DE2264742A1 - Ligandenbestimmung mit spinmarkierten verbindungen durch rezeptorverdraengung - Google Patents

Description

Ligandenbestimniung mit apinmarkierten Verbindungen durch Rezeptorverdrängung

Es besteht ein fortgesetztes Bedürfnis nach genauen und wirksamen Schnellanaly3enmethoden für kleine Mengen an organischen Verbindungen. Dieses Bedürfnis macht sich auf den unterschiedlichsten Gebieten geltend, M es auf die Bestimmung sehr kleiner Mengen an organischen Substanzen ankommt. Das Bedürfnis, unterschiedliche Substanzen, beginnend von Verunreinigungen im flaoser, im Boden oder in der Luft, die in äußerst kleinen Mengen vorhanden sein können, bis zu Arzneimitteln oder natürlich vorkommenden, physiologisch aktiven Substanzen, die in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Harn und Speichel vorkommen, zu analysieren, zeigt das große Anwendungsgebiet auf dem die Bestimmung von sehr kleinen Substanzmengen erforderlich ist.

Besonders ist es bei einem Mißbrauch von Narkotika und Drogen vom medizinischen und gesundheitspolJzeilichen notwendig, eine unkomplizierte Methode zum

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schnellen Nachweis dieser Drogen zur Verfügung zu haben, entweder unmittelbar nach der Einnahme oder der Einspritzung, oder häufig auch nach einer verhältnismäßig langen Zeit. Die Analyse soll entweder auf die Droge, auf ihre Stoffwochsalprodukte oder beide, entweder einzeln oder zusammen, ansprechen, sie soll hinsichtlich der zu analysierenden Droge spezifisch sein und sie soll durch andere Substanzen, die in der Körperflüssigkeit vorhunden sein können, nicht verfälscht werden.

Bei geutörtor Körperfunktion kann es wichtig sein, bestimmte Verbindungen oder StoffWechselprodukte zu analysieren, um die Jeweilige Fehliunktion zu diagnostizieren. Auch im Falle von Vergiftungen kann eine unkomplizierte und schnelle Methode zum Nachweis des Giftstoffee bei der Auswahl des Gegengiftes Uußerst wichtig sein.

Es existiert eine Vielzahl von Analysenmethoden für ein breites Spektrum von unterschiedlichen organischen Verbindungen. Viele dieser Methoden basieren auf der Verwendung von unterschiedlichen Nachweisinstrumenten, wie Fluorometern, Ult.raviolett-Spektrophotometern, gravimetrischen Analysen, titrimetrischen Analysen usw. Andere Methoden beruhen auf der Dünnschichtchromatographie, dia häufig langsam, störanfällig und nicht reproduzierbar ist. Infolge der großen Unterschiede in den Arbeitsweisen, Genauigkeiten und hinsichtlich der vorhandenen störenden Srbstanzen können viele diagnostische Tests nicht routinemäßig ausgeführt werden, da die hierfür benötigte Ausrüstung aufwendig ist und in vielen Fällen fehlt.

Die Verwendung von freien Radikalen als Testsubstanzen bei Naturstoffen ist in den USA-Patentschriften 3 489 und 3 453 288 beschrieben. Die Markierung einiger hochmolekularer Proteine ist in der USA-Patentschrift 3 481

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beschrieben (vgl. auch Hubbell et al., Proo.Nat.Acad.Sei. U.S., 61, 12 (1968)). Es wurden freie organische Radikale mit Antikörpern vereinigt und untersucht. (L.Stryer und O. Hayes Griffith, Proc. Nat. Acad.Sci. U.S. H» ¹⁷⁸⁵ (1965) und J.C. Hsia and L.H. Piette, Arch. Bioohem. and Biophys., 122, 466 (1969)). Nach der zuletzt genannten Literaturstelle wurden Dinitrophenyl-Antikörper mit 2,4-Dinitrophenyl-SpinmarkierungBBubjtanzen markiert, und die Veränderungen des Elcktronenspinresonanzspektrums (ßSR-Spektrums) als Ergebnis der Wechselwirkung zwischen den MarkiorungsBubotanzen und den Antikörpern wurden untersucht. Es wurden auch Steroide spinnarkigrt, entweder durch Heroteilung des Oxazole des 3-Kotooteroide und Oxydation des Stickstoffe zum Nitroxyd, oder durch Verwendung einer Carboxyalkylgruppe in der 17-Stellung zur Bildung des Amide einer Tetramethyl-(Amino)-Piperidino-Oxyl-Gruppe (vgl. McConnall ot al., Quart. Rev, of Biophys., 91-136 (1970) und Hamilton et al, Structural Chemistry and Molecular History,W.H. Freemann ft Co., San Francisco, Calif. (1968), the Chapter on Spin Labels! vgl. auch Hubbell, Proo. Natl. Acad. Sei. U.S. 6^, 16 (1963)).

Die Bestimmung von äußerst niedrigen Konzentrationen an organischen Molekülen mit mindestens 6 Kohlenetoffatomen und mindestens einer polaren Stelle kann erfindungsgsmäß dadurch erfolgen, daß man ein RezeptormolekUl mit einer Stelle, die konfigurationsmäßig charakteristisch für ein Ligandenmoleküylst, mit einem Liganden und einem Ligand-Analogen zusammenbringt, wobei das Ligand-Analoge eine ähnliche räumliche und polare Konfiguration wie der Ligand hat, sich aber von dieser dadurch unterscheidet, daß 'er eine stabile, freie radikalieche Funktionalität besitzt. Durch Bestimmung der Veränderung des ESR-Spektrums der Kombination aus Rezeptor, Ligand und Ligand-Analogem, verglichen mit dem reinen Spektrum des Rezeptors und des Ligand-Analogen, kann die Konzentration des Liganden unter

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Verwendung bekannter Standards bestimmt werden. Das Verfahren ist besonders brauenbar bei biologisch aktiven Verbindungen als Liganden, bei der Nitroxyd-Funktionalität als freier radikalischer Gruppe und bei Proteinen als Rezeptoren. Es können auch andere freie radikalische Gruppen und Rezeptoren verwendet werden.

In der Zeichnung bedeuteni

Figur 1 eine graphische Darstellung der Veränderung des ESR-Spektrums bei Zusatz von N- £-Dinitrophenyl-Lyoin zu einer Löoung, die einen Komplex aus Antikörper und 1-0xyl-3-(2' ,V-dinitrophenylamino)· 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin enthält.

Figur 2 eine graphioche Darstellung der Verändeung des ESR-Spektrumo bei Zusatz von Morphin bzw. Codein zu einer Löaun^, die einen Komplex aus Antikörper und 3-^~2'-(O⁵'-Morphinc)-acotaraido7-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl enthält.

Nachstehend sind einige spezielle Ausführungsformen der Erfi^ung beschrieben.

Vorfahren

Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung der Menge eines bestimmten Materials (Ligand) in einer Löoung, wobei ein hochmolekulares Material mit einer Stelle, die für die polare Natur und rUumliche Geometrie des zu bestimmenden Ligundon charaktoriotiaoh ist (Rezeptor) mit einem freien Radikal-Analogon des Liganden (Ligand-Analogem) in Berührung gobraoht wird. Das ESR-Spektrum der freien Radikal-Funktionalitüt lindert sich, wenn sie mit einem verhiiltniamMßig kleinen Molekül kombiniert ist, verglichen mit dom Fall, in dom sie mit einem wesentlich grö3orer. Molekül kombiniert ist. ]n einer Lösung, die

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nur das Ligand-Analoge und den Rezeptor enthält, sind beiit Gleichgewicht die Rezeptorstellen praktisch vollständig mit den Ligand-Analogen aufgefüllt. Bei Zusatz einer kleinen Menge dos Liganden zu der Lösung treten der Ligand und das Ligand-Analoge hinsichtlich dos Unterschusses an Rozeptoratellen in Konkurrenz, wodurch die Lage des Gleichgewichte und das Ausoehon des Spektrums verschoben werden. Verwendet man bekannte Mengen an Ligand, so kann die Wirkung auf das Gleichgewicht, da3 sich als Änderung des ESR-Spektruma ausdrückt, leicht bestimmt werden. Sind die Standards einmal geeicht, ao können verschiedene Vorrichtungen verwendet v/erden, die eine Ablesung ermöglichen, welche direkt proportional der Menge des unbekannten Matoriala ist.

Bei der Durchführung der Analyse v/erden drei Grundreagentien verwendet» Die unbekannte Substanz (Ligand), das freie Radikal-Analogo und der Rozeptor. Das freie Radikal-Analoge und der Rezeptor worden zweckmäßig als Reagenslösungen, gegobenonfalls mit weiteren Reagentien, die in einer oder beiden Lösungen vorliegen können, hergestellt. Die Reagontion können entweder trocken oder in Lösung eingeführt worden. Zwockmiißig werden Flüssigkeiten für den Transport von klcinun tlatcrialraongen verwendet, da auf diese Waise eine loichto Abmooau*:g möglich ist.

Normalerwoiso v/orden polaro Lösungsmittel verwendet, insbesondere hydro;:ylgi'upponhaltigo Lösungsmittel, wie Wasser und wäßrige Alkanolo mit 1 - 2 Kohlenstoffatomen (Methanol und Äthanol). Andere aauGrutoffh.vLtigo Lösungsmittel können ebenfalls verwendet werden, z.B. Äther, Ester, Dimethylformamid, Dimothyloulfoxyd, Hoxaraothylpho3phuramid usw., gewöhnlich in Kombination mit Wasoor in Mengen von 0-40, vorisugav/oioe in Mengen von 1 - 30 Vol.-si.

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Bei der Durchführung der Analyse beträgt der VerdUnnurjafaktor f1lr Jedes Reagens gewöhnlich 1,5 - 10, üblicherweise 1,5-5. Deshalb bestimmt die Auagangokonzentration des Reagona in der Rtagenslösung in gewissem Ausaafl dir Endkonzentration des Reagens in der Analysonprobe.

Die Konzentration des Rezeptors in der Roagenolöoung liegt gewöhnlich im Bereich von 10"*' bis 10~³ Mol, vorzugawe. se zwischen etwa 10 ' und 10 ^? Mol, bezogen auf die aktiven Stellen (das Verfahren zur Bestimmung der aktiven Stellen ist im experimentellen Teil beschrieben). Deren Konzentration beträgt grob geschützt etwa 10 bi» 100 mg/ml, üblicherweise etwa 10 bis 10 mg/ml. Für die Analysenprobe soll dio Konzentration der Rczeptorstellen etwa 10 '
betragen.

etwa 1O~⁵ bis 10~⁹ Mol, üblicherweise 10~⁴ bi3 10"⁸ Mol

Die molaren Konzontrfition3beroioho für das Ligand-Analoge gehen mit donen dos Rozoptoro parallol, sowohl bei der Reagonolöoung als auch hinuichtlich der Konzentration der Anelyoonprobo. Dao Vorh/iltnio zwiochon Ligand-Analogem und Rozoptor botrilßt gowühnlich etwa 0,5 bis 10, üblicherweiae 0,5 - 3 ^olekülo Jo Rezoptorotelle. Das Verhältnia wird durch dio Ijin(hm_t';:jkonatnnten, flie Bcutimmunc3methode, die or.vartoto Konzentration doa Ligandon und die Spezifität der Anelyaenprobo bestimmt.

Gewöhnlich ist oo or.vUiiocht, da3 zu analysierende Gemisch zu pufforn, oo daO oa einon pH-Wort im Bereich von 5,0 bis 10,5, vorzucuv/oioo von 7,0 bis 8,5 hat. In diesen Füllen wird aufgrund dos Vordünnungsfaktors eine der Roagonolöoungcn, vorzugovvoi3O die Rezeptorlösung, gepuffort, oo dafl oin pH-Wort von 6,5 bis 9,5, vorzugsweise von 7,0 - 0,5 orhalton wird. Dia Konzentration des Puffers hängt vom jeweiligen Puffer abj in der Reagenslösung ist

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aie etwa 0,05 bio 0,8-Molar, vorzugsweise 0,2 - 0,7-Molar. Je saurer die unbekannte Lösung ist, ^esto höher ist der pH-Wert der verwendeten Reagenalösung. In dem zu analysierenden Gemisch ist die Pufferkonzentration gewöhnlich etwa 0,1 - 0,6-Molar.

Die Auswahl der Puffersubetanz kann in weiten Grenzen erfolgen, wao von ihrer Wirkrng auf die Reagentien, d.h. die Löslichkeit, Reaktionsträgheit gegenüber den Reagentien usw. ahhängt. Üblicherweise verwendete Puffer sind beispielsweise Tri-(hydroxymethyl)-methylamin (Trie) und Salze von Tris, z.B. Tris-Maleat, Alkali- und Ammoniumborate, z.B. Natriumborat, Alkali- und Ammoniumphosphate, z.B. Natrium- und Dinatriuraphosphat, Alkalibicarbonate und -carbonate, z.B. Natriumbicarbonat und -carbonat, Äthylendiamintetraes3igsäure, Amindiole in Kombination mit ihren Salzen, z.B. 2-Araino«2-methyl-1,3-propandiol-hydrochloridj, Kombinationen von Arcmoniumchlorid und Amnoniumhydrcxyd, Kombinationen von Barbituraäuro und Alkalibarbitvsi'aten, heterocyclische Amine in Kombination mit ihren Salzen, z.B. Collidin-HCl, Collidin-Pyridin-Ecoigsäure, ÄthanolV-amin-HCl, N-Xthylmorphin-Pyridin-Eaoicsäure, Glycin-HGl_f Piperazin-Glycylglycin usw.

Die bevorzugten Puffor oind Trio, Bioarbonat-Oarbonat, Phosphat und Borat. Bei don ^norßaniochen Puffern ist es häufig zweckmäßig, die anorganiarsho Säure, z.B. die Borsäure, mit der Baao oinoo Alkalimetalle^ z_eB. KJt NatriumhyJroxyd, bio zu dom gewünschten pH-Wert zu neutralisieren.

Nach Bedarf könnon ouch andere Salze oder Reagentien in der itsagonalüaung vorhanden sein.

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In einigen Fällen kann die Vorbehandlung des unbekannten Substrates erforderlich sein. Vermutet man, daß die unbekannte Substanz ein Reduktionsmittel, z.B. Ascorbinsäure, enthält, die in der Lage ist, das freie Radikal zu reduzieren, so kann das unbekannte Substrat mit einem Oxydationomittel, wie Natriumbichronat, Natriuraperborat, Natriumperjodat, Jod usw. behandelt werden. Die Auswahl des Oxydationsmittele wird durch 3eine Wirkung auf andere fteagentien, die in der zu analysierenden Probe vorhanden sind, bestimmt. Ausge-.wählte Oxydationsmittel sind Alkalibichromate, insbesondere Natriumbichroraat, und Natriumhypojbdit. Die Menge dea Oxydationsmittels hängt von der. vermuteten Menge dee Reduktionsmittels ab. Bei Urin genügen gewöhnlich Konzentrationen von 10 bis 10~* Mol.

Die Reihenfolge, in der die Reagentien zusammengebracht werden, ist verhältnismäßig unwichtig! in gewissem Umfang ist die Wechselwirkung zwischen dem freien radikalischen Ligand-Analogen und dem Rezeptor zu berücksichtigen. Deshalb kann das freie radikalische Ligand-Analoge an den Rezeptor gebunverwsndet und die unbekannte Lösung zugesetzt werden. Ee können aber auch die unbekannte Lösung und das freie radikaliache Ligand-Analcge gleichzeitig zugesetzt werden, damit³ ifm die freien Stellen am Rezeptor konkurrieren können. In einigen Fällen kann der Ligand zuerst an den Rezeptor gebunden werden, worauf das Lig-nd-Analoge zugesetzt wird» Alle diese Verfahren können genau geeicht und zur Bestimmung eines bestimmten Liganden verwendet werden. Wenn es zweckmäßig erscheint, kann die Lösung vom Rezeptor getrennt und die Konzentration dea freien radikalischen Ligand-Analogen in der Lösung bestimmt werden. Diese kann auch mit der Konzentration des unbekannten Liganden in Beziehung gesetzt werden.

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¹H-

Die lösungen werden miteinander vermiaeht, bis sie ausreichend homogen sind und, falls erforderlich, in einen ESR-Probenhalter gebracht. Der Halter wird dann in die Kavität eines ESR-Spektrometers gebracht. Die Temperatur in der Kavität wird normalerweise im Bereich von etwa 15 - 4O⁰C gehalten, und die Veränderung des Spektrums gemessen. Je nach der Standardisierungs- und Eichmethode müssen ein oder mehrere Punkte bestimmt werden, um die Konzentration des unbekannten Ligai.den zu bestimmen.

Für die Bestimmung genügen äußerst kleine Volumina, die gewöhnlich im Bereich von 10 - 100 Mikroliter für das Gesamtvolumen der Reagentien und der unbekannten Substanz liegen. Die erforderliche Menge des unbekannten Liganden liegt normalerweise im Bereich von etwa 10 bis 10 Mol, gewöhnlich im Bereich von 10 ' bis 10 ^J Mol.

Nach einer Variante mit einem zusätzlichen Verfahrensschritt ist der Rezeptor an einem Träger gebunden. Hier handelt es sich normalerweise um ein heterogenes System und nicht um ein homogenes System. In vielen Fällen überwiegen die Vorteile der Verwendung eines Träger in einem heterogenen System die Nachteile, die mit dem zusätzlichen Aufwand beim Verbinden des Rezeptors mit dem Träger verbunden sind.

Eine Möglichkeit der Verwendung des Trägers besteht darin, eine Säule (z.B. ein kleines Kapillarrohr) mit dem am Träger gebundenen Rezeptor zu füllen und anschließend das Ligand-Analoge mit dem Rezeptor zu verbinden. Die Menge des vorhandenen Ligand-Analogen kann durch Messung des ESR-Spektrums der Säule oder vorzugsweise durch Messen der Menge des Ligand-Analogen in der Lösung vor und nach dem Durchgang durch die Säule bestimmt werden. Hierbei können verhältnismäßig große Mengen des unbekannten fluiden Mediums durch die Säule geleitet werden, wobei anschließend das

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üpektrum der Säule oder der abströmenden Flüssigkeit ausgera33sen wird. Die Änderung dos Spektrums ist proportional dor Men^e des Ligandon in der durch die Säule geflossenen Flüssigkeit, (auch proportional der Strömungsgeschwindigkeit, wonn das Gleichgewicht nioht erreicht iat).

Man kann aber auch den Liganden und das Ligand-Analoge nit dom am Träger in einem Rohr gebundenen Rezeptor vermischen. Nach dor Einstellung dos Gleichgewichts kann man, wenn man den am Träger fiobundenon Rezeptor von dor überstehenden Flüssigkeit abtrennt, die Dlektronenspin^reaonana jedes einzelnen oder beider Teile, dos Trägen oder der überstehenden Flüssigkeit, messen. Eine weitere Variante besteht darin, das nach Zusatz des Liganden zum Trüger nooh am Träger gebundene Ligand-Analoge zu ber,bimmen, d.h. daa verbleibende Ligand-Analoge freizusetzen und daa Ligand-Analoge in der Lösung zu analysieren.

Weiterhin worden Träger insbesondere dann vorwendet, wenn ein großes Molekül, gewöhnlich mit einem Molekulargewicht von mehr als 5000, üblicherweise mit einem Molekulargewicht von mehr als 10.000, der zu analyaierende Ligand ist. Ee wurde gefunden, daß, wenn die freie Radikalverbindung an ein großes Molekül gebunden ist, dessen Molekulargewicht weit größer als 5000 ist, der Spin etwa dem eines unbeweglichen Spins in Lösung gleicht. Deshalb wird durch eine weitere Bindung an einon Rezeptor der Spin dea freien Radikale nicht wesentlich geändert. Es ist deshalb zweckmäßig, den Rezeptor am Träger zu binden, die Analyse durch Zusatz des Ligand-Analogen und des Liganden zum Träger durchzuführen und anschließend die Menge des Ligand-Analogen in einer Lösung und/oder auf dem Träger zu bestimmen. In diesem Fall bestimmt man nicht die Änderung dea ESR-Spektruma, aufgrund einer Verschiebung des unbeweglichen Spins zu einem beweglichen Spin, sondern vielmehr die Absolutzahl der vorhandenen freien Radikalgruppen.

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Reagentien Ligand - freies radikalischea Ligand-Analoges

Analysierbare Liganden sind in erster Linie auf solche beschränkt, welche eine Rezeptorstelle mit der gewünschten Spezifität haben. Ist die Wechselwirkung mit dsm Liganden und den freien radikalischen Ligand-Analogen reversibel, so kann entweder die Verdrängung des freien radikalischen Ligand-Analogen von der Rezeptorstalle durch den Liganden oder die Konkurrenz zwischen dem freien radikalischen Ligand-Analogen und dem Liganden um die Rezeptorstelle ausgenutzt werden. Reagiert die Rezeptorstelle mit dem Liganaen und/oder dea freien radikalischen Ligand-Analogen irreversibel, so kann nur die Konkurrenzmethode angewendet werden»

Die Liganden umfassen solche Verbindungen, die Narkotika^ Hypnotika, Sedativa, Analgetika, Antipyretika, Anästhetika, psychotogene Drogen, Muskelrelaxantien, Stimulantien tu* das Nervensystem, Anticholineateraee-Mittel, parasympatfaomimetische Mittel, syirpathomlmetisebe Mittel, oC-adrenergische Blockiermittel, antiandrener^ische Mittels ganglien stimulierende- und-blockierend© Mittel, neuromuakislärblockierende Mittel, Histamine, Antihiatamine, 5-Hydroatytryptaraine und Antagonisten, cardiovascular© Drogen, antiarrhythmische Drogen, Antibypertenaiv-Mittel^ vasodilatori3che Drogen, Diuretika, Pesticide (Fungioide, Aritihelminthica, Insecticide, Ektoparaaiticide uaw.}, Aiitimalnriadrogen, Antibiotika, Antimetaboliten, Hormone, Vitamine, Zucker, Thyroid- und Antithyroid-Drogenj Cortiesateroidej Insulin und orale Hypoglämischc Drogen und Stoffwechsel·· produkte darstellen·

Diese Drogen und Mittel umfassen beispielsweise Alkaloide, Steroide, Polypeptide, Prostaglandine, Catecholamine, Xanthine, Arylalkylamine, heterocyclische Verbindungen, z.B. Thiazlno, Piperazine, Indole und Thiazole, Aminosäuren Usw.

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Die Liganden sind zum größten Teil biologiach aktive Moleküle mit mindestens einer polaren Stelle, gewöhnlich mit mindestens zwei polaren Stellen und mindestens 6 Kohlenetoffatomen, deren Molekulargewicht mindestens etwa 125 beträgt. Die Molekulargewichte sind gewöhnlich nicht höher ale 70.000, häufig nicht höher als 10.000 und vorzugsweise nicht höher ala 5000. Wie vorstehend angegeben, wird bei Liganden mit einem Molekulargewicht von mehr als 5000 ein spezielles Verfahren angewendet. Das Verhältnis zwischen Kohlenstoffatomen und Heteroatomen ist gleich oder größer als 1i1, gewöhnlich größer als 2i1 und vorzugsweise größer als 4:1, jedoch nicht größer als 30t1. Die einzelnen Moleküle, die als Liganden dienen und diagnostisch von Interesse sind, können in verschiedene Kategorien unterteilt werdent

Alkaloide

Die erste Kategorie umfaßt die Alkaloide. In dieser Kategorie sind erfindungsgemäß auch solche Verbindungen eingeschlossen, die synthetisch hergestellt werden und als physiologische Ersatzstoffe für die natürlich vorkommenden Alkaloide in Frage kommen. Alle natürlich vorkommenden Alkaloide haben ein Aminotickotoffatom als heterocyclioches Glied. Die synthetischen Alkaloide enthalten normalerweise ein tertiäres Amin-Stickstoffatom, das gegebenenfalls auch ein heterocyclisches Glied darstellen kann. Die Alkaloide enthalten im Molekül eine Vielzahl von Funktionalitäten, z.B. Äther, Hydroxylgruppen, Ester, Acetale, Amine, Isoxazole, Olefine, von denen alle, in Abhängigkeit von ihrer bestimmten Stellung im Molekül, als Stellen zur Verbindung mit der Funktionalität des freien Radikals verwendet werden können.

Eine beuonders bevorzugte Gruppe von Alkaloiden sind die Morphin-Alkaloide und ihre phyoiologiaoh nachgeahmten synthetischen Analogen» Alle diO3e MolekUle hoben die

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nachstehend angegebene Funktionalität und Grundotrukturt

worin die freien Valenzen durch sehr unterschiedliche Gruppen_t hauptsächlich Kohlenstoff und Wasserstoff, abgesättigt sind.

Das freie Radikal-Analoge zu diesen Verbindungen hat in den meisten Fällen die nachstehend angegebene Grund3trukturi

worin X eine Bindung oder oine Funktionalität, z.B. Imino, Azo, Oxy, Thio, Sulfonyl, Oxocarbonyl, Honoxocarbonyl otxjv Kombinationen dieser Funktionalitäten darstellt. Der Sauerstoff steht in dor Ortho-, Mota- odor ί-Stollung. A ist eine heterocyclische Vorbindung mit 5 - 6 Ringgliedern, von denen eines ein Stickstoffatom einor Nitroxyd-FuriSionalität inLj das an'lero hoterocyclioohe Glied kann Sauerstoff, Sohv/ofel oder Stickstoff sein. Der Stickstoff und der

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-U-

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Schwefel können gegebenenfallb mit einem Saueratoffatom verbunden aein. Der Ring hat 0 - 1 äthylenisch ungesättigte Stellen. Die verschiedenen freien radikalischen Gruppen aind nachstehend erläutert.

Daa Molekulargewicht der Verbindungen mit dem freien radikalischen Substituenten beträgt mindestens 350 und normalerweise nicht mehr als 700j es liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 400 bis 600.

Daa mit dem freien Radikal markierte Morphin und seine nahe verwandten Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

W W

worin die Subatituonton folgende Bedeutungen habent

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein oder ein H jeder der Gruppen W kann duroh -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ ist naohstehend definiert (es ist nur ein -X⁺-A⁺ je Molekül vorhanden)!

W¹ a Wassorntoff odor ein Kohlenwasserstoff mit 1-8 Kohlenotoff atomen, insbesondere Alkyl und Aralkyl, z.B. Methyl und ß-Phenäthyl|

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ifi

ο ο Κ / IL"? W², w' und W^^a = Wasserstoffι

W* = Wasserstoff oder zusammen mit W* ein zweiwertiger Reat mit 3-6 Kohlenstoffatomen u;id 0-2 Sauerstoffatomen, der einen sechsGÜedrigen carbocyclischen Ring mit der Kohlenstoffkette bildet, an die er gebunden ist, z.B. Propylen-1,3, 1-Hydroxyprop-2-enylen-1,3, 1-Hydroxypropylen-1, 3, 1-Acetoxypropylen-1,3t 1-Acetoxyprop-2-enylen-1,3, 1-Oxopropylen-i,3, 1-0xoprop-2~enylen-1,31

W^ = Wasserstoff oder Hydroxyl?

W⁶ = Wasserstoff, Hydroxyl oder zusanmen rait W⁵ Oxy (-O-)j

W^ = Wasserstoff oder Methyl; W⁸ = Wasserstoff oder Hydroxylj und

W^ = Wasserstoff, Hydroxy, Acyloxy nit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. Acetoxy (Acyloxy umfaßt nur Carboxy), Hydrocarbyloxy mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z.J. Methoxy, Äthoxy, 2-(N-morpholino)-äthyl und Glucuronyl. (in allen diesen Porraeln sind die ungesättigten Valenzen durch Wasserstoff gesättigt, ausgenommen wenn eine Grunästruktur angegeben ist)»

Unter Hydrocarbyl verotoht man einen organiochen Reat, der nur aus Y/a3serstoff und Kohlenstoff zusammengesetzt ist und der gesättigt oder ungoatlttißt, aliphatisch, alicycliach oder aromatisch sein kann bzw. die ontnprachenden Kombinationen enthalten kann.

Beispiele für Verbindungen, die durch freie Radikalgruppen substituiert werden können, aind Morphin, Heroin, Hydro-• morphon, Oxymorphon, liotopon, Codein, Hydrocodon, Dihydrocodoin, Dihydrohydroxycodeinon, Pholoodin, Dextromethorphan, Phonasooin und Dionin. Eo fallen auch Stoffv/echselprodukte dioaor Vorbindundon darunter.

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In den bevorzugten Verbindungen ist W oder W gleich

bzw. es bilden W³ und W zusammen die Gruppierung

A⁺-X⁺-CHOH₂CH₂- oder A⁺-X⁺-CH-CH=CH-.

Die einzelnen Gruppen werden so ausgewählt, daß sie mit bekannten Verbindungen mit physiologischem Interesse in Beziehung gesetzt werden können. Der Hauptunterschied zwischen den bekannten Verbindungen und den vorliegenden Verbindungen ist die verbindende Gruppe und die Anwesenheit des freien Radikals als Spinmarkierung.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen mit narkotischer Wirksamkeit umfaßt Methadon und seine Analogen, die größtenteils die nachstehend angegebene Struktur habeni

In dieser Formel bedeuten!

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein, bzw. ein H jeder der Gruppen iff kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ iat naoh-

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stehend definiert (ea iat nur eine einzige Gruppe -X -A je Molekül vorhanden)}

η = 0 oder 1 (gewöhnlich dieselbe Zahl in beiden Fällen)| m = 2 oder 3f W¹⁰ ist Wasserstoff!

W¹¹ und W¹² sind Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Methylgruppc; sie können aber zusammen auch einen sechsgliedrigen Ring mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, bilden, > .B. in Form der Gruppen Pentylen-1,5 und 3-0xapentylen-1,5|

W¹⁵ ist Wasserstoff oder Methyl, wobei nur ein W¹⁵ Methyl ist}

W¹⁴ ist Wasserstoff|

W ist Wasserstoff oder Hydroxylf

W¹⁶ ist Wasserstoff, eine Acyloxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Propionoxygruppe, oder eine Hydroxylgruppe (wenn sowohl W¹^ als auch W Hydroxylgruppen sind, so liegt die Oxogruppe vor; und

W¹⁷ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. die Äthylgruppe.

Als Beispiele für Verbindungen, die mit einem freien Radikal markiert werden können, seien Methadon, Dextromoramid, Dipipanon, Phenadoxon, Propoxyphen (Darvon) und Acethylmethadon genannt.

Bevorzugte Verbindungen liegen vor, wenn W , W oder W die Gruppe -X⁺-A⁺ bedeuten.

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Die dritte Gruppe von Verbindungen, die eine narkotische Wirkung haben, aind Meperid?n-La!8gel^dJ?e sich in den meisten Füllen durch die nachstehende Formel kennzeichnen lassem

In dieser Formel haben die Subatituenten folgende Bedeutungen t

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw. ein H Jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt soin. X⁺-A⁺ iat naoh-

stehend definiert (es liegt nur eine Gruppe -X⁺-A⁺ Je Molekül vor)ι

W 1st Wasserstoff ι

W²¹ ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Methylgruppe, eine Aminophenylalkylgruppe, z.B. die ß-ip-Aminophenyl&thyl-gruppe, eine Phenylaminoalkylgruppe, z.B. die Phenylaminopropylgruppe (die Alkylgruppe enthält hier 2-3 Kohlenstoffatome)j

W²² ist eine Alkoxygruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z«B. die Xthoxygruppej

W²' ist Wasserstoff oder die Methylgruppe.

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Als Beispiele für diese Verbindungen seien Meperidin, alpha-Prodin, Alvodin und Anileridin gtnunnt·

21 Bevorzugte Verbindungen sind solche, in dunen W oder W²² -X⁺-A⁺ bedeutet bzw. in denen ein Wasserstoff von W²¹ durch -X⁺-A⁺ ersetzt ist.

Eine zweite Gruppe von interessierender. Ligandon leiten sich vom Tryptamin ab und fallen in die Klasoe der Indolalkaloide, insbesondere in die Klaase der Ergotalkaloide. Diese Verbindungen haben die nachstehende Grundstruktur t

worin die freien Valenzen durch eine Vielzahl von Gruppen abgesättigt sind, insbesondere Kohlenstoff und Wasserstoff, obgleich auch andere Substituenten vorhanden sein können» z.B. Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Ketogruppen uaw. Der häufigste Vertreter dieser Klasse, der erfindungsge-Qäß in Betracht gezogen wird, ist die Lysergsäure, hauptsächlich ihr Diine thy laraid. Andere Vertreter dieser Klaaae umfassen Ergotermin, Ergotaminin, Isolyaergaäure und Ergosin. Andere Vertreter der Indolalkaloid-Familie, die ebenfalls analysiert werden können, sind die Strychningruppe und die Indolopyridocolingruppe$ in dioao Klasse fallen Yohimbin und Reserpin·

Die mit dem freien Radikal substituierten Indolalkaloide haben die nachstehende Formelt

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X—A

worin X und A die vorstehend angegebene Bedeutung haben.

Andere Gruppen von Alkaloiden umfaaaen die Steroidalkaloide, die Iminazolylalkaloide, die Chinazolinalkaloide, die iBOchinolinalkaloide, die Chinolinalkaloide (am bedeutendsten ist hier das Chinin) und die Diterponalkaloide.

Zün größten Teil haben die Alkaloide, die mit einer freien radikalischen Funtttionalität verbunden sind, ein Molekulargewicht von etwa 3OO - 1500, gewöhnlich von etwa 400 - 1000. Sie sind η -"ualerweise nur aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sacarstoff, Stickstoff und Schwefel zusammengesetzt, wobei der Schwefel in den freien radikßli3chen Gruppen vorhanden ist. Der Sauerstoff ist in Form von Oxy- und Oxogruppen vorhanden, und der Stickstoff liegt in Form von Amino- oder Amidogruppen vor. Beim Nitroxydradikal sind der Stickstoff und der Sauerstoff natürlich als eine Funktionalität vorhanden.

Von großer Bedeutung sind auch Drogen, die zwar, medizinisch richtig angewendet, einen guten Zweck orfüllon, die aber auch außerhalb des medizinischen Gebietes mißbräuchlich verwendet wurden. Beispiele innerhalb dieser Kategorie sind Amphetamine, Barbiturate und andore Drogen, die gefühlsanregend wirken·

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Catecholamine Unter die erste Gruppe fallen Catecholamine mit der Formell

In dieser Formel haben die Substituonten folgende Bedeutungen!

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw. ein H von Jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ orootzt ooin· X⁺-A⁺ ist nachstehend definiert (ea ist nur eine Gruppe -X⁺-A⁺ je Molekül vorhanden))

W³ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppo mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z.B. die llethylgruppe|

W³ ist Wasserstoff, eine Alkylgruppo nit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. die Llethylgruppe 1

W³² und W⁵⁵ oind Wasserstoff|

W³ ist Wasserstoff, die Hydroxy-^Dliaothoxyoarboxyphonaoyl- und Dimet.hoxy- od-phthalidyl^ruppof

W³^ und \V Bind Wasoorotoff, wobol oino Gruppe mit W³* eine Bindung bildon kann) wonn U⁵¹ Uiid ff³⁵ Qitoinr.ndor verbunden sind, könnon W⁵² und W³³ baw. W³⁰ und W³⁶ »usammon eine Doppolbindung bildon| W³^ lot WnooQrotoff odor oine Allcoxyßruppo oit 1 - 3 Kohlonotoffatoaon, 2,B. dit L*.Qthoxygruppe \

409844/1020

ff* und ff™ sind Hydroxy- oder Alkoxygruppen mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. die Methoxygruppe.

AIa Beispiele für diese Verbindungen oeien Cotainln, Naroein, Noaoapin und Papaverin genannt.

In den bevorzugten Verbindungen bedeuten W* , ff* oder ff'⁹ die Gruppe -X⁺-A⁺ bzw. ein Wasserstoff ist duroh -I⁺-A⁺ ersetzt.

Eine weitere Gruppe von Catecholaminon sind die Amphetamine und verwandte Verbindungen. Diese Verbindungen haben die Formel

.40

DIo Subatitucntor» in didoor Pormol haben folgende Bedeutungen.

Die Gruppen W könnon -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H Jeder dor Gruppon \7 kann duroh -X⁺-A⁺ oraotst ooin. -X⁺-A⁺ iat nachotehend dofiniort (oa lot nur ein -X⁺-A⁺ Je tlolekül vorhanden)|

W^⁰ und W*¹ oind Uaoooratoff odor Alkylßruppon mit 1 - 3 Kohlonotoffatoncn, z.B. die Mothyl- und Ieopropylgruppe, woboi vorzucoY7oico ein Subotituont Waaseratoff iet|

ff** lot Waaoorotoff, eine Alkylgruppo mit 1- 3 Kohlenotoffatomon, β.B. die llothyl- und Xthylgrupps, sowie die Carboxygrupp·ι

409844/1020

W ist Wasserstoff oder Hydroxyl\ und

W und W * sind Wasserptoff, Hydroxyl- oder Alkoxylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen.

Beispiele für Verbindungen, die spinmarkiert werden können, sind Ephedrin, Epinephrin, L-Dopa, Cohefrin, Benzidrin (Amphetamin), Paredrin, Methamphetamin und Norephedrin.

Barbiturate

Eine breite Klasse von synthetischen Drogen, die einem ausgedehnten und häufigen Mißbrauch ausgesetzt sind, sind die Barbiturate. Diese Verbindungen sind synthetisch leicht zugänglich, und ihr Gebrauch kann nur schwierig überwacht werden. Die in Betracht kommenden Verbindungen lassen sich

durch die nachstehende Formel kennzneichnem

„50

W⁵? I P

In der Formel haben die Subatituonton folgende Bsdoutungent

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ iat nachstehend dofiniort (oo lot nur ein -X⁺-A⁺ Je Kolekül vorhanden)ι

W^⁰ ib$ Wasaorotoff, oino Alkylgruppo mit 1 - 3 Kohlenstoff atoraon, z.B. dio Mothylfjruppe odor ein Alkalimetall, z.B. Natriumι

409844/1020

W^¹ und W⁵* sind Wasserstoff, eine Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- oder Arylkohlenwasserstoffgruppe mit 1 - Θ,Insbesondere 1-6 Kohlenstoffatomen, z.B. die Äthyl-, η-Butyl-, οί -Methylbutyl-, Isoamyl-, Allyl-, / \ -Cyclohexenyl- und Phenylgruppe|

W ⁵ ist Wasserstoff oder ein Alkalimetall, z.B. Natriumi H ist Sauerstoff oder Schwefel.

Beispiele für Verbindungen, die spinmarkiert werden können, sind Veronal, Medinal, Luminal, Prominal, Soneryl, Nombutal, Amytal, Dial, Phenadorn, Seconal, Evipan, Phenobarbital und Pentothal.

In den bevorzugten Verbindungen sind W oder W bzw. ein Wasserstoff von W^ oder W⁵ gleich -X⁺-A*.

Cooaln

Eine Droge von profler Bedeutung hinsichtlich der verbrauohten Menge ist das Cooain. Das mit dem freien Radikal markierte Cocain bzw. Cocaln-Stoffwechoelprodukte oder -Analoge, wie Ecgonin, haben im wesentlichen die nachstehend angegebene Formel

CH, CH CHCOW⁵⁵

N—W⁵⁷ CH-OW⁵⁶ CH₂ CH- CH₂

In dieser Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen t

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H von jeder Gruppe W

40984A/102Ü

kann duroh -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ ist nachstehend definiert (es ist nur ein -X⁺-A⁺ Je Molekül vorhanden)f

w^J iat eine Hydroxy-, Methoxy- oder Aminogruppef W⁵ iat Wasserstoff oder eine Benzoylgruppe\ und

W⁵⁷ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. die Methylgruppe.

Amlnontiuron und Polypeptide

Die nächste Vorbindungagruppe umfaßt die Aminosäuren und Polypeptide. In den meisten Fällen enthalten die Aminosäuren 2-14 Kohlenstoffatome und umfassen eine Vielzahl von funktionellen Gruppen, wie die Meroapto-, Dithio-, Hydroxyl-, Guanidyl-, Pyrrolidin-, Indol-, Imidazol-, Methylthicäther-, Jod-, Diphenyläther-, Phenol- und andere Gruppen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um die menschlichen Aminosäuren, wobei es auoh andere Aminosäuren gibt, die in Pflanzen und Tieren vorkommen·

Die Polypeptide haben normalerweise von etwa 2 bis etwa 700, gewöhnlich etwa 2 bis 100 wiederkehrende Aminosäuregruppen. Alle der vorstehend angegebenen Aminosäuren können zur Herateilung des Polypeptide verwendet werden. Wegen der großen Vielzahl der funktionellen Gruppen in den Aminosäuren und in den verschiedenen natürlich vorkommenden Polypeptiden kann die freie radikalische Gruppe mit jeder beliebigen Funktionalität verbunden werden, indem für die freie Radikalverbindung die geeignete Funktionalität gewählt wird. Gewöhnlich kann die Funktionalität des freien Radikals mit einer lysin-oder Arginingruppe verbunden werden, obgleich auoh Serin, Threonin oder eine andere Aminosäure mit einer passenden Funktionalität verwendet werden kann, z.B. mit der Carboxy- und Hydroxy-Punktionalität.

409844/1020

In den meisten Füllen haben die mit dem freien Radikal markierten Polypeptide die folgende Formell

CHCO-NHA -CHCO₂H -\—X-A

worin X und A die vorstehend angegebene Bedeutung haben, R einen Arainooüurereat und N eine ganze ZahJ. von 1 bis 700, gewöhnlich von 1 - 200, Ublichorweioe von 2 - 100 bedeuten.

Beispiele für Aminooüuren sind Glycin, Alanin, Serin, Histidin, Methionin, Hydroxyprolin, Tryptophan, Tyrosin, Thyroxin, Ornithin, Phenylalanin, Arginin und Lysin· Interessierende Polypeptide sind ACTH, Oxytocin, GeIbkörperhormön, Inaulin, Bonoe-Jones-Protoin, Choriongonadotropin, Hypophyaon-Gonadotropin, Wuchehormon, Renin, thyroxidbindendes Globulin, Bradykinin, Angiotensin usw.

Steroide

Eine weitere wichtige Gruppe von Verbindungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind did Steroide, die einen weiten Bereich von Funktionalitäten haben, wae von ihrer Körperfunktion abhängt. Neben den Steroiden gibt es die steroidähnlichen Substanzen, die zwar nicht die polyoyolische Grundatruktur der Storoide haben, Jedoch einige der physiologischen Wirkungen der Steroide.

In den meisten Fällen haben die vorwendeten Steroide die folgende Grundstrukturi

409844/102Ü

-X-A

worin X und A wie voretehend definiert sind. Gewöhnlich ist die freie radikalische Markierungssubatanz mit den Ringen A oder B an den Stellungen 2, 3 oder 6 bzw. an der Stellung 17 des Ringes D bzw. an den Seitenketten der Stellung 17 gebunden. Die Ringe können verschiedene Substituenten tragen, inabesondere Methylgruppen, Hydroxylgruppen, Oxocarbonylgruppen, Äthergruppen und Aminogruppen. Alle diese Gruppen können dazu verwendet werden, um die freie radikalische Funktionalität mit der basischen Hingstruktur zu verbinden. Zum größten Teil haben die interessierenden Steroide mindestens eine, gewöhnlich 1-4 Sauerstoff-Funktionalitäten, z.B. Alkohol-| Äther-, Esteroder Ketofunktionen. Die Steroide haben gewöhnlich 18 bis 27 Kohlenstoffatome.

Die Ringe können eine oder mehrere ungesättigte Stellen (äthylenisch oder aromatisch ungesättigte Stellen) aufweiseni sie können weiterhin in anderen Stellungen mit sauerstoffhaltigen Substituenten substituiert sein, z.B. in den Stellungen 6, 7 und 11. Weiterhin können Methylgruppen in den Stellungen 10 und 13 vorhanden sein. Die mit Z bezeichnete Stellung, nämlich die Stellung 17, kann sehr unterschiedlich substituiert sein, waa von dem jeweiligen Steroid abhängt. Z kann ein Carbonylaaueratoff, eine aliphatische Gruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen, einschließlich einer Acetylgruppe, einer Hydroxyacetyigruppe, einer

40984.4/102Ü

Hydroxy-Carboxygruppe oder einer Carboxyalkylgruppe asit 2-6 Kohlenstoffatomen, olne acetylenische Gruppe mit 2-6 Kohlenstoffatomen oder eine halogensubstituierte Alkyl- oder eine sauerstoffhaltige Alkylgruppe, oder eine Gruppe mit mehr alB einer Funktionalität, gewöhnlich mit 1-3 Funktionalitäten, sein*

Diese Steroide stellen Hormone dar, z.B. männliche und weibliche Geschlechtshormone, die in östrogene, Gestagene und Androgene unterteilt werden könnenj weiterhin können sie adrenocortiooide Hormone (Glucocorticoide), Gallensäuren, cardiotonische Glyooeide und Aglycone sowie Saponine und Sapogenine darstellen·

Als Beispiel für storoidähnliche Substanzen, Insbesondere Geschlechtohormone, sei Diäthylstilästrol angegeben.

Die intereooieronden Geschlechtshormone können in zwei Gruppen unterteilt werden« Die männlichen Hormone (Androgene) und die woiblichen Hormone (östrogene).

Brauchbare Formel

haben die nachstehend angegebene _w60 „61

- 1 äthylenisch ungesättigte Stellen

In dieser Formel können die Substituenten folgende Be· deutungen habeni

4098/a/1070

<ψ

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H Jeder der Gruppen \T kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ ist nachstehend definiert (ea i3t nur ein -X⁺-A⁺ je Molekül vorhanden)}

W iat Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W ist Wasserstoff, eine Methyl- oder Hydroxylgruppe

(wenn zwei Hydroxylgruppen mit demselben Kohlenstoffatom verbunden sind, handelt es sich um eine Oxogruppe);

62 61

W und W ^? sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, wobei mindestens eine dor Gruppen W "" ' eine Hydroxylgruppe (eine eigentliche Hydroxylgruppe oder eine Oxogruppe) darstellt.

Beispiele für Verbindungen, die spinraarkiert werden können, sind Testosteron, Androstoron, Isoandrosteron, Ätiocholanolon, Methyltestosteron und Dehydroisoandrosteron.

Die östrogene haben einen aromatischen Ring A und zum größten Teil die nachstehend angegebene Formel

«70 ₇₁

O odor 2 Htnylenioch ungesättigte Stellen

In der Formel können die Substituonten folgende Bedeutungen habent

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ oein bzw· ein H Jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt eein. X⁺-A⁺ iat nach-

4098U/102G

stehend definiert (ea ist nur ein -X⁺-A⁺ Je Molekül vorhanden)}

W iat Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe!

W iat Wasserstoff, eine Xthinyl- oder Hydroxylgruppe (wenn zwei Hydroxylgruppen an demselben Kohlenatoffatom stehen handelt ea sich um wine Oxogruppe);

W' iat Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und

W ' ist eine Hydroxyl- oder Alkoxylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen.

Beispiele für Verbindungen, die opinmarkiert worden können, sind Equilenin, Q-Öatradiol, Catron, östriol und 17- c<-Xthinyl-öatradiol.

Eine weitere Klaaae von Hormonen aind die Geetogene mit der nachstehend angegebenen Formel»

„80

) - 1 Uthyloniaoh ungesättigte Stellen In der Pormol habon die Subatituonten folgende Bedeutungen!

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ aein bzw. ein H jeder der

Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ eraotzt sein. X⁺-A⁺ iat nach

. _w ....... . , . ·+ »+ Je Molekül vor-

atehend definiert (ea iat nur ein -X -A ^- handen)j

QA Q4

W und W sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, wobei mindestens eine Hydroxylgruppo vorhanden ist (wenn zwei Hydroxylgruppen an demselben Kohlenstoffatom stehen, so tändelt es sich um eine Oxogruppe);

ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

W ' und W Bind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist.

Beispiele für Verbindungen, die spinmarkiert werden können, sind Progesteron, Pregnenolon, Allopregnan-3ai20a-diol und Allopregnan-3a~ol-20-on,

Die nächste wichtige Gruppe von Steroiden sind die Corticosteroide, die sowohl die Hineralocorticoido alt» auch die Glucocortiooide umfassen, Dieoo Verbindungen haben die nachstehend angegebene Formel

.96

.95

-2 äthylenioch ungesättigte Stellen

In dor Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen!

Dio Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ ist nach-

etohend dofiniort (ee ist nur ain -X -A handen)}

409844/1020

je Molekül vor-

iat Wasaeratoff oder eine Hydroxylgruppe|

91 92 W^J und Vr aind Waaaeratoff oder eine Hydroxylgruppe,

wobei mindeatena eine Hydroxylgruppe vorhanden iat (wenn zwei Hydroxylgruppen an denselben Kohlenatoffatom stehen, ao handelt es sich um eine Oxogruppe);

iat Waaserstoff oder eine Hydroxylgruppe!

W⁹⁴, W⁹⁵, W°⁶ und W⁹⁷ aind Waaaeretoff oder eine Hydroxylgruppe, wobei mindeatena ein W bzw. W⁹ Hydroxyl daratellt; und

98 W³ i8t eine Methyl- oder Pormylgruppe.

Beiapiele für Verbindungen, die apinmarkiert werden können, aind n-Hydroxydioxycorticoateron (Verbindung S), Deaoxycorticoateron, Cortiaon, CortiooBteron, 11-Dihydrooortiaon (Verbindung F), Cortisol, Prednisolon und Aldoateron,

Eine weitere Steroidfamllle umfaßt die Sapogenine, von denen Digitalis win wichtiges Glied Iat. Sie Orundrerbindung ist daa Gitoxlgenin, dao auch als Glycoaid vorkommt. Die interessierenden Verbindungen haben die nachstehend angegebene Formelt

0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen

409844/1020

In der Formel haben die Subatituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H Jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X -A ist nachstehend definiert (ea ist nur ein -X⁺-A⁺ je Molekül vorhanden)}

W^a1, W^a2 und W^a3 sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, gewöhnlich eine Hydroxylgruppe.

Marihuana

Obgleich es sich hier nicht um eine Gruppe von Verbindungen handelt, ist das Tetrahydrocannabinol (der wirksame Beatandteil von Marihuana) wegen seiner leichten Zugänglichkeit und wegen seines häufigen Gebrauches eine Verbindung von großem Interesse, weshalb eine einfache Analysenmethode wichtig wäre. Die Verbindungen, die als Analoge in Frage kommen, haben die nachstehend angegebene Formell

0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen CH₃

In der Formel haben die Subatituenten folgende Bedeutungen ι

W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A ^v ist nachstehend definiert (es iat nur ein -X⁺-A⁺ je Molekül vorhanden)»

4098U/102Ü

und ;?^a12 sind Waoaeratoff| und

W iat eine Hydroxylgruppe.

Vitamine

Die nächste Gruppe von Verbindungen umfaßt die Vitamine. Chemisch aind die Vitamine keine einfache chemiache Klaaae, da sie sich in ihrer Struktur atark unterscheiden! sie werden jedoch hinsichtlich ihrer Wirkungsweise ala eine Gruppe zusammengefaßt. Die Vitamine umfaoaen Vitamin A, daa ein Carotin daratellt, die Vitarain-B-Gruppe die Riboflavin, Thiamin, Niacin, Pyridoxin, PantothenaUure, Biotin, Polaäure und Cyanocobalamin (Vitamin B.p) einachließt, Aocorbinoüure (Vitamin C), die Vitamine D, die sich von den Staroiden ableiton, Tocopherol (Vitamin E), und PhAhyl-1,4-naphthochinon (Vitamin K).

Zucker

Die nächate Gruppe von Verbindungen umfaßt die Zucker und Saccharide. Die Saccharide aind Korabinationen verschiedener Zucker, die Dimere, Trlmere und hochmolekular· Polymere bilden, die man als Polysaccharide bezeichnet·

Prostaglandin

Eine weitere Gruppe von Verbindungen von biologischer Bedeutung sind die Prostaglandine, Diese Verbindungen haben markiert zum größten Teil die nachstehend angegebene Pormel

w®²⁰ , 0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen

^C6^H10-.12-^C0W

a24

/ 1020

fr

In dieser Formel haben die Substituenten die nachstehend angegebenen Bedeutungen!

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen ff kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ ist nachstehend definiert (es ist nur ein -X⁺-A⁺ j« Molekül vorbanden)!

W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

W^a21 und W^a22 sind Waoaerstoff oder eine Hydroxylgruppe (wenn zwei Hydroxylgruppen mit demselben Kohlenatoffatom verbunden sind, handelt ea sich um eine uxog/uppe)|

W^a25 ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe j und

W^a2* ist eine Hydroxylamino- oder Garboxygruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Alkoxygruppe·

Tranquilizer (Beruhigungsmittel)

Eine Reihe von Verbindungen hat Tranquilizer-Wirkung, und infolge ihrer mißbräuchlichen Verwendung kann ea Fälle geben, in denen ihre Bestimmung wichtig ist·

Der erste interessierende Tranquilizer ist Meprobamat, das auch ale Miltown oder Equanil bekannt ist. Diese Verbindung und ihre Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

0 C,H₇ Ο

η ι Jl '

W^a25 COOH₂ C—-CH₂-O-CW^a26

In dieser Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen ι

409844/1020

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H Jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ ist nachstehend definiert (es ist nur ein -X⁺-A⁺ Je Molekül vorhanden);

W und W^a sind Aminogruppen.

Die nächste Gruppe von Tranquilizern sind Benzdiazocycloheptane, die als Librium, Valium, Diazepam oder Oxazepam bekannt sind. Diese Verbindungen und ihre Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

a34

a35

In der Formel haben die Substitucnten folgende Bedeutungeni

Dia Gruppen W können -X⁺-A sein bzw. ein H Joder der Gruppen'kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ iat nachstehend definiert (es ist nur ein -X⁺-A⁺ Je Molekül vorhanden)!

und W^a55 sind Wasserstoff j W^a'¹ lot Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. die LInthylgruppe, bzw. kann in Verbindung mit W^Q' eine Doppelbindung zwischen dem Kohlenstoff- und Stickstoffatom bilden;

ist eine Amino- oder niedere Alkylaminogruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Methylnmlno/'ruppe, bzw, kann zusammen mit ff ^J eine Carbonyl gruppe bildenj

409844/1020

-Sr

iat Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe| und ist eine Oxygruppa oder zwei ungepaarte Elektronen.

Die nächste Gruppe von Verbindungen umfaßt die Phenothiazine, zu denen das Ohlorpromazin gehört. Diene Verbindungen haben zum größten Teil die nachstehend angegebene Formel

a40

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

W ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen, eine Dialkylaminoalkylgruppe mit 4-8 Kohlenstoffatomen, z.B. 3-(Dimethylamino)-propyl; eine N-Hydroxyalkylgruppe (Alkylrest mit 2-3 Kohlen3toffatomon), eine N'-Piperazinoalkylgruppe (Alkylrest mit 2 - 3 Kohlenstoffatomen), z.B. N-Hydroxyiithyl-N'-piperazinopropylj eine N-Alkylgruppe (Alkylrest mit 1 - 3 Kohlonntoffatomen), eine N'-Piperazinoalkylgruppe (Alkylront mit 2-3 Kohlenstoffatomen), z.B. N-Methyl-N'-piporn.zinopropyli und eine 2-(N-Alkyl)-piperidinylalkylgruppo, worin die N-Alkylgruppe 1-3 Kohlen3toffatomo und dio andere Alkylgruppe 2-3 Kohlenstoffatome onthttlt, z.B. 2-(N-Methyl)-piperidinyläthyl, wobei mindosteno zwei Kohlenatoffatome zwischen den Heteroatomen stehenj

ist Wasserstoff, Chlor, eine Trifluormethyl- oder Alkylmercaptogruppe mit 1-3 KohlenBtoffntomen, z.B. eine Methylrafircaptogruppo, oder eine Acylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. die Acuthylgruppoi und W^a42 und //^fl45 oind Wn.ineretoff.

409844/1020

fff

Andere Verbindungen

Die letzte Gruppe umfaßt andere Verbindungen, die eine Vielzahl von Drogen oder anderen Chemikalien einschließen, die in der Medizin, in der Tiermedizin und auf anderen Gebieten Anwendung finden·

In diese Gruppe fallen die Antibiotika, z.B. Penioillin, Chloromycetin, Actinomycetin und Nucleinsäuren oder deren Derivate, wie Nuoleoside und Nucleotide.

Von Interesse ist weiterhin das Serotonin, bei dem es sich um 3-(2^l-Aminoäthyl)-5-hydroxyindol handelt. -X⁺-A⁺ kann mit jedem der beiden Stickstoffatome oder mit der Hydroxylgruppe verbunden 3ein.

Natürlich erleiden viele der interessierenden Verbindungen im Stoffwechsel von Vertebraten Veränderungen. Die Jowoilige physiologische Flüssigkeit, die getastet wird, kann nur einen kleinen Teil bzw. nichts mehr von der ursprünglichen Verbindung enthalten. Deshalb kann die ursprünglich vorhandene Vorbindung nur als Metabolit (Stoffwochselprodukt) nachweisbar sein. In vi3len Fällen kann der Motabolit das Glucurcnid dor ursprünglichen Verbindung sein. In anderen Fällen kc nn die uraprüng^iche Verbindung oxydiert (hydroxyliert), roduziert, aoetyliert, deeaminiert, aminiert, methyliert oder 3tark abgebaut worden sein. Hat der Metabolit immer noch einen wesentlichen Anteil der räumlichen und polaren Geometrie dor ursprünglichen Vorbindung, so ist es häufig möglich, das Ligand-Analoge eutwodor auf die ursprüngliche Verbindung oder den Motaboliten zu beziehen. Unterscheidet sich der Metabolit deutlich von der ursprünglichen Verbindung, so wird das Ligand-Analoge auf den Metaboliten bezogen.

Von großem Interesse sind Metaboliten, die sich auf Krenkbeitszustärde beziehen, Beispiele für diese Verbindungen

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■βτ

sind Spermin, Galactose, Phenylpyruvsäure und Porphyrin-Typ I, die als diagnostisch für gewisse Tumoren, für Oalactosämie, Phenylketonurie bzw. kongsnitale Porphyrie gelten·

Zwei interessierende Verbindungen, die Metaboliten von Epinephrin darstellen, sind Vanillylmandelsäure und HomovanillinsäurQ. Bei diesen Verbindungen kann entweder die Hydroxylgruppe oder die Carboxylgruppe als die Stelle für -X⁺-A⁺ verwendet werden.

Eine weitere interessierende Verbindung ist Gluthethimid, worin das freie Radikal-Analog die nachstehend angegebene Formel bat»

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen!

Die Gruppen W können -X -A⁺ sein bzw. ein H jeöor der Gruppen W kann durch -X⁺-^⁺ ersetzt sein. X⁺-A⁺ ist nachstehend definiert (es ist nur ein -X⁺-A⁺ je Molekül vorhanden) )

und Vi^a^¹ sind Wasserstoff; und

W^a52 ist eine niedere Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. die Äthylgruppe.

Eine weitere intereesierande allgemeine Gruppe umfaßt die Pesticide, z.B. die Insecticide, Fungicide, Bacteriocide und Nematocide. Beispiele für diese Verbindungen sind

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Jk

Phosphate, wie Maiethion, DDVP, Dibroinj Carbamate, wie Sevin usw.

Da viele der biologisch wirksamen Substanzen nur in einer ütereoiaomeren Form wirksam sind, kommt dje aktive Form oder das Racemat in Betracht, wenn das Racemat brauchbar und leicht zugänglich ist. Die Antikörper sind für die jeweils als Hapten verwendete Form spezifisch*

Die freie radlkallacho Gruppe (A).

Die freie radikalische Gruppe ist ein otabilos freie3 Radikal, vorzugsweise ein aolcheo mit einem vorhültniomiiOig oinfachen ESR-Spektrura, das über eine verbindende Gruppe bequem mit dom Liganden verbunden worden kann. Es können verschiedene stabile freie Radikale verwendet werden, z.B. Verdazyle, Diarylamino-Radikalo, Aroxyl-Radikale und Nitroxidradikale (vgl. Forrester, Organio Chemiatry of Stable Free Radioais, Academio Press, New York (1968)).

Erfindungsgemäß sind die brauchbarsten Verbindungen die Nitroxyd-Radikalverbindungen, in denen das Stickstoffatom der Nitroxydgruppe ein· Hetero-Ringglied darstellt. Dieae Verbindungen können mono- oder bicyclisch, kondensiert oder unkondensiert sein, und enthalten normalerweise 7-36 Kohlenstoffatome, gewöhnlich 7-16 Kohlenetoffatome, wovon die Ringglieder normalerweise 5-9 enthalten. Die Verbindungen können 0-2 andere, gewöhnlich 0-1 andere Hetero-Ringglieder, nämlich Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel enthalten. Der Stickstoff und der Schwefel können mit Sauerstoff verbunden sein, wobei der Stickstoff mit einem Sauerstoffatom und der Sohwefel mit 0-2, gewöhnlich mit 0 oder 2 Sauerstoffatomen verbunden sein kann. Die Verbindungen haben normalerweise 0-1 endo-äthylenisch ungesättigte Stellen.

409844/1020

Eine spezielle Gruppe von Nitroxydverbindungen sind die Monoaryl- und Diaryl-Nitroxyde, in denen die ortho- und para-Stellung gewöhnlich mit Alkoxygruppen substituiert sind, um eine Reaktion zwischen den zwei Nitroxydverbindungen zu verhindern. Bei der Monoaryl-Nitroxydverbindung ist die andere Valenz des SMokstoffatoma mit einem tertiären Kohlenstoffatom verbunden.

Die Nitroxydverbindungen, die > rfin-iung^emüß verwendet werden können, haben die nachstehend ar^egebene Formell

worin Z und Z' organische Reete bedeuten, die nicht in der Lage sind, eine Doppelbindung mit dem Stickatoff zu bilden, ohne daß eine wesentliche Veränderung der Struktur eintritt| es handelt sich hierbei entweder um Arylreste, normalerweise Trialkoxyarylreste, oder um tertiäre Alkylrostoj sie können aber auch zusammen mit dem Stickstoffatom, an daa sie gebunden sind, einen mono- oder bicyolischen Plng mit 5-9 Ringgliedern bilden.

In aen meisten Fällen haben die verwendeten Verbindungen die nachstehend angegebene Formel, worin die Substituenten folgende Bedeutungen habent

R 0·

V I

./V

R und Ri sind Kohlenwasserstoffgruppen mit 1-12 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Alkylgruppen mit 1 - 3 Kohlenetoffatomenj

409844/1020 BAD ORIGINAL

Y i;it eine zweiwertige Funktionalität mit 3-27 Atomen

on Wauueratof f), gewöhnlich mit 3-12 Atomen

Waaaeratoff) und inageaamt 0-2 Heteroatomen; :;■ιιιι.τ.ν,οΓΓ, Stickstoff oder Schwefel, die Ringglieder
'lai !«toi lf.-n; Y bildet einen Ring au3 5-6 Ringgliedern
n.lt dem Kohlenotoff- und Stickstoffatom, an die die
Hlnggliotlfr gebundon aind. Einea der Was3eratoffatome,
Im mit dorn Kohlenstoff, gewöhnlich einem Ringkohlenatoffitom verbunden int, lot erootzt, 30 daß eine Stelle zur Verbindung mit dom Liganden vorgeoehen ist.

Y iut mit dem otickutoffatora dea Nltroxyda durch ein
Kohlenotoffatom verbunden, dao frei von Waoaer3toff ist oder daa ateriach an der Auo'oildung einer Doppelbindung mit dem Stlckatoffatom gehindert iat, z.B. durch eine
endo-Doppelbindung.

Eine bevorzugte Gruppe von freien radikallachen Verbindungen hat die nachatehend angegebene Formel»

In dl3ser Formel haben die Subatituenten folgende Bedeutungen!

R²"⁵ aind gleich oder verachieden, vorzugsweise gleich, und stellen Kohlenwasaeratoffreste mit 1 - 12 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen dar; vorzugsweise handelt es sich um Alkylgruppen und besondere bevorzugt um die Methylgruppe j

409844/1020

BAD ORIGINAL

Ce-

226A742

Y¹ ist ein zweiwertißfτ Rest mit 2-10 Kohlenetoffatomen, gewöhnlich mit 2-4 Kohlenstoffatomen, und mit 0 - 1 Heteroatomen, wobei 2-3 Rin^lieder, gewöhnlich Kohlenstoff, vorhanden sind; Y^ kann 0 - 1 äthylenisch ungesättigte Stellen hnben und bildet vorzugsvYeise einen Pyrrolin-, Pyrrolidin- oder Piperidinring. Die Heteroatome sind normalerweise Stickstoff, Saueratot? und Schwefel.

Eine Untergruppe des nonocycliachen Nitroxydo int der fünfgliedrige Ring mit einem Ring-Heteroatom, mit der nachstehend angegebenen Formel

0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen

»2-5

worin R wie vorstehend definiert sind.

Eine weitere Untergruppe umfaßt die Verbindungen mit eine·?, sechsgliedrigen Ring, mit der nachstehend angegebenen Formel

2—5

-'· äthylenisch ungesättigte Stellen

2—5 P

worin R ' wie vorstehend definiert sind und Z Kohlenstoff oder Stickstoff bedeutet.

409844/1020

BAD ORIGINAL

Die fünfgliedrigen Ringe mit Zwoiring-rHeteroatomen haben zum größten Teil die nachstehend angegebene Formell

R² 0·

worin Y folgende Bedeutungen hati

-(R⁴) (R⁵)C-N⁺=C-R⁶-

0"

-(R⁶)(R⁷)C-O-C(R⁴)(R⁵)- -(R⁴ ) (R⁵ )C-N=C-R⁶-CO1JH-C(R⁴ ) (R⁵)- .

7—S 6 7

worin R wie vorstehend definiert sind und worin R und R

2—5

die gleiche Bedeutung wie R haben können oder Wasserstoff darstellen können.

Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen mit einem freien Nitroxyd-Raa ."..al hat die nachstehend angegebene Formell

R² 0· r'-C L^ ₆

η⁵ (i-)_q

worin q = 0 oder 1, vorzugsweise 1 ist, wobei im Falle q = 1 der Stickstoff, an den der Sauerstoff gebunden ist, posit:
sind.

positiv ist, und wobei R ⁵ und R wie vorstehend definiert

Beispiele für derartige Ringe umfassen 1-Oxylpiperidin, 1-Oxylpyrrolidin, 1-Oxylpyrrolin, 1-Oxylimidazolidin, i-Oxyl-3-oxy-imidazolidin, I-Oxyltotrahydropyridin und 3-Oxyloxazolidin. _40984W1020

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Die Brückenkopf-Hitroxydverbindungon haben zum größten Teil die nachotohend angegobone Foraelt

worin Y* und Y* zweiwertige aliphatioche Kohlonwaaaoratoffreate mit 0-1 ttthyleniach ungooiittieten Stellon und 2-3 Kohienetoffatoinen darotollon.

Die letzton, opeziell in Betracht zu ziehenden Nitroxyde aind die Arylnitroxyde mit der nachatohend angegebenen Formel»

0·

worin Tr eine 2,4»6-TrialkoxybonzolG'ruppo darstellt, in Y/elcher die Alkoxygruppon 1 - 3 Kohlonotoffatorae enthalten und worin Z die gleiche Bodoutun^ v/io Ί/ hat oder eine tertiäre Alkylgruppo mit 4-12 Kohlonatoffatonion, gev/öhnlich mit 4-6 Kohlcnotoffatouon bodoutet.

Die Verdasyle haben zum größton Toil dia nachotohend angegebene Pormol ,

f ^H

T/orin Z ein Kohlenwaooorotoff- odor oin Aoyloxyroot mit

1 - θ Kohlenotoffatouon und Z oin Arylroot odor ein boispielßweieo rait Hydroxy- oder Aninoßruppon oubatituiortor Arylreot mit 6-10 Kohlenstoffatomen bodoutet.

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Wie achon goeagt, ist die freie radlkaliache Gruppe über oino Bindung oder eine verbindende Gruppe, die ala Subotituont an dor froion radilcaliochon Gruppe durch Auatauoch eines der Waeooratoffatone angobracht iet, mit dom Liganden vorbunden. Woitorhin können eohürfere Spektren erhalton werdon, wonn man dio Uaoaorotoffatome duroh Deutoriumatomo ersotzt. lot aloo in Vorbindung nit der freien radikaliachon Gruppe von tfnaaorotoff die Rode, ao aoll Doutorium ala Äquivalont eingooohloeoon sein·

Bei der Durchführung dor Erfindung, inabooondere, wonn der Ligand koinon natürlich vorkorraondon Rozoptcr hat oder v;onn oa boquoaor lot, Antikörpor horzuotollon, v/Jrd dor Ligand modifiziert, dorart, daQ oino Gruppe vorgesehen wird, die Bit oinoa Protein verbunden v/ordon kann. Deshalb wird eine roaktionofilhigo Funktionalität in den Ligandon oingoführt, ontwodor durch Aktiviorung einer bereite vorhandonon Funktionalitiit, 3.B. durch üborführung einer Carbonoauro in oin gouioohtoo Anhydrid, odor duroh Einführung oinor nouon Funktionalitüt, z.B. duroh Modifizierung oinor Hydroxylgruppe durch oino Oarboxymothylgruppe. Da dio gobildoton Antikörpor don Liganden mit Doinor vorbindondon 3ruppo, dor zur Horotollung dee Antißor. Mfitorialo vorwe. dot vnirdo» erlconnon, wird normalorwoiao dor gloioho Ligand nit ooinon vorbindondon Gruppen, dor zur Horotollung doo Antigon-Üatoriala vornondot V7ird, ßuoh cur Bindung dor froion radikalioohon Gruppe vorwondot. DocliQlb oind dio Oubotituonton cn dor froion radilcalioohen Gruppe ο ehr h'iufiß vorhttltnior.'iniß oinfaoho Subotituonten, wio Anino-Hydroxyl- und Oarbosylgruppon.

Boiapiolo für Vorbindungon, dio zur Vorknüpfung mit dem Liccndcn vornondot v/ordon könnon, oind i-Ozyl-3-aaino-2,2,5,5-totrcmothylpyrrolidin, 1-0xyl-3-hydrosy-2,2,5,5-to trcnothylpyrrolidin, 1 -0xyl-3-oarbosy-2,2,5» 5-totmnethyl-

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■Mr

pyrrolidin, 1-0xyl-3-oarboxy-2,2,5» 5-tetramethylpyrrolidin, 1-0ryl-4-amino~2,2,6,6-tetramethylpiperidin, 1-Oxy1-4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin, 1-Oxyl-4-carboxy-2,2,6,6-tctramethyltetrahydropyridin, 2-LIethylamino-1,3-dioxy-4,4,5,5-tetramothylimidasolin, 2-Hydroxymethyl-1,3-dioxy-4,4,5,5-totramothylimidazolin und 1 -Amino-T-oxyl-T-azabioyclohoptan.

In vJ.elen Fällen kann es vorteilhaft soin, oino reaktionafähige Gruppe an der freien radikaliochen Gruppe zu haben und diese mit dem Ligandon zu vorbindon. Wonn abglich, ooll dioQO Gruppe eine funktionollo Brücko zua Liganden vom gleichen Typ oder oocar die gloicho Junktionolle Brücke liefern. In Wlrklichlcoit kann einfach auch der ungokohrte Pall vorliegen, wobei die endGültigo Verbindung die gleiche ist, wie wonn die Vorbindondo Gruppo am Ligandon vorhanden wäre. Bofindot oich bciopiolo-.voiao oine Aminogruppo am Liganden, do könnte die Lignndonsruppo bu ein ;k Iaooyanat modifiziert worden. Bcfindot oich ciaa Aninogruppo am froion Radikal, oo lot co in ontoprochenJer Vioioo ebenfalls möglich, diooo Auinofjxuppo sau oinor Ioooynnatgruppo zu modifizieren. Die Brücke biltlot die Uroylongruppe, ganz gloioh, violchoö Vorführen an£Q'..'ondot wurde.

Boiopiele für Verbindungen, dio cuu Vorknüpfen der freien radikaliochon runktionalitiit mit dem Ligandcn vor\7endet wordon können, oind 1-0::yl-2,2,5,5-totranothyl-3-ioooyanatopyrrolin, 1-02:yl-2,2,5,S-totrcathyl-J-ioothiocyanatopyrrolidln, II-(1-Oxy1-2,6-diaothyl-2,S-dibcnsyl-piporidin- · 4-yl)~üUccincaidDUuro, U~(1-0ryl-2,2,5,5-totraUthylpiporidin-4-yl)-maloamiöoüuro, N-(1~0xyl-2,2,5,5-tetra-• butylpyriOlidin-3-yl)-osalc.riidoUuro, Mono-(1-0xyl-2,2,5,5-totramothyl-piporid-4-yl)-fuiaarat, N-(1-0xyl-2,2,5,5-totruraothylpiporid-4-yl)-tflyoin, 1-Oxy1-2,2,5,5-tetramethylpyrrolid-3-ylDulfonylooaigcüuro, 1-Oxyl-2,2,5,5-totramethyl-3~hyöroxypyrrol^ din, 1-Oxy1-2,2,5,5-totramethylpyrrolin-3-ylocirboncäuro, N-( 1 -0j:yl-2 »2,5, S-tetramothylpyrrolidin^-yD-torophthalamidaäniO. 1-Oxyl-2,2,5,5-pyrrolidin-3-yl)-malonat,

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1-Oxylpyrrolin-3-yl-3»5-diapiro-(i'-cyclopentanj-carbon eäure, 4,4,5,5-Tetramethyl-1,2,3-trioxyimidazolin, 4 »4,5»5-Tetrapropyl-2-brommethyl-1-oxyl-3-oxydⁱ-imidazolin, 4,4,5,5-Tetrabenzyl-2-(p-aminophenyl)-1-oxyl-3-oxyd imidazolin, 4,4,5,5-T9traraethyl-2-chlorEiulfonyl-methyl-1- oxyl-3-oxyd-imidazolin, 4,4,5»5-Tetramcthyl-2-oarboxy methyl-1-oxyl-3-oxyd-imidazolin, 4,5-Ditiethyl-4,5-(butylen-1

A)-2-iaocyanatomothyl-1-oxyl-inidazolin, 4,4,5,5-Tetra-

methyl-2-corbcxycarbonyl-1-oxyl-3-oxydo-imidazolin,und 2-Chlorcartonyl-1-oxyl-3-oxydo-imidazolin-4,5-di8piro- (1'-oyclohexan).

Verbindende odor vorltnüpfende Gruppon

Die Gruppe -X⁺- hängt von den zur Verbindung mit A⁺ verfügbaren Stellen ab. Zum größten Teil aind die gorfügbaren Gruppen am Liganden Hydroxyl(-OH)j Amino /_J_jj worin R⁸ gewöhnlich Waeeeretoff oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen darstellt)| Meroapto (-SH)| oxo (-C=O) j Carboxy (-CO₂H) und Methin (^CH), wobei H gewöhnlich an ein aromatlachea KohlenBtoffatom gebunden ist und der Ring vorzugsweiae durch Oxy- oder Aminosubetituenten aktiviert ist.

Die Hauptfunktion der verbindenden Gruppe beeteht darin, daa freie Radikal in einem verhältniamäßig kurzen Abstand zueinander mit der verbindenden Gruppe zu verbinden. Die verbindende Gruppe kann aber auch noch andere Punktionen haben, z.B. die Lösliohkeitaeigenachaften des Endproduktes zu modifizieren. Insbesondere wenn verhältnismäßig große Hydrophobegruppen verwendet werden, wie bei den Steroiden, kann eine aalzbilder.de Gruppe in die verknüpfende oder verbindende Gruppe eingeführt werden. Beispiele für solche Gruppen sind Carboxylate, Sulfonate, Sulfate und quartäre Ammoniumsalze. Das Gegenion kann Jedes beliebige Gegenion sein, das vorzugsweise einwertig ist, z.B. Chlorid, Fluorld, Alkalisalz, Ammonium usw.

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Die verbindende Gruppe enthält gewöhnlich O - θ Kohlenatoffatome, gewöhnlich 0-6 Kohlenatoffatome, und 1 - 8 Heteroatome, gewöhnlich 1 - 6 Heteroatome, bei denen es sich um Bauerstoff, Schwefel und Stickstoff, gewöhnlich um Sauerstoff und Stickstoff, handelt. Die Gogenionen für die salzbildende Gruppe sind in der Anzahl der Heteroatome nicht eingeschlossen. Ala vorbindende Funktionalitäten werden vorzugav7eise die Gruppen nicht-Oxocarbonyl oder Thiocarbonyl, Alkylamino oder Alkoxy verwendet.

Die Kettenlänge der verbindenden Gruppe beträgt vorzugsweise 1-10, gewöhnlich 2-6 Atome bzw. das Äquivalent, wenn es sich um oyolische Strukturen handelt.

Die nachstehende Aufstellung zeigt die verschiedenen verbindenden Gruppen, in Abhängigkeit von den Funktionalitäten am Liganden und am freien Radikal.

I»iftand Freies Radikal

(HydroxyltO-)ι Amino(-N(R⁹)) Hydroxyl(-0-)jAmino(-N(R⁹))

Η -σ-

-J-

-8-z-

-SO₂-Z-SO₂

-8-Z-SO₂

-SO₂-Z-C -Z-SO₂

-SOp-Z 409844/1G20

R - Waaaeratoff oder oin Kohlonwaaaeratoffreat mit 1 - 6 Kohlenatoffatomeni

Z¹ iat eine Alkylidenylgruypei

Z iat eine Bindung oder ein Kohlenwaaooratoffreat mit 1 - 10 Kohlenutoffatocien, gewöhnlich e1no Alkylengruppe mit 1 - 6 Kohlenatoffatomon, eino Alkenylongruppe mit 2-6 Kohlenatoffatomen, eine Alkinylongruppe mit 2-6 Kohlenatoffatomen, eine Cycloalkingruppe mit 4-10 Kohlenatoffatomen, eine Arylengruppe mit 6 - 10 Kohlenatoffatomen, eine Oxyalkylengruppe mit 4-8 Kohlenstoffatomen oder eine Azalkylengruppe mit 4-8 Kohlenetoffatomen.

Wenn die verbindende Funktionalität eine Hydroxylgruppe daratellt, ao wird Z oder eine nicht-Oxooartonylbindung zur Hydroxylgruppe bevorzugt, inabeoondere Z·

Wenn die verbindende Funktionalität eine Aminogruppe daratellt, ao werden eine nioht-Oxooarbonylgruppe, eine nicht-Oxothiooarbonylgruppe oder Z bevorzugt, inabeaondere eine nicht-Oxocarbonylgruppe.

Ligand
(Oxooarbonyl (C=O))

Preiea Radikal (Hydroxy (-O-)fAmino(-N(R⁹)-)

-N-O-Z

=N-O-Z-CO

=N-O₂CZCO-

=CHCH-

«NNH-Z-CO-

-NNH-Z-CS-

1 020

Ligand _fi ^Pies Radikal

(Nicht-OxocarbonyK-ö-) (Hydroxy(-0-)J Amino(-H(R )-)

O-Z-CO- -N(R⁷J-Z-CO-

-N(R⁷J-Z- -0-Z-

FreiosE

(Methin (5CH)) (Hydroxy(-O-)l Amino(-K(R J-)

N₂-Z"-N²-Z^M-C0-

worin Z und R⁷ wie voratohend definiert eind und Z" eine Arylengruppe mit 6-10 Kohlenstoffatomen darstellt.

Wenn die freie radikalische Gruppe eina Oarboxy-P-nktionalität (Hicht-Oxocarbonyl) hat, so liegen die Gruppen ii oder 0 -C-O-

-C-N(R')- vor. worin der Sauerstoff und der Stickstoff be« liebig mit einer der vorstehend angegebenen Gruppen verbunden sind, und worin Z oder Z" mit dem Sauerstoff oder Stickstoff verbunden sind.

Wenn das freie Radikal eine Oxooarbonylgruppe hat und der Ligand eine Hydroxyl- oder Aminogruppe darstellt, so braucht man lediglich die verbindende Gruppe für daa Oxooarbonyl ao Liganden und die Hydroxyl- oder Aminogruppe an der freien radikalischen Gruppe umzukehren.

Die nachstehende Tabelle zeigt die verbindenden Gruppen für die Oxocarbonylgruppe im freien Radikal sowie andere Gruppen

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ale die Hydroxyl- oder Aminogruppe am Llganden.

L J. flan d (Oxocerbonyl (C=O))

=Π-Ο-Ζ-Ο-Ν·

=N-0₂C-Z-C0₂N« "N-O-Z-CO₂H"

-NNH-Z-NHN-

Llfland (Nicht-cärbonyl (C=O))

Ll/?:and (LIethin (=CH-)

-O-Z-O-N»

-N(R⁷)-Z-O-N« -0-N- -Ο-Ζ-ΙΠίΝ» -N(R⁷)-ZHNN-

-N₂-Z'-0-N- -Ν~-Ζ·-ΝΗΝ»

-N₂-ZCO₂N- -N₂-ZCONHN-

Frolea Radikal (Oxocarbonyl (C=O))

Freies Radikal (Oxocarbonyl (C =0 ))

Frolea Radikal (Oxocarbonyl (C = 0)

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Wenn der Ligand eine Moroaptogruppe hat, ao ist die Maloinsäuroamid-Funktionalität besonders brauchbar, wobei der Inidstickstoff entweder dirokt oder übor die voratehond beschriebenen Funktionalitäten (z.B. Carboxynethyl) mit der freien radikalischen Gruppe verbunden ist.

Während die froie radikaliache Funktionalität in den meisten Fällen an jeder beliebigen Stellung des Liganden gebunden sein kann, entweder Über eine Funktionalität, die im Ligandon natürlicherweise vorhanden ist, oder über eine synthetisch eingeführte Funktionalität, gibt es bevorzugte Verfahren, um die freie radikaliocho· Funktionalitat mit dem Liganden zu verbinden. Zuerst sei darauf hingewiesen daß der mit dem freien Radikal substituierte Ligand keine biologische Aktivität zu haben braucht. Es geht lediglich darum, die Geometrie und die Beziehungen zwischen den polaren Stellen eines größeren Teils des Moleküls nicht zu stören. Deswegen wird man, wenn die Synthese bequem durchzuführen ist, die freie radikalische Funktionalität normalerweise an einem Ende des Moleküls einführen.

Will man weiterhin ein Molekül aus einer Vielzahl von verhältnismäßig ähnlichen Molekülen untersuchen, z,B. Steroide die sich hinsichtlich ihrer Subatituenten in der Stellung unterscheiden, so zieht man es vor, da3 Molekül an einer Stolle entfernt von dor Funktionalität mit der freien Hadikalfunktionalität au inarkieronj auf diese Weise wird eine Unterscheidung zwischen der ?u untersuchenden Verbindung und ähnliohon Verbindungen, die in dom zu untersuchenden Gemisch vorhandon sein könnon, getroffen. Bei der Untersuchung von Storoidon ist oo häufig vorzuziehen, die Bindung an dor Stellung 3 anstatt an der Stellung 17 vorzunehmen da der unterschiedliche Teil dos Moleküls normalerweise in der Stellung 17 etoht und die Stellung 3 zum größten Teil die gleiche bleibt oder sich nur daduroh unterscheidet daß es sich um einon Alkohol oder ein Koton handelt.

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Bei einem niedrigmolekularen Polypoptid ist ea vorzuziehen, die freie radikaliache Gruppe mit einer Aminosäure zu verbinden, die unnittelbar nichts mit der Rozeptorstelle zu tun hat, anntatt mit einer Aminooäuro, die mit einer Rezeptorstelle zu tun hat. Deshalb bestoht eine Hauptregol darin, daß man nicht die sich unterscheidende Stelle des Moleküls duroh Bindung dor freien radikalischon Funktionalität an dieser Stelle modifiziert, wodurch man eine Geometrie schaffen würde, welche die Funktionalität des freien Radikale und nicht die Funktionalität des Moleküls beschreiben würde. Weiterhin kann ea oich ergeben, daß eine bessere Verbindung mit einem Rezeptor dann erziolt wird, wenn die freie radikalioche Funktionalität an einer Stello und nicht an einer andoron Stolle gebunden wird. Dies kann leicht dadurch festgestellt werden, duO man oino Anzahl von mit freien Radikalen modifizierton Ligand-Vorbindungen herstellt und ihre Gleichgowichtükonzuntratiun mit dem Rozoptor bestimmt. Dies gilt beaonderu dann, v/onn dor Ligand ein Hapten ist. Faat immer lot die Stollo dea Ligandon, gowöhnlich die verbindende Gruppe, dio gleiche für dio Vorbindung des Liganden mit dem Protein wie die für dio Bindung des Liganden zum freien Radikal. Auf dioue Waiae ist der Jeil dos Ligand-Moloküla, dor vom Protein nbotaht und der mit der größten ffahrochoinlichkeit don Toil dos Moleküle bildet, der ala "Schablone" für die Antikörper Jient, der gleiche Teil des Moleküls, dor durch die verbindende Gruppe der freien radikaliech.n Gruppo nicht modifiziert ist.

Eine ausgezeichnete Erörterung von vorbindenden Gruppen für Steroide, die mit Proteinen verbunden werden, findet eich bei Poron et al.. Immunologie Methode in Steroid Determination, Appleton-Contury-Crofts, New York, 1970.

Dor Rezeptor ErfindungoßonüO handelt ee sich bei den Rezeptoren um Makromoleküle mit Stellen, die epozifiache Strukturen erkennen.

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Die Erkennung der spezifischen Strukturen beruht auf van der Waale-Kräften, die eine besondere räumliche Umgebung liefern, wodurch die ran der Waals-Kräfte verstärkt werden ι weiterhin beruht sie auf Dipol-Wechoolwirkungen, •ntweder durch permanente oder induzierte Dipole| auf Wasserstoff- und Ionen-Bindung, auf fcoordinative aovalente Bindung und, in einigen Fällen auf oovalente Bindung. Ein* ausführliche Erörterung der Median! nmfcn, nach denen die Rezeptoren Liganden binden, 'indet sich bei Goldotein et al, Principle*» of Drug Action, Harper and Rowe, Now York, 1968.

Makromoleküle mit den größten Interesse sind Proteine und Nuoloirsauren, die in Zollen, Blut und anderen bilogisohen Flüssigkeiten vorkommen. Unter diete Verbindungen fallen Enzyme, Antikörper, Ribonucloinoäuro (ENS) und Dooox/ribonuoleinaäure (DN3), Trilgorprotoine, wie Trnnnoortin, thyroidbindondes Globulin (TBG), thyrcidbinderidoo Prttalbumin (TBP) und "gebundene" Pezoptoren (d.h. Rezeptoren, die an Zellmembranen gebunden sind).

Die bequemste Gruppe von Proteinen, die erfindungagomäß vorwondot worden, sind Antikörper. Dieae Substanzen werden zweckuüßig bei der Analyoo der Liganden-Kategorie verwendet, dio ala Hnptono bezeichnet wird. Antikörper werden durch Einführung oinor itaiunoßonen Substanz in den Blutkreislauf einoa Lobovioaeno erzougt. Die Reaktion auf die Einführung dor imaunogonen Substanz odor doe Antigens besteht in der Dildung von Antikörporn, die das Antigen überziehen und unciftig nachon bzw. es aus der Löcung ausfällen. Die Antikörper bilden einon überzug,dor geometrisch so angeordnet lot, daß or oich dor räumlichen Anordnung des Antigens anpaßt. Dioo kann mit einem Schloß und einem Schlüssel ver-' gliohon worden. Die Wechselwirkung ist normalerweise rovoroibol, derart, daß das Antigen auf verschiedene Weise vordrUngt oder entfernt worden kann, ohne daß die Rezeptorsteile zerstört wird.

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β gibt viele Substanzen, die Antigene daretellen und die ei der Einführung in den Blutkreislauf eines Säugetiere eine Immunreaktion erzeugen. Eine Anzahl von internierenden Substanzen Bind Jedoch keine Antigene, sondern Heptene, und in dieaem Pall let ein weiterer Schritt zur Herstellung des, Antikörpers erforderlich. Dieses Verfahren zur Herstellung von Antikbrporn mit Substanzen, die keine Antigene sind, ist bekannt und iat z.B. in Microbiology, Hoeber Medioal Division, Harper and Rone, 1969 boochrioben. Es sei auch auf Landateiner, Speoificity of Sorologioal Reactions, Dover Publications, H.Y. 1962| Kabat et al, Experimental Immunochemietry, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1967 und Williame et al, Methode in Immunology and Immunochemistry, Vol. I₁ Academic Press, New York, I967 verwiesen.

Das zu untersuchende Material wird in beliebiger Weise mit einem Protein verbunden, und das modifizierte Protein wird in den Blutkreislauf eingeführt. Es können verbindende Gruppen vom gleichen Typ wie eur Verbindung des freien Radikaie mit den Liganden verwendet werden. Die sich bildenden Antikörper schließen Gruppen von Antikörpern ein, die so geformt sind, daß sie mit der FremdBubotanz (Haptcn),die an das Protein gebunden ist, zusammenpassen. Auf diese Weise erhält man Antikörper, die für die Verbindung oder das Hapten, das mit dem Protein gebunden ist, spezifisch sind. Durch sorgfältige Trennverfahren können die in erster Linie mit dem fraglichen Hapten zusammenhängenden Antikörper konzentriert werden, so daß eine Antikörper-Zusammensetzung erhalten wird, die in erster Linie mit dem spezifischen Hapten, das mit dem Protein gebunden war, zu tun hat.

Zur Erläuterung dieses Verfahrens wird para-Aminobenzol-Arsonat zum Diazosalz dlazotiert. Durch Vereinigung des Diazcsalzes mit Kaninchen-Globulln wird das Kaninchen-Globulin mit para-Azobenzol-Arsonat markiert. Durch Einführung dieser Zusammensetzung in den Blutkreislauf eines

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anderen Tieres *ls eines Kaninchens, z.B. eines Schafea, können Antikörper gebildet werden, deren räumliche Anordnung daa Azobenzol-Arsonat "erkennt".

Neben den Antikörpern gibt es eino Anzahl von natürlich vorkommenden Rezeptoren, die für Verbindungen mit biologischem Intare3se apezifiach sind. Vorbindungen, für die natürliche Rezeptoren existieren, sind Thyroxin, Corticosteron, Cortison, H-Desoxycortisol, 11-IIydroxyprogesteron, östrogen, Insulin und Angiotonsin. (vgl. beispielsweise Vonderhaar et el, Biochem. Biophysios Acta, 176, 626 (1969)). Alle diese ligandon wurdon untersucht und sind in der Literatur in Verbindung mit Untersuchungen über ihre Verbindung mit spezifischen Rezeptoren erwähnt.

Falls gewünscht, können die Antikörper mit einer Reihe von Trägern verbunden werden. Die Verbindung kann in ähnlicher Weise wie die Verbindung eines Proteins mit einem Liganden durchgeführt werddn. Die Träger umfassen beispielsweise Polyacrylamide, Copolymere von Vinylacetat und Acrylsäure, Polyvinylester, modifizierte Zellulose, Agaro3e, Sepharose usw. Der Wert des Trägers besteht darin, daß der Antikörper auf diese Weise leicht von der Lösung getrenn., und die klare Lösung analysiert werden kann. Aus diesem Grund ist das Spektrum der am Antikörper absorbierten Radikale in der Prcbe nicht vorhanden. AIa Beispiel für einen Träger sei para-Aminobenzamidoäthyl-Bio-Gel P-60, Hersteller Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien genannt.

Um das große Gebiet der erfindungsgemäö analysierbaren Verbindungen zu zeigen, wurde eine Anzahl von verschiedenen Haptenen mit deutlich unterschiedlicher Struktur und Polarität verwendet und auf verschiedene Weise mit unterschiedlichen nitroxydhaltigen Radikalverbindungen verbunden. Diese Verbindungen sind keine Antigene und wurden deshalb

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mit Proteinen verbunden, die anschließend zur Bildung von Antikörpern verwendet werden. Die Antikörper werden mit und ohne Träger verwendet.

Experimentelles

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung, nioht aber zur Beschränkung der Erfindung.

Bolnplel 1

Syntheee von 3-_ζ/~2·-(2·, 4"-Dinitroanllino)-aoetamido7-2»2,5,5-tetramethylpyrrolidinyl-i-oxyl

250 mg Glycylamido-2,2,5,5-tetrQniethylpyrrolidinyl-1-oxyl wurden unter Rühren in 2 ml Methanol gelöst. Der Lösung wurden 0,5 g Kaliumbicarbonat und anschließend 0,5 ml 2,4-Dinitrofluorbenzol zugesetzt. Die Gaoontwicklung hörte nach einer Stunde auf, worauf die Lösung mit 10 ml Wasser verdünnt und mit 3 Anteilen (15 ml) Chloroform extrahiert wurde. Die vereinigten organischen Schichten wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert uni eingedampft. Der ölige Rückstand wurde mit 500 ml Chloroform und anschließend mit 250 ml Chloroform/Aooton im Verhältnis 1 r1 auf Kieselgel chromutographiert. Nach dem Eindampfen der Lösung und dem Umkristallisieren des Rückstandes unter Zusatz von Benzol wurden 370 mg (86 #) Produkt erhalten·

P. 125 -127°C (zers.) (umkristallisiert aus 5 ml Xthylacetat). Analysei C₁₆H₂₂N₅O₅I i> theor.i C, 5O,52| H, 5,S2| N, 18,41

£ gefunden! C,5O,45|H, 5,89| N, 16,17. Molekulargewichts 380,396 E3R-Spektrum a_N » 14,1 Gauß (^Aenzol)

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Beispiel 2

3-^~3 '-(2- ^"-DinitrophenylaminoJ-propylZ-carbamoyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidinyl-1-oxyl

250 mg 3-^"3 ·-Prop/laminoZ-oavbamoyl^,2,5,5-tetramethylpyrrolidinyl-1-oxyl wurden in 2 ml Methanol unter Rühren gelöst, worauf 0,5 g Kaliunbicarbonat und 0,5 nil 2,4-Dinitrofluorbenzol zugesetzt wurden, Na. Ii 2 Stunden wurde dae Gemisch in einen Scheidetrichtor gebracht, mit 15 nl Wasser verdünnt und mit 3 Antoiltm (je 15 ml) Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über wasserfreiem llagnesiunaulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der braune Rüokstand wurde mit Äthylacetat auf Kieselgel chroiratographiort. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels fiel ein öl an, das bei Zusatz von Äthylacetat/Tetrachlorkohlenstoff unter Bildung gelber Kristalle (280 mg) kristallisierte. P 150 - 151,5°C

Analyse: O₁₃K₂₆N₅O₆I <f> theor.» 0, 52,92; H, 6,42| N, 17,15

i> gefunden: C,52,6OfH, 6,4Oj N, 16,95

Molekulargewicht 408,4 Beispiel 3

4-(2«,4^l-Dinitroanilino)-2,2,6,6-tetramethylpiperidino-1-oxyl

50 mg 4-Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidino-1-oxyl wurden unter Rühren in 2 ml Methanol gelöst, worauf 0,5 mg Kaliumbicarbonat und 0,5 ml 2,4-Dinitrofluorbenzol zugesetzt wurden. Es trat ein Niederschlag auf, und nach 12 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit 15 ml Wasser verdünnt und mit 3 Anteilen (jeweils 15 ml) Chloroform extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Beim Chromatographieren auf Kieeelgel mit Chloroform wurden zwei gelbe Bänder erhalten. Die langsamer wandernde orangegelbe Komponente wurde gesammelt, und der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde aus Chloroform urakristallisiert, wobei orang gefärbte Kristalle (P. 178-179°C) erhalten wurdeni diese wurden vollständig

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erstarren gelassen und bei 189 - 19O⁰C erneut geschmolzen.

Analyse: C₁₅H₂₁N₄O₅₁ * theor.i C, 53,4Of H, 6,28| N, 16,61

* gefundeni C, 53,29» H₁ 6,18| N, 16,38 Molekulargewicht 337»3

Beispiel 4

3-Z~2'-(O* -Korphino)-acotanid£7-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl

139 mg J-

und 153 Eg Morphin wurden unter Stickotorf in ^ ml Äthanol mit 22 mg Natriumhydroxyd 2 Stunden unter Rückfluß gehalten, las Reaktionsgeni3ch wurde mit V/ao3or verdünnt, worauf 2 ml einer 2-molnren Kaliumhydroxydlöoung zugesetzt wurden. Nach dem Extrahieren mit Chloroform und erneutem Extrahieren der Extrakte mit Waoser wurde die Chloroformlösung mit Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem gelben, glasigen Rückstand eingedampft (F. 75 - 81°C). Krintallioationovoreuche führten zu keinem Erfolg. Die Kieselgulchromatographie mit Chloroform/ Methanol im Verhältnis 9»1 orgab eine Hauptfraktion, die das Nitroxydradikal darstellte. Das Radikal wurde durch Extraktion dea Kieselgela mit Methanol isoliert, erneut chromatographiert und wie vorstehend angegeben isoliert. Nach dem Eindampfen do_k .Methanols, orneutera Auflösen in Chloroform und Zentrifugieren wurdo dan im Methanol lösliche Kieselgel entfornt. Nach dem Eindaupfen wurden 113 mg oiner gelben, glasartigen Substanz erhalten.

ESR-Spektrum» a^ » 14,58 GauO (CHCl₅)

Bo I?) pi el 5

4-^~2'-(o' -Morphino)-acetamid£7-2»2,6,6-tetramethyl-Fipcridino-1-oxyl

153 ng Morphin wurden in 4 ml «absolutem Äthanol unter Stickstoff gelöst, worauf unter Rühron 146 mg 4-Bromacetamido-2 2 6 6-tetramothylpiporidino-1-oxyl zugesetzt wurden. Nachdem

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die Lösung 2 Stunden unter Rückfluß gerührt wurde, wurde aie über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die lösung wurde mit Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert (2 χ 30 ml).

Die vereinigten organischen Schichten wurden nochmale mit 50 ml Wasser (mit 3 Tropfon 1-molarer XOH-Löaung) extrahiert und dann " =er waacerfreien MgSO. getrocknet. Nach dem Filtrieren unrt Eindampfen des Lösungsmittels hinterblieb ein braunes öl, das bei der Dünnachichtchromatographie eine Houptkomponente ergab. Das Produkt konnte nicht kristallisiert werden.

Beispiel VI

pyrrolin-1-oxyl

A. Einer gerührten Lösung von 100 mg (0,58 mMol) 3-Hydroxymethyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl und 11,49 mg (0,62 mMol) tri-n-Butylamin in 15 ml absolutem Äther wurden 71,3 mg (0,60 mMol) Thionylchlorid zugesetzt. Dao Roaktionagemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend eingedampft. Das erhaltene öl wurde durch Dünnochichtchromatographie auf Kiesolgolplatton mit Chloroforn geroinigt. Die erhaltene gelbe PlÜooißkeit wurde unmittelbar für die nächste Reaktionsotufe verwendet.

B. Natriumhydrid wurde in aboolutom Xth?.nol gelöst und mit HCl-Normallösung bis zum Phenolphthalein-Endpunkt titriert. 30,2 mg (0,10 m!Iol) Morphin wurden in Xthanol, das 0,10 mMol Natriumhydrid enthielt, g. löst und unter Stickstoff gerührt. Dor Lösung wurden 18,8 mg (0,1 mMol) der /orstehend angegebenen Verbindung, gelöst in 1 ml absolutem Äthanol, zugosetzt, und die Lösung wurde 2 Stunden unter Rückfluß gohalten. Das Rouktionogomisch wurde dann dekantiert und eingedampft. Dao erhaltene öl wurde durch Dünn-

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schichtchromatographie mit Kieselgelplatten unter Verwendung von Chloroform-Methanol im Verhältnis als Eluierungamittel gereinigt. Es wurden 15 mg eines gelben, glasartigen Produktes erhalten.

Beispiel 7 0 -Carboxymethylmorphin

909 mg Morphin wurden 4 Stunden bei 50⁰C untor 0,01rraHg getrocknet. Das getrocknete Morphin wurde in 19 ml absolutem Äthanol gelöat, worauf 350 mg trockenes Natriumchloraoatat und anschließend 125 mg Natriumhydroxyd zugesetzt wurden. Nach dem Spülen mit Stickstoff wurde die lösung 4 Stunden unter Rückfluß gerührt. Die heiße Lösung wurde mit 3,8 ml äthanolischer Salzaäuro (0,85 Molar) behandelt und anschliessend noch warm filtriert. Doim Stehen über Nacht bildete sich ein Niederschlag (272 mg) der gesammelt und aus Äthanol/ Wasser umkriatallisiort wurde. Doi Zuoatz von Äther sum ursprünglichen Filtrat wurdo oin weiterer Niedoraohlag erhalten, der ebenfalls auo Äthanol/tfausor umkrintallisiert wurde. Qeaamtauubeute 600 mg (55 /«). Boim Erhitzen dieses Produktes in Vakuum bei 75⁰O wurdo ein Gewichtoverlust, entsprechend 0,48 Hol Äthanol odor 1,15 Mol Wasser festgestellt. Die getrocknete Verbindung zersetzt aioh bei ]<jO - 22O⁰C (in Abhängigkeit von dor Erhitzungogeochwindigkeit.

Analyeei C₁₉H₂₁NO₅I # thoor.i C, 66,45| H, 6,i6j N, 4,08

</, gofundoniC,65,87| H, 6,98; N, 4,09, 4,07

MNR (O₅D₅N) 2,44 ppm (-CH₅), 5,03 ppn (-CH₂COO)

Bolnpiol 8

KonJußQtion von Carboxymothylmorphin mit Poly-L-Lysin (PLL)

50 mg Poly-L-Lyoin-Hydrobromid (Miles Lot. LY 115A)

(1,14 χ 10"^ Hol) wurdon in 1 ml trockenom Dimethylformamid suepondiert, worauf 0,241 ml 1-normale Natriumhydroxydlösung

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zugesetzt wurden. Die suspendierte Substanz löste sich fast vollständig auf,(5 mg Rückstand).

In einem getrennten Kolben wurden ">2,4 cig (0,033 mMol) Carboxymethylmorphin in 1 ml Dimethylformamid (IM?) gelöst (mi⁺ weniger DMP wird die Säure nicht aufgelöst) und auf -15°C abgakühlt. Der Lösung wurden 3,28 g (0,033 mMol) Chloraiüsisensäureäthylester zugesetzt. Die Lösung wurde 20 Minuten bei -15°C gerührt, worauf zuerst die PoIy-L-Lysin-Lösung und anschließend 2 ml zum Auswaschen des Kolbens, der das Poly-L-Lysin enthielt, zugesetzt wurden. Es bildete sich ein Niederschlag. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 0⁰C gerührt, mit Wasser verdünnt und gegen destilliertes Wasser (sechsmal ausgetauscht) dialysiert· Nach der Gefriertrocknung wurde ein Rückstand von 19 mg erhalten.

Bestimmung des Kon.1ugatlona/?rados_

Das Ultraviolettspektrum wurde bei 280 nm in einer 1 om-Zelle gemessen» d = 0,25 bei einsr Konzentrat"¹..;, von 0,28? g/Liter in Wasser.

€²⁸⁰-Carboxymethylmorphin <= 1070, C^ = o. Dor Konjugaticn3grad kann aus diesen Worten und dar Formell d β (* Oarboxymothylinorphin + PLL)Q

^{+ M0}PLL

worin X die Anzahl der Haptono Je lloloktil, G dna Gewicht des ProteinkoniUGät-3'..; Je Litor und HG dun Molekulargewicht bedeuten, wobei sich ClSi auf daa Hapton und PLL auf dao Protein beziehen»

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Da das Molekulargewicht des Proteins 27.000 betrug, ao iat X « 30 Haptene/Molekül. Beispiel <?

Konjugation von Carboxymethylmorphin zu Rinderserumalbumin (RSA)

240 mg Carboxymethylmorphin, suspendiert in β ml trockenem DMP, wurden auf -15°C gekühlt und mit Θ4 /ul Chlorameiaensäureiscbutylester behandelt. Die feste Subatunz löste sich nach dem Rühren bei -15⁰C über einen Zeitrauü von 30 Minuten. Dieser Lösung wurden 400 mg Rinderoerumalbuniin, gelöst in 56 ml Wasser, das 2,6 g Natriumbicarbonat enthielt, zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei O⁰C gehalten. Das Gemisch wurde dann gegen destilliertes Wasser dialyaiert, wobei das Wasser viermal ausgetauscht wurde (Dialyseverhältnia 1i80), und gefriergetrocknet, wobei 390 mg Konjugat erhalten wurde.

Haptenkonzentration im Protein

d = 0,59 €^2β0 = 41600 ζ²⁸⁰ - 1070

R3A CMM

^MGCMM ^{β 527 M0}RSA ^β

Belsplel/ft Bindung von Antikörpern an Trägem

50 mg para-Aminobenzamidoathyl-Bio-Gel P-60 wurden in 10 ml Wasser suspendiert und mit 1-normaler Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 4,5 angesäuert. Die Suspension wurde auf 4°C abgekühlt, worauf 6 mg Natriumnitrit, gelöst in 2 ml Wasser, über einen Zeitraum von 10 Minuten zugesetzt wurden. Ein Anteil von 1 ml einer 1ö^-molaren Lösung von gereinigten Morphin-Antikörpern wurde mit dem vorstehend angegebenen Material bei einem pH-Wert VQn 9 unter Aufrechterhaltung der Temperatur vermischt. Nach

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40 Minuten wurden 20 mg Resorcin zugesetzt, um die restliche Diazoniumverbindung aufzufangen. Der feste Stoff wurde dann abfiltriert und mit einem Boratpuffer von pH = 8 gewaschen.

B. Die auf dem Träger befindlichen Morphin-Antikörper (50 mg) wurden in 10 ml einer Boratpufferlöaung (pH = β) mit 10"⁴ Mol 4-Z~2'-(0³"-Morphino)-acetamido7-2,2,5,6-tetra-

raethylpiperidino-1-oxyl suspendK.-t und 2 Stunden gerührt. Nach dem Abfiltrieren und dem Waschen Bit Wasser wurde ein fester Stoff (50 mg) erhalten, der breite ESR-Signale zeigte, was darauf hinweist, daß das mit dem freien Radikal markierte Morphin am Rezeptor gebunden war.

Beispiel 11. Isolierung von Antikörpern

In 20 ml Dimethylformamid wurden 400 mg Aminoäthyl-Bio-Gel P-60 und 300 mg Carboxymethy]morphin (vgl. Beispiel 7) sowie 1 g Natriumbicarbonat gegeben. Nach zweitägigem Rühren der Suspension bei A⁰O wurde diese filtriert, der Rückstand mit Wasser gewaschen bis die Waschwässer neutral waren, worauf der Rückstand in Vakuum getrocknet wurde.

Das erhaltene Produkt wurde dann in 20 ml Kaninchenaerum, das Morphin-Antikörper enthielt, suspendiert und 4 Stunden bei 4°C gerührt. Nach dem Abfiltrieren wurde ein Rückstand erhalten, der erneut in 5 ml 0,1 molarem Phthalatpuffer (pH = 3,8) suspendiert und 2 Stunden gerührt wurde. Das Gel wurde abzentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit gegen 0,1 molaren Phosphatpuffer (pH = 7,4) dialysiert, wobei eine gepufferte Lösung mit praktisch reinen Antikörpern erhalten wurde.

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Beispiel 12 Heratollung von Kanlnchenaerum und ^-Globulin

Antlaeron können wie folgt erhalten werdeni Das Antigen (Hapton, gckoppolt mit elnora geeigneten Protein) wird in oinor KoohonlzlöQung (9 g/Liter) alt einor Konzentration von 2 mg/ml zuboroitot. Jo Antoil von 1,0 ml dioaer LöBung worden glolchzoitig 3 ml vollatündigeo Freund'achoo Adjuvane in homogoniulortor Form alt Hilfe einer Zwoiwogonadel eingofUhrt. FUr aubkutano Injoktionon wordon nn jede Stelle otwu 0,3 ril (Antimon * Freund'ucho Lüoung) injlzlort, bei Jntraporitonoalon Injektionen otv/a 0,4 ml. Die geoamte Dooia betrugt otwa 4,0 ml Je Kaninchen.

Nach 3-4 tfochon wird eine otarke intramuekulüre Injektion auB 0,5 ml der vorutehond angogobenon Kochaalzlöaung und 0,5 ml vollotiindigem Freund'achera Adjuvana injiziert. Nach 5-7 Tagen wird daa Kaninchon durch Horzpunktur geblutet.

Iat die gewünochte Blutmengo geoammolt, so läßt man daa Blut koagulieren und entfernt daa Koagulat. Die hinterbleibende Löaung wird dann 10 Minuten bei 2000 U/rain zentrifugiert. Das gesammelte Serum ist frol von loeen roten Blutkörperchen.

Ein gleiches Volumen gesättigter Ammoniumaulfatlöaung wird dem Serum unter Rühren bei 4°C zugetropft. Nachdem die Lösung 1 Stunde bei dieser Temperatur gestanden ist, wird sie 15 Minuten bei 10.000 U/min zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird entfernt. Der Rückstand wird in einem möglichst kleinen Volumen von 1 X PBS (phoaphatgepufferte Salzlösung, nachstehend noch näher erläutert) suspendiert, in einen Dialysebeutel gebracht und über Nacht gegen 1 X PBS (pH = 7,0) dialysiert. Der P.ückatand im Dialyaebeutel wird dann isoliert und eingefroren.

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Zur Herstellung von 1 Liter 10 X PBS werden 76,5 g NaCl, 7,25 g Na₂HPO. (wasserfrei), 2,12 ίζ KHgPO^ und 10,0 g NaN vereinigt, mit destilliertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt und mit 1-normaler HCl auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Die 1 X P33 wird durch 10-fache Verdünnung erhalten, wobei sich der pH-Wert infolge der Verdünnung auf 7,0 - 7,1 ändert.

Beispiel 13 Phenobarbital-RSA-Konjugat

5,08 g (0,02 Mol) Natriumphenobarbitsl, 2,16 g (0,02 Mol) Chloressigsäuremethyleater, 14 ml !!ethanol und eine katalytische Menge DMP (1 ml) wurden 2 Stunden unter Rückfluß gehalten. Während dieser Zeit schied sich ein weißer Niederschlag aus. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und abfiltriert. Das raethanoliache FiItrat wurde zur Trockne eingedampft, wobei etwa 5 g eines gunmiartigen Materials erhalten wurden, das beim Stehen erstarrte. (Der Niederschlag aus der obigen Filtration löste sich teilweise auf wenn er nochmals mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Das wasserunlösliche Material (etwa 50 mg) «rwies sich als das dialkylierte Produkt).

Das erstarrte Material wurde mit 20 ml 1-normaler NaOH-Lösung 15 Minuten gerührt und dann filtriert. Hierdurch wurden die alkaliunlöslichen Derivate von dem monoalkylierten Produkt und nichtumgesetzte» Phenobarbital abgetrennt. Das alkalieche Filtrat wurde mit konzentrierter HOl bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert, und der weiße, guuuniartige Niederschlag wurde in Methylenchlorid aufgenommen.

.Nach dem Trocknen (über MgSO₄) und Eindampfen des organischen Lösungsmittels wurden 4 g eines gummiartigen Materials erhalten. Dieses Material wurde in Benzol gelöst und über einer Kieaelgelsä'ule (40 g) chromaxographiert. Es wurde mit

Chloroform eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 100 ml gesammelt wurden. (Der Verlauf der Chromatographie wurde durch Dünnschichtchromatographia verfolgt, da daa dialkylierte Produkt einen R_f von 0,9, daa monoalkyüerte Material einen R_f von 0,6 und Phenobarbital einen R- von 0,1 mit Chloroform/Methanol im Verhältnis 95:5 hat).

Die vereinigten Fraktionen 2-5 ergaben nach dem Eindampfen 1,6 g einer gummiartigen Ha3se, die beim Stehen erotarrte. Nach dem Verreiben mit Petroläther und Abfiltrieren wurden 1,5 g eine3 weißen Pulvers erhalten, das durch NMR als daa erforderliche monoalkyüerte Derivat, nämlich N-I.!ethoxycarbonylmethylphenobarbital nachgewiesen v/erden kpnnte.

Sine weitere Eluierung mit Chloroform (500 ml) ergab 1,5 g eines weißen festen Stoffes, der als nichtumge3etztes Phenobarbital nachgewiesen werden konnte.

B. 1 g des wie vorstehend hergestellten Monoestera wurde mit 10 ml 20 £-iger HCl-Lösung 3,5 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das abgekühlte Reaktionsgemiach wurde mit 2C ml Wasser verdünnt und mit Äther extrahiert. Die Eindumpfung dea Ätherextraktes ergab 0,98 g einer farblosen gummiartigen Substanz, die beim Stehen sehr langsam erotarrte. Durch

117.1R- und Dünnschichtchromatographie-Analyse konnte nach-

. jj dec,Estc.r vollqtandir zur gewiesen werden, daii <ii<3 Saure *ci4'j.;;li·:;·.;·^ hydrolisiert war.

Eine reine Probe der Säure wurde durch prtiparative Dünnachichtchromatographie für die UV-Analyue mit Chloroform/ Methanol im Verhältnis 5:1 ala Eluierungumittol horgoatellt.

C. 3 ml des wie vorstehend hergestellten Carboxymothylphenobarbitala wurden auf -15⁰C abgekühlt. Der mit Hilfe einee Magnptstabea gerührten Löaung wurden 0,14 ml (1,0 mMol) Triäthylamin und 0,13 ml (1 mMol) Chloramoiaonaüureiaobutylester zugesetzt. Das Reaktionagoraiech wurde 10 Minuten bei

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-15⁰C und dann 30 Minuten bei O⁰C gerUhrt.

Daa gemischte Anhydrid wurde Iar.g3am einer eisgekühlten Lösung von Rindersorumalbumin (R3A) (400 mg) in 56 ml Wasser, das 2,6 g Natriuoibicarbonat enthielt, zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden bei O⁰C gerührt und dann gegen destilliertes '.Yasser dialyaiert, wobei dieses (jeweils 4 Liter) viermal gewechselt wurde. Die dialysierte Lösung wurde dann zentrifugiert und dekantiert, wobei 118 ml einer klaren Lösung erhalten wurden. Die Lyophylisierung von 10 ml dieser Lösung ergab 0,036? g Proteinkonjugat, entspreohond einer Ge^aatauabeute von 0,427 g Konjugat. Der Rest der Lösung wurde wiederum mit einem Phosphatpuffer (pil » 8) dialysiort, wobei die Pufferlösung viermal in Abständen von 3, 17_f 24 und 49 Stunden ausgetauscht wurde. Schließlich wurde 48 Stunden gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet, wobei 0,325 g Proteinkonjurat erhalten wurden. Eine UV-Eichkurve mit RSA und Carboxyaethylphenoburbital in einem Η-,ΒΟ-,/HaOH/ KCl-Puffer bei pH = 10 ermöglichte die Bestimmung der Anzahl der Haptonnoleküle auf dem RSA. Es waren 15 Carboxymethylphenobarbital-Kolekülo Je Molekül RSA vorhanden.

Hoinplol 14. Secobarbi tal-RSA-Konjugat

A. Ozon wurde durch eine gokühlto (Trockeneis/Aceton) Lösung von Natrium-Scoobarbital (2,6 g, 0,01 tfol) in 250 ml Methanol geleitet. Nach Boomllgung ^_QT Ozonolyoo (KJ-Test positiv) v/urdo Stickntüff durch dan Roaktionagemisch geleitet, un allo Spuren von Ozon zn entfernen, worauf 7 ml Dimothylnulfid mittnlo oinor Spritze dor kalten Lösung zugoootzt wurden, die über Nacht boi Raumtemperatur stehen gelaasen wurde. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittel wurde dor RUckntand mit 20 ml Wasser verdünnt, mit konzentrierter HOl angesHuort und 3 x mit Je 20 ml Chloroform oxtrahiert. Dor Chloroformextrakt wurde über KgSO^) gotrooknot und eingedampft,

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wobei 2,4 g oinea gummiartigen, farblosen Materials erhalten wurden. Durcn NKR-Analyse konnte die Anwesenheit einer Aldehydgruppe bei 5 » 9»7 ppm nachgewiesen werddn. Das ProduKt wurde ohne weitere Reinigung für die Umsetzung mit Malonsäure verwendet.

Eine Probe de3 reinen Aldehyds (0,24 g, 1 mMol), 0,21 g (2 mMol) Malonsäure, 20 ml Pyridin und 1 ml Piperidin wurden miteinander 6 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wurde im Schnellverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde in einer 10 >'i-igen Natriumcarbonat-Iö3ung gelöst. Die Bicarbonntlösung v/urde 3 x mit je 20 ml Äther gewaschen und dann mit konzentrierter HCL angesäuert. Dann wurde die Lösung 2 χ mit je 20 ml Äther und anschließend mit 2 χ 25 ml Chloroform extrahiert und anschließend über MgGO.) getrocknet, worauf die vereinigten organischen Schichten eingedampft wurden. Es wurden 0,23 g (Ausbeute 60 ',O) einen weißen, festen Stoffes erhalten, der mit Hilf ο dor U.VR-Analyuo eis die gewünschte 5-(r>L-croton-L'iiure)-5-( 1 ' -uoth,ylbutyl)-barbitursäure nachgewiesen werden sonnte. Nach dem Umkristallisieren aus CHC1-/CC1. wurden 0,16 g reines Matorial erhalten.

Zu einer Lösung von 5-( SC~Croton3äure)-5-(1'-methylbutyl)-barbitursäure (0,282 g, 1 müoi) in DMF (3 ml), die auf -Ii)⁰C (ll.'.a-Salzbad) abgekühlt war, wurden 0,28 ml (2 mllol) Iriäthylamin und 0,13 ml (1 mMol) Chlorameiaen3äureisobutylestor gogoban. Das Rühren wurde noch 15 Minuten bei -15°C ·. nd dann 30 Minuten bei O⁰C fortgesetzt. Das Reaktionsgemische wurdo dann mit Hilfe einer Spritze zu einer gekühlten Lösung von 400 mg RSA in 56 ml Wasser, daa 2,6 g NaHCO, enthielt, zugotropft. Das Reaktionsgemisch wurde in einem kalten Raum 5 Tage bei O⁰C gorührt, wonach die anfängliche Trübung fast vollständig verschwunden war. Die Lösung wurde dann gogon 4 Liter Phosphatpuffer (pH = 8), dann gegen destilliertes Wasser dialyeiert, woboi das govrünschte Konjugat erhalten wurde·

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Das Anhydrid kann zur Verbindung mit 4--Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidino-1-oxyl oder 3-Amino-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidino-1-oxyl verwendet werden_r um den mit dem freien Radikal markierten Liganden zu bilden.

Beispiel 15
Konjugation von Meperidin mit Rindersemmalbumin (RSA)

A. 142 mg Meperidin-Hydrochlorid wurdan unter Stickstoff in 2,5 ml einer 4-molaren Kaliumhydroxydlöaung und 5 ml Methanol 2 Stunden unter Rückfluß gehalten. Der Methanol wurde mit Hilfe eine3 Drehverdampfers entfernt. Die wäßrige Lösung wurde bis auf einen pH-Wert von 8,1 neutralisiert. Es bildete sich ein Niederschlag, der gesammelt und getrocknet wurde. Ausbeute 79 rag (76 #); P 298 - 300⁰C.

B. 54,8 mg des wie vorstehend hergestellten 4-Carboxy-1-methyl-4-phenyl-piperidin wurden in 3 ml KiP :. ispendiert. Die Lösung wurde auf -15⁰G abgekühlt, worai ' ^2,8 /Ul Chlorameisensäureisobutylojt-Rr zu^caetiit wurden. Das Gemisch wurde unter Rühren auf -15° gehalten. Nach 30 Minuten wurde die Lösung zu einer Lösung voiri6i mg RSA in 18 ml V/aooer gegeben, das 1,1 g Natriumbicarbonat gelöst enthielt. Dan Gemisch wurde über Nacht in einem kulten Raum aufbewahrt. Ea wurde ßfigendeutiliierten Wasser (0Oi1) dinlyuiort, wotoi dioooa innerhalb von 36 Stunden 3 x auußotnuacht v/urdo. Bui dnr Lyophylisierung hintorbliebun 150 W. RUokntnnd. Er enthielt 32 Haptene jo Moloktll ΙΙΰΑ (nach{;c-.viouen durch UV-Analyse).

Bolonlol 16

3_(4«-(4«-rhenyl-1 '-methylpiperidin)-carbamoyl)-2,2,5,5-to tramothyl-1-pyrrolidinyloxyl

A. 110 to« 4_Carboxy-1-mothyl-*-P^nony^l-P^lP^Qridin (vgl. Beispiel 15) wurden in 3 ml frioch destilliertem TIIP und

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178 mg (110 /Ul) Thionylchlorid 30 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Die unlösliche Säure ergab einen voluminösen Niederschlag. Nach der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand in 3 ml trockenem Pyridin gelöst und zu 231 mg 3-Amino-2,2,5,5-tetramethyl-i-pyrrolidinyloxyl gegeben. Nach 1 Stunde bei 0⁰C wurde daa Reaktionagemi3ch mit Waas3r verdünnt, und der pH-Wert auf 11 eingestellt. Durch zwei Extraktionen mit Äther und zwei Extrnktionen mit Äthylacetat wurde das Radikal auo der wäßrigen Pha3e entfernt. Der Extraktionsrückstand wurde mch dor prüparutlv.«n Dünnschichtchroraatographie abgetrennt. Die gelbe D'in-Je mit dem niedrigsten R_f-'.7ert enthielt ein Amid (IR-Analyse). Ea wurde mit Methanol von dem Kie3elgel entfernt und au3 Benzol/Hexan umkri:;talliuiert. P 84 - 86⁰C.

Beispiel 17

Konjugation von 4-Carbiithox.y-1-carboxymeth.yl-4-phenylpiperidin mit Rinderaeruraalbumin (RSA).

A. 2,23 g 4-Cyano-4-phenylpiperidin-Hydrochlorid wurden in 15 ml Wasser gelöst, dem 4 ml 50 '^-iges wäßriges Ka 1-iumhydroxyd zugesetzt waren. Daa öl wurde 3 χ mit 15 ml Äther extrahiert, und die organischen Schichten wurden über wasserfreiem Magr.eaiumoulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Eindampfen der Lösung wurde ein Rückstand erhalten, der zusammen mit 3 ml Methanol und 1,23 ml einer 50 #-igen wäßrigen Kaliumhydroxydlösung in eine Glasampulle gebracht wurde. Die zugeschmolzene Ampulle wurde ^SStunden auf 165 - 17O⁰C erhitzt, und der Inhalt wurde anschließend mit 50 ml '.Yasser verdünnt. Nach der Extraktion mit Chloroform wurde die wäßrige Phase mit DOWEX 50-X8 (H*-Form) auf einen pH-Wert von 6 neutralisiert. Nach dem Filtrieren und Eindampfen wurde ein Rückstflnd (0,82 g) mit einem Schmelzpunkt von mehr als 300⁰C erhalten. Nach dem

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Umkristallisieren aus "Yasser und dem Trocknen über Phosphorpentoxyd wurde eine Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 285 - 286*0 erhalten.

B. 1,8 g 4-Carboxy-4-phenylpiperidin wurden in 50 ml

5 feiger äthanolischer Chlorwasserstoffsäure 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Der nach dem Eindampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde in Aceton gelöst, und der unlösliche T?il abfiltriert. Aus der Acetonlösung hinterblieb nach der Eindauipfuntf ein viokoses Öl, das beim Stehenlassen cristalliyierte.

P 107 - 11O⁰C (1,068 g). Das Material wurde ohne weitere Reinigung verwendet.

Alternative

B¹. Eine Lösung von 4-Cyano-4-piperidin-Hydrochlorid in

6 ml 66 #-iger Schwefelsäure wurde auf 145⁰C erhitzt und 45 Minuten gerührt. Beim Abkühlen auf 125° wurde die Lösung etwas viskoser. Durch Zugabe von Alkohol (Rohr des Tropftrichters unter der Oberfläche de3 Reaktionsgemiaches) wurde die Temperatur auf 105° erniedrigt. Diese Temperatur v/urde 4 Stunden beibehalten. Während der ersten Stunde wurden 20 ml Alkohol zugesetzt, in den nächsten Stunden jeweils 6 ml. Die Alkoholdämpfe wurden durch kontinuierliche Destillation entfernt. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Temperatur auf 125° erhöht, bis sich kein Kondensat mehr bildete. Die heiße Lösung wurde in 6 ml Wasser/40 g Eia, enthaltend 8 g Natriumhydroxyd gegossen. Nach dreimaliger Extraktion mit jeweils 70 ml Äther, Trocknung über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Entfernung des Lösungsmittels hinterblieb ein öl, das bei 112 - 115°C/0,2 mm Hg abdeatilliert wurde. Ausbeute 4,01 g (54 #),

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^J' '"^{Ο1 K 4}~^Cart)äthoxy-4-phenylpiperidin wurden in 13 ml

absolutem Alkohol gelöst und zusammen mit 2,01 g Natrium- -hloracetat unter Rückfluß erhitzt. Nach 7 Stunden konnte 'lurch Dünnschichtchromatographie kein Au3gang3material »lehr nachgewiesen werden. Das ausgefällte Natriumchlorid •v-irde abfiltriert und mit 3 ml Äthanol gewaschen. Beim Abkühlen des Filtrates traten weiße Kristalle auf. Nach dem Filtrieren und Trocknen wurden 2,9 g (58 yi) der vorstehend angegebenen Verbindung erhalten. ?. 148 - 150*0. Beidi Eindampfen der Mutterlauge wurde eine glasige Substanz erhalten, die aus Aceton/Hexan nicht kristallisierte.

D. Eine Lösung von 1,76 g 4-Carbäthoxy-1-carboxymethyl-4-Phfinyl-piperidin in 65 ml absolutem DMP wurde auf -10⁰C abgekühlt, worauf 680 /Ul Chlorameisensäureiaobutylester zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 45 Minuten unter Rühren auf -1O°C gehalten. Das gemischte Anhydrid wurde zu 3,2 g R3A, gelöst in 450 ml Wasser, das 21 g Natriumblcarbonat enthielt, zugetropft. Es trat eine leichte Trübung auf, nachdem ein Drittel der DMF-Lösung zugesetzt war. Die Trübung wurde teilweise durch Zusatz von weiterem 250 ml Wasser entfernt. Nach dem Rühren über Nacht bei 4⁰C und der Dialyse gegen destilliertes Wasser (2 Tage) wurde die Lösung zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen und lyophylisiert. Die UV-Analyse zeigte 46 Haptene je Molekül RSA.

Beispiel 17

3-(2-(4-Carbäthoxy-<-phenyl-piperidino-D-acetamido)-2,2,5,5-tetraraethyl-1-pyrrolidinyloxyl

69, 3 mg 4-Carbäthoxy-4-phenylpiperidin wurden in 2 ml JLthanol gelöst, worauf 82,3 mg 3-(2-Broraacetamido)-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidinyloxyl-1 in 2 ml Äthanol zusammen mit 40,8 mg Kaliumcarbonat zugesetzt wurden. Die Lösung wurde 2 Stunden unter Rückfluß gehalten und mit 20 ml Wasser verdünnt. Bei der

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JiU-

Extraktion mit Äther ging die gesamte öelbe Färbung leicht in die organische Phase. Der Rückstand der organischen Ph-^e wurde zweimal aus Benzol/Hexan umkristalliaiert und ergab 118 mg gelbe Kristalle. F. = 98 - 99⁰C.

Beispiel 19

4-(2-(4-Carbäthoxy-4-phenyl-1-piperid-'io)-acetamido )-2,2,6,6-tetratnethyl-1 -piperidinooxyl

33,7 mg 4-Carbäthoxy-4-phenyl-piperldin wurden in 2 ml trockenem Äthanol gelöst und zu der Lösung von 104,3 ^g 4-(2-Bromacetamido)-2,2,6,6-tetramethylpiperidinooxyl in 2 ml Äth.'injl, der 49,8 mg Kaliumcarbonat enthielt, gegeben. Nach dem Erhitzen dee Reaktionsgeraisches unter Rückfluß über einen Zeitraum von 2 Stunden wurde die Lösung mit 20 ml V/aaaer verdünnt. Der pH-V/ert wurde auf 12 eingestellt, und die Löuung wurde mit Äther extrahiert. Die gesamte gelbe Färbung ging in die organische Phase. Nach dem Verdampfen dea Äthera hinterblieb ein Rückstand, der aus Benzol/ Hexan umkri3tallisiert wurde. P. 137 - 138°C (48 mg).

Leiapiel 20

3-Carboxy-2,2,5,5-tetramethyl-1 -pyrrolidinyloxyl-(4'-carbathoxy-4'-phenyl)-piperidid

52,2 mg 3-Carboxy-2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidinyloxyl wurden in 2 ml trockenem Benzol zusammen mit 30 /Ul Pyridin gelöst. Der eiskalten Lösung wurden 27 /Ul Thionylchlorid zugesetzt. Nach einstündigem Rühren wurden die Salze unter Ausschluß von Feuchtigkeit abfiltriert und mit trockenem Benzol gewaschen. Das Pil trat wurde eingedampft, und der Rückstand bei 0,1 mm Hg 1 Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. 77,4 mg 4-Carbäthoxy-" 4-phenyl-piperidin wurden in 1 χ 3 ml Pyridin gelöst und zu der Lösung des vorstehend angegebenen Säurechlorids bei 0°C gegeben. Nach einstündigem Rühren bei O⁰C wurde daa Reaktionsgemisch mit 20 ml Äthylaoetat verdünnt und wit 20 ml

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0,1-normaler HCl extrahiert. Der Rückstand der organischen Fhase wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie (Methanol/Chloroform 1*9) abgetrennt. Es trat ein farbloses Band mit einem R~-Wert von 0,8 auf, bei dem es sich um die vorstehend angegebene Verbindung handelte. Nach dem Eluieren des Kieselgels mit !!ethanol wurde eine blaßgelbe Verbindung erhalten, die nach zwei Umkristallicierungen aus Cyclohexan bei 114 - 116°C schmolz.

Beispiel 21

Herstellung von Amphetarain-Rindorserumalburain-(RSA)-Konjugat

A. 3,68 g Amphetarainsulfat (20 mtfol Amin) wurden in 80 ml 0,5-norraaler Natriumhydroxydlöaung golö3t. Die alkalische Lösung wurde mit Äther extrahiert, der Äther getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 ml Benzol gelöst, worauf 3 ral Diiaopropyläthylamln und dnnn 2,2 ml (20 mMol) Bromesaigsäureäthylester zugegeben wurden. Da3 Reaktionsgemioch wurde 1 Stunde unter Rückfluß gehalten, abgekühlt, filtriert, und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthor aufgenommen, einige MnIe mit iVaa3or gewaschen, der Äther getrocknet und eingedampft. Der roino Aminoester wurde durch Säulenchronnto;;raphio auf Kicu»ilfiol (Hexan/ Äther = 7:3) erhalten. Auabeuto 3,1 g (70 ^). Die NMR-

und IR-Analyoe stimmt mit der Struktur überein.

B. 2,5 g (11,3 mllol) des Aminooatora wurden in einem 1i1-Gemisch von Methanol und 1-normaler Natriumhydroxydlösung

(50 ml) gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur stehen

wurde
gelassen. Das Gemisch auf ein kleines Volumen eingedampft, 2 x mit je 25 ml Äthor gewaschon und mit konzentrierter HCl bia G.uf einen pH-Wort von 6 angesäuert. Die sich abscheidenden Kristalle wurdon aus Äther/Acoton umkristallisiert, wobei zwoi Fraktionen erhalten wurdet 900 mg mit einem Schmelzpunkt von 222 - 225⁰C (Schmolzpunkt nach der Lite ratur 220 - 225⁰C, Totra. Lettom. 1966, 4603 - 7) und

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450 mg mit einem Schmelzpunkt von 210 - 218⁰C. Nur die erste Fraktion wurde für die weiteren Umsetzungen verwendet. .H₂O 257, €» 159.

max

700 mg (3,8 tallöl) Amphatarcincnrbonar.ure wurrlan bei 40° in 50 ml trockenem Dioxan auapeniiert, ,vorauf ?0 nl einer 12,5 Gew.-^igen Phoagenlö3un^ in Benzol auf oinml zugesetzt wurden. Das Reaktion3geini3ch wurde 3 1/2 Stunden bei 40 - 5O⁰C gerührt, zur Trockne eingedampft und in 20 ml trockenem Dioxan gelöst. Diese Lesung '.-rurde für die nächste Reaktioneatufe in Eis gehalten.

Die vorstehend angegebene LÖ3ung -.v.irde in 4 Anteilen über einen Zeitraum von 1/2 Stunde zu einer gerührten Lösung von 2 g Rinderaerumalburain in 100 ml 2 ;i-iger NaiICO.,-Lösung bei O⁰C gegeben. Daa Reaktionäre::;! u"h wurde 24 stunden bei 0⁰C und 18 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Es wurde 2 Tage gegen 35 Liter V/aaser von O⁰C dialyoiert und lyophyliaiert. Da3 Volumen der Dinlyaolöaung an Ende betrug 200 mlj 10 ml enthielten 110 mg (fioaantauobeute 2,2 g). Die tatsächliche Menge dea isolierten Konjugata betrug 1,91 g. Der Konjugationagrad (nach der UV-Analy3e) wurde auf etwa 76 Einheiten Amphetamin/RSA geschätzt.

Beiopiol 22

3-(N-(I »-Rumyl-^^-propyU-glyeinamido)-^,2,5,5-totramethyl-1-pyrrolldinyloxy

Eine Lösung von Anphotamin (2 nüol, horgootellt aus 368 mg des Sulfats) in 20 ml Methanol vurdo mit 106 mg (1 mMol Natriumcarbonat) und 321 mg (1 ElIoI) 3-(2-,Todacotamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl behandelt. Das Reaktionagemisch wurdo übor Nacht boi Rautitomporatur gerührt, zur Trockne eingedampft, und dor Rückstand wurdo zwischen Wasser und Xthor aufcoteilt. Dor nach den Vordampfon doe Xthora erhaltene Rückstand wurde auf Kiooolgol chromatoßraphiert (8 $ Methanol

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WO-

in Dichlormethan) bei 187 mg (59 #) eines tiofgelben Gemisches aus öl und Kristallen erhalten wurden, das als einziger Pxeck bei der Dünnschichtnhromatographie in dem verstehend angegebenen System erschien (R^ » 0,5).

ESR (in Wasser) a_N 15,9 g IRi 700, 740 om~¹ - stark

Belsptol 23 Ecgonin-RSA-Konjugat

A. 5 g Cocain wurden 6,5 Stunden in 25 ml Wasser unter Rückfluß erhitzt. Das nach dom Eindampfen der Löcung hinterbleibende öl wurde in 5 ml heißem Wasser gelöst. Beim Abkühlen schieden sich lange, woißo Kristalle ab (2,87 g). Aus der Mutterlauge wurden woitero 543 mg erhalten.

B. 1 g Benzoylocgonin wurda 1 Stunde in 25 ml 2-normalor Chlorwasserstoffaäuro untor Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung filtriert und mit Äther extrahiert. Die wäßrige Phase wurdo mit Natriumbloarbonat bis auf einen pH-Wert von 5,8 neutralisiert« Beim Eindampfen hinterblieb ein weißer Rückstand, de;· mit 40 ml 95 #-igem Äthanol untor Rückfluß erhitzt wurde. Es wurdo abfiltriert und das Lösunjomittol eingodunpft. Dor ölige Rückstand (580 mg) Aristallioiorte büi r.uantz von 0,5 ml Äthanol aus (130 mg) P. 135 - 196^CC (zors.).

C. 119 mg Ecgonin wurdon in 8 nl trookohom Dimethylformamid (DIiP) gelöst und auf -10⁰C nbgokühlt. Nach Zusatz von

84 /Ul Chloramoioonaäuroiuobutylootor wurde das Reaktionsgemisch 2 Stunden gorührt.

D. 400 mg R3A wurdon zuoatr.non mit 2,1 g Natriumbicarbonat in 25 til Viasoor golBst. Das wie vorstohend hergestellte gemisohte Anhydrid wurde tropfonwoiee zugegeben, und dae Reaktionsgomiooh vmrde übor Naoht bei O⁰C gerührt. Di· Lösung wurde in einen Dialyooboutel gebracht und 24 Stunden gegen 1 Litor Wasoor (doo Dialyoat wurde 4 x gewechaelt, Dialyse 1120) dialyoiert, Boim Lyophylisieren wurde ein·

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weiße Verbindung erhalten. Die UV-Analrae zeigte, daß 18 Haptene je Molekül RSA vorhanden waren.

BeiBpiel 24

N-2' ,2 ·, 5 ·, 5' -Tetramethylpyrrolidin-3'-yl-1 '-oxyl-6-keto-7,7-diphenyl-9-(dimethylamino)-dekansäure

(a) Eine Lösung von 32,4 g (150 mXcl) Tetramethylendibromid in 150 ml trockenem Äther wurde zu 10,9 g (450 mMol) Magnesium in 80 ml Äther mit einer solchen Geschwindigkeit gegeben, βiß der Äther unter Rückfluß siedete. Die Umsetzung wurde unter Argon durchgeführt. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch ¹ Stunde gekocht. Eine Lösung von 2,2-Diphenyl-4-dimethylamino-valeronitril (I), (hergestellt nach J.W. CUSIC, J, Am. Chem. Soc, V_, (3546), (8,4 g, 30 mMol) in trockenem Xylol (100 ml) wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten bei Raumtemperatur zugesetzt, und das Geraisch wurde 1 Stunde bei 55°C gerührt. Da3 Reaktionsgemisch wurde in einem Ei3-Wa3Ber-Bad gekühlt und CO« wurde unter kräftigem Rühren 4 Stunden lanp hindurchgeleitet. Dann wurden 200 ml Wanaer und 100 ml konzentrierte HCl zugesetzt, das Magnesium abfiltriert, und das Filtrat 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die abgekühlte, klare Lösung wurde 3 χ mit 150 ml Äther gov/aachen und 3 χ 150 ml Dichlorraethan extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückutand wurde in 0,5 Liter 0,5 normaler Natriunhydroxydlöoung «olöot.

Die Lösung wurde 3 x mit 100 ml Äther gowaoohon, mit 150 nl konzontriortor HCl angedauert, mit Natriumchlorid gesättigt und mit 3 χ 200 ml Dichlormothrm extrahiert. Boim Eindampfen doo Löaunccuittels hlntorbliobon 7,55 g (60 i» einen ölö, nUnlich 6-Koto-7,7Tdiphonyl-9-(dimethylaiaino)-dooanoäuro-hydroohlori(l, dao bei dor DUnnschiohtchroaatographio (HOCl₅iKothanol » 812 und 7i3) als einzelner Pleok wandert·

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	293	(ε=	2264742
UV-Spektrum	264	(ε=
Cf CQOU	259
		5*0)|
		500)|
	535)|

0,02 J
^ max

1,170 g (2,8 πώϊοΐ) des obigen Produktes und 423 /Ul (C₂H₅J₅N wurden in 5 ml trockenem DI.IF, das auf 0⁰C gekühlt war, gelüat und unter einatündigera Rühren unter Stickstoff mit 393 ,ul Chlorameisenoüureisobutylester behandelt. Dann wurden 450 ng 3-Amino-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl zugecetzt und daa Reaktionsgewurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, in

40 ml einer 5 jS-igen Na.CO^-Löaung gegossen und 3 x mit Je 20 tnl Äther extrahiert. Die Ätherlbsung wurde 2 x.mit Je 10 ml Waeaer und 2 χ mit Je 10 ml einer 19 #- KaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Eindampfen des Äthers hinterblieb ein rotes öl, das chromatographisch auf Kieaelgel gereinigt wurde (HCCl₃ (C₂H₅J₂O 5Oi5O

52 ^{wotei θ1η} öl erhalten wurde, das beim Stehen erstarrte. (900 mg, 62 *).

Analysei berechnet für C₃₂H₄₆H₃O₃I C 73,80| H 0,90| N 8,06

gefunden! C 73,27| H 8,86| N 7,98

Beispiel 25 Ilethadon-RSA-Konjugat

0,63 g (1,5 mMol) der nach Beispiel 24 hergestellten Deoanaäur· und 0,63 al (4,5 mliol) (C₂H₅J₃H wurden bei -8»C in 5 ml DMP gelöst. Dann wurde Chlorameiseneäureisobutyleetor (0,19 ml) zugesetzt und das Gemieoh wurdd 1 /2 Stunde bei 8⁰O und eine weitere halbe Stunde bei 0^cC gehalten. Die Lösung des so erhaltenen gemischten Anhydride wurde einer Lösung von RSA O »4 g» 1,07 mVal.) in einem Gemisch von Wasser (200 ml) Methanol (110 ml) und Natriumbioarbonat (9,2 g) bei 0°0 eugetropft. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei 0⁰C gerührt, dialyaiert (18 Stunden, stetiger Strom von destilliertem Wasser) und lyophylisiert. Ausbeute an Konjugati 1,2 g (einige

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mechanische Verluste). Der Konjugationsgrad wurde aua dem UV-Spektrum des !Conjugates (unter Verwendung einer Eichkurve) zu etwa 50 * ermittelt (35 Methadon-Moleküle je Molekül RSA).

Es können Cholesterin oder andere Steroide mit der 3-Hydroxy-Funktionalität und mit nicht-störenden Funktionalitäten in der Stellung 17 oder geschützten Funktionalitäten in dieser Stellung verwendet werden. Cholesterin kann mit Bromessigsäureäthylester umgesetzt und dann im basischen Milieu hydrolysiert werden, wobei der 3-Carboryoiethyläther gebildet wird. Das gemischte Anhydrid kann wieder, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und mit jedem der vorstehend angegebenen Proteine umgesetzt werden» das erhaltene Produkt kann in ein Tier eingeführt worden, um Antikörper zu erzeugen. In ähnlicher Weise kann das ßemischte Anhydrid mit ₂,2_l6,6-Tetramethyl-4-Aminopiperidino-1-oxyl oder mit ?,2,5,5-Tetramethyl-3~nydroxy-(oder 3-Amino)-pyrrolidin-1-oxyl umgesetzt werden.

Das Phenobarbital kann in einer anderen Weise ala vorstehend beschrieben verwendet werden. Das Phenobarbital kann hergestellt und durch Einführung einer Aminogruppe in die paraStellung des 5-Phenylsubstituenten modifiziert werden. Durch Diazotierung der Diazogruppe kann das Protein ir'.t dem Phenobarbital markiert werden, und das erhaltene Proiein kann in ein Tier eingeführt werden, um die gewünschten Antikörper zu erzeugen. Das gleiche, mit einer Aminogruppe modifizierte Phenobarbital kann mit 4-Carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl od9r 2,2,6,6-Isooyanato-piperidino-1-oxyl kombiniert werden.

Zur Erläuterung der Untersuchung auf Zucker kann lactose, d.h. (4-ß-D-Galaotopyranosido)-D-gluoopyranose als para-Diasophenyläther an der Stellung 1 hergestellt werden, der dann mit 2-( 1 '-(3-'Hydroxyphenyl))-4,4,5i5-tetramethylimida«olinyl-1-oxyl-3-oxy gekuppelt werden kann. Auoh die Diazoverbindung

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kann mit einem Protein, z.B. BGG, gekuppelt werden, um Antikörper herzu3tollen (vgl. P.C. Karuah, J.Am.Chem.Soc., T^_x 338Ü (1957)).

Aspirin kann unter Verwendung der 4-Amino-2-aoetoxybenzoeaäure, Diazotierung der Aminogruppe in ähnlicher ffeioe wie bei dem vorstehend verwendeten Aminophenol und anschließende Konjugierung der diazotierten Vorbindung mit RSA analyoiert werden. Die Aminogruppe kann auch mit dem Carboxy-Derivat oder dein Iaooyanato-Dorivet von 2,2,5,5-Tetramethyl-3-carboxy-(odor 3-Iaooyanato-pyrrolidin-i-oxyl odor 2,2,6,6-tetramethyl-4-carboxy- (oder 4-ieocyanato)-piporidin-1-oxyl) umgesetzt werden.

Zur Veranachaulichung der Analyae einer toxiachon Subatanz, ü.B. einea Pesticide, kann Malathion, nämlich Diüthyl-2-(0,0-Diäthylphoaphorthionothioylouccinat) derart modifiziert werden, daß der Halbester und das halbe Aoylchlorid gebildet werden, die dann zur Konjugierung mit einem Protein, wie Rinderaerumalbimin verwendet werden können. Da3 Acylhalogenid kann aber auch mit 3-(para-Aminophenyl)-1,5-diphenylvordazyl umgeaetzt werden.

Neben den Hapten-Liganden, die mit Antikörper-Rezeptoren verwondet werden, gibt es auch andere Liganden, die natürlich vorkommende, apezifiache Rezeptoren haben. Die naohatehende Tabelle erläutert diese Ligandon im Zuaammenhang mit einer Literaturatelle, in der ein geeigneter Rezeptor für einen Bolohen Liganden angegeben ist. Weiterhin aind geeignete freie Radikalanaloge angegeben, die bei der Liganden-Analyae nach einem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden können.

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Tabelle

Ligand

Thyroxin

Literaturhinweis Rezeptor für den Liganden

Thyroxin Binding Globulin (TBG) Thyroxin Bindung Prealbuzcn (TBA) 3.E.P. Hurphy, C.J.J· Pattee, J. Clin. Endocr.. 24, 187 (1964)

Struktur des Liganden

NH,

H₂-CH-CCOH

O
CO
OO

Corticosteron

Cortisol (R=OH,H) Cortison

11-Desoxyoortleol

(R-H, H)

Protein Fron Brain Cell Nuclei, B. McEwen, L. Plapinger 5at. 226, 263 (1970)

B.E.Murphy, J.ClIn,Endocr.. 28, 343 (196s;, 27, 973 U967) Corticoateroid Bindung Globulin (Transcortin) Thyroxin^

CE₂OH
C=O

Cortison

N)

cn

Tabelle 1 - Fortsetzunc

Tabelle 1 - Fortsetzung

Liffand

östradiol

Insulin

Literaturhinweia Rezeptor für den Liganden

Receptor Site for Estrogen Prom Uterus, BBA, V76, 626 (1969)

CR. Morgan, W.ü. Holland, III Diabetes, 1966 Struktur des Liganden OH

östradiol

⁺) vergl. unten

NH,

NH.

ii ι ri* r

) H-Gly-Ile-Val-Glu-Glu-Cye-Cya-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Asp-Tyr-Cys-Asp-OH

r ϊ

H-Phe-Tal-Aep-Glu-Hla-Ieu-Cye-Cly-Ser-Hia-Leu-Val-Glu-Ala-Leu—fyr'rTLeu—VaI—Cye-Gly-Glu-Arg-

^l2

Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Prc-Lye-Ala-OH

ro σ)

Tabelle 1 - Portsetzung

Ligand

Rezeptor für den Liganden Struktur dea Liganden JLagiotensin II

L.B. Page, E. Haber, A.Y. Kimura A. Puraode, J.Clin.End. 28. (1969)

Aap-Arg-Val-Tyx-Ileu-His-Pro-Phe

ro

NJ CD

NJ

Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Rezeptoren, dit> In der vorstehenden Tabelle angegeben sind, können auch Enzyme als Rezeptoren verwendet werden. Die nachstehende Tabelle zeigt verschiedene typische Enzyme und Liganden, mit denen diese in Wechselwirkungen treten. Weiterhin sind geeignete freie radikalische Li^and-Analogo angegeben. Die Literaturhinweise betreffen Veröffentlichungen, die sich auf die spezifische Wechselwirkung zwischen dem Liganden und dem Enzym beziehen.

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Tabelle 2

O N) O

Choliaeator&oe S

Choliaeator&oe -(Soldatein, S. 9-1O)¹

(Easer, S. 113-1 U)

Dihydrofolat-Heductaoe (ffoldatein, S. 426 - 531)

(Baker, S. 197 et aeq)²

Konosoin-Qxydaao . -(Goldstein, S. 2fl)'

Ligand

Ncostigmin

H₂O₃P 0 CH₂

5-Pluordeoxyuridylsäure

COOH

>N C—N

Methotrexat

Iproniazid

N) N) CD

Tabelle 2 - Portsetzung
Enzym-Rezeptor . Li^and

Phosphoribosyladenosin /.—^ra

Triphosphat-Pyrophosphorylase , HOOCCHCH^ /'

(Goldstein, S. 541 - 543) I

Histidin

-* "Principle» of Drug Action" von A. Goldstein, L. Aronow and S.M. Kalman,

rs) Harper & How Publishers, New York, 1970.

) "Design of Active-Site-Directed Irreversible Enzyme Inhibitors" von
B.H· Baker, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1967.

-«J ro

Bei der Auswahl von Enzymen als Rezeptoren wählt man vorzugeweiae solche Enzyme ;ue, die die Reaktionen der zu testenden Liganden nicht katalysieren, um eine Zerstörung des Teatliganden zu vermeiden, bevor das gewünschte Analysenergebnis erhalten wird. Vorzugsweise verwendet man deahalb Enzyminhibitoren als Rezeptoren. Sonst kann es erwünscht sein, das al3 Reagens bei der katalytinchen Reaktion benötigte Material, z.B. ein Coenzyra wegzulassen. Da viele Arzneimittel Enzyminhibitoren sind, so kann sich die Verwendung von Enzymen nla Rezeptoren für Liganden, bei denen es sich um Arzneimittel handelt, bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens als günstig erweisen.

Enzyme können brauchbare Rezeptoren zum Nachwnia von Pratizidm nein. Beispielsweise reagiert Cholinesterase mit und ist ein Rezeptor für organische Phosphate, die als Insecticide verwendet werden, beispielsweise kann daa Insecticid Parathion

H₁-C₉O _q

\p-0--, /V-NO₂

η C₂ </ *—y

unter Verwendung des Analogen

und von Cholinesterase als Rezeptor nachgewiesen werden.

Um die Analyse nach Liganden nach dem vorstehenden Verfahren zu erläutern, wurde das markierte Hapten, 3-(2'-,4'-Dinitrophenylamino)-2,2,5»5-tetramethylpiperidin-1-oxyl den

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trophenyl-Antikorpern in einer wäßrigen Lösung zugesetzt ^Ji° ^A"-iltörper wurden nach Eiaen et al., JACS, Jl* 45^Q3 Π953) und dag markierte Hapten wurde nach Hoia et al., Archives of Birchemiotry nnd Biophysics 132. 466 (1969)), Vorgestellt. Es wurdo folgonde Arbeitoweioe angevvendeti Die Mengen der beiden Verbindungen wurden oo govvühlt, indem kinine Anteile der Haptcno der Antikörpor-LÖoung zugooetzt wurden, bio die Intenuität dos ESR-Signala boi Zusatz Jedes Antoila ocharf anzuatoigen bogann. An dieoom Punkt waren allo Dindungootellon auf den Antikörpern durch die Markierungaaubatnnz boootzt, und die Zugabe wurdo unterbrochen. K3 wurden dann zunehmende Mengen N-epailon-Dinitrophenyllysin der Lösung zugesetzt. Böi Zusatz zunehmondor Mengen N-epailon-Dinitrophenyllysin zu dem mit den Antikörporn markierten Hapten-Komplex wurde eine Zunahme des ESR-Signals beobachtet. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in Figur 1 der Zeiuhnung angegeben.

Die Antikörperlösung hatte eine Konzentration von etwa 2 mg/ml, d.h. aie entsprach etwa 1-2 χ 10"^ Mol Bindungsatellen. Das markierte Hapten wurde bis zu einer Konzentration von etwa 1-2 χ 10"' molar in 20 £-igem wäßrigem Methanol gelöst. Etwa 10 /Ul der Antikörperlüsung und 10-20 /Ul der markierten Hapten-Lösung wurden vereinigt, worauf wechselnde Mengen der 10 molaren Löeung des N-fc-Mnitrophenyllyeins in Wasser zugesetzt wurde (maximal 14 /ul).

Unter Verwendung geeigneter Standards kann die Intensität des ESR-Signals mit der Konzentration des N-epsilon-DNP-Lysins in der Lösung in Beziehung gesetzt werden. Hat man also eine unbekannte Lösung, die vermutlich ein solches Hapten enthalt, und fügt man eine standardisierte Menge des Antikörper-Hapten-Komplexes zu, so kann man leicht die Konzentration des H-epsilon-DNP-Lyβine in der Lösung bestimmen.

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Um fcas vorliegende Verfahren.in Beziehung zu einer Anzahl von brauchbareren Haptenen zu erläutern, wurde eine große Anzahl von Arzneimitteln unterschiedlicher Struktur und physiologischer Wirksamkeit verwendet. Zum größten Teil werden diese Arzneini+tel mißbräuchlich benutzt bzw. tür Behandlung von Rauschgiftsüchtigen, a.B. !!ethadon. In jedem Fall wurde das Konjugat mit einem Protein, daa wie nach dem vorstehenden Beispiel hergestellt wur*e, einem Jier, z.B. einem Knninohen, einer Ziege usw. in an sich bekannter Weise injiziert, und das Serum für den Antikörper nach einer angemessenen Zeit gewonnen. Nachstehend sind einige Untersuchungen beachrioben, in denen die apezielle Verbindung zur Herstellung der Antikörper und der anderen Verbindungen für die der Antikörper in einer Untersuchung verwendet werden kann, angegeben sind.

Horphin-Antikörpor wurden mit dem spinmarkierten Morphin, daa nach Beispiel 4 hergestellt war, kombiniert. Die Mengen der beiden Komponenten wurden nach einer Titration ausgewählt, ähnlich der Titration, wie sie für die Bindung von markiertem Hapten an die Dinitrophenyl-Antikörper beschrieben ist. Einer wäßrigen Lösung des markierten Morphins und dee Morphin-Antikörpers wurdon zunehmrnde Mengen Morphin zugesetzt, und die Xnderung der Intensität des ESR-Signala wurde beobachtet. Die Ergebnisse sind in Figur 2 der Zeichnung dargestellt·

Codein kann infolge seiner starken strukturellen Ähnlichkeit mit Morphin nach den gloiohon Verfahren nachgewiesen werden. Ander· nahe verwandte Verbindungen, wie Halorphin und Morphin-O^-Gluouronid, können ebenfalle nachgewiesen worden, während die Mothod· gegenüber weiter entfernten Analogen, wi· Hethadon, und nioht rerwandten Verbindungen, wie Anphetaninen, uneapfindllch ist·

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tfff 226A7A2

Wie schon gesagt, besteht eine bevorzugte Anwendung der Erfindung darin, eine Droge in einer biologischen Flüssigkeit nachzuweisen. Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wurde der Urin von Rauschgiftsüchtigen nach der nachstehend angegebenen Arbeitsweise untersucht. Morphin-o'-Glucuronid ist das Hauptausscheidungsprodukt des Morphins und Heroins bei Menschen. Etwa 80 f> des gesamten eingenommenen Morphins erscheinen im Urin als Morphin-Glucuronid. Da da3 vorstehend angegebene, spinmarkierte Korphin in Kombination mit Morphin-Antikörpern zum Nachweis dieses üetaboliten ■ und des Morphins verwendet werden kann, ist das Verfahren besonders wirksam.

Uachv7ela von Morphin und Deinen Kotaboliton in Urin

Die Urinproben wurden zu Löoungon gcgebon, die das spinmarkierte Morphin gemäß Beispiel 4 gobundon an den Morphin-Antikörper in einer bis zu einem pH-Wort von etwa 7,9 gepufferten Löoung enthielten. E3 wurdo die Zunahme des ESR-Slgnals gemessen. Die Zunahmo wurdo als prozentuale Zunahme, bezogen auf die uaximale Zunuhmo dos 31cnnlo, die in Anwesenheit von hohen üorphinkonzentrationen orhnlton wordon konnte, aufgezeichne*

Das markierte Morphin wurde zunüchnt in oinißcn Tropfon Äthanol und anschließend in tfassor golüut, um oino Lösung mit einer noleron Konzentration von 2 χ 10~⁵ zu orhalton. Die Antikörporkoncentration in Waooor war ottra 1 - 2 χ 10"^ molar, bezogen auf die Bindunßootollen. Dio Antilcörporlösung enthielt etwa 0,4 Hol Trie odor 0,6 llol Natriuuborat, wobei im ersten Fall ein pH-üert von 7,5 und la lotcton Fall oin pH- \7ort von 7,9 erhalten wurde. Dor pH-t7ort füllt infolge Verdünnung und infolge der Anwooonhoit von Süure in Urin ab· Zu 20 /Ul Urin mirdo auoroiohond Natriunbichronat gegeben,

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Jr

um eine Konzentration 2 χ 10 Mol zu erhalten, ao daß alle störenden reduzierenden Substanzen zerstört wurden. Die Urinprobe wurde dann mit 10 /Ul eines gleichvolumigen Gemisches der Antikörperlösung und der markierten Morphinlösung vereinigt·

Die Werte für die Urinproben 1 - 5 in Tabelle 3 entsprechen den prozentualen Zunahmen tür eine Anzahl von willkürlich gewählten Urinproben von Personen, die mindestens eine Woche keine Rauschgifte genommen hatte. Die Urinproben 6 - 10 in Tabelle 3 stammten von bekannten Heroinsüchtigen und von Patienten, die Codein genommen hatt3Tj)ie hohe prozentuale Zunahme bei der letzteren Gruppe zoigt die Wirksamkeit dea Analysenverfahrens·

	Zunahme der Signalinten sität *	Tabelle 3	Verauchogruppe	einge nommen λ Droge
	6		Zunahme der Signalinten- sittit i»	Heroin
Kontrolle	3	Urin probe Nr.	58	Heroin
Urinprobe Nr.	5	6)	81	Horoin
D	7	7)	100	Codein
2)	4	8)	75	Codein
3)	9)	62
4)	10)
5)

Ua die Empfindlichkeit dos Vorfahrona zu zeigen, wurden die Ergobnisse der Liganden-Untorouohungomothode mit denen doa handoloüblichen Dünnochichtßromatoßraphio-Toata vorgliohor.* Bei dem Diinnochichtgromatographie-Toot wird daa Morphin duroh LÖBunßsnittoloxtr&ktion aus dom Urin entfernt und dor Rliokotand wird nach dom Eindampfen dor Extrakte duroh DUnnochichtgromatographie analysiert. Da dao Horphin-Glucuronid nioht mit Benzol extrahiert wird, wird nur dao Morphin naohgowleeon, unl der

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Teat ist verhältnismäßig unempfindlich. In Tabelle 4- alnd die Ergebnisse der beiden Analyaenverfahren mit dem Urin eines einzigen Heroinaüchtigen verglichen, der zugab, daß er das Rauachgift an zweiten und fünften Tag genommen hatte. Die Werte zeigen, daß daa Ligand-Analyaenverfahren den Nachweis dea Rauachgiftea auch noch 3 Tage nach der Einnahme ermöglicht. Dieaor Schluß wurde durch Vergleich der Daten mit den Daten über die gleichen Urinproben unter Verwendung einea vorbenaerten Dünnachichtgromatographie-Teata beatätigt, wonach daa Morphin-Glucuronid zuerat mit Säure hydrolyaiert wurde, um daa freie Morphin zu bilden. Dieae Werte aind zum Vergleioh in Tabelle 4 angegeben. Obcleich daa verbeaaerte Dünnnchichtgromatographie-Verfahren noch nicht ao empfindlich iot wie daa Hapten-Analyeenverfahren, beatätigen die Ergebnia3e, daß daa Verfahren mit dem markierten Liganden brauchbare Werte ergibt.

	Zunahme dea	Tabelle 4	Ergebnisae
A rf	Signala <f>	Ergebnisse der	der Dünn-
«ft		Dünnachicht-	achichtgroma-
		groraatographie	tographie
			(vorbeaaort)
	17		+
1	57	-
2	32	+
3	26	—
4	47	—	+
5	26	+	+
6	16	-	-
7	8	—	—
8	40	—	+
9

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Barbiturat-Untorauohung Seconal

Der Antikörper ( J-Globulin) wurde unter Verwendung von Secotarbital-Rinderseruualburain-Konjugat (hergestellt nach Beispiel 14) hergestellt. lie Spinmarkierung3oubatanz war N-2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidino-1-oxyl-3-yl-5-(c6-crotonamid)-5-(1'-methylbutyl)-Earbituraäuro. Das ^-Globulin hatte eine Bindangekonstantβ von 2,2 χ 10'.

Bei der Durchführung der Analyse wurden zwei Lösungen hergestellt. Für Lösung A wurden 1000 /ul /-Globulin (7,35 x 10"⁵ an den Bir.dungostollen), 725 /Ul 1,5-molare Kaliumphosphatlöaung, eingestellt auf pH " 7 und 87,5 /ul Wasser verwendet. Iür die Lösung B wurden 1175 /ul der Seconal-Spinraarkierung3oubatanz (5 x 10**' molar) und 637,5 /ul Wasjer verwendet.

Das Analyoonvorfahren war das gleiche wie für Phenobarbital, das nachotchond beschrieben ist.

Bei Verwendung doa Socobarbital-Antikörpers konnten die folgondon IlindeatkonBcntratlonen oji anderen Barbitalen nachgewiesen «ordern

Pentobarbital 2yUß/nl| Anobarbital 2,5/Ug/nl| Thiopental-Hatriun 3,5yuc/ol| Iloptabarbital 7/Ug/ml und Natrium-Phonobarbital 40/Uc/ol·

Zur FrUfuns doa Untorcuohungovorfahrons mit Urinproben von Spendern, dio koino Er-rbiturato nahncn, viurden insgooant 110 Γϊ-obcn notootot. 106 Probon orgabon Vierte unt«i*Vini>» »■»·«

gt

110 Ti-obcn c⁰*⁰⁰*⁰*· ¹⁰^ ^¹*⁰¹¹⁰³¹ orgabon Vierte unterhalb ettia' 1 onc/vl, vrGa flarauf hinwioo, üaQ dor Sooobarbital-Antikörper prcl:tioch koina Barbiturate "orliannto«. Drei Probon lioforten ErC^tnioco vc:i 1,1 bio 1,4yuc/cJ.i die boi einom orneuton Teat nocatiY waren· Dio ur-oprUnclichon Ergobniooo beruhen nahrochoinlich cuf oinop fohlorhaftsn Arboitcv?oise. Elno Probe,

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-96- 4?

^elnen *^ert von 12 - 13/Ug/ml ergab, wurde dünnachiehtgromatographiach untersucht, wobei festgeetellt wurde, dafl sie Seconal enthielt.

Bei einer abgewandelten Arbeitoweisc des Seconal-Tests betrug das gewählte Ludungaverhältnia (Antikörperbindungastellen/ Spinmarkierungsmoleküle) 1,25, d.h. ea handelte aich um ein schwach unterbelastetes System. Der bevorzugte pH-Wert lag bei 7, und eine Veränderung dea pH-Wertea nach 8 bzw. 6 ergab keine Signifikantenänderung. Eino Erhöhung der Pufferkonzentration hatte nur eine geringe Wirkung. Die Reihenfolge der Zugabe der unbekannten Probe und aea Antikörpers und die anschließende Zugabe der Spinmarkierungo3ubütnnz lieferte ein besseres Ergebnis ala die Reihenfolge, bei der zueret die Spinmarkierungssubstanz mit dem Antikörper kombiniert und anschließend die unbekannte Probe zugesetzt wurde.

Phenobarbltal

Der Phenobarbital-Antikörper ( ^-Globulin) wurde unter Verwendung von Phenobarbital-Rinderserumalbumin-Konjugat (hergestellt nach Boispiel 13) hergestellt. Die Ligand-Analog-SpinmarkierungsRubstanz war N-2',2·,5',5'-tetramethylpyrrolidin-i'-oxvl-J'-yl-S-athyl-S-phenyl-barbituryl-iacetamid. Das ^"-Globulin hatte eine Bindungakonatante von 9,4 χ 10⁶.

Bei der Iurchführung der Analyse wurden zwei Lösungen hergestellt. Für die lösung A wurden 1000/ul ^-Globulin (5»96 χ 10~⁵ molar beeUglich der Bindungaetellen) und 475/Ul 1,5-molare Kaliutaphoophatlösung (auf pH » 7 eingestellt) verwendet. PUr die Lösung B wurden 404yul der Phenobarbital-SpinmarkierungosubatanB (1,18 χ 10"** molar), 956yul Vasser und 115 /ul 1,5-molarer Kallumphoephatpuffer verwendet.

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2s wurden zwei Kuiib ^atof fbechei* verwendeti 1 Becher enthielt 5/Ul 0,2-molare Natrlumbichromatlöaungf der zweite Becher enthielt 5/Ul der Löaung A. 50/ul der zu untersuchenden Probe wurden mit Hilfe einer Drummond-Kapillare abgemeaaen und der Bichroraatlöaung im ersten Becher zugeaetztj dann wurden genau 20/Ul der erhaltenen Löaung mit Hilfe der gleichen Kapillare entfernt und dem zweiten Becher zugesetzt. Der Probe im zweiten Becher wurden dann 5/Ul der Löaung B zugesetzt. Dein wurde ein Aliquot der Löaung in eine ESR-Kapillare gezogen, und das Spektrum abgelesen·

Um das Verfahren mit Urinproben von 3pendern, die keine Barbiturate nahmen, zu teaten, wurden inageaamt 100 Proben untersucht. Alle Proben hatten eine Mobilität (mobilization) von weniger als 15 £·

Bei Verwendung des Phenobarbital-Antikörpers konnten die folgenden Mindeatkonzentrationen (15 ?δ Mobilität) an anderen Barbituraten nachgewiesen werdeni

Mephobarbital 0,9 - 1,0/Ug/ml; Heptabarbital 2,9 - 3/Ug/mlj Amobarbital 3,1 - 3,2/Ug/mlj Thiopental und Butiscl 7,2 - 7,3/Ug/ ml und Seconal 7,3 - 7,4/Ug/ml·

Um das Verfahren weiter zu teaten, wurden 27 Urinproben von verschiedenen Spendern genommen, die angaben, daß sie Barbiturate genommen hatten. Von den 27 getesteten Proben waren 22 positiv. Von den 5 negativen Ergebnissen wurde eines posi tiv mit der 3econal-Analyaej zwei Spender hatten die Barbi turate längere Zeit vor der Probenahme genommen, und die restlichen beiden Proben konnten nicht leicht erklärt werden·

Bei der Abwandlung des Verfahrene der Phenobarbital-Analyse wurde festgestellt, daß höhere Verhältnisse awisohen Antikörper-Bindungsstellen und Spinnarkiorungasubatanz als oben '

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beschrieben weniger befriedigend waren. Eine Änderung dea PH-Wertea von 7 brachte keine Vorteile. Die optimale Puffer- -^konzentration war etwa 0,1-molar.

Der Amphetarain-Antikörper wurde unter Verwendung des Amphetamin-Rinderaerumalbumin-KonJugatea (hergO3tollt nach Beispiel 21) hergestellt. Die Spinmarkiorungasubatanz wurde nach Beiapiöl 22 hergeutelltj eo handelte oich um 3-(N-1·- Phenyl-2^l-propyl)-glycinumido)-2_t2,5,5-totramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Die Bindung3konatante für daa JT-Globulin betrug 4,5 x 10⁶.

Bei der Durchführung dor Analyoo wurden zwei Lösungen hergestellt! Die Lösung A enthielt 22/ul T-Globulin (2,1Θ χ 10~*molar bezüglich der Bindung3stollen)j 144yul 2-nolaren Boratpuffer (pH =■ 8) und 99/ul Kochsalzlösung. Die Löaung B enthielt 160/Ul einer 2,8 χ 10" -molaren Löaung der Spinmar-

kierungssubatanz und 105/ul Wasser.

Ea wurden zwei Kunststoffbecher verwendet. Ein Booher enthielt 2,5 /Ul einer 0,2-molaron Natriutnbichromatlöaung. Per zweite Becher enthielt 5,0/ul Antikörperlöoung. Die Probe wurde mit Hilfe einea Oxford-Sampler mit oinem Faaoungovermögen von 25/Ul in den Becher, der die Bichromatlösung enthielt, übertragen. Die Bichromat-Probonlöaung wurde gerührt, mit dem Probenehmer hochgezogon und in den Becher, der den Antikörper enthielt, eingeführt, ohne den Antikörper tu berühren. Dieser Löaung wurden dann 5/Ul Spinmarkierungeaubatanz zugesetzt, worauf die Probe mit einem ESR-Kapillarröhrchen gerührt, in das K&pillarröhrohen aufsteigen gelaeeen und dae Spektrum abgelesen wurde.

A0984A/102Ü

Bei 100 Urinproben ergab der größte Teil Mobilitätawerte von 10 i» oder weniger, waa dem Untergraidwort entsprach· Vier "normale" Urinproben hatten eine Kobilität rwioohen 10 und H £. Von don 6 irobon, die höher als 14 Ί» lagen, gaben alle Perooren an, daß aie Subotanzen Rcr.oimaen hatten, die für Nebenroaktionen bekannt sind, z.B. Fheniithylbißuanid (DBI), verdnuungafordernde, Fhenylp"opanolaraj..i enthaltende Mittel, Amphetamln, Preudoephodrin und Üoocalin, daa oft zusammen mit Amphotamin verabreicht wird. 4 Urinprobon, die nach einem unabhängigen klinischen Test bezüglich Amphetamin positiv waren, lieferten bei dom Versuch positive Ergebniooe im Bereich von 0,7 - 1,5/Ug/ml.

Das Beladungaverhältnia zwischen Spinmarkierungeaubstane und Antikörper-Bindungsstellen betrug 0,95, entapreohond einen: SignalverhäTfcnie (peak ratio) von 5 (10^-> molare Konzentration an Amphetamin-Kochsalzlöaung). Höhere BeIadungfaverhältnisse ergaben etwas geringere Signalintensitäteverhältnisse·

Methadon

vorausgegangenen

Die Spin-Immunanalyse wurde ähnlich wie v Analysen durchgeführt· Es wurden zwei Kunststoff becher verwendet, von denen einer 5/ul 0,2-molare Katriumbichromatlösung und der eweite 5/ul Antikörperlösung, die mit Borat bia auf pH a θ gepuffert war, enthielt. Es 1st ausreichend Puffer in der Antikörper lösung vorhanden, so daß die Endkonzentration 0,18-molar ist. Der Bichromatlösung wurden 50/Ul Probe eugesetzt, und ein Aliquot von 20/ul wurde aus dem ersten Boaher in don zweiten Becher, der die Antikörper-Lösung enthielt, Übertragen· Doijorhaltonen Lösung wurden dann 10 /Ul einer Lösung dor SpincarkiorungosubstanB mit einer Konzentration von 3 ζ 10" Mol eugeaetst·

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Nach dieser Arbeitsweise wurden 55 Urinproben untersucht. Die Urinproben stammten aus einer Klinik, in der mit Uethadon behandelt wurdo. Kur eino Urinprobe, die nach der Dünnachichtchroaatographie ein poaitivos Ergebnis bezüglich Methadon zeigte, lieferte ein negativea Ergebnis.

Proben die eine niedrige LIothadon-Konzentration zeigten, wurden auch bezüglich Morphin untor3ucht, um sicherzustellen, daß hohe L!orphinkonzentrationen kein falsches positives Ergebnis liefern. In einer Urinprobe wurde ein positives Ergebnis mit dem Methadon-Tost erzielt, das nach 3 Minuter, den normalen Untergrundwert zeigte. In dieoora Fall wird angenommen, daß es sich bei dom Spendor um den Grenzfall eines Diabetikers handelte, der DDI genommen hatte j hierbei handelt es oich um einen Lletuboliton, der möglicherweise bei den Rcaktionabedingungon zu einem instabilen Radikal oxydiert wurde. Die Ergobniaoe zeigen oino ausgezeichnete Korrolation zwischen dem vorliegenden Analyoonvorfahren und der Dünnechichtchromatographie.

Boi der Abwandlung des Versucheo wurdo foot^oatollt, dafl ein geeigneter Eeladungsfaktor boi 1,15i1 liegt (Spininarkiorungjauba ,cJiz/Antikörper-Bindungostellen). Abweichungen von diesem Verhältnis führten zu oinor voriaindorton Empfindlichkeit. Boi Erniedrigung dor Konzentration der Spininarkiorunsssubstanz, war eine verhinderte Abtnotgosohwindigkoit orfordorlich, um die gleiohen Ergebnisse zu erziehen.

Das vorliegende 7orfahren ermöglicht unter Verwendung der Vorbindungon gecäß dor Erfindung in Konbination mit tr-

so2?.3 hergestellten Antikörpern eine aohnell*_$ und genaue Bestimmung ®inar großen Violeahl voa biclogiaofe intoroooiarondon Substanzen. Weiterhin iet das iogenio Erfahren goßcnü^cr bekannten Verfahren genauer tronlger anfällig gegenüber störenden Subotoneen. Da

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das radikalische-Ligand-Analoge nit einer minimalen Störung der räumlichen Geonotrie und dor wesentlichen polaren Morkraala dea l!oleküla hergestellt werden kann und da · eine Rotention der physiologiachen Aktivität do3 zu analyoioronden Moleküls nicht zu befürchten ist, ist da3 Vorfahren äußerst vielseitig. Weiterhin können die Reagentien über einen langen Zeitraum hergestellt und aufbewahrt worden, ohne daß nennenswerte Aktivität3ünderungen auftretenj sie laosen sich auch leicht eichen, und die Bestimmungen können schnell ohne viel Handgriffe oder lange Wartezeiten durchgeführt werden. Eine Isolierung oder weitgehende Abtrennung des zu untersuchenden Materials von anderen Gruppen i3t im allgemeinen nicht erforderlich. Di9 Verwendung von Radioiao+open, die häufig gefährlich und nur schwer zu handhaben aind, wird vermieden. Weiterhin hat da3 vorliegende Verfahren nicht die Nachteile der oolorimetrischon Vorfahron, die in Opaken oder trüben lösungen nicht durchgeführt werden können.

- Patentansprüche

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   worin X eine verbindende Gruppe und A eine ein stabiles freies radikaliechee Nitroxyd enthaltende heterooyvlisohe Gruppe mit 5-6 Ringgliedern, von denen eine.8 der Stickstoff der Nitroxyd-Funktionalität ist, darstellt, wobei das Molekulargewicht etwa 350 - 700 beträgt und wobei die Grundstruktur der räumlichen und polaren Anordnung mindestens eines Teils von Morphin, Codein oder eines physiologisch wirksamen Morphin-Analogen ähnlioh ist.

   09344/1020

   BAD ORIGINAL

   3. Ligand-Analoge nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

   - W

   w w-

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   W ist Wasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 - θ Kohlenstoffatomen; W² ist Wasserstoff; w' ist Wasserstoffj W ist Wasserstoff oder bildet zusammen mit W^ einen zweiwertigen Rest mit 3-6 Kohlenstoffatomen und 0-2 Sauerstoffatomen, die mit der Kohlenstoffkette, an die 3ie gebunden sind, einen sechsgliedrigen carbocyclischen Ring bilden; W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W ist Wasserstoff, eine

   5 Hydroxylgruppe oder zusammen mit W eine Oxygruppe,

   7 θ

   W ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe, W ist Wasser-

   stoff oder eine Hydroxylgruppe ι W ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Acyloxygruppe mit 1 - 3 Kohlenstoff atomen, eine Hydroearbyloxygruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen t eine 2-(N-Morpholino)-äthyl-Sruppe oder ein· Glucuronylgruppeι

   mit der Maßgabe, da3 eine der Sriippan f¹"⁹ -X⁺-A"¹" bedeutet oder ein Wasserstoff einer der Gruppen W ° durch -X⁺-A*"

   ersetzt ist« wobei X"*" eine 3ind:mg Gruppe mit 1-30 Μομ3Ώ

   ine stabile

   aus Kohle»etoff-1 Wasserstoff-₁ ESiokatof?

   Phoephor* und Sohwefalatsmen A⁺ eine freie radikaliache N äaa SticÄSfeoffatos d*B li-trc eines ^«ttrosyeliachen Sin» stellt,

   iliKii äa?stei2-i:

   409644/1920

   BAD ORIGINAL

   4. Ligand-Analoge nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel

   ,10

   „15

   W¹⁶· - C-

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   η = 0 oder 1; ra = 2 oder 3; W ist Wasserstoff, W und

   W sind Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen bzw. bilden zusammen einen sechsgliedrigen King mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind; W ^ ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe, wobei nur ein W * eine Methylgruppe darstellt, W ist Wasserstoff; W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W ist Wasserstoff, eine Acyloxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen

   17 oder eine Hydroxylgruppe; und W ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, d-aß eine der Gruppen w ⁷ die Gruppe -X⁺-A⁺ bedeutet oder ein H einer der Gruppen W ~ durch -X -A ersetzt ist, worin X eine Bindung oder eine stabile Verbindende Gruppe mit 1-30 Atomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- und Schwefelatomen bestehen, darstellt und A eine ein stabiles freies Nitnxyd-Radikal enthaltende Gruppe darstellt.

   Α098Λ4/1020

   BAD ORIGINAL

   5. Ligand-Analose nach Anspruch !,gekennzeichnet durch die Formel

   W⁴⁰

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   W und W sind Wasserstoff oder Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen; W ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen bzw. eine Carboxy-

   gruppe;

   ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

   W und W sind Hydroxyl- oder Alkoxygruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, daß eine der Gruppen _w4O-45 _{die Gruppe} _x⁺_A⁺ darstellt oder ein Wasserstoff von w⁴⁰"⁴⁵ durch -X⁺-A⁺ ersetzt ist, worin X⁺ eine Bindung oder eine stabile bindende Gruppe mit 1-30 Kohlenstoffatomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- oder Schwefelatomen bestehen, darstellt und A eine stabile freie radikalische Nitroxydgruppe darstellt.

   6. Ligand-Analoge nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   CQ

   W ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoff-

   51 52 atomen oder ein Alkalimetall; W und W sind Wasserstoff, Alkyl-, Alkenyl-, Cycalkyl-, Cycloalkenyl- oder Arylkohlenwasserstoffe mit nicht sehr αϊα Β Kohlenstoffatomen;

   409844/1020

   /Ob

   c* ei

   W * ist Wasserstoff oder ein Alkalimetall; W let Sauerstoff oder Schwefel, mit der Maßgabe, daß eine der ^; Gruppen VT ^J* die Gruppe -X-A darstellt oder ein Wasserstoff von w durch -X⁺-A⁺ ersetzt ist, worin X eine Bindung oder eine stabile verbindende Gruppe mit 1-30 loatomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- und Schwefelatomen bestehen, darstellt und A⁺ eine st;
   darstellt.

   A eine stabile, freie radikalische Nitroxydgruppe

   7. Ligand-Analoge nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel

   CH CHCOW"⁵

   Ni-W⁵⁷ " CH-OW⁵⁶

   CH₂ CH: CH₂

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   55
   W ist eine Hydroxyl-, Methoxy- oder Aminogruppe;

   W ist Wasserstoff oder eine Benzoylgruppe; W ist

   Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen,

   55—57 4. +

   wobei eine der Gruppen W die Gruppe -X -A ,bedeutet oder ein Wasserstoff von W durch -X⁺-A⁺ ersetzt ist, worin X^f j ine Bindung oder eine stabile verbindende Gruppe mit 1-30 Atomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- und Schwefelatomen bestehen, darstellt und A eine stabile freie radikalische Nitroxydgruppe darstellt.

   40984

   BAD ORIGINAL

   -Jer-

   8. Ligand-Analoge nach Anspruch 1 als Steroide mit 18 bis Kohlenstoffatomen und 1 bis 6 sauerstoffhaltigen Funktionalitäten, gekennzeichnet durch die Grundstruktur

   Z -i

   X-A

   worin X eine Bindung oder eine stabile verbindende Gruppe und A eine stabile freie radikalische Nitroxydgruppe ausgenommen die Oxazolgruppe und Z eine Hydroxyl-, Oxo-, oder aliphatische S'ruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen bzw. eine sauerstoffhaltige aliphatische Gruppe mit 1-3 Sauerstoffatomen und 1-8 Kohlenstoffatomen, ausgenommen die Garboxyalkylgruppe, darstellt.

   9i Ligand-Analoge nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch die Formel

   .a10

   G₅H_{1 r}_

   a12

   0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen

   GH,

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   W^a1° und W^a12 sind Wasserstoff und W^a11 ist eine Hydroxyl-

   a10 a12 gruppe; mit der Maßgabe, daß eine der Gruppen W -

   die Gruppe -X⁺-A* daretellt, worin X⁺ eine Bindung oder eine stabile verbindende Gruppe mit 1-30 Atomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- und Schwefelatomen

   bestehen, darstellt und A Hitroxydgruppe darstellt.

   •int stabil· freie radikalieohe

   10. Ligand-Analoge nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel

   _fa20 ^0-1 äthyleniach ungesättigte Stellen ^C5^H9-11

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   a2O—821
   W ^J sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe,

   a24 wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorliegt; W ist eine Hydroxyl-Amino- oder eine Oxygruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen; mit der Maßgabe, daß eine der Gruppen _wa2O-a24 _{die Gruppe} _χ⁺_Α⁺ darstellt oder ein Wasserstoff einer der Gruppen _w ^a20~^a24 fl_Urch -X⁺-A⁺ ersetzt ist, wobei X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe aus 1-30 Atomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- und Schwefel Tt omen bestehen, darstellt und A eine stabile freie radikalische Nitroxydgruppe darstellt.

   11. Ligand-Analoge nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel

   0 C₃H₇ 0 W^a25 COCH₀ - C - CHa - 0 - C

   3^Π7
   C - CHa - O - B - W^a26

   CH,

   a26
   worin W^{ac J} und W Aminogruppen darstellen, mit der

   Maßgabe, daß eine der Gruppen w^a25~^a26 die Gruppe -X⁺-A⁺ darstellt oder ein Wasserstoff einer der Gruppen _fa25-a26 _durch _χ⁺__Α ⁺ _ersetzt ist, wobei X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe mit 1-30 Atomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- und Schwefelatomen bestehen, darstellt und A eine stabile freie radikalische Nitroxydgruppe darstellt. {09844/1020

   12. Ligand-Ana 1 Oi't.· Formel

   Anspruch ¹, gekennzeichnet duron die ,a39 ^W _v

   W'

   a33

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   .a31

   W^a5° und

   aind Wasserstoff; W^ ist Wasserstoff,

   eine niedere Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen bzw.

   a32

   bildet zusammen mit W eine Doppelbindung; W ^JJ ist eine Aminogruppe, eine niedere Alkylaminogruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, bzw. bildet zusammen mit W * eine Carboxylgruppe; W^a^ ist Wasserstoff oder eine

   Hydroxylgruppe und W ^y ist eine Oxygruppe oder zwei ungepaart<~ 7.1 nktronen, mit der Maßgabe, daJ eine der Gruppen w^ri5"'~" dif- >-uppe -X⁺-A⁺ iar^tt¹"". I * oder ein Wasserstoff einer der Gruppen W ~ durch -X⁺-A⁺ ersetzt ist, wobei X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe mit 1-30 Atomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- und Schwefelet' - *?n bestehen, darstellt und A eine stabile freie rn-M kaiische Nitroxydgruppe darstellt.

   13. Ligand-Anair-.frp nach Ansprucn 1, gekennzeichnet durch die .Formel

   »a43 W^a42

   a41

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   W iet Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, ein· Dialkylaminoalkylgruppe mit 4-8 Kohlen·

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   BAD ORIGINAL

   AM*

   stoffatomen, eine N-Hydroxyalkyl-N'-piperazinoalkjlgruppe, worin die Alkylgruppen 2-3 Kohlenetoffatome enthalten, eine N-Alkyl-N'-piperazinoalkylgruppe, worin die N-Alkylgruppen 1-3 Kohlenstoffa.tome und die zweite Alkylgruppe 2-3 Kohlenstoffatome enthält, oder eine 2-(N-Alkyl)-piperidinoalkylgruppe, worin die N-Alkylgruppe 1-3 Kohlenstoffatome und die zweite Alkylgruppe 2-3 Kohlenstoff atome enthält, wobei mindestens 2 Kohlenetoffatome zwischen den Heteroatomen vorhanden aindj W ist Wasserstoff, Chlor, eine Trifluorraethyl·- oder eine Alkylmercaptogruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen; W^a42 und W^a43 sind Wasserstoff, mit der Maßgabe, daß eine der Gruppen _w ^a40"^a45 die Gruppe -K⁺-A⁺ darstellt oder ein Wasserstoff einer der Gruppen ^^a4ü~^a^5 c|_urcn -X -A ersetzt ist, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe mit 1-30 Atomen, die ausschließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff, Stickstoff-, Saueretoff-, Phosphor- und Schwefelatom bestehen, darstellt und A eine stabile freie radikalische Nitrox.v \?r j ;■; ^ darstellt.

   14. Ligand-Analoge nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die

   Formel

   _ffa50

   worin W^a5° und f^a51 Waseeretoff und W^a52 eine niedere Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen bedeuten, mit der Maßgabe, daß eine der Gruppen W die Gruppe -X⁺-A⁺ darstellt oder ein Wasserstoff einer der Gruppen _wa5i-a52 _durch _χ⁺._Α ⁺ ersetzt ist, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe mit 1-30 Atomen, die aus-

   4 C & tLl . 'C 2 0

   BAD ORIGINAL

   schließlich aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor- und Schwefelatomen bestehen, darstellt, und A⁺ eine stabile freie radikaliache Nitroxydgruppe iarstellt.

   15. Ligand-Analoge nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Po raue 1

   C C — CH-CH N

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   11 1 °
   W und W *" sind Wasserstoff, eine Methylgruppe oder

   bilden zusammen mit dem Sticketoffatom, an das sie ge™ '

   17 bunden aind, einen Morpholin- oder Piperidinringi W ist eine Älkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomenj mit der Maßgabe, daß eine beliebige Gruppe W die Gruppe -X⁺-A⁺ darstellt oder ein H einer der Gruppen W durch -I⁺-A⁺ ersetzt ist, wobei X⁺ eine verbindende Gruppe mit 0-8 Kohlenstoffatomen und 1-6 Heteroatomen darstellt, bei denen es sich um Sauerstoff und Stickstoff handelt, wobei mindestens eine Micht-Oxocartonyl-Punk^iöKali^äfe vorhanden ist, und wobei A⁺ eise stabile frei® z»a-äikausche Nitroxydgruppe darstellt*

   409844/102 BAD ORIGINAL

   , Ml

   L e e r s e

   it