannt, daß diese Systeme Rezeptoren und eine Vielzahl von Stellen für die Bindung mit einer großen Anzahl von Enzymen aufweisen. Bei Viren dient die äußere Proteinhülle als Ligand, an den die Enzyme gebunden werden. Bei Zellen kann die äußere Membrane die Bindunpsstellen für die Enzyme liefern. Beispielsweise kann ein System mit der Formel

(CV)-X⁺-A⁺J_n,

vorliegen, worin CV eine Zelle oder ein Vires darstellt, X⁺-A⁺ die nachstehend angegebene BedcJtung hat und /77 eine Zahl von sehr viel mehr als 1, d.h. von mindestens 100 bis einige Tausend, gemittelt über das gesamte System, bedeuten.

Da viele der biologisch aktiven Substanzen nur in einer steroisomeren Form aktiv sind, so soll die aktive Form oder das Racemat in Betracht kommen, wenn das Racemat befriedigend und leicht zugänglich ist. Die Antikörper sind füF die jeweils verwendete Form des Hapiens spezifisch.

Enzyme (A)

Obwohl im Prinzip erfindungsgemäß beliebige Enzyme verwendet und mit einem Liganden verbunden werden können, gibt es in der Praxis gewisse Beschränkungen. Bei der Beschränkung hinsichtlich der Enzyme handelt es sich aber nicht um eine Frage der Durchführbarkeit, sondern lediglich um eine Frage der Verminderung der Schritte zur Durchführung der Analyse, um eine Frage der Erhöhung der Zuverlässigkeit, z. B. durch Verwendung von stabileren Enzymen, die in trockenem Zustand oder in Lösung lange Zeit haltbar sind, und um eine Frage der Verwendung von Enzymen, die im allgemeinen nicht Störungen unterworfen sind, entweder durch andere, natürlich vorkommende Enzyme, die mit dem Substrat oder mit anderen

natürlicherweise vorhandenen Substraten in Wettbewerb treten oder die mit dem zum Nachweis des Liganden zugesetzten Substrat in Wettbewerb treten. Diese Beschränkungen können aber zum größten Teil überwunden werden, s j daß gegen die Verwendung eines bestimmten Enzyms kein prinzipieller Hinderungsgrund besteht. Weiterhin hängt die Art der jeweils verwendeten Enzyme von der Analyse und der jeweils zu untersuchenden Flüssigkeit ab. Hydrolytische Enzyme, die im Speichel vorhanden sind, brauchen im Urin to weniger berücksichtigt zu werden. Katalase, die mit Wasserstoffperoxyd reagiert, ist verhältnismäßig häufig, und wenn man eine Peroxydase verwenden will, so sollte aile vorhandene Katalase entweder denaturiert, entfernt oder unter Verwendung einer Kontrollprobe berücksichtigt werden, damit die Analyse möglichst genau wird.

In fast jedem Fall können störende Substanzen, wie Enzyme oder Inhibitoren beseitigt werden, entweder durch Desaktivierung oder Entfernung der Substanzen oder, im Falle des Substrates, durch Zerstörung oder Entfernung des Substrates bzw. durch Berücksichtigung des Substrates unter Verwendung einer Kontrollprobe. Labile Enzyme sind zv/ar nicht leicht als Handelsprodukte zu erhalten, jedoch können sie durch ein unabhängiges Laboratorium als frische Substanzen hergestellt werden, indem der Ligand vor Gebrauch mit dem Evizym verbunden wird. Da dieses Verfahren uqöequem ist, ist die allgemeine Verwendung derartiger Enzyme natürlich etwas eingeschränkt. so

Bei einigen Enzymen mit kleinen Substraten, wie Peroxydase und Katalase, können Schwierigkeiten bei der Inhibierung des Enzyms auftreten, wenn der Rezeptor mit dem enzymgebundenen Liganden verbunden ist. Diese Schwierigkeit kann auf verschiedene Weise umgangen werden. Einmal kann ein künstliches Substrat mit höheren sterischen Anforderungeil hergestellt werden. Zweitens kann die Methode der Affinitätsmarkierung angewendet werden, wobei der Ligand der reaktiven Enzymstelle benachbart ist. Soweit diese Modifikationen unbequem oder unerwünscht sind, können andere Enzyme mit den gewünschten Eigenschaften verwendet werden.

Mit vielen Enzymen und Liganden-Kombinationen wird die katalytische Wirksamkeit der Enzyme stark vermindert, indem mindestens ein Substrat (einschließlich des Coenzyms) der Enzymreaktion mit einem Molekulargewicht von mindestens 150, vorzugsweise von mindestens 500 und besonders bevorzugt von mindestens 1000 verwendet wird. In einigen Fällen Hegt das Molekulargewicht weit über 5000, beispielsweise bei Lysozym oder Cellulase.

Eine Liste der üblichen Enzyme findet sich in H a w k et aL, Practical Physiological Chemistry, McGraw-Hill Book Company, New York (1954), Seiten 306—307. Diese Liste ibt nachstehend angegeben, einschließlich der Herkunft des Enzyms, des Substrats und der Endprodukte. Weitere brauchbare Enzyme sind bei Barman, Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York (1969) angegeben.

Name und Klasse

Vorkommen

Substrat Endprodukte

Hydrolaten, Carbohydrasen

1. Amylase

2. Lactase

3. Maltase

4. Saccharose

5. Emulsin

Nucleasen

1. Polynucleotidase

2. Nucleotidase

3. Nucleotidase
Amidasen

1. Arginase

2. Urease

3. Glutaminase

4. Transaminasc

Kohlehydrate, Stärke.
Dextrin usw.
Lactose

Pankreas, Speichel,
Malz usw.

Darmflüssigkeit und
Schleim

Darmfiüssigkeit, Hefe usw. Maltose Darmflüssigkeit, Hefe usw. Saccharose

Pflanzen

Pancreasflüssigkeit,
Darmfiüssigkeit usw.

Darmfiüssigkeit und Nucleotide

andere Gewebsflüssigkeiten

tierisches Gewebe Nucleotide

^Glucoside Nucleinsäure und Derivate
Nucleinsä'ure

Leber

Bakterien, Sojabohnen, andere Bohnen usw.

Leber usw.
Tierisches Gewebe

Aminoverbindungen
und Amide

Arginin Harnstoff

Glutamin Glutaminsäure und
Oxalessigsäure usw.

Maltose und Dextrine
Glucose und Galactose

Glucose

Glucose und Fructose

Glucose usw.

Nucleotide

Nucleotide und Phosphorsäure

Kohlchvdrate und Basen

Ornithin und Harnstoff

Kohlendioxyd und
Ammoniak

Glutaminsäure und
Ammoniak

^-Ketoglutarsäure, Asparginsäure usw.

Purin-Desaminasen

1. Adcnase

2. Guanase

Tierisches Gewebe
Tierisches Gewebe

Purinbasen und Derivate

Adenin

Guanin Hypoxanthin und Ammoniak Xanthin und Ammoniak

	22 23 385	49	Substrat	50	1Λ	Acetaldehyd und andere
		Peptide			Aldehyde
Fortsetzung	Vorkommen	Polypeptide	Endprodukte		O\alessigs;iure '■;
Name und Klasse
Peptidasen	Hefe, Eingeweide usw.	Polypeptide	Einfachere Peptide und
1. Aminopolypeptidase			Aminosäuren
	Panoreas	Dipeptide	Einfachere Peptide und
2. Carboxypeptidase			Aminosäuren
	Pflanzliches und tierisches	Prolin, Peptide	Aminosäuren
3. Dipeptidase	Gewebe und Bakterien
	Tierisches Gewebe und	Proteine	Prolin und einfachere
4. Prolinase	Hefe	Proteine	Peptide
		Proteine, Proteosen und
Proteinasen	Magensaft	Peptone	Proteosen, Peptone usw.
1. Pepsin	Pancreasflüssigkeit	Proteine	Polypeptide und Amino
2. Trypsin		Casein	säuren
	Tierisches Gewebe	Proteine, Proteosen und	Proteosen und Peptone
3. Cathepsin	Kälbermagen	Peptone	Paracasein
4. Rennin	Fancreassaft	Proteine, Proteosen und	Polypeptide und Amino
5. Chymotrypsin		Peptone	säuren
	Papaya, andere Pflanzen	Proteine
6. Papain		Ester
	Feigensaft	Fette	Proteosen usw.
^Ί. Ficin			Alkohole und Säuren
Esterasen	Pancreas, Castor-Bohne	Äthylbutyrat usw.	Glycerin und Fettsäuren f
1. Lipase	usw.	Ester der Phosphorsäure
	Leber usw.		Alkohole und Säuren f
2. Esterasen	Pflanzliche und tierische	Schwefelsäureester	Phosphate und Alkohol i
3. Phosphatasen	Gewebe
	Tierische und pflanzliche	Acethylcholin	Schwefelsäure und Alkohol .^j
4. Sulfatasen	Gewebe		1
	Blut, Gewebe	Wasserstoffperoxyd	Cholin und Essigsäure j\|
5. Cholincsterase			I
Eisen-Enzyme	Alle lebenden Organismen		Wasser und Sauerstoff f;^:
1. Katalase	mit Ausnahme einiger	Reduziertes Cytochrom C
	Mikroorganismen-Arten	in Anwesenheit von	I
	Alle lebenden Organismen	Sauerstoff	Oxydiertes Cvtochrom C %
2. Cytochromoxidase	mit Ausnahme einiger	Eine große Anzahl von	und Wasser ίί
	Mikroorganismen-Arten	Phenolen, aromatischen	»,■
	Fast alle pflanzlichen	Aminen usw. in Ab	Oxydationsprodukt des i
3. Peroxidase	Zellen	wesenheit von H₂O₂	Substrats und Wasser :^!

		Verschiedene phenolische
		Verbindungen
Kupfer-Enzyme	Pflanzliches und		Oxydationsprodukt des
1. Tyrosinase (PoIy-	tierisches Gewebe	Ascorbinsäure in An	Substrats
phenoloxidase, Mono-		wesenheit von Sauerstoff
phenoloxidase)	Pflanzliches Gewebe		Dehydroascorbinsiiure
2. Ascorbinsäureoxidase
		Äthylalkohol und andere
Enzyme, enthaltend		Alkohole
Coenzym I und/oder II	Tierisches und pflanzliches	U-!-Apfelsäure
1. Alkoholciehydrogenase	Gewebe
	Tierisches und pflanzliches
2. Apfclsiiurc-Dchydro-	Gewebe
Kenasc

	22:	51	Fortsetzung	I	ί^; 1. Glyoxalase	Vorkommen	23 385	52
	Name und Klasse
	Enzyme, enthaltend	I 5. D-Aminosäureoxidase	S Desmolasen			Endprodukte
	Coenzym I und/oder Il	I 6. L-Aminosäureoxidasen	1 1. Zymohexase (aldolase)	Tierisches und pflanzliche!	Substrat
	3. Isozitronensäure-	I 7. TPN-Cyiochrom-		Gewebe
	Dehydrogenase	I C-reduktase	j	Tierisches Gewebe und		Oxalobernsteinsäure
	4. Milchsäure-	\ 8. DPN-Cytochrom-	,■ 2. Cnrboxylase	Hefe	s L-Isozitronensäure
	dehydrogenase	* C-reduktase I	3. //-Kctncarbowlascn	Leber, Nieren und Herz		Pyruvsäure
	5. jß-Oxybuttersäure-	i Hvdrasen			Milchsäure
	Dehydrogenase	Ϊ 1. Fumarase	Tierisches Gewebe		Acetoessigsäure
	6. Glucosedehydrogenase		Erythrocyten und Hefe	L-^Oxybuttersäure
	7. Robinson-Ester-	ί 2. Aconitase			D-Gluconsäure
	Dehydrogenase	1	Tierisches Gewebe	D-GIucose	Phosphohexonsäure
	8. Glycerophosphat-	ί 3. Enolase V		Robinson-Ester
	Dehydrogenase	1 1	Leber	(Hexose-6-phosphat)	Phosphoglycerinsäure
	9. Aldehyd-Dehyönigenase	j?i Mutasen		Glycerophosphat
	Cytochrom-reduzierende				Säuren
	Enzyme		Pflanzen, Tiere und	Aldehyde
	1. Bernsteinsäuredehydro-		Mikroorganismen
	genase (gewöhnlich	i			Fumarsäure
	hergestellt)			Bernsteinsäure
	Gelbe Enzyme	\	Hefe
	1. Altes gelbes Enzym
	nach Warburg	Bakterie;*, Hefen, höhere		Oxydiertes Coenzymll und
	2. Diaphorase	Pflanzen und Tiere	Reduziertes Coenzym II	reduziertes gelbes Enzym
		Hefe		Oxydiertes Coenzym I und
	3. Haas-Enzym		Reduziertes Coenzym I	reduzierte gelbe Diaphorase
		Tierisches Gewebe		Oxydiertes Coenzymll und
	4. Xanthinoxidase		Reduziertes Coenzym II	reduziertes gelbes Enzym
			Xanthin, Harnsäure, Säuren,
	Tierisches Gewebe	Hypoxanthin, Xanthin,	oxydiertes Coenzym I usw.
	Tieren, Schlangengifte	Aldehyde reduziertes	in Gegenwart .vn Lufi, H_:0_:
	Hefe, Leber	Coenzym I, usw.	a-Ketosäuren +NH, + H_:0_:
		D-Aminosäuren + O_:	Keiosäurcn und Ammoni.ik
	Leber, Hefe	L-Aminosäuren	Oxydiertes Coenzym Il und
ι		Reduziertes Coenzym Il	reduziertes Cylochrom C
ι		und Cytochrom C	Oxydiertes Coenzym I und
I	Lebende Organismen im	Reduziertes Coenzym I	reduziertes Cytochrom C
	allgemeinen	und Cytochrom C
J	Tiere und Pflanzen		L-Apfeisüure
		Fumarsäure + H₂O
	Tierisches Gewebe		cis-Aconitsäurc und L-Iso-
	und Hefe	Zitronensäure	zitroncnsiiure
			Phosphopyruvsäure -r H_;0
b	Lebende Organismen im	2-Phosphoglycerinsäure
i	allgemeinen
			D(-)-Milchsäur«.·
Alle Zellen	Melhylglyoxal und andere
	siibsliluierte Glyoxale
		ninyJrc'xyaccion. Phosphor
Pflanzliches Gewebe	Iructosc-Kö-diphosphai	säure und Phosphoglyceriri-
Tiere. Bakterien. Pflanzen		^äure
	Acetaldehyd und CO₂
Pyruvsäure	rr-KeU)s;iurcn
Ä-Kctosäuren

Fortsetzung

Name und Klasse

Vorkommen

Substrat Endprodukte

Desmolasen

4. Aminosäure-Decarboxylasen

5. KohlensSureanhydrase

Andere Enzyme

1. Phosphorylase

2. Phosphohexoisomerase

3. HexokiDase

4. Phosphoglucomutase

Pflanzen, Tiere, Bakterien L-Aminosäuren Erythrocyten Kohlensäure

Tierisches und pflanzliches Gewebe

Hefe, tierisches Gewebe Adenosintriphosphat Stärke oder Glycogen
und Phosphat

Glucose-6-phosphat

Pflanzen und Tiere

Glucose-1-phosphat

Amine und CO₂
CO₂ + H₂O

Glucose-1-phosphat
Fructose-6-phosphat

Adenosindiphosphat
+ Glucose-6-phosphat
Glucose-6-phosphat

Wie schon angedeutet, sollte das ideale Enzym in der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, wie Urin, Speichel und Blut, fehlen. Auch störende Substrate sollten in diesen Körperflüssigkeiten fehlen; andere Enzyme, die um dasselbe Substrat in Wettbewerb treten, sollten ebenfalls in diesen Korperflüssigkeiten fehlen. Das Enzym soll längere Zeit unter normalen Lagerbedingungen, entweder trocken oder in Lösung, stabil sein. Mit dem Enzym soll ein Substrat verwendet werden bzw. es soll ein Produkt des Substrates liefern, das leicnt nachweisbar ist, wobei der Nachweis nicht durch andere Chemikalien, die in den genannten Körperflüssigkeiten vorhanden sind, gestört werden sollte. Das ideale Enzym soll weiterhin eine sehr hohe Aktivität und eine maximale Aktivität unter den gleichen Bedingungen haben, bei denen eine maximale Bindung mit dem Rezeptor erfolgt. Schließlich soll es inhibiert sein, wenn es mit de..i Rezeptor verbunden ist.

Weitere Gesichtspunkte, die zwar nichts mit der Durchführbarkeit zu tun haben, aber die technische Durchführung erleichtern, sind die Verfügbarkeit eines bestimmten Enzyms und seine Kosten.

Enzyme mit einigen der genannten Eigenschaften sind Lysozym, Meerrettich-Perox:dase, /?-GIucuronidase, Äpfelsäuredehydrogenase, Amylase, Cellulase, Mannit- 1-phosphat-dehydrcgenase, Phospholipase, insbesondere Phospholipase C und Peroxidase. Diese Enzyme haben einen oder mehrere Nachteile, doch können diese Nachteile verhältnismäßig leicht vermieden wei den, und die Enzyme zeigen eine große Anzahl der vorstehend genannten erwünschten Eigenschaften.

Verbindende Gruppe (X)

Der Ligand oder das Ligand-Analoge sind normalerweise direkt mit dem Enzym verbunden, entweder durch eine Einfach- oder Doppelbindung cder vorzugsweise mit einer verbindenden Gruppe. Bei Liganden, bei denen es sich um Haptene handelt, und bei denen die Rezeptoren Antikörper sind, ist der Ligand zuvor an ein Protein gebunden, damit die Antikörper hergestellt werden können. Da die Antikörper denjenigen Teil des Ligandenmoleküls »erkennen«, der aus dem Protein herausragt, wird gewöhnlich die gleiche verbindende Gruppe zum Verbinden des Liganden mit dem Enzyrr. wie zur Verbindung Jes Liganden mit dem Protein verwendet, um die antigene Substanz herzustellen.

Die funktionelien Gruppen im Enzym, die zum Verbinden dienen, sind Amino-, (einschließlich Guanidino-V Hydroxy-, Carboxy- und Mercaptogruppen. Weiterhin können auch aktivierte aromatische Gruppen als Bindungsstellen dienen.

Aminosäuren mit Gruppen, die sich zum Verbinden eignen, sind Lysin, Arginin und Histidin. Aminosäuren mit freien Hydroxylgruppen sind Serin, Hydroxyprolin und Threonin. Aminosäuren mit freien Carboxylgruppen sind Aspartinsäure und Glutaminsäure. Eine Aminosäure mit einer freien Mercaptogruppe ist Cystein. Aminosäuren mit aktivierten aromatischen Ringen sind Tyrosin und Tryptophan.

In den meisten Fällen ist die bevorzugte verbindende Gruppe die Aminogruppe. Es gibt jedoch auch Fälle bei gewissen Enzymen, in denen eine der anderen verbindenden Gruppen bevorzugt wird.

Der Ligand hat natürlich eine große Vielfalt von "unktionalitäten, die verfügbar sein können. Weiterhin können die verfügbaren Funktionalitäten modifiziert werden, so daß eine andere Funktionalität erhalten wird; beispielsweise kann eine Ketogruppe in eine Oxygruppe oder ein Olefin in einen Aldehyd cder eine Carbonsäure umgewandelt werden. In dieser Hinsicht ist die Auswahl von verbindenden Gruppen zum Liganden größer als zum Enzym. In beiden Fällen wurde jedoch eine Vielzahl von unterschiedlichen Funtionalitäten erprobt, insbesondere zur Bindung verschiedener Verbindungen an Proteine und insbesondere Enzyme.

Wird eine verbindende Gruppe zum Binden des L'^anden an das Enzym verwendet, so geht man meist so vor, daß man die verbindende Gruppe an den Liganden anhängt, wodurch man eine a/U've Stelle für die Bindung an das Enzym erhält. Dies kann in einer einzigen oder in mehreren Synthesestufen geschehen, wobei andere aktive Gruppen am Liganden als die verbindende Gruppe blockiert und freigelegt werden

bo können. Die nachstehend angegebenen verbindenden Gruppen beziehen sich lediglich auf die Verbindung des Enzyms mit dem Liganden.

Als verbindende Gruppe wird normalerweise eine solche mit 1 — 14, gewöhnlich eine solche mit 2 — 8

to Atomen in der Kette, die den Liganden mit dem Enzym verbindet, verwendet. Verwendet man cyclische Strukturen, wählt man die Atomzahl so, daß man eine ähnliche Kettenlänee erhält.

Wenn man keine direkte Bindung verwendet, so enthält die verbindende Gruppe etwa 1—30 Atome (Kohlenstoff, Wasserstoff. Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor und Schwefel; mit Ausnahme der Atome am Liganden und am Enzym), gewöhnlich etwa 4 — 20 Atome.

Vorzugsweise enthält die verbindende Gruppe im allgemeinen 0—14 Kohlenstoffatome, gewöhnlich 1—8 Kohlenstoffatome, sowie 1—8, gewöhnlich 1—6 Heteroatome, bei denen es sich im allgemeinen um Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, gewöhnlich nur um Sauerstoff und Stickstoff, handelt. Die bevorzugten Funktionalitäten in der verbindenden Gruppe sind die Nicht-Oxocarbonyl-, Thiocarbonyl-, Amino- oder Hvdroxygruppe.

Besonders brauchbare verbindende Gruppen für eine Vielzahl von Liganden enthalten 2—4 Kohlenstoffatome und besitzen 1—2 Nicht-Oxocarbonyl-Funktionali-ISrAn₁ Oi£s£ Oru^^en leiten Sich von cyclischen Anhydriden und alpha-Halogencarbonsäuren ab. Eine weitere verbindende Gruppe enthält 2—4 Kohlenstoffatome und 1—2 Heteroatome in der Kette, wobei insgesamt 1—4 Heteroatome vorliegen können. Eine solche verbindende Gruppe leitet sich beispielsweise vom O-Carboxymethylhydroxylamin ab. 2:·

Die nachstehende tabellarische Aufstellung zeigt verschiedene verbindende Gruppen, die den Funktionalitäten am Liganden und am Enzym angepaßt sind. Falls nichts anderes gesagt ist, sättigt die verbindende Gruppe eine oder zw°i Valenzen der funktioneüen jo Gruppen am Liganden und am Enzym ab, an die sie gebunden ist.

Im.mil

-P(O)(OR")-

-P(O)(OR⁸)-

- C-C(R"),—

-C(R⁹),-

(mir primäre Amino-

— Z

—z—c— —z—so,—

LiL';tnd

Eii/\m

Amino!—NH—) oder \mino(—NH,).
HulroxyK—OH) Hulroxvll—OHi oder

Mercapto!—SH)

ρ	O	C) ι;
S	ii Z-C	I! ,C
ρ
O	NH-CH
ρ
O
i:

In den vorstehend angegebenen Formeln haben die Substituenten folgende Bedeutungen:
Z ist eine Bindung; ein Hydrocarbylenrest mit 1 — 10

41) Kohlenstoffatomen, insbesondere eine Alkylengruppe mit 1 —6 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylengruppe mit 2—6 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylengruppe mit 2—6 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylengruppe mit 4 — 10 Kohlenstoffatomen oder eine Arylengruppe mit

j-, 6—10 Kohlenstoffatomen; eine Oxaalkylengruppe mit 4—8 Kohlenstoffatomen; oder eine Azaalkylengruppe mit 4—8 Kohlenstoffatomen;

R⁸ ist eine Alkylengruppe mit 1 —6 Kohlenstoffatomen;
R⁹ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1—3 Kohlenstoffatomen.

Die Gruppe Z oder eine Nicht-Oxocarbonylgruppe werden zur Bindung an Hydroxyl bevorzugt; zur Bindung mit Aminogruppen werden Nicht-Öxocarbonylgruppen, Nicht-Oxothiocarbonylgruppen und die Gruppe Z bevorzugt.

Lisui.J

Enzjm

OxocarbonyK C=O)
(Aldehyde. Ketone)

=NOZ— =N0Z—CO- = NO,CZCO — Amino(—NH₂).
HydroxyK—OH) oder
Mercapto(—SH)

57	22 23 385	58	l-.n/>n:	)	Mcthin(=CH) Amino!—NH-. I
Fortsetzung
Li,;,ml
	=CHCO —
	==NNHZ—CO-	Amiiio(—NH_:), Hydroxyl!—OH) oder Mercapto!—SH)
	= NNHZ—CS-
Nicht-Oxocarbonyl (CO-Gruppe einer Carbonsäure oder ei Carbonsäurederivats	Il ] ies	-N(R⁹J-Z-CO-
	—0—Z—CO-	— N(R")—Z—
	*KJ /^*


Arylamino!—Z"NH

Aminol—NHi:
Hydroxyl!—ÖH)
Nicht-Oxocarbonyl
( C = O)

Methim'ssCH)
Aniinof—NH;)

-O—Z" —N_: — ⁹)- Z" — N —

Hierbei bedeutet Z" eine Arylengruppe mit 6—10 Kohlenstoffatomen.

Soll das Enzym über eine Carboxylgruppe des Liganden oder über eine an den Liganden gebundene verbindende Gruppe gebunden werden, so können entweder Ester oder Amide verwendet werden. Der Ligand an jede beliebige verbindende Gruppe gebunden sein, die in der Lage ist, eine Verbindung zwischen dem Liganden und der Alkohol- oder Aminogruppe des Enzyms unter Ausbildung der Ester- bzw. Amidgruppe zu bilden. Enthält das Enzym einen aktivierten aromatischen Ring, so kann der Ligand mit einem aromatischen Diazoniumsalz verbunden werden, damit die gewünschte Brücke entsteht.

Die verbindende Gruppe wird aufgrund der nachstehenden Überlegungen ausgewählt Die gebildeten Bindungen müssen unter den Bedingungen der Analyse stabil sein. Wird der Ligand über die verbindende ω Gruppe mit dem Enzym verbunden, so muß das Enzym nach der Isolierung mindestens einen Teil seiner Aktivität behalten. Das Enzym darf die Bindung des Liganden an den Rezeptor nicht verhindern. Die Funktionalitäten sollen eine gewisse Selektivität ermögliehen, so daß die Bindung an speziellen Gruppen oder Typen von Gruppen in den Liganden und an den Enzymen erfolgen kann.

werden, um das N-Substrat von Äthylglycinat zu bilden. Der Ester kann hydrolysiert und das gemischte Anhydrid der Carbonsäure gebildet werden. Das gemischte Anhydrid kann dann zur Bildung einer Cn.rboxamidgruppe mit einer Aminosäure eines Enzyms, die eine freie Aminogruppe enthält, (z. B. Lysin) verwendet werden.

Wenn der Ligand eine Ketongruppe enthält, so kann die Carbonylgruppe direkt mit einer Aminogruppe des Enzyms kondensiert werden; es kann aber auch das O-Carboxyinethyloxim mit O-Carboxymethylhydroxy!- amin hergestellt werden. In der gleichen Weise kann der Ester hydrolysiert und ein gemischtes Anhydrid gebildet werden, das dann zur Bildung des Carboxamids mit Lysin verwendet werden kann.

Enthält der Ligand eine Carboxylgruppe, so kann es zweckmäßig sein, die Carboxylgruppe unter Bildung des Mcnoamids von Phenylendiamin umzusetzen. Die erhaltene Verbindung kann dann zürn Diazosalz diazotiert werden, das dann mit dem im Enzym vorhandenen Tyrosin gekuppelt werden kann.

Eine weitere Möglichkeit, die verbindende Gruppe zu

bilden, besteht darin, einen Alkohol eines Liganden mit Bernsteinsäureanhydrid unter Bildung des Monoesters umzusetzen. Die freie Carboxylgruppe kann dann durch Herstellung des gemischten Anhydrids aktiviert und für die Umsetzung mit einer Aminogruppe im Enzym verwendet werden.

Enthält der LigarH »"ine Aminogruppe, so kann diese unter schärferen Bedingungen mit Maleinsäureanhydrid zum Maleinsäureimiü umgesetzt werden. Das Maleinsäureimid kann dann mit Cystein im Enzym kombiniert werden, wobei durch Michael-Addition das 3-Thiosuccinimid erhalten wird.

Bei polyfunktionellen Liganden, wie Proteinen, können bifunktionelle Reagentien mit Gemischen des Liganden und des Enzyms verwendet werden. Beispielsweise verbindet sich bis-(4-Fluor-3-nitro)-sulfon mit den Aminogruppen des Lysins, wodurch der Ligand und das Enzym durch eine bis-(4-Amino-3-nitro)-sulfongruppe überbrückt wird.

Obgleich das Enzym in den meisten Fällen mit jeder geeigneten Stelle des Liganden verbunden werden kann, was entweder über eine bereits im Liganden vorliegende oder synthetisch eingeführte Funktionalität geschehen kann, gibt es bevorzugte Verfahren zur Verbindung des Enzyms mit dem Liganden. Es sei vorausgeschickt, daß der Ligand des mit dem Enzym gebundenen Liganden keine biologische Aktivität zu haben braucht Hauptsächlich kommt es darauf an, daß die Geometrie und die Beziehungen zwischen den polaren Stellen eines größeren Teils des Ligandenmole- jo küls nicht gestört werden. Ist der Ligand ein Hapten, so wird das Enzym normalerweise an der gleichen Stelle gebunden, an der das Protein bei der Herstellung des Antigens angelagert wird. Ist der Ligand ein intaktes Antigen, so können verschiedene Stellen zur Bindung jj eines oder mehrerer Enzymmoleküle verwendet werden, wobei jedoch die offensichtliche Einschränkung gilt, daß die Anzahl der Enzymmoleküle nicht so groß sein darf, daß eine Bindung mit dem Antikörper verhindert wird. Hat der Ligand einen anderen natürlichen Rezeptor als einen Antikörper, so bestimmt sich die Bindestelle (oder die Sindesteilen) in erster Linie dadurch, daß eine starke Bindung mit dem Rezeptor aufrechterhalten wird.

Bei der Analyse eines Moleküls aus einer Vielzahl von ziemlich ähnlichen Molekülen, z. B. Steroiden, die sich hinsichtlich ihrer Substituenten in der Stellung 17 unterscheiden, zieht man es vor, das Molekül an einer Stelle, die von der unterscheidenden Funktionalität weiter abliegt, mit dem Enzym zu verbinden. Bei den Steroiden ist es häufig vorzuziehen, die Bindung an der Stellung 3 und nicht an der Stellung 17 durchzuführen, da der unterscheidende Teil des Moleküls gewöhnlich in der Stellung 17 angeordnet ist In den meisten Fällen ist die Stellung 3 entweder ein Alkohol oder ein Keton, wobei das Keton normalerweise einer aliphatisch ungesättigten Stelle benachbart ist

Die gleichen oder ähnliche Überlegungen gelten für andere Liganden. Zum Beispiel wird man bei einem Polypeptid, das eine natürliche Rezeptorstelle besitzt, to die Bindung vorzugsweise in einer gewissen Entfernung von der Rezeptorstelle durchführen.

Wie schon gesagt, ist in den vorstehend angegebenen Formeln nur ein mit einem Enzym A verbundener Ligand angegeben. Wie bereits angedeutet, kann die *,s AnzabJ der an das Enzym gebundenen Liganden auch größer als 1 sein, ausgenommen wenn man eine Affinitätsmarkierung vornimmt oder wenn das Enzym nur geringfügig substituiert zu sein braucht, damit eine Verminderung der kdtalytischen Wirksamkeit erzielt wird.
Die Formeln sollten deshalb richtiger wie folgt lauten:

—W¹-

A ⁺

worin eine der Gruppen W^xl, W"² und W*³ eine verbindende Gruppe, die andere Gruppe, nämlich X⁺, Wasserstoff oder eine geeignete Funktionalität, L den Liganden und a eine Zahl von 1 oder größer ist und der Anzahl der am Enzym A* gebundenen Liganden L entspricht. Deshalb können die vorstehend angegebenen Formeln entsprechend modifiziert werden, so daß sie auch mehrere, an ein Enzym gebundene Liganden umfassen. Der Bereich der Verhältnisse zwischen Liganden und Enzym wurde bereits angegeben. Bei den meisten, durch die Formeln angedeuteten Liganden (ausgenommen bei den Polypeptiden und den Proteinen) liegt λ im allgemeinen zwischen 1 und 40, gewöhnlich zwischen 1 und 35; ist das Enzym in statistischer Verteilung substituiert, so liegt der Durchschnittswert von a zv/ischen etwa 2 und 35.

Die Bindung von Liganden an Träger

Zur Bindung von Liganden an Träger können ähnliche Arbeitsweisen wie für die Bindung von Liganden an Enzyme angewendet werden. Die Träger können die gleichen Funktionalitäten wie die Enzyme haben, z. B. Carboxyl-, Amino- oder Hydroxylgruppen, die als Bindungsstellen verwendet werden können. Es können die gleichen verbindenden Gruppen bzw. direkten Bindungen wie bei der Bindung an Enzyme verwendet werden. Die Enzyme können in an sich bekannter Weise an Träger gebunden werden.

Enzymanalyse

Zur Bestimmung der Menge des aktiven Enzyms wird die Analyse der enzymatischen Aktivität angewendet, die für eine große Vielzahl von Enzymen bekannt ist. Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde bereits eine Vielzahl von Medien, Bedingungen und Substraten entwickelt (vgl. zum Beispiel Bergmeyer. Methods for Enzymatic Analysis, Academic Press, New York, 1965). Da es hier Unterschiede gibt, nicht nur zwischen den Analysenmethoden für verschiedene Enzyme, sondern auch für ein bestimmtes Enzym, kann eine allgemeine Beschreibung der Analysenmethode nicht angegeben werden.

Der Rezeptor

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den Rezeptoren um Makromoleküle mit Stellen, die spezifische Strukturen erkennen.

Die Erkennung der spezifischen Strukturen beruht auf van der Waals-Kräften, die eine besondere räumliche Umgebung liefern, wodurch die van der Waals-Kräfte verstärkt werden; weiterhin beruht sie auf Dipol-Wechselwirkungen, entweder durch permanente oder induzierte Dipole; auf Wasserstoff- und Ionen-Birdung. auf koordinativ-kovalenter Bindung und auf hydrophober Bindung. Eine ausführliche Erörterung der Mechanismen, nach denen die Rezeptoren Liganden binden, findet sich bei G ο 1 d s t e i η et al. Principles of

Drug Action, Harper and Row·;, New York, 1968.

Makromoleküle mit dem größten Interesse sind Proteine r.nd Nucleinsäuren, die in Zellmembranen, Blut i.nd anderen biologischen Flüssigkeiten vorkommen. Unter diese Verbindungen fallen Enzyme, Antikörper, Ribonucleinsäure (RNS), Desoxyribonucleinsäure (DNS) und andere natürliche Rezeptoren.

Die bequemste Gruppe von Proteinen, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind Antikörper. Diese Substanzen werden zweckmäßig bei der Analyse der Liganden-Kategorie verwendet, die als Haptene bezeichnet wird. Antikörper werden durch Einführung einer immunogenen Substanz in den Blutkreislauf eines Lebewesens erzeugt. Die Reaktion auf die Einführung der immunogenen Substanz oder des Antigens besteht uin der Bildung von Antikörpern, die das Antigen überziehen und ungiftig machen bzw. es aus di ■· Lösung ausfällen. Die Antikörper bilden einen Überzug, der geometrisch so angeordnet isi, daß er sich der räumlichen Anordnung des Antigens anpaßt. Dies kann mit einer Schloß und einem Schlüssel verglichen werden. Die Wechselwirkung ist normalerweise reversibel, derart, daß das Antigen auf verschiedene Weise verdrängt oder entfernt werden kann, ohne daß die Rezeptorstelle zerstört wird. ;5

Es gibt viele Substanzen, die Antigene darstellen und die bei der Einführung in den Blutkreislauf eines Wirbeltiers eine Immunreaktion erzeugen. Eine Anzahl von interessierenden Substanzen sind jedoch keine Antigene, sondern Haptene, und in diesem Fall ist ein weiterer Schritt zur Herstellung des Antikörpers erforderlich. Dieses Verfahren zur Herstellung von Antikörpern mit Substanzen, die keine Antigene sind, ist bekannt und ist z. B. in Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Rowe, 1969, beschrieben. Es sei auch auf Landsteiner, Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, N. Y. 1962; K a bat et al. Experimental Immunochemistry, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1967, und Williams et al,

Tabelle 1

Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. I. Academic Press, New York, 1967 verwiesen.

Das zu untersuchende Material wird in beliebiger Weise mit einem Protein verbunden, und das modifizierte Protein wird in den Blutkreislauf eingeführt. Es können verbindende Gruppen vcm gleichen Typ wie zur Verbindung des Enzyms mit dem Liganden verwendet werden. Die sich bildenden Antikörper schließen Grupper, von Antikörpern ein, die so geformt sind, daß sie mit der Fremdsubstanz, die an das Protein gebunden ist, zusammenpassen. Auf diese Weise erhält man Antikörper, die für die Verbindung oder die Substanz, die mit dem Protein gebunden ist, spezifisch sind. Durch sorgfältige Trennverfahren können die in erster Linie mit der fraglichen Substanz zusammenhängenden Antikörper konzentriert werden, so daß eine Antikörper-Zusammensetzung erhalten wird, die in erster Linie mit der spezifischen Substanz, die mit dem Pf utein gebunden war, zu tun hat.

Zur Erläuterung dieses Verfahrens wird para-Aminobenzol-A.'sonat zum Diazosaiz diazotiert Durch Vereinigung des Diazosalzes mit Kaninchen-Globulin wird das Kaninchen-Globulin mit para-Azobenzol-Arscnat markiert. Durch Einführung dieser Zusammensetzung in den Blutkreislauf eines anderen Tieres als eines Kaninchens, z. B. eines Schafes, können Antikörper gebildet werden, deren räumliche Anordnung nur das Azobenzol-Arsonat aufnimmt.

Neben den Antikörpern (»ibt es eine Anzahl von natürlich vorkommenden Rezeptoren, die für Verbindungen mit biologischem Interesse spezifisch sind. Verbindungen, für die natürliche Rezeptoren existieren, sind Thyroxin, Corticosteron, Cortison, 11-Desoxycortisol, 11-Hydroxyprogesteron, östrogen, Insulin und Angiotensin (vgl. beispielsweise Vonderhaar et al, Biochem. Biophysic Acta, 176, 626 [1969]). Alle diese Ligariden wurden untersucht und sind in der Literatur in Verbindung mit Untersuchungen über ihre Verbindung mit spezifischen Rezepte; en erwähnt.

Liüantl

Rezeptur für Lig;iiulcii mil Liy;indenslri;kuir Litcr;tuirhinuei>

Thyroxin

Thyroxinbindcndes
Globulin (TBG)
Thyroxinbindendes
Prealbumin (TBA)

B. E. P. Murphy,

C. J. J. Pat tee,

J. Clin Endocr., 24. 187
(1964)

NH,

CH₂-CH-COOH

Thyroxin

Corticosteron

Protein von
Gehirnkernzellen,
B. Mc. E w e η,
L. Plapinger
Nat. 226, 263(1970)

Corticosteron

Fortsetzune

Liuand

Rezeptor fur Liganden mit Literaturhinweis

Ligandensiniktur

Cortisol (R=OH, H)
Cortison (R=O)
11-DesoxycortisoI
_tR=R H)

B. W. Murphy,

J. din. Endocr., 28, 343

(1968), 27, 973 (1967)

Corticosteroid-bindendes

Globulin (Transcortin)

OH

östradiol

Rezeptorstelle für
östrosen aus dem Uterus. BBA. 176,626(1969)

Insulin

C.'R. Morgan,

W. M. Holland, III,

Diabetes, 1966

*) siehe unten

Ansiotensin II

H₁N S-

L. B. Pa s c. F.. H a b e r, Asp-Arg-Val-Tyr-Ilcu-His-Pro-Phc

A. Y. K i m u r a

A. P e r η ο d e.

J. Gin. End. 28, 200

NH₁ NH₁

NH,

') H-GIy-IIe-Val-Glu-Glu-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Lcu-Glu-Asp-Tyr-Cys-Asp-OH I I

S S

i

I i

H-Phc-Vil-Asp-Glu-Hii-Uu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Uu-Tyr-Uu-VaI-Cys-Gly-Glu-ArgGlyPhe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Aia-OH

H₁N NH₁

Falls gewünscht, können die Antikörper mit einer Reihe von Trägern verbunden werden. Die Verbindung kann in ähnlicher Weise wie die Verbindung eines Proteins mit einem Liganden durchgeführt werden. Die Träger umfassen beispielsweise Polyacrylamide, Copolymere von Vinylacetat und Acrylsäure, Polyvinylester, modifizierte Zellulose, z. B. Agarose und Sepharose usw. Der Rezeptor kann aber auch, wie schon gesagt, indirekt an einen Träger gebunden sein. Bei Antikörpern mit zwei Rezeptorstellen kann der Ligand für den Antikörper an einen Träger mit großen Poren geburiden sein. Auf diese Weise ist eine der Stellen des Antikörpers mit dem Liganden verbunden, der wiederum an den Träger gebunden ist, wobei die andere Stelle für die Analyse frei ist. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß die für den Liganden spezifischen Antikörper konzentriert und von den im Antiserum vorhandenen anderen Proteinen getrennt werden.

Experimentelles

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen diese aber nicht hierauf beschränken. '.1IeTemperaturen sind in ⁰C angegeben.

Beispiel A

Herstellung von Morphin-Antikörpern
und Bindung auf ci'i.^n Träger

1. 900 mg Morphin wurden 4 Stunden bei 50³C und 0,01 mm Hg getrocknet. Das getrocknete Morphin wurde in 18 ml absolutem Äthanol gelöst, worauf 125 mg Natriumhydroxyd und anschließend 350 mg

trockenes Natriumchloracetat zugesetzt wurde. Nach dem Spülen mit Stickstoff wurde die Lösung 4 Stunden unter Rückfluß gerührt. Die heiße Lösung wurde mit 3,8 ml äthanolischer Salzsäure (0,85 molar) behandelt und anschließend noch warm filtriert. Beim Stehen über Nacht bildete sich ein Niederschlag, der gesammelt und aus Äthanol/Wasser umkristallisiert wurde. Bei Zusatz von Äther zum ursprünglichen Filtrat wurde ein weiterer Niederschlag erhalten, der ebenfall aus Äthanol/Wasser umkristallisiert wurde. Gesamtausbeute 600 mg (55%). Beim Erhitzen dieses Produktes in Vakuum bei 75° C wurde ein Gewichtsverlust, entsprechend 0,48 Mol Äthanol oder 1,15 Mol Wasser festgestellt Die getrocknete Verbindung zersetzt sich bei 190—220⁰C (in Abhängigkeit von der Erhitzungsgeschwindigkeit).

Analyse: C9H21NO5;

% theor.: C 66,45; H 6,16; N 4,08;

% gefunden: C 65,87; H 6,98; N,4,09,4,07.

MNR (C₅D₅N) 2,44 ppm (-CH₃), 5,08 ppm (-CH₂COO).

?_ 240 mg Carboxymethylmorphin, suspendiert in 8 ml trockenem DMF, wurden auf -15°C gekühlt und mit 84 μΐ Chlorameisensäureisobutylester behandelt Die feste Substanz löste sich nach dem Rühren bei —15° C über einen Zeitraum von 30 Minuten. Dieser Lösung wurden 400 mg Rinderserumalbumin (RSA), gelöst in 36 ml Wasser, das 2,6 g Natriumbicarbonat enthielt, zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 0⁰C gehalten. Das Gemisch wurde dann gegen destilliertes Walser dialysiert, wobei das Wasser viermal ausgetauscht wurde (Dialyseverhältnis 1 :80), und gefriergetrocknet, wobei 350 mg Konjugat erhalten wurde.

Haptenkonzentration im Protein
MGcmm = 327

ε; mm = 1070
ε Sx =41600

Das Ultraviolettspektrum wurde bei 280 nm in einer 1-cm-Zelle gemessen: c/=0.59 bei einer Konzentration von 0,287 g/Liter in Wasser. Der Konjugationsgrad kann aus den obigen Werten und der Formel

IX 'UM + 'KSA ) G

., + MG₁₁₁.

d =

bestimmt werden, worin X die Anzahl der Haptene je Molekül, G das Gewicht des Proteinkonjugats je Liter und MG das Molekulargewicht bedeuten, wobei sich CMM auf das Hapten Carboxymethylmorphin und RSA auf das Prolein beziehen.

A^-= 46,6 Haptene/Molekül

3 Antiseren können wie folgt erhalten werden: Das Antigen (Hapten, gekoppelt mit einem geeigneten Protein) wird in einer Kochsalzlösung (9 g/Liter) mit einer Konzentration von 2 rng/ml zubereitet. Jc Anteil von 1,0 ml dieser Lösung werden gleichzeitig 3 ml vollständiges Freundsches Adjuvans in homogenisierter Form mit Hilfe einer Zweiwegenadel eingeführt. Für subukante Injektionen werden an jede Stelle etwa 0,3 ml (Antigen + Frcundschc Lösung) injiziert, bei intraperitonealen Injektionen etwa 0,4 mL Die gesamte Dosis beträgt etwa 4,0 ml je Kaninchen.

Nach 3—4 Wochen wird eine starke intramuskuläre Injektion aus 0,5 ml der vorstehend angegebenen Kochsalzlösung und 04 ml vollständigem Freundschem Adjuvans injiziert.

Nach 5—7 Tagen wird das Kaninchen geblutet, indem eine Injektionsnadel in den Brustkorb eingeführt und langsam in die Mitte gepreßt wird, während an die Spritze ein Vakuum angelegt wird.

Ist die gewünschte Blutmenge gesammelt, so läßt man das Blut koagulieren und entfernt das Koagulat Die hinterbleibende Lösung wird dann 10 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Das gesammelte Serum ist frei von losen roten Blutkörperchen.

Ein gleiches Volumen gesättigter Ammoniumsulfatlösung wird dem Serum unter Rühren bei 4"Ci cgetropft. Nachdem die Lösung 1 Stunde bei dieser Temperatur gestanden ist, wird sie 15 Minuten bei 10 000 U/min zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird entfernt Der Rückstand wird in einem möglichst kleinen Volumen eines Boratpuffers suspendiert, in einen Dialysebeutel gebracht und über Nacht gegen den Boratpuffer (pH = 8,0) dialysiert. Der Rückstand im Dialysebeutel wird dann isoliert und eingefroren.

Zur Herstellung des Boratpuffers werden 24,6 g Borsäure in Wasser gelöst, worauf der pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 7ß bis 8,0 eingestellt 0,1 g Natriumazid und 0,01 g Äthylmercurithiosalicylat zuge-

jo setzt werden und das Gesamtvolumen auf 1 Liter aufgefüllt wird.

4. In 20 ml Dimethylformamid v/erden 400 mg Aminoäihyl-Polyacrylamidgei und 300 mg Carboxymethylmorphin (vgl. Beispiel A-I) eingebracht, worauf 1 g

jj Natriumbicarbonat zugesetzt wird. Die Suspension wird 2 Tage bei 4°C gerührt und anschließend filtriert, worauf der Rückstand mit Wasser gewaschen wird bis die Waschwässer neutral sind; der Rückstand wird dann unter Vakuum getrocknet

Das erhaltene Produkt wird dann in 20 ml Kaninchenberum, das Morphin-Antikörper enthält, suspendiert und 4 Stunden bei 4⁰C gerührt. Nach dem Filtrieren erhält man einen Rückstand, der wieder in 5 ml Phthalatpuffer mit einem pH-Wert von 3,8 (0,1 molar) und 2 Stunden gerührt wird. Das Gel wird abzentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird gegen Phosphatpuffer (pH =7,4, 0,1 molar) dialysiert. wobei eine gepufferte Lösung von praktisch reinen Antikörpern erhalten wird.

5. In einen Kolben wurden 5 ml einer modifizierten Agarose-Suspension 5 ml Wasser und 5 ml einer CNBr-Lösung (100 mg/ml) eingebracht, und der pH-Wert mit 4 n-NaOH auf 11,5 eingestellt. Das Gemisch wurde gerührt, wobei der pH-Wert überwacht und durch Zusatz von 4 n-NaOH auf 11 — 11,5 gehalten wurde, bis keine Änderung des pH-Wertes mehr festgestellt werden konnte. Das Gemisch wurde filtriert und mit 100ml O.lmolarem Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,0 gewaschen.

bn Die Morphin-Antikörper wurden dadurch vorbehandelt, daß 3 ml der Antikörperlösung durch eine mit einem vernetzten Dextran gefüllte Kolonne (10 χ 0,9 cm) geleitet wurden, die mit 0,1 molarer Carbonatlösung (pH-9,0) ins Gleichgewicht gesetzt

i>5 worden war. Es wurden 4 ml Eluat erhalten.

Die wie oben vorbereitete modifizierte Agarose wurde in 5 ml kalter Carbonat-Pufferlösung suspendiert und der Morphin-Antikörperlösung zugesetzt. Das

Gemisch wurde 36 Stunden bei 4° C gerührt, filtriert und mit 100 ml 0,1 molarer Carbonat-Pufferlösung (pH=9) gewaschen. Die Ultraviolettanalyse ergab, daß 65% des Proteins an die modifizierte Agarose gebunden waren.

6. Die Rezeptorstellen können wie folgt bestimmt werden: Die Enzymaktivität einer Lösung, die den enzymgebundenen Liganden enthält, wird nach an sich bekannten Verfahren bestimmt Der Antikörper für den Liganden wird so lange zugesetzt, bis nach weiterer Zugabe des Antikörpers keine weitere Änderung der Enzymaktivität feststellbar ist. Hierdurch kann die Restaktivität für praktisch den gesamten enzymgebundenen Liganden, der wiederum an den Antikörper gebunden ist, festgestellt werden.

Es wird eine zweite Antikörper-Lösung hergestellt, welcher der enzymgebundene Ligand in Anteilen zugesetzt wird, wobei die Enzymaktivität nach jeder Zugabe festgestellt wird. Die Enzymaktivität wird gegen die Menge des zugesetzten enzymgebundenen Liganden aufgetragen. Im Ergebnis wird also der Antikörper mit dem enzymgebundenen Uganden titriert Zu einem gewissen Zeitpunkt sind praktisch alle Rezeptorstellen aufgefüllt, und man erhält eine geradlinige Beziehung zwischen der Zunahme der Enzymaktivität und der Menge des zugesetzten, enzymgebundenen Liganden. Extra poliert man den geradlinigen Teil der Kurve auf die Abszisse, so erhält man die tatsächliche Anzahl der Antikörperstellen, die den enzymgebundenen Liganden inhibieren. Erhöht man die effektive Zahl durch die Prozentzahl der Restaktivität, so erhält man eine gwte Annäherung an die Absolutzahl der Antikörperstellen.

Das vorstehend angegebene Verfahren kann mit jedem beliebigen Rezeptor verwende* werden, wenn das Enzym in ausreichendem Maße dadurch inhibiert wird, daß der enzymgebundene Ligand an den Rezeptor gebunden wird.

Beispiel 1
Konjugation von Morphin mit Amylase ⁴"

A. Einer Lösung von 100 mg Amylase in 15 ml Wasser mit 600 mg Natriumbicarbonat wurden 4,6 χ 10~² Mol des Morphin-Mischanhydrids (hergestellt nach Beispiel A-2) in 1 ml DMF bei 0-5⁰C zugesetzt. Die Lösung wurde 18 Stunden bei O⁰C gerührt, in einen Dialysebeutel gebracht und 2 Tage bei 0° gegen Wasser dialysiert. Der Rückstand wurde gefriergetrocknet, wobei ein weißer fester Stoff erhalten wurde.

Die Aktivität der mit Morphin modifizierten Amylase wurde wie folgt bestimmt:

Die mit Morphin modifizierte Amylase wurde mit einer Suspension von gefärbter Amylose bei 37° gemischt. Nach einer willkürlich gewählten Zeit wurde die Reaktion abgebrochen, zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit in eine Küvette gebracht und die optische Dichte gemessen. Dies wurde mehrmals wiederholt, so daß die optische Dichte gegen die Zeil aufgetragen werden konnte, wobei eine Gerade erhalten wurde. Die Steigung der Geraden war ein Maß s,o für die Enzymaktivität. Es wurde gefunden, daß die Modifizierung der Amylase mit Morphin nur einen geringen bis gar keinen Einfluß auf die enzymatische Aktivität der Ausgangs-Amylase hatte.

B. Eine abgemessene Menge Morphin-Antiserum to (Konzentration an aktiven Stellen 2 χ I0"⁷ Mol je Liter) wurde zu einer mit Carboxymethylmorphin modifizierten Amylaselösung (6,4 χ 10~⁸ Mol/Liter) gegeben. Dann wurde der Amylase-Aktivitätstest bei 37° über einen Gesamtzeitraum von 20 Minuten durchgeführt Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Bestimmung	Volumen der mit	Volumen der	Optische
	Carboxymethyl	Antikörper-	Dichte
	morphin modifi	lösung
	zierten Amylase
	al	ml
1	100	0,0	0,910
2	100	0,020	0,720
3	100	0,050	0,560
4	100	0,100	0,450
5	100	0,150	0,390

Die Tabelle zeigt, daß mit zunehmender Antikörperkönzeniration die "Aktivität der mit Carboxyrnethalrnorphin modifizierten Amylase abnimmt

C Der Einfluß eines Codeinzusatzes wurde dadurch bestimmt, daß eine .Probe mit Antikörper und Carboxymethylmorphin in Abwesenheit von Codein und eine entsprechende Probe in Anwesenheit von Codein getestet wurden.

Mit 0,2 ml einer Lösung, die den mit Antikörper und Carboxymethylmorj.-iin modifizierten Enzymkomplex enthielt, wie er bei der Amylasebestimmung verwendet wird, betrug die optische Dichte 0,450. Wurden jedoch 0,030 ml einer 10-⁷-molaren Codeinlösung zu der gleichen Menge des Antikörper-Enzym-Komplexes gegeben, so betrug die optische Dichte bei der Amylase-Analyse 0,580. Auf diese Weise kann eine 10-⁷-molare Codeinlösung, von der nur 30 μΙ zur Verfugung stehen, analysiert werden. Dies soll jedoch nicht bedeuten, daß es sich hierbei um die erforderliche Mindestkonzentration handelt, vi?.Imehi handelt es sich hierbei um eine Konzentration, die für eine erfolgreiche Analyse angewendet werden kann. Das beschriebene Verfahren kann auch mit Morphin, Morphin-Glucuronid und anderen eng verwandten strukturellen Analogen des Morphins und Codeins angewendet werden.

Beispiel 2

Konjugation von Morphin
mit Perox)dase oder Lysozym

A. (1) Zu 10 mg (2,5 χ 10-⁷ Mol) Mcerrettichperoxydase (3400 I.E./mg) und 20 mg NaHCO₃ in 1 ml Wasser wurdon 0,09 ml (9 χ 10"⁶MoI) einer Lösung von ΙΟΟμΜοΙ/ml des gemischten Anhydrids von Carboxymethylmorphin (siehe weiter unten) in Dimethylformamid (DMF) gegeben; das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die Lösung wurde dann durch eine mit einem vernetzten Dextran gefüllte Kolonne (1 χ 10 cm) geleitet, und der Abfluß wurde als an Pcroxydase gebundenes Morphin für die Bestimmung von Morphin verwendet.

A. (2) Das gemischte Anhydrid aus Chlorameisensäureisobutylester und 0³-Carboxymethylmorphin wurde in Form einer DMF-Lösung (ΙΟΟμΜοΙ) hergestellt. Dann wurden 5 mg Meerrettichperoxydase (MKP) (1,5 χ 10~⁶ Mol Lysinreste) in 0,5 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf 4°C abgekühlt und der pH-Wert mit verdünnter NaOH-Lösung auf 9,5 eingestellt. 90 μΐ (9 χ 10-⁶MoI) des gemischten Anhydrids wurden in

Anteilen von 10 μΐ zugesetzt, wobei der pH-Wert durch gelegentliche Zugabe von NaOH auf 9—10 gehalten wurde. Das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt und erschöpfend gegen Wasser dialysiert

B. Eine erste Lösung (Lösung A) wurde durch Auflösen von 100 mg Lysozym (6,S χ 10-⁶MoI) in 10 ml Wasser und Zusatz von Natriumbicarbonat, bis ein pH-Wert von 8,0 erreicht wurde, hergestellt. Eine zweite Lösung wurde dadurch hergestellt, daß 343 mg (1 χ 10-* Mol) Carboxymethylmorphin in 2 ml wasserfreiem DMF gelöst wurden. Nach dem Abkühlen auf -15°C wurden 13,1 μΐ Chloranieisensäureisobutylester (1 χ ΙΟ-⁴ Mol) zugesetzt, wobei sich ein gemischtes Anhydrid bildete. Die Lösung wurde bei -15° C etwa 30 Minuten gerührt, wonach die Feststoffe gelöst waren.

Die Lösung A wurde in einem Eisbad gekühlt und mit dem Morphin-Mischanhydrid versetzt. Die Lösung wurde 14 Stunden bei 4^CC stehengelassen und dann 4 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert (2000 ml Wasser zweimal täglich ausgetauscht).

Das Proieifi wurde gefriergetrocknet, und der Rückstand in 10 ml 0,128molarer Natriwnphosphatlösung (pH = 7,15) gelöst Das Produkt wurde dann in einer Säule mit einem schwachen Kationenaustauscherharz fraktioniert, wobei mit 400 ml einer Natriumphosphatlösung (pH = 7,15) mit einem linearen Gradienten von 0,128 bis 0,400 MoI bei einer Geschwindigkeit von 1 ml je Minute eluiert wurde. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 2 ml aufgefangen. Die chromatographische Trennung wurde durch Messen der Ultraviolettabsorption bei 280 nm kontinuierlich überwacht. Es wurden 5 Fraktionen erhalten. Die Lysozymaktivität wurde in der nachstehend angegebenen Weise gemessen.

Es wurde eine Suspension von getrockneten Bakterien, Micrococcuslysodeikticus (0,35 mg/ml) in einer 0,05molaren Natriumphosphatlösung (pH = 7,0) hergestellt. Zu 2,85 ml der in einer Küvette von 3 ml enthaltenen Suspension wurden 0,10 ml einer 8,76%igen (Gewichi/Volumen) Natriumchloridlösung und 0,025 ml Enzymlösung (7,5 χ 10~⁶g Protein) gegeben. Der Inhalt wurde durchgemischt und in ein auf 436 nm eingestelltes Spektrophotometer eingebracht. Die Abnahmegeschwindigkeit der optischen. Dichte als Funktion der Zeit wurde aufgezeichnet und als optische Dichteeinheiten je Minute und 7,5 χ 10~⁶ g Protein ausgedrückt. In der nachstehenden Tabelle sind die Fraktionen, das Gewicht des Proteins in mg/ml und die Reaktionsgeschwindigkeit angegeben.

Frakticnen =	mg Protein	Reaktionsgeschwindig
		keit O. D./min/
		7,5 x 10"⁶g Protein
a	0,15	0,027
b	0,18	0,033
C	0,26	0,040
d	0,28	0,047
C	0,31	0,043
Lysozym	0,30	0,070

60

A.
wurden

Beispiel 3

Konjugation von Meperidin mit Lysozym
2,23 g 4-Cyano-4-phenylpipcridin-hydrochlorid in

15 ml Wasser gelöst, dem 4 ml 50%iges wäßriges Kaliumhydroxyd zugesetzt war. Das Öl wurde dreimal mit 15 ml Äther extrahiert, und die organischen Schichten wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet Nach dem Filtrieren und Eindampfen der Lösung wurde ein Rückstand erhalten, der zusammen mit 3 ml Methanol und 1,23 ml einer 50%igen wäßrigen Kaliumhydroxydlösung in eine Glasampulle gebracht wurde. Die abgeschmolzene Ampulle wurde 3,5 Stunden auf 165- 170⁰C erhitzt und mit 50 ml Wasser verdünnt Nach der Extraktion mit Chloroform wurde die wäßrige Phase mit einem Austauscherharz in der H^-Form bis auf einen pH-Wert von 6 neutralisiert. Nach dem Filtrieren und Eindampfen wurden 0,82 g eines Rückstandes erhalten, der oberhalb 300° C schmolz. Nach dem Umkristallisieren aus Wasser und dem Trocknen über Phosphorpentoxyd wurde eine Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 285—236° C erhalten.

B. 1,8 g 4-Carboxy-4-phenylpiperidin wurden 4 Stunden in 50 ml einer 5°/oigen äthanolischen HCl-Losung unter Rückfluß erhitzt. Df nach dem Eindampfen des Lösungsmitteis erhaltene Rückstand wurde in Aceton gelöst und vom unlöslichen Teil abfiltriert. Beim Eindampfen der Acetonlösung hinterblieb e<n viskoses öl, das beim Stehen kristallisierte.

F197-110°C (1,068 g). Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.

B'. (Alternative). Eine Lösung von 4-Cyano-4-piperidinhydrochlorid in 6 ml 66%iger Schwefelsäure wurde auf 145⁰C erhitzt und 45 Minuten gerührt. Beim Abkühlen auf 125°C wurde die Lösung etwas viskoser. Durch Zusatz von Alkohol (Rohr des Zugabetrichters unterhalb der Oberfläche des Reaktionsgemisches) wurde die Temperatur auf !05⁰C erniedrigt. Das Gemisch wurde 4 Stunden auf dieser Temperatur gehalten. Während der ersten Stunde wurden 20 ml Alkohol zugegeben, in den nächsten Stunden jeweils

6 ml. Die Alkoholdämpfe wurden durch kontinuierliche Destillation entfernt. Am Ende der Zugabe wurde die Temperatur auf 125⁰C erhöht, bis sich kein Kondensat mehr bildete. Die heiße Lösung wurde in ein Gemisch aus 6 ml Wasser und 40 g Eis, das 8 g Natriumhydroxyd enthielt, gegossen. Nach der Extraktion mit 3 χ 70 ml Äther, Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Entfernung des Lösungsmitteis hinterblieb ein Öl, das bei 112- 115°C/0,2 mm Hg abdestillierte. Ausbeute 4,01 g(54%).

C. 4,01 g 4-Carbäthoxy-4-phenylpiperidin wurden in 13 ml absolutem Äthanol gelöst und zusammen mit 2,01 g Natriumchloracetat unier Rückfluß erhitzt. Nach

7 Stunden konnte durch Dünnschichtchromatographie kein Ausgangsmaterial mehr nachgewiesen wcden. Dann wurde das ausgeschiedene Natriumchlorid abfiitiiei-t und mit 3 ml Äthanol gewaschen. Beim Abkühlen des Filtrats schieden sich weiße Kristalle aus. N^.ch dem Abfiltrieren und Trocknen wurden 2.9 g (58%) Produkt erhalten. F. 148- 140⁰C. Beim Eindampfen der Mutterlauge wurde eine glasige Substanz erhalten, die aus Aceton/Hexan nicht kristallisierte.

D. Zu einer Lösung von 29,7 mg (0,! mMol) 4-Carbäthoxy-1 -carboxymethyl-4'phenylpiperidin in 1,0 ml trockenem Dimethylformamid von G^C wurden 13,1 μΙ Chlorameisensäureisobutylester (0,1 mMol) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 0° C gerührt.

E. Die kalte L ösung des gemischten Anhydrids (wie oben hergestellt) wurde einer Lösung von 100 mg Lysozym (6,9 μΜοΙ) und 100 mg Natriumbicarbonat in 10 ml Wasser von 0°C zugetropft. Das Reaklionsgcmisch wurde 24 Stunden bei 4'C Berührt und dann 48

Stunden gegen Wasser dialysiert. Das Wasser wurde täglich dreimal ausgewechselt. Das unvollständig gereinigte Enzymkonjugat wurde dann auf einem Gel mit einem Phosphatpuffergradienten von 0,05 -0.20 Mol (pH - 7,15) Chromatographien. Die Lysozymaktivität im Eluat wurde nach der üblichen Lysozymanalyse mit Micrococcusleisodeikticus (20 mg/ 50 ml Pufferlösung) bestimmt. Durch Zugabe von gamma-GIobulin aus Kaninchen oder Schafen, die mit dem RSA-Konjugat der Merperidinsäure immunisiert worden waren, wurde das Lysozyrn-Meperidin-Konjugat fast vollständig inhibiert. Durch Zusatz von freiem Meperidin zu dem inhibierten Enzym-Antikörper-Komplex wurde die Lysozym-Aktivität wiederhergestellt.

15

Beispiel 4
Konjugation von Amphetamin mit Lysozym

A. 3,68 g Amphetaminsulfat (20 mMol Amin) wurden μ in 80 ml 0,5normaler Natriumhydroxydlösung gelöst. Die alkalische Lösung wurde mit Äther extrahiert, der Äther getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 ml Benzol gelöst, worauf 3 ml Diisopropyläthylamin und dann 2,2 ml (20 mMol) Bromessigsäureäthylester zugegeben wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde unter Rückfluß gehalten, abgekühlt, filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde in Äther aufgenommen, einige Male mit Wasser gewaschen, der Äther g^ ■ rocknet und eingedampft. Der jo reine Aminoester wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgei (Hexan/Äther =7:3) erhalten. Ausbeute 3,1 (70%). Die NMR- und IR-Analyse stimmt mit der Struktur überein.

B. 2,5 g(11,3 mMol) des Aminoesters wurden in einem 1 :1-Gemisch von Methanol und !normaler Natriumhydroxydiösung (50 mi) gelöst und ober Nacht bc; Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde auf ein kleines Volumen eingedampft, zweimal mit je 25 ml Äther gewaschen und mit konzentrierter HCl bis -ίο auf einen pH-Wert von 6 angesäuert. Die sich abscheidenden Kristalle wurden aus Äther/Aceton umkristaüisiert, wobei zwei Fraktionen erhalten wurden: 900 mg mit einem Schmelzpunkt von 222-225⁰C (Schmelzpunkt nach der Literatur 220-225°C, Tetra. 4-, Letters, 1966. 4603-7) und 450 mg mit einem Schmelzpunkt von 210 —218^CC. Nur die erste Fraktion wurde für die weiteren Umsetzungen verwendet. .^;ÜV 257. £ = 159.

C. 700 mg (3,8 mMol) Amphetamincarbonsäure wurden bei 40⁵C in 50 ml trockenem Dioxan suspendiert. worauf 20 ml einer 12,5gew.-%igen Phosgenlösung in Benzol auf einmal zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde Vh Stunden bei 40 —50° C gerührt, zur Trockne eingedampft und in 20 ml trockenem Dioxan gelöst. Diese Lösung wurde für die nächste Reaktionsstufe in Eis gehalten.

D. 25 mg N-Carboxymethylamphetamin (0,133 mMol) wurden bei 40° C in 1,8 ml trockenem Dioxan suspendiert. Dann wurden 0,715 ml einer 12,5vol.-°/oigen to Lösung von Phosgen in Benzol auf einmal zugesetzt Das Reaktionsgemisch wurde VIi Stunden bei 40⁰C gerührt, worauf nochmals 0,2 ml Phosgenlösung (124vol.-%ig in Benzol) zugesetzt wurden. Nach weiterem Rühren über 30 Minuten wurde d:e Lösung -5 homogen. Das Lösungsmittel wurde bei 25° C unter Vakuum im Abzug entfernt. Für die nächste Stufe wurden nochmals 0.70 ml trockenes Dioxan zugesetzt.

E. Die kalte Dioxanlösung des Produktes wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten zu einer gerührten kalten (0⁰C) Lösung von 200 mg Natriumbicarboniit und 100 mg Lysozym in 10 ml Wasser gegeben. Das milchige Reaktionsgemisch wurde 48 Stunden bei 4°C gerührt und dann 48 Stunden gegen Wasser dialysiert (1 Liter, dreimal täglich ausgetauscht). Der Rückstand wurde gefriergetrocknet und für Aktivitäts- und Inhibitionsuntersuchungen verwendet.

Beispiel 5
Konjugation von Ecgonin mit Lysozym

A. 5 g Cocain wurden 6,5 Stunden in 25 ml Wasser unter Rückfluß erhitzt. Das nach dem Eindampfen der Lösung hinterbleibende öl wurde in 5 ml heißem Wasser gelöst. Beim Abkühlen schieden sich !auge, weiße Kristalle ab (2,87 g). Aus der Mutterlauge wurden weitere 543 mg erhalten.

B. 1 g Benzoylecgonin wurde 1 Stunde in 25 ml 2normaler Chlorwasserstoffsäure unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung filtriert und mit Äther extrahiert. Die wäßrige Phase wurde mit Natriumbicarbonat bis auf einen pH-Wert von 5,8 neutralisiert. Beim Eindampfen hinterblieb ein weißer Rückstand, u-er mit 40 ml 95%igem Äthanol unter Rückfluß erhitzt wurde. Es wurde abfiltriert und das Lösungsmittel eingedampft. Der ölige Rückstand (580 mg) kristallisierte bei Zusatz von 0,5 ml Äthanol aus (130 mg), F. 135- 196° C (ze rs.).

C. Einer Suspension von 22,7 mg (0,1 mMol) Ecgonin-Hydrochlorid in 1,0 ml trockenem Dimethylformamid von 0⁰C wurden 13,Z ul Chlorameisensäureisobutylester (0,1 mMol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0⁰C gerührt und anschließend für die Konjugation verwendet.

D. Einer kalten (4°C) Lösung von 100 mg Lysozym (6,9 μΜοΙ) und 100 mg Natriumbicarbonat in 10 ml Wasser wurde die Dimethylformamid-Suspension des gemischten Anhydrids zugesetzt. Die homogene Lösung wurde 40 Stunden bei 4°C gerührt und dann 4 Tage gegen Wasser dialysiert (1 Liter, dreimal täglich ausgetauscht). Das dialysierte Material wurde dann gefriergetrocknet. Mit diesem Material wurden Aktivitäts- und Inhibitionsuntersuchungen durchgeführt.

Beispiel 6
Konjugation mit Phenobarbital mit Lysozym

A. 5,08 g (0,02 Mol) Natriumphenobarbital, 2,16 g (0,02 MoS) Chloressigsäuremethylester, 14 ml Methanol und eine katalytische Menge DMF (1 ml) wurden 2 Stunden unter Rückfluß gehalten. Während dieser Zeit schied sich ein weißer Niederschlag aus. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und abfiltriert- Das methanolische Filtrat wurde zur Trockne eingedampft, wobei etwa 5 g eines gummiartigen Materials erhalten wurden, das beim Stehen erstarrte. Der Niederschlag aus der obigen Filtration löste sich teilweise auf, wenn er nochmals mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Das wasserunlösliche Materia! (etwa 50 mg) erwies sich ais das diaikylierte Produkt.

Das erstarrte Material wurde mit 20 ml 1 normaler NaOH-Lösung 15 Minuten gerührt und dann filtriert-Hierdurch wurden die alkaliunlöslichen Derivate von

20

dem monoalkylierten Produkt und nicht umgesetzten Phenobarbital abgetrennt. Das alkalische Filtrat wurde mit konzentrierter HCl bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert, uiid der weiße, gummiartige Niederschlag wurde in Melhylenchlorii) aufgenommen.

Nach dem Trocknen (über MgSOO ^und Eindampfen des organischen Lösungsmittels wurden 4 g eines gu.-.Tiiartigen Materials erhalten. Dieses Material wurde in Benzol gelöst und über einer Kieselgelsätile (40 g) Chromatographien. Es wurde mit Chloroform eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 100 ml gesammelt wurden. (Der Verlauf der Chromatographie wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt, da das dialkyliertc Produkt einen Rf von 0,9, das monoalkylierte Material einen Ri von 0,6 und Phenobarbital einen Ri von 0,1 mit Chloroform/Methanol im Verhältnis 95 :5 hat.)

Die vereinigten Fraktionen 2 bis 5 ergaben nach dem

tliriuaiTtpiCri i,ug ςίίΐΤΐΓΠΙα fugen iviäSäc, uic uciiTi *j teil eil erstarrte. Nach dem Verreiben mit Petroläther und Abfiltrieren wurden 1,5 g eines weißen Pulvers erhalten, das durch NMR als das erforderliche monoalkylierte Derivat, nämlich N-Methoxycarbonylmethylphenobarbita! nachgewiesen werden konnte.

Eine weitere Eluierung mit Chloroform (500 ml) ergab 1,5 g eines weißen festen Stoffes, der als nicht umgesetztes Phenobarbital nachgewiesen werden konnte.

B. 1 g des vorstehend hergestellten Monoesters wurde mit 10 ml 20%iger HCI-Lösung 3'/: Stunden up .er Rückfuß gehalten. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurd«: mit 20 ml Wasser verdünnt und mit Äther extrahiert. Die Eindampfung des Ätherextrakts ergab 0,98 g einer farblosen gummiartigen Substanz, die beim Stehen sehr langsam erstarrte. Durch NMR- und Dünnschichtchromatographie-Analyse konnte nachgewiesen werden, daß der Ester vollständig zur Säure hydrolysiert war.

Eine reine Probe der Säure wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie für die UV-Analyse mit Chloroform/Methanol im Verhältnis 5:1 als Eluierungsmittel hergestellt.

C. Zu einer kalten (0°C) Lösung von 29,6 mg N-Carboxymethylphenobarbital (0,1 mMoi) und 143 μΙ Triäthylamin (0,1 mMol) in 1,0 ml trockenem Dimethylformamid wurden 13,1 μΙ Chlorameisensäureisobutylester (0,1 mMol) gegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde vor dem Gebrauch bei 4° C gerührt.

D. Die kalte Lösung des gemischten Anhydrids wurde unter Rühren einer kalten (4°C) Lösung von 0,100 g Lysozym (63 mMol) und 0,100 g Natriumbicarbonat in 10 ml Wasser zugetropft. Die erhaltene heterogene Lösung wurde 48 Stunden bei 4° C aufbewahrt und anschließend 48 Stunden gegen Wasser dialysiert (das Wasser wurde dreimal täglich ausgetauscht). Das Dialysat wurde dann auf einem Gel Chromatographien, wobei zum Eluieren ein Phosphatpuffergradient von 0,05-0,20MoI (pH = 7,15) verwendet wurde. Die Lysozymaktivität im Eluat wurde nach der üblichen Lysozymanalyse mit Micrococcuslysodeikticus (20 mg/ 50 ml Pufferlösung) bestimmt Durch Zusatz von ^-Globulin von Schafen, die mit dem RSA-Konjugat von N-Carboxymethylphenobarbital immunisiert worden waren, wurde das Lysozym-Phenobarbital-Konjugat fast vollständig inhibiert. Durch Zusatz von freiem Phenobarbital zu dem inhibierten Enzym-Antikörper-Komplex wurde die Lysozym-Aktivität wiederhergestellt.

Beispiel 7

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50

65 Secobarbital-RSA- und Lysozym-Konjugai

A. Ozon wurde durch eine gekühlte (Trockeneis/Acelun) Lösung von Natrium-Secobarbital (2,6 g, 0,Oi Mol) in 250 ml Methanol geleitet. Nach Beendigung der Ozonolyse (KJ-Test positiv) wurde Stickstoff durch das Reaktionsgemisch geleitet, um alle Spuren von Ozon zu entfernen, worauf 7 ml Dimethylsulfid mittels einer Spritze der kalten Lösung zugesetzt wurden, die über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand mit 20 ml Wasser verdünnt, mit konzentrierter HCI angesäuert und dreimal mit je 20 ml Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde über MgSÜ4 getrocknet und eingedampft, wobei 2,4 g eines gummiartigen farblosen Materials erhalten wurden. Durch NMR-Analyse konnte die Anwesenheit einer AldehydgFüppc uci <33,t ppm iiäCugc\vieSei~i wei'üct'i. uns Produkt wurde ohne weitere Reinigung für die Umsetzung mit Malonsäure verwendet.

B. Ein·: Probe des reinen Aldehyds (0,24 g, 1 mMol), 0,21g (2 mMol) Malonsäure, 20 ml Pyridin und 1 ml Piperidin wurden miteinander 6 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wurde im Schnellverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde in einer 10%igen Natriumbicarbonatlösung gelöst. Die Bicarbonatlösung wurde dreimal mit je 20 ml Äther gewaschen und dann mit konzentrierter HCl angesäuert. Dann wurde die Lösung zweimal mit je 20 ml Äther und anschließend mit zweimal 25 ml Chloroform extrahiert und anschließend über MgSO4 getrocknet, worauf die vereinigten organischen Schichten eingedampft wurden. Es wurden 0,23 g (Ausbeute 80%) eines weißen, festen Stoffes erhalten, der mit Hilfe der NMR-Analyse als die gewünschte 5-(a-Crotonsäure)-5-(l '-methylbutyl)-barbitursäure nachgewiesen werden konnte Nach dem Umkristallisieren aus CHCI3/CCI4 wurden 0,16 g reines Material erhalten.

C. Zu einer Lösung von 5-(a-Crotonsäure)-5-(l'-mc· thylbutyl)-barbitursäure (0,282 g, ImMoI) in DMF (3 ml), die auf -15° C (Eis-Salzbad) abgekühlt war, wurden 0,28 ml (2 mMol) Triäthylamin und 0,13 ml (1 mMol) Chlorameisensäureisobutylester gegeben. Das Rühren wurde noch 15 Minuten bei - 15°C und dann 30 Minuten bei 0⁰C fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Hilfe einer Spritze zu einer gekühlten Lösung von 400 mg RSA in 56 ml Wasser, das 2,6 g NaHCO3 enthielt, zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde in einem kalten Raum 5 Tage bei 0⁰C gerührt, wonach die anfängliche Trübung fast vollständig verschwunden war. Die Lösung wurde dann gegen 4 Liter Phosphatpuffer (pH = 8), dann gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei das gewünschte Konjugat erhalten wurde.

D. 240 mg Lysozym (100 uMol Lysin) wurden in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung auf 0°C abgekühlt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 0,05normalem Natriumhydroxyd auf 10,2 eingestellt, worauf das gemischte Anhydrid (100 μΜοΙ) in 1,5 ml trockenem Dimethylformamid zugetropft wurde, während die Lösung durch Zugabe der erforderlichen Menge Base auf eine pH-Wert von 9,6-93 gehalten wurde. Der pH-Wert wurde noch 30 Minuten auf 9,6 gehalten, worauf das Gemisch zentrifugiert wurde.

Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen eine 0,5molareTris-Maleat-Lösung(pH = 8,0) dialysiert. Die beim Zentrifugieren erhaltene Pille löste sich in 20 ml

einer 8molaren Harnstofflösung und wurde in der vorstehend beschriebenen Weise dialysiert, wobei weiteres Enzym erhalten wurde. Die Dialysebehandlung mit Harnstoff wurde wiederholt, bis nur 10 mg unlösliches Material hinterblieben.

Beispiel 8
Methadon-Analog-Konjugat mit Lysozym

A. Eine Lösung von 32,4 g (15OmMoI) Tetramethylendibromid in 150 ml trockenem Äther wurde zu 10,9 g (450 mMo!) Magnesium in 80 ml Äther mit einer solchen Geschwindigkeit gegeben, daß der Äther unter Rückfluß siedete. Die Umsetzung wurde unter Argon durchgeführt. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde gekocht. Eine Lösung von 2,2-Diphenyl-4-dimethylaminovaleronitril (I) (hergestellt nach J. W. Cu s ic, J. Am. Chem. Soc, 71, 3546 [1949]), (8,4 g, 3OmMoI) in trockenem Xylol (100 ml) wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten bei Raumtemperatur zugesetzt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 55⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt, und CO2 wurde unter kräftigem Rühren 4 Stunden lang hindurchgeleitet. Dann wurden 200 ml Wasser und 100 ml konzentrierte HCl zugesetzt, das Magnesium abfiltriert und das Filtrat 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die abgekühlte, klare Lösung wurde dreimal mit 150 ml Äther gewaschen und mit dreimal 150 ml Dichlormethan extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft, und der jo Rückstand wurde in 0,5 Liter 0,5normaler Natriumhydroxydlösung gelöst.

Die Lösung wurde dreimal mit 100 ml Äther gewaschen, mit 150 ml konzentrierter HCl angesäuert, mit Natriumchlorid gesättigt und mit dreimal 200 ml Dichlormethan extrahiert. Beim Eindampfen des Lösungsmitteis hinterbiieben 7,55 g (60%) eines Öls, nämlich 6-Keto-7,7-diphenyl-9-(dimethylamino)-decansäure-hydrochlorid, das bei der Dünnschichtchromatographie (HCCI3 : Methanol = 8:2 und 7 :3) als einzel- ίο ner Fleck wandert.

UV-Spektrum
0,02% CF3COOH 293 (ε = 540);

264 (ε = 500);
259 (ε = 535).

45

B. 21,0 mg (5OuMoI) der Säure wurden in ImI trockenem Dimethylformamid unter Zusatz von 2 Tropfen Triäthylamin gelöst, und die abgekühlte Lösung wurde wie in der vorstehend beschriebenen Weise mit 6,5 μΐ Chlorameisensäureisobutylester behandelt.

C. 120 mg Lysozym (50 μΙΜο! Lysin) wurden in 12 ml Wasser gelöst Der pH-Wert wurde mit 0,05normaler Hydroxydlösung auf 10 eingestellt und während des Zutropfens der Mischanhydridlösung auf diesem Wert gehalten. Es wurde noch 30 Minuten weitergerührt, worauf das Gemisch zentrifugiert wurde. Die überstehende Fraktion biieb bei der Dialyse gegen Wasser homogen und enthielt das Lysozymkonjugat des Methadon-Analogen.

Beispiel 9

Konjugation von Carboxymethylmorphii! (CMM)
mit Äpfelsäuredehydrogenase (MDH)

Schweineherz-MDH wurde in Form einer Suspension (8 rng/ml) in einer 2,8molaren Ammoniumsulfatlösung erhalten. Ein Millil,.er dieser Lösung (2 χ 10"⁷ Mol MDH) wurde zentrifugiert und die Pille in 1 ml Wasser von 4⁰C gelöst. Der pH-Wert wurde mit verdünnter NaOH auf 9,0 eingestellt, worauf 0,30 ml der Lösung des gemischten Anhydrids in Anteilen von 10μ1 zugesetzt wurden. Während der Zugabe wurde der pH zwischen 8 und 9 eingestellt. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch 1 Stunde bei 4°C gerührt. Dann wurde eine ausreichende Menge eines 0,05molaren Phosphatpuffers (pH = 7,5) zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 5 ml zu erhöhen, worauf die Lösung gegen diesen Puffer dialysiert wurde.

Beispiel 10

Konjugation von Testosteron-3-carboxymethaloxim
mit Äpfelsäuredehydrogenase (MDH)

36,1mg (ΙΟΟμΜοΙ) Testosteron-3-carboxymethyloxim wurden in 1 ml Dimethylformamid, das 3 Tropfen Triäthylamin enthielt, gelöst. Die Lösung wurde auf -15°C abgekühlt, worauf 13,1 μΐ (ΙΟΟμΜοΙ) Chlorameisensäureisobutylester zugesetzt wurden. Die Lösung wurde 1 Stunde bei — 15 bis —5°C gerührt, wobei sie sich nach Hellorange verfärbte.

0,5 ml einer Suspension von Äpfelsäuredehydrogenase in 2,8molarer Ammoniumsulfatlösung (5 mg MDH, 6,8 χ 10-⁸MoI MDH, 4,4 χ 10"⁶MoI Lysinrückstände) wurden 20 Minuten bei 15 000 U/min zentrifugiert. Die Pille wurde in 1 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde 5 Stunden gegen Wasser von 4° C dialysiert (dreimal ausgetauscht). Die Lösung wurde mit verdünnter NaOH von 4°C auf einen pH-Wert von 8,5 gebracht und 44 μΐ der Lösung dps gemischten Anhydrids (4,4 mMol gemischtes Anhydrid; entspricht 1 Hapten je Lysin) wurden der gerührten Enzymlösung in 3 Anteilen über einen Zeitraum von 5 Minuten zugesetzt. Natriumhydroxydlösung wurde nach Bedarf zugesetzt, um den pH-Wert auf 8,5 zu halten. Die Lösur^ war zunächst trüb, klärte sich aber nach einstündigem Rühren bei 4° C.

Die Lösung wurde erschöpfend gegen 0,05molare Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) dialysiert. Eine kleine Menge eines Niederschlags wurde abzentrifugiert. Es waren etwa 27 Gruppen je MDH vorhanden.

Analyse: Wegen der Instabilität von stark verdünnten Enzymlösungen wurde die Stammlösung (5 mg/ml; 3,4 χ ΙΟ-⁵ Mol) unmittelbar vor jeder Analyse im Verhältnis 1 :500 verdünnt. Die Reihenfolge der Zugabe der Reagentien zum Analysengemisch war wie folgt:

1. Antikörper (falls verwendet),
Z verdünntes Enzym,

3. Oxalessigsäure.

4. NADH.

Die Endkonzentration an Enzym betrug 2,7 χ 10-⁹MoI. Die Antikörperkonzentration war nicht bekannt Es wurde ausreichend Antikörper verwendet um eine mehr als 40%ige Inhibition der Enzymaktivität zu erzielen. Diese Menge entspricht einem Äquivalent von 10 μΐ Antikörper enthaltendem Serum.

(1) Enzym allein: 0,073 OD/min. (2) Enzym und Antikörper: 0,042 OD/min. (3) Enzym + Antikörper + 50 μΐ χ 10~⁵ MoI Testosteron (zuerst zugegeben): 0,073 OD/min.

Codeinanalyse

Die nachstehenden Versuche wurden ausgeführt, um die Inhibition der Aktivität des mit Morphin modifizierten Lysozynis durch Antikörper und die Wiederkehr der Aktivität durch Zusatz von Codein zu zeigen. Zu abgemessenen Anteilen der einzelnen Fraktionen des mit Morphin modifizierten Lysozyms wurde Antikörper gegeben und die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt. Auf diese Weise konnte der Einfluß des Antikörpers auf die enzymatische Aktivität und des Codeins auf die Regeneration der enzymatischen Aktivität bestimmt werden. In der nachstehenden Tabelle sind die erhaltenen Ergebnisse angegeben.

Frak	Mit Morphin	Antikörper	Codein	O. D./min
tion	modifiziertes	MnI*) X 10"'	Mq! * !0~⁷	y in·'
	Enzym. Mol
a	3,3X1O"^:	_	_	33
U	3,3X10"'	4,2	-	17
a	3,3X10"'	4,2	6,7	27
a	3.3X10"'	13	-	8
a	3,3 x 10"'	13	30	15
a	3,3 x 10"'	13	67	25
b	3,3 x 10"'	-	-	65
b	3,3 x 10"'	13	-	10
b	3,3 x 10"⁷	13	30	20
b	3,3XlO"⁷	13	67	37
C	1,2XlO"⁷	_	-	43
C	1,2 X 10"'	6,7	-	7
C	1,2 XlO"⁷	6,7	33	13
C	1,2 x 10"'	6,7	67	23
d	1,2X10"'	_	_	47
d	1,2X10"'	6,7	-	10
d	1,2X10"'	6,7	33	20
d	1,2X10"'	6,7	67	25
e	1,2X10"'	—	_	43
e	1,2X10"'	6,7	-	8
e	l,2X10"⁷	6,7	33	12
e	1,2 X 10"'	6,7	67	20
e	1,2 XlO"⁷	3,3	-	17
e	1,2X10"'	3,3	33	25
·) Mole, bezogen auf die Bindestellen.

Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen klar die große Empfindlichkeit des Systems. Durch Verwendung äquimolarer Mengen (bezogen auf die Bindungsstellen) oder eines geringen Überschusses an Antikörper gegenüber dem Enzym kann eine Verminderung der Aktivität bis zu 85% erreicht werden. Ein wesentlicher Teil der Aktivität kann mit nur 10-⁶MoI Codein zurückerhalten werden. Im übrigen wird Lysozym durch den Antikörper oder das Codein überhaupt nicht beeinflußt.

Eine weitere Einzeluntersuchung wurde wie folgt durchgeführt: Die Enzymkonzentration wurde auf 1,7 χ 10~⁷ MoI konstantgehalten, während wechselnde Mengen an Morphin-Antikörper zugesetzt wurden. Die Geschwindigkeit wurde anhand der wechselnden Konzentrationen des Morphin-Antikörpers bestimmt. Die Fraktion c wurde als Enzymquelle verwendet Die

Antikörper, Mol*	) x 10^s Geschwindigkeit (O.D./min
	XlO-)
0	45,7
1,7	45,7
3,3	46,0
6,7	38,6
12	33,6
17	28.3
25	21,4
33	16,1
50	8,3
67	7,1
130	7,2
*) Konzentration	der Bindungsiellen.

Im nächsten Versuch wurde die Enzymkonzentration bei 1,7 χ 10"⁷MoI und die Antikörper-Bindungsstel-Ien-Konzentration auf 5,0 χ 10-⁷Mo! konstantgehalten. Es wurden wechselnde Mengen an Codein zugesetzt und die Geschwindigkeiten bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

^}r> Codein, Mo! x 10⁸

Geschwindigkeit (O. D./min x 10³)

530
270
130
67
33
17
6,7
1,3

45,0
31,3
28,0
26,0
22,1
16,7
12,9
10,0
8,3

Die vorstehend angegebenen Tabellen weisen schlüssig die große Empfindlichkeit des Systems. Mit nur 1,3 χ 10~⁸ Mol Codein ist ein erkennbarer Unterschied in der Geschwindigkeit erreichbar.

Es wurden auch Versuche mit dem mit Phenobarbital konjugierten Lysozym nach Beispiel 6 und dem mit Secobarbital konjugierten Lysozym nach Beispiel 7 durchgeführt. Sowohl das Phenobarbital-Analoge als auch das Seeobarbital-Analoge wurden mit Rinderserumalbumin konjugiert, und die Antikörper wurden in an sich bekannterWeise durch Injizieren der RSA-Konjugate in Tiere und Sammlung der Antikörper erhalten.

Hierbei wurden zunächst einige Reagenslösungen hergestellt. Die Pufferlösung war eine 0,05mo!are Tris-Maleat-Lösung mit einem pH-Wert von 6. Die Rinderserumalbumin-Lösung enthielt 0,1 Gew.-% RSA in Tris-Maleat-Pufferlösung. Die Bakterienlösung enthielt 30 mg Micrococcuslysodeikticus in 50 ml Pufferlösung. Die Suspension wurde erst 12 Stunden vor Gebrauch hergestellt und bei 4°C aufbewahrt Die mit dem Barbiturat konjugierte Lysozymlösung wird mit der RSA-Lösung verdünnt Der Verdünnungsgrad wird so eingestellt, daß eine Geschwindigkeit von etwa 0,21 O.DVmin mit einer Lösung erhalten wird, die 0,2 ml Bakterienlösung, 0,02 m! RSA-Aibumin-Lösunp· OOR ml

synthetischen Urin und 0,5 ml Lysozymlösung enthält. Die Anti-Secobarbital- und Anti-Phenobarbital-y-Globulin-Lösungen (0,025 Tris-Maleat, pH = 7,4) liegen in solchen Konzentrationen vor, daß 20 λ ausreichen, um die Aktivität des mit dem speziellen Barbiturat konjugierten Lysozyics der Enzymstammlösung zu 92—96% zu inhibieren. Der synthetische Urin wird erhalten, indem man in 1 Liter destilliertem Wasser 5,2 g Kaliumchlorid, %2 g Natriumchlorid, 1,4 g Natriumdihydrogenphosphat, 1,4 g Dinatriummonohydrogenphosphat und 11g Harnstoff löst. Barbiturat-{Phenobarb!- tal- oder Secobarbital-J-Standardlösungen werden dadurch hergestellt, daß man die gewünschte Menge des jeweiligen Barbiturats in synthetischem Urin löst.

Die Analyse wird dadurch ausgeführt, daß man 0,2 mi der Bakteriensuspension in einen Probekolben bringt, 20Ä des jeweiligen Anti-Barbiturat-y-GlobuIins zusetzt, dann 80 λ der Urinprobe zusetzt und das Gemisch mit 0,5 ml Enzymlösung verdünnt. Das Reaktionsgemisch wird dann in das Spektrometer gesaugt, und die Abnahme der optischen Dichte bei 435 nm über einen Zeitraum von 40 Sekunden wird bei 30° C bestimmt. Es kann jede beliebige Zeitspanne zwischen 10 und b0 Sekunden verwendet werden. Die Konzentration des jeweiligen Barbiturats in der Urinprobe wird anhand einer Kurve bestimmt, die unter Verwendung von Standardlösungen erhalten wurde. Eine Leerwert-Korrektur wird dadurch vorgenommen, daß man 0,52 ml einer 0,l%igen RSA-Lösung in 0,025 Tris-Maleat-Lösung (pH = 6,0) anstelle der Lösungen des Antibarbiturat-y-GIobulins und des mit Barbitural konjugierten Lysozyms verwendet. Dieser Leerwert wird von dem mit den Urinproben erhaltenen Ergebnis abgezogen.

Unter Anwendung dieser Arbeitsweise wurde eine Anzahl von bekannten und unbekannten Urinproben auf die Anwesenheit von Secobarbital und Phenobarbital getestet. Die Ergebnisse stimmten fast identisch mit der Dünnschichtchromatographie und einer weiteren Immunanalysenmethode auf der Grundlage eines stabilen freien Radikals als Detektor überein.

Weiterhin wurde eine zusätzliche Reaktivität mit anderen Barbituraten festgestellt, die mit Nicht-Barbiiuraten. einschließlich Verbindungen mit ähnlicher Struktur, wie Glutethimid, fehlte.

Unter Anwendung dieser Arbeitsweise wurde auch ei^e Reihe von Methadonanalysen durchgeführt. Die Urinproben wurden vor. klinisch mit Methadon behandelten Patienten genommen und auf Methadon getestet. Von 65 Proben ergab die Dünnschichtchromatographie 62 positive Proben, während die vorliegende Analyse 63 positive Proben ergab.

Weitere Versuche wurden mit anderen Enzymen durchgeführt. Es wurden andere Enzyme verwendet, die mit 0³-Carboxymethylmorphin konjugiert waren. Diese Versuche sind nachstehend beschrieben.

(1) Für die Meerrettich-Enzym-Analyse wurde ein spezielles Substrat hergestellt. Der monomere Donor, ein Analoges von Malachitgrün, wurde durch Umsetzung von Toluesäure und p.p'-Dimethylaminobenzophenon in Gegenwart von Schwefelsäure hergestellt, wobei sich der Leukofarbstoff bildete. Der Leukofarbstoff wurde nach der gleichen Methode, die für das Carboxymethylmorphin angewendet wurde, in das gemischte Anhydrid umgewandelt. Die Konzentration betrug 0.015 mMol je ml DMF. 44 mg Polyvinylalkohol (entsprechend 1 mMol monomerer Vinylalkohol) (Viskosität einer 4%igen wäßrigen Lösung bei 20°C = *■ — 6 cP) wurden in 5 ml DMF aufgeschlämmt. Beim

Erhitzen auf 100"C löste sich der PVA. Der Lösung wurden 2^mI des gemischten Anhydrids und 0,5 m Pyridin zugesetzt; die Lösung wurde 14 Stunden bei 100⁰C unter N> stehengelassen. Während der Reaktion fand eine beträchtliche Oxydation des Farbstoffes statt. Das Gemisch wurde zur Trockne eingedampft unc der Rückstand gründlich mit Aceton gewaschen, uir nichtumgesetztes Anhydrid zu entfernen. Das Gemisch wurde in 20 ml Wasser gelöst und gegen Wassei dialysiert. Das erhaltene Polymer war als Substrai gegenüber Meerrettich-Peroxydase aktiv und ergab eine blaue Farbe. Für die Analyse wurde die obige Lösung im Verhältnis 3 :10 mit 0,05-moIarem Tris-Maleat-Puffer (pH = 6,0) verdünnt. Zu 10 ml der Lösung wurden 0,100 ml 039-moIares Wasserstoffperoxyd gegeben. Zu 1 ml dieses Gemisches wurden Enzym Antikörper und Hapten gegeben, worauf die Entwicklungsgeschwindigkeit der OD (optische Dichte) be 620 nm gemessen wurde.

Enzym, Mol (AB), Mol

Codein, Mol Geschwindigkeit

OD/min

1,25XlO"⁹ 1,25XlO"⁹ IXlO"⁸
1,25 x 10"⁹ 1 x 10"^s

5X10"⁶

0,070
0,050
0,068

Der nächste Versuch wurde mit a-Amylase durchge führt.

(2) 0,100 g (2,0 χ 10-⁶MoI) «-Amylase aus Bacillu; subtilis und 0,600 g Bicarbonat wurden in 15 ml kalterr Wasser gelöst. Der gerüiirten, gekühlten Lösung wurde 1 ml der vorstehend genannten Mischanhydrid-Lösung zugetropft. Es wurde 18 Stunden weitergerührt, woraul gegen Wasser erschöpfend dialysiert wurde. Die Lösung wurde schließlich gefriergetrocknet.

Die Analysen wurden mit dem Roche-Amylochrom System durchgeführt. Die markierte Amylase wurde ir Wasser gelöst (3,2 mg/Liter) und für die Analyse irr Verhältnis 1 : 10 verdünnt.

Ver	Antikörper-	Enzvm	Codem	Geschwin
such	bindurms-			digkeit
	stclle
	MnI	Mol	Mol	OH/10 min

I- 6,4 x 10"⁹ - 0,490

2 4.18X10"' 6.4X10" - 0,210

3 4.18 x 10 ^s 6.4x10"" 4x10" 0.410

Der letzte Versuch wurde mit Äpfelsäuredehydrogc nase durchgeführt.

(3) Für die Analyse wurde ein 0.05-molarer Phosphat puffer (pH = 7,5) verwendet. Zu 0,900 ml Pufferlösung wurden in der angegebenen Reihenfolge gegeben:

0.50 ml 7 χ IO-³-molare Oxalessigsäure in Puffer lösung (pH = 7,5).

0,005 ml 3,67 χ 10 -'-molares Anliopiat-y-GIobulir (Bindungsstellenkonzcni ration),

0.020 ml 8,03 χ 10~^q-molares Enzym in Pufferlö sung (pH = 7.5).

0.020 ml !,4 χ 10"'-molares NADlI in Wasser.

Die Abnahme der optischen Dichte bei 340 nm wird als Funktion der Zeit bei 30" C abgelesen. Das Hapten, das Codein (falls verwendet), wurde vor allen anderen Reagentien der Pufferlösung zugesetzt

Versuche:

(1) Ohne Antikörper. Geschwindigkeit 0,0136 OD/min.

(2) Mit Antikörper. Geschwindigkeit 0,0073 OD/min.

(3) Antikörper und 5 μΐ 1 χ 10-⁶-inolares Codein. Geschwindigkeit 0,0107 OD/min.

(4) Antikörper und 2μΙ 1 χ 10-⁶-molares Codein. Geschwindigkeit 0,0099 OD/min.

(5) Antikörper und 2μΙ 1 χ 10-'-molares Codein. Geschwindigkeit 0,0079 OD/min.

Erfindungsgemäß liegen die für die Analyse einer großen Vielzahl von Liganden erforderlichen Konzentrationen in der Größenordnung von 10~⁷ MoI oder darunter, wobei weniger als 5 μΐ Lösung verwendet werden können. Somit wird mit äußerst kleinen Mengen an Rcageniicn ein sehr hoher Eüipiändiichkeiisgrad erreicht Weiterhin ermöglicht die äußerst hohe Spezifizität der Rszeptorstellen gegenüber einer bestimmten Verbindung oder ihrer nahe verwandten Analogen viele Analysenvarianten mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad und einer hohen Spezifizität gegenüber bestimmten Verbindungen. Deshalb können äußerst geringe Mengen an biologisch aktivem Material in verschiedenen Körperflüssigkeiten, wie Blut, Speichel oder Urin, untersucht werden.

Die Erfindung liefert also ein äußerst empfindliches Verfahren zur Analyse von äußerst geringen Mengen spezifischer Stoffe mit einem hohen Grad an Spezifizität und Genauigkeit.

Andererseits kann das Verfahren qualitativ zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Substanzen mit einem hohen Grad an Spezifizität angewendet werden. Die Enzymanalyse ist technisch schon ziemlich ausgereift. Enzymbestimmungen, die opitmalen Bedingungen für die Bestimmung, die Substrate und die Methoden zum Nachweis der enzymatischen Aktivität sind aus der Literatur weitgehend bekann;. Weiterhin ist ein großer Teil der auf dem Gebiet der Radioimmunanalyse geleisteten Arbeit

unmittelbar auf die vorliegende Erfindung anwendbar. Die für die Radioimmunanalyse zur Verfügung stehenden Antiseren sind im allgemeinen für die erfindungsgemäß verwendeten Liganden anwendbar.

Die Verfahren zur Bindung von Verbindungen an Enzyme an anderen Stellen als an der aktiven Stelle sind ebenfalls ausgereift Es gibt sehr viel Literatur über die Funktionalitäten, die zur Bindung einer bestimmten Verbindung an eine bestimmte Stelle, z. B. an eine Aminosäure in einem Enzym, verwendet werden können, ohne daß die Aktivität des Enzyms nennenswert beeinträchtigt wird. Die obigen Beispiele zeigen, daß die Gegenwart eines Antikörpers die Aktivität des Enzyms deutlich vermindern kann, wenn dieser an einen Liganden gebunden ist, der seinerseits wieder an ein Enzym gebunden ist Dies geschieht entweder als physikalische Barriere oder alosterisch. Weithin wird die enzymatische Aktivität weitgehend regeneriert, wenn ein Ligang in das Medium eingeführt wird, der den an das Enzym gebundenen Liganden wirksam verdrängen und das Enzym vom Antikörper befreien kann.

Indem ein Enzym an einen Liganden gebunden wird, reagiert für jeden Liganden, der einen enzymgebundenen Liganden von seinem Rezeptor befreit, eine große Anzahl von Substratrnolekülen, und die Konzentrationen des hinterbleibenden Substrats oder Produkts kann gemessen werden. Auf diese Weise kommt es zu einer deutlichen Verstärkung (durch Kupplung des Enzyms an einen Liganden), da viele Moleküle durch die Anwesenheit eines einzigen Moleküls modifiziert werden.

Die Erfindung ermöglicht die Bestimmung von Verbindungen, die in äußerst geringen Konzentrationen oder Absolutmengen vorhanden sind. Dies in erster Linie deshalb, weil Rezeptoren mit einer hohen Spezifizität zur Verfügung stehen, wodurch eine Verbindung oder eine Gruppe von Verbindungen bestimmt werden können, ohne daß Störungen durch andere Verbindungen auftreten. Dadurch, daß ein oder mehrere Enzyme in Beziehung zu einem spezifischen Liganden vorhanden sind, kann man eine starke Konzentrationsänderung des Enzymsubstrats, bezogen auf einen einzigen Liganden, erhalten. Weiterhin bietet die Verwendung von Enzymen viele Alternativen hinsichtlich des verwendeten Nachweissystems.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis eines organischen Ligander, in einem Medium, in welchem man diesen Liganden verminet, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer flüssigen Zone (1) das Medium mit (2) einem enzymgebundenen Liganden und (3) einem Rezeptor, der dem Liganden und dem enzymgebundenen Liganden gemeinsam ist, in Berührung bringt, wobei die enzymatische Aktivität des enzymgebundenen Liganden weitgehend inhibiert wird, wenn der enzymgebundene Ligand an den Rezeptor gebunden ist, und daß man den Einfluß des vorhandenen Liganden bei der Bestimmung der enzymatischen Aktivität analysiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Zone hinsichtlich (1), (2) und (3) im wesentlichen homogen ist und daß der Ligand eine biologisch wirksame Verbindung darstellt

3. Verfahren nach Ansprach 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der flüssigen Zone im Bereich von 5—10 und die Konzentration des Rezeptors im Bereich von ΙΟ-⁴ bis 10—^M, bezogen auf die Bindungsstellen, liegt, daß das Verhältnis zwischen den verfügbaren Bindungsstellen des Rezeptors und den Molekülen des enzymgebundenen Liganden größer als etwa 1 ist und daß das Verhältnis zwischen den verfügbaren Bindungsstellen des Rezeptors zu den Molekülen des Liganden jo als enzymgebundenem Liganden weniger als etwa 20 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert im Bereich von 6—9 liegt und daß das Verhältnis zwischen den verfügbaren J5 Bindungsstellen des Rezeptors und den Molekülen des enzymgebundenen Liganden größer als etwa 2 ist und daß das Verhältnis zwischen den verfügbaren Bindungsstellen des Rezeptors und den Molekülen des Liganden als enzymgebundenen Liganden weniger als etwa 5 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein lösliches oder unlösliches Substrat für das Enzym des enzymgebundenen Liganden in der flüssigen Zone vorhanden ist und daß die Anwesenheit dieses Liganden durch die Änderung der Menge des Substrates oder des Produktes dieses Substrates gemessen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die flüssige Zone innerhalb eines pH-Bereiches von 7,2—83 mit (Trishydroxymethyl)-methylamin, Carbonat, Borat oder Phosphat puffert.

7. Verfahren zum Nachweis eines Liganden, der eine organische biologisch aktive Verbindung mit einem Molekulargewicht von etwa 100—2000 darstellt, und der mindestens eine polare Funktionalität enthält, in einem Medium, in welchem dieser Ligand vermutet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer flüssigen Zone (1) das Medium mit (2) einem enzymgebundenen Liganden und (3) einem Rezeptor, der dem Ligangen und dem enzymgebundenen Liganden gemeinsam ist, in Berührung bringt, wobei die enzymatische Aktivität des enzymgebundenen Liganden im wesentlichen inhibiert wird, wenn der enzymgebundene Ligand an den Rezeptor gebunden wird, und daß man den Einfluß des vorhandenen Liganden durch Bestimmung der enzymatischem Aktivität analysiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Zone hinsichtlich (1), (2) und (3) im wesentlichen homogen ist, daß der Ligand eine biologisch aktive Verbindung darstellt und daß die enzymatische Aktivität des enzymgebundenen Liganden im wesentlichen inhibiert wird, wenn der enzymgebundene Ligand an den Rezeptor gebunden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ligand ein Polypeptid und als enzymgebundenen Liganden einen solchen verwendet, bei dem mindestens ein Enzymmolekül je enzymgebundenes Ligandenmolekül vorhanden ist

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Zone heterogen ist, der Ligand eine biologisch aktive Verbindung darstellt und der Rezeptor an einen unlösli^:^en Träger gebunden ist

11. Enzymgebunderier Ligand für enzymatische Immunanalysen, auf der Grundlage eines Alkaloids öder eines physiomimetischen Analogen eines Alkaloids, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkaloid oder Analoge an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die Grundstruktur

X-A

aufweist, worin X eine verbindende Gruppe und A ein Enzym darstellt, worin der Sauerstoff in einer oder mehreren Stellungen (ortho, meta oder beta) gebunden ist, um eine oder mehrere Oxy-Funktionalitäten zu liefern, worin die restlichen Valenzen durch Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und/oder Sauerstoff abgesättigt sind und worin A eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A, geteilt durch 2000, trägt.

12. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch die Formel

N—W¹

worin die Substitucnten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X ⁺ -A⁺ sein oder ein H jeder der Gruppen W kann durch X⁺-A* ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende

Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

W¹ ist Wasserstoff oder eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 —8 Kohlenstoffatomen; W² ist Wasserstoff; W³IStWaSSCrStOIf;

W* ist Wasserstoff oder bildet zusammen mit W³ einen zweiwertigen Rest mit 3—6 Kohlenstoffatomen und 0—2 Sauerstoffatomen, die mit der Kohlenstoffkette, an die sie gebunden sind, einen sechsgliedrigen carbocyclischen Ring bilden; W⁵ ist Wasserstoff oder Hydroxyl; W⁶ ist Wasserstoff, Hydroxyl oder zusammen mit W*, Oxy;

W⁷ ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe; W⁸ ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W⁹ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, eine Acyloxygruppe aiit 1—6 Kohlenstoffatomen, eine Hydrocarbyloxygruppe mit 1—3 Kohlenstoffato men, eine 2-(N-MorphoIino)-äthoxygruppe oder eine Glucuronyl-Gruppe;und W*'ist Wasserstoff.

13. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch die Formel an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel '

0—1

N-W

älhylenisch ungesättigte Stellen

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X+-A" ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; W¹' ist eine Alkylgruppe mit 1—3 Kohlenstoffatomen;

W* ^:st Wasserstoff, eine Hydroxy-, Oxo- oder Acetoxygruppe;

W⁵'ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W⁶' ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder zusammen mit W⁵' eine Oxy( -0 -)-Gruppe; und W⁹' ist eine Hydroxygruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen.

14. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage von Methadon oder eines physiomimetischen Analogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Methadon oder das Analoge über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms

W¹⁶—C—(O)_n-C-

W¹⁷

aufweist worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereicl· von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; η = 0 oder 1;
m = 2 oder 3;
W'o ist Wasserstoff;

W¹¹ und W¹² sind Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1—3 Kohlenstoffatomen oder bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen sechsgliedrigen Ring, wobei außer dem Stickstoffatom 0—1 andere Ringhetercatome vorhanden sein können;

W¹³ ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe, wobei nur ein W¹³ eine Methylgruppe ist; W" ist Wasserstoff;

W¹⁵ ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W¹⁶ ist Wasserstoff, eine Acyloxygruppe mit 1—3 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxylgruppe; und W" ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit ! —3 Kohlenstoffatomen.

15. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch die Formel

i ]

VV"⁵ \/'

' I ί

-C C CH

I ι

w"· J\

CH N

H — CH,-

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W ode,- ein H jeder der Gruppen W kann durch -X ⁺ -A⁺ ersetzt sein, worin X ⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von I bis zum

Molekulargewicht von A+, geteilt durch 2000, trägt; W¹⁰" und W^M' sind Wasserstoff; V*"¹' und W¹²" sind Methylgruppen oder bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Morpholin- oder Piperidinring; W'5' und W'6· sind Wasserstoff, Hydroxyl- oder Acetoxygruppen, wobei mindestens eine Hydroxyl- oder Acetoxygruppe vorliegt; und W¹⁷' ist eine Alkylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen.

16. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage von Meperidin oder eines physiomimetischen Analogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Meperidin oder das Analoge an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die Formel

_W2O

20

IiN
ο

w²

W²

aufweist, worin die Subsiituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ darstellen, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzjt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewi ;ht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; W» ist Wasserstoff;

W²¹ ist Wasserstoff, eine AlkylgnjDpe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen, eine Phenylaminoalkyl- oder Aminophenylalkylgruppe;

W²² ist eine Alkoxygruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen; und
W²³ ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe.

17. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage eines Methadon-Metaboliten oder eines physiomimetischen Analogen, dadurch gekennzeichnet, daß der Methadon-Meiabolit oder sein Analoges über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

W"-¹

Φ—

-W¹

b0 Jede der Giuppen W kann -X⁺-A⁺ darstellen, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺ -A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekular gewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; Φ ist eine Phenylgruppe;
W'O" ist Wasserstoff;

W¹¹" ist Wasserstoff, eine Methylgruppe oder eine freie Valenz, die mit W¹⁵" verbunden ist;
W>3" ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe;
W'⁵" ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder bildet zusammen mit W¹'" eine Doppelbindung; und W¹⁷" ist eine Alkylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen.

18. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage von Diphenylhydantoin, dadurch gekennzeichnet, daß das Diphenylhydantoin über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

W³⁶²

—W¹"⁰

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺ -A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺,geteilt durch 2000, trägt;
W»«o, w*⁶' und W*⁶² sind Wasserstoff.

19. Enzymgebundener Ligand für⁽enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage von Catecholamin, dadurch gekennzeichnet, daß das Catecholamin über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

aufweist, worin o·!; Subsiituenten folgende Bedeutungen haben:

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungenhaben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X ⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W³⁰ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 -3 Kohlenstoffatomen; ι ο

W³¹ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen;
W" und W" sind Wasserstoff;
W³⁴ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, eine Dimethoxycarboxyphenacylgruppe oder eine Dimethoxy-a-phthalidylgruppe;
W³⁵ und W³⁶ sind Wasserstoff, bzw. eines kann zusammen mit W³¹ eine Bindung bilden, mit der

iviaugauc, uau, wenn ty-· uiiu rr— £U5aiiiincit cmc Bindung bilden, jedes Paar von W³² und W³³ bzw. W³⁰ und W³⁶ zusammengenommen werden kann, um eine Doppelbindung zu bilden;

W³⁷ ist Wasserstoff oder eine Alkoxygruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen und

W^M und W^N simJ Hydroxylgruppen oder Alkoxy- :5 gruppen mit 1—3 Kohlenstoffatomen.

20. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage eines Epinephrins oder eines physiomimetischen Analogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Epinephrin oder jo Analoge über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

VV"

VV" CH C

N-W⁴"

35

40

43

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ darstellen bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetze sein, worin X ⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W⁴⁰ und W⁴¹ sind Wasserstoff oder Alkylgruppen mit 1 —3 Kohlenstoffatomen;

W⁴² sind gleich oder verschieden und bedeuten Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1 —3 Kohlenstoffatomen oder Carboxygruppen, bzw. ein W⁴² kann zusammen mit W⁴¹ einen Piperidinring bilden;
W⁴³ ist Wasserstoff, eine Hydroxyl- oder Carboxymethylgruppe und

W⁴⁴ und W⁴⁵ sind Wasserstoff, Hydroxylgruppen oder Alkoxylgruppen mit 1 —3 Kohlenstoffatomen.

21. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage eines Barbiturats,

50 dadurch gekennzeichnet, daß das Barbiturat über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die Formel

W⁵³—N

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

r~-j« J — i^_._„<«.. \i/ ι —- vj. α -l ι i-...-..

j<»ii<~ «*-i uiuppt.il f» ftatiii —s\ · —r\ · tscucuicil, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X ⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W⁵⁰ ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlens ,cffatomen oder ein Alkalimetailkation;
W³¹ und W'² sind Wasserstoff, Alkyl-Alkenyl-Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- oder Arylkohlenwasserstoffgruppen mit nicht mehr als 8 Kohlenstoffatomen;
W⁵³ ist Wasserstoff oder ein Alkalimetailkation und
W⁵⁴ ist Sauerstoff oder Schwefel.

22. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage von Cocain oder einer verwandten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß das CoGein oder die verwandte Verbindung über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die Formel

-CH

CH,-

/
-CH

N—W⁵⁷

• CHCOW⁵³

CH-OW*

CH,

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer arderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W⁵⁵ ist eine Hydroxyl-, Methoxy- oder Aminogruppe;

W⁵⁶ ist Wasserstoff oder eine Benzoylgruppe und
WS? ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen.

23. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage eines Steroids

mit 18-27 Kohlenstoffatomen und 1 -6 sauerstoffhaltigen Funktionalitäten, dadurch gekennzeichnet, daß das Steroid über eine verbindende Gruppe an einer ancicren Stelle als der aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Grundstruktur

X-A

äuiwcisi, worin λ cine oiiiuung oder eine stabile verbindende Gruppe und Z 1 —2 Gruppen darstellt, von denen eine eine Hydroxyl-oxo-aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen oder eine sauerstoffhaltige aliphatische Gruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen und 1-3 Sauerstoffatomen darstellt, und worin A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als an der reaktiven Stelle des Enzyms an X gebunden ist, wobei A eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A, geleilt durch 2000, trägt, darstellt

24. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 23 auf der Grundlage eines Androgens, gekennzeichnet durch die Formel

25

30

35

40

W"

0—I äthylenisch ungesättigte Stellen

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X+ -A⁺ sein bzw. ein _Μ H jeder der Gruppen W kann durch -X+-A⁺ ersetzt sein, worin X+ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; W⁶⁰ ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W⁶¹ ist Wasserstoff, eine Methyl- oder Hydroxylgruppe; _M W⁶² und W« sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine der Gruppen W⁶⁰-⁶³ eine Hydroxylgruppe darstellt;
W⁶⁴ ist Wasserstoff bzw. zwei W^M können zusammen eine Doppelbindung bilden; W⁶⁵ ist eine Methylgruppe und
W<* ist Wasserstoff.

25. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 23 auf der Grundlage eines östrogens, gekennzeichnet durch die Formel

W⁷

0—1 äthylenisch ungesättigte Stellen

(W⁷⁴),

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin W⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; W⁷⁰ ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W⁷¹ ist Wasserstoff, eine Äthinylgruppe oder eine Hydroxylgruppe;

W⁷² ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W⁷³ ist eine Hydroxylgruppe oder eine Alkoxylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen; W⁷⁴ ist Wasserstoff bzw. zwei W⁷⁴ können zusammen eine Doppelbindung bilden und W" ist Wasserstoff.

26. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 23 auf der Grundlage eines Gestogens, gekennzeichnet

W*¹

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

W⁸⁰-⁸⁴ sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens zwei Hydroxylgruppen vorhanden sind;

W⁸⁵ sind Wasserstoff bzw. zwei W⁸⁵ können zusammen eine Doppelbindung bilden.

27. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 23, auf der Grundlage eines Cortocosteroids, gekennzeichnet durch die Formel

W"

0—! äi!iy!eiiiM.li ungesättigte Steilen

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺ -A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A ⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
V/90-97 _sj_n(j Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens zwei Hydroxylgruppen vorhanden sind;

W⁹⁸ ist eine Methyl- oder Formylgruppe und
W" ist Wasserstoff bzw. zwei W" können zusammen eine Doppelbindung bilden.

28. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 23, auf der Grundlage eines Sapogenins, gekennzeichnet durch die Formel

0—1 äthylep'.sch ungesättigte Stellen

worin die Substituenten folgende Bedeutung haben: Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeuten, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt und
W"', W'² und W* sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist; und wobei für den Fall, daß am Lactouring eine äthylenisch ungesättigte Stelle vorhanden ist, am Kohlenstoffatom 12 eine Hydroxylgruppe vorhanden sein kann.

29. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen, udf der Grundlage eines Cannabinols oder einer verwandten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß das Cannabinol bzw. die verwandte Verbindung über eine verbindende Gruppe an einer anderen Steile als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

0-3 äthylenisch ungesättigte
Stellen

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben können:

Jede der Gruppen W kann -X⁺ -A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A ⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W^aloist Wasserstoff oder eine Carboxylgruppe;
W^lU ist eine Hydroxylgruppe; *
W"2 ist Wasserstoff;
W^al3 ist eine Pentylgruppe;
W¹'⁴ ist eine Methylgruppe und
W^al5 ist eine Methyl- oder Carboxygruppe.

30. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen, auf der Grundlage eines Prostaglandins, dadurch gekennzeichnet, daß das Prostaglandin über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

äthvlenisch uneesättiate Stellen

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargcv. xht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W"²⁰-"²³ sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist und

W¹²⁴ ist eine Hydroxyl-, Amino- oder eine Oxygruppe mit 1 —6 Kohlenstoffatomen.

3i. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage von Meprobamat oder verwandten Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß das Meprobamat bzw. die verwandten Verbindungen über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden sind, wobei der Ligand die nachstehende Formel

O QH₇ O

ti : Ii

\V'"—COCH,—C—CH₁-O-CW'²"

CH3

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutunge.. haben:

Jede der Gruppen W kann -X+-A+ bedeuten bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺ -A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A* ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt dirch 2000, trägt und
W^a25 und W"²⁶ sind Aminogruppen.

32. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage eines Tranquilizers mit einer Benziazocycloheptan-Funktionalität oder einer verwandten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß der Tranquilizer oder die verwandte Verbindung über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

10

Ij

20

30

■10

45

50

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben: Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven eo Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W*» und W>35 sind Wasserstoff;

W^ül ist Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe mit 1—3 Kohlenstoffatomen bzw. kann zusammen mit W·³² eine Doppelbindung zwischen dem Kohlenstoff- und dem Stickstoffatom bilden;

W*³³ ist eine Aminogruppe oder eine niedere Alkylaminogruppe mit 1—3 Kohlenstoffatomen oder kann zusammen mit W^a32 eine Carbonylgruppe bilden;

W¹³⁴ ist Wasserstoff oder eine Hydrox vlgrupoe und W·³⁶ ist eine Oxygruppe oder ein ungepaactes Elektronenpaar.

33. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen, auf der Grundlage eines Tranquilizers mit einer Phenothiazin-Funktionalität oder von verwandten Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Tranquilizer oder die verwandte Verbindung über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W*¹⁰ ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1—6 Kohlenstoffatomen eine Di2lkⁱ⁷l3rnino3!k^v!^oru^rine mit 4—8 Kohlenstoffatomen, eine N-Hydroxyalkylgruppe, eine N'-Pip:razinoalkylgruppe, worin die Alkylgruppe 2 — 3 Kohlenstoffatome enthält, eine N'-AIkylgruppe, eine N'-Piperazinoalkylgruppe, worin die Alkylgruppe 1—3 Kohlenstoffatome enthält, oder eine 2-(N-Alkyl)-piperidiny;->lkylgruppe, worin die Alkylgruppe 1—3 Kohlenstoffatome enthält, wobei zwischen den Heteroatomen mindestens 2 Kohlenstoffatome angeordnet sind;
W^a41 ist Wasserstoff, Chlor, eine Trifluormethylgruppe, eine Alkylmercaptogruppe mit 1 — 3 Kohlenstoffatomen oder eine Acylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen und
W»« und W»« sind Wasserstoff.

34. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Immunanalysen auf der Grundlage von Serotonin oder einer verwandten Verbindung, wie 3-(2'Aminoäthyl)-5-hydroxyindol, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe oder die Hydroxylgruppe der Carboxylgruppe durch -X⁺ -A⁺ ersetzt ist, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen als an seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt

35. Enzymgebundener Ligand für enzymatische Imrr.unanalysen auf der Grundlage von Glutethimid oder einer verwandten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß das Glutethimid oder die verwandte Verbindune über eine verbindende GruDDe

an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der LJgand die Formel

aufweist, worin die Substituenten die nachstehende Bedeutung haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺ -A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Ljganden im Bereich von ! bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;
W»»und W«5i sind Wasserstoff und
W*⁵² ist eine niedere Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen.

36. Ligand nach einem der Ansprüche 11,12,14,20, 21, 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Coenzym I oder Coenzym II enthaltendes Eni.ym, Lysozym, Amylase, Peroxydase, /!-Glucoronidase, Cellulase oder Phosphoiipase darstellt

37. CP-Carboxymethylmorphin für enzymatische Immunanalysen, gebunden an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.

Se.N-CarboxymethyM-phenyl-'J-carbäthoxypiperidin für enzymatische Immunanalysen, gebunden an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.

39. N-Carboxymethyl-l-phenyl-2-propylamin für enzymatische Immunanalysen, gebunden an Lysozym, Amyiase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.

40. Ecgonin für enzymatische Immunanalysen, an der 2-Carboxystellung an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase gebunden.

41. 5-(«-Crotonyl)-5-( 1 '-methylbutyl)-barbitursäurc für enzymatische Immunanalysen, gebunden an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehyd^rogenase oder Peroxydase.

42. Testosteron-3-carboxymethyIoxim für enzymatische Immunanalysen, gebunden an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.

43. ö-Keto-ZJ-diphenyl-O-dimethylaminodecansäure für enzymatische Immunanalysen, gebunden an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.

44. N-Carboxymethylphenobarbital für enzymatische Immunanalysen, gebunden an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.