DE2438350A1

DE2438350A1 - Peptide mit starker lh-rh/fsh-rhwirkung und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2438350A1
Application number: DE2438350A
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr Geiger; Wolfgang Dr Koenig; Juergen Dr Sandow
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-08-09
Filing date: 1974-08-09
Publication date: 1976-02-26
Also published as: IL47880A; FR2281132B1; SE424184B; JPS5761268B2; SE7805545L; US4024248A; FR2281132A1; NL7509260A; ATA618975A; SE7508926L; AU8374475A; AT364093B; BE832310A; DE2438350C3; NL182051C; IL47880A0; NL182051B; IE41510B1; JPS5148659A; DK361875A

Description

Peptide mit starkor LH-RH/FSH-RH-Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung

Das luteotrope Hormon (LH) und follikelstimuXierenue Hormon (FSH) ausschüttende Releasinghorrrion LH-RH/FSH-RH der Struktur

UGJ u-

His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH

1 2 3^567

9 10

(Biochem. Biophys. Res. Coranun. V3» 133^ (i.97'O) wurde bereits in vielen Positionen Modifiziert. Labe i. fand man, daß durch Ersatz von GIy in der Position C durch D-Alanin (J3?lochemi.stry 12, 4616 (1973)) oder durch Ersatz von" GIy-ΚΉ^ in d^r Position

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durch Äthylamid, Propylamid oder Iaopropylamid.(J. Med. Chem. 16, 11^^.(1973)): die Aktivität gesteigert, wird, Werden die beiden Modifikationen kombiniert, so erhält man Analoga mit noch stärkerer Wirkung (Biochem. Biophys. Res. Commun. J52, 335 (197²J)) Der erfolgreiche Austausch von GIy durch D-Aminosäuren wurde erstmals am Insulin gezeigt (Scientia Sinica XVI, 71-78 (1973))·

Der Ersatz von Glycin, in der Position 6 durch stärker lipophile D-Aminosäuren, wie z.B. D-Valin, D-Leucin oder D-Prolin führte zu Analogen mit geringerer LH-RH-Wirkung (Abstracts of The Endocrine Society 55th Annual Meeting, 1973» Seite A 1 ^5)· · .--, Es war deshalb sehr überraschend, daß der Austausch von Glycin durch stark lipophile unnatürliche D-Aminosäuren, die 'eine tert·-Butylgruppe enthalten, noch stärker wirksame Analoge als die bereits bekannten in ö-Stellung ausgetauschten Analoga ergab.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide der allgemeinen. Formel

i-Glu-His-Trp-Ser-Tyr- X -Leu-A.rg~Pro-Y (l) 1 2 3 4 5 .6. 7 8.. 9 .10-

worin X D-Se^Bu*),. D-TlIr(Bu*), D-Cys(Bu*)i D-ASp(OBu*), D-GIu(OBu ), D-Orn(Boc) oder D~Lys(ßoc) und Y Glycinamid, eine NH-Alkylgruppe, in der der Alkylrest T - 3 C-Atome enthält, bzw. den Cyclopropylrest darstellt und gegebenenfalls durch OH oder Pluoratome substituiert sein kann, oder eine NH-0-CII_o-Gruppe bedeuten und gegebenenfalls Ser durch AIa oder Thr, Tyr durch Phe, Leu^ durch Ser(Bu^t), * * *

GIu(OBu ), Om(Bcc) oder Lys(Boc) und Arg durch Orn, Lys oder Homoarginin ersetzt sein kann.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Peptide, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

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a) durch in der Peptidchemie übliche Fragmentkondensation von Peptidbruchstücken nach dem Kondensationsschema
1_3 + k-10 oder 1-2 + 3-10 oder ■

b) durch stufenweisen Aufbau herstellt,

wobei andere funktioneile Gruppen durch abhydrierbäre, oder im alkalischen oder schwach saurem Medium abspaltbare Schutzgruppen ggf. intermediär blockiert werden.

Besonders lang wirkende LH-RH-Analoga werden erhalten, wenn Leu neben der erfindungsgemäßen Modifikation in Position 6 durch
Ser(Bu*), TlIr(Bu*), Cys(Bu*), ASp(OBu*) OdRrGIu(OBu*) ausgetauscht ist und/oder Y in der allgemeinen Formel I eine- gegebenenfalls durch Fluor substituierte NH-Alkylgruppe von 2-3
C-Atomen bedeutet.

Von großer Bedeutung sind die erfindungsgemäß en Verbindungen, bei denen für X D-Ser(Bu*),, D-TlIr(Bu*), D-CyS(Bu*), D-GIu(OBu*) oder D-Asp(0Bu ) steht. Diese Verbindungen sind oral wirksam: oral wirksame Peptide dieser Kettenlänge waren bisher nicht
bekannt. Das ibt besonders überraschend, da die tert.-Butyläther und tert.-Butylester in saurem Medium instabil sind»

• Als Verbindungen mit dem erfindungsgemäßen Austausch in
Position 6 kommen z.B. folgende LH-RH-Analoga in Betracht:

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123^56 7 89 ίο

ÜGlu-His-Trp-Ser-Tyr- X - Leu -Arg-Pro-Gly-NHg

X -Ser(Bu*) - -NH-CgH,.

X - Cys(Bu*)- -NH-CHgCF

X -GIu(OBu*)- -NH-CHg-CHg-CH.

X -Asp(OBu*)- -NH-CgH-

Phe- X -Ser(Bu*) - -NH-CgH

AIa- - X -GIu(OBu*)- -NH-CgH

X -Ser(Bu*) - -NH-CH CF

X -GIu(OBu*)-Om- -NH-C₀H X -NH-CgH_

X -NH-CH

X -NH-OCH

Von den vorstehend genannten Verbindungen sind diejenige!? von besonderer Bedeutung, in denen X D-Ser(Bu ), D-GIu(OBu ) ur?d D-Asp(OBu ) bedeutet.

Bei der Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen dürren nur Methoden verwendet werden, unter denen die sauer leicht abspaltbaren tert.-Butylreste in Position 6 nicht abgespalten werden.

Bei der Fragmentkupplung nach a) verwendet man vorzugsweise die ohne Racemisierung verlaufende Azidkupplung oder die DCC/ 1-Hydroxybenzotriazol- bzw. DCC/3-Hydroxy-4-oxo-3·4-dihydro-1.2.3-benzotriazin-Methode. Man kann auch aktivierte Ester von Fragmenten einsetzen.

Für die stufenweise Kondensation von Aminosäuren nach b) eignen sich besonders gut aktivierte Ester von Benzyloxycarbonylaminosäuren, wie z.B. N-Hydroxysuccinimidester oder 2.^.^-Trichlorphanylester. und 4-Nitrophenylester. Bie Aminolyso dor beiden J.etzteren Aktivester läßt sich sehr gut durch N-Hydroxyver-

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bindungen, die in etwa die Acidität der Essigsäure besitzen, wie z.B. 1-Hydroxybenzotriazol katalysieren.

Als intermediäre Aminöschutzgruppen bieten sich abhydrierbar« Gruppen wie z.B. der Benzyloxycarboiiylrest (= Z-Rest) oder schwach sauer abspaltbare Gruppen wie z.B. der 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- oder 2-(3.5-Dimethoxyphenyl)-isopropyloxycarbonylrest an. Bei Derivaten, die Cys(Bu ) enthalten, wird der Z-Rest unter Zusatz von Triäthylämin oder N-Äthylmorpholin abhydriert.

Die Guanidofunktion des Arginins kann ungeschützt ,bleiben oder durch eine Nitrogruppe blockiert werden, welche bei der nächstfolgenden Hydrierung abgespalten wird. Sie kann aber auch durch sauer abspaltbare Schutzgi-uppen, wie dem Carbobenzoxyrest oder dem Tosylrest blockiert werden, wobei die Schutzgruppen jedoch spätestens auf der Tetrapeptidstufe abgespalten werden müssen. Im Falle dor Nitro- oder Tosylgruppe ist dies gut mit flüssigem HF/Anisol zu bewerkstelligen. Das Gleiche gilt für einen intermediären Schutz der Amidgruppe durch den sauer abspaltbaren 4.k'-Dimethoxybenzhydrylrest, der auch spätestens auf der Tetrapeptidstufe entweder mit Trifluoressigsäure/Anisol oder zusammen mit einer Guanidoschutzgruppe und/oder einer sauer abspaltbaren Aminogruppe mit HF/Anisol abgespalten wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen gegenüber den 6"G-Iy-, abei- auch gegenüber den 6-D-Ala-Analogen im Ovulationstcst und im Ascorbinsäuredepletionstest eine stärkere und längere WivKung-Die überraschende orale Wirkung (Dosis 0.01 - 0.2 mg/kg) dex' Verbindungen (X = D-SBr(Bu*), D-TLr(Bu*), D-CyS(Bu*), D-G-Iu(OBu*), D-Asp(0Bu )) eröffnen diesen Arzneimitteln einen Aireiteren Anwendungsbereich als den bis jetzt nur parenteral oder nasal applizierbaren LH-RH. Sie stellen neuartige Arzneimittel dar, die bei Hypothalamus- und Hypophysen-Insuffizienz die Ausschüttung des luteinisierenden und des follikelstimulierenden Hormons aus dem Ilypophysenvorderlappen bewirken und irerden deshalb zur Behandlung vcn weiblicher und männlicher SterilitäT: ver-

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wendet, soweit diese hypothalamisch-hypophysären Ursprungs ist. Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen Substanzen ist die Festlegung des Ovulatxonszeitpunktes bei der Frau. Kurz vor dem erwarteten Ovulationszeitpunkt kann durch Applikation der neuen Arzneimittel eine Ovulation sicher ausgelöst werden. Das ist von Bedeutung für die Familieriplanung sowohl nach der Methode Knaus-Ugino als auch für die künstliche Insemination.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gelöst in physiologischer Kochsalzlösung intravenös, intramuskulär oder subcutan applizierbar, können intranasal in Form von Nasentropfen oder Nasenspray und auch oral angewendet werden.

Die bei verschiedenen Anwendungsarten bevorzugt angewandten Dosierungen sind:

intravenös	20 -	1000	ng/kg
subcutan	20 -	2000	ng/kg
intramuskulär	20 -	10 000	ng/kg
intranasal	100 -	50 000	ng/kg
peroral	10 000 -	200 000	ng/kg

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Verfahrensvariante a)

Reaktionsschema 1

1

2

3

T

rp

Z

h '

5 6

17

r . ■ β

"ε Ρ

ro

10

(Beispiel 1 und 2)

(Beispiel 6)

G¹J

H.

Ser

fc 3

Zi

ί Ai

f

= NH-C₂H (Beispiel 3)

Z

. ' Z^J

■V 1 Cp JtI

NH-Cyclopropyl (Beispiel 5)

H

OTcpH·

NH-OCH

Z
r/

BzI

/i

/

.nu τι.

^N3

BzI

und Y =

*) und Y

Ls

und Y =

!Reaktionsschema 2

NH-C₂H

Lu

Leucin

Ser(Bu

Leucin

¥ =

¥ -

¥ =

His

Trρ Ser Tyr

OH H

Z-

N H-

OTcp H-

Leu Arg Prc GIy-NII₀ NO₂

'OH H-I- h-NK-Mbh

N0„

-XH-Mbh

-NH.

-NH

-N7L

/8

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Abkürzungen:

BzI Boc Bu* DCC

Benzyl tert.-Butyloxycarbonyl Tert.-Butyl Dicyclohexylcarbodiimid Pyroglutaminsäure 1-Hydroxybenzotriazol k, k¹ -Diine thoxybenzhydrol tert.-Butylester p-Nitrobenzylester N-Hydroxysuccinimidester 2.4.5-Trichlorphenylester 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-berizotriazinester Benzyloxycarbonyl

COPY

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Beispiel 1 (analog; Reaktion-sscaeMa 1): 2 43 83 5 0

I-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu*)-Leu-Arg-Pro-ITH-C₂ E₅ a) Z-

Zu einer Lösung von 8.9 g (50 ml-iol) H-PrO-IIH-C₂H₅-HCl, 28.9 S (50 mMol) Z-Arg(Z₂)-0H und 6.75 g (50 mHol) HOBt in 150 ml" Methylenchlorid gibt man bei 0° C 6.5 ml N-A'thylmorpholin und 11. g DCC, läßt 1 Stunde bei 0⁰C rühren und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag v/ird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand v/ird zwischen Essig— ester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase v/ird nacheinander mit gesättigter NaHCO₅-LOsUHg, 2n H₂SO₁,, gesättigter NaHCO₃-Lösung und mit V/asser ausgeschüttelt, über ITa₂SO₁, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand v/ird in Isopropanol gelöst. Kit Petroläther wird daraus ein öl gefällt, das überNacht kristallisiert. Ausbeute 27.8 g (SO ?-'), Schmp. 82-85⁰C ^{2 =} -5°·°° (^c=1> Methanol)

b) H-Arc--Pro-i:H-C₉ H_q -2HC1

39.7 g (56.7 ml'iol) Z-Arg(Z₂ )-PrO-EH-C₂ Ii₅ werden in 200 ml Methanol gelöst. Dazu gibt man eine opatelspitze PcI/BaSO^- Katalysator und hydriert indem man unter Rühren Wasserstoff durch die Lösung leitet. Der pH der Lösung v:ird mit Hilfe eines Autotitrators durch Zugabe von In methar.oliseher Salzsäure auf 4.5 gehalten. Der Katalysator wird nach beendigter Hydrierung' abgesaugt und das Fiitrat eingeengt. Der Rückstand v/ird mit Äther verrieben und abgelaugt. Ausb. 17.9 S amorphe Substanz (85 So), [a]^° = -26.0° (c«l, Methanol) .' . " - .' ' ' .

c) Z-Ser-Tyr(BzI)-CE

Zu einer Suspension von 5.52 g (20 rcHoi) H-TyT(BzI)-GE in 60 ml Dimethylacetarr.id gibt man 7.68 g Z-Ser-OOEt? und rührt sechs Stunden bei Räumtomperatur. Von Ungelöstem v/ird abgesaugt und das auf O⁰C abgekühlte FiItrat mit 3GO mi Wass.er vers-etzt. Der niederschlag wird abgesaugt, mit Dinethylacetamid/V/asser-Kischung (l:±0) und Wasser gev/aschen und mit In H₂SO₁, verrüiirt. IT^un v/ird wieder abgesaugt rnd rät l/asser gewaschen und getrocknet. Aus ^ssigect&r/Ictroläth^r wird urnkristallisiert. Ausbeute 7.35 g (75 f.'·)» Sch~rj. 156°C,

3° = +20.9° (c=l, Metnanol) COPY |

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BAD ORIGINAL /10

Zu einer Lösung von 11.2 g (30 mKol) E-Arg-Pro-NK-C₂H₅-2HC1 in 50 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° 7.3 ml K-Athylmorpholin und 8.25 g Z-Leu-0N3u. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand je ein mal mit Essigester und Äther. Man dekantiert die Lösungsmittel ab und trocknet das öl im Hochvakuum. Der Rückstand (20.0 g) wird in Methanol gelöst und analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Es entstehen 16.1 g amorphes H-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅·2ECl, das durch Salze verunreinigt ist (14.5 g = 100 0 bezogen auf H-Arg-Pro-ICH-C₂ K₅ -2EC1) . 2.4-5 S dieser Substanz v/erden zusammen mit 675 mg HOBt, 1.3 nl N-Äthylmorpholin und 2.4 g Z-D-Ser(3u^t)-O0?cp in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen, engt anderntags ein, verreibt den Rückstand 2 mal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, löst in Kethylenclilorid, trocknet über Na₂SO,,, engt ein und verreibt den Rückstand mit Auher» Ausbeute 2.3 g (71 % bezogen auf H-Arg-Pro-NH~C₂H₅ »21101), Schmp. 85-116°C.

e) E-Ser-^7r-D-Ser(3u^t)-Leu-Arfr-Pro-i:E-C,.S, »2 HC].

2.3 g (3·33 mKol) Z-D-Ser(Bu )-Leu-Arg-Frο-FH-C₂ Ii₅ werden in Methanol gelöst und analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausb. 1.93 S amorphes Material (93 /'). Obige 1.95 g (3-1 mKol) B-D-SeriBu^-Leu-Ärg-Pro-l-H-Ca^ -2K01 v/erden zusammen mit 1.53 g (3.1 mfcol) Z-Ser-Tyr(BzI)-OH, 420 mg HOBt und C.8 ml N-ÄthylmorpLoliri in 7 el Dimethylformamid suspendiert. Bei 0⁰C gibt man 680 mg DCC zu und läßt 1 Stünde bei O⁰C rühren und über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird anderntars abgesaugt und das Filtrat eingeengt, Der Rückstand wird zwei mal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung verrieben, in Methylenchlorid relöct und die Lösung über Ea₂ SO* getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Es resultieren 2,65 Z (= 2.57 mi.öl Z-Ser-a?yr(Bzl)-I)-^er(:3u^r)-Leu-,.r-;-rro-:;H-C_?iJ₅ ) einer amorphen Substanz, die analog Beispiel Ib katalytisch hydriert wird. Der Rücketand wird mit A'tiier verrieben und axs

Hochvakuum getrocknet. ^«,«^

COPY

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Ausbeute 2.2 g amorphes H-3er-i'yr-D-3er(Bu )-Leu-Ar£:-Pro-i;ii-C₂ h₅ '2RCl (= 2.5 mHcl = 75 £ bezogen auf Z-D-Ser(3u )-Leu-Arg-Pro-1IH-C₂H₅ ). ..

Für eine analytische Probe v/erden 1.3 g auf unten beschriebener Verteilungschromatographie-Säule gereinigt.

Aufbau der Säule: 400 ml Eisessig, 800 ml n-Butanol und 4 Liter Wasser werden geschüttelt. 300 ml der oberen Phase werden mit 240 g Sephadex LH 20^ ' verrührt. Dabei wird das gesamte Lösungsmittel aufgesaugt. Diese so vorbehandelte Säulenfüllung wird in einer entsprechenden Menge der unteren Phase suspendiert. Man läßt 3 Stunden quellen und füllt die Säule (Im χ 4 cm). Mit der unteren Phase wird eluiert. ' .

Ausbeute an chronatographisch reiner Substanz: 562 mg ² = -43.9° (c=l, in Methanol)

f ) ^LGlu-His-Tr-p-3er-Tyr-D-Ser(Bu )-Leu-Ar^-Pro-NH-C;, Hr, -diacetat

Zu einer Lösung von 500 mg ·-GIu-His-Trp-EE-ITHj in 6 ml Dimethylformamid gibt man bei -JiC⁰C 0.66 nl einer 6.05 π HOl/Dioxan-Lösung und 1.2 ml einer 10-proz. tert.-Butylnitrit-Lösung in absolutem Dioxan. Man läßt 20 Minuten bei -1G°C rühren und gibt bei -40⁰C 877.8 mg rohes H-Ser-Tyr-D-!Ser(Eu*)-Leu-Arg-Pro -KH-C₂H₅-2HCl und 0.78 ml K-Xthylnorpholin zu. Man läßt über Kacht im Kühlraum bei 4⁰C stehen, engt ein und verreibt den Rückstand mit A'ther. Die Substanz wird in Wasser gelöst und über Dowex ^ν1χ2 (Acetat-Form) chromatographiert. Das Sluat wird eingeengt u"nd über eine CarDoxymethylcellulosesaule (90 χ 1.5 cm), die mit 0.002 m KH₁, -acetat-Lösung äquilibriert ist, gereinigt. Die Substanz wird gelöst in 0.G02 m ITH₁, -acetat-Lösung aufgegeben, fluiert v/ird mit einer 0.002 π EH^-ace^^t-Lösung, der ein Gradient einer 0.1 m NH^-acetat-Lösung angelegt wird (Mischvolumen 250 ml).

Die Fraktionen, die das gewünschte Peptid enthielten wurden zwei mal gefre-irgetrocknet. Ausb. 401 mg chronatographisch reine Substanz. Der Gehalt an Peptidbase is I; laut UV-Spektrum 76 % (Ausb. 25 D- [a]J}⁰ = -40.4° (c=l, in Dirnethylacetamid)

COPY , /12

BAD ORIGINAL

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g) ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Scr-L^u-Ars-ΐ'ΓO-l·Ή-σ■, E, -diacVtat (als Vergleichssubstanz)

200 mg ^Glu-Eis-irp-Ser-Tyr-D-SerCBu )-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ diacetat werden mit 0.1 ml Mercaptoäthanol in 2 ml Trifluoressigsäure gelöst. Man läßt 1 Stde. bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Die Substanz wird abgesaugt und mit Äther gewaschen, in Wasser gelöst und über Dowex 1x2 (Acetatform) chromatographiert. Das Eluat wird eingeengt und der Rückstand analog Beispiel Ie an Sephadex LH 20 gereinigt. Ausbeute 120 mg. Der Gehalt an Peptidbase ist laut UV-Spektrum 77.5 #. [^a]p° = -4-3.7° (c=l, E₂O)

Beispiel 2 (analog Reaktionsschema 1): ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(OBu^t)-Leu-Arg-Pro-ITH-C₂ H₅ a) Z-D-GIu(OBu¹Q-Leu-Ar g-Pr ο-ΓΤΉ-C? Ης

2.45 g durch Salze verunreinigtes H-Leu-Arg-Pro-l!lI-C₂ H₅ «2HC1 werden analog Beispiel Id mit 2.6 g Z-D-GIu(OBu )~OTcp, 675 mg HOBt und 1.3 ml N-Äthylmorpholin in 20 ml Dimethylformamid umgesetzt. Ausbeute 2.75 g (81 % bezogen auf F-ATg-PrO-KH-C₂H₅ •2HG1), Schmp. 83-100⁰C.

b) H-Ser-Tyr-D-Glu(OBu^)-Leu-Arg-Pro-M-C, H_c -2EOl 1.85 g (2.53 mMol) Z-D-GluiOBu^-Leu-Arg-Pro-NH-C^L; werden analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben'und abgesaugt. Ausbeute 1.7 g (99.5 %).

Obige 1.7 g (2.5 mMol) H-D-GIu(OBu*)-Leu-Ärg-?rο-IHT-C₂H₅ -2HCL werden analog Beispiel Ie mit 1.23 S Z-SBr-C¹Jr(BzI)-OH, 34-0 mg HOBt, 0.65 ml N-Äthylmorpholin und 550 mg DCC in 5 ml Dimethylformamid umgesetzt. Ausbeute 2.8 g leicht verunreinigtes Z-8er-a?yr(33l)-D-Glu(O3u^t)-Leu-Arg-Pro-i:K-C₂H₅ , das analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch hydriert wird. Die Rohsubstanz wird analog Beispiel 2e verteilungschrcmatographisch gereinigt. Ausbeute .1.108 g chronotocraphn sch einheitliches Produkt (47 '.- bezogen auf Z-I'-Glu(CBu^t)-Leu-Arg-Pro-iai-C, H₅^. W^{2 =} ~⁴²·3° (c=l, in Methanol)

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- ¹³ " 2 4 3_8 3 5

c) LGlu-His-Trp-Ser-^r-D-GlufOBu^-Leu-Ars-Pro-KE-C, Η_ς -diacetat Analog Beispiel If werden 500 mg LGIu-HiS-TrP-IIH-IiH₂ mit 920 mg (1 mMol) H-Ser-Tyr-D-Glu^Bu¹⁷)-Leu-Arg-Pro-NH-C₂ H₅ ·2KCl umgesetzt und chromatographisch gereinigt. Ausbeute 491·5 chromatographisch reines Material. Der Gehalt an Peptidbase ist laut UV-Spektrum 79 % (Ausbeute 30 #). ⁼ "5¹^⁰ (c=l» Dimethylacetamid)

d) ^lu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu-Leu-Arg-Pro-IIH-C-, ?I_q -diacetat (als Vergleichssubstans)

ί—^f t

190 mg -Glu-His-Trp-Ser-^fTyr-D-Glu(OBu )-Leu-_Arg-Pro-NH-C₂ H₅-diacetat werden analog Beispiel Ig umgesetzt und gereinigt. Ausbeute 148,9 mg. Der Gehalt an Peptidbase ist laut UV-Spektrum 85 S. [a]^² = -4-7-8° (c=l, in H₂O).

Beispiel 3 (analog Reaktionsschema 1):

Γ¹ t t -

'-Glu-IIis-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu )--Ser(/ßu )~Arg-Pro-NII-C₂ H₅

a) H-Ser(Bu¹Q-ArS-PrO-NH-C, K; -2HC1

Zu einer Lösung von 2.23 g (6 rnMol) H-Arg-Frο-MH-C₂ K₅ ·2HCl und 810 mg HOBt in 10 ml Dimethylformamid gibt man 1.56 Di Π-Athylmorpholin und 3.12 g Z-Ser(Bu ')-OTcp und rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach v/ird im Vakuum, eingeengt, der Huckst and in Essigester gelöst und die Lösung zv/ei mal mit gesättigter NaHCO₅-Lösung ausgeschüttelt, über TIa₂SO₁, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand v/ird mit A'ther verrieben und ara Hochvakuum, getrocknet. Es werden 2.3 g amorphe Substanz erhalten, die" analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch hydriert werden. Ausbeute 2.7 g (81 f.) amorphe Substanz. Dünnschichijchrorr.ato— graphisch nicht einheitlich (durch etwa 5 Nebenprodukte verunreinigt).

b) H-D-Ser(3u^L)-3er(BuQ-Arg-Pi-o-i:H-C_vH^ .2FGl

Zu einer Lösung von 2.57 & (5 ral-iol) H-3er(Bu"')-Arg-Pro-1IH-C₂ • 2HC1 und 675 rr.g HOEt ir. 5 ml Dime thyIf ormarnid gibt nan bei O⁰C 1.3 ml K-A'thylmorp.^olin und 2.37 g Z-O-SeriBu^-O.Tcp zu· Man läßt über Nacht stehen, enrrt ein und loet den AÜckptann. in Essigester. Mit gesättigter ITc-.HCu₅ -.Lesung Vird 2-raal auspe-BADORlGiNAL 609809/1006 " COPY /14

schüttelt, über Na₂SO₁, getrocknet und eingeengt. Der· Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum, getrocknet. Ausbeute 2.3 g einer amorphen Substanz, die analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch hydriert wird. Der Rückstand wird mi"c · Äther verrieben* Ausbeute 2.G5 5 einer amorphen Substanz

-L.

(62 ^c/j bezogen auf Z-D-.3er(3u°)-CTcp. Die Substanz wird ohne weitere Reinigung v/eiterverarbeitet.

c) H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu^t)-Ser(3u^t)-Ar!r-Pro-r~!-0p E, «2I-IC1

j. j-

Zu einer Lösung von 2.0 g (3 mMol) H-D-Ser(Bu )-Ser(Bu⁰)»Arg-Fr ο-HH-C₂H₅·2HCl, 1.5 g Z-3er-Tyr(Bzl)-CH und 405 mg HOBt in 5 ml Dimethylformamid gibt man bei 0⁰C 0.7S ml IT-itthylmorpholin und 660 mg DCC* läßt 1 Stunde bei O⁰C und über ITacht bei Raumtemperatur stehen. Der niederschlag wird abges.augt und das ITiltrat eingeengt. Der Rückstand wird in Essii'.ester gelöst und drei mal mit gesättigter HaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt· Der Essigester wird ohne Trockneω eingeengt, da bereits das Peptid ausfällt. Das resultierende Cl v/ird analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Hydriert v/ird in einer Mischung aus Methanol und Dimethylformamid. Das Rohprodukt wird analog Beispiel Io chromaOographisch gereinigt. Ausbeute 957 rag (35 ^c/~ bezogen auf Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH) einer amorphen Substanz. T]² = -33-8° (c=l, in Methanol).

dl

diacetat

Γ'

Analog Beispiel If -werden 250 ngji-Glu-His-Trp-IIE-KB^ mit 454 ng: (0.5 mMol) FI-Ser-l'yr-D-Sei^Bu*)-SBr(Bu¹^)-ArS-PrO-Kr-C₂ K₅ umgesetzt und clironiatographisch gereinigt. Ausbeute 321 mg. Der Gehalt an Peptidbase ist laut UV-Spektrum 75.5 ?-' (38 fs Ausbeute).

Γ ^l Ό f

L^aJD°-~ ~2^»9° (c=l, in Dimethylacetamid)

Beispiel 4 (analog Seraktionsschema_j_)j_

Krlu-iiTs-Trp-Ser-'i'.yr-D-ljy s (Boc)-Leu-AT*p;-Pro-GIy-ITH₂

a) Z-Pro-Gly-ni-l-ibh

Zu einer Lösung von 30.5 g (Cl Mol) Z-PrO-GI^-HH₂ und 24 g

₂ (0.1 Hol) 4.4'-DimGtliOxyben2hyd.rol in 2CO ml Eisessig gibt ca:i BAD ORIGINAL 6098 09/1006 COPY \

0.5 ml kons. H₂SO,, und läßt cir.cn Tag bsi Eaumi emperatur .stehen, Anschließend wird mit 850 ml Wasser ein öl ausgefällt, das im Laufe von 24 Stunden kristallisiert. Die Substanz wird abfiltriert und in Essigester gelöst. Die Essigesterlösung wird zwei mal mit gesättigter NaKGO₃-Lösung ausgeschüttelt, mit Na₂ SO₁, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird aus Sssigester/Petroläther kristallisiert. Ausbeute 46.3 g (87 /j) ■> Schmp. 108⁰C, [a]^⁰ = -9-7⁰Cc=I, in Dimethylacetanid).

b) H-Fro-Gly-lTH-Kbh«HCl

45 g (84.7 ΐηΓΊοΙ) Ζ—Pro-Gly-EH-Hbh werden analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch hydriert. Der Rückstand wird-mit Ä'tber verrieben. Ausbeute 33-7 C (91.5 ^)» Schnp. 233^CC. Eine Probe wurde zur Analyse aus Methanel/A'ther um^efällt: Schmp. 236°, ⁰ = -24„7° (c=l, in Dimethylacetamid)

c) Z-Leu-ArrC FC₉)-OR

Zu einer Lösung von 24.8 g (G.1 Mol) Z-Leu-OH, 26.9 g (0.1 Hol) H-Arg(l-iO₂ )-OMe-HCl und 13.5 S H03t in 200 ml Dimethylformamid gibt man bei 0⁰C 13 ml N-A'thylmorpholin und 22 g DCC. Man rührt 1 Stunde bei 0⁰C und läßt über Nacht bei Rauntemperatur stehen. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand in Sssigester aufgenommen. Die Essigesterphase wird: mit gesättigter UaHCC₅-Lösung , 2n H₂SO₁,, gesättigter NaIICO₃-Lösung und «'asser ausgeschüttelt, über TTa₂SOj₁ getrocknet und eingeengt. Mit Diisoprcpyläther wird die^Substanz verrieben. Zur weiteren Reinigung wird die Substanz in Essig-' ester gelöst und über basisches Al₂ O₅ chromatographiert» Ausbeute 23.05 g amorphe Substanz.

19.2 g (40 mKol) oben gewonnener Substanz v/erden in 80 ml Dioxan gelöst. Dazu gibt man 16 ml Wasser und eine Spatelspitse Thymolphthalöin. Unter Rühren läßt man In Natronlauge bis zur bleibenden Blaufärbung langsam zutropfen (Verbrauch 57-7 ml). Nun wird neutralisiert, eingeengt und der Rückstand zwischen Essigaster und 2n HCl verteilt. Die Essigesterphase v/ird mit Wasser gewaschen, mit J\a_? BGi, getrocknet und eingeengt. Hit Diisopropj^Tläther wird verri oben und ab^csauct. Ausbeute 15.75 ns Schmp. 147-155°C, [ci]ip = -3.6° (c=l, Dirne i;hy Iac et andd) . -

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BAD ORIGINAL

d) Z-Leu-ArsCrOj, )-Pro-Gly-im-Hbh

Zu einer Lösung von 4.66 g (IO mMol) Z-Leu-Arg(NO₂ )-OH, 4. 34- g H-Pro-Gly-KH-Mbh-HCl und 1.35 g HOBt in 30 ml Dimethylformamid gibt man bei 0⁰C 1.3 ml N-Äthylir.orpholin und 2.2 g DCC. Man läßt 1 Stunde bei 0⁰C und über ITacht bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und fällt aus dem ^'iltrat mit Wasser eine Substanz, die in iSssirvester gelöst wird. Die Essigester— lösung wird mit gesättigter NcHCO₃-Lösung, KHSO₁,-Lösung und Wasser ausgeschüttelt, über Ka₅, SOf, getrocknet und eingeengt. Ausbeute 6 g, Schrap. 89-93°C, [a]Jp = -21,7° (c=l, in Dimethylacetamid). · -_t

e) H-Leu-Arp;-Pro-GIy-NK? «2HF

6 g Z-Leu—^rg(KC₂ )-Pro-GIy-NK-föbh und 12 ml Anisol v/erden mit 120 ml HF versetzt. Man rührt 1 Stunde bei 0⁰C, zieht iin Vakuum das HF ab und verteilt den Rückstand zwischen Wasser und Zither. Die ätherische Phase wird ein mal mit Wasser ausgeschüttelt. Die vereinigten Wasserphasen werden mit Äther gewaschen und gefriergetrocknet. Ausbeute 3.35 g einer amophen Substanz. ¹⁰ C^Cssl» ^{in H}2°)

f) H-D-Tjys(Boc)-Leu-Arr;-Pro-Gl7-EP, -2HCl

Zu einer Lösung von 2Λ g (5 mMol) H-Leu-^rg-Pro-GIy-NH₂ -2EF und 675 mg HOBt in 5 ml Dimethylformamid gibt man bei 0⁰C 1.3 ml N-Äthylmorpholin und .2.8 g Z-D-L.ys(Boc)-OTcp. Man läßt 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand zwei mal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Ka₂SO₄ und engt ein. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 3-1 g (77 &) amorphes Material. Diese Substanz wird analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 2.67 S (7M- tf bezogen auf Z-D-LyS(BoC)-C¹TCp) amorphes Material. Dünnschichtchromatographisch nicht einheitlich (verunreinigt durch 2 Nebenprodukte).

/17

COPY 609809/1006 y original

2A38350 - ¹? -

g) H-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Boc)-Leu-ArK-Pro-Gly-KHi> -2HC1 ...

Zu einer Lösung von 2.23 g (3.7 ml-iol) Z-Trp-3er-Tyr-UE-NH₂ in 25 ml Dimethylformamid gibt man bei -3O⁰G 2.4-4- ml einer 6.05n HCl/Dioxan-Lösung und 4.4-5 ml einer lO-proaentigen tert.— Butylnitrit-Lösung in absolutem Dioxan. Man läßt 20 Minuten bei -10⁰C rühren und gibt bei -40⁰G 2.9 ml ir-Äthylmorpholin und 2.67 g (3.7 mMol) H-D-Lys(Boc)-LeU-ArS-PrO-GIiZ-ITE₂ zu. Man läßt über Nacht im Kühl-raum bei 4°C stehen, engt ein und verreibt den Rückstand mit Ä'ther. Analog Beispiel Ib wird katalytisch hydriert und die Rohsubstanz analog Beispiel Ie an Sephadex: LH 20 chromatographisch gereinigt. Ausbeute an reiner amorpher Substanz. I.3 g (30 ?'■>) .

h) ^LGlu-His-TrO-Ser-T^r-r>-L,yo(3oc)-Lev-Ar,s:-Pro-G]y~NH, -diacetat

Zu einer Lösung von 590 mg (0.5 mMol) E-Irp-Ser-Tyr-D-Lys^oc) Leu-Arg-Pro-Gly-HE> ·2Η01, I5I mg (0.5 mi-Iol) *-Giu-His-OH und I35 mg HOBt in 5 ml Dimethylformamid gibt man bei O⁰C 0.13 ml K-A"thylmorpholin und 110 mg DGC. Han läßt 1 Stunde bei O⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur stehen, saugt den fticderschlag ab, engt ein, und verreibt den Rückstand mit Äther, han löst in " Wasser, filtriert von unlöslichem und reinigt analog Beispiel If über Dowex 1x2 und Carboxymethylcellulose.. Anschließend wird noch über Sephad.ex LK 20 analog Beispiel Ie gereinigt. Ausbeute 155 mg. Der Gehalt an Peptid ist laut UV-Spektrura 76 >i (17 ⁰A .Ausbeute). [cx]ip = -39° (c=l, in Dimethylacetamid). ·

COPY . J 609809/1006 BAD ORIGINAL

Beispiel 5 (analog Reaktionsschema 1): . -

■ "-Glu-His-Trp-Ser-'Tyr-D-SerCBu )-Leru-Arg-Pro-cyclopropylamicL

a) Z-Pro-cyclopropylamid ' _

Zu einer Lösung von 25 g (0.1 Mol) Z-Prolin, 13.5 g (0.1 Hol) HOBt und 5.71 g (0.1 Mol) Cyclopropy-lamin in 2CO ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man bei 0⁰C 22 g DCC, gelöst in 50 ml kaltem absolutem Tetrahydrofuran. Man läßt eine Stunde bei ü°C und drei.Stunden bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der ölige Rückstand wird in Sssigester gelöst und nacheinander mit gesättigter ITaHCO₃-Lösung, 2n HCl, KaHCO₃-Lösung und V/asser ausgeschüttelt, über Na₂SOj, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben und abgesaugt. Zur Reinigung wird aus ,Essigester/Petroläther unkristallisiert. Ausbeute 23 E (- 80 f-0 . Schmp,- 120-125°, [ex] ^" = -45.5^C (c=l, in Methanol)

b) E-Fro-cyclopropylamid«HG1

Analog Beispiel Ib werden 19 g Z-Pro-cyclopropylamid in Methanol katalytisch hydriert. Der Rückstand wird: mit Xther verrieben. Ausb. 11 g (88 ^). Schmp. 169-173°C.

c) Z-ArgCZ? )-Pro--cycloOroT7, ^rla!::id

Zu einer Lösung von 28.85 g (50 ml-iol) Z-Arg(Z₂ )-0H, 9.5 g (50 mNol) E-Pro-cyclcpropylamid.HCl und 6.75 S (50 nl-iol) EOBt in 100 ml Methylenchlorid und 25 ml Dimerhylxormanid gibt r.ian 6.5 ml IT-Äthylraorpholin und bei 0° eine Lösung von 11g 'DOO in wenig Methylenchlorid. Kan läßt eine Stunde bei O⁰C und über I-Tacht bei liauntemperatur stehen. Der i-Tiederschlag wird abgesaugt und das Filnrat eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und mit V/asser, ITaIiCO₅ -Lösung, In HCl,und. ITaHCO₃-Lösung gev/aochen, nit Na₂SO₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand kristallisiert aus Essigester/Petroläther. Die Rohsubstan? (26.J g) wird an einer 250 g-Kieselgelsäule in Methylenchlorid/Aceton v;ie 9:1 und 8:2 chror.atographisch gereinigt. Ausbeute 22.2 g (62 ^), Schmp. 171°C ^{1 =} ""^5.0° (c=l, in MetharJol)

609809/1008 _BAD original

d) F-Arg-Pro-cyclopropylamid«2HCl

22 g (3O.9 mMol) Z-Arg(Z₂ ^Pro-cyclopropylamid werden in Methanol analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird im Hochvakuum getrocknet. Ss resultieren 11 g (89 0) eines amorphen Schaums.

e) Z-D-Ser(Bu )-Leu-Arg-Pro-cyclopro"pylamid

Zu einer Lösung von 3.83 g (10 mHol) H-Arg-Pro-cycloprcpyl— amid·2EGl in 20 ml Dimethylformamid gibt man bei 0⁰C 2.6 ml N-A'thylmorpholin und 2.75 g Z-Leu-OKSu. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand je ein mal mit Essigester und A'ther. Man dekantiert die Lösungsmittel ab und trocknet das Öl im Hochvakuum. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und analog Beispiel 3b katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit A'ther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Es entstehen 5*^5 S amorphes H-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamr.d^HCl, das durch Salze verunreinigt ist (4.96 g = 100 % bezogen auf F-Arg-Fro-cycloproylamid«2HCl). Die gesamte Substanz wird zusammen mit 1.35 G HOEt., 2.6 ml K-iithylmorpholin und 4.8 g Z—D-Ser(3u )-0Tcp in 20 ir:l Dimethylformamid gelöst. Man Ir3t 2 Stunden stehen, engt ein und verreibt den Rückstand 2 mal mit gesättigter NaHCO₅-Lösung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Ka₂SO₁,, engt ein und verreibt den Rückstand zwei mal mit gesättigter NaHCO₃-Losung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Na₂SO₁,, engt ein und verreibt den Rückstand mit i'ither. Ausbeute 4.55 K (65 ^cp bezogen auf E-Arg-Pro-cyclopropylamid*2HCl). Die Substanz ist amorph und wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.

f) K-3er-Tyr-D-SerfBu )-Leu-Arn;-I-ro-c_;,'cloprop7^rlHrnia»2H01

3·5 g (5 mMol) Z-D-Ser(Bu )-Leu-Arg-Pro-cycloprop7ria!T.id v/erden in Methanol analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 3 S (94 fJ) amorphes Material. Obige 3 g (4,7 mMol) H-D-Ser(Eu. ^-Leu-Arg-rro-cycloprop.ylamid· 2KCl werden zusammen nit 2.32 g (4.7 r.Mol) Z-3er-n?vr(5zl)»0H, 635 mg KOBt und 1.22 ml N-'!t^;/lmorpholin in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Bei 0⁰G gibt man 1.C4 g DCC zu und läßt eine Stunde bei 0⁰C und über Lacht bei Raumtemperatur stehen.

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609809/1006 BAD ORIGINAL

Der Niederschlag wird andentags abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zwei mal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung verrieben, in Methylenchloridlösung gelöst und die Lösung über Na₂SO₁, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Es resultieren 3.5 g (71 #) Z-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bu^t)-Leu-Arg-Procyclopropylamid, die analog Beispiel Ib katalytisch hydriert werden. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausb. 2.92 g (» 70 # bezogen auf Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH). Die Rohsubstanz wird wie bei Beispiel Ie beschrieben chromatographisch an Sephadex LH 20 gereinigt. Ausbeute an chromatographisch reiner Substanz 1.4 g. ²° (° ^β !» ⁱⁿ Methanol)

g) *-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu )-Leu-Arg-Pro-cyclopropyl— amid-diacetat

Analog Beispiel If werden 500 mg '-Glu-His-Trp-M-NHj mit 890 mg H-Ser-Tyr-D-Ser(3u )-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid»2HCl umgesetzt, aufgearbeitet und gereinigt.

Ausbeute 420 mg chromatographisch reiner Substanz. Der Gehalt an Peptidbase ist laut UV-Spektrum 77 # (Ausbeute 32 ?3). ° ⁸⁰ C^c=1» ⁱⁿ Dimethylacetamid)

Beispiel 6 (analog Reaktionsschema 1);

P t

LGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-SeriBu^-Leu-Arg-Pro-mi-OCHj

a) Z-Ar^-Pro-ONb'HBr

30.8 g (0.1 Mol) Z-Arg-OH und 29-7 g (0.09 Mol) H-Pro-OIfb-HBr werden in einer Mischung aus 250 ml Pyridin und 250 ml Dimethylformamid gelöst. Man gibt 2.2 g (0.107 Mol) DCC zu und rührt über Kacht bei Raumtemperatur. Dann.wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel im Vakuum abdesciiliert und der Rückstand in feuchtem Essigester aufgenommen. Man wäscht die Essigesterlösung mit In KaIICO₃ , In HBr und Wasser, trocknet rasch über Ka₂SO^ und destilliert den Essigester ab. Der Rückstand wird mit Isopropanol und Äther digeriert. Ausbeute 51-1 g (82 £). Chromatographisch fast einheitlich und frei von Aus fran (^produkten.

COPY

60 9809/1006 /²¹

BAD ORIGINAL

Ber. N 13.52 Br 12.9
Gef» N 13.2 Br 13-2

b) Z-Arg-Pro-OH

49.8 g Z-Arg-Pro-ONb.HBr (80 mMol) werden in einer Mischung von 300 ml Dioxan, 200 ml Methanol und 200 ml Wasser gelöst. Man gibt 2n NaOH bis PK 13.0 zu und verseift bei diesem pH, bis keine HaOH mehr aufgenommen wird (etwa 40,Minuten).. Dann stellt man mit 2n HCl auf pH 8 und engt die Lösung im Vakuum auf ein kleines Volumen ein. Man dekantiert vom ausgefallenen Harz und löst dieses aus Isopropanol durch Erhitzen und Abkühlen um. Ausbeute 22.5 g (70 fu)
C₁₉H₂₇N₅O₅ (405.43) Ber. N 17.27 Gef. N 17-0

c) Z-Arg-Prο-NK-OCH, «HC1

10.13 S (25 mMol) Z-Arg-Pro-OH und 2.5 g (30 mMol) KH₂-CCH₃-ECl, hergestellt nach DPB 1 112 -082, werden in ICO ml Dimethylformamid gelöst. Man gibt 6.75 S (50 ml-lol) HOBt, 3„2 ral (25 mMol) N-A'thylmorpholin und 5.5 g (26.6 mMol) DCC zu und rührt über Nacht. Dann filtriert man und destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Ölige Rückstand wird in 100 ml In HCl gelöst, die Lösung nach Filtration 3 ™sl m2t etwas Essigester gewaschen, mit 2n NaCH auf pH 7-5 gestellt und im Vakuum zur Trockene gebracht. Der Rückstand wird mit Äthanol extrahiert. Aus der äthanolischen Lösung fallt mau das Produkt mit der zehnfachen Menge Essi^t-ster aus und verreibe Oen Niederschlag mit Essigester und A'ther. Ausbeute 9ο S (79 ^) -

d) H-Arg-Pro-ITH-OCli, »2 ECl

Die nach c) erhaltene Verbindung wird in I50 ml Methanol unter Zugabe der berechneten Menge netnanolischer HCl an Pd katalytisch hydriert. Man filtriert vom Katalysator ab, bringt das Filtrat zur Trockene und verreibt den rückstand mit Äther, " Es resultieren 5-7 g einer hygroskopischen, aber chromatographisch einheitlichen Substanz,

C₁₂E₂₆N_SO₃C1_? (373.3) Ber C 38,61 H 7.C2 N 22.52 OCE₅ β.31

Ger C 33.3 H 7.4 N 22.0 CCH₃ 7.9

COPY '

BAD ORIGINAL 609809/1006

e) Z-Leu-Arpr-Fro-HH-OCH, -dOl <- -

Zu 5.6 s (15 mMol) H-ATg-PrO-KH-OCH₃ ·2Η01 in 25 ml Dimethylformamid gibt man 4.1 g Z-Leu-ONSu und $.8 ml N-Xtaylmorpholin. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen, destilliert dann das Lösungsmittel im Vakuum ab und nimmt den öligen Rückstand in 50 nl Methanol auf. Nun rührt man mit stark basischem Ionenaustauscher in der OH-Form, filtriert nach 5 Minuten ab, engt ein, verreibt den Rückstand mit Äther, löst wieder in Methanol und neutralisiert mit 2n methanolischer" HGl. Nach Abdestillieren erhält man einen schaumigen Rückstand, der mit äther verrieben wird. Ausbeute 7.1 g (86.5. #)·

f ) Z-D-Ser(Bu*)-Leu-Arp;-Pro-HH-CCB,

5.84 g (IO mMol) Z-Leu-Arg-Pro-IiIH-OOHj -HCl. werden in 50 ml Methanol in Anwesenheit der theoretischen Menge HCl an Pd katalytisch hydriert. Man filtriert den Katalysator ab, engt die Lösung ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Nun löst man die Verbindung in 40 ml Diniethy!formamid, gibt 1.35 5 HOEt, 4.8g Z-D-3er(3U¹O-OTCp und 2.6 ml N-Athylmorpholin zu und läßt über Rächt bei Raumtemperatur stehen. Anderntags destilliert man das Lösungsmittel im Vakuum ab, verreibt den Rückstand zweimal mit gesättigter NaIICO₃-Lösung, löst ihn iii. Methylenchlorid, trocknet die Lösung mit Natriumsulfat, engt ein und.verreibt den Rückstand mit Äther. Ausbeute 5-22 g (77 SS).

OCH₃ : Ber. 4.5, Gef. 4.3

g) H-Ser-g.Yr-D-Ser(3u^t)-Leu-x\r^-Pro-i-.H-OCr:, «2HC1 3.39 g (5 ml-'ol) Z-D-SeT(Bu* )-I.eu-Arg-Pro-NE-COH₃ v/erden in Methanol gelöst und analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand v.'ird reit Äther verrieben und am Hochvakuum - getrocknet. Ausbeute 2.9 g amorphes Material (94 f.^;)· Obige 2.9 g (4.7 πϋ·Ιο1) H-D-Ser(Bu^t)-Leu-Arg-?ro-iiH-OCH₃ -2HCI werden zusammen mit 2.32 g (4.7 mMol) Z-SeT-TyT-(BzI)-OH, 635 mg K03t und 1.2 ml N-Äthylmorphcl-J η in 10 inl Dimethylformamid suspendiert. Bei 0°C ^ibt man 1.04- g DCC au und läßt 1 Stunde bei G⁰C rühren und über !."acht bei riauntecperacur stehen. Der NiedereGIiIaJ:; wird anderntags abgesaugt und dos Filtrst eingeengt. Der Rückstand v/ird zwei mal mit f-esättisx^i'

ITaHCO₃.-Lösunr: verrieben, in Kefchylenc/ilorid r eic st v.iv'· die Lösung über La₂SOi, getrocknet und ein^oenj;«. Der Rückst^r.d

609809/1006 COPY /23

BAD ORiGINAL

wird mit Äther verrieben, und abgesaugt. Es resultieren 4r2 g (82 #) amorphes Z-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bu^t)-Leu-Arg-Fro-liE-CCH₃ , die analog Beispiel Ib katalytisch hydriert werden. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 3.3 g amorphes H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu ~)-Leu-Arg-Pro-NH-OCH₃ .2HCl (=3.8 mMol = 76 # bezogen auf Z-D-Ser(3u^t)-Leu-Ärg-Pro-NH-OCH₃). Die Rohsubstanz wird analog Beispiel Ie chromate»— graphisch an Sephadex LH 20 gereinigt. Ausbeute an chronatographisch reiner Substanz: 1.9 g [a]^² = -4-3.7° (c=l, in Methanol)

Π t

h) ^LGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-3er(Bu )-Leu-Ar?:-Pro-KH-OCKs-diacetat

Analog Eeispiel If werden 500 mg l-Glu-Eis-Trp-NE-KEg mit 869 mg H-Ser-Tyr-L'-Ser(Bu^)-LeU-ArG-PrO-KH-CCH₃ -2EC1 umgesetzt, aufgearbeitet und gereinigt.

Ausbeute 4-50 mg chromatographisch reine Substanz. Der Gehalt an Peptidbase ist laut UV-Snektrun 78 # (Ausb 29 ?0 · ²° (^c=1> ⁱⁿ Dimethylacetamid;

Beispiel 7 (Zubereitung zur oralen Anwendung):

10 g l~Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Eu^t)-Leu-Arg-Pro-iTH-C₂H₅ -diacetat werden mit 5^-2 g Lactose verrieben. Man mischt die. Verreibung mit 300 g Kartoffelstärke, befeuchtet mit der alkoholischen Lösung von 8 g Gelatine und granuliert. Nach dem Trocknen mischt man 60 g Kartoffelstärke, 10 g Kagnesiuiustearat, 20 g hochdisperses Siliciumoxid und 60 g Talk zu und preEt die Mischung zu IC 000 Tabletten von je 150 rag Gewicht. Jede Tablette enthält 1 mg Wirkstoff.

Beispiel 8 (Zubereitung zur intranasalen Anwendung);

P t

4.0 g^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-GluCCBu⁰)-Leu-Arg-Fro-r:K-C, H₅ diacetat werden in 100 ml destilliertes Wasser gelöst. Gleich zeitig löst man 31.2 g NaLTO₁₁-PH₂O, 66.29 % IJa₂HTC,,, 25 g NaCl und 100 g Benzylalkohol in 8 1 Cest. V/asser und gibt 500 g Polyvinylalkohol mit einem K-'./ert von ca. 90 zu. Die beiden Lösungen werden vc3?^Qinigt und filtriert. Die 3inzel- clor.ic von 20 pe ist in 0,05 nl entölten.

609809/1006 ^COPY /24

• BAD ORIGINAL

~ 24 ~
Beispiel 9 (Zubereitung zur intranasalen Anwendung);

100 s Viasserfreies Lanolin und 440 g Vaseline werden zusammengeschmolzen. Zu der erkalteten Schmelze gibt man eine Suspension von 800 mg mikrofeinem l-Glu-His-'Trp-Ser-Phe-D-Ser(Bu )--Leu-Arg-Pro-KH-OCH₃-diac et at in 359.2 g flüssigem Paraffin. Zum Schluß v/erden 10 g Benzylalkohol dazugegeben und die Salbe homogenisiert.. Die Einzeldosis von 40 ug ist in 0.05 g Salbe enthalten.

Beispiel IQ. (Zubereitung für Injektionen);

Man löst 2 mg LGlu-His~Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Boc)-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅-diacetat in 500 ml bidestilliertes Wasser und versetzt mit 100 ml Phosphatpuffer pH. 4.5. Dann gibt man Ig Mannit und die errechnete Menge NaCl zur Isotonie zu und füllt mit Wasser auf

1 Liter auf. Nach Sterilfiltration wird in Ampullen zu 1 bzw·.

2 ml abgefüllt und lyophilisiert.

Beispiel 11 (Zubereitung für Injektionen);

Man arbeitet nach Beispiel 10, gibt aber vor dem Auffüllen mit Wasser 2.5 g 4-Hydroxybenzoesäuremethylester zu. Nach Sterilfiltration wird in Ampullen zu 1 oder 2 ml abgefüllt.

/25

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Claims

hoe 7Vf 225

Patentansprüche;

1) Peptide der allgemeinen Formel I

EGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (^)

worin X D-Ser(Bu*), D-TlIr(Bu*), D-CyS(Bu*), D-ASp(OBu*), D-GIu(OBu ), D-Orn(Boc) oder D-Lys(Boc) und Y Glycinamid. eine NH-Alkylgruppe, in der der Alkylrest 1-3 C-Atome enthält, bzw. den Cyclopropylrest darstellt und gegebenenfalls durch OH oder Fluoratome substituiert sein kann, oder eine

4 NH-O-CH_-Gruppe bedeuten und gegebenenfalls Ser durch AIa oder Thr, Tyr durch Phe, Leu' durch Ser(Bu ), Cys(Bu'), Thr(Bu ), Asp(0Bu ), GIu(OBu ), Orn(Boc) oder Lys(Boc) und Arg durch Om, Lys oder Homoarginin ersetzt sein kann.

Z) Verfahren zur Herstellung von Peptiden gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man sie

a) durch in der Peptidchemie übliche Fragmentkondensation von Peptidbruchstücken nach dem Kondensationsschema 1 _ 3 + Zf _ 10 oder 1-2+3-10 oder

b) durch stufenweisen Aufbau herstellt,

wobei andere funktioneile Gruppen durch abhydrierbare, oder im alkalischen oder schwach sauren Medium abspaltbax^e Sehutagruppen gegebenenfalls intermediär blockiert werden.

3) Pharmazeutische Zubereitungen zur peroralen, intranaöalen, intramuskulären, subcutanen oder intravenösen Verabreichung bestehend aus oder enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1.

^f) Pharmazeutische Zubereitungen zur peroralen Verabreichvmg bestehend aus oder enthaltend Verbindungen gemäßt Anspruch !.

-26-

6 G 9 8 0 9 / 10 06

HOE 7Vf 225

5) Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen gemäß Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen gemäß Anspruch 1 gegebenenfalls mit pharmazeutisch üblichen Trägerstoffen und/oder Stabilisatoren in eine für therapeutische Zwecke geeignete Anwendungsform bringt.

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