DE2114300C3

DE2114300C3 - Octadekapeptide und Arzneipräparate

Info

Publication number: DE2114300C3
Application number: DE2114300A
Authority: DE
Inventors: Ken Kobe Hyogo Inouye; Hideo Mino Osaka Otsuka
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1970-03-24
Filing date: 1971-03-24
Publication date: 1974-03-14
Also published as: US3759891A; DE2114300B2; NO137152C; DE2114300A1; ZA711856B; NO137152B; AT310958B; CH593918A5; SE361661B; NL7103983A; CA945144A; BE764783A; FR2085734B1; GB1298318A; FR2085734A1

Description

in der X ein L-Methionin-, L-Norvalin-, L-Norleucin-, L - Leucin- oder a - Aminobuttersäurerest, Y ein L- Glutaminsäure- oder l - Glutaminrest und Z ein L- Arginin-, l - Argininester- oder L - Argininamidrest ist, ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.

2. Octadekapeptide nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel

/i-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-

L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-

L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-i.-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-Z

in der Z ein L-Arginin-, L-Argininester- oder L-Argininamidrest ist, ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe. , ο 3. Octadekapeptide nach Anspruch 1 der Formel

,-f-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-

L-glutamyl-L-histidyl-i.-phenylalanyl-

L-arginyl-i-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-

L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-

L-arginyl-L-argininamid

seine pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.

4. Arzneipräparat, enthaltend ein Octadekapcp tid nach Anspruch 1 bis 3 als Arzneistoff urv. übliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel und Hilfs stoffe.

Die Erfindung betrifft neue Octadekapeptide mit einem j-i-Alaninrest als aminoendständige Aminosäure und einem i.-Ornithinrest in der 15-Stellung an Stelle des Serinrestes bzw. des Lysinrestes im nativen Corticotropin, deren Derivate, pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze und Komplexe. Die Octadekapeptide sind somit [1-,,'-Alanin. 15-ornithin] - octadekapeptide, die abgekürzt auch als [,■»-Ala¹. Orn^1:>]-octadekapepüde bezeichnet werden. Die Octadekapeptide der Erfindung sind wertvolle Arzneistoffe, da sie eine ausgeprägte Corticotropinaktivität, z. B. eine stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde, sowie eine lipolytische und melanocytenstimulierende Wirkung aufweisen. Diese Wirkungen sind von besonders langer Dauer.

In der Zeitschrift J. Biochem. (Tokyo). Bd. 58 (1965), S. 512, ist die Herstellung der Octadekapeptide ACTH(I-IS)-OHuHdACTH(I-IS)-NH₂, die den ersten 18 Aminosäureresten des Corticotropins (ACTH) entsprechen, beschrieben. Ferner ist in Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 43 (1970), S. 196. die Herstellung des 1 - Glycinanalogen, d. h. GIy¹ - ACTH(I-IS) - NH₂ beschrieben. Biologische Untersuchungen an Corticotropinpeptiden haben ergeben, daß die aminoendständigen 18 Reste die Mindester^rordernisse für eine hohe stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde •rfüllen. ACTH(I-18)-NH₂ und GIy¹-ACTH(I-18)-HH₂ sind jedoch wesentlich weniger aktiv als das •itive Hormon, insbesondere wenn sie zur Prüfung •Hbcutan oder intravenös verabfolgt werden. Schließ- ich ist in Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 43 (1970), $. 1163, ein ausgezeichnet wirkendes Corticotropin-

tiptid beschrieben, nämlich /J-AIa¹-ACTH! 1-1 S)-NH₂. lieses Pi:ptid besitzt eine wesentlich verbesserte ktivität. da es siegen die intrazelluläre Aminopepti- »illase sehr beständig ist. Die aminoendständige Substitution durch ,(-Alanin verbessert die Stabilität des f*cptids im Gewebe, jedoch nicht im Blut. Die Wirkung des 1-^-Alaninanaloaen im Blut ist tatsächlich vor. serinsierer Dauer als die des nativen Corticotropin-, Dies 1st ein Anzeichen dafür, daß es unter der Einwirkung von Endopeptidase in Blut rascher desaktiviert wird als natives Corticotropin, wenn es intravenös verabfolgt wird.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein kur/.-kettiges Peptid zu entwickeln, das der Wirkung de.-, nativen Corticotropins nahekommt und das sich in einfacher Weise herstellen läßt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung sind somit Octadekapeptide der allgemeinen Formel

,i-Alanyl-i -tyrosyl-i -seryl-X-Y-i.-histidyli.-phenylalanyl-i.-arginyl-i.-tryptophyl-glycyli.-iysyl-i.-prolyl-i.-valyl-glycyl-i.-orniihyli.-lysyl-i.-arginyl-Z

in der X ein 1 -Methionin-, i.-Norvalin-, i.-Norleucin-. L-Leucin- oder ri-Aminobuttersäurerest, Y ein 1 -Glutaminsäure- oder i.-Glutaminrest und Z ein i.-Arginin-, L-Argininester- oder L-Argininamidrest ist, ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.

Die erfindungsgemäßen Octadekapeptide haben eine verbesserte Wirkungsdauer, und sie besitzen die gleiche stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde wie natürliches Corticotropin. Es wurde festgestellt, daß die verbesserten Eigenschaften dieser Octadekapeptide auf ihrer geringeren Empfindlichkeit gegenüber der Endopeptidase im Blut und der Aminopeptidase in den Geweben beruht.

Die Octudekapeptide der Erfindung können durch Kondensation der Aminosäuren oder durch Kondensation kleinerer Peptide in üblicher Weise hergestellt werden. Insbesondere können die Octadekapeptide der Erfindung hergestellt werden

a; durch Umsetzung eines Aminosäureester^ oder Peptidesters mit einer freien Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure .oder einem anderen Peptidester mit geschlitzter Aminogruppe bzw. geschützten Aminogruppen in Gegenwart eines kondensationsmittels oder

b) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Aminogruppe und geschützter oder ungeschützter Carboxylgruppe" mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe oder

ei durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Carboxylgruppe und geschütz-Γ-.Τ Aminogruppe mit anderen Aminosäuren oder i-inem Peptid mit aktivierter Aminogruppe und geschützter Carboxylgruppe und anschließender Abspaltung der Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Peptid durch Hydrogenolyse. Acidolyse, alkalische Verseifung, Hydrazinolyse oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak.

S ;ie Kondensation zur Ausbildung von Peptidbii-.uingen kann nach üblichen Methoden erfolgen. Be;-piele für diese Methoden sind die Azid-. Dicyclohevslcarbodiimic¹· oder Carbonyldiimidazolmethode. die gemischte Anhydridmethode, die aktivierte Ester-ηκ-ihüde. z. B. die p-NitrophenyleF'srmethode. N-Hydrowsuccinimidestermethod", Pentnchlorphenylestermeihode, Cyanmethylestermethode und p-Nitrophenyiihiolestermethode, die Isoxazolium-. N-Carboxyanhydrid-, Tetraäthylpyrophosphit- oder Äthylchlorphosphitmethode oder eine Kombination dieser Methoden. Die Octadekapeptide der Erfindung können auch nach der sogenannten Peptidsynthese in fester Phase hergestellt werden. Es können zwar sämtliche vorgenannten Methoden zur Ausbildung von Peptidbindungen Tür die Herstellung der Octadekapeptide der Erfindung angewendet werden, die besonders bevorzugten Methoden sind jedoch die aktivierte Estermethode, die Dicyclohexylcarbodiimidmethode, die Azidmethode und die gemischte Anhydridmethode.

Zur Herstellung der Octadekapeptide werden vorzugsweise freie funktionell Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, geschützt, insbesondere durch solche Gruppen, die sich leicht durch Hydrogenolyse, Acidolyse, alkalische Verseifung. Hydrazinolyse oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak abspalten lassen. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isobutanol oder tert.-Butanol, oder durch einen Arylalkylalkohol, wie Benzylalkohol. p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, oder durch Amidbildung geschützt. Diese Carboxyl- «chutzgruppen werden in üblicher Weise eingeführt.

Die Aminogruppe wird vorzugsweise z. B. durch eine lert. - Butyloxycarbonyl-, tert. - Amyloxycarbonyl-, ο - Nitrophenylsulfenyl-, 2 - (p - Diphenyl) - isopropyl-Oxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-. ρ - Nitrobcnzyl- ©xycarbonyl-, Tosyl-, Formyl- oder Tritylgruppe in üblicher Weise geschützt. Zum Schutz der Guanidylgruppe des Arginins wird vorzugsweise die Nitrogruppe, Tosylgruppe oder Adamantyloxycarbonylgruppe verwendet. Der Schutz der Guanidylgruppc ist icdoch nicht immer erforderlich. Die --Carboxylgruppe der Glutaminsäure wird vorzugsweise durch eine der vorgenannten Schutzgruppen für Carboxylgruppen geschützt. Die endständige Aminogruppe des Lysins oder Ornithins wird vorzugsweise durch eine der vorgenannten Schutzgruppen für Aminogruppen geschützt. Die Imidazolgruppe des Histidins kann durch eine Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Benzylgruppe geschützt werden. Ferner kann die Hydroxylgruppe des Serins oder Tyrosins z. B. durch

ίο eine Acetyl-, Benzyl- oder tert.-Butylgruppe geschützt werden. Ihr Schutz ist jedoch nicht immer erforderlich.

Außer den Aminosäureresten der amincendständi-

gen Aminosäure und denen in der Stellung 15 können noch andere Reste der Aminosäurensequenz des

i> Corticotropinpeptids durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die Corticotropinaktivität wesentlich zu verschlechtern. Beispielsweise kann die vierte Aminosäure Methionin durch Norvalin, Norleucin. Leucin oder a-Aminobuttersäure und bzw. oder die fünfte Aminosäure Glutaminsäure durch Glutamin ersetzt werden.

Die letzte Kupplungsreaktion zur Herstellung der Octadekapeptide der allgemeinen Formel I erfolgt z. B. durch Kondensation eines geschützten Dekapeptids der allgemeinen Formel

Ri-,-(-Alanyl-i.-tyrosyl-i.-seryi-X-v-R₂-L-glutamyli.-histidyl-i.-phenylalanyl-i.-arginyl-i.-tryptophylglycin

in der R, eine Aminoschutzgruppe ist, X der i.-Methionin, L-Norvalin-, L-Norleucin-, L-Leucin- oder n-Aminobuttersäurerest und R₂ eine Carboxylschutzgruppe ist, mit einem geschützten Octapeptid der allgemeinen

.15 Formel

N^£-R₃-L-Lysyl-i.-prolyl-i--valyi-glycyl-N^-R.j-i.-ornithyl-N'-Rä-i.-lysyl-i.-arginyl-Z

in der R₃. R₄. und R₅ jeweils eine Aminoschutzgruppe und Z einen 1 -Arginin-, 1.-Argininester- oder i.-Argininamidrest bedeutet, nach der aktivierten Estermethode, der Dicyclohexylcarbodiimidmethode. der Azidmethode. der gemischten Anhydridmethode oder einer Kombination dieser Methoden in einem inerten Lösungsmittel bei Temperaturen von —20 bis 60 C während etwa 2 Stunden bis 7 Tagen. Anschließend werden die Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Octadekapeptid der allgemeinen Formel

R^-i-Alanyl-i.-tyrosyl-i.-seryl-X-v^-i.-glutamyl-1 -histidyl-i -phenylalanyl-i.-arginyl-i -tryptophylglycyl-N'-Rj-i.-lysyl-i -prolyl-i -valyl-glycyl-N'^s-R₄-i -ornithyl-N^-R,-! -lysyl-i -arginyl-Z

in der R₁. X. R₂, R.,. R₄. R₅ und Z die obige Bedeutung haben, durch Hydrogenolyse, Acidolyse. alkalische Verseifung. Hydrazinolyse oder Reduktion mit Na-

ήο trium in flüssigem Ammoniak bei Temperaturen von etwa -20 bis 60 C während 30 Minuten bis 24 Stunden. Als inerte Lösungsmittel werden vorzugsweise Dimethylformamid. Dimethylsulfoxid, üioxan. Hexamethylphosphortriamid und deren Gemische mit

f>5 Wasser verwendet.

Die bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Octadekapeptide der allgemeinen Formel I sind in den Tabellen 1 bis IV zusammengestellt.

X O

Oi

X O

H	BzI	Χ	X O	j- O I	J-
SO L-	Ο	O	ν_/ Cj	δ	C
<		δ	Ll?		k
O Ou		Trp-	U	C L-	Ü
■Τ*
J- I	L-			α. L-
X			U_- <*	H
H—	->χ: —
	α.		ν:	SO L-
Cu	ν.	BzI	χ
Z		O	— _	χ:
O	X		IO	O-
Ξ J»	3		I
ο—α	-α		X
ι U	ό
O	ο
CQ	CQ

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Arg	a	Arg	Hj b-
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as ^ as ^ an ^:

ο—α ο—ο

O	Z	ζ	O	Z	■Si
j		L	Z	]
	ζ	_>»			ζ-
<		i-Ala		•i-Ala	fi-Ala

				O	O
CD				03	S3

Ζ/1

O O

6 ο

03

Ur

03

■109 611/405

10

X U O

X Z

-Ij

CQ -J

aa-

ce — _i

	—'	¹TS CC	ζ'	<	G	OBzI	<	ΟΒ/Ι	<	<
	nun:		CJ Σ	Phe	i		Phe		Phe	Phe
	Mel		Ser ·		j—		r.		*•τ.*
	C/j						—►Ξ		χ	ir
	U.		Γ .'	—			■ GIu ■			• GIu ·
			-AIa ·^;	CQ ^ Ο—O		Met		Met	Σ
π	-Ala ■'	d ζ	6	Met		Ser		Ser·	U «; *tr.*
Z rl	-G > i		Ser	U-	L	ι
Z					E-
		η"	<	<
		<	O Xi U	i
		I

12

In den Tabellen werden folgende Abkürzungen verwendet:

//-AIa = ,i'-Alaninrcst,
Tyr = ι -Tyrosinrest,
Scr = ι -Scrinrcst.
Met = ι -Methioninrest,

— GIu = Glutaminsäurerest,

X His = i -Histidinrest,

Q Phc = ι-Phenylalaninrc· ι.

¹⁰ Arg = ι-Argininrest,

X Trp = ι -Tryptophanrest,

^- GIy = Glycinrest.

X Lys = ι -Lysinrest.

O Pro = ι-Prolinrcst,

II . '⁵ VaI = i-Valinrest.

QÄ Orn = ι-Ornithinresl.

^, Cbo = Benzyloxycarbonyl.

BOC = lcrt.-Butyloxycarbonyl,

ei' BzI = Benzyl.

"5 ²⁰ OBu¹ = tert.-Butoxy.

=ij DCC = Dieyclohexylearbodiimid.

< HOSii = N-Hydroxysuccinimid und

^ '.y. >

^m -¹ l_h l_rj 25 Wie aus den Tabellen hervorgeht, bestellt das be-

ί=ί = J? < vorzugle Verfahren in der Kupplung des Tripeptids.

iü ---O ι ; das die ersten drei Aminosäuren enthält, nämlich

^- ^ ,(-Aliinyl-i -tyrosyl-1 -serin oder das Tctrapeptul

7j -^j .*" .*" , ί - Λ1 a η yl -1 -tyrosyl-ι -seryl-i -methionin mit dem

C Ü. Ϊ. w Heptiipeptid bzw. Hexapeptid entsprechend der Stel-

T^ ca---J *-> lung 4 bis 10 bzw. 5 bis 10. vorzugsweise nach der

■"* '^ c c Azidmethode. Hierauf wird das erhaltene Dekapcptid

ο CQ-C O mit dem Peptid entsprechend dem Rest des Moleküls

c- ■ ; (Stellungen 11 bis 181 vorzugsweise nach der aktivierten

^ s γΞ' ^' 35 Listermethode kondensiert.

co— Jj' ^ · Das vorgenannte Verfahren ist zwar das bevorzugte

-r- ~p Ji Verfahren zur Herstellung der Octadekapeptide der

^ "* Frfindung. doch ist es möglich, die Schutzgruppen.

__t c c die Kupphingsmethoden oder die Abspaltung der

c- — 40 Schutz-gruppen auch nach äquivalenten Methoden

-, ^ \r f durchzuführen und die Wahl der Ausgangspeptide

ί £ -Jj' Jj' und der Reihenfolge der Kupplungsreaktionen ent-

^ ; ^ sprechend zu ändern.

rz' 7=' ~' Die Schutzgruppen können durch Hydrogenolyse.

^, ^ ^ 45 alkalische Verseifung. Hydrazinolyse. Reduktion mit

Ό £- £" , E" Natrium in flüssigem Ammoniak oder durch Bc-

~\ ^T~ ~ έ ^" handlung mit einer Säure, wie Trifluoressigsäure,

yj p/j Ameisensäure, einem Halogenwasserstoff, wie Fluor-

< < Wasserstoff. Bromwasserstoff, Chlorwasserstoff, einei

„ uj° Halogenwasserstoffsäure, wie Flußsäure, Bromwasser-

ja = q_ ' α. öl £ stoffsäure oder Salzsäure, oder deren Gemischen ir

C C · ■ ■ ■ üblicher Weise und je nach der Art der Gruppe abge-

■_■£.■£.£·%. spalten werden.

S _ ^a' _ "t* _ ^u T Die verfahrensgemäß hergestellten [/i-Ala¹, Orn¹⁵]

ι ca Ξ ω -Ξ aa ^ ^55 octadekapeptide der Erfindung können nach üblichei

;£ -¹- O — O C—O O—O O Methoden gereinigt werden, z. B. durch Säulenchro

Z H > 1. _r J- 1 matographie mit Ionenaustauscherharzen, Ionenaus

φ ' 2 S ? S tauscher-Cellulose oder -Sephadex oder durch Gegen

ι Ο* ^ · · - · stromverteilung.

Jj Z J> u S J> β* Je nach den verwendeten Reaktionsbedingungei

X ■" ■ ■ - erhält mar die Octadekapeptide der Erfindung ii

Ϊ. > >,>.>,>,?, Form der freien Basen oder ihrer phirmakologisc

¹T . *7 'Γ ¹T . verträglichen Säureadditionssalze. Diese Salze könne

J2 J2 ^ J2 j3 J3 durch Umsetzung der Octadekapeptide mit anoi

"£ ^ *? ■< "ί α ⁶5 ganischen Säuren, wie Halogsnwasserstoffen, ζ. ϊ

Λ Λ Λ" ί* Λ" ^" Fluorwasserstoff. Chlorwasserstoff oder Bromwassei

Q Q Q Q Q ¹^" sioff. Halogenwasserstoffsäuren, wie Flußsäure. Sah

cn as ca ca säure oder BromwasserstoffsäUie, Schwefelsäure ode

Phosphorsäure oder mit organischen Säuren, wie (•ssigsäiirc. Ameisensäure. Propionsäure, Glykolsäure. Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure. Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsiiure, hergestellt werden. Zur Salzbildung kann die Säure in äquimolarcr Menge oder im Überschuß eingesetzt werden.

Die Octadekapeptide der Erfindung haben eine hohe corticotrope Aktivität und eine ausgezeichnete Wirkungsdauer. Ihre Halbwertszeit im Plasma ist liinger als die von nativern Corticotropin. Die Ergebnisse von Untersuchungen über die biologischen Eigenschaften der Octadekapeptide der Erfindung »erden nachstehend erläutert. Als Testsubstanz wird t/i-Ala¹. Orn¹⁵]-ACTH(1-1 S)-NH₂ verwendet.

Die biologische Halbwertszeit des Qf-AIa¹, Orn¹⁵]-ACTM(I-IS)-NH₂ wird an Hand der in vitro-lipolylischen Aktivität nach A. T a η a k a, B. T. P i c k ering und C. H. Li. Arch. Biochem. Biophys.. BcI. 99 (1962). S. 294, als Parameter bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt und mit den Werten für natürliches Corticotropin (Schaf: «,-ACTH), /J-AIa¹ -ACTH(I -18)-NH₂ und GIy¹-ACTH(I-18)-NH₂ verglichen.

Tabelle V

Peptid

Li-AIa¹. Om¹⁵]-ACTH( 1 -18)-NH₂

«,-ACTH

/i-Ala'-ACTH(l-18)-NH₂

GIy¹-ACTH(I-I S)-NH₂

in vivo") i. v.

(Min.I

in vitrcv) inkubiert

mit Plasma

(Min.)

4,5 4,4 3,1 2.0

76,1 59.2 35.4 30.0

und Nelson. Endocrinol.. Bd. 71 (1962). S. 1.1 mit einer kleineren Modifikation nach A. T a η a k ; und CH. Li, Endocrinol. Japonica, Bd. 13 (19661 S. ISO, bestimmt. Die in vivo-steroidbildende Aktivi tat wurde auch an der mit Dex! methason-pcntobarbi tal betäubten Maus bestimmt; vgl. A. T a η a k ι und N a k a m u r a »Integralivc mechanism ο neurocndocrine system«. Hokkaido Univcsity Medi cal Library Series, Vol.1 (1968), S. 49. 7.usätzlicl wurde die stcroidbildendc Aktivität bei intramusku lärer Verabreichung an hypophysenektomierte Rattci bestimmt, wobei die Tcstsubslanz in den Ratten schenkelmuskel injiziert und 30 Minuten nach de Injektion eine Blutprobe aus der abdominalen Aorti entnommen wurde. Schließlich wurde die steroid bildende Aktivität bei intravenöser Verabreichung ar hypophysenektomierte Ratten derart bestimmt, daf die Testverbindung in die femorale Vene injizier und eine Blutprobe 30 Minuten nach der Injcktior aus der abdominalen Aorta entnommen wurde. F-Tr aile Versuche wurde der »Third USP Corticotropin Reference Standard« als Standard verwendet und di< Bildung von 1 l-Hydroxycorticosteroiden (11-OHCS nach dem fluorophotometrischen Verfahren voi Peterson. .1 Biol. Chem. Bd. 225 (1957). S. 25 bestimmt. Bei jedem Bestimmungsverfahren wurdet gewöhnlich mehrere Messungen durchgeführt, um die unabhängig voneinander erhaltenen Werte wurdet nach dem statistischen Verfahren von S h e ρ s um Moore. J. Pharmacol. Extl. Thcrap.. Bd. \2i (I960). S. 99, ausgewertet. Die Ergebnisse dieser Be Stimmungen mit OAIa¹. Orn^l5]-ACTH(1 - IS)-NH. sind in Tabelle VI zusammen mit den Werten fiii natürliches Corticotropin («,-ACTH) angegeben.

40

Tabelle VI

Anmerkungen:

") Pine Probe des Peptid« wird Ratten in die Vena cava inferior injiziert. Aus der abdominalen Aorta werden in Zeitabständen Blutproben entnommen, angesäuert und auf die in vitro-lipotrope Aktivität untersucht.

^fl Eine Probe wird in frischem Plasma aus anaslhetisierten Ratten geliisl. und das Gemisch wird tvi 37 C' inkubiert. In bestimmten Zeiiabständen werden Proben entnommen und auf in vitro-lipotrope Aktivität untersucht.

Aus den vorstehenden Werten ist ersichtlich, daß die Halbwertszeit des [/J-AIa¹, Orn¹⁵]-ACTH(1-18)- ' NH₂ nahezu die gleiche ist wie die von natürlichem Corticotropin und langer ist als die ähnlicher Peptide bei intravenöser Injektion. Ferner ist die Halbwertszeit des genannten Octapeptids der Erfindung wesentlich langer als die von natürlichem Corticotropin und verwandten Octadekapeptiden bei der Inkubation mit Plasma in vitro. Die längere Wirkungsdauer der Octadekapeptide der Erfindung beruht auf einer höheren Beständigkeit der Peptide gegenüber der Wirkung von Endopeptidase im Blut.

Die stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde der Octadekapeptide der Erfindung wurde nach vier verschiedenen Methoden bestimmt, und sie wurde mit der von nativem Schafcorticotropin (a_s-ACTH) 65' verglichen. Die in vivo-steroidbiidende Aktivität bei intravenöser Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten wurde nach dem Verfahren von L i ρ s c ο m b Adrenocorticot-ope Aktivität von Schafcorticotrop
und [,.-AIa¹, Orn^ls]-ACTH(l-!8)-NH₂

Peptid

Verfahren

In-vivo-Steroidbildung bei:

adrenaler Cannulieiung

mit Dexamethason-
nembutal betäubter Maus

peripheres Blut..

Verab-

retchungs-

art

1. V.

i. v.
i. v.

f/f-A'i'.Orn¹⁵]-

<· .'JTH-H-IS)-NH,

145

162

160

86

-ACTH

100

180

Anmerkung:

Die Aktivitäten werden ausgedrückt in USP-Einheiten mg. i bezug auf den »Third USP Corticotropin-Reference Standard«.

Wie aus Tabelle VI hervorgeht, ist die stimulie rende Wirkung auf die Nebennierenrinde bei derr Octadekapeptid der Erfindung nahezu die gleicru wie die von Schafcorticotropin.

Das Q^Ala\Om¹⁵]-ACTH(l-18)-NH₂ weist aucl eine hohe lipolytische Aktivität auf, die in Tabelle VI mit der Aktivität von Schafcorticotropin vergliche wird.

Tabelle VII

Versuchstier

Minimale wirksame Dosis.
IΟ"" mg 50 mg Gen ehe

[.•f-Ala'.Orn¹⁵]-ACTHlI-IS)-NH,

-.,-ACTH

Adipöses Rattengewebe ! 0,35
Adipöses Kaninchengewebe 0,10

6.0

7,1

Anmerkung:

Dii lipolytische Aktivität wurde nach dem von T a π a k a et al beschriebenen Verfahren. Arch. Biochem. Biophys. Bd. 99 (1962), S. 294. beschriebenen Verfahren mit Rattenepididymal- und K.aniDchenperir'malfettgewebe bestimmt. Das Ansteigen der Konzentration von freien Fettsäuren im Medium und im Gewebe dient als Parameter. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die minimale wirksame Dosis pro 50 mg Gewebe.

Die Bestimmung der in vitro-melanocytenstimulierenden Wirkung von [,;-Ala^:. Orn^I5]-ACTH(!-'8l-NH, wurde nach der Methode von K. S h i ζ u m e. A. B. L e r η e r und T. B. Fitzpatrick. Endocrinol.. Bd. 54 (1954), S. 553, an isolierten Hautfragmenten von Rana pipiens bestimmt. Die in vitromelanocytenstimulierende Aktivität des Octadekapepti Js der Erfindung betraut 0.7 · \(f°. die von GIy¹ -ACTH(I - 18)- NH₂ 6.^ · IO^H und die -on ACTH(I-24)-OH (Synacthen¹-) Ii · 10^s Einheiten g. Als Bezugswert wurde natürliches reines a-melanocytenstimulierendes Hormon (.(-MSH) verwendet.

Die Octadekapeptide der Erfindung können in die entsprechenden Schwermetallkomplexe, 7.. B. die Komplexe von Zink. Kupfer, Eisen, Nickel oder Kobalt, oder in Komplexe mit Polyaminosäuren, wie PoIyglutaminsäure. Poiyasparaginsäure. Copolyglutamyltyrosin oder Copolyasparagv !glutaminsäure übergeführt v'verden. Diese Komplexe haben eine längere Wirkung als die einfachen Polypeptide. Die Schwermetailkomplexe können durch Umsetzung des Octadekapeptids mit einem Schwermetallhalogenid. wie Zinkchlorid. Kupferchlorid. Eisenchlorid. Kobaltchlorid oder Nickelchlorid, einem Acetat, wie Zinkacetat. Sulfat, wie Zinksulfat, oder Hydroxid, wie Zinkhydn id. im Gewichtsverhältnis I :0,l bis 100 unter schwu. sauren Bedingungen, vorzugsweise bei pH 6.5 bis 7.0, in üblicher Weise hergestellt werden. Der Zinkkomplex ist besonders bevorzugt. Die PoIyaminosäurekomplexe können durch Umsetzung der Octadekapeptide der Erfindung mit einer Polyaminosäure im Mengenverhältnis von etwa I :0.l bis 100 unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise hei pH 6.5 bis 7.0 in üblicher Weise hergestellt werden. Als Polyaminosäuren können die Homopolymerisate oder Copolymerisate verwendet werden, die die ι.-. D- oder Di.-Konfiguration aufweisen. Beispiele für bevorzugte Polyaminosäuren sind Po!y-i.-glutaminsäure. Poly-D-glutaminsäure, Poly-m.-glutaminsäure. PoIyi - asparaginsäure, Poly - υ - asparaginsäure. PoIy-Ui.-asparaginsäure. Copoly-i -glutamyl-i -tyrosin und Copoly -1 - asparagyl -1 - glutaminsäure. Die PoIvaminosäure hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von 1000 bis 100 000. insbesondere von 2000 bis 6000. Vorzugsweise wird die Polyaminosäure vorher mit einer Base, wie Natriumhydroxid, neutralisiert. Bei der Herstellung der Komplexe können gegebenenfalls Konservierungsmittel, wie Benzylalkohol und Phenol. Puffer, wie Phosphat-. Carbonat- oder Citratpuffer.

oder isotonisierende Verbindungen, wie Natriumchlorid, zugesetzt werden.

Die vorgenannten Werte für [,<- Ala", Om¹⁵]-ACTH(I-18)-NH, dienen nur als Beispiele. Die anderen Octadekapeptide der Erfindung haben praktisch die gleichen Eigenschaften und Vorteile. Die Verbindungen der Erfindung sind wertvolle Arzneimittel, z. B. zur Behandlung von akutem oder chronischem Gelenkrheumatismus, allergischen Krankheiten und

ίο Erkrankungen der Nebennieren bei Menschen und Haustieren, und sie können zur Bestimmung der Funktion der Nebennierenrinde dienen.

Die Octadekapeptide der Erfindung, ihre Säureadditionssalze und Komplexe können oral oder parenteral in üblichen Darreichungsformen verabreicht werden, z. B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten. Suspensionen. Emulsionen. Aerosole oder Tabletten, im Gemisch mit Trägern. Stabilisatoren. Emulgatoren. Konservierungsmitteln. Puffern, isotonisierenden Verbindungen und bzw. oder Netzmitteln.

Die wirksame Dosis kann vom Arzt leicht unter Zugrundelegung der vorgenannten Werte bestimmt werden. Zum Beispie! beträgt eine typische klinische Dosis der Verbindungen der Erfindung ungefähr 0.2 bis 0.8 Einheiten kg für eine normale erwachsene Person. Die Octaaekapeptide der Erfindung werden vorzugsweise in Form eines fnjekiionspräparates verabreicht.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
al Benzy!oxycarbonyi-.;-alany!-i.-tyrosinmethylester

Eine Lösung von 8.9 g Benzyloxycarbonyl-./'-alanin und 7.8 g L-Tyrosinrnethylester in Acetonitril wird zu einer Lösung von 8.3 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan bei 0 C szeeeben. Das Gemisch wird 16 bis !8 Stunden bei 0 C stehengelassen und danach vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, die Äthylacctatlösung mit 1 η-Salzsäure und j'niger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat ge.rocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückst.ind wird ,ms Allylacetat iimkristaliisiert. Nach nochmaliger Umknstalüsation werden 13.2 ti Produkt vom F. 114 bis 116 C erhalten. [-,]i⁷ -~6.2 -: 0.4 C = 1.040.

Methanol).

b) Benzyloxycarbonyl-, ,'-alanyi-! -tyrosiiihydrazid

4.81 g Benzyloxycarbonyl -,; - alanyl - 1 - tyrosinmethylesler werden in 50 ml Äthanol gelöst und mit 2.9 ml Hydra/in-hydrat versetzt. Das Gemisch wird 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur und 16 bis 18 Stunden bei 4 C stehengelassen. Das auskristallisiertc Hydrazid wird abfiltriert, mit kaltem Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.

Ausbeute 4.72 g. Nach Umkristallisation aus Äthanol schmilzt die Verbindung bei 125 bis 128 C. [<i]' + 3.9 - 0.4 U = 1.031 50%ige Essigsäure).

c| Benzyloxycarhonyl-yi-alanyl-i.-tyrosyli -scrinmcthvlcstcr

2.40 g Benzyloxycarbonyl -,; - alanyl - 1 - tyrosiiihydrazid werfen in 7 ml Dimethylformamid gelöst, und die I.ösuiie wird mit 15 ml I n-Sal/säure versetzt.

2 I 14300

Die Lösung wird mit Eis abgekühlt und sodann mit 3,6 ml eiskalter 2moiarer Natriumnitritlösunii versetzt. Nach 4minutigem Stehen bei 0 C wird das auskristallisierte Azid mit zwei Portionen \on jeweils 25 ml eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden mit eiskalter 5"„iger Natriumbicarbonatlüsung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Danach wird die Losung zu einer Lösung von 0,93 g i.-Serinmethylesier-hydrochlurid und 0,84 ml Triäthylamin in 20 ml 9Ü%igem Tetra- ig hydrofuran gegeben, und das Gemisch wird 4.S Stunden bei 4 C gerührt. Die gelatinöse Fällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,5S g. Nach Behandlung mit heißem Äthanol schmilzt die Ver- i> bindung bei 195 bis 196" C. O]? - 2.1 = 0.4 (c = 1.091. Methanol).

d) Benzyloxvcarbonyl-zi-alanyl-i -tyrosyl-L-serin-hydrazid

Eine Lösung von 1,46 g Benzyloxycarbonyl-,-i-alanyl-i.-tyrosyl-L-serinmethylester in 5 ml Dimethylformamid wird mit 0.73 ml Hydrazinhydrat versetzt und 24 Stunden bei 4"'C stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit Äthanol versetzt, die ausgeschiedenen Kristalle des Hydrazids werden abfiltriert. mit Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,40 g. Nach Behandlung mit heißem Äthanol werden 1.32 g Produkt vom F. 220 bis 224 C !Zersetzung) erhalten, O] -^: - 15.7 ~ 0.5 ic = 1.042. Eisessig).

e) tert.-Butyloxycarbonyl---benzyl-^-glut.ίrnyl-

i.-histidyl-i.-phenylalanyl-i.-arginyl-i.-tryptophyl-

glycin

Eine Lösung von 1.20 g 1 -Histidyl-L-phenylalanyl-L - arginyl - 1. - tryptophyl - giycinacetat (hergestellt gemäß Bull. Chem. Soc. Japan. Bd. 43 (1970). 'S. 196) in 10 ml 50%igem Dimethylformamid wird mit 1.03 g tert. - Butyloxycarbonyl - ■> - benzyl -1. - glutaminsäure- ₄c p-nitrophenylester und 25 ml Dimethylformamid versetzt, und das Gemisch wird 3 Tage bei 4 C stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 200 ml eines Gemisches gleicher Teile Äthylacetat und Diäthyläther eingetropft. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert. mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute l.Sfig. Das Produkt wird erneut in 10 mi 50%iger Essigsäure gelöst und mit 100 ml Äthanol versetzt. Die ausgeschiedene Füllung wird abfiltriert so und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1.37 g. O]" - 23,9 :t 0.6' (c = 1.020. 50%ige Essigsäure).

0 tert.-Butyloxycarbonyl-i.-methionyl-i-benzyl-

1 -glutamyl-i -histidyl-i.-phenylalanyl-i -arginyl-

i.-tryptophyl-^'.ycin

1,2 g tert.-Butyloxycarbonyl-j'-benzyl-i -glutamyl-1. - histidyl - \. - phenylalanyl - l - arginyl -1 - tryptonhylglycin werden in 6 ml Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wird 30 Minuten be; Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird die Lösung in einem Eisbad abgekühlt und mit Diäthylather versetzt. Das ausgeschiedene, von Endgruppen teilweise befreite Hexapeptid (1.34 g) wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.46 ml Triäthylamin sowie 0.74 g tert. - But vlox\ carbonyl -1 - methionin - ρ - nitrophenvlester versetzt, 24 Stunden bei 4 C stehengelassen und sodann in 250 ml eines Gemisches aus Äthylacetat und Äther (1:4) eingegossen. Die ausgeschiedene Fällung wird abfilmen, mit.Äther gewaschen und unter \ermmtlertem Druck getrocknet. Ausbeute 1.56 g Die Fällung wird in 15 ml Äther suspendiert, erwärmt und abgekühlt. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit kaltem Äthanol und Äther gewaschen und aus Äthylacetat lyophilisiert. Ausbeute 1,16 g, O]" - IS,5 ± 0,5"^J (c = 1,072, Dimethylformamid).

g) Benzyloxycarbonyl-^-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-;-benzyl-L-glutamyl-t-histidyii.-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin

1,09 g tert. - Butyloxycarbonyl - L - methionyl- ; - benzyl -1. - glutamyl - l - histidyl - L - phenylalanyl-L - arginyl - l - tryptophyl - glycin werden unter Eiskühlung in 6 ml Trifluoressigsäure gelöst, die einen Tropfen Wasser enthält. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, und danach wird das gebildete Heptapeptid-trifluoracetat durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Fällung wird abfiltriert, mit Äther gründlich gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1.21 g.

Ein Gemisch aus 0,86 g Benzyloxycarbonyl-,,■-alanyl-! -tyrosyl-i.-serinhydrazid. 4 ml 1 n-Salzsäure und 5 ml Dimethylformamid wird in einem Eisbad abgekühlt und tropfenweise mit 0,96 ml eiskalter 2molarer Natriumnitritlösung versetzt. Nach 4minutigem Rühren bei OC werden 10 ml eiskaltes Dimethylformamid zugegeben, um das ausgeschiedene Azid in Lösung zu bringen. Nach Zusatz von 0.56 ml Triäthylamin wird die erhaltene Lösung zur oben erhaltenen Lösung des Heptapeptid-trifluoracetats und 0.49 ml Triäthylamin in 20 ml eiskaltem Dimethylformamid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei OC stehengelassen und sodann mit 1 mi Essigsäure versetzt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45 C abdestiiliert. Der sirupöse Rückstand wird mit 20 ml Äthanol versetzt, die ausgeschiedene gelatinöse Masse abfiltriert. gründlich mit Äthanol. Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 0.88 g. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und die unlöslichen Fällungen werden abfiltriert. Diese Fällungen werden in Äthanol bis zum Siedepunkt erhuzt. sodann wird das Gemisch abgekühlt und filtriert. Hierbei werden nochmals 0.27 g Fällung erhalten. Die Gesamtausbeute beträgt 1.15 g. Die vereinigten Fällungen werden mi; heißem Äthanol gereinigt. \"Y' — M.5 ■ 0.5 ic ■-■1.067, Dimethylformamid). R_f==0.75 iSilikagel-Dünnsehichtchromaiographie im Lösungsmittel·^ stern η - Butanol - Essigsäure - Pyridin - Wasser = 30:6:20:24). R_f = 0,80 (Papierchromatographie im Lösungsmittelsystem η - Butanol - Essigsäure-Wasser = 4:1:2).

h) N'-Benzyloxycarbonyi-N'-tert.-butyloxycarbonyli -lysyl-i -propyl-i -valyl-glycyl-N'-tert.-butyl-

oxycarbonyl-i -ornithin-methylester

1,20 g N'- Benzyloxycarbonyl - N¹*- tert. - butyloxycarbonyl -1 - ornithin - methylester [F. 69 bis 70 C. O] " -- !0.6 ± 0.5 (c = 1.092. Methanol)] wird in Methanolmit 10".» Essigsäure2 Stundenan Palladiumschwarz als Ka'aiysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Fs hinterbleilx

N' - tert. - Butyloxycarbonyl -1 - ornithinmcthylesteracetat als sirupöser Rückstand, der bei Of mit 50%iger wäßriger Kaliumcarbonatlösung in Dichlormethan behandelt wird. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 20 C eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Dichiormethan gelöst und die Lösung wird mit 1,83 g N^a - Benzyloxycarbony! - N^E - tert."- butyloxycarbonyl· L-lysyl-L-prolyl-b-valyl-glycin versetzt, das gemäß ,0 Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 37 (1964), S. 1471, hergestellt wurde. Danach wird die Lösung mit einer Losung von 0,60 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan bei 0⁰C versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4^CC stehengelassen, danach wird der ,,-ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eineedampft. Der sirupöse Rückstand wird in Äihylacerat aufgenommen, mi', eiskalter 1 η-Salzsäure'und 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird erneut in 30 ml Äthylacetat gelöst und mit 30 m! Äther versetzt. Hierbei fällt der Pentapeptidmethyiester in reiner Form an. Ausbeute 2,24 g; [«]? - 5?*9 ± 0.9 (c = 1.062. 2, Methanol).

i) Ν''-Benzyloxycarbonyl-N''-tert.-butyloxy-

_s carbonyl-L-lysyl-L-propyi-L-valyl-glycyi-

N¹-tert.-b^.yloxycarbonyl-i-ornithin-hvdrazid

2,2 g des oben erhaltenen P .Hapeptidmethylesters " werden in 30 ml Metharol gelöst und mit 0.26 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das" Gemisch wird 3 Taae bei Raumtemperatur stehengelassen, und danach wird das Hydrazid durch Zusatz von Wasser ausgefällt. Die Fällung wird abfiltriert und das wäßrisze^Methanol "" umkristallisiert. Ausbeute 2.1a. F. 1 75" bis 180'· C. [-0- - 35.8 ± 0.7'^J (r = 1.040." Dimethylformamid).

j) N'-Benzyioxycarbonyl-N'-tert.-butvloxycarbopyl-L-lysyl-i-prolyl-i.-vaIyl-glycy!-N'⁵-tert.-butyioxy-'^: carbonyl-i.-ornithyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-., i.-lysyl-i -arginyl-L-argininamid-diacetat

Eine eiskalte Lösung von 0.95 g des oben erhaltenen Pentapeptidhydrazids in 10 ml 90%igem Tetrahydrofuran wird mit 2,75 ml eiskalter 1 η-Salzsäure* und m! 2

o!arer Nairiurnniiriiiüsuiig versetzt. 5 MiC h

nuten bei 0 C stehengelassen und hierauf mil 0.38 ml Triäthylamin auf pH 7.4 bi.·, 7.6 eingestellt. Danach V.ird die Lösung mit einer eiskalten Lösung von so hT-tert.-Butyloxycarbonyl-i -lysyl-i.-arginyl-i -arginintmidtriacetat und 0.42 ml Triäthylamin in 7.5 ml t0%igem Tetrahydrofuran versetzt. Das Triacetat Hürde aus 0.92 mMoi N'-Benzyloxycarbonyl-N^r-tert.-t>utyloxycarbonyl - 1 - lysyi - N"' - nitro - 1 - arginyl- |4^f'-nitro-i -argininamid durch katalytische Hydrielung nach der in Bull. Chem. Soc. Japan. Bd. 39 (1966), S. 882, beschriebenen Methode erhalten.

Das Gemisch wird 3 Tage bei 4'C stehengelassen und sodann unter vermindertem Druck eingedampft, fio Der Rückstand wird mit 10 ml Athylacetat und 10 ml 1 n-Essigsiiure versetzt und gründlich durchgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Äthylacetatextrakte werden unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml ft« eingedampft.

Das Konzentrat wird mit wassergesättigtem N-Butanol erschöpfend extrahiert. Der Extrakt wird

Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure iyophüisiert. Ausbeute 0,85 g; [</]? - 43,1 ± 1,5 (r =0,540, 50%ige Essigsäure).

k) ,.'-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-gluiamyl-1 -histidyl-i -phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyi-

glycyl-i-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-i .-ornithyl-

L-!ysy]-L-arginyl-L-argininamid

Eine Lösung von 0.405 g Benzyloxycarbonyl- ri - alanyl -1 - tyrosyl -1. - seryl - L - methionyl - - · - benzyl-L - glutamyl -1 - hLtidyl -1. - phenylalanyl -L- arginyl-L-tryptophyl-glycin in 5ml Essigsäure wird mit 0,5 ml einer 1 η-Lösung von Chlorwasserstoff in Essigsäure versetzt und sofort gefriergetrocknet. Danach wird der Rückstand über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Das erhaltene Dekapeptidhydroehlorid wird in 4 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,104 g N-Hydroxysuccinimid gelöst und mit einer Lösung von 0.186 g Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat in 100 ml eines eiskalten Gemisches gleicher Teile Athyiaceta; und Äther eingegossen. Die erhaltene Fällung wird abfiltriert. mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0.435 g des aktiven Dekapjptidesters erhalten.

0.230 g N³-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl -ι.- lysyi -1. - prolyl -1. - valyl - glycyl - N'' - tert.-butylüxycarbonyl - 1. - ornithyl - N* - tert. - butyloxycarbonyl -L- lysyi-1.-arginyl- l-argininamid werden in 90%igem Methanol, das 0.1 ml Essigsäure enthält. 3 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren de-, Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Drjck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird aus Essigsäure Iyophüisiert. Ausbeute 0.262 g eines Pulvers. Das Produkt wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.2 ml Triäthylamin versetzt. Hierauf wird die Lösung mit einer Lösung von 0.435 g des oben erhaltenen aktiven Esters des Dekapeptids in 1.5 ml Dimethylformamid versetzt und 45 Stunden bei 4 C stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 100 m! eiskaltes Äthylacetat eingegossen und die ausgeschiedene Fällung abnitriert. Die Fällung wird mit Äthylacetat und Äther gewaschen, aus Essigsäure Ivophilisiert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Es werden 0.662 g geschütztes Octadekapeptid als Rohprodukt erhalten.

0.646 g des geschützten Octadekapeptids werden mit etwa 10 ml Fluorwasserstoff 60 Minuten bei 0 C in Gegenwart von 0.6 ml Anisol und 0.12 g 1 -Methionin zur Umsetzung gebracht. Danach wird der Fluorwasserstoff verdampfen gelassen, der Rückstand in eiskaltem Wasser gelöst und die Lösung mit Äthylacetat gewaschen. Hierauf wird die Lösung auf eine Kolonne mit den Abmessungen 1.7 χ 15 cm mit Amberlitc CG-400 in der Acetatform gegeben. Die Kolonne wird mit Wasser eluiert, das Eluat stark eingedampft und Iyophüisiert. Das erhaltene, von Endgruppe!! befreite Peptid (0,704 g) wird an einer Kolonne mit den Abmessungen 2,7 χ 32 cm an Carboxymethylcellulose (Serva, 0.56 mÄq/g) mit Ammoniumacetatpuffjr (pH 6.5. 2000 ml) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0.025 bis 0.6molar chromatographiert. Es werden 10-ml-Fraktionen auf-

gefangen, und die Absorption bei 280 nm wird registriert. Die Fraktionen, die einem Absorptionsmaximum (Nr. 153 bis 180) und seiner Schulter lNr. ISI bis 200) entsprechen, werden gesondert aufgefangen. Der Haupttei! des Lösungsmittels wird s unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 50 bis 55" C verdampft. Die Rückstände werden bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Es werden 228 mg(F-I) bzw. 62 mg (F-II) eines farblosen flockigen Pulvers dci beiden Fraktionen erhalten. Die Fraktion F-I (228 mg) wird erneut an Carboxymethylcellulose in einer Kolonne mit den Abmessungen 2.1 χ 27 cm auf die vorstehend geschilderte Weise Chromatographien. Das gereinigte Peptid 1195 mg. F-I-I) wird aus einem einzigen Absorptionsmaximum _!5 erhalten. Eine kleine Schulter des Absorptionsmaximums ergibt 20 mg der Fraktion F-I-2. 62 mg der Fraktion F-II und 20 mg der Fraktion F-I-2 werden vereinigt, und die chromatographische Reinigung wird zweimal wiederholt. Es wird eine weitere Menge \oii 46 mg reinem Peptid erhalten. Die Gesamtausbeute an Octadekapeptid beträgt 241 mg.

[„]? - 55.4¹ (c = 0,5. 0,1 η-Essigsäure), UV;.'^,""^HC! .-= 279 ma (EU 24,4), /ω^'= 288 ma (E¹,^ 17.8). Χ'ηίΐ ^NjOH =281 rna (EU 25,9), 288 nv (EU 25.0).

Das Aminosäureverhälinis im sauren Hydrolysat hat folgenden Wert: Serin 0,83, Glutaminsäure 0.96. Prolin "l,04, Glycin 2,09, Valin 1,00. Methionin 1,03. ₃c T>rosin 1.03, Phenylalanin 0,98. ,''-Alanin 0.93. Ornithin 1.11, Lysin 1,95, Histidin 0,97. Arginin 3.07. Das Molverhältnis von Tryptophan zu Tyrosin im intakten Peptid beträgt spektrophotometrisch bestimmt 1,15: 1.

Beispiel 2
a) tert.-Butyloxycarbonyl-fi-alanin

8,91 g /J-Alanin werden in 100 ml 1 n-Natroniauge ₍o gelöst. Die Lösung wird mit 21,0 gNatriumbicarbonat und 70 ml Dioxan versetzt, auf 50 C erwärmt und unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 17,2 » lert.-Butylazidformiat in 30 ml Dioxan versetzt. Das Gemisch wird 41,5 Stunden bei 50^cC gerührt und anschließend auf etwa 100 ml unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird mit Eis abgekühlt und mit 180 ml 4n-Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Die Lösung wird mit etwa 100 ml eiskaltem Äthylacetat extrahiert, der Extrakt über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird aus einer Mischung "on Äthylacetat und Petroläther umkriitallisiert. Ausbeute 12,66 g vom F. 77 bis 78 C.

b) tert-Butyloxycarbonyl-zi-alanyl-i.-tyrosinmethylester

55

3,48 g i.-Tyrosinmethylester-hydrochlorid werden in 15 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Eiskühlung mit 5 ml 50%iger Kaliumcarbonatlösutig versetzt und 40 Minuten im Kühlschrank stehengelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, gründlich mit kaltem Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 2,55 g L-Tyrosinr.iethylester. 6<

1.89 g tert. - Bucyloxycarbonyl - /; - alanin werden in wasserfreiem Tetrahyd jfuran gelöst. Die Lösung wird auf -1O⁰C abgekühlt und unter R.ühreti zunächst mit 2,04 g Tri-n-buiylamin und hierauf mit 1,19 g ChIi rameisensüureäthylester versetzt. Nach. 10 Minuten wird eine Suspension von 1,95 gi.-Tyrosinmethylester in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei - 10 C und anschließend 2V₁ Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wird" das Lösungsmitte! unter vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand in Athylacetat gelöst, nacheinander mit 1 n-Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 2,99 g. Nach Umkristallisation aus einer Mischung von Methanol und Äther schmelzen die Kristalle bei 141 und 142'C. [a]i,^J + 8,2 ± 0.5 (c = 1,020. Methanol).

cj tert.-Butyloxycf/ :jonyl-,->-alanyli.-tyrosinhydnzid

2,56 g terl.-Butyloxycarbonyl-^-alai.yl-i.-tyrosinmethylester werden in 26 ml wasserfreiem Äthanol ßolöst und mit 1.7 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und danach 16 bis 18 Stunden in einen Eisstrang verbracht. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 2,54 g. Nach Umkristallisation aus heißem Wasser schmilzt die Verbindung bei 213.5 bis 215 C. [a]y + 3.6 ± 0,6° (c = 0,978. 50%ige Essigsäure).

d) tert.-Butyloxycarbonyl-zi-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-i.-methioninmethylester

1.10 g tert.-Butyloxycarbonyl-ff-alanyl-L-tyrosinhydrazid werden in 7,5 ml kalter 1 n-Saizsäure gelöst. Die Lösung wird auf -10" C abgekühlt und mit 3.6 ml 2molarer Natriumnitritlösung versetzt. Nach 4minutigem Stehen wird das gebildete Azid mit Äther extrahiert, der Ätherextrakt -nit kalter !molarer Natriumbicdrbonatlösung gev.aschen und über Natriumsulfat getrocknet. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von etwa 10 C eingedampft. Der Rückstand wird in kaltem Acetonitril gelöst und die Lösung mit 0,756 g 1. - Seryl - L - methioninmethylester versetzt und 48 Stunden stehengelassen. Der L-Seryl-L-methioninmethylester wurde nach Bull. Chem. Soc. Japan. Bd. 39 (1966), S. i 171. hergestellt.

Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel unter verr. indertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äthyiacetat und einer geringen Menge Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung wird nacheinander mit kalter 1 η-Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Sodann wird das Lösungsmittel unter vermindertem Di uck abdestilliert, die gelatinöse Masse abnitriert, mit kaltem Äthylacetat und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 1.204 g. Dis Produkt wird durch Umfällunu aus Allylacetat gereinigt. F. 121.5 bis 123 C; [V]" - 13.0 ± 0,6 ic = 0,997, Methanol).

R_f = 0,53 (Dünnschichtchromatographie an SiIikagel im Lösungsmittelgemisch mit Methanol-Essigsäure = 15:85).

e) tert.-Butyloxycarbonyl-ii-alanyl-i -ty rosy I-ι -seryl-i -mcthioninhydrazid

0,969 g tert.-Butyloxycarbonyl-ii-alanyl-i-tyrosyli - seryl -1 - methioninmethylcster werden in ft ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 0.5 ml Ilydrazinhydrat versetzt und 43 Stunden in der Kälte stehengelassen. Danach wird die Lösung mit Äthylacetat versetzt. Hierbei Rillt eine gelatinöse Masse aus. die abfiltriert, mit kaltem Allylacetat gewinnen und getrocknet wird. Ausbeute 1.01 g. Nach Umkristallisation aus Wasser schmilzt die Verbindung bei 186.5 bis 188 C. [.ι]·ν - 20.1 i- 0.5 U l.34ft. 50%iges Methanol).

0 terL-Butyloxycarbonyt-fi-alanyl-i -tyrosyi-

1 -seryl-i -methionyl-;-tert.-butyl-i -glutamyl-L-histidyl-i -phenylalanyl-i.-arginyl-i -liyptophyl-

glycin

0.452 g tcrt.-Butyloxycarbnnyl-/i-alanyl-i -t\ro>\li - seryl - ι - mcthioninhydrazid werden in 4.5 ml 90%igem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird in einer Kältemischung aus Eis und Kochsalz abgekühlt und unter Rühren mit 2J) ml eiskalter 1 η-Salzsäure sowie 0.825 ml !molarer Natriumnitritlösung versetzt. Nach etwa 4 Minuten werden 20 ml eiskalte gesättigte Natriumchloridlösung zugegeben, und das gebildete tert.-Butyloxycarbonyl-tetrapeptidazid wird mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit eiskalter 5%iger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

0.496 g y-tert.-Butyl-i -glutamyl-i -histidyl-i -phenylalanyl-L-arginyl-i -trvptophyl-glycin-acetal !hergestellt nach der in Bull. Chem. Soc. Japan. Bd. 38 (1965). S. 1148. beschriebenen Methode) und 0.21 ml Triäthylamin werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung des oben erhaltenen Azids in Äthylacetat versetzt, und das Äthylacetat wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 10 bis 15 C abdestilliert. Die erhaltene klare Lösung wird 16 bis 18 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Nach nochmaliger Zugabe von aus 0.226 g Tetrapeptidhydrazid hergestelltem Azid zur Lösung wird das Gemisch im Kühlschrank 16 bis 18 Stunden stehengelassen.

Anschließend wird das Gemisch tropfenweise in 200 ml eiskaltes Äthylacetat unter Rühren gegeben. Die gebildete Fällung wird abfiltriert. Ausbeute 0.691 g rohes Dekapeptid. das aus einer Mischung von Dimethylformamid und Methanol (2:5) umgefälit und aus Essigsäure lyophilisiert wird. Ausbeute 0,454 g eines Pulvers. Die Dünnschichtchromatographie des Produktes an Silikagel ergibt einen einzigen Fleck mit einem R_f-Wert von 0,54 bis 0.57. [α]|^J - 19.4-0.7 (c = 0.882. Dimethylformamid).

Gemäß Beispiel 1 k) wird tert.-Butyloxycarbonyl- ß - alanyl -L- tyrosyl - L - seryl - L - methionyl - γ - tertbutyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit N'-tert.-Butyloxycarbonyl-L - lysy 1 - L - prolyl - L - valyl - glycyl - N - tert. - butyloxycarbonyl - l - ornithyl - N¹ - tert - butyloxycarbonyl-L - lysyl - L - arginyl -L- argininamid kondensiert, und das erhaltene geschützte Octadekapeptid wird mit Fluorwasserstoff .Tür Umsetzung gebracht und von den Schutzgruppen befreit. Nach chromatographischer Reinigung erhält man das β - Alanyl - L - tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-

i. -valyl-glycy I-1- ornithyl-i.-lysyl-i.-arginyl-i. -argininamid. Dieses Produkt ist identisch mit dem im Beispiel I k) erhaltenen Octadekapeptid.

B e i s ρ i e 1 3

0.5mg [,<-Ala\Orn¹⁵]-ACTH(l-18)-NH₂-acetat werden in 0,25 ml 40millimolarer Zinkchloridlösung bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird mit ίο 0.25 ml einer 40millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 4,5 mg Natriumchlorid enthält. Man erhält eine Suspension des Zinkkomplexes, die mit 0.1 η-Natronlauge auf pH 7.0 eingestellt wird.

B e i s ρ i e 1 4

0,5 mg [/J-Ala¹,Orn¹⁵]-ACTH(l-!8)-NH₂-acetat werden in 0,15 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 0,1 ml einer Lösung von Poly-i.-glutaminsäure versetzt (0,5 mg; Molekulargewicht 1500 bis 2000). Diese Lösung wurde vorher mit 0.1 n-Natronlauge neutralisiert. Das Gemisch wird mehrere Minuten gerührt, danach mit 0,25 ml eines m 30-Phos-■phatpuffers versetzt,, der 4,5 mg Natriumchlorid enthält. Der erhaltene Komplex wird mit 0.1 n-Natronlauge mf pH 7,0 eingestellt.

Beispiel 5

1.0mg OAIa',Orn¹⁵]-ACTH(l-18)-NH₂-acetat werden in 0.2 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit einer Lösung von Poly- !.-asparaginsäure versetzt (2 mg, Molekulargewicht etwa 3000). Diese Lösung wurde vorher mit 0,3 ml 0,1 η-Natronlauge neutralisiert. Es bildet sich eine weiße Fällung. Diese Fällung wird mit 0.5 ml einei Lösung von ml5 Dinatriumhydrogenphosphat/Kaliumdihydrogenphosphatpuffer vom pH 6.8 versetzt der 9.0 mg Natriumchlorid enthält, und mit 0.1 n-Na tronlauge auf pH 7,0 eingestellt.

Beispiel 6

0.5 mg OAla',Orn¹⁵]-ACTH(I -18)-NH₂-acetal werden in 0,15 ml lOOmillimolarer Zinkchloridlösung gelöst. Andererseits werden 0,5 mg Poly-i.-glutaminsäure vom Molekulargewicht 2000 bis 3000 mil 0.1 ml 0.1 η-Natronlauge neutralisiert. Die Lösum wird mit 4,5 mg Natriumchlorid sowie 0.25 ml 40milli· molarer Dinatriumhydrogenphosphatlösur.^ versetzt Die eihaltenen Lösungen werden vereinigt und be Raumtemperatur gerührt. Die Suspension des erhal tenen Komplexes wird mit 0,1 η-Natronlauge neutrali siert.

Beispiel 7

0,5 mg |>Ala\ Om¹⁵]-ACTH(I-18)-NH₂-aceta werden in 0,1 ml Wasser bei Raumtemperatur gelös und mit 0,25 ml eines m/15 Kaliumdihydrogenphos phat - Dinatriumhydrogenphosphatpuffers versetzt der 4,5 mg Natriumchlorid enthält. 2,0 mg Copoly

L - glutamyl - L - tyrosin (Molekulargewicht 21 850 werden mit 0,15 ml 0,1 η-Natronlauge neutralisiert Die neutralisierte Lösung wird zur erhaltenen Peptid lösung gegeben und gerührt. Der erhaltene Komple: wird mit 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt

Beispiels

0,5 mg fjJ-Ala¹, Orn¹⁵]-ACTH(I -18)-NH₂-aceta werden in 0,1 ml Wasser gelöst und mit 0.25 m

409 611-40;

m,15 l'hosphatpuffer versetzt, der 4,5 mg Natriumchlorid enthält. 7 mg Copoly-i.-glutamyl-i -tyrosin (Molekulargewicht etwa 21 850) werden mit 0,1 n-Natronlauge neutralisiert. Die neutralisierte Lösung (0,1 ml) wird zu der Lösung des erhaltenen Peptids gegeben. Zunächst bildet sich eine Suspension, d sofort klar wird. Danach wird die Lösung mit 0,1 η Natriumsalz der Äthylmercurithiosalicylsäure
0,05 ml Wasser versetzt und mit 0,1 n-Natronlau; auf pH 7,0 eingestellt.

Claims

2 i 14 Patentansprüche:

1. Octadekapeptide der allgemeinen Formel 1

/i-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-Y-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-i.-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-Z