DE2114300B2

DE2114300B2 - Octadekapeptide und arzneipraeparate

Info

Publication number: DE2114300B2
Application number: DE19712114300
Authority: DE
Inventors: Hideo Mino Osaka; Inouye Ken Kobe Hyogo; Otsuka (Japan)
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1970-03-24
Filing date: 1971-03-24
Publication date: 1973-07-26
Also published as: US3759891A; DE2114300C3; NO137152C; DE2114300A1; ZA711856B; NO137152B; AT310958B; CH593918A5; SE361661B; NL7103983A; CA945144A; BE764783A; FR2085734B1; GB1298318A; FR2085734A1

Description

in der Z ein L-Axginin-, L-Argininester- oder L-Arginiiiamidrest ist, ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.

3. Octadekapeptide nach Anspruch 1 der Formel

/5-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-

L-giutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-

L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-

L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-i.-lysyl-

L-arginyl-L-argininamid

seine phaxmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.

4. Arzneipräparat. enthaltend ein Octadekapeptid nach Anspruch 1 bis 3 als Arzneistoff und übliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel und Hilfsstoffe.

Die Erfindung betrifft neue Octadekapeptide mit einem ,-f-Alaninrest als aminoendständige Aminosäure und einem ι-Ornithinrest in der 15-Stellung an Stelle des Serinrestes bzw. des Lysinrestes im nativen Corticotropin, deren Derivate, pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze und Komplexe. Die Octadekapeptide sind somit [l-^-Alanin. 15-ornithin] - octadekapeptide, die abgekürzt auch als ftf-Ala'. Orn¹⁵]-octadekapeptide bezeichnet werden. Die Octadekapeptide der Erfindung sind wertvolle Arzneistoffe, da sie eine ausgeprägte Corticotropinaktivität, z. B. eine stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde, sowie eine lipolytische und melanocytenstimulierende Wirkung aufweisen. Diese Wirkungen sind von besonders langer Dauer.

In der Zeitschrift J. Biochem. (Tokyo), Bd. 58 (1965), S. 512, ist die Herstellung der Octadekapeptide ACTH(l-18)-OHundACTH(l-18)-NH₂, die den ersten 18 Arnir.osäureresten des Corticotropins (ACTH) entsprechen, beschrieben. Ferner ist in Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 43 (1970), S. 196, die Herstellung des 1 - Glycinanalogen, d. h. GIy¹ - ACTH(1-18) - NH₂ beschrieben. Biologiscne Untersuchungen an Corticotropinpeptiden haben ergeben, daß die aminoendständigen 18 Reste die Mindesterfordernisse Tür eine hohe stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde erfüllen. ACTH(I -18J-NH₂ und GIy¹-ACTH(I-18)-NH₂ sind jedoch wesentlich weniger aktiv als das native Hormon, insbesondere wenn sie zur Prüfung subcutan oder intravenös verabfolgt werden. Schließlieh ist in Bull. Chem. Soc. Japan. Bd. 43 (1970), S. 1163. ein ausgezeichnet wirkendes Corticotropinpeptid beschrieben, nämlich ,J-Ala'-ACTH(1-18)-NH_:. Dieses Peptid besitzt eine wesentlich verbesserte Aktivität, da es gegen die intrazelluläre Arninopcptidase sehr beständig ist. Die aminoendständige Substitution durch /-(-Alanin verbessen, die Stabilität des Peptids im Gewebe, jedoch nicht im Blut. Die Wirkung des 1-rf-Alaninanalogen im Blut ist tatsächlich von geringerer Dauer a!s die des nativen Corticotropins. Dies ist ein Anzeichen dafür, daß es unter der Einwirkung von Endopeptidase in Blut rascher desaktiviert wird als natives Corticotropin, wenn es intravenös verabfolgt wird.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein kurzkettiges Peptid zu entwickeln, das der Wirkung des nativen Corticotropins nahekommt und das sich in einfacher Weise herstellen läßt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung sind somit Octadekapeptide der allgemeinen Formel

/i-Alanyl-i.-tyrosyl-i -seryl-X-Y-i -histidyli-phenylalanyl-i-arginyl-i.-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-i -prolyl-i -valyl-glycyl-i -ornithyl-1 -lysy l-i -arginyl-Z

in der X ein ι-Methionin-, i.-Norvalin-, 1 -Norleucin-, L-Leucin- oder «-Aminobuttersäurerest, Y ein L-Glutaminsäure- oder 1 -Glutaminrest und Z ein ι-Arginin-, 1.-Argininester- oder i.-Argininamidrest ist. ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.

Die erfindungsgemäßen Octadekapeptide haben eine verbesserte Wirkungsdauer, und sie besitzen die gleiche stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde wie natürliches Corticotropin. Es wurde festgestellt, daß die verbesserten Eigenschaften dieser Octadekapeptide auf ihrer geringeren Empfindlichkeit gegenüber der Endopeptidase im Blut und der Aminopeptidase in den Geweben beruht.

Die Octadekapeptide der Erfindung können durch Kondensation der Aminosäuren oder durch Kondensation kleinerer Peptide in üblicher Weise hergestellt werden. Insbesondere können die Octadekapeptide deir Erfindung hergestellt werden

a) durch Umsetzung eines Amir.osäureesters oder Peptidesters mit einer freien Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure .oder einem anderen Peptidester mit geschützter Aminogruppe bzw. geschützten Aminogruppen in Gegenwart eines Kondensationsmittels oder

b) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Aminogruppe und geschützter oder ungeschützter Carboxylgruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe oder

el durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe mit anderen Aminosäuren oder einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe und geschützter Carboxylgruppe und anschließender Abspaltung der Schutzgruppen aus dem erhalteu-n geschützten Peptid durch hydrogenolyse. \cidolyse. alkalische Verseifung. Hydrazinolyse oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak.

D.c Kondensation zur Ausbildung von Peptidbinujngen kann nach üblichen Methoden erfolgen Beispiele für diese Methoden sind die Azid-, Dicyclohe\\lcarbodiimid- oder Carbonyldiimidazoimethode, die iiemiNchte Anhydridmelhode. die aktivierte I-.sier-Tm'' hode. z. B. die p-Nitrophenylestermethode. N-Hydr>^\succinimidestermethode. Pentachlorphenylestermcihode, Cyanmethylestermethod': und p-Nitrophenvithiolestermethode, die Isoxazoiium-, N-Carboxyanlndrid-, Tetraäthylpyrophosphit- oder Äthylchlorphosphitmethode oder eine Kombination dieser Methoden. Die Octadekapeptide der Erfindung können auch nach der sogenannten Peptidsynthese in fester Phase hergestellt werden. Es können zwar sämtliche vorgenannten Methoden zur Ausbildung von Peptidbindungen für die Herstellung der Octadekapeptide der Erfindung angewendet werden, die besonders bevorzugten Methoden sind jedoch die aktivierte Estermethode, die Dicyclohexylcarbodiimidmethode. die A/idmethode und die gemischte Anbydridmelhode.

Zur Herstellung der Octadekapeptide werden vorzugsweise freie funktionell Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, geschützt, insbesondere durch solche Gruppen, die sich leicht durch Hydrogenolyse, Acidolyse, alkalische Verseifung, Hydrazinolyse oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak abspalten lassen. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isobutanol oder tert.-Butanol, oder durch einen Arylalkylalkohol, wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, oder durch Amidbildung geschützt. Diese Carboxylschutzgruppen werden in üblicher Weise eingeführt.

Die Aminogruppe wird vorzugsweise z. B. durch eine tert. - Butyloxycarbonyl-, tert. - Amyloxycarbonyl-, ο - Nitrophenylsulfcnyl-, 2 - (p - Diphenyl) - isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-. ρ - Nitrobenzyloxycarbonyl-. Tosyl-, Formyl- oder Tritylgruppe in üblicher Weise geschützt. Zum Schutz der Guanidylgiruppe des Arginins wird vorzugsweise die Nitrogruppe. Tosylgruppe oder Adamantyloxycarbonylgruppe verwendet. Der Schutz der Guanidylgruppe ist icdoch nicht immer erforderlich. Die -'-Carboxylgruppe der Glutaminsäure wird vorzugsweise durch eine der vorgenannten Schutzgruppen für Carboxylgruppen geschützt. Die endständige Aminogruppe des Lysins oder Ornithins wird vorzugsweise durch eine der vorgenannten Schutzgruppen für Aminogruppen geschützt. Die Imidazolgruppe des Histidins kann durch eine Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Benzylgruppe geschützt werden. Ferner kann die Hydroxylgruppe des Serins oder Tyrosins z, B. durch

ίο eine Acetyl-, Benzyl- oder tert.-Butylgruppe geschützt werden. Ihr Schutz ist jedoch nicht immer erforderlich.

Außer den Aminosäureresten der aminoendständi-

gen Aminosäure und denen in der Stellung 15 können noch andere Reste der Aminosäurensequenz des

is Corticotropinpeptids durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die Corticotropinaktivität wesentlich zu verschlechtern. Beispielsweise kann die vierte Aminosäure Methionin durch Norvalin. Norleucin. Leucin oder a-Amiuobuttersäure und bzw. oder die fünfte Aminosäure Glutaminsäure durch Glutamin ersetzt werden.

Die letzte Kupplungsreaktion zur Herstellung der Octadekapeptide der "allgemeinen Formell erfolgt z. B. durch Kondensation eines geschützten Dekapeptids der allgemeinen Formel

R,-,-i-A!anyl-t -tyrosyl-i-seryl-X-'-Rj-i -glutamyl-ί -histid\l-i -phenylalanyl-i.-arginyl-i-tryptophylgiycin

in der R₁ eine Aminoschutzgruppe ist. X der ι -Methionin. L-Norvalin-, L-Norleucin-, L-Leucin- oder «-Aminobuttersäurerest und R₂ eine Carboxylschutzgruppe ist. mit einem geschützten Octapeptid der allgemeinen Formel

N^c-R₃-i -Lysyl-i -prolyl-i-valyl-glycyl-N'-Pvj-i-ornithyl-N'-Rs-i -lysyl-i-arginyl-Z

in der R₃, R₄ und R₅ jeweils eine Aminoschutzgruppe und Z einen L-Arginin-, 1 -Argininester- oder 1 -Argininamidrest bedeutet, nach der aktivierten Estermethode, der Dicyclohexylcarbodiimidmethode, der Azidmethodc. der gemischten Anrndridmethode oder einer Kombination dieser Methoden in einem inerten Lösungsmittel bei Temperaturen von - 20 bis 60" C während etwa 2 Stunden bis 7 Tagen. Anschließend werden die Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Octadekapeptid der allgemeinen Formel

R,-,-;-Alanyl-i -tyrosyl-i -seryl-X-;-R_:-i -glutamyli -histidyl-i -phenylalanyl-i -arginyl-i -tryptophylglycyl-N^c-R_ri -lysyl-i -prolyl-i -valyl-glycyl-N⁰-R₄-i -ornithyl-N^£-R₅-t -lysyl-i -arginyl-Z

in der R₁, X, R,, R₃, R₄, R₅ und Z die obige Bedeutung haben, durch Hydrogenolyse, Acidolyse. alkalische Verseifung, Hydrazinolyse oder Reduktion mit Nairium in flüssigem Ammoniak bei Temperaturen von etwa -20 bis 6OC während 30 Minuten bis 24 Stunden. Als inerte Lösungsmittel werden vorzugsweise Dimethylformamid. Dimethylsulfoxid, Dioxan. Hexamethylphosphoririamid und deren Gemische mit Wasser verwendet.

Die bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Octadekapeptide der allgemeinen Formel I sind in den Tabellen 1 bis IV zusammengestellt.

Cbo-Mla-OH + H-Tyr-OMe

DCC Cbo-/y-Ala · Tyr-OMe

NH^NH₂ Cbo-;i-Ala· Ty₁-NHNH₂

HNO₂ Cbo-,-i-Ala · Tyr-N, + H-Ser-OMe

Cbo-/(-Ala ■ T\ r Ser-OMe NH₂NH₂

Cbo/i-AIa ; Tyr · Ser-NHNH₂ HNO,

Tabelle I

OBzI BOC-GIu- ONP + H-His · Phe · Arg · Trp · GIy-OH

OBzI BOC-GIu · His · Phe · Arg Trp · GIyOH

OBzI

CF₃COOH

BOC-Met-ONP + H-GIu · His · Arg Trp · GIy-OH

OBzI
BOC-Met · GIu · His · Phe ■ Arg · Trp · GIy-OH

CF₃COOH

BOC BOC BOC

I I I

Cbo-Lys · Pro ■ VaI · GIy · Om-N₃ I- H-Lys · Arg · Arg-R (R = OH. NH₂, OCH₃)

Cbo-p-Ala · Tyr ■ Ser-N·, + H-Met ■ GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy-OH

OBzI

BOC

BOC BOC

Cbo-0-Ala ■ Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp ■ GIy-OH Cbo-Lys · Pro · VaI · GIy ■ Orn · Lys · Arg ■ Arg-R

OBzI

I

HOSu₁DCC

H₂ Pd BOC BOC

Cbo-^-Ala · Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg Trp ■ GIy-OSu + H-Lys · Pro ■ VaI · GIy · Om · Lys · Arg · Arg-R

OBzI BOC BOC BOC

Cbo-p-Ala Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe ■ Arg · Trp · GIy ■ Lys · Pro · VaI · GIy · Orn · Lys ■ Arg ■ Arg-R

HF

H-/i-Ala-Tyr-Ser-Met-GIu-His-Phe-Arg-Trp-GIv l.y.s- I'm VaI · GIy inn · Ly Λιιΐ-Λπ.· Κ

Tabelle

BOC-MIa-OH + H-Tyr-OMe DCC

BOC-/i-Ala · Tyr-OMe NH₂NH₂ · Tyr-NHNH₂

HNO₂ B0C-/5-Ala · Tyr-N₃

BOC-Ser-OH + H-Met-OMe

DCC BOC- Ser ■ Met-OMe

HCl

H-Ser · Met-OMe

BOC-MIa · Tyr · Ser · Met-OMe

NH₂NH₂ BOC-0-Ala · Tyr · Ser · Met-NHNH₂

HNO₂ OBu'

Tyr · Ser · Met-N₃ + H-GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy-OH

OBu¹ BOC-MIa · Tyr · Ser · Met ■ GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy-OH

OBu¹

HOSu, DCC

BOC BOC

OO

BOC-MIa · Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp GIy- OSu + H-Lys · Pro · VaI · GIy · Om · Lys · Arg-R (R == OH, NH₂, OCH₃)

OBu' BOC BOC BOC

I ill!

Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy · Lys · Pro · VaI ■ GIy · Om · Lys · Arg · Arg-R

CF₃COOH Γ.«, a I_n TVr. ς*ί -Met · Olu · His· Phe · Ar« · Trp · GIy Lys· Pro· VaI GIy · Om- Lys Arg Arg-R

ίο

χ υ

ac ο

ε?

CQ — J PQ—O

a:

CU

ta—

α.

CQ Ξ.

X O

O α.

W
QO

3 CO

O O

OO

U U Q a"

Vl

Ser

u Vi

ο—ο

α <

ό χ;

O Xl

m J3

o—o

co

X)

8 .

CQ — —

υ ο -

CQ—C

C >

CQ -J

C-.

Ο—C

Xi

7 ■>

11 12

In den Tabellen werden folgende Abkürzungen verwendet:

/f-Ala = /i-Alaninrest, Tyr = i.-Tyrosinrest,

⁵ Ser = i.-Serinrest,

Met = L-Methioninrest,

~ GIu = Glutaminsäurerest,

2C His = L-Histidinrest,

^ Phe = i.-Phenylalaninrest,

_Λ ¹⁰ Arg = L-Argininrest,

X Trp = L-Tryptophanrest,

^z CiIy = Glycinrest,

iC Lys = i.-Lysinrest,

O Pro = L-Prolinrest,

Il '⁵ VaI = l-Valinrest,

e£ Orn = ι -Ornithinrest,

p, Cbo = Benzyloxycarbonyl,

BOC = tert.-Butyloxycarbonyl, :

E? BzI = Benzyl, I

5 ^M OBu¹ = tcrt.-Butoxy, I

=p DCC = Dicyclohexylcarbodiimid, j

< HOSu = N-Hydroxysuccinimid und I

y I·. OhP = p-Nitrophenoxyrest. I

^m "T¹ it, it, 25 Wie aus den Tabellen hervorgeht, besteht das be-Q= <; <j vorzugte Verfahren in der Kupplung des Tripeptide, | ca—O · · das die ersten drei Aminosäuren enthält, nämlich ; ^₁ i t; /i-Alanyl-i.-tyrosyl-i-serin oder das Tetrapeptid Q (j . /i-Alanyl-i -tyrosyl-i - scryl - L - methionin mit dem O £ £30 Heptapeptid bzw. Hexapeptid entsprechend der Steles ^m T¹ "T^{1 mn}g 4 bis 10 bzw. 5 bis 10, vorzugsweise nach der y c c Azidmethode. Hierauf wird das erhaltene Dekapeptid

> 2 ca—O O mit dem Peptid entsprechend dem Rest des Moleküls

~ cu ·■ (Stellungen 11 bis 18) vorzugsweise nach der aktivierten

= O " O ü ³⁵ E^stermethode kondensiert.

-^ CQ——1 ■ · Das vorgenannte Verfahren ist zwar das bevorzugte

t- i 5 4° Verfahren zur Herstellung der Octadekapeplide der

tC . Erfindung, doch ist es möglich, die Schutzgruppen,

O _| _t ο ο die Kupplungsmethoden oder die Abspaltung der

-Ξ· °- °- 40 Schutzgruppen auch nach äquivalenten Methoden

^ 3 y \n v, durchzuführen und die Wahl der Ausgangspeptide

£r O O ^m —"-^ ^ ^un<^ ^^er Reihenfolge der Kupplungsreaktionen ent-

H J^ J^ ^ ^ sprechend zu ändern.

I₀ Q Q Q Q Die Schutzgruppen können durch Hydrogenolyse,

^ U- · -45 alkalische Verseifung, Hydrazinolyse, Reduktion mit

£■ ^ £r S" £■ Natrium in flüssigem Ammoniak oder durch Be-

*"" „ ^7* ^T je ^T handlung mit einer Säure, wie Trifiuoressigsäure, I

ao ^ w) ao ac Ameisensäure, einem Halogenwasserstoff, wie Fluor- j

.2 < O < < "< wasserstoff, Bromwasserstoff, Chlorwasserstoff, einer

■£ ü "^* ώ ώ ü 5° Halogenwasserstoffsäure, wie Flußsäure, Bromwasser-

^₃ g > £ cu cu stoffsäure oder Salzsäure, oder deren Gemischen in

O δ .... ühücher Weise und je nach der Art der Gruppe abge-

;, S £ j? £ spalten werden.

42_._._^. . Die verfahrensgemäß hergestellten Fji-Ala¹, Orn¹⁵]-

1 η I a 5 B 3 3 55 oetadekapeptide der Erfindung können nach üblichen

Jj? K O—O O—O O—O O Methoden gereinigt werden, z. B. durch Säulenchro-

£ ^ ,ij L L Ζ- matographie mit Ionenaustauscherharzen, lonenaus-

iC ^ J; Jg |§ 2 tauscher-Cellulose oder -Sephadex oder durch Gegen-

v^y - · - ^ stromverteilung.

u£o ^o ^ ^ ^⁶⁰Jc ^nac* ^<^^en verwendeten Reaktionsbedingungen

*? IE ■ · · · erhält man die Oetadekapeptide der Erfindung in

>» » >» >. >. ^. £►> Form der freien Basen oder ihrer pharmakologisch

¹T" ¹T ^T . . . verträglichen Säureadditionssalze. Diese Salze können

ja je ja .S ^s JS durch Umsetzung der Oetadekapeptide mit anor-

<; <■ ■<■ "^ "£ 5-65 ganischen Säuren, wie Halogenwassersti.ffen, z. B.

"^" ^" Λ Λ Λ 5" Fluorwasserstoff, Chlorwasserstoff oder Bromwasser-

QQQOO stoff, Halogenwasserstoffsäuren, wie Flubsäure, SaIz-

CQ ω co co PQ säure oder Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder

α.

Phosphorsäure oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure. hergestellt werden. Zur Salzbildung kann die Säure in äquimolarer Menge oder im Überschuß eingesetzt werden.

Die Octadekapeptide der Erfindung haben eine hohe corticotrope Aktivität und eine ausgezeichnete Wirkungsdauer. Ihre Halbwertszeit im Plasma ist langer als die von nativem Corticotropin. Die Ergebnisse von Untersuchungen über die biologischen Eigenschaften der Octadekapeptide der Erfindung werden nachstehend erläutert. Als Testsubstanz wird OAIa¹, Orn¹⁵]-ACTH(1-18)-NH₂ verwendet.

Die biologische Halbwertszeit des [/J-AIa¹, Orn¹⁵]-ACTH(MS)-NH₂ wird an Hand der in vitro-lipolytischen Aktivität nach A. Tanaka, B. T. Pickering und CH. Li, Arch. Biochem. Biophys., Bd. 99 (1962), S. 294, als Parameter bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt und mit den Werten für natürliches Corticotropin (Schaf; «,-ACTH), /J-AIa¹-ACTH(I-18)-NH₂ und GIy¹-ACTH(1-18)-NH₂ verglichen.

Tabelle V

Peptid

! in vivo") ¹ i. v.

OAIa¹, Orn¹⁵]-ACTH( 1-1S)-NH₂

(Z₅-ACTH

/i-Ala¹-ACTH(I-18)-NH₂

GV-ACTH(I-IS)-NH₂

(Min.»

in vitro¹·) inkubiert

mit Plasma

(Min.)

4,5 4,4 3,1 2.0

76,1 59,2 35,4 30,0

35 und Nelson, Endocrinol., Bd. 71 (1962), S. 13, mit einer kleineren Modifikation nach A. T a n a k a und CH. Li, Endocrinol. Japonica, Bd. 13 (i%6), S. 180, bestimmt. Die in vivo-steroidbildende Aktivität wurde auch an der mit Dexamethason-pentobarbital betäubten Maus bestimmt; vgl. A. T a n a k a und Nakamura, »Integrative mechanism of neuroendocrine system«, Hokkaido University Medical Library Series, Vol.1 (1968), S. 49. Zusätzlich wurde die steroidbildende Aktivität bei intramuskulärer Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten bestimmt, wobei die Testsubstanz in den Rattenschenkelmuskel injiziert und 30 Minuten nach der Injektion eine Blutprobe aus der abdominalen Aorta entnommen wurde. Schließlich wurde die steroidbildende Aktivität bei intravenöser Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten derart bestimmt, daß die Testverbindung in die femorale Vene injiziert und eine Blutprobe 30 Minuten nach der Injektion aus der abdominalen Aorta entnommen wurde. Für alle Versuche wurde der »Third USP Corticotropin Reference Standard« als Standard verwendet und dit Bildung von ll-Hydroxycorticosteroiden (11-OHCS nach dem fluorophotometrischen Verfahren vor Peterson, J. Biol. Chem. Bd. 225 (1957), S. 25 bestimmt. Bei jedem Bestimmungsverfahren wurdev gewöhnlich mehrere Messungen durchgeführt, uru die unabhängig voneinander erhaltenen Werte wurde; nach dem statistischen Verfahren von S h e ρ s um Moore, J. Pharmacol. Extl. Therap., Bd. 12> (1960), S. 99. ausgewertet. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen mit OAIa¹, Orn¹⁵]-ACTH(1-18)-Nli sind in Tabelle Vl zusammen mit den Werten fu natürliches Corticotropin ((Z₅-ACTH) angegeben.

Tabelle VI

Adrenocorticotrope Aktivität von Schafcorticotropn und OAIa¹, Orn"]-ACTH(1-18)-NH₂

40

Anmerkungen:

") Eine Probe des Peptids wird Ratten in die Vena cava inferior injiziert. Aus der abdominalen Aorta werden in Zeitabständen Blutproben entnommen, angesäuert und auf die in vitro-lipotrope Aktivität untersucht.

^b) Eine Probe wird in frischem Plasma aus anästhctisierten Rauen gciösJ. und d2i Gemisch wird bei ^7°O inkubiert In bestimmten Zeitabständen werden Proben entnommen und auf in vilro-lipotrope Aktivität untersucht.

Aus den vorstehenden Werten ist ersichtlich, daß die Halbwertszeit des OAIa¹, Orn¹⁵]-ACTH(1-18)- " NH₂ nahezu die gjeiche ist wie die von natürlichem Corticotropin und langer ist als die ähnlicher Peptide bei intravenöser Injektion. Ferner ist die Halbwertszeit des genannten Octapeptids der Erfindung wesentlich langer als die von natürlichem Corticotropin und verwandten Octadekapeptiden bei der Inkubation mit Plasma in vitro. Die längere Wirkungsdauer der Octadekapeptide der Erfindung beruht auf einer höheren Beständigkeit der Peptide gegenüber der Wirkung von Endopeptidase im Blut

Die stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde der Octadekapeptide der Erfindung wurde nach vier verschiedenen Methoden bestimmt, und sie wurde mit der von nativem Schafcorticotropin (α,-ACTH) verglichen. Die in vrvo-steroidbildende Aktivität bei intravenöser Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten wurde nach dem Verfahren von L i ρ s c ο m b Verfahren

ln-vivo-Steroidbiluuiig bei:

adrenaler Cannulierung

mit Dexametliasonnembutal betäubter Maus

peripheres Blut..

peripheres Blut..

Verabreichungsart

Peptid

[/f-Ala'.Orn¹⁵]-

ACTH-(1-181-NH,

I.V.

i.V.
Lv.

145

162

160

86

x.-ACTt

100

180

Amaerkiing:

Dte Aktivitäten werden ausgedrückt in USP-Einhdten/mg, bezog auf den »Third USP Ckjrticotropin-Reference Standard«.

Wie aus Tabelle VI hervorgeht, ist die stimuli rende Wirkung auf die Nebennierenrinde bei de Octadekapeptid der Erfindung nahezu die gleid wie die von Schafcorticotropin.

Das OAIa¹, Ora¹⁵]-ACTH(i-18)-NH₂ weist au eme hohe lipolytische Aktivität auf, die in Tabelle \ mit der Aktivität von Schafcorticotropin verglich wird.

Tabelle VII Versuchstier

Adipöses Rattengewebe
Adipösis Kaninchengewebe

Minimale wirksame Dosis, 10"' mg/50 mg Gewebe

α,-ACTH

ACTH(1-18)-NH₃

035
0,10

6,0

7,1

Anmerkung:

Die lipolytische Aktivität wurde nach dem von T a n a k a et al beschriebenen Verfahren, Arch. Kochern. Biophys. Bd. 99 (1962). S. 294, beschriebenen Verfahren mit Rattenepididymal- und Kaninchenperirenalfettgewebe bestimmt. Das Ansteigen der Konzentration von freien Fettsäuren im Medium und im Gewebe dient als Parameter. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die minimal* wirksame Dosis pro 50 mg Gewebe.

Die Bestimmung der in vitro-melanocytensümulierenden Wirkung von OAIa¹, Orn¹⁵]-ACTH* 1-18V-NH₂ wurde nach dor Methode von K. Shizume, A. B. L e r η e r und T. B. Fitzpatrick, Endocrinol., Bd. 54 (1954), S. 553, an isolierten Hautfragmenten von Rana pipiens bestimmt Die in vitromelanocytenstimulierende Aktivität des Octadekapeptids der Erfindung beträgt 0,7 · ΙΟ¹⁰, die von GV-ACTH(I-IS)-NH₂ 6,7 · 10⁸ und die von ACTH(I-24)-OH (Synacthen«) 2,1 ■ 10⁸ Einheiten g. Als Bezugswert wurde natürliches reines «-melanocytenstimulierendes Hormon («-MSH) venvendet.

Die Octadekapeptide der Erfindung können in die entsprechenden Schwennetallkomplexcz. B. die Komplexe von Zink, Kupfer, Eisen, Nickel oder Kobalt, oder in Komplexe mit Polyaminosäuren, wie PoIyglutaminsäure. Polyasparaginsäure, Copolyglutamylivrosin oder Copolyasparag>!glutaminsäure übergeführt werden. Diese Komplexe haben eine längere W irkung als die einfachen Polypeptide. Die Schwermetallkomplexe können durch Umsetzung des Octadekapeptids mit einem Schwermetallhalogenid, wie Zinkchlorid, Kupferchlorid, Eisenchlorid, Kobaltchlorid oder Nickelchlorid, einem Acetat, wie Zinkacetat, Sulfat, wie Zinksulfat, oder Hydroxid, wie Zinkhydroxid, im Gewichtsverhältnis 1:0,l bis 100 unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei pH 6,5 bis 7,0, in üblicher Weise hergestellt werden. Der Zinkkomplex ist besonders bevorzugt Die PoIyaminosäurekomplexe können durch Umsetzung der Octadekapeptide der Erfindung mit einer Polyaminosäure im Mengenverhältnis von etwa 1:0,1 bis 100 unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei pH 6,5 bis 7,0 in üblicher Weise hergestellt werden. Als Polyaminosäuren können die Homopolymerisate oder Copolymerisate verwendet werden, die die ι -, D- oder im-Konfiguration aufweisen. Beispiele für bevorzugte Polyaminosäuren sind Poly-i-glutaminsäure, Poly-n-glutaminsäure, Poly-οι-glutaminsäure, PoIyi - asparaginsäure, Poly - ο - asparaginsäure, PoIy-Di -asparaginsäure, Copoly-i -glutamyl-i-tyrosin und Copoly -1 - asparagyl -1. - glutaminsäure. Die PoIyaminosäure hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von 1000 bis 100 000, insbesondere von 2000 bis 6000. Vorzugsweise wird die Polyaminosäure vorher mit einer Base, wie Natriumhydroxid, neutralisiert. Bei der Herstellung der Komplexe können gegebenenfalls Konservierungsmittel, wie Benzylalkohol und Phenol. Puffer, wie Phosphat-, Carbonat- oder Citratpuffer, oder isotonisierende Verbindungen, wie Natriumchlorid, zugesetzt werden.

Die vorgenannten Werte für [ß - Ala¹, Om¹⁵]-ACTH(1-18 >-NH₂ dienen nur als Beispiele. Die anderen Octadekapeptide der Erfindung haben praktisch die gleichen Eigenschaften und Vorteile. Die Verbindungen der Erfindung sind wertvolle Arzneimittel, z. B. zur Behandlung von akutem oder chronischem Gelenkrheumatismus, allergischen Krankheiten und Erkrankungen der Nebennieren bei Menschen und Haustieren, und sie können zur Bestimmung der Funktion der Nebennierenrinde dienen.

Die Octadekapeptide der Erfindung, ihre Säureadditionssalze und Komplexe können oral oder

_Is parenteral in üblichen Darreichungsformen verabreicht werden, z. B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen, Aerosole oder Tabletten, im Gemisch mit Trägern, Stabilisatoren. Emulgatoren. Konservierungsmitteln, Puffern, iso-

ionisierenden Verbindungen und bzw. oder Netzmitteln.

Die wirksame Dosis kann vom Arzt leicht unter Zugrundelegung eier vorgenannten Werte bestimmt werden. Zum Beispiel beträgt eine typische klinische Dosis der Verbindungen der Erfindung ungefähr 0.2 bis 0,8 Einheiten kg Tür eine normale erwachsene Person. Die Octadekapeptide der Erfindung werden vorzugsweise in Form eines Injektionspräparates verabreicht.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 a) Benzyloxycarbonyl-^-alanyl-i-tyrosinmethylester

Eine Lösung von 8,9 g BenzyOxycarbonyl-,'-alanin und 7,8 g 1 -Tyrosinmethylester in Acetonitril wird zu einer Lösung von 8,3 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan bei 0 C gegeben. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 0 C stehengelassen und danach vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, die Äthylacetatlösung mit 1 η-Salzsäure und 5'yoigcr Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über

Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird üus Äthylacetat umkristallisiert. Nach nochmaliger Umkristallisation werden 13,2 g Produkt vom F. 114 bis 116 C erhalten. [«]£' + 6.2 ± 0,4° (' = 1,040.

Methanol).

b) Benzyloxycarbonyl-^-alanyl-i -tyrosinhydrazid

4.81 g Benzyloxycarbonyl -r<- alanyl -1 - tyrosinmethylester werden in 50 ml Äthanol gelöst und mit

2,9 ml Hydrazin-hydrat versetzt. Das Gemisch wird 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur und 16 bis 18 Stunden bei 4 C stehengelassen. Das auskristallisierte Hydrazid wird abfiltriert, mit kaltem Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.

Ausbeute 4,72 g. Nach Umkristallisation aus Äthanol schmilzt die Verbindung bei 125 bis 128 C. [.«]" + 3.9 ± 0.4 (<· = 1.032, 50%ige Essigsaure).

c) Benzyloxycarbonyhi-alanyl-i-tyrosyl-1-serinmethylester

2.40 g Benzyloxycarbonyl - // - alanyl -1 - tyrosinhydrazid werden in 7 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird mit 15 ml 1 η-Salzsäure versetzt.

Die Lösung wird mit Eis abgekühlt und sodann mit 3,6 ml eiskalter 2molarer Natriumnitritlösung versetzt. Nach 4minutigem Stehen bei O⁰C wird das auskristallisierte Azid mit zwei Portionen von jeweils 25 ml eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden mit eiskalter 5%iger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Danach wird die Lösung zu einer Lösung von 0,93 g L-Serinmethylester-hydrochlorid und 0,84 ml Triäthylamin in 20 ml 90%igem Tetra- ι ο hydrofuran gegeben, und das Gemisch wird AS Stunden bei 4° C gerührt. Die gelatinöse Fällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,58 g. Nach Behandlung mit heißem Äthanol schmilzt die Verbindung bei 195 bis 196° C. [α]? - 2,1 ± 0,4° (c = 1,091, Methanol).

d) Benzyloxycarbonyl-/rf-alanyl-i -tyrosyl-

L-serin-hydraad

20

Eine Lösung von 1,46 g Bcnzyloxycarbonyl-/i-alanyl-L-tyrosyl-i.-serinmethylester in 5 ml Dimethylformamid wird mit 0,73 ml Hydrazinhydrat versetzt und 24 Stunden bei 4^C C stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit Äthanol versetzt, die ausgeschiedenen Kristalle des Hydrazids werden abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,40 g. Nach Behandlung mit heißem Äthanol werden 1,32 g Produkt vom F. 220 bis 224⁰C (Zersetzung) erhalten, [η]Γ + 15,7 ± 0,5 (c = 1,042, Eisessig).

e) tert.-Butyloxycarbonyl-: -benzyl-i -glutamyl-

i -histidyl-i -phenylalanyl-i -arginyl-i -tryptophyl-

glycin

Eine Lösung von 1,20 g 1-Histidyl-L-phenylalanyl-L - arginyl -1. - tryptophyl - glycinacetat (hergestellt gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 43 (1970), S. 196) in 10 ml 50%igem Dimethylformamid wird mit 1,03 g tert. - Butyloxycarbonyl -γ- benzyl -1. - glutaminsäure- 4c p-nitrophenylester und 25 ml Dimethylformamid versetzt, und das Gemisch wird 3 Tage bei 4° C stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 200 ml eines Gemisches gleicher Teile Äthylacetat und Diäthyläther eingetropft. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,86 g. Das Produkt wird erneut in 10 ml 50%iger Essigsäure gelöst und mit 100 ml Äthanol versetzt. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1,37 g. [α]? - 23,9 ± 0,6° (c = 1,020, 50%ige Essigsäure).

35

f) tert-Butyloxycarbonyl-i-methionyl-y-benzyl-

l.-glutamyl-L-histidyl-i.-phenylalanyl-i.-arginyl-

i.-tryptophyl-glycin

55

1,2 g tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutamyl-L - histidyl -1. - phenylalanyl -1. - arginyl -1. - tryptophylglycin werden in 6 ml Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird die Lösung in einem Eisbad abgekühlt und mit Diäthyläther versetzt. Das ausgeschiedene, von Endgruppen teilweise befreite Hexapeptid (1,34 g) wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,16 ml Triäthylamin sowie 0,74 g 65, tert. - Butyloxycarbonyl -1. - methionin - ρ - nitrophenylester versetzt, 24 Stunden bei 4° C stehengelassen und sodann in 250 ml eines Gemisches aus Äthylacetat und Äther (1:4) eingegossen. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,56 g. Die Fällung wird in 15 ml Äther suspendiert, erwärmt und abgekühlt. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit kaltem Äthanol und Äther gewaschen und aus Äthylacetat lyophilisiert Ausbeute 1,16 g. [α]? - 18,5 ± 0,5° (c = 1,072, Dimethylformamid).

g)Benzyloxyrarbonyl-p-alany!-L-tyrosyl-L-seryl-L-metmonyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin

1.09 g tert - Butyloxycarbonyl - L - methionyl- γ - benzyl - l - glutamyl - l - histidyl - l - phenylalanyl-L - arginyl-1.-tryptophyl-glycin werden unter Eiskuhlung in 6 ml Trifluoressigsäure gelöst, die einen Tropfen Wasser enthält Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, und danach wird das gebildete Heptapeptid-trifluonicet;!! durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Fällung wird abfiitriert mit Äther grundlich gewaschen und unter vermindertem Druck getiuck.net. Ausbeute l.:i »

Ein Gemisch aus 0,86 g Benzyloxycarhom' ■ί-alanyl-i -tyrosyl-i -serinhydrazid. 4 ml 1 n-Sahsäurc und 5 rr¹ Dimethylformamid wird in einem f.istW, abgekühlt und tropfenweise mit 0.96 ml eiskalter 2molarer Natriumnitritlösung versetzt. Nach 4mmu· tigern Rühren bei 0^cC werden 10ml eiskaltes \ι·. methylformamid zugegeben, um das ausgeschieden Azid in Lösung zu bringen. Nach Zusatz von 0.5* uv. Triäthylamin wird die erhaltene Lösung zur oher. erhaltenen Lösung des Heptapeptid-trifiuoraa-t..κ und 0,49 ml Triäthylamin in 20 ml eiskaltem Γ methylformamid gegeben. Das Reaktionsgemisch w i; d 24 Stunden bei 0⁰C stehengelassen und sodann n.it ImI Essigsäure versetzt. Das Lösungsmittel w,,d unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatv; von 45⁰C abdestilliert. Der sirupöse Rückstand v;ni mit 20 ml Äthanol versetzt, die ausgeschiedene geht tinöse Masse abfiltriert, gründlich mit Äthanol. Ätlulacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet Ausbeute 0,88 g. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und die unlöslichen Fällungen werden abfiltriert. Diese Fällungen werden in Äthanol bis zum Siedepunkt erhitzt, sodann wird das Gemisch abgekühlt und filtriert. Hierbei werden nochmals 0,27 g Fällung erhalten. Die Gesamtausbeute beträgt 1,15 g. Die vereinigten Fällungen werden mit heißem Äthanol gereinigt. [>i]" — 18,5 i 0.5 (C= 1,067, Dimethylformamid). R_f = 0.75 (Silikagcl-DünnSchichtchromatographie im Lösungsmittelsystem η - Butanol - Essigsäure - Pyridin - Wasser = 30:6:20:24). R, = 0,80 (Papierchromatographie im Lösungsmittelsystem η - Butanol - Essigsäure-Wasser = 4:1:2).

h) N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-

i.-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-N'-tert.-butyl-

oxycarbonyl-L-ornithin-methylester

1,20 g N" - Benzyloxycarbonyl - N^a - tert. - butyloxycarbonyl - L - ornithin - methylester [F. 69 bis 70¹ C, [α]? - 10,6 ± 0,5° (c = 1,092, Methanol)] wird in Methanol mit 10% Essigsäure 2 Stunden an Palladiumschwarz als Katalysator hydriert. Nach dem Abnitrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem E>ruck eingedampft. Es hinterbleibt

N^- icrt. - Buiyloxywrbonyi -L- omithinmeihyiesteracetat als sirupöser Rückstand, der bei 0⁰C mit 50%iger wäßriger Kaliuracarbonatlösung in Dichlormethan behandelt wird. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 20⁰C eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wird mit 1,83 g N" - Benzyloxycarbonyl - N* - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin versetzt, das gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 37 (1964), S. 1471, hergestellt wurde. Danach wird die Lösung mit einer Lösung von 0,60 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan bei 0^QC versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4^CC stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft Der sirupöse Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, mit eiskalter 1 η-Salzsäure und lmolarer Natriumbrcarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird erneut in 30 ml ;V hy !acetal gelöst und mit 30 m! Äther versetzt. Hierbei fällt der Pentapeptidmethylester in reiner Form Mi Ausbeute 2,24 g; [«]? - 55,9 ± 0,9 (r = 1,062, Methanol).

i) N "Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i-lysyl-i -propyl-i-valyl-glycyl-

N"-tert.-butyloxycarbonyl-i.-ornithin-hydrazid

30

2.2 g des oben erhaltenen Pentapeptidmethylesters ..erden in 30 ml MethanoS gelöst und mit 0,26 ml : ivdrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird 3 Tage ¹Vi Raumtemperatur stehengelassen, und danach wird i!.is Hydrazid durch Zusatz von Wasser ausgefällt. Die !allung wird abfiltriert und das wäßrige Methanol umkristallisiert. Ausbeute 2,1g, F. 175 bis 180C. >.φ' - 35,8 t 0,7' (c = 1,040. Dimethylformamid).

ι ι N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-1 -lysyl-i.-prolyl-i-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i.-ornithyl-N'-tert.-butyloxycarbonyli -lysyl-i -arginyl-i -argininamid-diacetat

Eine eiskalte Lösung von 0.95 g des oben erhaltenen Pentapeptidhydrazids in 10 ml 90%igem Tetrahydrofuran wird mit 2,75 ml eiskalter 1 η-Salzsäure und 0.61 ml 2molarer Natriumnitritlösung versetzt, 5 Minuten bei 0"C stehengelassen und hierauf mit 0,38 ml Tnäihylamin auf pH 7,4 bis 7,6 eingestellt. Danach wird die Lösung mit einer eiskalten Lösung von N^c-tert.-Butyloxycarbonyl-i.-lysyl-i -arginyl-i-argininamidtriacetat und 0,42 ml Triäthylamin in 7,5 ml 80%igem Tetrahydrofuran versetzt. Das Triacetat wurde aus 0,92 mMol N'-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxycarbonyl - l - lysyl - N^G - nitro - L - arginyl-N^c-nitro-1 -argininamid durch katalytische Hydrierung nach der in Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 39 (1966), S. 882, beschriebenen Methode erhalten.

Das Gemisch wird 3 Tage bei 4° C stehengelassen und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit 10 ml Äthylacetat und 10 ml 1 η-Essigsäure versetzt und gründlich durchgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Äthylacetatextrakte werden unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingedampft.

Das Konzentrat wird mit wassergesättigtem N-Butanol erschöpfend extrahiert. Der Extrakt wird üben

Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert- Ausbeute 0,85 g; [α]? — 43,1 ± 14° (c = 0,540, 50%ige Essigsäure).

k) ^-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L -glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptoph'/l-

glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-

L-lysyl-L-arginyl-i-argininamid

Eine Lösung von 0,405 g Benzyloxycarbonyl- p - alanyl - L - tyrosyl - L - seryl - L - methionyl -γ- benzyl-L - glutamyl - L - histidyl - L - phenylalanyl - L - arginyl-L - tryptophyl - glycin in 5 ml Essigsäure wird mit 0,5 ml einer 1 η-Lösung von Chlorwasserstoff in Essigsäure versetzt und sofort gefriergetrocknet. Danach wird der Rückstand über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Das erhaltene Dekapeptidhydrochlorid wird in 4 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,104 g N-Hydroxysuccinimid gelöst und mit einer Lösung von 0,186 g Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4 C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat in 100 ml eines eiskalten Gemisches gleicher Teile Äthylacetat und Äther eingegossen. Die erhaltene \ allung wird abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0.435 g des aktiven Dekapeptidesters erhalten.

0,230 gN'- Benzyloxycarbonyl - N' - tert. - butyloxycarbonyl -1 -lysyl-i - prolyl -1. - valyl - glycyl - N* - tertbutyloxycarbonyl -1 - omithyl - N' - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysyl -1 - arginyl -1 - argininamid werden in 90%igem Methanol, das 0,1 ml Essigsäure enthält, 3 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupüse Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0,262 g eines Pulvers. Das Produkt wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.2 ml Triäthylamin versetzt. Hierauf wird die Lösung mit einer Losung von 0,435 g des oben erhaltenen aktiven Esters des Dekapeptids in 1.5 ml Dimethylformamid vernetzt und 45 Stunden bei 4 C stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 100 ml eiskaltes Äthylacetat eingegossen und die ausgeschiedene Fällung abfiltriert. Die Fällung wird mit Äthylacetat und Äther gewaschen, aus Essigsäure lyophilisiert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Es werden 0,662 g geschütztes Octadekapeptid als Rohprodukt erhalten.

0,646 g des geschützten Octadekapeptids werden mit etwa 10 ml Fluorwasserstoff 60 Minuten bei 0 C in Gegenwart von 0.6 ml Anisol und 0,12 g ι-Methionin zur Umsetzung gebracht. Danach wird der Fluorwasserstoff verdampfen gelassen, der Rückstand in eiskaltem Wasser gelöst und die Lösung mit Äthylacetat gewaschen. Hierauf wird die Lösung auf eine Kolonne mit den Abmessungen 1,7 χ 15 cm mit Amberlite CG-400 in der Acetatform gegeben. Die Kolonne wird mit Wasser eluiert, das Eluat stark eingedampft und lyophilisiert. Das erhaltene, von Endgruppen befreite Peptid (0,704 g) wird an einer Kolonne mit den Abmessungen 2,7 χ 32 cm an Carboxymethylcellulose (Serva, 0,56 mÄq/g) mit AmmoniumacetatpufJer (pH 6,5, 2000 ml) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,025 bis 0,6molar Chromatographien. Es werden 10-ml-Fiaktionen auf-

gefangen, und die Absorption bei 280 nir. wird registriert. Die Fraktionen, die einem Absorptionsmaximum (Nr. 153 bis 180) und seiner Schulter (Nr. 181 bis 200) entsprechen, werden gesondert aufgefangen. Der Hauptteil des Lösungsmittels wird unter vermindertem Drucl· bei einer Badtemperatur von 50 bis 55" C verdampft. Die Rückstände werc'en bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Es werden 228 mg (F-I) bzw. 62 mg (F-I!) eines farblosen flockigen Pulvers der beiden Fraktionen erhalten. Die Fraktion F-I (228 mg) wird erneut an Carboxymethylcellulose in einer Kolonne mit den Abmessungen 2,2 χ 27 cm auf die vorstehend geschilderte Weise chromatugraphiert. Das gereinigte Peptid (195 mg. F-I-I) wird aus einem einzigen Absorptionsmaximum erhalten. Eine kleine Schulter des Absorptionsmaximums ergibt 20 mg der Fraktion F-I-2. 62 mg der Fraktion*F-H und 20 mg der Fraktion F-l-2 werden vereinigt, und die chromatographische Reinigung wird zweimal wiederholt. Es wird eine weitere Menge von 46 mg reinem Peptid erhalten. Die Gesamtausbeute an Octadekapeptid beträgt 241 mg.

[_..]·„■ - 55,4 (c = 0.5, 0.1 n-Essigsäurc). UV/£1?""° = 279 ma (EJl 24,4). /sÄ¹ = 288 mμ (EJl 17,8), ·· u . _m;t -> 04 £ Tri-n-butylamin und hierauf mit nächst mit J-V* g ' ^4,.,W₂₅- versetzt. Narh

^^; _l95 _L._Tyrosin:

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_Tetra ^s _hydrofuran _Mmuten bei - 10=C

methylester m ^53

*f ^geben _h„Snd " Stunden bei Raumtemperatu ^Un M^ Hkr?uf wird das Lösungsmittel unter vergeruhrt Hierauf wira^ _{der Rttckstand in}

minderten Drude aoa _χ _Β__&1ζώ

Athylacetat g^^Lnatlösung und Wasser S übeT Natriumsulfat getrocknet. Da-

Nach

werden abfil-Druck getrockne, aus einer

(EJl 25,9). 288πΐμ (Ε',1 25.0).

Das Aminosäureverhältnis im sauren Hydrolysat hat folgenden Wert: Serin 0.83, Glutaminsäure 0.96. Prolin 1,04, Glycin 2,09. Valin 1,00, Methionin 1.03. Tyrosin 1.03. Phenylalanin 0,98. rf-Alanin 0.93. Ornithin 1.11, Lysin 1,95. Histidin 0,97. Arginin 3,07. Das M öl verhältnis von Tryptophan zu Tyrosin im intakten Peptid beträgt spektrophotometrisch bestimmt 1.15:1.

Beispiel 2 a) tert.-Butyloxycarbonyl-^-alanin

8,91 g /f-Alanin werden in 100 ml 1 n-Natronlauge gelöst. Die Lösung wird mit 21,0 g Natriumbicarbonat und 70 ml Dioxan versetzt, auf 50^cC erwärmt und unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 17,2 g tert.-Butylazidformiat in 30 ml Dioxan versetzt. Das Gemisch wird 41,5 Stunden bei 50⁰C gerührt und anschließend auf etwa 100 ml unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird mit Eis abgekühlt und mit 180 ml 4n-Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Die Lösung wird mit etwa 100 ml eiskaltem Äthylacetat extrahiert, der Extrakt über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird aus einer Mischung von Äthylacetat und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 12,66 g vom F. 77 bis 78'C.

55

b) tert.-Butyloxycarbonyl-rt-alanyl-i-tyrosinmethylester

3,48 g ι -Tyrosinmethylester-hydrochlorid werden in 15 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Eiskühlung mit 5 ml 50%iger Kaliumcarbonatlösung versetzt und 40 Minuten im Kühlschrank stehengelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, gründlich mit kaltem Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 2,55 g l.-Tyrosinmethylester. 6;

1,89 g tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanin werden in wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird auf -1O⁰C abgekühlt und unter Rühren zuk7istalle~bei 141 und .42 C. [«]* + 8.2 t n, {c = 1,020, Methanol).

c)tert.-Butyloxycarbony]-/i-alanyl-L-tyrosinhydrazid

2 56 u lert-Butvloxycarhonyl-rf-alanyl-i.-tvr,·.. ··.. methylester werden in 26ml wasserfreiem Am ;.. St und mit 1.7 ml Hydrazinhydrat versetzt Gern sch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur >te, J assen und danach 16 bis 18 Stunden in euter, strang verbracht. Die ausgeschiedenen Kristalk den abfiltnert, mit Äthanol und Äther gev^chc, getrocknet. Ausbeute 2,54 g Nach Urnkr.st. ll,v„ Ls heißem Wasser schmilzt die Verbindung 213.5 bis 215 C. [α]? + 3.6 ± 0.6 U- = 0,978. Essigsäure).

d) tert -Butyloxycarbonyl-^-alanyl-L-tyrosNl

1 -seryl-i -methionmmethylcster 1 1Oe tert.-Butvloxycarbonyl-/<-alanyl-i-t>- χ hvdrazid werden in 7.5 ml kalter 1 η-Sa zsäure ^. Die Lösung wird auf -10 C abgekühlt und ;,, 3 6 ml 2molarer Natriumnitritlosung.versetzt. Nach 4minutigem Stehen wird das gebildete A/.id nut Äther extrahiert, der Ätherextrakt mit kalter Im,,,,or Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über natriumsulfat getrocknet. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei einer Badternper,tür von etwa 10 C eingedampft. Der Ruckstand w.rd in kaltem Acetonitril gelöst und die Losung mit 0 756 g L- Seryl - L - methioninmelhylester versetzt und 48 Stunden stehengelassen. Der L-Seryl-L-meth.oninmethylester wurde nach Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 39 (1966), S. 1171, hergestellt.

Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat und einer geringen Menge Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung wird nacheinander mit kalter 1 η-Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Sodann wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert, die gelatinöse Masse abfiltriert, mit kaltem Äthylacetat und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 1 "Ό4 e Das Produkt wird durch Umfällung aus Athylacetat gereinigt. F. 121.5 bis 123 C: [„]? - 13.H ± 0,6 (c = 0,997, Methanol).

R_f = 0,53 (Dünnschichtchromatographie an SiIikagel im Lösungsmittelgemisch mit Methanol-Essigsäure = 15:85).

e) tert-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-i-tyrosyl-

i.-seryl-i.-methioninhydrazid

0,969 g tert-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-i -tyrosyli. - seryl - l - methioninmethylester werden in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 0,5 ml Hydrazinhydrat versetzt und 43 Stunden in der Kälte stehengelassen. Danach wird die Lösung mit Äthylacetat versetzt. Hierbei fällt eine gelatinöse Masse aus, die abfiltriert, mit kaltem Äthylacetat gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute 1,01 g. Nach Umkristallisation aus Wasser schmilzt die Verbindung bei 186.5 bis 18SC [a]i^; - 20,1 ι 0.5 ύ = 1,346. 50%iges Methanol).

f) tert.-Butyloxycarbonyl-zi-alanyl-i -tyrosyli-seryl-i-methionyl-r-tert.-butyl-L-glutamyl-

l -histidyl-i -phenylalanyl-i -arginyl-i -tryptophylglycin

0.452g ten.-But}loxycarbonyl-,-i-alan}l-i_-t\ros\!- L - seryl -1 - methioninhydrazid werden in 4,5 ml 90%igem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird in einer Kältemischung aus Eis und Kochsalz abgekühlt und unter Rühren mit 2,0 ml eiskalter 1 η-Salzsäure sowie 0,825 ml 1 molarer Natriumnitritlösung versetzt. Nach etwa 4 Minuten werden 20 ml eiskalte gesättigte Natriumchloridlösung zugegeben, und das gebildete tert-Butyloxycarbonyl-tetrapeptidazid wird mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit eiskalter 5%iger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

0,496 g -/-tert.- Butyl -ι -glutamyl-i -histidyl-i -phenylalanyl-L-arginyl-i-tryptophyl-glycin-acetat (hergestellt nach der in Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 38 (1965), S. 1148, beschriebenen Methode) und 0.21 ml Triäthylamin werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung des oben erhaltenen Azids in Äthylacetat versetzt und das Äthylacetat wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 10 bis 15^CC abdestilliert. Die erhaltene klare Lösung wird 16 bis 18 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Nach nochmaliger Zugabe von aus 0.226 g Tetrapeptidhydrazid hergestelltem Azid zur Lösung wird das Gemisch im Kühlschrank 16 bis 18 Stunden stehengelassen.

Anschließend wird das Gemisch tropfenweise in 200 ml eiskaltes Äthylacetat unter Rühren gegeben. Die gebildete Fällung wird abfiltriert. Ausbeute 0.691 g rohes Dekapeptid, das aus einer Mischung von Dimethylformamid und Methanol (2:5) umgefällt und aus Essigsäure lyophilisiert wird. Ausbeute 0,454 g eines Pulvers. Die Dimnsctochtchromatographie des Produktes an SiUkagd ergibt einen einzigen Reck mit einem R_rWert von 0,54 bis 0.57. [«]? - 19.4 i 0.7 (c = 0,882, Dimethylformamid).

Gemäß Beispiel 1 k) wird tert-Bntyk>x\carbony!- ß - alanyl - L - tyrosyl - L - seryl -L- methion y 1 - γ - tertbutyl-L-glutamyl-i -histidyl-L-phenylalanyl-i -arginyl·- L-tryptophyl-glycin mit N*-tert-Bntyloxycarbonyl-L - lysyl -1. - prolyl - L - valyl - glycyl - N - tert - but \ k>x> carbonyl - L - ornithyl - N¹ - tert. - butyloxvcarbonyl·- L-lysyl-L-arginyl-L-argiriinamid kondensiert, und das erhaltene geschützte Octadekapeptid wird mit Fluorwasserstoff zur Umsetzung gebracht and von den Schutzgruppen befreit. Nach chromatographischer Reinigung erhält man das β - Alanyl - l - ryrasyi-L-seryi-L-nietnionyl-L-giutamyl-L-bistidyl-L -phenylalanyl-L-argmyl-L-üTptophyl-giycyl-L-lvsyl-L-prolyl- L - valyl-glycyl - L - ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid. Dieses Produkt ist identisch mit dem im Beispiel 1 k) erhaltenen Octadekapeptid.

B e i s ρ i e 1 3

0,5 mg [β-Ala¹, Om¹⁵]-ACTH(I -18)-NH₂-acetal werden in 0,25 ml 40millimolarer Zinkchloridlösung bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird mit ίο 0,25 ml einer 40millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt die 4,5 mg Natriumchlorid enthält. Man erhält eine Suspension des Zinkkomplexes, die mit 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt wird.

Bei s ρ i e 1 4

0,5 mg fji-Ala¹, Om¹⁵]-ACTH(l-18)-NH₂-acetal werden in 0,15 ml destilliertem Wasser gelöst Die Lösung wird mit 0,1 ml einer Lösung von Po1y-i.-glutaminsäure versetzt (0,5 mg; Molekulargewicht 150t bis 2000). Diese Lösung wurde vorher mit 0,1 n-Natronlauge neutralisiert. Das Gemisch wird mehrere Minuten gerührt, danach mit 0,25 ml eines m 30- Phosphatpuffers versetzt, der 4,5 mg Natriumchlorid ent hält. Der erhaltene Komplex wird mit 0,1 n-Natron lauge auf pH 7,0 eingestellt

Beispiel 5

1,0mg OAla'.Orn^I5]-ACTH(l-18)-NH₂-aceta! werden in 0,2 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lö sung wird unter Rühren mit einer Lösung von Poly !.-asparaginsäure versetzt (2 mg, Molekulargewich etwa 3000). Diese Lösung wurde vorher mit 0,3 m 0,1 η-Natronlauge neutralisiert Es bildet sich ein« weiße Fällung. Diese Fällung wird mit 0,5 ml einei Lösung von m 15 Dinatriumhydrogenphosphat Ka liumdihydrogenphosphatpuffer vom pH 6,8 versetzt der 9,0 mg Natriumchlorid enthält, und mit 0.1 n-Na tronlauge auf pH 7,0 eingestellt

Beispiel 6

0.5 mg OAla^Om'^-ACTHO-lSJ-NH^aceta werden in 0,15 ml lOOmillimolarer Zinkchloridlösun' gelöst. Andererseits werden 0,5 mg Poly-r -glutamin säure vom Molekulargewicht 2000 bis 3000 mi 0,1 ml 0,1 η-Natronlauge neutralisiert Die Lösung wird mit 4.^5 mg Natriumchlorid sowie 0,25 ml 40milli molarer Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt Die erhaltenen Lösungen werden vereinigt und be Raumtemperatur gerührt Die Suspension des erhal tenen Komplexes wird mit 0,1 η-Natronlauge neutrali siert

Beispiel 7

05 mg [^tf.Oni^ACTHillSJNHjaceta werden in 0,1 ml Wasser bei Raumtemperatur gelös und mit 0.25 ml eines m/15 Kalitnndihydrogenphos pfaat - Dmatriunihydrogenpbosphatpuffers versetzt der 4,5 mg Natriumchlorid enthält 2,0 mg Copoly

*° L - gJutamyl - L - tyrosin (Molekulargewicht 21 850 werden mit 0,15 ml 0,1 η-Natronlauge neutralisiert Die neutralisierte Lösung wird zur erhaltenen Peptid lösung gegeben and gerührt Der erhaltene Komplex wird mit 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,0 .angestellt

Beispiel 8

05 mg |>-Ala¹,Orn^ls]-ACTH<l-I8)-NH₂-acetai werden in 0,1 ml Wasser gelöst und nrit 0^25 m

30953O/53

1 1 ·* J \J KJ

m/15 Phosphatpuffer versetzt, der 4,5 mg Natriumchlorid enthält. 7 mg Copoly-L-glutamyl-L-tyrosin (Molekulargewicht etwa 2! 850) werden mit 0,1 n-Natronlauge neutralisiert. Die neutralisierte Lösung (0,1 ml) wird zu der Lösung des erhaltenen Peptids

gegeben. Zunächst bildet sich eine Suspension, die sofort klar wird. Danach wird die Lösung mit 0,1 mg Natriumsalz der Athylmercurithiosalicylsäure in 0,05 ml Wasser versetzt und mit 0,1 n-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.

Claims

Patentansprüche:

1. Octadekapeptide der allgemeinen Formel I

,i-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-Y-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-argmyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-Z

in der X ein L-Methionin-, L-Norvalin-, L-Norleucin-, L - Leucin- oder α - Aminobuttersäurerest, Y ein L - Glutaminsäure- oder L - Glutaminrest und Z ein L- Arginin-, l - Argininester- oder L - Argininamidrest ist, ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Komplexe.

2. Octadekapeptide nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel

^-AJanyl-j-tyrosyl-L-seryl-L-methionyli-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyli -arginyl-i-tryptophyl-glycyl-i-lysyl-

L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-omithyl-L-lysyl-L-arginyl-Z