DE69120397T2

DE69120397T2 - Physiologisch aktive substanzen, die gut zum durchdringen biologischer membranen befähigt sind

Info

Publication number: DE69120397T2
Application number: DE69120397T
Authority: DE
Inventors: Toru Hibi; Kouki Kitagawa; Noriko Mizobuchi
Original assignee: Teikoku Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Teikoku Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1990-02-28
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: DK0516851T3; DK0668290T3; EP0516851A4; DE69130489T2; EP0516851A1; DE69120397D1; EP0516851B1; DE69130489D1; WO1991013081A1; EP0668290B1; CA2076849A1; EP0668290A1

Description

Die Erfindung betrifft eine physiologisch aktive Substanz mit einer hohen Biomembranpermeabilität, insbesondere mit einer hohen Blut-Hirn-Schrankenpermeabilität (BHS). Da die erfindungsgemäße physiologisch aktive Substanz eine hohe Blut-Hirn-Schrankenpermeabilität zeigt, kann sie eine ausreichende intraventrikuläre physiologische Aktivität selbst bei subkutaner Gabe oder intravenöser Injektion bereitstellen, was einfacher ist als die intraventrikuläre Gabe.
Morphin als ein opioides Alkaloid im Mohn ist seit langem dafür bekannt, daß es eine effektive analgetische Wirkung zeigt; es wurde mit dem Ziel verwendet, den scharfen Schmerz, beispielsweise im Endstadium von Krebs zu mindern. Da jedoch Morphin Nebenwirkungen zeigt, wie etwa Süchtigkeit, Abhängigkeit, Absenkung der Respiration und Verstopfung, weist es derartige Nachteile auf, daß seine Verwendung ziemlich eingeschränkt ist und die Art der Verwendung auch schwierig ist. Angesichts des vorstehend Gesagten besteht ein starkes Bedürfnis, ein Analgetikum mit einem im Vergleich zum Morphin gleich guten oder überlegenen analgetischen Effekt zu entwickeln, das zu keiner Abhängigkeit führt wie etwa das Morphin.
Auf der anderen Seite wurde von J. Hughes et al. im Jahre 1975 Enkephalin gefunden, bei dem es sich um eine endogene morphinartige Substanz (ein endogenes Opioid) handelt; es wurde erwartet, daß diese Substanz in der Lage ist, Morphin zu ersetzen. Jedoch wurde gefunden, daß Enkephalin und seine Derivate die folgenden Nachteile nach sich ziehen:
(1) Es handelt sich dabei um Peptide, die dementsprechend durch Enzyme im lebenden Körper schnell abgebaut werden;
(2) sie zeigen eine schlechte BHS-Permeabilität und sind deshalb direkt dem Gehirn zuzugeben und
(3) sie zeigen ähnliche Nebenwirkungen wie das Morphium, wie etwa Süchtigkeit oder Abhängigkeit, obwohl es sich bei ihnen um endogene Substanzen handelt.
Um die vorstehend genannten Nachteile der Enkephaline zu überwinden, werden auch gegenwärtig verschiedene Untersuchungen durchgeführt, jedoch sind die meisten von ihnen auf die Verstärkung der analgetischen Aktivität und die Abschwächung der Nebenwirkungen der Enkephaline im in vitro Test oder beim Test auf die intraventrikuläre Zugabe ebenso wie auch auf die Entwicklung von Derivaten mit hoher Beständigkeit gegen die Zersetzung in vivo durch Enzyme gerichtet. Die US-A-4273704 offenbart mit N-Adamantan substituierte Tetrapeptid-Säureamide, wobei die Tetrapeptide analog zum Enkephalin sind.
Angesichts der vorstehend wiedergegebenen Situation versuchten sich die Erfinder an einer Verbesserung der BHS- Permeabilität, die bis jetzt nicht so sehr untersucht wurde. Man erwartete, daß im Falle einer Verbesserung der BHS- Permeabilität der Enkephaline auch die BHS-Permeabilität anderer Substanzen mit schlechter BHS-Permeabilität ebenfalls angehoben werden kann, so daß der Anwendungsbereich ausgeweitet wird.
Die physiologisch aktive Substanz, die erfindungsgemäß die Biomembran zu durchdringen vermag, zeigt ein Merkmal, das durch die nachfolgende allgemeine Formel repräsentiert ist:
wobei X¹ und X² - die miteinander identisch oder voneinander verschieden sein können - eine Ester- oder Amidbindung repräsentieren, A repräsentiert eine Niederalkylengruppe, wobei n = 0 ist, wenn m = 0 ist, und n = 0 oder 1 ist, wenn m = 1 ist, R repräsentiert ein Pentapeptid oder dessen physiologisch aktives Derivat, vorausgesetzt, daß für den Fall, daß R Enkephalin ist, X² eine Esterbindung repräsentiert.
Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die physiologisch aktive Substanz H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-NH-Ada- Dihydrat.
Wie vorstehend beschrieben sind Adamantyl-Gruppen in das Pentapeptid als der physiologisch aktiven Substanz gemäß der Erfindung eingeführt, so daß die schlechte BHS-Permeabilität der physiologisch aktiven Substanz verbessert werden kann. Dementsprechend wurde die Möglichkeit einer Verabreichung im Wege der hypodermalen Injektion von Enkephalinen aufgezeigt, was bislang nicht zu einem analgetischen Effekt führte, sofern nicht direkt intraventrikulär verabreicht wurde.
Als bei der Erfindung verwendete physiologisch aktive Substanzen kann man beispielsweise anführen: Pentapeptide vom Typ der Enkephaline, Thyreotropin-Releasinghormon, adrenocorticotropes Hormon, Cholecystokinin, P-Substanz und GRF. Spezifische Beispiele vom Enkephalin-Typ sind in Anspruch 3 bis 9 definiert.
Bei der Erfindung können eine oder mehrere der wahlweisen Positionen in der Adamantylgruppe mit einer Gruppe substituiert sein, die die BHS-Permeabilität der physiologisch aktiven Substanz verstärkt. Als die spezifische Gruppe kann man beispielsweise nennen: Niederalkylgruppen wie etwa Methyl- oder Ethylgruppen, Hydroxylgruppen, Niederalkoxy-Gruppen, Aminogruppen, Carboxygruppen und Carboxy-Niederalkylgruppen. Es ist jedoch erwünscht, daß die Verbindung nicht so sehr hydrophil ist.
Erfindungsgemäß kann die BHS-Permeabilität dadurch verstärkt werden, daß die Adamantylgruppe in eine Substanz von schlechter BHS-Permeabilität eingeführt wird, um eine Möglichkeit bereitzustellen, daß Enkephaline und derartige Substanzen, die keine analgetische Wirkung zeigen, solange sie nicht direkt intraventrikulär verabreicht werden, verwendet werden können.
Fig. 1 ist eine Ansicht, die die Strukturformel eines Enkephalinderivats (Prototyp a-d) illustriert;
Fig. 2 ist ein Graph, der das Ergebnis von Messungen der analgetischen Aktivität in vivo des Derivats a wiedergibt;
Fig. 3 ist ein Graph, der das Ergebnis von Messungen der analgetischen Aktivität in vivo des Derivats b wiedergibt;
Fig. 4 ist ein Graph, der das Ergebnis von Messungen der analgetischen Aktivität in vivo von Morphium HCl illustriert;
Fig. 5 ist ein Graph, der das Ergebnis von Messungen der analgetischen Aktivität in vivo der Kontrolle illustriert.
Verschiedene Studien zur Verbesserung der BHS- Permeabilität von Enkephalinderivaten wurden durchgeführt, als ein vorbereitender Schritt wurde versucht, eine Adamantylgruppe zur Verbesserung der Fettlöslichkeit einzuführen.
Als Prototyp vor dem Einführen der Adamantylgruppe wurde ein Derivat, nämlich H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-OH verwendet, bei dem der zweite Glycin-Rest vom N-terminalen Ende von Enkephalin durch D-Ala substituiert ist. Für das erwähnte Derivat wurde bereits berichtet, daß es eine hohe Beständigkeit gegen Aminopeptidase sowie einen verbesserten analgetischen Effekt aufweist.
Die folgenden vier Arten von Derivaten wurden synthetisiert, bei denen die Adamantylgruppe in das Derivat eingeführt ist, wobei die Abkürzung Ada den Adamantanrest repräsentiert.
(A) H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-Ada --- a
Zunächst wurde Z-Tyr(Bzl)-D-Ala-Gly-NHNH&sub2; und H-Phe-Leu- O-Ada synthetisiert, beide wurden mittels der Azid-Methode ausgefällt, um so ein am N-terminalen Ende geschütztes Pentapeptid zu erhalten, das anschließend durch katalytische Reduktion von der Kopf-N-Gruppe befreit wurde, um so das Derivat a zu erhalten.
(B) H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-NH-Ada.2H&sub2;O --- b
Das Derivat b wurde erhalten, indem H-Phe-Leu-NH-Ada anstelle des H-Phe-Leu-O-Ada verwendet, und die gleiche Vorgehensweise wie in (A) beschrieben eingesetzt wurde.
(C) H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-CH&sub2;-Ada --- c
(D) H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada --- d
Derivate c und d wurden erhalten, indem die gleiche Behandlungsweise wie in (A) angewandt wurde, wobei H-Phe-Leu- O-CH&sub2;-Ada oder H-Phe-Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada verwendet wurden (vgl. Fig. 1).
Nachfolgend werden die Details der einzelnen Syntheseschritte näher beschrieben. In der Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen für Aminosäurereste und die entsprechenden Schutzgruppen gemäß der üblichen Praxis in dem betreffenden Gebiet gegeben:
Tyr : L-Tyrosin
Gly : Glycin
Phe : L-Phenylalanin
Leu : L-Leucin
GABA : γ-Aminobuttersäure
D.Ala: D-Alanin
Z : Benzyloxycarbonyl--
Z(OMe) : p-Methoxybenzyloxycarbonyl--
Ada : 1-Adamantyl--
Bzl : Benzyl--
ONp : p-Nitrophenylester
OSu : N-Hydroxysuccinimidester
OMe : Methylester
OAda 1-Adamantyloxy--
NHAda: 1-Adamantylamino--
NHNH&sub2;: Hydrazid
DCC : Dicyclohexylcarbodiimid
DBU : 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]-7-undecen
TFA : Trifluoressigsäure
THF : Tetrahydrofuran
DMA : N,N-Dimethylacetamid
DMAP : 4,4-Dimethylaminopyridin
DMF : Dimethylformamid
Desweiteren wurde bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) ein Silica-Gel und das nachfolgend aufgeführte Lösungsmittelsystem verwendet:
Rf&sub1; = CHCl&sub3; : MeOH : H&sub2;O (8:3:1)
Rf&sub2; = CHCl&sub3; : MeOH (10:1)
Rf&sub3; = CHCl&sub3; : MeOH (20:1)
Rf&sub4; = CHCl&sub3; : MeOH (50:1)
Rf&sub5; = CHCl&sub3;

Beispiel 1

Herstellung von H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-OAda

(1) Herstellung von Z-Leu-OAda

Z-Leu-OH (3,00 g, 11,3 mMol) wurden in Methylenchlorid (30 ml) gelöst; hinzugefügt und anschließend bei 4ºC 72 Studen lang gerührt wurden: Adamantan-1-ol (1,9 g, 12, mMol), DCC (2,60 g, 12,4 mMol) und DMAP (0,15 g, 1,24 mMol). Nachdem das erhaltene Harnstoffderivat mittels Filtration entfernt war, wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rest wurde in Ethylacetat gelöst und die Ethylacetatschicht wurde mit einer 5%-igen wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat, einer 10%-igen Lösung von Zitronensäure, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und anschließend mit Wasser nacheinander gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Ethylacetat abdestilliert.
Der Rest wurde in Chloroform gelöst und anschließend mittels Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt. Aus der Chloroformfraktion des Eluats wurde ein öliges Produkt erhalten, das lediglich einen einzigen Fleck ergab.
Ausbeute: 3,10 g (69%)

(2) Herstellung von Z-Phe-Leu-OAda

Z-Leu-OAda (6,20 g, 15,5 mMol) wurden in THF (30 ml) gelöst, anschließend zwei Tropfen Essigsäure und 5% Palladium-Kohlenstoff (2,0 g) hinzugegeben und ein Wasserstoffgas zwei Stunden lang hindurchgeleitet. Nach Entfernen des Palladium-Kohlenstoffs mittels Filtrierens wurde das Filtrat ausgefällt bzw. kondensiert und der Rest in DMF (70 ml) gelöst. Triethylamin (2,14 ml, 15,5 mMol) und Z-Phe-ONp (4,64 g, 15,5 mMol) wurden der Lösung hinzugefügt und anschließend 48 Stunden lang gerührt. Nach Entfernen des DMF mittels Destillation wurde der Rest in Ethylacetat gelöst und mit einer wäßrigen 10%-igen Lösung von Zitronensäure, einer wäßrigen 5%-igen Lösung von Natriumcarbonat, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Ethylacetat abdestilliert. Der Rest wurde in Chloroform gelöst, ein öliges Produkt mit einem einzigen Fleck wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Chloroform als Elutionslösung erhalten.
Ausbeute: 4,25 g (51%)

(3) Herstellung von Z(OMe)-D.Ala-Gly-OMe

Z(OMe)-D.Ala-OH (5,06 g, 20 mMol) wurden in DMF gelöst und ein gemischtes Säureanhydrid mittels Triethylamin (3,04 ml, 22 mMol) und Isobutylchlorformiat (2,88 ml, 22 mMol) hergestellt. H-Gly-OMe HCl (2,07 g, 16,5 mMol) wurden in DMF (20 ml) gelöst und mit Triethylamin (2,30 ml, 16,5 mMol) neutralisiert. Beide Lösungen wurden miteinander gemischt und unter Eiskühlung zwei Stunden lang gerührt. Nach Abdestillieren des DMF wurde der Rest in Ethylacetat gelöst und mit einer 10%-igen Lösung von Zitronensäure, einer wäßrigen 5%-igen Lösung von Natriumcarbonat, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und mit Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Ethylacetat abdestilliert und Ether dem Rest hinzugegeben, so daß ein Pulver erhalten wurde. Nach Sammeln des Pulvers mittels Filtrieren wurde es aus Ethylacetat-ether rekristallisiert.
Ausbeute: 3,10 g (58%), Schmelzpunkt: 99 - 101ºC
Rf&sub1;: 0,75
Elementaranalyse C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub0;N&sub2;O&sub6;
Berechneter Wert: C 55,55, H 6,22, N 8,64
Ermittelter Wert: C 55,41, H 6,34, N 8,68

(4) Herstellung von Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-OMe

TFA (6,0 ml) - Anisol (1,5 ml) wurden Z(OMe)-D.Ala-Gly-OMe (3,00 g, 9,25 mMol) unter Eiskühlen hinzugegeben und eine Stunde lang gerührt. Nach Abdestillieren des TFA wurde der Rest in DMF (30 ml) gelöst und mit Triethylamin (1,28 ml, 9,25 mMol) neutralisiert. Z-Tyr(Bzl)-OH (3,81 g, 11,1 mMol) wurden in DMF (40 ml) gelöst und ein gemischtes Säureanhydrid durch Zugabe von N-Methylmorpholin (1,34 ml, 12,2 mMol) und Isobutylchlorformiat (1,60 ml, 12,1 mMol), hergestellt und anschließend unter Eiskühlung zwei Stunden lang gerührt. Nach Abdestillieren von DMF wurde der Rest in Ethylacetat gelöst, mit einer wäßrigen 100%-igen Lösung von Zitronensäure, einer wäßrigen 5%-igen Lösung von Natriumcarbonat, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Ethylacetat abdestilliert und Isopropylether dem Rest hinzugegeben, um so ein Pulver zu erhalten. Nach Sammeln desselben mittels Filtration wurde aus Methanol-Ether rekristallisiert.
Ausbeute: 3,31 g (65%), Schmelzpunkt: 157 - 161ºC
Rf&sub1;: 0,81
Elementaranalyse C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub3;N&sub3;O&sub7;
Berechneter Wert: C 65,80, H 6,07, N 7,67
Ermittelter Wert: C 65,33, H 6,06, N 7,60

(5) Herstellung von Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-NHNH&sub2;

Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-OMe (3,20 g, 5,8 mMol) wurden in DMF (40 ml) gelöst, 80% Hydrazinhydrat (3,60 ml, 1,58 mMol) hinzugegeben und 24 Stunden lang gerührt. Nach Abdestillieren von DMF wurde dem Rest Ethanol hinzugefügt, um ein Pulver zu erhalten. Nach Sammeln durch Filtrieren wurde aus DMF-Ethanol rekristallisiert.
Ausbeute: 3,15 g (98%), Schmelzpunkt: 171 - 174ºC
Rf&sub1;: 0,61
Elementaranalyse C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub3;N&sub5;O&sub6;.H&sub2;O
Berechneter Wert: C 61,58, H 6,24, N 12,38
Ermittelter Wert: C 61,73, H 6,06, N 12,86

(6) Herstellung von Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-Phe-Leu-OAda

Z-Phe-Leu-OAda (1,00 g, 1,83 mMol) wurden in Tetrahydrofuran (20 ml) gelöst, anschließend wurden 5% Palladium-Kohlenstoff (etwa 1 g) hinzugegeben und die katalytische Reduktion durch Hindurchströmenlassen von Wasserstoffgas durchgeführt. Zwei Stunden später wurde der Katalysator mittels Filtrierens entfernt, das Lösungsmittel abdestilliert und der Rest in DMF (50 ml) gelöst. Ein aus Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-NHNH&sub2;) (1,30 g, 2,38 mMol) hergestellter Acid-Bestandteil und Triethylamin (0,70 ml, 5,0 mMol) wurden hinzugegeben und danach 24 Stunden lang bei 4ºC gerührt. Nach Abdestillieren des DMF wurde zum Rest Wasser hinzugegeben, um ein Pulver zu erhalten. Das Pulver wurde durch Filtrieren gesammelt und anschließend mit einer wäßrigen 10%-igen Lösung von Zitronensäure, einer wäßrigen 5%-igen Lösung von Natriumhydrogencarbonat, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknung wurde zwei Mal aus Methanol-Ether rekristallisiert.
Ausbeute: 1,67 g (85%), Schmelzpunkt: 136 - 139ºC
Rf&sub1;: 0,38
Elementaranalyse C&sub5;&sub4;H&sub6;&sub5;N&sub5;O&sub9;.1/2H&sub2;O
Berechneter Wert: C 69,21, H 7,17, N 7,47
Ermittelter Wert: C 69,29, H 7,23, N 7,33

(7) Herstellung von H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-OAda

Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-Phe-Leu-OAda (250 mg, 0,27 mMol) wurden in THF (30 ml) gelöst, anschließend 5% Palladium- Kohlenstoff (1 g) hinzugegeben und die katalytische Reduktion fünf Stunden lang durchgeführt. Nach Entfernen des Katalysators durch Filtrieren wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rest in einer kleinen Menge von Chloroform-Methanol (10:1) gelöst. Durch Silicagel- Säulenchromatographie unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels zur Eluierung wurde eine einzige Fraktion erhalten; das Lösungsmittel wurde abdestilliert und Ether zu dem Rest hinzugegeben, um ein Pulver zu erhalten.
Ausbeute: 85 mg (85%), Schmelzpunkt: 110 - 115ºC
Rf&sub1;: 0,53, [α]D = + 159,6º (C = 0,2, DMF, 25ºC)
Elementaranalyse C&sub3;&sub9;H&sub5;&sub3;N&sub5;O&sub7;.2H&sub2;O
Berechneter Wert: C 63,31, H 7,77, N 9,47
Ermittelter Wert: C 63,56, H 7,66, N 9,05
FAB-MS: 704,0 [M+H]
Aminosäurenanalysewert nach Hydrolyse mit 6N-HCl Gly 1,13, Ala 1,03, Leu 1,00, Tyr 0,88, Phe 1,05

Beispiel 2

Herstellung von H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-NHAda 2H&sub2;O

(1) Herstellung von Z-Leu-NHAda

Z-Leu-OH (1,75 g, 6,6 mMol) wurde in DMF (30 ml) gelöst; Triethylamin (0,94 ml, 6,8 mMol) und Isobutyl-Chlorformiat (0,90 ml, 6,8 mMol) wurden hinzugefügt, um ein gemischtes Säureanhydrid herzustellen. Eine durch Lösen von 1-Aminoadamantan HCl (1,88 g, 10 mMol) in DMF (20 ml) hergestellte Lösung wurde mit Triethylamin (1,38 ml, 10 mMol) neutralisiert und der vorstehend genannten Lösung hinzugegeben und anschließend unter Eiskühlung zwei Stunden lang gerührt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde der verbliebene Rest in Ethylacetat gelöst und mit einer 10%- igen wäßrigen Lösung von Zitronensäure, einer 5%-igen wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat, einer wäßrigen nicht gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde Ethylacetat abdestilliert und Petrolether dem Rest hinzugegeben, um ein Pulver zu erhalten. Nach Sammeln durch Filtrieren wurde aus Ethylacetat-Petrolether rekristallisiert.
Ausbeute: 2,20 g (84%), Schmelzpunkt: 103 - 105ºC
Rf&sub5;: 0,44
Elementaranalyse C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub4;N&sub2;O&sub3;
Berechneter Wert: C 72,33, H 8,60, N 7,03
Ermittelter Wert: C 72,02, H 8,78, N 6,82

(2) Herstellung von Z-Phe-Leu-NHAda

Z-Leu-NHAda (2,20 g, 5,5 mMol) wurde in Methanol (30 ml) gelöst, zwei Tropfen Essigsäure und 5% Palladium-Kohlenstoff (etwa 1 g) wurden hinzugefügt und die katalytische Reduktion zwei Stunden lang durchgeführt. Nach Entfernen des Katalysators mittels Filtrieren wurde das Filtrat konzentriert und der Rest in DMF (20 ml) gelöst. Die Lösung nach der katalytischen Reduktion wurde einer DMF-Lösung (20 ml) eines gemischten Säureanhydrids, das aus Z-Phe-OH (1,98 g, 6,63 mMol), Triethylamin (1,00 g, 7,29 mMol) und Isobutylchlorformiat (0,96 ml, 7,29 mMol) hergestellt war, hinzugegeben; anschließend erfolgte zwei Stunden lang Rühren unter Eiskühlung. Nach Abdestillieren von DMF wurde dem Rest Wasser hinzugegeben, um ein Pulver zu bilden, das durch Filtrierung gesammelt wurde. Es wurde anschließend mit einer 10%-igen wäßrigen Lösung von Zitronensäure, einer 5%-igen wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknen wurde es aus Ethylacetat- Petrolether rekristallisiert.
Ausbeute: 2,20 g (68%), Schmelzpunkt: 125 - 127ºC
Rf&sub4;: 0,58
Elementaranalyse C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub3;N&sub3;O&sub4; 1/2H&sub2;O
Berechneter Wert: C 71,45, H 8,00, N 7,58
Ermittelter Wert: C 71,57, H 8,08, N 7,61

(3) Herstellung von Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-Phe-Leu-NHAda

Z-Phe-Leu-NHAda (1,00 g, 1,83 mMol) wurde in THF (20 ml) gelöst, zwei Tropfen Essigsäure und 5% Palladium-Kohlenstoff (1 g) hinzugegeben und die katalytische Reduktion vier Stunden lang durchgeführt. Nach Entfernen des Katalysators durch Filtrieren wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rest in DMF (50 ml) gelöst. Ein Azid-Ingrediens, das aus Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-NHNH&sub2; (1,30 g, 2,38 mMol) hergestellt war, und Triethylamin (0,70 ml, 2,38 mMol) wurden hinzugegeben und bei 4ºC 24 Stunden lang gerührt. Nach Abdestillieren von DMF wurde Wasser dem Rest hinzugefügt, um ein Pulver zu erhalten. Das Pulver wurde durch Filtrieren gesammelt und mit einer 10%-igen wäßrigen Lösung von Zitronensäure, einer 5%-igen wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknen wurde es aus Methanol-Isopropylether rekristallisiert.
Ausbeute: 1,39 g (81%), Schmelzpunkt: 145 - 149ºC
Rf&sub1;: 0,75
Elementaranalyse C&sub5;&sub4;H&sub6;&sub6;N&sub6;O&sub8;.1/2H&sub2;O
Berechneter Wert: C 69,28, H 7,28, N 8,98
Ermittelter Wert: C 69,25, H 7,14, N 8,85

(4) Herstellung von H-Tyr-D.Ala-Gly-Leu-NHAda

Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-Phe-Leu-NHAda (500 mg, 0,54 mMol) wurde in THF (30 ml) gelöst, zwei Tropfen Essigsäure und 5% Palladium-Kohlenstoff (1 g) hinzugefügt und eine katalytische Reduktion vier Stunden lang durchgeführt. Nach Entfernen des Katalysators durch Filtrieren wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rest in einer kleinen Menge von Chloroform gelöst. Mittels Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Chloroform-Methanol (10:1) als Elutionslösung wurde eine Fraktion erhalten, die einen einzigen Fleck zeigte. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde Ether dem Rest hinzugegeben, um ein Pulver zu erhalten.
Ausbeute: 155 mg (41%), Schmelzpunkt: 141 - 145ºC
Rf&sub1;: 0,51 [α]D = + 32,5º (C = 0,2, DMF, 25ºC)
Elementaranalyse C&sub3;&sub9;H&sub5;&sub4;N&sub6;O&sub9; 2H&sub2;O
Berechneter Wert: C 63,39, H 7,91, N 11,37
Ermittelter Wert: C 63,76, H 7,85, N 11,21
FAB-MS: 703,0 [M+H]&spplus;
Aminosäurenanalysenwert nach Hydrolyse mit 6N-HCl Gly 1,04, Ala 1,03, Leu 1,00, Tyr 1,00, Phe 1,07

Beispiel 3

Herstellung von H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-CH&sub2;-Ada und H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada

(1) Herstellung von Z-Leu-O-CH&sub2;-Ada

Z-Leu-OH (2,10 g, 7,9 mMol) wurde in Methylenchlorid (30 ml) gelöst, 1-Adamantanmethanol (1,31 g, 7,9 mMol), DCC (1,8 g, 8,7 mMol) und DMAP (97 mg, 0,79 mMol) hinzugegeben und anschließend bei 4ºC 48 Stunden lang gerührt. Nach Entfernen des erhaltenen Harnstoffderivats mittels Filtrierens wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rest wurde in Ethylacetat gelöst und die Ethylacetatschicht mit einer wäßrigen 5%-igen Lösung von Natriumcarbonat, einer wäßrigen 10%-igen Lösung von Zitronensäure, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Ethylacetat abdestilliert. Desweiteren wurde der erhaltene Rest in Chloroform gelöst und mittels Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt, so daß ein öliges Produkt, welches einen einzigen Fleck zeigte, erhalten wurde.
Ausbeute: 2,43 g (74%)
Rf&sub3;: 0,88
FAB-MS: 414,2 [M+H]&spplus;

(1') Herstellung von Z-Leu-O-CH&sub2;-CH&sub2;-Ada

Die Verfahrensschritte waren die gleichen wie die vorstehend in (1) beschriebenen, außer daß anstelle des 1-Adamantan-Methanols 1-Adamantan-Ethanol (1,70 g, 9,4 mMol) verwendet wurde.
Ausbeute: 1,85 g (46%)
Rf&sub5;: 0,63
FAB-MS: 428,0 [M+H]&spplus;

(2) Herstellung von Z-Phe-Leu-O-CH&sub2;-Ada

Z-Leu-O-CH&sub2;-Ada (2,18 g, 5,27 mMol) wurde in THF (20 ml) gelöst, 5% Palladium-Kohlenstoff (etwa 2 g) und Essigsäure (2 ml) hinzugefügt und die katalytische Reduktion zehn Stunden lang angewandt. Nach Entfernen des Palladium- Kohlenstoffs durch Filtrierung wurde das Filtrat konzentriert und der Rest in DMF (20 ml) gelöst. Triethylamin (0,74 ml, 5,27 mMol) und Z-Phe-ONP (2,21 g, 5,27 mMol) und N- Hydroxybenzotriazol (0,36 g, 2,64 mMol) wurden hinzugefügt und 24 Stunden lang gerührt. Nach Abdestillieren des DMF wurde der Rest in Ethylacetat gelöst und mit einer wäßrigen 5%-igen Lösung von Natriumcarbonat, einer wäßrigen 10%-igen Lösung von Zitronensäure, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser aufeinanderfolgend gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Ethylacetat abdestilliert. Der Rest wurde in Chloroform gelöst und mittels Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Chloroform-Methanol (20:1) als Elutionslösung gereinigt, so daß ein ölartiges Produkt erhalten wurde, das einen einzigen Fleck zeigte.
Ausbeute: 2,19 g (99%)
Rf&sub4;: 0,46
FAB-MS: 561,3 [M+H]&spplus;

(2') Herstellung von Z-Phe-Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada

Die Verfahrensschritte waren die gleichen wie die in (2) vorstehend beschriebenen, außer daß anstelle von Z-Leu-O-CH&sub2;-Ada Z-Leu-O-CH&sub2;-CH&sub2;-Ada (1,85 g, 4,33 mMol) verwendet wurde.
Ausbeute: 2,49 g (100%)
Rf&sub5;: 0,15
FAB-MS: 575,0 [M+H]&spplus;

(3) Herstellung von Z-Tyr(Bzl)-D-Ala-Gly-Phe-Leu-O-CH&sub2;-Ada

Z-Phe-Leu-O-CH&sub2;-Ada (2,0 g, 3,57 mMol) wurde in Tetrahydrofuran (15 ml) gelöst, dazugegeben wurde 5% Palladium-Kohlenstoff (etwa 2 g) und Essigsäure (1 ml), und die katalytische Reduktion wurde fünf Stunden lang durchgeführt. Nach Entfernen des Katalysators durch Filtrieren wurde das Filtrat konzentriert. Der Rest wurde in DMF (10 ml) gelöst, ein Azid-Ingrediens, das aus Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-NHNH&sub2; (1,60 g, 2,92 mMol) hergestellt war, und Triethylamin (0,27 ml, 1,95 mMol) wurden hinzugefügt und bei 4ºC 48 Stunden lang gerührt. Nach Abdestillieren des DMF wurde der Rest in Ethylacetat gelöst und mit 5%-iger wäßriger Lösung von Natriumcarbonat, einer 10%-igen wäßrigen Lösung von Zitronensäure, einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid und Wasser in aufeinanderfolgenden Schritten gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Ethylacetat unter reduziertem Druck abdestilliert und Ether dem Rest hinzugefügt, um ein Pulver zu erhalten; anschließend wurde es in Chloroform gelöst und mittels Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Chloroform-Methanol (20:1) als Elutionslösung gereinigt, so daß ein Produkt mit einem einzelnen Fleck erhalten wurde, das aus Methanol-Ether rekristallisiert wurde.
Ausbeute: 0,70 g (38%), Schmelzpunkt: 158 - 162ºC
Rf&sub3;: 0,34 [α]D = + 17,2º (C = 0,5, DMF)
Elementaranalyse C&sub5;&sub5;H&sub6;&sub7;N&sub5;O&sub9;.1/2H&sub2;O
Berechneter Wert: C 69,45, H 7,21, N 7,36
Ermittelter Wert: C 69,61, H 7,29, N 7,79

(3') Herstellung von Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada

Z-Phe-Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada (1,15 g, 2 mMol) wurde in Tetrahydrofuran (15 ml) gelöst, 5% Palladium-Kohlenstoff (etwa 2 g) und 5 ml Essigsäure wurden hinzugefügt und eine katalytische Reduktion fünf Stunden lang durchgeführt. Nach Entfernen des Katalysators durch Filtrierung wurde das Filtrat konzentriert. Der Rest wurde in DMF (10 ml) gelöst, ein aus Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-NHNH&sub2; (1,2 g, 2,19 mMol) hergestelltes Acid-Ingrediens und Triethylamin (0,28 ml, 2 mMol) wurden hinzugegeben und bei 4ºC 48 Stunden lang gerührt. Nach Abdestillieren des DMF wurde der Rest in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit 5%-iger wäßriger Lösung von Natriumcarbonat, 10%-iger wäßriger Lösung von Zitronensäure, einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Ethylacetat unter reduziertem Druck abdestilliert und Ether dem Rest hinzugegeben, um ein Pulver zu erhalten. Dieses wurde in Chloroform gelöst und mittels Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Chloroform-Methanol (30:1) als Elutionslösung gereinigt, so daß ein Produkt mit einem einzigen Fleck erhalten wurde, das aus Methanol-Ether rekristallisiert wurde.
Ausbeute: 0,84 g (51%), Schmelzpunkt: 148 - 151ºC
Rf&sub3;: 0,31 [α]D = - 13,3º (C = 0,6, DMF)
Elementaranalyse C&sub5;&sub6;H&sub6;&sub9;N&sub5;O&sub9;.1,5H&sub2;O
Berechneter Wert: C 68,41, H 7,38, N 7,12
Ermittelter Wert: C 68,44, H 7,09, N 7,46

(4) Herstellung von H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-CH&sub2;-Ada

Z-Tyr(Bzl)-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-CH&sub2;-Ada (283 mg, 0,3 mMol) wurde in Essigsäure (10 ml) gelöst, 5% Palladium- Kohlenstoff (1 g) wurde hinzugegeben und die katalytische Reduktion fünf Stunden lang durchgeführt. Nach Entfernen des Katalysators durch Filtrieren wurde das Filtrat mit Wasser verdünnt und anschließend gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in 5% Essigsäure gelöst, auf eine Diaion HP-20-Säule gegeben und mit 5% Essigsäure (200 ml) gewaschen. Anschließend wurde es mittels einer Gradientenelution unter Verwendung von 5% Essigsäure (200 ml) und Acetonitril (200 ml) eluiert, die Hauptfraktion konzentriert und gefriergetrocknet, so daß weiße federartige Kristalle erhalten wurden.
Ausbeute: 135 mg (56%)
Rf&sub1;: 0,30 [α]D = + 6,3º (C = 0,2, DMF)
FAB-MS: 718,0 [M+H]&spplus;
Elementaranalyse C&sub4;&sub1;H&sub5;&sub4;N&sub5;O&sub7;.1,5H&sub2;O
Berechneter Wert: C 65,14, H 7,60, N 9,27
Ermittelter Wert: C 65,15, H 7,61, N 9,39

(4') Herstellung von H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada

Z-Tyr-(Bzl)-D.Ala-Gly-Phe-Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada (287 mg, 0,3 mMol) wurde in 10 ml Essigsäure gelöst, anschließend 1 g 5% Palladium-Kohlenstoff hinzugefügt und die katalytische Reduktion fünf Stunden lang druchgeführt. Nach Entfernen des Katalysators mittels Filtrieren wurde das Filtrat mit Wasser verdünnt und anschließend gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in 5% Essigsäure gelöst, auf eine Diaion HP-20-Säule gegeben und mit 5% Essigsäure (200 ml) gewaschen. Anschließend wurde es unter Verwendung einer Gradientenelution mit 5% Essigsäure (200 ml) und Acetonitril (200 ml) eluiert. Die Hauptfraktion wurde konzentriert und gefriergetrocknet, so daß ein weißes federartiges kristallines Produkt erhalten wurde.
Ausbeute: 110 mg (50%), Schmelzpunkt: 117 - 122ºC
Rf&sub1;: 0,28 [α]D = + 34,9º (C = 0,2, DMF)
FAB-MS: 732,0 [M+H]&spplus;
Elementaranalyse C&sub4;&sub1;H&sub5;&sub7;N&sub5;O&sub7;.1,5H&sub2;O
Berechneter Wert: C 64,88, H 7,97, N 9,23
Ermittelter Wert: C 64,61, H 7,72, N 8,91

Beispiel 4

Die in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen adamantylierten Enkephalinderivate a und b wurden in vitro auf die analgetische Wirkung untersucht und in vivo auf die Unterdrückung des Effekts, herausgenommenen Meerschweinchendarm mittels elektrischer Stimulierung schrumpfen zu lassen.

Messung der in vivo analgetischen Aktivität

Die adamantylierten Enkephalinderivate a und b wurden subkutan einer Maus verabreicht; der analgetische Effekt im Zentralnervensystem wurde gemäß dem Randall-Selitto-Verfahren gemessen; d.h. die Derivate a und b wurden in einer gemischten Lösung von DMA:physiologischer Kochsalzlösung (4:6) gelöst und etwa 100 µl der Lösung subkutan einer Maus (Stamm dd-Y; etwa 20 g) in einer Dosis von (1 - 50 mg/kg) verabreicht wurden; der analgetische Effekt wurde nach der Zugabe gemäß der Randall-Selitto-Methode zu jedem vorher festgelegten Zeitpunkt gemessen. Morphiumhydrochlorid wurde als Vergleichsdroge verwendet und [D-Ala²]-LeucinEnkephalin, 1-Adamantol, physiologische Kochsalzlösung und das gemischte Lösungsmittel von physiologischer Kochsalzlösung und DMA (6:4) als Kontrolle verwendet. Die Testergebnisse sind in Fig. 2 (Derivat a), Fig. 3 (Derivat b), Fig. 4 (Morphin- Hydrogenchlorid) und Fig. 5 (Kontrolle) gezeigt.
Die Derivate a und b mit einer C-terminalen Endadamantylgruppe zeigten eine analgetische Aktivität, die gegenüber dem Morphiumhydrogenchlorid verringert, jedoch gegenüber den Kontrollen überlegen war.

Messung der in vitro analgetischen Aktivität

Der Unterdrückungseffekt für die Schrumpfung des herausgenommenen Darms von Meerschweinchen durch die adamantylierten Enkephalinderivate a und b wurde gemäß dem Verfahren von Kosterlitz [H.W. Kosterlitz, A.A. Watterfield, Ann. Rev. Pharmacol., 15, 29, (1975)] gemessen. Desweiteren wurde Morphiumhydrogenchlorid als Vergleichsdroge und [D-Ala²] Leucinenkephalin als Kontrolle verwendet. Die Testergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Verbindung ED&sub5;&sub0; (Mol) (Mittelwert ± SD) relative Wirksamkeit Morphin.HCl [D-Ala²] Leucin-Enkephalin Derivat
Jedes der Derivate a und b zeigte eine Unterdrückung der Schrumpfung, die jeweils durch Naloxon als Antagonisten aufgehoben werden konnte. Es kann also gesehen werden, daß die Derivate morphiumähnliche Aktivität zeigen, unabhängig von der Einführung der Adamantylgruppe.
Von den vorstehend beschriebenen Testergebnissen wird bestätigt, daß die adamantylierten Enkephaline morphiumähnliche analgetische Wirkung bei hypodermaler Verabreichung zeigen. Dies zeigt eine Verbesserung der BHS- Permeabilität; klinische Anwendung als hypodermale Injektionslösung kann erwartet werden, wenn die Sicherheit bestätigt wird.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen Ergebnisse wurde gezeigt, daß die BHS-Permeabilität bei der Einführung der Adamantylgruppe verbessert wird, während die physiologische Aktivität beibehalten bleibt; ähnliche Effekte können von analogen Derivaten erwartet werden. Da man jedoch überlegen muß, daß die Aktivität in Abhängigkeit von der Position der eingeführten Adamantylgruppen in Hinsicht auf die Natur der physiologisch aktiven Substanz verlorengehen kann, ist eine ausreichende Sorgfalt bei der Einführung notwendig.

Claims

1. Physiologisch aktive Substanz gemäß der allgemeinen Formel:

wobei X¹ und X², die jeweils miteinander identisch oder voneinander verschieden sein können, eine Ester- oder Amid- Bindung repräsentieren, A eine Niederalkylen-Gruppe repräsentiert, wobei n = 0, wenn m = 0 ist, n= 0 oder 1, wenn m = 1 ist, und R ein Pentapeptid oder ein physiologisch aktives Derivat davon repräsentiert, vorausgesetzt, daß für den Fall, daß es sich bei R um ein Enkephalin handelt, X² eine Esterbindung repräsentiert.

2. Substanz nach Anspruch 1, wobei X² eine Esterbindung und R ein Enkephalin repräsentiert.

3. Substanz nach Anspruch 1, welche H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe- Leu-O-Ada ist.

4. Substanz nach Anspruch 1, welche H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe- Leu-O-Ada-Dihydrat ist.

5. Substanz nach Anspruch 1, welche H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe- Leu-O-CH&sub2;-Ada ist.

6. Substanz nach Anspruch 1, welche H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe- Leu-O-CH&sub2;-Ada 1,5H&sub2;O ist.

7. Substanz nach Anspruch 1, welche H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe- Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada ist.

8. Substanz nach Anspruch 1, welche H-Tyr-D.Ala-Gly-Phe- Leu-O-(CH&sub2;)&sub2;-Ada 1,5H&sub2;O ist.

9. Physiologisch aktive Substanz, welche H-Tyr-D.Ala-Gly- Phe-Leu-NH-Ada-Dihydrat ist.