DE2913549A1 - Chemisch induzierter fluoreszenz- immuntest und testreagens zu dessen durchfuehrung - Google Patents

Description

Die Erfindung "betrifft einen chemisch induzierten Pluoreszenz-Immuntest und eine Testpackung zu dessen Durchführung.

In den letzten Jahren hat die klinische Diagnose sowohl in bezug auf die Art und Zahl der leicht und genau zu "bestimmenden Substanzen als auch in bezug auf die Bestimmungsverfahren einen starken Aufschwung erfahren. Bei einer grossen Gruppe von klinischen Tests werden organische Rezeptoren verwendet, die eine spezifische Bindung an eine bestimmte räumliche und polare Anordnung eines anderen Moleküls eingehen. Meistens handelt es sich bei derartigen Verbindungen um Antikörper, die zwischen der zu bestimmenden Verbindung oder Substanz und anderen Verbindungen oder Substanzen analoger Struktur unterscheiden können. Aufgrund der Bindung des Rezeptors an einen markierten Liganden ist man in der Lage, zwischen markiertem Liganden, der rezeptorgebunden ist, und ungebundenem markiertem Liganden zu unterscheiden.

Die beobachtete Wirkung der Bindung durch den Rezeptor hängt von der Markierung ab. In einigen Fällen bewirkt die Bindung des Antikörpers nur eine Differenzierung bezüglich des Molekulargewichts zwischen gebundenem und ungebundenem markiertem Liganden. In anderen Fällen kann die Anwesenheit des Rezeptors die Art des von der Markierung erhaltenen Signals beeinflussen, so dass das S.ignal mit der Menge des an den

markierten Liganden gebundenen Rezeptors variiert. Eine

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weitere Abänderung besteht darin, dass der Eezeptor markiert und der Ligand unmarkiert ist. Wenn die Rezeptoren mit zwei verschiedenen markierenden Substanzen (im folgenden kurz Marker) markiert sind, wobei diese Marker bei Vorliegen in enger Nachbarschaft zueinander einer Wechselwirkung unterliegen, so beeinflusst die Ligandenmenge das Ausmass der gegenseitigen Beeinflussung der Marker am Eezeptor.

Bei der Entwicklung eines Tests spielen verschiedene Ge-Sichtspunkte eine Rolle: 1. Das auf Veränderungen der Konzentration des Analyten zurückzuführende Signal; 2. eine einfache Versuchsdurchführung; 3· Veränderungen der Störfaktoren von Probe zu Probe. Ferner ist bei der Entwicklung eines in der Praxis durchführbaren Tests unter anderem auch auf folgende Punkte zu achten: Leichte Herstellung und Reinigung. der Reagentien, zur Verfügung stehende Ausrüstung, leichte Automatisierung und Wechselwirkung mit Liganden.

In der klinischen Praxis besteht nach wie vor ein Bedarf nach neuen und genauen Verfahren, die für die verschiedensten Liganden angewendet werden können oder die in speziellen Fällen, bei denen herkömmliche Verfahren nicht ohne weiteres geeignet sind, Anwendung finden können.

Zum Stand der Technik wird auf die nachstehenden Druckschriften verwiesen: Ein Beispiel für einen Radioimmuntest findet sich in der US-PS 3 709 868, für einen Spinimmuntest in der US-PS 3 960 834 und für Enzymimmuntests in der US-PS 3 654 090 und der DE-AS 22 23 385. Ferner wird auf L. Brand und J.R. Gohlke, Annual Review of Biochemistry, Bd. 41 (1972), S. 843 bis 868 und Stryer, Science, Bd. 162 (1968), S. 526 verwiesen. Smith (FEBS Letters, Bd. 77 (1977), S.25) beschreibt einen Fluoreszenzimmuntest, bei dem Thyroxin an eine fluoreszierende Verbindung gebunden wird und die fluoreszierende Verbindung auslöscht (quencht), wobei der Auslösch-

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Vorgang durch Bindung eines Antikörpers für Thyroxin umkehrbar ist. In diesem Zusammenhang, wird auch auf Ullman und Mitarb., J. Biol. Chem., Bd. 251 (1976), S. 4-172 verwiesen. Ein ausführlicher Übersichtsartikel über Chemilumineszenz findet sich bei McCapra, Quarterly Reviexirs, Bd. (1966), S. 485.

Erfindungsgemäss wird ein kompetitiver Proteinbindungstest zur Verfugung gestellt, bei dem als zu analysierende Verbindung oder Substanz (im folgenden kurz Analyt) ein Bestandteil eines aus einem Liganden und einem Rezeptor für den Liganden bestehenden immunologischen Paars vorliegt. Der Test basiert auf der Anwesenheit des Analyten in einem Testmedium, der das Ausmass, in dem eine Chemilumineszenzquelle durch Energieübertragung auf eine auslöschende Verbindung oder Substanz (im folgenden kurz Quencher) ausgelöscht (gequencht) wird, und zwar bei Vorliegen von relativ weiten Abständen. Durch Bindung (Konjugation) der Chemilumineszenzquelle oder — für den Fall, dass die Chemilumineszenzquelle aus mehreren Bestandteilen besteht - eines Bestandteils der Chemiluinineszenzquelle an einen Bestandteil des immunologischen Paars und durch Bindung eines Quenchers an einen -Bestandteil des immunologischen Paars lassen sich Reagentien herstellen, die bei ihrer Vereinigung im Testmedium je nach der Menge des. im Testmedium vorhandenen Analyten unterschiedlich grosse Lichtemissionen ergeben.

Die Chemilumineszenzquelle oder deren Bestandteil sowie der Quencher können entweder an den Liganden oder an den Rezeptor gebunden sein. Das erhaltene Reagens wird in einem wässrigen, normalerweise gepufferten Medium bei massigen Temperaturen vereinigt und die Menge des emittierten Lichts wird bestimmt. Durch Vergleich mit Testmedien, die eine bekannte Analytenmenge aufweisen, lässt sich eine quantitative Beziehung zwischen den emittierten Lichtquanten und der

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Analytenmenge im Testmedium aufstellen.

Erfindungsgemäss werden auch Testpackungen zur Verfugung gestellt, die die Reagentien in abgemessenen Mengen enthalten, so dass sie direkt verwendet oder leicht unter Bildung von Reagenslösungen verdünnt werden können, so dass man die Konzentrationen erhält, bei denen sich eine optimale Empfindlichkeit und Versuchsdurchführung ergibt.

Erfindungsgemäss wird die Erscheinung der Chemilumineszenz .angewendet, um ein mit der Analytenmenge im Testmedium in Beziehung stehendes Signal zu erhalten. Beim Analyten handelt es sich um einen Bestandteil eines aus Ligand und Rezeptor bestehenden immunologischen Paars. Bei Konjugation der Ghemilumineszenzquelle oder - falls diese Quelle aus mehr als einem Bestandteil besteht - eines Bestandteils der Chemilumineszenzquelle mit einem Bestandteil des immunologischen Paars und bei Konjugation eines Quenchers mit einem Bestandteil des immunologischen Paars beeinflusst die Anwesenheit eines Analyten die Quenchermenge, die sich in quenchendem Abstand zur gebundenen Chemilumineszenzquelle befindet. Die in der Probe vorhandene Analytenmenge lässt sich bestimmen, indem man das Ghemilumineszenzreagens und das Quencherreagens, wobei sich die beiden Markierungen an unterschieden liehen Molekülen befinden, und je nach Bedarf zusätzliche Bestandteile des immunologischen Paars mit dem Analyten im Testmedium vereinigt, gegebenenfalls für die Chemilumineszenz erforderliche Hilfsreagentieix zusetzt, die aus dem Testmedium emittierte Lichtmenge bei einer speziellen Wellen— länge oder einem Wellenlängenbereich misst und mit einem Medium mit bekannter Analytenmenge vergleicht.

Das erfindungsgemässe Verfahren beruht auf der Feststellung, dass bei Vorhandensein eines Farbstoffs innerhalb eines begrenzten Abstands von einer c'hemiluminiszierenden Verbindung oder Gruppe in erregtem Zustand, die chemilumines-

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zierende Verbindung oder Gruppe ihre Energie auf den Quencher stossfrei und ohne Strahlungsemission übertragen kann. Der Quencher kann sodann die Strahlung bei einer höheren Wellenlänge als die chemilumineszierende Verbindung oder Gruppe emittieren oder kann die Energie durch strahlungslosen Zerfall verlieren. Man kann den Bestandteil der Chemi lumineszenzquelle und den Quencher entweder an den Liganden oder den Rezeptor binden, so dass bei einer Kombination der beiden Kon jugate die Menge des sich im quenchenden Abstand zur Chemilumineszenzquelle befindlichen Quenchers durch die Menge des im Testmedium vorhandenen Analyten beeinflußt vrird. JDie Natur und die Menge des aus dem Testmedium emittierten Lichts ist somit eine Funktion des im Testmedium vorhandenen Analyten. Bei der Durchführung von Tests mit bekannten Analytenmengen lässt sich eine quantitative Beziehung zwischen der Analytenmenge im Testmedium und der aus dem Testmedium bei einer oder mehreren Wellenlängen emittierten Lichtmenge herstellen.

Nachstehend werden kurze Definitionen für hier verwendete Ausdrücke gegeben:

Analyt: Zu messende Verbindung oder Substanz. Es kann sich um einen mono- oder polyepitopen, antigenen oder hapteni-

sehen Liganden, eine oder mehrere Verbindungen, die mindestens ein gemeinsames epitopes Zentrum aufweisen, oder einen Rezeptor handeln.

Ligand: Beliebige Verbindung, für die ein Rezeptor natür-

lieh vorkommt oder hergestellt werden kann.

Ligandenanaloges; Modifizierter Ligand, der mit dem analogen Liganden um den Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation die Möglichkeit zur Verbindung mit einem

Marker oder mit einem "hub^M-Kern bietet.

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Poly-(ligandenanaloges): Eine Hehrzahl von kovalent aneinander gebundenen Lxgandenanalogen, in der Regel in bezug zu einem "hub^u-Kern. d.h. eine Verbindung mit einer Mehrzahl von epitopen Stellen» ("epitopic site" nachstehend als epxtopes Zpntrum bezeichnet) die xn der Lage sind, mit dem

analogen Liganden um den Rezeptor zu konkurrieren.

Marker; Bestandteil einer Chemilumineszenzquelle oder eines Quencherfarbstoffs, die ein lichtemittierendes reziprokes Paar bilden, wobei der Quencherfarbstoff eine hohe Übergangswahrscheinlichkeit der Energieabsorption von der Chemilumineszenzquelle aufweist.

(a) Chemilumineszenzmarker: Eine Verbindung, die als solche oder in Kombination mit anderen Verbindungen ein Molekül in einem elektronisch angeregten Zustand bildet, wobei das Molekül unter Lichtemission in einen energieärmeren Zustand übergehen kann und wobei sich insgesamt gesehen eine chemische Veränderung von einer oder mehreren dieser Verbindungen ergibt.

(b) Quencher: Ein Molekül., das in der Lage ist, die chemilumineszierende Lichtemission zu hemmen, wenn es sich vom Chemilumineszenzmolekül in einem kurzen, aber nicht-stossen-

den Abstand, im allgemeinen weniger als etwa 100 A, befindet, wobei das Molekül die Energie, die anderenfalls als chemilumineszierendes Licht ausgestrahlt würde, aufnimmt. Tatsächlich ist es für die Quenchwirkung nicht erforderlich, dass der Quencher der nächste Nachbar zur Chemilumineszenzquelle ist.
30

Marker-Konjugat: Der Marker, d.h. entweder eine Verbindung . der Chemilumineszenzquelle oder der Quencher,ist entweder über eine Bindung oder eine verknüpfende Kette an einen Bestandteil des immunologischen Paars gebunden, wobei nicht beide an dasselbe Molekül gebunden sind. Das Konjugat

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r -j

weist mindestens einen Marker auf. Es können eine Mehrzahl von Markern an den Bestandteil des immunologischen Paars oder eine Mehrzahl von derartigen Bestandteilen an den Marker gebunden sein. Es können auch eine Mehrzahl von Lif.

ganden und Markern gebunden sein, d.h. es können PoIy-(Iigandenanaloge)-Polymarker vorliegen. Insbesondere kann, wenn ein Enzym einen Bestandteil der als Marker verwendeten Chemilumineszenzguelle darstellt, eine Mehrzahl von Ligandenanalogen an das Enzym unter Bildung eines PoIy-(Iigandenanalogen)-Markers gebunden sein.

Rezeptorr Beliebige Verbindungen oder Zusammensetzungen, die in der Lage sind, eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, d.h. ein epitopes Zentrum, zu erkennen. Beispiele für Rezeptoren sind natürlich auftretende Rezeptoren, Antikörper, Enzyme, Lectine und I"ab-Fragmente. Die Rezeptoren können in bezug auf die Rezeptorstellen monovalent oder polyvalent sein. Im allgemeinen sind sie polyvalent, d.h. es handelt sich um Antikörper. Für einen spezifischen Liganden stellt ein Rezeptor einen "Antiliganden" dar. Der Rezeptor-Antiligand und der reziproke Ligand bilden ein immunologisches Paar.

Poly-(ligandenanaloges)-Marker; Eine Zusammensetzung, in der eine Mehrzahl von Ligandenanalogen und ein oder mehrere Marker aneinander gebunden sind, wobei das Ligandenanaloge und der Marker benachbart sind, so dass bei Bindung des Rezeptors an das Ligandenanaloge sich die Markierung am markierten Rezeptor innerhalb eines quenchenden Abstands vom reziproken Marker befindet. Sofern ein Enzym Teil der Chemilumineszenzquelle ist und es sich beim Liganden um einen haptenischen Liganden handelt, können eine Mehrzahl von Ligandenanalogen an das Enzym gebunden sein. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass eine Mehrzahl von

Ligandenanalogen und ein·oder mehrere Marker an einen

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wasserlöslichen, polyfunktionellen "trab"-Kern gebunden sind.

Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren wird in einer wässrigen, im allgemeinen homogenen Zone im allgemeinen (aber nicht notwendigerweise) bei einem massigen pH-Wert, vorzugsweise in der Nähe des Empfindlichkeitsoptimums, durch geführt. Die Testzone zur Bestimmung des Analyten wird unter Verwendung einer entsprechenden Testlösung, die im

^O allgemeinen gepuffert ist, der unbekannten Probe, die einer ■ Vorbehandlung unterzogen worden sein kann, des mit der Chemilumineszenzquelle markierten Reagens , des mit dem quenchermarkierten Reagens (einschliesslich Poly-(ligandenanalogem)-Polymarker) und des Liganden bzw. Antiliganden hergestellt. Die Anwesenheit des Antiliganden oder Liganden zusammen mit einer vorbestimmten Menge an Antiligandem im Testmedium steuert das Ausmass, in dem der Quencher in quenchenden Abstand zur Chemilumineszenzquelle kommt.

Bei der Herstellung der Quencher- und Chemilumineszenzreagentien gibt es die folgenden vier Grundmöglichkeiten:

(1) Die chemilumineszierende Gruppe (Chemiluminescer) ist an den Liganden unter Bildung eines chemilumineszierend markierten Liganden gebunden und der Quencher ist an den Rezeptor unter Bildung eines quenchermarkierten Antiliganden gebunden;

(2) der Quencher ist an den Liganden unter Bildung eines quenchermarkierten Liganden gebunden und die chemilumineszierende Gruppe ist an den Rezeptor unter Bildung eines chemilumineszierend markierten Antiliganden gebunden;

(3) die chemilumineszierende Gruppe ist an den Rezeptor unter Bildung eines chemilumineszierend markierten Antiliganden gebunden und der Quencher ist an den

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' Rezeptor unter Bildung eines quenchermarkierten Antiliganden gebunden; und

(4-) die chemilumineszierende Gruppe ist an den Liganden unter Bildung eines chemilumineszierend markierten Liganden gebunden und der Quencher ist an den Liganden unter Bildung eines quen'chermarkierten Liganden gebunden.

Bei den beiden erstgenannten Kombinationen befindet sich bei einer Vereinigung der Reagentien der Quencher in quenchendem Abstand zur chemilumineszierenden Gruppe. Die Anwesenheit eines Analyten, d.h. entweder eines Liganden oder Antiliganden, verringert die Menge der zwischen der chemilumineszierenden Gruppe und dem Quencher übertragenen Energie, indem die Anzahl der Quenchermoleküle im Bereich des quenchenden Abstands von der chemilumineszierenden Gruppe verringert wird. Bei der dritten Kombination muss ein polyepitoper Ligand (einschliesslich Poly-(ligandenanaloge))für einen Antiliganden oder einen monoepitopen Liganden als Analyt zugesetzt werden. Bei Vorliegen eines polyepitopen Liganden wird mit zunehmender Konzentration des polyepitopen Liganden ein zunehmendes Quenchen bis zum Erreichen eines Maximums festgestellt, wonach ein abnehmendes Quenchen mit weiter zunehmender Konzentration des polyepitopen Liganden folgt. Somit ergibt sich eine biphasische Reaktion, so dass es zur Ermittlung eines diskreten Ergebnisses wesentlich ist zu wissen, auf welchem Kurventeil man sich befindet. Im Gegensatz dazu trägt bei einem Poly-(ligandenanalogen) die Anwesenheit eines monoepitopen Liganden zu einer Verminderung des Quenchens bei. Bei Vorliegen eines Rezeptors als Analyt ergeben erhöhte Rezeptorkonzentrationen auch eine Verminderung des Quenchens.

Wenn die chemilumineszierende Gruppe und der Quencher beide an einen Liganden gebunden sind, kann eine Bestimmung des

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Liganden oder des polyvalenten Antiliganden durchgeführt werden. Bei der Bestimmung eines Liganden werden die zweifach markierten Konjugate zusammen mit dem Antiliganden verwendet, was die chemilumineszierende Gruppe und den Quencher in quenchenden Abstand zueinander bringt. Die Zugabe des Liganden verringert die Menge der chemilumineszierenden Gruppe und der Markierung, die sich in quenchendem Abstand befinden. Zur Bestimmung des Antiliganden werden die zweifach markierten Konjugate verwendet. Bei steigenden Mengen an Antiligandem ergibt sich eine Abnahme der Chemilumineszenz auf ein Minimum und anschliessend eine Zunahme mit steigender Antiligandenkonzentration. Sofern man unsicher ist, auf welchem Teil der biphasischen Kurve man sich befindet, so erhält man durch eine oder mehrere

^⁵ Verdünnungen der Probe eine Information über die genaue Konzentration.

Unter Quenchen ist lediglich die Energieübertragung von der chemilumineszierenden Gruppe auf den Quencher zu verstehen. Das Ergebnis dieser Energieübertragung ist, dass Licht einer einzelnen Wellenlänge oder eines Wellenlängenbereichs, das sonst durch die chemilumineszierende Gruppe auf andere Weise emittiert worden wäre, auf den Quencher übertragen wird, der dann fluoreszieren kann, wobei Licht bei einer höheren Wellenlänge im Vergleich zur Energieabsorption emittiert wird. Je nach der Quantenausbeute der Emission der chemilumineszierenden Gruppe, der Ausbeute der Energieübertragung von der chemilumineszierenden Gruppe zum Quencher und der Quantenausbeute der Emission des Quenchers sowie je nach dem beobachteten Wellenlängebereich können grössere oder kleinere Lichtmengen aufgrund des Quenchvorgangs beobachtet werden. Unter der Bezeichnung Quenchen ist deshalb nicht zu verstehen, dass notwendigerweise eine Verminderung des beobachteten Signals erfolgt. Beobachtet man das durch den Quencher emittierte

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^Γ 21

Licht, so ergibt ein erhöhtes Quenchen tatsächlich ein zunehmend grosses Signal.

Eine spezielle Situation ist bei kleinen Haptenen mit einem 'Molekulargewicht von etwa 125 bis 2000 gegeben. Bei diesen Haptenen kann eine wesentlich verringerte Chemilumineszenz erreicht werden, d.h. ein Quenchen, ohne dass der Quencher an den Rezeptor gebunden ist. Insbesondere ist dies der Fall, wenn es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper handelt. Obgleich die Signalverminderung nicht ebenso gross ist, wie wenn der Quencher an den Rezeptor gebunden ist, so ergibt sich doch eine für die Durchführung einer Bestimmung ausreichende Verminderung. Mit Ausnahme der Verwendung eines Rezeptors ohne Quencher wird die Bestimmung auf die gleiche Weise durchgeführt, wobei das durch die chemilumineszierende Gruppe emittierte Licht abgelesen wird.

Zur Durchführung des Tests wird im allgemeinen ein wässriges Medium verwendet. Es können auch andere polare Lösungsmittel verwendet werden, im allgemeinen sauerstoffhaltige organische Lösungsmittel mit 1 bis 6 und insbesondere mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen, wie Alkohole und Äther. Im allgemeinen sind diese Kolösungsmittel in Mengen von höchstens etwa 40 Gewichtsprozent und insbesondere von höchstens etwa 20 Gewichtsprozent vorhanden.

Der pH-Wert des Mediums beträgt im allgemeinen etwa 5 bis 12 und insbesondere etwa 7 bis 10. Bei Verwendung von Enzymen als Teil der Chemilumineszenzquelle beträgt der pH-Wert vorzugsweise 7 bis 9· Zur Einstellung des pH-Werts und zu dessen Aufrechterhaltung während der Bestimmung können verschiedene Puffer angewendet werden. Beispiele dafür sind Borat-, Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Barbitalpuffer. Die Art des Puffers ist nicht kritisch,

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^Γ - 22 -

wenngleich, bei speziellen Tests "bestimmte Puffer besonders bevorzugt sein können.

Zur Durchführung des Tests werden im allgemeinen massige c .die

° Temperaturen angewendet. Vorzugsweise sind/Temperaturen während des gesamten Tests konstant. Im allgemeinen eignen sich Temperaturen von etwa 10 bis 50⁰G und insbesondere von etwa 15 bis 40⁰C.

Die Konzentration des zu bestimmenden Analyten beträgt

_a. -15
im allgemeinen etwa 10 bis 10 ^m und insbesondere etwa 10 bis 10" ^ m. Die in Präge kommenden Konzentrationen betragen anders ausgedrückt etwa 10 ^ bis 10 g/ml.

Abgesehen von der in Frage kommenden Analytenkonzentration wird die Konzentration der Reagentien normalerweise auch von anderen Gesichtspunkten bestimmt, beispielsweise davon, ob der Test qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ durchgeführt werden soll, welche Vorrichtung verwendet wird und welche Art von Reagentien eingesetzt werden. Obgleich im allgemeinen zur Erzielung einer möglichst hohen Testempfindlichkeit die Konzentration der Reagentien unter Berücksichtigung der Analytenkonzentration festgelegt wird, werden die einzelnen Reagentienkonzentrationen

empirisch festgelegt. Da die Bindungskonstante und das Bindungsprofil von Rezeptoren beispielsweise bei Antikörpern je nach Blutart variieren,kann jede neue Charge von Antikörpern verschiedene Konzentrationsverhältnisse

der verschiedenen Reagentien erforderlich machen. 30

Im allgemeinen entspricht bei mono- und polyepitopen Ligandenanalyten die Antiligandenkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen, der interessierenden Minimalkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen, und

nicht mehr als dem etwa 50-fachen der interessierenden

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Γ

Maximalkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen, vorzugsweise dem etwa 1- bis 10-fachen und insbesondere dem etwa 1- bis 3-fachen der interessierenden Maximalkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen.

Bei polyepitopen Ligandenrezeptoranalyten betragen die Iquivalentverhältnisse von markiertem Liganden oder Ligandem zu Rezeptoranalyt im allgemeinen etwa das 0,01-fache der interessierenden Minimalkonzentration und nicht mehr als etwa das 100-fache der interessierenden Maximalkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen. Der in Verbindung mit dem markierten Liganden oder dem Liganden verwendete markierte Rezeptor liegt im allgemeinen in der etwa 0,01- bis 100-fachen Konzentration des Liganden oder markierten Liganden, bezogen auf die bindenden Stellen, vor.

Pur polyepitope Ligandenanalyten beträgt bei Verwendung eines markierten Liganden dessen Konzentration im allgemeinen mindestens das etwa 10~ -fache und insbesondere das etwa 10~ -fache der interessierenden Minimalkonzentration. Insbesondere entspricht in diesem Tall die Konzentration des markierten Liganden etwa der interessierenden Minimalkonzentration und übersteigt in etwa die interessierende Maximalkonzentration nicht. Der Anteil an markiertem Rezeptor beträgt im allgemeinen mindestens das etwa 0,1-fache der Konzentration des markierten Liganden, bezogen auf die bindenden Stellen, und nicht mehr als etwa das 100-fache der Konzentration des markierten Liganden, bezogen auf die

bindenden Stellen.
30

Für monoepitope Ligandenanalyten und monoepitope Ligandenrezeptoranalyten beträgt bei Verwendung eines markierten Liganden (einschliesslich Poly-(ligandenanaloge)-Marker) die Konzentration des markierten Liganden, bezogen auf die bindenden Stellen, im allgemeinen mindestens das 10"* -fache

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der interessierenden Minimalkonzentration., vorzugsweise mindestens das 10 -fache der interessierenden Minimalkonzentration und insbesondere liegt diese Konzentration im Bereich von et\ia. der interessierenden Minimalkonzentra- ^ tion bis zur interessierenden Maximalkonzentration. Bei Verwendung eines Poly-(ligandenanalogen) zusammen mit markiertem Antiliganden liegt die Konzentration des PoIy-(ligandenanlogen) innerhalb der gleichen Bereiche, wie sie für den markierten Liganden angegeben sind. Die Antiligandenkonzentration wurde vorstehend bereits erwähnt.

Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Eeagentieii kann stark variieren und hängt davon ab, ob eine Gleichgewichts- oder Geschwindigkeitsmessung vorgenommen wird. Ferner hängt sie von der Art der Eeagentien, der Geschwindigkeit, mit der sich das Gleichgewicht" zwischen Ligand und Antiligand einstellt und der Art der Chemilumineszenzquelle ab. Wenn die Chemilumineszenzquelle aus mehreren Bestandteilen besteht, wovon einer dieser Bestandteile ein Marker ist, kann die Chemilumineszenz zu einem beliebigen Zeitpunkt durch Zugabe der anderen Bestandteile der Chemilumineszenzquelle eingeleitet werden. In den Fällen, wo die Chemilumineszenzquelle aus mehreren Bestandteilen besteht, können die markierten Eeagentien und die unbekann-

te Probe gleichzeitig vereinigt x^erden, wonach die Zugabe der anderen Bestandteile der Chemilumineszenzquelle folgt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Analyten mit dem markierten Antiliganden zu vereinigen, anschliessend den markierten· Liganden zuzusetzen und schliesslich die restlichen Bestandteile der Chemilumineszenzquelle zuzugeben. Zwischen den einzelnen Zugaben können Inkubationszeiten liegen. In den Fällen, in denen die Chemilumineszenzquelle nur aus einem Bestandteil besteht, wird normalerweise der markierte Rezeptor mit dem Analyten ver-

einigt, wonach die Zugabe des markierten Liganden erfolgt.

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γ -ι

Je nach, der angewendeten Verfahrensweise, dem Gleichgewichts- oder ETichtgleichgewichtszustand, der Bindungsgeschwindigkeit des Antiliganden an den Liganden und den markierten Liganden und. den relativen Konzentrationen des Liganden, des markierten Liganden und des markierten Antiliganden können eine oder mehrere Inkubationsstufen vorgenommen werden. Im allgemeinen liegen zwischen den einzelnen Zugaben wenige Sekunden bis mehrere Stunden, vorzugsweise nicht mehr als 16 Stunden und insbesondere nicht mehr als 6 Stunden. Im allgemeinen betragen die Inkubationszeiten etwa 1/2 Minute bis 1 Stunde und insbesondere etwa 0,15 Minuten bis 30 Minuten. Da das Endergebnis von

abhängt, den Ergebnissen von Eichsubstanzen/ die im wesentlichen auf die gleiche Weise und nach Möglichkeit auf identische Weise behandelt worden sind, sind die spezielle Verfahrensweise und die vorstehend genannten Zeiten nicht kritisch, solange sich bei verschiedenen Analytenkonzentrationen signifikante, reproduzierbare Unterschiede ergeben.

Je nach Wahl des Testablaufs, der verwendeten Vorrichtung und der vorliegenden Analytenkonzentration können die Testvolumina von nur etwa 1 ul, vorzugsweise etwa 25}il bis höchstens 5 ml, vorzugsweise höchstens 2 ml, betragen.

Die Messung hängt von der Zählung der aus dem Testmedium emittierten Lichtquanten ab. Es können verschiedene Vorrichtungen verwendet werden, wie Szintillationszähler oder Photozellen, die zur Lichtmessung bei einer Wellenlänge

oder innerhalb eines Wellenlängenbereichs in der Lage sind. 30

Materialien

Die Hauptbestandteile beim erfindungsgemässen Test zur Bestimmung von Analyten, die gegebenenfalls in jedem einzelnen Fall verwendet werden,sind: Markierter Ligand (unter Einschluss von Poly-(ligandenanalogem)-Marker);

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γ -ι

Markierter Antiligand; Ligand; Antiligand; und zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle.

Analyt
Die erfindungsgemäss bestimmten Ligandenanalyten sind mono- oder polyepitop. Bei den polyepitopen Ligandenanalyten handelt es sich normalerweise um Poly-(aminosäuren), d.h. um Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und entsprechende Kombinationen. Beispiele für derartige Kombinationen sind Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne und Zellmembranen.

In den meisten Fällen weisen die erfindungsgemäss bestimmten polyepitopen Ligandenanalyten ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000 und im allgemeinen von mindestens etwa 10 000 auf. Bei Poly-(aminosäuren) liegt das Molekulargewicht im Bereich von etwa 5000 bis 5 Millionen und insbesondere von etwa 20 000 bis 1 Million. Bei den Hormonen liegt das Molekulargewicht im allgemeinen im Bereich von etwa 5000 bis 60 000.

Die grosse Gruppe von Proteinen kann in verschiedene Gruppen eingeteilt werden, beispielsvreise Gruppen mit ähnlichen Strukturmerkmalen, Gruppen mit besonderen biologischen Funktionen und Gruppen, die mit speziellen Mikroorganismen im Zusammenhang stehen, insbesondere mit pathogenen Mikroorganismen.

Nachstehend sind strukturell verwandte Proteine aufgeführt: Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Scleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nucleoproteine und Glycoproteine.

Beispiele für nicht klassifizierte Proteine sind Somatotropin, Prolactin, Insulin und Pepsin.

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^Γ · . ■

"* Eine Anzahl von Proteinen aus dem menschlichen Plasma sind klinisch bedeutsam. Beispiele dafür sind: Präalbumin, Albumin, oc^-Lipoprotein, α,,-Säureglycoprotein, a^-Antitrypsin, ou-Glycoprotein, Transcortin, ^.öS-Postalbumin, tryptophanarmes α,,-Glycoprotein, oc^ χ-Glycoprotein, thyroxinbindendes Globulin, Inter-oc-trypsin-inhibitor, Gc-Globulin, (Gc 1-1; Gc 2-1; Gc 2-2), Haptoglobin (Hp 1-1; Hp 2-1; Hp 2-2), Ceruloplasmin, Cholinesterase, O^-Lipoproteine, oCp-Macroglobulin, 0C2-HS-Glycoprotein,

Zn-a^-Glycoprotein, otp-Neuraminoglycoprotein, Erythropoietin, ß-Lipoprotein, Transferin, Hämopexin, !"ibrinogen, Plasminogen, ß^-Glycoprotein I, ßo-Glycoprotein II, Immuno globulin G (IgG) oder yG-Globulin der Formeln:

\^r2 K2. oder f^ \~, Immunoglobulin A (IgA) oder /A-Globulin der Formeln: («2/f ο)ⁿ oder (a.^ X p)ⁿ» Immunoglobulin M (IgM) oder J^M-Globulin der Formeln: (^u, K^ oder Qi₂A₂)^i Immunoglobulin D (IgD) oder j^D-Globulin CfD) der Formeln: (.6 ^Ko) °d-^er C ei 2^2^' £^Dmun°gl°^1:)Uli¹¹ ^ (IgE) oder j^E-Globulin (/Έ) der Formeln: (£ ₂ ^2) ^oder (£ 2^-2^' f^reie /fund Λ-Ketten des Immunoglobulins, Komplementfaktoren: C'1 (C'1g; C'1r; C'1s) C'2, C'3 (ß^A; CC₂D), C'4-, C'5, C6, C^!7, C'8, C'9-

„,. Nachstehend sind die wichtigsten Blutgerinnungsfaktoren aufgeführt:

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- 28 -	2913549	Fibrinogen
	Name	Prothrombin
Internationale Bezeichnung	Thrombin
I	Gewebsthromboplastin
II	Proaccelerin, Accelerator-
Ha	globulin
III	Proconvertin
V und VI	Antihämophiles Globulin
	(AHG)
VII
VIII

IX Christmas-Faktor, Plasma-

Thromboplastin-Component (PTC)

X Stuart-Prower-Faktor,

Autoprothrombin III

XI Plasma-Thromboplastin-

Antecedent (PTA)

XII Hagemann-Faktor

XIII Fibrinstabilisierender

Faktor

Beispiele für wichtige Proteinhormone sind: Peptid- und Proteinhormone

Parathyroides Hormon (Parathormon), Thyrocalcitonin, Insulin, Glucagon, Relaxin, Erythropoietin, Melanotropin (melanocytenstimulierendes Hormon, Intermedin), Somatotropin (Wachstumshormon), Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon), Thyrotropin, follikelstimulxerendes Hormon, luteinisierendes Hormon (interstitialzellenstimulierendes Hormon), luteomammotropes Hormon (Luteotropin, Prolactin) und Gonadotropin (chorionisches Gonadotropin).

Gewebshormone

Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin und Lactogen aus Humanplacenta.

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Peptiditormone aus der Heurohypophyse Oxytocin, Vasopressin, Eeleasing-Factors (EI¹), wie CEF, LEF, TEF, Somatotropin-BF, GBF, FSH-EF, PIF und MIF.

Weitere polymere Materialien von Interesse sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.

Beispiele für antigene Polysaccharide, die sich von Mikroorganismen ableiten sind:

Mikro organi smen-Sp e ζ i e s

Streptococcus pyogenes Diplococcus pneumoniae

Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoe,. -

Corynebacterium diphtheriae Actinobacillus mallei;

Actinobacillus whitemori Francisella tularensis

Pasteurella pestis Pasteurella pestis

Pasteurella multocida Bruce!la abortus Haemophilus influenzae Haemophilus pertussis Treponema reiteri Veillonella
Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium Mycobacterium tuberculosis Hämosensitin gefunden in

Polysaccharid Polysaccharid

Polysaccharid Polysaccharid

Polysaccharid·. Eohextrakt

Lipopolysaccharid 'Polysaccharid

Polysaccharid·

Kapsuläres Antigen Rohextrakt Polysaccharid roh

Pc-iysaccharid. Lipopolysaccharid Polysaccharid Polysaccharid ■ Lipopolysaccharidi Kochsalzextrakt von mit 90% Phenol extrahierten Mykobakterien und PoIysaccharidfraktion von Zellen und Tuberkulin

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Klebslella aerogenes Polysaccharide

Klebsiella cloacae Polysaccharid.

Salmonella typhosa Lipopolysaccharid. ,

Polysaccharid\

Salmonella typhi-murium; Polysaccharid

Salmonella derby

Salmonella pullorum
Shigella dysenteriae Polysaccharid

Shigella flexneri roh, Polysaccharid

Shigella sonnei

Rickettsiae Rohextrakt

> Candida albicans Polysaccharid ·

: Entamoeba histolytica . -Rohextrakt

Die zu bestimmenden Mikroorganismen können intakt, lysiert,

gemahlen oder anderweitig zerkleinert sein. Das erhaltene Präparat oder der erhaltene Anteil, beispielsweise durch Extraktion, werden bestimmt. Beispiele für in Frage kommende Mikroorganismen sind:

Coryneba k'terien

Corynebacterium diptheriae

Pneumokokken

Diplococcus pneumoniae

Streptokokken

Streptococcus pyogenes

Streptococcus salivarus

Staphylokokken

Staphylococcus aureus
Staphylococcus albus

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NeisSerien

Neisseria ineningitidis Neisseria gonorrhoe

Enterobakterien "

Escherichia coli Aerobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Salmonella typhosa Salmonella choleraesuis Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae Shigella Schmitzii Shigella arabinotarda Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei

andere Jarmbazillen

Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morgani Pseudomonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae coliforme Bakterien

Salmonell.en

Shigell en

Proteus- Arten

909842/0782

Haemop'hilus-Bordetella-.Gruppe -

Haemophilias influenzae, H. ducreyi

H. hemophilus

H. aegypticus 5

H. parainfluencae-

Bordetella pertussis

in Pasteurellen

Pasteurella pestis Pasteurella tularensis

¹⁵ Brucellen

Bruceila rnelitensis Brucella abortus

Bruceila suis 20

Aerobe sporenbildende Bazillen

Bacillus anthracis ge Bacillus subtilis

Bacillus megaterium Bacillus cereus

³⁰ Anaerobe sporenbildende Bazillen Clostridium botulinum Clostridium tetani

Clostridium perfringens 35

Clostridium novyi

Clostridium septicum

L- 9098.42/0782

Clostridium histoIyticum

Clostridium tertium

Clostridium bifermentans 5

Clostridium sporogenes

Mykobakteriert

Mycobacterium tuberculosis hominis

Mycobacterium bovis Mycobacterium avium

Mycobacterium leprae

Mycobacterium paratuberculosis

Actinomyceten (pilzähnliche Bakterien)

Actinomyces israelii 20

Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Nocardia·asteroides Nocardia brasiliensis

Spirochaet.en

Treponema pallidum Spirillum minus

Treponema pertenue Streptobacillus moniliformis

Treponema carateum Borrelia recurrent!s Leptospira icterohaeinorrhagiae Leptospira canicola

909842/0782 -J

Mycoplasma pneurnoniae

andere

pathogene -MkroOrganismen 5

Listeria monocytogenes

Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis ^g Donvania granulomatis

Bartonella bacilliformis

Rickettsien ' ' " Rickettsia prowazekii

Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii

Rickettsia conorii 20

australis

Rickettsia sibirica Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi

Rickettsia burnetii

Coxiella quintana

Chlamydien Ghlamydia-Arten (C.p'sittaci u. andere)

Pilze

Cryptococcus neoformans

Blastomyces dermatidis

^L 909842/0782

.-■35-

Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis

Paracoccidioides brasiliensis

·

Candida albicans

Aspergillus fumigatus

Mucor corymblfer (Absidia coryiabifera) Rhizopus oryzae Rhizopus arrhizus ^ Phycomycetes Rhizopus nigricans Sporotrichum schenkii Ponsecaea pedrpsoi

Fonsecaea compacta Fonsecaea dermatitidis

Cladosporium carrionii

Phialophora verrucosa

Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii Phialosphora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes

Keratinomyces ajelloi Microsporum canis

Trichophyton rubrum

Microsporum andouini

^L 9098A2/0782

^Γ - 36 -

Adenoviren Herpesviren

Herpes simplex Varicella

Herpes Zoster

Virus B

Cytomegalovirus 10

Pockenviren

Variola

Vaccinia 15

Poxvirus bovis Paravaccinia Molluscum contagiosum 20

Picornaviren

Poliovirus

Coxsackievirus

Echoviren

Ehinoviren

Myxoviren
-^-

Influenza (A, B, und:. C) Parainfluenza (1-4) Mumps-Virus Newcastle - Disease-Virus

Masern-Virus Rinderpest-Virus

L 909842/0782 _J

^Γ - Ύ? -

Bespiratory-Syncytial-Virus RoteIn-Virus

Eastern-Equine-Eacephalitis-Virus Western-Equine-Ea cephalitis-Virus

Sindbis-Virus 10

Chikugunya-Virus

Semliki-Forest-Viruc

Mayora-Virus .J₅ St. Louis-Encephalitis-Virus

California-Encephalitis- Virus

Colorado-Tick-Fever-Virus Gelbfieber-Virus Dengue-Virus

Reovir en

Reovirus Typen 1-3 25

• Hepatitis -^Viren

Hepatitis A-Virus 3Q Hepatitis B-Virus

Tumorviren

Rauscher-Leukämie-Virus Gros s-Virus

Maloney-Leukämie-Virus Allergen.e

^L 9098A2/0782

π

Das Molekulargewicht der mono ep i top en Ligandenanalyten beträgt im allgemeinen etwa 100 bis 2000 und insbesondere 125 bis 1000. Beispiele für in Frage kommende Analyten sind Arzneistoffe, Metaboliten, Pestizide und umweltverschmutzende Substanzen. Beispiele für Arzneistoffe sind Alkaloide, insbesondere Morphinalkaloide, wie Morphin, Codein, Heroin, Detromethorphan sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte, Kokainalkaloide, wie Kokain und Benzoylecgonin sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte, Ergotalkaloide, wie Lysergsäurediäthylamid, Steroidalkaloide, Iminazoylalkaloide, Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide, Chinolinalkaloide, wie Chinin und Chinidin, und Diterpenalkaloide sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte .
15

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Steroide, zum Beispiel die Östrogene, Gestagene, Androgene, Nebennierenrindensteroide, Gallensäuren, cardiotone Glycoside und Aglycone, wie Digoxin und Digoxigenin, Saponin

und Sapogenine, sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte. Hierzu gehören auch die mimetischen Steroidsubstanzen, wie Diäthylstilböstrol.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Lactame mit

oder 6 Ringatomen, beispielsweise die Barbiturate, wie Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, sowie deren StoffWechselprodukte.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Aminoalkylbenzole mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten, wie die Amphetamine, Catecholamine, zum Beispiel Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin, sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Benzhetero-

^L 909842/0782 ->

cyclen, wie Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte. Als heterocyclische Ringe liegen dabei Azepine, Diazepine und Phenothiazine vor.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoff en sind die Purine, wie Theophyllin, Coffein, sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind von Marihuana abgeleitete Verbindungen, wie Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Vitamine, beispielsweise die Vitamine A, B, C, D, E und K.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Prostaglandine, die sich in bezug auf Anzahl und Stellung von

Hydroxylgruppen und Doppelbindungen unterscheiden. 20

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Antibiotika, wie Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Nucleoside und Nucleotide, wie ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit den entsprechenden Zucker- und Phosphatsubstituenten.

Beispiele für verschiedene einzelne Arzneistoffe sind Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propanolol, Griseofulvin, Butyrophenone, Antihistaminika, anticholinerge Arzneistoffe, wie Atropin, sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

^L- 909842/0782 -I

^r -no-

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind Aminosäuren und kleine Peptide, wie die Polyjodthyronine, zum Beispiel Thyroxin und Trijodthyronin, Oxytocin, ACTH, Angiotensin, Gentamycin, Met- und Leu-enkephalin sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.

Beispiele für pathogene Stoffwechselprodukte sind Spermin, Galactose, Pheny!brenztraubensäure und Porphyrin vom Typ 1.
10

In Präge kommende Pestizide sind polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.
15

Das Molekulargewicht der Bezeptoranalyten beträgt im allgemeinen 10 000 bis 2 χ 10 und insbesondere 10 000 bis 10 . Bei den Immunoglobulinen IgA, IgG, IgE und IgM beträgt das Molekulargewicht im allgemeinen etwa 160 000 bis etwa 10 . Das Molekulargewicht von Enzymen liegt im allgemeinen bei etwa 10 000 bis 600 000. Das Molekulargewicht von natürlichen Rezeptoren schwankt stark und beträgt im allgemeinen mindestens etwa 25 000, kann aber 10 erreichen oder darüber hinaus gehen. Entsprechende Beispiele sind Avidin, thyroxinbindendes Globulin, thyroxinbindendes Präalbumin und Transcortin. Marker Quencher
Beim Quencher handelt es sich um ein chromophores MoIekül, das Licht der von der Chemilumineszenzquelle emittierten Wellenlänge absorbiert. Vorzugsweise absorbiert der Quencher das Licht bei einer Wellenlänge, die nahe bei der dem Emissionsmaximum entsprechenden Wellenlänge der Chemilumineszenzquelle liegt. Erwünscht ist eine hohe Ausbeute der Energieübertragung, die erreicht wird, wenn der Quencher sich in realtiv naher Wachbarschaft zur

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r ■ . ■

_ ZL-I _

Chemilumineszenzquelle befindet«, Normalerweise absorbiert der Quencher Licht bei einer Wellenlänge von mehr als

O O

etxira 350 A und insbesondere von mehr als etwa 400 A. Beispiele für verschiedene chromophore Verbindungen, die als Quencher verwendet werden können, sind die Xanthenfarbstoffe wie die von 3j6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol abgeleiteten Fluoreseine sowie die Rosamine und Rhodamine, die sich von 3,6-Diamino-9-phenylxanthhydrol ableiten. Ehodamine und Fluorescine x^eisen eine 9-°-Carboxyphenylgruppe auf und sind Derivate von 9-o-Carboxyphenylxanthhydrol.

Entsprechende handelsübliche Verbindungen weisen Substituenten am Phenylrest auf, die als Bindungsstellen oder als Bindungsfunktionalitäten verwendet werden können. Beispielsweise sind Fluoresceine erhältlich, die durch Amino- oder Isothiocyanatgruppen substituiert sind.

Beispiele für weitere Farbstoffe, die als Quencher ver-

^ wendet werden können, sind 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin, Acridine, wie 9-Isothiocyanatoacridin und Acridinorange, ir-Cp-(2-Benzoxazolyl)-phenyl)-Eialeinimid, Benzoxadiazole, wie 4-Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol und 7-(p-Methoxybenzylamino)-4~nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol, Stilbene, wie 4-Dimethylamino-4'~isothiocyanatostilben und 4-Dimethylamino—4'-maleinimidostilben, N,N'-Dioctadecyloxacarbocyanin-p-toluolsulfonat, Pyrene, wie 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonsäure und 1-Pyrenbuttersäure, Merocyanine, wie Merocyanin 540, Bengalrosa, 2,4-Diphenyl-3(2H)-furanon, Cyanine, Anthrachinone, Porphyrine, Triarylmethane sowie andere leicht zugängliche Farbstoffe, die eine quenchende Wirkung aufweisen. Diese Farbstoffe können entweder zur Konjugation geeignete aktive funktioneile Gruppen aufweisen oder aber es lassen sich derartige funktioneile Gruppen leicht einführen.

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Die Absorptions- und Emissionseigenschaften von Farbstoffen ändern sich beim Übergang vom gelösten Zustand zum gebundenen Zustand unter- Bindung an ein Protein oder an einen Liganden. Deshalb beziehen sich die angegebenen Wellenlängenbereiche und Eigenschaften der Farbstoffe jeweils auf den Farbstoff in der angewendeten Form und nicht auf einen nicht-konjugierten und in einem beliebigen Lösungsmittel vorliegenden Farbstoff. Im Überlappungsbereich zwischen Chemilumineszenzquelle und Queneher ist es erwünscht, dass der Quencher eine hohe Übergangswahrscheinlichkeit aufweist.

Schliesslich können auch "blaue fluoreszierende Proteine" und/oder "grüne fluoreszierende Proteine", die normalerweise mit bestimmten bakteriellen Luciferasen assoziiert sind, wie Luciferase aus Photobacterium fisheri, ebenfalls als Quencher verwendet werden.

Chemilumineszenzquelle

Die Chemilumineszenzquelle kann aus einem oder mehreren, im allgemeinen 2 oder 3 Bestandteilen bestehen. Es ist zwar durchaus möglich, ein einzelnes Molekül zu verwenden, das thermisch labil ist und bei der Zersetzung chemiluminesziert, beispielsweise bestimmte Dioxetane, jedoch sind diese Moleküle aus einer Reihe von Gründen für die Praxis und insbesondere für den Handel weniger gut geeignet. Diese Reagentien können bei ausreichenden niedrigen Temperaturen hergestellt und gelagert werden, wobei ihre Zersetzungsgeschwindigkeit vertretbar gering ist. Anschliessend können diese Reagentien unmittelbar vor der Verwendung erwärmt werden. Eine solche Verfahrensweise ist jedoch im allgemeinen unzweckmassig, selbst wenn diesbezüglich gewisse Parallelen zum Radioimmuntest bestehen. Vorzugsweise besteht die Chemilumineszenzquelle aus mindestens 2 Bestandteilen. Der Grossteil

·- 909842/0782 -J

Γ

der nachfolgenden Erörterungen bezieht sich auf den letztgenannten Fall.

Zur Vereinfachung werden die Chemolumineszenzquellen in 2 Gruppen eingeteilt: Solche mit und ohne Beteiligung einer enzymatischen Katalyse.

Von den Chemilumineszenzquellen, bei denen keine enzymatische Katalyse beteiligt ist, können nur solche Quellen verwendet werden, die unter Bedingungen, bei denen weder die Bindung des Rezeptors an den Liganden inhibiert oder der Rezeptor und der Ligand mit unannehmbarer Geschwindigkeit während der Messdauer abgebaut werden, chemilumineszieren. Im allgemeinen sind Chemilumineszenzquellen, die von nicht-wässrigen Lösungsmitteln und starken basischen Bedingungen (pH-Wert >11) abhängen,ungeeignet. Es können aber entsprechende Techniken angewendet werden, beispielsweise rasch ablaufende Einspritz- oder Fliesstechniken, bei denen die modulierte Emission im wesentlichen beendet ist, bevor das Protein denaturiert ist und eine wesentliche Disassoziation auftritt. Nach dem Injizieren der Base beobachtet man einen Lichtsprung (Burst), der gemessen werden kann.

Es wurde festgestellt, dass verschiedene Verbindungsgruppen unter verschiedenen Bedingungen 'chemilumineszieren. Eine derartige Gruppe stellen die 2,3-Dihydro-1,4~phthalazindione dar. Die bekannteste Verbindung ist Luminol, d.h.. die 5-Amino verbindung. Andere Verbindungen dieser Gruppe sind die 5-Amino-6,7>8-trimethoxy- und Dimethylamino/~ca_7benz-analogen. Diese Verbindungen werden mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder mit Calciumhypochlorit und einer Base zum Lumineszieren gebracht. Die 2,4-,5-Tri^· phenylimidazole stellen eine weitere Gruppe von Verbindüngen dar, wobei Lophin der Trivialname für das Ausgangs-

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Γ -η

^ produkt ist. Beispiele für chemilumineszierende analoge Verbindungen sind die Verbindungen mit p-Dimethyl amino und -Methoxysubstituenten.

Eine weitere Gruppe von chemiluinineszierenden Verbindungen sind die Indolen-3-yl-hydroperoxide, sowie deren Vorläufer und Derivate.

Eine weitere Gruppe sind die Bis-9,9^l-^iacridiniumsalze, wie Lucigenin /![,N'-Dimethyl-S^'-biacridiniumdinitrat. Diese Verbindungen chemilumineszieren nach Vereinigung mit alkalischem Wasserstoffperoxid.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind die in der 9-Stellung substituierten Acridiniumsalze. Spezielle Derivate davon sind die Carbonsäureester, insbesondere die Arylester, Acylderivate, insbesondere die Benzoylderivate, sowie die Cyanoderivate. Zur Einleitung der Chemilumineszenz wird alkalisches Wasserstoffperoxid verwendet.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind verschiedene Acylperoxyester und Hydroperoxide, die in situ durch Vereinigung mit bestimmten Verbindungen, wie 9}10-Βχρ1ιβην1-anthracen, hergestellt werden können.

Eine weitere Gruppe von Chemilumineszenzquellen sind bestimmte Hydroperoxide, wie Tetralinhydroperoxid in Kombination mit Metallkomplexen, insbesondere Porphyrine und Phthalocyanine, wobei als Metalle Eisen oder Zink .vorliegen.

Bevorzugt sind solche Systeme, die eine ausreichende Quantenausbeute der Emission von der Chemilumineszenz-

quelle beim pH-Wert 11 oder darunter, vorzugsweise 10 35

oder darunter, ergeben. Ferner werden solche Systeme be-

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vorzugt, die sich, eines Katalysators bedienen,, der an einen Bestandteil des immunologischen Paars gebunden sein kann. Sofern kein Katalysator beteiligt ist„ ist die Verbindung, die sich unter Emission von Licht zersetzt, an einen Bestandteil des immunologischen Paars gebunden» In diesen Fällen ist die Anzahl der chemilumineszierenden Moleküle auf die Moleküle, die gebunden sind, beschränkt.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind solche, die unter enzymatischer Katalyse chemilumineszieren. Es gibt 2 Gruppen von enzymatisch katalysierten Chemi lumineszenz que 11 en. Bei der ersten Gruppe handelt es sich um Verbindungen, die in Kombination mit alkalischem Wasserstoffperoxid chemilumineszieren. Bei Verwendung einer Peroxidase, wie Meerettichperoxidase oder Katalase, zusammen mit Wasserstoffperoxid und der chemilumineszierenden Gruppe entsteht Chemilumineszenz. Ein Beispiel für derartige Systeme sind die 2,3-Dihydx'o-1,4-phthalazindione. Bei der zweiten Gruppe der enzymatischen Chemilumineszenzquellen handelt es sich um die Luciferine und deren Analoge sowie um Luciferasen.

Markierter Ligand

Die Liganden lassen sich in 2 Kategorien einteilen, nämlich Haptene, deren Molekulargewicht im allgemeinen 125 bis 5000, vorzugsweise etwa 125 bis 2000 und insbesondere etxra. 125 bis 1000 beträgt, und Antigene, deren Molekulargewicht im allgemeinen mindestens etwa 2000, vorzugsweise mindestens etwa 5000 und bei Vorhandensein als Teil von Zellen, Viren, Chromosomen und dergleichen mehr als 10 Millionen beträgt.

Die meisten Antigene von diagnostischem Interesse weisen ein Molekulargewicht von höchstens 1 Million, vorzugsweise etwa höchstens 600 000 und insbesondere von etwa 10 000 bis 350 000 auf.

Bei der Markierung handelt es sich entweder um einen Quencher mit einem Molekulargewicht von etwa 125 bis 1000 oder

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um einen Bestandteil der Chemilumineszenzquelle, "bei dem es sich. 12m ein kleines Molekül mit einem Molekulargewicht von etwa 125 "bis 1000 oder um ein grosses Molekül, beispielsweise um ein Enzjm. oder Hämin mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis etwa 250 000 und vorzugsweise von etwa 10 000 bis 150 000 handeln kann.

Je nach der Art des Liganden und des Markers, kann die Eigenschaft der markierten Verbindung stark variieren. Zunächst wird auf das Quencher-Hapten-Reagens näher einge-' gangen. Da beide Moleküle klein sind ergibt sich im allgemeinen ein 1 : 1-Verhältnis mit einer relativ kurzen verknüpfenden Gruppe zwischen Quencher und Haptenteil.

Bei Beteiligung eines Antigens können ein oder mehrere Quencher an das Antigen gebunden sein. Im allgemeinen liegt mindestens etwa 1 Quenchermolekül pro 100 000 Molekulargewichtseinheiten, vorzugsweise mindestens etwa 1 Quenchermolekül pro 50 000 Molekulargewichtseinheiten sowie im allgemeinen nicht mehr als etwa 1 Quenchermolekül pro 1000 Molekulargewichtseinheiten und vorzugsweise höchstens etwa 1 Quenchermolekül pro 2000 Molekulargewi chtseinheiten vor. Bei Antigenen mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 3OO 000 beträgt die Anzahl der Quenchermoleküle etwa 2 bis

30, vorzugsweise etwa 2 bis 20 und insbesondere etwa 2 bis

16. Handelt es sich bei dem gebundenen Bestandteil der Chemulumineszenzquelle um ein kleines Molekül, d.h. mit einem Molekulargewicht von etwa 125 "bis 1000, so liegt im allgemeinen ein 1:1-Verhältnis von Chemilumineszenzbestandtexlen

zu Hapten im Reagens aus Chemilumineszenzbestandteil und Hapten vor. Bei Antigenen beträgt die Anzahl von kleinen chemilumineszierenden Bestandteilen im allgemeinen mindestens 1, vorzugsweise mindestens 1 pro 100 000 Molekular-

eewichtseinheiten und insbesondere mindestens 1 pro 50 000 35

Molekulargewichtseinheiten sowie im allgemeinen höchstens

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Γ "1

1 pro 1000 Molekulargewichtseinheiten und insbesondere höchstens 1 pro 2000 Molekulargewichtseinheiten.

Bei Vorliegen von Antigenen und grossen (über 10 000) Bestandteilen der Chemilumineszenzquelle können die Verhältnisse stark variieren, wobei entweder eine Mehrzahl von Chemilumineszenzbestandteilen an den autigenen Liganden oder eine Mehrzahl von Liganden an den Chemilumineszenzbestandteil gebunden sein können. Im allgemeinen beträgt das Verhältnis von Antigen zum Chemilumineszenzbestandteil etwa 0,05 bis 20 und vorzugsweise etwa 0,01 bis 10, wobei die Chemilumineszenzquelle und das Antigen Molekulargewichte im Bereich von etwa 10 000 bis 300 000 aufweisen.

Die Art der verknüpfenden Gruppe hängt stark von den speziellen, zu verbundenen Materialien ab. Im allgemeinen x^eisen die verknüpfenden Gruppen bis zu etwa 20 Atomen in der Kette auf, wobei es sich um Kohlenstoff-,

Sauerstoff-, Stickstoff- und/oder Schwefelatome handelt, wobei Kohlenstoff-, Sauerstoff- und Stickstoffatome bevorzugt sind und die Stickstoffatome nur durch Kohlenstoffatome substituiert sind oder neutral sind, sofern sie durch Kohlenstoff- und Wasserstoffatome substituiert sind, beispielsweise Amidogruppen. In der US-PS 3 817 837 sind eine grosse Anzahl von entsprechenden verknüpfenden Gruppen aufgeführt.

Bei Vorliegen eines Poly-(ligandenanalogen)-Markers kann

ein hub-Kern verwendet werden, bei dem es sich normaleren

weise um ein wasserlösliches Polymerisat und insbesondere um eine Poly-(aminosäure) oder ein Polysaccharid handelt. Im allgemeinen beträgt das Molekulargewicht des hub-Kerns etwa 25 000 bis 600 000 und insbesondere etwa 30 000 bis 300 000. Das Molekulargewicht von Enzymen, die an das

nc .

Ligandenanaloge gebunden werden können, beträgt etwa

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Γ "I

15 000 bis 300 000. Die vorstehend erläuterten verknüpfenden Gruppen können auch zur Verknüpfung von Marker und Ligandenanalogem an den hub-Kern oder das Enzym verwendet werden.

Beispiele für funktionelle Gruppen in den verknüpfenden Resten sind Alkylamin-, Amid-, Amidin-, Thioamid-, Harnstoff-, Thioharnstoff- und Guanidingruppen. Spezielle Beispiele sind Carbonsäuren in Verbindung mit Diimiden, gemischte Anhydride mit Carbonatmonoestern, Aldehyde in Verbindung mit Reduktionsmitteln, wie Borhydride, Imidoester, aktive Carbonsäureester, wie M-Hydr-oxysuccinimid- oder p-Witrophenylester, Isocyanate, Isothiocyanate und

aktive Halogenide.
15

Markierter Rezeptor

Der Rezeptor kann entweder mit dem Quencher oder dem Chemilumineszenzbestandteil markiert sein. Handelt es sich bei dem Marker um ein kleines Molekül mit einem Molekulargewicht von etwa 125 bis 1000, so liegt im allgemeinen mindestens 1 Marker pro Rezeptor und höchstens etvra. 1 Marker pro 1500 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors, Vorzugspreise höchstens etwa 1 Marker pro 2500 Molekulargewichtseinheiten und insbesondere höchstens etwa 1 Marker pro 5000 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors vor. Handelt es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper (IgG) beträgt die Anzahl der Marker im allgemeinen etwa 2 bis 20 und vorzugsweise etwa 2 bis 12. Handelt es sich bei dem Marker um ein Makromolekül mit einem Molekular— gewicht von etwa 10 000 bis 300 000, so liegen im allgemeinen 1 bis 10 Marker und vorzugsweise etwa 1 bis 6 Marker vor.

Die Art der Konjugation an den Rezeptor ist vorstehend ³^ erläutert.

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Γ

Testpackungen

Um beim erfindungsgemässen Test reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, ist es wünschenswert, die kritischen Reagentien in vorbestimmten Verhältnissen zur Verfügung zu stellen, so dass die Testempfindlichkeit ihr Optimum erreicht. Bei der Bestimmung von Liganden gehören zu den kritischen Reagentien: Markierter Ligand unter Einschluss von Poly-(ligandenanalogem)-Marker und markierter Rezeptor. Bei der Rezeptorbestimmung kann auch der Ligand ein kritisches Reagens sein. Abgesehen von der bevorzugten Massnahme, die kritischen Reagentien in vorbestimmten Verhältnissen zur Verfügung zu stellen, ist es häufig auch wünschenswert, dass Hilfssubstanzen, wie Puffer und Stabilisatoren, den kritischen Reagentien beigefügt werden, so dass trockene Pulver oder Konzentrate entstehen, die direkt unter Bildung von Testlösungen verdünnt werden können, so dass es nicht notwendig ist, die verschiedenen Materialien abzuwiegen.

In den Testpackungen werden die Reagentien in relativen Anteilen zur Verfugung gestellt, so dass die Testempfindlichkeit auf den in Frage kommenden Konzentrationsbereich optimal eingestellt werden kann. Einem oder beiden Reagentien können Puffer, inerte Proteine, wie Albumine, Stabilisatoren, wie Natriumazid, und ähnliche Verbindungen einverleibt werden. Vorzugsweise werden die Reagentien als trockene Pulver, insbesondere im Fall von markierten polyepitopen Liganden und Rezeptoren,zur Verfügung gestellt. Die Herstellung von Pulvern aus diesen Materialien kann durch Lyophilisation erfolgen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich sämtliche Prozent- oder Teilangaben auf das Gewicht. Ausgenommen davon sind Flüssigkeitsgemische, bei denen sich die Angaben auf das Volumen beziehen.

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"" Beispiel 1

Konjugation von Meerrettichperoxidase an Human-· jT-Globulin* (MKG) ^j

Es wird das von Hakane und Kawaoi in J. Hist. Cyto., Bd. (1974), S. 1084 bis 1091 angegebene Verfahren angewendet. Zu 1 ml 0,3 m Natriumhydrogencarbonatpuffer vom pH-Vert 8,1 werden 6 mg Meerrettichperoxidase (HRP) und 100^1 einer 1-prozentigen wässrigen Lösung von 2,4-Dinitro-1-fluor-

benzol gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde inkubiert. An-10

schliessend wird das Gemisch gegen 0,01 m Hatriumcarbonatpuffer vom pH-Wert 9,5 2 Stunden dialysiert, worauf sich eine Dialyse gegen 0,3 m Natriumhydrogencarbonatpuffer vom pH-Wert 8,1 anschliesst.

Etwa 1,5 ml der vorstehend hergestellten HEP-Lösung werden zu 1 ml 0,4- m Natriumperjodatlösung gegeben. Das Gemisch wird 4-5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Diese Lösung wird sodann mit 25 μΐ 0,32 m wässrigem Äthylenglykol versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde stehengelassen und anschliessend 2 Stunden in einem Kollodiumsack gegen 0,01 m Natriumcarbonatlösung vom pH-Wert 9,5 dialysiert. Der im Dialysesack verbliebene Rückstand wird mit 5 mg hlgG vereinigt. Das Gemisch wird 1 Stunde stehengelassen. Sodann werden 15 mg Natriumborhydrid zugegeben. Das Gemisch wird 1,25 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann über Nacht in einem Kollodiumsack gegen PBS vom pH-Wert 7 dialysiert. Der Rückstand im Dialysesack wird sodann an Sephadex G-200 unter Verwendung von 0,01 m PBS vom pH-Wert 7 chromatographiert. Die Fraktionen werden aufgefangen. In der Fraktion 7 werden spektrophotometrisch 2,5 χ 10~⁷ m hlgG und 4,95 χ ΙΟ"? m HRP festgestellt.

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r ■ ~ι

¹ Beispiel 2

Konjugation von Fluorescein an anti-(hlgG)

In ein mit einem Rührstab ausgerüstetes Fläschchen werden 5 mg lyophilisiertes Kaninchen-anti-(hlgG) (Miles Laboratories, Lot 18, Code 64-155) gegeben. Bas Gemisch, wird in 0,5 ml wässrigem Matriumphosphat vom pH-¥ert 8,0 gelöst und der pH-Wert wird mit wässriger Natriumcarbonatlösung auf 9 eingestellt. Eine Lösung von 0,3 mg Fluoresceinisothiocyanat in 0,3 ml Dimethylformamid wird unter heftigem Rühren innerhalb von etwa 40 Sekunden zugesetzt. Das Gemisch, wird weitere 60 Minuten gerührt. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch an einer mit Sephadex G-25 gepackten Säule Chromatographiert und fraktioniert. Man erhält eine Fraktion mit einem Gehalt an 2,4 mg/ml anti-(hlgG) mit einem Verhältnis von Fluorescein : anti-hlgG von etwa 5 ^: 1 ·

Anschliessend wird der folgende erfindungsgemässe Test bei Raumtemperatur durchgeführt. Hierzu werden die folgenden Lösungen verwendet: 1,86 mg/ml hlgG in Wasser, 0,023 mg/ml Fluorescein-anti-(hIgG)-Konjugat (gemäss obigen Ausführungen hergestellt) und 2,5 χ 10 m HRP-hlgG-Konjugat. Zusätzlich werden jeweils 100 ^uI wässrige Lösungen von 10~^ m Luminol und 1O^--⁵ m Wasserstoffperoxid zugesetzt. In der nachstehenden Tabelle sind die Mengen der einzelnen

zugesetzten Materialien sowie die Ergebnisse als gezählte Ereignisse pro 0,1 Minute in verschiedenen Abständen vom Mischzeitpunkt zusammengestellt.

Tabelle . , _. _ —^:—■■ innerhalb von 6 see. ge-

hlgG Fluorescein- HRP-hlgG, zählte Ereignisse (in ^uI anti-(hlgG), ^l ^uI tausend) zum angegebenen

Zeitpunkt (min) ab ' Mischung

0 0 25

35 1 5 25

2,5 5 25

5 5 25

10 5 25

^L 909842/0782

5 ,	15	60
23,3	38,3	56,8
27,2	41,1	60,8
34,9	50,3	71,3
36,8	44,7	81,7
49,8	66,0	78,9

Zur.Zählung wird ein ß-Mate Scintillation Counter (Nicht-Koinzidenz-Ausführungsform) verwendet.

Aus den vorstehenden Ergebnissen ergibt sich, dass eine Eichkurve zur Bestimmung der Analytenmenge in einem Testmedium aufgestellt werden kann. Dieses Verfahren ist sehr einfach, da die Reagentien rasch vereinigt und die Ablesung innerhalb sehr kurzer Zeit vorgenommen werden kann. Ferner stabilisieren sich die Ablesungen nach etwa 1/2 Stunde, so dass der Ablesezeitpunkt weniger kritisch wird.

Der vorstehend beschriebene Test erlaubt es, eine grosse Anzahl von Analyten auf zweckmässige Weise quantitativ zu bestimmen. Ferner ermöglicht es dieses Verfahren ein

Signal durch Verwendung eines katalytisehen Systems (enzymatisches oder nicht-enzymatisches System), das für jedes im Medium vorhandenes Analytenmolekül eine Mehrzahl von Ereignissen liefert, zu verstärken. Ausserdem werden bei diesem Verfahren Probleme durch Lichtstreuung und Protein-

absorption und -emission, die zu einer Störung der Ergebnisse führen können, vermieden.

8Ο98Λ2/0782

Claims (32)

VOSSIUS ■ VOSSIUS - Hll.TL . TAUCHNER ■ HEUNEMANN SIEBERTSTRASSE Λ · 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (OSS) 4-T4-O75 CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN -TELEX 5-29 45 3 VOP AT D u.Z.: P 034- Case: 5652-113 E SYTA,COMPANY Palo Alto, California, V. St. A. 10 15 20 "Chemisch induzierter Fluoreszenz-Immuntest und Testreagens zu dessen Durchführung" Priorität: 5. April 1978, V. St. A., Nr. 893 910 P atentansprüche Verfahren zur Bestimmung eines Analyten (zu bestimmender Bestandteil) in einer Testlösung (zu untersuchende Lö sung), dadurch■gekennz e ichne t, da s s 25 - der Analyt Bestandteil eines aus Ligand und Antiligand bestehenden immunologischen Paars ist, - der Ligänd mindestens ein epitopes Zentrum aufweist, - der Antiligand spezifisch am epitopen Zentrum des Liganden gebunden werden kann, - ein lichtemittierendes reziprokes Paar als Marker ver-■'wendet wird', - das lichtemittierende reziproke Paar aus einer mindestens einen Bestandteil aufweisenden Chemilumineszenzquelle und einem Quencher, der das von der Chemilumineszenzquelle emittierte Licht kollisionsfrei auslöschen $09842/0782 OWQlNAL INSPECTED (quenclien) kann, besteht, - die Marker unter Bildung eines Kon^'ugats mit Chemilumineszenzmarkierung und eines Konjügats mit Quenchermarkierung an Bestandteile des immunologischen Paars gebunden (konjugiert) werden und - in der Testlösung die Menge des Quenchers, der in einem quenchenden Abstand zur Chemilumineszenzquelle gebracht ist, in Beziehung zur Analytenmenge in der Lösung steht, wobei man zur Durchführung des Verfahrens A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt:

1. die Probe,

2. das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung,

3. das Konjugat mit Quenchermarkierung und

4. beliebige zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle,

mit der Massgabe dass,

a. wenn es sich beim Analyten um einen monoepitopen Liganden handelt und keiner der Marker an den Liganden gebunden ist, in der Testlösung ein PoIy-(ligandenanaloges) vorhanden ist,

b. wenn es sich beim Analyten um einen mehrwertigen

Antiliganden für den monoepitopen Liganden handelt, ein Poly-(ligandenanaloges)-Marker oder ein PoIy-(ligandenanaloges) oder eine Kombination aus Ligand

mit Quenchermarkierung und Ligand mit Chemiltimines-

zenzmarkierung in der Testlösung vorhanden ist und,

wenn es sich bei dem Analyten um einen einwertigen Antiliganden handelt, ein Poly-(ligandenanaloges)-Marker in der Testlösung vorhanden ist,

c. wenn es sich bei dem Analyten um einen Antiliganden

für den polyepitopen Liganden handelt und keiner

L 909842/0782 _j

1 der Marker ligandengebunden ist, ein Ligand in der

Testlösung vorhanden ist und,

d. wenn es sich bei dem Analyten um einen polyepi-5 topen Liganden handelt und sowohl der Quenchermarker

als auch der Ghemilümineszenzmarker ligandengebunden sind, ein Antiligand in der Testlösung vorhanden ist,

10 wobei das Ligandenanaloge mindestens ein epitopes Zentrum mit dem Liganden gemeinsam hat und mit dem Liganden um den Antiliganden konkurrxeren kann, und

B. die von der Testlösung emittierte.Lichtmenge bei min-15 destens einer Wellenlänge misst und mit der von einer Testlösung mit bekannter Analytenmenge emittierten Lichtmenge vergleicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 20 die Testlösung einen pH-Wert von etwa 5 bis 11 und eine Temperatur von etwa 10 bis 50⁰C aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen haptenischen Liganden

25 mit einem Molekulargewicht von etwa 125 "bis 2000 handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um ein Antigen mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa 2000 handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten .um einen Antiliganden handelt.

6. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Test-35 lösung, dadurch gekennzeichnet, dass

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- der Analyt Bestandteil eines aus einem monoepitopen Liganden mit einem Molekulargewicht von etwa 125 "bis 2000 und einem Antiliganden "bestehenden immunologischen Paars ist,

- der Antiligand an das epitope Zentrum des Liganden gebunden werden kann,

- ein lichtemittierendes reziprokes Paar als Marker verwendet wird,

- das lichtemittierende reziproke Paar aus einer mindestens einen Bestandteil aufweisenden Chemilumineszenzquelle und einem Quencherfarbstoff, der das von der Chemilumineszenzquelle emittierte Licht kollisionsfrei quenchen kann, besteht,

- die Marker unter Bildung eines Konjugats mit Chemilumi-

neszenzmarkierung und eines Konjugats mit Quenchermarkierung an Bestandteile des immunologischen Paars gebunden sind, wobei mindestens einer der Marker nicht an einen Liganden gebunden ist, und

- in der Testlösung die Menge des Quenchers, der in quenchenden Abstand zur Chemilumineszenzquelle gebracht ist, in Beziehung zur Analytenmenge in der Lösung steht,

wobei man zur Durchführung des Verfahrens A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium vom pH-Bereich 5 his 11 und einer Temperatur von 10 bis 50⁰C folgende Bestandteile vereinigt:

1. die Probe,

2. das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkxerung, 3- das Konjugat mit Quenchermarkierung und 4. beliebige zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle ,

mit der Massgabe, dass, wenn es sich beim Analyten um einen Antiliganden für den monoepitopen Liganden handelt und keiner der Marker ligandengebanden ist, ein Poly-(ligandenanaloges) in der Testlösung vorhanden ist, wobei das Ligandenanaloge des Poly-(ligandenanalogen) ein epitopes Zentrum mit dem Liganden gemeinsam hat und

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in der lage ist mit dem Liganden um den Antiliganden zu konkurrieren, und

B. die von der Testlösung emittierte Lichtmenge bei mindestens einer Wellenlänge misst und mit der von einer Testlösung mit bekannter Analytenmenge emittierten Lichtmenge vergleicht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen Antiliganden handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen monoepitopen Liganden handelt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Chemilumineszenzquelle mindestens zwei Bestandteile aufweist und einer der Marker an den Liganden und der andere an den Antiliganden gebunden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9i dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Alkaloid handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Steroid handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Lactam mit 5 oder 6 Ringgliedern handelt.

13- Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Aminoalkylbenzol mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen im Alkylrest handelt.

14-, Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um einen Benzheterozyklus handelt

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15. Verfahren nach Anspruch 9₅ dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Purin handelt.

16. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um eine Aminosäure handelt.

17- Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Aminosäure um Polyjodthyronin handelt.

18. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei einem der Bestandteile der Chemilumineszenzquelle um ein Enzym und bei dem Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung um einen an dieses Enzym gebundenen Liganden handelt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Enzym um eine Peroxidase und beim anderen Bestandteil der Chemilumineszenzquelle um Luminol handelt.

20. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Testlösung, dadurch gekennzeichnet, dass

- der Analyt Bestandteil eines aus einem polyepitopen Liganden mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa

Paars ist, 2000 und einem Antiligand bestehenden immunologischen/ - der Antiligand an die epitopen Zentren des Liganden gebunden werden kann,

- ein lichtemittierendes reziprokes Paar als Marker verwendet wird,

- das lichtemittierende reziproke Paar aus einer mindestens einen Bestandteil aufweisenden Ghemilumineszenzquelle und einem Quencherfarbstoff, der das von der Chemilumineszenzquelle emittierte Licht kollisions— frei quenchen kann, besteht,

- die Marker unter Bildung eines Konjugats mit Chemilumineszenzmarkierung und eines Konjugats mit Quenchermarkierung an Bestandteile des immunologischen Paars

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^Γ -7- 291354s"¹

gebunden werden, wobei mindestens einer der Marker

an einen Nichtliganden gebunden ist, - in der Testlösung die Menge des Quenchers, der in quenchendem Abstand zur Chemiluminesζenzquelle gebracht ist, in Beziehung zur Analytenmenge in der Lösung steht, wobei man zur Durchführung des Verfahrens

A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium vom pH-Bereich 5 bis 11 und einer Temperatur von 10 bis 50⁰C folgende Bestandteile vereinigt:

1. die Probe,

2. das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung, J. das Konjugat mit Quenchermarkierung und 4. beliebige weitere Bestandteile der Chemilumineszenzquelle

mit der Massgabe, dass, wenn es sich bei dem Analyten um einen Antiliganden handelt und keiner der Marker ligandengebunden ist, der Ligand in der Testlösung vorhanden ist, und

B. die von der Testlösung emittierte Lichtmenge bei mindestens einer Wellenlänge misst und mit der von einer Testlösung mit bekannter Analytenmenge emittierten Lichtmenge vergleicht.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen Antiliganden handelt.

22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen polyepitopen Liganden handelt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Chemilumineszenzquelle mindestens zwei Bestandteile aufweist und einer der Marker an einen Liganden und der andere an einen Antiliganden gebunden ist.

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24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Polypeptid handelt.

25. Verfahren nach Anspruch 24-, dadurch gekennzeichnet, dass es sich "bei dem Polypeptid um ein Globulin handelt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Globulin um ein Immunoglobulin handelt.

27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Polypeptid um ein Hormon handelt.

28. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bestandteil der Ghemilumineszenzquelle, der an einen Bestandteil des immunologischen Paars gebunden ist, um ein Enzym handelt.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Enzym um eine Peroxidase und bei einem anderen Bestandteil der Chemilumineszenzquelle um Luminol handelt.

30. Verfahren zur Bestimmung von Humanglobulin in einer Testlösung, dadurch gekennzeichnet, dass - anti-Humanglobulin als Reagens und ein lichtemittierendes reziprokes Paar als Marker verwendet werden,

- das lichtemittierende reziproke Paar aus einer Chemilumineszenzquelle, die eine Peroxidase und Luminol enthält, und einem Quencherfarbstoff, der das von der . Chemilumineszenzquelle emittierte Licht quenchen kann, besteht,

- die Peroxidase an das Humanglobulin unter Bildung eines Humanglobulin-Peroxidase-Konjugats und der Quencherfarbstoff an das anti-Humanglobulin unter Bildung eines Quencher-anti-Humanglobulin-Kon^jugats gebunden werden und

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" - in der Testlösung die Menge des Quenchers, der in einen quenchenden Abstand zur Chemilumineszenzquelle gebracht ist, in Beziehung zur Menge an Humanglobulin steht, wobei man zur Durchführung des Verfahrdns

A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium vom pH-Bereich etwa 7 bis ΊΟ und einer Temperatur von etwa 10 bis 50⁰C folgende Bestandteile vereinigt:

1. die Probe,

2. das Peroxidase-Humanglobulin-Konjugat,

3. das Quencher-anti-Humanglobulin-Konjugat und

4-, beliebige zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle, und

B. die von der Testlösung emittierte Lichtmenge bei mindestens einer Wellenlänge misst und mit der von einer Testlösung mit bekannter Menge an Humanglobulin emittier ten Lichtmenge vergleicht.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Quencherfarbstoff um Fluorescein handelt.

32. Testpackung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung und das Konjugat mit Quenchermarkierung in Mengenverhältnissen, die eine optimale Durchführung, des Verfahrens ermöglichen.

33- Testpackung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei einem Bestandteil der Chemilumineszenzquelle um ein Enzym handelt.

34·. Testpackung nach Anspruch 33» dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym an den Liganden gebunden ist.

35- Testpackung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bestandteil der Chemilumineszenzquelle und der Quencherfarbstoff beide an den Antiliganden gebunden sind.

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36- Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Testlösung, bei dem

- der Analyt Bestandteil eines aus einem monoepitopen Liganden mit einem Molekulargewicht von etwa 125 bis 20Θ0 und einem Antiliganden bestehenden immunologischen Paars ist,

- der Antiligand an das epitope Zentrum des Liganden gebunden werden kann,

- ein Marker, der ein Bestandteil einer mindestens einen Bestandteil aufweisenden Ghemilumineszenzquelle ist, verwendet wird und

- der Marker an den Liganden unter Bildung eines Konjugats mit Chemilumineszenzmarkierung gebunden wird,

dadurch gekennzeichnet, dass man

A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium vom pH-Bereich 5 bis 11 und einer Temperatur von 10 bis 50⁰C folgende Bestandteile vereinigt:

1. die Probe,

2. das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung und

3. beliebige zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle,

mit der Massgabe, dass, wenn es sich bei dem Analyten um einen Liganden handelt, Antiligand zugesetzt wird, und

B. die von der Testlösung emittierte Lichtmenge bei mindestens einer Wellenlänge misst und mit der von einer Testlösung mit bekannter Analytenmenge emittierten Lichtmenge vergleicht.

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