DE69230105T2

DE69230105T2 - Differentielle bindungsaffinitäten und darauf beruhende dissoziationstestverfahren

Info

Publication number: DE69230105T2
Application number: DE69230105T
Authority: DE
Inventors: Judith Fitzpatrick; Regina Lenda
Original assignee: Serex Inc
Current assignee: Serex Inc
Priority date: 1991-07-29
Filing date: 1992-07-29
Publication date: 2000-01-20
Anticipated expiration: 2012-07-30
Also published as: ATE185424T1; EP0600936B1; EP0600936A1; AU2402292A; EP0600936A4; DE69230105D1; US5527686A; WO1993003367A1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung bzw. zum Nachweis der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe. Insbesondere werden homogene, in flüssiger Phase ablaufende, und heterogene, in flüssiger bzw. fester Phase ablaufende Freisetzungsassays zur Verfügung gestellt, die hochspezifisch und empfindlich sind.

2. Hintergrund der Erfindung

Immunoassays nutzen die spezifischen Bindungsfähigkeiten von Antikörpern, um die Anwesenheit von Zielmolekülen in Lösung nachzuweisen. Obwohl das allgemeine Prinzip auf einen breiten Bereich von Problemstellungen anwendbar ist, hat sich das hauptsächliche wirtschaftliche Interesse auf medizinische diagnostische Anwendungen für einen breiten Bereich von Analyten in biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Speichel und Urin konzentriert.
Es existieren bereits verschiedene Arten von Immunoassays, die für bestimmte Anwendungen nützlich sind. Jeder dieser Assaytypen erfordert einen Weg, um feststellen zu können, ob Bindungsstellen auf dem Antikörper besetzt oder frei sind. Typischerweise wird dies mit Hilfe eines Labels erreicht, wie einem Atom, einem Molekül, einem Enzym oder einem Partikel, der permanent mit entweder dem Antikörper oder einem Analogen des Analyten verbunden ist.
Die Empfindlichkeit und die Spezifität sind die Schlüsselparameter für einen Immunoassay. Die Spezifität hängt in erster Linie von der Bindungsstelle des Antikörpers für das Antigen ab, die inhärent mit der Auswahl von Gensegmenten mit variablen Regionen verbunden ist und nicht vom Aufbau des Assays abhängt. Die Empfindlichkeit hängt in erster Linie von der Affinität des Antikörpers zu seinem oder seinen Liganden und von der inhärenten Nachweisbarkeit des Labels zusammen. Zum Beispiel können für Radioimmunoassays verwendete Radioisotope bei deutlich niedrigeren Konzentrationen als fluoreszierende Moleküle nachgewiesen werden. Enzymlabel können bei vergleichbaren Konzentrationen nachgewiesen werden wie Fluoreszenzlabel. Werden Substrate, die fluoreszierende oder chemilumineszierende Produkte freisetzen, zusammen mit Enzymlabeln verwendet, ist die Empfindlichkeit der sich ergebenden Immunoassays vergleichbar mit oder größer als bei radioaktiven Labeln.
Viele herkömmliche Assaytechniken wirken kompetitiv, da Analyt und die markierte Komponente vergleichbare Affinitäten zur Bindungsstelle des Antikörpers aufweisen. Ein Beispiel für ein solches kompetitives Verfahren ist in dem US-Patent 3,817,837 von Rubinstein und Ullman offenbart, das eine Technik beschreibt, bei der der Ligand und der an ein Enzym gebundene Ligand um die Bindungsstelle auf dem Antikörper konkurrieren. Da die Bindung des Antikörpers an den mit einem Enzym verbundenen Liganden dessen enzymatische Aktivität verändert, kann die vorhandene Konzentration des Liganden abgeschätzt werden, indem die Rate gemessen wird, mit der eine solche Mischung ein Substrat in ein Produkt umwandelt.
Immunoassays können weiter als homogen und als heterogen gekennzeichnet werden. Bei einem heterogenen Verfahren kann das Label im gebundenen und im ungebundenen Zustand gleichwertig nachgewiesen werden. Um ein aussagekräftiges Ergebnis des Assays zu erhalten, ist eine stoffliche Abtrennung der ungebundenen Antikörper von den gebundenen Antikörpern erforderlich. Ein übliches Verfahren, um diese Trennung zu erreichen erfordert, daß das Label mit einer festen Phase verbunden wird, die vor dem Nachweisschritt stofflich von der flüssigen Phase abgetrennt werden kann. Ein typischer heterogener Assay ist der Tandem EIA der Firma Hybritech, Inc. Ein weiteres Beispiel für einen heterogenen Assay ist die US 4434236, die ein Verfahren beschreibt, bei der die Probe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht wird, auf der ein Analoges des Analyten immobilisiert ist, an das abspaltbar ein markierter, gegen den Analyten gerichteter Antikörper gebunden ist. Der Antikörper zeigt eine größere Affinität zum Analyten als zum Analogen des Analyten, so daß der markierte Antikörper von der festen Phase verdrängt wird. Der Komplex wird von der festen Phase abgetrennt und die Menge des Komplexes gemessen.
Beim homogenen Verfahren ist die nachweisbare Eigenschaft des Labels inhärent verschieden und hängt davon ab ob er gebunden oder ungebunden ist. Im gebundenen Zustand zeigt das Label ein stärkeres oder schwächeres Signal. Gewöhnlich bewirkt die Bindung des Antikörpers an den markierten Liganden eine Abschwächung der Signalintensität, z. B. wenn das Label ein Enzym ist. Typische Produkte dieser Kategorie umfassen die EMIT®-Linie von Enzym-Immunoassays der Syva Company und die TDX®-Linie von Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays der Abbott Diagnostics.
Zwei weitere Eigenschaften von Immunoassays sind von besonderer Bedeutung. Dies sind die minimale Konzentration, bei der ein Analyten nachgewiesen werden kann und der dynamische Bereich der Nachweisbarkeit. Der dynamische Bereich des Analyten ist der Konzentrationsbereich des Analyten, innerhalb dessen sich das Signal eines Labels von Null bis zum Maximum verändert. Die Reihenfolge, mit der die Probe, der Antikörper, und eine markierte Komponente zusammengegeben werden, kann beide dieser Schlüsselparameter deutlich beeinflussen, indem sie den Bindungsgrad der markierten Komponente beeinflußt, der wiederum den Nachweis des Labels beeinflußt.
Bei verschiedenen bekannten Assayverfahren werden der Antikörper und der Analyt vor der Zugabe der markierten Verbindung kombiniert. Bei anderen werden der Analyt und die markierte Verbindung vor der Zugabe des Antikörpers kombiniert. Jeder dieser Fälle erfordert, daß zwei getrennte Reagentien zur Verfügung gestellt werden, die mit der den Analyten enthaltenden Probe kombiniert werden. Die Notwendigkeit von zwei getrennten Reagentien kann unbequem sein und zu einem schwerfälligeren, komplexeren Verfahren führen. Da die genaue volumetrische Messung jedes Reagenz für eine gute Auswertbarkeit des Assays wichtig ist, kann das Erfordernis von zwei Schritten bei der Messung Fehler verursachen, die zu verfälschten Ergebnissen führen können.
Ein Verfahren, um die Genauigkeit des Assays zu verbessern und damit die Empfindlichkeit des Assays zu verstärken besteht darin, einen vorgefertigten Komplex aus Antikörper und der markierten Komponente zur Verfügung zu stellen. Dies ist jedoch problematisch, da die Bindungsreaktion im Allgemeinen irreversibel verläuft. Wird daher ein Komplex des markierten Analyten und des Antikörpers mit einer den Analyten enthaltenden Lösung kombiniert, tritt keine merkliche Verdrängung des gebundenen Labels in einem sinnvollen Zeitrahmen (Sekunden oder Minuten) auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Methodologie von Assays, die einen Komplex aus Rezeptor und einem Liganden nutzen, wobei der Komplex aus Rezeptor und Ligand in Gegenwart eines Analyten dissoziiert und ein stabiler Komplex aus Rezeptor und Analyt gebildet wird. Die Dissoziation des Komplexes aus Rezeptor und Ligand in Gegenwart eines Analyten kann nachgewiesen werden wodurch die Gegenwart eines Analyten in der Testprobe positiv angezeigt wird. Verfahren für den Aufbau, die Herstellung, die Anwendung und die Stabilisierung derartiger Komplexe sind bekannt. Die Methodologie ist sowohl auf homogene Assays wie auch auf heterogene Assays für Analyten anwendbar, die einen großen Bereich von Arten und Größen umfassen.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt für heterogene und homogene Freisetzungs-Assays Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe zur Verfügung. Weiter wird ein Kit zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung gestellt.
Nach einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe zur Verfügung gestellt, welches umfaßt:
(a) das Inkontaktbringen einer Testprobe mit einem Rezeptor-Liganden-Komplex, der einen an einen Freisetzungs-Liganden gebundenen Rezeptor aufweist, der in der Lage ist, sich an einen Analyten zu binden, wobei der Freisetzungs-Ligand sich an den Rezeptor bindet mit einer Assoziationskonstanten von 1% oder weniger der Assoziationskonstanten des Analyten für den Rezeptor, und der Freisetzungs-Ligand mit dem Analyten nicht nachweisbar konkurriert für die Bindung an den Rezeptor; und
(b) die Bestimmung der Dissoziation des Freisetzungs-Liganden von dem Rezeptor als Maß für die Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Probe.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe zur Verfügung gestellt, das umfaßt:
(a) die Bildung eines Rezeptor-Liganden -Komplexes, der einen an einen Freisetzungs-Liganden gebundenen Rezeptor aufweist, der in der Lage ist, sich an einen Analyten zu binden, wobei der Freisetzungs-Ligand sich an den Rezeptor bindet mit einer Assoziationskonstanten von 1% oder weniger der Assoziationskonstanten des Analyten für den Rezeptor, und der Freisetzungs- Ligand mit dem Analyten nicht nachweisbar Konkurriert für die Bindung an den Rezeptor;
(b) das Inkontaktbringen einer Testprobe mit dem Komplex, und
(c) die Bestimmung der Dissoziation des Freisetzungs-Liganden von dem Rezeptor, die positiv korreliert mit der Anwesenheit des Analyten in der Probe.
Nach dem vorliegenden Verfahren wird eine Testprobe mit einem Rezeptor-Ligand- Komplex in Kontakt gebracht. Der Rezeptor zeigt eine viel höhere Assoziationskonstante für den Analyten, als der Ligand. Dissoziiert der Rezeptor- Ligand-Komplex in Gegenwart von freiem Analyten in der Testprobe in seine Rezeptor- und seine Ligandenkomponente, bindet der Rezeptor den freien Analyten unter Ausbildung eines stabilen Rezeptor-Analyt-Komplexes, der im wesentlichen durch die Gegenwart von freiem Liganden unbeeinflußt bleibt. Nach dem vorliegenden Verfahren ist die Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes, d. h. die Freisetzung von Rezeptor und Ligand, das nachweisbare Ereignis, das die Gegenwart des Analyten in der Testprobe anzeigt. Der Nachweis entweder des dissoziierten Liganden oder des Rezeptors wird betrachtet. Nachweismittel sind unten in den Abschnitten 5.2, 5.2.1 und 5.2.2 genau beschrieben.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur Verfügung gestellt, mit dem das vorliegende Verfahren durchgeführt werden kann.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Kit zum Nachweis der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe zur Verfügung gestellt, der einen vorgefertigten Rezeptor-Freisetzungs-Ligand-Komplex umfaßt, welcher einen an einen Freisetzungs-Liganden gebundenen Rezeptor umfaßt wobei der Rezeptor an einen Analyten binden kann, wobei der Freisetzungs-Ligand an den Rezeptor mit einer Assoziationskonstante bindet, die 1% oder weniger der Assoziationskonstante des Analyten für den Rezeptor ist, wobei der Freisetzungs-Ligand nicht nachweisbar mit dem Analyten um die Bindung an den Rezeptor konkurriert, sowie Mittel zum Nachweis der Dissoziation des Komplexes und der Bindung des Rezeptors an einen Analyten in Gegenwart eines Analyten in der Probe.
Nach einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Kit zum Nachweis der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe zur Verfügung gestellt, der einen Rezeptor und einen Freisetzungs-Liganden umfaßt, die einen Rezeptor- Freisetzungs-Ligand-Komplex ausbilden können, wobei der Rezeptor an einen Analyten binden kann, wobei der Freisetzungs-Ligand an den Rezeptor mit einer Assoziationskonstante binden kann, die 1% oder weniger der Assoziationskonstante des Analyten für den Rezeptor ist, und wobei der Freisetzungs-Ligand nicht nachweisbar mit dem Analyten um die Bindung an den Rezeptor konkurriert, sowie Mittel, zum Nachweis der Dissoziation des Komplexes und der Freisetzung des Liganden, die mit der Anwesenheit des Analyten in der Probe positiv korrelieren.
Der Kit umfaßt entweder einen vorgefertigten Rezeptor-Ligand-Komplex oder den Rezeptor und den Liganden, die vor der Durchführung des Assays vermischt werden, um den Komplex auszubilden. Wie unmittelbar verständlich, kann in dem Fall, daß ein vorgeformter Komplex verwendet wird, außer der Testprobe nur dieses einzelne Reagenz erforderlich sein, um den Test auszuführen.
Wie unten in den Beispielen gezeigt wird, ermöglicht die vorliegende Erfindung überraschenderweise eine höhere Empfindlichkeit, Spezifität, Genauigkeit und einen größeren Nachweisbereich als herkömmliche Bindungsassays oder kompetitive Dissoziationsassays.

3.1. Definitionen

Analyt: interessierendes Molekül im Assay.
Ligand: Molekül mit der Eigenschaft, mit einer wesentlich geringeren Affinität an einen für den Analyt spezifischen Rezeptor binden zu können, als der Analyt an den Rezeptor bindet.
Rezeptor: Molekül mit der Eigenschaft, spezifisch an den Analyten oder den Liganden zu binden. In jedem Fall wird ein stabiler Komplex ausgebildet, die Bindungskonstante des Rezeptors für den Analyten ist jedoch größer als die für den Liganden. Die Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes in seine Rezeptor- und Ligandenbestandteile in der Gegenwart von freiem Analyten führt zur Freisetzung des Rezeptors, der an freien Analyten bindet und dadurch einen stabilen Rezeptor- Analyt-Komplex ausbildet, der durch die Gegenwart von freiem Liganden im wesentlichen unbeeinflußt bleibt.

4. kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1: Freisetzung von anti-Cotinin Antikörpern in Gegenwart von Cotinin in einer Urinmatrixprobe. Anti-Cotinin war mit Peroxidase markiert und mit einem an eine feste Phase gebundenen Cotininliganden komplexiert. Freies Cotinin wurde zugegeben und freigesetztes anti-Cotinin nachgewiesen, indem die Enzymaktivität im Überstand nach 2 Minuten Inkubation gemessen wurde. Die Liganden waren unter Verwendung eines Aminocapronsäurelinkers (leere Rechtecke) oder p-Aminobenzoesäurelinkers (gefüllte Rechtecke) mit BGG konjugiertes Cotinin.
Fig. 2: Freisetzung eines anti-Cotinin-Antikörpers nach 10 Minuten Inkubation in einem Komplex mit immobilisiertem Liganden. Eine Probe einer synthetischen Urinmatrix war mit Cotinin versetzt worden. Die Liganden sind die gleichen wie in Fig. 1.
Fig. 3: Freisetzung eines anti-Cotinin Antikörpers nach 2 Minuten Inkubation in Proben von Urin und synthetischer Urinmatrices. Die Freisetzung von markiertem anti-Cotinin aus Cotinin-Aminocaproyl-BGG in Urin (gefüllte Rechtecke) und in synthetischem Urin (leere Rechtecke) und aus Cotinin-Benzoyl-BGG in Urin (Sterne) und in synthetischem Urin (gefüllte Dreiecke) wurde gemessen.
Fig. 4. Deaktivierung und Inhibierung eines Glucose-6-phosphatdehydrogenase- Hydroxycotinin-Konjugats. Gezeigt ist die normale Enzymaktivität (gefüllte Rechtecke), die Aktivität des Konjugats (leere Rechtecke) und die Aktivität des Konjugats in Gegenwart von Antikörpern (Sterne).
Fig. 5. Inhibierung und Freisetzung eines Hydroxycotinin-Glucose-6- phosphatdehydrogenase-Konjugats. Gezeigt ist die Enzymaktivität (A&sub3;&sub4;&sub0; gegen die Zeit) des Enzymkonjugats (gefüllte Rechtecke), des Enzymkonjugats mit einem Antikörper gegen Cotinin (gefüllte Dreiecke) und des Enzymkonjugats + Antikörper + freies Cotinin (leere Rechtecke).
Fig. 6. Automatisierter Freisetzungsassay für Cotinin. Die Freisetzung in Gegenwart von Cotinin wurde mit einem automatisierten Analyzer nach < 1 (Punkte), 18 (Kreuze), und 22 (Sterne) Stunden Inkubation des Komplexes gemessen.
Fig. 7. Wirksamkeit verschiedener Analoga von Cotinin mit niedriger Affinität, die mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase konjugiert sind. Konjugate von trans- Hydroxycotinin (stark konjugiert (Punkte), oder teilweise konjugiert (senkrechte Linien, Sterne)), cis-Hydroxycotinin (Kreuze) und Carboxycotinin (leere Rechtecke) mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase wurden als Freisetzungs-Liganden in einem Festphasenassay getestet.
Fig. 8. Struktur von (a) Nikotin, (b) Cotinin, (c) N-Isopropyl-4-carboxy-norcotinin und (d) N-Propyl-4-carboxy-norcotinin.
Fig. 9. Freisetzungsassay im ELISA Format. Mikrotiterplatten wurden mit cis- Hydroxycotinin G-6-PDH (Sterne); N-Isopropyl-norcotinin G-6-PHD (plus-Zeichen); N-Propylnorcotinin G-6-PHD (leere Rechtecke) beschichtet.
Fig. 10. Vergleich der Dosis-Wirkung-Beziehungskurven eines assoziativen homogenen Assays für Cotinin (NiMA®) mit dem Freisetzungsassay. Assoziativer NiMA-Assay (plus-Zeichen); Freisetzungsassay (leere Rechtecke).
Fig. 11. Standardkurve des Freisetzungsassays für Cotinin nach dem homogenen Verfahren.
Fig. 12. Benzoylecgonin-Freisetzungsassay unter Verwendung eines Mikrotiterplattenformats. Es wurden Matrixeffekte beobachtet, die vom flüssigen Medium abhingen, das entweder Wasser (gefüllte Rechtecke) oder Urin (Kreuze) war. BE steht für Benzoylecgonin.
Fig. 13. Auswirkung der Inkubationszeit auf den Benzoylecgonin-Freisetzungsassay unter Verwendung von Mikrotiterplatten. Der Überstand wurde 0 (gefüllte Rechtecke), 2 (leere Rechtecke) und 10 (Sterne) Minuten nach Zugabe von freiem Benzoylecgonin (BE) abgenommen und auf die Freisetzung von markiertem anti- Benzoylecgonin untersucht.
Fig. 14. Niedrig-Affinitätschromatographie von anti-beta hCG. Kaninchenserum gegen menschliches Choriogonadotropin (hCG) wurde auf eine Schafgonadotropin- Affinitätssäule gegeben und mit 13 ml PBS, 20 ml Puffer pH 4, und 10 ml Puffer pH 8 eluiert. Protein (schräge Schraffierung); anti-hCG (waagrechte Schraffierung); IgG (senkrechte Schraffierung).

5. detaillierte Beschreibung der Erfindung

Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe sowie dafür geeignete Kits zur Verfügung gestellt. Als Testprobe kann jede Körperflüssigkeit, wie Urin, Blut, Serum, Speichel, Körperexudate usw. verwendet werden, die im Verdacht steht, den Zielanalyten zu enthalten. Das Verfahren des erfindungsgemäßen Freisetzungsassays umfaßt, daß eine Testprobe mit einem Rezeptor-Ligand-Komplex in Kontakt gebracht wird und, sofern der Analyt vorhanden ist, den Nachweis der Dissoziation des Komplexes in seine Rezeptor- und seine Ligandenkomponente. Die Dissoziation des Komplexes in Anwesenheit des Analyten führt zur Freisetzung des Rezeptors und des Liganden.
Nach der Freisetzung bindet der Rezeptor an freien Analyten unter Ausbildung eines Rezeptor-Analyt-Komplexes, der in Gegenwart von freiem Liganden stabil bleibt. Es kann entweder dissoziierter Ligand oder Rezeptor nachgewiesen werden, um die Anwesenheit von Analyten in der Probe anzuzeigen. Das erfindungsgemäße Assayverfahren kann sowohl in homogenem als auch in heterogenem Format ausgeführt werden. Die genauen Details dieser Format sind unten in Abschnitt 5.2 angegeben.
Ein erfindungsgemäßer Freisetzungsassay erlaubt die Herstellung eines Komplexes, in dem Rezeptorbindungsstellen und Ligand mit annähernd gleicher Konzentration vorliegen, d. h. die Komplexbildung erfolgt quantitativ, obwohl dies nicht essentiell ist. Liegt jedes Element in gleicher Konzentration vor, erhöht dies die Empfindlichkeit, da in dem Fall, wenn der Rezeptor im Überschuß vorliegt, dieser Analyten binden kann, ohne das eine Freisetzung aus dem Rezeptor-Ligand-Komplex erfolgt.
Um einen Rezeptor-Ligand Komplex zu erhalten, in dem die Anzahl der Bindungsstellen jedes Elements in im wesentlichen äquimolaren Mengen vorhanden ist, werden Rezeptor und Ligand vor der Anwendung auf die Probe für zumindest 10 Sekunden inkubiert. Bevorzugt beträgt die Inkubationszeit mehr als ungefähr eine Stunde. Eine lange Inkubationszeit erlaubt die Ausbildung des stabilsten Komplexes während wiederholte Freisetzungs- und Bindungsreaktionen, wenn ein Element, entweder der Rezeptor oder der Ligand, im Überschuß vorliegt. Nachdem die Bindungsreaktion mit niedriger Affinität ein Gleichgewicht erreicht hat, wird der Rezeptor-Ligand-Komplex von den überschüssigen Elementen abgetrennt. Die Isolierung des Komplexes kann entweder durch Ausschlußchromatographie nach Größe, durch Dichtegradientenzentrifugation, Niedrig-Affinitätschromatographie oder andere Techniken zur Abtrennung von Komplexen von ihren Bestandteilen erfolgen. Als Alternative können zur Herstellung stabiler Komplexe Rezeptor und Ligand mit gleicher Konzentration an Bindungsstellen gemischt und zur Einstellung einer im wesentlichen quantitative Bindung inkubiert werden. Die Ausbildung des Reagenz- Ligand-Komplexes wird unten in Abschnitt 5.1. genauer diskutiert.
Der erfindungsgemäße Kit enthält bevorzugt einen vorgeformten Rezeptor-Ligand- Komplex, wodurch die Notwendigkeit der Herstellung des Reagenz vor der Durchführung des Assays vermieden wird. Der Umfang der Erfindung schließt jedoch auch die getrennte Bereitstellung sowohl des Rezeptors wie auch des Liganden und deren Vermischung vor dem Assay ein.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Prinzip, daß im Fall, daß die Assoziationskonstante für Rezeptor und Analyt größer ist als die Assoziationskonstante von Rezeptor und Ligand die Dissoziation eines Komplexes aus Rezeptor und Ligand in Gegenwart eines Analyten bevorzugt zu einer Assoziierung von Rezeptor und Analyt führt als zu einer Reassoziierung von Rezeptor und Ligand. Im weiteren wird die Dissoziation eines Rezeptor-Ligand- Komplexes, die Freisetzung des Rezeptors und des Liganden, und die Ausbildung eines stabilen Komplexes durch die Bindung des Rezeptors an den Analyten als Freisetzungsreaktion bezeichnet. Folglich beeinflußt der freie Komplex bei einer Freisetzungsreaktion nicht die Stabilität des Rezeptor-Analyt-Komplexes, so daß der Rezeptor nicht an freie Liganden bindet, d. h. die Freisetzungsreaktion ist nicht reversibel. In ähnlicher Weise wird ein stabiler Komplex aus Rezeptor und Ligand nicht dissoziieren und Rezeptor freisetzen, der an einen zweiten kreuzreaktiven Liganden niedriger Affinität bindet, da keine kinetische oder thermodynamische Lücke besteht. Sogar die Dissoziationskonstante eines Rezeptor-Ligand-Komplexes mit niedriger Affinität ist vergleichsweise niedrig und die Bindung an einen anderen Liganden mit einer vergleichbaren Affinitätskonstante führt nicht zu einer Änderung der freien Energie. Dies führt zu einem empfindlichen, hochspezifischen und sehr genauen (minimal kreuzreaktiven) Assay.
Bindet der Analyt jedoch an den Rezeptor mit hoher Affinität und ist die Assoziationskonstante hoch, erfolgt eine Dissoziation des Rezeptors aus dem Rezeptor-Ligand-Komplex und die Bindung des Analyten ohne Schwierigkeit. Die hohe Bindungsrate führt zu einer raschen Aufnahme des dissoziierten Rezeptors. Die Freisetzungsreaktion ist thermodynamisch bevorzugt, da eine größere Affinitätskonstante netto eine negative Änderung der freien Energie ergibt. Die Thermodynamik und die Kinetik treiben eine Freisetzungsreaktion in Gegenwart eines Analyten an und führen zu keiner Veränderung in Abwesenheit des Analyten.
Vorzugsweise beträgt die Affinitätskonstante der Bindung des Rezeptors an den Liganden ungefähr 10%, und insbesondere bevorzugt ungefähr 1%, der Affinitätskonstante der Bindung des Rezeptors zum Analyten. Dies kann qualitativ als relative Bindung gemessen werden, z. B. durch die beobachtete Aktivität in einem Assay.
Da die Thermodynamik und die Kinetik der Freisetzungsreaktion die Bindung des Rezeptors an den Analyten gegenüber der Bindung des Rezeptors an den Liganden bevorzugt, erscheint makroskopisch der Analyt die Freisetzungsreaktion zu induzieren, d. h. die Dissoziation des Komplexes aus Rezeptor und Ligand.
Da die Freisetzungsreaktion von einer Assoziierung von Rezeptor und Analyt mit hoher Affinität abhängt, ist diese empfindlich und spezifisch. Dies bedeutet, der Rezeptor bindet bereits niedrige Konzentrationen des Analyten. Die Abhängigkeit der Freisetzungsreaktion von der differentialen Affinitätsbindung steigert die Spezifität weiter. Der Rezeptor wird nicht dissoziieren und kreuzreaktive Analoge binden, falls die Assoziationskonstante nicht viel größer ist als die Assoziationskonstante von Rezeptor und Ligand.
Es ist wichtig hervorzuheben, daß ein erheblicher Anteil des Komplexes dissoziieren muß, da andernfalls das Hintergrundrauschen des Systems zu groß sein wird. Sind beispielsweise nur 1% des Rezeptor-Ligand-Komplexes dissoziiert, sind 99% des Systems nicht betroffen. Ist die Standardabweichung der Messung 1% (was gleich ist zu 99 ± 1%), was einen ausgezeichneten Variationskoeffizienten für ein Immunassaysystem darstellt, würde die Wirkung einer 1%-igen Freisetzung 1% ± 1% sein, was jede Messung entwerten würde. Indem der thermodynamische und kinetische Antrieb der Freisetzungsreaktion genutzt wird, kann der vorliegende Assay eine deutliche Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes ermöglichen, d. h. eine Freisetzung oberhalb des Niveaus der Grundlinie. Weiter stellt dieser Freisetzungsassay einen weiten Konzentrationsbereich zur Verfügung, innerhalb dessen Analyten nachgewiesen werden können.
Der Rezeptor-Ligand-Komplex muß für seine Wirksamkeit jedoch nicht vollständig dissoziiert sein. Wird beispielsweise eine Festphasenpräparation von Hydroxycotinin, das an ein Trägerprotein (z. B. Glucose-6-phospatdehydrogenase) gebunden ist, mit einer Probe umgesetzt, werden nur 5-10% des gesamten mit dem Enzym Meerrettichperoxidase markierten Antikörpers durch den Analyten verdrängt. Der exakte prozentuale Anteil ist nur schwer festzustellen, da bekannt ist, daß die Enzymaktivität in der festen Phase geringer ist als von Enzym in der flüssigen Phase. Dennoch ermöglicht der Grad der Freisetzung (mehr als 5%) ein deutliches Signal über dem Hintergrund. Bei einem homogenen Freisetzungs-Assay induziert die Cotinin enthaltende Probe eine 100%-ige Umkehrung der Enzymhemmung, was auf eine 100%-ige Freisetzung hindeutet.

5.1. Der Rezeptor-Ligand-Komplex

Ein wirksamer Freisetzungsassay erfordert im Gleichgewicht die Ausbildung eines stabilen Rezeptor-Ligand-Komplexes mit niedriger Affinität. Dieser Komplex bildet sich normalerweise langsamer als konventionelle Komplexe aus, z. B. Rezeptor- Analyt oder Antikörper-Antigenkomplexe usw. Während der anfänglichen Ausbildung des Rezeptor-Ligand-Komplexes erfolgt die Dissoziation leicht. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der Rezeptor-Ligand-Komplex jedoch stabil. Die Stabilität des Komplexes ist zum Teil eine Funktion des Designs des Liganden sowie der Inkubationszeit von Ligand und Rezeptor. Die geeignete Inkubationszeit kann für jede Kombination von Rezeptor und Ligand einfach bestimmt werden. Generell sollten jedoch Rezeptor und Ligand für mindestens 10 Sekunden, bevorzugt für zumindest 10 Minuten, und insbesondere bevorzugt für mehr als 1 Stunde vor der Zugabe des Analyten inkubiert werden. In Fällen, in denen der Rezeptor-Ligand- Komplex vor der Durchführung des Assays isoliert wird, sind die Bindungsstellen sowohl auf dem Rezeptor wie auch auf dem Liganden in im wesentlichen äquimolaren Mengen vorhanden und die Inkubationszeit ist nicht wichtig (siehe Abschnitt 5, oben). Bei geeigneten Bedingungen, z. B. in Gegenwart von Salzen, wie Natriumchlorid, oder Stabilisierungsagentien, wie Glucose, oder von beiden, kann der stabile Rezeptor-Ligand-Komplex über längere Zeit, Tage, Wochen oder länger, freisetzbar erhalten bleiben. Erfindungsgemäß kann ein stabiler Rezeptor-Ligand- Komplex gelöst sein oder er kann getrocknet sein. In einem unten angeführten Beispiel konnte der Freisetzungsassay sechs Tage nach der Bildung des Antikörper- Ligand-Komplexes in Gegenwart von 5% Natriumchlorid durchgeführt werden. Bei einem anderen unten aufgeführten Beispiel wurde ein getrockneter Antikörper- Ligand-Komplex durch die Gegenwart von Glucose stabilisiert.
Obwohl die vorliegende Erfindung nicht durch irgendeine Theorie oder Hypothese gebunden ist, wird angenommen, daß die Bildung eines stabilen Rezeptor-Ligand- Komplexes ein Modell einer molekularen räumlichen Beziehung zwischen dem Liganden und dem Rezeptor unterstützt. Das Gleichgewicht dieser Bindung begünstigt eine Konfiguration des Komplexes, die diesen stabilisiert, was heißt, daß die wirksame Affinität des Komplexes im reifen Komplex höher sein kann, oder sein muß, als anfänglich. Nur durch die Bildung eines stabilen Komplexes kann sichergestellt werden, daß die Dissoziation spezifisch erfolgt und von der weitaus höheren Affinität des Rezeptors zum Analyten angetrieben wird.
Sofern ein Assay des Freisetzungstypus nicht mit unterschiedlichen Bindungsaffinitäten ausgestattet ist, und vorzugsweise die Verwendung eines Stabilisierungsagens umfaßt, kann eine unerwünschte irreversible Bildung des Rezeptor-Ligand-Komplexes auftreten. Verbleibt zum Beispiel in einem konventionellen homogenen Immunoassay der Komplex zwischen Antikörper und dem mit einem Enzym markierten Liganden über Nacht in Lösung, denaturiert das Enzym teilweise. Offensichtlich tritt die molekulare räumliche Anordnung des Antikörper-Ligand-Komplexes allgemein in der Weise ein, daß das Enzym eher denaturiert wird als daß nur eine reversible Inhibierung eintritt.
Die vorliegende Erfindung überwindet diese Beschränkungen. Um auf dass Beispiel eines Enzymlabels zurückzukommen: Bei einem Freisetzungssystem, bei dem ein Komplex in Gegenwart einer hohen Salzkonzentration inkubiert wird, um die Ausbildung eines nicht mehr freisetzbaren Rezeptor-Ligand-Komplexes zu verhindern, indem der Ligand oder der Rezeptor mit einem Enzym markiert ist, bleibt die Enzymaktivität wie auch die Fähigkeit zur Dissoziation des Rezeptor-Ligand- Komplexes erhalten. Wird der Ligand mit einem Enzym markiert, hilft die Verwendung eines molekularen Linkers den Rezeptor so zu positionieren, daß die Bildung des Komplexes das Label, beispielsweise ein Enzym, für zumindest einige Tage nicht denaturiert.

5.1.1. Rezeptoren

Ein Element des Rezeptor-Ligand-Komplexes ist ein Rezeptor, der eine oder mehrere Bindungsstellen aufweist, die spezifisch an einen Analyten binden können, wobei die Assoziationskonstante der Bindung hoch ist. Der Rezeptor kann auch an einen Liganden mit einer Assoziationskonstanten für die Bindung binden, die im Vergleich zu der der Bindung des Rezeptors an den Analyten relativ niedrig ist. Für die Verwendung in einem Freisetzungsassay geeignete Rezeptoren umfassen Nukleinsäuremoleküle (RNS oder DNS), Antikörper (oder ein Fragment des Antikörpers, das die Analytenbindungsstelle für den Analyten und den Liganden umfaßt), Zelloberflächenrezeptoren (oder ein Fragment eines Zelloberflächenrezeptors, das die Bindungsstelle für den Analyten und den Liganden enthält), Enzyme (oder Substratbindungsstellen eines Enzyms), Lektine oder jedes andere Molekül oder Makromolekül, das spezifisch an einen Liganden binden kann und mit diesem einen stabilen Komplex mit niedriger Affinität ausbilden kann, sowie einen stabilen Komplex mit hoher Affinität mit einem Analyten. Antikörper und Zelloberflächenrezeptoren sind bevorzugt, wobei insbesondere die Antikörper bevorzugt sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Rezeptor so generiert oder ausgewählt, daß er spezifisch für das am meisten einzigartige Epitop auf dem Analyten ist.
Verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren können zur Herstellung der Antikörper gegen den interessierenden Analyten verwendet werden. Solche Antikörper umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sei, polyklonale, monoklonale, chimärische, einzelkettige, Fab-Fragmente und eine Fab Expressionsbibliothek. Für die Herstellung der Antikörper können verschiedene Wirtstiere wie, ohne auf diese beschränkt zu sein, Kaninchen, Mäuse, Ratten, etc., durch Injektion eines bestimmten Analyten oder eines an einen immunogenen Träger konjugierten Analyten immunisiert werden. Es können in Abhängigkeit von der Wirtsspezies verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verstärken, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Freunds (vollständiges und unvollständiges) Adjuvans, mineralische Gele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, kexhole limpet Hämocyanin, Dinitrophenol, und potentiell nützliche menschliche Adjuvantien, wie BCG (bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Monoklonale Antikörper gegen Analyten können unter Verwendung jeder Technik hergestellt werden, die für die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Ziellinien oder in vivo geeignet sind. Diese umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Köhler und Milstein beschrieben wurde (Nature, 1975, 256 : 495-497), die neuere humane B-Zellen Hybridomtechnik (Kosbor et af., Immunology Today, 4 : 72) und die EBV-Hybridom Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96). Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können für den Analyten spezifische monoklonale Antikörper unter Verwendung einer neueren Technologie (WO 90/13678; PCT/US90/02545) in keimfreien Tieren hergestellt werden. Erfindungsgemäß können humane Antikörper verwendet werden, die unter Verwendung von humanen Hybridomen erhalten werden können (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80 : 2026-2030) oder in vitro durch Transformation humaner B-Zellen mit dem EBV-Virus (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77-96). Praktisch können erfindungsgemäß auch Techniken verwendet werden, die für die Herstellung von "Antikörperchimären" entwickelt worden sind (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81 : 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312 : 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314 : 452-454) indem die Gene eines Mausantikörpermoleküls mit geeigneter Antikörperspezifität mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls mit geeigneter biologischer Aktivität verspleißt werden; solche Antikörper werden vom Umfang der Erfindung mit umfaßt.
Erfindungsgemäß können Techniken, die für die Herstellung von einkettigen Antikörpern beschrieben wurden (US-Patent 4,946,778) zur Erzeugung von gegen den Analyten spezifischen einkettigen Antikörpern herangezogen werden. Eine weiter Ausführungsform der Erfindung verwendet die für die Herstellung von Fab Expressionsbibliotheken beschriebenen Techniken (Huse et al., 1989, Science, 246 : 1275-1281), um die rasche und einfache Identifizierung von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der erwünschten Spezifität für Analyten zu ermöglichen.
Antikörperfragmente, die Stellen enthalten, die für Analyten spezifisch sind, können mit bekannten Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel umfassen solche Fragmente, ohne darauf beschränkt zu sein: die F(ab')&sub2;-Fragmente, die durch Verdauung des Antikörpermoleküls mit Pepsin hergestellt werden können und die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')&sub2;-Fragmente erzeugt werden können.
Als Alternative können polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch für den interessierenden Analyten sind, aus kommerziellen Quellen bezogen werden.
Der den Analyten bindende Rezeptor kann z. B. durch Affinitätschromatographie oder Niedrig-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Monoklonale Antikörper können auch durch Protein A oder anti-Ig-Chromatographie gereinigt werden. Techniken zur Reinigung polyklonaler und monoklonaler Antikörper sind aus dem Stand der Technik bekannt. Eine Präparation heterogener Rezeptoren, z. B. polyklonale Antikörper, können auch mit einer geringen Konzentration (z. B. 1% der Rezeptorkonzentration) an Ligand absorbiert werden, um jegliche Rezeptoren zu entfernen, die an den Liganden mit hoher Affinität binden können.

5.1.2. Ligand

Der Ausdruck "Ligand", wie er in diesem Zusammenhang verwendet wird, umfaßt Moleküle mit einer begrenzten Kreuzreaktivität zum Analyten um die Bindung an den Rezeptor. Der Ausdruck "Reland" wird hier austauschbar mit Ligand benutzt. Reland ist ein Begriff, der von den Miterfindern geprägt wurde, um auf eine Freisetzungs- Liganden hinzuweisen. Der Ligand oder Reland bindet im Vergleich zum Analyten den Rezeptor mit einer geringeren Assoziierungskonstante, z. B. vorzugsweise weniger als ungefähr 10%, insbesondere weniger als ungefähr 1%, und beeinflußt die Stabilität eines Analyt-Rezeptor-Komplexes nicht. Der Ligand umfaßt ein Analoges des Analyten, einschließlich eines Epitops des Analyten, eines Derivats des Analyten, eines modifizierten Analyten oder eines Isomeren des Analyten.
Vorzugsweise unterscheidet sich der Ligand vom Analyten am oder nahe am Bindungsepitop des Rezeptors. Diese Unterschiede können sterische, konfigurelle, konformelle oder ionische Änderungen umfassen. Bei einer anderen Ausführungsform, bei der der Rezeptor eine Nucleinsäure ist, ist der Ligand eine Nucleinsäure, die komplementär zum Rezeptor ist, unter der Voraussetzung, daß der Grad der Komplementarität nicht so hoch ist, wie die Komplementarität des Rezeptors und des Nucleinsäureanalyten.
Analoge des Analyten umfassen die analogen Moleküle aus verwandten Tierspezies, soweit diese vorhanden sind, z. B. ist das lutenisierende Hormon des Schafs ein Analoges zum humanen Choriogonadotropin (siehe unten, Abschnitt 16). Moleküle, die erzeugt wurden, um den Analyten strukturell zu imitieren, sind ebenfalls Analoge, die als Ligand verwendet werden können. Solche strukturellen Imitate können, müssen jedoch nicht, dieselbe chemische Natur aufweisen, wie der Analyt, solange das Epitop chemisch ähnlich ist. So kann beispielsweise ein Peptid ein Analoges für ein Protein sein. Ein geeignetes Analoges wird einfach in einem Rezeptorbindungsepitop oder einem Teil eines Epitops mit dem Analyten übereinstimmen.
Derivate des Analyten können hergestellt werden, indem funktionelle Gruppen zum Molekül hinzugefügt oder bei diesem weggenommen werden. Die Derivate können auch natürliche metabolische Produkte des Analyten sein. Der Fachmann weiß ohne weiteres, wie er die für die Erfindung verwendeten Derivate der Analyten herstellen oder identifizieren kann. Vorzugsweise ändern Veränderungen der Molekülstruktur des Analyten die Zusammensetzung oder die Konformation des Rezeptorbindungsepitops, um die Bindungsaffinität des Rezeptors zum Liganden zu erniedrigen.
Modifizierte Analyten umfassen den mit einem Trägerprotein konjugierten Analyten. Die Addition räumlich anspruchsvoller Gruppen oder ionischer Gruppen, wie aliphatische, aromatische oder zyklische Moleküle zum Analyten oder an das Protein können wegen sterischer und/oder Ladungswechselwirkungen zu einer erniedrigten Bindungsaffinität des Rezeptors führen. Als Alternative kann eine Konjugation mit einer räumlich anspruchsvollen Gruppe einen Änderung der Konformation an der Rezeptorbindungsstelle des Liganden bewirken, was die Bindungsaffinität erniedrigt. Chemische Modifikationen von organischen Molekülen sind aus dem Stand der Technik bekannt und können verwendet werden, um den Liganden zu modifizieren. Beispielsweise kann der Freisetzungs-Ligand ein Cotininderivat mit einer aliphatischen Kette mit drei oder mehr Kohlenstoffatomen an der N1-Position sein. Bei einem unten beschriebenen bestimmten Beispiel ist ein Analyt, Norcotinin, das durch die Anwesenheit von N-Isopropyl- oder N-Propylgruppen modifiziert ist, ein bevorzugter Ligand in einem Assay für Cotinin.
Isomere von Analyten sind Moleküle mit derselben Zusammensetzung aber verschiedener Konfiguration. Typischerweise besitzen Isomere eine unterschiedliche Konfiguration an einem bestimmten Kohlenstoffzentrum, z. B. cis und trans oder D und L. Isomere umfassen Diastereomere, die die gegenteilige Konfiguration an einem oder mehreren Chiralitätszentren aufweisen, und die Enantiomeren der Analyten. Da biologische Bindungswechselwirkungen von der Konfiguration wie auch von der Konformation und der Zusammensetzung abhängen, kann die Verwendung eines Isomeren als Ligand zu einer wesentlich niedrigeren Bindungsaffinität zum Rezeptor führen.
Ist der Analyt ein Protein, kann der Ligand durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, unter Verwendung von gezielter Mutagenese oder anderer Mutagenesetechniken, um die Aminosäuresequenz des Proteins zu ändern. Diese Techniken sind dem Fachmann geläufig (siehe z. B. Zoller und Smith, 1984, DNA 3 : 479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44 : 177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 : 710). Die Technik der Polymerasekettenreaktion (PCR) ist für die gezielte Mutagenese bevorzugt (siehe Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA," in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, Hrsg. Stockton Press, Kapitel 6, S. 61-70).
Der Ligand kann weiter ein Trägerprotein umfassen. Das Trägerprotein kann ein im wesentlichen inertes Protein sein, wie Albumin oder keyhole limpet Hämocyanin, das Trägerprotein sollte jedoch nicht derselbe Carrier sein, der, soweit vorhanden, zur Immunisierung bei der Herstellung des Antikörpers gegen den Analyten verwendet wurde. Ein Enzymlabel kann als Trägerprotein wirken.
Der Ligand kann auch eine Bindungsgruppe umfassen. Eine Bindungsgruppe kann den Liganden von einem Enzymlabel auf Abstand halten, wodurch die Deaktivierung des Enzyms nach einer langen Inkubation mit dem Rezeptor verhindert oder verlangsamt wird. Ein Beispiel für eine als Spacer wirkende Bindungsgruppe ist &epsi;- Aminocapronsäure. Es können auch räumlich anspruchsvolle Bindungsgruppen verwendet werden, um die Bindung des Liganden an den Rezeptor sterisch zu behindern. Ein Beispiel für eine räumlich anspruchsvolle Bindungsgruppe ist p-Aminobenzoesäure.
Die Liganden können auf ihre Eignung für eine Verwendung in einem Freisetzungsassay bewertet werden. Diese Evaluierungsassays für den Liganden umfassen kompetitive Assays, Bindungsverstärkungsassays, direkte Assays, Niedrig-Affinitätschromatographie und Freisetzungsassays auf Mikrotiterplatte, sowie den betrachteten Freisetzungsassay selbst.
Die für die Bewertung möglicher Liganden nützlichen kompetitiven Assays können nach einem ELISA-Format durchgeführt werden, obwohl jede Technik eines kompetitiven Assays verwendet werden kann. Wie unten in Beispiel 16 gezeigt, ist die Wirksamkeit eines Liganden bei der Hemmung der Bindung des Rezeptors an den an der Festphase gebundenen Analyten weit geringer als die des Analyten. Ein Molekül, das im Vergleich zum Analyten ein schlechter kompetitiver Hemmer ist, kann eine gute Wahl für die Verwendung als Ligand darstellen.
Eine niedrige Konzentration eines geeigneten Freisetzungs-Liganden kann tatsächlich bewirken, daß in einem kompetitiven Assay die Bindung des Rezeptors an den Analyten verstärkt wird. Bei einem kompetitiven Assay mit polyklonalen Antikörpern kann daher ein verstärktes absolutes Signal in Gegenwart eines zu testenden Moleküls darauf hinweisen, daß dieses Molekül ein geeigneter Freisetzungs-Ligand ist.
Wird ein direkter Assay für die Bewertung eines potentiellen Liganden herangezogen, wird die Bindung zwischen Rezeptor und Ligand mit der Bindung zwischen Rezeptor und Analyt verglichen. Für diesen Assaytyp ist das ELISA-Format sehr gut geeignet, aber andere Assayformate können ebenso verwendet werden. Ein Ligand sollte nicht mehr als ungefähr 10%, vorzugsweise weniger als ungefähr 1%, der Bindungsaktivität des Analyten zeigen. Typischerweise wird die Bindungsaktivität in einem ELISA durch einen Titer angegeben, d. h. die Verdünnung oder Konzentration des Rezeptors mit einer bestimmten Bindungsaktivität. Als Alternative kann auch die spezifische Aktivität bei gleicher Rezeptorkonzentration verglichen werden.
Wird ein für den Analyten spezifischer Rezeptor bei milden Bedingungen aus einer mit dem Ligand versehenen Affinitätschromatographiesäule eluiert, kann dieser Ligand für eine Freisetzungsassay geeignet sein.
Bei der Mikrotiterplattenmethode wird die Platte mit dem Liganden oder dem Rezeptor beschichtet. Wird die Mikrotiterplatte mit dem Liganden beschichtet, umfaßt der Ligand vorzugsweise ein Protein, um die Bindung an die Platte zu verstärken. Der komplementäre Bindungspartner (Rezeptor bzw. Ligand) wird zugegeben und es kann sich ein Komplex ausbilden. Ist das aus Rezeptor und Ligand gebildete Paar geeignet, kann die Freisetzung des Rezeptors oder des Liganden im Überstand der Probe nachgewiesen werden, wenn eine den Analyten enthaltende Probe zugegeben wird. Wie unten in Beispiel 11 gezeigt wird, kann ein Konjugat aus Ligand und Enzym, das für die Verwendung in einem homogenen Assay entworfen worden ist, in einem Mikrotiterplatten-Assay getestet werden.

5.2 Aufmachung des Freisetzungsassays

Der einen Rezeptor, einen Liganden und Mittel zum Nachweis des freigesetzten, d. h. dissoziierten Rezeptor-Ligand-Komplexes umfassende Freisetzungsassay ist besonders zur Analyse einer Probe auf die Anwesenheit eines kleinen Moleküls, wie eines Arzneimittelmetaboliten, geeignet. Der Nachweis der Anwesenheit eines Arzneimittels oder eines Arzneimittelmetaboliten in einer Probe von Körperflüssigkeiten eines Patienten ist bei vielen Anwendungen wichtig. Die Anwesenheit von Arzneimitteln oder Arzneimittelmetaboliten ist für die Bestimmung der geeigneten medizinischen Behandlung wichtig, insbesondere unter Notfallbedingungen. Der Nachweis von Arzneimitteln oder Arzneimittelmetaboliten in Personen ist wichtig für die Strafverfolgung, für Anstellungsverhältnisse, in Schulen und im Sport. Die Proben können aus jeder Quelle gewonnen sein, sie stammen jedoch vorzugsweise von Tieren und insbesondere vom Menschen. Die Proben können Körperflüssigkeiten sein, wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Körperexudate usw., ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Analyt kann jedes Antigen sein, besonders interessant sind jedoch kleine Analyten (Molekulargewichte von 100 bis 1000 Dalton). Solche Analyten umfassen therapeutische Arzneimittel und deren Metabolite, illegale Drogen und deren Metabolite, Steroide und Peptidhormone. Es können jedoch auch Freisetzungsassays für größere Moleküle, wie Proteinhormone, z. B. Insulin, virale Antigene, bakterielle Antigene, Serumproteine, Antikörper oder jedes interessierende Antigen betrachtet werden, bei denen der Nachweis der Anwesenheit (oder der Abwesenheit) eines Analyten in einem schnellen, spezifischen und empfindlichen Assay erwünscht ist.
Weiter unten werden in spezifischen Beispielen Freisetzungsassays für Cotinin (ein Nikotinmetabolit, der mit Rauchen assoziiert ist), Benzoylecgonin (ein Kokainmetabolit), Tetrahydrocannabinol (der Betäubungswirkstoff von Marihuana), Thiazide (eine Klasse von Diuretika) und für Betablocker beschrieben. Es ist des weiteren offensichtlich, daß Freisetzungsassays für den Nachweis jedes interessierenden Analyten geeignet ist.
Zum Beispiel kann ein Freisetzungsassay für HIV-Antikörper hergestellt werden. Die Aufmachung für einen Freisetzungsassay für HIV ist wie folgt:
1. Erzeugung von Antikörpern gegen ein HIV-Peptid, die in der Weise modifiziert sind, daß sie zu Freisetzungs-Liganden werden, z. B. durch Substitution von Aminosäuren. Dieser Antikörper entspricht einem Liganden, der für die Zwecke des Assays geeignet ist, da er im Vergleich zum interessierenden Analyten (dem anti-HIV Antikörper) verändert ist.
2. Konjugieren der nativen HIV-Peptidsequenz mit einem Protein, wie Albumin, und Aufbringen des Konjugats auf Plastikperlen oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte. Das Konjugat aus Peptid und Protein wirkt für die Zwecke dieses Assays als Rezeptor für den Analyten.
3. Vermengen des Rezeptors (Konjugats) und des Liganden (Antikörper), so daß ein Komplex ausgebildet wird. Der Ligand sollte mit einem Marker versehen sein, z. B. einem Fluoreszenzmarker. Nach der Komplexbildung wird die Platte gewaschen.
4. Zugabe der den Analyten (anti-HIV Antikörper) enthaltenden Probe zur festen Phase. Die anti-HIV Antikörper ersetzen den markierten Antikörper. Die Menge des freigesetzten Labels wird gemessen.
Vorzugsweise ist der als Ligand wirkende Antikörper in einem HIV-Assay ein monoklonaler Antikörper.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht den positiven Nachweis der Dissoziation eines Rezeptor-Ligand-Komplexes, der eine Freisetzung der markierten Komponente bewirkt. Ein positiver Nachweis bedeutet, daß das Signal mit der Menge des Analyten in der Probe positiv korreliert. Eine positive Korrelation ist vorteilhaft, da es in psychologischer Hinsicht besser ist, daß die Gegenwart eines Signals oder die Verstärkung eines Signals die Anwesenheit eines Analyten in der Probe anzeigt. Ergebnisse, die mit einem Assay erhalten werden, bei denen die Signalstärke in Anwesenheit eines Analyten abnimmt, führen leicht zu Fehlinterpretationen. Es ist daher erwünscht, einen Assay, wie bei der vorliegenden Erfindung der Fall, zu verwenden, bei dem nur ein positives Ergebnis ein Signal erzeugt. Die erfindungsgemäßen Assays sind gleichermaßen geeignet für die Verwendung in einem Labor durch technisches Personal, wie auch außerhalb des Labors durch sowohl technisches wie auch nicht-technisches Personal.
Die Erfindung ermöglicht daher den Nachweis der Freisetzung einer Komponente aus einem Rezeptor-Ligand-Komplex. Bei einem heterogenen Freisetzungsassay (Abschnitt 5.2.2., unten) muß entweder der Rezeptor oder der Ligand markiert sein, so daß nach der Freisetzung in Gegenwart des Analyten das markierte Signal von den Reaktionsprodukten getrennt und nachgewiesen wird. Bei einem homogenen Freisetzungsassay (Abschnitt 5.2.1, unten) ist es vorteilhaft, wenn der Ligand markiert ist, unter bestimmten Bedingungen, wenn ein nichtenzymatisches Label verwendet wird, kann jedoch auch der Rezeptor markiert werden. Wird beispielsweise ein Fluoreszenzlabel verwendet, kann der Ligand einen Fluoreszenzlöscher enthalten. Im Rezeptor-Ligand-Komplex wird das Fluoreszenzsignal gelöscht und es erfolgt kein Nachweis von Fluoreszenz, bis die Dissoziation in Gegenwart eines Analyten erfolgt. Geeignete Label umfassen Enzyme, Fluorophore, Chromophore, Latexpartikel, kolloides Gold, Färbereagetien und chemilumenisizierende Agentien.
Die Mittel zum Nachweis einer Dissoziierung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes hängen zum Teil davon ab, ob der Assay homogen oder heterogen ist, wie dies unten in den Abschnitten 5.2.1. und 5.2.2. beschrieben wird.
Sobald der geeignete Bindungsrezeptor, der Freisetzungs-Ligand und die Mittel zum Nachweis eines bestimmten Analyten ausgewählt sind, muß das Assaysystem für die Verwendung mit einer bestimmten Probenmatrix optimiert werden. Eine Urinprobe weist andere intrinsische Eigenschaften auf als eine Probe in einem wäßrigen Puffer. Dasselbe trifft für Proben aus Speichel, Blut, Plasma oder Serum oder jegliche Körperflüssigkeit zu. Der Assay kann optimiert werden, indem die Konzentration des Reagenz, die Zusammensetzung des Puffers, die Zeit für die Freisetzung, die Zeit für den Nachweis, die Kontrolle der Nullinie und andere Variablen variiert werden. Diese Variablen sind dem Fachmann bekannt und es ist ihm ohne weiteres möglich, diese so einzustellen, daß eine optimale Spezifität und Empfindlichkeit des Assays bei einer bestimmten Assaymatrix erreicht wird.

5.2.1. homogene Freisetzungsassays

Der Freisetzungsassay kann homogen in flüssiger Phase durchgeführt werden. Ein solcher Assay ist bevorzugt, da er in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden kann und daher für die Verwendung in automatischen Analysegeräten geeignet ist.
Bei einer Ausführungsform kann der Ligand mit einem Enzymlabel konjugiert sein, das einen nachweisbaren Grad der Enzymaktivität behalten hat. Ein Ligand-Enzym- Konjugat wird unter der Voraussetzung ausgewählt, daß bei Ausbildung einer Bindung zwischen Rezeptor und Ligand die Enzymaktivität abnimmt. Um die Empfindlichkeit zu verstärken, ist vorzugsweise eine Rezeptorbindungstelle auf dem Enzym vorhanden, es können jedoch auch mehrere vorhanden sein.
Wird der Analyt zum Rezeptor-Ligand-Komplex gegeben, dissoziiert der Komplex in seine Rezeptor- und Ligandkomponente und der freigesetzte Rezeptor bindet den Analyten. Nach Freisetzung des Ligand-Enzymkonjugats steigt die katalytische Enzymaktivität. Dieser Anstieg wird nachgewiesen, indem die Rate der Produktbildung gemessen wird. Es kann jedes Enzym-Substrat System verwendet werden, mit der Bedingung, daß kein in der Probe vorhandenes endogenes Enzym die Rate der Produktbildung künstlich erhöht. Vorzugsweise ist das Enzym Glucose-6-phsphatdehydrogenase und das Reaktionsprodukt ist reduziertes Nicotinadenindinucleotid (NADH), dessen Absorption bei 340 nm gemessen werden kann.
Als Alternative kann ein Rezeptor-Ligand Komplex in einem homogenen Freisetzungsassay ein Fluoreszenzlabel oder ein Chemilumeneszenzlabel umfassen, das mit dem Liganden verbunden ist sowie einen Fluoreszenzlöscher, der mit dem Rezeptor verbunden ist. Der Rezeptor kann selbst die Fluoreszenz löschen. Im Komplex wird die Fluoreszenz oder die Lumineszenz gelöscht und es wird kein Signal beobachtet. Nach der Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes und der Freisetzung des Rezeptors und des Liganden in Gegenwart des Analyten verschwindet die Löschung und es kann ein Signal beobachtet werden. Andere vom Abstand abhängige Signalabschwächer, wie zum Beispiel Fluoreszenzpolarisation, sind dem Fachmann bekannt und können für eine Verwendung in einem Freisetzungsassay angepaßt werden. Es wird ferner darauf hingewiesen, daß das Label auch am Rezeptor und der Löscher am Liganden vorgesehen sein kann.

5.2.2. Heterogene Freisetzungsassays

In einer anderen Ausführungsform wird ein heterogener Festphasen-/ Flüssigphasen-Freisetzungsassay zur Verfügung gestellt. Bei einem derartigen Assay ist entweder der Rezeptor oder der Ligand irreversibel auf einem Festphasenträger absorbiert. Unter dem Ausdruck "irreversibel absorbiert", wie er hier verwendet wird, werden kovalente, nicht-kovalente und ionische Bindungen verstanden. Die Festphasenträger umfassen Plastik, Polymerperlen, Glasperlen, Glas, Silikagel und Membranen. In den unten aufgeführten Beispielen sind die Festphasenträger Vertiefungen in Mikrotiterplatten aus Plastik sowie Nitrocellulosemembranen. Der Freisetzungsassay ist jedoch nicht auf eine bestimmte Auswahl des Festphasenträgers beschränkt und es kann jeder aus dem Stand der Technik bekannte Festphasenträger verwendet werden.
Der Bindungspartner des Rezeptors oder der auf dem Festphasenträger absorbierte Ligand, d. h. der Ligand bzw. der Rezeptor, sind markiert und ein stabiler Komplex, der das markierte Element und das Element der Festphase umfaßt, wird ausgebildet. Ist ein stabiler Rezeptor-Ligand-Komplex ausgebildet, kann dieser auf die Probe angewandt werden. Ist der interessierende Analyt in der Probe vorhanden, erfolgt eine Freisetzungsreaktion und das Signal des Labels kann in der flüssigen Phase nachgewiesen werden. Das Ausmaß der Freisetzung, und damit die Signalintensität in der flüssigen Phase, korreliert positiv mit der Menge des Analyten in der Probe. Die Signalintensität in der festen Phase nimmt invers zur Menge des Analyten in der Probe ab (siehe Tabelle 6).
Es können vielerlei Labels für den heterogenen Freisetzungsassay verwendet werden. Enzymlabels sind vorteilhaft, auch für einen in einem einzelnen Reaktionsgefäß durchgeführten Assay, da die an der festen Phase gebundenen Enzyme eine 10- bis 20-fach niedrigere katalytische Aktivität aufweisen können als dieselben Enzyme in Lösung. Weiter kann wie bei der homogenen Freisetzung die Bindung des Rezeptors an ein Ligand-Enzymkonjugat die Enzymaktivität weiter reduzieren. Andere Labels, wie Chromophore, Fluorophore, chemiluminezierende Agentien, Radioisotopen, chelatbildende Komplexe, Färbemittel, kolloides Gold und Latexpartikel können nach der Freisetzungsreaktion in der flüssigen Phase als gesteigerte optische Dichte, Fluoreszenz, Lumineszenz, Radioaktivität, Farbe (bei Färbemitteln), und Trübung (bei kolloidalem Gold und Latexpartikeln) nachgewiesen werden. In den Fällen, in denen das Signal des im Rezeptor-Ligand-Komplex gebunden verbleibenden Labels nicht nachgewiesen werden kann, kann der Assay auch in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden.
Bei einer bestimmten Ausführungsform, die für Anwendungen außerhalb des Labors bevorzugt ist, wird die Anwesenheit des Analyten durch das Auftreten eines Umrisses, z. B. eines Buchstabens, in einem Reaktionsfeld des Festphasenträgers angezeigt. Folglich wird ein Reaktionsfeld, das einen Indikatorbereich und einen Kontrollbereich umfaßt, auf dem Festphasenträger bereitgestellt. Der Indikatorbereich umfaßt entweder immobilisierten Rezeptor oder Ligand, wie bei der heterogenen Ausführungsform des Assays zur Verfügung steht. Ein Rezeptor- Ligand-Komplex im Indikatorbereich ist für die Freisetzungsreaktion empfindlich. Der Kontrollbereich besteht aus einem anderen Rezeptor-Ligand-Komplex. Der Rezeptor-Ligand-Komplex im Kontrollbereich ist keiner bestimmten Freisetzungsreaktion zugänglich, er zeigt jedoch nichtspezifische Freisetzung an, wenn die Bedingungen so gewählt sind, daß eine nichtspezifische Freisetzung bewirkt wird.
Bei der praktischen Ausführung wird in dem Fall, wenn die Probe, die den interessierenden Analyt enthält, mit dem Reaktionsfeld in Berührung gebracht wird, eine nachweisbare Freisetzungsreaktion im Indikatorbereich und keine Reaktion im Kontrollbereich bewirkt. Die Freisetzungsreaktion wird durch die Ausbildung einer Kontrastzone nachgewiesen, die dem Indikatorbereich entspricht. Um dies zu erreichen, werden die Label sowohl für den freisetzbaren Komplex, wie auch für den Kontrollkomplex so gewählt, daß sie mit dem Festphasenträger kontrastieren.
Sofern keine Entwicklung eines kontrastierenden Bereichs beobachtet wird, ist die Probe negativ. Erscheinen sowohl der Indikatorbereich wie auch der Kontrollbereich "blaß", d. h. es werden Label aus beiden Komplexen freigesetzt, weist dies auf eine fehlerhafte positive Reaktion, ungeeignete Reaktionsbedingungen und eine mögliche Verfälschung der Probe hin. Auf diese Weise ermöglicht der Kontrollbereich eine Kontrolle auf akkurate Ergebnisse des Assays.
In Abhängigkeit von dem interessierenden Analyten werden bevorzugt unterschiedliche Buchstaben oder Symbole als Indikator benutzt. Beispielsweise kann ein Indikatorbereich, der spezifisch für Kokaingebrauch ist, wie der Buchstabe "C" geformt sein; ein Indikatorbereich für Marihuanagebrauch kann wie der Buchstabe "M" ausgeformt sein (oder "T" für Tetrahydrocannabinol), und ein Bereich, der Nikotin anzeigt, kann wie der Buchstabe "N" ausgeformt sein.
Die Kontrollzone umfaßt einen Komplex aus immobilisiertem Kontrollrezeptor oder Ligand und einem markierten Liganden oder Rezeptor und entspricht dem zum Indikatorbereich mit dem Unterschied, daß der Kontrollkomplex gegenüber der Anwesenheit des Analyten unempfindlich ist, während der Komplex im Indikatorbereich in Gegenwart des Analyten freigesetzt wird. Ist beispielsweise der interessierende Analyt Cotinin, ist der immobilisierte Ligand Cotinin, das an Rindergammaglobulin über einen Aminocapronsäurelinker gebunden ist, und der Rezeptor ist anti-Carboxycotinin, das mit blauem Latex markiert ist, ein geeigneter Kontrollligand ist immobilisiertes Trinitrophenol (TNP), das mit Rinderserumalbumin konjugiert ist, und ein geeigneter Kontrollrezeptor ist ein anti-TNP Antikörper, der ebenfalls mit blauem Latex markiert ist. In Gegenwart von Cotinin würde das markierte anti-Carboxycotinin freigesetzt und eine kontrastierende Zone ausgebildet werden. Der TNP-anti-TNP Komplex verbleibt vom Cotinin unbeeinflußt.
Es versteht sich von selbst, daß andere Kombinationen von Rezeptor und Ligand ebenso gut als Kontrollkomplexe wirken. Zum Beispiel kann bei einem Assay zum Nachweis von Cotinin immobilisiertes Ecgonin-anti-Benzoylecgonin als Kontrollkomplex dienen. Es wird weiter darauf hingewiesen, daß auf einem einzelnen Festphasenträger mehr als ein Nachweisfeld vorgesehen sein kann, da jedes Nachweisfeld für einen bestimmten Analyten spezifisch ist und für jeden anderen Analyten unempfindlich ist. Die Erfindung stellt daher einen Assay für mehrere Analyten, z. B. Tetrahydrocannabinol, Benzoylecgonin und Cotinin, in einer einzigen Vorrichtung zur Verfügung.
Geeignete Labels, die für diesen Assay verwendet werden können, ohne auf diese beschränkt zu sein, sind farbige Latexpartikel, Färbemittel, kolloides Gold sowie Enzyme, die im Fall, daß ein weißer oder schwach gefärbter Festphasenträger verwendet wird, die Herstellung von unlöslichen, farbigen Reaktionsprodukten katalysieren, und von weißem Latex, wenn ein dunkler Festphasenträger verwendet wird. Bevorzugt werden farbige Latexpartikel als Labels verwendet. Es kann auch jeder Festphasenträger für diese Ausführungsform verwendet werden, jedoch sind Plastik und Membranen bevorzugt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform, wie einer solchen, die unten in Abschnitt 15 beschrieben ist, umfaßt der Festphasenträger einen Rezeptor-Ligand-Komplex und einen Kontrollkomplex in getrockneter Form.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert, die nur beispielhaft für die Erfindung sein sollen und die Erfindung nicht beschränken sollen. Dem Fachmann ist es ohne weiteres möglich, ausgehend von der Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen verschiedene zusätzliche Modifikationen zu den hier gezeigten und beschriebenen zu finden. Derartige Modifikationen werden vom Umfang der Ansprüche mit umfaßt.

6. Beispiel: Festphasen-Freisetzungsassay für Cotinin

Cotinin und trans-3-'Hydroxycotinin sind die Hauptmetaboliten des Nikotins (Langone et al., 1973, Biochem. 12 : 5025 - 30; Jacob et al., 1991, JJ Chromatography 222 : 61 - 70; Neurath et al., 1987, Inf. Arch. Occup. Environ. Health 59 : 199-201). Sie erscheinen im Urin in einem Verhältnis von 1 : 3 (Neurath et al., siehe oben). Der Nachweis von Cotinin in Urin, Serum oder Speichel ist die am weitesten verbreitete biochemische Methode zum Nachweis des Grades, mit dem eine Person Nicotin ausgesetzt war (Fitzpatrick, 1991, C. N. N. 11). Anders als andere Drogen, die mißbraucht werden, wird wegen des Passivrauchens Cotinin in Körperflüssigkeiten von Nichtbenutzern gefunden. Der für einen Cotininassay interessierende Bereich erstreckt sich von 0,010 ug/ml, der für einen Nachweis in Speichel und Blut gefordert wird, bis zu < 10 ug/ml bei Urin von Tabaknutzern (Greenberg et al., 1984, N. Engl. J. Med. 310 : 1075 - 78; Matsukura et al., 1984, N. Engl. JJ Med. 311 : 828 - 31; Sepkovic et al., 1985, Am. J. Public Health 75 : 663 - 6; Sepkovic et al., 1986, J. A. M. A. 256 : 863; Jarvis et al., 1987, Am. JJ Public Health 77 : 1435 - 8; Schepers und Walk, 1988, Arch. Toxicol. 62 : 395 - 7; Langone et al., 1988, J. I. M. 114 : 73 - 8).
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von drei unterschiedlichen Cotininliganden in einem heterogenen Festphasen-Freisetzungsassay. Ein Ligand umfaßt einen Cotininmetaboliten, der direkt an ein inertes Trägerprotein gebunden ist (Hydroxy-Cotinin-BGG), ein weiterer Ligand umfaßt den Cotininmetaboliten, der mit dem Protein über einen räumlich anspruchsvollen Linker konjugiert ist (Hydroxycotinin-Aminobenzyl-BGG) und ein dritter Ligand umfaßt den Cotininmetaboliten, der mit dem Protein über einen Spacer verbunden ist (Hydroxycotinin-Aminocaproyl-BGG).

6.1 Materialien und Verfahren

Trans-3'-Hydroxycotinin wurde nach einem veröffentlichten Verfahren erhalten (Jacob et al., 1990, J. Med. Chem. 33 : 1888). Bernsteinsäureanhydrid und Dimethylformamid (DMF) wurden von Aldrich Chemical Co. bezogen. Pyridin, N-Hydroxysuccinimid, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), p-Aminobenzoesäure (PABA), &epsi;-Aminocapronsäure (ACA) und Rindergammaglobulin (BGG) wurden von Sigma bezogen.

6.1.1. Herstellung des Hydroxycotinin-BGG Liganden

Schritt 1: Hydroxycotinin-hemisuccinat wurde wie folgt hergestellt. In einem Reagenzglas wurden 19 mg trans-3'-Hydroxycotinin in 1 ml DMF gelöst. In dieser Lösung wurden 21 mg Bernsteinsäureanhydrid aufgelöst. Nach Zugabe von 20 ul Pyridin, wurde das Reagenzglas verschlossen (PARAFILM®) und über Nacht bei 37ºC inkubiert.
Schritt B: Nach Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) wurden 14 mg N-Hydroxysuccinimid und 23 mg EDC in der Cotininlösung gelöst. Die Lösung wurde verschlossen (Parafilm) und zur Aktivierung des Cotinin-hemisuccinats bei Raumtemperatur für 3 Stunden inkubiert.
Schritt C: Das aktivierte Cotinin-hemisuccinat (400 ul der Lösung aus Schritt B) wurden zu der Lösung von 6 mg BGG, gelöst in 1 ml PBS, gegeben. Die Mischung wurde vorsichtig vermischt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschließend über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das erhaltene Konjugat wurde für 48 Stunden sechsmal gegen PBS dialysiert.

6.1.2. Herstellung des Hydroxycotinin-aminobenzyl-BGG Liganden

Schritt D: 6 mg PABA wurden in 0,6 ml PBS gelöst. Zu dieser Lösung wurden 400 ul aktiviertes Cotinin-hemisuccinat gegeben, das wie oben in Schritt B hergestellt worden war. Die so erhaltene Lösung wurde innig vermischt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur und bei 4ºC über Nacht inkubiert.
Schritt E: Das Hydroxycotinin-hemisuccinat-PABA wurde auf Raumtemperatur erwärmt und durch Zugabe von 0,5 ml einer Lösung von 14 mg/ml N-Hydroxysuccinimid in DMF und 0,5 ml einer Lösung von 24 mg/ml EDC in Dimethylformamid aktiviert. Die Mischung wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden 400 ul aktiviertes Cotinin-PABA zu 6 mg BGG in 2 ml PBS gegeben. Die so erhaltene Lösung wurde vorsichtig vermischt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur und bei 4ºC über Nacht inkubiert. Das so erhaltene Konjugat wurde für 48 Stunden 6 mal gegen PBS dialysiert.

6.1.3. Herstellung des Hydroxycotinin-Aminocaproyl-BGG Liganden

Schritt F: Zu einer Lösung von 4 mg ACA in 0,6 ml PBS wurden 400 ul der oben in Schritt B hergestellten Lösung des aktivierten Cotininsuccinats gegeben. Die so erhaltene Lösung wurde innig vermischt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4ºC inkubiert.
Schritt G: Die Hydroxycotininhemisuccinat-ACA-Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und durch Zugabe einer Lösung von 0,5 ml von 14 mg/ml N-Hydroxysuccinimid in DMF und 0,5 ml einer Lösung von 24 mg/ml EDC in DMF aktiviert. Die so erhaltene Mischung wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Zu 6 mg BGG in 2 ml PBS wurden 400 ul aktiviertes Cotinin-ACA gegeben. Die so erhaltene Lösung wurde vorsichtig vermischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschließend bei 4ºC über Nacht inkubiert. Das so erhaltene Konjugat wurde für 48 Stunden sechsmal gegen PBS dialysiert.

6.1.4. Antiserum-Bindungsreagenz

Antiserum gegen Carboxycotinin wurde wie folgt erhalten: 320 mg keyhole limpet Hämocyanin (KLH) Protein (Sigma) wurden in 40 ml entionisiertem Wasser gelöst. Es wurden 300 mg trans-4'-caboxycotinin (Aldrich) unter Rühren bis zur vollständigen Auflösung zugegeben. Anschließend wurden unter Rühren 300 mg EDC zur Reaktionsmischung gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur weiter gerührt. das KLH-Carboxycotininkonjugat wurde für 8 Stunden bei 2-8ºC gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert. Die Dialyseflüssigkeit wurde einmal nach 4 Stunden gewechselt.
Mit dem Immunogen in Freunds Adjuvans wurden Kaninchen immunisiert, wobei nach Standardprotokoll innerhalb mehrerer Monate mehrfach injiziert wurde. Es wurden in bestimmten Intervallen Blutproben entnommen und der Anstieg des Antikörpertiters unter Verwendung eines Enzym-Immunoassays für Cotinin gemessen. Messungen der Antikörperaffinität und der Kreuzreaktivität wurden ebenfalls durchgeführt. Nachdem die Assays zufriedenstellende Eigenschaften der Antikörper anzeigten, wurden die Kaninchen ausgeblutet, die Seren isoliert und vereinigt. Das Antiserum wurde bei -40ºC aufbewahrt.
Die IgG-Fraktion wurde durch Ammoniumsulfatpräzipitation vom Serum abgetrennt. Es wurde eine Immunoaffinitäts-Chromatographiesäule hergestellt, indem succinyliertes Hydroxycotinin über seine Carboxygruppe an Amino-Sepharose® 4B gekuppelt wurde (siehe unten, Abschnitt 9). Der affinitätsgereinigte Antikörper wurde unter Verwendung des Natrium-m-periodatverfahrens mit Meerrettich-Peroxidase markiert.
Es wurde davon ausgegangen, daß die gegen 4'-Carboxycotinin, das in der 4'- Position an ein Trägerprotein gekuppelt war, hergestellten Antiseren mit niedrigerer Affinität an Cotinin binden, das in der 3'-Position an ein Protein konjugiert war.

6.1.5. Assay

Es wurden Mikrotiterplatten über Nacht mit 100 ul jedes Liganden bei 1 ug Protein pro ml PBS beschichtet. Die getrockneten Platten wurden für 1 Stunde mit 100 ul mit Enzym markiertem Antikörper inkubiert. Überschüssiger Antikörper wurde weggewaschen und 90 ul destilliertes Wasser und 10 ul Urinprobe oder Standard in jede Vertiefung gegeben. Nach zweiminütigem Schütteln wurde der Überstand in unbeschichtete Vertiefungen überführt. Das im Überstand enthaltene freigesetzte Label wurde nach Reaktion mit TMB-Substrat für 15 Minuten durch Messung der O. D. bei 450 nm quantifiziert.

6.2. Ergebnisse

Die Freisetzung des an einen Festphasen Liganden komplexierten markierten Antikörpers konnte im Überstand nachgewiesen werden, wenn freies Cotinin in der Probe vorhanden war. Ein Vergleich der Freisetzung aus Festphasen- Hydroxycotinin-PABA-BGG und Festphasen-Hydroxycotinin-ACA-BGG zeigt, daß nach einer Reaktionsdauer von 2 Minuten freies Cotinin die Freisetzung des an beide Antigene gebundenen anti-Cotinin Antikörpers in Abhängigkeit von der Konzentration bewirkt (Fig. 1). Die Ergebnisse zeigen, daß die Freisetzung bei Hydroxycotinin-ACA-BGG etwas besser verläuft.
Eine verbesserte Freisetzungsreaktion wurde bei der Freisetzung beobachtet, wenn der Freisetzungsabschnitt des Assays auf 10 Minuten verlängert wurde (Fig. 2). Ein Ansteig der A450 konnte bis zu einer niedrigen Konzentration von 0,5 ug/ml Cotinin beobachtet werden. Wiederum war die Freisetzung bei Hydroxycotinin-ACA-BGG besser. Ein Vergleich der Freisetzung nach einer Inkubationszeit von 2 Minuten bei Proben von Urin und synthetischer Matrices (Fig. 3) zeigt, das (i) die Empfindlichkeit des Assays bei der synthetischen Matrix im Vergleich zur Urinmatrix größer ist, und daß (ii) Hydroxycotinin-ACA-BGG bei der Freisetzung des anti-Cotininantikörers wirksamer ist.

6.3. Diskussion

Diese Ergebnisse zeigen, das ein Freisetzungsassay die Anwesenheit von freiem Cotinin in einer Urinpobe oder einer künstlichen Urinmatrix anzeigen kann. Der Nachweis von freiem Cotinin in einer Probe konnte mit Assayplatten, die hergestellt wurden, indem die Mikrovertiefungen mit einem Cotininliganden beschichtet wurden, der in der 3'-Position mit einem Protein konjugiert war und der einen Komplex mit einem Antikörper ausbildete, der spezifisch für Cotinin ist, das in der 4'-Position mit einem immunogenen Trägerprotein konjugiert war, unter Verwendung dieses Assays in weniger als 30 Minuten ausgeführt werden. Ein Vergleich der Fig. 2 und 3 zeigt, daß die Freisetzung schon 2 Minuten nach der Zugabe der Probe beobachtet werden konnte.
Kleine Unterschiede in der Bindungsaffinität beeinflussen die Empfindlichkeit des Freisetzungsassays. Die Freisetzung aus dem Hydroxycotinin-Aminocapronsäure- Rindergammaglobulinliganden gab etwas bessere Ergebnisse als die Freisetzung aus dem Hydroxycotinin-Aminobenzoyl-BGG. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Nutzung von Unterschieden in der Bindungsffinität eine Fortentwicklung der Empfindlichkeit des Immunoassays erlaubt.

7. Beispiel: Mikrotiterplattenverfahren für den Assay von Ligand-Protein-Konjugaten

Ein Festphasenassay ermöglicht ein Verfahren, um Ligand-Protein- Konjugatpräparationen auf ihre Eignung für Freisetzungsassays zu vergleichen und zu bestimmen, ob ein bestimmter Ligand den für einen Analyten spezifischen Antikörper mit ausreichend niedriger Affinität bindet. Das vorliegende Beispiel beschriebt die mit einem Cotinin-Liganden erhaltenen Ergebnisse.

7.1. Materialien und Verfahren

Reagentien, Hydroxycotinin-p-Aminobenzoesäure-Rindergammaglobulin (BGG) und Hydroxycotinin-&epsi;-Aminocapronsäure-BGG wurden wie oben in Abschnitt 6.1. beschrieben hergestellt.

7.1.1. Assayprotokoll

Mikrotiterplatten wurden wie oben in Abschnitt 6.1.5. beschrieben mit Cotininliganden beschichtet. Die Vertiefungen wurden zweimal mit Puffer gewaschen und 100 ul des anti-Cotinin-Peroxidasekonjugats (siehe oben Abschnitt 6.1.4.) in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zweimal mit Waschpuffer gewaschen. In jede Vertiefung wurden 100 ul Waschpuffer und 10 ul Probe gegeben. Die Proben bestanden aus 0, 0,5, 2,0 und 10 ug/ml Cotinin in Urin und zwei negativen und zwei positiven Urinproben. Die Platte wurde unter Bewegung für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 100 ul Überstand wurden abgenommen und in weitere Vertiefungen auf einer unbeschichteten Mikrotiterplatte überführt. Zu den den Überstand enthaltenden Vertiefungen wurden 100 ul von 2x TMB Substratlösung gegeben. Die Platte wurde für 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 N Schwefelsäure zu jeder Vertiefung gestoppt. Die Absorption wurde bei 450 nm gemessen.

7.2. Ergebnisse

Die Anwesenheit von Cotinin in der Probe bewirkte eine Freisetzung von markiertem anti-Cotinin Antikörper aus der Cotinin-Ligand Festphase. Der A&sub4;&sub5;&sub0;-Wert des Überstandes korrelierte positiv mit der Menge an freiem Cotinin in den mit Cotinin versetzten Urinproben. Weiter zeigen die negativen und positiven Urinproben die Nützlichkeit des Assays für den Nachweis von Cotinin in Urin. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Durch Cotinin induzierte Freisetzung aus Cotinin-BGG-Konjugaten

7.3 Diskussion

Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Mikrotiterassay ein geeignetes Mittel ist, um die Eignung eines bestimmten Ligand-Protein-Konjugats für einen Freisetzungsassay zu zeigen. Bei diesem Assay wirkt sich die Verwendung eines räumlich anspruchsvollen Linkers oder eines Spacers nur geringfügig auf die Ergebnisse aus.

8. Beispiel: homogener Freisetzungsassay für Cotinin

Das Freisetzungssystem ermöglicht eine gegenüber herkömmlichen Assays verbesserte Empfindlichkeit und Spezifität, indem die Spezifität der Dissoziierungsreaktionen genutzt wird. Die Dissoziierungsreaktionen bieten den Vorteil, daß sie von störenden Substanzen weniger betroffen werden.
Die vorliegende Erfindung zeigt
(1) die Herstellung von Cotinin-Liganden, die mit dem Enzym Glucose- 6-phosphatdehydrogenase markiert sind;
(2) die Inhibierung der enzymatischen Aktivität eines Enzym-Cotinin-Kojugats in Gegenwart von anti-Cotinin;
(3) die Verdrängung von anti-Cotinin im Enzym-Cotinin-Konjugat in Gegenwart von Cotinin;
(4) einen automatischen Assay für die Freisetzung eines Antikörpers vom Liganden, insbesondere nach 22 Stunden Komplexinkubation; und
(5) die Stabilisierung des Antikörper-Ligand-Komplexes für bis zu 6 Tage.

8.1 Materialien und Verfahren

Die folgenden Reagentien wurden verwendet: trans-4'-Carboxycotinin, N-Hydroxysuccinimid, 1,3-Dicyclocarbodiimid und Dimethylformamid (DMF), alle von Aldrich Chemical Co. bezogen; Glucose-6-phosphatdehydrogenase (Beckman, 367 (U/mg Protein); Glucose-6-Phosphat und beta-Nikotinamidadenindinucleotid in der reduzierten Form (NADH) waren beide von Sigma Chemicals Co. bezogen; und Carbitol [2-(2-Ethoxyethoxy)ethanol] wurde von Aldrich Chemical Co. bezogen.
Die Herstellung der cis-Hydroxycotinin-Glucose-6-phophatdehydrogenase wird unten in Abschnitt 10.1.3. beschrieben.

8.1.1. Assayverfahren

Als Puffer für den Assay wurde 0,05 M Tris-HCl, pH 7,8, äquilibriert bei 37ºC verwendet. Zu 150 ul Assaypuffer wurden 10 ul des Cotinin-Enzymkonjugats und 1 ul des anti-Cotinin Antikörpers gegeben (siehe oben, Abschnitt 6.1.4.), und die Lösung für 10 min bei 37ºC inkubiert. Zu dieser Lösung wurden 10 ul der Cotinin enthaltenden Probe gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ul Glucose- 6-phosphat/NAD gestartet und die Absorption bei 340 nm im Minutenabstand gemessen.
Eine Kontrollreaktion in Abwesenheit des Antikörpers wurde durchgeführt, indem 10 ul des Enzym-Cotinin-Konjugats zu 160 ul des Assaypuffers gegeben wurden und für 10 min. bei 37ºC äquilibriert wurden. Zum Starten der Reaktion wurden 20 ul Glucose-6-phosphat /NAD zugegeben und die A&sub3;&sub4;&sub0; in Minutenintervallen gemessen.
Das Cotinin-Enzym-Konjugat wurde mit 1 mg/ml Protein hergestellt und 500-fach zu einer endgültigen Konzentration von 2,0 ug/ml verdünnt. Der anti-Cotinin Antikörper lag in der Stammlösung in einer ungefähren Konzentration von 15 mg/ml vor. Die Glucose-6-Phosphat-NAD-Lösung wurde hergestellt, indem 3 Volumenteile 0,11 M Glucose-6-phosphat mit zwei Volumenteilen 0,1 M NAD vermischt wurden.

8.1.2. Automatisiertes Assay-Verfahren

Reagenz A wurde aus anti-Cotinin-Antiserum (Verdünnung 1 : 150), Cotinin-Glucose- 6-phosphatdehydrogenase-Konjugat, und 0,0015% Kathon CG in 0,05 M Tris-HCl, 0,005 M MgCl&sub2;, pH 7, 8 hergestellt. Reagenz B enthielt 6,2 mg/ml Glucose-6- phosphat und 13,3 mg/ml NAD.
Die Reagenzienreservoirs eines automatischen EPOS-Analyzers (Eppendorf) wurden mit den Reagentien A und B gefüllt. Reagenz A (0,2 ml) wurde vor der Zugabe der Probe (0,01 ml) für 0, 18 oder 22 Stunden inkubiert. Die Proben, einschließlich der Standards, wurden in die Mischung des Reagenz A pipettiert. Es wurde Reagenz B (0,05 ml) zugegeben und nach 0 und 5 Minuten die Absorption bei 340 nm gemessen.

8.2. Ergebnisse

8.2.1. Reduktion und Inhibierung der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität von cis-Hydroxycotinin-Enzym-Konjugat wurde mit dem Assay in Gegenwart und in Abwesenheit von anti-Cotinin Antikörper getestet. Die Ergebnisse sind in den Fig. 5 und 6 zusammengefaßt.
Die Konjugation von Cotinin an Enzym führt zu einer verringerten Enzymaktivität. Die Zugabe von anti-Cotinin Antikörper zum Enzym-Cotinin Konjugat erniedrigte (inhibierte) die Enzymaktivität weiter (Fig. 4). Die Inhibierung der Enzymaktivität durch die Bindung von Antikörpern wird durch die Zugabe von 10 ul Probe mit 4 ul/ml Cotinin vollständig aufgehoben. (Fig. 5).

8.2.2. Automatisierter Enzymassay

Mit bekannten Mengen an Cotinin versetzte Proben, oder von denen bekannt war, daß sie positiv für Cotinin waren, wurde 0, 18 und 22 Stunden nach Vermischen des Antikörper/Ligand-Enzym Konjugats ein Assay durchgeführt. Der Assay wurde wie in Abschnitt 8.1.2. beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß obwohl lange Inkubationszeiten zu etwas verringerten absoluten Änderungsraten führten, die Anwesenheit von Cotinin in der Probe selbst bei niedrigsten Konzentrationen nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Automatisierter Cotinin-Freisetzungsassay
Diese Daten zeigen, daß das gemischte Reagenz A bis zu 22 Stunden stabil verbleibt. Eine statistische Analyse der geschätzten Mengen an Cotinin in den positiven und negativen Urinproben unterstützt diese Annahme (Tabelle 3). Tabelle 3 Statistische Analyse der Daten aus dem automatisierten Assay
* negative Probe
Tabelle 3 zeigt, daß bei einer vorherigen Inkubation für 0, 18 oder 22 Stunden die Übereinstimmung mit der in der Probe vorhandenen Cotininmenge zufriedenstellend ist. Zum Beispiel schwankt die geschätzte Cotininkonzentration in der positiven Probe #1 zwischen 3,6 und 4,3 ug/ml. Vergleichbare Daten wurden für alle anderen Proben erhalten. Obwohl die absolute Änderung der Absorption nach einer Inkubationszeit von < 1 Stunde ansteigt, ergeben alle drei Kurven geeignete Daten um die Konzentration durch Extrapolation aus der Standardkurve abzuschätzen (Fig. 6).

8.2.3. Stabilisierung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes in einer Lösung mit hohem Salzgehalt

Der Antikörper-Ligand-Komplex wurde in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,9 gebildet, der 3 mM Magnesiumchlorid und 0 bis 5% Natriumchlorid enthielt. Der Assay wurde wie in Abschnitt 8.1.1. beschrieben durchgeführt. Der homogene Freisetzungsassay für Cotinin wurde für bis zu 6 Tage auf die Stabilität des Rezeptor-Ligand-Komplexes überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4. Freisetzungsassay nach lang andauernder Inkubation eines Antikörper- Ligand-Komplexes
* Delta ist die Enzymaktivität in Gegenwart von 2 u11 ml Cotinin unter Subtraktion der Grundlinie (Aktivität in Abwesenheit von Cotinin)
Die Daten zeigen, daß 5% Natriumchlorid sowohl die Enzymaktivität als auch den Antikörper-Ligand Komplex in freisetzbarer Form stabilisierten. Obwohl der Grad der maximalen Enzymaktivität mit der Zeit auch bei Anwesenheit von NaCl von 18,3 (Tag 0) über 11 (Tag 1) auf 10,7 (Tag 6) abnahm, blieb die Enzymaktivität bei subtrahierter Grundlinie ziemlich konstant bei 1,7, 1,33 und 1,6 für die Tage 0, 1 und 6. Die in Abwesenheit von Natriumchlorid inkubierten Proben blieben nicht stabil.

9. Beispiel: Herstellung von Antikörpern mit niedriger Affinität für die Anwendung in Freisetzungsassays

Niedrig-Affinitätschromatographie stellt ein geeignetes Verfahren zur Reinigung von Antikörpern und anderen Rezeptoren dar und kann auch auf geeignete Liganden hinweisen. Insbesondere die Eluierung von Rezeptoren unter milden Bedingungen führt zu viel höheren Ausbeuten als konventionelle Affinitätschromatographie, z. B. von annähernd 100%. Die milden Bedingungen schützen den Antikörper vor irreversibler Denaturierung und verlängern die Lebensdauer der Säule. Eine mit einem potentiellen Liganden hergestellte Affinitätssäule weist darauf hin, daß der Ligand in einem Freisetzungsassay mit diesem Liganden verwendet werden kann. Dieses Beispiel zeigt die Reinigung von anti-Cotinin Antikörpern mit einem Affinitätssäule mit trans-3'-Hydroxycotinin als Liganden.

9.1 Materialien und Verfahren

9.1.1. Herstellung des Immunoabsorbens

Cotinin-hemisuccinat wurde hergestellt, indem 19 mg trans-3'-Hydroxycotinin in 1 ml Dimethylformamid (Aldrich) gelöst wurden. 21 mg Bersteinsäureanhydrid (Aldrich) wurden zugegeben, gefolgt von 15 ul Pyridin (Aldrich). Die Mischung wurde über Nacht bei 45ºC inkubiert.
Iminodipropylamin-Sepharose wurde wie folgt hergestellt. Mit Bromcyan (CNBr) aktivierte Sepharose 4B (Sigma), 1 g, wurde hydratisiert und mehrmals mit 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,5, gewaschen. 3 ml 0,1 M 3,3'-Iminobispropylamin (Sigma) wurden zu 3 ml CNBr-Sepharose®Gel gegeben und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Amino-Sepharose® wurde mit einem Puffer gewaschen, der 0,1 M Natriumcarbonat, pH 8,5, 0,1 M Natriumhydrogencarbonat, pH 8,5, und 0,5 M Natriumchlorid enthielt, bis keine Reaktion von Trinitrobenzolsulfonsäure mit freien Aminogruppen mehr nachgewiesen werden konnte.
Hydroxycotinin-hemisuccinat-bersteinsäureester wurde hergestellt, indem 14 mg N-Hydroxysuccinimid (Sigma) und 23 mg 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (Sigma) zu 1 ml Cotinin-hemisuccinat gegeben und für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurden.
Hydroxycotinin-Sepharose® wurde hergestellt, indem 0,45 ml Hydroxycotininsuccinylester mit 1 ml Iminodipropylsepharose und 0,6 ml 0,2 M Natriumhydrogencarbonat vermischt wurden. Die Mischung wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur leicht bewegt und bei 4ºC über Nacht inkubiert.

9.1.2. Affinitätschromatographie

Eine kleine Säule wurde mit dem Hydroxycotinin-Sepharose®-Gel gepackt und die Säule dreimal mit 1 ml 0,5 M Natriumchlorid und anschließend mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen.
Eine Portion des durch die Injektion von Carboxycotinin in Kaninchen gewonnenen anti-Cotinin Antiserums (siehe oben, Abschnitt 6.1.4.) wurde 1 : 1 mit PBS verdünnt und die gesamte Mischung (2,1 ml) auf die Säule gegeben. Das Material wurde für 10 Minuten äquilibriert und dann die Säule nacheinander mit PBS, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,0 und 0,1 M Citratpuffer pH 2, 3 eluiert. Die Säule wurde dann mit 1 M Natriumchlorid gewaschen und anschließend mit PBS. Die Proteinkonzentration wurde in den Fraktionen unter Verwendung des Pierce Coomassie Blue Reagenz bestimmt und die Antikörperaktivität, indem die Reaktivität auf mit Cotinin beschichteten Platten in einem ELISA-Assay bestimmt wurde. Orthophenylendiamin (OPD) und Peroxid wurden als Indikator bzw. Substrat für Peroxidase verwendet.

9.2 Ergebnisse

Obwohl das meiste Protein in den vorderen Fraktionen aus der Affinitätssäule (Totvolumen) eluiert wurde, wurde die Antikörperaktivität in den späteren Fraktionen gefunden. Fraktion 14 enthält Antikörper mit hoher Affinität zu Cotinin. Die Antikörperausbeute betrug über 80%, was sehr hoch ist. Wie durch eine Reihe von Tests gezeigt werden konnte, war ferner die spezifische Aktivität der mit Niedrig- Affinitätschromatographie gereinigten Antikörper besser als die des Gesamtserums oder der IgG-Fraktionen (Daten nicht aufgeführt).

9.3. Diskussion

Niedrig-Affinitätschromatographie bietet einen ausgezeichneten Weg um Antikörper mit niedriger Affinität zu erhalten, welche mit diesem Ligand in Freisetzungsassays verwendet werden können. Antikörper mit niedriger Affinität werden früher aus einer Immuno-Affinitätschromatographiesäule und unter milderen Bedingungen eluiert als Antikörper mit hoher Affinität. Weniger scharfe Bedingungen reichen nur dann aus, um Antikörper mit niedriger Affinität von einem Festphasenchromatographieträger zu eluieren, wenn die Wechselwirkung zwischen Antikörper und Ligand selbst eine ausreichend niedrige Affinität besitzt.
Die Eluierung unter neutralen oder milden Bedingungen bietet den weiteren Vorteil, daß eine Denaturierung der Antikörper verringert oder verhindert wird.

10. Herstellung von Analogen von Cotinin mit niedriger Affinität und ihre Wirksamkeit in einem Freisetzungsassay

Liganden können hergestellt werden, indem Analoge oder Stereoisomere von Analogen des Analyten verwendet werden, wozu ein Unterschied in der Konfiguration oder Konstitution eingeführt wird, der zu einer niedrigeren Bindungsaffinität zum für den Analyten spezifischen Antikörper führen kann.
Beim vorliegenden Beispiel zeigt ein anti-Cotinin Antikörper, der aus Kaninchen hergestellt wurde, die mit an KLH konjugiertem Carboxycotinin immunisiert worden waren (siehe oben, Abschnitt 6.1.4.) günstige Eigenschaften bei der Freisetzung aus trans-3'-Hydroxycotininkonjugaten mit Meerrettich-Peroxidase in der Gegenwart von Cotinin. Das optische Isomere von trans-3'-Hydroxycotinin ist cis-3'-Hydroxycotinin und es wird gezeigt daß dies auch ein hervorragender Ligand ist.

10.1 Materialien und Verfahren

10.1.1. Extensive Modifikation von Glucose-6-phosphatdehydrogenase mit trans-3'- Hydroxycotinin zur Ausbildung eines Liganden

11 mg trans-3'-Hydroxycotinin wurden in 0,29 ml Dimethylformamid gelöst; zur Mischung wurden 12 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nachdem sich alle Feststoffe gelöst hatten, wurden 9 ul Pyridin zugegeben, das Reagenzglas dicht verschlossen und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Zu der Hydroxycotininsuccinatmischung wurden 7 mg N-Hydroxysuccinimid und 12 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Diese Mischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Es wurden drei Reagenzgläser vorbereitet, die jeweils 1 ml 0,1 M Carbonatpuffer pH 9, und 2,8 mg Glucose-6-phosphatdehydrogenase enthielten. Zum ersten Reagenzglas wurden 35 ul des aktivierten trans-Hydroxycotinin innerhalb einer Stunde in Aliquots von 5 ul in Abständen von 10 Minuten zugegeben. Diese Zubereitung wurde als RL-24 bezeichnet. Zum zweiten Reagenzglas wurden 70 ul aktiviertes trans-Hydroxycotinin in derselben Weise wie oben zugegeben. Diese Zubereitung wurde als RL-25 bezeichnet. Zum dritten Reagenzglas wurden 105 ul aktiviertes trans-Hydroxycotinin in der selben Weise wie oben in 15 u) Aliquots gegeben. Diese Zubereitung wurde als RL-26 bezeichnet.
Fünfzehn Minuten nach der letzten Zugabe von aktiviertem trans-Hydroxycotinin wurden Proben in Dialysebeutel transferiert und bei 2-8ºC gegen 0,05 M Tris- Puffer pH 7,8 dialysiert. Die Dialyse wurde für annähernd 44 Stunden fortgesetzt, wobei die Flüssigkeit mehrmals ausgetauscht wurde.

10.1.2. Schwächere Modifizierung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase mit trans- Hydroxycotinin zur Ausbildung eines Liganden.

9,5 mg trans-3'-Hydroxycotinin wurden in 0,25 ml Dimethylformamid gelöst. Dann wurden 6 mg Bernsteinsäureanhydrid zur Mischung gegeben und gemischt, bis alles gelöst war. 7,5 ul Pyridin wurden zugegeben und das Reagenzglas dicht verschlossen und über Nacht bei 37ºC inkubiert.
Zu dieser Mischung wurden 6 mg N-Hydroxysuccinimid und 10 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Die Mischung wurde unter Rühren für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Es wurden zwei Reagenzgläser vorbereitet, die jeweils 1 ml 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,0 und 2,8 mg Glucose-6-phosphatdehydrogenase enthielten. Zum ersten Reagenzglas wurden 25 ul aktiviertes trans-3'-Hydroxycotinin während 1 Stunde in Aliquots von 5 ul in Intervallen von 10 Minuten zugegeben. Diese Zubereitung wurde als RL-29 bezeichnet. Zum zweiten Reagenzglas wurden 70 ul aktiviertes trans-3'- Hydroxycotinin in derselben Weise wie oben in 10 ul Aliquots zugegeben. Diese Zubereitung wurde als RL-30 bezeichnet.
Diese Zubereitungen wurden über Nacht in der Kälte gegen 0,05 M Tris-Puffer pH 7,8 dialysiert.

10.1.3. ein cis-3'-Hydroxycotinin Ligand

47.5 mg cis-3'-Hydroxycotinin wurden in 0,4 ml Pyridin gelöst. Zu dieser Lösung wurden 10 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben und die Mischung gerührt, bis alles aufgelöst war. Die Mischung wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert und dann bei Raumtemperatur aufbewahrt.
cis-3'-Hydroxycotininhemisuccinat wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Silicagel von der Reaktionsmischung abgetrennt unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, bestehend aus Benzol: Methanol: Ammoniumhydroxid = 10 : 3 : 0,5. Das cis-3'-Hydroxycotinin wurde unter UV-Licht sichtbar gemacht. Das erwünschte Produkt wurde wie folgt isoliert: Der Bereich auf dem Chromatogramm, der das cis-3'-Hydroxycotininhemisuccinat enthielt, wurde abgeschabt und in ein Reagenzglas überführt. Es wurde 1 ml Methanol zugegeben und das Reagenzglas von Hand geschüttelt, während der Inhalt mit einem Glasspatel vermischt wurde. Das Reagenzglas wurde kurz bei 1500 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und das Silicagel dreimal mit 0,5 ml Methanol gewaschen. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände gesammelt und mit dem ursprünglichen Überstand vereinigt. Die kombinierten Überstände wurden unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockene eingedampft. Das cis-3'-Hydroxycotinin-hemisuccinat wurde in 0,6 ml Methanol aufgelöst. Durch Spektroskopie wurde festgestellt, das 5,28 mg Produkt erhalten worden waren. Das Material wurde dann erneut zur Trockene eingedampft.
Das cis-3'-Hydroxycotinin-hemisuccinat wurde in 280 ul Dimethylformamid gelöst. 8 mg N-Hydroxysuccinimid und 12 mg Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben und die Mischung gerührt, bis sich alle Feststoffe aufgelöst hatten. Die Mischung wurde für 1 Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert.
Es wurde ein Reagenzglas vorbereitet, das 1 ml 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,0 und 2,8 mg Glucose-6-phosphatdehydrogenase enthielt. Zu diesem Reagenzglas wurden 7 10 ul Aliquots des cis-3'-Hydroxycotinin-hemisuccinats während 1 Stunde zugegeben und nach der letzten Zugabe für weitere 15 Minuten gerührt. Die Mischung wurde in einen Dialysebeutel überführt und über Nacht in der Kälte gegen 0,05 M Tris-HCl pH 7, 8 dialysiert. Die Dialyse wurde für weitere 26 Stunden fortgesetzt, wobei der Puffer mehrmals ausgetauscht wurde. Diese Konjugat wurde als RL-34 bezeichnet.

10.1.4. Herstellung des Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Carboxycotinin- Liganden

Carboxycotinin wurde mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase nach dem folgenden Verfahren konjugiert:
Zu 1 ml 0,1 M Natriumcarbonatpuffer pH 9,0 wurden 0,43 ml Glucose-6- phosphatdehydrogenase (2,8 mg), 20 mg NADH (Dinatriumsalz), 10 mg Glucose-6- phosphat und 300 ul Carbitol gegeben. Die Lösung (Enzymlösung") wurde bei 4ºC in der Kälte gelagert.
In ein leeres Teströhrchen wurden 22 mg Carboxycotinin, 11,5 mg N-Hydroxysuccinimid 20,6 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 1,0 ml Dimethylformamid gegeben. Diese Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen, damit sich der aktivierte Cotininester bilden konnte. Nach 1 Stunde wurden 10 ul der Reaktionsmischung in Intervallen von 15 Minuten zur kalten Enzymlösung gegeben, bis insgesamt 70 ul zugegeben waren (Gesamtzeit 90 Minuten). Fünfzehn Minuten nach der letzten Zugabe der Reaktionsmischung wurde das modifizierte Enzym fünfmal gegen jeweils 1 Liter 0,055 M Tris-HCl Puffer pH 7,9 für jeweils mindestens 3 Stunden dialysiert.

10.1.5. Assay auf Mikrotiterplatten

Streifen von Mikrotiterplatten wurden durch Zugabe von 100 ul jedes Konjugats bei einer Proteinkonzentration von 1 ug/ml in jede Vertiefung beschichtet. Die Streifen wurden mit Parafilm abgedeckt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Der Inhalt der Vertiefungen wurde entfernt und die Vertiefungen zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Die Vertiefungen wurden anschließend mit 100 ul Antikörper- Peroxidasekonjugat für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundenes Konjugat wurde verworfen und die Vertiefungen zweimal mit Waschpuffer gewaschen. In jede Vertiefung wurden 100 ul Waschpuffer und 10 ul Cotininstandard gegeben und die Platten für 2 Stunden bewegt. Nach dem Mischen wurden aus jeder Vertiefung 100 ul Flüssigkeit entnommen und in Vertiefungen unbeschichteter Platten überführt und 100 ul Tetramethylbenzidinreagenz (TMB) wurden zugegeben. Die Platten wurden 7 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 N Schwefelsäure zu jeder Vertiefung gestoppt. Die Absorption wurde bei 450 nm gemessen.
Restliches Peroxidase-Antikörperkonjugat, das nach der Freisetzung in den Vertiefungen gebunden verblieb, wurde gemessen, indem 200 ul TMB in jede Vertiefung gegeben wurden. Nach 7 Minuten Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 N Schwefelsäure gestoppt und die Absorption bei 450 nm gemessen.
Ein zuvor hergestelltes Konjugat von Carboxycotinin-Glucose-6- phosphatdehydrogenase wurde ebenfalls nach diesem Assay untersucht.

10.2. Ergebnisse

Die Ergebnisse der Assays mit verschiedenen Hydroxycotinin-Glucose-6- phosphatdehydrogenase-Konjugaten sind in den Tabellen 5, 6 und 7 aufgeführt. Tabelle 5 Freigesetztes Antikörper-Peroxidase-Konjugat (A&sub4;&sub5;&sub0;) Tabelle 6. In den Vertiefungen verbleibendes Antikörper-Peroxidase Konjugat (A&sub4;&sub5;&sub0;) Tabelle 7. Freisetzungsassay mit cis-Hydroxycotinin
Die Freisetzung von Enzym-Antikörperaktivität ist auch graphisch in Fig. 7 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß die Verwendung eines modifizierten Analogen als Ligand den für einen Freisetzungsassay erforderlichen Unterschied in der Affinität bewirkt. Der Ligand cis-Hydroxycotinin-Glucose-6- phosphatdehydrogenase wurde auch in einem homogenen Freisetzungsassay getestet, wie er oben in Abschnitt 8.1.2. beschrieben wurde. Nach 10 Minuten Inkubation von 10 ul Antikörper-Bindungsreagenz mit 10 ul Ligand in 140 ul Tris- Puffer wurden 10 ul Probe zugegeben. NAD und Glucose-6-phosphat-Substrat (20 ul) wurden nach einer weiteren Periode von 5 Minuten zugegeben und die A&sub3;&sub4;&sub0; nach 0, 2, 4, 8, 12, 16 und 20 Minuten gemessen. Proben, die Cotinin enthielten, zeigten einen schnelleren Anstieg der Absorption als Proben ohne Cotinin. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Tabelle 8. Homogene Freisetzung mit cis-Hydroxycotinin

Cotininkonz. (ul/ml) Änderungsrate OD (mA/min)
0 8,8
0,5 17,5
4,0 20,0
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Mikrotiterplattenformat ideal für das Screening nach geeigneten Liganden mit niedriger Affinität und Ligand-Enzymkonjugaten ist. Ein Ligand, bei dem festgestellt wurde, daß er in einem Mikrotiterplatten- Freisetzungsassay geeignet ist, kann genauso gut in einem homogenen Freisetzungsassay verwendet werden.

11. Beispiel Freisetzungs-Immunoassay für Cotinin

In Beispiel 11 werden Cotinin-Freisetzungsassays beschrieben, bei denen N-Propylcarboxynorcotinin und N-Isopropylcarboxynorcotinin als Relanden mit sehr niedriger Affinität verwendet werden. Cis-3'-Hydroxycotinin wurde ebenfalls als Reland verwendet. Die Assays wurden sowohl in homogener Phase (was mit dem EMITTM-System (Rubenstein et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47 : 846) verglichen werden kann, wobei jedoch gezeigt wird, daß es besser als dieses ist), als auch in heterogener Phase (Mikrotiterplatte, ELISA) durchgeführt und mit einem herkömmlichen Bindungsassay für Cotinin verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Freisetzungsassays, die auf Dissoziation beruhen, genauer sind und weniger Einflüsse durch Kreuzreaktivität zeigen, als herkömmliche Assays, die auf Assoziation beruhen. Ferner zeigt der erfindungsgemäße Assay eine Standardkurve, die über einen > 10.000 fachen Bereich linear, r 0,999, verläuft.
Die folgenden Abschnitte zu Materialien und Verfahren geben eine allgemeine Beschreibung der hergestellten und in den Assays verwendeten Reagentien, wie auch der verwendeten Verfahren. Die in jedem Assay verwendeten spezifischen Liganden werden im Abschnitt über die Ergebnisse angegeben und sind, soweit nicht anders angegeben, N-Isopropylnorcarboxycotinin.

11.1. Materialien und Verfahren

Die verwendeten Geräte umfaßten ein SLT Lab instruments 340ATTC Mikrotiterplattenlesegerät, COBAS MIRA, und Varion VXR-200. Die Urinproben entstammten einer allgemeinen Population, die zuvor auf Cotinin analysiert worden waren. Die Proben und wurden bei -20ºC gelagert.
Alle Chemikalien wurden soweit nicht anders angegeben von Sigma Aldrich bezogen. Cis und trans-Hydroxycotinin wurde aus dem Labor von George Neurath (s. o. Neurath et al.) bezogen. Glucose-6-phosphatdehydrogenase wurde von Beckman bezogen. Der Assay-Kit für Nikotin-Metaboliten, NiMA AutoMatesTM, und die ELISA-Kits, Tobacco Screen®, und zur Quantifizierung von Cotininspuren, CotiTraq®, das TMB-Chromogensystem, anti-Cotinin-Antisera, mit Peroxidase markiertes anti-Cotinin und Cotinin-Urinstandards wurden kommerziell von Serex, Inc. (Maywood, NJ) bezogen. Die Herstellung von anti-Cotinin-Antiseren ist oben in Abschnitt 6.1.4. beschrieben.

11.1.1. Herstellung der Relanden

1-Isopropyl-4-carboxy-5-(3-pyridyl)-2-pyrrolidon (im weiteren als N- Isopropylcarboxynorcotinin bezeichnet) und 1-Propyl-4-carboxy-5-(3-pyridyl)-2- pyrrolidinon (im weiteren als N-Propylcarboxynorcotinin bezeichnet) (Fig. 8) wurden nach dem Verfahren von Cushman & Castagnoli hergestellt (1972, J. Org. Chem. 37 : 1268) Kurz zusammengefaßt wurde eine Lösung von 17 g Pyridin-3- carboxyaldehyd in 50 ml Benzol zu einer Benzollösung von 8 g Isopropylamin (bzw. 8 g Propylamin) und 12 g Molekularsiebperlen gegeben. Die Mischung wurde in einem Kolben bei 20ºC über Nacht gerührt. Die Lösung wurde durch zwei Lagen Whatman Nr. 2 Filterpapier filtriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abgedampft um das Imin als gelbes Öl zu ergeben. Die Struktur der Produkte wurde durch ¹H-NMR überprüft.
N-Isopropylnorcarboxycotinin und N-Propylcarboxynorcotinin wurden wie folgt hergestellt. 12 g N-3-Pyridylidenisopropylimin oder N-3-Pyridylidenpropylimin und 15 g Bernsteinsäureanhydrid wurden für 24 Stunden in 100 ml Xylen unter Rückfluß erhitzt. Nachdem die Mischung abgekühlt war, wurde die obere Schicht abdekantiert und verworfen. Das verbleibende braune Öl wurde in 300 ml 5% Hydrogencarbonatlösung gelöst, zweimal mit je 250 ml Chloroform gewaschen und durch Absorption an 1 g Aktivkohle entfärbt. Die Suspension wurde filtriert und das gelbe Filtrat im Wasserdampf erhitzt, um Spuren von Chloroform zu entfernen. Der pH wurde mit Phosphorsäure auf 4,7 eingestellt, um das Produkt zu präzipitieren. Die rohe Carbonsäure wurde durch Filtration gesammelt und in siedendem Ethanol umkristallisiert um 4 g weiße Kristalle zu ergeben. Die Struktur der Verbindungen wurde mit ¹H-NMR überprüft.

11.1.2. Herstellung der Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Konjugate

Die Konjugate von N-Isopropyl-4-carboxynorcotinin, N-Propyl-4-carboxy-norcotinin und cis-3'-Hydroxycotinin mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase wurden nach den Verfahren von Rubenstein und Ullman (1975, U.S.-Patent Nr. 3,875,011) hergestellt. Kurz zusammengefaßt wurden 1 ml 0,1 M Natriumcarbonatpuffer pH 9,0 zu 0,43 ml Glucose-6-phosphatdehydrogenase (2,8 mg), 20 mg NADH (Dinatriumsalz), 10 mg Glucose-6-phosphat und 300 ul Carbitol gegeben. Die Lösung ("Enzymlösung") wurde bei 4ºC in der Kälte gelagert.
In ein leeres Teströhrchen wurden 26 mg N-Propyl oder N-Isopropylcarboxynorcotinin, 11,5 mg N-Hydroxysuccinimid, 20,6 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 1,0 ml Dimethylformamid gegeben. Diese Mischung wurde zur Bildung des aktivierten Cotininesters 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Nach 1 Stunde wurden 10 ul der Reaktionsmischung in Intervallen von 15 Minuten zur kalten Enzymlösung gegeben, bis eine Gesamtmenge von 70 ul zugegeben war (Gesamtzeit 90 Minuten). Fünfzehn Minuten nach der letzten Zugabe zur Reaktionsmischung wurde das modifizierte Enzym gegen fünfmal jeweils 1 Liter 0,055 Tris-HCl-Puffer pH 7,9 für jeweils mindestens drei Stunden dialysiert.

11.1.3. Reagentien für den homogenen Freisetzungsassay

Die Lösungen der Reagentien für den homogenen Assay für Cotinin wurden als drei getrennte Lösungen, die Reagentien A, A+ und B hergestellt. Reagenz A bestand aus Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Konjugat mit einer Proteinkonzentration von 0,74 ugg/ml, 0,05 M Tris-Puffer, 5mM MgCl&sub2;, 0,5 mM EDTA, 1,75 mg/ml Glucose-6- phosphat, 0,5% BSA und Konservierungsstoffen bei pH 7,9. Reagenz A+ bestand aus Antiserum in Reagenz A-Puffer. Die Reagentien A und A+ wurden vor Gebrauch gemischt und ergaben die Arbeitslösung A, die bei 4ºC für eine Woche stabil ist.
Reagenz B bestand aus 3,3 mg/ml NAD in 0,02 M Tris-Puffer pH 7,0.
Die Kreuzreaktivität wurde mit Cotinin und/oder trans-3'-Hydroxycotininlösungen getestet, die wie folgt hergestellt wurden. Zu 10 ul aus einem negativen Urinpool wurden 100 ug Cotinin oder trans-3'-Hydroxycotinin gegeben. Die Mischung wurde mit Vortex vermischt und eine Konzentrationsreihe durch Verdünnen mit demselben negativen Urinstandard hergestellt, wobei Lösungen mit 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 und 0,16 ug/ml an Cotinin oder trans-3'-Hydroxycotinin erhalten wurden.
Zur Herstellung der 1 : 3, Cotinin: trans-3'-Hydroxycotinin, Lösung wurde ein Aliquot von 10 ul des negativen Urinstandards mit 100 ug Cotinin und 300 ug trans-3'- Hydroxycotinin versetzt. Diese Lösung wurde mit dem Vortex vermischt und mit demselben negativen Urinstandard eine Verdünnungsreihe erstellt, die Verdünnungen von 5 (15), 2,5 (7,5), 1,25 (3,75), 0,62 (1,87), 0,31 (0,94), 0,16 (0,48) ug/ml Cotinin (Hydroxycotinin) enthielten.
Die Kreuzreaktivität wurde mit der folgenden Formel bestimmt:
gefundene Konzentration (ug/ml)/Konzentration des Kreuzreaktanden (ug/ml) in der Probe · 100%

11.1.4. Assayformate

ELISA-Format. Corning-Mikrotiterplatten wurden über Nacht mit jeweils 100 ul der Konjugate von Glucose-6-phosphatdehydrogenase mit cis-Hydroxycotinin, N-Propylnorcotinin oder N-Isopropylnorcotinin bei 1 ug Protein pro ml PBS beschichtet; die Vertiefungen wurden geleert, getrocknet und bis zum Gebrauch unter Trockenmittel aufbewahrt. Für die Aktivierung zur Freisetzung wurde die Platte < 1 Stunde mit 100 ul mit Peroxidase markiertem und affinitätsgereinigtem anti- Cotinin Antikörper inkubiert. Überschüssiger Antikörper wurde durch zweimaliges Waschen mit PBS in 0,05% Tween® 20 entfernt.
10 ul Urin / Standard und 90 ul destilliertes Wasser wurden in jede Vertiefung einer mit einem Freisetzungs-Ligand-Antikörper (Reland) Komplex beschichteten Mikrotiterplatte gegeben. Nach 2 Minuten wurden 50 ul des Überstands in unbeschichtete Vertiefungen überführt, die 100 ul TMB enthielten, und für 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 ml 1 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt und die A450 ausgelesen.
Homogener Freisetzungsassay. Der erfindungsgemäße homogene Assay wurde im AutoMatesTM-Format durchgeführt, wobei dasselbe Enzymsystem und dieselben Reagenzien verwendet wurden, wie bei einem konventionellen homogenen Assoziationsassay, der jedoch in der folgenden Weise modifiziert war, um eine Dissoziationsreaktion zu erhalten.
Ab : Ligandkonjugat + Analyt → Ab: Analyt + Ligandkonjugat
Ab: Antikörper
Vor der Verwendung wurden Reagenz A (Enzymkonjugat in Puffer) und Reagenz A+ (Antiserum in Puffer) für zumindest eine Stunde vermischt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Probe und NAD gestartet. Wie bei einem assoziativen Assay wurde die Enzymaktivität durch Beobachtung der Bildung von NADH bei A&sub3;&sub4;&sub0; gemessen, wobei die Enzymaktivität direkt mit der Konzentration des Analyten in der Probe in Beziehung steht.
Der erfindungsgemäße homogene Assay unter Verwendung des AutoMatesTM wurde auf COBAS MIRA entsprechend den Anwendungsanweisungen des Herstellers durchgeführt. 200 ul Reagenz A wurden mit 10 ul Reagenz B (NAD) inkubiert und die Mischung für 25 Sekunden inkubiert. Die Absorption wurde während der letzten 200 Sekunden gemessen. Die Gesamtzeit des Assays betrug 5,0 Minuten. Bei 25 ul Proben wurde eine größere Empfindlichkeit für eine Probe beobachtet, die 10 ng/ml Analyt enthielt.

Assoziativer homogener Assay

Das NiMA AutoMatesTM-Format ist ein homogener assoziativer kompetitiver Assay, der dem von Rubenstein, Schneider und Ulmann (s.o., 1972) beschriebenen entspricht. Es treten zwei Schritte bei der Immunreaktion ein:
Ab + Analyt → Ab : Analyt + Ab
Ab : Analyt + Ab + Konjugat → Ab : Konjugat + Ab : Analyt
Kurz zusammengefaßt wurde die Probe mit dem Antiserum für mehrere Minuten vorinkubiert. Zu diese Reaktionsmischung wurde Glucose-6-phosphatdehydrogenase gegeben, die mit Cotinin konjugiert war. Antikörper, die nicht mit in der Probe vorhandenem Cotinin in Wechselwirkung getreten waren, binden an Cotinin an der Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Die Bindung des Antikörpers an den mit dem Enzym verbundenen Liganden inhibiert die Enzymaktivität, weshalb die Enzymaktivität direkt mit der Konzentration des Analyten in der Probe in Beziehung steht. Die Enzymaktivität der Glucose-6-phosphatdehydrogenase wurde gemessen, indem bei A&sub3;&sub4;&sub0; nm die Bildung von NADH beobachtet wurde, das sich bildet, wenn das Enzym Glucose-6-phosphat zu Glucono-δ-lacton-6-phosphat oxidiert und NAD zu NADH reduziert.
NiMA AutoMatesTM wurden auf COBAS MIRA nach den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. 200 ul Reagenz A wurden mit 10 ul der Probe bei 37ºC für 75 Sekunden inkubiert. 50 ul Reagenz B wurden zugegeben und die Mischung für 25 Sekunden inkubiert. Die Absorption wurde während der letzten 250 Sekunden ausgelesen. Die Gesamtzeit des Assays betrug 5,83 Minuten.

11.2 Ergebnisse

11.2.1. heterogener Freisetzungsassay (ELISA-Format)

Die Freisetzung von an der festen Phase komplexiertem markiertem Antikörper konnte im Überstand nachgewiesen werden, wenn freies Cotinin in der Probe vorhanden war (Fig. 9). Anders als bei konventionellen kompetitiven Immunoassays war die Absorption oder das Signal direkt proportional zur Konzentration des Analyten.
Das cis-Hydroxycotininkonjugat konnte den Antikörper am besten binden und freisetzen, wies jedoch den höchsten Hintergrund auf.

11.2.2. homogenes Format

Die Dosis-Wirkungskurve des assoziativen (NiMA) und des homogenen Freisetzungsassays zeigen den wesentlich vergrößerten Bereich des Freisetzungsassays (Fig. 10). Der Vergleich des assoziativen und des Freisetzungsassays ist in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9. Vergleich eines homogenen dissoziativen Assays für Cotinin und eines homogenen assoziativen Assays für Cotinin (NiMA)
Tabelle 9 zeigt, daß der Freisetzungsassay die 17-fach größere Menge an Enzym und die doppelte Menge an Antikörper nutzt als der assoziative Assay. Die gesteigerte Enzym- und Antikörpermenge führt jedoch nicht zu einer verringerten Empfindlichkeit wie bei assoziativen Immunoassays: es können bei der Freisetzung geringere Mengen aller Reaktanden verwendet werden, jedoch beschränkt dies den oberen Bereich des Assays. Fig. 11 zeigt den Bereich des Assays, 0,01 - 100 ug/ml. Bei dem gezeigten Beispiel bewirkt ein 17-facher Anstieg der Reaktanden einen Anstieg des Bereichs des Assays um das mehr als tausendfache, ohne daß am unteren Ende der Kurve Empfindlichkeit verloren geht. Diese Formulierung ist bis zu 10 ng/ml empfindlich und kann zur Quantifizierung von Speichelproben verwendet werden. Das Verhältnis von Antikörper zu Enzym des Freisetzungs- und des assoziativen Assays beträgt 10 : 80; dies bedeutet, daß der assoziative Assay die achtfache Antikörpermenge pro Enzymmolekül benötigt als der Freisetzungsassay. Beim Freisetzungsassay können alle Antikörpermoleküle an mit Enzymen konjugierte Liganden gebunden werden und können durch den Analyten wieder freigesetzt werden. Der assoziative Assay benötigt einen hohen Überschuß an Antikörper, was die Reaktionszeit erniedrigt. Die Fähigkeit des Freisetzungsassays, die Aktivität eines weit höheren prozentualen Anteils an Antikörpern in der Reaktionsmischung nachweisen zu können, steigert die Empfindlichkeit und verringert das Hintergrundrauschen und die Reaktionszeit.

11.2.3. Kreuzreaktivität: trans-Hydroxycotinin

Die Spezifität des Freisetzungsassays im Vergleich zum assoziativen Assay wurde durch Vergleich der Kreuzreaktivität zu trans-3'-Hydroxycotinin bei der Freisetzungs- und der Assoziationsanordnung nachgewiesen (Tabelle 10). Tabelle 10. Einfluß von trans-Hydroxycotinin auf Freisetzungs- und assoziative (NiMA) Assays für Cotinin. Freisetzungsassay NiMA
Der Freisetzungsassay zeigt mit Hydroxycotinin ein Viertel der Kreuzreaktivität des assoziativen Assays. Beim Freisetzungsassay trat am unteren Ende der Kurve keine Kreuzreaktivität auf. Die stärkste Wechselwirkung war beim assoziativen Assay am unteren Ende der Kurve zu beobachten. Um die tatsächliche Auswirkung von trans- 3'-Hydroxycotinin auf einen Assay von Urinproben zu bewerten, wurden die Proben mit Cotinin trans-3'-Hydroxycotinin im Verhältnis 1 : 3 versetzt (von diesem Verhältnis wird berichtet, daß es im Urin von Rauchern auftritt (Engvall et al., 1971, Immunochemistry 8 : 871)) und sowohl in einem Freisetzungs- als auch in einem assoziativen Assay getestet (Tabelle 11). Tabelle 11. Kreuzreaktivität von trans-Hydroxycotinin in Gegenwart von Cotinin bei homogenen Freisetzungs- und assoziativen (NiMA) Assays für Cotinin
Das trans-3'-Hydroxycotinin trug zur Quantifizierung von Cotinin sowohl des Freisetzungs- wie auch des assoziativen Assays bei. Der Beitrag ist bei beiden Formaten über den Bereich des Assays ziemlich konstant, führt jedoch zu einer durchschnittlichen Wiedergewinnung von 220% beim assoziativen Assay gegenüber nur 144% beim Freisetzungsassay, was darauf hinweist, daß der Freisetzungsassay durch Kreuzreaktivität geringer beeinflußt wird, wodurch die Möglichkeit für falsche positive Ergebnisse bei einem Cotininassay reduziert wird.
Die Ergebnisse der Kreuzreaktivität aus Tabelle 10 legen den Schluß nahe, daß trans-Hydroxycotinin, das in einer Probe in einem erwarteten Verhältnis von 3 : 1 zu Cotinin vorhanden ist, die scheinbar nachgewiesene Cotininmenge um etwa 45% (das dreifache der ungefähr 15% der Cotininrückgewinnung) steigert. Die erwartete Rückgewinnung für Cotinin beim in Tabelle 11 aufgeführten Freisetzungsassay beträgt daher ungefähr 145%. Tatsächlich lag die durchschnittliche prozentuale Cotininmenge bei etwa 144%. Eine vergleichbare Analyse für das assoziative Format (NiMA) zeigt, daß dasselbe Verhältnis trans-Hydroxycotinin: Cotinin von 3 : 1 die scheinbar gemessene Cotininrückgewinnung um etwa 60% erhöht (3 · 20%).
Die in Tabelle 11 angegebene, für den assoziativen Assay (NiMA) erwartete Rückgewinnung von Cotinin beträgt daher 160%. Die durchschnittliche Cotininrückgewinnung beträgt jedoch 220% und erreichte Werte von bis zu 294%. Es scheint daher ein "synergistischer" Effekt des trans-Hydroxycotinin auf den Nachweis von Cotinin vorzuliegen, so daß die Gegenwart von trans-Hydroxycotinin Verunreinigungen sich beim assoziativen Assay für Cotinin in unerwarteter, und daher vermutlich nicht zu korrigierender Weise auswirkt.
Der Freisetzungsassay zeigt die vorhergesagte Kreuzreaktivität, während das assoziative Format eine durchschnittliche Rückgewinnung von 220% zeigt, was fast dem Doppelten des aus den einfachen Daten der Kreuzreaktivität vorhergesagten entspricht. Dies zeigt, daß der assoziative Assay leichter für Störungen anfällig ist als der Freisetzungsassay.

11.2.4. Kreuzreaktivität von N-Isopropyl-4-carboxy-norcotinin

Zur weiteren Untersuchung der Stabilität und der Freisetzbarkeit des Antikörper- Ligand-Komplexes untersuchten wir die Fähigkeit von N-Isopropyl-4-carboxynorcotinin verschiedene Freisetzungsassays zu beeinflussen, die jeweils denselben Antikörper verwendeten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 aufgeführt. Tabelle 12 Kreuzreaktivität von N-Isopropyl-4-Carboxy-norcotinin in assoziativen und in Freisetzungsassays
Der Ligand N-Isopropyl-4-carboxy-cotinin zweigte weniger als 4% Kreuzreaktivität, sogar bei hohen Konzentrationen von 100 ug/ml. Der Ligand zeigt bis zu 100 ug/ml keine Kreuzreaktivität gegenüber dem Antikörper, der mit ihm auf G-6-P-DH komplexiert war, wobei an diesem Punkt eine Kreuzreaktivität von 0,4% nachgewiesen wurde. N-Isopropyl-4-carboxy-cotinin störte in den herkömmlichen NiMA und CotiTraq®-Assayformaten stärker als beim Freisetzungsassay, was darauf hinweist, daß es beim Freisetzungsassay kein Wettbewerber um den Antikörper ist.
Der homogene Freisetzungsassay und konventionelle homogene und konventionelle ELISA-Formate wurden ebenfalls zum Vergleich herangezogen. Der heterogene Freisetzungsassay, NiMA AutoMatesTM- und Tobacco Screen®- (ELISA) Assays für Cotinin wurden verglichen, indem ein Cotininäquvalent von 0,5 ug/ml verwendet wurde (0,5 ug/ml werden als äquivalent angenommen zu einer Urinzusammensetzung von 0,25 ug/ml Cotinin, 0,75 ug/ml Hydroxycotinin bei Tobacco Screen ® und NiMA, und zu 0,35 ug/ml Cotinin beim Freisetzungsassay für Cotinin). Tabelle 13 zeigt, daß die Freisetzung zu 100% mit Tobacco Screen® korreliert. Tobacco Screen® korreliert zu 100% mit den HPLC-Ergebnissen, die mit einer HPLC-Probe von 200 ng/ml und einer Tobacco Screen®-Probe von 400 ng/ml erhalten wurden. Tabelle 13 Vergleich des homogenen Freisetzungsassay für Cotinin mit den assoziativen Assays Tobacco Screen® (ELISA) und NiMA (homogen), unter Verwendung einer 0,5 ug/ml Probe für alle Assays

11.2.5 Genauigkeit des Assays

Die homogenen Freisetzungs- und NiMA-Assays für Cotinin wurden auf einem COBAS MIRA auf ihre Genauigkeit untersucht, wobei negative, 0,5 ug/ml und 2 ug/ml Urinproben verwendet wurden (Tabelle 14). Die Genauigkeit wird verwendet, um den Variationskoeffizienten bei wiederholten Tests mit derselben Probe zu ermitteln. Der Freisetzungsassay zeigte eine um mehr als das zweifache Verbesserung der Genauigkeit gegenüber dem assoziativen Assay. Obwohl die Konzentration der Reaktanden 17-fach höher waren als bei NiMA, zeigte der Freisetzungsassay eine bessere Genauigkeit. Tabelle 14. Genauigkeit der homogenen Freisetzungs- und assoziativen NiMA- Assays für Cotinin. Die angegebenen Ergebnisse beziehen sich auf die Reaktionsrate in mA/min. Freisetzungsassay NiMA

11.3. Diskussion

11.3.1. heterogenes Format

Eine Vertiefung für einen ELISA-Freisetzungsassay enthält weniger als 1/5 der Antikörper, die in konventionellen ELISA-Assays genutzt werden. Als Folge wird die Empfindlichkeit gesteigert, da die nichtspezifische Aktivität abnimmt. Die Empfindlichkeit wird auch durch die fast 10-fach höhere Enzymaktivität des freigesetzten, mit Peroxidase markierten Antikörpers verstärkt.
Beim ELISA-Format reduziert dieser Endpunkt des Freisetzungsassays die Zeit für den Assay von 1,5 Stunden auf unter 15 Minuten (2 Minuten für die Freisetzungreaktion und 10 Minuten für die TMB-Farbentwicklung). Die Zeit könnte weiter verkürzt werden, indem beispielsweise die Assayschritte in der Weise automatisiert werden, daß eine zeitbestimmte Reaktion auf einem automatisierten Gerät durchgeführt wird. Der Freisetzungsassay verringert auch die für den Assay erforderlichen Schritte um mindestens die Hälfte. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Freisetzung ein positives Signal bei Anwesenheit des Analyten erzeugt.

11.3.2. homogenes Format

Beim homogenen Assayformat wird die Empfindlichkeit durch die Tatsache weiterverbessert, daß ein freigesetzter, mit Peroxidase markierter Antikörper eine weit höhere Aktivität zeigt, als das Enzym auf der Platte. Dies bedeutet, daß man, wenn man den freigesetzten, an Peroxidase konjugierten Antikörper sowie den auf der Platte verbleibenden mißt, erkennen kann, daß ein Abfall der Absorption der Platte um 0,1 O. D. einen Ansteig um 2,0 O. D. im Überstand bewirken kann. Diese 10-. bis 20-fache Verstärkung der Aktivität des freien Enzyms ist vermutlich zu einem erheblichen Teil auf die Abnahme von Diffusionseffekten bei der Reaktionsrate des freigesetzten Enzyms zurückzuführen.
Der Bereich des Freisetzungsassays ist erweitert, weil der Freisetzungsassay ein System ist, das vom Gleichgewicht ausgeht. Es ist daher möglich, höhere Anfangskonzentrationen des Enzymkomplexes zu verwenden, ohne das Rauschen zu erhöhen oder Empfindlichkeit im niedrigen Bereich zu verlieren. Bei konventionellen Immunoassays verändert die Zugabe von zusätzlichem Reagenz die Empfindlichkeit des Assays, indem die Gleichgewichtsbedingungen zu Ende der Reaktion verschoben werden. Die Enzymkonzentration der betrachteten Freisetzungsassays betrugen 0,50 ug/ml im Vergleich zu 0,03 ug/ml bei konventionellen homogenen (assoziativen) Assays. Die konventionellen Assays wiesen jedoch ein 8-fach größeres Antikörper: Enzym Verhältnis auf als der Freisetzungsassay. Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern wird das Verhältnis von Antikörper und Enzym beim Freisetzungsformat weiter verbessern. Das Verhältnis von Antikörper zu Enzym bestimmt die Empfindlichkeit des Assays.
Während andere Assaysysteme, die die Dissoziation vorgebildeter Antikörper-Ligand Komplexe umfassen (Cocola et al., 1979, Analytical Biochem. 99 : 121-8, Hinds et al., 1984, Chin. Chem. 30 : 1174 - 8; Hinds et al., 1985, Chin. Chem. Acta 149 : 145 - 15), kompetitive Liganden als Bindungspartner genutzt haben, ist der Freisetzungsassay ein nicht-kompetitives System. Dies wird oben durch Tabelle 12 gezeigt, wo der Freisetzungs-Ligand (bzw. Reland) nicht den Antikörper aus dem Antikörper-Ligand Komplex verdrängen kann. Von Bedeutung ist auch, daß anders als beim erfindungsgemäßen Freisetzungsassay die von Cocola et al., Hinds et al., 1984 und Hinds et al., 1985 (siehe oben) beschriebenen kompetitiven Dissoziationsassays keine wesentliche Verbesserungen gegenüber den assoziativen Verfahren bei Immunoassays gebracht haben. Obwohl die vorliegende Erfindung nicht an irgendeine Theorie gebunden ist, nehmen wir an, daß der Antikörper über eine sehr schwache Affinitätswechselwirkung an den Freisetzungs-Liganden gebunden ist und daß in Abwesenheit eines Bindungspartners mit höherer Affinität der Antikörper eine Änderung in der Konformation zu einem metastabilen Komplex erfährt, der freisetzbar ist und für die Freisetzung eine über die Zeit stabile Affinitätskonstante besitzt. Der Komplex kann zu stabil werden, wie dies bei konventionellen Ligandkonjugaten beobachtet wird. N-Isopropyl-norcotinin wurde gewählt, um eine räumlich anspruchsvolle Gruppe an einer immunologisch unkritischen Stelle zur Verfügung zu haben, um nach der Gleichgewichtseinstellung eine Dissoziation zu ermöglichen.
Die schnelle Dissoziation des Reland-Komplexes in Gegenwart eines Liganden kann analog zum Turn-over bei der Katalyse durch Antikörper erfolgen (Benkovic et al., 1990, Science 250 : 1135 - 8) bei der ein Antikörper, der gegen ein Substrat mit der Konformation eines Übergangszustands hergestellt wurde, ein Substrat bindet, die Konformation des Übergangszustandes im Substrat induziert und dann das gespaltene Substrat rasch freisetzt, da das Produkt nicht mehr im Übergangszustand erscheint.

11.3.3. Kreuzreaktivität

Der Freisetzungsassay ist gegenüber Kreuzreaktivität weniger empfindlich. Wichtiger ist jedoch, daß er nicht den synergistischen Effekten der Kreuzreaktivität unterliegt, die bei konventionellen Immunoassays beobachtet wurden. Wir haben diese synergistische Verstärkung der Störwirkung bei anderen konventionellen Immunyassayformaten beobachtet. Dies kann ein allgemeines Phänomen darstellen und vielleicht muß jede Kreuzreaktivität als prozentualer Anteil der Kreuzreaktivität in Gegenwart des Analyten bei einer Bindungsrate von 50% angegeben werden, so daß der wahre Beitrag zum Assay abgeschätzt werden kann.

11.3.4. Genauigkeit des Assays

Die beim erfindungsgemäßen Freisetzungsassay beobachtete zweifache Verbesserung der Genauigkeit ist vermutlich auf mehrere Faktoren zurückzuführen: Das Ausgangssystem befindet sich im Gleichgewicht und nur eine Reaktion - Dissoziation - tritt auf, und die Matrix hat weniger Einfluß auf die Reaktion, wie dies aus der niedrigeren Kreuzreaktivität ersichtlich ist.

11.4. Schlußfolgerung

Wir haben ein Assayverfahren entwickelt, welches die Fähigkeit von Antikörpern nutzt, eine induzierte Paßform mit einem Bindungspartner einzugehen, zu dem sie eine niedrige Affinität aufweisen, dem Freisetzungs-Liganden bzw. dem Relanden. Der Freisetzungsassay stellt einen vorgeformten Rezeptor-Reland Komplex zur Verfügung, der in Gegenwart von Analyt schnell dissoziieren kann. Das Freisetzungssystem kann für alle Immunoassayformate verwendet werden. Der Freisetzungsassay hat inhärente Vorteile gegenüber konventionellen oder assoziativen Assays:
1. durch Eliminierung eines Schrittes bei der Immunreaktion spart der Freisetzungsassay Zeit und Arbeitsschritte und vermeidet mögliche Fehlerquellen, wodurch die für den Assay erforderliche Zeit verringert und die Durchführung des Assays vereinfacht wird.
2. Die Freisetzung, d. h. die Dissoziation wird inhärent weniger von Wechselwirkungen beeinflußt, wodurch diese genauer wird.
3. Die Fähigkeit, alle Antikörper im Assay nutzen zu können, verringert das Rauschen und ermöglicht einen 1.000-10.000-fach größeren Empfindlickeitsbereich. Diese Methodologie, die Nutzung empfindlicherer Marker, vergrößert den theoretisch zugänglichen Bereich sowohl nach oben wie auch nach unten im Vergleich zudem bei konventionellen Formaten zugänglichen Bereich. Die Zugabe weiterer Reaktanden verringert nicht wie bei konventionellen Assayformaten die Empfindlichkeit, sondern vergrößert den oberen Bereich der Empfindlichkeit.
4. Ein wichtiger Vorteil des Freisetzungsassays sind die milden Bedingungen, unter denen die Dissoziation erfolgt. Dies ermöglicht es, die feste Phase oder den Komplex zu regenerieren. Dies sollte die Möglichkeiten für Biosensoren verbessern. Ein Hauptproblem bei Biosensoren besteht darin, daß die feste Phase gewöhnlich verworfen wird; beim Freisetzungsassay kann die feste Phase kontinuierlich regeneriert werden.
5. Der große Bereich, die positive Korrelation mit der Anwesenheit des Analyten, und das geringe Rauschen des Systems deutet darauf hin, daß das Freisetzungsassayformat dazu verwendet werden kann, nach vielen Analyten in einer Reaktionsmischung zu suchen.

12. Beispiel: Freisetzungsassay für einen Kokainmetaboliten

Benzoylecgonin ist ein Metabolit des Kokains. Freisetzungsassays, die den Nachweis von löslichem Benzoylecgonin in einer Probe ermöglichen, sind unten beschrieben. Insbesondere kann die Freisetzung eines mit einem Enzym markierten Antikörpers gegen Benzoylecgonin im Überstand der Lösung des Assays nachgewiesen werden, wenn freies Benzoylecgonin vorhanden ist. Das folgende Beispiel zeigt einen wirksamen Freisetzungsassay für Benzoylecgonin. Zwei Assayparameter, die Wirkung der relativen Menge an Antikörper-Label-Konjugat, das auf einer mit einem Ligand-Protein Komplex beschichteten Platte inkubiert wird und die Inkubationszeit nach der Zugabe der Probe, auf den Nachweis des freigesetzten Labels wurden untersucht.

12.1. Materialien und Verfahren

Unter Verwendung von Standardtechniken wurde Ecgonin an BGG über einen räumlich anspruchsvollen Linker (p-Aminobenzoesäure) konjugiert. Das anti- Benzoylecgonin-Peroxidasekonjugat wurde unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt.

12.1.1. Titration des Konjugats

Mikrotiterplatten wurden mit Benzoylecgonin-BGG Ligand beschichtet. Nach dem Waschen wurden 100 ul Antikörper-Peroxidasekonjugat in jede Vertiefung bei einer Verdünnung von entweder 1 : 500 oder 1 : 1000 gegeben und bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert und zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Benzoylecgonin(BE)-Standardlösungen (100 ul) wurden zu den einzelnen Vertiefungen gegeben. Das Benzoylecgonin war in den folgenden Konzentrationen in destilliertem Wasser oder Urin vorhanden: 0, 0,025, 0,3 und 5,0 ul/ml. Nach Zugabe der Probe wurden die Platten unter Bewegen 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 100 ul des Überstands zu weiteren Vertiefungen auf einer unbeschichteten Mikrotiterplatte gegeben. Zu jeder Vertiefung mit dem Überstand aus dem Assay wurden 100 ul 2x TMB-Substratlösung gegeben. Die Platten wurden 6 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 N H&sub2;SO&sub4; zu jeder Vertiefung gestoppt. Die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Plattenlesegerät gemessen.

12.1.2. Assay für den Einfluß der Inkubationszeit und der Matrixzusammensetzung

Das oben beschriebene Verfahren (Abschnitt 12.1.1.) wurde durchgeführt. Um die Auswirkung der Matrixzusammensetzung zu untersuchen, wurden Standards in synthetischem Urin mit entionisiertem Wasser verdünnt. Um die Auswirkung der Inkubationszeit zu testen, d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um die Freisetzung des markierten Antikörpers nachzuweisen, wurden mit Peroxidase markierte anti-Benzoylecgonin, Ecgonin-BGG-beschichtete Platten 0, 2 und 10 Minuten nach der Zugabe von freiem Benzoylecgonin inkubiert, ehe der Überstand auf eine saubere Mikrotiterplatte überführt wurde.

12.2 Ergebnisse

Freies Benzoylecgonin in einer Probe bewirkte eine Freisetzung von Antikörper- Peroxidase-Konjugat. Die Menge des freigesetzten Konjugats korrelierte mit der Menge an auf die mit Benzoylecgonin-BGG beschichtete Platte gegebenen Konjugats, sowie mit der Menge an in der Probe vorhandenem Analyt (Tabelle 15). Daher wird bei der Inkubation einer 1 : 500 verdünnten Lösung mehr Konjugat freigesetzt als bei einer 1 : 1.000 verdünnten Lösung. Tabelle 15. Freisetzung von anti-Benzoylecgonin-Peroxidase aus einer mit Ecgonin- PABA-BGG beschichteten Platte.
Die Matrixeffekte sind auch aus den Daten in Tabelle 15 entnehmbar. Insbesondere erscheint die Freisetzung in Wasser wirksamer zu sein als in Urin. Diese Ergebnisse wurden erwartet, da bekannt ist, daß die Matrix Reaktionen zwischen Antikörper und Antigen beeinflußt. Dennoch wird die relative Freisetzung des Antikörper-Enzym- Konjugats von der Zusammensetzung der Matrix nicht beeinflußt. Diese Beziehung wird sichtbar, wenn das Verhältnis der A&sub4;&sub5;&sub0; bei Anwesenheit von freiem Benzoylecgonin zum Leerwert der A&sub4;&sub5;&sub0; für jede Matrix verglichen wird (Fig. 12). Es scheint, daß die Matrixeffekte von der Inhibierung des Enzyms durch Komponenten des Urins verursacht werden und es scheint, daß dies die Menge an freigesetztem Antikörper-Enzym-Konjugat nicht beeinflußt.
Die Inkubationszeit scheint nur minimale Auswirkungen auf die Enzymaktivität im Überstand zu haben, wie dies graphisch gezeigt ist (Fig. 13).

12.3. Diskussion

Diese Ergebnisse deuten an, daß die Freisetzung von markiertem Antikörper aus einer mit einem Liganden beschichteten Platte proportional zur Menge des auf die Platte gegebenen markierten Antikörpers ist.
Die Ergebnisse zeigen auch, daß während Effekte der Probenmatrix die absolute Aktivität des Enzymlabels im freigesetzten Überstand beeinflussen, dieser Effekt durch Normalisierung gegen eine Grundlinie einer Kontrollaktivität korrigiert werden kann. In Allgemeinen erlaubt die Normalisierung verschiedener Proben einen Vergleich und eine Quantifizierung des freien Liganden, in diesem Fall freies Benzoylecgonin, das in der Probe vorhanden ist.
Letztlich zeigen die Ergebnisse aus Fig. 13, daß die Freisetzung nahezu unmittelbar nach der Zugabe von freiem Liganden fast vollständig ist, was zeigt, daß der Freisetzungsassay mit sehr geringem zeitlichen Aufwand durchgeführt werden kann.

13. Beispiel: Freisetzungsassay auf mit Antikörpern beschichteten Membranen

In einer bestimmten Ausführungsform kann die Anwesenheit eines löslichen Analyten durch die Freisetzung eines markierten Liganden aus einem mit einem Antikörper beschichteten Festphasenträger, z. B. einer Membran, nachgewiesen werden. Dieses Beispiel zeigt die Freisetzung von markiertem Ecgonin aus einem Komplex mit einem auf einer festen Phase gebundenen Antikörper, der spezifisch für Benzoylecgonin ist.

13.1. Materialien und Verfahren

13.1.1. markierter Ligand

Ecgonin wurde über einen Spacer an alkalische Phosphatase gebunden. In 20 ml DMSO (Sigma) wurden 40 mg Ecgonin (Alltech), 32 mg N-Hydroxysuccinimid (Sigma) und 56 mg 1-Ethyl-(3-aminopropyl)carbodiimid (Pierce) bei Raumtemperatur für 4 Stunden gelöst. Eine Lösung von 25 mg N-(4- Aminobenzyl)-6-aminocapronsäure (Aldrich) in 0,5 ml DMSO wurden zu 2,0 ml 0,2 M Natriumhydrogencarbonat pH 7,8 gegeben und diese Mischung zur Lösung des aktivierten Ecgonin gegeben. Die sich ergebende Lösung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und über Nacht bei 4ºC aufbewahrt. Zu 1 ml der aktivierten Ecgonin-Linkerlösung wurden 0,3 ml einer Lösung von 10 mg/ml N-Hydroxysuccinimid und 16,7 mg/ml 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino)carbodiimid (Sigma) in DMSO gegeben und die sich ergebende Lösung für 4 Stunden bei Raumtemperatur bewegt. Zu 1 ml einer Lösung von 1 mg/ml alkalischer Phosphatase (Biozyme ALPI IIG, 1650 Ulmg) wurden 0,65 ml des aktivierten Ecgonin-Linkers gegeben und die Mischung für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann bei 4ºC über Nacht aufbewahrt. Das Produkt wurde in der Kälte für 8 Stunden gegen 0,5 M Carbonatpuffer, pH 7,8 dialysiert, wobei die Dialyseflüssigkeit alle 4 Stunden gewechselt wurde.

13.1.2. Assay mit mit Antikörper beschichteter Latexmembran

Es wurde eine Suspension von 0,5 ml Polystyrol Latexpartikeln, 0,776 um (IDC) in 3,5 ml Phosphatpuffer pH 7,5 hergestellt. Ziege anti Kaninchen IgG, Fc Fraktion, wurde auf 0,5 mg/ml in Phosphatpuffer (0,2 ml auf 4 ml) verdünnt. Die beiden Mischungen wurden durch Inversion vereinigt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert und dann bei 4ºC aufbewahrt. 1 ml dieser Latexpräparation wurde für 5 Minuten bei 3.000 UpM zentrifugiert, mit 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen und wiederum zentrifugiert. Die Latexpartikel wurden in 5 ml Phosphatpuffer, der 0,1% Tween 20 enthielt, suspendiert. 55 ul Kaninchenantikörper gegen Benzoylecgonin wurden mit 5 ml des Tween/Phosphatpuffers verdünnt und zur Latexsuspension gegeben. Die Mischung wurde vorsichtig bei Raumtemperatur für 60 Minuten vermischt. Sie wurde dann für 5 Minuten bei 3.000 UpM zentrifugiert, zweimal mit Tween/Phosphatpuffer gewaschen, wobei jeweils zentrifugiert und wieder suspendiert wurde. Die Präparation wurde in Tween/Phosphatpuffer, der 0,1% Natriumazid enthielt, suspendiert.
Die Membranen wurden hergestellt, indem 0,45 u Filtermembranen mit 80 ul Tween/Phosphatpuffer getränkt wurden und 20 ul anti- Benzoylecgonin beschichtetes Latex zugegeben und absorbiert wurden. Dann wurden 10 ul des markierten Ecgonin zu jedem Latexpunkt gegeben. Die Membranen wurden für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, damit sich ein stabiler Rezeptor-Ligand- Komplex ausbilden konnte und anschließend dreimal mit Phosphatpuffer, der 0,1% Tween 20 enthielt, gewaschen. Die Probe oder der Standard (100 ul) wurde zugegeben und die Membran für 10 Minuten unter Bewegen bei Raumtemperatur inkubiert. Der Test wurde im Allgemeinen als visueller Test durchgeführt, indem das Substrat direkt auf die Membran gegeben wurde, wo es freigesetzten Ligand-Enzym- Proben wegwusch. Verringerte Farbintensität wurde in Beziehung zur Benzoylecgoninkonzentration in der Probe gesetzt.
Um die Freisetzung quantifizieren zu können, wurde die flüssige Phase (Überstand) durch Filtration gesammelt und Aliquots von 50 ul in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben. Zu jeder Vertiefung wurden 100 ul p-Nitrophenylphosphat (Sigma) in Diethanolaminpuffer pH 9,7 gegeben und die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.

13.2. Ergebnisse

Die Ergebnisse dieses Assays sind in Tabelle 16 gezeigt.

Tabelle 16. Enzymaktivität in der flüssigen Phase

Benzoylecgoninkonzentration (ug/ml) A&sub4;&sub0;&sub5;
0 0,214
5 0,352
Diese Ergebnisse zeigen die Freisetzung von Ecgonin-Linker-alkalische Phosphatase aus der Antikörperpräparation, wenn freies Benzoylecgonin in der Probe vorhanden ist.

14. Beispiel: Freisetzungsassay für Tetrahydrocannabinol (THC)

Es wurde ein Festphasen-Membranassay hergestellt, der vergleichbar ist mit dem oben in Abschnitt 13 beschriebenen, mit dem der Nachweis von Tetrahydrocannabinol, der aktiven Hauptkomponente von Marihuana, möglich ist.

14.1 Materialien und Verfahren

14.1.1. Herstellung der Membranen

Es wurden polyklonale Antikörper (Schaf) gegen THC verwendet. Mit Ammoniumsulfat gereinigte Antikörper, 13 mg/ml in 0,5 M Carbonatpuffer pH 9,3 in einem Volumen von 3 ul wurden auf 5 mm Scheiben von Gelman KV3000 ultrabind- Membranen absorbiert. Die Scheiben wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet und dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1% (wlv) Rinderserumalbumin in Carbonatpuffer behandelt. Überschüssiges Albumin wurde durch Aspiration entfernt und die Membranen für 10 Minuten mit einem Puffer gewaschen, der 2% (w/v) Glucose und 0,01% (w/v) 2,6-di-tert. Butyl-4-methylphenol (BHT) (Aldrich) in 0,5 M Carbonatpuffer pH 9,3 enthielt. Die Scheiben wurden bei Raumtemperatur getrocknet und bei 4ºC gelagert.

14.1.2. Herstellung des Liganden

2 mg 9-Carboxy-11-nor-delta-9-tetrahydrocannabinol (THC)wurden in 0,2 ml Dimethylsulfoxid gelöst und 0,74 mg N-Hydroxysuccinimid zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 2 Stunden reagiert hatte, wurden 0,5 ml der Mischung zu 5 mg alkalischer Phosphatase in 3 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gegeben. Die gesamte Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

14.1.3. Durchführung des Assays

Scheiben, die 3 ul des anti-THC Antikörpers in einer 1 : 10 Verdünnung enthielten, wurden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte plaziert. Zu diesen Scheiben wurden 100 ul des THC-alkalische Phosphatase Liganden in einer Verdünnung von 1 : 2000 gegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Um die Auswirkung verschiedener Komponenten auf die Stabilisierung des trockenen Rezeptor-Ligand Komplexes abzuschätzen, wurden verschiedene Formulierungen verwendet, um den Komplex vor dem Trocknen zu waschen. Die Vertiefungen wurden mit Tris-Puffer gewaschen, der 0,1% Tween 20 enthielt, oder mit Tris-Puffer, der Glucose enthielt. Die Scheiben wurden dann getrocknet und 200 ul eines Standards, der 0 oder 10 ug/ml THC enthielt, zu den Scheiben in den Vertiefungen gegeben. Der Assay konnte dann visuell ausgelesen werden, indem ein Substrat auf die Membran gegeben wurde und eine bestimmte Abschwächung der Färbung beobachtet wurde, wenn THC eine Freisetzung bewirkte. Die Reaktion konnte auch quantifiziert werden, wie dies im weiteren beschrieben wird. Die Platten wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 100 ul des Überstandes aus jeder Vertiefung in die Vertiefungen einer weiteren sauberen Mikrotiterplatte überführt.
Zu jeder Vertiefung der weiteren Mikrotiterplatte wurden 100 ul p-Nitrophenylphosphat (Sigma) gegeben. Die Platten wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann die Absorption bei 405 nm gemessen.
Die verbleibende Inkubationsmischung des an die Festphase gebundenen Antikörpers und des Konjugats wurde für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und 100 ul dieses Überstandes in weitere Vertiefungen sauberer Mikrotiterplatten überführt. Zu jeder Vertiefung wurden 100 ul p-Nitrophenylphosphat gegeben und die Platten für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Absorption bei 405 nm gemessen.

14.2. Ergebnisse

Die Ergebnisse dieses Assays sind in Tabelle 17 aufgeführt. Tabelle 17 Freisetzung von markiertem THC-alkalische Phosphatase Konjugat als Funktion der Stabilität des freisetzbaren Komplexes
Diese Ergebnisse zeigen die Optimierung der Inkubationszeit und der Formulierung des Waschpuffers bei der Freisetzung des THC: alkalische Phosphatase-Konjugats aus an Membranen gebundenen Antikörpern. Insbesondere die Gegenwart von Glucose im Waschpuffer verbessert die Aktivität des freigesetzten Enzyms im Überstand. Besonders wichtig ist, daß diese Ergebnisse auf die Bevorzugung des Analyten in der Probe durch den Antikörper hinweisen, und so einen wirksamen Freisetzungsassay für THC aufzeigen.
Es sollte noch darauf hingewiesen werden, daß die auf den Membranen beobachtete Freisetzungsreaktion weit deutlicher ausfiel.

15. Beispiel Freisetzungsassay für Betablocker

Es wird ein homogener Freisetzungsassay für Betablocker aufgezeigt. Der Nachweis von Betablockern ist nützlich für die Beobachtung von Patienten, die mit diesen Medikamenten behandelt werden. Insbesondere wurde die Stabilität des Antikörperkomplexes mit dem Liganden getestet.

15.1. Materialien und Verfahren

15.1.1. Ligand: Analyt-Enzym-Konjugat

Atenololsäure (2[p-[2-Hydroxy-3-(isopropyl-amino)propoxy]phenoxy]essigsäure) (6,5 mg) (Imperial Chemical Industries) wurden in 0,125 ml 0,1 M Natriumcarbonat mit Hilfe von 0,015 ml 1 N HCl aufgelöst. Nach dem Auflösen wurden 0,1 ml entionisiertes Wasser und 0,25 ml Dimethylsulfoxid zugegeben, gefolgt von 6 mg N- Hydroxysuccinimid und 10 mg EDC. Die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. In ein Glasröhrchen wurden 1 ml 0,1 M Natriumcarbonatpuffer pH 9,0 und 2,8 mg Glucose-6-phosphatdehydrogenase gegeben; nach dem Auflösen wurden 20 mg reduziertes Nicotinadenindinucleotid (NADH), 10 mg Glucose-6-phosphat und 0,3 ml Carbitol [2-Ethoxyethoxy)ethanol] zugegeben. Diese Mischung wurde für 1 Stunde bei 4ºC gehalten.
140 ul des aktivierten Atenolol wurden während 90 Minuten in Aliquots von 10 ul in das Glucose-6-phosphatdehydrogenasereaktionsgefäß gegeben. 15 Minuten nach der letzten Zugabe wurde das Material in einen Dialysebeutel überführt und über Nacht in der Kälte gegen 2 l 0,05 M Tris-HCl pH 7,9 dialysiert. Am nächsten Tag wurde die Dialyse für 8 Stunden fortgesetzt, wobei die Flüssigkeit dreimal gewechselt wurde.

15.1.2. Assaysystem

Reagenz A (160 ul) wurde aus 1 ul Antiserum (Kaninchen) gegen 4-Hydroxypropanolol und 12 ul 0,11 M Glucose-6-phosphat in 0,05 M Trispuffer, pH 7,9, 3,3 mM Magnesiumchlorid hergestellt.
Reagenz B (30 ul) wurde aus 10 ul Konjugat in einer Verdünnung von 1 : 500 und 8 ul 0,1 M Nicotinadenindinucleotid in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,9 hergestellt.
A und B wurden für 10 Sekunden vermischt und 10 ul der Probe oder des Standards zugegeben, gefolgt von erneutem Mischen für 10 Sekunden. Die Mischung wurde für die angegebenen Zeiten bei 37ºC inkubiert und die Absorption bei 340 nm gemessen.

15.2. Ergebnisse

15.2.1. Stabilität des Antikörper-Konjugat Komplexes

Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Stabilität des Antikörper/Betablocker-Enzym Komplexes zu bestimmen.
Der Komplex wurde aus 1,41 ml 0,05 M Tris-HCl, pH 7,8, 10 ul unverdünntem Antikörper, 80 ul 0,1 M NAD und 100 ul Konjugat mit einer Konzentration von 2 mg/ml hergestellt und für die angegebenen Zeiten bei Raumtemperatur gehalten. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben, die freies 4-Hydroxypropanolol enthielten, zu Aliquots des Komplexes gegeben und die Mischung für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reagenz, das Glucose-6-phosphat enthielt, wurde anschließend zugegeben und die Absorption bei 340 nm während einer Dauer von 20 Minuten gemessen. Tabelle 18. Änderung der OD nach unterschiedlichen Inkubationszeiten des Rezeptor-Ligand Komplexes ¹
¹ Bei diesem Assay betrug die Zeit für die Freisetzung 5 Minuten und die Meßzeit betrug 20 Minuten
² Steigung und Achsenabschnitt wurden nach der Methode der kleinsten Quadrate bestimmt.
Die ähnlichen Werte bei der Statistik der Reaktionen in Tabelle 18 zeigen, daß der Antikörper/Ligand-Enzym Komplex bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden stabil verblieb und während dieser Zeit in Anwesenheit eines freien Analyten eine wirksame Freisetzung bewirkt werden konnte.

15.2.2. Optimierung der Zeit für die Freisetzung und die Messung

Zusätzlich zum Nachweis, daß das Antikörper/Ligand-Enzym Konjugat für zumindest 2 Stunden stabil verblieb, wurde der Assay auf die Zeit für die Freisetzung hin optimiert, d. h. die Zeit nach der Zugabe der Probe und des NAD-Substrats und vor der Messung der Änderung der OD, sowie auf die optimale Meßzeit, d. h. die Zeit von Beginn bis zum Ende der Messung der Änderung der OD. Die Ergebnisse dieser Optimierungsassays sind in den Tabellen 19 und 20 aufgeführt. Tabelle 19. Optimierung der Zeit für die Freisetzung¹
¹ Die Antikörper/Ligand-Enzym Komplexe wurden vor Zugabe der Probe 10 s inkubiert; mOD/Min (Rate der Änderung der Absorption wurde für 10 Minuten gemessen
² Steigung und Achsenabschnitt wurden nach der Methode der kleinsten Quadrate berechnet. Tabelle 20. Optimierung der Auslesezeit¹
¹ Die Antikörper/Ligand-Enzym Komplexe wurden vor Zugabe der Probe 10 s inkubiert; die Zeit für die Freisetzung betrug bei diesem Assay 5 Minuten.
² Steigung und Achsenabschnitt wurden nach der Methode der kleinsten Quadrate ermittelt.
Unter den Bedingungen dieses Assays ergibt eine Zeit für die Freisetzung von 5 Minuten und eine Meßzeit für die Reduktion von NAD von 10 Minuten die besten Ergebnisse, bei den besten Werten für Steigung und Achsenabschnitt.

16. Beispiel: homogener Freisetzungsassay für Thiazide

Thiazide sind eine Klasse von Diuretika, das bekannteste von ihnen ist Hydrochlorothiazid. Der Nachweis von Thiaziden ist für die medizinische Behandlung wichtig, insbesondere in Nolfallsituationen.

16.1 Materialien und Verfahren

16.1.1. Ligand: Thiazid-Glucose-6-Phosphat Konjugat

Das Ligand-Enzym Konjugat wurde wie folgt hergestellt: 15 mg Hydrochlorothiazid wurden in 0,5 ml 5 N Natriumhydroxid gelöst und für 30 Minuten in kochendem Wasser erwärmt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 1 ml 6 N HCl angesäuert. Das Röhrchen wurde in ein Eisbad gestellt und 0,5 ml 0,2 M Natriumnitrit zugegeben. Die Mischung wurde für 10 Minuten bei 0ºC gehalten und dann 0,5 ml 7% Ammoniumsulfat zugegeben.
Der pH der Mischung wurde mit 100 ul 0,5 M Natriumcarbonat auf 5 bis 6 angehoben. In einem Eisbad wurden 280 ul der Mischung unmittelbar mit 2,8 g Glucose-6-phosphatdehydrogenase in 1 ml 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,0 gemischt, der 10 mg Glucose-6-phosphat und 300 ul Carbitol enthielt, und für 30 Minuten bei 0ºC gehalten. Die Reaktionsmischung wurde dann gegen 0,05 M Tris-Puffer pH 7,8 für 24 Stunden bei 2-8ºC dialysiert, wobei der Puffer viermal ausgetauscht wurde.

16.1.2. Assay

Reagenz A (160 ul) bestand aus anti-Thiazid Antikörper (Kaninchen), 1 ul, in 147 ul Tris-HCl pH 7,8 und 12 ul 0,11 M Glucose-6-phosphat. Reagenz B (22 ul) bestand aus 10 ul Konjugat in einer Verdünnung von 1 : 250 in 12 ul Tris-HCl Puffer pH 7,8 und enthielt 3 mM Magnesium. Die Reagentien A und B wurden gemischt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Probenzugabe erfolgte in Volumen von 10 ul. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur für 3 Minuten fortgesetzt und dann 8 ul 0,1 M NAD zugegeben. Die Absorption wurde bei 340 nm über 10 Min. gemessen.

16.2 Ergebnisse

Freies Hydrochlorothiazid in der Probe bewirkte eine Freisetzung des Antikörpers aus dem Ligand-Enzym Konjugat, was zu einer dramatischen Verschiebung in der Rate der Änderung der Absorption führte. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 21 zusammengefaßt.

Tabelle 21 Thiazid Freisetzungsassay

Hydrochlorothiazidkonzentration (ug/ml) Rate der Änderung der Absorption (mAU/Min.)
0,1 0,030
1,0 9,501
10 15,399

17. Beispiel: Identifikation eines Analogen von Cotinin mit niedriger Affinität durch seine Fähigkeit zur Verdrängung

Der zweite wesentliche Urinmetabolit von Nikotin, trans-3-Hydroxycotinin, wurde auf seine Fähigkeit untersucht, Cotinin im Immunoassay zu verdrängen, wozu ein gegen Carboxycotinin erzeugter Antikörper verwendet wurde.

17.1 Materialien und Verfahren

Trans-Hydroxycotinin oder Cotinin wurden zu einer synthetischen Urinmatrix in Mengen von 0,1 bis 5 ug/ml gegeben und mit ELISA auf Cotinin getestet, eine Mischung von Cotinin und trans-Hydrocxycotinin im Verhältnis 1 : 3 wurde ebenfalls getestet.

17.2 Ergebnisse

Trans-Hydroxycotinin zeigte nur 10% der Wirkung von Cotinin bei der Inhibierung der Bindung in einem Cotinin-ELISA. Die verstärkte Bindung (größere absolute OD-Werte) in Gegenwart von Hydroxycotinin ist ein Effekt, der zuvor bei Inhibierungsassays mit Liganden niedriger Affinität beobachtet wurde.
Die mangelnde Wirksamkeit von Hydroxycotinin als Inhibitor kann auch aus der Inhibierungskurve bei einem Verhältnis von Cotinin zu Hydroxycotinin von 1 : 3 entnommen werden. Obwohl in dreifachem Überschuß vorhanden, wirkt die Kombination von Cotinin und Hydroxycotinin schwächer inhibierend als Cotinin allein. Es wird keine zusätzliche Inhibierung durch Hydroxycotinin beobachtet.

17.3. Diskussion

Der Cotininmetabolit trans-Hydroxycotinin, der sich von Cotinin nur durch die Gegenwart einer Hydroxylgruppe am C-3' in trans-Orientierung unterscheidet, bindet mit wesentlich geringerer Affinität an einen Antikörper gegen Cotinin als Cotinin selbst. Diese Eigenschaft ist für einen nützlichen Freisetzungs-Liganden erforderlich und tatsächlich wurde gefunden, daß Liganden, die mit trans-Hydroxycotinin hergestellt worden waren, in Assays für Cotinin verwendet werden können (siehe oben, Abschnitt 6.11.).
Das Phänomen einer verstärkten Bindung, d. h. höheren absoluten OD-Werten, in Gegenwart eines Analogen mit niedriger Affinität ist nicht genau verstanden. Dies kann auf die Inhibierung kreuzreaktive Antikörper zurückzuführen sein. Dennoch weist die Verstärkung der Bindung in Gegenwart niedriger Konzentrationen eines potentiellen Inhibitors auf einen für Freisetzungsassays verwendbaren Liganden mit niedriger Affinität hin.

18. Verwendung von Niedrig-Affinitätschromatographie zur Isolierung von Antikörpern

Die Verwendung von Liganden mit niedriger Affinität zur Chromatographie bei der Reinigung von Antiseren ist vorteilhaft, da Eluierung unter milden Bedingungen zu einer höheren Rückgewinnung von Antikörpern führt. Derartige Antikörper finden insbesondere in Freisetzungsassays Verwendung.
Die Isolierung von Antikörpern gegen humanes Choriogonadotropin (nCG) wurde durchgeführt, indem eine Säule verwendet wurde, auf der ein Rohextrakt von gonadotropen Hormonen des Schafes kovalent gebunden worden war. Während diese Schafhormone in Menschen nicht biologisch aktiv sind und auch keine Kreuzreaktion zu anti-hCG eingehen, verbleibt doch genügend Sequenz erhalten, insbesondere mit luteinisierendem Hormon des Schafes(sLH), um zu ermöglichen, unter kontrollierten Bedingungen mit Antikörpern zu hCG wechselzuwirken.

18.1. Materialien und Verfahren

18.1.1. Herstellung der Affinitätssäule

Ein Rohextrakt von Schafgonadotropin aus der Hirnanhangsdrüse wurde an Sepharose gebunden, wozu 1 g mit Bromcyan aktivierte Sepharose 4B verwendet wurde. Das Gel wurde in in 1,6 ml 0,1 M Carbonatpuffer pH 8,0 gegeben, der 0,5 M Natriumchlorid enthielt. Es wurden 24 mg des Rohextraktes zugegeben und das Material für 3 Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Das Gel wurde zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Gel in 0,01 M Tris-Puffer pH 8,0 suspendiert und bei 4ºC über Nacht aufbewahrt.
Das Gel wurde erneut zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Gel in 10 ml 0,01 M Tris-Puffer pH 8,0, der 0,2 M Glutaminsäure enthielt suspendiert. Diese Suspension wurde unter Mischen für 1 Stunde inkubiert. Das Gel wurde anschließend in eine 1 · 10 cm Säule gepackt und nacheinander mit 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,0, 0,5 M Natriumchlorid und 0,1 M Natriumcarbonatpuffer pH 8,0, der 0,5 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen. Die Säule wurde mit Phosphatpuffer pH 7,0 äqulibriert, der 0,5 M Natriumchlorid und 0,01% Natriumazid enthielt.

18.1.2. Affinitätschromatographie

Die Säule wurde übe Nacht bei 4ºC mit 1 ml normalem Kaninchenserum belegt und das Serum mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eluiert, gefolgt von Waschschritten mit den Puffern bei pH 4 und 8. 1 ml Kaninchenantiserum gegen hCG mit einem Titer von 1 : 100,000 wurde auf die Säule gegeben und 10 Minuten auf dieser belassen. Die Säule wurde nacheinander mit PBS pH 4 Puffer und pH 8 Puffer eluiert. Der Proteingehalt der aufgefangenen Fraktionen wurde nach der Lowrymethode bestimmt und die anti-hCG Aktivität mit einem kompetitiven Festphasen-Enzymimmunoassay.

18.2 Ergebnisse

Das Chromatogramm des Proteingehalts und der Antikörperaktivität ist in Fig. 14 gezeigt. Die Hauptmenge des Proteins wurde im Totvolumen der Säule eluiert, während der Hauptanteil der Antikörperaktivität kurz nach dem Totvolumen in den proteinarmen Fraktionen eluiert wurde. Ein kleinerer Proteinpeak wurde mit dem pH 4-Puffer eluiert und kein Protein wurde im pH 8-Puffer eluiert.
Der Titer der vereinigten Antiserumfraktionen betrug 1 : 91,200 und der Proteingehalt 2,7 mg, was einer Rückgewinnung der Aktivität von 91% entspricht, was weit größer ist, als die vorher in der Literatur für affinitätsgereinigten Antikörper berichteten Werte. Die spezifische Aktivität des Ausgangsserum betrug 2200 U/mg, während die der vereinigten gereinigten Fraktionen 37.000 U/mg betrug, was einer 17-fachen Reinigung entsprach.
Um zu zeigen, daß die Rückgewinnung des Antikörpers nach diesem Verfahren nicht von den Eigenschaften der Sepharose selbst abhängt, wurde eine Sepharose 4B Säule hergestellt und normales Kaninchenserum und -antiserum wie eben beschrieben aufgetragen und eluiert. Die gesamte Antikörperaktivität wurde zusammen mit dem Protein im Totvolumen eluiert; es wurde nichts auf der Säule zurückgehalten, um später eluiert zu werden.
Die für das Experiment verwendeten Antiseren zeigten nach der Affinitätschromatographie 10% Kreuzreaktivität zu sLH, dieser Anteil der Kreuzreaktivität veränderte sich nicht.

18.3. Diskussion

Die Reinigung von Antikörpern unter Verwendung von Analogen mit niedriger Affinität, die an ein Affinitätschromatographiegel gebunden waren, scheint eine wirksame Rückgewinnung von Antikörpern zu ermöglichen, ohne daß Denaturierung auftritt und bei erhöhter spezifischer Aktivität für das Antigen.
Das Schema der Affinitätsreinigung stellt auch ein Verfahren zur Verfügung, mit dem ein Analoges mit niedriger Affinität durch seine Fähigkeit identifiziert werden kann, die Eluierung eines spezifischen Antikörpers in einem milden Eluens zu verzögern. Nach dem oben beschriebenen Beispiel können Schaf-Gonadotropine als Liganden in einem Freisetzungsassay für hCG dienen.
Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang nicht auf die bestimmten Ausführungsformen beschränkt, die oben in den Beispielen beschrieben wurden. Dem Fachmann ist es ohne weiteres möglich auf der Grundlage der Beschreibung und der beigefügten Figuren, zusätzlich zu den hier beschriebenen andere Ausführungsformen der Erfindung zu finden. Solche Ausführungsformen fallen ebenfalls unter den Umfang der beigefügten Ansprüche.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, das umfaßt:

(a) das Inkontaktbringen einer Testprobe mit einem Rezeptor-Liganden- Komplex, der einen an einen Freisetzungs-Liganden gebundenen Rezeptor aufweist, der in der Lage ist, sich an einen Analyten zu binden, wobei der Freisetzungs-Ligand sich an den Rezeptor bindet mit einer Assoziationskonstanten von 1% oder weniger der Assoziationskonstanten des Analyten für den Rezeptor, und der Freisetzungs-Ligand mit dem Analyten nicht nachweisbar konkurriert für die Bindung an den Rezeptor; und

(b) die Bestimmung der Dissoziation des Freisetzungs-Liganden von dem Rezeptor als Maß für die Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Probe.

2. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, das umfaßt:

(a) die Bildung eines Rezeptor-Liganden-Komplexes, der einen an einen Freisetzungs-Liganden gebundenen Rezeptor aufweist, der in der Lage ist, sich an einen Analyten zu binden, wobei der Freisetzungs-Ligand sich an den Rezeptor bindet mit einer Assoziationskonstanten von 1% oder weniger der Assoziationskonstanten des Analyten für den Rezeptor, und der Freisetzungs- Ligand mit dem Analyten nicht nachweisbar konkurriert für die Bindung an den Rezeptor;

(b) das Inkontaktbringen einer Testprobe mit dem Komplex und

(c) die Bestimmung der Dissoziation des Freisetzungs-Liganden von dem Rezeptor, die positiv korreliert mit der Anwesenheit des Analyten in der Probe.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Bestimmung der Dissoziation erfolgt durch Messung eines Signals, das von einem Markierungsmittel abgegeben wird, das entweder mit dem Rezeptor oder mit dem Liganden assoziiert ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Markierungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus einem Enzym, einem Fluorophor, einem Chromophor, einem Latex-Teilchen, einem chemolumineszierenden Agens, einem Radioisotop, einem chelatbildenden Komplex, einem Farbstoff und kolloidalem Gold.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem es sich bei dem Analyten um Cotinin, Benzoylecgonin, Tetrahydrocannabinol, Betablocker oder Thiazide handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem es sich bei dem Rezeptor um eine Nucleinsäure, einen Antikörper, ein Antikörperbruchstück, einen Zelloberflächen-Antikörper-Rezeptor oder ein Zelloberflächen- Rezeptorbruchstück handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper handelt, der durch Niedrigaffinitäts-Chromatographie an einer mit dem Liganden konjugierten Kolonne gereinigt worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Ligand ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus einem Analyten-Analogon, einem Derivat, einer Modifikation oder einem Isomer davon.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Ligand oder Rezeptor an einem Festphasen-Träger irreversibel absorbiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Freisetzungs-Ligand ein Cotinin-Derivat mit einer aliphatischen Kette aus drei oder mehr Kohlenstoffatomen in der 1N-Position umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die aliphatische Kette in dem Cotinin-Derivat eine Propylgruppe ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die aliphatische Kette in dem Cotinin-Derivat eine Isopropylgruppe ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, bei dem das Cotinin- Derivat an ein Enzym konjugiert ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Enzym Glucose-6- phosphatdehydrogenase ist.

15. Kit zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, der umfaßt

einen vorher hergestellten Rezeptor-Freisetzungs-Liganden-Komplex, der einen an einen Freisetzungs-Liganden gebundenen Rezeptor umfaßt, der in der Lage ist, sich an einen Analyten zu binden, wobei sich der Freisetzungs- Ligand an den Rezeptor bindet mit einer Assoziationskonstanten von 1% oder weniger der Assoziationskonstanten des Analyten für den Rezeptor, und der Freisetzungs-Ligand mit dem Analyten nicht nachweisbar konkurriert für die Bindung an den Rezeptor, und

eine Einrichtung zur Bestimmung der Dissoziation des Komplexes und der Bindung des Rezeptors mit dem Analyten in Gegenwart des Analyten in der Probe.

16. Kit zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, der umfaßt

einen Rezeptor und einen Freisetzungs-Liganden zur Bildung eines Rezeptor- Freisetzungs-Liganden-Komplexes, wobei der Rezeptor in der Lage ist, sich an einen Analyten zu binden, wobei der Freisetzungs-Ligand sich an den Rezeptor bindet mit einer Assoziationskonstanten von 1% oder weniger der Assoziationskonstanten des Analyten für den Rezeptor, und der Freisetzungs- Ligand mit dem Analyten nicht nachweisbar konkurriert für die Bindung an den Rezeptor, und

eine Einrichtung zur Bestimmung der Dissoziation des Komplexes und zur Freisetzung des Rezeptors, die positiv korreliert mit der Anwesenheit des Analyten in der Probe.

17. Kit nach Anspruch 15 oder 16, worin der Freisetzungs-Ligand oder Rezeptor irreversibel an einem festen Träger absorbiert ist und die Bestimmungs- Einrichtung gefärbte Latexperlen umfaßt.

18. Kit nach Anspruch 15 oder 16, bei dem es sich bei dem Analyten um Cotinin, Benzoylecgonin, Tetrahydrocannabinol, Betablocker oder Thiazide handelt.

19. Kit nach Anspruch 15 oder 16, bei dem es sich bei dem Rezeptor um eine Nucleinsäure, einen Antikörper, ein Antikörperbruchstück, einen Zelloberflächen-Antikörper-Rezeptor oder ein Zelloberflächen-Rezeptorbruchstück handelt.

20. Kit nach Anspruch 19, worin der Rezeptor ein Antikörper ist, der durch Niedrigaffinitäts-Chromatographie an einer mit dem Liganden konjugierten Kolonne gereinigt worden ist.

21. Kit nach Anspruch 15 oder 16, worin der Freisetzungs-Liganden ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus einem Analyten-Analogon, einem Derivat, einer Modifikation oder einem Isomer davon.

22. Kit nach Anspruch 15 oder 16, worin der Freisetzungs-Ligand oder der Rezeptor irreversibel an einen Festphasen-Träger absorbiert ist.

23. Kit nach Anspruch 15 oder 16, bei dem die Bestimmung der Dissoziation erfolgt durch Messung eines Signals, das von einem Markierungsmittel abgegeben wird, das entweder mit dem Rezeptor oder mit dem Freisetzungs- Liganden assoziiert ist.

24. Kit nach Anspruch 15 oder 16, bei dem das Markierungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus einem Enzym, einem Fluorophor, einem Chromophor, einem Latex-Teilchen, einem chemolumineszierenden Agens, einem Radioisotop, einem Chelat-bildenden Komplex, einem Farbstoff und kolloidalem Gold.

25. Kit nach Anspruch 15 oder 16, bei dem es sich bei dem Freisetzungs- Liganden um ein Cotinin-Derivat mit einer aliphatischen Kette aus drei oder mehr Kohlenstoffatomen in der 1 N-Position handelt.

26. Kit nach Anspruch 25, bei dem die aliphatische Kette in dem Cotinin- Derivat eine Propylgruppe ist.

27. Kit nach Anspruch 25, bei dem die aliphatische Kette in dem Cotinin- Derivat eine Isopropylgruppe ist.

28. Kit nach einem der Ansprüche 25 bis 27, bei dem das Cotinin-Derivat an ein Enzym konjugiert ist.

29. Kit nach Anspruch 28, bei dem das Enzym Glucose-6-phosphatdehydrogenase ist.